NO315331B1

NO315331B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et konsentrat av anti-D- immunglobulin G samt farmasoytisk preparat inneholdende dette

Info

Publication number: NO315331B1
Application number: NO19945032A
Authority: NO
Inventors: Gerhard Hodler; Peter Lerch; Martin Stucki
Original assignee: Zlb Bioplasma Ag
Priority date: 1993-12-27
Filing date: 1994-12-23
Publication date: 2003-08-18
Also published as: JP2926463B2; NZ278057A; TW311884B; AU1414395A; JPH07206708A; AU682243B2; CA2138921A1; NO945032L; EP0659767B1; FI946103A; PL180358B1; ATE175979T1; DK0659767T4; DK0659767T3; ES2129076T5; CZ286271B6; CA2138921C; EP0659767B2; KR100368563B1; DE59309332D1

Description

Foreleggene oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et nytt konsentrat av anti-D (anti-rhesus) immunglobulin G (anti-D IgG), så vel som et farmasøytisk preparat inneholdende et slikt konsentrat som aktivt prinsipp.

Som Morbus haemolytikus neonatarum betegner man vanligvis den hemolytiske anemi hos fostre og nyfødte som er utviklet gjennom moderlige antistoffer. Disse er rettet mot antigener på overflatene av barnas erytrocytter. Ved dette handler det enten om antigener av rhesus-, ABO- eller andre blodtypesystemer.

De viktigste rhesus-blodtypeantigener er D, de betydelig mindre immunogent aktive antitetiske antigener C, c og E, e, så vel som Du; dessuten er det kjent over 40 ytterligere rhesus-antigener. Av klinisk betydning ved rhesusuforenligheten er fremfor alt rhesus-antigenet D (RhD; Rh0), et membranprotein i erytrocytter som nylig er blitt klonet og primærstrukturen av proteinet er beskrevet (Le Van Kim et al., PNAS USA, 89, 10925,1992). D-antigenet forekommer hos ca. 85 % av de hvite mennesker i Europa; disse individer betegnes som rhesus-positive. Individer som mangler D-antigenet betegnes som rhesus-negative. Antistoffer med spesifisiteten anti-D er de hyppigste irregulære rhesus-antistoffer og opptrer fremfor alt under rhesus-uforenlige svangerskap og etter transfusjon av rhesus-uforenlig blod. Anti-D-antistoffer tilhører hovedsakelig IgG-underklassene 1 og 3 (IgGl og IgG3).

En sikkert virksom kausalterapi ved rhesussensibiliserte svangerskap er hittil ikke kjent. Fordi en desensibilisering heller ikke er mulig blir for rhesus-negative kvinner i fruktbar alder profylaksen av rhesus-sensibiliseringen med immunglobulin anti-D av avgjørende betydning.

Uten behandling blir inntil 17 % av de førstegangs- gravide med rhesuskonstellasjon (mor rhesus-negativ, barn rhesus-positiv) sensibilisert mot rhesus-antigenet i løpet av svangerskapet eller under fødselen.

Anti-D-preparater har i over 30 år vært anvendt

effektivt for å forhindre rhesus-sensibiliseringen av rhesus-negative, henholdsvis Du-positive kvinner, mot rhesusfaktor D, henholdsvis Du, og dermed de anti-D-betingede spebarnssykdommer rhesus-erytroblastoser i alle sine fonner.

Risikoen for en rhesus-sensibilisering øker med størrelsen av innstrømningen av rhesus-positive fostererytrocytter. Den anbefalte behandlingsdose av WHO på 200 ig anti-D IgG som postpartal profylakse er tilstrekkelig til å nøytrali-sere inntil 10 ml fostererytrocytter (tilsvarer ca. 20 ml fosterblod) og forhindrer således, selv ved større innstrømninger, en rhesussensibilisering i ca. 90 % av tilfellene; ved dette kan det imidlertid kun regnes med en sensibilisering mot rhesus-antigenet i 1 til 2 % av alle førstegangsgraviditeter med rhesuskonstilasjon. Gjennom ytterligere rutinemessig rhesusprofylakse under svangerskapet (antepartal profylakse) kan sensibiliseringsrestrisikoen enda en gang reduseres i 0,1-0,2 % av alle første gangs graviditeter med rhesuskonstellasjon.

Anti-D anvendes også dessuten etter feiltransfusjon av rhesus-positivt blod til rhesus-negative mottakere av begge kjønn; ved dette blir doseringen tilpasset graden av innstrømning av rhesus-positive erytrocytter.

I noen år er anvendelsen av anti-D-immunglobulin også diskutert for behandling av idiopatisk trombocytopeni purpura (ITP).

Farmakokinetikken for intramuskulært og intravenøst injisert IgG i organismen viser tydelig at den intravenøse applikasjon ubetinget er å foretrekke. Ved intramuskulær injeksjon må det, som følge av den langsomme resorpsjon fra muskeldepoet og lokal proteolyse, regnes med en temporær forsinkelse av den maksimale aktivitet og et virkningstap. Den maksimale IgG-plasmakonsentrasjon nås hos friske testpersoner først 4 dager, og hos sengeliggende først 6 dager etter injeksjon; dessuten oppgår den maksimale IgG-plasmakonsentrasjon hos friske testpersoner kun til rundt 30 % og hos sengeliggende kun til 20 % av den injiserte dose.

På den annen side medfører den intravenøse anvendelse vesentlige fordeler. Kun ved denne anvendelsesform gir den totale utleverte dose umiddelbar virkning uavhengig av den kroppslige aktivitet; IgG-plasmaspeilet synker i løpet av 5 dager, praktisk talt uavhengig av den kroppslige aktivitet, til rundt 35-40 % av den utleverte dose, og når dermed først på den femte dag verdier som er sammenlignbare med den maksimalt oppnådde plasmakonsentrasjon etter intramuskulær injeksjon.

(Morell, A. et al. Vox Sang. 38,272,1980).

For fremstilling av immunglobulinpreparater i produksjonmålestokk blir det i dag anvendt forskjellige fraksjoneringsfremgangsmåter: Alkoholutfellinger med kald alkohol, f.eks. ifølge Cohn, eller modifiserte fremgangsmåter ifølge Cohn, er fremfor alt egnede for opparbeidelse av plasmamengder på over 5001 pr. uke. Gjennom spesiell behandling, f.eks. med pepsin ved pH 4, kan således isolerte immunglobuliner gjøres intravenøst forenlige. Andre utfellingsfremgangsmåter beror på den spesifikke utfelling av immunglobuliner ved hjelp av ammoniumsulfat, natriumsulfat, polyetylenglykol, kaprylsyre eller rivanol (for oversikt se Curling, J.M. i: Separation of plasma proteins, J.M. Curling red., 1983, Pharmacia, Uppsala, Sverige).

En første fremgangsmåte for isolering av immunglobuliner gjennom porsjonsvis adsorpsjon på ionebyttere ble allerede beskrevet i 1964 (Baumstark, J.S. et al. Arch. Biochem. Biophys., 108, 514,1964). I de følgende år ble det også utviklet et antall kolonnefremgangsmåter (CH-A-572745; US-A-3 869 436; EP-A-0 085 747), som blant annet også ble anvendt for fraksjonering av anti-D-immunglobuliner (Friesen, A.D. et al. J. Appl. Biochem. 3,164,1981).

Ved alle de beskrevne fremgangsmåter ble det med høy renhet og uforandret IgG-underklassefordeling oppnådd et høyt utbytte av totalt IgG, men ingen spesifikk anrikning av be-

stemte IgG-underklasser eller spesifikke IgG-molekyler, som f.eks. anti-D IgG.

De fleste anti-D hyperimmunglobulinpreparater er kun egnet for

intramuskulær anvendelse. I hele verden er det kun få intravenøst forenlige preparater på markedet. Et slikt preparat er søkerens immunglobulin anti-D SRK som fremstilles etter fraksjoneringsmetoden ifølge Kistler og Nitschmann (Kistler, P. og Nitschmann, H. Vox Sang, 7,414, 1962) og som gjøres intravenøst forenlig gjennom en mild pepsinbehandling ved pH 4. Fordi utbyttet av de spesifikke anti-D-antistoffer er lavt med slike fraksjonsfremgangsmåter og samtidig at anti-D-hyperimmunplasma er sjeldent, foreligger det et behov for en ny fremgangsmåte som, i motsetning til de beskrevne metoder, også med anti-D-plasmaporsjoner med lave titere gir et rent IgG-preparat med høyere spesifikk anti-D-aktivitet i høyere utbytte.

Et mål for foreliggende oppfinnelse er således å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et rent anti-D-konsentrat, hvori anti-D-immunglobulinet av IgG-underklasser 1 og 3 blir spesifikt anriket. Det er funnet at dette kan utføres på overraskende enkel måte ved samtidig eliminering av over 85 % av det uspesifikke IgG og nesten alt av de andre uønskede plasmakomponenter, idet blodplasma eller immunglobulininneholdende fraksjoner fremstilt fra blodplasma fra spesielt utvalgte og spesifikt immuniserte kvinnelige og mannlige blodgivere, med et titer fortrinnsvis høyere enn 30 ig/ml anti-D IgG, underkastes en kationbytterkromatografi under betingelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Det oppnådde anti-D-konsentrat med høyt utbytte har dessuten en forhøyet spesifikk aktivitet (gram anti-D IgG pr. gram totalt IgG) og kan renses ytterligere gjennom videre behandlinger med ionebyttere eller aluminiumhydroksidgel, alene eller i en egnet kombinasjon.

Et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse er et anti-D-preparat som kun inneholder spormengder av immunglobulin A, er intravenøst forenlig og som, ved tilsetning av egnede stabilisatorer, eventuelt lyofilisert eller fortrinnsvis i løsning, kan lagres i flere måneder uten aktivitetstap. Det er funnet at det ved den foreslåtte fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse erholdes et rent anti-D-konsentrat som oppfyller disse betingelser, dvs. at det blant annet oppviser en hittil ikke oppnådd spesifikk aktivitet, er intravenøst forenlig og oppviser et ekstremt lavt innhold av IgA. Anti-D-konsentratet viser dessuten en unormal IgG-underklassefordeling, idet IgG-underklassene 1 og 3 blir kraftig anriket ved fremgangsmåten, mens underklassene 2 og 4 blir sterkt redusert.

Foreliggende oppfinnelse omfatter:

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et anti-D-immunglobulin G-preparat med en spesifikk aktivitet høyere enn 1 % anti-D IgG pr. g totalt IgG, fra humant plasma, kjennetegnet ved at plasma fra rhesus-negativt blod fra rhesusfaktor D-sensibiliserte mannlige og kvinnelige blodgivere, eller en anti-D IgG-inneholdende plasmafraksjon, A) ved en pH-verdi i området pH 3,5 til 6,5 og en ledningsevneverdi i området 2 til 4 mS/cm, underkastes en ionebytterkromatografi med en adsorbent som inneholder karboksymetylgrupper som funksjonelle

grupper, idet anti-D IgG er bundet til adsorbenten,

B) adsorbenten med det bundne anti-D IgG vaskes først med en vaskeløsning ved en pH-verdi i området 5 til 8 og en ledningsevneverdi i området 2 til 4 mS/cm, etterfulgt av at anti-D IgG elueres, etterfulgt

av at

C) det eluerte anti-D IgG behandles ved en pH-verdi i området 6 til 8 og en ledningsevneverdi i området 2 til 4 mS/cm med en basisk adsorbent med ionebytteregenskaper for å binde uønskede komponenter, etterfulgt av at

anti-D IgG til sist konsentreres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, kjennetegnet ved at anti-D IgG konsentreres i trinn C), idet trinnene A) og B) minst gjentas én gang. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, kjennetegnet ved at det som utgangsmateriale anvendes plasma som på forhånd behandles med en basisk adsorbent med ionebytteregenskaper for å binde uønskede komponenter. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, kjennetegnet ved at proteaseinnholdet i plasma eller plasmafraksjonen reduseres ved inkubasjon med en adsorbent, slik som aluminiumhydroksidgel. 5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 4, kjennetegnet ved at alle ionebytterkromatografitrinn og eventuelt ytterligere adsorpsjonstrinn valgfritt gjennomføres som sats-, søyle- eller membrankromatograferinger. 6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 5, kjennetegnet ved at den basiske adsorbent i trinn C) inneholder dietylaminoetylgrupper som funksjonelle grupper. 7. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 6, kjennetegnet ved at elueringen i trinn B) gjennomføres under pH-forskyvning og/eller forandring av buffer, f.eks. gjennom forandring av deres ionestyrke, henholdsvis ledningsevne. 8. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 7, kjennetegnet ved at den omfatter minst ett virusinaktiveringstrinn. 9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, kjennetegnet ved at virusinaktiveringstrinnet omfatter en behandling av plasma eller den anti-D IgG-inneholdende fraksjon med en detergent og tri-n-butylfosfat, hvorved fasen inneholdende blandingen av løsningsmiddel og detergent atskilles og det klare bunnsjikt anvendes. 10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, kjennetegnet ved at virusinaktiveringstrinnet er en varmebehandling. 11. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 10, kjennetegnet ved at utgangsplasmaet eller utgangsplasmafraksjonen før ionebytterkromatografitrinnet i trinn A) underkastes minst ett av de etterfølgende trinn: a) nedfrysing av plasma, hvorved etter opptining og før videre anvendelse kryobunnfallet fjernes ved filtrering og/eller sentrifugering, b) behandling med en løsningsmiddel-detergentblanding, inkubasjon ved 37 °C og faseatskillelse. 12. Farmasøytisk preparat, fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ett av kravene 1 til 11 og kjennetegnet ved at det inneholder farmasøytisk akseptable bærer- og tilsetningsstoffer.

13. Farmasøytisk preparat ifølge krav 12, kjennetegnet ved at det inneholder 20-

200 ig/ml anti-D IgG og mindre enn 5 ig/ml IgA, idet det samlede proteininnhold høyst er 10 %, pH-verdien er mellom 5,0 og 7,5, fortrinnsvis mellom 5,0 og 5,5, og den lett hypertoniske osmolaritet innstilles ved hjelp av en kombinasjon av glysin eller sukker og NaCl.

Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan immunglobulin anti-D direkte fremstilles fra humantplasma. Utgangsmateriale er plasma fra rhesus-negative kvinnelige og mannlige blodgivere som er sensibiliserte mot rhesusfaktor D. Fortrinnsvis blir blodet fra de enkelte blodgivere, som er oppsamlet ved plasmaferese, nedfrosset og forsiktig tint ved 0-4 °C før fraksjoneringen og sammenslått. Det samlede plasma bør ha et innhold på mer enn 10 ig anti-D IgG pr. ml, fortrinnsvis et innhold på mer enn 30 ig anti-D IgG pr. ml. Plasmafraksjonen anvendt i kationbytterkromatografien kan renses på forhånd ved hjelp av enhver kjent fremgangsmåte, f.eks. ved atskillelse av kryoglobulinene eller ved fraksjonert felling med alkohol (Cohn, E.J. et al. J. Am. Chem. Soc. 68,459,1946; Kistler, P. og Nitschmann, H. Vox Sang 7,414, 1962), ved hjelp av andre utfellingsfremgangsmåter som utfelling av immunglobulinene med ammoniumsulfat, natriumsulfat, polyetylenglykol, kaprylsyre eller rivanol, eller ved hjelp av en kromatografisk fremgangsmåte eller en kombinasjon av slike fremgangsmåter. Før kationbytterkromatografien ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis det kryoglobulinfrie plasma eller den immunglobulininneholdende plasmafraksjon som er oppløst i ekvilibreirngsbuffer, filtrert og behandlet med et biologisk forenlig organisk løsningsmiddel for inaktivering av innkapslede virus, som f.eks. tri-n-butylfosfat og en detergent, som f.eks. 0-t4-(l,l,3,3-tetrametylbutyl)-fenyl]-deka(oksyetylen) ("Triton" X-100) etter Horowitz (Thrombosis and Haemostasis 65,1163,1991). Blandingen av plasma, løsningsmiddel og detergent inkuberes deretter ved 37 °C. Ved dette følger en faseatskillelse. Det klare bunnsjikt fjernes, fortynnes, filtreres og innstilles til ekvilibreringsbetingelsene for kationbytterkromatografien, hvorved temperaturen for de videre trinn som regel er høyere enn 10 °C og fortrinnsvis 20-25 °C. I et første hovedrensingstrinn blir anti-D IgG fra det forbehandlede produkt bundet til en svakt sur ionebyttergel med fortrinnsvis karboksymetyl (CM) som funksjonell gruppe. Over 98 % av fremmedproteiner vaskes derved bort; likeledes er løsningsmidlene og detergentene anvendt for virusinaktivering. Anti-D IgG av IgG-underklasser 1 og 3 som spesifikt anrikes ved dette fremgangsmåtetrinn elueres fra ionebyttergelen ved økning av ledningsevnen til fortrinnsvis over 10 mS/cm. Eluatet er en ren IgG-fraksjon; den inneholder mindre enn 15 % av de totale IgG-molekyler og viser forandret IgG-underklassespektrum: IgGl og IgG3 er sterkt anriket, IgG2 og IgG4 er sterkt redusert. Denne anti-D IgG-fraksjon renses deretter ytterligere ved behandling med en andre, svakt basisk, ionebyttergel, med fortrinnsvis dietylaminoetyl (DEAE) som funksjonell gruppe, hvor anti-D IgG ikke bindes til ionebytteren under de valgte betingelser. Den rensede anti-D IgG-fraksjon blir for oppkonsentrering fortrinnsvis bundet en andre gang til en CM-ionebyttergel og eluert konsentrert under de best mulige egnede betingelser og utformet til sluttprodukt. For oppnåelse av betingelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er det ikke av betydning hvorvidt anti-D IgG-fraksjonen elueres ved hjelp av økning av ionestyrken, forskyvning av pH eller ved hjelp av en buffer med endret sammensetning. For ytterligere å fjerne uønskede komponenter, som f.eks. protease, kan immunglobulinløsningen ytterligere behandles på et hvilket som helst trinn i fremgangsmåten med en adsorbent, som f.eks. aluminiumhydroksidgel. Løsningsmiddel-detergentbehandlingen kan valgfritt erstattes eller suppleres med et annet kjent virusinaktiveringstrinn, eksempelvis en varmebehandling som f.eks. en pasteurisering.

Et anti-D IgG fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er stabilt i flytende tilstand. Det er dessuten intravenøst forenlig, har et IgA-innhold lavere enn 5 ig/ml og har et IgG-innhold på 1-10 mg/ml. pH-verdien er ca. 5,2. Preparatet inneholder fortrinnsvis inntil 25 mM fosfat, inntil 200 mM NaCl og inntil 100 mg/ml humant albumin, og valgfritt 250-300 mM av en aminosyre, som f.eks. glysin, eller inntil 100 mg/ml av et disakkarid, som f.eks. sakkarose, eller 50 mg/ml av et monosakkarid, som f.eks. mannitol.

Et anti-D IgG fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan alternativt lyofiliseres under tilsetning av et disakkarid, som f.eks. 100 mg/ml sakkarose, i en dose på 200 ig anti-D IgG, ved en pH på ca. 6,6.

Den medfølgende figur tjener til belysning av foreliggende oppfinnelse og er ikke tilsiktet som en begrensning av oppfinnelsen. Figuren viser det typiske kromatogram for den første kationbytterkromatografi ifølge eksempel 1.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse belyses nærmere ved hjelp av de følgende eksempler.

Eksempel 1

Utgangsmateriale er plasma fra rhesus-negative kvinner eller rhesus-negative menn som lar seg sensibilisere mot rhesusfaktor-D med omhyggelig utvalgte erytrocytter. Hver blodgiver blir testet på fravær av HBs-antigen, HIV- og hepatitt C-antistoffer og forhøyet ALAT-aktivitet. Plasma oppsamlet gjennom plasmaferese nedfryses hver for seg og tines forsiktig ved 0-4 °C og sammenslås før fraksjoneringen. Det isfrie plasma med et anti-D-innhold på 25 ig/ml sentrifugeres i en gjennomstrømningssentrifuge (Cepa, Lahr, Tyskland) ved 2-4 °C (1 l/minutt; 12 000 U/minutt). Supematanten filtreres gjennom et 1,2 im filter ("Opticap", Millipore, Bedford, MA, USA). Virusinaktivering utføres deretter ifølge Horowitz et al.

(Thrombosis and Haemostasis 65,1163,1991) gjennom en løsningsmiddel-detergentbehandling med 1 % "Triton" X-1Q0 (Rohm und Haas, Frankfurt, Tyskland) og 1 % tri-n-butylfosfat (Merck, Darmstadt, Tyskland) i løpet av 4-4,5 time ved 30 °C. Den virusinaktiverte løsning hensettes deretter i 10-18 timer ved 37 °C. Det klare bunnsjikt atskilles og filtreres gjennom et 0,2 im filter (Sealkleen NFP 7002, Pall, Dreieich, Tyskland). 25 1 løsningsmiddel-detergentbehandlet, filtrert plasma fortynnes med en 10 mM natriumfosfatbuffer til ledningsevnen til ekvilibreringsbufferen (50 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,5,3,2 mS/cm), pH innstilles til 5,5, plasmaet filtreres gjennom et 1,2 im filter ("Opticap", Millipore, Bedford, MA, USA) og bindes til "MacroPrep" 50 CM (BioRad, Hercules, CA, USA) i en søyle med en grunnflate på 314 cm<2> og en søylehøyde på 16 cm, med en gjennomstrømningshastighet på

150 cm/time, idet gelen på forhånd er ekvilibrert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,5. Temperaturen holdes ved 20-25 °C. Søylen vaskes deretter med 40 søylevolumer 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, og den anti-D-inneholdende IgG-fraksjon elueres med 25 mM natriumfosfatbuffer + 0,2 M natriumklorid, pH 7,5. Det typiske kromatogram som erholdes gjennom den foreliggende behandling er vist i den medfølgende figur. I diagrammet er den optiske tetthet (OD) ved 280 nm plottet mot tid (t). Det fremgår av diagrammet at mesteparten av de uønskede produkter atskilles under appliseringen og vaskingen, mens ved elueringen fremkommer en smal hovedtopp som inneholder det ønskede anti-D IgG kraftig anriket i en IgG-delfraksjon. Den spesifikke aktivitet dppgår her til mer enn 2 % anti-D IgG pr. gram totalt IgG. Eluatet fortynnes med vann til en ledningsevne på 3,3 mS/cm (1 volumeluat + 5 volumer vann), pH innstilles med 0,2 M NaOH på 7,5 og eluatet adsorberes porsjonsvis i 2,5 time med 100 g tørr DEAE-"Sephadex" A50 (Pharmacia, Uppsala, Sverige). DEAE-gelen ekvilibreres på forhånd med en 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5. Den ubundne anti-D IgG-fraksjon avfiltreres gjennom en polypropylenmembran og pH innstilles på 5,5. DEAE-filtratet blir for oppkonsentreringbundet en andre gang til "MacroPrep" 50 CM (BioRad, Hercules, CA, USA) i en søyle med en grunnflate på

78,5 cm<2> og en søylehøyde på 10 cm, med en gjennomstrømningshastighet på

60 cm/time, idet gelen på forhånd er ekvilibrert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,5. Den anti-D-inneholdende IgG-fraksjon elueres med 25 mM natriumfosfatbuffer + 0,2 M natriumklorid, pH 5,5. CM-gelen regenereres ved hjelp av 1 N NaOH og pyrogenfri vask og kan anvendes på nytt minst 20 ganger; DEAE-gelen kasseres etter én gangs bruk.

Eksempel 2

Utgangsmaterialet er plasma fra rhesus-negative kvinner eller fra rhesus-negative menn som lar seg sensibilisere mot rhesusfaktor D med omhyggelig utvalgte erytrocytter. Hver blodgiver testes på fravær av HBs-antigen, HIV- og hepatitt C-antistoffer og forhøyet ALAT-aktivitet. Plasma oppsamlet gjennom plasmaferese nedfryses enkeltvis og tines forsiktig ved 0-4 °C før fraksjoneringen og sammenslås. Det isfrie plasma sentrifugeres i en gjennomstrømningssentrifuge (Cepa, Lahr, Tyskland) ved 2-4 °C (1 l/minutt; 12 000 U/minutt). Supernatanten filtreres gjennom et 1,2 im filter ("Opticap", Millipore, Bedford, MA, USA). Virusinaktiveringen utføres deretter ifølge Horowitz et al. (Thrombosis and Haemostasis 65,1163,1991) gjennom en løsningsmiddel-detergentbehandling med 1 % "Triton" X-100 (Rohm und Haas, Frankfurt, Tyskland) og 1 % tri-n-butylfosfat (Merck, Darmstadt, Tyskland) i løpet av 4-4,5 time ved 30 °C. Den virusinaktiverte løsning settes deretter til henstand i 10-18 timer ved 37 °C. Det klare bunnsjikt atskilles og filtreres gjennom et 0,2 lm filter (Sealkleen NFP 7002, Pall, Dreieich, Tyskland). 25 1 løsningsmiddel-detergentbehandlet, filtrert plasma fortynnes med en 10 mM natriumfosfatbuffer til ledningsevnen til ekvilibreringsbufferen (50 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,5,3,2 mS/cm), pH innstilles til 5,5, plasmaet filtreres gjennom et 1,2 im filter ("Opticap", Millipore, Bedford, MA, USA) og bindes til "MacroPrep" 50 CM (BioRad, Hercules, CA, USA) i en søyle med grunnflate 314 cm<2> og søylehøyde 16 cm, med en gjennomstrømningshastighet på 150 cm/time, idet gelen på forhånd er ekvilibrert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,5. Temperaturen holdes ved 20-25 °C. Søylen vaskes deretter med 40 søylevolumer 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, og den anti-D-inneholdende IgG-fraksjon elueres med 25 mM natriumfosfatbuffer + 0,2 M natriumklorid, pH 7,5. Eluatet filtreres ved pH 6,6 under tilsetning av 100 mg/ml sakkarose, i en dose på 200 ig anti-D IgG, gjennom et 0,2 im filter ("Millidisk" MCGL-10, Millipore, Bedford, MA, USA) og lyofiliseres deretter.

Eksempel 3

5 ml løsningsmiddel-detergentbehandlet plasma fortynnes til ekvilibreringsbufferens ledningsevne (3,3 mS/cm) og kromatograferes i en søyle med en grunnflate på 2 cm<2> og en søylehøyde på 5 cm, med en

gjennomstrømningshastighet på 30 cm/time, gjennom "DEAE-Sephadex" A50

(Pharmacia, Uppsala, Sverige). Gelen ekvilibreres på forhånd med en 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5. Temperaturen holdes ved 20-25 °C. Den ubundne IgG-fraksjon blir for videre rensing innstilt med 0,2 M HC1 til pH 5,5 og en ledningsevne på 3,2 mS/cm, og bundet til "MacroPrep" 50 CM (BioRad, Hercules, CA, USA) i en søyle med en grunnflate på 0,8 cm<2> og en søylehøyde på 6,5 cm, med en gjennomstrømningshastighet på 230 cm/time, idet gelen på forhånd er ekvilibrert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,5. Den anti-D-inneholdende IgG-fraksjon elueres med 25 mM natriumfosfatbuffer + 0,2 M natriumklorid, pH 5,5, og utformes til sluttproduktet. "DEAE-Sephadex" A50-gelen kasseres etter én gangs bruk; "MacroPrep" 50 CM-gelen regenereres ved hjelp av 1 N NaOH og vaskes pyrogenfritt og kan anvendes videre minst 20 ganger.

Eksempel 4

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 til 3 gjentas, hvorved det som utgangsmateriale i stedet for plasma anvendes en immunglobulininneholdende plasmafraksjon som er fremstilt fra en tilsvarende mengde utgangsplasma, hvori fraksjon I+II+III eller fraksjon II+III ifølge Cohn (Cohn, E.J. et al., J. Am. Chem. Soc. 68,459, 1949) eller bunnfall A eller gammaglobulinbunnfall ifølge Kistler og Nitschmann (Kistler, P. og Nitschmann, H. Vox Sang, 7, 424, 1962) isoleres og løses i ekvilibreringsbuffer til 30 g/l protein, hvorved det oppnås analoge resultater.

Eksempel 5

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 til 4 gjentas, hvorved den anti-D-inneholdende IgG-fraksjon, i stedet for med 25 mM natriumfosfatbuffer + 0,2 M natriumklorid, pH 7,5, alternativt elueres med 0,1 M glysin + 0,5 M natriumklorid, pH 9, eller generelt ved pH-forskyvning og/eller forandring av ionestyrken og/eller andre forandringer av buffersammensetningen, gjennom "MacroPrep" 50 Cm gel (BioRad, Hercules, CA, USA) hvorved det erholdes analoge resultater.

Eksempel 6

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 og 2 gjentas, hvorved "MacroPrep" 50 CM gel (BioRad, Hercules, CA, USA) vaskes med 10 mM glysin, pH 9, i stedet for med 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, hvorved det oppnås analoge resultater..

Eksempel 7

Det konsentrerte anti-D-eluat erholdt ifølge eksempel 1 innstilles som og fylles sterilt etter filtrering gjennom et 0,2 im filter ("Millipak"-20, Millipore, Bedford, MA, USA) i Hypac ferdigsprøyter av glass (Vetter, Ravensburg, Tyskland).

Eksempel 8

DEAE-filtratet ifølge eksempel 1 behandles ved en pH på 5,5 med 0,2 g aluminiumhydroksidgel pr. g protein i 30 minutter ved 20-25 °C, og opparbeides deretter videre ifølge eksempel 1.

Eksempel 9

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 til 6 gjentas, hvorved det i stedet for "MacroPrep" 50 CM alternativt anvendes én av de følgende geler med den samme funksjonelle gruppe: "CM-Spherodex" (Sepracor IBF, Villeneuve la Garenne, Frankrike), "CM-Trisacryl" (Sephracor IBF, Villenevue la Garenne, Frankrike), "CM-Sepharose" FF (Pharmacia, Uppsala, Sverige) eller "Fractogel" TSK CM-650 (Merck, Darmstadt, Tyskland), hvorved det oppnås analoge resultater.

Eksempel 10

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1, så vel som 3 til 6, gjentas, hvorved det i stedet for "DEAE-Sephadex" A50 alternativt anvendes "MacroPrep" DEAE (BioRad", Hercules, CA, USA), hvorved analoge resultater oppnås.

De kromatografiske fremgangsmåtetrinn i de ovennevnte eksempler 1 til 6 kan valgfritt gjennomføres som sats-, søyle- eller membrankromatograferinger, hvorved det oppnås analoge resultater

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et anti-D-immunglobulin G-preparat med en spesifikk aktivitet høyere enn 1 % anti-D IgG pr. g totalt IgG, fra humant plasma, karakterisert ved at plasma fra rhesus-negativt blod fra rhesusfaktor D-sensibiliserte mannlige og kvinnelige blodgivere, eller en anti-D IgG-inneholdende plasmafraksjon, A) ved en pH-verdi i området pH 3,5 til 6,5 og en ledningsevneverdi i området 2 til 4 mS/cm, underkastes en ionebytterkromatografi med en adsorbent som inneholder karboksymetylgrupper som funksjonelle grupper, idet anti-D IgG er bundet til adsorbenten, B) adsorbenten med det bundne anti-D IgG vaskes først med en vaskeløsning ved en pH-verdi i området 5 til 8 og en ledningsevneverdi i området 2 til 4 mS/cm, etterfulgt av at anti-D IgG elueres, etterfulgt av at C) det eluerte anti-D IgG behandles ved en pH-verdi i området 6 til 8 og en ledningsevneverdi i området 2 til 4 mS/cm med en basisk adsorbent med ionebytteregenskaper for å binde uønskede komponenter, etterfulgt av at anti-D IgG til sist konsentreres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at anti-D IgG konsentreres i trinn C), idet trinnene A) og B) minst gjentas én gang.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som utgangsmateriale anvendes plasma som på forhånd behandles med en basisk adsorbent med ionebytteregenskaper for å binde uønskede komponenter.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at proteaseinnholdet i plasma eller plasmafraksjonen reduseres ved inkubasjon med en adsorbent, slik som aluminiumhydroksidgel.

5. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 4, karakterisert ved at alle ionebytterkromatografitrinn og eventuelt ytterligere adsorpsjonstrinn valgfritt gjennomføres som sats-, søyle- eller membrankromatograferinger.

6. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den basiske adsorbent i trinn C) inneholder dietylaminoetylgrupper som funksjonelle grupper.

7. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 6, karakterisert ved at elueringen i trinn B) gjennomføres under pH-forskyvning og/eller forandring av buffersammensetningen, f.eks. gjennom forandring av deres ionestyrke, henholdsvis ledningsevne.

8. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 7, karakterisert ved at den omfatter minst ett virusinaktiveringstrinn.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved atvirusinaktiverings- trinnet omfatter en behandling av plasma eller den anti-D IgG-inneholdende fraksjon med en detergent og tri-n-butylfosfat, hvorved fasen inneholdende blandingen av løsningsmiddel og detergent atskilles og det klare bunnsjikt anvendes.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at virusinaktiveringstrinnet er en varmebehandling.

11. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1 til 10, karakterisert ved at utgangsplasmaet eller utgangsplasmafraksjonen før ionebytterkromatografitrinnet i trinn A) underkastes minst ett av de etterfølgende trinn: a) nedfrysing av plasma, hvorved etter opptining og før videre anvendelse kryobunnfallet fjernes ved filtrering og/eller sentrifugering, b) behandling med en løsningsmiddel-detergentblanding, inkubasjon ved 37 °C og faseatskillelse.

12. Farmasøytisk preparat, fremstilt ved fremgangsmåten ifølge ett av kravene 1 til 11, karakterisert ved at det inneholder farmasøytisk akseptable bærer- og tilsetningsstoffer.

13. Farmasøytisk preparat ifølge krav 12, karakterisert ved at det inneholder 20-200 ig/ml anti-D IgG og mindre enn 5 ig/ml IgA, idet det samlede proteininnhold høyst er 10 %, pH-verdien er mellom 5,0 og 7,5, fortrinnsvis mellom 5,0 og 5,5, og den lett hypertoniske osmolaritet innstilles ved hjelp av en kombinasjon av glysin eller sukker og NaCl.