NO321514B1

NO321514B1 - DNA sequence encoding modulators of TNF / NGF superfamily receptors, as well as protein, pharmaceutical composition, vector, methods and uses thereof.

Info

Publication number: NO321514B1
Application number: NO19964741A
Authority: NO
Inventors: David Wallach; Mark Boldin; Igor Mett; Eugene Varfolomeev
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1994-05-11
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2006-05-15
Also published as: NO964741D0; KR100404737B1; JP3966387B2; WO1995031544A1; FI964509A; CN1152937A; AU2546995A; FI964509A0; AU703919B2; NO964741L; CN1329512C; CN1616661A; EP0759984A4; JPH10500568A; CA2189983A1; EP0759984A1; CN1173033C; IL111125A0; KR970703419A

Description

Det blir beskrevet nye proteiner som binder til de intracellulære områdene av p55 og p75 TNF-R og Fas-it som er i stand til å modulere funksjonen til p55 og p75 TNF-R og Fas-R, og DNA sekvenser som koder for dem. Det blir også beskrevet nye oppløselige oligomere TNF-R, oligomere Fas-R og oligomere reseptorer med en blanding av TNF-R og Fas-R. Det blir også beskrevet fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av alle ovenfor nevnte. New proteins are described that bind to the intracellular regions of p55 and p75 TNF-R and Fas-it, which are capable of modulating the function of p55 and p75 TNF-R and Fas-R, and DNA sequences that code for them. New soluble oligomeric TNF-R, oligomeric Fas-R and oligomeric receptors with a mixture of TNF-R and Fas-R are also described. Methods for the production and use of all of the above are also described.

O ppfinnelsens felt The field of invention

Foreliggende oppfinnelse er generelt innen feltet reseptorer som hører til TNF/NGF superfamilien av reseptorer og kontrollen av deres biologiske funksjoner. TNF/NGF superfamilien av reseptorer omfatter reseptorer slik som p55 og p75 tumornekrose-faktorreseptorer (TNF-R) og FAS ligandreseptorer (også kalt FAS/APOl eller FAS-R og vil heretter bli kalt FAS-R) og andre. Mer spesifikt, angår foreliggende oppfinnelse nye proteiner som binder til de intracellulære områdene (IC) av p55 og p75 TNF-R og Fas-R (disse intracellulære områdene er henholdsvis angitt p55IC, p75IC og Fas-IC) og hvis nye proteiner er i stand til å modulere funksjonen av p55 og p75 TNF-Rs og Fas-R. Et av proteinene som er i stand til binding av p55IC av det intakte p55-TNF-R er P55IC selv i formen av et p55IC molekyl eller en del derav, slik som for eksempel det såkalte "dødsområdet" (DD) av p55IC. Foreliggende oppfinnelse angår også nye anvendelser Foreliggende oppfinnelse angår også fremstillingen og anvendelsen av disse nye p55 og p75 TNF-F-bindende proteinene og Fas-R bindende proteiner, referert til her som p55 IC-, p75IC- og Fas-IC-bindende proteiner. The present invention is generally in the field of receptors belonging to the TNF/NGF superfamily of receptors and the control of their biological functions. The TNF/NGF superfamily of receptors includes receptors such as p55 and p75 tumor necrosis factor receptors (TNF-R) and FAS ligand receptors (also called FAS/APO1 or FAS-R and will hereinafter be called FAS-R) and others. More specifically, the present invention relates to novel proteins that bind to the intracellular regions (IC) of p55 and p75 TNF-R and Fas-R (these intracellular regions are designated p55IC, p75IC and Fas-IC, respectively) and whose novel proteins are able to modulate the function of p55 and p75 TNF-Rs and Fas-R. One of the proteins capable of binding p55IC by the intact p55-TNF-R is P55IC itself in the form of a p55IC molecule or a part thereof, such as for example the so-called "death region" (DD) of p55IC. The present invention also relates to new applications The present invention also relates to the production and use of these new p55 and p75 TNF-F-binding proteins and Fas-R binding proteins, referred to here as p55 IC-, p75IC- and Fas-IC-binding proteins.

Bakgrunn for oppfinnelsen Background for the invention

Tumornekrosefaktor (TNF-a) og lymfotoksin (TNF-p) (heretter refererer TNF både til TNF-a ogTNF-P) er multifunksjonelle pro-inflammatoriske cytokiner dannet hovedsakelig ved mononukleære fagocytter, som har mange effekter på celler (Wallach, D. (1986) i: Interferon 7 (Ion Gesser, ed.), s. 83-122, Academic Press, London; og Beutler og Cerami (1987)). Både TNF-a og TNF-0 initierer deres effekter ved binding til spesifikke celleoverflatereseptorer. Noen av effektene er sannsynligivs fordelaktige for organismen: de kan ødelegge, for eksempel tumorceller eller virøst infuserte celler og øke den antibakterielle aktiviteten til granulocytter. På denne måten bidrar TNF til forsvaret av organismen mot tumorer og infeksiøse midler bidrar til gjenvinning fra skade. TNF kan således bli benyttet som anti-tumormiddel i hvilken anvendelse den binder til dets reseptorer på overflaten av tumorceller og derved initierer hendelsene som fører til død av tumorcellene. TNF kan også bli benyttet som et anti-infeksiøst middel. Tumor necrosis factor (TNF-a) and lymphotoxin (TNF-p) (hereafter TNF refers to both TNF-a and TNF-P) are multifunctional pro-inflammatory cytokines produced mainly by mononuclear phagocytes, which have many effects on cells (Wallach, D. ( 1986) in: Interferon 7 (Ion Gesser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; and Beutler and Cerami (1987)). Both TNF-α and TNF-0 initiate their effects by binding to specific cell surface receptors. Some of the effects are probably beneficial for the organism: they can destroy, for example, tumor cells or virally infused cells and increase the antibacterial activity of granulocytes. In this way, TNF contributes to the defense of the organism against tumors and infectious agents contribute to recovery from damage. TNF can thus be used as an anti-tumor agent in which application it binds to its receptors on the surface of tumor cells and thereby initiates the events that lead to the death of the tumor cells. TNF can also be used as an anti-infective agent.

Imidlertid har både TNF-a og TNF-P skadelige effekter. Det finnes bevis på at overproduksjon av TNF-a kan spille en viktig patogen rolle i forskjellige sykdommer. Således er effekter av TNF-a primært på vaskulaturen, kjent å være en hovedårsak for symptomene ved septisk sjokk (Tracey et al., 1986). I noen sykdommer kan TNF forårsake stort vekttap (cachexia) ved å undertrykke aktiviteten av adipocytter og ved å forårsake anorexia, og TNF-a ble således kalt cachetin. Det var også beskrevet som en mediator i skadingen av vev ved reumatiske sykdommer (Beutler og Cerami, 1987) og som en hovedmediator for skaden observert med implantat versus vertreaksjoner (Piquet et al., 1987). I tillegg er TNF kjent å være involvert i inflammasjonsprosessen og i mange andre sykdommer. However, both TNF-α and TNF-P have deleterious effects. There is evidence that overproduction of TNF-α may play an important pathogenic role in various diseases. Thus, effects of TNF-α primarily on the vasculature are known to be a main cause of the symptoms of septic shock (Tracey et al., 1986). In some diseases, TNF can cause severe weight loss (cachexia) by suppressing the activity of adipocytes and by causing anorexia, and TNF-a was thus named cachetin. It was also described as a mediator of tissue damage in rheumatic diseases (Beutler and Cerami, 1987) and as a major mediator of the damage observed with implant versus host reactions (Piquet et al., 1987). In addition, TNF is known to be involved in the inflammation process and in many other diseases.

To distinkte, uavhengig uttrykte, reseptorer, p55 og p75 TNF-Rs, som binder både TNF-a og TNF-P spesifikt, initierer og/eller medierer de ovenfor angitte biologiske effektene av TNF. Disse to reseptorene har strukturelt forskjellige intracellulære områder, noe som foreslår at de signaliserer forskjellig (Se Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990: Brockhaus et al, 1990; Leotscher et al., 1990, Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; og Heller et al., 1990). Imidlertid har de cellulære mekanismene, for eksempel, de forskjellige proteinene og mulig andre faktorer som er involvert i den intracellulære signaleringen av p55 og p75 TNF-R, enda ikke blitt funnet (som angitt ovenfor er det for første gang beskrevet nye proteiner som er i stand til å binde p75IC og p55 IC). Det er denne intracellulære signaleringen som opptrer vanligvis etter bindingen av liganden, dvs. TNF (a eller P) til reseptoren som er ansvarlig for igangsettingen av kaskaden av reaksjoner som til sist resulterer i den observerte responsen til cellen overfor TNF. Two distinct, independently expressed, receptors, p55 and p75 TNF-Rs, which bind both TNF-α and TNF-β specifically, initiate and/or mediate the above-mentioned biological effects of TNF. These two receptors have structurally different intracellular regions, suggesting that they signal differently (See Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990: Brockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; and Heller et al., 1990). However, the cellular mechanisms, for example, the different proteins and possibly other factors involved in the intracellular signaling of p55 and p75 TNF-R, have not yet been found (as indicated above, new proteins have been described for the first time that are in able to bind p75IC and p55 IC). It is this intracellular signaling that usually occurs after the binding of the ligand, i.e. TNF (a or P) to the receptor that is responsible for the initiation of the cascade of reactions that ultimately results in the observed response of the cell to TNF.

Hva angår den ovenfornevnte cytocidale effekt av TNF, blir denne effekten i de fleste celler studert hittil, hovedsakelig utløst av p55 TNF-R. Antistoffer mot det ekstracellulære området (ligandbindende område) av p55 TNF-R kan selv utløse den cytocidale effekt (se EP 412486) som korrelerer med effektiviteten til reseptortverrbindingen av antistoffer, noe som er ansett å være det første trinn i genereringen av den intracellulære signaliseringsprosessen. Videre har muteringsstudier (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) vist at den biologiske funksjonen til p55 TNF-R avhenger av integriteten til dets intracellulære område, og følgelig har det vært foreslått at initieringen av den intracellulære signaleringen som fører til den cytocidale effekt av TNF opptrer som en følge av assosieringen av to eller flere intracellulære områder av p55 TNF-R. Videre opptrer TNF (a og B) som en homotrimer og som sådan har den blitt foreslått å indusere intracellulær signalering via p55 TNF-R ved hjelp av dets evne til å binde til og tverrbinde til reseptormolekyler, dvs. forårsake reseptoraggregering. Her er det nedenfor beskrevet hvordan p55IC og p55DD kan selvassosiere og indusere på en ligandavhengig måte TNF-assosierte effekter i celler. Regarding the above-mentioned cytocidal effect of TNF, this effect in most cells studied so far is mainly triggered by p55 TNF-R. Antibodies against the extracellular region (ligand binding region) of p55 TNF-R can themselves trigger the cytocidal effect (see EP 412486) which correlates with the efficiency of the receptor cross-linking of antibodies, which is considered to be the first step in the generation of the intracellular signaling process. Furthermore, mutational studies (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) have shown that the biological function of the p55 TNF-R depends on the integrity of its intracellular domain, and consequently it has been proposed that the initiation of the intracellular signaling leading to to the cytocidal effect of TNF occurs as a result of the association of two or more intracellular regions of p55 TNF-R. Furthermore, TNF (a and B) acts as a homotrimer and as such has been proposed to induce intracellular signaling via the p55 TNF-R by means of its ability to bind to and cross-link receptor molecules, i.e. cause receptor aggregation. It is described below how p55IC and p55DD can self-associate and induce TNF-associated effects in cells in a ligand-dependent manner.

Et annet medlem av TNF/NGF superfamilen av reseptorer er FAS reseptoren (FAS-R) som også er blitt kalt Fas antigenet, et celleoverflateprotein uttrykt i forskjellige vev og som deler homologi med et antall celleoverflatereseptorer inkludert TNF-R og NGF-R. FAS-R medierer celledød i form av apoptosis (Itoh et al., 1991) og synes å tjene som en negativ selektor for autoreaktive T celler, dvs. under modning av T celler, FAS-R medierer den apoptopiske død av T celler som gjenkjenner selvantigener. Det har også blitt funnet at mutering i FAS-R genet ( Ipr) forårsaker en lymfoprolifieringsforstyrrelse hos mus som tilsvarer den humane autoimmune sykdom systemisk lupus erythematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Liganden for FAS-R synes å være celleoverflateassosiert molekyl båret av blant annet killer T celler (eller cytotoksisk T lymfocytter - CTL) og således når slike CTL kontaktceller som bærer FAS-R, er i stand til å indusere apoptisk celledød til FAS-R bærende celler. Videre har et monoklonalt antistoff blitt preparert som er spesifikt for FAS-R, dette monoklonale antistoffet er i stand til å indusere apoptopisk celledød i celler som bærer FAS-R, inkludert musceller transformert med cDNA som koder for humant FAS-R (Itoh et al., 1991). Another member of the TNF/NGF superfamily of receptors is the FAS receptor (FAS-R) which has also been called the Fas antigen, a cell surface protein expressed in various tissues and which shares homology with a number of cell surface receptors including TNF-R and NGF-R. FAS-R mediates cell death in the form of apoptosis (Itoh et al., 1991) and appears to serve as a negative selector for autoreactive T cells, i.e. during maturation of T cells, FAS-R mediates the apoptotic death of T cells that recognize self antigens. It has also been found that mutation in the FAS-R gene ( Ipr ) causes a lymphoproliferative disorder in mice corresponding to the human autoimmune disease systemic lupus erythematosus (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). The ligand for FAS-R appears to be a cell surface-associated molecule carried by, among other things, killer T cells (or cytotoxic T lymphocytes - CTL) and thus when such CTL contact cells that carry FAS-R, they are able to induce apoptotic cell death to FAS-R bearing cells. Furthermore, a monoclonal antibody has been prepared that is specific for FAS-R, this monoclonal antibody is able to induce apoptotic cell death in cells bearing FAS-R, including mouse cells transformed with cDNA encoding human FAS-R (Itoh et al ., 1991).

Det har også blitt funnet at forskjellige andre normale celler ved siden at T lymfocytter uttrykker FAS-R på deres overflate og kan bli avlivet ved utløsning av denne reseptoren. Ukontrollert indusering av en slik avlivingsprosess er mistenkt for å bidra til vevsskade i visse sykdommer, for eksempel destruksjon av leverceller ved akutt hepatitis. Følgelig kan funn av måter å tilbakeholde den cytotoksiske aktiviteten ved FAS-R ha terapeutisk potensial. It has also been found that various other normal cells besides T lymphocytes express FAS-R on their surface and can be killed by triggering this receptor. Uncontrolled induction of such a killing process is suspected of contributing to tissue damage in certain diseases, for example destruction of liver cells in acute hepatitis. Accordingly, finding ways to withhold the cytotoxic activity of FAS-R may have therapeutic potential.

I motsetning, da det har blitt funnet av visse maligne celler og HIV-infiserte celler bærer FAS-R på overflaten, kan antistoffer mot FAS-R eller FAS-R liganden bli forårsaket å utløse FAS-R medierte cytotoksiske effekter i disse cellene og derved gi et middel for bekjemping av slike maligne celler eller HIV-infiserte celler (se Itoh et al., 1991). Funnet av enda en måte å øke den cytotoksiske aktiviteten til FAS-R kan således ha terapeutisk potensial. In contrast, as it has been found that certain malignant cells and HIV-infected cells carry FAS-R on their surface, antibodies against FAS-R or the FAS-R ligand can be caused to trigger FAS-R mediated cytotoxic effects in these cells and thereby provide a means of combating such malignant cells or HIV-infected cells (see Itoh et al., 1991). The discovery of yet another way to increase the cytotoxic activity of FAS-R may thus have therapeutic potential.

Det har vært et lenge følt behov å fremskaffe en fremgangsmåte for modulering av den cellulære responsen ovenfor TNF (a eller B) og FAS-R liganden, for eksempel i patologiske situasjoner som nevnt ovenfor, hvor TNF eller FAS-R liganden blir overekspressert, er det ønskelig å hemme TNF- eller FAS-R ligandinduserte cytocidale effekter, mens i andre situasjoner, for eksempel sårhelingsanvendelser, er det ønskelig å øke TNF-effekten, eller i tilfellet av FAS-R er det i tumorceller eller HIV-infiserte celler ønskelig å øke den FAS-R medierte effekten. There has been a long-felt need to provide a method for modulating the cellular response to TNF (a or B) and the FAS-R ligand, for example in pathological situations as mentioned above, where TNF or the FAS-R ligand is overexpressed, it is desirable to inhibit TNF- or FAS-R ligand-induced cytocidal effects, while in other situations, for example wound healing applications, it is desirable to increase the TNF effect, or in the case of FAS-R it is desirable in tumor cells or HIV-infected cells to increase the FAS-R mediated effect.

Et antall tilnærminger har blitt gjort av oppfinnerne (se for eksempel europeiske søknader nr. 186833, EP 308378, EP 398327 og EP 412486) for å regulere de skadelige effektene til TNF ved å hemme bindingen av TNF til dets reseptorer ved anvendelse av anti-TNF antistoffer eller ved anvendelse av oppløselige TNF reseptorer (som er hovedsakelig på de oppløselige ekstracellulære områder av reseptorene) for å konkurrere med bindingen av TNF til de celleoverflatebundne TNT-R. Videre, på basis at TNF-bindingen til dets reseptorer er nødvendig for de TNF-induserte cellulæreffektene, har oppfinnerne gjort tilnærminger (se for eksempel EPO 568925) for å modulere TNF effekten ved å modulere aktiviteten til TNF-R. Kort angår EPO 568925 en fremgangsmåte for modulering av signaltransduksjon og/eller spaltingen i TNF-R hvorved peptider eller andre molekyler kan vekselvirke enten med reseptoren selv eller med effektorproteiner som vekselvirke med reseptoren, for således å modulere den normale funksjonen av TNF-R. I EPO 568925 er det beskrevet konstruksjoner og karakteriseringen av forskjellig mutant p55 TNF-R, som har mutasjoner i de ekstracellulære, transmembranale og intracellulære områder av p55 TNF-R. På denne måten blir regioner innenfor de ovenfomevnte områdene av p55 TNF-R identifisert å være essentielle for funksjonen av reseptoren, dvs. bindingen av liganden (TNF) og den påfølgende signaltransduksjon og intracellulær signalering som til sist resulterte i den observerte TNF-effekten på cellene. Videre er det også beskrevet et antall tilnærminger å isolere og identifisere proteiner, peptider eller andre faktorer som er i stand til å binde til forskjellige regioner i de ovenfomevnte områdene av TNF-R, hvis proteiner, peptider og andre faktorer kan være involvert i reguleringen eller moduleringen av aktiviteten av TNF-R. Et antall tilnærminger for isolering og kloning av DNA sekvenser som koder for slike proteiner og peptider; for konstruksjon av ekspresjonsvektorer for produksjon av disse proteiner og peptider, og for fremstillingen av antistoffer eller fragmenter derav som vekselvirker med TNF-R, eller med de ovenforstående proteinene og peptidene som binder forskjellige regioner av TNF-R, er også angitt i EPO 568925. Imidlertid er det ikke gjort noen beskrivelse i EPO 568925 på de faktiske proteinene og peptidene som binder til de intracellulære områdene av TNF-R (for eksempel p55 TNF-R), heller er det ikke gjort noen beskrivelse av gjær to-hybridtilnærmingen for å isolere og identifisere slike proteiner eller peptider som binder til de intracellulære områdene av TNF-R. Tilsvarende har det hittil ikke vært gjort noen beskrivelse av proteiner eller peptider som er i stand til å binde til det intracellulære området av FAS-R. A number of approaches have been made by the inventors (see for example European Applications No. 186833, EP 308378, EP 398327 and EP 412486) to regulate the harmful effects of TNF by inhibiting the binding of TNF to its receptors using anti-TNF antibodies or by using soluble TNF receptors (which are mainly on the soluble extracellular regions of the receptors) to compete with the binding of TNF to the cell surface bound TNT-R. Furthermore, on the basis that the TNF binding to its receptors is necessary for the TNF-induced cellular effects, the inventors have made approaches (see for example EPO 568925) to modulate the TNF effect by modulating the activity of TNF-R. Briefly, EPO 568925 relates to a method for modulating signal transduction and/or cleavage in TNF-R whereby peptides or other molecules can interact either with the receptor itself or with effector proteins that interact with the receptor, thus modulating the normal function of TNF-R. In EPO 568925, the constructions and the characterization of different mutant p55 TNF-R, which have mutations in the extracellular, transmembrane and intracellular regions of p55 TNF-R, are described. In this way, regions within the above-mentioned regions of the p55 TNF-R are identified to be essential for the function of the receptor, i.e. the binding of the ligand (TNF) and the subsequent signal transduction and intracellular signaling that ultimately resulted in the observed TNF effect on the cells . Furthermore, a number of approaches have also been described to isolate and identify proteins, peptides or other factors capable of binding to different regions in the above-mentioned regions of TNF-R, whose proteins, peptides and other factors may be involved in the regulation or the modulation of the activity of TNF-R. A number of approaches for the isolation and cloning of DNA sequences encoding such proteins and peptides; for the construction of expression vectors for the production of these proteins and peptides, and for the production of antibodies or fragments thereof that interact with TNF-R, or with the above proteins and peptides that bind different regions of TNF-R, are also indicated in EPO 568925. However, no description is made in EPO 568925 of the actual proteins and peptides that bind to the intracellular regions of TNF-R (eg p55 TNF-R), nor is there any description of the yeast two-hybrid approach to isolate and identifying such proteins or peptides that bind to the intracellular regions of TNF-R. Correspondingly, no description of proteins or peptides capable of binding to the intracellular region of FAS-R has so far been made.

JBC, Vol. 267, nr. 7, s. 4304 - 4307, 1992, foreslår at aggregering av p55 TNF reseptorens intracellulære domener, ved tilstedeværelsen av et ligand, er en viktig komponent i signalet for cellulær toksisitet. Det antydes imidlertid ikke at de intracellulære domenene binder i fraværet av ligand. JBC, Vol. 267, No. 7, pp. 4304-4307, 1992, suggests that aggregation of the p55 TNF receptor intracellular domains, in the presence of a ligand, is an important component of the cellular toxicity signal. However, it is not suggested that the intracellular domains bind in the absence of ligand.

EP 0510691 fremlegger DNA kodende for FAS. PNAS, Vo. 88, s. 2830 - 2834,1991, rapporterer om kloningen og ekspresjonen av cDNA av to distinkte murine TNF reseptorer og demonstrerer at en reseptor er artsspesifikk. EP 0510691 discloses DNA coding for FAS. PNAS, Vol. 88, pp. 2830-2834, 1991, reports the cloning and expression of cDNA of two distinct murine TNF receptors and demonstrates that one receptor is species specific.

Således, når det er ønskelig å hemme effekten av TNF eller FAS-R liganden, vil det være ønskelig å redusere mengden eller aktiviteten av TNF-R eller FAS-R på celleoverflaten, mens en økning av mengden eller aktiviteten av TNF-R eller FAS-R vil være ønskelig når en øket TNF eller FAS-R ligandeffekt er søkt. På denne siden har promotorene for både p55 TNF-R og p75 TNF-R nylig blitt sekvensert og analysert av foreliggende oppfinnere og et antall nøkkelsekvensmotiver har blitt funnet som er spesifikke for forskjellige transkripsjonsregulerende faktorer og som sådan kan ekspresjon av disse TNF-R bli kontrollert ved promotornivået, dvs. inhibering av transkripsjon fra promotorene for en reduksjon i antallet av reseptorer og en økning i transkripsjon fra promotorene for en økning i antallet reseptorer (se IL 104355 og IL 109633 og deres tilsvarende, foreløpig ikke publiserte EP og PCT motparter). Tilsvarende studier angående kontroll av FAS-R ved nivået av promotoren av FAS-R genet har enda ikke blitt rapportert. Thus, when it is desired to inhibit the effect of the TNF or FAS-R ligand, it will be desirable to reduce the amount or activity of TNF-R or FAS-R on the cell surface, while an increase in the amount or activity of TNF-R or FAS -R will be desirable when an increased TNF or FAS-R ligand effect is sought. In this regard, the promoters of both p55 TNF-R and p75 TNF-R have recently been sequenced and analyzed by the present inventors and a number of key sequence motifs have been found which are specific for various transcriptional regulatory factors and as such expression of these TNF-Rs can be controlled at the promoter level, i.e. inhibition of transcription from the promoters for a decrease in the number of receptors and an increase in transcription from the promoters for an increase in the number of receptors (see IL 104355 and IL 109633 and their corresponding, as yet unpublished EP and PCT counterparts). Corresponding studies regarding the control of FAS-R at the level of the promoter of the FAS-R gene have not yet been reported.

Videre må det også bli nevnt at mens det er kjent at tumornekrosefaktor (TNF) reseptorene og den strukturelt-relaterte reseptor FAS-R, utløser i celler etter stimulering av leukocytt-produserte ligander, destwktive aktiviteter som fører til deres egen død, er mekanismen av denne utløsningen enda dårlig forstått. Mutasjonsstudier indikerer at i FAS-R og p55 TNF reseptoren (p55-R) omfatter signalisering for cytotoksisk aktivitet distinkte regioner i deres intracellulære områder (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh og Nagata, 1993). Disse regionene ("dødsområder") har sekvenslikheter. "Dødsområdene" av både FAS-R og p55-R har tendens til selv-assosiering. Deres selv-assosiering fremmer tilsynelatende den reseptoraggregeringen som er nødvendig for initiering av signalisering (som angitt her nedenfor så vel som av Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al,. 1995) og ved høye nivåer av reseptorekspresjon kan dette resultere i utløsning av liganduavhengig signalisering (som beskrevet nedenfor og av Boldin et al., 1995). Furthermore, it must also be mentioned that while it is known that the tumor necrosis factor (TNF) receptors and the structurally-related receptor FAS-R, trigger in cells after stimulation by leukocyte-produced ligands, destwktive activities that lead to their own death, the mechanism of this release is still poorly understood. Mutational studies indicate that in FAS-R and the p55 TNF receptor (p55-R), signaling for cytotoxic activity involves distinct regions in their intracellular regions (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). These regions ("dead regions") have sequence similarities. The "dead zones" of both FAS-R and p55-R tend to self-associate. Their self-association apparently promotes the receptor aggregation necessary for the initiation of signaling (as noted here below as well as by Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995) and at high levels of receptor expression, this can result in the triggering of ligand-independent signaling (as described below and by Boldin et al., 1995).

Det er således ikke før foreliggende oppfinnelse blitt fremskaffet proteiner som kan avregulere effekten av ligandene som hører til TNF/NGF superfamilien, slik som TNF eller FAS-R ligandeffekten på celler ved mediering av intracellulær signaleringsprosess, hvilken signalering sannsynligvis er styrt til en stort grad av de intracellulære områder (IC) av reseptorer som hører til TNF/NGF superfamilien av reseptorer slik som de av TNF-R, dvs. p55 og p75 TNF-R intracellulære områder (henholdsvis p55IC og p75IC) så vel som FAS-IC. Thus, prior to the present invention, no proteins have been obtained that can deregulate the effect of the ligands belonging to the TNF/NGF superfamily, such as TNF or the FAS-R ligand effect on cells by mediating an intracellular signaling process, which signaling is probably controlled to a large extent by the intracellular domains (IC) of receptors belonging to the TNF/NGF superfamily of receptors such as those of TNF-R, i.e. p55 and p75 TNF-R intracellular domains (p55IC and p75IC, respectively) as well as FAS-IC.

Følgelig er det et mål ifølge oppfinnelsen å fremskaffe proteiner som er i stand til å binde til de intracellulære områdene av TNF-R og FAS-R, hvis proteiner for tiden er antatt å være involvert i den intracellulære signaleringsprosessen initiert ved binding av TNF til dets reseptorer, eller bindingen av FAS liganden til dens reseptor. Accordingly, it is an aim of the invention to provide proteins capable of binding to the intracellular regions of TNF-R and FAS-R, whose proteins are currently believed to be involved in the intracellular signaling process initiated by the binding of TNF to its receptors, or the binding of the FAS ligand to its receptor.

Et annet mål ifølge oppfinnelsen er å fremskaffe antagonister (for eksempel antistoffer) for disse intracellulære områdebindende proteiner (IC-bindeproteiner) som kan bli benyttet for å hemme signaleringsprosessen når ønskelig, når slike IC-bundede proteiner er positive signaleffekter (dvs. induserer signalisering), eller å øke signaliseringsprosessen når ønskelig, når slik IC-bindende proteiner er negative signaleffektorer (dvs. hemmer signalering). Another aim according to the invention is to provide antagonists (for example antibodies) for these intracellular region-binding proteins (IC-binding proteins) which can be used to inhibit the signaling process when desired, when such IC-bound proteins are positive signaling effects (i.e. induce signalling) , or to increase the signaling process when desired, when such IC-binding proteins are negative signaling effectors (ie, inhibit signaling).

Enda et mål med oppfinnelsen er anvendelsen av slike IC-bindende proteiner for å isolere og karakterisere ytterligere proteiner eller faktorer som eksempelvis kan være involvert videre nedstrøms i signaleringsprosessen, og/eller isolere eller identifisere andre reseptorer videre oppstrøms i signaleringsprosessen til hvilke disse IC-bindende proteinene binder (for eksempel andre TNF-R eller relaterte reseptorer) og således i hvis funksjon de IC-bindende proteinene også er involvert. Another aim of the invention is the use of such IC-binding proteins to isolate and characterize further proteins or factors that may for example be involved further downstream in the signaling process, and/or isolate or identify other receptors further upstream in the signaling process to which these IC-binding the proteins bind (for example other TNF-R or related receptors) and thus in whose function the IC-binding proteins are also involved.

Videre er et mål ved foreliggende oppfinnelse rettet mot anvendelsen av de ovenfomevnte IC-bindende proteinene som antigener for fremstillingen av polyklonale og/eller monoklonale antistoffer. Antistoffene kan igjen bli benyttet for rensing av de nye IC-bindende proteinene fra forskjellige kilder, slik som celleekstrakter eller transformerte cellelinjer. Furthermore, an aim of the present invention is directed towards the use of the above-mentioned IC-binding proteins as antigens for the production of polyclonal and/or monoclonal antibodies. The antibodies can again be used for purification of the new IC-binding proteins from different sources, such as cell extracts or transformed cell lines.

Videre kan disse antistoffene bli benyttet for diagnostiske formål, for eksempel for identifisering av forstyrrelser som er relatert til abnormal funksjon av cellulære effekter mediert av reseptorene som hører til TNF/NGF reseptorsuperfamilien. Furthermore, these antibodies can be used for diagnostic purposes, for example for the identification of disorders related to abnormal function of cellular effects mediated by the receptors belonging to the TNF/NGF receptor superfamily.

Et videre mål ved oppfinnelsen er å fremskaffe farmasøytiske sammensetninger omfattende de IC-bindende proteinene ovenfor og farmasøytiske sammensetninger omfattende antagonistene for IC-bindende proteinene, for behandlingen eller profylakse av TNF-indusert eller FAS ligandinduserte betingelser, for eksempel kan slike sammensetninger bli benyttet for å øke TNF eller FAS ligandeffekten eller å hemme TNF eller FAS ligandeffekten avhengig av den ovenfor angitte natur av det IC-bindende protein eller antagonisten derav inneholdt i sammensetningen. A further aim of the invention is to provide pharmaceutical compositions comprising the IC-binding proteins above and pharmaceutical compositions comprising the antagonists for the IC-binding proteins, for the treatment or prophylaxis of TNF-induced or FAS ligand-induced conditions, for example such compositions can be used to increasing the TNF or FAS ligand effect or inhibiting the TNF or FAS ligand effect depending on the above-mentioned nature of the IC-binding protein or antagonist thereof contained in the composition.

Videre, ifølge enda et mål ved oppfinnelsen, blir det beskrevet andre måter å eliminere eller antagonisere endogent dannet eller eksogent administrert TNF eller FAS-R ligand ved anvendelse av oppløselig oligomere TNF-R, oligomere FAS-R eller oligomerer som er en blanding av TNF-R og FASS-R. Hva dette angår, kan det nevnes at et forsøk i denne retning var isoleringen og rekombinant produksjon av et TNF-bindende protein kalt TBP-I som ble vist å være i stand til å antagonisere effektene av TNF. Denne antagonismen ble bestemt ved både måling av reduksjon av den cytotoksiske aktiviteten av TNF så vel som måling av interferensen av TNF binding til dets reseptorer (EP 308 378). TBP-I ble vist å beskytte celler fira TNF-toksisitet ved konsentrasjoner på noen få nanogram pr. ml og å interferere med bindingen av både TNF-a og TNF-fi til celler, når gitt samtidig med disse cytokinene. Videre undersøkelse av mekanismen ved hvilke TBP-I fungerer avslørte at TBP-I ikke vekselvirker med målcellen, men blokkerer heller funksjonen av TNF ved spesifikt å binde TNF, for således å konkurrere med TNF om TNF reseptoren. Furthermore, according to yet another object of the invention, other ways of eliminating or antagonizing endogenously formed or exogenously administered TNF or FAS-R ligand are described using soluble oligomeric TNF-R, oligomeric FAS-R or oligomers which are a mixture of TNF -R and FASS-R. In this regard, it may be mentioned that an attempt in this direction was the isolation and recombinant production of a TNF-binding protein called TBP-I which was shown to be able to antagonize the effects of TNF. This antagonism was determined by both measuring the reduction of the cytotoxic activity of TNF as well as measuring the interference of TNF binding to its receptors (EP 308 378). TBP-I was shown to protect cells from TNF toxicity at concentrations of a few nanograms per ml and to interfere with the binding of both TNF-a and TNF-fi to cells, when given simultaneously with these cytokines. Further investigation of the mechanism by which TBP-I works revealed that TBP-I does not interact with the target cell, but rather blocks the function of TNF by specifically binding TNF, thus competing with TNF for the TNF receptor.

Følgelig, med en annen renseteknikk ble nærværet av to aktive komponenter funnet: en, TBP-I, og et andre TNF-bindende protein som ble kalt TBP-II (først beskrevet i EP 398327). Begge proteinene gir beskyttelse mot in vitro cytocidal effekt av TNF og begge binder TNF-B mindre effektivt enn TNF-a. Selvom ifølge SDS P AGE analyse de to proteinene, TBP-I og TBP-II, synes å ha en meget tilsvarende molekylvekt, kan de klart bli adskilt fra hverandre ved mangel av immunologisk kryssreaktivitet, forskjellige N-terminale aminosyresekvenser og forskjellig armnosyresammensetning. Accordingly, with another purification technique, the presence of two active components was found: one, TBP-I, and a second TNF-binding protein called TBP-II (first described in EP 398327). Both proteins provide protection against the in vitro cytocidal effect of TNF and both bind TNF-B less efficiently than TNF-a. Although according to SDS PAGE analysis the two proteins, TBP-I and TBP-II, appear to have a very similar molecular weight, they can be clearly separated from each other by a lack of immunological cross-reactivity, different N-terminal amino acid sequences and different armnoic acid composition.

Imidlertid, de ovenfor tidligere nevnte oppløselige TNF bindende proteinene er monomere og er i stand til å binde kun en monomer av TNF homotrimeren, den naturlige liganden som fremdeles tillater TNF aktivitet (dvs. ufullstendig nøytralisering) av TNF enda to aktive monomerer ubundet til TNF bindende proteiner. Videre har det hittil ikke vært beskrevet oppløselige FAS-R (oppløselig FAS-R ligandbindende proteiner) som er i stand til å binde FAS-R ligand som er kjent å være et homotrimert, celleoverflateforbundet molekyl. However, the aforementioned soluble TNF binding proteins are monomeric and are able to bind only one monomer of the TNF homotrimer, the natural ligand that still allows TNF activity (ie incomplete neutralization) of TNF even two active monomers unbound to TNF binding proteins. Furthermore, soluble FAS-R (soluble FAS-R ligand-binding proteins) capable of binding FAS-R ligand, which is known to be a homotrimeric, cell surface-associated molecule, has not been described to date.

Et såkalt "dødsområde" av p55-IC (Tartaglia et al., 1993) har blitt beskrevet, men viste ikke, som ved foreliggende oppfinnelse, at p55-IC og "dødsområdet" av denne selv-assosierer, hvor denne selv-assosieringen er primært ansvarlig for signaleringen som fører til induksjon av cellecytotoksis. Videre er denne publikasjonen taus om muligheten for produksjon av oppløselige, oligomere TNF-R, eller oppløselig, oligomer Fas-R, eller blandede oligomerer derav, dessuten beskriver den ikke andre TNF-forbundne effekter indusert ved p55-IC eller deler derav, for eksempel EL-8 genekspresjoninduksjon, som alle er beskrevet i den foreliggende oppfinnelse. Likeledes beskriver en annen publikasjon, publisert etter prioritetsdatoen for foreliggende oppfinnelse, aggregeringen (dvs. selv-assosieringen) evnen til p55-IC, men angår ikke, som angitt ovenfor, anvndelsen av dette for å fremstille oppløselige, oligomere TNF-R eller Fas-R eller andre TNF-assosierte effekter indusert på en liganduavhengig måte ved p55-IC eller deler derav ifølge oppfinnelsen. A so-called "dead zone" of p55-IC (Tartaglia et al., 1993) has been described, but did not show, as in the present invention, that p55-IC and the "dead zone" of this self-associate, where this self-association is primarily responsible for the signaling that leads to the induction of cell cytotoxicity. Furthermore, this publication is silent on the possibility of production of soluble, oligomeric TNF-R, or soluble, oligomeric Fas-R, or mixed oligomers thereof, moreover, it does not describe other TNF-related effects induced by p55-IC or parts thereof, e.g. EL-8 gene expression induction, all of which are described in the present invention. Likewise, another publication, published after the priority date of the present invention, describes the aggregation (i.e., self-association) ability of p55-IC, but does not, as noted above, relate to the use thereof to produce soluble, oligomeric TNF-R or Fas- R or other TNF-associated effects induced in a ligand-independent manner by p55-IC or parts thereof according to the invention.

O ppsummering av oppfinnelsen Summary of the invention

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet nye proteiner som er i stand til binding til enten det intracellulære området av p55 NTF-R (de p55IC-bindende proteinene) av p75 NTF-R (de p75IC-bindende proteinene) og FAS-R (de FAS-IC-bindende proteinene). Disse p55IC-, p75IC- og FAS-IC-bindende proteinene kan virke som mediatorer eller modulatorer for TNF eller FAS-R ligandaktiviteten på celler ved hjelp av mediering eller modulering av intracellulær signaleringsprosess som vanligvis opptrer etter binding av TNF til p55 og/eller p75 TNF-R, eller bindingen av FAS-R ligand til celleoverflaten. Videre er det overraskende og uventet funnet at p55IC og FAS-IC er i stand til selv-assosiering og at fragmentene av p55IC og FAS-IC er tilsvarende i stand til bindingen til p55 IC, spesielt de såkalte "dødsområder" (DD) i IC av disse reseptorene, dvs. p55DD og FAS-DD. Således representerer p55 IC og FAS-IC og deres fragmenter også proteiner som er i stand til binding til p55IC og FAS-IC og kan således være modulatorer for TNF eller FAS-R ligandaktiviteten på celler. According to the present invention, new proteins have been found which are capable of binding to either the intracellular region of p55 NTF-R (the p55IC-binding proteins) of p75 NTF-R (the p75IC-binding proteins) and FAS-R (the FAS -the IC-binding proteins). These p55IC, p75IC and FAS-IC binding proteins may act as mediators or modulators of TNF or FAS-R ligand activity on cells by mediating or modulating intracellular signaling processes that normally occur after binding of TNF to p55 and/or p75 TNF-R, or the binding of FAS-R ligand to the cell surface. Furthermore, it has been surprisingly and unexpectedly found that p55IC and FAS-IC are capable of self-association and that the fragments of p55IC and FAS-IC are similarly capable of binding to p55 IC, especially the so-called "death domains" (DD) in the IC of these receptors, i.e. p55DD and FAS-DD. Thus, p55 IC and FAS-IC and their fragments also represent proteins capable of binding to p55IC and FAS-IC and can thus be modulators of TNF or FAS-R ligand activity on cells.

Videre har naturen til bindingen av et av de nye proteinene ifølge oppfinnelsen, heretter betegnet 55.11 protein, til det intracellulære området av p55-TNF-R, blitt mer fullstendig forklart (se eksempel 1). Furthermore, the nature of the binding of one of the new proteins according to the invention, hereafter designated 55.11 protein, to the intracellular region of p55-TNF-R, has been more fully explained (see example 1).

Videre, ifølge et annet aspekt, er foreliggende oppfinnelse basert på det funn at det intracellulære området av p55 TNF reseptoren (p55-IC), en region inneholdt deri, det såkalte p55-IC "dødsområdet11, det intracellulære området av Fas/APOI reseptoren (Fas-IC), og en region inneholdt deri, det såkalte Fas-IC "dødsområdet" er i stand til selv-assosiering. Følgelig er det mulig å konstruere ved standard rekombinante DNA teknikker en oppløselig oligomer TNF reseptor som er et fusjonsprodukt inneholdende minst to ekstracellulære områder av en TNF reseptor på dets ene ende, og på den andre enden minst to av de ovenfor angitte selv-assosierende intracellulære områdene eller porsjonene derav som selv-assosierer for å gi en oligomer som har minst to slike fusjonsprodukter bundet sammen. Et slikt oppløselig, oligomert TNF-R er således i stand til binding av to monomeer av naturlig forekommende TNF homotrimer, og er som sådan effektiv i nøytralisering av TNF aktivitet. Nøytraliseringen av TNF aktiviteten er ønskelig i alle de ovenfor nevnte tilstandene hvor TNF blir overprodusert endogent eller blir administrert eksogent i høye doser for å resultere i uønskede bivirkninger. Videre kan den effektive bindingen av TNF av oppløselige oligomere reseptorer ifølge oppfinnelsen også tjene til å tillate binding av eksogent tilsatt TNF og dets påfølgende ønskede sakte frigiving i tilstander hvor TNF blir administrert for dets fordelaktige effekter, for eksempel ved tumorterapi. Likeledes er det også mulig å konstruere standard rekombinante DNA teknikker et oligomert FAS-R som er et fusjonsprodukt inneholdende minst to ekstracellulære områder av et FAS-R ved dets ene ende og ved dets andre ende minst to av de ovenfor nevnte selv-assosierte intracellulære områdene eller porsjoner derav som selv-assosierer for å gi en oligomer som har minst to slike fusjonsprodukter bundet sammen. Et slikt oligomert FAS-R er således i stand til å binde to monomerer av naturlig forekommende FAS-R ligandhomotrimer, og som sådan nøytraliserer effektivt FAS-R ligandaktiviteten. Nøytraliseringen av FAS-R hgandaktiviteten er ønskelig i alle av de ovenfor nevnte tilstandene hvor overskuddsmengder derav er forbundet med uønskede sideeffekter. På tilsvarende måte og i lys av nylige rapporter som indikerer en mulig assosiering mellom TNF og FAS-R ligandinduserte effekter på celler og således også en mulig assosiering, geografisk på celleoverflaten hvor de binder til sine reseptorer, er det også mulig å konstruere ved standard rekombinante DNA teknikker en blandet oligomer reseptor som har spesifitet for både TNF og FAS-R ligand. En slik blandet oligomer vil være en blanding av de ovenfor angitte fusjonsproduktene inneholdende minst et ekstracellulært område av en TNF-R og minst et ekstracellulært område av en FAS-R ved dets ene ende, og ved dets andre ende minst to av de ovenfor nevnte selv-assosierende intracellulære områdene eller porsjoner derav som selv-assosierer for å gi en blandet oligomer som har minst to slike fusjonsprodukter bundet sammen. En slikt blandet oligomer er således i stand til å binde minst en monomer av TNF og en monomer av FAS-R ligand samtidig for derved å redusere eller effektivt nøytralisere TNF og FAS-R ligandaktivitetene ved celleoverflaten i betingelser som angitt ovenfor hvor overskuddsmengder av disse to cytokinene er forbundet med de uønskede cellulæreffekter. Som angitt ovenfor, er FAS-R liganden vanligvis celleoverflate-assosiert og nylige rapporter beskriver også celleoverflate-assosierte former av TNF. Disse blandede TNF-R/FAS-R oligomerene er således spesielt anvendelige for nøytralisering av TNF og FAS-R ligandaktiviteter på celleoverflaten. Furthermore, according to another aspect, the present invention is based on the finding that the intracellular region of the p55 TNF receptor (p55-IC), a region contained therein, the so-called p55-IC "death region11, the intracellular region of the Fas/APOI receptor ( Fas-IC), and a region contained therein, the so-called Fas-IC "death region" is capable of self-association. Accordingly, it is possible to construct by standard recombinant DNA techniques a soluble oligomeric TNF receptor which is a fusion product containing at least two extracellular regions of a TNF receptor at one end thereof, and at the other end at least two of the above self-associating intracellular regions or portions thereof that self-associate to give an oligomer having at least two such fusion products bound together. Such soluble, oligomeric TNF-R is thus capable of binding two monomers of naturally occurring TNF homotrimers, and as such is effective in neutralizing TNF activity. tivity is desirable in all of the above-mentioned conditions where TNF is overproduced endogenously or is administered exogenously in high doses to result in unwanted side effects. Furthermore, the effective binding of TNF by soluble oligomeric receptors according to the invention may also serve to allow binding of exogenously added TNF and its subsequent desired slow release in conditions where TNF is administered for its beneficial effects, for example in tumor therapy. Likewise, it is also possible to construct standard recombinant DNA techniques an oligomeric FAS-R which is a fusion product containing at least two extracellular regions of a FAS-R at its one end and at its other end at least two of the above-mentioned self-associated intracellular regions or portions thereof that self-associate to give an oligomer having at least two such fusion products bound together. Such an oligomeric FAS-R is thus capable of binding two monomers of naturally occurring FAS-R ligand homotrimers, and as such effectively neutralizes FAS-R ligand activity. The neutralization of the FAS-R hgand activity is desirable in all of the above-mentioned conditions where excess amounts thereof are associated with undesirable side effects. In a similar way and in light of recent reports that indicate a possible association between TNF and FAS-R ligand-induced effects on cells and thus also a possible association, geographically on the cell surface where they bind to their receptors, it is also possible to construct by standard recombinant DNA techniques a mixed oligomeric receptor that has specificity for both TNF and FAS-R ligand. Such a mixed oligomer will be a mixture of the above-mentioned fusion products containing at least one extracellular region of a TNF-R and at least one extracellular region of a FAS-R at its one end, and at its other end at least two of the aforementioned themselves -associating intracellular regions or portions thereof which self-associate to give a mixed oligomer having at least two such fusion products bound together. Such a mixed oligomer is thus capable of binding at least one monomer of TNF and one monomer of FAS-R ligand at the same time to thereby reduce or effectively neutralize the TNF and FAS-R ligand activities at the cell surface in conditions as stated above where excess amounts of these two the cytokines are associated with the unwanted cellular effects. As noted above, the FAS-R ligand is usually cell surface-associated and recent reports also describe cell surface-associated forms of TNF. These mixed TNF-R/FAS-R oligomers are thus particularly useful for neutralizing TNF and FAS-R ligand activities on the cell surface.

Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse en DNA sekvens som koder for et protein som er i stand til å binde ett eller flere av de intracellulære områdene av en eller flere reseptorer som tilhører tumornekrosefaktor/nervevekstfaktor (TNF/NGF) superfamilien av reseptorer. Consequently, the present invention provides a DNA sequence that codes for a protein capable of binding one or more of the intracellular regions of one or more receptors belonging to the tumor necrosis factor/nerve growth factor (TNF/NGF) superfamily of receptors.

Spesielt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en DNA sekvens valgt blant gruppen omfattende: (a) en cDNA sekvens avledet fra den kodende regionen av et nativt TNF-R In particular, the present invention provides a DNA sequence selected from the group comprising: (a) a cDNA sequence derived from the coding region of a native TNF-R

intracellulært områdebindende protein; intracellular domain binding protein;

(b) DNA sekvenser osm er i stand til hybridisering til et DNA av (a) under moderat stringente betingelser og som koder for et biologisk aktivt TNF-R intracellulært (b) DNA sequences osm are capable of hybridization to a DNA of (a) under moderately stringent conditions and which encodes a biologically active TNF-R intracellularly

områdebindende protein, og domain-binding protein, and

(c) DNA sekvenser som er degenerert som et resultat av den genetiske koden til DNA sekvensene definert i (a) og (b) og som koder for et biologiskt aktivt TNF-R intracellulære områdebindende protein. (c) DNA sequences which are degenerate as a result of the genetic code of the DNA sequences defined in (a) and (b) and which encode a biologically active TNF-R intracellular domain binding protein.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en DNA sekvens valgt blant gruppen omfattende: (a) en cDNA sekvens avledet fra den kodende regionen av et nativt FAS-R The present invention also provides a DNA sequence selected from the group comprising: (a) a cDNA sequence derived from the coding region of a native FAS-R

intracellulært områdebindende protein; intracellular domain binding protein;

(b) DNA sekvenser som er i stand til hybridisering til en cDNA av (a) under moderat stringente betingelser og som koder for et biologisk aktivt FAS-R (b) DNA sequences capable of hybridization to a cDNA of (a) under moderately stringent conditions and which encode a biologically active FAS-R

intracellulært områdebindende protein; og intracellular domain binding protein; and

(c) DNA sekvenser som er degenerert som et resultat av den genetiske koden til DNA sekvenser definert i (a) og (b) og som koder for et biologisk aktivt FAS-R intracellulært områdebindende protein. (c) DNA sequences which are degenerate as a result of the genetic code of DNA sequences defined in (a) and (b) and which encode a biologically active FAS-R intracellular domain binding protein.

I utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse koder DNA sekvensene for p55 TNF-R, p75 TNF-R og FAS-R intracellulært områdebindende proteiner, slik som de som koder for de her betegnede proteinene 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 og DD11. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også et protein eller analoger eller derivater derav som er kodet ved hvilke som helst av de ovenfor nevnte sekvensene ifølge oppfinnelsen, hvor nevnte proteiner, analoger og derivater er i stand til å binde til en eller flere av de intracellulære områdene av ett eller flere TNF-R eller FAS-R. Utførelsesformer av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter de her betegnede proteinene 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 og DD11, deres analoger og deres derivater. In embodiments of the present invention, the DNA sequences encode p55 TNF-R, p75 TNF-R and FAS-R intracellular domain binding proteins, such as those encoding the herein designated proteins 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 and DD11. The present invention also provides a protein or analogues or derivatives thereof which are encoded by any of the above-mentioned sequences according to the invention, where said proteins, analogues and derivatives are capable of binding to one or more of the intracellular regions of one or more TNF-R or FAS-R. Embodiments of this aspect of the invention include the herein designated proteins 55.1, 55.3, 55.11, 75.3, 75.16, F2, F9 and DD11, their analogs and their derivatives.

Det blir også ved foreliggende oppfinnelse fremskaffet vektorer som koder for de ovenfor nevnte proteinene ifølge oppfinnelsen som inneholder den DNA sekvensene ovenfor ifølge oppfinnelsen, hvor disse vektorene er i stand til å bli uttrykt i passende eukaryote eller prokaryote vertsceller; transformerte eukaryote eller prokaryote celler inneholdende slike vektorer, og en fremgangsmåte for fremstilling av slike proteiner, analoger eller derivater ifølge oppfinnelsen ved dyrking av slike transformerte vertceller under betingelser som passer for ekspresjonen av nevnte protein, analoger eller derivater, utførelse av post-translasjonell modifikasjon av nevnte protein som nødvendig for oppnåelse av nevnte protein og ekstrahering av nevnte uttrykte proteinanaloger eller derivater fra det cellulære medium av nevnte transformerte celler eller fra celleekstrakter av nevnte transformerte celler. The present invention also provides vectors that code for the above-mentioned proteins according to the invention which contain the DNA sequences above according to the invention, where these vectors are capable of being expressed in suitable eukaryotic or prokaryotic host cells; transformed eukaryotic or prokaryotic cells containing such vectors, and a method for producing such proteins, analogues or derivatives according to the invention by culturing such transformed host cells under conditions suitable for the expression of said protein, analogues or derivatives, carrying out post-translational modification of said protein as necessary for obtaining said protein and extracting said expressed protein analogues or derivatives from the cellular medium of said transformed cells or from cell extracts of said transformed cells.

Oppfinnelsen muliggjør også antistoffer eller aktive derivater eller fragmenter derav som er spesifikke for proteinene, analogene eller derivater derav ifølge oppfinnelsen. The invention also enables antibodies or active derivatives or fragments thereof which are specific for the proteins, analogues or derivatives thereof according to the invention.

Oppfinnelsen muliggjør også forskjellige anvendelser av de ovenfor nevnte DNA sekvenser eller proteinene som de koder ifølge oppfifnnelsen, hvis anvendelser blant annet omfatter: (i) en fremgangsmåte for modulering av TNF eller FAS-R ligandeffekt på celler som bærer et TNF-R eller et FAS-R, omfattende behandling av nevnte celler med ett eller flere proteiner, analoger eller derivater valgt fra gruppen omfattende proteiner, analoger og derivater ifølge oppfinnelsen, og et protein som er p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD analoger eller derivater derav, alle av hvilke proteiner er i stand til å binde til det intracellulære området og modulere aktiviteten av nevnte TNF-R eller FAS-R, hvor nevnte behandling av cellene omfatter innføring av nevnte celler nevnte ett eller flere proteiner, analoger eller derivater i en form passende for intracellulær administrasjon eller innføring i nevnte celler i form av en passende ekspresjonsvektor, DNA sekvensen som koder for nevnte ene eller flere proteiner, analoger eller derivater; (ii) en fremgangsmåte for modulering av TNF eller FAS-R ligandeffekt på celler som bærer en TNF-R eller en FAS-R omfattende behandling av nevnte celler med antistoffer eller aktive derivater eller fragmenter derav ifølge oppfinnelsen; (iii) en fremgangsmåte for modulering av TNF eller FAS-R ligandeffekten på celler som bærer en TNF-R eller FAS-R omfattende behandling av nevnte celler med en oligonukleotidsekvens som koder for en antisenssekvens av minst en del av sekvensen ifølge oppfinnelsen, eller koder for en antisekvens av p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD sekvensen, hvor nevnte oligonukleotidsekvens er i stand til å blokkere ekspresjon av minst en av de TNF-R eller FAS-R intracellulære områdebindende proteinene; (iv) en fremgangsmåte for modulering av TNF eller FAS-R ligandaktiviteten på celler som bærer en TNF-R eller FAS-R omfattende: (a) konstruering av en rekombinant animalsk virusvektor som bærer en sekvens som koder for et viralt overflateprotein som er i stand til å binde til en spesifikk celleoverflatereseptor og en sekvens valgt blant en oligonukleotdsekvens som koder for en antisenssekvens av i det minste en del av sekvensen ifølge oppfinnelsen og en oligonukleotid sekvens som koder for en antisenssekvens av p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD sekvensen, hvor nevnte oligonukleotidsekvens er i stand til å blokkere ekspresjonen av minst et av TNF-R eller FAS-R intracellulært områdebindende proteiner når det blir innført i nevnte celler ved nevnte virus; og The invention also enables various applications of the above-mentioned DNA sequences or the proteins they encode according to the invention, whose applications include among others: (i) a method for modulating TNF or FAS-R ligand effect on cells carrying a TNF-R or a FAS -R, comprehensive treatment of said cells with one or more proteins, analogues or derivatives selected from the group comprising proteins, analogues and derivatives according to the invention, and a protein which is p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD analogues or derivatives thereof, all of which proteins are capable of binding to the intracellular area and modulating the activity of said TNF-R or FAS-R, wherein said treatment of the cells comprises introducing into said cells said one or more proteins, analogues or derivatives in a form suitable for intracellular administration or introduction into said cells in the form of a suitable expression vector, the DNA sequence that codes for said one or more proteins ner, analogues or derivatives; (ii) a method for modulating TNF or FAS-R ligand effect on cells carrying a TNF-R or a FAS-R comprising treatment of said cells with antibodies or active derivatives or fragments thereof according to the invention; (iii) a method for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells carrying a TNF-R or FAS-R comprising treating said cells with an oligonucleotide sequence that codes for an antisense sequence of at least part of the sequence according to the invention, or codes for an antisequence of the p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD sequence, where said oligonucleotide sequence is able to block expression of at least one of the TNF-R or FAS-R intracellular domain binding proteins; (iv) a method for modulating the TNF or FAS-R ligand activity on cells bearing a TNF-R or FAS-R comprising: (a) constructing a recombinant animal virus vector carrying a sequence encoding a viral surface protein that is in capable of binding to a specific cell surface receptor and a sequence selected from among an oligonucleotide sequence encoding an antisense sequence of at least part of the sequence according to the invention and an oligonucleotide sequence encoding an antisense sequence of p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS- the DD sequence, where said oligonucleotide sequence is capable of blocking the expression of at least one of TNF-R or FAS-R intracellular domain-binding proteins when it is introduced into said cells by said virus; and

(b) infisere nevnte celler med nevnte vektor av (a), (b) infecting said cells with said vector of (a);

(v) en fremgangsmåte for modulering av TNF eller FAS-R ligandeffekten på celler som bærer TNF-R eller FAS-R, omfattende behandling av nevnte celler med en passende vektor som koder for et ribozym som har en sekvens spesifikk for en sekvens valgt blant en mRNA sekvens som koder for et protein, en analog eller et derivat ifølge oppfinnelsen og en mRNA sekvens som koder for et protein, en analog eller et derivat derav ifølge oppfinnelsen og en mRNA sekvens som koder for p5IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, hvor nevnte ribozymsekvens er i stand til å vekselvirke med nevnte mRNA sekvens og i stand til å spalte nevnte mRNA sekvens for å resultere i hemming av ekspresjonen av proteinet, analogen eller derivatet ifølge opprinnelsen eller av ekspresjonen av p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, (v) a method of modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells bearing TNF-R or FAS-R, comprising treating said cells with a suitable vector encoding a ribozyme having a sequence specific for a sequence selected from an mRNA sequence that codes for a protein, an analog or a derivative according to the invention and an mRNA sequence that codes for a protein, an analog or a derivative thereof according to the invention and an mRNA sequence that codes for p5IC, p55DD, FAS-IC or FAS -DD, where said ribozyme sequence is capable of interacting with said mRNA sequence and capable of cleaving said mRNA sequence to result in inhibition of the expression of the protein, analog or derivative according to origin or of the expression of p55IC, p55DD, FAS- IC or FAS-DD,

(vi) en fremgangsmåte for behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler eller andre syke celler, omfattende: (a) konstruering av en rekombinant animalsk virusvektor bærende en sekvens kodende for et viralt overflateprotein som er i stand til å binde til en tumorcelleoverflatereseptor eller HIV-infisert celleoverflatereseptor eller i stand til å binde til en annen celleoverflatereseptor på andre syke celler og en sekvens valgt blant en sekvens ifølge oppfinnelsen som koder for et protein, en analog eller et derivat ifølge oppfinnelsen og en sekvens som koder for p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD eller en biologisk aktiv analog eller derivat derav, hvor nevnte protein, analog eller derivat ifølge oppfinnelsen, p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, analog eller derivat, når uttrykt i nevnte tumorcelle eller HIV-infisert celle eller annen syk celle, i stand til å avlive nevnte celle; og (b) infisere nevnte tumorceller eller HIV-infiserte celler eller andre infiserte celler med nevnte vektor ifølge (a), (vii) en fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner, faktorer eller reseptorer som er i stand til binding til de intracellulære områdebindende proteinene ifølge oppfinnelsen, omfattende anvendelse av prosedyren for affinitetskromatografi hvor nevnte protein ifølge oppfinnelsen blir forbundet til den afflnitetskromatografiske matriks, nevnte forbundne protein blir brakt i kontakt med et celleektrakt og proteiner, faktorer eller reseptorer fra celleektraktet som binder til nevnte forbundne protein blir så eluert, isolert og analysert; (viii) en fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner som er i stand til å binde til de intracellulære områdebindende proteinene ifølge oppfinnelsen, omfattende anvendelse av gjær to-hybridprosedyren hvor en sekvens som koder for nevnte intracellulære områdebindende protein blir utført ved en hybridvektor og en sekvens fra et cDNA eller genomisk DNA bibliotek blir utført ved den andre hybridvektor, vektorene blir så benyttet for å transformere gjær vertceller og de positive transformerte cellene blir isolert, fulgt av ekstrahering av nevnte andre hybridvektor for å oppnå en sekvens som koder for et protein som binder til nevnte intracellulære områdebindende protein; og (vi) a method for treating tumor cells or HIV-infected cells or other diseased cells, comprising: (a) constructing a recombinant animal virus vector carrying a sequence encoding a viral surface protein capable of binding to a tumor cell surface receptor or HIV -infected cell surface receptor or capable of binding to another cell surface receptor on other diseased cells and a sequence selected from among a sequence according to the invention which codes for a protein, an analog or a derivative according to the invention and a sequence which codes for p55IC, p55DD, FAS -IC, FAS-DD or a biologically active analogue or derivative thereof, where said protein, analogue or derivative according to the invention, p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, analogue or derivative, when expressed in said tumor cell or HIV-infected cell or other diseased cell, capable of killing said cell; and (b) infecting said tumor cells or HIV-infected cells or other infected cells with said vector according to (a), (vii) a method for isolating and identifying proteins, factors or receptors capable of binding to the intracellular domain-binding proteins according to the invention, comprehensive application of the procedure for affinity chromatography where said protein according to the invention is connected to the affinity chromatographic matrix, said connected protein is brought into contact with a cell extract and proteins, factors or receptors from the cell extract that bind to said connected protein are then eluted, isolated and analyzed; (viii) a method for isolating and identifying proteins capable of binding to the intracellular domain-binding proteins according to the invention, comprising the use of the yeast two-hybrid procedure where a sequence coding for said intracellular domain-binding protein is carried out by a hybrid vector and a sequence from a cDNA or genomic DNA library is carried out by the second hybrid vector, the vectors are then used to transform yeast host cells and the positive transformed cells are isolated, followed by extraction of said second hybrid vector to obtain a sequence encoding a protein which binds to said intracellular domain binding protein; and

(ix) en fremgangsmåte for isolering og identifisering av et protein som er i stand til å (ix) a method for isolating and identifying a protein capable of

binde til de intracellulære områdene av TNF-R eller FAS-R omfattende anvendelse av prosedyren for ikke-stringent sør-hybirdisering fulgt av PCR-kloning, i hvilken en sekvens eller del derav ifølge oppfinnelsen blir benyttet-som en probe for å binde sekvenser fra et cDNA elelr genomisk DNA bibliotek som i det minste har delvis homologi til dette, hvor nevnte bundne sekvenser så blir forsterket og klonet ved PCR prosedyren for å gi kloner som koder for proteiner som har i det minste delvis homologi til nevnte sekvenser ifølge oppfinnelsen. bind to the intracellular regions of TNF-R or FAS-R comprising application of the procedure of non-stringent southern hybridization followed by PCR cloning, in which a sequence or part thereof according to the invention is used-as a probe to bind sequences from a cDNA or genomic DNA library that has at least partial homology to this, where said bound sequences are then amplified and cloned by the PCR procedure to give clones that code for proteins that have at least partial homology to said sequences according to the invention.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF- eller FAS-ligandeffekten på celler omfattende, som aktiv ingrediens, en hvilken som helst av de følgende: (i) et protein ifølge oppfinnelsen, eller proteinet p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, dets biologisk aktive fragmenter, analoger, derivater eller blandinger derav; (ii) en rekombinant animalsk virusvektor kodende for et viralt overflateprotein som er i stand til å binde til en TNF-R eller FAS-R bærende celle, eller tumorcellespesifikk reseptor, og en sekvens som koder for et protein, en analog eller et derivat ifølge oppfinnelse eller koder for p55IC, p55ID, FAS-IC eller FAS-DD; (iii) en rekombinant animalsk virusvektor kodende for et viralt overflateprotein som i (ii) ovenfor og en oligonukleotidsekvens kodende for en antisenssekvens av p55IC, p55ID, FAS-IC eller FAS-DD sekvens; og (iv) en vektor kodende for et ribozym av sekvens som er i stand til å vekselvirke med en mRNA sekvens som koder for et protein, en analog eller et derivat ifølge oppfinnelsen eller en mRNA sekvens som koder for p55IC, p55DD, FAS-IC eller The present invention also provides a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS ligand effect on cells comprising, as active ingredient, any of the following: (i) a protein according to the invention, or the protein p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, its biologically active fragments, analogues, derivatives or mixtures thereof; (ii) a recombinant animal virus vector encoding a viral surface protein capable of binding to a TNF-R or FAS-R bearing cell, or tumor cell-specific receptor, and a sequence encoding a protein, an analog or a derivative according to invention or codes for p55IC, p55ID, FAS-IC or FAS-DD; (iii) a recombinant animal virus vector encoding a viral surface protein as in (ii) above and an oligonucleotide sequence encoding an antisense sequence of p55IC, p55ID, FAS-IC or FAS-DD sequence; and (iv) a vector encoding a ribozyme of sequence capable of interacting with an mRNA sequence encoding a protein, an analog or a derivative according to the invention or an mRNA sequence encoding p55IC, p55DD, FAS-IC or

FAS-DD. FAS-DD.

Oppfinnelsen muliggjør dermed anvendelsen av p55IC eller DNA som koder derfor. Dette er basert på oppdagelsen av et p55-IC kan på en ligand (TNF)-uavhengig måte indusere andre TNF-assosierte effekter i celler. Følgelig muliggjøres en fremgangsmåte for indusering av TNF-assosierte effekter i celler eller vev omfattnde behandling av nevnte celler med ett eller flere proteiner, analoger eller derivater derav, hvor nevnte ett eller flere proteiner valgt blant et protein som er hovedsakelig hele det selv-assosierende intracellulære området av p55 TNF-R (p55-IC) eller porsjoner derav som er i stand til å selv-assosiere og indusere, på en ligand (TNF)-uavhengig måte, nevnte TNF effekt i cellene, hvor nevnte behandling av cellene omfatter introdusering i nevnte celler av ett eller flere proteiner, analoger eller derivater i en form som passer for intracellulær introduksjon derav, eller innføring i nevnte celler en DNA sekvens som koder for nevnte ett eller flere proteiner, analoger eller derivater derav i form av en passende vektor som bærer nevnte sekvens, hvor nevnte vektor er i stand til å effekturere innsetting av nevnte sekvens i nevnte celler på en måte som gjør at nevnte sekvens blir uttrykt i cellene. The invention thus enables the use of p55IC or DNA encoding it. This is based on the discovery that a p55-IC can in a ligand (TNF)-independent manner induce other TNF-associated effects in cells. Accordingly, a method for inducing TNF-associated effects in cells or tissues is enabled, comprising treating said cells with one or more proteins, analogues or derivatives thereof, wherein said one or more proteins are selected from a protein which is essentially the entire self-associating intracellular the region of p55 TNF-R (p55-IC) or portions thereof which are capable of self-associating and inducing, in a ligand (TNF)-independent manner, said TNF effect in the cells, where said treatment of the cells comprises introduction into said cells of one or more proteins, analogues or derivatives in a form suitable for intracellular introduction thereof, or introduction into said cells of a DNA sequence that codes for said one or more proteins, analogues or derivatives thereof in the form of a suitable vector carrying said sequence, where said vector is able to effect insertion of said sequence into said cells in a way that causes said sequence to be expressed in the cells.

Utførelsesformer av metoden ovenfor omfatter: Embodiments of the above method include:

(i) en fremgangsmåte hvor nevnte behandling av celler er ved transfeksjon av nevnte celler med en rekombinant animalsk virusvektor omfattende trinnene: (a) konstruering av en rekombinant animalsk virusvektor som bærer en sekvens som koder for et viralt overflateprotein (ligand) som er i stand til å binde til en spesifikk celleoverflatereseptor på overflaten av nevnte celle som skal bli behandlet, og en andre sekvens som koder for et protein som er p55-IC, deler derav, analoger eller derivater av alle de foregående, hvor nevnte protein blir uttrykt i nevnte celler er i stand til selv-assosiering og indusering av nevnte en eller flere TNF-assosiserte effekter; og (i) a method wherein said treatment of cells is by transfection of said cells with a recombinant animal viral vector comprising the steps of: (a) constructing a recombinant animal viral vector carrying a sequence encoding a viral surface protein (ligand) capable of to bind to a specific cell surface receptor on the surface of said cell to be treated, and a second sequence encoding a protein which is p55-IC, parts thereof, analogues or derivatives of all the foregoing, wherein said protein is expressed in said cells are capable of self-associating and inducing said one or more TNF-associated effects; and

(b) infisere nevnte celler med vektoren fra (a), (b) infecting said cells with the vector from (a);

(ii) en fremgangsmåte hvor nevnte TNF-effekt som skal induseres i nevnte celler, er induksjonen av BL-8 genekspresjon, hvor nevnte vektor bærer en sekvens som koder hovedsakelig for hele p55-IC, deler derav, analoger eller derivater av alle de foregående som er i stand til, når uttrykt i cellene, til selv-assosiering og signalering for induksjonen av nevnte IL-8 genekspresjon, (iii) en fremgangsmåte for behandling av tumorceller eller viraltinfiserte celler, eller for svekking av den antibakterielle effekt av granulocytter hvor nevnte virale vektor bærer en sekvens som koder for en viral ligand som er i stand til å binde en spesifikk celleoverflatereseptor på overflaten til nevnte tumorceller, viraltinfiserte celler eller granulocytter og en sekvens som koder for nevnte p55-IC, deler derav, analoger og derivater derav, som når uttrykt i nevnte tumor, viraltinfiserte eller granulocyttceller induserer TNF-assosierte effekter som fører til død av disse cellene, (iv) en fremgangsmåte for behandling av tumorceller hvor nevnte p55-IC, deler derav, analoger eller derivater derav, når uttrykt i tumorceller, induserer ekspresjon av IL-8 som fører til avliving av nevnte tumorceller ved dets kjemotaktiske aktivitet som tiltrekker granulocytter og andre lymfocytter til tumorcellene som resulterer i død av tumorcellene. (ii) a method where said TNF effect to be induced in said cells is the induction of BL-8 gene expression, where said vector carries a sequence which encodes mainly the entire p55-IC, parts thereof, analogues or derivatives of all the preceding which is capable, when expressed in the cells, of self-association and signaling for the induction of said IL-8 gene expression, (iii) a method for treating tumor cells or virally infected cells, or for weakening the antibacterial effect of granulocytes wherein said viral vector carries a sequence that codes for a viral ligand capable of binding a specific cell surface receptor on the surface of said tumor cells, virally infected cells or granulocytes and a sequence that codes for said p55-IC, parts thereof, analogs and derivatives thereof, which when expressed in said tumor, virally infected or granulocyte cells induces TNF-associated effects leading to the death of these cells, (iv) a method of b eaction of tumor cells wherein said p55-IC, parts thereof, analogues or derivatives thereof, when expressed in tumor cells, induces expression of IL-8 leading to the killing of said tumor cells by its chemotactic activity which attracts granulocytes and other lymphocytes to the tumor cells resulting in death of the tumor cells.

Det blir således fremskaffet det intracellulære området av p55-R (p55-IC), deler, analoger og derivater av alle de foregående for anvendelse ved behandling av celler ved indusering deri av TNF-assosierte effekter; og de følgende utførelsesformer derav: (i) p55-IC, deler, analoger og derivater for anvendelse i behandling av celler ved induksjon deri av IL-8 genekspresjon, (ii) p55-IC, deler, analoger og derivater for anvendelse ved behandling av tumorceller ved induksjon deri av IL-8 genekspresjon som resulterer i avliving av tumorcellene. There is thus provided the intracellular region of p55-R (p55-IC), parts, analogs and derivatives of all the foregoing for use in treating cells by inducing therein TNF-associated effects; and the following embodiments thereof: (i) p55-IC, parts, analogues and derivatives for use in the treatment of cells by induction therein of IL-8 gene expression, (ii) p55-IC, parts, analogues and derivatives for use in the treatment of tumor cells by induction therein of IL-8 gene expression which results in the killing of the tumor cells.

Videre blir det fremskaffet en farmasøytisk sammensetning for behandling av celler ved indusering deri av TNF-assosierte effekter, omfattende, som aktiv ingrediens, p55-IC, deler derav, analoger og derivater av alle de foregående, og en farmasøytisk akseptabel bærer; og de følgende utførelsesformer derav: (i) en farmasøytisk sammensetning for behandling av celler ved indusering deri av TNF-assosierte effekter omfattende som aktiv ingrediens en rekombinant animalsk virusvektor kodende for p55-IC, deler derav, analoger og derivater derav, og et protein som er i stand til å binde et celleoverflateprotein på cellene som skal behandles, (ii) en farmasøytisk sammensetning for behandling av tumorceller, hvor administrasjon av nevnte sammensetning fører til induksjon av IL-8 ekspresjon, og påfølgende avliving av tumorcellene. Furthermore, there is provided a pharmaceutical composition for the treatment of cells by inducing therein TNF-associated effects, comprising, as active ingredient, p55-IC, parts thereof, analogs and derivatives of all the foregoing, and a pharmaceutically acceptable carrier; and the following embodiments thereof: (i) a pharmaceutical composition for the treatment of cells by inducing therein TNF-associated effects comprising as active ingredient a recombinant animal virus vector encoding p55-IC, parts thereof, analogs and derivatives thereof, and a protein which is able to bind a cell surface protein on the cells to be treated, (ii) a pharmaceutical composition for the treatment of tumor cells, where administration of said composition leads to induction of IL-8 expression, and subsequent killing of the tumor cells.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør også en oppløselig, oligomer tumornekrosefaktorreseptor (TNF-R) omfattende i det minste to selv-assosierende fusjonsproteiner, hvor hvert fusjonsprotein har (a) ved dets ene ende en TNF bindende område valgt blant det ekstracellulære området av en TNF-R, analoger eller derivater derav, hvor nevnte ektracellulære området, analoger eller derivater ikke er i stand til skadelig selv-assosiering og som er i stand til å binde TNF; og (b) ved dets andre ende, et selv-assosierende område valgt blant (i) hovedsakelig hele det intracellulære området av p55 TNF-R (p55-IC), som løper fra omkring aminosyrerest 206 til omkring aminosyrerest 426 på det native p55 TNF-R molekyl (p55-R); (ii) dødsområdet av p55-IC som løper fra omkring aminosyrerest 328 til omkring aminosyrerest 426 av det native p55-R; (iii) hovedsakelig hele det intracellulære området av Fas/APOl reseptor (Fas-IC); (iv) dødsområdet av Fas-IC; og (v) analoger, fraksjoner eller derivater av hvilke som helst av (i)-(iv) som er i stand til selv-assosiering, hvor nevnte to selv-assosierte proteiner selv-assosierer kun ved endene (b) som har nevnte ender (a) som er i stand til å binde til minst to TNF monomerer, hvor hver ende (a) er i stand til binding til en TNF monomer; og salter og funksjonelle derivater av nevnte oppløselige, oligomere TNF-R. The present invention also enables a soluble, oligomeric tumor necrosis factor receptor (TNF-R) comprising at least two self-associating fusion proteins, where each fusion protein has (a) at one end a TNF-binding region selected from the extracellular region of a TNF-R, analogues or derivatives thereof, wherein said extracellular region, analogues or derivatives are incapable of harmful self-association and which are capable of binding TNF; and (b) at its other end, a self-associating region selected from (i) substantially the entire intracellular region of p55 TNF-R (p55-IC), running from about amino acid residue 206 to about amino acid residue 426 of the native p55 TNF -R molecule (p55-R); (ii) the dead region of p55-IC running from about amino acid residue 328 to about amino acid residue 426 of the native p55-R; (iii) essentially the entire intracellular region of the Fas/APO1 receptor (Fas-IC); (iv) the dead region of Fas-IC; and (v) analogs, fractions or derivatives of any of (i)-(iv) capable of self-association, wherein said two self-associated proteins self-associate only at the ends (b) having said ends (a) which is capable of binding to at least two TNF monomers, where each end (a) is capable of binding to one TNF monomer; and salts and functional derivatives of said soluble, oligomeric TNF-R.

Varianter av nevnte løselige TNF-R omfatter alle de ovenfor nevnte kombinasjonene av ender (a) med ender (b) som definert ovenfor, for eksempel, en oppløselig, oligomer TNF-R omfattende som ektracellulært område, det p5S-R ektracellulære området og som selv-assosierende intracellulært område, pSS-IC. Variants of said soluble TNF-R include all the aforementioned combinations of ends (a) with ends (b) as defined above, for example, a soluble, oligomeric TNF-R comprising as extracellular region, the p5S-R extracellular region and as self-associating intracellular region, pSS-IC.

Dessuten kan det tenkes en fremgangsmåte for fremstilling av oppløselig oligomer TNF-R omfattende: (a) konstruksjonen av en ekspresjonsvektor som koder for en hvilken som helst av nevnte fusjonsproteiner, hvor DNA sekvensen av nevnte ender av fusjonsproteinet blir oppnådd fira klonede DNA sekvenser som koder hovedsakelig for hele det ekstracellulære området av TNF-R, analoger eller derivater derav; og fra klonede DNA sekvenser som koder hovedsakelig for hele av nevnte p55-IC, p55-IC dødsområde, Fas-IC, Fas-IC dødsområde, analoger eller derivater av alle de foregående endene som blir ligert sammen for å danne en fusjonsproteinsekvens, og nevnte fusjonsproteinsekvens blir innsatt i nevnte vektor under kontroll av transkripsjonene og translasjonelle regulatoriske sekvenser; (b) innføring av vektoren av (a) i en passende vertcelle i hvilken nevnte fusjonsprotein blir uttrykt; og (c) rensing av fusjonsproteinet uttrykt i nevnte vertcelle, hvor nevnte fusjonsprotein er selv-assosierende før, under eller etter rensingsprosessen for å gi et oppløselig, oligomert TNF-R. Furthermore, a method for the production of soluble oligomeric TNF-R is conceivable comprising: (a) the construction of an expression vector encoding any one of said fusion proteins, where the DNA sequence of said ends of the fusion protein is obtained four cloned DNA sequences encoding mainly for the entire extracellular region of TNF-R, analogs or derivatives thereof; and from cloned DNA sequences encoding substantially all of said p55-IC, p55-IC dead region, Fas-IC, Fas-IC dead region, analogs or derivatives of all the preceding ends which are ligated together to form a fusion protein sequence, and said fusion protein sequence is inserted into said vector under the control of the transcriptional and translational regulatory sequences; (b) introducing the vector of (a) into a suitable host cell in which said fusion protein is expressed; and (c) purifying the fusion protein expressed in said host cell, wherein said fusion protein is self-associating before, during or after the purification process to yield a soluble, oligomeric TNF-R.

Videre kan det tenkes en vektor som koder for fusjonsproteinene ovenfor, som er nyttige i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen; vertceller inneholdende vektoren så vel som en farmasøytisk sammensetning omfattende det oppløselige, oligomere TNF-R, salter eller funksjonelle derivater derav og blandinger av hvilke som helst av de foregående ifølge foreliggende oppfinnelse, som aktiv ingrediens, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Tilsvarende blir det fremskaffet oppløselige, oligomere TNF-R salter, funksjonelle derivater derav og blandinger av hvilke som helst av de foregående ifølge oppfinnelsen, for anvendelse ved antagonisering av skadelige effekter av TNF hos pattedyr, spesielt ved behandling av tilstander hvor et overskudd av TNF blir dannet endogent eller eksogent administrert; eller alternativt, for anvendelse i opprettholdelse av forlengede fordelaktige effekter av TNF hos pattedyr når benyttet med TNF eksogent administrert. Furthermore, a vector is conceivable which codes for the above fusion proteins, which are useful in the methods according to the invention; host cells containing the vector as well as a pharmaceutical composition comprising the soluble, oligomeric TNF-R, salts or functional derivatives thereof and mixtures of any of the foregoing according to the present invention, as an active ingredient, together with a pharmaceutically acceptable carrier. Correspondingly, soluble, oligomeric TNF-R salts, functional derivatives thereof and mixtures of any of the foregoing are provided according to the invention, for use in antagonizing the harmful effects of TNF in mammals, especially in the treatment of conditions where an excess of TNF is formed endogenously or exogenously administered; or alternatively, for use in maintaining prolonged beneficial effects of TNF in mammals when used with exogenously administered TNF.

Langs linjene angitt angående aspektet ovenfor, er det blitt oppdaget at det er mulig å konstruere en oppløselig, oligomer Fas/APOl reseptor (Fas-R) som er anvendelig for antagonisering av skadelige effekter av Fas liganden. Følgelig kan det tenkes en oppløselig, oligomer Fas/APOl reseptor (Fas-R) omfattende minst to selv-assosierte fusjonsproteiner, hvor hvert fusjonsprotein har (a) ved dets ene ende et Fas ligandbindende område valgt blant det ekstracellulære området av en Fas-R, analoger eller derivater derav som ikke er i stand til selv-assosiering og som er i stand til å binde Fas liganden; og (b) ved dets andre ende et selv-assosierende område valgt blant (i) hovedsakelig hele det intracellulære området av p55 TNF-R (p55-IC) som løper fra omkring aminosyrerest 206 til omkring aminosyrerest 426 i det native p55 TNF-R molekyl (p55-R); (ii) dødsområdet av p55-IC som løper fra omkring aminosyrest 328 til omkring aminosyrerest 426 i det native p55-R; (iii) hovedsakelig hele det intracellulære området av Fas/APOl reseptor (Fas-IC); (iv) dødsområdet av Fas-IC; og (v) analoger eller derivater av en hvilken som helst av (i)-(iv) som er i stand til selv-assosiering, hvor nevnte minst to selv-assosierende proteiner kun selv-assosierer ved nevnte ender (b) som har ender (a) som er i stand til å binde minst to Fas ligandmonomerer, hver ende (a) er i stand til å binde en Fas ligandmonomer; og salter og funksjonelle derivater av nevnte oppløselige, oligomere Fas-R. Along the lines indicated regarding the above aspect, it has been discovered that it is possible to construct a soluble, oligomeric Fas/APO1 receptor (Fas-R) useful for antagonizing the deleterious effects of the Fas ligand. Accordingly, a soluble, oligomeric Fas/APO1 receptor (Fas-R) is conceivable comprising at least two self-associated fusion proteins, each fusion protein having (a) at one end a Fas ligand-binding region selected from the extracellular region of a Fas-R , analogues or derivatives thereof which are not capable of self-association and which are capable of binding the Fas ligand; and (b) at its other end a self-associating region selected from (i) substantially the entire intracellular region of p55 TNF-R (p55-IC) running from about amino acid residue 206 to about amino acid residue 426 of the native p55 TNF-R molecule (p55-R); (ii) the dead region of p55-IC running from about amino acid residue 328 to about amino acid residue 426 in the native p55-R; (iii) essentially the entire intracellular region of the Fas/APO1 receptor (Fas-IC); (iv) the dead region of Fas-IC; and (v) analogs or derivatives of any of (i)-(iv) capable of self-association, wherein said at least two self-associating proteins only self-associate at said ends (b) having ends (a) capable of binding at least two Fas ligand monomers, each end (a) capable of binding one Fas ligand monomer; and salts and functional derivatives of said soluble, oligomeric Fas-R.

Det blir også fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av det oppløselige, oligomere Fas-R omfattende: (a) konstruksjon av en ekspresjonsvektor som koder for en hvilken som helst av nevnte fusjonsproteiner, hvor DNA sekvensen til hver av nevnte ender av fusjonsproteinet blir oppnådd fra klonede DNA sekvenser som koder for hovedsakelig hele nevnte ekstracellulære området av Fas-R, analoger eller derivater derav, og fra klonede DNA sekvenser som koder for hovedsakelig hele nevnte p55-IC, p55-IC dødsområde, Fas-IC, Fas-IC dødsområde, analoger eller derivater derav av alle de foregående, hvor nevnte ender blir ligert sammen for å danne en fusjonsproteinsekvens, og nevnte fusjonsproteinsekvens er satt inn i nevnte vektor under kontroll av transkripsjonene og translasjonelle regulerende sekvenser; (b) innføring av vektoren (a) i en passende vertcelle i hvilken nevnte fusjonsprotein blir uttrykt; og (c) rensing av fusjonsproteinet uttrykt i vertceller, hvor nevnte fusjonsprotein selv-assosierer før, under eller etter rensingsprosessen for å gi et oppløselig, oligomert Fas-R. There is also provided a method for producing the soluble, oligomeric Fas-R comprising: (a) construction of an expression vector encoding any of said fusion proteins, wherein the DNA sequence of each of said ends of the fusion protein is obtained from cloned DNA sequences encoding substantially all of said extracellular region of Fas-R, analogs or derivatives thereof, and from cloned DNA sequences encoding substantially all of said p55-IC, p55-IC death region, Fas-IC, Fas-IC death region, analogs or derivatives thereof of all the foregoing, wherein said ends are ligated together to form a fusion protein sequence, and said fusion protein sequence is inserted into said vector under the control of the transcriptional and translational regulatory sequences; (b) introducing the vector (a) into a suitable host cell in which said fusion protein is expressed; and (c) purifying the fusion protein expressed in host cells, wherein said fusion protein self-associates before, during or after the purification process to yield a soluble, oligomeric Fas-R.

Dessuten blir det også fremskaffet en ekspresjonsvektor inneholdende fusjonsproteinsekvensen som koder for det oppløselige, oligomere Fas-R, som er nyttig i fremgangsmåten ovenfor; vertceller inneholdende vektoren og farmasøytiske sammensetninger omfattende det oppløselige, oligomere Fas-R, salter eller funksjonelle derivater derav, eller blandinger av en hvilken som helst av de foregående som aktiv ingrediens sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Tilsvarende blir det fremskaffet en oppløselig, oligomer Fas-R, salter eller funksjonelle derivater derav eller blandinger av et hvilket som helst av de foregående for anvendelse ved antagonisering av skadelige effekter av Fas ligand hos pattedyr, spesielt i behandling av tilstander hvor et overskudd av Fas ligand blir dannet endogent eller blir administrert eksogent. In addition, an expression vector containing the fusion protein sequence encoding the soluble, oligomeric Fas-R useful in the above method is also provided; host cells containing the vector and pharmaceutical compositions comprising the soluble, oligomeric Fas-R, salts or functional derivatives thereof, or mixtures of any of the foregoing as an active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier. Similarly, there is provided a soluble, oligomeric Fas-R, salts or functional derivatives thereof or mixtures of any of the foregoing for use in antagonizing the deleterious effects of Fas ligand in mammals, particularly in the treatment of conditions in which an excess of Fas ligand is formed endogenously or is administered exogenously.

På en tilsvarende måte som angitt ovenfor vedrørende det oligomere TNF-R og oligomere FAS-R, er det også mulig å fremstille blandede oligomerer som har bindingsspesifisitet for både TNF og FAS-R ligand. Således fremskaffer foreliggende oppfinnelse også en blandet oligomer TNF-R/FAS-R som omfatter minst to selv-assosierte fusjonsproteiner, et av hvilke fusjonsproteiner er valgt fra en hvilken som helst av de ovenfomevnte TNF-spesifikke fusjonsproteiner, og det andre fusjonsproteinet er valgt blant et hvilket som helst av de ovenfomevnte FAS-R ligand-spesifikke fusjonsproteinene for å gi en blandet oligomer som har minst et TNF-R ekstracellulært område og minst et FAS-R ekstracellulært område forbundet ved hjelp av selv-assosiering mellom de intracellulære områdene eller deler derav sammensmeltet til hver av de ekstracellulære områdene. Disse blandede oligomere reseptorene blir fremstilt ved fremstilling, som angitt ovenfor, av oligomere TNF-R og oligomere FAS-R og så blanding av disse sammen og påfølgende utvelging ved standard prosedyrer av de oligomerene som har bindingsspesifisitet for både FAS-R ligand og TNF. En annen måte for fremstilling av blandede oligomere reseptorer er ved kotransfektering av passende vertceller med vektorer, som angitt ovenfor, som koder for en hvilken som helst av de TNF-spesifikke fusjonsproteiner (oppløselige TNF-R) og som koder for en hvilken som helst av FAS-R ligand-spesifikke fusjonsproteiner (oppløselig FAS-R), rensing av de uttrykte fusjonsproteinene som selv-assosierer før, under eller etter rensing for å gi oligomere reseptorer, og så utvelgelse ved standard prosedyrer av de oligomere reseptorene som er i stand til binding til både TNF og FAS-R ligand. In a similar way as stated above regarding the oligomeric TNF-R and oligomeric FAS-R, it is also possible to prepare mixed oligomers which have binding specificity for both TNF and FAS-R ligand. Thus, the present invention also provides a mixed oligomeric TNF-R/FAS-R comprising at least two self-associated fusion proteins, one of which fusion proteins is selected from any of the above-mentioned TNF-specific fusion proteins, and the other fusion protein is selected from any of the above FAS-R ligand-specific fusion proteins to provide a mixed oligomer having at least one TNF-R extracellular region and at least one FAS-R extracellular region linked by self-association between the intracellular regions or portions hence fused to each of the extracellular areas. These mixed oligomeric receptors are produced by producing, as indicated above, oligomeric TNF-R and oligomeric FAS-R and then mixing these together and subsequent selection by standard procedures of the oligomers that have binding specificity for both FAS-R ligand and TNF. Another way of producing mixed oligomeric receptors is by cotransfecting appropriate host cells with vectors, as indicated above, which encode any of the TNF-specific fusion proteins (soluble TNF-R) and which encode any of FAS-R ligand-specific fusion proteins (soluble FAS-R), purification of the expressed fusion proteins that self-associate before, during, or after purification to yield oligomeric receptors, and then selection by standard procedures of the oligomeric receptors capable of binding to both TNF and FAS-R ligand.

Likeledes blir det også fremskaffet farmasøytiske sammensetninger omfattende blandede oligomere reseptorer, salter eller funksjonelle derivater derav eller blandinger av hvilke som helst av de foregående som aktiv ingrediens sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. I tillegg blir det fremskaffet blandede oligomere reseptorer, salter eller funksjonelle derivater derav eller blandinger av en hvilken som helst av de foregående for anvendelse i antagonisering av de skadelige effektene av både TNF og FAS-R ligand hos pattedyr, spesielt ved behandling av tilstander hvor et overskudd av TNF og FAS-R ligand blir dannet endogent eller blir administrert eksogent; eller alternativt for anvendelse ved opprettholdelse av forlenget (sakte frigivende) fordelaktige effekter av TNF og/eller FAS-R ligand hos pattedyr når benyttet med TNF og/eller FAS-R ligand (i oppløselig form) administrert eksogent. Likewise, pharmaceutical compositions comprising mixed oligomeric receptors, salts or functional derivatives thereof or mixtures of any of the foregoing as active ingredient together with a pharmaceutically acceptable carrier are also provided. Additionally, mixed oligomeric receptors, salts or functional derivatives thereof or mixtures of any of the foregoing are provided for use in antagonizing the deleterious effects of both TNF and FAS-R ligands in mammals, particularly in the treatment of conditions where a excess TNF and FAS-R ligand are generated endogenously or are administered exogenously; or alternatively for use in maintaining prolonged (slow release) beneficial effects of TNF and/or FAS-R ligand in mammals when used with TNF and/or FAS-R ligand (in soluble form) administered exogenously.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en DNA-sekvens som koder for et protein i stand til å binde til et intracellulært domene av en reseptor tilhørende The present invention comprises a DNA sequence that codes for a protein capable of binding to an intracellular domain of a receptor belonging to

tumornekrosefaktor/nervevekstfaktor (TNF/NGF) -reseptorsuperfamilien, fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av p55 TNF-R, p75 TNF-R og FAS-ligandreseptoren, idet nevnte DNA-sekvens velges fra gruppen bestående av: the tumor necrosis factor/nerve growth factor (TNF/NGF) receptor superfamily, preferably selected from the group consisting of p55 TNF-R, p75 TNF-R and the FAS ligand receptor, said DNA sequence being selected from the group consisting of:

(a) DNA-sekvenser omfattende en nukleotidsekvens som koder for proteinet 55.1 med aminosyresekvensen tilsvarende aminosyreresidium 328 til residium 426 i p55 TNF-R-aminosyresekvens; (b) DNA-sekvenser omfattende en nukleotidsekvens som koder for proE6n 55.3 med aminosyresekvensen tilsvarende aminosyreresidium 277 til residium 426 i p55 TNF-R-aminosyresekvensen; (c) DNA-sekvenser omfattende en nukleotidsekvens som koder for proteinet 55.11 med aminosyresekvensen gitt i figur 4; (d) DNA-sekvenser som koder for et protein valgt fra gruppen bestående av de heri designerte proteinene 75.3 og 75.16 omfattende nukleotidsekvensen gitt henholdsvis i figur l(b) og figur l(c); (e) DNA-sekvenser som koder for et hvilket som helst av proteinene F2, F9 og DD11, omfattende en DNA-sekvens valgt fra gruppen bestående av nukleotidsekvensen gitt i henholdsvis første og andre del av figur 10, nukleotidsekvensen gitt i første, andre og tredje del av figur 11 og nukleotidsekvensen gitt i figur 12; (f) DNA-sekvenser i stand til å hybridisere til en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst av punktene (a) til (e) under moderat stringente betingelser, og (g) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske koden i for-hold til DNA-sekvensene ifølge hvilket som helst av punktene (a) til (f). (a) DNA sequences comprising a nucleotide sequence encoding the protein 55.1 having the amino acid sequence corresponding to amino acid residue 328 to residue 426 of the p55 TNF-R amino acid sequence; (b) DNA sequences comprising a nucleotide sequence encoding proE6n 55.3 with the amino acid sequence corresponding to amino acid residue 277 to residue 426 of the p55 TNF-R amino acid sequence; (c) DNA sequences comprising a nucleotide sequence encoding the protein 55.11 having the amino acid sequence given in Figure 4; (d) DNA sequences encoding a protein selected from the group consisting of the herein designated proteins 75.3 and 75.16 comprising the nucleotide sequence given in Figure 1(b) and Figure 1(c), respectively; (e) DNA sequences encoding any of the proteins F2, F9 and DD11, comprising a DNA sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequence given in the first and second parts of Figure 10, respectively, the nucleotide sequence given in the first, second and third part of Figure 11 and the nucleotide sequence given in Figure 12; (f) DNA sequences capable of hybridizing to a DNA sequence according to any of items (a) to (e) under moderately stringent conditions, and (g) DNA sequences which are degenerate as a result of the the genetic code relative to the DNA sequences according to any one of items (a) to (f).

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en vektor omfattende en DNA-sekvens i henhold til krav 1. The present invention also includes a vector comprising a DNA sequence according to claim 1.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en transformert eukaryot eller prokaryot vertscelle inneholdende en vektor i henhold til krav 2. Furthermore, the present invention comprises a transformed eukaryotic or prokaryotic host cell containing a vector according to claim 2.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av proteinet, analogene eller derivatene som er i stand til å binde til et intarcellulært domene til en reseptor tilhørende tumornekrosefaktor/nervevekstfaktor (TNF/NGF) - reseptorsuperfamilien, omfattende dyrking av den transformerte vertscellen i henhold til krav 3 under betingelser egnet for ekspresjon av nevnte protein, analoger eller derivater, som forårsaker posttranslasjonsmodifikasjon av nevnte protein som nødvendig for oppnåelse av nevnte protein og ekstraksjon av nevnte uttrykte protein, analoger eller derivater fra kulturmediet til nevnte transformerte celle eller fra celleekstraktene fra nevnte transformerte celle. Furthermore, the present invention comprises a method for the production of the protein, analogues or derivatives which are capable of binding to an intracellular domain of a receptor belonging to the tumor necrosis factor/nerve growth factor (TNF/NGF) - receptor superfamily, including cultivation of the transformed host cell according to requirements 3 under conditions suitable for expression of said protein, analogues or derivatives, causing post-translational modification of said protein as necessary for obtaining said protein and extraction of said expressed protein, analogues or derivatives from the culture medium of said transformed cell or from the cell extracts of said transformed cell .

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse et protein, eller analoger og derivater derav, kjennetegnet ved at det er i stand til å binde til et intracellulært domene til en TNF eller FAS-reseptor kodet av en DNA-sekvens i henhold til krav 1 eller produsert i henhold til fremgangsmåten i krav 4. Furthermore, the present invention comprises a protein, or analogues and derivatives thereof, characterized in that it is able to bind to an intracellular domain of a TNF or FAS receptor encoded by a DNA sequence according to claim 1 or produced according to the procedure in claim 4.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av ett eller flere proteiner, analoger eller derivater valgt fra gruppen bestående av proteinene, analogene og derivatene i henhold til krav 5 og et protein som er p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, analoger eller derivater derav, idet alle nevnte proteiner er i stand til å binde til det intracellulære domenet og modulere aktiviteten av nevnte TNF-R eller FAS-R, for fremstilling av en farmasøytisk sarnmensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler som bærer en TNF-R eller en FAS-R, hvor nevnte farmasøytiske sanmiensetning omfatter nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i en form egnet for intracellulær introduksjon i celler, eller en DNA-sekvens som koder for nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i form av en egnet vektor som bærer nevnte sekvens, idet nevnte vektor er i stand til å forårsake innsetting av nevnte sekvens i nevnte celler på en slik måte at nevnte sekvens uttrykkes i nevnte celler. Furthermore, the present invention comprises the use of one or more proteins, analogues or derivatives selected from the group consisting of the proteins, analogues and derivatives according to claim 5 and a protein which is p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, analogues or derivatives thereof , all said proteins being capable of binding to the intracellular domain and modulating the activity of said TNF-R or FAS-R, for the production of a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells bearing a TNF -R or a FAS-R, where said pharmaceutical composition comprises said one or more proteins, analogues or derivatives in a form suitable for intracellular introduction into cells, or a DNA sequence that codes for said one or more proteins, analogues or derivatives in form of a suitable vector carrying said sequence, said vector being able to cause insertion of said sequence into said cells in such a way that said sequence moved in said cells.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av en oligonukleotidsekvens valgt fra en sekvens som koder for en antisenssekvens av minst en del av sekvensen i henhold til krav 1, og en sekvens som koder for antisenssekvensen til p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, idet nevnte oligonukleotidsekvens er i stand til å blokkere ekspresjonen av minst én av de TNF-R eller FAS-R intracellulære domenebindende proteinene for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandvirkningen på celler som bærer en TNF-R eller en FAS-R. Furthermore, the present invention comprises the use of an oligonucleotide sequence selected from a sequence that codes for an antisense sequence of at least part of the sequence according to claim 1, and a sequence that codes for the antisense sequence of p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, wherein said oligonucleotide sequence is capable of blocking the expression of at least one of the TNF-R or FAS-R intracellular domain-binding proteins for the preparation of a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand action on cells bearing a TNF-R or a FAS-R.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av en rekombinant animalsk virusvektor som bærer en sekvens som koder for et viralt overflateprotein som er i stand til å binde til en spesifikk tumorcelle-overflatereseptor eller HTV-infisert celleoverflatereseptor eller reseptor båret av andre syke celler og en sekvens som koder for et protein, analog eller derivat ifølge krav 5, som, når uttrykt i nevnte tumorcelle, HIV-infiserte celle eller annen sykelig celle er i stand til å drepe nevnte celle, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler eller andre sykelige celler. Furthermore, the present invention comprises the use of a recombinant animal virus vector carrying a sequence encoding a viral surface protein capable of binding to a specific tumor cell surface receptor or HTV-infected cell surface receptor or receptor carried by other diseased cells and a sequence encoding for a protein, analog or derivative according to claim 5, which, when expressed in said tumor cell, HIV-infected cell or other diseased cell, is capable of killing said cell, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of tumor cells or HIV-infected cells or other diseased cells.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av ett eller flere proteiner, Furthermore, the present invention includes the use of one or more proteins,

analoger eller derivater ifølge krav 5, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for induksjon av TNF-assosierte virkninger i celler eller vev, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning som omfatter nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i en form egnet for intracellulær introduksjon i celler, eller en DNA-sekvens som koder for nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i form av en egnet vektor som bærer nevnte sekvens, idet nevnte vektor er i stand til å forårsake innsetting av nevnte sekvens i nevnte celler på en måte slik at nevnte sekvens uttrykkes i nevnte celler. analogues or derivatives according to claim 5, for the preparation of a pharmaceutical composition for the induction of TNF-associated effects in cells or tissues, where said pharmaceutical composition comprises said one or more proteins, analogues or derivatives in a form suitable for intracellular introduction into cells, or a DNA sequence which codes for said one or more proteins, analogues or derivatives in the form of a suitable vector carrying said sequence, said vector being able to cause insertion of said sequence into said cells in such a way that said sequence is expressed in said cells.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av en vektor som koder for en ribozymsekvens i stand til interaksjon med en cellulær mRNA-sekvens som koder for et protein i henhold til krav 5 eller en mRNA-sekvens som koder for p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler utformet på en måte som tillater ekspresjon av nevnte ribozymsekvens i nevnte celler, og når nevnte ribozymsekvens uttrykkes i nevnte celler interagerer den med nevnte cellulære mRNA-sekvens og kutter nevnte mRNA-sekvens, resulterende i ekspresjonsinhibering av nevnte protein eller nevnte p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD i nevnte celler. Furthermore, the present invention comprises the use of a vector that codes for a ribozyme sequence capable of interacting with a cellular mRNA sequence that codes for a protein according to claim 5 or an mRNA sequence that codes for p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS -DD for the preparation of a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells designed in a manner that allows expression of said ribozyme sequence in said cells, and when said ribozyme sequence is expressed in said cells it interacts with said cellular mRNA sequence and cutting said mRNA sequence, resulting in expression inhibition of said protein or said p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD in said cells.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner i stand til å binde de intracellulære domenebindende proteinene i henhold til krav 5, omfattende anvendelse av gjær-to-hybridprosedyre hvor en sekvens som koder for nevnte intracellulære domenebindende protein bæres av én hybridvektor og sekvens fra et cDNA eller genomisk DNA-bibliotek bæres av den andre hybride vektoren, vektorene anvendes så til å transformere gjærvertsceller og de positivt transformerte cellene isoleres, fulgt av ekstraksjon av nevnte andre hybride vektor for å oppnå en sekvens som koder for et protein som binder til nevnte intracellulære domenebindende protein. Furthermore, the present invention comprises a method for isolating and identifying proteins capable of binding the intracellular domain-binding proteins according to claim 5, comprising the use of the yeast two-hybrid procedure where a sequence coding for said intracellular domain-binding protein is carried by one hybrid vector and sequence from a cDNA or genomic DNA library is carried by the second hybrid vector, the vectors are then used to transform yeast host cells and the positively transformed cells are isolated, followed by extraction of said second hybrid vector to obtain a sequence encoding a protein that binds to said intracellular domain binding protein.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler omfattende et protein i henhold til krav 5 eller proteinet p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, dets biologisk aktive fragmenter, analoger, derivater eller blandinger derav. Furthermore, the present invention comprises a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells comprising a protein according to claim 5 or the protein p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, its biologically active fragments, analogues, derivatives or mixtures thereof.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF- eller FAS-R-ligandvirkningen på celler omfattende en rekombinant animalsk virusvektor som koder for et protein i stand til å binde en celleoverflatereseptor og som koder for et protein i henhold til krav S, eller proteinet p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, dets biologisk aktive fragmenter eller analoger. Furthermore, the present invention comprises a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand action on cells comprising a recombinant animal virus vector which codes for a protein capable of binding a cell surface receptor and which codes for a protein according to claim S, or the protein p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, its biologically active fragments or analogues.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandvirkningen på celler omfattende en oligonukleotidsekvens som koder for en antisenssekvens ifølge sekvensen i henhold til krav 1. Furthermore, the present invention comprises a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand action on cells comprising an oligonucleotide sequence that codes for an antisense sequence according to the sequence according to claim 1.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av et protein ifølge krav S for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, for behandling av tumorer. Furthermore, the present invention comprises the use of a protein according to claim S for the production of a pharmaceutical composition, for the treatment of tumours.

Andre aspekter og utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er også fremskaffet slik det kommer frem av den følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen. Other aspects and embodiments of the present invention are also provided as will be apparent from the following detailed description of the invention.

Det må noteres at følgende uttrykt: "Modulering av TNF-effekten på celler" og "Modulering av FAS-ligandeffekten på celler" gjennom hele beskrivelsen er ment å omfatte in vitro så vel som in vivo behandling. It should be noted that the following expressions: "Modulation of the TNF effect on cells" and "Modulation of the FAS ligand effect on cells" throughout the specification are intended to include in vitro as well as in vivo treatment.

Kort beskrivelse av figurene Brief description of the figures

Fig. la-c angir skjematisk den delvise og preliminære nukleotidsekvensen av cDNA Fig. 1a-c schematically indicate the partial and preliminary nucleotide sequence of the cDNA

kloner som koder for p55IC og p75IC-bindende proteiner, hvor fig. l(a) er sekvensen til klone 55.11 som koder for det p55IC-bindende protein 55.11; fig. l(b) er den delvise og preliminære sekvensen av klone 75.3 som koder for p75IC-bindende protein 75.3; og fig. l(c) er den delvise og preliminære sekvensen av klone 75.16 som koder for p75IC-bindende protein p75.16; alle som beskrevet i eksempel 1; og fig. l(d) angir den avledede aminosyresekvensen av protein 55.11, avledet av nukleotidsekvensen i fig. l(a), som også beskrevet i eksempel 1. clones encoding p55IC and p75IC-binding proteins, where fig. 1(a) is the sequence of clone 55.11 encoding the p55IC-binding protein 55.11; fig. 1(b) is the partial and preliminary sequence of clone 75.3 encoding p75IC-binding protein 75.3; and fig. 1(c) is the partial and preliminary sequence of clone 75.16 encoding p75IC-binding protein p75.16; all as described in Example 1; and fig. 1(d) indicates the deduced amino acid sequence of protein 55.11, derived from the nucleotide sequence of FIG. l(a), as also described in example 1.

Fig. 2 er en reproduksjon av et Northern blot som viser det 55.11-spesifikke mRNA Fig. 2 is a reproduction of a Northern blot showing the 55.11-specific mRNA

som er tilstede i et antall av de testede cellelinjer, som beskrevet i eksempel 1. which is present in a number of the tested cell lines, as described in example 1.

Fig. 3A og B er reproduksjoner av autoradiogrammer som viser in vitro binding av proteinet som er kodet for av 55.11 cDNA til GST fusjonsproteininneholdende deler av p55-IC, hvor i fig. 3A det er angitt bindingen av full-lengde 55.11 proteinet (55.11 full) til forskjellige GST fusjonsproteiner, og i fig. 3B er det angitt bindingen av en del av 55.11 koblet til FLAG oktapeptidet til forskjellige GST fusjonsproteiner, alt beskrevet i eksempel 1. Fig. 4 viser skjematisk en sammenligning av den avledede aminosyresekvensen av humant 55.11 til relaterte proteinsekvenser avledet fra lavere organismer, som beskrevet i eksempel 1. Fig. 5 er en reproduksjon av et Western blot farget med anti-MBP polyklonalt antiserum som viser selv-assosieringen av p55IC, Western blot avledet fra en SDS-PAGE gel på hvilken det ble elektroforisert det interakterende bakterielt-produserte chimere proteinet p55IC-MBP og p55IC-GST (spor 1-4) eller kontrollinteraksjonen mellom det chimere protein p55IC-MBP og GST alene (spor 5-8), interaksjonene mellom de chimere proteinene (og kontroll) som ble utført på glutation-agaroseperler før SDS-PAGE, som beskrevet i eksempel 2. Fig. 6 er en reproduksjon av fasekontrastmikrografer som viser den cytotoksiske effekten av full-lengde p55IC i HTtal-celler transfektert med en ekspresjonsvektor kodende for dette p55IC (høyre panel); og hemmingen av den cytotoksiske effekten når ekspresjonen av vektoren blir blokkert ved behandling av cellene med tetracyklin (venstre panel), som beskrevet i eksempel 2. Fig. 7 viser den ligand-uavhengige utløsningen av den cytocidale effekten i HeLa celler transfektert med full-lengde p55-R, dets intracellulære område, eller deler av det intracellulære området inkludert "dødsområdet", hvor: (i) på ytterste venstre side i fig. 7 er angitt skjematisk de forskjellige DNA molekylene som koder for full-lengde p55-R, dets intracellulære område og deler av det intracellulære området som er innsatt i vektoren hvor HeLa cellene var transfektert; (ii) den venstre og den midtre stolpen viser TNF reseptorekspresjon i HeLa celler av hver av typene reseptor vist helt til venstre i fig. 7, den venstre stolpen representerer mengdene av reseptor i ng/celleprøve og den midtre stolpen representerer mengdene reseptor uttrykt ved hjelp av radioiodinert TNF bundet til de transfekterte cellene, og (iii) den høyre stolpen viser levedyktigheten til HeLa cellene som uttrykker de forskjellige typene av reseptor; og hvor alle søylediagrammene med hvite søyler representerer celler transfektert i nærvær av tetracyklin og skraverte søyler representerer celler transfektert i fraværet av tetracyklin; dette er også beskrevet i eksempel 2. Fig. 8 viser den ligand-uavhengige induksjon av IL-8 genekspresjon i HeLa celler transfektert med full-lengde p55-R eller dets intracellulære område (p55IC), hvor i panel A der er vist en reproduksjon av et Northern blot som viser Northern-analysen av RNA ektrahert fra HeLa celler behandlet med eller ikke-behandlet med TNF (de to sporene til venstre merket "kontroll" og "TNF"), og RNA ekstrahert fra HeLa celler transfektert med vektorer som koder for p55-R, p55-IC eller kontrollproteinet, luciferase (resten av sporene representerer henholdsvis "p55-IC", "p55-R" og Lue), hvor cellene som har blitt transfektert i nærvær (+) eller fråvær (-) av tetracyklin i hvert tilfelle (således to spor pr. transfeksjon); og hvori i panel B det er vist metylenblåfargingen av 18S rRNA i hver av HeLa celleprøvene vist i panel A; alt det ovenfor er beskrevet i eksempel 2. Fig. 9 (A og B) angir grafisk den liganduavhengjge utløsningen av et cytocidal effekt i HeLa celler transfektert med p55R eller deler derav, eller med AS-IC, hvori fig. 9A det er angitt resultatene med hensyn på p55R eller deler derav, og i fig. 9B er det angitt resultatene med hensyn til FAS-IC. I panelene på venstre side i både fig. 9A og B er det angitt skjematisk andelen av p55R eller FAS-IC benyttet i transfeksjonene, mens panelene til høyre angir grafisk de eksperimentelle resultatene, alt som beskrevet i eksempel 2. Fig. 10 viser grafisk den partielle og preliminære nukleotidsekvensen av en cDNA Fig. 3A and B are reproductions of autoradiograms showing in vitro binding of the protein encoded by the 55.11 cDNA to GST fusion protein-containing portions of p55-IC, where in Fig. 3A the binding of the full-length 55.11 protein (55.11 full) to various GST fusion proteins is indicated, and in fig. 3B shows the binding of a portion of 55.11 linked to the FLAG octapeptide to various GST fusion proteins, all described in Example 1. Fig. 4 schematically shows a comparison of the deduced amino acid sequence of human 55.11 to related protein sequences derived from lower organisms, as described in example 1. Fig. 5 is a reproduction of a Western blot stained with anti-MBP polyclonal antiserum showing the self-association of p55IC, Western blot derived from an SDS-PAGE gel on which the interacting bacterially produced chimeric protein p55IC was electrophoresed -MBP and p55IC-GST (lanes 1-4) or the control interaction between the chimeric protein p55IC-MBP and GST alone (lanes 5-8), the interactions between the chimeric proteins (and control) performed on glutathione-agarose beads before SDS- PAGE, as described in Example 2. Fig. 6 is a reproduction of phase contrast micrographs showing the cytotoxic effect of full-length p55IC in HTta1 cells transfected with an exp recombinant vector encoding this p55IC (right panel); and the inhibition of the cytotoxic effect when the expression of the vector is blocked by treatment of the cells with tetracycline (left panel), as described in Example 2. Fig. 7 shows the ligand-independent release of the cytotoxic effect in HeLa cells transfected with full-length p55-R, its intracellular region, or parts of the intracellular region including the "dead region", where: (i) on the far left side of FIG. 7 shows schematically the different DNA molecules that code for full-length p55-R, its intracellular region and parts of the intracellular region that are inserted into the vector into which the HeLa cells were transfected; (ii) the left and middle bars show TNF receptor expression in HeLa cells of each of the types of receptor shown on the far left in fig. 7, the left bar represents the amounts of receptor in ng/cell sample and the middle bar represents the amounts of receptor expressed by radioiodinated TNF bound to the transfected cells, and (iii) the right bar shows the viability of the HeLa cells expressing the different types of receptor; and wherein all bar graphs with white bars represent cells transfected in the presence of tetracycline and shaded bars represent cells transfected in the absence of tetracycline; this is also described in example 2. Fig. 8 shows the ligand-independent induction of IL-8 gene expression in HeLa cells transfected with full-length p55-R or its intracellular region (p55IC), where in panel A a reproduction is shown of a Northern blot showing the Northern analysis of RNA extracted from HeLa cells treated or not treated with TNF (the two lanes on the left labeled "control" and "TNF"), and RNA extracted from HeLa cells transfected with vectors encoding for p55-R, p55-IC or the control protein, luciferase (the rest of the tracks represent "p55-IC", "p55-R" and Lue, respectively), where the cells that have been transfected in the presence (+) or absence (-) of tetracycline in each case (thus two lanes per transfection); and wherein in panel B there is shown the methylene blue staining of 18S rRNA in each of the HeLa cell samples shown in panel A; all of the above is described in example 2. Fig. 9 (A and B) graphically indicates the ligand-dependent release of a cytocidal effect in HeLa cells transfected with p55R or parts thereof, or with AS-IC, in which fig. 9A the results with regard to p55R or parts thereof are indicated, and in fig. 9B, the results with regard to FAS-IC are indicated. In the panels on the left in both Figs. 9A and B, the proportion of p55R or FAS-IC used in the transfections is indicated schematically, while the panels on the right graphically indicate the experimental results, all as described in example 2. Fig. 10 graphically shows the partial and preliminary nucleotide sequence of a cDNA

klone, kalt "F2", som koder for et protein som er i stand til å binde til p55IC og FAS-IC, som beskrevet i eksempel 3. clone, named "F2", which encodes a protein capable of binding to p55IC and FAS-IC, as described in Example 3.

Fig. 11 viser grafisk den partielle og preliminære nukleotidsekvensen til en cDNA klone, Fig. 11 graphically shows the partial and preliminary nucleotide sequence of a cDNA clone,

kalt F9, som koder for et protein som er i stand til binding til p55IC og FAS-IC, som beskrevet i eksempel 3. called F9, which encodes a protein capable of binding to p55IC and FAS-IC, as described in Example 3.

Fig. 12 angir skjematisk den partielle og preliminære nukleotidsekvensen til en cDNA Fig. 12 schematically indicates the partial and preliminary nucleotide sequence of a cDNA

klon, kalt DD11, som koder for et protein som er i stand til å binde til p55IC, spesielt p55DD, og FAS-IC, som beskrevet i eksempel 3. clone, named DD11, which encodes a protein capable of binding to p55IC, particularly p55DD, and FAS-IC, as described in Example 3.

Detalj et beskrivelse av oppfinnelsn A detailed description of the invention

Foreliggende oppfinnelse angår, ifølge et aspekt, nye proteiner som er i stand til å binde til det intracellulære området av reseptorer som hører til TNF/NGF superfamilien, slik som TNF-R og FAS-R og således er ansett som mediatorer eller modulatorer for denne superfamilien reseptorer, for eksempel TNF-R og FAS-R, som har en rolle i eksempelvis signalprosessen som blir initiert ved bindingen av TNF til TNF og FAS liganden til FAS-R. Eksempler på disse proteinene er de som binder til det intracellulære området av p55 TNF-R (p55IC), slik som proteinene betegnet her som 55.1, 55.3 og 55.11 (eksempel 1) så vel som de kodet av cDNA klonene F2, F9 og Ddl 1 (eksempel 3), de som binder til det intracellulære området v p75 TNF-R (p75IC), slik som proteinene betegnet som 75.3 og 75.16 (eksempel 1); og de som binder til det intracellulære området av FAS-R (FAS-IC), slik som proteinene kodet ved cDNA klonene F2, F9 og DD11 (eksempel 3). Proteiner 55.1 og 55.3 har blitt funnet å representere deler eller fragmenter av det intracellulære området a p55 TNF-R (p55IC); andre proteiner, 55.11,75.3 og 75.16, representerer proteiner som ikke er beskrevet i det hele tatt før foreliggende oppfinnelse (75.3,75.16) eller de som har blitt beskrevet The present invention relates, according to one aspect, to new proteins that are able to bind to the intracellular region of receptors belonging to the TNF/NGF superfamily, such as TNF-R and FAS-R and are thus considered mediators or modulators of this superfamily receptors, for example TNF-R and FAS-R, which have a role in, for example, the signaling process that is initiated by the binding of TNF to TNF and the FAS ligand to FAS-R. Examples of these proteins are those that bind to the intracellular region of p55 TNF-R (p55IC), such as the proteins designated herein as 55.1, 55.3 and 55.11 (Example 1) as well as those encoded by the cDNA clones F2, F9 and Ddl 1 (Example 3), those that bind to the intracellular domain v p75 TNF-R (p75IC), such as the proteins designated 75.3 and 75.16 (Example 1); and those that bind to the intracellular region of FAS-R (FAS-IC), such as the proteins encoded by cDNA clones F2, F9 and DD11 (Example 3). Proteins 55.1 and 55.3 have been found to represent parts or fragments of the intracellular domain of p55 TNF-R (p55IC); other proteins, 55.11,75.3 and 75.16, represent proteins that have not been described at all prior to the present invention (75.3,75.16) or those that have been described

(55.11, se Klan et al., 1992), men hvis funksjon og andre karakteirstikker, spesielt evnen til å binde til en TNF-R, ikke var beskrevet på noen måte (se eksempel 1, nedenfor). De nye proteinene kodet ved cDNA klonene F2, F9 og DD11 representerer også proteiner som ikke i det hele tatt var beskrevet før, dvs. deres sekvens er ikke i "GENEBANK" eller "PROTEIN BANK" databanker over DNA eller aminosyresekvenser. (55.11, see Klan et al., 1992), but whose function and other characteristics, particularly the ability to bind to a TNF-R, were not described in any way (see Example 1, below). The new proteins encoded by the cDNA clones F2, F9 and DD11 also represent proteins that had not been described at all before, i.e. their sequence is not in the "GENEBANK" or "PROTEIN BANK" databases of DNA or amino acid sequences.

Foreliggende oppfinnelse angår således DNA sekvenser som koder for disse proteinene og proteinene kodet ved disse sekvensene. The present invention thus relates to DNA sequences which code for these proteins and the proteins encoded by these sequences.

Dessuten angår foreliggende oppfinnelse også DNA sekvensene som koder for biologisk aktive analoger og derivater av disse proteinene og analogene og derivatene kodet derved. Fremstillingen av slike analoger og derivater er ved standard prosedyre (se for eksempel Sambrook et al., 1989) i hvilken DNA sekvensene som koder for disse proteine, kan en eller flere koder bli deletert, addert eller substituert av andre, for å gi analoger som har minst en aminosyrerestforandring med hensyn til det native proteinet. Akseptable analoger er de som opprettholder minst kapasiteten ved å binde til det intracellulære området av TNF/NGF reseptorsuperfamilien, slik som FAS-R eller TNF-R, for eksempel p55IC, p75IC eller FAS-IC, eller som kan mediere en hvilken som helst bindende eller enzymatisk aktivitet, for eksempel analoger som binder p55, p75IC eller FAS-IC, men som ikke signalerer, dvs. ikke binder til en videre nedstrømsreseptor, protein eller annen faktor, eller ikke katalyseserer en signalavhengig reaksjon. På en slik måte kan analoger bli produsert som har såkalt dominant-negativ effekt, nemlig en analog som er defekt enten i binding til for eksempel p55IC, p75IC eller FAS-IC, eller i etterfølgende signalering etter slik binding. Slike analoger kan eksempelvis bli benyttet for å hemme TNF- eller FAS-ligandeffekten ved å konkurrere med nøytrale IC-bindende proteiner. Likeledes kan såkalte dominant-positive analoger bli fremstilt som vil tjene til å forsterke, for eksempel, TNF eller FAS ligandeffekten. Disse vil ha like eller bedre IC-bindende egenskaper og de samme eller bedre signaliserende egenskapene som de naturlige IC-bindende proteinene. Tilsvarende kan derivater bli fremstilt ved standard modifikasjoner av sidegruppene på en eller flere aminosyrerester av proteinene, eller ved konjugering av proteinene til det andre molekylet, for eksemel et antistoff, enzym, reseptor etc, som er velkjente innen teknikken. Moreover, the present invention also relates to the DNA sequences which code for biologically active analogues and derivatives of these proteins and the analogues and derivatives encoded thereby. The preparation of such analogues and derivatives is by standard procedure (see for example Sambrook et al., 1989) in which the DNA sequences that code for these proteins, one or more codes can be deleted, added or substituted by others, to give analogues that has at least one amino acid residue change with respect to the native protein. Acceptable analogs are those that retain at least the capacity to bind to the intracellular region of the TNF/NGF receptor superfamily, such as FAS-R or TNF-R, such as p55IC, p75IC, or FAS-IC, or that can mediate any binding or enzymatic activity, for example analogs that bind p55, p75IC or FAS-IC, but do not signal, i.e. do not bind to a further downstream receptor, protein or other factor, or do not catalyze a signal-dependent reaction. In such a way, analogues can be produced which have a so-called dominant-negative effect, namely an analogue which is defective either in binding to, for example, p55IC, p75IC or FAS-IC, or in subsequent signaling after such binding. Such analogues can, for example, be used to inhibit the TNF or FAS ligand effect by competing with neutral IC-binding proteins. Likewise, so-called dominant-positive analogues can be produced which will serve to enhance, for example, the TNF or FAS ligand effect. These will have equal or better IC-binding properties and the same or better signaling properties as the natural IC-binding proteins. Similarly, derivatives can be prepared by standard modifications of the side groups on one or more amino acid residues of the proteins, or by conjugation of the proteins to the other molecule, for example an antibody, enzyme, receptor, etc., which are well known in the art.

De nye TNF-R og FAS-R intracellulære områdebindende proteinene, for eksempel proteinene 55.1, 55.3, 55.11, 75.3,75.16 såvel som proteinene kodet ved cDNA klonene F2, F9 og DD11 (heretter F2, F9 og DD11) har et antall mulige anvendelser, for eksempel: (i) De kan bli benyttet for å etterligne eller øke funksjonen til TNF eller FAS-R liganden i situasjoner hvor en øket TNF eller FAS-R ligandeffekt er ønsket slik som i anti-tumor, anti-inflammatorisk eller anti-HTV applikasjoner hvor TNF-eller FAS-R ligandindusert cytotoksisitet er ønskelig. I dette tilfellet kan proteinene, for eksempel de som binder til p55IC slik som 5.1, 55.3, så vel som F2, F9 og DD11, og det frie p55IC selv (se nedenfor og eksempel 2), så vel som "dødsområdet" av p55IC (p55DD), som øker TNF effekten; eller proteiner F2, F9 og DD11 så vel som FAS-IC og FAS-DD som øker FAS-R ligandeffekten, dvs. cytotoksisk aktivitet, kan bli introdusert til cellene ved standard prosedyrer kjent per se. For eksempel, ettersom proteinene er intracellulære og det er The new TNF-R and FAS-R intracellular domain binding proteins, for example the proteins 55.1, 55.3, 55.11, 75.3,75.16 as well as the proteins encoded by the cDNA clones F2, F9 and DD11 (hereafter F2, F9 and DD11) have a number of possible applications , for example: (i) They can be used to mimic or increase the function of the TNF or FAS-R ligand in situations where an increased TNF or FAS-R ligand effect is desired such as in anti-tumor, anti-inflammatory or anti- HTV applications where TNF- or FAS-R ligand-induced cytotoxicity is desirable. In this case, the proteins, for example those that bind to p55IC such as 5.1, 55.3, as well as F2, F9 and DD11, and the free p55IC itself (see below and Example 2), as well as the "dead zone" of p55IC ( p55DD), which increases the TNF effect; or proteins F2, F9 and DD11 as well as FAS-IC and FAS-DD which increase the FAS-R ligand effect, i.e. cytotoxic activity, can be introduced to the cells by standard procedures known per se. For example, as the proteins are intracellular and it is

ønskelig at de blir introdusert kun til cellene hvor TNF eller FAS-R ligandeffekten er ønsket, er et system som er spesifikt for innføring av disse proteinene i cellen nødvendig. En måte for utførelse av dette er ved dannelsen av et rekombinant animalsk virus, for eksempel et avledet fra Vaccinia, til hvilket DNA de følgende to genene vil bli innført: genet som koder for en ligand som binder til celleoverflateproteiner som spesifikt blir uttrykt av cellene, for desirable that they are introduced only to the cells where the TNF or FAS-R ligand effect is desired, a system that is specific for the introduction of these proteins into the cell is necessary. One way of accomplishing this is by the creation of a recombinant animal virus, for example one derived from Vaccinia, into which DNA the following two genes will be introduced: the gene that codes for a ligand that binds to cell surface proteins that are specifically expressed by the cells, for

eksempel en slik som AIDs (HIV) virus gp 120 protein som binder spesifikt til noen celler (CD4 lymfocytter og relaterte hvite blodlegemer) eller en hvilken som helst annen ligand som binder spesifikt til celler som bærer en TNF-R eller FAS-R, slik at den rekombinante virusvektoren vil være i stand til å binde slike TNF-R eller FAS-R-bærende celler; og genet som koder for det nye intracellulære områdebindende proteinet eller p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD proteinet. Således vil ekspresjon av det celleoverflatebindende proteinet på overflaten av viruset målrette viruset spesifikt for tumorcellen eller andre TNF-R- eller FAS-R-bærende celle, etter hvilket det intracellulært områdebindende proteinkodende sekvensen eller p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD kodende sekvensen vil bli innført i cellene via viruset, og straks det blir uttrykt i cellene, vil det resultere i en økning av TNF eller FAS-R ligandeffekten som fører til død av tumorcellene eller andre TNT-R- eler FAS-R-bærende celler det er ønskelig å avlive. Konstruksjon av et slikt animalsk virus gjøres ved standard prosedyrer (se for eksempel Sambrook et al., 1989). En annen mulighet er å innføre for example one such as the AIDs (HIV) virus gp 120 protein that binds specifically to some cells (CD4 lymphocytes and related white blood cells) or any other ligand that binds specifically to cells bearing a TNF-R or FAS-R, such that the recombinant viral vector will be able to bind such TNF-R or FAS-R bearing cells; and the gene encoding the novel intracellular domain binding protein or the p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD protein. Thus, expression of the cell surface binding protein on the surface of the virus will target the virus specifically to the tumor cell or other TNF-R or FAS-R bearing cell, after which the intracellular domain binding protein coding sequence or p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD coding the sequence will be introduced into the cells via the virus, and as soon as it is expressed in the cells, it will result in an increase in the TNF or FAS-R ligand effect which leads to the death of the tumor cells or other TNT-R or FAS-R-bearing cells that is desirable to euthanize. Construction of such an animal virus is done by standard procedures (see, for example, Sambrook et al., 1989). Another possibility is to introduce

seksvensene av de nye proteinene eller p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD i form av oligonukleotider som kan bli absorbert av cellene og uttrykt der. the sequences of the new proteins or p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD in the form of oligonucleotides that can be absorbed by the cells and expressed there.

(ii) De kan bli benyttet for hemme TNF eller FAS-R ligandeffekten, for eksempel i tilfeller slik som vevsskade under septisk sjokk, graft-vs.-vertsavisning, eller akutt hepatitis, i hvilket tilfelle det er ønskelig å blokkere TNF-induserte TNF-R eller FAS-R ligandindusert FAS-R intracellulær signalering. I denne situasjonen er det mulig eksempelvis å innføre i cellene, ved standard prosedyrer, oligonukleotider som har en anti-senskodende sekvens for disse nye proteinene, eller anti-senskodende sekvens for p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, som effektivt vil blokkere translasjonen av mRNA som koder for disse proteinene og derved blokkere deres ekspresjon og føre til hemming av TNF- eller FAS-R (ii) They can be used to inhibit the TNF or FAS-R ligand effect, for example in cases such as tissue damage during septic shock, graft-versus-host rejection, or acute hepatitis, in which case it is desirable to block TNF-induced TNF -R or FAS-R ligand-induced FAS-R intracellular signaling. In this situation, it is possible, for example, to introduce into the cells, by standard procedures, oligonucleotides that have an anti-sense coding sequence for these new proteins, or anti-sense coding sequence for p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, which will effectively block the translation of mRNA encoding these proteins and thereby block their expression and lead to inhibition of TNF- or FAS-R

ligandeffekten. the ligand effect.

Slike oligonukleotider kan bli innført i cellene ved bruk av den ovenfor nevnte rekombinante virustilnærmingen, hvor den andre sekvensen som er båret av viruset, er oligonukleotidsekvensen. En annen mulighet er å benytte antistoffer som er spesifikke for disse proteinene for å hemme deres intracellulære signaleringsaktivitet. Det er mulig at disse nye proteinene som har et ekstracellulært område så vel som et intracellulært et, kan den siste binde til TNF-R eller FAS-R bindende område, og således kan antistoffer generert til deres ekstracellulære områder bli benyttet for å blokkere deres TNF- eller FAS-R ligandrelaterte funksjoner. Such oligonucleotides can be introduced into the cells using the above-mentioned recombinant virus approach, where the second sequence carried by the virus is the oligonucleotide sequence. Another possibility is to use antibodies specific for these proteins to inhibit their intracellular signaling activity. It is possible that these new proteins that have an extracellular domain as well as an intracellular one, the latter can bind to the TNF-R or FAS-R binding domain, and thus antibodies generated to their extracellular domains can be used to block their TNF - or FAS-R ligand-related functions.

Enda en måte å hemme TNF eller FAS-R ligandeffekten er ved den nylig utviklede ribozymtilnæringen. Ribozymer er katalytiske RNA molekyler som spesifikt spalter RNA. Ribozymer kan bli utformet for å spalte det ønskede mål RNA, for eksempel mRNA som koder for de nye proteinene ifølge oppfinnelsen eller mRNA som koder for p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD. Slike ribozymer vil ha en sekvens som er spesifikk for den aktuelle mRNA og vil være i stand til å vekselvirke med denne (komplementær binding) fulgt av spalting av mRNA for å resultere i en reduksjon (eller fullstendig tap) av ekspresjonen av proteinet det er ønskelig å hemme, hvor nivået av redusert ekspresjon er avhengig av nivået ribozymekspresjon i målcellen. For å innføre ribozymer i de aktuelle cellene (for eksempel de som bærer TNF-R eller FAS-R), kan hvilke som helst passende vektor bli benyttet, for eksempel plasmid, animalsk virus (retrovirus) vektorer, som er vanlig benyttet for dette formålet (se også (i) over, hvor viruset har som en andre sekvens en cDNA som koder for den aktuelle ribozymsekvensen). Videre kan ribozymer bli konstruert som har multiple mål (flermåls ribozymer) som kan bli benyttet, for eksempel, for å hemme ekspresjonen av ett eller flere av proteinene ifølge oppfinnelsen og/eller p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD så vel (for oversikter, metoder etc. angående ribozymer se Chen et al., 1992; Zhao og Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph og Burke, 1993; Shimayama et al. 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Yet another way to inhibit the TNF or FAS-R ligand effect is by the recently developed ribozyme supplementation. Ribozymes are catalytic RNA molecules that specifically cleave RNA. Ribozymes can be designed to cleave the desired target RNA, for example mRNA encoding the new proteins according to the invention or mRNA encoding p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD. Such ribozymes will have a sequence specific to the mRNA in question and will be able to interact with it (complementary binding) followed by cleavage of the mRNA to result in a reduction (or complete loss) of the expression of the desired protein to inhibit, where the level of reduced expression is dependent on the level of ribozyme expression in the target cell. To introduce ribozymes into the cells in question (for example those carrying TNF-R or FAS-R), any suitable vector can be used, for example plasmid, animal virus (retrovirus) vectors, which are commonly used for this purpose (see also (i) above, where the virus has as a second sequence a cDNA that codes for the relevant ribozyme sequence). Furthermore, ribozymes can be constructed which have multiple targets (multi-target ribozymes) which can be used, for example, to inhibit the expression of one or more of the proteins according to the invention and/or p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD as well ( for reviews, methods etc. regarding ribozymes see Chen et al., 1992; Zhao and Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al. 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993;

Crisell et al., 1993 og Koizumi et al., 1993). Crisell et al., 1993 and Koizumi et al., 1993).

(iii) De kan bli benyttet for å isolere, identifisere og klone andre proteiner som er i stand til å binde dem, for eksempel andre proteiner involvert i den intracellulære signaleringsprosessen som er nedstrøms for TNF-R eller FAS-R intracellulære området. I denne situasjon kan disse opsjoner, nemlig DNA-sekvensene som koder dem, bli benyttet i gjær to-hybrid systemet (se eksempel 1 nedenfor) i hvilket sekvensen av disse proteinene vil bli benyttet som "agn" for å isolere, klone og identifisere fra cDNA eller genomiske DNA bibliotek andre sekvenser ("bytter") som koder for proteiner som kan binde til disse nye TNF-R eller FAS-R intracellulære områdebindende proteinene. På samme måte kan det også bli bestemt om de spesifikke proteinene ifølge oppfinnelsen, nemlig de som binder til p55IC, p75IC eller FAS-IC, kan binde til andre reseptorer av TNF/NGF superfamilien av reseptorer. For eksempel har det nylig blitt rapporter (Schwalb et al., 1993; Båens et al., 1993; Crowe et al., 1994) at det eksisterer andre TNF-R ved siden av p55 og p75 TNF-R. Følgelig, ved anvendelse av gjær to-hybrid systemet kan det spesifikt bli testet om proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til spesifikt å binde til disse andre TNF-R eller andre reseptorer i TNF/NGF superfamilien. Videre kan denne tilnærmingen også bli benyttet for å bestemme om proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er i stand til å binde til andre kjente reseptorer i hvilke aktivitet de kan ha en funksjonell rolle. (iv) De nye proteinene kan også bli benyttet for å isolere, identifisere og klone andre proteiner i de samme klassene, dvs. de som binder til TNF-R eller FAS-R intracellulære områder eller til funksjonelt relaterte reseptorer, og er involvert i den intracellulære signaleringsprosessen. I denne applikasjonen kan det ovenfor angitte gjær to-hybrid systemt bli benyttet, eller der kan bli benyttet det nylig utviklede (Wilks et al., 1989) systemet som benytter ikke-stringent southern hybridisering fulgt av PCR kloning. I Wilks et al.-publikasjonen er det beskrevet identifikasjonen og kloningen av to putative protein-tyrosin kinaser ved anvendelse av ikke-stringent southem hybridisering fulgt av kloning ved PCR basert på den kjente sekvensen til kinasemotivet, en utviklet kinasesekvens. Denne tilnærmingen kan bli benyttet ifølge foreliggende oppfinnelsen som anvendelse av sekvensene av de nye proteinene for å identifisere og klone de relatert til TNF-R, FAS-R eller relatert reseptor (TNF/NGF superfamiliereseptorer) intracellulære områdebindende proteiner. (v) Enda en tilnærming til anvendelse av de nye proteinene ifølge oppfinnelsen er å benytte dem i fremgangsmåter for affinitetskromatografi for å isolere og identifisere andre proteiner eller faktorer til hvilke de er i stand til å binde, for eksempel andre reseptorer relatert til TNF-R (TNF/NGF reseptorsuperfamilie) eller andre proteiner eller faktorer involvert i den intracellulære signaleringsprosessen. I denne anvendelsen kan proteinene ifølge oppfinnelsen individuelt være bundet til affinitetskromatografiske matriser og så brakt i kontakt med celleektrakter eller isolerte proteiner eller faktorer som antatt å være involvert i den intracellulære signaleringsprosessen. Etter affinitetskromatograflprosedyren kan proteinene eller faktorene som binder til de nye proteinene ifølge oppfinnelsen, bli eluert, isolert og karakterisert. (vi) Som notert ovenfor kan de nye proteinene ifølge oppfinnelsen også bli benyttet som immunogener (antigener) for å produsere spesifikke antistoffer. Disse antistoffene kan bli benyttet for rensingsformål av de nye proteinene enten fra celleektrakter eller fra transformerte cellelinjer som produserer dem. Videre kan disse antistoffene bli benyttet for diagnostiske formål for å identifisere forstyrrelser relatert til abnormale funksjoner av TNF eller FAS-R ligandsystemet, for eksempel overaktive eller underaktive TNF- eller FAS-R ligandinduserte cellulæreffekter. Således vil slike forstyrrelser være relatert til feilfunksjonerende intracellulært signaleringssystem som involverer de nye proteinene, og antistoffene vil således tjene som viktige diagnostiske verktøy. (iii) They can be used to isolate, identify and clone other proteins capable of binding them, for example other proteins involved in the intracellular signaling process downstream of the TNF-R or FAS-R intracellular domain. In this situation, these options, namely the DNA sequences encoding them, can be used in the yeast two-hybrid system (see example 1 below) in which the sequence of these proteins will be used as "bait" to isolate, clone and identify from cDNA or genomic DNA libraries other sequences ("swaps") that encode proteins that can bind to these new TNF-R or FAS-R intracellular domain binding proteins. In the same way, it can also be determined whether the specific proteins according to the invention, namely those that bind to p55IC, p75IC or FAS-IC, can bind to other receptors of the TNF/NGF superfamily of receptors. For example, it has recently been reported (Schwalb et al., 1993; Båens et al., 1993; Crowe et al., 1994) that other TNF-Rs exist in addition to p55 and p75 TNF-Rs. Consequently, by using the yeast two-hybrid system, it can be specifically tested whether the proteins according to the present invention are capable of specifically binding to these other TNF-R or other receptors in the TNF/NGF superfamily. Furthermore, this approach can also be used to determine whether the proteins according to the present invention are capable of binding to other known receptors in which activity they may have a functional role. (iv) The new proteins can also be used to isolate, identify and clone other proteins in the same classes, i.e. those that bind to TNF-R or FAS-R intracellular regions or to functionally related receptors, and are involved in the intracellular signaling process. In this application, the yeast two-hybrid system indicated above can be used, or the recently developed (Wilks et al., 1989) system that uses non-stringent southern hybridization followed by PCR cloning can be used. In the Wilks et al. publication, the identification and cloning of two putative protein-tyrosine kinases using non-stringent southern hybridization followed by cloning by PCR based on the known sequence of the kinase motif, an evolved kinase sequence, is described. This approach can be used according to the present invention as the use of the sequences of the new proteins to identify and clone the related to TNF-R, FAS-R or related receptor (TNF/NGF superfamily receptors) intracellular domain binding proteins. (v) Yet another approach to using the new proteins according to the invention is to use them in methods for affinity chromatography to isolate and identify other proteins or factors to which they are capable of binding, for example other receptors related to TNF-R (TNF/NGF receptor superfamily) or other proteins or factors involved in the intracellular signaling process. In this application, the proteins according to the invention can be individually bound to affinity chromatographic matrices and then brought into contact with cell extracts or isolated proteins or factors believed to be involved in the intracellular signaling process. After the affinity chromatography procedure, the proteins or factors that bind to the new proteins according to the invention can be eluted, isolated and characterized. (vi) As noted above, the new proteins according to the invention can also be used as immunogens (antigens) to produce specific antibodies. These antibodies can be used for purification purposes of the new proteins either from cell extracts or from transformed cell lines that produce them. Furthermore, these antibodies can be used for diagnostic purposes to identify disturbances related to abnormal functions of the TNF or FAS-R ligand system, for example overactive or underactive TNF- or FAS-R ligand-induced cellular effects. Thus, such disturbances will be related to malfunctioning intracellular signaling systems involving the new proteins, and the antibodies will thus serve as important diagnostic tools.

Det må også noteres at isoleringen, identifiseringen og karakteirseringen av de nye proteinene ifølge oppfinnelsen kan bli utført ved anvendelse av en hvilken som helst kjent standard screening-prosedyre. For eksempel ble en av disse screening-prosedyrene, gjær to-hybrid prosedyren som angitt i de følgende eksemplene (eksempler 1 og 3) benyttet for å identifisere de nye proteinene ifølge oppfinnelsen. Likeledes, som angitt ovenfor, kan andre prosedyrer bli benyttet slik som affinitetskromatografi, DNA hybridiseringsprosedyrer osv. som er velkjente i teknikken, for å isolere, identifisere og karakterisere de nye proteinene ifølge oppfinnelsen eller å isolere, identifisere og karakterisere ytterligere proteiner, faktorer, reseptorer osv. som er i stand til å binde til de nye proteinene ifølge oppfinnelsen eller til reseptorene som hører til TNF/NGF familien av reseptorer. It must also be noted that the isolation, identification and characterization of the new proteins according to the invention can be carried out using any known standard screening procedure. For example, one of these screening procedures, the yeast two-hybrid procedure as indicated in the following examples (Examples 1 and 3) was used to identify the new proteins according to the invention. Likewise, as indicated above, other procedures may be used such as affinity chromatography, DNA hybridization procedures, etc., which are well known in the art, to isolate, identify and characterize the new proteins of the invention or to isolate, identify and characterize additional proteins, factors, receptors etc. which are able to bind to the new proteins according to the invention or to the receptors belonging to the TNF/NGF family of receptors.

Hva angår antistoffene nevnt her blir det gjennom det hele med uttrykket "antistoff' ment å omfatte polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer (mAbs), chimere antistoffer, anti-idiotypiske (anti-Id) antistoffer overfor antistoffer som kan bli merket i oppløselig eller bundet form, så vel som fragmenter derav, som er gitt ved en hvilken som helst kjent teknikk slik som, men ikke begrenset til, enzymatisk spalting, peptidsyntese eller rekombinante teknikker. With regard to the antibodies mentioned here, the term "antibody" throughout is intended to include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies, anti-idiotypic (anti-Id) antibodies to antibodies that can be labeled in soluble or bound form , as well as fragments thereof, which are provided by any known technique such as, but not limited to, enzymatic cleavage, peptide synthesis or recombinant techniques.

Polyklonale antistoffer er heterogene populasjoner av antistoffmolekyler avledet fra sera av dyr som er immunisert med et antigen. Et monoklonalt antistoff inneholder en hovedsakelig homogen populasjon av antistoffer spesifikke for antigener, hvis populasjoner inneholder hovedsakelig tilsvarende epitope bindingsseter. MAbs kan bli oppnådd ved fremgangsmåter som er kjent for fagmannen. Se for eksempel Kohler og Milstein, Nature. 256:495-497 (1975); US-patent nr. 4376110; Ausubel et al., utg. Harlow og Lane ANTIBODffiS: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); og Colligan et al., utg. Current Protocols in Lnmunology, Greene publishing Assoc. og Wiley Juterscience N.Y., (1992,1993), innholdet av hvilke i referanser er innlemmet i sin helhet som referanse. Slike antistoffer kan være av en hvilken som helst immunoglobulinklasse inkludert IgG, IgM, IgE, IgA, GILD og hvilke som helst underklasse derav. En hybridoma som produserer en mAb ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli dyrket in vitro, in situ eller in vivo. Produksjon av høye titere av mAbs in vivo eller in situ gjør dette til den for tiden foretrukne fremgangsmåten av fremstilling. Polyclonal antibodies are heterogeneous populations of antibody molecules derived from the sera of animals immunized with an antigen. A monoclonal antibody contains a substantially homogeneous population of antibodies specific for antigens, whose populations contain substantially corresponding epitope binding sites. MAbs can be obtained by methods known to those skilled in the art. See, for example, Kohler and Milstein, Nature. 256:495-497 (1975); US Patent No. 4,376,110; Ausubel et al., ed. Harlow and Lane ANTIBODffiS: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); and Colligan et al., ed. Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Juterscience N.Y., (1992,1993), the contents of which are incorporated by reference in their entirety. Such antibodies may be of any immunoglobulin class including IgG, IgM, IgE, IgA, GILD and any subclass thereof. A hybridoma producing a mAb according to the present invention can be cultured in vitro, in situ or in vivo. Production of high titers of mAbs in vivo or in situ makes this the currently preferred method of production.

Chimere antistoffer er molekyler hvor forskjellige deler er avledet fra forskjellige animalske arter, slik som de som har den variable regionen avledet fra et murint mAb og en human immunoglobulin konstant region. Chimere antistoffer er primært benyttet for å redusere immunogenisiteten i anvendelse og å øke utbyttet ved produksjon, for eksempel hvor murint mAbs har høyere utbytter fra hybridomas, men høyere immunogenisitet hos pattedyr, slik at humant/murint chimert mAbs blir benyttet. Chimere antistoffer og fremgangsmåter for deres produksjon er kjent i teknikken (Cabilly et al., Proe. Ntl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proe. Chimeric antibodies are molecules in which different parts are derived from different animal species, such as those that have the variable region derived from a murine mAb and a human immunoglobulin constant region. Chimeric antibodies are primarily used to reduce the immunogenicity in use and to increase the yield during production, for example where murine mAbs have higher yields from hybridomas, but higher immunogenicity in mammals, so that human/murine chimeric mAbs are used. Chimeric antibodies and methods for their production are known in the art (Cabilly et al., Proe. Ntl. Acad. Sei. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proe.

Nati. Åcad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 Nati. Acad. Pollock. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646

(1984); Cabilly et al., europeisk patentansøkning 12023 (publisert 14. november 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985): Taniguchi et al., europeisk patentansøkning 171496 (publisert 19. februar 1985); Morrison et al., europeisk patentansøkning 173494 (publisert 5. mars 1986); Neuberger et al., PCT-ansøkning WO 8601533 (publisert 13. mars 1986); Kudo et al., europeisk patentansøkning 184187 (publisert 11. juni 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); robison et al., internasjonal patentansøkning nr. WO8702671 (publisert 7. mai 1987); Liu et al., Proe. Nati. Acad. Sei C/&484:3439-3443 (1987); Sun et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); og Harlow og Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. Disse referanser er i sin helhet . innlemmet her som referanse. (1984); Cabilly et al., European Patent Application 12023 (published Nov. 14, 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985): Taniguchi et al., European Patent Application 171496 (published February 19, 1985); Morrison et al., European Patent Application 173494 (published March 5, 1986); Neuberger et al., PCT Application WO 8601533 (published March 13, 1986); Kudo et al., European Patent Application 184187 (published June 11, 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); robison et al., International Patent Application No. WO8702671 (published May 7, 1987); Liu et al., Proe. Nati. Acad. Say C/&484:3439-3443 (1987); Sun et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); and Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. These references are in their entirety. incorporated herein by reference.

Et anti-iodiotypisk (anti-Id) antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter generelt assosiert med antigenbindingssetet til et antistoff. Et Id antistoff kan bli fremstilt ved immunisering av et pattedyr av den samme art og genetiske type (for eksempel musestamme) som kilden av mAb med mAb til hvilket et anti-Id er blitt fremstilt. Det immuniserte dyret vil gjenkjenne og respondere på de idiotypiske determinantene til det immuniserende antistoffet ved fremstilling av et antistoff til disse idiotypiske determinantene (anti-Id antistoff). Se for eksempel US-patent nr. 4699880 innlemmet her i sin helhet som referanse. An anti-iodiotypic (anti-Id) antibody is an antibody that recognizes unique determinants generally associated with the antigen binding site of an antibody. An Id antibody can be produced by immunizing a mammal of the same species and genetic type (eg mouse strain) as the source of the mAb with the mAb to which an anti-Id has been produced. The immunized animal will recognize and respond to the idiotypic determinants of the immunizing antibody by producing an antibody to these idiotypic determinants (anti-Id antibody). See, for example, US Patent No. 4,699,880, incorporated herein in its entirety by reference.

Anti-Id antistoffet kan også bli benyttet som et "immunogen" for å indusere en immunrespons i enda et dyr for å produsere et såkalt anti-anti-Id antistoff. Anti-anti-Id kan være epitpisk identisk med det opprinnelige mAb som induserte anti-id. Således ved anvendelse av antistoffer til de idiotypiske determinantene av en mAb, er det mulig å identifisere andre kloner som uttrykker antistoffer med identisk spesifisitet. The anti-Id antibody can also be used as an "immunogen" to induce an immune response in another animal to produce a so-called anti-anti-Id antibody. The anti-anti-Id may be epitopically identical to the original mAb that induced the anti-Id. Thus, by using antibodies to the idiotypic determinants of a mAb, it is possible to identify other clones expressing antibodies with identical specificity.

Følgelig kan mAbs generert mot IC-bindende proteiner, analoger eller derivater derav ifølge foreliggende oppfinnelse eller p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, analoger eller derivater derav bli benyttet for å indusere anti-Id antistoffer i passende dyr, slik som BALB/c mus. Miltceller fra slike immuniserte mus blir benyttet for å produsere anti-Id hybridomas som utskiller anti-Id mAbs. Videre kan anti-Id mAbs bli koblet til en bærer slik som keyhole limpet hemocyanin (KLH) og benyttet for å immunisere ytterligere BALB/c mus. Sera fra disse mus vil inneholde anti-anti-Id antistoffer som har de bindende egenskapene til det opprinnelige mAb spesifikke for en epitop av de ovenfor nevnte IC-bindende proteinene, analoger eller derivater eller p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD. Accordingly, mAbs generated against IC-binding proteins, analogs or derivatives thereof according to the present invention or p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, analogs or derivatives thereof can be used to induce anti-Id antibodies in appropriate animals, such as BALB /c mouse. Spleen cells from such immunized mice are used to produce anti-Id hybridomas that secrete anti-Id mAbs. Furthermore, anti-Id mAbs can be coupled to a carrier such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) and used to further immunize BALB/c mice. Sera from these mice will contain anti-anti-Id antibodies that have the binding properties of the original mAb specific for an epitope of the above-mentioned IC-binding proteins, analogs or derivatives or p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD.

Anti-Id mAbs har således deres idiotypiske epitoper eller "idiotoper" strukturelt tilsvarende epitopen som blir evaluert, slik som GRB protein-a. Anti-Id mAbs thus have their idiotypic epitopes or "idiotopes" structurally similar to the epitope being evaluated, such as GRB protein-a.

Uttrykket "antistoff<1> er også ment å omfatte både intakte molekyler så vel som fragmenter derav, for eksempel, Fab og F(ab')2, som er i stand til å binde antigen. Fab og F(ab')2 fragmentene mangler Fc fragmentet i det intakte antistoff, fjernes lettere fra sirkulasjon og kan ha mindre ikke-spesifikk vevsbinding enn et intakt antistoff (Wahl et a. 1, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). The term "antibody<1> is also intended to include both intact molecules as well as fragments thereof, for example, Fab and F(ab')2, which are capable of binding antigen. The Fab and F(ab')2 fragments lacks the Fc fragment in the intact antibody, is more easily removed from circulation and may have less non-specific tissue binding than an intact antibody (Wahl et al. 1, J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Det må noteres at Fab og F(ab')2 og andre fragmenter av antistoffene som er nyttige i foreliggende oppfinnelse, kan bli benyttet for å detektering og kvantifisering av de IC-bindende proteinene eller p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD ifølge fremgangsmåten beskrevet her for intakte antistoffmolekyler. Slike fragmenter blir typisk produsert ved proteolytisk spalting ved anvendelse av enzymer slik som papain (for å produsere Fab fragmenter) eller pepsin (for å produsere F(ab)2 fragmenter). It must be noted that Fab and F(ab')2 and other fragments of the antibodies useful in the present invention can be used for detection and quantification of the IC-binding proteins or p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD according to the method described here for intact antibody molecules. Such fragments are typically produced by proteolytic cleavage using enzymes such as papain (to produce Fab fragments) or pepsin (to produce F(ab)2 fragments).

Et antistoff er sagt å "være i stand til binding" av et molekyl dersom det er i stand til spesifikt å reagere med molekylet for derved å binde molekylet til antistoffet. Uttrykket "epitop" er ment å referere til den del av et hvilket som helst molekyl som er i stand til å bli bundet ved et antistoff som kan også bli gjenkjent ved det antistoffet. Epitoper eller An antibody is said to be "capable of binding" a molecule if it is able to specifically react with the molecule to thereby bind the molecule to the antibody. The term "epitope" is intended to refer to the portion of any molecule capable of being bound by an antibody that can also be recognized by that antibody. Epitopes or

"antigeniske determinanter" består vanligvis av en kjemisk aktiv overflategruppering av molekyler slik som aminosyrer eller sukkersidekjeder og har spesifikke tre-dimensjonale strukturelle karakteristikker så vel som spesifikke ladningskarakteristikker. "antigenic determinants" usually consist of a chemically active surface grouping of molecules such as amino acids or sugar side chains and have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics.

Et "antigen" er et molekyl eller en del av et slikt molekyl som er i stand til å bli bundet av et antistoff som ytterligere er i stand til å indusere et dyr å produsere antistoff som er i stand til å binde til et epitop av det antigenet. Et antigen kan ha en eller flere enn en epitop. Den spesifikke reaksjonen referert til ovenfor er ment å indikere at antigenet vil reagere på en høyt selektiv måte, med dets korresponderende antistoff og ikke med et flertall av andre antistoffer som kan være fremkalt av andre antigener. An "antigen" is a molecule or part of such a molecule capable of being bound by an antibody which is further capable of inducing an animal to produce antibody capable of binding to an epitope of it the antigen. An antigen can have one or more than one epitope. The specific reaction referred to above is intended to indicate that the antigen will react in a highly selective manner, with its corresponding antibody and not with a plurality of other antibodies that may be elicited by other antigens.

Antistoffene, inkludert fragmenter av antistoffer som er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bli benyttet for kvantitativt eller kvalitativt å detektere IC-bindende proteiner eller p55IC, p55DD, FAS-JD, FAS-DD i en prøve eller å detektere nærværet av celler som uttrykker IC-bindende proteiner ifølge oppfinnelsen eller p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD proteinene. Dette kan bli oppnådd ved immunofluorescens-teknikker som benytter et fluorescerende merket antistoff (se nedenfor) koblet med lysmikroskopiske, strømningscytometrisk eller fluorometrisk deteksjon. The antibodies, including fragments of antibodies useful according to the present invention, can be used to quantitatively or qualitatively detect IC-binding proteins or p55IC, p55DD, FAS-JD, FAS-DD in a sample or to detect the presence of cells expressing IC -binding proteins according to the invention or the p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD proteins. This can be achieved by immunofluorescence techniques using a fluorescently labeled antibody (see below) coupled with light microscopic, flow cytometric or fluorometric detection.

Antistoffene (eller fragmenter derav) som er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet histologisk, som en immunofluorescerens eller immunoelektronmikroskopi for in situ deteksjon av IC-bindende proteiner ifølge oppfinnelsen eller p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD. In situ deteksjon kan bli utført ved å fjerne en histologisk prøve fra en pasient og fremskaffe et merket antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse å få en slik prøve. Antistoffet (eller fragmentet) blir fortrinnsvis fremskaffet ved å tilføre eller ved å legge over det merkede antistoffet (eller fragmentet) på en biologisk prøve. Ved anvendelsen av en slik prosedyre er det mulig å bestemme, ikke kun nærværet av de IC-bindende proteinene eller p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, men også dets distribusjon i den undersøkte prøven. Ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse kan fagmannen lett forstå at en hvilken som helst av flere histologiske metoder (slik som fargeprosedyrer) kan bli modifisert for å oppnå slik in situ deteksjon. The antibodies (or fragments thereof) which are useful according to the present invention can be used histologically, as an immunofluorescence or immunoelectron microscopy for in situ detection of IC-binding proteins according to the invention or p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD. In situ detection can be performed by removing a histological sample from a patient and providing a labeled antibody according to the present invention to obtain such a sample. The antibody (or fragment) is preferably obtained by adding or overlaying the labeled antibody (or fragment) onto a biological sample. By applying such a procedure, it is possible to determine, not only the presence of the IC-binding proteins or p55IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, but also its distribution in the examined sample. In applying the present invention, one skilled in the art can readily appreciate that any of several histological methods (such as staining procedures) can be modified to achieve such in situ detection.

Slike analyser for IC-bindende proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse eller pS5IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, omfatter typisk inkubering av en biologisk prøve, slik som et biologisk fluid, et vevsekstrakt, ferskt høstede celler slik som lymfocytter eller leukocytter, eller celler som har blitt inkubert i vevskulturen, i nærvær av et detekterbart merket antistoff som i stand til å identifisere de IC-bindende proteinene eller pSSIC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, og detektere antistoffet ved en hvilket som helst av et antall teknikker som er velkjent i teknikken. Such assays for IC-binding proteins according to the present invention or pS5IC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, typically comprise incubation of a biological sample, such as a biological fluid, a tissue extract, freshly harvested cells such as lymphocytes or leukocytes, or cells which have been incubated in the tissue culture, in the presence of a detectably labeled antibody capable of identifying the IC-binding proteins or pSSIC, p55DD, FAS-IC, FAS-DD, and detecting the antibody at any one of a number techniques well known in the art.

Den biologiske prøven kan bli behandlet med en fastfasestøtte eller bærer slik som mtrocellulose, eller annen fast støtte eller bærer som er i stand til å immobilisere celler, cellepartikler eller oppløselige proteiner. Støtten eller bæreren kan så bli vasket med passende buffer fulgt av behandling med et detekterbart merket antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som notert ovenfor. Fastfasestøtten eller bæreren kan så bli vasket med bufferen en andre gang for å fjerne ubundet antistoff. Mengden bundet merke på hver faste støtte eller bærer kan så bli detektert ved konvensjonelle midler. The biological sample may be treated with a solid phase support or carrier such as mtrocellulose, or other solid support or carrier capable of immobilizing cells, cell particles or soluble proteins. The support or support may then be washed with appropriate buffer followed by treatment with a detectably labeled antibody of the present invention as noted above. The solid phase support or carrier can then be washed with the buffer a second time to remove unbound antibody. The amount of bound label on each solid support or carrier can then be detected by conventional means.

Ved "fastfasestøtte", "fastfasebærer", "faststøtte", "fastbærer", "støtte" eller "bærer" er det ment en hvilken som helst støtte eller bærer som er i stand til å binde antigen eller antistoffer. Velkjente støtter eller bærere omfatter glass, polystyren, polypropylen, polyetylen, dekstran, nylonamylaser, naturlige og modifiserte celluloser, polyakrylamider, gabbros og magnetitt. Naturen til bæreren kan enten være oppløselig til en viss grad eller uoppløselig for foreliggende oppfinnelses formål. Støttematerialet kan ha nærmest en hvilken som helst strukturell konfigurasjon så lenge det koblede molekylet er i stand til binding til et antigen eller antistoff. Således kan støtten eller bærerens være sfærisk, som i en perle, sylindrisk, som den indre overflaten på et testrør, eller den ytre overflaten av en stav. Alternativt kan overflaten være flat slik som et ark, teststripe osv. Foretrukne støtter eller bærere omfatter polystyrenperler. Fagmannen vil forstå hvilke andre passende bærere som er aktuelle for binding av antistoff eller protein, eller vil være i stand til å stille disse ved anvendelse ved ratine-eksperimenter. By "solid phase support", "solid phase carrier", "solid support", "solid support", "support" or "carrier" is meant any support or carrier capable of binding antigen or antibodies. Well-known supports or carriers include glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon amylases, natural and modified celluloses, polyacrylamides, gabbros and magnetite. The nature of the carrier can either be soluble to a certain extent or insoluble for the purposes of the present invention. The support material can have almost any structural configuration as long as the linked molecule is capable of binding to an antigen or antibody. Thus, the support or carrier may be spherical, as in a bead, cylindrical, like the inner surface of a test tube, or the outer surface of a rod. Alternatively, the surface may be flat such as a sheet, test strip, etc. Preferred supports or supports include polystyrene beads. The person skilled in the art will understand which other suitable carriers are relevant for the binding of antibody or protein, or will be able to provide these for use in ratine experiments.

Bindingsaktiviteten til et gitt parti antistoff ifølge oppfinnelsen som notert ovenfor, kan bli bestemt ifølge velkjente fremgangsmåter. Fagmannen vil være i stand til å bestemme operative og optimale analysebetingelser for hver bestemmelse ved anvendelse av rutine-eksperimenter. The binding activity of a given batch of antibody according to the invention as noted above can be determined according to well-known methods. The person skilled in the art will be able to determine operative and optimal analysis conditions for each determination using routine experiments.

Andre slike trinn som vasking, røring, rysting, filtrering og lignende kan bli lagt til analysene som vanlig eller nødvendig for den bestemte situasjonen. Other such steps as washing, stirring, shaking, filtering and the like may be added to the analyzes as usual or necessary for the particular situation.

En av måtene som antistoffene kan bli detekterbart merket er ved binding av det samme til et enzym og anvendelse av en enzymimmunoanalyse (EIA). Dette enzymet vil igjen, når senere eksponert for et passende substrat, reagere med substratet på en slik måte at det produserer en kjemisk gruppe som kan bli detektert, for eksempel ved spektrofotometrisk, fluormetrisk eller ved visuelle midler. Enzymer som kan være nyttige for detekterbar merking av antistoffet omfatter, men er ikke begrenset til, malathydrogenase, stafylokokkal nuklease, delta 5-steroidisomeras, gjæralkoholdehydrogenase, alfa-glycerofosfatdehydrogenase, triosefosfatisomerase, pepperotperoksidase, alkalisk fosfatase, araparinase, glukoseoksidase, beta-galaktosidase, ribonuklease, urease, catalase, glukose-6-fosfatdehydrogenase, glukoamylase og acetylcholinesterase. Deteksjonen kan bli utført ved kolorimetriske metoder som benytter et kromogent substrat for enzymet. Deteksjon kan også bli oppnådd ved visuell sammenligning av graden av enzymatisk reaksjon av et substrat sammenlignet med tilsvarende fremstilte standarder. One of the ways in which the antibodies can be detectably labeled is by binding the same to an enzyme and using an enzyme immunoassay (EIA). This enzyme will in turn, when later exposed to a suitable substrate, react with the substrate in such a way as to produce a chemical group which can be detected, for example by spectrophotometric, fluorometric or visual means. Enzymes that may be useful for detectable labeling of the antibody include, but are not limited to, malate hydrogenase, staphylococcal nuclease, delta 5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydrogenase, alpha-glycerophosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, araparinase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease , urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase and acetylcholinesterase. The detection can be carried out by colorimetric methods that use a chromogenic substrate for the enzyme. Detection can also be achieved by visual comparison of the degree of enzymatic reaction of a substrate compared to similarly prepared standards.

Deteksjon kan bli oppnådd ved anvendelse av en hvilken som helst av en variasjon av andre immunoanalyser. For eksempel, ved radioaktivitetsmerking av antistoffene eller antistoffragmenter, er det mulig å detektere R-PTPase ved anvendelsen av en radioummunoanalyse (RIA). En god beskrivelse av RIA kan bli funnet i Laboratory, Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, av Works, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) med spesiell referanse til kapittelet med tittelen "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" av Chard, T., som er innlemmet her som referanse. Den radioaktive isotopen kan bli detektert ved slike midler som anvendelse av en y teller eller en scintillasjonsteller eller ved autoradiografi. Detection can be achieved using any of a variety of other immunoassays. For example, by radioactivity labeling the antibodies or antibody fragments, it is possible to detect R-PTPase using a radioimmunoassay (RIA). A good description of RIA can be found in Laboratory, Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Works, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) with particular reference to the chapter entitled "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard, T., which is incorporated herein by reference. The radioactive isotope can be detected by such means as the use of a y counter or a scintillation counter or by autoradiography.

Det er også mulig å merke et antistoff ifølge foreliggende opprinnelse med en It is also possible to label an antibody according to the present origin with a

fluorescerende forbindelse. Når det fluorescerensmerkede antistoffet er eksponert for lys med passende bølgelengde, kan dets nærvær bli detektert på grunn av fluorescens. Blant de vanligvis benyttede fluorescensmerkede merkeforbindelse er fluoresceinisotiocyanat, rodamin, fycoerytrin, pykocyanin, allofykocyanin, o-ftaldehyd og fluoreskamin. fluorescent compound. When the fluorescently labeled antibody is exposed to light of the appropriate wavelength, its presence can be detected due to fluorescence. Among the commonly used fluorescently labeled label compounds are fluorescein isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, pycocyanin, allophycocyanin, o-phthalaldehyde and fluorescamine.

Antistoffet kan også bli detekterbart merket ved anvendelse av fluorescensemitterende metaller slik som ^^ E, eller andre av lantanidseriene. Disse metallene kan bli festet til antistoffet ved anvendelse av slike metallchelaterende grupper som dietylentriaminpentaeddiksyre (ETPA). The antibody can also be detectably labeled using fluorescence-emitting metals such as ^^ E, or others of the lanthanide series. These metals can be attached to the antibody using such metal chelating groups as diethylenetriaminepentaacetic acid (ETPA).

Antistoffet kan også bli detekterbart merket ved kobling av det til en kjemiluminescerende forbindelse. Nærværet av det kjemiluminescerende merkede antistoffet blir så bestemt ved detektering av nærværet av luminescens som opptrer under forløpet av en kjemisk reaksjon. Eksempler på spesielt nyttige kjemiluminescerende merkede forbindelser er luminol, isoluminol, teromatisk akridiniumester, imidazol, akridiniumsalt og oksalatester. The antibody can also be detectably labeled by coupling it to a chemiluminescent compound. The presence of the chemiluminescent labeled antibody is then determined by detecting the presence of luminescence that occurs during the course of a chemical reaction. Examples of particularly useful chemiluminescent labeled compounds are luminol, isoluminol, terromatic acridinium ester, imidazole, acridinium salt and oxalate esters.

Likeledes kan en bioluminescerende forbindelse bli benyttet for å merke antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse. Bioluminescens er en type chemiluminscens funnet i biologiske systemer hvor et katalytisk protein øker effektiviteten av den kjemiluminescerende reaksjonen. Nærværet av et bioluminescensprotein blir bestemt ved detektering av nærværet av luminescens. Viktige bioluminscerende forbindelser for merkeformål er luciferin, luciferase og aequorin. Likewise, a bioluminescent compound can be used to label the antibody according to the present invention. Bioluminescence is a type of chemiluminescence found in biological systems where a catalytic protein increases the efficiency of the chemiluminescent reaction. The presence of a bioluminescent protein is determined by detecting the presence of luminescence. Important bioluminescent compounds for labeling purposes are luciferin, luciferase and aequorin.

Et antistoffmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse kan være tilpasset for anvendelse i en immunometrisk analyse, også kjent som en "two-site" eller "sandwich"-analyse. I en typisk immunometrisk analyse blir en mengde umerket antistoff (eller fragment av antistoff) bundet til en støtte eller bærer og en mengde detekterbart merket oppløselig antistoff blir tilsatt for å tillate detektering og/eller kvantifisering av det ternære produktet dannet mellom fastfaseantistoffet, antigenet og det merkede antistoff. An antibody molecule according to the present invention can be adapted for use in an immunometric analysis, also known as a "two-site" or "sandwich" analysis. In a typical immunometric assay, an amount of unlabeled antibody (or fragment of antibody) is bound to a support or support and an amount of detectably labeled soluble antibody is added to allow detection and/or quantification of the ternary product formed between the solid-phase antibody, the antigen, and the labeled antibody.

Typisk, og foretrukket, omfatter immunometriske analyser "forward"-analyser hvor antistoffet bundet til den faste fasen blir først brakt i kontakt med prøven som blir testet for å ekstrahere antigenet fra prøven ved dannelse av en binær fastfaseantistoff-antigenkompleks. Etter en passende inkuberingsperiode blir den faste støtten eller bæreren vasket for å fjerne resten av fluidprøven inkludert ikke-reagert antigen, hvis noe, og så brakt i kontakt med en oppløsning inneholdende en ukjent mengde merket antistoff (som virker som et "reportermolekyl"). Etter en andre inkubasjonsperiode for å tillate det merkede antistoffet å kompleksdanne med antigenet bundet til den faste støtten eller bæreren gjennom det umerkede antistoffet, blir den faste støtten eller bæreren vasket en andre gang for å fjerne det ikke-reagerte merkede antistoffet. Typically, and preferably, immunometric assays comprise "forward" assays where the antibody bound to the solid phase is first brought into contact with the sample being tested to extract the antigen from the sample by forming a binary solid phase antibody-antigen complex. After an appropriate incubation period, the solid support or support is washed to remove the remainder of the fluid sample including unreacted antigen, if any, and then contacted with a solution containing an unknown amount of labeled antibody (acting as a "reporter molecule"). After a second incubation period to allow the labeled antibody to complex with the antigen bound to the solid support or support through the unlabeled antibody, the solid support or support is washed a second time to remove the unreacted labeled antibody.

I en annen type "sandwich"-analyse som også kan være anvendelig med antigenene ifølge oppfinnelsen, blir såkalte "samtidige" og "reverse" analyser benyttet. En samtidig analyse omfatter et enkelt inkuberingstrinn hvor antistoffet bundet til den faste støtten eller bæreren og det merkede antistoffet begge blir tilsatt til prøven som blir testet samtidig. Etter at inkuberingen er fullstendig, blir den faste støtten eller bæreren vasket for å fjerne resten av fluidprøve og ikke-kompleksdannet merket antistoff. Nærværet av merket antistoff forbundet med fast støtte eller bærer blir så bestemt som om det var en konvensjonell "forward" sandwich-analyse. In another type of "sandwich" analysis which can also be used with the antigens according to the invention, so-called "simultaneous" and "reverse" analyzes are used. A simultaneous assay involves a single incubation step where the antibody bound to the solid support or carrier and the labeled antibody are both added to the sample being tested at the same time. After incubation is complete, the solid support or carrier is washed to remove residual fluid sample and uncomplexed labeled antibody. The presence of labeled antibody associated with a solid support or carrier is then determined as if it were a conventional "forward" sandwich assay.

I den "reverse" analysen blir det benyttet en trinnvis tilsetning først av en oppløsning merket antistoff til fluidprøven fulgt av tilsetning av ikke-merket antistoff bundet til en faststøtte eller bærer etter en passende inkuberingsperiode. Etter en andre inkubering blir den faste fasen vasket på en konvensjonell måte for å frigjøre den for resten av prøven som blir testet og oppløsningen av ikke-reagert merket antistoff. Bestemmelsen av merket antistoff forbundet med en faststøtte eller bærer blir så bestemt som i den "samtidige" og den "forward" analysen. In the "reverse" assay, a stepwise addition first of a solution of labeled antibody to the fluid sample is used followed by the addition of unlabeled antibody bound to a solid support or carrier after an appropriate incubation period. After a second incubation, the solid phase is washed in a conventional manner to free it of the remainder of the sample being tested and the solution of unreacted labeled antibody. The determination of the labeled antibody associated with a support or carrier is determined as in the "simultaneous" and the "forward" assay.

De nye proteinene ifølge oppfinnelsen kan, straks de er isolert, identifisert og karakterisert ved standard screening-prosedyrer, for eksempel gjær to-hybrid metoden, affinitetskromatografi og andre velkjente fremgangsmåter, bli produsert ved en hvilken som helst standard rekombinant DNA prosedyre (se for eksempel Sambrook et al., 1989) hvor passende eukaryote eller prokaryote vertceller blir transformert ved passende eukaryote eller prokaryote vektorer inneholdende sekvensene som koder for proteinene. Følgelig omfatter oppfinnelsen også slike ekspresjonsvektorer og transformerte verter for produksjon av proteinene ifølge oppfinnelsen. Som nevnt ovenfor omfatter disse proteinene deres biologisk aktive analoger og derivater og således vektorene som koder for dem også inkludert vektorene som koder for analogene av disse proteinene og de transformerte vertene inkludert de som produserer slike analoger. Derivatene av disse proteinene er derivatene produsert ved standard modifikasjon av proteinene eller deres analoger, produsert ved transformerte verter. The new proteins according to the invention can, once they have been isolated, identified and characterized by standard screening procedures, for example the yeast two-hybrid method, affinity chromatography and other well-known methods, be produced by any standard recombinant DNA procedure (see for example Sambrook et al., 1989) where appropriate eukaryotic or prokaryotic host cells are transformed by appropriate eukaryotic or prokaryotic vectors containing the sequences encoding the proteins. Consequently, the invention also includes such expression vectors and transformed hosts for the production of the proteins according to the invention. As mentioned above, these proteins include their biologically active analogs and derivatives and thus the vectors encoding them also including the vectors encoding the analogs of these proteins and the transformed hosts including those that produce such analogs. The derivatives of these proteins are the derivatives produced by standard modification of the proteins or their analogues, produced by transformed hosts.

Ifølge et annet aspekt angår oppfinnelsen anvendelsen av det fri intracellulære området av p55 TNR-R (p55IC) eller FAS-R (FAS-IC) eller deres såkalte "dødsområder" til fremstilling av et medikament til behandling av spesifikke lidelser (henholdsvis p55DD eller FAS-DD som et middel for øking av TNF eller FAS-R ligandeffekten på celler, eller på dets eget (se eksempel 2). Hvor det er ønskelig å innføre en TNF- eller FAS-R ligandindusert cytotoksisk effekt i celler, for eksempel cancerceller eller HIV-infiserte celle, kan p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD bli introdusert i slike celler ved anvendelse av de ovenfor angitte (se (i) ovenfor) rekombinante dyrevirus (for eksempel vaccinia) tilnærmingen. Her kan også de native p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, biologisk aktive analoger og derivater eller fragmenter derav, bli benyttet, alle av hvilke kan bli fremstilt som angitt ovenfor. According to another aspect, the invention relates to the use of the free intracellular region of p55 TNR-R (p55IC) or FAS-R (FAS-IC) or their so-called "death regions" for the preparation of a drug for the treatment of specific disorders (p55DD or FAS, respectively -DD as a means of increasing the TNF or FAS-R ligand effect on cells, or on its own (see example 2). Where it is desirable to introduce a TNF- or FAS-R ligand-induced cytotoxic effect in cells, for example cancer cells or HIV-infected cell, p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD can be introduced into such cells using the above-mentioned (see (i) above) recombinant animal virus (eg vaccinia) approach. Here also the native p55IC , p55DD, FAS-IC or FAS-DD, biologically active analogues and derivatives or fragments thereof, can be used, all of which can be prepared as indicated above.

Likeledes muliggjør foreliggende oppfinnelse også den spesifikke blokkeringen av TNF-effekten eller FAS-R ligandeffekten ved blokkering av aktiviteten av p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, for eksempel antisens oligonukleotider kan bli innført i cellene ved blokkering av ekspresjonen av p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD. Likewise, the present invention also enables the specific blocking of the TNF effect or the FAS-R ligand effect by blocking the activity of p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, for example antisense oligonucleotides can be introduced into the cells by blocking the expression of p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD.

Foreliggende oppfinnelse angår også farmasøytiske sammensetninger omfattende rekombinante dyrevirusvektorer som koder for det TNF-R eller FAS-R intracellulære områdebindende proteinene (inkludert p55IC, p55DD, FAS-IC og FAS-DD), hvilken vektor også koder for et virusoverflateprotein som er i stand til å binde spesifikke målcelle (for eksempel cancerceller) overflateproteiner for å rette innsettingen av de intracellulære områdebindende proteinsekvensene i cellene. The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising recombinant animal virus vectors encoding the TNF-R or FAS-R intracellular domain binding proteins (including p55IC, p55DD, FAS-IC and FAS-DD), which vector also encodes a virus surface protein capable of to bind specific target cell (eg cancer cells) surface proteins to direct the insertion of the intracellular site-binding protein sequences into the cells.

Ifølge et annet aspekt angår foreliggende oppfinnelse også spesifkt effektene av de selv-assosierende intracellulære områdene av p55 TNF reseptor (p55-IC, se eksempel 2). Et eksempel på slike effekter som er en effekt normalt medisert ved TNF binding til dets reseptor og som blir etterlignet med signaleringsaktiviteten til de selv-assosierende p55-IC eller deler derav, er induksjonen av ekspresjon av genet som koder for IL-8. IL-8 er et cytokin som hører til subklassen av kjemokiner som har primær kjemotaktisk aktivitet, og har blitt vist å spille en nøkkelrolle i kjemotaksisen av granulocytter og andre celletyper forbundet med et antall patologiske tilstander (se for eksempel Endo et al., 1994; Sekido et al., 1993; Harada et al., 1993; Ferrick et al., 1991). According to another aspect, the present invention also specifically relates to the effects of the self-associating intracellular regions of the p55 TNF receptor (p55-IC, see example 2). An example of such effects which is an effect normally mediated by TNF binding to its receptor and which is mimicked by the signaling activity of the self-associating p55-IC or parts thereof, is the induction of expression of the gene that codes for IL-8. IL-8 is a cytokine belonging to the subclass of chemokines that have primary chemotactic activity, and has been shown to play a key role in the chemotaxis of granulocytes and other cell types associated with a number of pathological conditions (see, for example, Endo et al., 1994; Sekido et al., 1993; Harada et al., 1993; Ferrick et al., 1991).

TNF har en fordelaktig aktivitet og blir benyttet som sådan ved behandling for å ødelegge tumorceller og virusinfiserte celler eller for å øke antibakteriell aktiviteter til granulocytter. Imidlertid, som angitt ovenfor, har TNF også uønskede aktiviteter i hvilke tilfeller det er ønskelig å blokkere dets aktivitet, inkludert de situasjone hvor store doser TNF blir benyttet i cancerterapi, antiviral terapi eller antibakteriell terapi. TNF has a beneficial activity and is used as such in treatment to destroy tumor cells and virus-infected cells or to increase the antibacterial activities of granulocytes. However, as indicated above, TNF also has undesirable activities in cases where it is desirable to block its activity, including those situations where large doses of TNF are used in cancer therapy, antiviral therapy or antibacterial therapy.

Følgelig er det ønskelig å være i stand til å rette TNF eller et stoff som er i stand til å etterligne dets fordelaktige aktivitet til cellene eller vevene som er spesifikt ønskelig å behandle. Accordingly, it is desirable to be able to direct TNF or a substance capable of mimicking its beneficial activity to the cells or tissues specifically desired to be treated.

Ifølge foreliggende oppfinnelse har det blitt funnet at det selv-assosierende intracellulære området av p55-R (p55-IC) kan, på en liganduavhengig måte, etterligne et antall av effektene av TNF, for eksempel "dødsområdet" av p55-IC kan indusere cytotoksiske effekter på celler og at p55-IC kan indusere BL-8 genekspresjon. Således er det mulig å benytte p55-IC for å etterligne TNF funksjon på en seterettet måte, dvs. å innføre pSS-IC kun i de celler eller vev det er ønskelig å behandle. According to the present invention, it has been found that the self-associating intracellular region of p55-R (p55-IC) can, in a ligand-independent manner, mimic a number of the effects of TNF, for example the "death region" of p55-IC can induce cytotoxic effects on cells and that p55-IC can induce BL-8 gene expression. Thus, it is possible to use p55-IC to mimic TNF function in a site-directed manner, i.e. to introduce pSS-IC only in the cells or tissues it is desired to treat.

Et annet eksempel på den ovenfor nevnte tilnærming som nevnt ovenfor, er spesifikt å transfektere (transformere) tumorceller eller malignt vev med en DNA molekyl som koder for pSS-IC eller en del derav som kan indusere ikke kun cytotoksiske effekter på slike celler eller vev, men også øke disse effektene ved såkalt ko-induksjon av IL-8, som vil resultere i akkumulering ved setet av disse cellene eller vevene av granulocytter og andre lymfocytter, som igjen vil tjene til å ødelegge tumorcellene eller vev. Denne tilnærmingen unngår behovet for administrasjon av store doser TNF med dets forbundne skadende bieffekter. Another example of the above-mentioned approach as mentioned above is to specifically transfect (transform) tumor cells or malignant tissue with a DNA molecule encoding pSS-IC or a part thereof which can induce not only cytotoxic effects on such cells or tissue, but also increase these effects by so-called co-induction of IL-8, which will result in the accumulation at the site of these cells or tissues of granulocytes and other lymphocytes, which will in turn serve to destroy the tumor cells or tissues. This approach avoids the need for administration of large doses of TNF with its associated harmful side effects.

Ved anvendelse av konvensjoll rekombinant DNA teknologi er det mulig å fremstille forskjellige regioner v p55-IC og å bestemme hvilke region som er ansvarlig for hver TNF-indusert effekt, for eksempel er det funnet at "dødsområdet" er ansvarlig for cytotoksisitet (eksempel 2), og det er allerede fremstilt forskjellige andre konstrukter inneholdende deler av p55-IC, hvilke deler (sammen med deler eller hele dødsområdet) kan være ansvarlig for andre TNF-effekter, og som kan bli benyttet på en liganduavhengig måte straks den er selv-assosiert for aktivitet, for å indusere disse effektene, for eksempel IL-8 induksjon. Using conventional recombinant DNA technology, it is possible to produce different regions of v p55-IC and to determine which region is responsible for each TNF-induced effect, for example, it has been found that the "death region" is responsible for cytotoxicity (Example 2) , and various other constructs have already been produced containing parts of p55-IC, which parts (together with parts or the entire death region) may be responsible for other TNF effects, and which can be used in a ligand-independent manner once it is self-associated for activity, to induce these effects, for example IL-8 induction.

Det må noteres at sekvensen av p55-IC omfatter induksjon av andre TNF-assosierte effekter (for eksempel EL-8 induksjon) kan være forskjellig fra den involvet i cytotoksisitet, dvs. kan omfatte ingen eller kun deler av "dødsområdet" og ha andre sekvensmotiver fra andre regioner av det intracellulære området eller kan være den samme sekvens, forskjellige egenskaper ved sekvensen (samme sekvensmotiv) som blir involvert i induksjonen av forskjellige effekter. It must be noted that the sequence of p55-IC involved in the induction of other TNF-associated effects (for example EL-8 induction) may be different from that involved in cytotoxicity, i.e. may include none or only parts of the "death region" and have other sequence motifs from other regions of the intracellular area or may be the same sequence, different properties of the sequence (same sequence motif) being involved in the induction of different effects.

Følgelig, som detaljert ovenfor og nedenfor, kan ekspresjonvektorer inneholdende disse p55-IC delene, analoger eller derivater derav, bli fremstilt, uttrykt i vertceller, renset og testet for deres aktivitet. På denne måten kan et antall slike p55-IC fragmenter som har en eller flere TNF-assosierte aktiviteter bli fremstilt og benyttet på en differentiell måte for behandling av et stort antall patologiske tilstander, for eksempel virale infeksjoner, bakterielle infeksjoner, tumorer osv. I alle disse situasjonene kan den spesifikke aktiviteten bli øket ved innlemming (eller ko-transfeksjon) med p55-IC fragmentet som er ansvarlig for IL-8 genekspresjoninduksjon, tillate den ønskelige IL-8 kjemotaktiske aktiviteten å øke destruksjonen av cellene eller vevene det er ønskelig å ødelegge. Accordingly, as detailed above and below, expression vectors containing these p55-IC portions, analogs or derivatives thereof can be prepared, expressed in host cells, purified and tested for their activity. In this way, a number of such p55-IC fragments having one or more TNF-associated activities can be prepared and used in a differential manner for the treatment of a large number of pathological conditions, for example viral infections, bacterial infections, tumors, etc. In all in these situations, the specific activity can be increased by incorporation (or co-transfection) with the p55-IC fragment responsible for IL-8 gene expression induction, allowing the desired IL-8 chemotactic activity to increase the destruction of the cells or tissues it is desired to destroy .

Således, uten administrering systematisk av TNF, er det mulig å indusere dets ønskelige effekter ved spesifikt å innføre hele eller deler av p55-IC i cellene eller vevene det er ønskelig å behandle. Thus, without systemic administration of TNF, it is possible to induce its desired effects by specifically introducing all or parts of p55-IC into the cells or tissues it is desired to treat.

p55-IC kan bli introdusert spesifikt i cellene eller vev det er ønskelig å ødelegge ved en hvilken som helst av de ovenfor nevnte prosedyrene. For eksempel, en måte å gjøre dette er å danne et rekombinant animalsk virus, for eksempel avledet fra Vaccinia, til hvilket DNA de følgende to gener vil bli innført: genet som koder for en ligand som binder til celleoverflateproteinene som spesifikt blir uttrykt ved cellene, for eksempel et slikt som AJDS virus gp 120 protein som binder spesifikt til noen celler (CD4 p55-IC can be introduced specifically into the cells or tissues it is desired to destroy by any of the above procedures. For example, one way of doing this is to form a recombinant animal virus, for example derived from Vaccinia, into which DNA the following two genes will be introduced: the gene encoding a ligand that binds to the cell surface proteins specifically expressed by the cells, for example, such as the AJDS virus gp 120 protein that binds specifically to some cells (CD4

lymfocytter og beslektede hvite blodlegemer) eller eventuelt andre ligander som binder spesifikt til celler som bærer TNF-R, slik at den rekombinante virusvektoren kan være i stand til å binde til slike TNF-R bærende celler; og genet som koder for p55-IC eller en del derav. Således vil ekspresjonen av celleoverflatebindende protein på overflaten av viruset målrette viruset spesifikt til tumorcellen eller andre TNF-R-bærende celle, etter hvilke p55-IC eller deler derav som koder for sekvensen, vil bli innført i cellen via lymphocytes and related white blood cells) or optionally other ligands that bind specifically to cells bearing TNF-R, so that the recombinant viral vector may be able to bind to such TNF-R bearing cells; and the gene encoding p55-IC or part thereof. Thus, the expression of cell surface binding protein on the surface of the virus will target the virus specifically to the tumor cell or other TNF-R-bearing cell, after which p55-IC or parts thereof encoding the sequence will be introduced into the cell via

viruset og straks uttrykt i cellene vil det resultere i økning av TNF effekt som fører til avlivning av tumorcellene eller andre TNF-R bærende celler det er ønskelig å avlive eller induksjon, for eksempel, av IL-8 som vil føre til celledød. Konstruksjon av slikt rekombinant animalsk virus ved standard prosedyrer (se for eksempel Sambrook et al., 1989). Andre muligheter er å innføre sekvensene av p55-IC eller deler derav i form av oligonukleotider som kan bli absorbert ved cellene og uttrykt deri. the virus and immediately expressed in the cells, it will result in an increase in the TNF effect which leads to the killing of the tumor cells or other TNF-R bearing cells it is desirable to kill or the induction, for example, of IL-8 which will lead to cell death. Construction of such recombinant animal virus by standard procedures (see, for example, Sambrook et al., 1989). Other possibilities are to introduce the sequences of p55-IC or parts thereof in the form of oligonucleotides that can be absorbed by the cells and expressed therein.

Foreliggende oppfinnelse angår således spesifikt farmasøytiske sammensetninger omfattende de ovenfor nevnte rekombinante animalske virusvektorene som koder for p55-IC eller deler derav, hvis vektor også koder for et virusoverflateprotein som er i stand til å binde spesifikke målcelle (for eksempel cancerceller) overflateproteiner for å rette innsettingen av p55-IC eller deler derav, sekvenser inn i cellene. The present invention thus specifically relates to pharmaceutical compositions comprising the above-mentioned recombinant animal virus vectors that encode p55-IC or parts thereof, whose vector also encodes a virus surface protein that is capable of binding specific target cell (for example cancer cells) surface proteins to direct insertion of p55-IC or parts thereof, sequences into the cells.

Det kan også pekes på nye syntetiske TNF reseptorer som er oppløselige og i stand til oligomerisering for å danne dimere, og muligens også høyere ordens multimere, TNF reseptormolekyler, hvor hver monomere del av disse reseptorene er i stand til å danne en TNF monomer. TNF opptrer naturlig som en homotrimer inneholdende tre aktive TNF monomerer som hver i stand til binding til et enkelt TNF reseptormolekyl, mens TNF reseptorene opptrer normalt som monomere som hver er i stand til binding kun til en av monomerene av det TNF homotrimeriske molekylet. Således, når TNF binder til TNF reseptorene på celleoverflaten, er i stand til binding til tre reseptormolekyler for å resultere i clustering av TNF reseptorene som er antatt å være starten av signaleringsprosessen som til sist utløser den observerte TNF effekten på cellene. It can also be pointed to new synthetic TNF receptors that are soluble and capable of oligomerization to form dimers, and possibly also higher order multimers, TNF receptor molecules, where each monomeric part of these receptors is capable of forming a TNF monomer. TNF naturally acts as a homotrimer containing three active TNF monomers, each capable of binding to a single TNF receptor molecule, while the TNF receptors normally act as monomers, each capable of binding only to one of the monomers of the TNF homotrimeric molecule. Thus, when TNF binds to the TNF receptors on the cell surface, it is able to bind to three receptor molecules to result in clustering of the TNF receptors which is believed to be the start of the signaling process that ultimately triggers the observed TNF effect on the cells.

Mens TNF har mange ønskede effekter slik som muligheten til å ødelegge, for eksempel, tumorceller eller virusinfiserte celler og å øke antibakterielle aktiviteter til granulocytter, har imidlertid TNF mange uønskede effekter slik som, for eksempel, i mange alvorlige sykdommer inkludert autoimmune sykdommer, reumatoid arthritis, graft-versus-vertreaksjon (implantatawisning), septisk sjokk, har TNF blitt involvert som hovedårsak for den patologiske vevsødeleggelsen. TNF kan også forårsake stort vekttap (cachexia) ved å undertrykke aktivitetene av adipocytes. Imidlertid, selv når adminstrert for det ønskede aktivitet, for eksempel for behandling av forskjellige maligne eller virale sykdommer, er doseringen av TNF som blir benyttet, ofte høy nok til å forårsake et antall uønskede bieffekter hos pasienten, for eksempel destruksjon av sunt vev. While TNF has many desired effects such as the ability to destroy, for example, tumor cells or virus-infected cells and to increase the antibacterial activities of granulocytes, however, TNF has many undesirable effects such as, for example, in many serious diseases including autoimmune diseases, rheumatoid arthritis , graft-versus-host reaction (implant destruction), septic shock, TNF has been implicated as the main cause of the pathological tissue destruction. TNF can also cause large weight loss (cachexia) by suppressing the activities of adipocytes. However, even when administered for the desired activity, for example for the treatment of various malignant or viral diseases, the dosage of TNF used is often high enough to cause a number of undesirable side effects in the patient, for example destruction of healthy tissue.

Følgelig, i alle av de ovenfor nevnte tilfellene hvor TNF virkning er uønsket, har det vært søkt etter en effektiv hemmer for TNF. Mange TNF blokkerende midler har vært foreslått, inkludert oppløselige proteiner som er i stand til å binde TNF og hemme dets binding til dets reseptorer og således hemme de cytotoksiske effektene av TNF (se EP 308378, EP 398327 og EP 568925). Imidlertid er disse TNF bindende proteinene, eller oppløselige TNF reseptorer, monomere som hver binder kun en TNF monomer av TNF homotrimeren. Således kan blokkeringen av TNF funksjonen ikke være fullstendig da hvert monomere reseptorbundet TNF molekyl fremdeles har to TNF monomerer som er fritt i stand til å binde celleoverflate TNF reseptorer og gi dets effekter på cellene. Consequently, in all of the above-mentioned cases where TNF action is undesirable, an effective inhibitor of TNF has been sought. Many TNF blocking agents have been proposed, including soluble proteins capable of binding TNF and inhibiting its binding to its receptors and thus inhibiting the cytotoxic effects of TNF (see EP 308378, EP 398327 and EP 568925). However, these TNF binding proteins, or soluble TNF receptors, are monomers that each bind only one TNF monomer of the TNF homotrimer. Thus, the blocking of the TNF function cannot be complete as each monomeric receptor-bound TNF molecule still has two TNF monomers which are freely able to bind cell surface TNF receptors and produce its effects on the cells.

For å overvinne de ovenfor nevnte ulempene ved blokkering av TNF funksjon har det blitt utviklet midler for konstruksjon, som fusjonsproteiner, oppløselige oligomere TNF reseptorer som er i stand til binding av minst to TNF monomerer av naturlig forekommende TNF homotrimermolekyl. Som en konsekvens binder disse oppløselige TNF reseptorene sterkere til deres TNF ligand enn tidligere kjente monomeroppløselige TNF bindende proteiner eller reseptorer. For eksempel, når den oppløselige TNF reseptor ifølge oppfinnelsen er i form av en dimer, er den i stand til å binde to TNF monomerer av en TNF trirner og således forårsake en mer fullstendig nøytralisering av TNF, hvor nøytraliseringen er mer standhaftig på grunn av lavere dissosiasjonsrate for de dimere oppløselige reseptorene fra TNF. Videre er slike oppløselige, oligomere reseptorer også større enn deres monomere motparter og således har de farmasøytisk også fordeler på grunn av sannsynligheten av at de har en saktere utskillingshastighet fra kroppen. In order to overcome the above-mentioned disadvantages of blocking TNF function, means have been developed for constructing, as fusion proteins, soluble oligomeric TNF receptors which are capable of binding at least two TNF monomers of the naturally occurring TNF homotrimer molecule. As a consequence, these soluble TNF receptors bind more strongly to their TNF ligand than previously known monomer soluble TNF binding proteins or receptors. For example, when the soluble TNF receptor according to the invention is in the form of a dimer, it is able to bind two TNF monomers of a TNF triner and thus cause a more complete neutralization of TNF, where the neutralization is more persistent due to lower dissociation rate of the dimeric soluble receptors from TNF. Furthermore, such soluble, oligomeric receptors are also larger than their monomeric counterparts and thus pharmaceutically also have advantages due to the likelihood that they have a slower rate of excretion from the body.

Basis for utviklingen av de oppløselige oligomere TNF reseptorene var oppdagelsen at det intracellulære området av p55-R TNF reseptoren var i stand til selv-assosiasjon og videre at innen dette intracellulære området (p55-IC) eksisterer det en region, det såkalte "dødsområdet", som også er i stand til selv-assosiering og som sådan på en liganduavhengig måte, kan forårsake cytotoksiske effekter på cellene (se eksempel 2). Ved anvendelse av denne selv-assosiasjonsegenskapen til p55-IC og dets "dødsområde" er det således mulig å konstruere et fusjonsprotein ved anvendelse av standard rekombinant DNA teknologi inneholdende hovedsakelig hele det ektracellulære området av en TNF reseptor slik som p75-R eller p55-R reseptorer, fortrinnsvis p55-R, og sammensmeltet med dette, hovedsakelig hele det ekstracellulære området (p55-IC) eller dødsområdet av p55-IC. På denne måten ble det produsert et nytt fusjonsprodukt som på sin ene ende har det TNF bindende området, dvs. det ekstracellulære området av reseptoren, og på dets andre ende det intracellulære området eller dødsområdet derav som er i stand til selv-assosiering. Følgelig kan et slikt produkt oligomerisere ved selv-assosiasjon mellom to (og.muligens flere) p55-IC eller dødsområder derav for å gi oligomerer (eller i det minste dimerer) som har minst to TNF bindende områder. The basis for the development of the soluble oligomeric TNF receptors was the discovery that the intracellular region of the p55-R TNF receptor was capable of self-association and further that within this intracellular region (p55-IC) there exists a region, the so-called "death region" , which is also capable of self-association and as such in a ligand-independent manner, can cause cytotoxic effects on the cells (see example 2). By using this self-association property of p55-IC and its "dead region" it is thus possible to construct a fusion protein using standard recombinant DNA technology containing essentially the entire extracellular region of a TNF receptor such as p75-R or p55-R receptors, preferably p55-R, and fused thereto, essentially the entire extracellular region (p55-IC) or the death region of p55-IC. In this way, a new fusion product was produced which has at one end the TNF binding region, i.e. the extracellular region of the receptor, and at its other end the intracellular region or dead region thereof which is capable of self-association. Accordingly, such a product can oligomerize by self-association between two (and possibly more) p55-IC or dead regions thereof to give oligomers (or at least dimers) having at least two TNF binding regions.

Videre har det også blitt oppdaget at Fas/APOl reseptoren har et selv-assosierende, intracellulært område inklusivt et selv-assosierende "dødsområde" som har en viss homologi med p55-IC og dødsområdet derav (eksempel 2). Følgelig er det mulig å konstruere de oppløselige, oligomere TNF reseptorene ved sammensmelting av det ekstracellulære området av TNF reseptoren (som angitt ovenfor) til det intracellulære området eller "dødsområdet" av Fas/APOl reseptoren. Furthermore, it has also been discovered that the Fas/APO1 receptor has a self-associating, intracellular region including a self-associating "death region" which has some homology to p55-IC and the death region thereof (Example 2). Accordingly, it is possible to construct the soluble, oligomeric TNF receptors by fusing the extracellular region of the TNF receptor (as indicated above) to the intracellular region or "dead region" of the Fas/APO1 receptor.

I begge av de to ovennevnte situasjonene er de oligomere TNF reseptorene oppløselige ved at de kun har det oppløselige ekstracellulære området av TNF réseptoren og det oppløselige intracellulære området eller dødsområdet derav av enten pS5-R TNF reseptoren eller Fas/APOl reseptoren, dvs. de inneholder ikke det transmembrane (uoppløselige) området av noen av disse reseptortypene. In both of the above two situations, the oligomeric TNF receptors are soluble in that they only have the soluble extracellular region of the TNF receptor and the soluble intracellular region or dead region thereof of either the pS5-R TNF receptor or the Fas/APO1 receptor, i.e. they contain not the transmembrane (insoluble) region of any of these receptor types.

Konstruksjonen av de ovenfor nevnte oligomere TNF reseptorene er beskrevet i detalj nedenfor i eksempel 4. Det må imidlertid noteres at etter konstruksjon av de oligomere TNF reseptorene, kan det oppstå en situasjon som ikke tidligere er rapportert, dvs. at det ekstracellulære området av TNF reseptoren er i stand til selv-assosiering, en situasjon som ikke er ønskelig da den kan forstyrre med evnen av den oligomere reseptoren til å binde til to eller flere TNF monomerer av de TNF homotrimere molekyler eller føre til mindre enn optimal binding av slike TNF monomerer. Følgelig er det mulig i en slik situasjon ved standard rekombinante DNA prosedyrer å modifisere det ekstracellulære området av TNF reseptoren ved, for eksempel, deletering eller substituering av en eller flere aminosyrerester inneholdt i den selv-assosierende region for å forhindre slik selv-assosiering. Slike modifikasjoner av det ekstracellulære området av TNF reseptoren er således del av den foreliggende oppfinnelse og er angitt her som analoger eller derivater av det ekstracellulære området av TNF reseptoren. På en tilsvarende måte kan det selv-assosierende intracellulære området (IC) eller dødsområdet (DD) derav av p55-reseptoren eller Fas/APl reseptoren benyttet i de oligomere TNF reseptorene, også være analoger eller derivater derav, dvs. kan være en hvilken som helst modifikasjon av p55-IC sekvensen eller deler derav inkludert dødsområdet (p55DD), eller en hvilken som helst modifikasjon av Fas/APOl intracellulære område (FAS-IC) sekvensen eller deler derav inkludert dødsområdet (FAS DD) forutsatt at disse modifikasjonene gir et selv-assosierende produkt. The construction of the above-mentioned oligomeric TNF receptors is described in detail below in example 4. However, it must be noted that after construction of the oligomeric TNF receptors, a situation may arise that has not previously been reported, i.e. that the extracellular region of the TNF receptor is capable of self-association, a situation which is not desirable as it may interfere with the ability of the oligomeric receptor to bind to two or more TNF monomers of the TNF homotrimeric molecules or lead to less than optimal binding of such TNF monomers. Consequently, it is possible in such a situation by standard recombinant DNA procedures to modify the extracellular region of the TNF receptor by, for example, deletion or substitution of one or more amino acid residues contained in the self-associating region to prevent such self-association. Such modifications of the extracellular region of the TNF receptor are thus part of the present invention and are indicated here as analogues or derivatives of the extracellular region of the TNF receptor. In a similar way, the self-associating intracellular region (IC) or the death region (DD) thereof of the p55 receptor or the Fas/AP1 receptor used in the oligomeric TNF receptors can also be analogues or derivatives thereof, i.e. can be any which preferably modification of the p55-IC sequence or parts thereof including the death region (p55DD), or any modification of the Fas/APOl intracellular region (FAS-IC) sequence or parts thereof including the death region (FAS DD) provided that these modifications provide a self -associating product.

Tilsvarende, straks produsert og renset, kan de oppløselige oligomere TNF reseptorene, analogene eller derivatene derav, bli ytterligere modifisert ved standard kjemiske midler for å gi salter og funksjonelle derivater derav for formålet for preparering av farmasøytiske sammensetninger inneholdende som aktive ingredienser disse TNF reseptorene. Correspondingly, immediately produced and purified, the soluble oligomeric TNF receptors, analogues or derivatives thereof, can be further modified by standard chemical means to give salts and functional derivatives thereof for the purpose of preparing pharmaceutical compositions containing as active ingredients these TNF receptors.

For produksjon av de oppløselige, oligomere TNF reseptorene blir DNA sekvensene som koder for det ekstracellulære området av TNF reseptoren oppnådd fra eksisterende kloner av hele TNF reseptoren, således blir det intracellulære området av dødsområdet derav, og er også det intracellulære området eller dødsområdet av Fas/APOl reseptoren (se eksempel 2 og eksempel 5). På denne måten blir DNA sekvensen av det ønskede ekstracellulære området ligert til DNA sekvensen av det ønskede intracellulære området eller del derav inkludert dødsområdet, og dette sammensmeltede proteinet blir satt inn (og ligert) i en passende ekspresjonsvektor under kontroll av promotoren og andre ekspresjonskontrollerende sekvenser. Straks dannet, blir ekspresjonsvektoren introdusert (transformasjon, transfeksjon osv.) inn i en passende vertcelle som så uttrykker vektoren for å gi fusjonsproduktet ifølge oppfinnelsen som er de oppløselige selv-assosierende TNF reseptormolekylene. Disse blir så renset fra vertcellene ved standard prosedyrer for å gi det endelige produktet som er de oppløselige, oligomere TNF reseptorene. For the production of the soluble, oligomeric TNF receptors, the DNA sequences that code for the extracellular region of the TNF receptor are obtained from existing clones of the entire TNF receptor, thus the intracellular region becomes the death region thereof, and is also the intracellular region or the death region of Fas/ the APO1 receptor (see example 2 and example 5). In this way, the DNA sequence of the desired extracellular region is ligated to the DNA sequence of the desired intracellular region or part thereof including the dead region, and this fused protein is inserted (and ligated) into a suitable expression vector under the control of the promoter and other expression-controlling sequences. Once formed, the expression vector is introduced (transformation, transfection, etc.) into a suitable host cell which then expresses the vector to yield the fusion product of the invention which is the soluble self-associating TNF receptor molecules. These are then purified from the host cells by standard procedures to yield the final product which is the soluble, oligomeric TNF receptors.

Det foretrukne preparatet av fusjonsproduktet som koder for det ekstracellulære området og det intracellulære området eller deler derav, er ved hjelp av PCR teknologi ved anvendelse av oligonukleotider som er spesifikke for de ønskede sekvensene som skal kopieres fra klonene som koder for hele TNF reseptormolekylet. Andre midler er også mulige, slik som isolering av de ønskelige delene som koder for det ekstracellulære området og det intracellulære området, ved restriksjonsendonukleaser og så spleising av disse sammen på en kjent måte, med eller uten modifikasjoner ved de terminale endene av restriksjonsfragmentene for å sikre korrekt fusjon av de ønskede delene av reseptoren (ekstracellulære og intracellulære områder eller deler derav). De således oppnådde fusjonsproduktene blir så satt inn i den ønskede ekspresjonsvektoren. The preferred preparation of the fusion product that codes for the extracellular region and the intracellular region or parts thereof is by means of PCR technology using oligonucleotides that are specific for the desired sequences to be copied from the clones that code for the entire TNF receptor molecule. Other means are also possible, such as isolating the desired portions encoding the extracellular region and the intracellular region by restriction endonucleases and then splicing these together in a known manner, with or without modifications at the terminal ends of the restriction fragments to ensure correct fusion of the desired parts of the receptor (extracellular and intracellular regions or parts thereof). The thus obtained fusion products are then inserted into the desired expression vector.

På en tilsvarende måte muliggjøres også oppløselige, oligomere Fas/APOl (FAS) reseptorer inneholdende det ekstracellulære området av Fas/APOl reseptoren og det selv-assosiserende intracellulære området av p55-R (p55-IC), dødsområdet derav (p55DD), eller det selv-assosierende intracellulære området av Fas/APOl reseptoren In a similar way, soluble, oligomeric Fas/APO1 (FAS) receptors containing the extracellular region of the Fas/APO1 receptor and the self-associating intracellular region of p55-R (p55-IC), the death region thereof (p55DD), or the self-associating intracellular region of the Fas/APO1 receptor

(FAS-IC) eller dødsområdet derav (FAS DD), eller hvilke som helst analoger eller derivater derav (se ovenfor). Konstruksjonen av disse oppløselige, oligomere FAS reseptorene er beskrevet i detalj i eksempel 5 nedenfor, ved hjelp av en tilgjengelig klonet full-lengde FAS reseptorkodende sekvens som startmateriale og de passende oligonukleotidene for PCR produksjon av de ønskede ekstracellulære og intracellulære områdene, fulgt av ligering derav for å gi et fusjonsprodukt som så kan bli satt inn en passende ekspresjonsvektor. Som angitt ovenfor og under, kan prokaryote eller eukaryote vektorer og vertceller bli benyttet for å produsere de ønskede, oligomere FAS reseptorene, som så kan bli renset og formulert, som aktiv ingrediens, i en farmasøytisk sammensetning. (FAS-IC) or its dead area (FAS DD), or any analogues or derivatives thereof (see above). The construction of these soluble, oligomeric FAS receptors is described in detail in Example 5 below, using an available cloned full-length FAS receptor coding sequence as starting material and the appropriate oligonucleotides for PCR production of the desired extracellular and intracellular regions, followed by ligation thereof to yield a fusion product which can then be inserted into an appropriate expression vector. As indicated above and below, prokaryotic or eukaryotic vectors and host cells can be used to produce the desired oligomeric FAS receptors, which can then be purified and formulated, as an active ingredient, in a pharmaceutical composition.

De ovenfor nevnte oppløselige, oligomere FAS reseptorene er ment for effektiv blokkering av Fas liganden, som også eksisterer som en trimer (tilsvarende til TNF, se ovenfor), hvor hver oligomer reseptor er i stand til å binde to eller muligens flere Fas ligander og derved nøytralisere deres aktivitet. Fas liganden er kjent å være hovedsakelig celleoverflateassosiert, men kan også eksistere i en oppløselig form. I ethvert tilfelle kan de oligomere FAS reseptorene binde i det minst to monomerer av denne liganden og derved nøytralisere mer effektivt (enn monomere FAS reseptorer) aktiviteten til Fas liganden. Fas liganden, og således aktivering derved av FAS reseptoren, har blitt sett i sammenheng med et antall patologiske tilstander, spesielt de som angår leverskade (apoptosis av hepatocytter, for eksempel), omfatter leverskade forbundet med hepatitis, så vel som i autoimmune tilstander, inkludert lymfocyttskade (apoptosis) hos HIV-infiserte mennesker (se for eksempel Ogasawara et al., 1993, Cheng et al., 1994). Følgelig er de oppløselige, oligomere FAS reseptorene ment for blokkering av aktiviteten til Fas liganden og kan bli benyttet som aktiv ingrediens i farmasøytiske sammensetninger for behandling av slike Fas ligand-forbundne patologiske tilstander. The above-mentioned soluble, oligomeric FAS receptors are intended for effective blocking of the Fas ligand, which also exists as a trimer (similar to TNF, see above), where each oligomeric receptor is able to bind two or possibly more Fas ligands and thereby neutralize their activity. The Fas ligand is known to be mainly cell surface associated, but can also exist in a soluble form. In any case, the oligomeric FAS receptors can bind at least two monomers of this ligand and thereby neutralize more effectively (than monomeric FAS receptors) the activity of the Fas ligand. The Fas ligand, and thus activation thereby of the FAS receptor, has been seen in the context of a number of pathological conditions, particularly those involving liver damage (apoptosis of hepatocytes, for example), including liver damage associated with hepatitis, as well as in autoimmune conditions, including lymphocyte damage (apoptosis) in HIV-infected humans (see, for example, Ogasawara et al., 1993, Cheng et al., 1994). Accordingly, the soluble, oligomeric FAS receptors are intended for blocking the activity of the Fas ligand and can be used as an active ingredient in pharmaceutical compositions for the treatment of such Fas ligand-related pathological conditions.

Likeledes muliggjøres også oppløselige, oligomere reseptorer som har bindingsaffinitet for både TNF og FAS-R ligand, de såkalte "blandede" TNF-R/FAS-R oligomere reseptorene. Disse blandede oligomere reseptorene vil inneholde minst et TNF-R ekstracellulært område og minst et FAS-R ekstracellulært område som er forbundet med den oligomere reseptoren ved hjelp av hvert av disse ekstracellulære områdene som er sammensmeltet til et hvilket som helst av de ovenfor nevnte, selv-assosierende p55IC, p55DD, FAS IC eller FAS DD. Likewise, soluble, oligomeric receptors that have binding affinity for both TNF and FAS-R ligand, the so-called "mixed" TNF-R/FAS-R oligomeric receptors, are also made possible. These mixed oligomeric receptors will contain at least one TNF-R extracellular region and at least one FAS-R extracellular region linked to the oligomeric receptor by each of these extracellular regions fused to any of the above, even -associating p55IC, p55DD, FAS IC or FAS DD.

Disse blandede oligomere reseptorene kan bli fremstilt ved: (a) fremskaffelse av et hvilket som helst av ovenfor angitte fusjonsproduktene som inneholder det ekstracellulære området av et TNF-R (p75 TNF-R eller fortrinnsvis p55 TNF-R) sammensmeltet til en hvilken som helst av de selv-assosierende intracellulære områdene p55 IC og FAS IC eller et hvilket som helst av de selv-assosierende "dødsområdene" p55DD og FAS DD, eller selv-assosierende deler, analoger eller derivater derav; (b) fremskaffelse av et hvilket som de ovenfor angitte fusjonsproduktene som inneholder det ekstracellulære området av FAS-R sammensmeltet med et hvilket som helst av de selv-assosierende P55IC, FAS-IC, p55DD og FAS DD, eller eventuelle selv-assosierende deler, analoger eller derivater av noen av disse; og (c) blanding av et hvilket som helst av de TNF-spesfikke fusjonsproduktene av (a) med et hvilket som helst av FAS-R ligand-spesifikke fusjonsproduktene av (b) for å fremskaffe (etter standard seleksjon og renseprosedyrer) oligomere (dimere eller høyere ordens oligomere) reseptorer som har minst begge de ekstracellulære områdene av TNF-R og FAS-R som er forbundet ved hjelp av selv-assosieringsevnen til deres sammensmeltede IC eller DD regioner. These mixed oligomeric receptors can be prepared by: (a) providing any of the above fusion products containing the extracellular region of a TNF-R (p75 TNF-R or preferably p55 TNF-R) fused to any of the self-associating intracellular regions p55 IC and FAS IC or any of the self-associating "death" regions p55DD and FAS DD, or self-associating parts, analogs or derivatives thereof; (b) providing any of the above fusion products containing the extracellular region of FAS-R fused to any of the self-associating P55IC, FAS-IC, p55DD and FAS DD, or any self-associating portions; analogues or derivatives of any of these; and (c) mixing any of the TNF-specific fusion products of (a) with any of the FAS-R ligand-specific fusion products of (b) to provide (after standard selection and purification procedures) oligomers (dimers or higher order oligomers) receptors having at least both extracellular regions of TNF-R and FAS-R linked by the self-association of their fused IC or DD regions.

En andre mulighet for fremstilling av de ovenfor nevnte blandede oligomere reseptorene er ved ko-transformering av passende vertceller med de ovenfor nevnte ekspresjonsvektorene, en av hvilke koder for TNF-spesifikke TNF-R fusjonsprodukter og et av hvilke koder for FAS-R ligandspesifikke FAS-R fusjonsprodukter. Etter ekspresjonen av disse forskjellige fusjonsproduktene i vertcellene kan de blandede oligomere (TNF-R/FAS-R) reseptorene bli oppnådd ved hjelp av standard rensing og seleksjonsprosedyrer. A second possibility for producing the above-mentioned mixed oligomeric receptors is by co-transformation of suitable host cells with the above-mentioned expression vectors, one of which codes for TNF-specific TNF-R fusion products and one of which codes for FAS-R ligand-specific FAS- R fusion products. After the expression of these different fusion products in the host cells, the mixed oligomeric (TNF-R/FAS-R) receptors can be obtained by means of standard purification and selection procedures.

Anvendeligheten til disse blandede affinitetsoligomere reseptorene er primært for nøytralisering av både TNF og FAS-R ligandene når den endoge ekspresjonen er for stor eller er ved uønsket høye nivåer etter eksogen administrasjon. Nylig bevis påpeker en sannsynlighet at det eksisterer en synergisme i funksjon mellom FAS-R liganden (vanligvis celleoverflate-assosiert) og TNF-a (som også kan være celleoverflate-assosisert). Følgelig i noen tilfeller er det ønskelig å nøytralisere begge disse ligandene ved det samme punkt på celleoverflaten, dvs. en slik blandet affinitetsreseptor kan blokkere både TNF bindingen til dets reseptor og bindingen av FAS-R liganden til dets reseptor. Følgelig kan disse blandede affinitetsreseptorene bli benyttet som en aktiv ingrediens i farmasøytiske sammensetninger for behandling av slike tilstander (se ovenfor) hvor både TNF og FAS-R ligandeffektene er uønskede. The utility of these mixed affinity oligomeric receptors is primarily for neutralization of both the TNF and FAS-R ligands when the endogenous expression is excessive or is at undesirably high levels following exogenous administration. Recent evidence points to the possibility that a synergism exists in function between the FAS-R ligand (usually cell surface-associated) and TNF-α (which may also be cell surface-associated). Accordingly, in some cases it is desirable to neutralize both of these ligands at the same point on the cell surface, i.e. such a mixed affinity receptor can block both TNF binding to its receptor and FAS-R ligand binding to its receptor. Accordingly, these mixed affinity receptors can be used as an active ingredient in pharmaceutical compositions for the treatment of such conditions (see above) where both the TNF and FAS-R ligand effects are undesirable.

Tilsvarende langs linjene nevnt ovenfor angående de oppløselige, oligomere TNF-R og FAS-R og blandede TNF-R/FAS-R oligomerene ifølge oppfinnelsen, er det mulig å produsere oppløselige, oligomere reseptorer for andre reseptorer eller hvilke som helst blandinger derav, spesielt de av eventuelle andre familier av TNF/NGF superfamilien. I dette tilfellet kan en hvilken som helst av de ekstracellulære områdene av de forskjelle reseptorene bli sammensmeltet til de ovenfor nevnte selv-assosierte intracellulære områdene eller deler derav eller et hvilket som helst av de intracellulære områdene av superfamiliens medlemmer som er i stand til selv-assosiering. Similarly along the lines mentioned above regarding the soluble, oligomeric TNF-R and FAS-R and mixed TNF-R/FAS-R oligomers according to the invention, it is possible to produce soluble, oligomeric receptors for other receptors or any mixtures thereof, in particular those of any other families of the TNF/NGF superfamily. In this case, any of the extracellular regions of the different receptors can be fused to the above-mentioned self-associated intracellular regions or parts thereof or any of the intracellular regions of the superfamily members capable of self-association .

Ekspresjon av eventuelle av de rekombinante proteinene ifølge oppfinnelsen som nevnt heri kan bh effektuert i eukaryote celler (for eksempel gjær, insekter eller mammalske celler) ved anvendelse av passende ekspresjonsvektorer. En hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent i teknikken kan bli benyttet. Expression of any of the recombinant proteins according to the invention as mentioned herein can be effected in eukaryotic cells (for example yeast, insects or mammalian cells) using suitable expression vectors. Any method known in the art may be used.

For eksempel blir DNA molekyler som koder for proteinene oppnådd ved en hvilken som helst av metodene satt inn i passende konstruerte ekspresjonsvektorer ved teknikker som er vel kjent i teknikken (se Sambrook et al., 1989). Dobbeltstrenget cDNA blir forbundet til plasmidvektorer ved homopolymere haler eller ved restriksjonslinking som involverer anvendelsen av syntetiske DNA linkere eller buttende ligeringsteknikker. DNA ligaser blir benyttet for å ligere DNA molekylene og uønsket sammenbinding blir inngått ved behandling med alkalisk fosfatase. For example, DNA molecules encoding the proteins obtained by any of the methods are inserted into appropriately engineered expression vectors by techniques well known in the art (see Sambrook et al., 1989). Double-stranded cDNA is joined to plasmid vectors by homopolymeric tails or by restriction ligation involving the use of synthetic DNA linkers or blunt ligation techniques. DNA ligases are used to ligate the DNA molecules and undesired binding is entered into by treatment with alkaline phosphatase.

For å være i stand til ekspresjon av det ønskede protein må en ekspresjonsvektor omfatte også spesifikke nukleotidsekvenser inneholdende transkripsjonen og translasjonen reguleringsinformasjon bundet til DNA som koder for det ønskede protein på en slik måte at det tillater genekspresjon og produksjon av proteinet. Først for at genet skal bli transkribert, må det foran seg ha en promoter som kan gjenkjennes av RNA polymerase til hvilket polymerasen binder og således initierer transkripsjonsprosessen. Det er forskjellige slike promotere i anvendelse, som arbeider med forskjellige effektiviteter (sterke og svake promotere). De er forskjellige for prokaryote og eukaryote celler. To be able to express the desired protein, an expression vector must also include specific nucleotide sequences containing the transcription and translation regulatory information bound to DNA that codes for the desired protein in such a way as to allow gene expression and production of the protein. First, for the gene to be transcribed, it must have a promoter in front of it that can be recognized by RNA polymerase to which the polymerase binds and thus initiates the transcription process. There are different such promoters in use, which work with different efficiencies (strong and weak promoters). They are different for prokaryotic and eukaryotic cells.

Promoterene som kan bli benyttet i foreliggende oppfinnelse kan være enten konstitutive, for eksempel int promoteren fra bakteriofag A, bla promoteren fra 3-laktamasegenet fra pBR322 og CAT promoteren fra The promoters that can be used in the present invention can be either constitutive, for example the int promoter from bacteriophage A, for example the promoter from the 3-lactamase gene from pBR322 and the CAT promoter from

kloramfenikolacetyltransferasegenet fra pPR325 etc. eller indusibel slik som de prokaryote promoterene inkludert hoved høyre og venstre promotere fra bakteriofag A the chloramphenicol acetyltransferase gene from pPR325 etc. or inducible such as the prokaryotic promoters including the major right and left promoters from bacteriophage A

(Pl og Pr), trp., recA. lacZ. lad, ompF og gal promotere av E. coli, eller trp- lac hybridpromoteren osv. (Glick, B.R., (1987). Ved siden av anvendelsen av sterke promotere for å generere store mengder mRNA for å oppnå høye nivåer av genekspresjon i prokaryote celler, er det nødvendig å anvende også ribosomale bindingsseter for å sikre at mRNA blir effektivt translatert. Et eksempel er Shine-Dalgarno sekvensen (SD sekvensen) som passende blir plassert fra initieringskodonet og komplementert til 3'-terminalsekvensen av 16S RNA. (Pl and Pr), trp., recA. lacZ. lad, ompF and gal promoters of E. coli, or the trp-lac hybrid promoter, etc. (Glick, B.R., (1987). In addition to the use of strong promoters to generate large amounts of mRNA to achieve high levels of gene expression in prokaryotic cells , it is necessary to also use ribosomal binding sites to ensure that the mRNA is efficiently translated. An example is the Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) which is appropriately placed from the initiation codon and complemented to the 3'-terminal sequence of the 16S RNA.

For eukaryote verter kan forskjellige transkripsjonene og tranlasjonelle regulerende sekvnser bli benyttet, avhengig av naturen av verten. De kan være avledet fra virale kilder, slik som adenovirus, bovint paillomavirus, Simian-virus eller lignende, hvor de regulerende signalene er forbundet med et spesielt gen som har et høyt ekspresjonsnivå. Eksemple er TK promoteren for Herpes virus, SV40 early promoter, gjær gal4 genpromoteren etc. Transkripsjonene initieringsregulerende signler kan bli valgt som tillater represjon og aktivering slik at ekspresjonen av genene kan bli modulert. For eukaryotic hosts, different transcriptional and translational regulatory sequences may be used, depending on the nature of the host. They may be derived from viral sources, such as adenovirus, bovine pailloma virus, Simian virus or the like, where the regulatory signals are associated with a particular gene that has a high expression level. Examples are the TK promoter for Herpes virus, the SV40 early promoter, the yeast gal4 gene promoter etc. The transcription initiation regulatory signals can be selected which allow repression and activation so that the expression of the genes can be modulated.

DNA molekylet som omfatter nukleotidsekvensen som koder for fusjonsproduktproteinene blir satt inn i en vektor som har de operativt forbundne transkripsjonene og translasjonelle regulerende signalene som er i stand til integrering av de ønskede gensekvensene i vertcellen. Cellene som har blitt stabilt transformert ved det innførte DNA kan bli selektert ved også å inkludere en eller flere markører som tillater for seleksjon av vertcellene som inneholder ekspresjonsvektoren. Markøren kan sørge for fototropi til en auksotrop vert, biocidresistans, for eksempel antibiotika, eller tungmetaller, slik som kobber eller lignende. Det selekterbare markørgenet kan enten være bundet direkte til DNA gensekvensen som skal bli uttrykt, eller introdusert i den samme cellen ved ko-transfeksjon. Ytterligere elementer kan også være nødvendig for optimal syntese av termineringssignaler, cDNA ekspresjonsvektorer som omfatter slike elementer inkluderer de beskrevet av Okayama, H. (1983). The DNA molecule comprising the nucleotide sequence encoding the fusion product proteins is inserted into a vector having the operably linked transcriptions and translational regulatory signals capable of integration of the desired gene sequences into the host cell. The cells that have been stably transformed by the introduced DNA can be selected by also including one or more markers that allow for selection of the host cells containing the expression vector. The marker can provide phototropy to an auxotropic host, biocide resistance, for example antibiotics, or heavy metals, such as copper or the like. The selectable marker gene can either be linked directly to the DNA gene sequence to be expressed, or introduced into the same cell by co-transfection. Additional elements may also be required for optimal synthesis of termination signals, cDNA expression vectors comprising such elements include those described by Okayama, H. (1983).

I en foretrukket utførelsesform vil det innførte DNA molekylet bli innlemmet i et plasmid eller viral vektor som er i stand til autonom replikasjon i den motlagende vert. Faktorer som er viktige i valg av et bestemt plasmid eller viral vektor omfatter: enkelheten med hvilken mottakscellene som inneholder vektoren kan bli gjenkjent og selektert fra de motlagende cellene som ikke inneholder vektoren; antallet kopier av vektoren som er ønskelig i en bestemt vert; og om det er ønskelig å være i stand til å "flytte" vektoren mellom vertceller av forskjellige arter. In a preferred embodiment, the introduced DNA molecule will be incorporated into a plasmid or viral vector which is capable of autonomous replication in the opposing host. Factors important in choosing a particular plasmid or viral vector include: the ease with which the recipient cells containing the vector can be recognized and selected from the counterproductive cells that do not contain the vector; the number of copies of the vector desired in a particular host; and whether it is desirable to be able to "move" the vector between host cells of different species.

Foretrukne prokaryote vektorer omfatter plasmider slike som er i stand til replikasjon i E. coli, for eksempel pBR322, ColEl, pSOOl, ACYC 184 etc. (se Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989); Bacillusplasmider slik som pC194, pC221, pT127 etc. Preferred prokaryotic vectors include plasmids such as are capable of replication in E. coli, for example pBR322, ColE1, pSOO1, ACYC 184 etc. (see Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989); Bacillus plasmids such as pC194, pC221, pT127 etc.

(Gryczan, T., (1982)); Streptomyces plasmider inkludert pLTlOl (Kendall, J.K. et al., (Gryczan, T., (1982)); Streptomyces plasmids including pLT101 (Kendall, J.K. et al.,

(1987)); Streptomyces bakeriofager slik som ØC31 (Chater, K.F. et al, i: Sixth International Symposium on Actionomvcetals Biology (1986)) og Pseudomonas plasmider (John, J.F. et al., (1986) og Izaki. K. (1978)). Foretrukne eukaryote plasmider omfatter BPV, vaccima SV40,2-mikronsirkel osv. eller deres derivater. Slike plasmider er velkjente i teknikken (Botstein, D. et al., (1982); Broach, J.R. i: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces: Life Cvcle and Inheritance (1981); Broach, J.R., (1987)); Streptomyces bakeriophages such as ØC31 (Chater, K.F. et al, in: Sixth International Symposium on Actionomvcetals Biology (1986)) and Pseudomonas plasmids (John, J.F. et al., (1986) and Izaki. K. (1978)). Preferred eukaryotic plasmids include BPV, vaccima SV40.2 micron circle, etc. or their derivatives. Such plasmids are well known in the art (Botstein, D. et al., (1982); Broach, J.R. in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces: Life Cycle and Inheritance (1981); Broach, J.R.,

(1982); Bollon, D.P. et al., (1980); Manaiatis, T., i Cell Biolev: A Comnrehensive Treatise. Vol. 3: Gene Expression. (1980); og Sambrook et al., 1989). (1982); Bollon, D.P. et al., (1980); Manaiatis, T., in Cell Biolev: A Comprehensive Treatise. Vol. 3: Gene Expression. (1980); and Sambrook et al., 1989).

Straks vektoren eller DNA sekvensen inneholdende konstruktet(ene) har blitt fremstilt for ekspresjon, kan DNA konstruktet(ene) bli introdusert i en passende vertcelle ved en hvilken som helst av forskjellige passende måter: transformasjon, transfeksjon, konjugasjon, protoplastfusjon, elektroporering, kalsiumfosfatutfelling, direkte mikroinjeksjon osv. Once the vector or DNA sequence containing the construct(s) has been prepared for expression, the DNA construct(s) may be introduced into a suitable host cell by any of a variety of suitable means: transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, calcium phosphate precipitation, direct microinjection etc.

Vertceller som skal benyttes ifølge oppfinnelsen kan enten være prokaryote eller eukaryote. Foretrukne prokaryote verter omfatter bakterier slik som E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia etc. Den mest foretrukne prokaryote verten er E. coli. Bakterielle verter med spesiell interesse omfatter E. coli Kl 2 stamme 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F", lambda-, prototropisk (ATCC 27325), og andre enterobakteria slik som Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskjellige Pseudomonas arter. Under slike betingelser vil proteinet ikke bli glykosylert. Den prokaryote verten må være forenelig med replikon og kontroUsekvensene i ekspresjonsplasmidet. Host cells to be used according to the invention can be either prokaryotic or eukaryotic. Preferred prokaryotic hosts include bacteria such as E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia etc. The most preferred prokaryotic host is E. coli. Bacterial hosts of particular interest include E. coli Kl 2 strain 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F", lambda-, prototropic (ATCC 27325), and other enterobacteria such as Salmonella typhimurium or Serratia marcescens and various Pseudomonas species. Under such conditions the protein will not be glycosylated. The prokaryotic host must be compatible with the replicon and the control sequences in the expression plasmid.

Foretrukne eukaryote verter er mammalske celler, for eksempel humane, ape-, mus- og kinesiske hamsterovarie (CHO) celler da de gir post-translasjonelle modifikasjoner til proteinmolekyler inkludert riktig folding eller glykosilering ved korrekte seter. Også gjærceller kan utføre post-translasjonelle peptidmodifikasjoner inkludert glykosylering. Et antall rekombinante DNA strategier eksisterer som benytter sterke promotersekvenser og et høyt antall kopier av plasmid kan bh benyttet for produksjon av de ønskede proteinene i gjær. Gjær gjenkjenner leader-sekvensene på klonede mammalske genprodukter og utskiller peptider som bærer leader-sekvnser (dvs. pre-peptider). Preferred eukaryotic hosts are mammalian cells, such as human, monkey, mouse and Chinese hamster ovary (CHO) cells as they provide post-translational modifications to protein molecules including proper folding or glycosylation at correct sites. Also, yeast cells can perform post-translational peptide modifications including glycosylation. A number of recombinant DNA strategies exist that use strong promoter sequences and a high number of copies of plasmid can be used for the production of the desired proteins in yeast. Yeast recognizes the leader sequences on cloned mammalian gene products and secretes peptides carrying leader sequences (ie pre-peptides).

Etter introduksjon av vektoren blir vertcellene dyrket i et selektivt medium som selekter for vekst på vektorinneholdende celler. Ekspresjon av klonede gensekvenser resulterer i produksjon av de ønskede proteinene. After introduction of the vector, the host cells are cultured in a selective medium that selects for growth on vector-containing cells. Expression of cloned gene sequences results in production of the desired proteins.

Rensing av rekombinante proteiner blir utført ved en hvilken som helst av fremgangsmåtene kjent for dette formålet, dvs. en hvilken som helst konvensjonell prosedyre som omfatter ekstrahering, utfelling, kromatografi, elektroforese eller lignende. En ytterligere renseprosedyre som kan bli benyttet ved preferanse for rensing av proteinet ifølge oppfinnelsen er affinitetskormatografi ved anvendelse av anti-TNF reseptor monoklonale antistoffer som blir produsert og immobilisert på en gelmatriks inneholdt i en kolonne. Urene preparater inneholdende det rekombinante proteinet blir ledet over kolonne. Proteinet vil bli bundet til kolonnen ved det spesifikke antistoffet mens urenhetene vil gå gjennom. Etter vasking blir proteinet eluert fra gelen ved en forandring av pH eller ionestyrke. Purification of recombinant proteins is carried out by any of the methods known for this purpose, i.e. any conventional procedure comprising extraction, precipitation, chromatography, electrophoresis or the like. A further purification procedure which can be used in preference for purification of the protein according to the invention is affinity chromatography using anti-TNF receptor monoclonal antibodies which are produced and immobilized on a gel matrix contained in a column. Impure preparations containing the recombinant protein are passed over the column. The protein will be bound to the column by the specific antibody while the impurities will pass through. After washing, the protein is eluted from the gel by a change in pH or ionic strength.

Som benyttet her (se ovenfor) refererer uttrykket "salter" til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter" av arninogrupper av proteinmolekylet dannet ved midler som er kjent i teknikken. Salter av en karboksylgruppe omfatter uorganiske salter, for eksempel, natrium, kalsium og salter med organiske baser slik som de eksempelvis dannet med aminer, slik som trietanolamin, arginin eller lysin. Syreaddisjonssalter omfatter for eksempel salter med mineralsyrer og salter med organiske syrer. As used herein (see above), the term "salts" refers to both salts of carboxyl groups and to acid addition salts" of amino groups of the protein molecule formed by means known in the art. Salts of a carboxyl group include inorganic salts, for example, sodium, calcium and salts with organic bases such as, for example, those formed with amines, such as triethanolamine, arginine or lysine Acid addition salts include, for example, salts with mineral acids and salts with organic acids.

"Funksjonelle derivater" som benyttet her dekker derivater som kan bli fremstilt fra de funksjonelle gruppene som opptrer som sidekjeder på restene eller de N- eller C-terminale gruppene ved midler som er kjent i teknikken, og blir inkludert i oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytisk akseptable, dvs. de ødelegger ikke aktiviteten til proteinet og gir ikke toksiske egenskaper til sammensetninger inneholdende dem. Disse derivatene omfatter alifatiske estere eller amider av karboksylgruppene og N-acylderivater av frie arninogrupper av O-acylderivater av frie hydroksylgrupper dannet med acylgrupper (for eksempel alkanoyl eller karboksylsyrearoylgrupper). "Fraksjoner" som benyttet her refererer til en hvilken som helst del eller porsjon av reseptoren, (intracellulære eller ekstracellulære områder derav), eller av proteinene som binder til det intracellulære området av reseptoren, forutsatt at den opprettholder dets biologiske aktivitet. "Functional derivatives" as used herein cover derivatives which may be prepared from the functional groups acting as side chains on the residues or the N- or C-terminal groups by means known in the art, and are included in the invention as long as they remain pharmaceutically acceptable acceptable, i.e. they do not destroy the activity of the protein and do not give toxic properties to compositions containing them. These derivatives include aliphatic esters or amides of the carboxyl groups and N-acyl derivatives of free amino groups of O-acyl derivatives of free hydroxyl groups formed with acyl groups (for example alkanoyl or carboxylic acid aroyl groups). "Fractions" as used herein refers to any part or portion of the receptor, (intracellular or extracellular regions thereof), or of the proteins that bind to the intracellular region of the receptor, provided that it maintains its biological activity.

Som nevnt ovenfor angår foreliggende oppfinnelse også forskjellige farmasøytiske sammensetninger omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og forskjellige noterte aktive ingredienser ifølge oppfinnelsen eller deres salter, funksjonelle derivater eller blandinger av en hvilken som helst av foregående. Disse sammensetningene kan bli benyttet i hvilke som helst av tilstandene som notert her, for eksempel i tilstander hvor der er en overproduksjon av endogent TNF, slik som i tilfeller av septisk sjokk, cachexia, graft-versus vertreaksjoner, autoimmune sykdommer som rheumatoid arthritis osv. Administrasjonsmåten kan være via en hvilken som helst akseptert administrasjonsmåle for tilsvarende midler og vil avhenge av tilstanden som skal behandles, for eksempel når benyttet for å hemme TNF effekter blir de administrert intravenøst i tilfelle av septisk sjokk eller lokal injeksjon i tilfelle av rheumatoid arthritis (for eksempel i kneet), eller kontinuerlig ved infusjon osv. Sammensetningene kan også bli benyttet for eksempel ved tilfeller av TNF intoksikering forårsaket av eksogen administrering av for store mengder (overdoser) av TNF, for eksempel i tilfellet ved cancerterapi eller terapi av virale sykdommer. As mentioned above, the present invention also relates to various pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable carrier and various noted active ingredients according to the invention or their salts, functional derivatives or mixtures of any of the foregoing. These compositions may be used in any of the conditions noted herein, for example in conditions where there is an overproduction of endogenous TNF, such as in cases of septic shock, cachexia, graft-versus-host reactions, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, etc. The mode of administration can be via any accepted route of administration for similar agents and will depend on the condition to be treated, for example when used to inhibit TNF effects they are administered intravenously in the case of septic shock or local injection in the case of rheumatoid arthritis (for for example in the knee), or continuously by infusion, etc. The compositions can also be used, for example, in cases of TNF intoxication caused by exogenous administration of excessive amounts (overdoses) of TNF, for example in the case of cancer therapy or therapy of viral diseases.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen blir fremstilt for administrering ved blanding av proteinet eller dets derivater med fysiologisk akseptable bærere, stabilisatorer og hjelpestoffer, og fremstilt i doseringsform, for eksempel ved lyofilisering i doseringsglass. Mengden aktiv forbindelse for administrering vil avhenge av administrasjons veien, sykdommen som skal behandles og tilstanden til pasienten. For eksempel vil lokal injisering ved inflammatoriske tilstander ved rheumatoid arthritis kreve mindre aktiv ingrediens på kroppsvektbasis enn intravenøs infusjon ved septisk sjokk. The pharmaceutical compositions according to the invention are prepared for administration by mixing the protein or its derivatives with physiologically acceptable carriers, stabilizers and excipients, and prepared in dosage form, for example by lyophilization in a dosage glass. The amount of active compound to be administered will depend on the route of administration, the disease to be treated and the condition of the patient. For example, local injection in inflammatory conditions of rheumatoid arthritis will require less active ingredient on a body weight basis than intravenous infusion in septic shock.

Andre aspekter av oppfinnelsen vil bli tydelig fra de følgende eksempler. Other aspects of the invention will become apparent from the following examples.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i større detalj i de følgende ikke-begrensende eksemplene og de vedlagte figurer: The invention will now be described in greater detail in the following non-limiting examples and the attached figures:

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

Kloning og isolering av proteiner som binder til de intracellulære områdene av p55 og p75 TNF reseptorene Cloning and isolation of proteins that bind to the intracellular regions of the p55 and p75 TNF receptors

For å isolere proteiner som vekselvirker med de intracellulære områdene av p55 og p75 TNF reseptorene (p55IC og p75 IC), ble gjær to-hybrid systemet benyttet (Fields og Song, 1989). Kort er dette to-hybrid systemet et gjærbasert genetisk analysesystem for å detektere spesifikke protein-proteininteraksjoner in vivo ved gjeninnføring av en eukaryot transkripsjonen aktivator slik som GAL4 som har to separate områder, et DNA bindende og et aktiveringsområde, hvilke områder når uttrykt og bundet sammen for å danne et gjeninnført GAL4 protein, er i stand til å binde til en oppstrøms aktiveringssekvens som igjen aktiverer en promoter som kontrollerer ekspresjonen av et reportergen slik som lacZ eller HJ.S3, ekspresjonen av hvilke enkelt blir observert i de dyrkede cellene. I dette systemet blir genene for de aktuelle vekselvirkende proteinene klonet inn i separate ekspresjonsvektorer. I en ekspresjonsvektor blir sekvensen av et aktuelt protein klonet inn i fase med sekvensen av GAL4 DNA-bindende område for å generere et hybrid protein med GAL4 DNA-proteinområdet, og i den andre vektoren blir sekvensen av det andre aktuelle proteinet klonet i fase med sekvensen av GAL4 aktiveringsområdet for å generere et hybridprotein med GAL4-aktiveringsområdet. De to hybridvektorene blir så ko-transformert inn i en gjær vertstamme som har et lacZ eller HIS3 reportergen under kontroll av oppstrøms GAL4 bindingsseter. Kun de transformerte vertcellene (kotransformantene) i hvilke de to hybridproteinene blir uttrykt og er i stand til å vekselvirke med hverandre, vil være i stand til ekspresjon av reportergenet. For lacZ reportergenet vil vertceller som uttrykker dette genet bli blå i farge når X-gal blir tilsatt til kulturene. Således er blå kolonier indikative på det faktum at de to klonede kandidatproteinene er i stand til å vekselvirke med hverandre. To isolate proteins that interact with the intracellular regions of the p55 and p75 TNF receptors (p55IC and p75 IC), the yeast two-hybrid system was used (Fields and Song, 1989). Briefly, this two-hybrid system is a yeast-based genetic analysis system for detecting specific protein-protein interactions in vivo by reintroduction of a eukaryotic transcriptional activator such as GAL4 that has two separate regions, a DNA binding and an activation region, which regions when expressed and bound together to form a reintroduced GAL4 protein, is able to bind to an upstream activation sequence which in turn activates a promoter controlling the expression of a reporter gene such as lacZ or HJ.S3, the expression of which is easily observed in the cultured cells. In this system, the genes for the respective interacting proteins are cloned into separate expression vectors. In one expression vector, the sequence of a protein of interest is cloned in phase with the sequence of the GAL4 DNA binding region to generate a hybrid protein with the GAL4 DNA protein region, and in the second vector, the sequence of the second protein of interest is cloned in phase with the sequence of the GAL4 activation region to generate a hybrid protein with the GAL4 activation region. The two hybrid vectors are then co-transformed into a yeast host strain that has a lacZ or HIS3 reporter gene under the control of upstream GAL4 binding sites. Only the transformed host cells (cotransformants) in which the two hybrid proteins are expressed and are able to interact with each other, will be able to express the reporter gene. For the lacZ reporter gene, host cells expressing this gene will turn blue in color when X-gal is added to the cultures. Thus, blue colonies are indicative of the fact that the two cloned candidate proteins are able to interact with each other.

Ved bruk av dette to-hybridsystemet blir de intracellulære områdene p55IC og p75IC klonet separat inn i vektoren pGBT9 (som bærer GAL4 DNA-bindingssekvensen, levert av CLONTECH, USA, se nedenfor), for å danne fusjonsproteiner med det GAL4 DNA-bindende området (tilsvarende, ble det intracellulære området, FAS-IC og en del av 55IC, nemlig 55DD også klonet inn i pGBT9 og benyttet for å isolere andre IC-bindende proteiner, se eksempel 3 nedenfor). For kloning av p55IC og p75IC inn i pGBT9 ble kloner som kodet for full-lengde cDNA sekvenser av p55 TNF-R (Schall et al., 1990) og p75 TNF-R (Smith et al., 1990) benyttet fra hvilke de intracellulære områdene (IC) ble skåret ut som følger: p55IC ble skåret ved anvendelse av enzymene EcoRI og Sali, EcoRI-Sall fragmentet inneholdende p55IC sekvensen ble så isolert ved standard prosedyrer og ført inn i pGBT9 vektoren åpnet ved dets multiple kloningsseteregion (MCS), ved hjelp av EcoRI og Sali. p75 IC ble skåret ut ved hjelp av enzymene BspHI og Sali, BspHI-Sall fragmentet inneholdende p75 IC sekvensen ble isolert ved standard prosedyrer og tylt inn ved hjelp av Klenow enzymet for å generere et fragment som kan bli satt inn i pGBT9 vektoren åpnet med Smal og Sali. Using this two-hybrid system, the p55IC and p75IC intracellular regions are cloned separately into the vector pGBT9 (carrying the GAL4 DNA-binding sequence, supplied by CLONTECH, USA, see below), to form fusion proteins with the GAL4 DNA-binding region ( correspondingly, the intracellular region, FAS-IC and part of 55IC, namely 55DD, were also cloned into pGBT9 and used to isolate other IC-binding proteins, see example 3 below). For cloning of p55IC and p75IC into pGBT9, clones encoding full-length cDNA sequences of p55 TNF-R (Schall et al., 1990) and p75 TNF-R (Smith et al., 1990) were used from which the intracellular regions (IC) were excised as follows: p55IC was excised using the enzymes EcoRI and SalI, the EcoRI-SalI fragment containing the p55IC sequence was then isolated by standard procedures and inserted into the pGBT9 vector opened at its multiple cloning site (MCS) region, by with the help of EcoRI and Sali. p75 IC was excised using the enzymes BspHI and SalI, the BspHI-Sall fragment containing the p75 IC sequence was isolated by standard procedures and silenced using the Klenow enzyme to generate a fragment that can be inserted into the pGBT9 vector opened with Smal and Sally.

De ovenfor angitte hybride (chimere) vektorerne ble så kontransfektert (separat, en kotransfeksjon med p55IC hybridet og en med p75 IC hybridvektoren) sammen et cDNA bibliotek fra humane HeLa celler klonet med pGAD GH vektoren, som bærer GAM aktiveringsområdet, inn i HF7c gjærvertstammen (alle de ovenfor angitte vektorene pGBT9 og pGAD GH som bærer HeLa celle cDNA biblioteket og gjærstammen ble fra anskaffet fra Clontech Laboratories, Inc., USA, som en del av MATCHMAKER Two-Hybrid System, #PT1265-I). De ko-transfekterte gjærene ble valgt for deres evne til å vokse i medium uten histidin (His- medium), dyrking av kolonier som var indikative på positive transformanter. De valgte gjærklonene ble så testet for deres evne til å uttrykke lacZ genet, dvs. for deres LAC Z aktivitet, og dette ved tilsetning av X-gal til kulutmediet som blir katabolisert for å danne et blåfarget produkt ved B-galoksidase, enzymet kodet ved lacZ genet. Således er blå kolonier indikative for et aktivt lacZ gen. For aktivitet av lacZ genet er det nødvendig at GAL4 transkripsjonsaktivatoren er tilstede i en aktiv form i de transformerte klonene, nemlig at GAL4 DNA-bindende område som koder for en av de ovenfor nevnte hybridvektorene, er kombinert riktig med GAL4 aktivatorområdet som er kodet ved den andre hybridvektoren. En slik kombinasjon er kun mulig dersom de to proteinene sammensmeltet til hver av GAL4 områdene er i stand til stabilt å vekselvirke (bindende) til hverandre. Således ble His<+> og blå (LAC Z<+>) kolonier som ble isolert, kolonier som har blitt kotransfektert med en vektor kodende for p55IC og en vektor som koder for et proteinprodukt av human HeLa celleopprinnelse som er i stand til å binde stabilt til p55IC; eller som har blitt transfektert med en vektor som koder for p75IC og en vektor som koder for et proteinprodukt av human HeLa celleopprinnelse som er i stand til å binde stabilt til p75 IC. The above hybrid (chimeric) vectors were then countertransfected (separately, one cotransfection with the p55IC hybrid and one with the p75 IC hybrid vector) together with a cDNA library from human HeLa cells cloned with the pGAD GH vector, which carries the GAM activation region, into the HF7c yeast host strain ( all the above-mentioned vectors pGBT9 and pGAD GH carrying the HeLa cell cDNA library and the yeast strain were obtained from Clontech Laboratories, Inc., USA, as part of the MATCHMAKER Two-Hybrid System, #PT1265-I). The co-transfected yeasts were selected for their ability to grow in medium without histidine (His medium), growing colonies indicative of positive transformants. The selected yeast clones were then tested for their ability to express the lacZ gene, i.e. for their LAC Z activity, by adding X-gal to the pellet medium which is catabolized to form a blue colored product by B-gal oxidase, the enzyme encoded by the lacZ gene. Thus, blue colonies are indicative of an active lacZ gene. For activity of the lacZ gene, it is necessary that the GAL4 transcriptional activator is present in an active form in the transformed clones, namely that the GAL4 DNA-binding region encoding one of the above-mentioned hybrid vectors is combined correctly with the GAL4 activator region encoded by the second the hybrid vector. Such a combination is only possible if the two proteins fused to each of the GAL4 regions are capable of stably interacting (binding) with each other. Thus, His<+> and blue (LAC Z<+>) colonies that were isolated were colonies that have been cotransfected with a vector encoding p55IC and a vector encoding a protein product of human HeLa cell origin capable of binding stable to p55IC; or which has been transfected with a vector encoding p75IC and a vector encoding a protein product of human HeLa cell origin capable of binding stably to p75 IC.

Plasmid DNA fra de ovenfor nevnte His<+>, LAC Z"<5>" gjærkoloniene ble isolert og elektroporert inn i E. coli stamme HB 101 ved standard prosedyrer ved valgt av Leu<+> og ampicillin resistente transformanter, disse transformantene er de som bærer hybrid GAD GH vektoren som har både de Amp<R> og Leu^ kodende sekvensene. Slike transformanter er derfor kloner som bærer sekvensene som koder for nylig identifiserte proteiner som er i stand til binding til p55IC eller p75IC. Plasmid DNA ble så isolert fra disse transformerte E. coli og retestet ved: (a) retransformering av dem med de opprinnelig intracellulære område hybridplasmidene (hybrid pGTB9 som bærer enten p55IC eller p75IC sekvensene) inn i gjærstamme HF7 som angitt ovenfor. Som kontroller ble det benyttet vektorer som bærer irrelevante proteinkodende sekvenser, for eksempel pACT-lamin eller pGT9 alene for kotransfeksjon med det p55IC-bindende protein elelr p75IC-bindende protein kodende plasmider. De kotransformerte gjærene ble så testet for vekst på His- medium alene, eller med forskjellige nivåer av 3-aminotriazol; og (b) retransformering av plasmid DNA og opprinnelig intracellulære område hybridplasmider og kontrollplasmider beskrevet i (a) inn i gjærceller av stamme SFY526 og bestemmelse v LAC Z<+> aktiviteten (effektivitet på B-gal dannelse, dvs. blåfargedannelse). Plasmid DNA from the above-mentioned His<+>, LAC Z"<5>" yeast colonies was isolated and electroporated into E. coli strain HB 101 by standard procedures by selecting from Leu<+> and ampicillin resistant transformants, these transformants are the carrying the hybrid GAD GH vector having both the Amp<R> and Leu^ coding sequences. Such transformants are therefore clones carrying the sequences encoding newly identified proteins capable of binding to p55IC or p75IC. Plasmid DNA was then isolated from these transformed E. coli and retested by: (a) retransforming them with the original intracellular site hybrid plasmids (hybrid pGTB9 carrying either the p55IC or p75IC sequences) into yeast strain HF7 as indicated above. As controls, vectors carrying irrelevant protein coding sequences, for example pACT-lamin or pGT9 alone, were used for cotransfection with the p55IC-binding protein or p75IC-binding protein coding plasmids. The cotransformed yeasts were then tested for growth on His medium alone, or with different levels of 3-aminotriazole; and (b) retransformation of plasmid DNA and originally intracellular region hybrid plasmids and control plasmids described in (a) into yeast cells of strain SFY526 and determination of the LAC Z<+> activity (efficiency on B-gal formation, i.e. blue color formation).

Resultatene av testene ovenfra avslørte at vekstmønsteret til koloniene i His- mediet var identisk med mønsteret av LAC Z aktivitet; som målt ved fargingen av kolonien, dvs. His<+> koloniene var også LAC Z<+>. Dessuten ble LAC Z aktiviteten i væskekultur (foretrukne kulturbetingelser) analysert etter transfeksjon med GAL4 DNA-binding og aktiveringsområde hybrider inn i SFY526 gjærverter som hadde en bedre LAC Z indusibilitet med GAL4 transkripsjonsaktivatoren enn den til HF-7 gjærvertsceller. The results of the above tests revealed that the growth pattern of the colonies in the His medium was identical to the pattern of LAC Z activity; as measured by the staining of the colony, i.e. the His<+> colonies were also LAC Z<+>. Moreover, the LAC Z activity in liquid culture (preferred culture conditions) was analyzed after transfection with GAL4 DNA binding and activation region hybrids into SFY526 yeast hosts which had a better LAC Z inducibility with the GAL4 transcriptional activator than that of HF-7 yeast host cells.

Resultatene fra de ko-transfeksj onene ovenfor angitt i tabell 1 nedenfor, fra hvilken det er tydelig at et antall proteiner ble funnet som var i stand til binding til pSSIC eller p75IC, nemlig proteinene betegnet 55.11, som binder til p55IC; og 75.3 og 75.16 som binder til p75IC. Alle disse p55IC- og p75IC-bindende proteinene er autentiske humane proteiner som alle er kodet ved cDNA sekvenser som stammer fra HeLa celle cDNA biblioteket som ble sammensmeltet til GAL4 aktiveringsområdesekvensen i plasmidet pGAD GH i det ovenfor nevnte gjær to-hybrid analysesystemet. The results of the above co-transfections are set forth in Table 1 below, from which it is clear that a number of proteins were found capable of binding to pSSIC or p75IC, namely the proteins designated 55.11, which bind to p55IC; and 75.3 and 75.16 that bind to p75IC. All of these p55IC- and p75IC-binding proteins are authentic human proteins that are all encoded by cDNA sequences originating from the HeLa cell cDNA library which was fused to the GAL4 activation region sequence in the plasmid pGAD GH in the above-mentioned yeast two-hybrid analysis system.

Interessant har det også blitt funnet at fragmenter av p55IC selv, nemlig proteinene betegnet 55.1 og 55.3 var i stand til binding til p55IC. Disse er diskutert også i eksempel 2 nedenfor. Interestingly, it has also been found that fragments of p55IC itself, namely the proteins designated 55.1 and 55.3 were capable of binding to p55IC. These are also discussed in example 2 below.

DNA- bindende områdehvbrider: DNA binding site hybrids:

pGBT9-IC55: full-lengde intracellulært område forp55-TNF-F (p55IC) pACT-lamin: irrelevant proteinlamin pGBT9-IC55: full-length intracellular region of p55-TNF-F (p55IC) pACT-lamin: irrelevant protein lamin

pGBT9: vektor alene pGBT9: vector alone

pGBT9-IC75: full-lengde intracellulært område av p75-TNF-R (p75IC) pGBT9-IC75: full-length intracellular region of p75-TNF-R (p75IC)

Aktiveringsområdehvbrid: Activation range:

55.1 og 55.3 tilsvarer fragmenter av det intracellulære området av p55-TNF-R 55.11: er det nye proteinet forbundet med p55-TNF-R 55.1 and 55.3 correspond to fragments of the intracellular region of p55-TNF-R 55.11: is the new protein associated with p55-TNF-R

75.3 og 75.16 er de nye proteinene assosisert med p75-TNF-R 75.3 and 75.16 are the novel proteins associated with p75-TNF-R

De ovenfor angitte klonede cDNA som koder for nye p55IC- og p75IC-bindende proteinene, 55.11,75.3 og 75.16, ble så sekvensert ved anvendelse av standard DNA sekvenseringsprosedyrer. De delvise sekvensene til alle disse proteinkodende sekvensene angitt i fig. 1 a-c, hvor fig. l(a) viser sekvensen av cDNA som koder for protein 55.11; fig. l(b) angir den delvise sekvensen til cDNA som koder for protein 75.3; og fig. l(c) angir den delvise sekvensen til cDNA som koder for protein 75.16.1 fig. l(d) er det vist den avledede aminosyresekvensen av protein 55.11, som avledet fra nukleotidsekvensen i fig. l(a). The above cloned cDNAs encoding the novel p55IC and p75IC binding proteins, 55.11, 75.3 and 75.16, were then sequenced using standard DNA sequencing procedures. The partial sequences of all these protein coding sequences indicated in fig. 1 a-c, where fig. 1(a) shows the sequence of cDNA encoding protein 55.11; fig. 1(b) indicates the partial sequence of the cDNA encoding protein 75.3; and fig. 1(c) indicates the partial sequence of cDNA encoding protein 75.16.1 fig. 1(d) shows the deduced amino acid sequence of protein 55.11, as derived from the nucleotide sequence in fig. let).

Det må imidlertid noteres at en delvis sekvens til cDNA som koder for 55.11 proteinet også har blitt rapportert av Khan et al. (1992) i et studie av humane hjerne cDNA sekvenser, hvis studier var rettet mot etableringen av en hurtig og nøyaktig fremgangsmåte for sekvensering og fysiskalsk og genetisk mapping av human hjerne cDNA. Imidlertid ga Khan et al. ingen informasjon hva angår funksjonen eller andre karakteristikker til proteinet som er kodet ved 55.11 cDNA sekvensen, slike funksjonelle eller andre analyser var ikke hensikten til Khan et al. i deres studie. However, it should be noted that a partial sequence of the cDNA encoding the 55.11 protein has also been reported by Khan et al. (1992) in a study of human brain cDNA sequences, whose studies were aimed at the establishment of a rapid and accurate method for sequencing and physical and genetic mapping of human brain cDNA. However, Khan et al. no information regarding the function or other characteristics of the protein encoded by the 55.11 cDNA sequence, such functional or other analyzes were not the purpose of Khan et al. in their study.

Analyse og karakterisering av 55. 11 proteinet Analysis and characterization of the 55. 11 protein

( a) Generelle prosed<y>rer og materialer (a) General procedures and materials

( i) Kloning av cDNA av 55. 11 (i) Cloning of cDNA of 55. 11

Etter analyse (for eksempel Northern analyse, se nedenfor) av cDNA protein 55.11 ble det avslørt at ovenfor angitte 55.11 cDNA klonet ved to-hybrid screen-prosedyren representerte kun et delvis cDNA 5.11 med nukleotidene 925-2863 (se fig. l(a)) som koder for aminosyrer 309-900 (se fig. l(d)). Den gjenværende del av 55.11 cDNA [nuklotider 1-924 (fig. l(a)) som koder for aminosyrer 1-308 (fig. l(d))] ble oppnådd ved standard prosedyrer, nemlig ved kloning av PCR fra en human fetal lever cDNA bibliotek (for flere detaljer, se nedenfor). Den fulle nukleotidsekvensen av 55.11 (fig. l(a)) ble bestemt i begge retninger ved dideoksykjede termineringsmetoden. After analysis (eg Northern analysis, see below) of cDNA protein 55.11, it was revealed that the above-mentioned 55.11 cDNA cloned by the two-hybrid screen procedure represented only a partial cDNA 5.11 with nucleotides 925-2863 (see Fig. 1(a) ) which codes for amino acids 309-900 (see Fig. 1(d)). The remaining portion of the 55.11 cDNA [nucleotides 1-924 (Fig. 1(a)) encoding amino acids 1-308 (Fig. 1(d))] was obtained by standard procedures, namely by PCR cloning from a human fetal liver cDNA library (for more details, see below). The full nucleotide sequence of 55.11 (Fig. 1(a)) was determined in both directions by the dideoxy chain termination method.

( ii) To- hvbrid fi- galaktosidase ekspresjonstester (ii) Two-hybrid fi-galactosidase expression tests

13-galaktosidase ekspresjonstester ble utført som beskrevet ovenfor bortsett fra at i noen av testene ble pVP16 vektoren, som inneholder aktiveringsområdet av VP 16, benyttet i stedet for pGAD-GH, Gal4 aktiveringsområdevektoren. Nummereringen av restene i proteinene som er kodet ved cDNA insertene, er som i Swiss-Prot databank. 13-galactosidase expression assays were performed as described above except that in some of the assays the pVP16 vector, which contains the activation region of VP 16, was used instead of pGAD-GH, the Gal4 activation region vector. The numbering of the residues in the proteins encoded by the cDNA inserts is as in the Swiss-Prot databank.

Delesjonsmutanter ble produsert ved PCR, og punktmutasjoner ved oligonukleotid-rettet mutagenese (Kunkel, 1994). Deletion mutants were produced by PCR, and point mutations by oligonucleotide-directed mutagenesis (Kunkel, 1994).

( iii) Northern- analvse (iii) Northern analvse

Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Oh., USA) denaturert i formaldehyd/formamidbuffer, elektroforisert gjennom en agarose/formaldehydgel og blottet til en GeneScreen Plus membran (Dupont, Wilmington, De., USA) i lOxSSPE buffer ved bruk av standard teknikker. Hybridiseringsblottene ble hybridisert med det delvise cDNA av 5.11 (se ovenfor, nukleotider 925-2863), radiomerket med random-prime kit (Boehringer Mannheim Biochemia, Mannheim, Tyskland) og vasket grundig. Autoradiografi ble utført i 1 uke. Total RNA was isolated using TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Oh., USA) denatured in formaldehyde/formamide buffer, electrophoresed through an agarose/formaldehyde gel and blotted to a GeneScreen Plus membrane (Dupont, Wilmington, De. , USA) in lOxSSPE buffer using standard techniques. The hybridization blots were hybridized with the partial cDNA of 5.11 (see above, nucleotides 925-2863), radiolabeled with the random-prime kit (Boehringer Mannheim Biochemia, Mannheim, Germany) and washed thoroughly. Autoradiography was performed for 1 week.

( iv) Eks<p>resjon av 55. 11 cDNA i HeLa celler og binding av 55. 11 proteinet til glutation S- transferase fusjonsproteiner av p55- IC (iv) Expression of 55.11 cDNA in HeLa cells and binding of the 55.11 protein to glutathione S-transferase fusion proteins of p55-IC

Glutation S-transferase (GST) fusjonerer med p55-IC (GST-p55IC) og med p55-IC trunkerte nedenfor aminosyre 345 (GST-p55IC345) ble produsert og absorbert på glutation-agaroseperler som beskrevet i eksempel 2 nedenfor (se også Smith og Corcaran, 1994; Frangioni og Neel, 1993). cDNA av 55.11 (1-2863 nukleotider, dvs. full-lengde 55.11 cDNA) av FLAG-55.11 og av luciferase ble uttrykt i HeLa celler. FLAG-55.11 er regionen som løper videre mellom restene 309 og 900 i 55.11 proteinet (det delvise cDNA av 55.11 (nukleotider 925-2863), opprinnelig klodet med to hybrid screen), N-forbundet til FLAG oktapeptidet (Eastman Kodak. New Haven, Ct., USA). Ekspresjon av fusjonsproteinene ble gjort ved hjelp av tetracyklin-kontrollert ekspresjonsvektor (HtTA-1) i en HeLa celleklone som uttrykte en tetracyklin-kontrollert transaktivator (se eksempel 2 nedenfor, og Gossen og Bujard, 1992). Metabolisk merking av de uttrykte proteiner med [^ S] Met og [^S] Cys (Dupont, Wilmington, De., USA og Amersham, Buckinghamshire, England), lysis av HeLa celler, immunoprecipitering og binding av de merkede proteinene med GST fusjonsproteinene, ble utført som beskrevet nedenfor (eksempel 2), bortsett fra at 0,5% i stedet for 0,1% Nonidet P-40 var tilstede i cellelysisbufferen. Immunoprecipiteringene av 55.11 og FLAG-55.11 ble oppnådd ved anvendelse av kanin antiserum (fortynnet 1:500) mot et GS fusjonsprotein inneholdende regionen av 55.11 som går fra aminosyrer 309 og 900 og et musmonoklonalt antistoff mot FLAG oktapeptidet (M2; Eastman Kodak, 5 ug/ml av cellelysat). Glutathione S-transferase (GST) fused to p55-IC (GST-p55IC) and with p55-IC truncated below amino acid 345 (GST-p55IC345) were produced and absorbed onto glutathione-agarose beads as described in Example 2 below (see also Smith and Corcaran, 1994; Frangioni and Neel, 1993). cDNA of 55.11 (1-2863 nucleotides, i.e. full-length 55.11 cDNA) of FLAG-55.11 and of luciferase was expressed in HeLa cells. FLAG-55.11 is the region running between residues 309 and 900 of the 55.11 protein (the partial cDNA of 55.11 (nucleotides 925-2863), originally cloned by two hybrid screen), N-linked to the FLAG octapeptide (Eastman Kodak. New Haven, Ct., USA). Expression of the fusion proteins was done using tetracycline-controlled expression vector (HtTA-1) in a HeLa cell clone expressing a tetracycline-controlled transactivator (see Example 2 below, and Gossen and Bujard, 1992). Metabolic labeling of the expressed proteins with [^S]Met and [^S]Cys (Dupont, Wilmington, De., USA and Amersham, Buckinghamshire, England), lysis of HeLa cells, immunoprecipitation and binding of the labeled proteins with the GST fusion proteins , was performed as described below (Example 2), except that 0.5% instead of 0.1% Nonidet P-40 was present in the cell lysis buffer. The immunoprecipitations of 55.11 and FLAG-55.11 were obtained using rabbit antiserum (diluted 1:500) against a GS fusion protein containing the region of 55.11 extending from amino acids 309 and 900 and a mouse monoclonal antibody against the FLAG octapeptide (M2; Eastman Kodak, 5 µg /ml of cell lysate).

( b ) Binding av 55. 11 proteinet til p55- IC i transformert gjær (b) Binding of the 55.11 protein to p55-IC in transformed yeast

I denne studien ble det søkt å fastslå naturen til bindingen mellom 55.11 og p55IC, spesielt regionene av begge av disse proteinene som involvert i denne bindingen. For formålet ovenfor ble to-hybrid prosedyren fulgt hvor forskjellige full-lengde og delesjonsmutanter av p55IC (se også eksempel 2 nedenfor) i "DNA-bindingsomrpde" konstrukter ble benyttet som "rot" for å binde til "byttet", som var det delvise 55.11 proteinet kodet i konstrukter i hvilke den delvise 55.11 sekvensen (rester 309-900, som opprinnelig isolert) var sammensmeltet til "aktiveringsområdet" i vektorene GAL4AD og VP 16AD. Videre ble forskjellige delesjonsmutanter av 55.11 også konstruert og sammensmeltet til "aktiveringsområdet" i GAL4AD vektoren (for eksempel mutanter av 55.11 med kun restene 309-680 og 457-900). Bindingen av de forskjellige "bindingsområde" konstruktene til de forskjellige "aktiveringsområde"-konstruktene ble undersøkt i transfekterte SFY526 gjærceller. Bindingen ble målt ved en to-hybrid 8-galaktosidase ekspresjonsiflteranalyse. De ikke-relevante proteinene SNF1 og SNF4 tjente som positive kontroller for "bindingsområde" og "aktiveringssområde" konstruktene; de tomme Gal4 (pGAD-GH) og VP 16 (pVP16) vektorene tjente som negative kontroller for "aktiveringsområde" konstruktene; og den tomme Gal4 (pGBT9) vektoren tjente som en negativ kontroll for "bindingsområde" konstruktene. Resultatene i analysen er angitt i tabell 2 nedenfor hvor symbolene og "-5-+" indikerer utviklingen av sterk farge i løpet av 20-60 minutter for start av analysen (positive bindingsresultater); og "-" indikerer ingen utvikling av farge innen 24 timer fra start av analysen (negative resultater). Blanke felt i tabellen indikerer at bindingsanalyse ikke ble testet. Fra resultatene vist i tabell ovenfor kan det bli konkludert at 55.11 binder til p55-IC ved et sete som er forskjellig fira "dødsområde" (restene 328-426) av p55-IC. In this study, we sought to determine the nature of the binding between 55.11 and p55IC, particularly the regions of both of these proteins involved in this binding. For the above purpose, the two-hybrid procedure was followed where various full-length and deletion mutants of p55IC (see also Example 2 below) in "DNA binding rearranged" constructs were used as "root" to bind to the "prey", which was the partial The 55.11 protein was encoded in constructs in which the partial 55.11 sequence (residues 309-900, as originally isolated) was fused to the "activation region" of the GAL4AD and VP 16AD vectors. Furthermore, various deletion mutants of 55.11 were also constructed and fused to the "activation region" of the GAL4AD vector (for example, mutants of 55.11 with only residues 309-680 and 457-900). The binding of the different "binding region" constructs to the different "activation region" constructs was examined in transfected SFY526 yeast cells. Binding was measured by a two-hybrid 8-galactosidase expression filter assay. The non-relevant proteins SNF1 and SNF4 served as positive controls for the "binding region" and "activation region" constructs; the empty Gal4 (pGAD-GH) and VP 16 (pVP16) vectors served as negative controls for the "activation region" constructs; and the empty Gal4 (pGBT9) vector served as a negative control for the "binding region" constructs. The results of the analysis are set out in Table 2 below where the symbols and "-5-+" indicate the development of strong color within 20-60 minutes before the start of the analysis (positive binding results); and "-" indicates no development of color within 24 hours from the start of the analysis (negative results). Blank fields in the table indicate that binding analysis was not tested. From the results shown in the table above, it can be concluded that 55.11 binds to p55-IC at a site different from the "dead zone" (residues 328-426) of p55-IC.

55.11 proteinet bundet til en trunkert p55-IC fra hvilket dødsområdet har blitt deletert (konstrukt 206-328 i tabell 2), er mer effektivt enn ikke-trunkert p55-IC. Det binder også til en ytterligere C terminalt trunkert konstrukt (konstrukt 206-308) og til et konstrukt fra hvilket både dødsområdet og en membranproksimal del var deletert (konstrukt 243-328). Imidlertid bandt ikke 55.11 proteinet til et konstrukt som var N-terminalt trunkert ned til aminosyre 266 (tabell 2). Disse funnene indikerer at bindingssetet for 55.11 er lokalisert i regionen som går mellom restene 243 og 308 i p55-IC og at N-terminalen i dette bindingssetet er mellom restene 243 og 266. The 55.11 protein bound to a truncated p55-IC from which the dead region has been deleted (construct 206-328 in Table 2) is more effective than non-truncated p55-IC. It also binds to a further C terminally truncated construct (construct 206-308) and to a construct from which both the dead region and a membrane-proximal part were deleted (construct 243-328). However, 55.11 did not bind the protein to a construct that was N-terminally truncated down to amino acid 266 (Table 2). These findings indicate that the binding site for 55.11 is located in the region between residues 243 and 308 of p55-IC and that the N-terminus of this binding site is between residues 243 and 266.

Overføring av cDNA for 55.11 fra det opprinnelig klonede "bytte" konstruktet som inneholdte Gal4 aktiveringsområdet, til et byttekonstrukt inneholdende VP 16 aktiveringsområdet, reduserte ikke bindingseffektiviteten til 55.11 proteinet ti p55-IC (tabell 2). Således syntes strukturen(e) involvert i denne bindingen å ligge innen 55.11 molekylet og involverte ikke setet for fusjon av 55.11 med aktiveringsområdet. Transfer of cDNA for 55.11 from the originally cloned "swap" construct containing the Gal4 activation region to a swap construct containing the VP 16 activation region did not reduce the binding efficiency of the 55.11 protein to p55-IC (Table 2). Thus, the structure(s) involved in this binding appeared to be within the 55.11 molecule and did not involve the site of fusion of 55.11 with the activation site.

Imidlertid ble bindingen av 55.11 til p55-IC opphevet ved selv begrensede trunkeringer av 55.11 proteinet ved enten dets C(55.11 konstrukt 309-680) eller N terminus (55.11 konstrukt 457-900), (rest 309 er den første resten i 55.11 proteinet som er kodet ved det delvise cDNA klonet opprinnelig isolert i to-hybrid undersøkelsen). However, the binding of 55.11 to p55-IC was abolished by even limited truncations of the 55.11 protein at either its C (55.11 construct 309-680) or N terminus (55.11 construct 457-900), (residue 309 is the first residue in the 55.11 protein that is encoded by the partial cDNA clone originally isolated in the two-hybrid study).

Den observerte bindingen mellom 55.11 og p55-IC syntes å være spesifikk da 55.11 ikke bandt til andre proteiner, inkludert tre reseptorer av TNF/NGF reseptorfamilien (p75-R, Fas/APOl og CD40) og andre proteiner slik som lamin og cyklin D (data ikke vist). Det må noteres at av de andre TNF/NGF reseptorproteinene testet, var det også testet deler derav som omfatter deres intracellulære områder: human FAS-R (rester 175-319), CD40 (rester 216-277) og p75-TNF-R (rester 287-461), ingen av hvilke bandt 55.11 (data ikke vist). The observed binding between 55.11 and p55-IC appeared to be specific as 55.11 did not bind to other proteins, including three receptors of the TNF/NGF receptor family (p75-R, Fas/APO1 and CD40) and other proteins such as lamin and cyclin D ( data not shown). It must be noted that of the other TNF/NGF receptor proteins tested, parts of them comprising their intracellular regions were also tested: human FAS-R (residues 175-319), CD40 (residues 216-277) and p75-TNF-R ( residues 287-461), none of which bound 55.11 (data not shown).

( c) Northern-analvse av RNA fra flere cellelinjer ved anvendelse av 55. 11 cDNA som en probe og kloning av full- lengde 55. 11 cDNA (c) Northern analysis of RNA from several cell lines using 55.11 cDNA as a probe and cloning of full-length 55.11 cDNA

Cellelinjene undersøkt var HeLa CEM, Jurkat, og HepG2 celler avledet fra humant epitelisk karcinoma, en akutt lymfoblastisk T celleleukemi, en akutt T celle leukemi og en hepaatocellulær karcinoma. 55.11 cDNA opprinnelig isolert (nukleotider 925-2863) ble benyttet som en probe. Prøver besto av 10 ug RNA/spor. Resultatene av Northern-analysen er vist i fig. 2 som er en reproduksjon av et Northern-blot. The cell lines examined were HeLa CEM, Jurkat, and HepG2 cells derived from human epithelial carcinoma, an acute lymphoblastic T cell leukemia, an acute T cell leukemia, and a hepatocellular carcinoma. 55.11 cDNA originally isolated (nucleotides 925-2863) was used as a probe. Samples consisted of 10 µg RNA/lane. The results of the Northern analysis are shown in fig. 2 which is a reproduction of a Northern blot.

Fra fig. 2 er det således tydelig at Northem-analysen ved bruk av 55.11 cDNA som en probe avslørte i flere cellelinjer et enkelt hybridiseringstranskript på omkring 3 kB, som er større enn cDNA (2 kB) av det opprinnelig isolerte 55.11 cDNA. Ved anvendelse av oligonukleotidprimere som tilsvarer 55.11 sekvensen ble det klonet ved PCR en 5' forlengende sekvens hvis lengde var omkring 1 kB. Summen av lengden av denne 5' forlengede enden med den til det opprinnelig klonede cDNA var omkring lengden på 55.11 transkriptet. 3 kB cDNA som omfattet begge disse delene ble effektivt uttrykt i transfekterte HeLa celler (se nedenfor) for å gi et protein på omkring 84 kDa, noe som antyder at 3 kB cDNA inneholder et translasjonelt startsete. From fig. 2, it is thus clear that the Northem analysis using 55.11 cDNA as a probe revealed in several cell lines a single hybridization transcript of about 3 kB, which is larger than the cDNA (2 kB) of the originally isolated 55.11 cDNA. Using oligonucleotide primers corresponding to the 55.11 sequence, a 5' extending sequence whose length was around 1 kB was cloned by PCR. The sum of the length of this 5' extended end with that of the originally cloned cDNA was about the length of the 55.11 transcript. The 3 kB cDNA comprising both of these parts was efficiently expressed in transfected HeLa cells (see below) to give a protein of about 84 kDa, suggesting that the 3 kB cDNA contains a translational start site.

( d) In vitro binding av 55. 11 proteinet til GST- fusionsproteiner inneholdende deler av p55- IC (d) In vitro binding of the 55.11 protein to GST fusion proteins containing parts of p55-IC

For å sikre at 55.11 faktisk kan binde til p55-IC og ekskludere involvering av gjærproteiner i denne bindingen, ble in vitro interaksjon av GST p55-IC fusjonsproteinene produsert ved bakterie med proteinet kodet av 3 kB 55.11 cNDA (55.11-full) produsert av transfekterte HeLa celler, undersøkt. I denne studien ble cDNA for full-lengde 55.11, FLAG-55.11 (rester 309-900 av 55.11 kodet av det opprinnelige klonede partielle cDNA og sammensmeltet ved N terminalen med FLAG oktapeptidet), og luciferase (kontroll) ble uttrykt i transfekterte HeLa celler og metabolisk merket med [3<5>s] Met og [<35>S] Cys. De følgende proteinene ble sammensmeltet med GST: full-lengde p55-IC (GST-p55-IC) og p55-IC C-terminalt trunkert opp til aminosyre 345 (GST-p55-IC345) for å fjerne det meste av "dødsområdet" (se tabell 2). GST alene tjente som en kontroll. Lysater av de transfekterte cellene ble immunoprecipitert med antistoffer mot 55.11 proteinet når full-lengde 55.11 proteinet ble benyttet for binding av GST-msjonsproteiner, eller med antistoffer mot FLAG oktapeptidet når FLAG-55.11 fusjonsproduktet ble benyttet for binding av GST-fusjonsproteinene. Proteinene var analysert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE: 10% akrylamid) fulgt ved autoradiografi. To ensure that 55.11 can indeed bind to p55-IC and exclude the involvement of yeast proteins in this binding, in vitro interaction of the GST p55-IC fusion proteins produced by bacteria with the protein encoded by the 3 kB 55.11 cDNA (55.11-full) produced by transfected HeLa cells, investigated. In this study, cDNA for full-length 55.11, FLAG-55.11 (residues 309-900 of 55.11 encoded by the original cloned partial cDNA and fused at the N terminus with the FLAG octapeptide), and luciferase (control) were expressed in transfected HeLa cells and metabolically labeled with [3<5>s] Met and [<35>S] Cys. The following proteins were fused to GST: full-length p55-IC (GST-p55-IC) and p55-IC C-terminally truncated up to amino acid 345 (GST-p55-IC345) to remove most of the "dead region" ( see table 2). GST alone served as a control. Lysates of the transfected cells were immunoprecipitated with antibodies against the 55.11 protein when the full-length 55.11 protein was used for binding GST-msion proteins, or with antibodies against the FLAG octapeptide when the FLAG-55.11 fusion product was used for binding the GST fusion proteins. The proteins were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE: 10% acrylamide) followed by autoradiography.

I fig. 3A og B er det vist reproduksjoner av autoradiogrammene av de ovenfor nevnte SDS-PAGE gelene, hvor fig. 3A viser bindingen av full-lengde 55.11 proteinet (55.11-full) til de forskjellige GST-fusjonsproteinene; og hvor fig. 3B viser bindingen av Flag-55.11 fusjonsproduktet til de forskjellige GST-fusjonsproteiner. I fig. 3A er det vist i sporet lengst til høyre et kontroll-immunoprecipitat av lysater fra celler transfektert med kim full-lengde 55.11 og immunoprecipitert med anti-55.11 antistoffer (a55.11 Abs.). I fig. 3B er det vist i sporet lengst til høyre et kontroll-immunoprecipitat av lysater av celler transfektert med kun FLAG-55.11 og immunoprecipitert med anti-FLAG antistoffer (ccFLAG Abs.). In fig. 3A and B, reproductions of the autoradiograms of the above-mentioned SDS-PAGE gels are shown, where fig. 3A shows the binding of the full-length 55.11 protein (55.11-full) to the various GST fusion proteins; and where fig. 3B shows the binding of the Flag-55.11 fusion product to the various GST fusion proteins. In fig. 3A, a control immunoprecipitate of lysates from cells transfected with germ full-length 55.11 and immunoprecipitated with anti-55.11 antibodies (a55.11 Abs.) is shown in the rightmost lane. In fig. 3B, a control immunoprecipitate of lysates of cells transfected with only FLAG-55.11 and immunoprecipitated with anti-FLAG antibodies (ccFLAG Abs.) is shown in the rightmost lane.

Således er det tydelig fra fig. 3A og B at proteinet kodet ved full-lengde 55.11 cDNA kan bli uttrykt i HeLa celler og de binder til fusjonsproteiner som inneholdt det fulle p55-IC (GST-p55IC) eller et trunkert p55-IC som manglet det meste av dødsomårdet (GST-p55IC345) (fig. 3A). Full-lengde 55.11 proteinet bandt ikke til GST alene (kontroll). Tilsvarende bandt det HeLa celle uttrykte proteinet kodet ved det initielt klonede partielle cDNA av 55.11 i fusjon med FLAG oktapeptid (FLAG-55.11) in vitro til GST-p55IC og GST-p55IC345, men ikke til GST (fig. 3B). Resultatene ovenfor gir derfor også ytterligere bevis (se (b) ovenfor) at 55.11 binder til en region av p55IC oppstrøms for "dødsområdet", dvs. regionen av p55-IC som er mer proksimalt for det transmembrane området. Thus, it is clear from fig. 3A and B that the protein encoded by the full-length 55.11 cDNA can be expressed in HeLa cells and they bind to fusion proteins containing the full p55-IC (GST-p55IC) or a truncated p55-IC lacking most of the death domain (GST- p55IC345) (Fig. 3A). The full-length 55.11 protein did not bind to GST alone (control). Similarly, the HeLa cell-expressed protein encoded by the initially cloned partial cDNA of 55.11 in fusion with FLAG octapeptide (FLAG-55.11) bound in vitro to GST-p55IC and GST-p55IC345, but not to GST (Fig. 3B). The above results therefore also provide further evidence (see (b) above) that 55.11 binds to a region of p55IC upstream of the "dead region", i.e. the region of p55-IC more proximal to the transmembrane region.

Dessuten demonstrerte studiene ovenfor at antistoffer til 55.11 hadde blitt suksessfullt produsert (fig. 3A). Moreover, the above studies demonstrated that antibodies to 55.11 had been successfully produced (Fig. 3A).

( e) Sammenligning av den avledede aminosyresekvensen av humant 55. 11 til de til relaterte proteiner tilstede i lavere organismer, og sekvense<g>enskapene til 55. 11 proteinet (e) Comparison of the deduced amino acid sequence of human 55.11 to those of related proteins present in lower organisms, and the sequence<g>properties of the 55.11 protein

Som nevnt ovenfor, ifølge foreliggende oppfinnelse, har full-lengde 55.11 cDNA blitt klonet og sekvensert (se nukleotidsekvensen i fig. l(a)) og full-lengde aminosyresekvensen av 55.11 har blitt avledet fra cDNA sekvensen (se aminosyresekvnsen i fig. l(d)). Databank (Genbank™/EMBL Databank) søk avslørte at deler av sekvensen av humant 55.11 cDNA (aksessjonnumre T03659, Z19559 og F09128) og dets mushomolog (aksessjonsnumre X80422 og Z31147) allerede har blitt bestemt under tilfeldig sekvensering av cDNA biblioteker. En cDNA sekvens (aksessjonsnummer Ul 8247) som koder for et humant protein på 596 aminosyrer som er tilstede i kulturer av humane hepatoma HC10 celler, er tilsvarende det til 55.11. Dette hepatomaproteinet mangler imidlertid en N terminal del (aminosyrer 1-297) tilsvarende til den til 55.11 og skiller seg også fra 55.11 ved regionene som tilsvarer til restene 297-377 og restene 648-668 i 55.11. Søkene i databanken avslørte også at proteiner med meget høy sekvenshomologi med 55.11 eksisterer i Saccharomyces cerevisiae (gjær), Arabidopsis thaliana (planter) og Caenorhabditis elegans (ormer). Således synes 55.11 å oppfylle en evolusjonsmessig konservert funksjon. I gjær er det to kjente proteiner (den åpne leserammen YHR027c og SEN3) hvis DNA sekvenser tilsvarer den til 55.11. Størrelsene av begge er mer den til 55.11. YHR027c er kjent kun ved sekvensering av en genomisk klone, mens SEN3 har blitt klonet som et cDNA. Setene innen 55.11 som er tilsvarende til de i SEN3 korrelerer til setene for dets likhet til YHR027c, selv om mye mer likhet er tydelig mellom 55.11 og YHR027c enn mellom 55.11 og SEN3. DNA sekvensinformasjon som er tilgjengelig for Arabidopsis thaliana og Caenorhabditis elegans proteinene viser klart, selv om de kun er delvise, at disse proteinene er tilsvarende til 55.11 samt YHR027c proteinet fra gjær. Det eneste av disse fire proteinene hvis natur har blitt utledet hittil er gjær SEN3 hvis homologi til 55.11 er begrenst. SEN3 har blitt identifisert som gjærekvivalenten til pl 12 subenheten av en aktivator av 20S proteasomet (den proteolytiske kjernen av 26S proteasomet [Rechsteine et al., 1993, DeMartino et al., 1994] (M.R. Culbertson og M. Hockstrasser, personlig overlevering). As mentioned above, according to the present invention, the full-length 55.11 cDNA has been cloned and sequenced (see the nucleotide sequence in Fig. 1(a)) and the full-length amino acid sequence of 55.11 has been derived from the cDNA sequence (see the amino acid sequence in Fig. 1( d)). Databank (Genbank™/EMBL Databank) search revealed that parts of the sequence of human 55.11 cDNA (accession numbers T03659, Z19559 and F09128) and its mouse homologue (accession numbers X80422 and Z31147) have already been determined during random sequencing of cDNA libraries. A cDNA sequence (accession number Ul 8247) encoding a human protein of 596 amino acids present in cultures of human hepatoma HC10 cells is equivalent to that of 55.11. However, this hepatoma protein lacks an N terminal portion (amino acids 1-297) corresponding to that of 55.11 and also differs from 55.11 at the regions corresponding to residues 297-377 and residues 648-668 of 55.11. The searches in the data bank also revealed that proteins with very high sequence homology with 55.11 exist in Saccharomyces cerevisiae (yeast), Arabidopsis thaliana (plants) and Caenorhabditis elegans (worms). Thus, 55.11 seems to fulfill an evolutionarily conserved function. In yeast, there are two known proteins (the open reading frame YHR027c and SEN3) whose DNA sequences correspond to that of 55.11. The sizes of both are more that of 55.11. YHR027c is known only by sequencing a genomic clone, while SEN3 has been cloned as a cDNA. The seats within 55.11 that are equivalent to those in SEN3 correlate to the seats for its similarity to YHR027c, although much more similarity is evident between 55.11 and YHR027c than between 55.11 and SEN3. DNA sequence information available for the Arabidopsis thaliana and Caenorhabditis elegans proteins clearly shows, although only partially, that these proteins are equivalent to 55.11 as well as the YHR027c protein from yeast. The only one of these four proteins whose nature has been deduced to date is yeast SEN3 whose homology to 55.11 is limited. SEN3 has been identified as the yeast equivalent of the pl 12 subunit of an activator of the 20S proteasome (the proteolytic core of the 26S proteasome [Rechsteine et al., 1993, DeMartino et al., 1994] (M.R. Culbertson and M. Hockstrasser, personal communication).

I fig. 4 er det vist skjematisk en sammenligning av den avledede aminosyresekvensen av humant 55.11 med den til de ovenfor nevnte, relaterte proteinene som er tilstede i lavere organismer. I fig. 4 er sekvensene sammenlignet med sekvensene av aminosyrer avledet for: 55.11 cDNA (se fig. l(d)), en åpen leseramme (YHR027c) innen et kosmid avledet fra det 8. kromosom av Saccharomyces cerevisiae (nukleotider 21253-24234, aksessjonsnummer Ul0399); SEN3, cDNA av et Saccharomyces cerevisiae protein (aksessjonsnummer L06321); et delvist cDNA av et protein av planten Arabidopsis thaliana (aksessjonsnummer T21500), og et delvis cDNA av et protein fra nematoden Caenorhabditis elegans (aksessjonsnummer D27396), "KEKE" sekvensen i 55.11 er merket med en heltrukken linje og sekvensen AYAGS(x)gLL med brutte linjer. Sekvensene ble innrettet ved bruk av PJJJEUP og PRETTYBOX programmene av GCG pakken. Gap introdusert for å maksimalisere innretningene er angitt ved prikker. In fig. 4 schematically shows a comparison of the deduced amino acid sequence of human 55.11 with that of the above-mentioned related proteins present in lower organisms. In fig. 4, the sequences are compared with the sequences of amino acids derived for: 55.11 cDNA (see Fig. 1(d)), an open reading frame (YHR027c) within a cosmid derived from the 8th chromosome of Saccharomyces cerevisiae (nucleotides 21253-24234, accession number Ul0399) ; SEN3, cDNA of a Saccharomyces cerevisiae protein (accession number L06321); a partial cDNA of a protein from the plant Arabidopsis thaliana (accession number T21500), and a partial cDNA of a protein from the nematode Caenorhabditis elegans (accession number D27396), the "KEKE" sequence in 55.11 is marked with a solid line and the sequence AYAGS(x)gLL with broken lines. The sequences were aligned using the PJJJEUP and PRETTYBOX programs of the GCG package. Gaps introduced to maximize the devices are indicated by dots.

Hva angår de forskjellige sekvensegenskapene eller motivene tilstede i den humane As regards the different sequence characteristics or motifs present in the human

55.11 sekvensen har det følgende blitt observert: Konserverte aminosyresekvensmotiver ble ikke sett i proteinet kodet for av 55.11, bortsett fra en repetitiv "KEKE" sekvens som finnes mellom Lys 614 og Glu 632 (understreket i fig. 4). Slike "KEKE" sekvenser, som er tilstede i mange proteiner, omfatter proteasonale subenheter og kaperoniner, kan 55.11 sequence, the following has been observed: Conserved amino acid sequence motifs were not seen in the protein encoded by 55.11, except for a repetitive "KEKE" sequence found between Lys 614 and Glu 632 (underlined in Fig. 4). Such "KEKE" sequences, which are present in many proteins, include protease subunits and chaperonins, can

fremme assosiasjon av proteinkomplekser (Realini et al., 1994). En sekvens AYAGS(x)gLL synes to ganger i 55.11 proteinet (ved seter 479, 590, se fig. 4); ingen funksjonell signifikans for denne sekvensen har enda blitt beskrevet. promote association of protein complexes (Realini et al., 1994). A sequence AYAGS(x)gLL appears twice in the 55.11 protein (at sites 479, 590, see Fig. 4); no functional significance for this sequence has yet been described.

( f) sekvensegenskaper til p55IC regionen involvert i proteinbinding av 55. 11 (f) sequence characteristics of the p55IC region involved in protein binding of 55. 11

Som beskrevet ovenfor (se (b) og (d)) binder 55.11 proteinet til en region av p55-IC mellom restene 243 og 308 (N terminalen for dette bindingssetet er mellom restene 243 og 266), denne regionen er oppstrøms for "dødsområdet" og mer proksimalt for det transmembrane området av p55-TNF-R. Denne regionen innen p55-IC til hvilken 55.11 binder, har et høyt innhold at prolin, serin og treoninrester. Imidlertid inneholder denne regionen ikke RPM1 og RPM2 prolinrike motiver som er tilstede i flere andre cytokine reseptorer (OTMeal og Y-Lee, 1993). I regionen som løper mellom restene 243 og 266, hvis delesjon ødelegger bindingen av p55-R til 55.11 (se (b) og (d) ovenfor og tabell 2), blir to av serinene og to av treoninen fulgt av prolinrester som gjør dem til potentielle seter for fosforylering ved MAP kinase, CDS2 og andre prolinavhengige kinaser (Seger og Krebs, 1995). Fosforylering av dette setet i reseptoren kan påvirke dets binding til 55.11 proteinet. As described above (see (b) and (d)), the 55.11 protein binds to a region of p55-IC between residues 243 and 308 (the N terminus of this binding site is between residues 243 and 266), this region being upstream of the "dead region" and more proximally for the transmembrane region of p55-TNF-R. This region within p55-IC to which 55.11 binds has a high content of proline, serine and threonine residues. However, this region does not contain RPM1 and RPM2 proline-rich motifs that are present in several other cytokine receptors (OTMeal and Y-Lee, 1993). In the region running between residues 243 and 266, the deletion of which destroys the binding of p55-R to 55.11 (see (b) and (d) above and Table 2), two of the serines and two of the threonines are followed by proline residues making them potential sites for phosphorylation by MAP kinase, CDS2 and other proline-dependent kinases (Seger and Krebs, 1995). Phosphorylation of this site in the receptor can affect its binding to the 55.11 protein.

I lys av alt ovenfor nevnte med hensyn til protein 55.11 og dets binding til p55-IC, kan det bli konkludert at ifølge foreliggende oppfinnelse har det blitt funnet et nytt protein som binder til en distinkt region oppstrøms for "dødsområdet" av p55-IC. Slik binding kan påvirke TNF-medierte aktiviteter forskjellig fra induksjonen av celledød. Regionen til hvilken 55.11 binder har tidligere blitt vist å være involvert i induksjonen av nitrogenoksydsyntase (Tartaglia et al., 1993) og synes å være involvert i aktiveringen av nøytrl spingomeylinase ved TNF (Wiegmann et al., 1994). Det er således mulig at assosiering (binding) av 55.11 med det intracellulære området av p55-TNF-R (p55IC) påvirker eller er involvert i: (i) signaleringen for disse ovenfor angitte eller andre TNF effekter, (ii) foldingen eller prosessering av protinet (som foreslått ved likheten av 5.11 med en subenhet av 26S protesomet), eller (iii) reguleringen av aktiviteten eller ekspresjon av p55-TNF-R. In light of all the above mentioned with respect to protein 55.11 and its binding to p55-IC, it can be concluded that according to the present invention, a new protein has been found that binds to a distinct region upstream of the "death region" of p55-IC. Such binding may affect TNF-mediated activities distinct from the induction of cell death. The region to which 55.11 binds has previously been shown to be involved in the induction of nitric oxide synthase (Tartaglia et al., 1993) and appears to be involved in the activation of neutral sphingomeylinase by TNF (Wiegmann et al., 1994). It is thus possible that association (binding) of 55.11 with the intracellular region of p55-TNF-R (p55IC) affects or is involved in: (i) the signaling for these above-mentioned or other TNF effects, (ii) the folding or processing of the protein (as suggested by the similarity of 5.11 to a subunit of the 26S proteasome), or (iii) the regulation of the activity or expression of p55-TNF-R.

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

Selv- assosieringsevne til det ekstracellulære området av p55 TNF reseptoren ( p55IO og dets evne til å forårsake celledød og andre egenskaper og aktiviteter derav, oe et relatert Fas/ APOl reseptor intracellulært område Self-association ability to the extracellular region of the p55 TNF receptor ( p55IO and its ability to cause cell death and other properties and activities thereof, oe a related Fas/ APO1 receptor intracellular region

Som angitt i eksempel 1 ovenfor, ble det oppdaget at det intracellulære området av p55 TNF-R (p55IC) er i stand til binding til seg selv, og videre at fragmenter av p55IC, nemlig proteinene 55.1 og 55.3, også er i stand til binding til p55IC. As indicated in Example 1 above, it was discovered that the intracellular region of p55 TNF-R (p55IC) is capable of binding to itself, and further that fragments of p55IC, namely proteins 55.1 and 55.3, are also capable of binding to p55IC.

Det har blitt vist at bindingen av TNF til p55 TNF-R fører til en cytocidal effekt på cellene som bærer denne reseptoren. Videre kan antistoffer mot det ekstracellulære området av denne reseptoren selv utløse effekten i korrelasjon med effektiviteten til reseptortverrbindingen ved dem. It has been shown that the binding of TNF to the p55 TNF-R leads to a cytocidal effect on the cells that carry this receptor. Furthermore, antibodies against the extracellular region of this receptor can themselves trigger the effect in correlation with the efficiency of the receptor cross-linking by them.

I tillegg viste mutasjonsstudier (Tartaglia et al., (1993); Brakebusch et al., (1992)) at funksjonen til p55-R avhenger av integriteten av dets intracellulære område. Det ble derfor foreslått at initieringen av signaleringen for den cytocidale effekten av TNF opptrer som en konsekvens av assosiasjon av to eller flere intracellulære områder av p55-R (p55-IC), pålagt ved reseptoraggregering. Resultatene ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffer ytterligere bevis for dette ved å vise at ekspresjonen av det intrcellulære området av p55-R i cellene uten det transmembrane eller intracellulære området, utløser deres død. Slike frie intracellulære områder av p55-R er vist å selv-assosiere, som sannsynligvis står for deres evne til å fungere uavhengig av TNF. Det faktum at signaleingen av full-lengde p55-R er avhengig av TNF stimulering, er foreslått å reflektere aktiviteter til transmembrant eller ekstracellulært område av reseptoren som reduserer eller hindrer dets selv-assosiering. In addition, mutational studies (Tartaglia et al., (1993); Brakebusch et al., (1992)) showed that the function of p55-R depends on the integrity of its intracellular region. It was therefore proposed that the initiation of signaling for the cytocidal effect of TNF occurs as a consequence of association of two or more intracellular regions of p55-R (p55-IC), imposed by receptor aggregation. The results of the present invention provide further evidence for this by showing that the expression of the intracellular region of p55-R in the cells without the transmembrane or intracellular region triggers their death. Such free intracellular regions of p55-R have been shown to self-associate, which likely accounts for their ability to function independently of TNF. The fact that signaling by full-length p55-R is dependent on TNF stimulation has been suggested to reflect activities of the transmembrane or extracellular region of the receptor that reduce or prevent its self-association.

Evnen til det intracellulære området av p55-R (p55-IC) til selv-assosiering ble funnet å være heldig i forsøkene på å klone effektorproteinene som vekselvirker med denne reseptoren (se eksempel 1 ovenfor). Det ble for dette formålet benyttet den ovenfor nevnte "to hybrid" teknikken. I tillegg til det nye proteinet 55.11 funnet å assosiere The ability of the intracellular region of p55-R (p55-IC) to self-associate was found to be fortunate in the attempts to clone the effector proteins that interact with this receptor (see Example 1 above). The above-mentioned "two hybrid" technique was used for this purpose. In addition to the new protein 55.11 found to associate

(binde) til p55IC, ble det funnet at tre andre klonede HeLa celle cDNA inneholdt cDNA sekvenser som kodet for deler av det intracellulære området av p55-R, noe som betyr at p55-IC er i stand til selv-assosiering. To av disse klonene var identiske, inneholdende et insert som kodet for aminosyrene 328-426 (angitt som klone 55.1 som kodet for (binding) to p55IC, three other cloned HeLa cell cDNAs were found to contain cDNA sequences encoding parts of the intracellular region of p55-R, meaning that p55-IC is capable of self-association. Two of these clones were identical, containing an insert encoding amino acids 328-426 (designated as clone 55.1 encoding

proteinfragment 55.1 av p55IC). Den tredje inneholdt et lenger insert som kodet for aminosyrer 277-426 (betegnet som klone 55.3 som kodet for proteinfragment 55.3 på p55IC). protein fragment 55.1 of p55IC). The third contained a longer insert encoding amino acids 277-426 (designated clone 55.3 encoding protein fragment 55.3 of p55IC).

I tillegg ble in vitro interaksjon mellom to bakterielt produserte chimeras av p55IC, en i hvilken det var fusert til maltosebindingsproteinet (MBP) og den andre i hvilken det var fusert til glutation-S-transferase (GST). Disse chimeras ble konstruert, klonet og uttrykt ved standard metoder. Etter deres ekspresjon ble det undersøkt selvinteraksjonen av In addition, in vitro interaction between two bacterially produced chimeras of p55IC, one in which it was fused to the maltose-binding protein (MBP) and the other in which it was fused to glutathione-S-transferase (GST), was investigated. These chimeras were constructed, cloned and expressed by standard methods. After their expression, the self-interaction of

p55-R intracellulært område (p55IC) ved bestemmelse av interaksjonen av de ovenfor bakterielt produserte chimere proteinene GST-IC55 (Mr - 51kD) og MBP-IC55 (Mr - p55-R intracellular region (p55IC) by determining the interaction of the above bacterially produced chimeric proteins GST-IC55 (Mr - 51kD) and MBP-IC55 (Mr -

67 kD) med hverandre. Like mengder GST-IC55 chimera (prøver fra spor 1-4 i fig. 5) eller GST alene (prøver fra spor 5-8 i fig. 5) ble bundet til glutationagaroseperler (Sigma) og så inkubert med den samme mengden MBP-IC55 fusjonsprotein i en av de følgende bufferoppløsningene: (i) buffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM KC1,2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,2% Triton X100, 0,5 mM PMSF, 5% glycerol). Dette ble gjort for prøvene i spor 1 og 5 i fig. 5. (ii) buffer I inneholdende 5mM EDTA i stedet for MgCtø. Denne ble gjort for prøvene i spor 2 og 6 i fig. 5. (iii) buffer I inneholdende 250 mM i stedet for 100 mM KC1. Dette ble gjort for prøvene i spor 3 og 7 i fig. 5. (iv) buffer I inneholdende 400 mM i stedet for 100 mM KC1. Dette ble gjort for prøvene i spor 4 og 8 i fig. 5. 67 kD) with each other. Equal amounts of GST-IC55 chimera (samples from lanes 1-4 in Fig. 5) or GST alone (samples from lanes 5-8 in Fig. 5) were bound to glutathione agarose beads (Sigma) and then incubated with the same amount of MBP-IC55 fusion protein in one of the following buffer solutions: (i) buffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM KC1, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.2% Triton X100, 0, 5 mM PMSF, 5% glycerol). This was done for the samples in tracks 1 and 5 in fig. 5. (ii) buffer I containing 5mM EDTA instead of MgCto. This was done for the samples in tracks 2 and 6 in fig. 5. (iii) buffer I containing 250 mM instead of 100 mM KCl. This was done for the samples in tracks 3 and 7 in fig. 5. (iv) buffer I containing 400 mM instead of 100 mM KCl. This was done for the samples in tracks 4 and 8 in fig. 5.

Etter inkubering med rotasjon i 2 timer ved 4°C ble perlene vasket med de samme bufrne og så kokt i SDS-PAGE bufferen fulgt av elektroforese ved PAGE. Proteinene på gelen ble så Western-blottet på nitrocellulosemembranen som så ble farget med polyklonalt antiserum mot MBP. En reproduksjon av disse fargede Western-blot er vist i fig. 5, prøvene i spor 1-8 er de angitt ovenfor. After incubation with rotation for 2 hours at 4°C, the beads were washed with the same buffers and then boiled in the SDS-PAGE buffer followed by electrophoresis by PAGE. The proteins on the gel were then Western blotted onto the nitrocellulose membrane which was then stained with polyclonal antiserum against MBP. A reproduction of these stained Western blots is shown in Fig. 5, the samples in tracks 1-8 are those indicated above.

Fra fig. 5 er det tydelig at p55IC-MBP chimera binder til p55IC-GST chimera (spor 1-4) uavhengig av divalente kationer og selv ved en relativt høy saltkonsentrasjon (0,4M KC1). Således ble det konkludert at p55IC er i stand til å selv-assosiere kraftig. From fig. 5, it is clear that the p55IC-MBP chimera binds to the p55IC-GST chimera (lanes 1-4) independently of divalent cations and even at a relatively high salt concentration (0.4M KCl). Thus, it was concluded that p55IC is capable of strongly self-associating.

For å evaluere de funksjonelle implikasjonene av tendensen til p55-IC å selv-assosiere, ble det forsøkt å uttrykke p55-IC i cytoplasmaet av celler som er sensitive for den cytocidale effekten av TNF. Med hensyn på muligheten at p55-IC vil være cytotoksisk, ble det valgt å uttrykke den på en induserbar måte ved anvendelsen av det nylig utviklede, sterkt regulerte tetracyklinkontrollerte mammalske ekspresjonssystemet (Gossen og Boujard, 1992). Ekspresjon av p55-IC resulterte i massiv celledød (fig. 6, høyre panel). De døende cellene viste oppløsning av celleoverflaten som observert ved avliving av celler ved TNF. Transfeksjon av p55-IC konstruktet til cellene i nærvær av tetracyklin som ifølge rapporter reduserte ekspresjonen av pHD10-3 regulerte konstruker så mye som 10^ fold, resulterte fremdeles i noe celledød, selv om den var signifikant mindre enn den observert i fråvær av tetracyklin (fig. 6, venstre panel). I kontrast viste celler transfektert med et kontrollkonstrukt inneholdende luciferase cDNA, ingen tegn på celledød (resultater ikke vist). To evaluate the functional implications of the tendency of p55-IC to self-associate, it was attempted to express p55-IC in the cytoplasm of cells sensitive to the cytocidal effect of TNF. In view of the possibility that p55-IC will be cytotoxic, it was chosen to express it in an inducible manner using the recently developed highly regulated tetracycline-controlled mammalian expression system (Gossen and Boujard, 1992). Expression of p55-IC resulted in massive cell death (Fig. 6, right panel). The dying cells showed disintegration of the cell surface as observed in the killing of cells by TNF. Transfection of the p55-IC construct into the cells in the presence of tetracycline, which reportedly reduced the expression of pHD10-3 regulated constructs as much as 10^fold, still resulted in some cell death, although it was significantly less than that observed in the absence of tetracycline ( Fig. 6, left panel). In contrast, cells transfected with a control construct containing luciferase cDNA showed no signs of cell death (results not shown).

Evnen til pSS-IC til å utløse celledød når uttrykt uten transmembrane eller ekstacellulære områder på reseptoren, ga ytterligere bevis for involveringen av dette området i signalering. Videre indikerer det at det ikke er noen andre deler av reseptoren som spiller en direkte rolle i slik signalering. Studier av effektene av mutasjoner, inkludert de mutasjoner studert i foreliggende oppfinnelse, på funksjonen av p55-IC, indikerte at regionen som løper mellom aminosyrerestene 326 og 407 er meget kritisk for dets funksjon. Denne regionen viser en markert likhet med sekvensen i det intracellulære området av de to andre reseptorene, som er evolusjonsmessig relatert til p55 TNF-R, nemlig Fas reseptoren (Itoh et al., 1991); Oehm et al., 1992) som også kan signalere for celledød og CD40, en reseptor (Stamenkovic et al., 1989) som øker cellevekst; denne sekvensen synes derfor å utgjøre et konserveirngsmotiv som spiller en slags generell rolle ved signalering. Da den ikke ligner kjente motivkarakteristikker for enzymatiske aktiviteter, synes det plausibelt at den signalerer på en indirekte måte, dvs. muligens ved å tjene som et dokkingsete for signaleringsenzymer eller for proteiner som overfører stimulerende signaler til dem. p55-IC, Fas reseptoren og CD 40 kan alle bli stimulert ved antistoffer mot deres ekstracellulære området. Deres stimulering kan bli vist å korrelere med evnen til antistoffer til å tverrbinde reseptoen. Det synes derfor som om signaliseringen blir initiert som en konsekvens av interaksjon av to eller flere intracellulære områder ved hjelp av aggregering av dé ektracellulære områdene. Involvering av slik interaksjon i initieringen av signalering av disse reseptorene ble også indikert ved studier (Brakebusch et al., 1992) som viser at ekspresjonen av reseptorer som er gjort ikke-funksjonelle ved mutasjon av deres intracellulære område, hadde en "dominant negativ" effekt på funksjonen av ko-uttrykte normalreseptorer. Aggregering av p55-R som respons på TNF ble antydet å skje på en passiv måte, kun på grunn av det faktum at hver av TNF molekylene som opptrer som homotrimerer, kan binde to eller tre reseptormolekyler. Imidlertid antyder funnene i foreliggende oppfinnelse at denne prosessen opptrer noe annerledes. The ability of pSS-IC to trigger cell death when expressed without transmembrane or extracellular regions of the receptor provided further evidence for the involvement of this region in signaling. Furthermore, it indicates that there are no other parts of the receptor that play a direct role in such signaling. Studies of the effects of mutations, including those studied in the present invention, on the function of p55-IC indicated that the region running between amino acid residues 326 and 407 is very critical for its function. This region shows a marked similarity to the sequence in the intracellular region of the other two receptors, which are evolutionarily related to the p55 TNF-R, namely the Fas receptor (Itoh et al., 1991); Oehm et al., 1992) which can also signal for cell death and CD40, a receptor (Stamenkovic et al., 1989) that increases cell growth; this sequence therefore seems to constitute a conservation motif that plays a kind of general role in signalling. As it does not resemble known motif characteristics for enzymatic activities, it seems plausible that it signals in an indirect manner, i.e. possibly by serving as a docking site for signaling enzymes or for proteins that transmit stimulatory signals to them. p55-IC, the Fas receptor and CD 40 can all be stimulated by antibodies against their extracellular domain. Their stimulation can be shown to correlate with the ability of antibodies to cross-link the receptor. It therefore seems as if the signaling is initiated as a consequence of interaction of two or more intracellular areas by means of aggregation of the extracellular areas. Involvement of such interaction in the initiation of signaling by these receptors was also indicated by studies (Brakebusch et al., 1992) showing that the expression of receptors rendered non-functional by mutation of their intracellular region had a "dominant negative" effect on the function of co-expressed normal receptors. Aggregation of p55-R in response to TNF was suggested to occur in a passive manner, only due to the fact that each of the TNF molecules acting as homotrimers can bind two or three receptor molecules. However, the findings of the present invention suggest that this process behaves somewhat differently.

Tendensen til p55-IC til selv-assosiering indikerer at dette området spiller en aktiv rolle i dets induserte aggregering. Dessuten synes aktiviteten til p55-IC å være tilstrekkelig for initiering av dets signalering, da den når den blir uttrykt uavhengig av resten av reseptormolekylet, kan utløse celledød i fråvær av TNF eller en hvilken som helst annen ytre stimuli. Likevel, når uttrykt som full-lengde reseptoren, signaliserer p55-TNF-R ikke, hvis den ikke blir stimulert av TNF. Man må derfor anta at ved aktivering av p55-TNF-R, overvinner faktisk TNF noen inhibitoriske effekter som forhindrer spontan assosiering av de intracellulære områdene og denne hemmingen skjer på grunn av bindingen av p55-IC til resten av reseptormolekylet. Hemmingen kan skyldes orienteringen som er gitt ved det intracellulære området ved det transmembrane eller ekstracellulære området, for å assosiere noen andre proteiner med reseptoren eller kanskje er årsak til begrensning av mengdene reseptorer som kan være tilstede på plasmamembranen. Denne kontrollmekanismen må naturligvis være meget effektiv, da ifølge noen beregninger bindingen av kun et TNF molekyl til en celle er tilstrekkelig for utløsning av dens død. The tendency of p55-IC to self-associate indicates that this region plays an active role in its induced aggregation. Moreover, the activity of p55-IC appears to be sufficient for the initiation of its signaling, as when expressed independently of the rest of the receptor molecule, it can trigger cell death in the absence of TNF or any other external stimuli. However, when expressed as the full-length receptor, p55-TNF-R does not signal if not stimulated by TNF. One must therefore assume that upon activation of p55-TNF-R, TNF actually overcomes some inhibitory effects that prevent spontaneous association of the intracellular regions and this inhibition occurs due to the binding of p55-IC to the rest of the receptor molecule. The inhibition may be due to the orientation provided by the intracellular region by the transmembrane or extracellular region to associate some other proteins with the receptor or may be due to limitation of the amount of receptors that can be present on the plasma membrane. This control mechanism must of course be very efficient, as according to some calculations the binding of just one TNF molecule to a cell is sufficient to trigger its death.

Spontan signalering uavhengig av ligand kan resultere i stor forvirring i prosessen kontrollert av reseptoren. Det best kjente eksempel er dereguleringen av vekstfaktorreseptorene. Mutasjoner som er årsak til at de starter signalering spontant, for eksempel de som forårsaker dem aggregerer spontant, spiller en viktig rolle i den deregulerte veksten av tumorceller. TNF effekter, når indusert i overskudd, er velkjent å bidra i patologien i mange sykdommer. Muligheten til frie intracllulære områder (p55IC) av p55-TNF-R å signalisere uavhengig av TNF, kan bidra til slik eksessiv funksjon. Det synes mulig, for eksempel, at noen av de cytopatiske effektene av virus og andre patogener resulterer, ikke fra deres direkte cytocidale funksjon, men fra proteolytisk løsning av det intracellulære området av p55-TNF-R, og den resulterende TNF-lignende cytotoksiske effekten. Spontaneous signaling independent of ligand can result in great confusion in the process controlled by the receptor. The best known example is the deregulation of the growth factor receptors. Mutations that cause them to initiate signaling spontaneously, such as those that cause them to aggregate spontaneously, play an important role in the deregulated growth of tumor cells. TNF effects, when induced in excess, are well known to contribute to the pathology of many diseases. The ability of free intracellular regions (p55IC) of p55-TNF-R to signal independently of TNF may contribute to such excessive function. It seems possible, for example, that some of the cytopathic effects of viruses and other pathogens result, not from their direct cytocidal function, but from proteolytic cleavage of the intracellular region of p55-TNF-R, and the resulting TNF-like cytotoxic effect .

For videre å utlede regionene i pSSIC som er ansvarlig for dets selv-assosierende evne og således dets liganduavhengige celletoksisitet, og også å bestemme om andre beslektede medlemmer av TNF/NGF reseptorfamilien (for eksempel FAS-R) også har intracellulære områder med selv-assosierende evner og liganduavhengige effekter, ble den følgende detaljerte studien utført: To further deduce the regions of pSSIC responsible for its self-associating ability and thus its ligand-independent cellular toxicity, and also to determine whether other related members of the TNF/NGF receptor family (for example, FAS-R) also have intracellular regions of self-associating abilities and ligand-independent effects, the following detailed study was performed:

( a) Generelle prosedyrer og materialer (a) General procedures and materials

( i) To- hvbrid undersøkelse og to- hvbrid fi- galaktosidase- ekspresionstest (i) Two-hybrid examination and two-hybrid fi-galactosidase expression test

cDNA inserter, som kodet for p55-IC og dets delesjonsmutanter, Fas-IC og forskjellige andre proteiner (se tabell 3), ble klonet ved PCR, enten fra full-lengde cDNA klonet på tidligere i søkers laboratorium, eller fra anskaffede cDNA biblioteker. B-galaktosidase-ekspresjon i gjær (SFY526 reporterstamme (Bartel et al., 1993)) transformert med disse cDNA inserts, which coded for p55-IC and its deletion mutants, Fas-IC and various other proteins (see Table 3), were cloned by PCR, either from full-length cDNA cloned previously in applicant's laboratory, or from acquired cDNA libraries. B-galactosidase expression in yeast (SFY526 reporter strain (Bartel et al., 1993)) transformed with these

cDNA i pGBT-9 og pGAD-GH vektorer (DNA bindende område (DBD) og aktiveringsområde (AD) konstrukter, henholdsvis) ble undersøkt ved en væsketest (Guarente, 1983); det ble også undersøkt ved en filteranalyse for å gi kvantitativt de samme resultater (ikke vist). To-hybrid undersøkelsen (Fields og Song, 1989) av et anskaffet Gal4 AD-merket HeLa celler cDNA bibliotek (Clontech, Palo Alto, Ca., USA) for proteiner som binder til det intracellulære området av p55-R (p55-IC), ble utført ved anvendelse av HF7c gjærrepotrerstamme ifølge anbefalingen fra produsenten. Positive resultater for isolerte kloner ble undersøkt ved (a) prototrofi av transformert gjær for histidin når dyrket i nærvær av 5 mM 3-aminotriazol, (b) fi-galaktosidase-ekspresjon, (c) spesifikke tester (interaksjon med SNF4 og lamin sammensmeltet til Gal4 DBD). cDNA in pGBT-9 and pGAD-GH vectors (DNA binding domain (DBD) and activation domain (AD) constructs, respectively) was examined by a liquid assay (Guarente, 1983); it was also examined by a filter analysis to give quantitatively the same results (not shown). The two-hybrid assay (Fields and Song, 1989) of an acquired Gal4 AD-labeled HeLa cells cDNA library (Clontech, Palo Alto, Ca., USA) for proteins that bind to the intracellular region of p55-R (p55-IC) , was performed using the HF7c yeast reporter strain according to the manufacturer's recommendation. Positive results for isolated clones were examined by (a) prototrophy of transformed yeast for histidine when grown in the presence of 5 mM 3-aminotriazole, (b) β-galactosidase expression, (c) specific tests (interaction with SNF4 and lamin fused to Gal4 DBD).

( ii) In vitro selv- assosiering av bakterielt produserte p55- IC fusjonsproteiner (ii) In vitro self-association of bacterially produced p55-IC fusion proteins

Glutation S-transferase (GST) og glutation S-transferase-p55-IC fusjonsprotein (GST-p55-IC) ble produsert som beskrevet andre steder (Frangioni og Neel, 1993; Ausubel et al., 1994). Maltosebindende protein (MBP) fusjonsproteiner ble oppnådd ved anvendelse av pMalcRI vektor (New England Biolabs) og renset på en amyloseresinkolonne. Interaksjonen av MBPP og GST fusjonsproteiner ble undersøkt ved inkubering av glutation-agaroseperler sekvensielt med GST og MBPP fusjonsproteiner (S ug protein/20 ul perler; først inkubering i 15 minutter, og den andre i 2 timer, begge ved 4°C). Inkubering med MBP fusjonsproteiner ble utført i en bufferoppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,5,100 mM KC1,2 mM CaCl2,2 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,2% Triton X100,0,5 mM fenyl-metyl-sulfonyl-fluorid og 5% (v/v) glycerol, eller når angitt, i den samme buffer inneholdende 0,4 M KC1, eller 5 mM EDTA i stedet for MgCtø. Assosiering av MBP fusjonsproteiner ble undersøkt ved SDS polyakrylamid gelelektroforese (10% akrylamid) av de proteinene som var assosiert med glutation-agaroseperler, fulgt av Westem-blotting. Blotene ble testet med kaninantiserum mot MBP (produsert i søkers laboratorium) og med pepperot-peroksidasebundet geit-anti-kanin immunoglobulin. Glutathione S-transferase (GST) and glutathione S-transferase-p55-IC fusion protein (GST-p55-IC) were produced as described elsewhere (Frangioni and Neel, 1993; Ausubel et al., 1994). Maltose binding protein (MBP) fusion proteins were obtained using the pMalcRI vector (New England Biolabs) and purified on an amylose resin column. The interaction of MBPP and GST fusion proteins was examined by incubating glutathione-agarose beads sequentially with GST and MBPP fusion proteins (S ug protein/20 µl beads; first incubation for 15 minutes, and the second for 2 hours, both at 4°C). Incubation with MBP fusion proteins was performed in a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM KC1, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0.2% Triton X100, 0.5 mM phenyl-methyl- sulfonyl fluoride and 5% (v/v) glycerol, or when indicated, in the same buffer containing 0.4 M KCl, or 5 mM EDTA instead of MgCl. Association of MBP fusion proteins was examined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (10% acrylamide) of those proteins associated with glutathione-agarose beads, followed by Westem blotting. The blots were tested with rabbit antiserum against MBP (produced in the applicant's laboratory) and with pepperot peroxidase-linked goat anti-rabbit immunoglobulin.

( tii) Indusert ekspresjon i HeLa celler av p55- R og fra<g>menter derav (tii) Induced expression in HeLa cells of p55-R and fragments thereof

HeLa celler som uttrykte den tetracyklinkontrollerte transaktivatoren utviklet av Gossen og Bujard (HtTA-1 klon (Gossen og Bujard, 1992)), ble dyrket i Bulbeccos modifiserte Eagle's medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, 100 u/ml penicillin, 100 ug/mnl streptomycin og 0,5 mg/ml neomycin. cDNA inserter som kodet for p55-R eller deler derav, ble introdusert i en tetracyklinkontrollerte ekspresjonsvektoren (pUHD 10-3, som var levert av H. Bujard). Cellene ble transformert med ekspresjonskonstruktet (5 ug DNA/6 cm plate) med kalsiumfosfat precipiteirngsmetoden (Ausubel et al., 1994). Effekter av transientekspresjon av transfekterte proteiner ble undersøkt ved de angitte tidene etter transfeksjon i nærvær eller fravær av tetracyklin (1 ug/ml). Kloner av celler som stabilt var transfektert med det humane p55-IC cDNA i pUHD 10-3 vektoren ble stabilisert ved transfektering av cDNA til HtTA-1 celler i nærvær av tetracykliln sammen med et plasmid som ga resistens til hygromycin, fulgt av seleksjon for kloner som var resistente for hygromycin (200 ug/ml). Ekspresjon av cDNA ble oppnådd ved fjerning av tetracyklin som ellers ble opprettholdt konstant i cellevekstmediet. HeLa cells expressing the tetracycline-controlled transactivator developed by Gossen and Bujard (HtTA-1 clone (Gossen and Bujard, 1992)) were grown in Bulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal calf serum, 100 u/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin and 0.5 mg/ml neomycin. cDNA inserts encoding p55-R or parts thereof were introduced into a tetracycline-controlled expression vector (pUHD 10-3, which was provided by H. Bujard). The cells were transformed with the expression construct (5 µg DNA/6 cm plate) by the calcium phosphate precipitation method (Ausubel et al., 1994). Effects of transient expression of transfected proteins were examined at the indicated times after transfection in the presence or absence of tetracycline (1 µg/ml). Clones of cells stably transfected with the human p55-IC cDNA in the pUHD 10-3 vector were stabilized by transfecting the cDNA into HtTA-1 cells in the presence of tetracycline together with a plasmid conferring resistance to hygromycin, followed by selection for clones which were resistant to hygromycin (200 ug/ml). Expression of cDNA was achieved by removal of tetracycline which was otherwise maintained constant in the cell growth medium.

( iv) Måling av TNF- lignende effekter, utløsning av indusert ekspresjon på p55- R og fragmenter derav (iv) Measurement of TNF-like effects, triggering of induced expression of p55-R and fragments thereof

Effekter av indusert ekspresjon på reseptoren og TNF på cellelevedyktighet ble undersøkt ved nøytral-rød opptaksmetoden (Wallach, 1984). Induksjon av IL-8 genekspresjon ble undersøkt ved Northem-analyse. RNA ble isolert ved anvendelse av TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc.), denaturert i formaldehyd/formamidbuffer, elektroforisert gjennom en agarose/formaldehydgel og blottet på en GeneScreen Plus membran (Du Pont) i lOxSSPE buffer ved bruk av standard teknikker. Filtre ble hybridisert med en IL-8 cDNA probe (Matsushima et al., 1988), nukleotider 1-392), radiomerket ved random-prime kit (Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Tyskland) og vasket stringent ifølge protokollen til produsenten. Autoradiografi ble utført i 1-2 dager. Effects of induced expression of the receptor and TNF on cell viability were examined by the neutral-red uptake method (Wallach, 1984). Induction of IL-8 gene expression was examined by Northem analysis. RNA was isolated using TRI REAGENT (Molecular Research Center, Inc.), denatured in formaldehyde/formamide buffer, electrophoresed through an agarose/formaldehyde gel and blotted onto a GeneScreen Plus membrane (Du Pont) in lOxSSPE buffer using standard techniques. Filters were hybridized with an IL-8 cDNA probe (Matsushima et al., 1988), nucleotides 1-392), radiolabeled by random-prime kit (Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany) and washed stringently according to the manufacturer's protocol. Autoradiography was performed for 1-2 days.

( v) Undersøkelse av TNF reseptorekspresjon (v) Examination of TNF receptor expression

TNF reseptorekspresjon i prøver av lxlO<6> celler ble undersøkt ved måling av binding av TNF, merket med <12>^i ved kloramin-T metoden, som tidligere beskrevet (Holtmann og Wallach, 1987). Det ble også undersøkt ved ELISA, utført som beskrevet for kvantifiseringen av oppløselige TNF reseptorer (Aderka et al., 1991) bortsett fra anvendelsen av RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5,150 mM NaCl, 1% NP-40,1% deoksycholat, 0,1% SDS og 1 mM EDTA) for å lyser cellene (70 ul/10<6> celler) og for å fortynne testprøvene. Den oppløselige formen av p55-R, renset fra urin, tjente som standard. TNF receptor expression in samples of lxl0<6> cells was investigated by measuring binding of TNF, labeled with <12>^i by the chloramine-T method, as previously described (Holtmann and Wallach, 1987). It was also examined by ELISA, performed as described for the quantification of soluble TNF receptors (Aderka et al., 1991) except for the use of RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate, 0.1% SDS and 1 mM EDTA) to lyse the cells (70 µl/10<6> cells) and to dilute the test samples. The soluble form of p55-R, purified from urine, served as a standard.

( b) Mutasjonsanalyse av det intracellulære området av p55- R ( p55- IC) for å bestemme regionene av p55- IC som er involvert i dets selv- assosiering (b) Mutational analysis of the intracellular region of p55-R (p55-IC) to determine the regions of p55-IC involved in its self-association

Som angitt ovenfor kan p55-IC selv-assosiere og utløse cytotoksiske effekter på cellene, og der er deler av p55-IC som i seg selv er i stand til å binde til full-lengde p55-IC. Spesielt ble en av delene av p55-IC (betegnet som proteinfragment 55.1 i eksempel 1 ovenfor) identifisert som var i stand til sterk binding til full-lengde p55-IC, denne delen ble sekvensert og ble observert å inneholde aminosyrerestene 328-426 av p55-TNF-R, som er innen p55-IC. Det ble videre oppdaget (se nedenfor) at delen ovenfor, proteinfragment 55.1, er i seg selv stand til selv-assosiering og av utløsning av cytotoksiske effekter på celler. Således er denne delen av p55-IC blitt kalt "dødsområdet" og er lokalisert i regionen mellom aminosyrerestene 328-426 i det humane p55-R, mest sannsynlig bestående av aminosyrerestene mellom omkring rest 328 og 414 derav. As indicated above, p55-IC can self-associate and trigger cytotoxic effects on cells, and there are parts of p55-IC that are themselves capable of binding to full-length p55-IC. In particular, one of the parts of p55-IC (designated as protein fragment 55.1 in Example 1 above) was identified as capable of strong binding to full-length p55-IC, this part was sequenced and was observed to contain amino acid residues 328-426 of p55 -TNF-R, which is within p55-IC. It was further discovered (see below) that the above portion, protein fragment 55.1, is itself capable of self-association and of triggering cytotoxic effects on cells. Thus, this part of p55-IC has been called the "dead region" and is located in the region between amino acid residues 328-426 of the human p55-R, most likely consisting of the amino acid residues between about residue 328 and 414 thereof.

Det faktum at "dødsområdet" av p55-IC selv-assosierer, ble funnet ved et lykketreff. Ved undersøkelse av et HeLa celle cDNA bibliotek ved to-hybrid teknikken (se eksempel 1 ovenfo) for proteiner som binder til det intracellulære området av denne reseptoren, ble det blant cDNA hvis produkter bandt spesifikt til det intracellulære området GAL4 DBD fusjonsprotein, funnet flere kloner (for eksempel 55.1 og 55.3) som i seg selv koder for deler av p55-R intracellulære området (p55-IC, merket med stjerne i tabell 3). The fact that the "dead zone" of p55-IC self-associates was found by serendipity. When examining a HeLa cell cDNA library by the two-hybrid technique (see example 1 above) for proteins that bind to the intracellular region of this receptor, several clones were found among cDNAs whose products bound specifically to the intracellular region of the GAL4 DBD fusion protein (eg 55.1 and 55.3) which themselves encode parts of the p55-R intracellular region (p55-IC, marked with an asterisk in Table 3).

Anvendelsen av to-hybrid testen for å evaluere graden av spesifisitet i selv-assosieringen av p55-IC og for å definere mer nøyaktig den involverte regionen, førte til de følgende funn (tabell 3): (a) Selv-assosieringen av p55-IC er gitt til en region innen "dødsområdet". Dets N terminal er lokalisert mellom restene 328 og 344 og dets C terminal er nær rest 404, noe oppstrøms for den rapporterte C terminalen til dette området (rest 414). (b) Delesjon av den membranproksimale del av p55-IC oppstrøms for "dødsområdet" øket selv-assosieringen, noe som antyder at denne regionen har en hemmende effekt på assosieringen, (c) Mus p55-IC selv-assosiserer, og assosierer også med "dødsområdet" av human p55-R. (d) Undersøkelse av selv-assosieringen av de intracellulære områdene av de tre andre reseptorene av TNF/NGF reseptorfamilien: Fas/APOl (FAS-R), CD40 (Fields og Song, 1989) og p75 TNF reseptor (Smith et al., 1990), viste at Fas-IC som signaliserer for celledød ved et sekvensmotiv relatert til p55-R "dødsområdet, selv-assosierer, og assosierer til en viss grad med p55-IC. Imidlertid, CD40-IC som gir vekststimulerende signaler (selv om det også inneholder en sekvens som tilsvarer "dødsområdet") og p75-IC som ikke har noen strukturell likhet med p55-IC, selv-assosierer ikke og binder heller ikke til p55-IC eller Fas-IC. The application of the two-hybrid test to evaluate the degree of specificity in the self-association of p55-IC and to define more precisely the region involved led to the following findings (Table 3): (a) The self-association of p55-IC is given to a region within the "dead area". Its N terminus is located between residues 328 and 344 and its C terminus is close to residue 404, slightly upstream of the reported C terminus of this region (residue 414). (b) Deletion of the membrane-proximal part of p55-IC upstream of the "death region" increased self-association, suggesting that this region has an inhibitory effect on association, (c) Mouse p55-IC self-associates, and also associates with the "dead zone" of human p55-R. (d) Examination of the self-association of the intracellular regions of the other three receptors of the TNF/NGF receptor family: Fas/APO1 (FAS-R), CD40 (Fields and Song, 1989) and the p75 TNF receptor (Smith et al., 1990), showed that Fas-IC which signals for cell death by a sequence motif related to the p55-R "death region, self-associates, and associates to some extent with p55-IC. However, CD40-IC which provides growth-stimulatory signals (although it also contains a sequence corresponding to the "death region") and p75-IC, which has no structural similarity to p55-IC, does not self-associate nor bind to p55-IC or Fas-IC.

Tabell 3 ovenfor viser at den kvantitative bedømmelsen av interaksjonen av Gal4 hybridkonstruktene omfatter de følgende proteinene: det intracellulære området av Table 3 above shows that the quantitative evaluation of the interaction of the Gal4 hybrid constructs includes the following proteins: the intracellular region of

human p55-R og dets forskjellige delesjonsmutanter (restene nummerert i (Loetscher et al., 1990)); de intracellulære områdene av mus p55-R (restene 334-454, nummert som i (Goodwin et al., 1991)); mus Fas/APOl (Fas-IC, 166-306, nummerert som i (Watanabe-Fukanaga et al., 1992)); human CD40 (CD40-IC, 216-277, nummerert som i (Stamenkovic et al., 1989)); og human p75 TNF reseptor (p75-IC, 287-461, nummerert som i (Smith et al., 1990)). SNFl og SNF4 ble benyttet som positive kontroller for assosiering (Fields og Song, 1989), og lamin som en negativ kontroll (Bartel et al., 1993). Proteiner kodet ved Gal4 DBD konstruktene (pGPT9) er opplistet vertikalt; de kodet ved Gal4 AD konstrukter (pGAD-GH) horisontalt. De to delesjonmutantene angitt ved stjerne ble klonet i en to-hybrid screen av et HeLa celle cDNA bibliotek (Clontech, Palo Alto, Ca., USA) ved anvendelse av p55-IC klonet i pGBT9 som "åte". I den screenen ble fire av de 4xl0<6> undersøkte cDNA klonene positive. Tre av disse klonene ble funnet å korrespondere til deler av humant p55-R cDNA (to var identiske, kodende for restene 328-426 og en kodet for restene 277-426). Den fjerde ble funnet å kode et ukjent protein. 6-galaktosidaseekspresjonsdataene er gjennomsnitt av analyser av to uavhengige transformanter og er presentert som mengde 6-galaktosidaseprodukt; (en aktivitetsenhet er definert som OD420 ganger 10-<*> dividert på ODgQO av gjærkulturen og reaksjonstid i minutter). Deteksjonsgrensen for analysen var 0,05 enheter. Variasjon mellom duplikate prøver var i alle tilfeller mindre enn 25% av gjennomsnittet (ikke testet). ;En in vitro test av interaksjonen av et p55-IC-glutation-S-transferase (GST) bakterielt fusjonsprotein med et p55-IC-maltosebindende protein (MBP) fusjonsprotein bekreftet at p55-R selv-assosierte og utelukket involvering av gjærproteiner i denne assosiasjonen (se ovenfor). Assosiasjonen ble ikke påvirket ved øket saltkonsentrasjon eller ved EDTA (se ovenfor). ;For å evaluere funksjonelle implikasjoner av selv-assosiering av dødsområdet, ble det undersøkt måten på hvilken indusert ekspresjon av p55-R eller deler derav, påvirket celler sensitive for TNF cytotoksisitet. Resultatene av denne analysen er angitt i fig. 7 som angir den liganduavhengige utløsningen av en cytocidal effekt i HeLa celler transfektert med p55-R, dets intracellulære område (p55-IC) eller deler derav (inkludert "dødsområdet"). ;I fig. 7 er det skjematisk vist de forskjellige DNA molekylene som koder for de forskjellige typene TNF reseptorer inkludert i vektorene med hvilke HeLa celler ble transfektert (helt til venstre i fig. 7); og ekspresjonen (venstre og midtre kurver) og levedyktigheten (kurven til høyre) i HeLa celler som transientuttrykker de forskjellige full-lengde p55-R (p55-R), p55-IC eller deler av p55-IC, eller som en kontroll, luciferase (LUC) (som hver er angitt helt til venstre på fig. 7), ved anvendelse av en tetracyklinkontroUert ekspresjonsvektor. De åpne søylene (venstre, midtre og høyre) står for celler transfektert i nævær av tetracyklin (1 ug/ml), som hemmer ekspresjon, og de fylte kolonnene (venstre, midtre og høyre) representerer celler transfektert i fravær av tetracykliln. TNF reseptorekspresjon ble undersøkt 20 timer etter transfeksjon, både ved ELISA ved anvendelse av antistoffer mot reseptorens ekstracellulære område (se skjematisk illustrasjon på venstre side i fig. 7) og ved bestemmelse av bindingen av radiomerket TNF av cellene (midten). Den cytocidale effekten av de transfekterte proteinene ble undersøkt 48 timer etter transfeksjon. De viste data er fra et av tre eksperimenter med kvalitativt tilsvarende resultater, i hvilke hvert konstrukt ble testet i duplikat. ND - ikke bestemt. ;Av fig. 7 er det således tydelig at ved anvendelse av en ekspresjonsvektor som tillater strengt kontrollert ekspresjon av transfektert cDNA ved en tetracyklinregulert transaktivator (Crossen og Bujard, 1992) resulterte en liten økning av p55-R ekspresjon i HeLa celler ved ekspresjon av transienttransfektert cDNA for full-lengde reseptor, i relativt stor celledød. En enda større cytotoksisitet ble observert ved ekspresjon av kun p55-IC. Signifikant cytotoksisitet var også observert ved ekspresjon av kun deler av p55-IC omfattende hovedsakelig "dødsområdet" (restene 328-426) i HeLa celler. På den andre side ekspresjon av deler av p55-IC som manglet "dødsområdet" eller inneholdt bare deler av dette (eller ekspresjon av luciferasegenet, benyttet som en irrelevant kontroll) hadde ingen effekt på cellelevedyktighete. Cytotoksisiteten av p55-IC ble ytterligere bekreftet ved anvendelse av celler stabilt transformert med dets cDNA; disse cellene fortsetter å vokse når p55-IC ekspresjon ikke var indusert, men døde når p55-IC ble uttrykt (se ovenfor). ;( c) Andre effekter av det intracellulære området av p55- TNF- R ;For å undersøke om andre aktiviteter av TNF blir utløst ved selv-assosiering av det intracellulære området, inkludert derav "dødsområdet", ble effekten av økningen av ekspresjonen av full-lengde reseptor (p55-R) og ekspresjonen av det intracellulære området av reseptoren (p55-IC) på transkripsjonen av interleukin 8 (IL-8), som er kjent til å bli aktivert av TNF (Matsushima et al., 1988) undersøkt. Resultatene er vist i fig. 8 som viser den liganduavhengige induksjon av IL-8 genekspresjon av HeLa celler transfektert med p55-R eller p55-IC ved anvendelse av et tetracyklinkontrollert konstrukt (se også "General Procedures and Materials" og eksempel 1 ovenfor). I panel A i fig. 8 er der vist en reproduksjon av et Northern blot som viser Northern blot analysen (se "General Procedures and Materials" ovenfor) av RNA (7 ug/spor) ekstrahert fra HeLa (HTta-1) celler, ikke-behandlet ("kontroll") eller behandlet ("TNF") med TNF (500 ug/ml i 4 timer), eller HTta-1 celler 24 timer etter transfeksjon (i nærværet eller fraværet av tetracykllin) med p55-IC ("p55-IC"), p55-R ("p55-R"), eller luciferase ("Lue") cDNA. I panel B i fig. 8 er der vist en reproduksjon av et Northern blot som viser metylenblåfarging av 18S rRNA i hver av prøvene vist i panel A i fig. 8. ;Som det er tydelig fra fig. 8, induserte således transfeksjon av HeLa celler med et tetracyklinkontrollert konstrukt som koder for p55-R cDNA, IL8-transkripsjon. Selv en sterkere induksjon ble observert i celler transfektert med cDNA for p55-IC. I begge tilfellene opptrådte induksjon kun når tetracyklin var ekskludert fra celledyrkningsmediet, noe som indikerer at den opptrer som en konsekvens av ekspresjon av det transfekterte p55-R eller p55-IC. Transfeksjon med luciferase cDNA som kontroll, hadde ingen effekt på IL-8 transkripsjon. ;Følgelig, fra resultatene ovenfor (fig. 8), synes det som en liten økning i p55-R ekspresjon eller selv ekspresjon kun av det intracelllulære området (p55-IC) derav er tilstrekkelig for å utløse på en ligand (TNF)-uavhengig måte, cytotoksisitet og også andre effekter inkludert den ved en økning i ekspresjonen av IL-8 genet i celler. Utløsningen av disse effektene skyldes sannsynligvis selv-assosieringen av det intracellulære området av p55-R (p55-IC). Som angitt ovenfor, synes det som det etter selv-assosiering av p55-IC at "dødsområdet" er hovedsakelig ansvarlig for signlering av induksjonen av de intracellulære prosessene som fører til utløsning av cytotoksisitet i cellene, mens de andre effektene, for eksempel signalering som fører til induksjonen av IL-8 genekspresjon, sannsynligvis skyldes andre regioner av p55-IC, etter selv-assosiasjon derav. Det er derfor mulig at forskjellige regioner av p55-IC er ansvarlige for forskjellige TNF-induserte effekter (for eksempel cytotoksisitet, BL-8 induksjon) inne i cellene, hvor disse effektene er en konsekvens av den intracellulære signaleringen etter selv-assosiering av p55-IC. ;Det faktum at p55-IC kan indusere på en ligand (TNF)-uavhengig måte, utløsningen av andre intracellulære effekter, for eksempel IL-8 induksjon, betyr at p55-IC eller spesifikke deler derav kan blil benyttet som høyt spesifikke verktøy for å gi effekter i celler eller vev som det er ønskelig å behandle, uten behovet for å behandle slike celler eller vev med TNF. For mange patologiske tilstander (for eksempel malignitet), kan behandling med TNF, spesielt ved høye doser, føre til uønskede bieffekter på grunn av antallet intracellulære effekter indusert systemisk ved TNF etter dets binding til dets reseptorer. Ved hjelp av oppdagelsen ifølge foreliggende oppfinnelse at p55-IC kan etterligne spesifikke andre TNF-induserte effekter (ved siden av cytotoksisitet) for eksempel IL-8 induksjon, åpnes veien for introdusering på en celle- eller vevsspesifikk måte, av p55-IC eller spesifikke deler derav, som vil være i stand til å signalerisere for induksjon av spesifikt ønskede intracellulære effekter, for eksempel IL-8 induksjon, og derved overvinne de systemiske bieffektene som ofte blir observert ved TNF behandling. ;( d) Liganduavhengig utløsning av cytocidale effekter i HeLa celler ved de intracellulære områdene og " dødsområdene" derav av p55 TNF- R oe FAS- R ( Fas/ APO!) ;Hva angår den cytotoksiske aktiviteten av de intracellulære områdene av p55 TNF-R og FAS-R (pttIC og FAS-IC) har det nå videre blitt utviklet at både p55IC, dets "dødsområde" (p55DD) og FAS-IC er i stand til en liganduavhengig utløsning av et cytocidal effekt i HeLa celler. I denne studien ble HeLa celler transfektert med ekspresjonsvektorer inneholdende forskjellige konstrukter av enten full-lengde p55-TNF-R, deler derav inkludert p55IC og p55DD eller FAS-IC. I et sett eksperimenter ble HeLa celler ko-transfektert med konstrukter inneholdende p55 TNF-R (p55-R) og FAS-IC (for detaljer av konstruktene, deres fremstilling osv., se ovenfor). Resultatene i denne studien er angitt i fig. 9 (A og B), hvor i både fig. 9A og B konstruktene benyttet for transfektering av HeLa celler er vist skjematisk i panelene til venstre; resultatene av TNF eller FAS reseptorekspresjon er vist grafisk i de to midtre panelene (andre og tredje paneler fra venstre), og resultatene for transfekterte celleoverlevelse er vist grafisk i panelet til høyre. I fig. 9A er det vist resultatene av transfekterte HeLa celler som transientuttrykker full-lengde p55-R, p55-IC eller deler derav, eller som en kontroll, luciferase (LUC), i alle tilfeller ved anvendelse av en tetracykUlnkontrollert ekspresjonsvektor. I fig. 9B er det vist resultatene av transfekterte HeLa celler som transientuttrykker FAS-IC alene eller sammen med p55-R ved anvendelse av en tetracyklinkontrollert ekspresjonsvektor. I den grafiske representasjonen i fig. 9A og B representerer åpne søyler celler transfektert i nærvær av tetracyklin (1 ug/ml), som hemmer ekspresjon, og de fylte søylene representerer celler transfektert i fraværet av tetracyklin. TNF reseptorekspresjon ble målt 20 timer etter transfeksjon både ved ELISA ved anvendelse av antistoffer mot det ekstracellulære området av reseptoren (se panelene på venstre side), og ved bestemmelse av bindingen av radiomerket TNF til cellene (midtre paneler). Den cytocidale effekten av de transfekterte proteinene ble målt 48 timer etter transfeksjon. De viste data er fra et av tre eksperimenter med kvalitativt tilsvarende resultater hvor hvert konstrukt blir testet i duplikat. Betegnelsen "ND" i fig. 9A og B betyr ikke bestemt. Fra resultatene vist i fig. 9A og B er det tydelig at ekspresjon av kun p55IC resulterer i enda større cytotoksisitet. Signifikant cytotoksisitet kan også opptre ved ekspresjon av kun dødsområdet (p55DD). Derimot hadde ekspresjon av deler av p55IC som mangler dødsområdet eller inneholdt kun deler derav, ingen effekt på celleoverlevelsen. Ekspresjon av FAS-IC resulterte ikke i signifikant cytotoksisitet, selv om den signifikante økte cytotoksisiteten til ko-ekspresserte p55-R. ;EKSEMPEL 3: ;Ytterligere proteiner som er i stand til binding til de intracellulære områdene av p55 TNF- R eller FAS- R ;Ved bruk av den samme angrepsmåte og teknologi som angitt i eksempel 1 ovenfor, ble tre ytterligere proteiner isolert og identifisert til å være i stand til å binde til p55IC eller ;FAS-IC. ;I fig. 10-12 er det vist skjematisk den delvise og preliminære nukleotidsekvensen til cDNA kloner, kalt F2, FO og DD 11. ;Kloner F2 og F9 ble isolert ved screening av murint (mus) embryonisk bibliotek ved anvendelse av murint FAS-IC som "åte ". I fig. 10 er det skjematisk vist den delvise nukleotidsekvensen fra F2 cDNA som hadde blitt sekvensert. I fig. 11 er det skjematisk vist den delvise nukleotidsekvensen til 1724 baser fra F9 cDNA som hadde blitt sekvensert. Analyse av bindingsevnen av proteinet kodet ved kloner F2 og F9 (F2 og F9 henholdsvis) har vist at: (a) F2 vekselvirker sterkt med humant p55IC og p55DD og med murint FAS-IC, mens det vekselvirker svakt med ikke-relevante (kontroll) proteiner SNF1 og lamin så vel som relevant protein, humant FAS-IC. (b) F9 vekselvirker sterkt med humant p55-IC og murint FAS-IC, mens det vekselvirker svakt med humant FAS-IC (relevant protein) og irrelevante proteiner SNFl og lamin. (c) Hverken F2 eller F9 vekselvirket i det hele tatt med humant p75IC, pGBT9 (tom åtevektor) eller humant CD-40. ;Videre fra "Gene Bank" og "Protein Bank" søk ble det avslørt at F2 og F9 representerer nye proteiner. ;F2 og F9 representerer således nye proteiner som hadde bindingsspesifisitet for både FAS-IC og p55IC. ;Klone DD11 ble isolert ved screening av et human HeLa bibliotek ved anvendelse av humant p55DD som "åte". I fig. 12 er det vist skjematisk den delvise nukleotidsekvensen av 425 baser fra DD11 cDNA som hadde blitt sekvensert. ;DD11 klonen har en omtrentlig lengde på 800 nukleotider. Den fulle lengden av transkriptet er omtrent 1,2 kb, hvor transkripet har blitt prøvet ved anvendelse av klonen. Analyse av bindingsevnen til proteinet kodet ved klone DD11 har vist at DD11 vekselvirker sterkt med p55DD (aminosyrer 326-414) (se fig. 9) og vekselvirker ikke med delesjonsmutanter i dette området, for eksempel aminosyrer 326-404. DD11 vekselvirker også med mus og humant FAS-IC og til en viss grad med lamin. DD11 vekselvirker ikke i det hele tatt med SNFl eller med pGBT9 (tom åtevektor). DD11 ble heller ikke funnet i "Gene Bank" og "Protein Bank" databaser. DD11 representerer således et p55 IC (p55DD) og FAS-IC spesifikt bindende protein. ;EKSEMPEL 4 ;Konstruksjon av oppløseli<g>e dimere TNF reseptorer ;Basert på funnene angitt i eksempel 2 ovenfor at det intracellulære området av p55-R (p55-IC) og en del derav ("dødsområdet") og at det intracellulære området av Fas/APOl og en del derav (også kalt "dødsområdet") som tilsvarer p55-IC "dødsområdet", er i stand til selv-assosiering, er det mulig å konstruere nye TNF reseptorer som er i stand til selv-assosisering (aggregering) og som er oppløselige. Slike TNF reseptorer vil være fusjonsproteiner som har hovedsakelig hele det ekstracellulære området av p55-R sammensmeltet med hovedsakelig alle de intracellulære områdene eller "dødsområdene" derav av p55-R eller Fas/APOl. Slike fusjonskonstrukter vil således være uten det transmembrale området av p55-R (eller FAS/APOl) og således være oppløselig. Videre ved hjelp av selv-assosieringsevnen til de intracellulære områdene eller "dødsområdene" vil disse fusjonskonstruktene være i stand til oligomerisering for å gi minst dimere (og muligens også høyere ordens multimerer) av p55-R. Følgelig vil slike dimere TNF reseptorer (p55-R) være i stand til binding til minst to TNF monomerer av naturlig forefinnende TNF homotrimer for å gi en oppløselig TNF reseptor som binder kraftigere til dets ligand (homotrimer TNF). ;Følgelig vil minst fire typer av p55 TNF reseptor fusjonsproteiner bli konstruert, hvert av hvilke vil være i stand til oligomerisering og vil være oppløselig: (i) Et fusjonsprodukt mellom det ekstracellulære området av pSS-R (ECSS) og det intracellulære området av p55-R (p55-IC); (ii) Et fusjonsprodukt mellom EC55 og "dødsområdet" av p55-IC (DD55); (iii) Et fusjonsprodukt mellom EC55 og det intracellulære området av Fas/APOl (ICFAS);og ;(iv) Et fusjonsprodukt mellom EC55 og "dødsområdet" av ICFAS (DDFAS). ;I hvert av fusjonsproteinene ovenfor blir TNF monomerbindekapasitet gitt ved EC55 delen mens oligomerisering (eller i det minst dimeriseringen) av hver type av fusjonsprotein bli gitt ved dets "hale" region som er en hvilken som helst av p55IC, DD55, ICFAS eller DDFAS delene. ;For konstruksjon av fusjonsproteinene ovenfor vil standard teknikker av rekombinant DNA teknologi bli benyttet som nå er vel etablert i teknikken (se for eksempel Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), en hvilken som helst passende bakterie, bakteriofag eller animalsk virusekspresjonsvektor (klonebærer eller plasmid utformet for ekspresjon av det innsatte DNA) blir benyttet i hvilken det blir satt inn i ett eller flere av trinnene DNA som koder for EC55 og en av "halene" som er p55.IC, DD55, ICFAS eller DDFAS. Det således innsatte DNA som koder for hvert av fusjonsproteinene vil bli plassert under kontroll av forskjellige ekspresjonskontrollerende sekvenser av klonebæreren eller plasmidet slik som promotere, ribozymbindeseter, transkripsjonene faktorbindeseter osv. Disse ekspresjonskontrollerende sekvensene vil bli valgt avhengig av typen ekspresjonsvektor som er valgt og således typen vertcelle (eukaryote eller prokaryote) i hvilken det er ;ønskelig å uttrykke fusjonsproteinene. Foretrukne vertceller (og således ekspresjonsvektorer) er eukaryote, spesielt mammalske. ;DNA molekylet som koder for hvert av de ovenfor angitte fusjonsproteinene vil bli fremstilt og satt inn i ekspresjonsvektoren ved den følgende prosedyren: (a) Først vil et sett oligonukleotider for anvendelse i PCR bli konstruert ved standard midler, hvor oligonukleotidene er: ;1) ACC ATG GGC CTC TCC ACC GTG (EC55, sens) ;2 ACGC GTC GAC TGT GGT GCC TA GTC CTC (EC55, antisens) ;3) ACGC GTC GAC CGC TAC CAA CGG TGG AAG (IC55, sens) ;4) TCATCT GAG AAG ACTGGG(IC55, antisens) ;5) ACGC GTC CAG AAG AGA AAG GAAA GTA CAG (IC FAS, sens) ;6) CTA GAC CAA GCT TTG GAT (IC FAS, antisens) ;7) ACGC GTC GAC CCC GCG ACG CTG TAC GCC (DD55, sens) ;8) ACGC GTC GAC GAT GTT GAC TTG AGT AAA (DD FAS, sens) ;(b) Plasmider inneholdende de klonede full-lengde p55-R og Fas/APOl reseptorene som søkerene har i laboratoriet (se også paralleltløpende EP56892S og eksemplene 1-3 ovenfor) vil bli utsatt for de følgende manipulasjoner for å gi DNA fragmentene som koder for hvert av fusjonsproteinene, hvis DNA fragmenter så blir ligert inn i de ovenfor angitte valgte ekspresjonsvektorene: (i) For å fremstille DNA fragmentet som koder for EC55 som er en komponent av alle 4 fusjonsproteinene, blir PCR utført på et plasmid som bærer cDNA av humant p55 ved anvendelse av oligonukleotidene nr. 1 og 2 ovenfor (størrelse av fragment 640 bp). (ii) For å få et fusjonsprodukt EC55-IC55, blir PCR utført på et plasmid som bærer cDNA for humant p55 ved anvendelse av oligonukleotidene nr. 3 og 4 for å oppnå et DNA fragment som koder for ICSS (størrelse 677 bp) som så blir blandet med ECSS kuttet ved Sal I og ligert ved buttendeligering inn i en hvilken som helst ekspresjonsvektor for mammalske celler under kontroll av en passende promoter. Orienteringen av det innsatte EC55--IC55 i vektoren blir verifisert for restriksjonskutting og ved sekvensering. (iii) For å få et fusjonsprodukt EC55-IC FAS, blir IC FAS produsert ved PCR på et plasmid med cDNA for FAS ved anvendelse av oligonukleotidene nr. 5 og 6 for å oppnå et fragment (størrelse 448 bp) som så blir kuttet med Sal I og blandet med ECSS kuttet ved Sali og deretter buttendeligert inn i en mammalsk ekspresjonsvektor under kontroll av en passende promoter. Orienteringen av den innsatte EC55--IC FAS i vektoren blir verifisert ved restriksjonskutting og ved sekvensering. (iv) For å få et fusjonsprodukt EC55--DD55 blir et DNA fragment produsert med DD55 sekvensen ved PCR i cDNA for humant p55 ved anvendelse av oligonukleotider nr. 7 og 4. Produktet med en størrelse på 314 bp blir kuttet med Sali og blandet med EC55 kuttet med Sali og deretter buttendeligert inn i den mammalske ekspresjonsvektoren. Orientering av det innsatte EC55-DD55 i vektoren blir verifisert ved restriksjonskutting og sekvensering. (v) For å få et fusjonsproduktet EC55-DD FAS, blir et DNA fragment med DD FAS produsert ved PCR på cDNA for FAS ved anvendelse av oligonukleotidene nr. 6 og 8. Produktet med en størrelse på 332 bp blir kuttet med Sali og blandet med EC55 kuttet ved Sali og deretter buttendeligert inn i den mammalske ekspresjonsvektoren. Orienteringen av EC55--FAS blir så verifisert ved restriksjonskutting og sekvensering. ;Straks ekspresjonsvektorene ovenfor har blitt konstruert, vil de så bli innført ved standard metoder i passende mammalske celler (for eksempel kinesisk hamsterovarie (CHO) eller apenyre (COS) celler) for ekspresjonsformål. De således uttrykte fusjonsproteinene vil så bli renset ved standard metoder (se paralleltløpende søknader EP308378; EP398327 og EP568925). De rensede fusjonsproteinene vil så bli analysert for deres evne til å oligomerisere (og graden derav, dvs. om de danner dimerer eller høyere ordens multimerer) og for deres evne til å binde TNF (og affiniteten eller styrken av bindingen derav). ;EKSEMPEL 5 ;Konstruksjon av oppløselie dimere Fas/ APOl reseptorer ;På en tilsvarende måte som angitt i eksempel 4 ovenfor er det mulig å produsere de fire følgende fire typene Fas/APOl fusjonsprodukter, hver av hvilke vil være i stand til oligomerisering og vil være oppløselig: ;(i) Fusjonsprodukt mellom det ekstracellulære området av Fas/APOl (EC FAS) og det intracellulære området av p55-IC; (ii) Fusjonsprodukt mellom EC FAS og "dødsområdet" av p55-IC (DD55); (iii) Fusjonsprodukt mellom EC FAS og det intracellulære området av Fas/APOl (IC FAS); og ;(iv) Fusjonsprodukt mellom EC FAS og "dødsområdet" av IC FAS (DD FAS). ;I hvert av fusjonsproteinene ovenfor blir den FAS ligandbindende evnen gitt ved EC FAS delen, mens oligomeriseringen (eller i det minste dimeriseringen) av hver type fusjonsprotein gitt ved dets "hale" region som er en hvilken som helst av p55-IC, DD55, IC FAS eller DD FAS delene. ;Konstruksjonen av DNA fragmentene som koder for fusjonsproteinene ovenfor og ekspresjonsvektorene inneholdende dem vil være som angitt i eksempel 4, bortsett fra at forskjellige passende oligonukleotider (ikke vist) vil bli benyttet for fremstilling av EC FAS fragmentet som skal ligeres til en hvilken som helst av de ovenfor angitte "hale" regioner. Deretter vil ekspresjonsvektorene bli innført i de passende vertcellene og de resulterende uttrykte fusjonsproteinene vil bli renset og testet ved deres evne til å oligomerisere (eller graden derav, dvs. om de danner dimerer eller høyere ordens dimerer) og for deres evne til å binde FAS liganden (og affiniteten eller graden av bindingen derav). ;EKSEMPEL 6 ;Konstruksjon av oppløselige oligomere " blandede" TNF/ FAS reseptorer ;For å fremstille oligomere reseptorer som har "blandet" affinitet, dvs. affinitet for både TNF og FAS-R liganden, kan de ovenfor nevnte (eksempler 4 og 5) fusjonsproduktene bli benyttet i den følgende prosedyre: i) Framskaffing av et fusjonsprodukt som angitt i eksempel 4 som inneholder det ekstracellulære området av en TNF-R (p75 TNF-R eller p55 TNF-R) sammensmeltet ved en hvilken som helst av: p55 IC, FAS-IC, p55 DD eller FAS DD; ;ii) Framskaffing av et fusjonsprodukt som angitt i eksempel 5 som inneholder det ekstracellulære området av Fas-R sammensmeltet med et hvilket som helst av: p55 IC, FAS-IC, p55 DD eller FAS-DD; og ;iii) Blanding av et hvilket som helst av fusjonsproduktene fra i) med et hvilket som helst av fusjonsproduktene av ii) for å fremskaffe en ny dimer (eller høyere ordens oligomer) reseptor som har både de ekstracellulære områdene av en TNF-R og FAS-R som er sammenblandet ved deres -IC eller -DD regioner. ;I prosedyren ovenfor kan fusjonsproduktene av i) og ii) bli fremskaffet separat, nemlig for deres rensing fra transformerte celler i hvilke de blir produsert, og så blandet in vitro for å oppnå de blandede affinitetsreseptorene. Alternativt kan vertcellene bli ko-transfektert med vektorer som bærer sekvenser som koder for begge typer fusjonsprodukter, i hvilket tilfelle de blandede affinitetsreseptorene kan bli oppnådd direkte fra de ko-transfekterte cellene. Den faktiske oligomeriseringen av fusjonsproduktene til oligomere reseptorer kan skje i cellene eller under eller etter rensingsprosedyren for å oppnå fusjonsprodukter uttrykt i cellene. For spesifikt å selektere for de blandede affinitetsreseptorene kan en hvilken som helst standard metode bli benyttet, for eksempel affinitetskromatografiprosedyrer i hvilke antistoffer mot TNF-R og FAS-R ekstracellulære områder blir benyttet i sekvensielle kromatografiske trinn for å selektere for de reseptorene som har begge typer ekstracellulære områder. ;REFERANSER ;Aderka, D., Englemann, H., Hornik, V., Skornick, Y., Levo, Y., Wallach, D. and Kushtai, G. ;(1991) Cancer Res. 51 5602-5607. ;Båens et al. (1993) Genomics 16:214-218. ;Barinaga, M. (1993} Science 2621512-4. ;Bartel, P.L., Chien, C.T., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993) Bio Techniques J4, 920-924. Berger, J.. Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. and Cullen, B.R. (1988) Gene 64 1-10. ;Beutler, B. and Cerami, C. (1987) NEJM, 3J£:379-385. ;Boldin, M.P. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270,337-341. ;Bollon, D.P. et al. (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. JO, 39-48. ;Botstein, D. et al. (1982) Miami-Wint. Smyp. 19, 265-274. ;Brakebusch, C. et al. (1992) EMBO J., U:943-950. ;Broach, J.R. (1981) in : The Molecular Biolog<y> of the Yeast Saccharom<y>ces : Life Cycle and ;Inheritance. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 445-470. ;Broach, J.R. (1982) Cell 28, 203-204. ;Brockhaus, M. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:3127-3131. ;Cantor, G.H. et al. (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 20:10932-6. ;Chater, K.F. et al. (1986) in : Sixth International Symposium on Actinomvcetales Biology. ;Akademiai Kaido, Budapest, Hungary, 45-54. Chen, C.J. et al. (1992) Ann N.Y. Acad. Sei. 660:271-3. ;Cheng, J., Zhou, T., Liu, C. Shapiro, J.P. Brauer, M., Kiefer, M.C., Barr, P.J. and Mountz, J.D. ;(1994) Science 263. 1759-1762. ;Crisell, P. et al., (1993) Nucleic Acids Res. (England) 2_L(22):5251-5. ;Crowe, P~.D. et al., (1994) Science, 264:707-709. ;Current protocols in molecular biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., ;Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Varki, A., eds.), ;(1994) pp. 8.1.1-8.1.6 and 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & ;Sons, Inc., New York. ;DeMartino, G.N. Moomaw, C.R., Zagnitko, O.P., Proske, R.J., Chu-Ping, M., Afendis, S.J., ;Swaffield, J.C. and Slaughter, CA. (1994) J. Biol. Chem. 269, 20878-20884. ;Dirks, W., Wirth, M. and Hauser, H. (1993) Gene 128, 247-249. ;Endo, R, Akahoshi, T., Nishimura, A., Tonegawa, M., Takagishi, K.t Kashiwazaki, Matsushima, ;K. and Kondo, H. (1994) Clin. Exp. Immunol. 26, 31-35. ;Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:1531-1536. ;Ferrick, M.R., Thurau, S.R., Oppenheim, M.H., Herbort, C.P., Ni, M., Zachariae, C.P., ;Matsushima, K. and Chan, CC. (1991) Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 32, 1534-1539. Fields, S. and Song, 0. (1989) Nature, 540:245-246. ;Frangioni, IV. and Neel, B.G. (1993) Anal. Biochem. 210. 179-187. ;Glick, B.R. (1987) J. Ind. Microbiol. 1 277-282. ;Goodwin, R.G., Anderson, D., Jerzy, R., David, T., Brannan, C.I., Copeland, N.G. Jenkins, N.A. ;and Smith, CA. (1991) Mol. Cell Biol. IL 3020-3026. ;Gossen, M. and Boujard, H. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5547-5551. ;Gryczan, T. (19821 The Molecular Biolog<y> of the Bacilli. Academic Press, N.Y. 307-329. Guarente, L. (1983) in Methods Enzymol. 101. 181-191. ;Harada, A., Sekido, N., Kuno, A., Akiyama, M., Kasahara, T., Nakanishi, I., Mukaid, and ;Matsushima ;K. (1993) Int. Immunol. i 681-690. ;Heller, R.A. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6151-6155. ;Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem., 26* 14927-14934. human p55-R and its various deletion mutants (residues numbered in (Loetscher et al., 1990)); the intracellular regions of mouse p55-R (residues 334-454, numbered as in (Goodwin et al., 1991)); mouse Fas/APO1 (Fas-IC, 166-306, numbered as in (Watanabe-Fukanaga et al., 1992)); human CD40 (CD40-IC, 216-277, numbered as in (Stamenkovic et al., 1989)); and human p75 TNF receptor (p75-IC, 287-461, numbered as in (Smith et al., 1990)). SNF1 and SNF4 were used as positive controls for association (Fields and Song, 1989), and lamin as a negative control (Bartel et al., 1993). Proteins encoded by the Gal4 DBD constructs (pGPT9) are listed vertically; they encoded by Gal4 AD constructs (pGAD-GH) horizontally. The two deletion mutants indicated by asterisks were cloned in a two-hybrid screen of a HeLa cell cDNA library (Clontech, Palo Alto, Ca., USA) using p55-IC cloned in pGBT9 as "bait". In that screen, four of the 4xl0<6> examined cDNA clones were positive. Three of these clones were found to correspond to portions of human p55-R cDNA (two were identical, encoding residues 328-426 and one encoding residues 277-426). The fourth was found to encode an unknown protein. The 6-galactosidase expression data are averages of analyzes of two independent transformants and are presented as amount of 6-galactosidase product; (a unit of activity is defined as OD420 times 10-<*> divided by ODgQO of the yeast culture and reaction time in minutes). The detection limit of the assay was 0.05 units. Variation between duplicate samples was in all cases less than 25% of the mean (not tested). ;An in vitro test of the interaction of a p55-IC-glutathione-S-transferase (GST) bacterial fusion protein with a p55-IC-maltose-binding protein (MBP) fusion protein confirmed that p55-R self-associates and ruled out the involvement of yeast proteins in this the association (see above). The association was not affected by increased salt concentration or by EDTA (see above). ;To evaluate the functional implications of death site self-association, the manner in which induced expression of p55-R or parts thereof affected cells sensitive to TNF cytotoxicity was investigated. The results of this analysis are shown in fig. 7 which indicates the ligand-independent triggering of a cytocidal effect in HeLa cells transfected with p55-R, its intracellular region (p55-IC) or parts thereof (including the "death region"). In fig. 7 schematically shows the different DNA molecules that code for the different types of TNF receptors included in the vectors with which HeLa cells were transfected (far left in fig. 7); and the expression (left and middle curves) and viability (right curve) in HeLa cells transiently expressing the different full-length p55-R (p55-R), p55-IC or parts of p55-IC, or as a control, luciferase (LUC) (each of which is indicated on the far left of Fig. 7), using a tetracycline-controlled expression vector. The open bars (left, middle and right) represent cells transfected in the presence of tetracycline (1 µg/ml), which inhibits expression, and the filled columns (left, middle and right) represent cells transfected in the absence of tetracycline. TNF receptor expression was examined 20 hours after transfection, both by ELISA using antibodies against the receptor's extracellular region (see schematic illustration on the left side in Fig. 7) and by determining the binding of radiolabeled TNF by the cells (middle). The cytocidal effect of the transfected proteins was examined 48 hours after transfection. The data shown are from one of three experiments with qualitatively similar results, in which each construct was tested in duplicate. ND - not determined. ;From fig. 7, it is thus clear that using an expression vector that allows strictly controlled expression of transfected cDNA by a tetracycline-regulated transactivator (Crossen and Bujard, 1992) resulted in a small increase of p55-R expression in HeLa cells upon expression of transiently transfected cDNA for full- length receptor, in relatively large cell death. An even greater cytotoxicity was observed upon expression of only p55-IC. Significant cytotoxicity was also observed upon expression of only parts of p55-IC comprising mainly the "death region" (residues 328-426) in HeLa cells. On the other hand, expression of parts of p55-IC that lacked the "death region" or contained only parts thereof (or expression of the luciferase gene, used as an irrelevant control) had no effect on cell viabilities. The cytotoxicity of p55-IC was further confirmed using cells stably transformed with its cDNA; these cells continued to grow when p55-IC expression was not induced, but died when p55-IC was expressed (see above). ;( c) Other effects of the intracellular region of p55-TNF-R ;To investigate whether other activities of TNF are triggered by self-association of the intracellular region, including hence the "death region", the effect of increasing the expression of full -length receptor (p55-R) and the expression of the intracellular region of the receptor (p55-IC) on the transcription of interleukin 8 (IL-8), which is known to be activated by TNF (Matsushima et al., 1988) investigated . The results are shown in fig. 8 showing the ligand-independent induction of IL-8 gene expression by HeLa cells transfected with p55-R or p55-IC using a tetracycline-controlled construct (see also "General Procedures and Materials" and Example 1 above). In panel A in fig. 8 shows a reproduction of a Northern blot showing the Northern blot analysis (see "General Procedures and Materials" above) of RNA (7 µg/lane) extracted from HeLa (HTta-1) cells, untreated ("control" ) or treated ("TNF") with TNF (500 ug/ml for 4 h), or HTta-1 cells 24 h after transfection (in the presence or absence of tetracycline) with p55-IC ("p55-IC"), p55 -R ("p55-R"), or luciferase ("Lue") cDNA. In panel B of fig. 8 shows a reproduction of a Northern blot showing methylene blue staining of 18S rRNA in each of the samples shown in panel A in fig. 8. As is clear from fig. 8, thus transfection of HeLa cells with a tetracycline-controlled construct encoding p55-R cDNA induced IL8 transcription. Even a stronger induction was observed in cells transfected with cDNA for p55-IC. In both cases, induction occurred only when tetracycline was excluded from the cell culture medium, indicating that it occurs as a consequence of expression of the transfected p55-R or p55-IC. Transfection with luciferase cDNA as a control had no effect on IL-8 transcription. Accordingly, from the above results (Fig. 8), it appears that a small increase in p55-R expression or even expression of only the intracellular region (p55-IC) thereof is sufficient to trigger a ligand (TNF)-independent manner, cytotoxicity and also other effects including that of an increase in the expression of the IL-8 gene in cells. The release of these effects is likely due to the self-association of the intracellular region of p55-R (p55-IC). As indicated above, it appears that after self-association of p55-IC the "death zone" is mainly responsible for signaling the induction of the intracellular processes leading to the triggering of cytotoxicity in the cells, while the other effects, such as signaling leading to the induction of IL-8 gene expression, probably due to other regions of p55-IC, following its self-association. It is therefore possible that different regions of p55-IC are responsible for different TNF-induced effects (eg cytotoxicity, BL-8 induction) inside the cells, where these effects are a consequence of the intracellular signaling after self-association of p55- IC. The fact that p55-IC can induce, in a ligand (TNF)-independent manner, the triggering of other intracellular effects, for example IL-8 induction, means that p55-IC or specific parts thereof can be used as highly specific tools to produce effects in cells or tissues that are desired to be treated, without the need to treat such cells or tissues with TNF. For many pathological conditions (eg, malignancy), treatment with TNF, especially at high doses, can lead to undesirable side effects due to the number of intracellular effects induced systemically by TNF after its binding to its receptors. By means of the discovery according to the present invention that p55-IC can mimic specific other TNF-induced effects (besides cytotoxicity) for example IL-8 induction, the way is opened for the introduction in a cell- or tissue-specific way, of p55-IC or specific parts thereof, which will be able to signal for the induction of specifically desired intracellular effects, for example IL-8 induction, thereby overcoming the systemic side effects that are often observed with TNF treatment. ;( d) Ligand-independent triggering of cytocidal effects in HeLa cells at the intracellular areas and "death areas" thereof by p55 TNF-R oe FAS-R (Fas/APO!) ;What concerns the cytotoxic activity of the intracellular areas of p55 TNF- R and FAS-R (pttIC and FAS-IC) it has now been further developed that both p55IC, its "dead region" (p55DD) and FAS-IC are capable of a ligand-independent triggering of a cytocidal effect in HeLa cells. In this study, HeLa cells were transfected with expression vectors containing various constructs of either full-length p55-TNF-R, parts thereof including p55IC and p55DD or FAS-IC. In one set of experiments, HeLa cells were co-transfected with constructs containing p55 TNF-R (p55-R) and FAS-IC (for details of the constructs, their preparation, etc., see above). The results of this study are shown in fig. 9 (A and B), where in both fig. 9A and B the constructs used for transfection of HeLa cells are shown schematically in the panels on the left; the results of TNF or FAS receptor expression are shown graphically in the two middle panels (second and third panels from the left), and the results for transfected cell survival are shown graphically in the right panel. In fig. 9A shows the results of transfected HeLa cells transiently expressing full-length p55-R, p55-IC or parts thereof, or as a control, luciferase (LUC), in all cases using a tetracycline-controlled expression vector. In fig. 9B shows the results of transfected HeLa cells transiently expressing FAS-IC alone or together with p55-R using a tetracycline-controlled expression vector. In the graphic representation in fig. 9A and B, open bars represent cells transfected in the presence of tetracycline (1 µg/ml), which inhibits expression, and the filled bars represent cells transfected in the absence of tetracycline. TNF receptor expression was measured 20 hours after transfection both by ELISA using antibodies against the extracellular region of the receptor (see panels on the left), and by determining the binding of radiolabeled TNF to the cells (middle panels). The cytocidal effect of the transfected proteins was measured 48 hours after transfection. The data shown are from one of three experiments with qualitatively similar results where each construct is tested in duplicate. The designation "ND" in fig. 9A and B mean not determined. From the results shown in fig. 9A and B, it is clear that expression of p55IC alone results in even greater cytotoxicity. Significant cytotoxicity can also occur upon expression of only the death domain (p55DD). In contrast, expression of parts of p55IC lacking the death domain or containing only parts of it had no effect on cell survival. Expression of FAS-IC did not result in significant cytotoxicity, although it significantly increased the cytotoxicity of co-expressed p55-R. ;EXAMPLE 3: ;Additional proteins capable of binding to the intracellular regions of p55 TNF-R or FAS-R ;Using the same approach and technology as set forth in Example 1 above, three additional proteins were isolated and identified to to be able to bind to p55IC or ;FAS-IC. In fig. 10-12 is shown schematically the partial and preliminary nucleotide sequence of cDNA clones, named F2, FO and DD 11. Clones F2 and F9 were isolated by screening murine (mouse) embryonic library using murine FAS-IC as "ate ". In fig. 10 schematically shows the partial nucleotide sequence from the F2 cDNA that had been sequenced. In fig. 11 schematically shows the partial nucleotide sequence of 1724 bases from the F9 cDNA that had been sequenced. Analysis of the binding capacity of the protein encoded by clones F2 and F9 (F2 and F9 respectively) has shown that: (a) F2 interacts strongly with human p55IC and p55DD and with murine FAS-IC, while it interacts weakly with non-relevant (control) proteins SNF1 and lamin as well as the relevant protein, human FAS-IC. (b) F9 interacts strongly with human p55-IC and murine FAS-IC, while it interacts weakly with human FAS-IC (relevant protein) and irrelevant proteins SNF1 and lamin. (c) Neither F2 nor F9 interacted at all with human p75IC, pGBT9 (empty bait vector) or human CD-40. Furthermore, from "Gene Bank" and "Protein Bank" searches, it was revealed that F2 and F9 represent new proteins. ;F2 and F9 thus represent new proteins that had binding specificity for both FAS-IC and p55IC. Clone DD11 was isolated by screening a human HeLa library using human p55DD as "bait". In fig. 12 schematically shows the partial nucleotide sequence of 425 bases from the DD11 cDNA that had been sequenced. The DD11 clone has an approximate length of 800 nucleotides. The full length of the transcript is approximately 1.2 kb, where the transcript has been sampled using the clone. Analysis of the binding ability of the protein encoded by clone DD11 has shown that DD11 interacts strongly with p55DD (amino acids 326-414) (see Fig. 9) and does not interact with deletion mutants in this region, for example amino acids 326-404. DD11 also interacts with mouse and human FAS-IC and to some extent with lamin. DD11 does not interact at all with SNF1 or with pGBT9 (empty bait vector). DD11 was also not found in the "Gene Bank" and "Protein Bank" databases. DD11 thus represents a p55 IC (p55DD) and FAS-IC specific binding protein. ;EXAMPLE 4 ;Construction of soluble dimeric TNF receptors ;Based on the findings set forth in Example 2 above that the intracellular region of p55-R (p55-IC) and part thereof ("death region") and that the intracellular region of Fas/APOl and a part thereof (also called the "death zone") corresponding to the p55-IC "death zone" are capable of self-association, it is possible to construct new TNF receptors capable of self-association (aggregation ) and which are soluble. Such TNF receptors will be fusion proteins having substantially all of the extracellular region of p55-R fused with substantially all of the intracellular regions or "dead regions" thereof of p55-R or Fas/APO1. Such fusion constructs will thus be without the transmembrane region of p55-R (or FAS/APO1) and thus be soluble. Furthermore, by the self-association of the intracellular regions or "dead regions", these fusion constructs will be capable of oligomerization to give at least dimers (and possibly also higher order multimers) of p55-R. Accordingly, such dimeric TNF receptors (p55-R) will be capable of binding to at least two TNF monomers of naturally occurring TNF homotrimers to give a soluble TNF receptor that binds more strongly to its ligand (homotrimer TNF). ;Therefore, at least four types of p55 TNF receptor fusion proteins will be constructed, each of which will be capable of oligomerization and will be soluble: (i) A fusion product between the extracellular region of pSS-R (ECSS) and the intracellular region of p55 -R (p55-IC); (ii) A fusion product between EC55 and the “death domain” of p55-IC (DD55); (iii) A fusion product between EC55 and the intracellular domain of Fas/APO1 (ICFAS); and; (iv) A fusion product between EC55 and the "death domain" of ICFAS (DDFAS). ;In each of the above fusion proteins, TNF monomer binding capacity is conferred by the EC55 portion while oligomerization (or at least the dimerization) of each type of fusion protein is conferred by its "tail" region which is any of the p55IC, DD55, ICFAS or DDFAS portions . For the construction of the above fusion proteins, standard techniques of recombinant DNA technology will be used which are now well established in the art (see for example Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.), any suitable bacterial, bacteriophage or animal viral expression vector (clone carrier or plasmid designed for expression of the inserted DNA) is used in which is inserted in one or more of the steps DNA encoding EC55 and one of " the tails" which is p55. IC, DD55, ICFAS or DDFAS. The thus inserted DNA encoding each of the fusion proteins will be placed under the control of various expression controlling sequences of the clone carrier or plasmid such as promoters, ribozyme binding sites, transcription factor binding sites, etc. These expression controlling sequences will be chosen depending on the type of expression vector chosen and thus the type of host cell (eukaryotic or prokaryotic) in which it is desirable to express the fusion proteins. Preferred host cells (and thus expression vectors) are eukaryotic, especially mammalian. ;The DNA molecule that codes for each of the above-mentioned fusion proteins will be prepared and inserted into the expression vector by the following procedure: (a) First, a set of oligonucleotides for use in PCR will be constructed by standard means, where the oligonucleotides are: ;1) ACC ATG GGC CTC TCC ACC GTG (EC55, sense) ;2 ACGC GTC GAC TGT GGT GCC TA GTC CTC (EC55, antisense) ;3) ACGC GTC GAC CGC TAC CAA CGG TGG AAG (IC55, sense) ;4) TCATCT GAG AAG ACTGGG(IC55, antisense) ;5) ACGC GTC CAG AAG AGA AAG GAAA GTA CAG (IC FAS, sense) ;6) CTA GAC CAA GCT TTG GAT (IC FAS, antisense) ;7) ACGC GTC GAC CCC GCG ACG CTG TAC GCC (DD55, sens) ;8) ACGC GTC GAC GAT GTT GAC TTG AGT AAA (DD FAS, sens) ;(b) Plasmids containing the cloned full-length p55-R and Fas/APOl receptors that the applicants have in the laboratory ( see also parallel EP56892S and examples 1-3 above) will be subjected to the following manipulations to provide the DNA fragments encoding each of the fusion proteins, if the DNA fragments then is ligated into the expression vectors selected above: (i) To prepare the DNA fragment encoding EC55 which is a component of all 4 fusion proteins, PCR is performed on a plasmid carrying the cDNA of human p55 using the oligonucleotides No. 1 and 2 above (size of fragment 640 bp). (ii) To obtain a fusion product EC55-IC55, PCR is performed on a plasmid carrying cDNA for human p55 using oligonucleotides No. 3 and 4 to obtain a DNA fragment encoding ICSS (size 677 bp) which then is mixed with ECSS cut at Sal I and ligated by buttend ligation into any mammalian cell expression vector under the control of an appropriate promoter. The orientation of the inserted EC55--IC55 in the vector is verified for restriction cutting and by sequencing. (iii) To obtain a fusion product EC55-IC FAS, IC FAS is produced by PCR on a plasmid with cDNA for FAS using oligonucleotides No. 5 and 6 to obtain a fragment (size 448 bp) which is then cut with Sal I and mixed with ECSS cut at SalI and then buttdelegated into a mammalian expression vector under the control of an appropriate promoter. The orientation of the inserted EC55--IC FAS in the vector is verified by restriction digestion and by sequencing. (iv) To obtain a fusion product EC55--DD55, a DNA fragment is produced with the DD55 sequence by PCR in cDNA for human p55 using oligonucleotides No. 7 and 4. The product with a size of 314 bp is cut with SalI and mixed with EC55 cut with SalI and then buttdelegated into the mammalian expression vector. Orientation of the inserted EC55-DD55 in the vector is verified by restriction cutting and sequencing. (v) To obtain a fusion product EC55-DD FAS, a DNA fragment with DD FAS is produced by PCR on cDNA for FAS using oligonucleotides No. 6 and 8. The product with a size of 332 bp is cut with SalI and mixed with EC55 cut at Sali and then buttdelegated into the mammalian expression vector. The orientation of EC55--FAS is then verified by restriction cutting and sequencing. ;Once the above expression vectors have been constructed, they will then be introduced by standard methods into appropriate mammalian cells (eg, Chinese Hamster Ovary (CHO) or Monkey Kidney (COS) cells) for expression purposes. The thus expressed fusion proteins will then be purified by standard methods (see parallel applications EP308378; EP398327 and EP568925). The purified fusion proteins will then be analyzed for their ability to oligomerize (and the degree thereof, ie whether they form dimers or higher order multimers) and for their ability to bind TNF (and the affinity or strength of binding thereof). ;EXAMPLE 5 ;Construction of soluble dimeric Fas/APOl receptors ;In a similar manner as indicated in example 4 above, it is possible to produce the following four types of Fas/APOl fusion products, each of which will be capable of oligomerization and will be soluble: ;(i) Fusion product between the extracellular region of Fas/APO1 (EC FAS) and the intracellular region of p55-IC; (ii) Fusion product between EC FAS and the “dead domain” of p55-IC (DD55); (iii) Fusion product between EC FAS and the intracellular domain of Fas/APO1 (IC FAS); and ;(iv) Fusion product between EC FAS and the "dead area" of IC FAS (DD FAS). ;In each of the above fusion proteins, the FAS ligand-binding ability is conferred by the EC FAS portion, while the oligomerization (or at least dimerization) of each type of fusion protein is conferred by its "tail" region which is any of p55-IC, DD55, IC FAS or DD FAS parts. ;The construction of the DNA fragments encoding the above fusion proteins and the expression vectors containing them will be as indicated in Example 4, except that different appropriate oligonucleotides (not shown) will be used to prepare the EC FAS fragment to be ligated to any of the above indicated "tail" regions. Next, the expression vectors will be introduced into the appropriate host cells and the resulting expressed fusion proteins will be purified and tested for their ability to oligomerize (or the degree thereof, ie whether they form dimers or higher order dimers) and for their ability to bind the FAS ligand (and the affinity or degree of binding thereof). ;EXAMPLE 6 ;Construction of soluble oligomeric "mixed" TNF/ FAS receptors ;To prepare oligomeric receptors that have "mixed" affinity, i.e. affinity for both TNF and the FAS-R ligand, the above mentioned (examples 4 and 5) the fusion products be used in the following procedure: i) Preparation of a fusion product as set forth in Example 4 containing the extracellular region of a TNF-R (p75 TNF-R or p55 TNF-R) fused to any of: p55 IC , FAS-IC, p55 DD or FAS DD; ;ii) Obtaining a fusion product as set forth in Example 5 containing the extracellular region of Fas-R fused to any of: p55 IC, FAS-IC, p55 DD or FAS-DD; and ;iii) Mixing any of the fusion products of i) with any of the fusion products of ii) to provide a new dimeric (or higher order oligomeric) receptor having both the extracellular regions of a TNF-R and FAS-Rs that are fused at their -IC or -DD regions. In the above procedure, the fusion products of i) and ii) can be obtained separately, namely for their purification from transformed cells in which they are produced, and then mixed in vitro to obtain the mixed affinity receptors. Alternatively, the host cells can be co-transfected with vectors carrying sequences encoding both types of fusion products, in which case the mixed affinity receptors can be obtained directly from the co-transfected cells. The actual oligomerization of the fusion products into oligomeric receptors can occur in the cells or during or after the purification procedure to obtain fusion products expressed in the cells. To specifically select for the mixed affinity receptors any standard method can be used, for example affinity chromatography procedures in which antibodies against TNF-R and FAS-R extracellular regions are used in sequential chromatographic steps to select for those receptors that have both types extracellular areas. ;REFERENCES ;Aderka, D., Englemann, H., Hornik, V., Skornick, Y., Levo, Y., Wallach, D. and Kushtai, G. ;(1991) Cancer Res. 51 5602-5607. ;Båens et al. (1993) Genomics 16:214-218. ;Barinaga, M. (1993} Science 2621512-4. ;Bartel, P.L., Chien, C.T., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993) Bio Techniques J4, 920-924. Berger, J.. Hauber, J ., Hauber, R., Geiger, R. and Cullen, B.R. (1988) Gene 64 1-10.;Beutler, B. and Cerami, C. (1987) NEJM, 3J£:379-385.;Boldin, M.P. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270,337-341. ; Bollon, D. P. et al. (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. JO, 39-48. ; Botstein, D. et al. (1982 ) Miami-Wint. Smyp. 19, 265-274. ;Brakebusch, C. et al. (1992) EMBO J., U:943-950. ;Broach, J.R. (1981) in : The Molecular Biolog<y> of the Yeast Saccharom<y>ces : Life Cycle and ;Inheritance. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 445-470. ;Broach, J.R. (1982) Cell 28, 203-204. ;Brockhaus, M. et al. (1990) Proe Nat Acad Sci USA, 87:3127-3131. ;Cantor, G. H. et al (1993) Proe Nat Acad Sci USA 20:10932-6. ; Chater, K. F. et al. . (1986) in : Sixth International Symposium on Actinomvcetales Biology. ;Akademiai Kaido, Budapest, Hungary, 45-54. Chen, C.J. e etc. (1992) Ann N.Y. Acad. Pollock. 660:271-3. ;Cheng, J., Zhou, T., Liu, C. Shapiro, J.P. Brauer, M., Kiefer, M.C., Barr, P.J. and Mountz, J.D. ;(1994) Science 263. 1759-1762. Crisell, P. et al., (1993) Nucleic Acids Res. (England) 2_L(22):5251-5. ;Crowe, P~. D. et al., (1994) Science, 264:707-709. ;Current protocols in molecular biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., ;Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Varki, A. , eds.), (1994) pp. 8.1.1-8.1.6 and 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley &;Sons, Inc., New York. DeMartino, G.N. Moomaw, C.R., Zagnitko, O.P., Proske, R.J., Chu-Ping, M., Afendis, S.J., ;Swaffield, J.C. and Slaughter, CA. (1994) J. Biol. Chem. 269, 20878-20884. Dirks, W., Wirth, M. and Hauser, H. (1993) Gene 128, 247-249. ;Endo, R, Akahoshi, T., Nishimura, A., Tonegawa, M., Takagishi, K.t Kashiwazaki, Matsushima, ;K. and Kondo, H. (1994) Clin. Exp. Immunol. 26, 31-35. Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:1531-1536. ;Ferrick, M.R., Thurau, S.R., Oppenheim, M.H., Herbort, C.P., Ni, M., Zachariae, C.P., ;Matsushima, K. and Chan, CC. (1991) Invest. Ophthalmol. View. Pollock. 32, 1534-1539. Fields, S. and Song, 0. (1989) Nature, 540:245-246. ;Frangioni, IV. and Neel, B.G. (1993) Anal. Biochem. 210. 179-187. Glick, B.R. (1987) J. Ind. Microbiol. 1 277-282. ;Goodwin, R.G., Anderson, D., Jerzy, R., David, T., Brannan, C.I., Copeland, N.G. Jenkins, N.A. and Smith, CA. (1991) Mol. Cell Biol. IL 3020-3026. ;Gossen, M. and Boujard, H. (1992) Proe. Nati. Acad. Pollock. USA, 89:5547-5551. ;Gryczan, T. (19821 The Molecular Biolog<y> of the Bacilli. Academic Press, N.Y. 307-329. Guarente, L. (1983) in Methods Enzymol. 101. 181-191. ;Harada, A., Sekido, N., Kuno, A., Akiyama, M., Kasahara, T., Nakanishi, I., Mukaid, and ;Matsushima ;K. (1993) Int. Immunol. i 681-690. ;Heller, R. A. et al. (1990) Proe. Nat. Acad. Sci. USA, 87:6151-6155.; Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem., 26* 14927-14934.

Holtmann, H. and Wallach, D. (1987) J. Immunol. m 1161-1167. Holtmann, H. and Wallach, D. (1987) J. Immunol. m 1161-1167.

Itoh, N. et al. (1991) Cell 66:233. Itoh, N. et al. (1991) Cell 66:233.

Itoh, N. and Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 10932-7. Itoh, N. and Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 10932-7.

Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33, 729-742. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33, 729-742.

John, J.F. et al. (1986) Rev.,Infect. Dis. 8, 693-704. John, J.F. et al. (1986) Rev., Infect. Haze. 8, 693-704.

Joseph, S. and Burke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 2^8:24515-8. Joseph, S. and Burke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 2^8:24515-8.

Kendall, K.J. et al (1987) J. Bacteriol 169, 4177-4183. Kendall, K.J. et al (1987) J. Bacteriol 169, 4177-4183.

Khan, A.S. et al. (1992) Nature Genettes, 2: 180-185. Khan, A.S. et al. (1992) Nature Genets, 2: 180-185.

Koizumi, M. et al. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9):879-83. Koizumi, M. et al. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9):879-83.

Kunkel, T.A. (1994) in : Current protocols in molecular biology, pp. 8.1.1-8.1.6 (Ausubel, F.M. Kunkel, T.A. (1994) in : Current protocols in molecular biology, pp. 8.1.1-8.1.6 (Ausubel, F.M.

et al., eds.) Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & Sons, Inc., New York. Loetscher, H., Pan, Y-CE., Lahm, H.-W, Gentz, R., Brockhaud, M., Tabuchi, H. and Lesslauer, et al., eds.) Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & Sons, Inc., New York. Loetscher, H., Pan, Y-CE., Lahm, H.-W, Gentz, R., Brockhaud, M., Tabuchi, H. and Lesslauer,

W. (1990) Cell, 61:351-359. W. (1990) Cell, 61:351-359.

Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor. Laboratory, Cold Spring Harbor.

Maniatis, T. (1980) in : Cell Biology : A Comprehensive Treatise Vol. 3 : Gene Expression. Maniatis, T. (1980) in : Cell Biology : A Comprehensive Treatise Vol. 3 : Gene Expression.

Academic Press, N.Y. 563-608. Academic Press, N.Y. 563-608.

Matsushima, K., Morishita, K., Yoshimura, T., Lavu, S., Kobayashi, Y., Lew, W., Appella, E., Matsushima, K., Morishita, K., Yoshimura, T., Lavu, S., Kobayashi, Y., Lew, W., Appella, E.,

Kung, H.F., Leonard, E.J. and Oppenheim, J.J. (1988) J. Exp. Med. 167, 1883-1893. Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J., £:3269-3278. Kung, H.F., Leonard, E.J. and Oppenheim, J.J. (1988) J. Exp. Med. 167, 1883-1893. Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J., £:3269-3278.

Oehm, A. et al. (1992) J. Biol. Chem. 261:10709. Oehm, A. et al. (1992) J. Biol. Chem. 261:10709.

Ogasawara, I, Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M., Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y., Ogasawara, I, Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M., Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y.,

Itoh, N., Suda, T, and Nagata, S. (1993) Nature 364, 806-809. Itoh, N., Suda, T, and Nagata, S. (1993) Nature 364, 806-809.

Okayama, H. (1983) Mol. Cell Biol. 3, 280. Okayama, H. (1983) Mol. Cell Biol. 3, 280.

CWeal, K.D. and Yu-Lee, L.Y. (1993) Lymphokine Cytokine Res. 12,309-312. CWeal, K.D. and Yu-Lee, L.Y. (1993) Lymphokine Cytokine Res. 12,309-312.

Piquet, P.F. t al. (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89. Piquet, P.F. etc. (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89.

Realini, C, Rogers, S.W. and Rechsteiner, M. (1994) FEBS Lett 348, 109-113. Realini, C, Rogers, S.W. and Rechsteiner, M. (1994) FEBS Lett 348, 109-113.

Rechsteiner, M., Hoffman, L. and Dubiel, W. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6065-6068. Rechsteiner, M., Hoffman, L. and Dubiel, W. (1993) J. Biol. Chem. 268, 6065-6068.

Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring HarborLaboratory Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory

Press. Cold spring Harbor, NY. Pressure. Cold Spring Harbor, NY.

Schall, T.J. et al. (1990) Cell, 6J.:361-370. Schall, T.J. et al. (1990) Cell, 6J.:361-370.

Schwalb et al. (1993) J. Biol. Chem. 261(14) :9949-54. Schwalb et al. (1993) J. Biol. Chem. 261(14) :9949-54.

Seger, R. and Krebs, E.G. (1995) FASEB J. in press. Seger, R. and Krebs, E.G. (1995) FASEB J. in press.

Sekido, N., Mujaida, N., Harada, A., Nakanishi, I., Watanabe, Y., Matsushima, K. (1993) Nature Sekido, N., Mujaida, N., Harada, A., Nakanishi, I., Watanabe, Y., Matsushima, K. (1993) Nature

365. 654-657. 365. 654-657.

Shimayama, T. et al.» [ 1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29_: 177-8 Shimayama, T. et al.” [ 1993) Nucleic Acids Symp. Looking. 29_: 177-8

Shore, S.K. et al. (1993) Oncogene 8:3183-8. Shore, S.K. et al. (1993) Oncogene 8:3183-8.

Smith, C.A., David, T., Anderson, D., Solam, L., Beckmann, M.P., Jerzy, R., Dower, S.K., Smith, C. A., David, T., Anderson, D., Solam, L., Beckmann, M. P., Jerzy, R., Dower, S. K.,

Cosman, D. and Goodwin, R.G. (1990) Science, 248:1019-1023. Cosman, D. and Goodwin, R.G. (1990) Science, 248:1019-1023.

Smith, D.B. and Corcoran, L.M. (1994) in : Current protocols in molecular biology, pp. 16.7.1-16.7.8 (Ausubel, F.M. et al., eds.) Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & Sons, Smith, D.B. and Corcoran, L.M. (1994) in : Current protocols in molecular biology, pp. 16.7.1-16.7.8 (Ausubel, F.M. et al., eds.) Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & Sons,

Inc. New York. Inc. New York.

Song, H.Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 22492-22495. Song, H.Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 22492-22495.

Stamenkovic, I., Clark, E.A. and Seed, B. (1989) Embo J. 8:1403-1410. Stamenkovic, I., Clark, E.A. and Seed, B. (1989) Embo J. 8:1403-1410.

Tartaglia, L. A., Ayres, T.M., Wong, G.H. and Goeddel, D.V. (1993) Cell, 74:845-853. Tartaglia, L.A., Ayres, T.M., Wong, G.H. and Goeddel, D.V. (1993) Cell, 74:845-853.

Tracey, J.T. et al. (1987) Nature, 320:662-664. Tracey, J.T. et al. (1987) Nature, 320:662-664.

Wallach, D. (1984) J. Immunol. J32, 2464-9. Wallach, D. (1984) J. Immunol. J32, 2464-9.

Wallach, D. (1986) in Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London Wallach, D. et al. (1994) Cytokine & 556. Wallach, D. (1986) in Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London Wallach, D. et al. (1994) Cytokine & 556.

Watånabe-Fukanaga, R., Brannan, CL, Itoh, N., Yonehara, S., Copeland, N.G., Jenkins, N.A. Watånabe-Fukanaga, R., Brannan, CL, Itoh, N., Yonehara, S., Copeland, N.G., Jenkins, N.A.

and Nagata, S. (1992) J. Immunol. J4S, 1274-1279. and Nagata, S. (1992) J. Immunol. J4S, 1274-1279.

Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature, 356, 314-317. Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nature, 356, 314-317.

Wiegmann, K., Schutze, S., Machleidt, T., Witte, D. and Kronke, M. (1994) Cell 78, 1005-1015. WUks.. A.F. et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, £6:1603-1607. Wiegmann, K., Schutze, S., Machleidt, T., Witte, D. and Kronke, M. (1994) Cell 78, 1005-1015. WUks.. A.F. et al. (1989) Proe. Nati. Acad. Pollock. United States, £6:1603-1607.

Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature (England) 3J55_:448-51. Zhao, J.J. and Pick, L. (1993) Nature (England) 3J55_:448-51.

Claims

1. DNA-sekvens som koder for et protein i stand til å binde til et intracellulært domene av en reseptor tilhørende tumornekrosefaktor/nervevekstfaktor (TNF/NGF) -reseptorsuperfamilien, fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av p55 TNF-R, p75 TNF-R og FAS-ligandreseptoren, idet nevnte DNA-sekvens velges fra gruppen bestående av: (a) DNA-sekvenser omfattende en nukleotidsekvens som koder for proteinet 55.1 med aminosyresekvensen tilsvarende aminosyreresidium 328 til residium 426 i p55 TNF-R-aminosyresekvens; (b) DNA-sekvenser omfattende en nukleotidsekvens som koder for proE6n 55.3 med aminosyresekvensen tilsvarende aminosyreresidium 277 til residium 426 i p55 TNF-R-aminosyresekvensen; (c) DNA-sekvenser omfattende en nukleotidsekvens som koder for proteinet 55.11 med aminosyresekvensen gitt i figur 4; (d) DNA-sekvenser som koder for et protein valgt fra gruppen bestående av de heri designerte proteinene 75.3 og 75.16 omfattende nukleotidsekvensen gitt henholdsvis i figur l(b) og figur l(c); (e) DNA-sekvenser som koder for et hvilket som helst av proteinene F2, F9 og DD11, omfattende en DNA-sekvens valgt fra gruppen bestående av nukleotidsekvensen gitt i henholdsvis første og andre del av figur 10, nukleotidsekvensen gitt i første, andre og tredje del av figur 11 og nukleotidsekvensen gitt i figur 12; (f) DNA-sekvenser i stand til å hybridisere til en DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst av punktene (a) til (e) under moderat stringente betingelser, og (g) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske koden i for-hold til DNA-sekvensene ifølge hvilket som helst av punktene (a) til (f).1. DNA sequence encoding a protein capable of binding to an intracellular domain of a receptor belonging to the tumor necrosis factor/nerve growth factor (TNF/NGF) receptor superfamily, preferably selected from the group consisting of p55 TNF-R, p75 TNF-R and FAS- the ligand receptor, said DNA sequence being selected from the group consisting of: (a) DNA sequences comprising a nucleotide sequence encoding the protein 55.1 with the amino acid sequence corresponding to amino acid residue 328 to residue 426 in the p55 TNF-R amino acid sequence; (b) DNA sequences comprising a nucleotide sequence encoding proE6n 55.3 with the amino acid sequence corresponding to amino acid residue 277 to residue 426 of the p55 TNF-R amino acid sequence; (c) DNA sequences comprising a nucleotide sequence encoding the protein 55.11 having the amino acid sequence given in Figure 4; (d) DNA sequences encoding a protein selected from the group consisting of the herein designated proteins 75.3 and 75.16 comprising the nucleotide sequence given in Figure 1(b) and Figure 1(c), respectively; (e) DNA sequences encoding any of the proteins F2, F9 and DD11, comprising a DNA sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequence given in the first and second parts of Figure 10, respectively, the nucleotide sequence given in the first, second and third part of Figure 11 and the nucleotide sequence given in Figure 12; (f) DNA sequences capable of hybridizing to a DNA sequence according to any of items (a) to (e) under moderately stringent conditions, and (g) DNA sequences which are degenerate as a result of the the genetic code relative to the DNA sequences according to any one of items (a) to (f).

2. Vektor omfattende en DNA-sekvens i henhold til krav 1.2. Vector comprising a DNA sequence according to claim 1.

3. Transformert eukaryot eller prokaryot vertscelle inneholdende en vektor i henhold til krav 2.3. Transformed eukaryotic or prokaryotic host cell containing a vector according to claim 2.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av proteinet, analogene eller derivatene som er i stand til å binde til et intarcellulært domene til en reseptor tilhørende tiimornekrosefaktor/- nervevekstfaktor (TNF/NGF) -reseptorsuperfamilien, omfattende dyrking av den transformerte vertscellen i henhold til krav 3 under betingelser egnet for ekspresjon av nevnte protein, analoger eller derivater, som forårsaker posttranslasjonsmodifikasjon av nevnte protein som nødvendig for oppnåelse av nevnte protein og ekstraksjon av nevnte uttrykte protein, analoger eller derivater fra kulturmediet til nevnte transformerte celle eller fra celleekstraktene fra nevnte transformerte celle.4. Process for producing the protein, analogs or derivatives capable of binding to an intracellular domain of a receptor belonging to the tumor necrosis factor/nerve growth factor (TNF/NGF) receptor superfamily, comprising culturing the transformed host cell according to claim 3 under conditions suitable for expression of said protein, analogues or derivatives, causing post-translational modification of said protein as necessary for obtaining said protein and extraction of said expressed protein, analogues or derivatives from the culture medium of said transformed cell or from the cell extracts of said transformed cell.

5. Protein, eller analoger og derivater derav, karakterisert ved atdeteristandtilåbmdeuletmtracellulærtdomeneitlenTNFellerFAS-reseptor kodet av en DNA-sekvens i henhold til krav 1 eller produsert i henhold til fremgangsmåten i krav 4.5. Protein, or analogues and derivatives thereof, characterized by the ability to carry out the intracellular domain of the TNF or FAS receptor encoded by a DNA sequence according to claim 1 or produced according to the method in claim 4.

6. Anvendelse av ett eller flere proteiner, analoger eller derivater valgt fra gruppen bestående av proteinene, analogene og derivatene i henhold til krav 5 og et protein som er p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, analoger eller derivater derav, idet alle nevnte proteiner er i stand til å binde til det intracellulære domenet og modulere aktiviteten av nevnte TNF-R eller FAS-R, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler som bærer en TNF-R eller en FAS-R, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning omfatter nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i en form egnet for intracellulær introduksjon i celler, eller en DNA-sekvens som koder for nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i form av en egnet vektor som bærer nevnte sekvens, idet nevnte vektor er i stand til å forårsake innsetting av nevnte sekvens i nevnte celler på en slik måte at nevnte sekvens uttrykkes i nevnte celler.6. Use of one or more proteins, analogues or derivatives selected from the group consisting of the proteins, analogues and derivatives according to claim 5 and a protein which is p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, analogues or derivatives thereof, all said proteins are capable of binding to the intracellular domain and modulating the activity of said TNF-R or FAS-R, for the preparation of a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells bearing a TNF-R or a FAS-R, where said pharmaceutical composition comprises said one or more proteins, analogues or derivatives in a form suitable for intracellular introduction into cells, or a DNA sequence encoding said one or more proteins, analogues or derivatives in the form of a suitable vector carrying said sequence, said vector being able to cause insertion of said sequence into said cells in such a way that said sequence is expressed in said cells.

7. Anvendelse av en oligonukleotidsekvens valgt fra en sekvens som koder for en antisenssekvens av minst en del av sekvensen i henhold til krav 1, og en sekvens som koder for antisenssekvensen til p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, idet nevnte oligonukleotidsekvens er i stand til å blokkere ekspresjonen av minst én av de TNF-R eller FAS-R intracellulære domenebindende proteinene for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandvirkningen på celler som bærer en TNF-R eller en FAS-R.7. Use of an oligonucleotide sequence selected from a sequence that codes for an antisense sequence of at least part of the sequence according to claim 1, and a sequence that codes for the antisense sequence of p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, said oligonucleotide sequence being in able to block the expression of at least one of the TNF-R or FAS-R intracellular domain binding proteins for the preparation of a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand action on cells bearing a TNF-R or a FAS-R.

8. Anvendelse av en rekombinant animalsk virusvektor som bærer en sekvens som koder for et viralt overflateprotein som er i stand til å binde til en spesifikk tumorcelle-overflatereseptor eller HIV-infisert celleoverflatereseptor eller reseptor båret av andre syke celler og en sekvens som koder for et protein, analog eller derivat ifølge krav 5, som, når uttrykt i nevnte tumorcelle, HIV-infiserte celle eller annen sykelig celle er i stand til å drepe nevnte celle, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av tumorceller eller HIV-infiserte celler eller andre sykelige celler.8. Use of a recombinant animal virus vector carrying a sequence encoding a viral surface protein capable of binding to a specific tumor cell surface receptor or HIV-infected cell surface receptor or receptor carried by other diseased cells and a sequence encoding a protein, analog or derivative according to claim 5, which, when expressed in said tumor cell, HIV-infected cell or other diseased cell, is capable of killing said cell, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of tumor cells or HIV-infected cells or other diseased cells cells.

9. Anvendelse av ett eller flere proteiner, analoger eller derivater ifølge krav 5, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for induksjon av TNF-assosierte virkninger i celler eller vev, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning som omfatter nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i en form egnet for intracellulær introduksjon i celler, eller en DNA-sekvens som koder for nevnte én eller flere proteiner, analoger eller derivater i form av en egnet vektor som bærer nevnte sekvens, idet nevnte vektor er i stand til å forårsake innsetting av nevnte sekvens i nevnte celler på en måte slik at nevnte sekvens uttrykkes i nevnte celler.9. Use of one or more proteins, analogues or derivatives according to claim 5, for the production of a pharmaceutical composition for the induction of TNF-associated effects in cells or tissues, where said pharmaceutical composition comprises said one or more proteins, analogues or derivatives in a form suitable for intracellular introduction into cells, or a DNA sequence encoding said one or more proteins, analogues or derivatives in the form of a suitable vector carrying said sequence, said vector being able to cause insertion of said sequence into said cells in such a way that said sequence is expressed in said cells.

10. Anvendelse av en vektor som koder for en ribozymsekvens i stand til interaksjon med en cellulær mRNA-sekvens som koder for et protein i henhold til krav 5 eller en mRNA-sekvens som koder for p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD til fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler utformet på en måte som tillater ekspresjon av nevnte ribozymsekvens i nevnte celler, og når nevnte ribozymsekvens uttrykkes i nevnte celler interagerer den med nevnte cellulære mRNA-sekvens og kutter nevnte mRNA-sekvens, resulterende i ekspresjonsinhibering av nevnte protein eller nevnte p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD i nevnte celler.10. Use of a vector encoding a ribozyme sequence capable of interacting with a cellular mRNA sequence encoding a protein according to claim 5 or an mRNA sequence encoding p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD for production of a pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells designed in a manner that allows expression of said ribozyme sequence in said cells, and when said ribozyme sequence is expressed in said cells it interacts with said cellular mRNA sequence and cuts said mRNA sequence, resulting in expression inhibition of said protein or said p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD in said cells.

11. Fremgangsmåte for isolering og identifisering av proteiner i stand til å binde de intracellulære domenebindende proteinene i henhold til krav 5, omfattende anvendelse av gjær-to-hybridprosedyre hvor en sekvens som koder for nevnte intracellulære domenebindende protein bæres av én hybridvektor og sekvens fra et cDNA eller genomisk DNA-bibliotek bæres av den andre hybride vektoren, vektorene anvendes så til å transformere gjærvertsceller og de positivt transformerte cellene isoleres, fulgt av ekstraksjon av nevnte andre hybride vektor for å oppnå en sekvens som koder for et protein som binder til nevnte intracellulære domenebindende protein.11. Method for isolating and identifying proteins capable of binding the intracellular domain-binding proteins according to claim 5, comprising the use of the yeast two-hybrid procedure where a sequence coding for said intracellular domain-binding protein is carried by one hybrid vector and sequence from a cDNA or genomic DNA library is carried by the second hybrid vector, the vectors are then used to transform yeast host cells and the positively transformed cells are isolated, followed by extraction of said second hybrid vector to obtain a sequence encoding a protein that binds to said intracellular domain binding protein .

12. Farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandeffekten på celler omfattende et protein i henhold til krav 5 eller proteinet p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, dets biologisk aktive fragmenter, analoger, derivater eller blandinger derav.12. Pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand effect on cells comprising a protein according to claim 5 or the protein p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, its biologically active fragments, analogues, derivatives or mixtures thereof.

13. Farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF- eller FAS-R-ligandvirkningen på celler omfattende en rekombinant animalsk virusvektor som koder for et protein i stand til å binde en celleoverflatereseptor og som koder for et protein i henhold til krav 5, eller proteinet p55IC, p55DD, FAS-IC eller FAS-DD, dets biologisk aktive fragmenter eller analoger.13. Pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand action on cells comprising a recombinant animal virus vector encoding a protein capable of binding a cell surface receptor and encoding a protein according to claim 5, or the protein p55IC, p55DD, FAS-IC or FAS-DD, its biologically active fragments or analogues.

14. Farmasøytisk sammensetning for modulering av TNF eller FAS-R-ligandvirkningen på celler omfattende en oligonukleotidsekvens som koder for en antisenssekvens ifølge sekvensen i henhold til krav 1.14. Pharmaceutical composition for modulating the TNF or FAS-R ligand action on cells comprising an oligonucleotide sequence encoding an antisense sequence according to the sequence according to claim 1.

15. Farmasøytisk sammensetning i henhold til krav 12 for behandling av celler ved induksjon deri av TNF-assosierte virkninger, omfattende p55-IC, deler derav, analoger og derivater derav og en farmasøytisk akseptabel bærer.15. Pharmaceutical composition according to claim 12 for the treatment of cells by induction therein of TNF-associated effects, comprising p55-IC, parts thereof, analogues and derivatives thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.

16. Anvendelse av et protein ifølge krav 5 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, for behandling av tumorer.16. Use of a protein according to claim 5 for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of tumors.