NO311643B1 - <alfa>-substituerte arylsulfonamidohydroksamsyrer som TNF- <alfa>-og matrisemetalloproteinase-inhibitorer, farmasöytiskpreparat inneholdende slike forbindelser, deres anvendelse, ogfremgangsmåte for deres fremstilling - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører alfa-substituerte arylsulfonamidohydroksamsyrer og deres anvendelse som TNF-alfa- og matxisemetalloproteinase-inhibitorer.

Arylsulfonamido-substituerte hydroksamsyrer og deres anvendelse som inhibitorer av matrisenedbrytende metalloproteinaseenzymer er beskrevet i EP-patent 0606046 Bl.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt foretrede cykloheksyl- og arylsulfonamido-substituerte hydroksamsyrer, som er kjennetegnet ved at de har formel I:

Ar pyridyl;

Ri representerer laverealkyl, cykloalkyl, fenyl-Ci-C6-alkyl, naftyl-Ci-C6-alkyl, laverealkoksylaverealkyl, eller halogenlaverealkyl;

R2 representerer hydrogen eller laverealkyl;

R3 og R4 representerer uavhengig hydrogen eller laverealkoksy;

n representerer et helt tall fra 1 til 4;

betegnelsen "lavere" definerer et organisk radikal eller forbindelse som forgrenet eller uforgrenet med opptil og innbefattende 7 karbonatomer;

et farmasøytisk akseptabelt prodrug-derivat derav hvor CONHOH-gruppen er derivatisert i form av et O-acylderivat avledet fra en organisk karbonsyre, en organisk karboksylsyre eller en karbaminsyre, eller i form av et eventuelt substituert O-benzylderivat; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for fremstilling av disse forbindelsene, farmasøytiske preparater omfattende forbindelsene, anvendelsen av forbindelsene for terapeutisk behandling av det menneskelige eller animalske legemet eller for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

Oppfinnelsen tilveiebringer således også et farmasøytisk preparat, som er kjennetegnet ved at det innbefatter en effektiv TNF-alfa-konvertaseinhiberende mengde av en forbindelse ifølge hvilket som helst av de medfølgende krav 1-11 i kombinasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av de medfølgende krav 1-11 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av TNF-alfa-avhengige eller matrisenedbrytende metalloproteaseavhengige tilstander.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er, avhengig av substituentenes beskaffenhet, i besittelse av et eller flere asymmetriske karbonatomer. Cykloheksansubstituentene er enten cis eller trans til hverandre. De resulterende diastereoisomerene, enantiomerene og geometriske isomerene omfattes av foreliggende oppfinnelse.

Foretrukne er de forbindelser ifølge oppfinnelsen hvor konfigurasjonen for det asymmetriske karbonatomet i a-aminohydroksamsyre-gruppedelen hvor til cykloheksanringen er festet, tilsvarer den til en D-aminosyre-forløper og er tildelt (R)-konfigurasjonen.

Farmasøytisk akseptable prodrug-derivater er de som ved solvolyse eller under fysiologiske betingelser kan omdannes til de foreliggende hydroksamsyrene og representerer slike hydroksamsyrer hvor CONHOH-gruppen er derivatisert i fonn av et O-acylderivat eller et eventuelt O-benzylderivat. Foretrukket er de eventuelt substituerte O-benzylderivatene.

Prodrug-acylderivater er de som er avledet fra en organisk karbonsyre, en organisk karboksylsyre eller en karbaminsyre.

Et acylderivat som er avledet fra en organisk karboksylsyre er f.eks. laverealkanoyl, fenyllaverealkanoyl eller usubstituert eller substituert aroyl, slik som benzoyl.

Et acylderivat som er avledet fra en organisk karbonsyre er f.eks. alkoksykarbonyl, spesielt laverealkoksykarbonyl, som er usubstituert eller substituert med karbocyklisk eller heterocyklisk aryl eller er cykloalkoksykarbonyl, spesielt C3.C7-cykloalkyloksy-karbonyl, som er usubstituert eller substituert med laverealkyl.

Et acylderivat som er avledet fra en karbaminsyre er f.eks. aminokarbonyl som er substituert med laverealkyl, karbocyklisk eller heterocyklisk aryllaverealkyl, karbocyklisk eller heterocyklisk aryl, laverealkylen eller laverealkylen avbrutt av O eller S.

Eventuelt substituerte O-benzyl-prodrug-derivater er fortrinnsvis benzyl eller benzyl som er mono-, di- eller trisubstituert med f.eks. laverealkyl, laverealkoksy, amino, nitro, halogen og/eller trifluormetyl.

Farmasøytisk akseptable salter av de sure forbindelsene ifølge oppfinnelsen er salter dannet med baser, nemlig kanoniske salter slik som alkali- og jordalkalimetallsalter, slik som natrium-, litium-, kalium-, kalsium-, magnesium- samt ammoniumsalter, slik som ammonium-, trimetylammonium-, dietylammonium- og tris-(hydroksymetyl)metyl-ammoniumsalter.

Syreaddisjonssalter slik som mineralsyrer, organiske karboksylsyre og organiske sulfonsyrer f.eks. saltsyre, metansulfonsyre, maleinsyre, tilveiebringes også eventuelt av en basisk gruppe slik som pyridyl, og utgjør likeledes en del av strukturen.

De generelle definisjoner som er benyttet i foreliggende sammenheng har følgende betydninger innenfor oppfinnelsens omfang, med mindre annet er angitt.

Betegnelsen "lavere" som referert til det ovenstående og i de følgende i forbindelse med henholdsvis organiske radikaler eller forbindelser, definerer slike som er forgrenet eller ikke-forgrenet med opptil og innbefattende 7, fortrinnsvis opptil og innbefattende 4, og fordelaktig 1 eller 2 karbonatomer.

En laverealkylgruppe er forgrenet eller ikke-forgrenet og inneholder fra 1 til 7 karbonatomer, fortrinnsvis 1-4 karbonatomer, og representerer f.eks. metyl, etyl, propyl, butyl, isopropyl eller isobutyl.

En laverealkoksy (eller alkyloksy)gruppe inneholder fortrinnsvis 1-4 karbonatomer og representerer f.eks. metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, butoksy eller isobutoksy.

Halogen representerer fortrinnsvis klor eller fluor, men kan også være brom eller iod.

Fenyl og naftyl er aktuelle karbocykliske arylgrupper.

Fenyl- eller naftyllaverealkyl representerer fortrinnsvis rett eller forgrenet fenyl- eller naftyl-Ci-C4-alkyl, f.eks benzyl eller fenyl-(etyl, propyl eller butyl).

Acyl er avledet fira en organisk karboksylsyre, karbonsyre eller karbaminsyre.

Acyl representerer f.eks. laverealkanoyl, karbocyklisk aryllaverealkanoyl, laverealkoksykarbonyl, aroyl, dilaverealkylaminokarbonyl eller dilaverealkylaminolaverealkanoyl. Acyl er fortrinnsvis laveralkanoyl.

Laverealkanoyl representerer f.eks. Ci-C7-alkanoyl, inkludert formyl og er fortrinnsvis C2-C4-alkanoyl slik som acetyl eller propionyl.

Aroyl representerer f.eks. benzoyl eller benzoyl som er mono- eller disubstituert med et eller to radikaler valgt fra laverealkyl, laverealkoksy, halogen, cyano og trifluormetyl; eller 1- eller 2-naftoyl; og også f.eks. pyridylkarbonyl.

Laverealkoksykarbonyl representerer fortrinnsvis d-C4-alkoksykarbonyl, f.eks. etoksy-karbonyl.

Laverealkylen representerer enten rett eller forgrenet alkylen med 1-7 karbonatomer og representerer fortrinnsvis rettkjedet alkylen med 1-4 karbonatomer, f.eks. en metylen-, etylen-, propylen- eller butylenkjede, eller nevnte metylen-, etylen-, propylen- eller butylenkjede monosubstituert med Ci-C3-alkyl (fordelaktig metyl) eller disubstituert på samme eller forskjellige karbonatomer med Ci-C3-alkyl (fordelaktig metyl), idet det totale antall karbonatomer er opptil og innbefattende 7.

Laverealkylendioksy er fortrinnsvis etylendioksy eller metylendioksy.

Forestret karboksyl er f.eks. laverealkoksykarbonyl eller benzyloksykarbonyl.

Amidert karboksyl er f.eks. aminokarbonyl, mono- eller di-laverealkylaminokarbonyl.

En spesiell utførelse av oppfinnelsen består av forbindelsene av formel I hvor det asymmetriske karbonatomet er a-aminohydroksamsyre-gruppedelen har (R)-konfigurasjonen, nemlig forbindelser av formel II.

hvor Ar, Ri, R2, R3 og R4 har de ovenfor angitte betydninger, farmasøytisk akseptable prodrugs derav hvor CONHOH-gruppen er derivatisert i form av et O-acylderivat avledet fra en organisk karbonsyre, en organisk karboksylsyre eller en karbaminsyre, eller i form av et eventuelt substituert O-benzylderivat; og farmasøytisk akseptable salter derav.

Ytterligere foretrukket er nevnte forbindelser av formel II hvor Ar er heterocyklisk aryl som definert ovenfor; Ri er laverealkyl; R2 er hydrogen; R3 er para-laverealkoksy; R4 er hydrogen; og n er 1 eller 2; og farmasøytisk akseptable salter derav.

Særlig foretrukket er forbindelser av formel II hvor Ar er pyridyl, spesielt 3- eller 4-pyridyl; Ri er laverealkyl, spesielt rettkjedet C2-C5-alkyl, R2 og R4 er hydrogen, R3 er para-laverealkoksy, og n er 1; og farmasøytisk akseptable salter derav.

Ytterligere foretrukket er nevnte forbindelser hvor Ar er 4-pyridyl; Ri er C2-C4-alkyl; R2 og R4 er hydrogen; R3 er para-etoksy; og n er 1; og farmasøytisk akseptable salter derav.

Spesielt skal nevnes følgende undergruppe av en gruppe av forbindelser ifølge oppfinnelsen: forbindelser (av formel I eller n, respektivt) hvor Ri er C2-C7-alkyl.

Oppfinnelsen angår spesielt de spesifikke forbindelsene som er beskrevet i eksemplene, farmasøytisk akseptable prodrug-derivater derav, som definert ovenfor, og farmasøytisk akseptable salter derav, og særlig de spesifikke forbindelsene som er beskrevet i eksemplene og farmasøytisk akseptable salter derav, og i de medfølgende krav 8-11.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen utviser verdifulle farmakologiske egenskaper i pattedyr og menneske.

For det første er de inhibitorer av TNF-ct-omdannende enzym (TNF-oc-konvertase) og inhiberer således TNF-a-aktivitet, f.eks. undertrykker produksjonen og/eller frigjøringen av TNF-oc, en viktig mediator av inflammasjon og vewekst. Slike egenskaper gjør foreliggende forbindelser primært nyttige for behandling av tumorer (maligne og ikke-maligne neoplasmer) samt av inflammatoriske tilstander i pattedyr, f.eks. for behandlingen av artritt (slik som reumatoid artritt), septisk sjokk, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og lignende.

Videre inhiberer foreliggende oppfinnelse også matrise-nedbrytende metalloproteinaseenzymer slik som gelatinase, stromelysin, kollagenase og makrofag-metalloelastase. Foreliggende forbindelser inhiberer således matrise-nedbrytning og er også nyttige for behandling av gelatinase-, stromelysin-, kollagenase- og makrofag-metalloelastase-avhengige patologiske tilstander i pattedyr. Slike tilstander inkluderer tumorer (ved inhibering av tumorvekst, tumormetastase, tumorprogresjon eller -invasjon og/eller tumorangiogenese), hvor slike tumorer er f.eks. bryst-, lunge-, blære-, colon-, ovarie- og hudkreft. Andre tilstander som kan behandles med foreliggende forbindelser inkluderer osteoartritt, bronkiale forstyrrelser (slik som astma ved inhibering av nedbrytningen av elastin), aterosklerotiske tilstander (ved f.eks. inhibering av brudd i aterosklerotiske plakk), samt akutt koronarsyndrom, hjerteanfall (hjerteischemi), slag (cerebrale ischemier) og restenose etter angioplastikk.

Andre tilstander som kan behandles med foreliggende forbindelser er inflammatoriske demyeliniserende forstyrrelser i nervesystemet hvor myelin-ødeleggelse eller -tap eller involvert (slik som multippel sklerose), optisk neuritt, neuromyelitis optika (Devics sykdom), diffus og transitional sklerose (Schilders sykdom) og akutt disseminert encefalomyelitt, også demyeliniserende perifere neuropatier slik som Landry-Guillain-Barre-Strohl-syndrom for motoriske defekter; også vevulcerasjon (f.eks. epidermal og gastrisk ulcerasjon), abnormal sårheling, periodontal sykdom, bensykdom (f.eks. Pagets sykdom og osteoporose).

Okulare anvendelser av foreliggende forbindelser inkluderer behandlingen av okular inflammasjon, korneale ulcerasjoner, pterygium, keratitt, keratoconus, åpenvinkel-glaukom, retinopatier, og også deres anvendelse i forbindelse med refraktiv kirurgi (laser eller incisjonal) for å minimalisere skadelige effekter.

Forbindelsene er særlig nyttige for behandling av inflammatoriske tilstander slik som reumatoid artritt og av tumorer.

Nyttige effekter er evaluert i farmakologiske tester som er generelt kjente innen teknikken, og som illustrert heri.

De ovenfor angitte egenskaper kan demonstreres i in vitro- og in vivo-tester ved bruk av fordelaktige pattedyr, f.eks. rotter, marsvin, hunder, kaniner, eller isolerte organer og vev, samt pattedyrenzympreparater. Nevnte forbindelser kan påføres in vitro i form av oppløsninger, f.eks. vandige oppløsninger, og in vivo enten enteralt eller parenteralt, fordelaktig oralt, f.eks. som en suspensjon eller i vandig oppløsning. Dosen in vitro kan variere mellom IO"<5> molar- og IO'<10> molar-konsentrasjoner. Dosen in vivo kan, avhengig av administrasjonsveien, variere mellom 0,1 og 100 mg/kg.

Inhiberingen av produksjonen av utskillelsen av TNF-oc (ved inhibering av TNF-ct-konvertase) kan bestemmes f.eks. som beskrevet i Nature, 370, 555, 558 (1994).

Effekten på produksjonen av oppløselig TNF-a av LPS-stimulerte THP-1-celler kan bestemmes som følger: Benyttet vevkulturmedium er RPM 1640 (Gibco kat. # 11875-036) inneholdende 10% føtalkalveserum, 1% penicillin og streptomycin. THP-1-celler (ATCC # 202-TIB) ved 1 x 10+5 celler/brønn tilsettes til 100 ul medium eller testforbindelse. Celler pre-inkuberes med forbindelse i 30 minutter i et 37°C fuktet kammer med 5% CO2 og stimuleres deretter med 100 ng/ml LPS (Sigma kat # L-4391) i 4 timer. Plater blir deretter sentrifugert og 100 ul kondisjonert medium for TNF-analyse innhøstes. Mengden av TNF-a i kontroll- og testkulturer bestemmes ved ELISA ved bruk av rekombinant TNF-a for standardkurven, ved anvendelse av TNF ELISA-plater (Genzyme) for TNF-analyse. Absorbansavlesninger og databeregninger utføres på en Molecular Devices-plateleser. Resultater er uttrykt i ICso-verdier for testforbindelse.

Effekten på plasmakonsentrasjon av TNF-a i mus etter intravenøs injeksjon av endo-toksin kan bestemmes som følger: Balb-CbyJ-hunnmus doseres ved gavage med testforbindelse i 0,1 ml maisstivelsevehikkel/10 g kroppsvekt. 1 til 4 timer etter administrasjon av testforbindelse blir 0,1 mg/kg lipopolysakkarid fra E. coli 0127:B8 (Dicfo # 3880-25-0) i saltoppløsning injisert i.v. En time etter i.v.-injeksjon av LPS oppsamles blod for bestemmelse av plasma TNF a ved bruk av TNF-a ELISA-kit (Genzyme). 8 mus benyttes pr. behandlingsgruppe. Resultater er uttrykt som % inhibering av gjennomsnittlig TNF-a-konsentrasjon i kontrollmus.

Effekten på synovialfluidkonsentrasjonen av TNF-a i et inflammert rottekne kan bestemmes som følger: Lewis-hunnrotter doseres ved gavage med testforbindelse i 0,1 ml maisstivelsevehikkel. 1 til 4 timer etter administrasjon av testforbindelse blir lipopolysakkarid fra E. coli 0127:B8 (Difco # 3880-25-0) injisert i begge knær. 2 timer etter intra-artikulær LPS-injeksjon skylles knær med 0,1 ml saltoppløsning og 2 skyllinger fra samme rotte kombineres. TNF-a måles ved bruk av mus-TNF-a ELISA-kitt (Genzyme) som kryss-reagerer med rotte-TNF-a. Resultater er uttrykt som % inhibering av gjennomsnittlig TNF-a-konsentrasjon i synovialfluid fra saltoppløsnings-injiserte knær.

Antiinflammatorisk aktivitet kan bestemmes i standard inflammasjons- og artritikk-dyremodeller som er velkjent innen teknikken, f.eks. adjuvans artrititt modellen i rotter og den kollagen-n-induserte artrittmodellen i mus [Mediators of Inflam., \, 273-279

(1992)].

En test for å bestemme inhiberingen av stromelysinaktivitet er basert på dens hydrolyse av Substans P ved bruk av en modifisert prosedyre ifølge Harrison et al. (Harrison, R.A. Teahan J. og Stein R., A semicontinuous, high performance chromatography based assay for stromelysin, Anal. Biochem., 180, 110-113 (1989)). I denne analysen blir Substans P hydrolysert av rekombinant human-stromelysin for å utvikle et fragment, Substans P 7-11, som kan kvantifiseres ved HPLC. I en typisk analyse blir en 10 mM forrådsoppløsning av en forbindelse som skal testes fortynnet i analysebufferen til 50 uM, blandet 1:1 med 8 ug rekombinant human-stromelysin (mol.vekt 45-47 kDa, 2 enheter; hvor 1 enhet produserer 20 mmol Substans P 7-11 i løpet av 30 minutter) og inkubert sammen med 0,5 mM Substans P i et sluttvolum på 0,125 ml i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 10 mM EDTA og Substans P 7-11 kvantifiseres på RP-8 HPLC. ICso-verdien for inhiberingen av stromelysinaktivitet og Ki beregnes fra kontrollreaksjon uten inhibitoren.

Stromelysinaktivitet kan også bestemmes ved anvendelse av aggrecan som et substrat. Denne analysen gir anledning til bekreftelse in vitro at en forbindelse kan. inhibere virkningen av stromelysin på dens sterkt negativt ladede, naturlige substrat, aggrecan (store aggregerende proteoglycan). I brusk eksisterer proteoglycan som et aggregat bundet til hyaluronat. Human-proteoglycan aggregert til hyaluronat benyttes som et enzymsubstrat. Analysen arrangeres i 96-brønners mikrotiterplater hvilket gir anledning for hurtig evaluering av forbindelser. Analysen har tre hovedtrinn: 1) Plater belegges med hyaluronat (human-navlestreng, 400 ug/ml), blokkert med BSA (5 mg/ml), og deretter bindes proteoglycan (human-artikulær brusk Dl - kondroitinase ABC-nedbrutt, 2 mg/ml) til hyaluronatet. Plater vaskes mellom hvert trinn. 2) Buffere + inhibitor (1 til 5000 nM) + rekombinant human-stromelysin (1-3 enheter/brønn) tilsettes til brønner. Platene forsegles med tape og inkuberes natten over ved 37°C. Platene blir deretter vasket. 3) Et primært (3B3) antistoff (muse-IgM, 1:10.000) benyttes for å detektere gjenværende fragmenter. Et sekundært antistoff, peroksydase-bundet anti-IgM, bindes til det primære antistoffet. OPD tilsettes deretter som et substrat for peroksydasen

og reaksjonen stoppes med svovelsyre. ICso-verdien for inhibering av stromelysinaktivitet utledes grafisk og Ki beregnes.

Kollagenaseaktivitet bestemmes som følger: 96-brønners, flatbunnede mikrotiterplater belegges først med type I-bovinkollagen (35 ug/brønn) i løpet av en to-dagersperiode ved 30°C ved anvendelse av en fuktet og deretter tørr atmosfære; plater skylles, luft-tørkes i 3-4 timer, forsegles med Saran-omhylling og lagres i et kjøleskap. Human, rekombinant fibroblatkollagenase og en testforbindelse (eller buffer) tilsettes til brønner (totalvolum = 0,1 ml) og plater inkuberes i 2 timer ved 35°C under fuktige betingelser; mengden av kollagenase som benyttes pr. brønn er den som forårsaker ca. 80% av maksimal nedbrytning av kollagen. Inkubasjonsmediene fjernes fra brønnene, som deretter skylles med buffer, fulgt av vann. "Coomasie"-blåfarge tilsettes til brønnene i 25 minutter, fjernes, og brønner skylles på nytt med vann. Natriumdodecylsulfat (20% i 50% dimetylformamid i vann) tilsettes for å oppløseliggjøre det gjenværende, fargede kollagen og den optiske densiteten ved 570 nM bølgelengde måles. Nedgangen i optisk densitet på grunn av kollagenase (fra den til kollagen uten enzym) sammenlignes med nedgangen i optisk densitet som skyldes enzymet i nærvær av testforbindelse, og prosent inhibering av enzymaktivitet beregnes. ICso-verdier bestemmes fra et område av konsentrasjoner av inhibitorer (4-5 konsentrasjoner, hver testet i triplikat), og K-verdier beregnes.

Effekten av forbindelser ifølge oppfinnelsen in vivo kan bestemmes i kaniner. Typisk blir 4 kaniner dosert oralt med en forbindelse opptil 4 timer før intra-artikulær injeksjon i begge knær (N=8) av 40 enheter rekombinant human-stromelysin oppløst i 20 mM Tris, 10 mM CaCh og 0,15M NaCl ved pH 7,5. 2 timer senere avlives kaninene, synovial-skyllevæske oppsamles og keratansulfat (KS)- og sulfatert glykosaminoglycan (S-GAG)-fragmenter som er frigjort i leddet, kvantifiseres. Keratansulfat måles ved en inhiberings-ELISA ved bruk av metoden til Thonar (Thonar, E.J.-M.A., Lenz, M.E., Klinsworth, G.K., Caterson, B., Pachman, L.M., Glickman, P., Katz, R., Huff, J., Keuttner, K.E., Quantitation of keratan sulfate in blood as a marker of cartilage catabolism, Arthr. Rheum., 28, 1367-1376 (1985)). Sulfatert glykosaminoglycaner måles ved først å nedbryte synovial-skyllevæsken med streptomyceshyaluronidase og deretter måling av DMB-fargestoffbinding ved anvendelse av metoden til Goldberg (Goldberg, R.L. og Kolibas, L., An improved method for determining proteoglycan synthesized by chondrocytes in culture. Connect. Tiss. Res., 24, 275-275 (1990)). For et i.v.-studium oppløseliggjøres forbindelsen i 1 ml PEG-400, og et p.o.-studium administreres en forbindelse i 5 ml berike maisstivelse pr. kg kroppsvekt.

Effekten av beskyttelse mot brusknedbrytning ved artritiske forstyrrelser kan bestemmes f.eks. i en kirurgisk modell av osteoartritt beskrevet i Artrhritis and Rheumatism, vol. 26, 875-886 (1983).

Effekten på ulcerasjoner, f.eks. okulare ulcerasjoner, kan bestemmes i kanin ved måling av reduksjonen av korneal ulcerasjon etter alkaliforbrenning i cornea.

Makrofag-metalloelastase (MME)-inhiberende aktivitet kan bestemmes ved måling av inhiberingen av nedbrytningen av [<3>H]-elastin av trunkert rekombinant muse-makrofag-metalloelastase som følger: Omkring 2 ng av rekombinant, trunkert muse-makrofag-metalloelastse (FASEB Journal, vol. 8, A151, 1994), renset ved Q-Sepharose-kolonnekromatografi, inkuberes med testforbindelser ved de ønskede konsentrasjoner i nærvær av 5 nM CaCh, 400 nM NaCl, [<3>H]elastin (60.000 cpm/rør), og 20 mM Tris, pH 8,0, ved 37°C natten over. Prøvene sentrifugeres i en microfuge-sentrifuge ved 12.000 omdr./min. i 15 minutter. En alikvot av supernatanten telles i en scintillasjonsteller for å kvantifisere nedbrutt

[<3>H]elastin. ICso-verdier bestemmes fra et område av konsentrasjoner av testforbin-delsene og den prosentvise inhibering av enzymaktivitet oppnås.

Effekten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen når det gjelder behandling av emfysem kan bestemmes i dyremodeller beskrevet i American Review of Respiratory Disease, 117.1109(1978).

Antitumoreffekten til foreliggende forbindelser kan bestemmes f.eks. ved måling av veksten av humane tumorer implantert subkutant i Balb/c-nakne, behandlede mus ifølge den metodikk som er kjent innen teknikken sammenlignet med placebo-behandlede mus. Illustrative tumorer er f.eks. østrogen-avhengig human-brystkarsinom BT20 og MCF7, human-blærekarsinom T24, human-colonkarsinom Colo 205, human-lunge-adenokarsinom A549 og human-ovairekarsinom NIH-OVCAR3.

Effekten på tumorangiogenese kan bestemmes f.eks. i rotter implantert med Walker 256 karsinom i pellets for å stimulere angiogenese fra blodkar i limbus, som beskrevet av Galardy et al., Cancer Res., 54,4715 (1994).

Effekten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen på aterosklerotiske tilstander kan evalueres ved anvendelse av aterosklerose plakk fra kolesterol-forede kaniner som inneholder aktivert matrise-metalloproteinaser som beskrevet av Sukhova et al., Circulation, 90,1404 (1994). Den inhiberende effekten på matrise-metalloproteinase-enzymaktivitet i kanin-aterosklerostiske plakk kan bestemmes ved in situ zymografi, som beskrevet av Galis et al., J. Clin. Invest., 94,2493 (1994), og er betegnende for plakkstabilisering.

Effekten på restenose og vaskulær remodellering kan evalueres i den ballong-oppblåste karotidarteiremodellen i rotte.

Effekten på demyeliniserende forstyrrelser i nervesystemet, slik som multippel sklerose, kan evalueres ved måling av reverseringen av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt i mus, f.eks. som beskrevet av Gijbels et al., J. Clin. Invest., 94, 2177 (1994).

Som inhibitorer av TNF-a-konvertase og matrise-metalloproteinaser er foreliggende forbindelser spesielt nyttige i pattedyr som antiinflammatoriske midler for behandling av f.eks. osteoartritt, reumatoid artritt, og som antitumormidler for behandling og forebyggelse av tumorvekst, tumormetastase, tumorinvasjon eller -progresjon.

Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsene av formel, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved kondensering av en karboksylsyre av formel IV

eller et reaktivt funksjonelt derivat derav, hvor Ar, n og R1-R4 har de ovenfor angitte betydninger, med hydroksylamin av formel V,

eventuelt i beskyttet form, eller et salt derav;

og, om nødvendig, midlertidig beskyttelse av en eventuell forstyrrende reaktiv gruppe(r), og deretter frigjøring av den resulterende forbindelsen ifølge oppfinnelsen; og, om nødvendig eller ønsket, omdannelse av en resulterende forbindelse ifølge oppfinnelsen til en annen forbindelse ifølge oppfinnelsen, og/eller, om ønsket, omdannelse av den resulterende frie forbindelsen til et salt eller et resulterende salt til en fri forbindelse eller til et annet salt; og/eller separering av en oppnådd blanding av isomerer eller racemater i enkeltisomerene eller -racematene; og/eller, om ønsket, spalting av et racemat i de optiske antipodene.

I utgangsforbindelser og mellomprodukter som omdannes til forbindelsene ifølge oppfinnelsen på en måte som heri beskrevet, blir tilstedeværende funksjonelle grupper slik som amino-, karboksyl- og hydroksygrupper, eventuelt beskyttet ved hjelp av konvensjonelle beskyttelsesgrupper som er vanlige i preparativ organisk kjemi. Beskyttede amino-, karboksyl- og hydroksygrupper er de som kan omdannes under milde betingelser til frie amino- og hydroksygrupper uten at den molekylære struktur ødelegges eller uten at andre uønskede sidereaksjoner finner sted.

Formålet med innføring av beskyttelsesgrupper er for å beskytte de funksjonelle gruppene overfor uønskede reaksjoner med reaksjonskomponenter under de betingelser som benyttes for utførelse av en ønsket kjemisk omdannelse. Behovet for og valget av beskyttelsesgrupper for en spesiell reaksjon er kjent for fagfolk innen teknikken og avhenger av typen av den funksjonelle gruppen som skal beskyttes (hydroksygruppe, aminogruppe, osv.), strukturen og stabiliteten til molekylet i hvilken substituenten er en del og reaksjonsbetingelsene.

Velkjente beskyttelsesgrupper som tilfredsstiller disse betingelsene og deres innføring og fjerning er beskrevet f.eks. i J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London, New York, 1973, T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, 1991.

I de heri angitte fremgangsmåter representerer reaktive funksjonelle derivater av karboksylsyrer f.eks. anhydrider, spesielt blandede anhydrider, syrehalogenider, syre-azider, laverealkylestere og aktiverte estere derav. Blandede anhydrider er fortrinnsvis slike fra pivalinsyre, eller en laverealkyl (etyl, isobutyl) hemiester av karbonsyre; syrehalogenider er f.eks. klorider eller bromider; aktiverte estere f.eks. succinimido-, ftalimido- eller 4-nitrofenylestere; laverealkylestere er f.eks. metyl- eller etylestrene.

Videre, et reaktivt forestret derivat av en alkohol i hvilke som helst av de heri angitte reaksjoner representerer nevnte alkohol forestret med en sterk syre, spesielt en sterk uorganisk syre slik som en hydrohalogensyre, spesielt saltsyre, hydrobromsyre eller hydroiodsyre, eller svovelsyre, eller med en sterk organisk syre, spesielt en sterk organisk sulfonsyre slik som en alifatisk eller aromatisk sulfonsyre, f.eks. metansulfonsyre, 4-metylbenzensulfonsyre eller 4-brombenzensulfonsyre. Et reaktivt forestret derivat er spesielt halogen, f.eks. klor, brom eller iod, eller alifatisk eller aromatisk substituert sulfonyloksy, f.eks. metansulfonyloksy, 4-metylbenzensulfonyloksy (tosyloksy) eller trifluormetansulfonyloksy.

Fremgangsmåten ovenfor for syntese av forbindelser ifølge oppfinnelsen kan utføres ifølge metodikk som er generelt kjent innen teknikken for fremstilling av hydroksamsyrer og derivater derav.

Syntesen ifølge fremgangsmåten ovenfor (som innebærer kondensering av en fri karboksylsyre av formel IV med et eventuelt hydroksy-beskyttet hydroksylaminderivat av formel V) kan utføres i nærvær av et kondensasjonsmiddel, f.eks. 1,1 '-karbonyl-diimidazol, eller N-(dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid eller dicykloheksyl-karbodiimid, med eller uten 1-hydroksybenzotriazol i et inert, polart oppløsningsmiddel, slik som dimetylformamid eller diklormetan, fortrinnsvis ved romtemperatur.

Syntesen som involverer kondensasjon av et reaktivt, funksjonelt derivat av en syre av formel IV som definert ovenfor, f.eks. et syreklorid eller blandet anhydrid med eventuelt hydroksybeskyttet hydroksylamin, eller et salt derav, i nærvær av en base slik som trietylamin, kan utføres ved en temperatur varierende fortrinnsvis fra -78°C til +75°C, i et inert, organisk oppløsningsmiddel slik som diklormetan eller toluen.

Beskyttede former av hydroksylamin (av formel V) i den ovenfor angitte fremgangsmåte er de hvor hydroksygruppen er beskyttet f.eks. som en t-butyleter, en benzyleter, en trifenylmetyleter, en tetrahydropyranyleter, eller som et trimetylsilylderivat. Fjerning av nevnte beskyttelsesgrupper utføres ifølge metoder som er velkjent innen teknikken, f.eks. hydrogenolyse eller syrehydrolyse. Hydroksylamin utvikles fortrinnsvis in situ fra et hydroksylaminsalt, slik som hydroksylaminhydroklorid.

Karboksylsyre-utgangsforbindelsene av formel IV kan fremstilles som følger:

En aminosyre av formel VI

hvor R2 er hydrogen eller laverealkyl, som eventuelt er forestret med f.eks. en laverealkanol (slik som metanol) eller benzylalkohol, behandles med et reaktivt, funksjonelt derivat av den passende sulfonsyren av formel VE hvor R3 og R4 har de ovenfor angitte betydninger, f.eks. med det tilsvarende sulfonyl-kloridet, i nærvær av en egnet base, slik som trietylamin eller dicykloheksylamin, ved anvendelse av et polart oppløsningsmiddel slik som tetrahydrofuran, dioksan eller acetonitril til oppnåelse av en forbindelse av formel VIE

hvor R2-R4 har de ovenfor angitte betydninger og R5 er hydrogen eller en karboksyl-beskyttelsesgruppe, f.eks. laverealkyl eller benzyl.

Utgangsmaterialene av formel VI, VU og XII er enten kjent innen teknikken eller kan fremstilles ved fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken eller som beskrevet heri.

Optisk aktive D-aminosyrer av formel VI (R-enantiomerene) kan fremstilles ifølge fremgangsmåter som er kjent innen teknikken, f.eks. ifølge metoder beskrevet i Coll. Czech. Comm., 49, 712-742 (1984) og Angew. Chem. Int. Ed. (Engl.), 27,1194 (1988).

Mellomproduktene av formel VHJ kan omdannes til mellomproduktene av formel IX

hvor Ri-R5 har de ovenfor angitte betydninger, ved behandling med et reaktivt forestret derivat av alkoholen av formel: hvor Ri har betydning som definert i formel I, under betingelser som er velkjent innen teknikken for eterdannelse. Etermellomproduktene av formel DC kan alternativt fremstilles ved reduksjon av keton-forbindelser av formel XI

hvor R2-R5 har betydninger som definert i formel VHJ, i nærvær av en alkohol av formel X (Ri-OH). Den reduktive O-alkyleringen kan utføres vesentlig som beskrevet i J. Am. Chem. Soc., 94, 3659 (1972), ved bruk av mono-, di- eller trialkylsilaner eller mono-, di- eller triarylsilaner i surt medium, f.eks. i nærvær av trifluoreddiksyre. De resulterende cis- og trans-isomerene kan separeres ved hjelp av kjente metoder, slik som kromatografi på silisiumdioksydgel.

Ketonmellomproduktene av formel XI hvor R2 er hydrogen kan alternativt omdannes til de tertiære alkohol-mellomproduktene av formel VTfl hvor R2 er laverealkyl (og R2 og ORi' befinner seg på det samme karbonatomet) ifølge konvensjonelle metoder, og disse foretres deretter med et reaktivt forestret derivat av Ri-OH, slik som trifluormetan-sulfonylderivatet.

Ketonene av formel XI kan videre fremstilles ved oksydasjon av alkoholer av formel VIE ved behandling med f.eks. natriumhypokloritt i nærvær av et fritt radikal, f.eks. TEMPO (det frie radikalet 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidinyloksy).

Behandling av et mellomprodukt av formel EX med et reaktivt forestret derivat (slik som halogenidet, f.eks. klorid-, bromid- eller iodidderivatet) av alkoholen av formel XE

hvor Ar og n har de heri definerte betydninger, i nærvær av en passende base, slik som kaliumkarbonat eller dicykloheksylamin, i et polart oppløsningsmiddel, slik som dimetylformamid, gir en ester av en forbindelse av formel IV. Esteren kan deretter omdannes til syren av formel IV ved anvendelse enten av hydrogenolyse eller standard milde esterhydrolysemetoder, fortrinnsvis under sure betingelser, hvor metoden avhenger av forestringsgruppens beskaffenhet.

De ovenfor nevnte reaksjoner utføres ifølge standard metoder, i nærvær eller fråvær av fortynningsmiddel, idet slike fortrinnsvis er inerte overfor reagensene og er oppløsnings-midler for disse, av katalysatorer, kondensasjonsmidler eller nevnte andre midler respektivt og/eller inerte atmosfærer, ved lave temperatur, romtemperatur eller for-høyede temperaturer (fortrinnsvis ved eller nær kokepunktet for de benyttede oppløs-ningsmidlene), og ved atmosfære- eller overatmosfæretrykk. De foretrukne oppløsnings-midlene, katalysatorene og reaksjonsbetingelsene er angitt i de medfølgende illustrerende eksempler.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen og mellomprodukter kan også omdannes til hverandre ifølge i og for seg generelt kjente metoder.

Avhengig av valget av utgangsmaterialer og fremgangsmåter, kan de nye forbindelsene være i form av en av de mulige isomerene eller blandinger derav, f.eks. som vesentlig rene geometriske (cis eller trans) isomerer, optiske isomerer (antipoder), racemater, eller blandinger derav. Nevnte mulige isomerer eller blandinger derav omfattes av oppfinnelsen.

Hvilke som helst resulterende blandinger av isomerer kan separeres på basis av fysikalsk-kjemiske forskjeller mellom bestanddelene, til de rene geometriske eller optiske isomerene, diastereoisomerene, racematene, f.eks. ved kromatografi og/eller fraksjonert krystallisering.

Hvilke som helst resulterende racemater av sluttprodukter eller mellomprodukter kan spaltes i de optiske antipodene ved kjente metoder, f.eks. ved separering av de diastereo-isomeriske saltene derav, oppnådd med en optisk aktiv syre eller base, og frigjøring av den optisk aktive sure eller basiske forbindelsen. Hydroksamsyrene eller karboksylsyre-mellomproduktene kan således spaltes i deres optiske antipoder, f.eks. ved fraksjonert krystallisering av d- eller l-(a-metylbenzylamin, cinchonidin, cinchonin, kinin, kinidin, efedrin, dehydroabietylamin, brucin elle stryknin)-salter.

Sluttelig blir sure forbindelser ifølge oppfinnelsen enten oppnådd i den frie formen, eller som et salt derav.

Sure forbindelser ifølge oppfinnelsen kan omdannes til salter med farmasøytisk akseptable baser, f.eks. et vandig alkalimetallhydroksyd, fordelaktig i nærvær av et eterisk eller alkoholisk oppløsningsmiddel, slik som en laverealkanol. Fra oppløsningene av sistnevnte kan saltene utfelles med etere, f.eks. dietyleter. Resulterende salter kan omdannes til de frie forbindelsene ved behandling med syrer. Disse eller andre salter kan også benyttes for rensing av de oppnådde forbindelsene.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen som har basiske grupper kan omdannes til syreaddisjonssalter, spesielt farmasøytisk akseptable salter. Disse dannes f.eks. med uorganiske syrer, slik som mineralsyrer, f.eks. svovelsyre, en fosforsyre eller hydrohalogensyre, eller med organiske karboksylsyrer, slik som (Ci-C4)-alkankarboksylsyrer som f.eks. er usubstituert eller substituert med halogen, f.eks. eddiksyre, slik som mettede eller umettede dikarboksylsyrer, f.eks. oksalsyre, ravsyre, maleinsyre eller fumarsyre, slik som hydroksykarboksylsyrer, f.eks. glykolsyre, melkesyre, eplesyre, vinsyre eller sitronsyre, slik som aminosyrer, f.eks. asparaginsyre eller glutaminsyre, eller med organiske sulfonsyrer, slik som (Ci-C4)-alkan- eller arylsulfonsyrer som er usubstituerte eller substituerte, f.eks. med halogen, f.eks. metansulfonsyre. Foretrukket er salter dannet med saltsyre, metansulfonsyre og maleinsyre.

I betraktning av det nære slektskapet mellom de frie forbindelsene og forbindelsene i form av deres salter, så er det alle steder der en forbindelse er referert til i foreliggende sammenheng også ment et tilsvarende salt, forutsatt at dette er mulig eller passende under omstendighetene.

Forbindelsene, inkludert deres salter, kan også oppnås i form av deres hydrater, eller innbefatte andre oppløsningsmidler benyttet for deres krystallisering.

De farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen er de som er egnet for enteral, slik som oral eller rektal, transdermal og parenteral administrasjon til pattedyr, inkludert menneske, for å inhibere TNF-a-omdannende enzym og matrise-nedbrytende metalloproteinaser, og for behandling av forstyrrelser som reagerer på disse, omfattende en effektiv mengde av en farmakologisk aktiv forbindelse ifølge oppfinnelsen, alene eller i kombinasjon, med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere.

De farmakologisk aktive forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nyttige i fremstillingen av farmasøytiske preparater omfattende en effektiv mengde derav i forbindelse med eller i blanding med eksipienser eller bærere egnet for enten enteral eller parenteral anvendelse. Foretrukket er tabletter og gelatinkapsler omfattende den aktive bestanddelen sammen med a) fortynningsmidler, f.eks. laktose, dekstrose, sukrose, mannitol, sorbitol, cellulose og/eller glycin; b) smøremidler, f.eks. silisiumdioksyd, talk, stearin-syre, deres magnesium- eller kalsiumsalt og/eller polyetylenglykol; for tabletter også c) bindemidler, f.eks. magnesiumaluminiumsilikat, stivelsespasta, gelatin, tragant, metyl-cellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon; om ønsket d) desintegreringsmidler, f.eks. stivelser, agar, alginsyre eller dens natriumsalt, eller brusende blandinger; og/eller e) absorpsjonsmidler, fargestoffer, smaksstoffer og søtningsmidler. Injiserbare preparater er fortrinnsvis vandige, isotoniske oppløsninger eller suspensjoner, og suppositorier blir fordelaktig fremstilt fra fettemulsjoner eller -suspensjoner. Nevnte preparater kan steriliseres og/eller inneholde hjelpemidler slik som preserverings-, stabiliserings-, fukte- eller emulgeringsmidler, oppløsnings-fremmende midler, salter for regulering av det osmotiske trykket og/eller buffere. I tillegg kan de også inneholde andre terapeutisk verdifulle stoffer. Nevnte preparater fremstilles ifølge konvensjonelle henholdsvis blande-, granulerings- eller beleggings-metoder, og inneholder 0,1-75%, fortrinnsvis 1-50%, av den aktive bestanddelen. Egnede formuleringer for transdermal anvendelse inkluderer en effektiv mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen med bærer. Fordelaktige bærer inkluderer absorberbare farmakologisk akseptable oppløsningsmidler for å hjelpe passasje gjennom vertens hud. Karakteristisk er transdermale anordninger i form av en bandasje omfattende et under-lagselement, et reservoar inneholdende forbindelsen eventuelt med bærere, eventuelt en hastighetsregulerende barriere for avlevering av forbindelsen til vertens hud ved en regulert og forutbestemt hastighet over en lengere tidsperiode, og anordninger for å feste anordningen til huden.

Egnede formuleringer for topisk påføring, f.eks. på huden og øynene, er fortrinnsvis vandige oppløsninger, salver, kremer eller geler som er velkjent innen teknikken.

De farmasøytiske formuleringene inneholder en effektiv TNF-a-konvertase-inhiberende mengde og/eller matrise-nedbrytende metalloproteinase-inhiberende mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som definert ovenfor, enten alene eller i kombinasjon med et annet terapeutisk middel, f.eks. et antiinflammatorisk middel med cyklooksygenase-inhiberende aktivitet, eller andre antireumatiske midler slik som meto-treksat, hver ved en effektiv terapeutisk dose som rapportert i teknikken. Slike terapeu-tiske midler er velkjente innen teknikken.

Eksempler på antiinflammatoriske midler med cyklooksygenase-inhiberende aktivitet er diklofenac, naproksen, ibuprofen og lignende.

I forbindelse med en annen aktiv bestanddel, kan en forbindelse ifølge oppfinnelsen administreres enten samtidig, før eller etter den andre aktive bestanddelen, enten separat ved samme eller forskjellig administrasjonsvei eller sammen i samme farmasøytiske formulering.

Dosen av aktiv forbindelse som administreres er avhengig av arten av varmblodig dyr (pattedyr), kroppsvekten, alder og individuell tilstand, og av administrasjonsformen. En enhetsdosering for oral administrasjon til et pattedyr på 50-70 kg kan inneholde mellom 10 og 1000 mg, fordelaktig mellom 25 og 250 mg av den aktive bestanddelen.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen og deres farmasøytisk akseptable salter, eller farmasøytiske preparater derav, kan benyttes i pattedyr for inhibering av TNF-a-aktivitet og inhibering av de matrise-nedbrytende metalloproteinasene, f.eks. stromelysin, gelatinase, kollagenase og makrofag-metalloelastase, for inhibering av vevmatrise-nedbrytning og for behandling av TNF-a- og matrise-nedbrytende metalloproteinase-avhengige tilstander som beskrevet heri, f.eks. inflammasjon, reumatoid artritt, osteoartritt, også tumor (tumorvekst, metastase, progresjon eller invasjon), pulmonale forstyrrelser og lignende beskrevet heri. Tumorer (karsinomer) inkluderer bryst-, lunge-, blære-, colon-, prostata- og ovariekreft, og hudkreft, inkludert melanom og Kaposis sarkom, hos pattedyr.

Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen og skal ikke anses som begrensende for denne. Temperaturer er angitt i °C. Dersom ikke annet er nevnt, utføres alle inndamp-ningene under redusert trykk, fortrinnsvis mellom ca. 15 og 100 m Hg (=20-133 mbar). Strukturen til sluttprodukter, mellomprodukter og utgangsmaterialer er bekreftet ved hjelp av standard analytiske metoder, f.eks. mikroanalyse og spektroskopiske egenskaper (f.eks. MS, IR, NMR). Benyttede forkortelser er de som er konvensjonelle innen teknikken. Konsentrasjonen for [a]D-bestemmelser er uttrykt i mg/ml.

Eksempel 1: N-(t-butyloksy)-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)acetamid (0,84 g, 1,5 mmol) oppløses i dikloretan (50 ml) inneholdende etanol (0,1 ml, 1,5 mmol) i en rundbunnet kolbe og reaksjonsblandingen avkjøles til -10°C. Saltsyregass (fra en "lecture"-flaske) bobles igjennom i 10 minutter. Reaksjonsblandingen forsegles, far oppvarmes langsomt til romtemperatur og omrøres i 4 dager. Oppløsningsmidlet reduseres til 1/3 volum ved inndampning og tritureres med eter. Blandingen filtreres, filterkaken fjernes og tørkes i vakuum og dette gir N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksy-cykloheksyl)-acetamidhydroklorid som et hvitt faststoff, smp. 135-140°C, av formelen:

Utgangsmaterialet fremstilles som følger:

D-4-hydroksyfenylglycin (10 g) oppløses i 3N natriumhydroksyd (20 ml). Vann (180 ml) og deretter Raney-nikkel (27 g) tilsettes. Reaksjonsblandingen hydrogeneres ved 3 atmosfærers trykk og 50-80°C natten over. Reaksjonsblandingen filtreres gjennom celitt og reduseres i volum til ca. 85 ml og dioksan (85 ml) tilsettes. Oppløsningen av 4-hydroksycykloheksylglycin (se Coll. Czech. Chem. Comm., 49, 712-742 (1984)) avkjøles til 0°C og behandles med trietylamin (11,37 ml) og 4-metoksybenzensulfonyl-klorid (10,95 g). Reaksjonsblandingen får oppvarmes til romtemperatur og omrøres over helgen. Dioksanen fjernes i vakuum og den gjenværende, vandige oppløsning fortynnes med IN saltsyre. Det resulterende bunnfall oppsamles, vaskes med vann og eter og dette gir (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-hydroksycykloheksylglycin.

En blanding av uren (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-hydroksycykloheksylglycin (7,0 g, 20,4 mmol) i dimetylformamid (100 ml) inneholdende N,N-dicykloheksylamin (3,7 g, 20,4 mmol) og benzylbromid (3,5 g, 20,4 mmol) omrøres ved romtemperatur i 24 timer. Blandingen fortynnes med vann og ekstraheres med etylacetat. De kombinerte organiske ekstraktene vaskes med saltoppløsning, tørkes (Na2S04), filtreres og konsentreres i vakuum og dette gir (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-hydroksycykloheksyl-glycinbenzylester som en blanding av diastereomerer.

Til en oppløsning av uren (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-hydroksycykloheksyl-glycinbenzylester (8,67 g, 20 mmol) i diklormetan (66 ml) ved 0°C tilsettes dråpevis en oppløsning av natriumbromid (2,06 g, 20 mmol) i vann (10 ml), fulgt av tilsetning av det frie radikalet 2,2,6,6-tetrametyl-l-piperidinyloksy (TEMPO, 27 mg). Til denne blandingen tilsettes dråpevis en vandig oppløsning av 5% natriumhypokloritt (34,2 ml, 34,3 mmol, Clorox-kvalitet) og vann (34,2 ml) hvori pH-verdien justeres til 8,6 med natriumbikarbonat før tilsetning. Tilsetningstiden for den resulterende pH-justerte, vandige natriumhypoklorittoppløsningen er 30 minutter og omrøring fortsettes i ytterligere 20 minutter, mens det opprettholdes en reaksjonstemperatur på 0°C. Diklormetan-laget separeres og vaskes suksessivt med 10% vandig kaliumhydrogensulfat (40 ml), en liten mengde 10% vandig kaliumiodid (3 x 30 ml), 10% vandig natriumtiosulfat (60 ml) og saltoppløsning (40 ml). Det organiske laget tørkes (MgS04), filtreres og konsentreres i vakuum og dette gir et faststoff som ytterligere kan renses ved omkrystallisering fra etylacetat til oppnåelse av (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-oksycykloheksylglycin-benzylester.

Til en blanding av (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-oksycykloheksylglycinbenzyl-ester (15 g, 34,6 mmol) i n-propanol (7 ml, 93,2 mmol) inneholdende fenylsilan (5,2 ml, 43.3 mmol) tilsettes dråpevis trifluoreddiksyre og blandingen omrøres ved romtemperatur natten over. Blandingen fortynnes med etylacetat og vaskes med mettet, vandig natriumbikarbonat. Det organiske laget tørkes (MgSC^), filtreres og konsentreres i vakuum. Råproduktet renses ved silisiumdioksydgelkromatografi (1% til 5% etylacetat/metylenklorid) hvilket gir (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-cis-4-propoksy-cykloheksylglycinbenzylester og (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-trans-4-propoksy-cykloheksylglycinbenzylester.

Til en oppløsning av (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-trans-4-propoksycykloheksyl-glycinbenzylester (4,0 g, 8,42 mmol) i dimetylformamid (55 ml) tilsettes 4-pikolyl-kloridhydroklorid (1,5 g, 8,95 mmol) fulgt av kaliumkarbonat (11,6 g, 84,2 mmol). Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur natten over. Blandingen fortynnes deretter med vann og ekstraheres med etylacetat. De kombinerte, organiske ekstraktene vaskes med saltoppløsning, tørkes (NaiSCu) og oppløsningsmidlet inndampes og dette gir benzyl-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksy-cykloheksyl)acetat som et råprodukt.

Oppløsningen av benzyl-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)acetat (3,0 g, 5 mmol) i etanol (50 ml) inneholdende 3N saltsyre (5 ml, 15 mmol) hydrogeneres ved 345 kPa i nærvær av 5% palladium-på-trekull (200 mg) ved romtemperatur i 4 timer. Reaksjonsblandingen filtreres gjennom celitt, vaskes med etanol og konsentreres i vakuum hvilket gir 2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)-(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)eddiksyrehydroklorid som et råprodukt.

2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)-eddiksyrehydroklorid (2,65 g, 4,82 mmol), 1-hydroksybenzotriazol (0,65 g, 4,81 mmol), 4-metylmorfolin (2,93 ml, 26,5 mmol) og O-t-butylhydroksylaminhydroklorid (1,81 g, 14.4 mmol) oppløses i metylenklorid (100 ml). N-[dimetylaminopropyl]-N'-etylkarbo-diimidhydroklorid (1,1 g, 5,8 mmol) tilsettes og reaksjonsblandingen omrøres natten over. Reaksjonsblandingen blir deretter fortynnet med vann og ekstrahert med metylenklorid. De kombinerte, organiske ekstraktene vaskes med saltoppløsning, tørkes (Na2S04) og oppløsningsmidlet inndampes. Råproduktet renses ved silisiumdioksydgelkromatografi (5% metanol/metylenklorid) og dette gir N-(t-butyloksy)-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)acetamid.

Eksempel 2: Følgende forbindelser fremstilles på lignende måte som i eksempel 1:

(a) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 145-155°C. (b) N-hydroksy-2(R)- [(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino] -2-(trans-4-etoksy-cykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 127-135°C. (c) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(1rans-4-butoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 132-137°C. (d) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-pentoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 135-145°C. (e) N-hydroksy-2(R)- [(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino] -2- [trans-4-(2-fenetyloksy)cykloheksyl]-acetamidhydroklorid, smp. 120-130°C. (f) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-[trans-4-(2-(l-naftyl)-etoksy)cykloheksyl]-acetamidhydroklorid, smp. 125-140°C. (g) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-iso-propoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 140-145°C. (h) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-iso-butoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 126-134°C. (i) N-hydroksy-2(R)- [(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino] -2-(trans-4-cyklo-heksyloksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 135-144°C. (j) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-[trans-4-(2-metoksyetoksy)cykloheksyl]-acetamidhydroklorid, smp. 108-117°C. (k) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-(2-fluor-etoksy)cykloheksyl]-acetamidhydroklorid, smp. 130-141°C. (1) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(fr pentoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 125-134°C. (m) N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(cis-4-metoksy-cykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 142-149°C. (n) N-hydroksy-2CR)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(3-pikolyl)amino]-2-(trans-4-etoksy-cykloheksyl)-acetamidhydroklorid. (o) N-hydroksy-2(R)-[(4-benzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksycyklo-heksyl)-acetamidtrifiuoracetat, smp. 160-165°C. (p) N-hydroksy-2(R)-[(4-etoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksy-cykloheksylj-acetamidhydroklorid, smp. 131°C. (q) N-hydroksy-2(R)- [(4-propoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino] -2-(trans-4-propoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 163-165°C. (r) N-hydroksy-2(R)-[(4-butoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 163-165°C. (s) N-hydroksy-2(R)-[(3,4-dimetoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 164°C. (t) N-hydroksy-2(R)- {(4-metoksybenzensulfonyl)[2-(4-pyridyl)etyl]amino} -2-(trans-4-etoksycykloheksyl)-acetamid. (u) N-hydroksy-2(R)-[(4-etoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksy-cykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 131°C. (v) N-hydroksy-2(R)-[(4-isobutoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-propoksycykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 145-146°C.

(w) N-hydroksy-2(R)-[(4-etoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-etoksy-cykloheksyl)-acetamidhydroklorid, smp. 150-15 5°C.

(x) N-hydroksy-2(R)-[(4-etoksyte

butoksycykloheksyl)-acetarnidhydroklorid, smp. 168-169°C.

(y) N-hyo^oksy-2(S)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)-acetamidtrifluoracetat, smp. 165-174°C.

Eksempel 3:

(a) Til en oppløsning av N-(trifenylmetoksy)-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)-(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksy-4-metylcykloheksyl]acetamid (348 mg, 0,48 mmol) i metylenklorid ved 0°C inneholdende trietylsilan (260 ul, 1,63 mmol) tilsettes trifluoreddiksyre (260 ul, 3,4 mmol) dråpevis. Etter 20 minutter blir reaksjonsblandingen konsentrert direkte i vakuum og fortynnet med metylenklorid (4 ml). Den resulterende oppløsning avkjøles til 0°C og surgjøres med hydrogenkloridgass. Oppløs-ningsmidlet blir på nytt fjernet i vakuum og resten gjenoppløst med metylenklorid. Oppløsningen tritureres ved tilsetning av pentan for å utfelle produkt. Supernatanten fjernes og fremgangsmåten gjentas inntil all trifenylmetan er fjernet. Det gjenværende faste bunnfallet er N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksy-4-metylcykloheksyl)acetamidhydroklorid, smp. 133°C.

Utgangsmaterialet fremstilles som følger:

En oppløsning av (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-4-oksocykloheksylglycinbenzyl-ester (se eksempel 1, 5,0 g, 11,6 mmol) i metylenklorid (35 ml) ved romtemperatur, tilsettes til en oppløsning av titantetraklorid (1,0M i metylenklorid) (21,2 ml, 21,2 mmol) og dimetylsink (1,0M i heptan) (23,0 ml, 23,0 mmol) ved -78°C i diklormetan (20 ml). Reaksjonsblandingen omrøres ved -78°C i 30 minutter, oppvarmes deretter langsomt til romtemperatur i løpet av 2,5 timer. Reaksjonsblandingen helles i vann (700 ml) og ekstraheres med kloroform. De kombinerte, organiske ekstraktene vaskes med vann, tørkes (MgS04), filtreres og konsentreres i vakuum. Råproduktet renses ved silisiumdioksydgelkromatografi (40%, etylacetat/heksaner) og dette gir (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-trans-4-hydroksy-4-metylcykloheksylglycinbenzylester og (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-cis-4-metyl-4-hydroksycykloheksylglycinbenzylester.

Til en oppløsning av (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-trans-4-hydroksy-4-metylcyklo-heksylglycinbenzylester (600,0 mg, 1,34 mmol) i metylenklorid (15 ml) inneholdende 2,6-di-tert-butylpyridin (755 ul, 3,36 mmol) tilsettes metyltrifluormetansulfonat (305 ul, 2,68 mmol) dråpevis ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen omrøres ved romtemperatur natten over og reaksjonen stoppes deretter med en liten mengde metanol. Blandingen fortynnes med kloroform, vaskes deretter med mettet, vandig ammonium-klorid og vann. Det organiske laget tørkes (MgSC^), filtreres og konsentreres i vakuum. Råproduktet renses ved silisiumdioksydgelkromatografi (35% etylacetat/heksaner) og dette gir (R)-N-(4-metoksybenzensulfonyl)-trans-4-metoksy-4-metylcykloheksylglycin-benzylester.

Hydrogenolyse av benzylesteren til syren og behandling med O-tritylhydroksylamin (istedenfor O-t-butylhydroksylamin) som i eksempel 1, gir N-(trifenylmetoksy)-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-metoksy-4-metylcykloheksyl)-acetamid. (b) På lignende måte fremstilles N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)-(4-pikolyl)amino] -2-(cis-4-metoksy-4-metylcykloheksyl)acetamidhydroklorid, smp. 128°C.

Eksempel 4: Fremstilling av 3000 kapsler hver inneholdende 25 mg av den aktive bestanddelen, f.eks. N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksycykloheksyl)acetamid:

Den aktive bestanddelen føres gjennom en nr. 30 håndsikt.

Den aktive bestanddelen, laktose, Avicel PH 102 og Polyplasdone XL blandes i 15 minutter i en blander. Blandingen granuleres med tilstrekkelig vann (ca. 500 ml), tørkes i en ovn ved 35°C natten over, og føres gjennom en nr. 20 sikt.

Magnesiumstearat føres gjennom en nr. 20 sikt, tilsettes til granuleringsblandingen, og blandingen blandes i 5 minutter i en blander. Blandingen innkaples i nr. 0 harde gelatinkapsler, hver inneholdende en mengde av blandingen som er ekvivalent med 25 mg av den aktive bestanddel.

Claims (16)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel (I) hvor Ar representerer pyridyl; Ri representerer laverealkyl, cykloalkyl, fenyl-Ci-C6-alkyl, naftyl-Ci-C6-alkyl, laverealkoksylaverealkyl, eller halogenlaverealkyl; R2 representerer hydrogen eller laverealkyl; R3 og R4 representerer uavhengig hydrogen eller laverealkoksy; n representerer et helt tall fra 1 til 4; betegnelsen "lavere" definerer et organisk radikal eller forbindelse som forgrenet eller uforgrenet med opptil og innbefattende 7 karbonatomer; et farmasøytisk akseptabelt prodrug-derivat derav hvor CONHOH-gruppen er derivatisert i form av et O-acylderivat avledet fra en organisk karbonsyre, en organisk karboksylsyre eller en karbaminsyre, eller i form av et eventuelt substituert O-benzylderivat; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1 med formel (II) hvor konfigurasjonen til det asymmetriske karbonatomet i a-aminohydroksamsyre-gruppedelen til hvilken cykloheksanringen er festet er gitt (R)-konfigurasjonen og hvor Ar, n, Ri, R2, R3 og R4 har betydninger som definert i krav 1, et farmasøytisk akseptabelt prodrug-derivat derav hvor CONHOH-gruppen er derivatisert i form av et O-acylderivat avledet fra en organisk karbonsyre, en organisk karboksylsyre eller en karbaminsyre, eller i form av et eventuelt substituert O-benzylderivat; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

3. Forbindelse ifølge krav 2 av formel II, karakterisert ved at Ri er laverealkyl; R2 er hydorgen, R3 er para-laverealkoksy; R4 er hydrogen; og n er 1 eller 2; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

4. Forbindelse ifølge krav 2 av formel n, karakterisert ved at Ri er laverealkyl, R2 og R4 er hydrogen; R3 er para-laverealkoksy; og n er 1; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved at Ar er 3- eller 4-pyridyl.

6. Forbindelse ifølge krav 2 av formel II, karakterisert ved at Ar er 3- eller 4-pyridyl; Ri er rettkjedet C2-C5-alkyl; R2 og R4 er hydrogen; R3 er para-laverealkoksy; og n er 1; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

7. Forbindelse ifølge krav 2 av formel n, karakterisert ved at Ar er 4-pyridyl; R\ er C2-C4 alkyl; R2 og R4 er hydrogen; R3 er para-etoksy; og n er 1; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

8. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-hydroksy-2(R)-[(4-metoksybenzensulfonyl)(4-pikoyl)amino]-2-(trans-4-propoksy-cykloheksyl)-acetamid, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

9. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-hydroksy-2(R)-[(4-etoksybenzensulfonyl)(4-pikolyl)amino]-2-(trans-4-propoksy-cykloheksyl)-acetamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

10. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-hydroksy-2(R)-[(4-etoksybenzensulfonyl)(4-pikoyl)amino]-2-(trans-4-etksycyklo-heksyl)acetamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

11. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-hydroksy-2-(R)-[(4-etoksybenzensulfonyl)(4-pikoyl)amino]-2-(trans-4-isobutoksy-cykloheksyl)-acetamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det innbefatter en effektiv TNF-alfa-konvertaseinhiberende mengde av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 i kombinasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere.

13. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, karakterisert ved at den er beregnet for bruk i en metode for terapeutisk behandling av dyr eller mennesker.

14. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, karakterisert ved at den er beregnet for bruk i behandlingen av TNF-alfa-avhengige eller matrise-nedbrytende metalloproteinaseavhengige tilstander.

15. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av TNF-alfa-avhengige eller matrise-nedbrytende metalloproteinaseavhengige tilstander.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse av formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter kondensasjon av en karboksylsyre av formel IV: eller et reaktivt funksjonelt derivat derav, hvor Ar, n og Ri-Pm er som definert i krav 1, med hydroksylamin av formel V, eventuelt i beskyttet form, eller et salt derav; og, om nødvendig, midlertidig beskyttelse av en eventuell forstyrrende reaktiv gruppe(r), og deretter frigjøring av den resulterende forbindelsen ifølge oppfinnelsen; og, om nødvendig eller ønsket, omdannelse av en resulterende forbindelse ifølge oppfinnelsen til en annen forbindelse ifølge oppfinnelsen, og/eller, om ønsket, omdannelse av en resulterende fri forbindelse til et salt eller et resulterende salt til en fri forbindelse eller til et annet salt; og/eller separering av en oppnådd blanding av isomerer eller racemater i enkeltisomerene eller -racematene; og/eller, om ønsket, spalting av et racemat til de optiske antipodene.