NO302824B1 - Isolert DNA-sekvens som koder for interleukin-7, ekspresjonsvektor inneholdende sekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av interleukin-7, samt antistoff mot proteinet - Google Patents

Isolert DNA-sekvens som koder for interleukin-7, ekspresjonsvektor inneholdende sekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av interleukin-7, samt antistoff mot proteinet Download PDF

Info

Publication number
NO302824B1
NO302824B1 NO892630A NO892630A NO302824B1 NO 302824 B1 NO302824 B1 NO 302824B1 NO 892630 A NO892630 A NO 892630A NO 892630 A NO892630 A NO 892630A NO 302824 B1 NO302824 B1 NO 302824B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
protein
residues
sequence
dna sequence
Prior art date
Application number
NO892630A
Other languages
English (en)
Other versions
NO892630D0 (no
NO892630L (no
Inventor
Anthony E Namen
Raymond G Goodwin
Stephen D Lupton
Diane Yukiko Mochizuki
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of NO892630D0 publication Critical patent/NO892630D0/no
Publication of NO892630L publication Critical patent/NO892630L/no
Publication of NO302824B1 publication Critical patent/NO302824B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Teknisk område
Foreliggende oppfinnelse omfatter en isolert DNA-sekvens som koder for interleukin-7, ekspresjonsvektor inneholdende sekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av interleukin-7, samt antistoff mot proteinet.
Bakgrunn for oppfinnelsen
B- og T-lymfocytter er de primære effektorceller i immunresponsene. Begge celleklasser blir antatt å være endelig avledet fra hematopoietiske stamceller i pattedyr-benmargen, via forstadier eller forløperceller som. representerer erkjennbare stadier i differensieringen av hver klasse.
B-lymfocytter, eller B-celler, er forløperne til de sirkulerende antistoff-utskillende plasmaceller. Modne B-celler som erkarakterisert vedekspresjon av overflatebundet immunglobulin som er i stand til å binde spesifikke antigener, utgår fra hematopoietiske stam-
celler via en intermediær celleklasse kjent som pre-B-celler. Modne T-celler utvikler seg prinsipielt i thymus, sannsynligvis fra en hittil ikke identifisert for-løpercelle som vandrer fra benmargen til thymus på et tidlig stadium av T-lymfocyttutvikling.
Mens betraktelige fremskritt er blitt gjort med hensyn til å identifisere løselige hormonlignende fak-
torer som regulerer differensiering av andre celler av hematopoietisk opprinnelse, f.eks. granulocytter og makrofager, er svært lite kjent når det gjelder regulerende faktorer som er involvert i B- og T-cellelymfogenese. Den flerpotente, lymfoide stamcelle er ikke blitt identifisert,
og alle de faktorer eller betingelser som kreves for bestemmelse i utvikling og utvidelse av B- og T-cellelinjer, er heller ikke definert. Senere stadier av B- og T-cellevekst og differensiering som følger etter tilsynekomst av overflate-immunglobulin og utvikling av B-cellen fra benmargen, eller T-cellen fra thymus, er blitt studert
mest grundig. Dette arbeid har avslørt et antall faktorer som er aktive på modne, perifere B- og T-celler, inkludert IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, interferon gamma, BSF-2, neuroleukin og transformerende vekstfaktor beta.
Enkelte holdepunkter er tilgjengelige vedrørende B-cellene som blir betraktet å være de nære forløperne til modne, funksjonelle, perifere B-celler. Disse pre-B-celler er blitt definert som celler som inneholder cytoplasmatisk/u-kjede, men ingen cytoplasmatisk lett kjede og intet overflate-immunglobulin.
Paige, Nature 302:711 (1983) og Paige et al., Eur. J. Immunol. L4:979 (1984) beskrev teknikker for å dyrke B-celleforstadier som stammet fra 14-dager gamle murine, føtale leverceller. Disse pre-B-celler ble observert å differensiere til antistoffutskillende B-celler in vitro når kulturene ble understøttet av et lag av føtale leverceller, benmarg-adherente celler, eller kondisjonert medium som inneholdt kolonistimulerende faktorer.
Giri et al., J. Immunol. 132:223 (1984) dyrket en murin benmarg-avledet pre-B-cellelinje, 70Z/3, i nærvær av delvis rensede IL-l-preparater som stammet fra lipopoly-saccharid (LPS)-induserte P388Dl-cellesupernatanter. I den etterfølgende kontakt med IL-l-preparater ble pre-B-cellene observert å uttrykke overflate-immunglobulin. Jyonouchi et al., J. Immunol. 135:1891 (1985) rapporterte at en humoral faktor eller faktorer fra serum eller NZB-mus kunne fremme modningen av B-linje forløperceller. Landreth et al.,
J. Immunol. 134:2305 (1985) demonstrerte at en faktor (eller faktorer) til stede i urinen av en pasient som hadde periodevis neutrofil leukopeni, stimulerte dannelsen av pre-B-celler i humane og muse-benmargkulturer.
Imidlertid har disse resultater vært vanskelige å tolke på grunn av den ikke-homogene natur til de celle-populasjoner som ble benyttet. De pleiotrope effekter av kjente lymfokiner, såvel som deres potente, reelle, biologiske aktiviteter, kompliserer analysen av prøver som involverer responsen til heterogene cellekulturer til et kondisjonert cellekulturmedium som stammer fra serumholdige cellekulturer.
En hovedhindring for å studere lymfocyttutvikling, har vært vanskeligheten som er forbundet med å oppnå anrikede populasjoner av levedyktige, lymfoide forløpere. Langtids-ben-margkultursystemet som ble utviklet av Whitlock og Witte, J. Immunol. Meth. 67:353 (1984), har gitt en tilgang på pre-B-celler for undersøkelse. I en Whitlock-Witte kultur benyttes et adherent støttelag som består av stromal-oppnådde fibro-blaster, makrofager og endotelceller som et matelag for å underholde veksten til en øvre fase av ikke-adherente pre-B-og tidlige lymfoide forløpere.
Whitlock et al., Cell 48:1009 (1987), og Hunt et al., Cell 48:997 (1987), rapporterte kloning av cellelinjer som var avledet fra murin benmargstroma som var i stand til å understøtte veksten av pre-B-celler og andre forløpere til modne B-celler i Whitlock-Witte-kulturer. Supernatantene til en slik cellelinje, betegnet ALC, ble testet for aktivitet i IL-1-, IL-2-, IL-3- og IL-4-prøver. Fraværet av aktivitet i disse prøver antydet at disse faktorene ikke var kilden til den proliferasjonsinduserende aktivitet som ble funnet i ALC-supernatanter. Både Whitlock et al. og Hunt et al. anså pre-B-celle-induserende aktivitet, slik som de observerte, å kunne føres tilbake til en ny faktor til stede i stromacellesuperna-tantene.
Oppsummering av oppfinnelsen
Ved utvikling av den foreliggende oppfinnelse ble det benyttet en variant av Whitlock-Witte-kultursystemet som en kilde til umodne B-celler som var basis for en rask kvantitativ prøve for å oppdage vekstfaktorer som var i stand til å stimulere proliferasjon av pre-B-celler. En antatt faktor som ble observert i mur ine stromacellekulturer, var tentativt betegnet "Lymfopoietin-1" ("LP-1"), og senere betegnet "Interleukin-7" ("IL-7"). For å klone murin IL-7 cDNA som ble brukt for å sikre den humane cDNA, ble det benyttet en ny klonings-teknikk. For å oppnå en cellelinje som uttrykte et løselig murint IL-7 i målbare menader ble en ny cellelinie etablert ved transformasjon av stromaceller, oppnådd fra en Whitlock-Witte-kultur. Denne cellelinje som utskiller en pre-B-celle-vekstaktivitet i serumfritt medium, ga tilgang på spesifikk IL-7 budbringer-RNA for ekspresjonskloning, og protein for rensning og sekvensering. Isolering av en murin cDNA-klon muliggjorde identifisering ved kryss-hybridisering av humane genomiske og cDNA-kloner som kodet for humant IL-7.
Preliminære forsøk som omhandlet tilførsel av renset, rekombinant IL-7 til mus, har indikert at i tillegg til å stimulere utviklingen og prolifereringen av de hematopoietiske forløpere til T- og B-celler, er IL-7 også i stand til å indusere prolifereringen av megakaryocytt- og granulo-cytt/makrofagforløpere i benmarg. I lys av en potensiell immunologisk bruk for å stimulere proliferering av forløpere til T-celler og antistoff-utskillende B-celler, såvel som andre hematopoietiske celletyper, er det betraktelig interesse for å utvikle teknologi for å produsere biologisk aktive IL-7-molekyler. Bruk av rekombinante ekspresjonssystemer kan gi tilstrekkelige mengder av rent protein for å tillate detaljert studium av den biologiske aktivitet til slike molekyler og for å forsyne antatte kliniske behov for terapeutiske IL-7-preparater.
Den foreliggende oppfinnelse gir tilgang på pattedyr interleukin-7 (IL-7)-proteiner som tidligere ble betegnet lymfopoietin-1 ("LP-1"). Disse molekyler kan bli fremstilt ved opprensning fra cellekultursupernatanter eller ved å uttrykke DNA-sekvenser som koder for pattedyr-IL-7. Det fore-trekkes at slike sekvenser i hovedsak består av en enkel åpen leseramme-nucJ ootidsekvens som er i stand til å bli uttrykt i en rekombinent transkripsjonsenhet under kontrollen til pattedyr, mikrober eller virale transkripsjons- eller translasjonskontrollelementer. Den foreliggende oppfinnelse omhandler også rekombinante ekspresjonsvektorer som består av DNA-sekvensene, eukaryote og prokaryote ekspresjonssystemer som omfatter de rekom binante ekspresjonsvektorer, fremgangsmåter for å lage proteinene ved rensning fra pattedyr-cellekulturmedier eller ved rekombinant ekspresjon i passende eukaryote eller prokaryote systemer og antistoffer som er immunreaktive med proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således en isolert DNA-sekvens som koder for et pattedyr-interleukin-7 (IL-7), en IL-7-analog eller avkortet IL-7 med tilsvarende biologisk aktivitet, kjennetegnet ved at DNA-sekvensen er valgt fra: (a) en DNA-sekvens omfattende nukleotidsekvensen vist i figur 3 og figur 5; (b) en DNA-sekvens som degenereres som følge av den genetiske kode til en DNA-sekvens ifølge (a); og (c) en DNA-sekvens som under hybridiseringsbeting-elser ved 50 °C og 0,9 M NaCl, etterfulgt av vask i IX SSC ved 55 °C, vil hybridisere til en DNA-sekvens ifølge (a), og som koder for et IL-7, en IL-7-analog eller avkortet IL-7 med biologisk aktivitet i en pre-B-celleproliferasjonsanalyse, en rekombinant ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke IL-7, en fremgangsmåte for fremstilling av et pattedyr-IL-7, en IL-7-analog eller avkortet IL-7, kjennetegnet ved dyrking av en passende vertcelle som omfatter en vektor ifølge krav 5 under betingelser som fremmer ekspresjon av IL-7, IL-7-analog eller avkortet IL-7, hvoretter IL-7 isoleres, samt et antistoff som immunreagerer med et IL-7-protein som omfatter en aminosyresekvens valgt fra rester 1 til 129 ifølge figur 3 og rester 1 til 152 ifølge figur 5.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 fremstiller restriksjonskart til cDNA-kloner som koder for humane og murine IL-7-proteiner. Boksene indikerer posisjonene til de åpne leserammer; de kryssede bokser indikerer et signalpeptid eller ledersekvens. De omtrentlige posisjoner til selekterte restriksjonsendo-nuclease-gjenkjennelsesseter er markert. Figur 2 illustrerer nucleotidsekvensen til en cDNA-klon som koder for murint IL-7 (mIL-7), som ble identifisert ved direkte ekspresjonskloning ved bruk av en pattedyr-ekspresjonsvektor. Startkodonet til full-lengde naturlig protein, kodonet som spesifiserer den N-terminale amino syre til den modne sekvens, og termineringskodon er understreket.
Figur 3 indikerer nucleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til den kodende region til den murine cDNA-klon i fig. 2. Den fullt utviklede proteinsekvens er kodet for av nucleotidsekvensen som begynner ved nucleotid 1 og ender ved nucleotid 387. Det antatte signalpeptid som koder for en ledersekvens til det naturlige translasjonsprodukt, kodes
for av nucleotidene -75 til -1. Den N-terminale glutamin-syrerest av fullt utviklet mIL-7 er understreket.
Figur 4 illustrerer nucleotidsekvensen til en cDNA-klon som koder for humant IL-7 (hIL-7) som ble isolert ved kryss-hybridiseringsstudier ved bruk av en probe som stammet fra mIL-7 cDNA. Startkodon til det full-lengde, naturlige protein, kodonet som spesifiserer den N-terminale amino-
syre til den modne sekvens og termineringskodon, er understreket.
Figur 5 indikerer nucleotidsekvensen og den utledede aminosyresekvens til den kodende region av hIL-7 cDNA-klon på figur 4. Det fullt utviklede humane protein er kodet for ved sekvensen som begynner ved nucleotid 1 og ender ved nucleo-
tid 456. Et antatt hydrofobt signalpeptid som koder for en ledersekvens i det naturlige translasjonsprodukt, kodes for av nucleotidene -75 til -1. Den N-terminale asparaginsyre-
rest til det modne protein er understreket. Et plasmid som har den kodende sekvens til hIL-7 i E. coli-stamme JM107,
ble deponert i American Type Culture Collection den 21. oktober 1987 og ble gitt registreringsnr. ATCC 67546.
Figur 6 indikerer responsen til pre-B-celler (panel A) og thymocytter (panel b) til IL-7. I forsøket avbildet i panel A, ble pre-B-celler fra Whitlock-Witte benmargkulturer
(se nedenfor) dyrket i en tetthet på 2,5 x 10 5 celler pr. ml i nærvær av IL-7 i tre dager ved 3 7°C. To kilder til IL-7
ble benyttet: seriefortynninger av supernatant fra C0S-7-celler transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder IL-7-genet (åpne firkanter), og renset, rekombinant IL-7-protein som begynner i en 100 ng/ml konsentrasjon (fylte firkanter). I forsøket avbildet i panel B ble thymocytter dyrket i en tetthet på 1 x 10 7 celler pr. ml under de samme
betingelser, bortsett fra at fortynninger til det rensede, rekombinante IL-7-protein ble startet i en konsentrasjon av 1 ug/ml. I alle forsøk representerer hver fremstilte verdi gjennomsnittet av triplikate prøver.
Figur 7 er en skjematisk illustrasjon av pattedyr-høyekspresjonsplasmidet pDC201 som er beskrevet mer detaljert i eksempel 7.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
1. Definisjoner
"Interleukin-7" og "IL-7" refererer seg til et pattedyr-endogent sekretorisk protein som er i stand til å indusere proliferasjon av benmarg-utledede lymfocytt-forstadier og forløpere, innbefattende de spesialiserte for-løperne kjent som pre-B-celler. Alternative betegnelser for dette molekyl er "pre-B-cellevekstfaktor" og "lymfopoietin-1". Den antatte molekylvekt til det fullt utviklede, murine protein er 14.897 dalton og tilsvarer sekvensen avbildet i figur 3 med unntagelse av mulig glycosylering. Den antatte molekylvekt til det modne, humane protein er 17.387 dalton og tilsvarer sekvensen avbildet i figur 5 med unntagelse av glycosylering. Som benyttet i beskrivelsen, betyr betegnelsen "fullt utviklet" et protein som er uttrykt i en form som mangler en ledersekvens som kan være til stede i full-lengde-transkripter av et naturlig gen.
"Vesentlig homologt" eller "vesentlig identisk" som kan referere seg både til nucleinsyre og aminosyresekvenser, betyr at en spesiell nevnt sekvens, f.eks. en mutantsekvens, varierer fra en referansesekvens ved én eller flere substitusjoner, utslettelser eller addisjoner hvor nettoeffekten av disse ikke resulterer i en uventet funksjonell ulikhet mellom referanse og nevnte sekvenser. For formålene vedrør-ende foreliggende oppfinnelse vil aminosyresekvenser som har større enn 90% likhet, ekvivalent biologisk aktivitet og ekvivalente ekspresjonskarakteristika, bli betraktet som vesentlig identiske eller homologe, og blir inkludert i den rekke av proteiner som definert ved hjelp av uttrykket "interleukin-7". Aminosyresekvenser som har større enn 40% likhet, blir ansett for å være vesentlig like. Ved defini-
sjon av nucleinsyresekvenser vil alle nevnte nucleisyre-sekvenser som er i stand til å kode for i det vesentlige homologe eller lignende aminosyresekvenser, bli betraktet som vesentlig homologe eller like en referanse-nucleinsyre-sekvens. Med det formål å bestemme homologi eller likhet skulle en se bort fra avstumping eller interne utslettelser i referansesekvensen. Sekvenser som har mindre grad av homologi og sammenlignbar bioaktivitet, blir ansett for å være ekvivalente. For de formål som beskrives i foreliggende oppfinnelse, bestemmes det at en "subenhet" av et IL-7-protein består av en aminosyresekvens på minst 20 aminosyrer.
"Rekombinant" som anvendt her, betyr at et protein er fremkommet fra rekombinante (f.eks. mikrobielle eller pattedyr) ekspresjonssystemer, som kan omfatte transformasjon av celler av ethvert slag ved hjelp av teknikker som er kjent for fagmannen. "Mikrobielle" refererer seg til rekombinante proteiner laget i bakterielle eller sopp-(f.eks. gjær) ekspresjonssystemer. Som et produkt definerer "rekombinant mikrobielt" et protein som er i det vesentlige fritt for opprinnelige endogene substanser og ikke ledsaget av en assosiert, naturlig glycosylering. Protein uttrykt i de fleste bakteriekulturer, f.eks. E. coli, vil være fritt for glycan; protein uttrykt i gjær, vil ha et glycosyleringsmønster som er forskjellig fra det som uttrykkes i pattedyrceller.
"Isolert DNA-sekvens" refererer seg til en DNA-polymer i form av et separat fragment eller som en komponent i en større DNA-konstruksjon som er oppnådd fra DNA isolert minst én gang i hovedsakelig ren tilstand, dvs.
fri for kontaminerende endogene materialer og i en mengde eller konsentrasjon som tillater identifikasjon, manipulasjon og gjenvinning av sekvensen og dens komponent-nucleotidsekvenser ved standard biokjemiske metoder, f.eks. ved bruk av en kloningsvektor. Slike isolerte sekvenser oppnås fortrinnsvis i form av en åpen leseramme som ikke er avbrutt av interne ikke-translaterte sekvenser, eller introner, og som typisk er til stede i eukaryote gener. Sekvenser av ikke-translatert DNA kan være til stede ned-
strøms fra den åpne leseramme hvor den samme ikke interferer med manipulasjon eller ekspresjon av de kodende regioner. "Nucleotidsekvens" refererer seg til eh heteropolymer av deoxyribonucleotider. Generelt er DNA-sekvenser som koder for proteinene omtalt i denne oppfinnelse, satt sammen av cDNA-fragmenter og korte oligonucleotidlinkere, eller fra en serie av oligonucleotider, for å gi et syntetisk gen som er i stand til å bli uttrykt i en rekombinant transkripsjonsenhet. IL-7 DNA-er kan også bli isolert fra det genomiske DNA i enhver pattedyrcelle.
"Rekombinant ekspresjonsvektor" refererer seg til et plasmid som omfatter en transkripsjonsenhet som består av en samling av (1) et genetisk element eller elementer som har en regulerende rolle i genekspresjon, f.eks. promotorer eller forsterkere, (2) en strukturell eller kodende sekvens som er transkribert til mRNA og translatert til protein, og (3) passende transkripsjonsinitierings- og termineringssekvenser. Strukturelle elementer som er ment å bli brukt i gjærekspresjonssystemer, inkluderer fortrinnsvis en ledersekvens som er i stand til ekstracellulær sekresjon av translatert protein ved hjelp av en vertcelle. Alternativt, hvor rekombinant protein er uttrykt uten en leder-eller transportsekvens, kan det inkludere en N-terminal methionrest. Denne rest kan eventuelt deretter bli kløyvet fra det uttrykte rekombinante protein for å gi et endelig produkt. Vektorer som er potensielt nyttige i ekspresjon av biologisk aktive IL-7-proteiner, inkluderer også virus, f.eks. fag, eller DNA-fragmenter som kan integreres i vert-^genomet ved hjelp av rekombinasjon.
"Rekombinant mikrobielt ekspresjonssystem" betyr
en i det vesentlige homogen monokultur av passende vert-mikroorganismer, f.eks. bakterier slik som E. coli eller gjær slik som S. cerevisiae, som har en rekombinant trans-krips jonsenhet stabilt integrert i kromosomalt DNA eller bærer den rekombinante transkripsjonsenhet som en komponent av et opptatt plasmid. Generelt er celler som utgjør systemet, etterfølgeren av en enkel forløpertransformant. Rekombinante ekspresjonssystemer slik de er definert herved, vil uttryke heterologt protein etter induksjon av de
regulerende elementer som bindes til DNA-sekvensen eller det syntetiske gen som skal uttrykkes.
2. Utvikling av IL- 7- prøve og cellulære kilder for faktor
Et in vitro kultursystem for B-celleforløpere ble benyttet for å identifisere en faktor utskilt i cellekultur av murine benmargstromaceller som regulerer pre-B-cellevekst. Den observerte, strenge vekstavhengighet av pre-B-celler
på deres stromale matelag i Whitlock-Witte-kulturer antyder at stromacellene produserte en pre-B-cellevekststimulerende aktivitet. For å karakterisere denne vekstaktivitet ble det utviklet en kvantitativ prøve, og det ble søkt etter en cellulær kilde til den pre-B-cellevekststimulerende aktivitet.
Tidlige forsøk for å utvikle en bioprøve benyttet
seg av cellefrie supernatanter fra langtids-stromale benmarg (mate)-lag som en kilde for vekststimulerende aktivitet. Generelt ble prøveresultatene de samme, fordi en stimuler-ingsindeks på bare 2 til 4 ganger over bakgrunnen ble observert. Dette er i tråd med resultatene som ble rapportert av Whitlock et al., Cell 4_8:1009 (1987), og Hunt et al.,
Cell 4_8_:997 (1987). For å omgå denne hindring og å etablere en passende cellulær kilde for vekstfaktor ble det utviklet en udødelig cellelinje ved å transfektere stromaceller fra langtids-benmargkulturer med pSV3 neo-plasmidet som inneholdt SV40 T-antigen-transformerende sekvenser. En av de resulterende klonale cellelinjer, betegnet IxN/A6, ble funnet å sponant produsere en faktor som var i stand til å understøtte veksten av forløper B-celler. Følgelig ble det funnet at sammen-lignbare nivåer av pre-B-cellevekststimulerende aktivitet kunne bli produsert når cellene ble dyrket under serumfrie betingelser i nærvær av 1 ug/ml LPS.
For å optimalisere prøvesensitiviteten ble en høyt anriket populasjon av forløper B-celler oppnådd fra langtids-benmargkulturer.. Et videre celleanrikningstrinn som benyttet passasje over G-10 Sephadex<®>, ble benyttet for å oppnå en mer homogen populasjon som var i stand til å danne passende biologiske prøveresultater. Spesifisiteten i dette prøvesystem ble testet med andre definerte faktorer. Ingen faktor som ble testet, inbefattende IL-la, IL-18, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF, G-CSF, CSF-1, BSF-2, alfa-, beta-og gammainterferon, neuroleukin og transformerende vekstfaktor beta, var i stand til å indusere stimulering av thymidininkorporering over bakgrunnsnivåer innenfor et område av faktorkonsentrasjoner. I tillegg utløste ikke renset mIL-7 noen respons i standard bioprøver for IL-1, IL-2, IL-3, GM-CSF (FDCP2-1D), IL-4, IL-5, G-CSF, CSF-1 og interferon. Imidlertid stimulerte cellefrie supernatanter fra IxN/A6-cellelinjen dannelse av murine makrofag-type-kolonier i myk agar. Fraksjonering av IxN/A6-kondisjonert medium ved DEAE-Sephacel<®->kromatografi adskilte den kolonistimulerende aktivitet fra pre-B-cellevekstfremmende aktivitet. En foretrukket prøveprotokoll for IL-7-aktivitet er beskrevet nedenfor.
3. Prøve for IL- 7 biologisk aktivitet
For å etablere en pre-B-celle-forløperpopulasjon ble benmargskulturer startet og opprettholdt som beskrevet av Whitlock et al., J. Immunol. Meth. 6J7:353 (1983), i RPMI 1640 supplert med en utvalgt del av 5% føtalt, bovint serum (FBS) (Irvine Scientific, Santa Clara, CA, USA), 50 uM 2-mercaptoethanol, 50 U/ml penicillin, 50 yg/ml streptomycin og 2 mM L-glutamin.
De ikke-adherente hematopoietiske celler som ble oppnådd fra denne type kultursystem, er vist å inkludere B-forstadiumceller, pre-B-celler og noen tidlige B-celler. Se Whitlock et al., Cell _32:903 (1983). Det er av betydning at Dorshkind et al., J. Immunol. 137:3457 (1986), demonstrerte at celler fra slike benmargskulturer var i stand til å rekonstituere både B-celle- og T-cellepopulasjonene i kombinerte immundefekte mus, noe som indikerte at et lymfoid stamcelleelement også kan være til stede i disse kulturer. For tiden er ikke det fullstendige repertoar av responsive celler blitt bestemt, men klart nok inkluderer denne populasjon forløperceller til B-linjen. Disse cellene viser et lymfocyttlignende utseende med en stor kjerne og en liten krans av cytoplasma som er i tråd med en pre-B-celle-fenotype.
For måling blir ikke-adherente pre-B-celler fjernet fra adherente stromalag i Whitlock-Witte-kulturer ved for-siktig pipettering, bunnfelt ved hjelp av sentrifugering og resuspendert i 1-2 ml av Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) som inneholder 5% FBS, 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin og 2 mM L-glutamin (prøvemedium).
Cellene blir så påført på en liten søyle av Sephadex<®>G-10 (varemerke til Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Uppsala, SE, for gelfiltreringsmedium) i en tetthet på mindre enn 10 g celler pr. ml gel, for å fjerne feil-plasserte, kontaminerende adherente eller stromaceller, og så inkubert ved romtemperatur i 10 minutter, som beskrevet av Ly et al., J. Immunol. Meth. 5_:239 (1974). Pre-B-cellene blir så eluert fra G10-søylen med prøvemedium, vasket og resuspendert til en tetthet på 2,5 x 10^ celler/ml i prøve-medium. Prøver som skal måles, blir seriefortynnet i individuelle brønner i en 96-brønns mikrotiterplate i et sluttvolum på 50 ml. 50 mikroliter av cellesuspensjonen
(12.500 celler/brønn) blir tilsatt hver brønn, og platene blir inkubert i 4 8 timer i en fuktig CO2-inkubator som inneholder 7,5% CO2, 5% 0,,, balansert med . Kulturene blir pulsmerket de siste fire timer av inkubasjonen med 2 uCi/brønn av tritiert. thymidin (<3>H-TdR; NEN, 60-80 Ci/mmol) i et volum på 25 mikroliter. Kulturer blir høstet med en automatisk høster på glassfiberfiltre og inkorporert radioaktivitet bestemt ved væskescintillasjonstelling. En enhet av IL-7 er definert som mengden av faktor som kreves for å indusere halvmaksimal<3>H-TdR-inkorporering under de betingelser som IL-7-prøven beskrev ovenfor.
Resultatene av typiske pre-B-celleproliferasjons-prøver som benytter grove og rensede preparater av rekombinant IL-7, er avbildet i figur 6, panel A.
4. Isolering av renset, naturlig protein
Utvikling av rensemetoder for murint IL-7 avslørte at den biologiske aktivitet til faktoren er stabil innenfor et vidt spektrum av betingelser som inkluderte ytter-punktene til pH (2,1 til 9,0) og løsninger som inneholdt de organiske løsningsmidler acetonitril eller n-propanol. Isolering av aktiviteten ved SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese) indikerte at IL-7-aktiviteten var assosiert med et protein på Mr 25.000 og var stabil i nærvær av SDS og temperaturer på 70°C. Imidlertid ødela redusering av proteinet gjennom kontakt med 1% 2-mercaptoethanol fullstendig dens biologiske aktivitet, hvilket indikerte nærvær av intramolekylære disulfidbindinger. Preparativ SDS-PAGE oppløste et enkelt protein av Mr 25.000 som falt med den biologiske aktivitet. Enn videre bandt radioaktivt merket IL-7 seg spesifikt til celler som responderte på denne faktor, hvilket antydet at IL-7, på samme måte som andre polypeptidhormoner, binder seg til spesifikke reseptorer på overflaten av cellene. Rensnings-protokollen resulterte i en 10 millioner ganger opprensning med et endelig utbytte på 35%. En N-terminal sekvens oppnådd ved Edman-nedbrytning, viste X-X-His-Ile-Lys-Asp-Lys-Glu-X-Lys-Ala-Tyr-Glu-X-Val-Met som var unik når den ble sammenlignet i en database med publiserte proteinsekvenser.
Det rensede IL-7 viste en antatt spesifikk aktivitet på omkring 4 x 10^ enheter/ug protein og var aktivt i en konsentrasjon på 10 pM, basert på visuelle bedømm-elser av proteinkonsentrasjon bestemt ved intensiteten til sølvfarget SDS-PAGE. Denne opprinnelige beregning av spesifikk aktivitet i pre-B-celleproliferasjonsprøven er blitt revidert nedover i lys av mer nøyaktige bestemmelser for proteinkonsentrasjoner. Den spesifikke aktivitet av renset rekombinant IL-7 i pre-B-celleproliferasjonsprøven synes å være i området 1-2 x 10^ enheter/ug.
5. Isolering av cDNA- er
For å sikre den murine kodende sekvens ble en DNA-sekvens som kodet for mIL-7, isolert fra et cDNA-bibliotek laget ved revers transkripsjon av polyadenylert RNA som var isolert fra den transformerte, murine stromacellelinje IxN/A6. Biblioteket ble screenet ved direkte ekspresjon av samlede cDNA-fragmenter i ape C0S-7-celler ved bruk av en pattedyrekspresjonsvektor (pDC20l) som benytter regulerende sekvenser oppnådd fra SV40 og adenovirus 2. Omtrent 720.000 cDNA-er ble screenet i blandinger på omtrent 1000 cDNA-er inntil måling av superriatanten til en trans-fektantblanding oppdaget en 10-ganger økning i thymidininkorporering over bakgrunn. Et frosset lager av bakterier fra denne positive blanding ble så benyttet for å oppnå plater på omtrent 200 kolonier. Plasmid-DNA fra koloniene på hver av disse platene ble samlet og transformert inn i C0S-7-celler, og en positiv blanding ble identifisert. Individuelle kolonier fra denne blanding ble screenet inntil en enkelt klon ble oppdaget som dirigerte syntese av et 25 kilodalton protein med målbar IL-7-aktivitet. Denne klon ble isolert, og dens innskudd ble sekvensert for å bestemme den kodende sekvens til det murine cDNA vist i figur 2. Denne cDNA inkluderer en 54 8 basepar ikke-translatert region tilstøtende translas jonsstartssetet. St ar ts setet for det fullt utviklede protein ble dedusert ved sammenligning til en N-terminal aminosyresekvens oppnådd fra høyt rensede preparater av IL-7 oppnådd fra A6-cellesupernatanter. Den kodende region inneholder seks cysteinrester og to potensielle N-glycosyleringsseter.
Prober ble konstruert fra den murine sekvens og benyttet for å screene humane genomiske DNA-biblioteker og humane cDNA-biblioteker oppnådd fra kulturer av den humane lever-adenocarcinom-cellelinje SK-HEP-1 (ATCC HTB-5 2). cDNA-kloner som hybridiserte til oligonucleotidprober oppnådd
fra humane, genomiske sekvenser og prober som omfattet utvalgte 3 - og 5ikke-translaterte sekvenser til det murine gen, ble så isolert og sekvensert. Full-lengde cDNA-sekvensen som således ble isolert, er avbildet i figur 4, og den utledede kodingssekvens er avbildet i figur 5.
Humant IL-7 kodes for av et multi-exon-gen. Ved isolering av cDNA-klonen beskrevet i figur 1, ble flere alternative mRNA-konstruksjoner observert, og disse kan bli tilskrevet forskjellig mRNA-"splicing"-prosesser etter transkripsjon. Disse alternative konstruksjoner som deler store regioner av homologi med de cDNA-er som er spesifikt krevet herved, betraktes å være innenfor området for foreliggende oppfinnelse.
6. Syntetiske DNA- konstruksjoner
I sine nucleinsyreutførelsesformer gir den foreliggende oppfinnelse DNA-sekvenser som koder for pattedyr IL-7, en IL-7-analog eller avkortet IL-7. Eksempler på pattedyr-IL-7 inkluderer primat IL-7, humant IL-7, murint, hund-, katt-, hest-, bovint, gris-, sau-, hjort- og geit-lL-7. IL-7 DNA blir fortrinnsvis fremstilt i en form som er i stand til å bli uttrykt i en rekombinant transkripsjonsenhet under kontroll av pattedyr^mikrobielle eller virale transkripsjons-eller translasjons-kontrollelementer. F.eks. vil en sekvens som skal uttrykkes i en mikroorganisme, ikke inneholde introner. I foretrukne deler omfatter DNA-sekvensene minst én, men eventuelt mer enn én, sekvenskomponent som er oppnådd fra en cDNA-sekvens eller kopi av denne. Slike sekvenser kan bli bundet eller flankert av DNA-sekvenser som er fremstilt ved sammensetning av syntetiske oligonucleotider. Eksempler på sekvenser inkluderer de som i det vesentlige
er homologe med nucleotidsekvensene avbildet i figur 3 og figur 5. Etter ønske kan de kodende sekvenser inbefatte kodoner som koder for én eller flere tilleggsaminosyrer beliggende i N-enden, f.eks. en N-terminal ATG-kodon som spesifiserer methionin bundet til leseramme med nucleotidsekvensen. På grunn av kodedegenerering kan det være betraktelig variasjon i nucleotidsekvensene som koder for den samme aminosyresekvens; et eksempel på en DNA-utførelsesform er den som tilsvarer sekvensen til nucleotidene 1-387 i figur 3. Syntetiske DNA-sekvenser som koder for IL-7-proteiner som innbefatter nucleotidsekvensener som er forandret f or å introdusere restriksjonsseter eller foretrukket kodonbruk for bakteriell ekspresjon, er innbefattet i området for oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse gir også ekspresjonsvektorer for å produsere anvendbare mengder renset IL-7 som kan omfatte syntetiske eller cDNA-utledede DNA-fragmenter som koder for pattedyr-IL-7 eller IL-7-analoger eller subenheter som er operativt bundet til regulerende elementer oppnådd fra pattedyr-, bakterie-, gjær-, bakteriofage eller virale gener. Anvendbare regulerende elementer er beskrevet mer detaljert nedenfor. Etter transformasjon eller transfeksjon av passende cellelinjer kan slike vektorer bli indusert til å uttrykke rekombinant protein.
7. Rekombinante ekspresjonssystemer
Pattedyr-IL-7 kan bli uttrykt i pattedyr eller insektceller, gjær, bakterier eller andre celler under kontroll av passende promotorer. Cellefrie translasjonssys-temer kunne også bli benyttet for å produsere pattedyr-IL-7 ved å benytte RNA-er som stammer fra DNA-konstruksjoner ifølge foreliggende oppfinnelse. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for bruk i bakterielle, fungale, gjær-og pattedyr-celleverter er beskrevet av Pouwels et al.,. CloningVéctors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985) ,
den relevante omtale av disse er herved inkorporert ved referanse.
Forskjellige pattedyr-cellekultursystemer kan bli benyttet for å uttrykke rekombinant protein. Eksempler på pattedyrekspresjonssystemer inkluderer C0S-7-linjer av ape-nyrefibroblaster, beskrevet av Gluzman, Cell 2_3: 175 (1981) , og andre cellelinjer som er i stand til å uttrykke en sammenlignbar vektor, f.eks. C127, 3T3, CHO, HeLa ogBHK-cellelinjer. Pattedyrekspresjonsvektorer kan omfatte ikke-transkriberte elementer slik som en replikasjonsstart, en passende promotor og forsterker, og andre 5'-eller 3'-flan-kerende ikke-transkriberte sekvenser, og 5'-eller 3'-ikke-translaterte sekvenser slik som nødvendige ribosom-bindingsseter, et polyadenyleringssete, donor og akseptor-seter for splicing, og termineringssekvenser. DNA-sekvenser utledet fra det SV40 virale genom, f.eks. SV40-start, tidlig promotor, forsterker, seter for splicing og polyadenylering, kan bli benyttet for å gi de andre genetiske elementer som kreves for ekspresjon av en heterolog DNA-sekvens. Ytterligere detaljer vedrørende bruk av pattedyr-høyekspresjons-vektorer for å produsere et rekombinant pattedyr-IL-7, er gitt i eksempel 3 og 8 nedenfor. Eksempelvise vektorer kan bli konstruert som beskrevet av Okayama og Berg,
Mol. Cell. Biol. 2:28° (1983) Cosman et al., Nature 312;768
(1984), Cosman et al., Mol. Immunol. 23:935 (1986) eller Clark et al., U.S. patent 4.675.285.
Gjærsystemer som fortrinnsvis benytter Saccharomyces-arter slik som S. cerevisiae, kan også anvendes for ekspresjon av de rekombinante proteiner ifølge oppfinnelsen, såvel som gjær fra andre slekter, f.eks. Pichia eller Kluyveromyces.
Generelt vil anvendbare gjærvektorer innbefatte replikasjonsstart og seleksjonsmarkører som tillater transformasjon av både gjær og E. coli, f.eks. ampicillinresistens-genet til E. coli og S. cerevisiae TRPl-genet og en promotor som stammer fra et høyt uttrykt gjærgen for å indusere transkripsjon av en nedstrøms strukturell sekvens. Slike promotorer kan oppnås fra gjær-transkripsjonsenheter som koder høyt uttrykte gener slik som bl.a. 3-fosfoglyceratkinase (PGK), a-faktor, sur fosfatase eller varmesjokkproteiner.
Den heterologe strukturelle sekvens er sammensatt i passende ramme med translasjonsstart og termineringssekvenser og fortrinnsvis en ledersekvens som er i stand til å dirigere sekresjon av translatert protein til det ekstracellulære medium. Etter ønske kan den heterologe sekvens kode et fusjonsprotein som innbefatter et N-terminalt identifikasjons-peptid (f.eks. Asp-Tyr-Lys-(Asp)4~Lys) eller andre sekvens-holdige, ønskede karakteristika, f.eks. stabilisering eller forenklet rensning av uttrykt rekombinant produkt.
Nyttige gjærvektorer kan bli satt sammen ved bruk
av DNA-sekvenser fra pBR322 for seleksjon og replikasjon i E. coli (Amp -genet og replikasjonsstart) og gjær-DNA-sekvenser innbefattet en glucoseundertrykkende alkohol-dehydrogenase 2 (ADH2)-promotor. ADH2-promotor er blitt beskrevet av Russel et al., J. Biol. Chem. 258:2674 (1982)
og Beier et al., Nature 300:724 (1982). Slike vektorer kan også innbefatte et gjær-TRPl-gen som en seleksjonsmarkør og gjær 2 u replikasjonsstart. En gjærledersekvens, f.eks. a-faktorleder som dirigerer sekresjon av heterologe proteiner fra en gjærvert, kan bli innsatt mellom promotoren og det strukturelle gen som skal uttrykkes. Se Kurjan et al.,
U.S. patent 4.546.082; Kurjan et al., Cell 30:933 (1982);
og Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 8J.:5330 (1984). Ledersekvensen kan bli modifisert slik at den inneholder
nær sin 3'-ende et av de mest anvendbare restriksjonsseter for å underlette fusjon av ledersekvensen til fremmede gener.
Passende gjærtransformasjonsprotokoller er kjent
for fagmannen; en eksempelvis metode er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929 (1978) der det selekteres for Trp<+->transformanter i et selektivt medium som består av 0,67% gjærnitrogenbase, 0,5% casaminosyrer,
2% glucose, 10 ug/ml adenin og 20 ug/ml uracil.
Vertstammer som er transformert med vektorer som omfatter ADH2-promotoren,kan dyrkes for ekspresjon i et rikt medium som består av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% glucose supplementert med 80 ug/ml adenin og 80 ug/ml uracil. Opphevelse av undertrykkelse av ADH2-promotor opptrer når mediet tømmes for glucose. Ubehandlede gjærsupernatanter blir høstet ved filtrering og holdt ved 4°C før videre rensning. Bruk av et gjærekspresjonssystem for å produsere et rekombinant pattedyr-IL-7 er beskrevet i eksempel 4 nedenfor.
Anvendelige ekspresjonsvektorer for bakteriell bruk er konstruert ved å sette inn en strukturell DNA-sekvens som koder for pattedyr-IL-7 sammen med passende translasjonsstart og termineringssignaler i en operativ lesefase med en funksjonell promotor. Vektoren vil omfatte én eller flere fenotypiske seleksjonsmarkører og en start på replikasjon for å sikre forsterkning innen vertcellen. Passende prokaryote verter for transformasjon innbefatter E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium og forskjellige arter innen slektene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus, skjønt andre kan også bli benyttet etter valg.
Ekspresjonsvektorer er passende konstruert ved å kløyve cDNA-kloner i seter nær kodonet som koder for den N-terminale rest i det fullt utviklede protein. F.eks. kan det murine cDNA bli kuttet med Ndel eller Clal, eller det humane cDNA med Clal for å danne et fragment som omfatter hovedsakelig hele den kodende region. Syntetiske oligonucleotider kan bli benyttet for å "addere tilbake" enhver delert del av den kodende region og gi en bindingssekvens for ligering av det kodende fragment i passende leseramme i ekspresjonsvektoren, og etter ønske, et kodon som spesifiserer et startmethionin.
Som et representativt, men ikke begrensende eksempel, kan anvendbare ekspresjonsvektorer for bakteriell bruk omfatte en seleksjonsmarkør og bakteriell replikasjonsstart oppnådd fra kommersielt tilgjengelige plasmider som omfatter genetiske elementer av den velkjente kloningsvektor pBR322 (ATCC 37017). Slike kommersielle vektorer innbefatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Disse pBR322 "ryggrad"-seksjoner blir kombinert med en passende promotor og den strukturelle sekvensen som skal uttrykkes. Et særlig anvendbart bakterielt ekspresjonssystem benytter fagen ^PL-promotor og cI857ts termolabil repressor. Plasmidvektorer som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection som inkorporerer derivater av KPTLi-promotor, innbefatter plasmid pHUB2, levedyktig i E. coli-stamme JMB9 (ATCC 37092) og pPLc28, beliggende i E. coli RR1 (ATCC 53082). Andre anvendbare promotorer for ekspresjon i E. coli, innbefatter T7 RNA-polymerasepromotoren beskrevet av Studier et al.,
J. Mol. Biol. 189:113 (1986), lacZ-promotoren beskrevet av Lauer, J. Mol. Appl. Genet. _1:139-147 (1981) og tilgjengelig som ATCC 37121, og tac-promotoren beskrevet av Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 412) og tilgjengelig som ATCC 37138.
Etter transformasjon av en passende vertstamme og vekst av vertstammen til en passende celletetthet er den selekterte promotor derepressert ved passende midler (f.eks. temperaturendring eller kjemisk induksjon) og cellene dyrket i en ytterligere periode. Cellene er typisk høstet ved sentrifugering, slått istykker ved hjelp av fysiske eller kjemiske virkemidler og det resulterende grove ekstrakt beholdt for videre rensning. Celler er dyrket, f.eks. i en 10-liters fermentor hvor det benyttes betingelser som maksimal lufttilgang og kraftig rysting. Et antiskummende middel (Antifoam A) blir fortrinnsvis benyttet. Kulturene blir dyrket ved 30°C i superinduksjonsmedium beskrevet av Mott et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:88 (1985), og kan valg-fritt inneholde antiobiotika, er derepressert ved en celletetthet som tilsvarer A6Q0= 0,4-0,5 ved å heve temperaturen til 42 C, og høstet fra 2-20, fortrinnsvis 3-6, timer etter temperaturøkningen. Cellemassen blir først konsentrert ved filtrering eller ved hjelp av andre virkemidler, så sentrifugert ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4°C etterfulgt av rask frysing av cellepelleten.
Bruk av et bakterielt ekspresjonssystem for å produsere et rekombinant pattedyr-IL-7 er beskrevet i eksempel 5 nedenfor.
8. Rensningsprosesser
Fortrinnsvis er renset pattedyr-IL-7 eller bioekvivalente homologer fremstilt ved å dyrke passende vert/vektor-systemer for å uttrykke de rekombinante translasjonsprodukter til de syntetiske genene i foreliggende oppfinnelse, som så er renset fra kulturmedier.
En alternativ fremgangsmåte for å produsere renset IL-7 omhandler rensning fra cellekultursupernatanter. Ved denne fremgangsmåte benyttes en cellelinje som utvikler anvendelige mengder av proteinet som skal benyttes. Supernatanter fra slike cellelinjer kan eventuelt bli konsentrert ved bruk av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrer-ingsfilter, f.eks. en "Amicon" (varemerke til W.R. Grace&Co., Danvers, MA, USA) eller "Pellicon" (varemerke til Millipore Corp., Bedford, MA, USA) ultrafiltreringsenhet. Etter konsentrasjonstrinnet kan konsentratet ble påført på en passende anionbytterharpiks, f.eks. en matriks eller et sub-strat som har virksomme diethylaminoethyl (DEAE)-grupper. Disse matriser kan være polyacrylamid, agarose, dextran, cellulose eller andre typer vanligvis benyttet i protein- rensning. En foretrukket matriks er DEAE-Sephacel<®>(Pharmacia). Når medier som inneholder DEAE-grupper blir benyttet, blir ekstrakter som inneholder IL-7, anvendt ved en svakt basisk pH (f.eks. pH 8) og ved en natriumkloridkonsentrasjon (eller annet passende salt) på omtrent 100 mM. Mange kontaminer-
ende proteiner blir bundet ved ionebytteren, mens IL-7 finnes i ubundne fraksjoner.
Etter anionbytterkromatografi kan et kationbytter-trinn bli benyttet. I dette trinn er IL-7-holdige fraksjoner påført på en kationbytter ved svakt sure betingelser med lavt salt (f.eks. pH 5, 100 mM NaCl). IL-7 blir bundet av bytteren og kan bli eluert i en høyere renset form og ved høyere saltkonsentrasjoner og ved svakt basisk pH. Egnede kation-byttere innbefatter forskjellige uløselige matriser som omfatter sulfopropyl- eller carboxymethylgrupper. Sulfopropyl-grupper blir foretrukket. Et anvendbart materiale for IL-7-rensning er "SP-Trisacryl" (Pharmacia-LKB). Etter kation-bytterkromatografi har et affinitetstrinn som benytter en matriks som har en blåfargeligand, vist seg å være nyttig.Passende fargeligander inkluderer blå B som kan oppnåes
som et konjugat med agarose (blå B agarose). Andre farge-ligandekvivalenter kan også bli benyttet. Endelig kan ett eller flere revers-fase høyprestasjons-væskekromatografi (RP-HPLC)-trinn som benytter hydrofobe RP-HPLC-medier,
f.eks. silicagel som har påkoblet methyl eller andre ali-fatiske grupper, bli benyttet til videre rensning av en IL-7-blanding. Noen eller alle foregående rensetrinn, i forskjellige kombinasjoner, kan også bli benyttet for å gi et homogent rekombinant protein.
Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, er vanligvis isolert ved en første ekstraksjon fra cellepellets etterfulgt av ett eller flere konsentrasjons-, utsaltings-, væskeionebytter- eller størrelseeksklusjonskromatografi-
trinn. Proteinet kan være renaturert etter bakteriell ekspresjon ved kontakt med en katalytisk reduserende substans ved en proteinkonsentrasjon på 10-50 ug/ml i nærvær av 1-6 M guanidin-HCl for å forhindre aggregering. Endelig
kan høyprestasjons-væskekromatografi (HPLC) anvendes for sluttrensningstrinn. Mikrobiologiske celler som benyttes i ekspresjon av rekombinant pattedyr-IL-7, kan bli slått istykker ved hjelp av enhver passende metode, innbefattet fryse-tine-gjentagelser, sonikering, mekanisk ødeleggelse, eller bruk av cellelyserende midler.
Fermentering av gjær som uttrykker pattedyr-IL-7 som et utskilt protein, forenkler rensning i stor grad. Utskilt rekombinant protein som resulterer fra en storskala-fermentering, kan bli renset ved hjelp av metoder som er analoge med dem beskrevet av Urdal et al., J. Chromatog. 296;171 (1984). Denne referanse beskriver to sekvensielle, revers-fase HPLC-trinn for rensning av rekombinant human GM-CSF på en preparativ HPLC-søyle.
Som benyttet her, refererer "renset" seg til et pattedyr-IL-7-preparat som har en spesifikk aktivitet på
minst omkring 10 4enheter pr. mikrogram (ug) protein i en pre-B-celleproliferasjonsanalyse som beskrevet et annet sted i beskrivelsen. Fortrinnsvis viser rensede IL-7-preparater en spesifikk aktivitet på minst omkring 10^ enheter/ug.
9. Biologisk aktive proteinanaloger
I forskjellige proteinutførelsesformer gir den foreliggende oppfinnelse vesentlig homogene, rekombinante pattedyr-IL-7-polypeptider som er frie for kontaminerende endogene materialer og eventuelt, uten å være assosiert med et naturlig mønster for glycosylering. De naturlig murine og humane IL-7-molekyler blir gjenvunnet fra cellekultur som glycoproteiner som har en tilsynelatende molekylvekt ved SDS-PAGE på omkring 25 kilodalton (kD). De IL-7 som er uttrykt i pattedyrekspresjonssystemer, f.eks. C0S-7-celler, kan være like eller litt forskjellige i molekylvekt og glycosylerings-mønster sammenlignet med de naturlige molekyler, avhengig av ekspresjonssystemet. Ekspresjon av IL-7 DNA-er i bakterier slik som E. coli, gir ikke-glycosylerte molekyler som har en tilsynelatende molekylvekt på omkring 16 kD ved SDS-PAGE
under ikke-reduserende betingelser.
Rekombinante IL-7-proteiner innen området for foreliggende oppfinnelse innbefatter også N-terminalt methionyl murint og humant IL-7. Ytterligere påtenkte utførelsesformer er pattedyr-IL-7 uttrykt som fusjonsproteiner med en poly-peptidleder som omfatter sekvensen Asp-Tyr-Lys-(Asp^)-Lys eller andre passende peptid- eller proteinsekvenser som benyttes som hjelp for fremstilling i mikroorganismer eller rensning av mikrobielt uttrykte proteiner.
Bioekvivalente eller biologisk aktive homologer eller analoger til proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter forskjellige muterte former, f.eks. forkortede versjoner av IL-7 hvori terminale eller interne rester eller sekvenser som ikke er nødvendige for biologisk aktivitet, er delert,
og også alloproteiner som de beskrevet av Koide et al.,
Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85^:6237 (1988). Som benyttet her, betyr uttrykkene "bioekvivalent" og "biologisk aktivt" at et spesielt protein har samme biologiske aktivitet som et naturlig lL-7-molekyl. Andre muterte former omtalt her, er de hvor én eller flere cysteinrester er blitt delert eller erstattet med andre aminosyrer, f.eks. nøytrale aminosyrer, for å gi gunstigere renaturerings- eller stabilitets-karakteristika. Andre fremgangsmåter vedrørende mutagenese involverer modifikasjon av tilstøtende dibasiske aminosyrerester for å øke ekspresjon i gjærsystemer hvor KEX2-proteaseaktivitet er til stede, eller modifikasjon av pro-teinsekvensen for å eliminere ett eller flere N-bundne glycosyleringsseter. Det er også blitt observert at delesjon av residuer 121-139 av det humane IL-7-molekyl som ikke har noen motpart i det murine IL-7-molekyl, ikke gir opphør av biologisk aktivitet i murine eller humane pre-B-celle-analysesystemer.
Som anvendt her, refererer "mutert aminosyresekvens" seg til et polypeptid som er kodet for av en nucleotidsekvens som med hensikt er gjort forskjellig fra en naturlig sekvens. "Mutant protein" eller "mutein" betyr et protein som omfatter en mutert aminosyresekvens. "Naturlig sekvens" refererer seg til en aminosyre eller nucleinsyre-sekvens som er identisk med en villtype eller naturlig form av et gen eller protein. Betegnelsene "KEX2 protease gjenkjennelsessete" og "N-glycosyleringssete" er definert nedenfor. Betegnelsen "inaktivere" som benyttet når det gjelder definisjon av bestemte aspekter av foreliggende oppfinnelse, betyr å forandre et selektert KEX2-protease-gjenkjennelsessete for å retardere eller forhindre kløyving av KEX2-proteasen i Saccharomyces cerevisiae, eller å forandre et N-glycosyleringssete for å forhindre covalent binding av oligosacchariddelene til spesielle aminosyrerester.
Setespesifikke mutageneseprosedyrer kan anvendes
for å inaktivere KEX2-proteaseprosesseringssetene ved delesjon, addisjon eller substitusjon av rester for å forandre Arg-Arg, Arg-Lys og Lys-Arg-par for å eliminere opp-treden av disse tilstøtende basiske rester. Lys-Lys-par er betraktelig mindre følsomme overfor KEX2-kløyving, og over-føring av Arg-Lys eller Lys-Arg til Lys-Lys representerer en konservativ og foretrukket fremgangsmåte for å inaktivere KEX2-seter. De resulterende "muteiner" er mindre følsomme overfor kløyving av KEX2-proteasen ved andre lokalisasjoner enn gjær a-faktor-ledersekvensen hvor kløyving i forbind-else med sekresjon er ønsket.
Mange utskilte proteiner mottar kovalent bundne carbohydratenheter etter translasjon, ofte i form av oligo-saccharidenheter bundet til asparagin-sidekjeder ved N-glycosidbindinger. Både strukturen og antallet oligo-sacharridenheter bundet til et spesielt utskilt protein, kan være høyst variable og resulterer i en lang rekke tilsynelatende molekylære masser som skyldes et enkelt glyco-protein. mIL-7 og hIL-7 er utskilte glycoproteiner av denne type. Forsøk på å uttrykke glycoproteiner i rekombinante systemer kan kompliseres ved heterogeniteten som kan tilbakeføres til denne variable carbohydratkomponent. F.eks. kan rensede blandinger av rekombinante glycoproteiner slik som human eller murin granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) sameksistere der vektmessig 0 til 50% utgjøres av carbohydrat. Miyajima et al., EMBO Journal 5_:1193 (1986) rapporterte ekspresjon av en rekombinant, murin GM-CSF i hvilken N-glycosyleringsseter er blitt mutert for å forhindre glycosylering og redusere heterogeniteten til det gjær-uttrykte produkt.
Tilstedeværelsen av variable mengder av assosiert carbohydrat i rekombinante, utskilte glycoproteiner kompliserer rensningsprosedyrene, hvorved utbyttet reduseres. Hvis glycoproteinet i tillegg skulle bli benyttet som et terapeutisk middel, er det en mulighet for at mottagerne kan utvikle allergiske reaksjoner mot gjærcarbohydrat-delene, hvilket krever at terapien må avsluttes. Av disse grunner, kan biologisk aktive, homogene analoger av immun-regulerende glycoproteiner med redusert carbohydratinnhold, være ønskelig for terapeutisk bruk.
Funksjonelle mutantanaloger av pattedyr-IL-7 som har inaktiverte N-glycosyleringsseter, kan bli produsert ved oligonucleotidsyntese og ligering eller ved setespesifikke mutageneseteknikker som beskrevet nedenfor. Disse analoge proteiner kan produseres i en homogen, redusert carbohydratform med godt utbytte ved bruk av gjærekspresjonssystemer. N-glycosyleringsseter i eukaryote proteiner erkarakterisert vedaminosyretripletten Asn-A<1->Z hvor A"<1>" er enhver aminosyre unntatt Pro, og Z er Ser eller Thr. I denne sekvens gir asparagin en sidekjedeaminogruppe for covalent binding til carbohydrat. Et slikt sete kan elimineres ved å substituere en annen aminosyre for Asn eller for residuet Z, delere Asn eller Z, eller innsette en ikke-Z aminosyre mellom A<1>og Z, eller en aminosyre annen enn Asn mellom Asn og A"<*>". Fortrinnsvis er substitusjoner gjort konservative; dvs. de mest foretrukne substitutt-aminosyrer er de som har fysiokjemiske karakteristika som ligner de til det residuum som skal erstattes. På samme måte, når en delesjon eller innføyelsesstrategi er utviklet, skulle den potensielle effekt av delesjonen eller innføy-elsen på biologisk aktivitet tas i betraktning.
I tillegg til de spesielle muteiner beskrevet ovenfor.
kan tallrike DNA-konstruksjoner som inkluderer alle eller deler av nucleotidsekvensene avbildet i figur 1-5, sammen med oligonucleotidkassettene som omfatter ytterligere anvendbare restriksjonsseter, bli fremstilt som det passer. Mutasjoner kan bli introdusert ved spesielle steder ved å syntetisere oligonucleotider som inneholder en mutert sekvens, flankert av restriksjonsseter som muliggjør ligering til fragmenter av den naturlige sekvens. Etter ligering koder den resulterende, rekonstruerte sekvens for et mutein som har den ønskede aminosyreinnføyelse, substitusjon eller delesjon.
Alternativt kan oligonucleotid-rettede, setespesif ikke mutageneseprosedyrer bli benyttet for å gi et endret gen som har spesielle kodoner forandret ifølge substitusjonen, delesjonen eller innføyelsen som ønskes. Walder et al.,
Gene 4_2:133 (1986); Bauer et al., Gene _37:73 (1985); Craik, Biotechniques, januar 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and.Methods (Plenum Press, 1981);
og U.S. patent 4.518.584 omtaler passende teknikker og er inkorporert herved ved referanse.
I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er aminosyresekvensen IL-7 bundet til en gjær-a-faktor-ledersekvens via en N-terminal fusjonskonstruksjon som omfatter et nucleotid som koder for peptidet Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK). Den sistnevnte sekvens er uttalt antigen og gir en epitop som reversibelt bindes av spesifikke, monoklonale antistoffer, hvilket muliggjør rask måling og enkel rensning av uttrykt, rekombinant protein. Denne sekvens er også spesifikt kløyvet av bovin mucosal entero-kinase ved resten som følger like etter Asp-Lys-paret. Fusjonsproteiner tilkoblet dette peptid, kan også være resistent til intracellulær nedbrytning i E. coli. En alternativ konstruksjon er Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Glu-Ile-Gly-Arg-Pro som gir et faktor X gjenkjennelsessete umiddelbart nedstrøms fra enterokinasesetet.
De følgende eksempler illustrerer spesielle aspekter av foreliggende oppfinnelse, innbefattet rensning av naturlig murint IL-7, kloning og ekspresjon av gener som koder for murine og humane IL-7-proteiner, rensning av rekombinante murine og og humane IL-7-proteiner til homogenitet, biologiske analyser som involverer bruk av rensede IL-7-proteiner og tilførsel av rensede IL-7-proteiner til pattedyr i et modell-terapeutisk regime. I eksemplene var alle prose-dyrene som involverte bruk av DNA-enzymer, f.eks. restrik-sjonsendonucleaser og DNA-polymeraser, utført ifølge instruk-sjonene som var gitt av tilvirkeren. Alle prober ble merket med<32>P. Andre standard nuclemsyremanipulasjonsteknikker er hovedsakelig lik dem som er beskrevet av Maniatis, supra, og av Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley-Interscience, Media, PA, USA) .
Eksempel 1: Utvikling av en murin IL-7-produserende cellelinje (IxN/A6) ved transfeksjon; rensning av murint IL-7
fra cellesupernatanter
Adherente benmarg-stromaceller ble transfektert med plasmidet pSV3 neo som inneholder SV40 T-antigen-transformerende sekvenser under anvendelse av en calciumfosfat-fremgangsmåte som beskrevet av Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1:327 (1982), og Graham et al., Virology 52:456
(1973); som modifisert av Wigler et al., Cell 14:725 (1978). De transfekterte, adherente celler ble fjernet med trypsin:EDTA og klonet ved hjelp av begrenset fortynning. Supernatantene fra de resulterende kloner ble testet for IL-7-aktivitet, og den beste produsent (IxN/A6) ble eks-pandert for videre studium. Denne cellelinje ble monitorert på en månedlig basis for mycoplasma ved bruk av kommersielt tilgjengelig mycoplasma-påvisningssett.
Kondisjonert medium fra IxN/A6-celler ble utviklet
i 1750 cm 2vevskultur-rollerflasker (Falcon nr. 3029) på følgende måte. Når cellene nådde sammenflytning, ble mediet erstattet med 1 liter/rollerflaske med serumfritt RPMI supplert med 2,3 g/liter glucose og 1,54 g/liter natrium-bicarbonat og inneholdt 1 ug/ml S. typhimurium LPS som stimulant. Flaskene ble gasset med 10% CO2i luft og
inkubert i seks dager. Supernatanten ble høstet og så konsentrert 20 ganger i et Amicon DC10 hulfiber-apparat (10.000 MW avkutting). De urensede konsentrater ble sterilisert ved filtrering før måling og rensning.
En liter av det urensede, konsentrerte, kondisjonerte medium ble justert til pH 8 med 1 N NaOH og fortynnet med sterilt destillert vann til en ledningsevne på 1 m Siemen/cm (en ledningsevne på 1 m Siemen/cm tilsvarer en natriumkloridkonsentrasjon av 100 mM på et radiometer CDM85 ledningsevne-måler) . Konsentratet ble deretter påført på en DEAE-Sephacel<®>
(Pharmacia)-søyle (5,0 x 15 cm) tidligere ekvilibrert med 20 mM Tris-HCl (pH 8) og inneholdende 100 mM NaCl. Utløpet ble målt ved OD280'°9 ^enProteinn°l^i9e væskefraksjon som kom gjennom, ble samlet for videre rensning.
Den ikke-bindende fraksjon fra DEAE-Sephacel<®->søylen ble justert til pH 5 med 1 M sitronsyre (fri syre). Dette ble så påført direkte på en søyle (3,2 x 10,5 cm) av "SP-Trisacryl" (Pharmacia-LKB) som tidligere var blitt ekvilibrert i 10 mM citrat (pH 5,0) og som inneholdt 100 mM NaCl. Søylen ble vasket med fem søylevolumer av ekvilibreringsbuffer etterfulgt av vasking med 5 søylevolumer av 20 mM Tris-HCl (pH 8). Når pH i væsken fra søylen nådde pH 8 og OD28o<h>a<^e returnert til basalverdier, ble søylen eluert med en liter lineær gradient fra 0,0 til 0,5 M natriumklorid i 20 mM Tris-HCl
(pH 8). Elueringen ble utført ved en strømningshastighet på 50 ml/h, og 10 ml fraksjoner ble samlet og målt for nærværet av IL-7.
Samlede IL-7-holdige fraksjoner fra to separate "SP-Trisacryl"-elueringer ble slått sammen og anvendt direkte til en søyle (2,5 x 40 cm) og Blue B agarose (Amicon Corp., Danvers, MA, USA) som tidligere var blitt ekvilibrert i 20 mM Tris-HCl (pH 8) og som inneholdt 125 mM NaCl. Prøven ble anvendt ved en strømningshastighet på 15 ml/h. Etter vasking med ekvilibreringsbuffer inntil OD280 hadde returnert til basale verdier, ble søylen eluert med en liter lineær gradient fra 0,125 til 2 M NaCl i 20 mM Tris-HCl (pH 8). 10 ml fraksjoner ble samlet ved en strømningshastighet på 25 ml/h og målt med hensyn til IL-7-aktivitet.
Høy prestasjons-væskekromatografi (HPLC) ble utført med en Waters Associates (Milford, MA) væskekromatograf utstyrt med to modell 510 pumper, en modell 720 system-kontrollør, og en modell 441 absorpsjonsdetektor som målte ved 218 nm hovedsakelig som beskrevet av Urdal et al.,
J. Chrom. 296;171 (1984). Store prøvevolumer ble pumpet på søylene med en minipumpe.
Fraksjoner som inneholdt IL-7-aktivitet fra Blue B agarose-kromatografitrinnet, ble anvendt ved en strømnings-hastighet på 5 ml/min til en 8 mm x 10 radial PAK patron (Waters Associates) som inneholdt 15-20 u "Vydac" C-4 revers-fase silica (Separations Group, Hesperia, CA, USA). Vann som inneholdt 0,1% trifluoreddiksyre (TFA, løsning A), ble ført gjennom søylene inntil absorpsjonen ved 214 nm var nede på basallinjenivåer. På dette tidspunkt ble en lineær gradient etablert som ledet fra 0 til 100% løsning B (acetonitril som inneholdt 0,1% TFA) med en hastighet på 1% løsning B/min. og en strømningshastighet på 1 ml/min.
Aktive fraksjoner som ble oppnådd etter en enkel HPLC-fasekjøring, ble samlet, fortynnet med to volumer av 0,9 M eddiksyre og 0,2 M pyridin (pH 4,0, buffer A,>) og anbrakt på den samme søylen etter reekvilibrering i pyridin-acetat-løsningssystemet. En gradient med løsning B2
(0,9 M eddiksyre, 0,2 M pyridin og 60% N-propanol) ble så anbrakt på søylen, hvilket ledet fra 0 til 20% løsning B2i 10 minutter, og fra 20% B2til 84% B2i 100 minutter, ved en strømningshastighet på 1 ml/min.
Fraksjoner som inneholdt aktivitet fra denne andre HPLC-fase, ble samlet, fortynnet med to volumer av løsning A2og anbrakt på en 3,9 mm x 30 cm radial PAK-søyle pakket med 10 u "Vydac" C-18 revers-fase silica som tidligere var blitt ekvilibrert i 20% løsning B2. En gradient av løsning B2 fra 20% til 84% ble brukt for å eluere protein fra søylen. Fraksjoner som inneholdt aktivitet fra den tredje fase av HPLC, ble fortynnet med to volumer av løsning A1(0,1% TFA) og anbrakt på en C-18-søyle tidligere ekvilibrert i 20% løsning B^(acetonitril, 0,1% TFA) og en gradient med løs-ning B^etablert fra 20% til 100% B^i en utbytningshastighet på 1% pr. minutt og en strømningshastighet på 1 ml/min som ble benyttet for å eluere IL-7.
SDS-PAGE ble utført ved en modifikasjon av frem-gangsmåten beskrevet av Laemmli, Nature 227:680 (1970). Materiale som var renset gjennom fire faser av RP-HPLC, ble fordampet til tørrhet i vakuum i en lyofiliseringsmaskin og oppløst igjen i et lite volum SDS prøvebuffer uten 2-mercaptoethanol. Prøven ble elektroforesebehandlet i en 12% polyacrylamidgel. Det passende spor av den resulterende gel ble delt opp i 1-2 mm biter, og hver bit ble knust og eluert ved diffusjon over natten i 0,2% SDS; den biologiske aktivitet i hver fraksjon ble så bestemt. De aktive fraksjoner ble samlet og en prøve analysert etter elektroforese på et "Phastgel" PAGE-system (Pharmacia) ved å benytte en 10-15% gradientgel. Proteinene ble synliggjort ved bruk av en sølv-fargingsmetode.
Tabell 1 nedenfor summerer resultatene av fremgangs-måtene som ble benyttet for å rense IL-7. Ved pH 8,0 og 100 mM NaCl bandt ikke IL-7-aktiviteten i det konsentrerte medium fra IxN/A6-celler til DEAE Sephacel<®->søylen, skjønt 90% av det totale protein til stede i det urensede, kondisjonerte medium, innbefattet det som var ansvarlig for makrofag koloni-stimuleringsaktivitet, bandt ikke til søylen. Etter kromato-grafitrinnene, innbefattet "SP-Trisacryl", "Blue B^agarose og fire separate revers-fase HPLC-protokoller, ble resultatet en 200.000 ganger rensning av IL-7-aktivitet.
Prosessering av 800 liter urenset, kondisjonert medium på denne måte resulterte i fire HPLC-søylefraksjoner som inneholdt totalt 5 x 10 enheter av IL-7-aktivitet. Analyse av dette materiale ved SDS-PAGE og sølvfarging eller 125 I-merkxng avslørte at et antall proteiner fremdeles var til stede på dette rensetrinn. Hovedproteinet til stede i dette materiale, viste en masse på 18.000; imidlertid kunne man oppdage svake bånd over og under dette.
To eksperimenter ble utført for å identifisere proteinet i denne blanding som var ansvarlig for IL-7-aktivitet. I det første ble IL-7 anbrakt på SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. Etter fullføring av elektroforese ble gelen kuttet i 1 mm bånd, og proteinet i hvert bånd ble eluert til medier og målt for biologisk aktivitet. Resultatene viste at IL-7 biologisk aktivitet var assosiert med et protein av Mr 25.000 og var tydelig fra regionen av gelen som tilsvarte den som inneholdt M r18.000 proteinbåndet. Ingen aktivitet ble isolert når elektroforesen ble utført under reduserende betingelser.
125
I det andre eksperiment ble I-merket IL-7 absor-bert til celler som svarte til denne faktor (IxN/2b).
IxN/2b er en klonal cellelinje utviklet fra de ikke-adherente pre-B-celler i en langtids benmargkultur. Disse celler kan dyrkes i fravær av eksogene mateceller og er nøye avhengige av renset IL-7 for fortsatt vekst og levedyktighet. Cellene ble vasket og deretter ekstrahert med PBS som inneholdt 1% Triton<®>X-100 (polyoxyethylenether-overflateaktivt middel, Rohm & Haas Co., Philadelphia, PA, USA). En prøve av dette materiale ble så analysert etter SDS-PAGE ved hjelp av autoradiografi. Resultatene viste at bare et protein med Mr 25.000 viste seg å binde til IL-7-responsive celler. Overskudd umerket IL-7 hemmet binding av dette protein, og kontrollceller som ikke responderer til IL-7, bandt ikke Mr 25.000-proteinet. Resultatene av begge eksperimenter antydet at et protein av M 25.000 var ansvarlig for IL-7-aktiviteten.
Resistensen til IL-7-aktiviteten utsatt for SDS-PAGE, antydet at denne fremgangsmåte kunne bli benyttet som det endelige trinn i rensningen av dette protein. Resultatene viste at som funnet i piloteksperimentet, eluerte IL-7-aktiviteten ved en stilling som sammenfalt med et protein på Mr 25.000. PAGE-analyse av denne bioaktive fraksjon avslørte et enkelt protein påvist ved sølvfarging. Proteinsekvensering ved Edman-nedbrytning ved bruk av en Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) automatisert sekvenseringsanordning indikerte den følgende N-terminale aminosyresekvens: X-X-His-Ile-Lys-Asp-Lys-Glu-X-Lys-Ala-Tyr-Glu-X-Val-Met.
Den endelige spesifikke aktivitet ble preliminært vurdert å være 4 x 10^ enheter/ug protein som kunne represen-tere en rensning på 10 million ganger fra startmaterialet.
Av grunnene anført tidligere, er denne vurdering revidert
ned til omtrent 2 x 10 enheter/ug, ekvivalent med den spesifikke aktivitet av homogent, rekombinant murint IL-7 produsert i C0S-7-celler.
Eksempel 2: Isolering av cDNA som koder for murint IL-7 ved direkte ekspresjon av aktivt protein i C0S- 7- celler
Et cDNA-bibliotek ble konstruert ved revers transkripsjon av polyadenylert mRNA isolert fra totalt RNA som var ekstrahert fra IxN/A6-celler dyrket under IL-7-induserende betingelser. Cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium pluss 5% føtalt bovinserum i 48 timer i nærvær av 10 ng/ml forbol-myristylacetat (PMA) og 1 ug/ml S. typhimurium LPS for å
gi maksimal IL-7-spesifikk budbringer-RNA-fremstilling. Cellene ble høstet ved bruk av trypsin-EDTA og cytoplasmatisk RNA isolert ved bruk av en NP40 lysefremgangsmåte som i hovedsak var lik den beskrevet av Pennica et al., Nature 301:214 (1983). Poly A<+>RNA ble isolert ved oligo dT-cellul-osekromatografi, og dobbeltstrenget cDNA ble fremstilt ved bruk av revers transkriptase. Like-endet cDNA ble ligert inn i Smal-spaltet, defosforylert pDC201 vektor-DNA.
Den eukaryote høyekspresjonsvektor pDC201 (se eksempel 7 og figur 7) var satt sammen fra SV40, adenovirus 2, og pBR322 DNA omfattende, i rekkefølge: (1) et SV40-fragment som inneholdt start for replikasjon, tidlige og sene promotorer og forsterker; (2) et adenovirus 2-fragment som inneholdt hoved sen-promotoren, det første exon og del av det første intron av den trefunksjonelle sene leder; (30 en syntetisk sekvens som omfattet et Hindlll-sete, et akseptorsete for splicing, det andre og tredje exon til adenovirus 2 tre-funksjonell leder og et multippelt kloningssete som innbefattet et Smal-sete; (4) ytterligere SV40-sekvenser som inneholdt tidlige og sene polyadenyleringsseter; (5) adenovirus 2-sekvenser som innbefattet virus-assosierte RNA-gener og (6) pBR322-elementer for replikasjon i E. coli.
Det resulterende IxN/A6 cDNA-bibliotek i pDC201 ble benyttet for å transformere E. coli-stamme DH5a og rekombinanter ble sådd ut for å gi omtrent 1000 kolonier pr. plate og tilstrekkelige plater til å gi omtrent 50.000 totale kolonier pr. plate. Koloniene ble skrapet av fra hver plate, slått sammen og plasmid-DNA fremstilt fra hver blanding. Det sammenslåtte DNA ble så brukt for å transfektere et nært sammenflytende lag av ape C0S-7-celler ved bruk av DEAE-dextran etterfulgt av klorokinbehandling som beskrevet av Luthman et al., Nucleic Acids Res. 3J.:1295 (1983) og McGutchan et al., J. Nati. Cancer Inst. £1:351 (1968). Cellene ble så dyrket i kultur i tre dager for å tillate forbigående ekspresjon av de innsatte sekvenser. Etter tre dager ble celle-kultursupernatantene undersøkt på IL-7-aktivitet ved bruk av pre-B-celleproliferasjonsmetoden som beskrevet annet sted i beskrivelsen. Etter at omtrent 720.000 rekombinanter fra biblioteket var blitt undersøkt på denne måte, fant man én transfektant blanding som viste IL-7-aktivitet i prolifera-sjonsmetoden på et nivå 10 ganger over bakgrunnsnivået.
Et frosset lager av bakterier fra den positive blanding ble så benyttet for å oppnå plater på omtrent 200 kolonier. Disse platene ble behandlet som før for å oppnå plasmid-DNA fra de blandede, bakterielle kolonier, og DNA
ble transfektert inn i C0S-7-celler som beskrevet ovenfor. Etter identifikasjon av en positiv blanding ble plasmid-DNA
fremstilt fra individuelle kolonier og igjen undersøkt ved C0S-7-celletransfeksjon. På denne måte ble en enkelt klon isolert som var i stand til å indusere ekspresjon av IL-7 i C0S-7-celler. Innskuddet ble subklonet og sekvensert ved konvensjonelle teknikker. Sekvensen er vist i figur 2.
Eksempel 3: Isolering av cDNA som koder for humant IL-7 og ékspresjon av aktivt protein i C0S- 7- celler
De første forsøk på å oppdage humant IL-7 mRNA på Northern blots ved bruk av "nick"-translatert, murint IL-7 cDNA, var ikke vellykkede. Imidlertid var det mulig å oppnå hybridisering av den murine probe til Southern blots av humant genomisk DNA. Således ble det startet en søking etter et humant IL-7 cDNA ved først å screene et kommersielt tilgjengelig humant genomisk bibliotek. Omtrent 400.000 humane genomiske kloner ble undersøkt med "nick"-translatert murint IL-7 cDNA ved bruk av teknikkene beskrevet av Benton og Davis, Science 196:180 (1977). Denne undersøkelse ga en enkelt hybridiserende klon som ble renset og restriksjonskartlagt. Southern blots av dette klonede genomiske DNA indikerte at hybridiseringen til den murine probe var begrenset til et 1,2 kb EcoRI-fragment. Dette fragment ble subklonet og sekvensert og avslørte at det korresponderte til den 5'-ikke-kodende region av genet og omfattet de første 10 baser av den kodende region, hvoretter den humane genomiske DNA-sekvens adskilte seg fra den murine IL-7 cDNA-sekvens på grunn av nærværet av et intron. Bestemmelsen av denne genomiske sekvens muliggjorde syntese av oligonucleotider som hadde sekvenser komplementære til det humane IL-7 RNA-transkript.
To slike oligonucleotider på 29 og 31 baser ble syntetisert,
32
merket med P ved bruk av T4 polynucleotidkmase og anvendt for å undersøke Northern blots med RNA fra et antall humane cellelinjer. Disse prober ble funnet å spesifikt hybridisere til to størrelsesklasser fra mRNA fra en human leveradenocarcinoma-cellelinje, SK-HEP-1 (ATCC HTB 52).
Et cDNA-bibliotek ble konstruert ved revers transkripsjon av polyadenylert mRNA isolert fra total RNA ekstra hert fra SK-HEP-1. Cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium pluss 10% føtalt bovint serum i 16 timer i nærvær av 1 ug/ml LPS for å utløse hIL-7 mRNA-syntese. Polyadenylert mRNA ble isolert ved kromatografi på oligo-dT-cellulose og revers-transkribert ved bruk av standardteknikker for å gi den første cDNA-streng. Dette cDNA ble gjort dobbeltstrenget ved bruk av DNA-polymerase I, gjort butt-endet med T4 DNA-polymerase, methylert med EcoRI-methylase for å beskytte EcoRI-kløyvnings-seter inne i cDNA, og ligert til EcoRI-linkere. De resulterende konstruksjoner ble fordøyd med EcoRI for å fjerne alle bortsett fra én kopi av linkerne på hver ende av cDNA, og ligert til EcoRI-avkuttede og defosforylerte armer på bakteriofag ?\gtl0 (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, red., IRL Press, s. 49-78). Det ligerte DNA ble pakket i fag-partikler ved bruk av et kommersielt tilgjengelig sett for å generere et bibliotek av rekombinanter (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Rekombin-antene ble utspredd på E. coli-stamme C600(hfl ) og undersøkt ved standard plakkhybridiseringsteknikker under betingelser med moderat stringens (50°C, 0,9 M NaCl) ved bruk av de samme kinaserte oligonucleotider som hybridiserte til mRNA-et.
Ved undersøkelse av omtrent 150.000 plakk ble én klon isolert fra biblioteket som hybridiserte til probene når filtrene ble vasket med lxSSC ved 55°C. Denne klon (hIL-7 cDNA nr. 1) ble plakkrenset og det innsatte DNA renset og subklonet i et EcoRI-kuttet derivat (pGEMBL18) av standard kloningsvektoren pBR322 som inneholdt en polylinker som hadde et enkelt EcoRI-sete, et BamHl-sete og tallrike andre unike restriksjonsseter. Et eksempel på denne type vektor er beskrevet av Dente et al., Nucleic Acids Research JL1:1645 (1983).
Dette cDNA ble så sekvensert og vist å være 14 65 basepar i lengde, med en åpen leseramme som var i stand til å kode for et protein på 133 aminosyrer. Både DNA-et og aminosyresekvensen av dette humane cDNA viste omtrent 78% homologi med det murine IL-7 cDNA. Imidlertid, når dette humane cDNA ble subklonet i Smal-setet av pDC201 for å muliggjøre dets ekspresjon i C0S-7-celler, ble ingen IL-7-aktivitet påvist i
kultursupernatantene etter transfeksjon.
For å oppnå ytterligere humane IL-7 cDNA-er ble det undersøkt omtrent 1 million AgtlO bakteriofagholdige cDNA-er oppnådd fra SK-HEP-1 poly A<+>RNA ved bruk av "nick"-translatert humant IL-7 cDNA nr. 1. Dette resulterte i isoleringen av ytterligere 5 cDNA-er som så ble innsatt i Smal-setet av pDC201. Disse konstruksjoner ble så transfektert inn i C0S-7-celler og kultursupernatantene undersøkt på IL-7-aktivitet. Ett cDNA, betegnet hIL-7 nr. 3, viste målbar IL-7-aktivitet. Dette cDNA ble subklonet i pGEMBL18 og sekvensert. cDNA-sekvensen er vist i figur 4; den kodende sekvens og utledede aminosyresekvens av hIL-7 er vist i figur 5.
Eksempel 4: Ekspresjon av murint IL- 7 i et gjærsystem
For å utvikle en gjærekspresjonsvektor for mIL-7, gjærplasmid pBCIO, som er et derivat og ekvivalent til pYaHuGM (ATCC 53157), ble forandret som følger. pBCIO er en gjær/bakterieskyttelvektor som omfatter (1) en start på replikasjon og Amp -gen fra pBR322 som muliggjør seleksjon og replikasjon i E. coli; (2) TRPl-genet og 2 y replikasjonsstart for seleksjon og replikasjon i S. cerevisiae; (3) gjær-alkoholdehydrogenase 2 (ADH2)-promotor etterfulgt av gjær-pre-pro-a-faktor-ledersekvensen for å tillate fremmedprotein-ekspresjon og sekresjon fra gjær; og (4) et multippelt kloningssete innbefattende et Spel-sete. pBCIO ble fordøyd fullstendig med Asp718 og Spel, vektorfragmentet isolert og ligert til det følgende oligonucleotid A som gir en N-terminal epitop eller identifikasjonsleder Asp-Tyr-Lys-(Asp^)-lys ("flagg") fusjonert inntil og i leseramme med a-faktor-ledersekvensen , etterfulgt av et faktor X protease-gjenkjennelsessete og en polylinkersekvens som omfatter Stul-, Ncol-, BamHl-, Smal- og Spel-kløyvingsseter:
Den resulterende konstruksjon, betegnet pIXY166, ble så for-døyd med Stul og Spel, og vektoren ligert til et~950 bp Ndel-Xbal-fragment innbefattende mesteparten av den kodende region til mIL-7 cDNA, og den følgende oligonucleotidlinker som adderer tilbake de N-terminale 11 aminosyrer til den fullt utviklede sekvens av mIL-7 opp til det interne Ndel-sete:
Denne ekspresjonsvektor, betegnet pIXY171, ble renset og benyttet for å transformere en diploid gjærstamme av S. cerevisiae (XV2181) ved standardteknikker, slik som de beskrevet i EPA 0165654, med seleksjon for tryptofan-prototrofer. De resulterende transformanter ble dyrket for ekspresjon av et flagg-mIL-7-fusjonsprotein. Kulturer som skulle undersøkes på biologisk aktivitet, ble dyrket i 20-50 ml av YPD-medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 1% glucose) ved 37°C til en celletetthet på 1-5 x 10 gceller/ml. Cellene ble så fjernet ved sentrifugering, og mediet ble filtrert gjennom 0,45 u celluloseacetatfilter. Supernatantene som ble fremstilt av den transformerte gjærstamme, ble så undersøkt ved omsetning med et muse-monoklonalt antistoff etterfulgt av pepperrot-peroxydase-konjugert geit-anti-muse-antistoff for å oppdage nærværet av flaggpeptidet, og også undersøkt ved hjelp av pre-B-celleproliferasjonsmetoden for IL-7-aktivitet, noe som bekreftet ekspresjon av et biologisk aktivt protein.
Eksempel 5; Ekspresjon av humant IL- 7 i gjær
For ekspresjon av hIL-7 ble det konstruert en gjærekspresjonsvektor utledet fra pIXY120 som følger. pIXY120
er identisk med pYaHuGM (ATCC 53157) bortsett fra at det ikke inneholder cDNA-innskudd og innbefatter et polylinker/multippelt kloningssete med et Ncol-sete. Denne vektor innbefatter DNA-sekvenser fra de følgende kilder: (1) et stort SphI (nucleotid 562) til EcoRI (nucleotid 4361)-fragment spaltet fra plasmid pBR322 (ATCC 37017) som innbefattet replika-sjonsstarten og ampicillinresistensmarkøren for seleksjon i E. coli; (2) S. cerevisia-DNA som innbefattet TRP-l-markøren, 2 u replikasjonsstart, ADH2-promotor; og (3) DNA som koder for et 85 aminosyresignalpeptid som stammer fra genet som koder for den utskilte peptid a-faktor (se Kurjan et al., U.S. patent 4.546.082). Et Asp718-restriksjonssete ble introdusert i posisjon 237 i a-faktor-signalpeptidet for å underlette fusjon til heterologe gener. Dette ble oppnådd ved å forandre thymidinresten ved nucleotid 241 til en cytosinrest ved oligonucleotid-rettet in vitro-mutagenese som beskrevet av Craik, Biotechniques, januar 1985, 12-19. Et syntetisk oligonucleotid som inneholdt multiple kloningsseter og som hadde den følgende sekvens, ble innsatt fra Asp718-setet ved aminosyre 79 nær 3'-enden av a-faktor-signalpeptidet til et Spel-sete i 2 u-sekvensen:
pBC120 adskiller seg også fra pYaHuGM ved nærværet av et 514 bp DNA-fragment som stammer fra den enkelttrådede fag fl som inneholder replikasjonsstart og en intergen region som
er blitt innsatt ved Nrul-setet i pBR322-sekvensen. Nærværet av en f1-replikasjonsstart tillater dannelsen av enkelttrådede DNA-kopier av vektoren når den transformeres inn i passende stammer av E. coli og superinfiseres med bakterio-
fag fl som underletter DNA-sekvensering av vektoren og gir en basis for in vitro mutagenese. For å innsette et cDNA blir pIXY120 fordøyd med Asp718 som kløyver nær 3<1->enden av a-faktor-lederpeptidet (nucleotid 237) og f.eks. Ncol som kløyver i polylinkeren. Det store vektorfragment blir så renset og ligert til et DNA-fragment som koder for proteinet som skal uttrykkes.
For å utvikle en sekresjonsvektor for å uttrykke humant IL-7 ble et cDNA-fragment som koder for hIL-7 fra Clal-setet (se figur 1) til et Ncol-sete beliggende 3' til den åpne leseramme spaltet fra en cDNA som inneholdt den kom-plette hIL-7-sekvens. pIXY120 fordøyes med Asp718 nær 3<1->enden av a-faktorlederen og Ncol. Vektorfragmentet ligeres til Clal-Ncol hIL-7 cDNA-fragmentet og det følgende oligonucleotid som regenererer de siste fem aminosyrene til a-faktorlederen og de første 20 aminosyrene for fullt utviklet hIL-7.
Oligonucleotidet innbefatter også en T-»C-forandring ved nucleotid 12 for å introdusere et EcoRV-restriksjonssete uten å forandre den kodende aminosyresekvens. Den resulterende hIL-7-ekspresjonsvektor er betegnet pIXYl92.
For å lage en intracellulær ekspresjonsvektor for hIL-7-produksjon i S. cerevisiae ble pIXY120 spaltet med Xhol (som kløyver 5' til a-faktor-ledersekvensen) og Ncol for å fjerne DNA-sekvensen som koder for lederen. Vektorfragmentet isoleres og ligeres til et EcoRV-NcoI-fragment som koder for hIL-7 fra nucleotid 12 som er avledet fra pIXY192 (som beskrevet ovenfor) og det følgende oligonucleotid:
Dette oligonucleotid binder fullt utviklet hIL-7 til gjær ADH2-promotoren og gir et start-methioninkodon og de første tre aminosyrer av fullt utviklet hIL-7 opptil EcoRV-setet. Den resulterende vektor betegnes pIXY193.
De foran beskrevne ekspresjonsvektorer blir så renset og anvendt for å transformere en diploid gjærstamme av S. cerevisiae (XV2181) ved standardteknikker, slik som de som er beskrevet i EPA 165.654 med seleksjon for tryptofan-prototrofer. De resulterende transformanter dyrkes for ekspresjon av et hIL-7-protein enten intracellulært eller som et utskilt protein. Kulturene som skal måles for biologisk aktivitet, blir dyrket i 20-50 ml YPD-medium (1% gjærekstrakt, 2% pepton, 1% glucose) ved 37°C til en celletetthet av 1-5 x 10 g celler/ml. For å skille celler fra mediet fjernes cellene ved sentrifugering og mediet filtreres gjennom et 0,45 u celluloseacetatfilter før måling. Supernatantene som ble fremstilt av den pIXY192-transformerte gjærstamme, eller urensede ekstrakter fremstilt fra ødelagte gjærceller transformert ved pIXY193, undersøkes ved bruk av pre-B-celleproliferasjonsmetoden for IL-7-aktivitet for å verifisere ekspresjon av et biologisk aktivt protein.
Eksempel 6: Ekspresjon av murint IL- 7 i E. coli
Fullt utviklet mIL-7 ble uttrykt intracellulært i
E. coli ved å plassere den kodende region nedstrøms for bakteriofag A's venstre beliggende promotor PT. Det mRNA
som ble fremstilt av plasmidet, inneholder et konsensus-ribosom-bindingssete og ATG (start-methioninkodon). Eks-
presjonsplasmidet ble konstruert som følger. For det første ble plasmid-pLNbIL2 (ATCC 53202; se EPA 215.576) spaltet med Xbal og Stul, og det resulterende 5,2 kb vektorfragment ble isolert. For det annet ble etsyntetisk oligonucleotid syntetisert for å binde transkripsjonsenheten til det avstumpede N-gen av fag lambda til et konsensus-ribosom-bindingssete (cRBS) og kodende region av mIL-7 opptil Ndel-setet (se figur 1). Dette oligonucleotid hadde den følgende sekvens:
For det tredje ble et restriksjonsfragment som inneholdt mesteparten av den mIL-7-kodende region, oppnådd fra klonen som var isolert som beskrevet i eksempel 2 ved Ndel- og PvuII-fordøyelse. De foregående tre fragmenter ble ligert sammen for å gi et ekspresjonsplasmid betegnet pLNPBGF. Dette plasmid ble brukt for å transformere E. coli stamme K802:pRK248cIts (ATCC 33526; ATCC 33766) som så ble dyrket i superinduksjonsmedium [se Mott et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 8_2:88 (1985)]. Ekspresjon av den rekombinante trans-krips jonsenhet ble indusert ved å forandre dyrkningstempera-turen fra 30°C til 42°C når kulturene nådde en 0DgQ0på omtrent 0,5 og så holdt ved denne temperatur i omtrent to timer. Ved dette tidspunkt ble cellene høstet, og den resulterende cellepellet oppløst i en ekstraksjonsbuffer som besto av (for pellet svarende til 1 ml kultur) 0,5 ml 7 M guanidin-HCl, 10 mM citrat pH 7,0, 5 mM EDTA, 0,1% beta-mercaptoethanol og 0,1% "Triton" X100. Det resulterende fullstendig denaturerte celleekstrakt ble så raskt fortynnet (1 del pr. 100) i vevskulturmedium (RPMI 1640) som inneholdt 1% bovint serumalbumin. Denne fremgangsmåte resulterte i ekspresjon av 20-50.000 aktivitetsenheter pr. ml av celleekstrakt.
Nivået av mIL-7-ekspresjon ble forbedret omtrent 100 ganger ved å overføre et restriksjonsfragment fra pLNPBGF som kodet for proteinet inn i et plasmid som inneholdt en avkortet 5'-ikke-kodende region. Dette ekspresjonsplasmid (betegnet pPL lppPBGF) ble konstruert fra plasmid pPL3 som følger. pPL3 er et derivat av det kommersielt tilgjengelige plasmid pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) som inneholder en temperatursensitiv A P_ —promotor som i hovedsak er lik den beskrevet i detalj av Gourse et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:1069 (1985). Lignende APTju-promotor-sekvenser er til stede på plasmidene pHUB2 som kan leve i E. coli stamme JMB9 (ATCC 37092) og pPLc28 som kan leve i
E. coli RR1 (ATCC 53082). pPL3 ble spaltet med Hindlll, det resulterende, lineariserte plasmid ble gjort butt-endet med T4 polymerase og så fordøyd med Asp718. Et syntetisk oligonucleotid ble så fremstilt som hadde følgende sekvens:
Et restriksjonsfragment fra pLNPBGF som inneholdt hele den kodende region, ble dannet ved spaltning med Xbal og Sspl. Disse elementene ble ligert sammen ved bruk av standardteknikker, og det resulterende plasmid pPL lppPBGF ble brukt for å transformere K802:pRK248cIts. Når denne stamme ble indusert som beskrevet ovenfor, ble det dannet omtrent 2,5-3,2 millioner enheter av pre-B-cellevekststimulerende aktivitet pr. ml av kulturmedium i celleekstrakter fremstilt som beskrevet ovenfor. I tillegg indikerte SDS-PAGE et tett farget proteinbånd i en stilling som er i tråd med molekyl-vekten av fullt utviklet mIL-7.
Eksempel 7: Ekspresjon av rekombinant humant IL-7 ved bruk av høyeffektive pattedyr- ekspresjonssysterner
Pattedyr-ekspresjonsplasmidet pDC201, avbildet i figur 7, er laget for å uttrykke cDNA-sekvenser som er innsatt i dets multiple kloningssete (MCS) når det transfekteres inn i pattedyrceller. Ved referanse til figur 7 innbefatter pDC201 de følgende komponenter: SV40 (skravert firkant) inneholder SV40-sekvenser fra koordinatene 5171-270 som innbefatter replikasjonsstart, forsterkersekvenser og tidlige og sene promotorer. Fragmentet er orientert slik at retningen for transkripsjon
fra den tidlige promotor er som vist ved pilen. Ad-MLP (åpen firkant ) inneholder adenovirus-2-sekvenser fra koordinatene 5779-6231 og innbefatter hoved-sen-promotoren, det første exon og del av intronet mellom det første og andre exon i den trifunksjonelle leder. TPL (stiplet firkant) inneholder en syntetisk DNA-sekvens som spesifiserer adenovirus-2-sekvenser 7056-7172, 9634-9693 (inneholdende akseptorsetet for splicing til det annet exon av den trifunksjonelle leder, det annet exon og del av det tredje exon til den trifunksjonelle leder) og et multippelt kloningssete (MCS) som inneholder seter for Kpnl, Smal og Bglll. pA (skravert firkant) inneholder SV40-sekvenser fra 4127-4100 og 2770-2533 som innbefatter poly-adenylerings- og termineringssignalene for tidlig transkripsjon. VA (fylt firkant) inneholder adenovirus-2-sekvenser fra 10226-11555 som innbefatter de virus-assosierte RNA-gener (VAI og VAII) og et Nhel-sete beliggende omtrent 570 basepar nedstrøms fra MCS. De heltrukne linjer stammer fra pBR322 og representerer (start etter pA-sekvensene og fortsettelse med urviseren) koordinatene 29-23, 651-185 (på det punkt er VA-sekvensene innsatt) 29-1, 4363-2486 og 1094-375. pDC201 er et derivat av pMLSV, tidligere beskrevet av Cosman et al., Nature 312:768 (1984).
C0S-7-celler dyrkes og transfekteres som beskrevet
av Cosman et al., supra, med plasmid DNA fra en 1,5 ml kultur av E. coli DH5a ( rec A ) transformert med Smal-kuttet pDC201 som omfatter et innsatt hIL-7 cDNA (se eksempel 3 ovenfor).
I en foretrukket utførelsesform er et hIL-7 cDNA bundet til
en human IL-2-reseptor (p55, Tac-antigen)-signalsekvens, benyttet for å øke sekresjon av rekombinant hIL-7 fra transfekterte C0S-7-celler.
I denne utførelsesform er pDC201-plasmidet som har hIL-7 cDNA-innskuddet, kuttet med Clal og Nhel, og det resulterende Clal-Nhel-fragment (som inneholder den C-terminale del av den humane IL-7-kodende sekvens) ligert til det følgende oligonucleotid som regenererer den sekvens som koder for de første 19 aminosyrer av fullt utviklet, humant IL-7 opptil og innbefattende et internt Clal-sete:
Et PvuII-Xbal-fragment fra en human IL-2-reseptor cDNA blir så spaltet fra pMLSV-Nl/N4-S [ATCC 39890; se EPA 162.699 og Cosman et al., supra]. Dette plasmid innbefatter et PvuII-sete like oppstrøms for Pstl-setet beskrevet i de motholdte publikasjoner. PvuII-Xbal-fragmentet blir isolert og gjort butt-endet med T4 DNA-polymerase og ligert til BamHI-linkere. Dette fragment klones så inn i en Bglll-kuttet mellomvektor. Etter kløyving med BamHI isoleres det resulterende fragment og klones i Bglll-kuttet pDC201 for å gi pDC201/IL-2R. For å koble IL-2-reseptorlederen til fullt utviklet hIL-7 er pDC201/IL-2R kuttet med Sstl, gjort butt-endet og så kuttet med Nhel, og det resulterende vektorfragment ligert til hIL-7-fragmentet og satt sammen ved bruk av det foregående nucleotid. Etter transfeksjon i C0S-7-celler induserer den resulterende vektor høynivå flyktig ekspresjon av hIL-7.
Et alternativt pattedyr-celleekspresjonssystem for humant IL-7 er satt sammen ved å sette inn den foregående
IL2R/IL-7-konstruksjon i en pattedyr-stabil ekspresjonsvektor som inneholder en seleksjonsmarkør som så blir introdusert i baby hamster-nyre (BHK)-celler. Ekspresjonsvektoren kon-strueres som følger. Et Smal-HincII cDNA-fragment skjæres ut fra det foregående pDC201/hIL-2R/hIL-7-plasmid satt sammen som beskrevet ovenfor og klonet inn i det reparerte (Klenow polymerase) BamHl-sete av en pattedyr-ekspresjonsvektor som består av en SV40 replikasjonsstart og virale forsterkersekvenser bundet til en mus-metallothioneinpromotor (MT-1).
Se Palmiter, et al., U.S. patent 4.579.821. Denne hybrid-promotor viser en høy grad av stabil, vedvarende ekspresjon i én rekke pattedyrcelletyper. pNPVl inneholder også den normale dihydrofolatreduktase (DHFR) DNA-sekvens som gjør det mulig å methotrexatselektere for pattedyrceller som har dette plasmid. DHFR-sekvensforsterkningshendelser i slike celler kan selekteres ved bruk av forhøyede methotrexat-konsentrasjoner. På denne måte kan man også generelt for-sterke de sammenhengende DNA-sekvenser og så oppnå økt ekspresjon.
Seleksjon og ekspresjon ble utført ved bruk av adherente BHKtk-ts 13-celler (ATCC CRL 1632) beskrevet av Waechter, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:1106 (1982)
og Talavera, et al., J. Cell Physiol. 92,:425 (1977). Disse celler er i stand til å gi både høy mannose- og kompleks oligosaccharidproteinmodifikasjon [se Hsieh, et al., J. Biol. Chem. 258:2548 (1983)]. Etter linearisering av ekspresjonsplasmidet med Sali, er DNA introdusert i BHK-celler ved elektroporering ved 300 volt ved 9 60 mikrofarad. Passende elektroporeringsteknikker er beskrevet av Ausubel et al., red., supra, ved 9.3.1. Etter 48 timer ble 1 mikromolar methotrexat tilsatt kulturmediet og resistente kolonier selektert etter to uker. Representative kloner blir undersøkt for sekresjon av hIL-7 i kultursupernatantfraksjonen. De høyest uttrykkende kloner blir så behandlet med videre seleksjonsregimer ved bruk av 10, 20 og 50 mikromolar methotrexat. Resistente kolonier analyseres deretter for å analysere høyekspresjonsnivåkloner. BHK-linjene som er selektert ved bruk av denne protokoll, er
adherente celler, og oppgraderte produksjonsprosedyrer kan tenkes å involvere enten suspensjonsvekst ved hjelp av kuler eller vekst i bioreaktorer der man bruker perforert fiber-teknologi. BHK-celler kan raskt tilpasses til vekst som suspensjonsceller.
Eksempel 8: Bruk av IL-7 for å stimulere proliferasjon av ikke fullt utviklede T- celler og thymocytter
For å vise at IL-7 stimulerer proliferasjon av forskjellige linjer og stadier av T-celler ble thymocytter fra føtale og voksne mus dyrket i nærvær av urensede og rensede preparater av rekombinant murint IL-7.
Thymus som er ansvarlig for utviklingen og/eller differensieringen av den cellulære immunrespons, består av en heterogen populasjon av T-celler. Den store majoritet, omtrent 80-85% av cellene, er fenotypisk unike (CD4<+>/CD8<+>) og funksjonelt passive. Mer fullt utviklede celler, både funksjonelt og fenotypisk, er også til stede i thymus. Disse celler eller enkle positive (CD4<+>/CD8~ eller CD4~/CD8<+>) omfatter omtrent 5-10% av thymocyttene og er i stand til å respondere til forskjellige immunologiske stimuli. Også
til stede i thymus er en populasjon av CD4 /CD8 -celler som er tenkt å være de tidligste celler i T-celleutviklingen. Innen CD4 /CD8 -undergruppen finnes celler som er i stand til å repopulere thymus i immundefekte mottagere og gi opphav til de andre thymocyttpopulasjoner.
Det er nå kjent at tidlige thymocytter, f.eks. L3T4~/Lyt2~ eller CD4~/CD8~-celler kan repopulere thymus til bestrålte mottagere og differensiere til de forskjellige thymocytt-subpopulasjoner (dvs. CD4<+>/CD8~, CD4~/CD8<+>og CD4<+>/CD8<+>). For å bestemme virkningene av IL-7 på thymocyttproliferasjon ble forskjellige thymocyttpreparater inkubert i nærvær av renset mIL-7 og [ H]-thymidin, og de relative nivåer av inkorporert radioaktivitet ble målt ved hjelp av scintillasjonstelling. I den følgende serie med eksperimenter ble det fremstilt kultursupernatanter som inneholdt IL-7 avledet fra en C0S-7-cellelinje transformert med en ekspresjonsvektor som omfattet en murin IL-7 cDNA slik som beskrevet i eksempel 3. Disse supernatantene ble anvendt direkte eller renset til en enkel 25 kd proteinart som beskrevet detaljert i eksempel 1. Ved rensning hadde den rekombinante mIL-7 en spesifikk aktivitet på omtrent 8 x IO<5>enheter/mg protein.
I thymocyttproliferasjonsmålinger ble voksne C3H/HeJ- eller C57BL/6J-thymocytter dyrket ved en tetthet på 10 ^ celler/brønn i Costar 96 brønn i flatbunnede mikrotiterplater (Cambridge, MA, USA) i RPMI-1640-medium supplert med 10% føtalt bovinserum, 5 x 10 ^ M 2-mercaptoethanol, 50 ug/ml glutamin i et sluttvolum på 0,2 ml. Rekombinant murint IL-2 ble tilsatt til kulturer i en konsentrasjon på 50 ng/ml mens rIL-7 ble tilsatt i en 1:50 fortynning av urenset C0S-7-supernatant som inneholdt omtrent 1,25 ng/ml mIL-7.<3>H-thymidin ble tilsatt til kulturbrønner i de siste 6 timer av en 72-timers kultur. Resultatene er uttrykt i tellinger pr. minutt (cpm) i tabell 2, nedenfor, som det aritmetriske gjennomsnitt av fire målinger.
De mitogene egenskaper til IL-7 ble vurdert på de tidligste T-celler, eller thy+ CD4~/CD8~-thymocytter, både alene og i nærvær av Con A. To kilder til CD4 /CD8 - thymocytter ble anvendt. CD4 /CD8~-thymocytter ble erholdt fra voksne thymusorganer ved negativ seleksjon ved bruk av antistoff og komplementformidlet cytolyse. C57BL/6J voksne thymocytter ble inkubert ved 4°C i 45 minutter med like volumer av anti-L3T4 og anti-Lyt2 mAb. Etter denne inkuba-sjon ble cellene sentrifugert, supernatanten aspirert og cellene resuspendert i kultursupernatanten til Mar 18,5 celle-linjen (anti-rotte kappakjede mAb) (American Type Tissue Center, Rockville, MD, USA) (1 ml/IO<7>celler) i 30 minutter ved 4°C. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i en 1:10 fortynning av kaninkomplement og inkubert i 30 minutter ved 3 7°C. Cellene ble så vasket én gang og de levedyktige cellene isolert ved sentrifugering gjennom en diskontinuerlig tetthetsgradient. De resulterende celler utgjorde omtrent 0,1% av starttallet. De var mer enn 98% levedyktige, og analyse av CD4- og CD8-ekspresjon ved immunfluorescens-farging og strømningscytometri viste at de var mindre enn 4% CD4+ eller CD8<+>.
CD4~/CD8~-thymocytter ble også oppnådd som dag 13 føtale thymocytter som består hovedsakelig (>99%) av CD4~/CD8~ Thyl<+->celler. Dag 13 føtale thymocytter (dag 0 er den første dag med vaginalpropp) ble dyrket med en tetthet på 5 x 10 4 celler/brønn i rundbunnede brett ifølge metoden til Raulet, Nature 314:101 (1985). Når disse celler ble dyrket med rekombinant IL-7, ble en proliferativ respons observert som vist i tabell 2. CD4 /CD8~-thymocytter kan proliferere i respons til IL-7 i fravær av ethvert annet comi togen..
Tilsetningen av plantelectinet concanavalin A
(Con A, 2,5 ug/ml) i kulturene økte responsen av CD4~/CD8~-thymocytter til IL-2 og IL-7 markert. Voksne CD4~/CD8~-celler responderte ganske kraftig til Con A alene, mens tilsetningen av IL-2 til kulturene ga en tre ganger økning i proliferering. Tilsetningen av IL-7 mer enn fordoblet den proliferative respons til disse cellene. Føtale thymocytter responderte ikke merkbart til Con A alene, men i nærvær av IL-2 eller IL-7 ble en signifikant proliferasjon observert. Disse resultatene demonstrerer at cellene på det minst modne intra-thymiske stadium av T-celledifferensiering kan stimuleres til å proliferere ved IL-7, hvilket indikerer rollen til dette cytokin i T-celledifferensiering og modning.
Den relative effektivitet til IL-7 som et T-celle-mitogen ble også undersøkt, både alene og i nærvær av co-mitogen stimulering, PHA, og sammenlignet med to andre T-celle-vekstfaktorer, interleukin-2 (IL-2) og interleukin-4 (IL-4). Både IL-2 og IL-7 stimulerte direkte thymocyttproliferering. Imidlertid var IL-2 omtrent ti ganger mer aktivt på vekt-basis enn IL-7. Selv ved konsentrasjoner så høye som 1 ug/ml var IL-4 et dårlig mitogen for thymocyttkulturer. Når imidlertid lectinfytohemagglutinin (PHA) ble tilsatt til kulturene i en endelig konsentrasjon på 1% (volum/volum), ble en sterk økning i IL-2-, IL-4- og IL-7-avhengig proliferasjon observert. IL-7 virker uavhengig av IL-2, IL-4 eller PHA ved stimulering av thymocyttproliferasjon. Eksempelvis ved IL-2-konsentrasjoner som var maksimale for thymocytt-prolif eras jon (1-1000 ng pr. ml), økte IL-7 (ved omtrent 1-2 ng pr. ml) signifikant den proliferative respons og resulterte i omtrent en 50% økning i inkorporering av tritiert thymidin. På lignende måte ble det også observert en økning i IL-4-avhengig proliferasjon i nærvær av IL-7. Videre ble IL-7-drevet proliferasjon av thymocytter ikke hemmet av anti-IL-2-reseptor monoklonalt antistoff i konsentrasjoner som var i stand til å hemme IL-2-drevet thymocyttproliferasjon.
En anti-mIL-4-monoklonal hemmet heller ikke evnen til IL-7
til å indusere thymocyttproliferasjon.
De foregående eksperimenter indikerer at IL-7 er i stand til å stimulere proliferasjonen av ikke fullt utviklede T-celler og er også en sterk costimulator av fullt utviklede T-celler i nærvær av et mitogen.
Eksempel 9: Tilførsel av IL- 7 til normale mus
En serie eksperimenter ble utført for å bestemme effektene av intraperitoneal tilførsel av mIL-7 i normale C57BL/6J-mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA).
Murint IL-7 fremstilt ved hjelp av C0S-7-celleekspresjon som beskrevet i eksempel 3, ble tilført på dag 0 til og med dag 4. Celletall, funksjon og celleoverflateantigenfenotype i milten, peritonealhulen, perifert blod, thymus og benmarg ble under-søkt på dag 5 og 8, i doser på 40 ng, 200 ng og 1 ug pr. dyr, der fem mus ble brukt pr. dosegruppe.
Benmarggranulocytt/makrofagkolonidannende enheter (CFU-GM) ble øket på dag 8 i mus som mottok alle doser av IL-7 der 40 ng-gruppen viste den maksimale økning sammenlignet med kontrollmus som bare mottok bæremidlet. På lignende måteøkte IL-responsive margceller i de samme musene, med maksimal effekt til stede i 40 ng-gruppen. Benmarg-megakaryocytt CFU (CFU-MK) økte i alle dosegrupper og var maksimal (3X over kontroller) på dag 8 i mus som mottok 200 ng. I milten økte CFU-GM bare i mus som mottok den høyeste dose av IL-7.
Celletallet i perifert blod økte 1,5 til 2,5X på
dag 5 i alle dosegrupper og forble på omtrent 2,5X i den høye dosegruppe på dag 8. Lignende kinetikk ble observert for peritoneale hulromcelletall, men økningene her var opptil 3,5X. Benmarg økte~1,5X på dag 5, men var ikke forskjellig fra kontrollene på dag 8. I milten ble 1,5-1,8X økninger i celletall observert på dag 5 og 8 i høydosegruppen. Thymus-celletall var uforandret på dag 5, men økte 2X på dag 8 i høydosegruppen.
Eksempel 10: Utvikling av antistoffer immunreaktive med IL- 7
Preparater av renset, normalt eller rekombinant IL-7, f.eks. humant IL-7, anvendes for å danne polyklonale antisera eller fortrinnsvis monoklonale antistoffer mot IL-7 ved hjelp av konvensjonelle teknikker, f.eks. de beskrevet i U.S. patent 4.411.993. Slike antistoffer er sannsynligvis anvendbare ved påvisning av IL-7, eller ved nøytralisering av IL-7 biologisk aktivitet i prøver eller eksperimenter som innbefatter multiple lymfokiner.
For å immunisere mus ble et i det vesentlige rent IL-7-preparat emulgert i fullstendig Freunds adjuvans og injisert i mengder som varierte fra 10-100 ug subkutant iBalb/c-mus. 10 til 12 dager senere ble de immuniserte dyr igjen injisert med ytterligere IL-7 emulgert i ufullstendig Freunds adjuvans og periodevis injisert deretter på en ukentlig eller to-ukers immuniseringsprotokoll. Serumprøver ble periodevis tatt opp ved retro-orbital blødning eller hale-endeavkutting for testing ved dot-blot-analyse (antistoff sandwich) eller ELISA (enzymbundet immunsorbent-analyse). Andre analysefremgangsmåter er også mulige. Etter påvisning av en passende antistofftiter blir positive dyr gitt en intravenøs injeksjon med antigen i saltvann. Tre til fire dager senere blir dyrene ofret, miltcellene høstet og fusert til murin myelomacellelinje NS1. Hybridomcellelinjene som dannes ved denne fremgangsmåte, blir sådd ut i multiple mikrotiterplater i et HAT selektivt medium (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) for å hemme proliferasjon av ikke-fuserte celler, myelomhybrider og miltcellehybrider.
Hybridomkloner som således dannes, kan undersøkes ved ELISA på reaktivitet med IL-7, f.eks. ved tilpasninger av teknikkene som er beskrevet av Engvall et al., Immuno-chemistry8^:871 (1971) og i U.S. patent 4.703.004. Positive kloner injiseres deretter inn i peritonealhulrommene til syngene Balb/c-mus for å fremstille ascites som inneholder høye konsetnrasjoner (>1 mg/ml) anti-IL-7 monoklonalt antistoff. Det resulterende monoklonale antistoff kan renses ved ammoniumsulfatutfelling etterfulgt av geleksklusjons-kromatografi, og/eller affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A fra Staphylococcus aureus.

Claims (10)

  1. !• Isolert DNA-sekvens som koder for et pattedyr-interleukin-7 (IL-7), en IL-7-analog eller avkortet IL-7 med tilsvarende biologisk aktivitet,karakterisert vedat DNA-sekvensen er valgt fra:
    (a) en DNA-sekvens omfattende nukleotidsekvensen vist i figur 3 og figur 5; (b) en DNA-sekvens som degenereres som følge av den genetiske kode til en DNA-sekvens ifølge (a); og (c) en DNA-sekvens som under hybridiseringsbeting-elser ved 50 °C og 0,9 M NaCl, etterfulgt av vask i IX SSC ved 55 °C, vil hybridisere til en DNA-sekvens ifølge (a), og som koder for et IL-7, en IL-7-analog eller avkortet IL-7 med biologisk aktivitet i en pre-B-celleproliferasjonsanalyse.
  2. 2. Isolert DNA-sekvens følge krav 1,karakterisert vedat den koder for et IL-7, en IL-7-analog eller avkortet IL-7 omfattende en aminosyresekvens valgt fra rester -25 til 129 ifølge figur 3, rester 1 til 129 ifølge figur 3, rester -25 til 152 ifølge figur 5 og rester 1 til 152 ifølge figur 5, idet IL-7, IL-7-analogen eller avkortet IL-7 og har en biologisk aktivitet som nativt IL-7.
  3. 3. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 2,karakterisert vedat den koder for en aminosyresekvens valgt fra rester -25 til 129 ifølge figur 3, rester 1 til 129 ifølge figur 3, rester -25 til 152 ifølge figur 5 og rester 1 til 152 ifølge figur 5.
  4. 4. Isolert DNA-sekvens ifølge krav 1,karakterisert vedat den koder for en aminosyresekvens som mangler én eller flere aminosyrer tilsvarende rester 121-139 vist i figur 5, men som ellers er identisk med aminosyresekvensen vist som rester 1 til 152 ifølge figur 5.
  5. 5. Rekombinant ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke IL-7, karakterisert vedat den inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte protein ifølge kravene 1-4, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er i stand til å dirigere ekspresjon av nevnte DNA-sekvens, samt inneholdende seleksjonsmarkørkodende sekvenser.
  6. 6. Fremgangsmåte for fremstilling av et pattedyr-IL-7, en IL-7-analog eller avkortet IL-7,karakterisert veddyrking av en passende vertcelle som omfatter en vektor ifølge krav 5 under betingelser som fremmer ekspresjon av IL-7, IL-7-analog eller avkortet IL-7, hvoretter IL-7 isoleres.
  7. 7. Fremgangsmåte for fremstilling av et pattedyr-IL-7-protein ifølge krav 6, karakterisert vedrensing av et IL-7-protein med en molekylvekt på 25 000 dalton og som oppviser aktivitet i en pre-B-celleproliferasjonsanalyse; idet IL-7 renses til . hovedsakelig homogenitet, som indikert ved påvisning av et enkelt proteinbånd tilsvarende en molekylvekt på 25 000 dalton med SDS-PAGE etterfulgt av sølvfarging.
  8. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det anvendes en ekspresjonsvektor som koder for et IL-7 som er humant IL-7 omfattende aminosyresekvensen til restene 1-152 ifølge figur 5.
  9. 9. Antistoff, karakterisert vedat det immunreagerer med et IL-7-protein som omfatter en aminosyresekvens valgt fra rester 1 til 129 ifølge figur 3 og rester 1 til 152 ifølge figur 5.
  10. 10. Antistoff ifølge krav 9, karakterisert vedat det er et monoklonalt antistoff.
NO892630A 1987-10-26 1989-06-23 Isolert DNA-sekvens som koder for interleukin-7, ekspresjonsvektor inneholdende sekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av interleukin-7, samt antistoff mot proteinet NO302824B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11356687A 1987-10-26 1987-10-26
PCT/US1988/003747 WO1989003884A1 (en) 1987-10-26 1988-10-19 Interleukin-7

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO892630D0 NO892630D0 (no) 1989-06-23
NO892630L NO892630L (no) 1989-06-23
NO302824B1 true NO302824B1 (no) 1998-04-27

Family

ID=22350177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO892630A NO302824B1 (no) 1987-10-26 1989-06-23 Isolert DNA-sekvens som koder for interleukin-7, ekspresjonsvektor inneholdende sekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av interleukin-7, samt antistoff mot proteinet

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0314415B1 (no)
JP (1) JP2749838B2 (no)
AT (1) ATE109829T1 (no)
AU (1) AU616456B2 (no)
CA (1) CA1340491C (no)
DE (1) DE3851035T2 (no)
DK (1) DK175865B1 (no)
FI (1) FI103987B (no)
IE (1) IE64159B1 (no)
IL (1) IL88151A (no)
NO (1) NO302824B1 (no)
NZ (1) NZ226679A (no)
WO (1) WO1989003884A1 (no)
ZA (1) ZA887773B (no)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE56471T1 (de) 1980-04-03 1990-09-15 Biogen Inc Dns-sequenzen, rekombinante dns-molekuele und verfahren zur herstellung von dem menschlichen fibroblast-interferon.
US5032396A (en) * 1989-02-17 1991-07-16 Immunex Corporation IL-7 to stimulate platelet production
ZA943348B (en) * 1993-05-21 1995-11-16 Hirano Toshio A gene encoding a polypeptide having pre-B cell growth-supporting ability
TW442493B (en) * 1993-10-15 2001-06-23 Toshio Hirano A membrane protein polypeptide having pre-B cell growth-supporting ability and a gene thereof
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
DK0690127T3 (da) * 1994-03-31 1999-05-03 Amgen Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til stimulering af megakaryocytvækst og -differentiering
EP2314696A1 (en) * 1998-09-21 2011-04-27 Schering Corporation Therapeutic uses of human Interleukin-B50 antagonist.
US20030099947A1 (en) 1998-09-21 2003-05-29 Bazan J. Fernando Mammalian cytokines; related reagents and methods
MXPA01008142A (es) 1999-02-10 2003-07-21 Welfide Corp Compuestos de amida, y uso medicinal de los mismos.
DE10137792A1 (de) * 2001-08-06 2003-02-27 Erdmann Volker Verfahren zur Genexpression
EP1391513A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-25 Cytheris IL-7 drug substance, IL-7 comprising composition, preparation and uses thereof
BRPI0519000A2 (pt) * 2004-12-09 2008-12-23 Merck Patent Gmbh variantes de il-7 com imunogenicidade reduzida
EP1746161A1 (en) 2005-07-20 2007-01-24 Cytheris Glycosylated IL-7, preparation and uses
UA120027C2 (uk) 2006-12-14 2019-09-25 Шерінг-Плау Лтд. Ізольоване антитіло проти собачого тимусного стромального лімфопоетину (tslp)
KR20140063657A (ko) 2011-08-03 2014-05-27 사이세리스 Ｈｃｖ 면역요법
US8962913B2 (en) * 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
KR101873201B1 (ko) 2015-06-11 2018-07-02 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도
KR102386735B1 (ko) 2015-11-06 2022-04-14 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형
KR20170066265A (ko) 2015-12-04 2017-06-14 주식회사 제넥신 면역글로불린 Fc가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 유래 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102604595B1 (ko) 2015-12-04 2023-11-21 주식회사 제넥신 면역글로불린 Fc가 융합된 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20230071889A1 (en) 2018-12-21 2023-03-09 Ose Immunotherapeutics Bifunctional anti-pd-1/il-7 molecule

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4546082A (en) 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4720482A (en) * 1982-10-20 1988-01-19 Dana Farber Cancer Institute Pharmaceutical compositions containing one or more lymphocyte growth factors
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4730036A (en) * 1984-01-03 1988-03-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Purifications of B-cell inducing factor (BIF) and B-cell growth factor (BGF)
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
JPS6490199A (en) * 1987-09-30 1989-04-06 Hiromi Fujiwara T cell growth factor derived from thymic interstitial cell and production thereof

Also Published As

Publication number Publication date
FI103987B1 (fi) 1999-10-29
CA1340491C (en) 1999-04-13
AU616456B2 (en) 1991-10-31
NO892630D0 (no) 1989-06-23
AU2827289A (en) 1989-05-23
IL88151A (en) 1993-01-31
ATE109829T1 (de) 1994-08-15
DK302089D0 (da) 1989-06-19
DK302089A (da) 1989-06-19
WO1989003884A1 (en) 1989-05-05
EP0314415A2 (en) 1989-05-03
NO892630L (no) 1989-06-23
JP2749838B2 (ja) 1998-05-13
EP0314415A3 (en) 1990-05-30
FI902077A0 (fi) 1990-04-25
ZA887773B (en) 1989-07-26
NZ226679A (en) 1991-06-25
DE3851035D1 (de) 1994-09-15
EP0314415B1 (en) 1994-08-10
IE883221L (en) 1989-04-26
FI103987B (fi) 1999-10-29
DE3851035T2 (de) 1994-12-01
JPH05268971A (ja) 1993-10-19
DK175865B1 (da) 2005-04-18
IE64159B1 (en) 1995-07-12
IL88151A0 (en) 1989-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4965195A (en) Interleukin-7
US5705149A (en) Use of interleukin-7 to stimulate proliferation of hematopoietic cell precursors
NO302824B1 (no) Isolert DNA-sekvens som koder for interleukin-7, ekspresjonsvektor inneholdende sekvensen, fremgangsmåte for fremstilling av interleukin-7, samt antistoff mot proteinet
CA1341611C (en) Interleukin-1 receptors
EP0318296B1 (en) DNA encoding proteins which bind to human IL-1
US5319071A (en) Soluble interleukin-1 receptors
NO301888B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner som omfatter GM-CSF og IL-3, DNA-sekvens som koder for slike og rekombinant ekspresjonsvektor som omfatter en slik DNA-sekvens
WO1988005469A1 (en) Human interleukin-3 proteins
NO301482B1 (no) Fremgangsmåte for fremstilling av renset rekombinant human-IL-3-analogprotein som omfatter Met3huIL-3(Pro8Asp15Asp70), isolert DNA-sekvens, rekombinant ekspresjonsvektor og gjærvertscelle
US5106733A (en) Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
WO1990001039A1 (en) Nonglycosylated human interleukin-3 compositions
US5328988A (en) Interleukin-7
AU620537B2 (en) Human interleukin-4 muteins
EP0383764B1 (en) Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
AU625534B2 (en) Interleukin-1 receptors

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired