NO317033B1 - Anvendelse av en benzimidazolforbindelse til fremstilling av et medisinsk eller veterinaermedisinsk preparat, benzimidazolforbindelser og fremgangsmate for fremstilling derav, samt farmasoytiske formuleringer og preparater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører visse benzimidazolforbindelser som er av interesse siden de i det minste er potensielt anvendbare kjemoterapeutiske midler i kraft av en evne til å inhibere aktiviteten til enzymet poly-ADP-ribosyltransferase (EC 2.4.2.30), også kjent som poly(ADP-ribose)-polymerase, vanligvis henvist til som ADPRT eller PARP. Generelt vil den sistnevnte forkortelse, PARP, bli brukt i foreliggende beskrivelse. Videre vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av benzimidazolforbindelser og anvendelse av en benzimidazolforbindelse til fremstilling av et medisinsk eller veterinærmedisinsk preparat. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske formuleringer og preparater.

Bakgrunn

I det minste i høyere organismer er enzymet poly-ADP-ribosyltransferase kjent for å katalysere en overføring av ADP-riboseresten fra den oksiderte form, NAD<+>, av nikotinamid-adenindinukleotid til kjerneakseptorproteiner slik at det dannes homo, ADP-ribosepolymerer, og denne prosessen har vært implisert i en rekke cellulære hendelser, slik som f eks reparasjon av DNA-skade, utvikling av cellulær differensiering, omdannelse av celler ved hjelp av onkogener og genekspresjon. Et vanlig trekk i en rekke av disse prosessene er dannelsen og reparasjonen av DNA-trådbrudd og det stadium som involverer PARP-enzymet synes å være stadiet for DNA-ligase II-formidlet trådgjenforening. I flertallet av tilfeller har en rolle for poly-ADP-ribosylering vært implisert ved bruken av inhibitorer for PARP-enzymer, og dette har ført til antydninger om at slike inhibitorer ved å virke inn på den intracellulære DNA-reparasjonsmekanisme kan ha en nyttig kjemoterapeutisk rolle ettersom de burde være i stand til å modifisere behandlingsre-sistenskarakteristika og potensere eller forøke effektiviteten av cytotoksiske midler i kjemoterapien eller ved stråling i radioterapi hvor en primæreffekt av behandlingen er det at det forårsaker DNA-skade i målceller som f eks ved mange former av antitumorterapi.

I denne forbindelse er flere klasser av PARP-inhibitorer allerede kjent, inkludert benzamid og forskjellige niko-tinamid-og benzamidanaloger, spesielt 3-substituerte benzamider med små substituentgrupper, slik som 3-amino, 3-hydroksy og 3-metoksy. PARP-inhibitoraktivitet av visse N-substituerte benzamider er også blitt rapportert i EP-A-0305008 hvor det også er blitt foreslått å bruke disse forbindelsene i medisin for å øke cytotoksisiteten av stråling eller av kjemoterapeutiske legemidler.

Når det gjelder denne bruken av benzamidforbindelser som kjemoterapeutiske midler, har forskjellige undersøkelser vedrørende slike forbindelser som er kjent for å utøve PARP-inhibitoraktivitet, bekreftet at de kan potensere cytotoksisiteten til en rekke andre antitumormidler in vitro, f eks bleomycin og metylerende legemidler. Mer begrensede data har videre indikert at slike benzamidforbindelser også kan potensere aktiviteten til cytotoksiske legemidler in vivo, selv om dosebehovene har syntes å være ganske høye, (f eks i området 0,5 g/kg"<1> per dose for 3-aminobenzamid), og det kan være ledsagende problemer ved fremstilling av tilfredsstillende farma-søytiske preparater og ved å unngå toksisitetsbegrensninger. Dessuten har også en rekke av de kjente benzamidforbindelsene blitt påvist å ha et klart potensiale som radiosensitivitets-midler, idet de f eks øker tumorcelledreping indusert med ioniserende stråling både in vitro og in vivo, og det menes at denne effekten i mange tilfeller er relatert til de forbindelsene som virker som PARP-inhibitorer og virker inn på DNA-reparasjon.

Uansett de eksisterende data fra in vitro og in vivo undersøkelser som tyder på at PARP-inhibitorer har betydelig potensiale som nyttige kjemoterapeutiske midler som gjør dem fortjent til ytterligere klinisk evaluering, f eks i forbindelse med kreftterapi, anses imidlertid for tiden tilgjenge-lige, kjente PARP-inhibitorer ikke som ennå helt egnet til å representere kandidatlegemidler, og det gjenstår et behov for å finne og utvikle et større spekter av forbindelser med potensielt anvendbare PARP-inhibitoregenskaper.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse identifiserer nytt område eller nye områder av forbindelser av interesse som PARP-inhibitorer som kan være anvendbare innen medisin, spesielt når de administreres sammen med minst visse cytotoksiske legemidler eller med radioterapi for å øke den cytotoksiske effekt derav. Generelt omfatter forbindelsene som denne oppfinnelsen ved-rører, visse benzimidazolderivater, nærmere bestemt benzimidazol-4-karboksamidforbindelser som definert nedenunder. I kraft av deres struktur vil det synes som om mange slike forbindelser er særlig godt tilpasset for å konkurrere med det natur-lige substrat NAD<+> med hensyn på PARP-enzymet.

Nærmere bestemt ligger oppfinnelsen i ett aspekt i

anvendelse av en benzimidazolforbindelse som her definert til fremstilling av et medisinsk eller veterinærmedisinsk preparat for anvendelse i terapi for inhibering av aktivitet av enzymet poly(ADP-ribose)polymerase eller PARP, (også kjent som ADP-ribosyltransferase eller ADPRT), idet slik enzyminhibering utgjør et element i en terapeutisk behandling, hvor forbindelsen tilveiebringer det aktive PARP-enzyminhiberende middel og omfatter et benzimidazol-4-karboksamid med den generelle strukturformel I

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og i strukturformel I er

R valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og fenyl, hvor fenylgruppen eventuelt er substituert med en substituent valgt fra d-C6alkoksy, trihalometyl,

hydroksy, cyan, amino og nitro, og

R' valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl, benzoyl og karboksybenzyl.

Oppfinnelsen tilveiebringer også benzimidazolforbindelser for anvendelse i terapi som aktive farmasøytiske stoffer, spesielt, men ikke utelukkende, som PARP-inhibitorer, med den generelle strukturformel I

hvor

R er valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og fenyl, hvor fenylgruppen eventuelt er substituert med en substituent valgt fra Ci-C6alkoksy, trihalometyl,

hydroksy, cyan, amino og nitro, og

R' er valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og benzoyl,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre nye benzimidazolforbindelser med den generelle strukturformel I, hvor R er valgt fra hydrogen og fenyl substituert med en substituent som er valgt fra Ci-C6alkoksy,

trihalometyl, hydroksy, cyan, amino og nitro, og

R' er valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og benzoyl,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Alkylgrupper vil, når de er til stede som sådanne eller som en rest i andre grupper, generelt være sammensatt av 1-6 karbonatomer, og mer vanlig 1-4 karbonatomer. Særlig vil, når R og/eller R' er en alkylgruppe, denne generelt være Ci-6-alkyl, slik som f eks metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl eller sykloheksyl. Når R og/eller R<1> er eller omfatter en fenylgruppe, kan denne være substituert spesielt i 4-(para)-stillingen, men alternativt eller i tillegg i f eks 2-stillingen og/eller 3-stillingen, med forskjellige substitu-enter, inkludert hydroksy, Ci-C6alkoksy (f eks metoksy eller etoksy), cyan, amino eller CW3 (f eks CF3) , hvor W er halogen.

I tilfeller hvor R' er hydrogen eller alkyl, omfatter forbindelser med strukturformel I forbindelser hvor R er fenyl som har minst én substituent i benzenringen som er valgt fra hydroksy, Ci-C6alkoksy, N02, NH3, CW3 (hvor W er halogen) og CN. i Nærmere bestemt, når R er en substituert fenylgruppe med strukturformel II

kan Ri være valgt fra H, hydroksy, Ci-C6alkoksy, N02, NH2, CW3 (hvor W er halogen) og CN.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med strukturformel I som angitt ovenfor, hvor R er en eventuelt substituert fenylgruppe med strukturformel II, idet fremgangsmåten omfatter trinnene med å omsette et alkyl-2,3-diaminobenzoat med et arylsyreklorid, behandle produktet med eddiksyre ved en forhøyet temperatur for å tilveiebringe benzimidazolringdannelse og omsette med flytende ammoniakk slik at amidderivatet dannes.

Forbindelser med strukturformel I som definert ovenfor og som har en fenylring som omfatter en CN-substituent,-. kan ofte også være særlig anvendbar som mellomprodukter ved fremstilling av andre forbindelser i overensstemmelse med oppfinnelsen ettersom en cyansubstituent generelt kan omdannes under anvendelse av standardmetoder til mange forskjellige andre funksjonelle grupper, inkludert amin, karboksyl, amid og tetrazol.

Innenfor omfangene av benzimidazolforbindelsene som her er beskrevet, omfatter foretrukne medlemmer som er av særlig interesse: (a) 2 -mety1benzimida zo1-4-karboksamid; (b) benzimidazol-4-karboksamid; (c) 2-fenylbenzimidazol-4-karboksamid; (d) 2-(4<1->metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (e) 2-(4<1->trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (f) 2-(4<1->hydroksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (g) 2-(41-metoksyfenyl)-.N-metylbenzimidazol-4-karboksamid; (h) 2-(4<1->nitrofenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (i) 2-(4<1->cyanfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (j) 2-(3<1->trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (k) 2-(3<1->metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (1) 2-(4<1->metoksyfenyl)-l-N-benzoylbenzimidazol-4-karboksamid; (m) 2-(4'-aminofenyl)benzimidazol-4-karboksamid;

(n) 2-( 2'-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid;

(o) Jtf-karboksybenzyl-2-(41-metoksyfenyl)-benzimidazol-4-karboksamid.

I de ovenfor nevnte forbindelser ifølge denne oppfinnelsen hvor det er en elektronrik aromatisk ring, menes det at, i det minste i noen tilfeller, karboksamidgruppen kan være begrenset til en bestemt konformasjon, særlig gunstig for å presentere forbindelsen som en inhibitor for NAD<+->binding for PARP-enzymet, ved hjelp av intramolekylær hydrogenbinding mellom et imidazolringnitrogenatom og et av hydrogenatomene i karboksamidgruppen.

Som allerede angitt omfatter eller strekker oppfinnelsen seg til en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser som definert ovenfor (inkludert mellomprodukter i noen tilfeller), og til anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medisinske eller veterinærmedisinske preparater som inneholder en effektiv PARP-inhibitormengde av den aktive forbindelse, for administrering til en pasient sammen med et cytotoksisk legemiddel eller radioterapi for å øke den cytotoksiske effek-tivitet av den sistnevnte. Slike preparater eller formuleringer kan lages i overensstemmelse med hvilken som helst av de metodene som er godkjent innen farmasifaget for administrering på hvilken som helst egnet måte, f eks oralt, parenteralt {inkludert subkutant, intramuskulært eller intravenøst), eller topisk, idet administreringsmåten, typen av preparater eller

formulering, og doseringen generelt bestemmes av detaljene ved den ledsagende kjemoterapi med cytotoksisk legemiddel eller

radioterapi som skal forsterkes.

Ved fremstilling av slike farmasøytiske preparater

f eks i form av sterile, flytende preparater for parenteral anvendelse, kan en forutbestemt, terapeutisk effektiv, ikke-toksisk mengde av angjeldende forbindelse oppløses i fosfatbufret saltoppløsning og preparatene kan presenteres i enhetsdoseringsform og inneholdt i lukkede ampuller klar for bruk. Generelt vil det, i det minste i vandig oppløsning, være fore-trukket med konsentrasjoner som ikke er større enn 2 00 mg/ml, men mengden og doseringsrutinen som kreves for optimal effek-tivitet, vil selvsagt variere og er til sist opp til den medisinske eller veterinærmedisinske utøver som behandler angjeldende pasienter i hvert bestemt tilfelle, å avgjøre. Når forbindelsen skal anvendes sammen med et cytotoksisk legemiddel, kan det sistnevnte i noen tilfeller administreres samtidig og kan passende være inkorporert i den samme farmasøytiske formulering eller det samme farmasøytiske preparat.

Som angitt har forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen i det minste potensiale som PARP-inhibitorer, og tester in vitro som er beskrevet nedenunder, har vist positiv farmakologisk aktivitet som antas å gjenspeile aktiviteten som skal finnes in vivo i løpet av den terapeutiske kliniske bruk.

Det vil forstås at der hvor det er gjort henvisning i denne beskrivelsen til forbindelser med formel I, skal slik henvisning oppfattes som å strekke seg også til deres farma-søytisk akseptable salter.

Det skal også forstås at når en av forbindelsene som det er henvist til, kan foreligge i mer enn én enantiomerform, er alle slike former, blandinger av og deres fremstilling og anvendelser innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Beskrivelse av eksempler på foretrukne utførelsesformer

De følgende eksempler og beskrivelser av trinn i syn-teseveien for fremstilling av forskjellige foretrukne forbindelser av interesse, tjener til ytterligere å illustrere foreliggende oppfinnelse.

I det første eksemplet (Eksempel 1) er det beskrevet fremstilling av forskjellige mellomproduktforbindelser som er påkrevet for fremstillingen av benzimidazolforbindelser i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse som er beskrevet i eksemplene 2-6.

Eksempel 1

Fremstilling av mellomproduktforbindelser

( a) 3- nitroftalamlnsvre

3-nitroftalsyreanhydrid (10,0 g, 50 mmol) ble tilsatt i porsjoner i løpet av 20 minutter til konsentrert vandig ammoniakkoppløsning og blandingen ble omrørt ved 30 °C i ytterligere 30 minutter. Krystallmassen av ammoniumftalamat, avsatt etter avkjøling av den lysegule oppløsningen, ble samlet opp og på nytt oppløst i minimal mengde varmt vann. Konsentrert saltsyre (4,5 ml) ble tilsatt dråpevis under omrøring og den resulterende pasta ble vasket med vann og tørket under vakuum, hvorved man fikk 3-nitroftalaminsyre som et fint hvitt pulver. (9,01 g, 83 %), smp. 217 °C.

Funnet: C, 45,76; H, 2,79; n 13,21.

C8H6N205 krever C, 45,71; H, 2,86; N, 13,33 %; v^ Jcm' 1 3466,52, 3321,84, 1668,64, 1604,98 og 1525,89; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 7,75 (1H, br s, C0NH), 7,8 (1H, t, Ar-5H), 8,16 (1H, brs, CONH), 8,2 (1H, d, Ar-6H), 8,3 (1H, d, Ar-4H); 6C (d6-DMS0) 127,32, 130,06, 132,28, 133,49, 134,78, 147,71, 166,25 og 166,60; m/z (EI) 192 (M<+->l), 177, 149, 103, 75.

( b) 2- amino- 3- nitrobenzosyre-( 3- nitroantranilsvre)

Til en omrørt oppløsning av kaliumhydroksid (24,1 g) i vann (110 ml) ved 0 °C ble det tilsatt brom (2,46 ml), etterfulgt av 3-nitroftalaminsyre (10 g, 47,62 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer ved 60 °C, avkjølt til romtemperatur og omrørt i ytterligere 12 timer. Den oransje utfelling ble samlet opp, på nytt oppløst i minimal mengde vann og surgjort ved dråpevis tilsetning av konsentrert saltsyre. Rekrystallisering av det resulterende gule faste stoff og varmt vann ga 3-nitroantranilsyre som gule mikrokrystaller

(6,42 g, 74 %), smp. 208-209 °C.

Funnet: C, 45,83; H, 3,07; N, 15,21.

C7H6N304 krever C, 46,15, H, 3,29; N, 15,38 %; voakB/cm_1 3476,17, 3344,99, 3094,21 og 1687,93; 6tt (d6-DMS0, 200 MHz) 6,76-6,84 (1H, t, Ar-5H), 8,29-8,41 (2H, dd, Ar-4/6H), 8,60 (2H, s, Ar-NHj), 13,4-14,0 (1H, br s, Ar-C02H); 6C (d6-DMS0) 113,19, 131,97, 140,02 (Ar-4/5/6CH), 115,02 (Ar-C-NH2), 132,77 (Ar-C-C02H), 147,09 (Ar-C-N02), 168 , 95 (Ar-C02H); m/z (EI) 182 (M<*>), 164.

(c) metvl- 2- amlno- 3- nitrobenzoat

Hydrogenkloridgass ble boblet gjennom en oppløsning av 2-amino-3-nitrobenzosyre (0,5 g, 2,75 mmol) i metanol (40 ml) 1 15 minutter ved 0 °C. Reaksjonsblandingen ble varmet under refluks i 5 timer og fikk avkjøles til romtemperatur i løpet av ytterligere 12 timer, hvoretter metyl-2-amino-3-nitrobenzoat ble avsatt som et gult fast stoff (417 mg, 77 %), smp. 95-96 °C.

Funnet: C, 49,09; H, 3,78; N, 14,03.

C8H8N204 krever C, 48.98; H, 4,08; N, 14,29 %; v^/crn-<1> 3452,5, 3316,9, 1702 og 1253,7; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 3,95 (3H, s, OCHRj), 6,79-6,87 (1H, t, Ar-5H), 8,28-8,33 (1H, dd, Ar-4H), 8,41-8,46 (1H, dd, Ar-6H), 8,45-8,46 (2H, br s, Ar-NH2); m/ z (EI) 196 (M<+>), 164, 118, 90, 63.

( d) 2 . 3- diamlnobenzosvre

Palladium-på-karbon-katalysator (10 % Pd, -200 mg)

ble forsiktig tilsatt som en oppsiemming i metanol (10 ml) til en oppløsning av 3-nitroantranilsyre (2,44 g, 13 mmol) i metanol (120 ml) og blandingen ble omrørt under hydrogenatmosfære i 2 timer inntil absorpsjonen av gass stanset. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom Celite og filtratet ble inndampet til tørrhet under redusert trykk, hvorved man fikk råproduktet. Rensing ved hjelp av kolonnekromatografi på silikagel med klormetan:metanol (4:1) som elueringsmiddel, ga 2,3-diaminobenzosyre som et rødt fast stoff (1,34 g, 66 %). "«aks/CTT<1> 3433,73, 2882,02, 2602,30 og 1658,99; 6H (d6-<D>MS0, 200 MHz) 5,8-7,4 (4H, br s, 2 x NHj), 6,45 (1H, t, Ar-5H), 6,75

(1H, d Ar-4H), 7,20 (1H, d, Ar-6H); 6C (d6-DMS0) 110,31, 115,45, 118,33, 120,55, 135,03, 140,36, 170,68; m/ z (EI) 152 (M<+>), 134, 106, 79.

( e) metyl- 2. 3- dlamlnobenzoat

En oppløsning av 2,3-diaminobenzosyre (0,2 g, 1,32 mmol) i metanol (40 ml) ble mettet med hydrogenklorid som beskrevet ovenfor, og blandingen ble deretter varmet opp under refluks i 2 timer. Den faste rest erholdt etter foramping av oppløsningsmidlet ble oppløst i vann og oppløsningen ble regulert til pH 7,0 med natriumhydrogenkarbonant. Etter ekstrak-sjon med etylacetat (2 x 30 ml) ble de kombinerte organiske lag tørket (MgS04) og oppløsningsmidlet ble fjernet, hvorved man fikk metyl-2,3-diaminobenzoat som en brun olje som gikk over i fast form etter triturering med bensin (40/60) (121,6 mg 56 %) smp. 62-63 °C.

Funnet: C, 58,35; H, 5,80; N, 16,69.

C8H10N202 krever C, 57,83; H, 6,02; N, 16,87 %;

6H (d6-DMS0, 200 MHz) 3,87 (3H, s, OCHj), 4,90 (2H, br s, Ar-2-NHj), 6,32 (2H, br s, Ar-S-NH^), 6,46-6,54 (1H, t, Ar-5H), 6,80-6,84 (1H, dd, Ar-4H), 7,18-7,23 (1H, dd/ Ar-6H); m/ z (EI) 166 (M<*>), 134, 106, 79.

Metyl-2,3-diaminobenzoat ble også fremstilt ved

reduksjon av metyl-2-amino-3-nitrobenzoat på følgende måte: en oppløsning av metyl-2-amino-3-nitrobenzoat (284 mg, 1,45 mmol) i metanol (40 ml) inneholdende palladium-på-karbon-katalysator (10 % Pd, ~50 mg) ble omrørt under hydrogen i 24 timer.

Oppløsningen ble filtrert gjennom Celite for å fjerne katalysatoren og oppløsningsmidlet ble avdampet under vakuum, hvorved man fikk metylesteren som et brunt fast stoff (180 mg, 75 %) som var identisk med metyl-2,3-diaminobenzoat fremstilt ovenfor.

( f) metvl- 2- amino- N- benzoylaminobenzoat

En oppløsning av benzoylklorid (38,4 pl, 0,331 mmol) i tetrahydrofuran (5 ml) ble dråpevis tilsatt til en oppløs-ning av metyl-2,3-diaminobenzoat (50 mg, 0,301 mmol) i tørt hydrofuran (5 ml), inneholdende trietylamin (46 ul) og 4-dimetylaminopyridin (1,8 mg, 5 mol %). Etter omrøring av blandingen 1 24 timer ved 45 °C, ble oppløsningsmidler avdampet, råproduktet ble renset ved kolonnekromatografi på silikagel med bensin (40/60), etylacetat (3:2) som elueringsmiddel. Rekrystallisering fra etylacetat og bensin (40/60) ga tittelforbindelsen som hvite krystaller. (60 mg, 74 %); 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 3,95 (3H, s, OCH3), 6,64 (2H, br s, Ar-NHj), 6,69-6,77 (1H, t, Ar-5H), 7,46-7,50 (1H, d, Ar-4H), 7,59-7,70 (3H, m, Ph-3 og Ph' 4H), 7,81-7,85 (1H, d, Ar-6H), 8,11-8,14 (2H, d, Ph-2H og Ph-2'H), 9,8-9,9 (1H, br, s, Ar-NHCO): m/ z (EI) 270 (M<*>), 253, 105.

( q) metyl-2-amino-3-N-( 4'- metoksvbenzoyl) aminobenzoat

Til en oppløsning av metyl-2,3-diaminobenzoat (460 mg), 2,77 mmol) i tørt tetrahydrofuran (20 ml) ble det tilsatt 4-metoksybenzoylklorid (378 ul, 2,77 mmol) trietylamin (385,5 pl, 2,77 mmol) og 4-dimetylaminopyridin (17 mg, 5 mol%). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur over natten, hvorved man fikk en uoppløselig utfelling som ble samlet opp ved filtrering. Filtratet ble inndampet under redusert trykk det gjenværende faste stoff ble på nytt oppløst i kokende metanol og varmfUtrert for å fjerne det uoppløselig materia-let. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og den faste rest ble slått sammen med den tidligere oppsamlede utfelling. Rekrystallinsering fra vandig metanol ga hvite krystaller av tittelforbindelsen. (513,2 mg, 62 %); smp. 179-180 'C. Funnet: C, 64,26; H, 5,31; N, 9,17.

C16H16N204 krever C, 64,0; H, 5,33; N, 9,33.

v^/cnf<1> 3425,54, 3341,54, 3277,84, 1699,24, 1632,12, 1251,11, 6H (d6-DMS0, 200 MHZ) 3,92 (3H, s, OMe), 3,94 (3H, s, OMe), 6,59 (2H, s, Ar-NH2), 6,68-6,75 (1H, Ar-5H), 7,13-7,17 (2H, d, J=8,8, Ph-3/3<»>H), 7,43-7,46 (1H, d, Ar-4H), 7,79-7,83 (1H, d, Ar-6H), 8,07-8,12 (2H, d, J=8,8, Ph-3,3'H), 9,7 (1H, br s, -NHC0-); 6C (D6-DMS0) 51,98, 55,76, 110,62, 113,79, 114,67, 125,0, 126,84, 129,12, 130,14, 133,20, 147,36, 162,21, 165,74, 168,33; m/ z (EI) 300 (M<+>), 135, 107, 77.

fh) metvl- 2- fenylberizimldazol- 4- karboksylat

En oppløsning av metyl-2-amino-3-W-benzoylaminobenzoat (6,3 mg, 0,023 mmol) i iseddik (0,5 ml) ble omrørt under refluks i 15 minutter. Etter avkjøling ble oppløsningsmidlet fjernet under redusert trykk, hvorved man fikk tittelforbindelsen; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 4,09 (3H, s, OCRj), 7,40-7,48 (1H, t, Ar-5H), 7,64-7,70 (3H, m, 2-Ph-3H og 3'-Ph-4H), 7,93-7,97 (1H, d, Ar-4H), 8,06-8,10 (1H, d, Ar-6H), 8,39-8,41 (2H, d, 2-Ph-2/2'H), 12,4-12,5 (1H, br,- s, Ar-NHCO).

Eksempel 2

Benzimidazol-4-karboksamid (forbindelse NU1066)

( a) første trinn - fremstilling av benzimidazol- 4- karboksvl-svre ( forbindelse NU1067)

En blanding av 2,3-diaminobenzosyre (0,5 g, 3,29 mmol) og maursyre (405 ul, 9,87 mmol) i saltsyre (4M, 10 ml) ble varmet opp under refluks i en time. Utfellingen som ble dannet etter avkjøling ble samlet opp, på nytt oppløst i kokende metanol og avfarget med aktivt karbon. Avdamping av oppløsningsmidlet ga benzooksazol-4-karboksylsyre som et hvitt pulver (407,9 mg, 77 %).

Funnet: C, 46,11; H, 3,63; N, 13,27.

CeH6N2O2.HC1.0,5 H20 krever C, 46,28; H, 3,88; N, 13,49

6H (d6-DMS0, 200 MHz) 7,7-7,8 (1H, t, Ar-5H), 8,2-8,3 (2H, dd, Ar-4/6H), 9,65 (1H, s, imidazol-2H).

( b) Andre trinn - fremstilling av benzlmidazol- 4- karboksamid

( forbindelse NU1066)

En suspensjon av benzimidazol-4-karboksylsyre (3,97,4 mg, 2,45 mmol) i tionylklorid (10 ml) ble varmet opp under refluks i 3,5 timer og tionylkloridet ble fjernet ved vakuumdestillasjon. Den gjenværende faste rest ble oppslemmet i tørt tetrahydrofuran (10 ml) og tilsatt dråpevis til vandig ammoniakk (50 ml) ved omrøring i 30 minutter. Overskudd av oppløs-ningsmidlet ble fjernet under vakuum og resten ble oppløst i et minimalt volum vann og det ble ekstrahert med etylacetat (2 x 20 ml). Det faste stoff som ble utvunnet etter inndamping av de kombinerte organiske lag, ble oppløst i saltsyre (0,1 M, 10 ml) og den uoppløselige utfelling ble fjernet ved filtrering. Det vandige filtrat ble forsiktig regulert til pH 9 i trinn på 1 pH-enhet, og etylacetatekstraksjoner (10 ml) ble gjennomført i hvert trinn. De kombinerte ekstrakter ble tørket (MgS04) og oppløsningsmidlet avdampet. Rekrystallisasjon fra etylacetat ga benzimidazol-4-karboksamid (50 mg, 13 %). Funnet: C, 59,95; H, 3,90; N, 24,59.

CgH7N30 krever C, 59,63; H, 4,35; N, 26,09

uv/nm 210, 270, 291; v^/ cnf1 3321,84, 3150,16, 1747,73, 1680,21; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 7,4 (1H, t, Ar-5H), 7,8-8,0 (3H, dd, Ar-4/6H), 8,5 (1H, br s, imidazol-2H), 9,4 (1H, br s, CONH) 13,1 (1H, br s, CONH); m/ z (EI) 161 (M<*>), 141, 116, 99.

Eksempel 3

2-metylbenzimidazol-4-karboksamid (forbindelse NU1064)

( a) Første trinn - fremstilling av 2- metylbenzimidazol- 4- kar-boksylsyre

Xseddiksyre (0,23 ml) ble tilsatt til en oppløsning av 2,3-diaminobenzosyre (200 mg, 1,32 mmol) i saltsyre (4M, 3,2 ml) og blandingen ble kokt under tilbakeløpskjøling i en time. Oppløsningsmidlet ble avdampet og det gjenværende faste stoff ble på nytt oppløst i kokende metanol (5 ml) og avfarget med aktivkarbon. Fjerning av oppløsningsmidlet ga 2-metylbenzimidazol-4-karboksylsyre som et amorft, fast stoff (167,5 mg, 72 %).

6H (d6-DMS0) 2,9 (3H, s, imidazol-2-CH3), 7,6-7,8 (1H, t, Ar-5H) 8,1 (2H, d, Ar-4/6H); m/ z (EI) 176 (M<+>), 158, 130.

( b) Andre trinn - fremstilling av 2- metylbenzimidazol- 4- karboksamid ( forbindelse NU1064)

En suspensjon av 2-metylbenzimidazol-4-karboksylsyre (500 mg, 2,84 mmol) i tionylklorid (10 ml) ble varmet opp under refluks i 2 timer, og tionylkloridet ble fjernet ved vakuumdestillasjon. Den faste rest ble på nytt oppløst i tørt tetrahydrofuran og tilsatt dråpevis til konsentrert vandig ammoniakkoppløsning (50 ml) i løpet av 30 minutter med om-røring. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og den faste rest ble på nytt oppløst i et minimum av varmt vann, det ble filtrert og ekstrahert med etylacetat (2 x 30 ml). Avdamping av oppløsningsmidlet ga et brunt fast stoff som ble rekrystallisert fra etylacetat, hvorved man fikk tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff (70,1 mg, 14 %).

Funnet: C, 61,47; H, 4,96; N, 23,39.

CgH9N30 krever C, 61,71; H, 5,14; N, 24,0 %;

uv/nm 209, 270; v^/cm"<1> 3296,77, 3071,07, 1913,63, 1859,62, 1805,60; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 2,68 (3H, s, imidazol-2-CHa), 7,30-7,38 (1H, t, Ar-5H), 7,72-7,46 (1H, d, Ar-4H), 7,86-7,90 (1H, d, Ar-6H), 7,72-7,90 (1H, br s, imidazol-NH), 9,4 (1H, br s, CONH), 12,8 (1H, brs, CONH); m/ z (EI) 175 (M<*>), 158, 130.

Eksempel 4

2- fenylbenzimidazol-4-karboksamid (forbindelse NU1070)

( a) Første trinn - fremstilling av 2- fenylbenzimidazol- 4- kar-boksylsyre

En blanding av 2,3-diaminobenzosyre (0,1 g, 0,66 mmol), benzosyre (80,2 mg, 0,66 mmol) og polyfosforsyre (~5 ml) ble varmet opp ved 150-160 °C i 30 minutter og etter av-kjøling ble knust is ("10 g) tilsatt. Uoppløselige materialer ble fjernet fra den mørke oppløsning ved filtrering og filtratet ble ekstrahert med etylacetat (2 x 20 ml) for å fjerne uomsatt benzosyre. Den vandige oppløsning ble forsiktig nøytralisert med natriumhydroksid (10 M) og filtrert og filtratet ekstrahert med etylacetat (2 x 30 ml). De kombinerte ekstrakter ble tørket (MgS04) og oppløsningsmidlet ble avdampet. Kromatografi på silikagel med diklormetan og metanol (85:15) som elueringsmiddel ga tittelforbindelsen (31,2 mg, 20 %); 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 7,4 (1H, t, Ar-5H), 7,62 (3H, br s, 3- Ph-4H og 3'-Ph-4H), 7,91 (1H, d, Ar-6H), 7,97 (1H, d, Ar-4H), 8,39 (2H, d, Ph-2H og Ph2'-H); m/ z (EI) 238 (M<+>), 220, 192, 77.

( b) Andre trinn - fremstilling av 2- fenvlbenzimidazol- 4- karboksamid ( NU1070)

2-fenylbenzimidazol-4-karboksylsyre (50 mg, 0,21 mmol) ble oppløst i tørt tetrahydrofuran (10 ml) og tionylklorid (16,8 ul, 0,231 mmol) og DMF (0,05 ml) ble tilsatt. Blan-

dingen ble omrørt ved romtemperatur i 12 timer mens det ble utviklet hvit utfelling, og suspensjonen ble tilsatt dråpevis til omrørt vandig ammoniakk (10 ml) i løpet av 10 minutter. Blandingen ble omrørt i ytterligere 30 minutter og fortynnet

med vann (20 ml) og nøytralisert med saltsyre (4 M). Det hvite faste stoff som ble utfelt etter avkjøling, ble samlet opp ved filtrering, hvorved man fikk 2-fenylbenzimidazol-4-karboksamid (31 mg, 62 %); v^/cm"1 3320, 3180, 1660 og 1600; 6H (d6-DMS0,

200 MHz) 7,45 (1H, t, Ar-5H), 7,72 (3H, d, 3-Ph-4H), 7,87 (1H, d, Ar-4H), 7,97 (1H, br s, CONH), 7,99 (2H, d, Ar-6H), 8,38 (2H, d, Ph-2-H- og Ph-2-H), 9,5 (1H, br s, CONH); m/z (EI) 237 (M<+>), 220, 192, 165, 77.

Eksempel 5

2-(4<*->metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid (NU1076)

( a) Første trinn - fremstillin<g> av metyl- 2-( 4'- metoksy- fenyl)-benzimidazol- 4- karboksvlatacetatsalt

Metyl-2-amino-3-W-(4'-metoksybenzoyl)benzoat (480 mg, 1,6 mmol) ble oppløst i iseddik (15 ml) og det ble varmet opp ved 120-130 °C i 30 minutter. Oppløsningsmidlet ble fjernet og den faste rest ble rekrystallisert fra etylacetat-bensin (40/60), hvorved man fikk produktet som et hvitt, krystallinsk fast stoff. (409 mg, 75 %); smp. 141-142 °C.

Funnet: C, 63,68; H, 4,79; N, 7,88.

C16H14N203. CH3C02H krever C, 63,16; H, 5,26; N, 8,19; vw./cnT<1 >3375,33, 1718,46, 1696,80, 1282,81, 1257,81, 1257,34; 6H (d8-DMSO, 200 MHz), 2,02 (3H, s, ClijCOjH), 3,97 (3H, s, OMe), 4,09 (3H, s, OMe), 7,21-7,25 (2H, d, J=8,6, Ph-3/3'H), 7,39-7,46 (1H, t, Ar-5H), 7,90-7,93 (1H, d, Ar-4H), 8,00-8,04 (1H, d, Ar-6H), 8,36-8,40 (2H, d, J=8,6, Ph-2/2'H), 12,1 (1H, s, Imz-H), 12,3-12,4 (1H, br, s, CH3C02H); 6C (d6-DMS0) 21,35, 52,37, 55,64, 114,41, 121,68, 122,35, 124,34, 129,56, 153,63, 161,27, 166,13, 172,37; m/ z (EI) 282 (M<*->CH3C02H), 250, 222, 77, 60, 43, 32.

( b) Andre trinn - fremstilling av 2-( 4'- metoksyfenyl) benzimidazol- 4- karboksamid ( NU1076)

Acetatsaltet av metyl-2-(4'-metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksylat ble oppløst 1 et overskudd av flytende ammoniakk og det ble varmet opp ved 100 °C i en lukket trykkbeholder ved 40 atmosfærer over natten. Ammoniakken fikk for-dampe og oppløsningsmiddelresten ble samlet opp og renset med iskaldt vann (3 x 5 ml). Rekrystallisasjon fra vandig metanol ga tittelforbindelsen (226,4 mg, 80 %); smp. 261-263 °C. Funnet: C, 66,07; H, 4,23; N, 15,29.

ci5Hi3N3°2-°/2CH3OH brever C, 66,70; H, 5,08; N, 15,35;

v mÉkm/car l 3321,47, 3140,72, 1656,23, 1608,25, 1421,43, 1242,55, 6h (d6-DMS0, 200 MHz) 3,96 (3H, s, OMe), 7,23-7,27 (2H, d, J=8,6, Ph-3/3'H), 7,37-7,45 (1H, t, Ar-5H), 7,78-7,82 (1H, d, Ar-4H), 7,87 (1H, br s, Imz-H), 7,93-7,96 (1H, d, Ar-6H), 8,27-8,31 (2H, d, J=8,6, Ph-2/2'H), 9,4-9,5 (1H, br s, -CONH), 13,3-13,4 (1H, br s, -CONH); m/ z (EI) 267 (M<*>), 249, 222, 206, 77, 32.

Eksempel 6

2-(41 -trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid (NU1077)

( a) Første trinn - fremstilling av metyl- 2- amino- 3- N-( 41- tri-fluormetylbenzoyl) aminobenzoat

Til en oppløsning av metyl-2,3-diaminobenzoat (300 mg, 1,807 mmol) ble det tilsatt 4-trifluormetylbenzoylklorid (268,4 ul, 1,807 mmol), trietylamin (251,4 ul, 1,807 mmol) og 4-dimetylaminopyridin (11 mg, 5 mol%), og blandingen ble om-rørt ved romtemperatur over natten. Reaksjonsoppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og det resulterende faste stoffet ble vasket med etylacetat. Rekrystallisasjon to ganger fra metanol-vann ga tittelforbindelsen som et hvitt fast stoff. (83,6 rag, 14 %); smp. 180-181 'C;

Funnet: C, 56,75; H, 3,50; N, 8,28.

CieHisFaNjOa krever C, 56,80; H, 3,85; N, 8,28;

uv/nm 222; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 3,93 (3H, s, OMe, 6,70-6,76 (3H, m, Ar-5H2), 7,46-7,49 (1H, d, Ar-4H), 7,81-7,85 (1H, d, Ar-6H), 7,99-8,03 (2H, d), 8,29-8,33 (2H, d), 10,05 (1H, s, -NHC0-); m/ z (EI) 338 (M<*>), 321, 289, 145, 32.

( b) Andre trinn - fremstilling av metvl- 2-( 4'- trlfluormetyl-fenyl) benzimidazol- 4- karboksvlatacetatsalt

Metyl-2-amino-3-W-(4•-trifluormetylbenzoyl)aminobenzoat (75,7 mg, 0,224 mmol) ble oppløst i iseddik (5 ml) og omrørt ved 125 "C i 0,5 time. Oppløsningsmidlet ble avdampet og det gjenværende hvite faste stoff ble vasket med bensin (40/60) hvorved man fikk tittelforbindelsen. (59,6 mg, 70 %);

smp. 138-140 °C.

Funnet: C, 56,78; H, 3,98; N, 7,36;

Cl6HuF3N202.CH3C0zH krever C, 56,84; H, 3,94; N, 7,37. uv/nm 206, 319; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 2,01 (3H, s, CH^CO^), 7,44-7,52 (1H, t, Ar-5H), 7,97-8,14 (4H, m), 8,65-8,66 (2H, d), 12,1 (br s, imidizol-NH), 12,7-12,8 (1H, br s, CH3C02H); m/ z (EI) 320 (M<*->CH3C02H), 301, 288, 260, 145, 60, 43.

( c) Tredje trinn - fremstilling av 2-( 4'- trifluormetvl) benzimidazol- 4- karboksamid ( NU 1077)

Acetatsaltet av metyl-2-(4'-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksylat ble oppløst i et overskudd av flytende ammoniakk og det ble varmet opp ved 100 °C i en lukket trykkbeholder ved 40 atmosfærer i 12 timer. Ammoniakken fikk for-dampe og den faste rest ble vasket med iskaldt vann (3x5 ml). Rekrystallisasjon fra metanol-vann ga produktet som fine hvite nåler. (19,1 mg, 48 %); smp 301-305 °C;

Funnet: C, 56,45; H, 3,50; N, 12,41.

C15H10F3N30.CH30H krever C, 56,97; H, 4,18; N, 12,46; 6H (d6-DMS0, 200 MHz) 7,45 (1H, t, Ar-5H), 7,88-7,92 (1H, d, Ar-4H), 7,99 (1H, br s imidazol-NH), 8,03 (1H, d, Ar-6H); 8,06-8,10 (2H, d,

J=8,l), 8,55-8,59 (2H, d, J=8,l), 9,3^9,4 (1H, br s, -CONH), 13,7-13,8 (1H, br s, -CONH); m/ z (EI) 288 (M<+->NH3), 260, 69.

Eksempel 7

2-(4<1->hydroksyfenyl)-l-H-benzimidazol-4-karboksamid (Forbindelse NU1085).

Under en argonatmosfære ble IM bortribromid i diklormetan (3,8 ml, 3,79 mmol) overført til en kolbe inneholdende 2-(4'-metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid (NU 1076 fra eksempel 5) (202,4 mg, 0,758 mmol). Den resulterende oppløs-ning ble kokt under tilbakeløpskjøling i 24 timer under anvendelse av en luftkondensator. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved destillasjon inntil fullstendig tørrhet. Den faste rest ble behandlet med 10 % NaOH (10 ml) etterfulgt av dråpevis tilsetning av konsentrert saltsyre for å nøytralisere (pH 7). Etter utfelling ble det samlet opp ved filtrering og oppløst i etylacetat (10 ml). Det organiske oppløsningsmiddel ble vasket med vann (2 x 3 ml), tørket over MgS04 og produktet ble erholdt ved fjerning av oppløsningsmidlet under redusert trykk. (109,5 mg, 57 %). Smp. 266-267 °C.

Funnet: C, 63,27, H, 4,37, N, 15,67

ci4HuN3°2-°'75 Me0H krever C, 63,04, H 4,69 N 15,76; v^fcnT<1>) 3424,01, 3384,16, 3309,20, 3249,55, 3155,62, 1642,35, 1618,02, 1594,50, 1577,74; 6H 7,03-7,07 (2H, d, J=8,5), 7,34-7,42 (1H, t), 7,75-7,79 (1H, d), 7,85 (1H, br s), 7,90-7,94 (1H, d), 8,15-8,19 (2H, d, J=8,5), 9,4-9,6 (1H, br s), 10,0-10,4 (1H, br s), 13,0-13,4 (1H, br s); m/ z (EI) 253 (M<*>), 236, 208, 93.

Eksempel 8

2-( 4'- metoksyfenyl)- l- metvlbenzimidazol- 4- karboksamid ( forbindelse Nul090)

2-(4'-metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid (Nul076 fra eksempel 5) (105,3 mg, 0,394 mmol) og pulverisert kaliumhydroksid (22 mg, 0,394 mmol) ble oppslemmet i aceton (4 ml) og omrørt inntil alle de faste stoffene var oppløst.

Metyljodid (24,6 ul, 0,394 mmol) ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt ved romtemperatur over natten. Oppløsningsmidlet ble fjernet under redusert trykk og den hvite, faste rest renset med kolonnekromatografi med diklormetan og metanol i forholdet 95:5 hvorved man fikk små hvite krystaller av tittelforbindelsen. (33,2 mg, 30 %), smp. 289-292 °C.

Funnet: C, 68,62 H 5,36 N 14,67.

C16H1SN302 krever C 68,33 H 5,34 N 14,95; ^.(cnT<1>) 3309,23, 3141,44, 1671,29, 1605,30, 1255,08, 6H 3,95 (3H, s), 4,02 (3H, s), 7,22-7,27 (2H, d), 7,44-7,52 (1H, t), 7,86-8,00 (5H, m), 9,4 (1H, br s, NH); m/ z (EI) 281 (M<*>), 264, 250.

Eksempel 9

2- f 4'- metoksyfenvl)- l- benzoylbenzimidazol- 4- karboksamid ( forbindelse NU11011

En oppløsning av 2-(4'-metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid (NU1076 fra eksempel 5) (75,1 mg, 0,281 mmol) og pulverisert kaliurahydroksid (15,8 mg, 0,281 mmol) ble fremstilt i aceton (3 ml) og omrørt inntil alle de faste stoffene var oppløst. Benzoylklorid (32,6 pl, 0,281 mmol) ble tilsatt og omrøringen omrørt over natten ved romtemperatur, med fremstilling av en hvit utfelling. Oppløsningsmidlene ble fjernet under redusert trykk og den hvite rest ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi under anvendelse av diklormetan og metanol i forholdet 95:5. Det resulterende faste stoff ble rekrystal-li sert fra bensin og etylacetat i forholdet 40:60, hvorved man fikk det rene produkt som skinnende hvite prismer. (15,6 mg, 15 %). Smp. 207-210 °C.

Funnet: C 70,45 H 4,60 N 10,99.

C22H17N303.0,25Ch3OH krever 70,45 H 4,47 N 11,08 v^ lcaT1) 3445,99, 3318,55, 2922,99, 1689,79, 1666,36; 6H 3,86 (3H, s, 0CH3), 7,02-7,06 (2H, d), 7,50-7,65 (4H, m), 7,72-7,82 (3H, m), 7,88-7,92 (2H, d), 8,08 (1H, s, CONH), 8,10-8,14 (1H, d), 9,1-9,2 (1H, br s, CONH); m/ z (EI) 371 (M<*>), 105.

Ytterligere eksempler

I de følgende ytterligere eksempler, og også i noen av eksemplene som allerede er beskrevet, gjøres det bruk av visse vanlige standardfremgangsmåter. Disse omfatter: (1) Omsetning av metyl-2,3-diaminobenzoat med arylsyreklorid (standardfremgangsmåte A) (2) Benzimidazolringdannelse ved hjelp av syrekatalysert ringslutning (standardfremgangsmåte B) (3) Amiddannelse ved omsetning med flytende ammoniakk

(standardfremgangsmåte C)

De eksperimentelle detaljene ved standardfremgangsmåtene er beskrevet nedenunder:

Standardfremqanqsmåte A

En is/salt-badavkjølt oppløsning av metyl-2,3-di-aminobenzoat (1 ekvivalent), tørt trietylamin (1-1,5 ekviva-lenter) og dimetylaminopyridin (DMAP - 5mol%) i halvparten av det nødvendige volum av tørt tetrahydrofuran (THF) ble fremstilt. Det nødvendige syreklorid (1 ekvivalent) ble oppløst i det gjenværende, tørre tetrahydrofuran (THF) og tilsatt til den avkjølte oppløsning under omrøring i 30 minutter. Reaksjonsblandingen fikk varmes sakte opp til romtemperatur og ble omrørt over natten. Oppløsningsmidlet ble filtrert for å fjerne den utfelling som ble oppslemmet i.acetylacetat, vasket to ganger med vann, etterfulgt av mettet saltoppløsning, og tørket med MgS04. Det organiske lag ble tilsatt fra filtratet" og oppløsningsmidlet fjernet under trykk. Den faste rest ble på nytt oppløst i etylacetat, det ble vasket to ganger med vann etterfulgt av mettet saltoppløsning og tørket med MgS04. Fjerning av oppløsningsmidlene under redusert trykk etterlot en fast rest som ble renset ved hjelp av kolonnekromatografi og/eller rekrystallisasjon fra egnede oppløsningsmidler.

Standardfremqanqsmåte B

Utgangsmaterialet ble oppløst i iseddik og senket fort ned i et forvarmet oljebad ved 120 °C. Oppløsningen ble varmet opp i det passende tidsrom og fikk så avkjøles til romtemperatur. Eddiksyren ble fjernet under redusert trykk og den faste rest renset ved hjelp av kolonnekromatografi og/eller rekrystallisasjon fra egnede oppløsningsmidler.

Standardfremqanqsmåte C

Utgangsmaterialet ble oppløst i et overskudd av ny-kondensert, flytende ammoniakk. Dette ble varmet opp til 80 °C i en lukket beholder, hvorved det ble frembrakt et trykk på 40 atmosfærer, i 24 timer. Ammoniakken ble avdampet og den erholdte faste rest renset ved hjelp av kolonnekromatografi og/eller rekrystallisasjon fra egnede oppløsningsmidler.

Eksempel 10

2- (4 * -cyanfenyl) -l-H-benzimidazol-4-karboksamid (NU1092)

fa) Første trinn - fremstilling av metyl- 2- amino- 3- y-( 4'- cvan-benzoyl) aminobenzoat

Ved å følge standard fremgangsmåte A ble metyl-2,3-diaminobenzoat (300 mg, 1,81 mmol), trietylamin (251 pl, 1,81 mmol) og DMAP (11 mg) oppløst i THF (7,5 ml) og det ble av-kjølt. Til dette ble det tilsatt 4-cyanbenzoylklorid (299 mg, 1,81 mmol) oppløst i THF (7,5 ml). Produktet ble renset på kolonnekromatografi, diklormetan og metanol i forholdet 99:1, etterfulgt av rekrystallisasjon fra kokende metanol. (196 mg, 37 %). Smp. 198-202 °C; ^.(cm"<1>) 3486,40, 3374,02, 3245,61, 2231,25, 1688,04, 1646,65; 6H 3,93 (3H, s, C02CH3), 6,68-6,76 (1H, t), 6,72 (2H, br s, NH2), 7,45-7,49 (1H, d), 7,81-7,86 (1H, d), 8,11-8,15 (2H, d, J=8,4), 8,25-8,29 (2H, d, J=8,4), 10,01 (1H, br s, NH); m/ z (EI) 295 (M<+>), 278, 263, 246, 130, 102.

( b) Andre trinn - fremstilling av metyl- 2-( 4'- cvanfenyl)- l- H-benzimidazol- 4- karboksylat

Ved å følge standardfremgangsmåte B ble metyl-2-amino-3-W-(41 -cyanbenzoyl)aminobenzoat (301 mg, 1,02 mmol) fra første trinn varmet opp i iseddik (10 ml). Produktet ble erholdt ved rekrystallisering to ganger under anvendelse av bensin og etylacetat i forholdet 40:60. (203 mg, 72 %). Smp. 195-198 °C; v^ icm- 1) 3447,66, 2228,84, 1691,90, 1288,11; 6H 4,09 (3H, s, C02CH3), 7,44-7,53 (1H, t), 7,97-8,01 (1H, d), 8,10-8,13 (2H, d, J=8,4), 8,58-8,62 (2H, d, J=8,4), 12,8 (1H, br s), m/ z (EI) 277 (M<+>), 245, 217.

( c) Tredje trinn - fremstilling av 2-( 4'- cyanfenyl)- l- ff- benz-imldazol- 4- karboksamid ( NU1092)

Ved å følge standardfremgangsmåte C ble metyl-2-(4'-cyanfenyl)-l-ff-benzimidazol-4-karboksylat (169,5 mg, 0,612 mmol) behandlet med ammoniakk under trykk. Råproduktet ble rekrystallisert fra kokende metanol, hvorved man fikk tittelforbindelsen i ren form som hvite krystaller. (116,5 mg, 73 %). Smp. >310 °C.

Funnet: C 67,81 H 3,89 N 20,87.

C15H10N40.0,2MeOH krever C 67,95 H 4,05 N 20,85; ^.(cm-<1>) 3332,27, 3274,86, 3177,98, 2230,85, 1658,54, 1608,10; 6H 7,45-7,49(1H, t); 7,87-7,91 (1H, br s), 7,98-8,02 (1H, d); 8,13-8,17 (2H, d, J-8,3), 8,50-8,54 (2H, d, J=8,3), 9,2-9,4 (1H, br s), 13,6-13,8 (1H, br s); m/ z (EI) 262 (M<*>), 245, 217, 102.

Eksempel 11

2-(4'-nltrofenyl)-l-ff-benzimidazol-4-karboksamid (NU1091)

( a) Første trinn - fremstilling av metyl-2-amino-3-N-(4'-nitrobenzoyl) aminobenzoat

Ved å følge standardfremgangsmåte A ble metyl-2,3-diaminobenzoat (300 mg, 1,807 mmol), tørt trietylamin (276,6 ul, 1,988 mmol) og DMAP (11 mg) oppløst i tørt THF (12 ml). Til dette ble det tilsatt 4-nitrobenzoylklorid (335,2 mg, 1,807 mmol) i tørt THF (12 ml). Kolonnekromatografi med diklormetan og metanol i forholdet 99:1, etterfulgt av rekrystallisasjon fra metanol ga det rene produkt. Smp. 196-197 °C. Funnet: C 57,08 H 3,78 N 13,25.

C15H13N305 krever C 57,14 H 4,12 N 13,33; v^tcm"<1>) 3382,31, 3293,01, 3256,56, 1702,05, 1657,83, 1525,37; 6H 3,94 (3h, s, C02CH3), 6,70-6,78 (1H, t), 6,66 (2H, br s, NH2), 7,48-7,51 (1H, d), 7,83-7,87 (1H, d), 8,33-8,38 (2H, d, J=8,8), 8,46-8,51 (2H, d, J=8,8), 10,15 (1H, br s, NH); m/ z (EI) 315 (M<+>), 297,265, 165.

( b) Andre trinn - fremstilling av metyl- 2-( 4'- nitrofenyl)- l- ff-benzimidazol- 4- karboksylat

Ved å følge standardfremgangsmåte B ble metyl-2-amino-3-N-(4•-nitrobenzoyl)aminobenzoat (340,2 mg, 1,08 mmol) varmet opp i iseddik (10 ml) i 15 minutter. Produktet ble erholdt i ren form ved rekrystallisasjon fra metanol. (280 mg, 65%). Smp. 208-210 °C.

Funnet: C 60,69 H 3,57 N 13,96.

Cl5HnN304 krever 60,61 H 3,70 N 14,14; v^tcm"<1>) 3433,70, 1720,14, 1601,84, 1513,07; 6H 4,21 (3H, s C02CH3), 7,57-7,65 (1H, t), 8,10-8,12 (1H, d), 8,23-8,27 (1H, d), 8,60-8,64 (2H, d, J=8,8), 8,78-8,82 (2H, d, J=8,8), 13,04 (1H, br s, NH); m/ z (EI) 297 (M+), 265.

( c) Tredje trinn - fremstillin<g> av 2-( 4'- nitrofenyl)- l- fl-benzimidazol- 4- karboksamid ( NU1091)

Ved å følge standardfremgangsmåte C ble metyl-2-(4<1->nitrofenyl)-l-JT-benzimidazol-4-karboksylat oppløst i flytende ammoniakk og det ble varmet opp under konstant volum i en trykkbeholder. Produktet ble renset ved hjelp av kolonne-kromatograf i fra diklormetan og metanol i forholdet 99:1 og rekrystallisert fra metanol.

Smp. >310 °C; 6H 7,48-7,56 (1H, t), 7,90-7,94 (1H, d), 8,00 (1H, s, NH), 8,00-8,04 (1H, d), 8,52-8,56 (2H, d, J=8,8), 8,60-8,64 (2H, d, J=8,8), 9,3-9,4 (1H, br s, NH), 13,8-14,0 (1H, br s, NH).

Eksempel 12

2-(3'-trifluormetylfenyl)-l-ff-benzimidazol-4-karboksamid

(NU1093)

( a) Første trinn - fremstilling av metyl- 2- amino- 3- N-( 3'- tri-fluormetylbenzoyl) aminobenzoat

Ved å følge standardfremgangsmåte A ble metyl-2,3-diaminobenzoat (200 mg, 1,205 mmol), tørr trietylamin (704 ul, 5,06 mmol) og dimetylaminopyridin (DMAP, 7,3 mg) oppløst i tørr THF (7,5 ml). Til dette ble det tilsatt 3-trifluormetylbenzoylklorid (183 ul, 1,205 mmol) i tørt THF (7,5 ml). Kolon-nekromatograf i med diklormetan og metanol i forholdet 99:1 fjernet urenheter og det mest polare produkt ble eluert med diklormetan og metanol 97:3. Rekrystallisasjon fra metanol ga produktet som et hvitt fast stoff. (160,4 mg, 26 %).

Smp. 157-159 °C. Funnet: C 57,14 H 3,57 N 8,10.

C16H13F3N203 krever C 56,80 H 3,85 N 8,28; ^.(ciii-<1>) 3368,48, 3283,82, 2953,87, 1705,98, 1650,77, 1250,02; 6H 3,95 (3H, s, C02CH3), 6,69-6,77 (1H, t), 6,73 (2H, s, NH2), 7,45-7,49 (1H, d), 7,82-7,92 (2H, m), 8,06-8,10 (1H, d), 8,40-8,44 (1H, d), 8,48 (1H, s, 2'-H), 10,1 (1H, s, NH), m/ z (EI) 338 (M<+>), 320,

288, 260, 173, 145.

( b) Andre trinn - fremstilling av metyl- 2- f3'- trifluor^ letvl-fenvl)- l- H- benzimidazol- 4- ka^ bok3vlatacetat:salt

Ved å følge standardfremgangsmåte B ble en iseddik-oppløsning (6 ml) av metyl-2-amino-3-N-(3'-trifluormetylben-zoyl ) aminobenzoat varmet opp i 15 minutter. Fjerning av opp-løsningsmidlet under redusert trykk etterfulgt av tørking ved høyvakuum ga produktet som et rent, hvitt fast stoff. (154,2 mg, 96 %). Smp. 105-107 °C.

Funnet: C 56,93 H 3,78 N 7,32.

Ci6HiiF3N2°j• CH3C02H krever C 56,84 H 3,95 N 7,37; ^«.(cm-<1>) 3438,30, 3339,14 2959,13, 1707,99, 1328,24, 1313,53; 6H 2,01 (3H, s, CH3C02H), 4,09 (3H, s, C02CH3), 7,44-7,51 (1H, t), 7,79-8,13 (4H, m), 8,71-8,75 (1H, d), 8,82 (1H, s), 11,8-12,2 (1H, br s), 12,8-13,0 (1H, br s); m/ z (EI) 320 (M<+->CH3C02H), 288, 260.

( c) Tredne trinn - fremstillin<g> av 2-( 3'- trifluormetylfenyl)-1- H- benzimidazol- 4- karboksamid ( forbindelse Nul093)

Ved å følge standardfremgangsmåte C ble acetatsaltet av metyl-2-(3<1->trifluormetylfenyl)-l-H-benzimidazol-4-karboksylat (134,8 mg, 0,358 mmol) behandlet med overskudd av flytende ammoniakk i en lukket beholder. Produktet ble renset ved rekrystallisasjon fra metanol, hvorved man fikk gråhvite nåler. (78 mg, 72 %). Smp. 268-270 °C.

Funnet: C 57,68 H 3,82 N 12,96.

C15H10F3N30.0,6CH30H krever C 57,74 H 3,82 N 12,95;

^.(cnr<1>) 3488,83, 3348,86, 3176,45, 1667,66, 1600,93, 1329,63; 6H 7,44-7,52 (1H, t), 7,88-8,04 (5H, m), 8,66-8,70 (1H, d), 8,70 (1H, s, 2' H), 9,3 (1H, br s, NH), 13,6 (1H, br s, NH); m/z (EI) 305 (M<+>), 288, 260, 145.

Eksempel 13

2- (3* -metoksyf enyl)-l-H-benzimidazol-4-karboksamid (NU1098)

( a) Første trinn - fremstilling av metvl- 2- amino- 3- N-( 3'-metoksvbenzovl) aminobenzoat

Ved å følge standardfremgangsmåte A ble en oppløsning av metyl-2,3-diaminobenzoat (670,3 mg, 4,038 mmol) tørt trietylamin (842,6 ul, 6,057 mmol) og DMAP (25 mg) i tørr THF (20

ml) fremstilt. En oppløsning av 3-metoksybenzoylklorid (567,

pl, 6,038 mmol) i tørr THF (20 ml) ble tilsatt til dette. Den resulterende faste rest ble renset ved hjelp av kolonne-kromatograf i under anvendelse av diklormetan og metanol i forholdet 99:1 og produktet ble erholdt i ren form etter to rekrystallisasjoner fra bensin og etylacetat i forholdet 40:60 (282,6 mg, 23 %). Smp. 124-125 °C.

Funnet: C 63,90 H 5,11 N 9,24.

C16H16N204 krever 64,0 H 5,33 N 9,33; ^(cm"1 )3386,19, 3292,38, 1697,97, 1586,87, 1520,79, 1250,27; 6H 3,92 (3H, s), 3,93 (3H, S), 6,61 (2H, s, NH2), 6,68-6,76 (1H, t), 7,22-7,27 (1H, d), 7,44-7,47 (1H, d), 7,49-7,57 (1H, t), 7,66 (1H, s, 2'-H), 7,677-7,71 (s. 30,eks 13,a) (1H, d), 7,79-7,84 (1H, d), 9,8

(1H, s, NH); m/z (EI) 300 (M<+>), 283, 135, 107.

( b^ Andre trinn - fremstilling av metyl- 2-( 3'- metoksyfenyl)- 1-H- benzlmidazol- 4- karboksylatacetatsalt

Ved å følge standardfremgangsmåte B ble metyl-2-amino-3-N-(3'-metoksybenzoyl)aminobenzoat (356,9 mg, 1,19

mmol) varmet opp i iseddik (12 ml). Fjerningen av oppløs-ninsmidlet under redusert trykk ble etterfulgt av rekrystallisasjon med bensin og etylacetat i forholdet 40:60 som ga tittelforbindelsen i ren form. (235,6 mg, 58%). Smp. 93-94 °C. Funnet: C 62,66 H 5,13 N 8,06.

C16H14N203.CH3C02H krever C 63,16 H 5,26 N 8,18; ^.(cm-<1>)

3453,23, 3375,10, 1706,75, 1257,40; 6H 1,99 (3H, s, CH3C02H), 3,96 (3H, s), 4,06 (3H, s), 7,15-7,21 (1H, d), 7,38-7,46 (1H,

t), 7,51-7,59 (1H, t), 7,91-8,00 (3H, m), 8,04-8,08 (1H, d), 12,0 (1H, s), 12,5 (1H, s); m/ z (EI) 282 (M<*->CH3C02H), 250.

( c) Tredje trinn - fremstilling av 2-( 3'- metoksyfenyl)- l- H-benzimidazoI- 4- karboksamid ( NU1098)

Ved å følge standardfremgangsmåte C ble en flytende ammoniakkoppløsning av metyl-2-(3'-metoksyfenyl)-l-ff-benzimidazol-4-karboksylat (203 mg, 0,596 mmol) varmet opp under konstant volum. Den faste rest ble rekrystallisert fra metanol, hvorved man fikk det rene produkt. (73,5 mg, 46 %).

Smp. 223-225 °C;

Funnet: C 67,52 H 4,91 N 15,62;

C15H13N302 krever C 67,42 H 4,87 N 15,73; ^.(an'<1>) 3408,59, 3388,94, 3168,65, 1662,05, 1625,86, 1603,39; 6H 3,99 (3H, s, 0CH3), 7,22-7,27 (1H, d), 7,43-7,51 (1H, t), 7,58-7,66 (1H, t), 7,85-8,01 (5H, m), 9,4-9,5 (1H, br s), 13,5 (1H, br s); m/ z (EI) 267 (M<*>), 250.

Eksempel 14

2- (2' -trif luormetylf enyl) -l-H-benzimldazol-4-karboksamid

(NU1104)

( a) Første trinn - fremstilling av metyl- 2- amino- 3- N-( 2'- tri-fluormetylbenzoyl) aminobenzoat

Ved å følge standardfremgangsmåte A ble metyl-2,3-diaminobenzoat (564 mg, 3,4 mmol) i en THF-oppløsning (20 ml) med trietylamin (709 ul, 5,1 mmol) og dimetylaminopyridin (21 mg) omrørt og til dette ble det tilsatt en THF-oppløsning (20 ml) av 2-trifluormetylbenzoylklorid. Den resulterende oljerest ble absorbert på silika og så underkastet kolonnekromatografi med diklormetan og metanol i forholdet 99:1 som elueringsmiddel. Produktet ble erholdt i ren form etter rekrystallisasjon fra bensin og etylacetat i forholdet 40:60. (303 mg, 26 %). Smp. 163-166 °C;

Funnet: C 56,91 H 3,75 N 8,29.

Ci6H13F3N203 krever C 56,80 H 3,85 N 8,28; ^.(cm"<1>) 3329,85, 3243,90, 2955,52, 1696,66, 1663,58, 1312,69; 6H 3,94 (3H, s, C02CH3), 6,58 (2H, s, NH2), 6,74-6,82 (1H, t), 7,57-7,62 (1H, d), 7,79-8,03 (5H, m), 10,0 (1H, s, NH); m/ z (EI) 338 (M<*>), 321, 289, 173, 145.

( b) Andre og tredje trinn - fremstilling av 2-( 2'- trifluor-metyl)- l- H- benzimidazol- 4- karboksamid ( NU1104)

Etter å ha underkastet produktet fra det første trinn for standardfremgangsmåtene B og C etter hverandre, ble tittelforbindelsen erholdt.

Eksempel 15

2-(4'-aminofenyl)-l-H-benzimidazol-4-karboksamid (NU1103)

( a) Første trinn - fremstilling av metvl-2-amino-3-N-(4'amlno-benzoyl) aminobenzoat

Metyl-2-amino-3-N-(4'-nitrobenzoyl)aminobenzoat (fra første trinn i eksempel 11) ble oppslemmet i metanol (40 ml) og en oppslemming av 10 % palladiumkatalysator-på-aktivtkarbon (-50 mg) i metanol (10 ml) ble tilsatt til dette ved omrøring under argon. Oppløsningen ble hydrogenert atmosfærisk i 2 timer. Etter filtrering gjennom Celite for å fjerne katalysatoren, ble produktet erholdt ved fjerning av oppløsningsmidlet under redusert trykk, hvorved man fikk et fast stoff som ble tørket under høyvakuum. (204,1 mg, 92 %). Smp. 197-200 °C. Funnet: C 62,95 H 5,30 N 14,39.

C15H15N303 krever C 63,16 H 5,26 N 14,73; v^crn-<1>) 3472,55, 3374,96, 3348,97, 3283,31, 1694,80, 1613,91; 6H 3,94 (3H, s, C02CH3), 5,87 (2H, s, NH2), 6,54 (2H, s, NH2) 6,68-3,73 (2H, d), 6,73-6,76 (1H, t), 7,42-7,47 (1H, d), 7,78-7,82 (2H, d), 9,4 (1H, s, NH); m/ z (EI) 285 (M<*>), 267, 235, 207, 120, 92.

( b) Andre trinn - fremstilling av metyl- 2-( 4'- aminofenyl)- l- H-benzimidazol- 4- karboksvlatacetatsalt

Ved å følge standardfremgangsmåte B ga behandlingen av metyl-2-amino-3-N-(4'-aminobenzoyl)aminobenzoat (186,5 mg, 0,654 mmol) med varm iseddik (8 ml) i 30 minutter tittelforbindelsen etter rekrystallisasjon fra bensin og etylacetat i forholdet 40:60. (113,4 mg, 91 %). Smp. 162-164 "C.

Funnet: C 62,60 H 5,04 N 12,73.

C15H13N302.CH3C02H krever C 62,39 H 5,20 N 12,84; ^.(cm-<1>) 3450,66, 3369,25, 3254,20, 1692,41, 1607,56, 1253,80; 6H 2,02 (3H, s, CH3C02H), 4,08 (3H, s, C02CH3), 5,81 (2H, s, NH2), 6,75-6,80 (2H, d, J«8,6), 7,32-7,40 (1H, t), 7,83-7,86 (1H, d), 7,93-7,97 (1H, d), 8,08-8,13 (2H, d, J=8,6), 11,9 (1H, s), 12,1 (1H, br s); m/ z (EI) 267, (M<+->CH3C02H), 235, 207, 92, 60.

( c) Tredje trinn - fremstilling av 2-( 4'- aminofenyl)- l- ff- benzimidazol- 4- karboksamid ( NU1103)

Ved å følge standardfremgangsmåte C ble acetatsalt av metyl-2-(4'-aminofenyl)-l-ff-benzimidazol-4-karboksylat (113 mg, 0,346 mmol) behandlet med flytende ammoniakk under trykk i 24 timer. Den rene tittelforbindelsen ble isolert ved kolonne-kromatograf i av råmaterialet under anvendelse av diklormetan og metanol i forholdet 90:10 (21,4 mg, 25 %). Smp. 237-240 °C; 6H 5,90 (2H, s, NH2), 6,79-6,83 (2H, d, J=8,3), 7,31-7,39 (1H, t), 7,71-7,75 (1H, d) 7,84 (1H, s, NH), 7,88-7,92 (1H, d), 8,00-8,04 (2H, d, J=8,3), 9,5-9,6 (1H, br s, NH), 13,0 (1H, br s NH).

Analyse med hensyn på PARP- inhibitoraktivitet

Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, særlig de som det er gitt en nærmere omtale av fremstillingen av i de forutgående eksempler, er blitt testet in vitro med hensyn på aktivitet som PARP-inhibitorer under anvendelse av de følgende fremgangsmåter og materialer.

I prinsippet er PARP-analysen basert på å aktivere endogen PARP (som heretter beskrevet) i celler som inneholder eksogen [<32>P]-NAD<+> innført ved å oppslemme cellene i en oppløs-ning av [<32>P]-NAD<*>, som de er blitt gjort permeable for i et innledende forbehandlingstrinn. Poly(ADP-ribose) som så syn-tetiseres ved hjelp av enzymet, kan utfelles ved hjelp av trikloreddiksyre (TCA) og mengden av inkorporert radioaktivt mer-ket <32>P måles, f eks ved å anvende en scintillasjonsteller, hvorved man får et mål for aktiviteten av PARP under de spesi-elle betingelsene i forsøket. Ved å gjenta forsøket idet den samme fremgangsmåte følges og under de samme betingelser, i nærvær av hver forbindelse som skal testes, kan så reduksjonen i enzymaktivitet som er representativ for inhibitoreffekten til testforbindelsen, fastlegges ut fra den reelle reduksjon i mengden av [<32>P] målt i den TCA-utfelte poly(ADP-ribose).

Resultatene av denne analysen kan uttrykkes som prosentvis inhibering eller reduksjon i aktivitet for en eller flere forskjellige konsentrasjoner av hver forbindelse som testes, eller den kan uttrykkes som den konsentrasjon av den testede forbindelse som reduserer enzymaktiviteten med 50 %, d.v.s. IC50-verdien. Med et spekter av forskjellige forbindelser kan det således oppnås et sett av sammenligningsverdier for inhibitoraktivitet.

I praksis er L1210 murine leukemiceller blitt brukt som en kilde for PARP-enzymet etter at de er blitt gjort permeable for eksogen [<32>P]NAD ved eksponering for hypoton buffer og kuldesjokk. Ved den foretrukne teknikk som er blitt funnet å gi nøyaktige og reproduserbare resultater, innføres en definert mengde av et lite syntetisk oligonukleotid, særlig et enkelttrådet nukleotid med palindomsekvensen CGGAATTCCG i cellesuspensjonen for å aktivere PARP-enzymet. Denne oligonukleo-tidsekvensen folder seg sammen slik at det dannes et dobbelt-trådet molekyl med en enkel buttende, og gir et effektivt substrat for aktivering av PARP. Dens oppførsel som en sterk aktivator for enzymet ble bekreftet i testene som ble utført.

Den eksperimentelle fremgangsmåte som ble tatt i bruk, hvor et syntetisk oligonukleotid som nevnt ovenfor inn-føres som en spesifikk aktivator for PARP, skjelner mellom PARP og andre mono-PARP-ribosyltransferaser i cellene. Inn-føring av slike syntetiske oligonukleotider forårsaker således en 5 til 6 ganger stimulering i den radioaktive markør som inkorporeres, og dette kan alene tilskrives PARP-aktivitet.

Nærmere detaljer vedrørende testen er gitt nedenunder .

Materialer

Materialene som ble brukt omfattet de følgende:

DTT fDithiothreitol)

En 100 mM (15,4 mg/ml) oppløsning (for anvendelse som en antioksidant) ble laget, delt i 500 ul aliguoter og lagret ved -20 °C.

Hypoton buffer:

De ovenfor nevnte bestanddeler ble oppløst i ca 80 ml destillert vann, pH ble regulert til 7,8 (NaOH/HCl), oppløs-ningen ble så fylt opp til 100 ml med destillert vann og lagret i et kjøleskap. DDT ble tilsatt inntil 5 mM like før bruk (50 pl/ml).

Isoton buffer:

40 mM Hepes (1,9 g/200 ml)

Bestanddelen ovenfor ble oppløst i ca 150 ml destillert vann, pH ble regulert til 7,8 (NaOH/HCl), oppløsningen ble så fylt opp til 200 ml med destillert vann og lagret i et kjøleskap. DDT ble tilsatt inntil 2,5 mM like før bruk (25 ul/ml).

NAD

NAD ble lagret som et fast stoff i på forhånd utveide aliguoter ved -20 °C. Fra disse ble oppløsninger av en konsentrasjon på ca 6 mM (4-4,5 mg/ml) nyfremstilt like før ut-førelse av en analyse, og molariteten sjekket ved å måle den optiske tetthet (O.D.) ved 260 nM. Standardoppløsningen ble så fortynnet med vann, hvorved man fikk en konsentrasjon på 600 ul og en liten mengde <32>P-merket NAD ble tilsatt (f eks 2-5 pl/ml).

Oligonukleotid

Oligonukleotidet med pallndromsekvens CGGAATTCCG syn-tetisert ved hjelp av konvensjonelle midler, ble vakuumtørket og lagret som pellets i en fryser. Før bruk ble det blandet ut til 200 ug/ml i 10 mM Tris/HCl, pH 7,8, idet hver pellet ble oppløst fullstendig i 50 ml buffer. Oppløsningen ble så varmet opp til 60 °C i et vannbad i 15 minutter, og fikk avkjøles sakte for å sikre korrekt reannelering. Etter tilsetning av 9,5 ml buffer ble konsentrasjonen sjekket ved å måle den optiske tetthet i en fortynnet prøve ved 260 nm. Hovedoppløs-ningen ble så fortynnet til en konsentrasjon på 200 pg/ml og lagret 1 500 pl aliguoter i en fryser, klar for bruk.

TCA

Oppløsninger av TCA (trikloreddiksyre) ble fremstilt ved to konsentrasjoner. 10 % TCA + 10 % natriumpyrofosfat, og 1 % TCA natriumpyrofosfat.

Celler

L1210-cellene som ble brukt som kilde for PARP-enzymer, ble holdt som en suspensjonskultur i RPMI-medium + 10 %

bovint fosterserum + glutamin og antibiotika (penicillin og streptomycin). HEPES og natriumbikarbonat ble også tilsatt og cellene ble inokulert i 100 ml-200 ml medium, slik at det ble en konsentrasjon på omtrent 8 x 10<5>/ml på tidspunktet for ut-førelse av en analyse.

> Fremgangsmåte

De testede forbindelser ble generelt tilberedt som en konsentrert oppløsning i DMSO (dimetylsulfoksid). Oppløselig-heten til forbindelsen ble så sjekket ved å tilsette en mengde

av DMSO-oppløsningen til en mengde av den isotone buffer, ved

i de påkrevde endelige mengdeforhold som skulle brukes ved ut-førelse av analysen, og etter et intervall ble oppløsningen undersøkt under et mikroskop med hensyn på eventuelle tegn på at krystaller ble dannet.

En ønsket mengde av cellene, fastlagt ved å telle med

> et hemocytometer, ble så sentrifugert (1500 rpm i en "Europa"-modell 24 M sentrifuge i 5 minutter), supernatanten ble fjernet og de erholdte pellets ble oppslemmet i 20 ml fosfatbufret saltoppløsning fri for Ca++ og Mg++ (Dulbeccos modifikasjon A,

forkortet Dul A) ved 4 °C før det igjen ble sentrifugert ved

s 1500 rpm og 4 °C. Etter igjen å ha fjernet supernatanten ble cellene på nytt oppslemmet ved en konsentrasjon på 3 x IO<7 >celler/ml i iskald hypoton buffer og fikk stå i 30 minutter på is. Ni volumdeler ble så tilsatt av iskald isotonbuffer og

cellene som nå var gjort permeable for eksogent NAD", ble så

) brukt innen den neste timen for å utføre en analyse. Permeabi-literingen av cellen kan sjekkes på dette stadium ved å tilsette aliguoter in duplo av celler til et likt volum av trypanblått, la dette stå i 5 minutter og så telle på et hemocytometer. De cellene som er gjort permeable vil ta opp try-

s panblåfargen og fremstå som fargede.

Analysen ble så utført ved å anvende 15 ml analyserør, av plast for lettvinthets skyld, med konisk bunn, plassert i et vannbad med risting ved 26 °C som er den optimale temperatur for dette enzymet. Ved en typisk analyse under anvendelse av oligonukleotidoppløsningen ved en konsentrasjon på 5 ug/ml og testforbindelse/DMSO-oppløsning ved en konsentrasjon på 2 %, og ved å utføre analysen i kvadruplo, ble det så plassert i hvert analyserør 5 ul av oligonukleotidoppløs-ningen, 50 ul av 600 um NAD + [<32>P]-NAD oppløsningen, 8 ul av testforbindelse/DMSO-oppløsningen og 37 ul vann. Før starten på forsøket forvarmes denne "cocktail" i 7 minutter ved 26 °C, noe som også gjelder for cellesuspensjonen. Reaksjonen startes så ved å tilsette 300 ul av cellesuspensjonen. Reaksjonen stanses ved å tilsette 2 ml av den iskalde oppløsning av 10 % TCA + 10 % natriumpyrofosfat.

I tillegg til det ovenfor nevnte oppstilles vanligvis seks analyserør som blindprøver, hvor disse inneholder de samme bestanddeler som ovenfor, men før tilsetningen av cellesuspensjonen tilsettes TCA-oppløsning for å forhindre at det finner sted en eventuell reaksjon. Dette gjør det mulig å anvende korreksjoner for eventuell ikke-spesifikk binding av det merkede materiale til det anvendte filter (se nedenunder).

Etter tilsetning av cellesuspensjonen ved tidsbe-stemte intervaller til hvert av analyserørene, ble 10 % TCA + 10 % natriumpyrofosfat ved 4 °C tilsatt til hvert analyserør nøyaktig 5 minutter etter tilsetning av cellesuspensjonen til røret. Etter å ha latt rørene stå på is et minimalt tidsrom på 1 time ble så innholdene i hvert enkelt rør filtrert gjennom den individuelle filtertrakt i et sugefilterapparat under anvendelse av GF/C-filterelementer (den grove side opp) fuktet med 10 % TCA. Etter filtrering av innholdene i hvert rør og skylling av filtrene flere ganger med 1 % TCA + 1 % natrium-pyrofosfatoppløsning, ble filtrene fjernet og tørket før de ble plassert i individuelle seintillasjonsvialer. Fire ytterligere scintillasjonsvialer ble også oppstilt som referanse-standarder inneholdende 10 ul av 600 uM NAD + [32P] -NAD-oppløs-ningen, idet 10 ml seintillasjonsmiddel så ble tilsatt til hver vial. Telling ble utført i 2 minutter på en B-teller, hvorved man fikk mål for det tilstedeværende <32>P, og således mengden av poly(ADP-ribose) og aktiviteten av PARP-enzymet.

Resultater av PARP- inhiberingsundersøkelser in vitro

Bortsett fra anvendelse av PARP-enzymanalysen i overensstemmelse med standardfremgangsmåten skissert ovenfor på et spekter av forbindelser som er blitt fremstilt i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, ble det for sammenlig-ningsformål også anvendt visse benzamidforbindelser, særlig benzamid, 3-hydroksybenzamid og 3-metoksybenzamid som allerede er kjent for å utvise en viss PARP-inhibitoraktivitet. En liste i tabellform over noen eksempelvise forbindelser som er blitt laget og/eller undersøkt, er vist nedenunder i tabellen på slutten av foreliggende beskrivelse, sammen med PARP-inhiberingsanalyseresultatene som ble oppnådd i ett eller flere forskjellige forsøk, uttrykt enten som den prosentvise inhlbering av en 10 uM konsentrasjon eller, mer vanlig, som IC50-verdier for forbindelser når de blir testet under anvendelse av analysen som er beskrevet ovenfor.

Når man ser på denne listen, kan de kjente PARP-inhibitorene benzamid, 3-aminobenzamid og 3-metoksybenzamid anses som referanseforbindelser. Selv om resultatene varierte noe, oppviste forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse som ble testet, generelt en forholdsvis høy grad av inhibitoraktivitet. Av spesiell interesse var benzimidazolkarboksamidene med referansenumrene NU1064, NU1066, NU1086 og særlig NU1070, NU1076, NU1077, NU1090, NU1091, NU1092, NU1093 og NU1098, hvorav NU1091 og NU1092 viste eksepsjonelt høye inhibitorak-tiviteter.

Ytterligere biologiske aktivitetersundersøkelser

Ved igjen å anvende kulturer av den murine leukemi L1210-cellellnje ble det utført vekstinhiberingsforsøk for å fastlegge de cytostatiske effektene av forbindelsene og klonogenoverlevelsesanalyser ble utført for å fastlegge cytotok-sisitet, spesielt i forhold til bruk av forbindelsene sammen med DNA-ødeleggende cytotoksiske midler, slik som cytotoksiske antitumorlegemidler eller gammastråling. DNA-skade og effekten av PARP-inhibitorene og fremgangsmåten for DNA-trådbruddan-nelse og -reparasjon er også blitt fastlagt ved å utføre DNA-trådbruddanalyser og overvåke ved hjelp av alkalisk eluering i

overensstemmelse med publiserte teknikker.

Ved vekstinhiberingsanalysene inokuleres Ll210-cellene vanligvis ved 1 x 10<*>/ml in triplo i 24-brønners multi-skåler, og 24 timer senere tilsettes de testede forbindelser eller legemidler i utvalgte kombinasjoner og konsentrasjoner. På dette tidspunkt telles et sett av replikater ved å anvende en Coulter-teller (N0) og 48 timer senere telles de gjenværende prøver (NL). Den prosentvise (%) vekstinhibering av legemiddel-behandlede prøver kan så beregnes. I legemiddelkombina-sjonsforsøk hvor bevis på synergistiske effekter på celleveg-gers klonogenisitet søkes, tas en enkelt, fastlagt konsentrasjon av den cytotoksisk legemiddelprøve, f eks temozolomid (TM), som kontroilverdi.

Eksempler på cvtotoksisitetsanalvse in vitro

1 et bestemt eksempel på en cytotoksisitetsanalyse in vitro under anvendelse av forbindelsen NU1064 (2-metylbenzimidazol-4-karboksamid) ble L1210 murine leukemiceller inkubert med økende konsentrajoner av NU1064 i nærvær eller fravær av lOOuM av metyleringsmidlet temozolomid ved en endelig DMSO-konsentrasjon på 1 % DMSO i 24 timer ved 36 "C. Cellene ble pelletert, på nytt oppslemmet i nytt medium, tellet og inokulert for kolonidannelse i 0,15 % agarose i legemiddelfritt medium. Etter 1 uke ble kolonier av levedyktige celler farget med MTT (1 ml, 0,5 mg/ml) og tellet. Utplatingseffektiviteten til kontrollen (89 %) og temozolomidet alene (32 %) ble norma-lisert til 100 % relativ overlevelse og utplatingseffektiviteten til de NUl064-behandlede celler uttrykt som en prosentan-del av disse verdiene.

Det var en middels reduksjon i celleoverlevelse for-årsaket av NU1064 alene (relativ utplatingseffektivitet ved 100 uM og 200 uM NU1064 = henholdsvis 72 % og 54 %), men en svært markert økning i temozolomidcytotoksisitet med økende konsentrasjoner av NU1064 (relativ utplatingseffektivitet ved 100 og 200 uM NU1064 = 28 % og 2 %), noe som indikerer en NU1064-konsentrasjonsrelatert forsterkelse av temozolomidcytotoksisitet. En illustrasjon av resultatene er vist i fig. 1 i den ledsagende tegning.

Ved andre klonogenoverlevelsesanalyser eksponeres vanligvis L1210-cellene for varierende konsentrasjoner av ± en fastlagt konsentrasjon av PARP-inhibitor i et fast tidsrom på 16 timer før telling og inokulering for kolonidannelse i 0,12-0,15 % agarose i legemiddelfritt medium. Etter 7-10 dager ble kolonier farget med 0,5 mg/ml MTT og tellet ved øyet på en lysboks med gitter. Denne gjør det så mulig å plotte over-levelseskurver og oppnå DEF10-verdier, idet DEF10 er definert som forholdet mellom den konsentrasjon av TM som reduserer overlevelse til 10 % og den konsentrasjonen av TM som reduserer overlevelse til 10 % i nærvær av en bestemt konsentrasjon av PARP-inhibitor.

Ved ytterligere klonogene overlevelsesanalyser kan det anvendes bestråling med gammastråle for å ødelegge cellene. Vanligvis bestråles L1210-celler (3 ml, 4 x IO<3>/ml i "bijoux"-flasker av plast) ved 4 °C med varierende doser av gammastråler i nærvær eller fråvær av forbindelsen som testes, og en sluttkonsentrasjon på 2 % DMSO. Cellene inkuberes så ved 37 °C i 2 timer ved fortsatt tilstedeværelse eller fravær av PARP-inhibitor før inokulering for kolonidannelse.

Reparasjon av potensielt dødelig skade (PLD) inntrer når celler holdes i stasjonærfase etter oppstarting av PLD før celledeling tillates å finne sted. I ytterligere typiske for-søk for å teste potensielle PARP-inhibltorer har L1210-celler fått mulighet til å reparere gammastråle-PLD i nærvær eller fravær av testforbindelsen på følgende måte: L1210-celler ble holdt i kultur inntil de hadde nådd stasjonær fase (>10<6 >celler/ml). De ble fortynnet til 1,5 x 10<5>/ml i kondisjonert medium fra stasjonærfasekulturer for å forhindre ytterligere celledeling. 2 ml replikaprøver av celler i plast"bijoux" ble holdt på is før og umiddelbart etter 8 Gray-gamma-bestråling.

1 ml med 3 x sluttkonsentrasjon av testforbindelsene laget i kondisjonert medium fra stasjonære kulturer tilsettes så for å gi passende sluttkonsentrasjoner (f eks 10<6> celler/ml i 1 % DMSO ± testforbindelser), og cellene inkuberes ved 37 °C i 0,2 eller 4 timer før de på nytt oppslemmes i legemiddelfritt medium og inokuleres for kolonidannelse. Ikke-bestrålte stasjonærfasekulturer inkubert ved 37 °C i 0,2 eller 4 timer med 1 % DMSO ± den samme mengde av testforbindelse, ga passende kontroller for å bestemme relativ overlevelse. I fravær av PARP-inhibitor vil celleoverlevelse normalt øke med tiden som gis for at PLD-reparasjon skal kunne finne sted. F eks over-levde bare ca 0,2 % av cellene i ett sett av forsøk hvor de ble inokulert umiddelbart etter stråling (ingen reparasjon), men etter en 4 timers reparasjonsperiode hadde dette økt til 0,7 %. En effektiv PARP-inhibitor blokkerer denne reparasjonen og reduserer derved overlevelseshyppigheten.

Når det gjelder de tidligere nevnte analyser med hensyn på DNA-trådbrudd, inkuberes typiske prøver av L1210-celler i en viss tid, f eks 1 time, med en bestemt konsentrasjon,

f eks 150 uM, av temozolomid og, bortsett fra en kontroll, i nærvær av økende konsentrasjoner av de testede PARP-inhibitorer. Dess mer effektiv inhibitoren er, dess større er hastigheten for den alkaliske eluering (et mål for omfang av trådbrudd) sammenlignet med temozolomid alene.

Generelt understøtter de utførte undersøkelser fullt ut den tro at PARP-inhibitorkarakteristikaene til de testede forbindelser gjenspeiler en evne hos disse forbindelsene til å forsterke cytotoksisiteten av DNA-skadende midler, som visse cytotoksiske antitumorlegemidler og bestråling brukt i radioterapi. Følgelig kan forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen når man tar i betraktning deres sterke PARP-inhibitorkarakte-ri stika, forventes å være spesielt anvendbare til administrering sammen med slike cytotoksiske legemidler eller radioterapi for å forsterke den cytotoksiske effekt av den sistnevnte i løpet av medisinsk behandling som angitt ovenfor.

Claims (16)

1. Anvendelse av en benzimidazolforbindelse med den generelle strukturformel I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav til fremstilling av et medisinsk eller veterinærmedisinsk preparat for anvendelse i terapi for inhibering av aktivitet av enzymet poly(ADP-ribose)-polymerase eller PARP (også kjent som ADP-ribosyltransferase eller ADPRT), hvor slik enzyminhibering utgjør et element i en terapeutisk behandling, kjennetegnet ved at benzimidazolforbin-delsen tilveiebringer det aktive PARP-enzyminhiberende middel, og at i strukturformel I er R valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og fenyl, hvor fenylgruppen eventuelt er substituert med en substituent valgt fra Ci-Cgalkoksy, trihalometyl, hydroksy, cyan, amino og nitro,og R' valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl, benzoyl og karboksybenzyl.

2 . Anvendelse ifølge krav 1 av en benzimidazolforbindelse som definert i krav 1, hvor R er en eventuelt substituert fenylgruppe med struktur formel II hvor Ri er valgt fra H, hydroksy, Ci-C6alkoksy, N02, NH2, CW3 (hvor W er halogen) og CN.

3. Anvendelse ifølge krav 1 av en benzimidazolforbindelse som definert i krav 2, hvor Ri er en annen gruppe enn hydrogen og er i 4'-stillingen.

4. Anvendelse ifølge krav 1 av en benzimidazolforbindelse som der definert, hvor R er valgt fra metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl og t-butyl.

5. Anvendelse ifølge krav i av en benzimidazolforbindelse, hvor forbindelsen er en av de følgende: {a) 2-metylbenz imida zol-4-karboksamid; (b) benzimidazol-4-karboksamid; {c) 2-fenylbenzimidazol-4-karboksamid; (d) 2-(41-metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (e) 2-(4<1->trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (f) 2-(4'-hydroksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (g) 2-(4'-metoksyfenyl)-N-metylbenzimidazol-4-karboksamid ; (h) 2-(4'-nitrofenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (i) 2-(4'-cyanfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (j) 2-(3'-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (k) 2-(3'-metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (1) 2-(4<1->metoksyfenyl)-l-N-benzoylbenzimidazol-4-karboksamid; (m) 2-(4<1->aminofenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (n) 2 -(2'-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (o) N-karboksybenzyl-2-(4<1->metoksyfenyl)-benzimidazol-4-karboksamid.

6. Forbindelse, karakterisert ved at den har den generelle strukturformel I hvor R er valgt fra hydrogen og fenyl substituert med en substituent som er valgt fra Ci-C6alkoksy, trihalometyl, hydroksy, cyan, amino og nitro, og R' er valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og benzoyl, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

7. Benzimidazolforbindelse for anvendelse som et aktivt farmasøytisk stoff, karakterisert ved at den har den generelle strukturformel I R er valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og fenyl, hvor fenylgruppen eventuelt er substituert med en substituent valgt fra Ci-C6alkoksy, trihalometyl, hydroksy, cyan, amino og nitro, og R<1> er valgt fra hydrogen, Ci-C6alkyl og benzoyl, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

8. Forbindelse ifølge krav 6 eller 7, karakterisert' ved at R er en fenylgruppe med s t ruktur f orme1 II "Os hvor Ri er valgt fra H, hydroksy, Ci-C6alkoksy, N02, NH2, CW3 (hvor W er halogen) og CN.

9. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at Ri er en annen gruppe enn hydrogen og er i 4'-stillingen.

10. Forbindelse ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at R er valgt fra metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl og t-butyl.

11. Forbindelse ifølge krav 6 eller 7, karakterisert ved at den er en av de følgende: (a) benzimidazol-4-karboksamid; (b) 2-(4<1->metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (c) 2-(4'-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (d) 2-(4'-hydroksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (e) 2-(4'-metoksyfenyl)-N-metylbenzimidazol-4-karboksamid ; (f) 2-(41-nitrofenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (g) 2-(4'-cyanfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (h) 2-(31-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (i) 2-(3<1->metoksyfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (j) 2-(4<1->metoksyfenyl)-l-N-benzoylbenzimidazol-4-karboksamid; (k) 2-(41-aminofenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (1) 2-(2'-trifluormetylfenyl)benzimidazol-4-karboksamid; (m) N-karboksybenzyl-2-(4<1->metoksyfenyl)-benzimidazol-4-karboksamid.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved trinnene med omsetning av et alkyl-2,3-diaminobenzoat med et arylsyreklorid, behandling av produktet med eddiksyre ved en forhøyet temperatur for å tilveiebringe benzimidazolringdannelse, og omsetning med flytende ammoniakk for å danne amidderivatet.

13 . Forbindelse for anvendelse i terapi som et aktivt PARP-inhiberende stoff, karakterisert ved at den er definert som i hvilket som helst av kravene 7-11.

14. Farmasøytisk formulering, karakterisert ved at den inneholder en forbindelse ifølge krav 13 i enhetsdoseringsform sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer for administrering til et pattedyr.

15. Farmasøytisk formulering, karakterisert ved at den omfatter en effektiv PARP-inhiberende mengde av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 6-11, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

16. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder en effektiv PARP-inhiberende mengde av en forbindelse ifølge krav 13 i blanding med en terapeutisk nyttig og effektiv mengde av et cytotoksisk legemiddel for anvendelse i antitumorbehandling.