NO301241B1 - Prövecelle, apparat og fremgangsmåte for bestemmelse av konsentrasjonen av en forbindelse i en vandig væskepröve - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en elektroanalytisk engangscelle, en fremgangsmåte og et apparat for kvantitativ bestemmelse av tilstedeværelsen av "biologisk viktige forbindelser slik som glukose; TSH; T4; hormoner slik som HCG; hjerteglykosider slik som digoksin; antiarrytmiske midler slik som lidokain; antiepi/leptika^j slik som fenobarbital; antibiotika slik som gentamlcin; kolesterol; ikke-terapeutiske legemidler, o.l., i kroppsvæsker.

Selv om foreliggende oppfinnelse i<\>har omfattende anvendelser, så vil det for illustrasjonsfofmål av oppfinnelsen bli lagt spesiell vekt på dens anvendelse ved^ kvantitativ bestemmelse av tilstedeværelsen av to biologisk viktige forbindelser-

glukose og kolesterol.

M. h. t. glukose:

Diabetes, og spesielt diabetes mellitus, er en metabolisk sykdom som er kjennetegnet ved manglende insulinproduksjon av pankreas, hvilket resulterer i abnormale nivåer av blodglukose. Selv om denne sykdom bare rammer omtrent 4$ av befolkningen i USA, så er den den tredje ledende dødsårsak etter hjertesykdom og kreft. Med riktig opprettholdelse av pasientens blodsukker gjennom daglige injeksjoner av insulin og streng kontroll av diettinntak, er prognosen for diabetikere utmerket. Blodglukosenivåene må imidlertid nøye følges hos pasienten enten ved klinisk laboratorieanalyse eller ved daglige analyser som pasienten kan utføre ved bruk av relativt enkle, ikke-tekniske metoder.

Nåværende teknologi for overvåking av blodglukose er i øyeblikket basert på visuell eller instrumentell bestemmelse av fargeforandring produsert ved enzymatiske reaksjoner på en tørr reagenspute på en liten plaststrimmel. Disse kolorimetriske metodene som utnytter det naturlige oksydasjonsmiddel for glukose til glukonsyre, spesielt oksygen, er basert på reaksj onene:

M. h. t. kolesterol:

Nåværende teknologi for bestemmelse av kolesterol er også basert på lignende metoder. I tilfelle for kolesterol er de for nærværende benyttede metoder basert på de generaliserte reaksjonene:

I alle nåværende teknikker er dioksygen det eneste direkte oksydasjonsmiddelet som benyttes med enzymet kolesteroloksydase for bestemmelse av både fritt og totalt kolesterol. Ved anvendelse av konvensjonelle testmetoder må oksygen diffun-dere inn i sensoroppløsningen ved bruk fra den omgivende luft for å tilveiebringe tilstrekkelig reagens for en fullstendig reaksjon med analytten kolesterol i ufortynnede serum- og helblodprøver.

I begge tilfeller bestemmes tilstedeværelsen av substansen ved kvantifisering, enten kolorimetrisk eller på annen måte, av tilstedeværelsen av hydrogenperoksyd. De eksisterende deteksjonsmetoder kan innbefatte direkte måling av det pro-duserte hydrogenperoksyd på enten spektroskopisk eller elektrokjemisk måte og ved indirekte metoder hvorved hydrogenperoksydet reageres med forskjellige fargestoffer, i nærvær av enzymet peroksydase, for frembringelse av en farge som overvåkes.

Selv om de er relativt lette å "bruke, krever disse testene ensartet brukerteknikk for å gi reproduserbare resultater. F.eks. krever disse testene fjerning av blod fra en reagenspute ved spesifiserte og kritiske tidsintervaller. Etter tidsintervallet må overskudd blod fjernes ved vasking og oppsuging, eller ved oppsuging alene, fordi fargemålingen tas ved reagensputens toppoverflate. Fargeutvikling avleses enten umiddelbart eller etter et spesifisert tidsintervall.

Disse trinnene er avhengig av god og ensartet operasjonsteknikk, hvilket krever streng oppmerksomhet m.h.t. timing. Selv ved bruk av god operasjonsteknikk har det dessuten blitt vist at kolorimetriske metoder for bestemmelse av glukose, f.eks., har dårlig presisjon og nøyaktighet, spesielt i det hypoglycemiske området. Videre varierer instrumenter benyttet for den kvantitative kolorimetriske målingen sterkt i deres kalibreringsmetoder: noen frembyr ingen bruker-kalibrering mens andre frembyr sekundære standarder.

P.g.a. den generelle mangel på presisjon og standardisering av de forskjellige metodene og apparatene som i dag er tilgjengelige for testing av biologisk viktige forbindelser i kroppsvæsker, er noen leger tilbakeholdne når det gjelder å bruke slikt utstyr for overvåking av nivåer eller dosering. De er spesielt tilbakeholdne når det gjelder å anbefale slike metoder for bruk av pasientene selv. Følgelig er det ønske-lig å ha en fremgangsmåte og et apparat som ikke bare vil tillate lege- , men pasient-selvtesting av slike forbindelser med større pålitelighet.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot legens interesse m.h.t. tilveiebringelse av enzymatiske amperometrimetoder og apparater for overvåking av forbindelser i helblod, serum og andre kroppsvæsker. Enzymatisk amperometri gir flere fordeler når det gjelder å regulere eller eliminere operator- avhengige teknikker, og gir samtidig et større lineært dynamisk område. Et system basert på denne type metode kan rette seg mot problemene til de leger som er tilbakeholdne m.h.t. å anbefale selvtesting til sine pasienter.

Enzymatiske amperometrimetoder har blitt benyttet på den laboratoriebaserte måling av en rekke analytter inkludert glukose, blodureanitrogen og laktat. Tradisjonelt består elektrodene i disse systemene av bulkmetalltråder, sylindere eller skiver innleiret i et isolerende materiale. Frem-still ingsprosessen resulterer i individualistiske egenskaper for hver elektrode, hvilket nødvendiggjør kalibrering av hver sensor. Disse elektrodene er også for kostbare for engangs-bruk, hvilket nødvendiggjør grundig oppmerksomhet m.h.t. elektrodevedlikehold for fortsatt pålitelig bruk. Det er ikke sannsynlig at dette vedlikehold vil bli utført på riktig måte av utrenet personell (slik som pasienter), og for derfor å bli vellykket må en enzymamperometrimetode som er ment for selvtesting (eller ikke-tradisjonell stedstesting) basere seg på en engangssensor som kan fremstilles på en måte som tillater at den kan gi reproduserbar ytelse eller effekt fra sensor til sensor og til en kostnad godt under den for tradi-sjonelle elektroder.

Foreliggende oppfinnelse takler disse fordringer ved tilveiebringelse av elektroanalytiske miniatyrprøveceller for en-gangsbruk for nøyaktig mikro-aliquotprøvetagning, et kom-plett, automatisk apparat for måling av den elektrokjemiske reduksjon i prøven, og en fremgangsmåte for anvendelse av cellen og apparatet ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en prøvecelle for bestemmelse av konsentrasjonen av en valgt forbindelse i en vandig væskeprøve, og denne prøvecellen er kjennetegnet ved at den omfatter a) en metallisert første elektrode som virker som en arbeidselektrode, b) en metallisert andre elektrode som virker som en referanse-elektrode eller en pseudoreferanse-elektrode hvor

nevnte andre elektrode er operativt forbundet med nevnte første elektrode

c) i det minste ett ikke-ledende lagelement som har en åpning derigjennom, hvor det ikke-ledende lagelementet er

anordnet i kontakt med minst en av nevnte elektroder og hvor nevnte ikke-ledende lagelement er forseglet mot minst en av nevnte første og andre elektrode til dannelse av et kjent elektrodeareale med nevnte åpning slik at åpningen danner en brønn for mottak av nevnte vandige prøvevaeske og for tillatelse av anbringelse av nevnte væske i det kjente elektrodearealet i kontakt med nevnte første elektrode og andre elektrode, idet cellen også innbefatter et reagenslag beliggende inne i nevnte celle dannet av nevnte åpning hvor reagenslaget inneholder et oksydasjonsmiddel, en buffer og et bindemiddel, hvorved innholdet i brønnen kan utsettes for en forutbestemt katalysert reaksjon;

d) anordning for påsetting av et potensiale over nevnte elektroder etter at den forutbestemte katalyserte reaksjonen

har forløpt vesentlig til fullendelse; og

e) anordning for måling av den resulterende Cottrell-strømmen etter påsetting av nevnte potensiale.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et apparat for måling av forbindelser i en vandig væskeprøve, og apparatet er kjennetegnet ved at det omfatter:

a. Et hus som har en adgangsåpning derigjennom,

b. en prøvecelle som kan mottas i nevnte adgangsåpning i huset, hvor prøvecellen er definert ifølge et hvilket som helst av kravene 12 til 24,

c. anordning for dannelse av en elektrisk krets mellom nevnte første elektrode og nevnte andre elektrode gjennom den vandige prøvevæsken og d. anordning for visuell fremvisning av en måling av nevnte vandige prøvevæske oppnådd ved hjelp av apparatet. Ytterligere tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for måling av mengden av en valgt forbindelse i kroppsvæsker, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved a) tilveiebringelse av en målecelle som har en første og en andre elektrode og nevnte celle inneholdende et

oksydasjonsmiddel og en buffer,

b) anbringelse av en væskeprøve som skal testes i nevnte celle, c) rekonstituering av nevnte oksydasjonsmiddel og buffer med nevnte væskeprøve for å utvikle en forutbestemt katalysert reaksjon,

d) reaksjonen får forløpe til vesenetlig fullendelse,

e) påsetting av et potensiale over nevnte elektroder og

prøve, og

f) måling av den resulterende Cottrell-strøm for å bestemme konsentrasjonen av nevnte valgte forbindelse som er

tilstede i prøven.

Engangscellene ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis laminerte lag av metallisert plast og ikke-ledende materiale. De metalliserte lagene representerer arbeids- og referanseelektrodene, hvis arealer blir definert på reproduserbar måte ved lamineringsprosessen. En åpning gjennom disse lagene er konstruert for å tilveiebringe det prøve-holdige areal eller celle for den nøyaktige måling av prøven. Innføringen av cellen i apparatet ifølge oppfinnelsen initierer automatisk målecykelen.

For bedre å forstå måleprosessen er det beskrevet en aktuell foretrukken utførelse av oppfinnelsen som innebærer en to-trinns reaksjonssekvens som anvender et kjemisk oksydasjons-trinn som benytter andre oksydasjonsmidler enn oksygen, og et elektrokjemisk reduksjonstrinn som er egnet for kvantifisering av reaksjonsproduktet i det første trinnet. En fordel med å benytte et oksydasjonsmiddel som er forskjellig fra dioksygen for direkte bestemmelse av en analytt, er at de kan forhåndsplasseres i sensoren i et stort overskudd i forhold til analytten og således sikre at oksydasjonsmiddelet ikke er den begrensende reagens (med dioksygen så er det normalt utilstrekkelig oksydasjonsmiddel til stede til å begynne med i sensoroppløsningen for en kvantitativ omdannelse av analytten ).

I oksydasjonsreaksjonen blir en prøve inneholdende glukose, f.eks., omdannet til glukonsyre og et reduksjonsprodukt av oksydasjonsmiddelet. Denne kjemiske oksydasjonsreaksjonen har blitt funnet å forløpe til fullendelse i nærvær av et enzym, glukose og oksydase, som er meget spesifikt for substratet B-D-glukose, og katalyserer oksydasjoner med enkel-og dobbel-elektronakseptorer. Det har imidlertid blitt funnet at oksydasjonsprosessen ikke forløper utover dannelsen av glukonsyre, hvilket dermed gjør denne reaksjonen særlig egnet for elektrokjemisk måling av glukose.

I en aktuell foretrukken utførelse foretrekkes oksydasjoner med en elektronakseptor ved anvendelse av ferricyanid, ferricinium, kobolt (III) ortofenantrolin og kobolt (III) dipyridyl. Benzokinon er en toelektron-akseptor som også gir utmerkede elektro-oksydasjonsegenskaper for amperometrisk kvantifisering.

Amperometrisk bestemmelse av f.eks. glukose ifølge foreliggende oppfinnelse benytter Cottrell strømmikro-kronoamperometri hvorved glukose pluss en oksydert elektronakseptor produserer glukonsyre og en redusert akseptor. Denne bestemmelsen innebærer et forutgående kjemisk oksy-dasjonstrinn katalysert av en enzymatisk bisubstrat-biproduktmekanisme slik det vil fremgå fra foreliggende sammenheng.

I denne kvantifiseringsmetoden har målingen av en diffusjons-regulert strøm ved et nøyaktig spesifisert tidspunkt (f.eks. 20, 30 eller 50 sek., f.eks.) etter øyeblikket med påsetting av et potensial, den anvendbare ligning for amperometri ved et regulert potensial (E = konstant) på:

hvor i betegner strøm, nF er antall coulomb pr. mol, D er diffusjonskoeffisienten for reagensens reduserte form, t er den forhåndsinnstilte tid ved hvilken strømmen måles, og C er konsentrasjonen av metabolitten. Målinger ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte av strømmen som skyldes reoksydasjonen av akseptorene, ble funnet å være proporsjonal med glukose-konsentrasjonen i prøven.

Foreliggende fremgangsmåte og apparat tillater, i foretrukne utførelser, direkte målinger av blodglukose, kolesterol, o.l. Videre sørger prøvecellen ifølge foreliggende oppfinnelse for testing av regulerte volumer av blod uten forhåndsmål ing. Innføring av prøvecellen i apparatet tillater således automatisk funksjonering og timing av reaksjonen hvilket gjør at pasienten kan foreta selvtesting med en meget høy presisjons- og nøyaktighetsgrad.

En av mange av de aktuelle foretrukne utførelser av oppfinnelsen for bruk ved måling av B-D-glukose er beskrevet i detalj for bedre å forstå oppfinnelsens natur og omfang. Spesielt er foreliggende fremgangsmåte og apparat i denne utførelsen bestemt for tilveiebringelse av klinisk selv-overvåkning av blodglukosenivåer av en diabetisk pasient. Foreliggende prøvecelle anvendes for å regulere prøve-tagningsvolumet og reaksjonsmedier og virker som den elektrokjemiske sensor. I denne beskrevne utførelse an-vendendes benzokinon som elektronakseptor.

Den grunnleggende kjemiske binære reaksjon som anvendes av foreliggende oppfinnelse, er: B-D-glukose + benzoekinon + EgO -♦ glukonsyre + hydroklnon Hydrokinon benzoekinon + 2e + 2H+

Den første reaksjonen er en oksydasjonsreaksjon som forløper til fullendelse i nærvær av enzymet glukoseoksydase. Elektrokjemisk oksydasjon finner sted i den andre delen av reaksjonen og tilveiebringer måten for kvantifisering av mengden av hydrokinon produsert i oksydasjonsreaksjonen. Dette er tilfelle enten katalytisk oksydasjon utføres med toelektron-akseptorer eller enelektron-akseptorer slik som ferricyanid [hvor redoks-paret ville være Fe(CN)^_3/Fe(CN)(,-4] , ferricinium, kobolt (III) trisortofenantrolin og kobolt (III) tris-dipyridyl.

Katalytisk oksydasjon av glukoseoksydase er meget spesifikk for B-D-glukose, men er ikke-selektiv m.h.t. oksydasjonsmiddelet. Det har nå blit oppdaget at de ovenfor beskrevne oksydasjonsmidler har tilstrekkelige positive potensialer til å omdanne vesentlig all B-D-glukose til glukonsyre. Videre tilveiebringer dette systemet en metode ved hjelp av hvilken mengder så små som 1 mg glukose (i den foretrukne utførelsen) til 1000 mg glukose kan måles pr. deciliter prøve - resultater som tidligere ikke er blitt oppnådd ved bruk av andre glukose-selvtestingssystemer.

Sensorene som inneholder kjemien for utførelse av den ønskede bestemmelse, konstruert ifølge foreliggende oppfinnelse, anvendes med en portabel måler for selvtestingssystemer. Ved bruk innføres sensoren i måleren, hvilket setter i gang måleren og initierer en ventetid for påføringen av prøven. Måleren gjenkjenner prøvepårøringen ved den plutselige lade-strøm som oppstår når elektrodene og det overliggende reagenslaget til å begynne med fuktes av prøvefluidet. Når prøvepåføringen først er detektert, så begynner måleren reaksjonsinkubasjonstrinnet (hvis lengde er kjemiavhengig) for å tillate at den enzymatiske reaksjon kan nå fullendelse. Denne perioden er av størrelsesorden 15-90 sek. for glukose, idet inkubasjonstider på 20-45 sek. er foretrukket. Etter inkubasjonsperioden så påsetter instrumentet et kjent potensial over elektrodene og måler strømmen ved spesifikke tids-punkter i løpet av Cottrell-strømfallet. Strømmållinger kan foretas i området 2-30 sek. etter potensialpåsettingen, hvor måletider på 10-20 sek. er foretrukket. Disse strømverdiene anvendes deretter for å beregne analyttkonsentrasjonen som deretter vises. Måleren vil så vente på at enten brukeren skal fjerne sensoren eller i en forutbestemt periode før den avstenger seg selv.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et målesystem som eliminerer flere av de kritike operatøravhengige variablene som på en uheldig måte påvirker nøyaktigheten og pålitelig-heten og gir et større dynamisk område enn andre selvtestingssystemer. Disse og andre fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra en gjennomlesning av den neden-stående detaljerte beskrivelse av en utførelse som i dag foretrekkes for måling av glukose og en annen for måling av kolesterol, i forbindelse med de medfølgende tegninger hvor like henvisningstall indikerer like komponenter og hvor: Fig. 1 er et sprengriss av et potabelt testapparat ifølge foreliggende oppfinnelse;

fig. 2 er et planriss av prøvetagningscellen ifølge opp-f innelsen;

fig. 3 er et sprengriss av prøvecellen vist på fig. 2;

fig. 4 er et sprengriss av en annen utførelse av en prøve-celle ifølge oppfinnelsen;

fig. 5 er et planriss av cellen vist på fig. 4;

fig. 6 er en ytterligere utførelse av en prøvecelle;

fig. 7 er en grafisk fremstilling som viser strøm som en funksjon av glukosekonsentrasjon;

fig. 8 er en grafisk fremstilling av Cottrell-strømmen som en funksjon av glukosekonsentrasjon; og

fig. 9 er et aktuelt foretrukket blokkdiagram av en elektrisk krets for bruk i apparatet vist på fig. 1.

Fig. 10 er en foretrukken utførelse av den elektrokjemiske cellen.

Under spesiell henvisning til fig. 1 vises et portabelt elektrokjemisk testapparat 10 for bruk ved pasient-selvtesting, slik som f.eks. for blodglukosenivåer. Apparatet 10 omfatter et fremre og bakre hus 11 og 12, respektivt, et fremre panel 13 og et kretskort 15. Frontpanelet 13 innbefatter grafiske displaypaneler 16 for å gi informasjon og instruksjoner til pasienten, og direkte avlesning av test-resultatene. Mens en startknapp 18 er anordnet for å initiere en analyse, er det foretrukket at systemet begynner operasjonen når en prøvecelle 20 er innført i vinduet 19 i apparatet.

På fig. 3 vises en prøvecelle 20 som er et metallisert plastsubstrat som har en åpning 21 av spesiell størrelse som definerer en volumetrisk brønn 21, når cellen er satt sammen, for innhold av en reagenspute og blodet som skal analyseres. Cellen 20 omfatter et første 22 og andre 23 substrat som fortrinnsvis kan være fremstilt av styren eller en annen vesentlig ikke-ledende plast. Anordnet på det andre substratet 23 er referanseelektroden 24. Referanseelektroden 24 kan fortrinnsvis være fremstilt f.eks. ved dampavsetning av elektroden på et substrat laget av et materiale slik som polyimidet kapton. I den foretrukne utførelsen er referanse elektroden 24 en sølv-sølvklorid-elektrode. Denne elektroden kan fremstilles ved først å avsette et sølvlag-sølvklorid ved enten kjemiske eller elektrokjemiske metoder før substratet anvendes for å konstruere cellene. Sølvkloridlaget kan endog utvikles in situ på en sølvelektrode når reagenslaget inneholder visse av oksydasjonsmidlene, slik som ferricyanid, og klorid som vist i følgende reaksjoner:

Alternativt kan sølv-sølvkloridelektroden fremstilles ved avsetning av et lag av sølvoksyd (ved reaktiv sputtering) på sølvfilmen. Dette sølvoksydlaget blir deretter omdannet in situ ved tidspunktet for testing til sølvklorid ifølge reaksj onen:

når sensoren fuktes av prøvefluidet og rekonstituerer det kloridholdige reagenslaget. Sølvelektroden med et lag inneholdende sølvklorid.

Referanseelektroden kan også være av den type som generelt er kjent som en "pseudo"-referanseelektrode som baserer seg på det store overskuddet av de oksyderende forbindelsene for opprettelse av et kjent potensial ved en edelmetallelektrode. I en foretrukken utførelse blir to elektroder av det samme edelmetallet benyttet, men en er imidlertid vanligvis av større overflateareal og er benyttet som ref eranseelektrode. Det store overskuddet av de oksyderte forbindelsene og det store overflatearealet motsetter seg en forandring i referanseelektrodens potensial.

Indikator eller arbeidselektrode 26 kan enten være en strim-mel av platina, gull, palladium eller metalisert plast anordnet på referanseelektroden 24 eller alternativt kan arbeidselektroden 26 og referanseelektroden være fremstilt som en koplanar enhet hvor elektroden 26 er anordnet mellom koplanart elektrodemateriale 24. En prøvecelle 20 blir fortrinnsvis fremstilt ved anbringelse eller laminering av elektrodene mellom substratet for dannelse av en kompositt-enhet.

Som vist på fig. 2 har det første substratet 22 en litt kor-tere lengde for derved å eksponere en endedel 27 av elektrodene 24 og 26 og gi anledning for elektrisk kontakt med test-kretsen som inneholdes i apparatet. I denne utførelsen blir, etter at en prøve har blitt anbragt i brønnen 21, cellen 20 skjøvet inn i vinduet 19 i frontpanelet for å starte testing. I denne utførelsen kan en reagens anbringes i brønnen 21, eller fortrinnsvis blir en pute av tørr reagens plassert deri og en prøve (dråpe) av blod anbringes i brønnen som inneholder reagensen.

På figurene 4-6 vises alternative utførelser av prøvecellen 20. På fig. 4 er prøvecellen 120 vist med første 122 og andre 123 substrater. Referanseelektroden 124 og arbeidselektroden 126 er laminert mellom substratene 122 og 123. Åpningen 121 er dimensjonert til å inneholde prøven som skal testes. Enden 130 er beregnet for å bli innført i apparatet, og elektrisk kontakt oppnås med de respektive elektrodene ved hjelp av utstansinger 131 og 132 i cellen. Referanseelektroden 124 innbefatter også en utstansing 133 for å tillate elektrisk kontakt med arbeidselektroden 126.

På fig. 6 er arbeidselektroden 226 foldet, for derved å oppnå forøket overflateareal rundt åpningen 221, for oppnåelse av øket sensitivitet eller spesifisitet. I dette tilfelle er referanseelektroden 224 anordnet under arbeidselektroden 226. Arbeidselektroden innbefatter en utsparing 234 for å gi elektrisk kontakt med referanseelektroden 224 gjennom utsparingen 231 i substratet 222. Enden 230 på substratet 222 inn befatter også en utsparing 232 for å tillate elektrisk kontakt med arbeidselektroden 226.

Prøvecellen ifølge oppfinnelsen føres gjennom vinduet 19 for å initiere testprosedyren. Når den er innført, påsettes et potensial ved delen 27 på prøvecellen over elektrodene 24 og 26 for å detektere tilstedeværelsen av prøven. Når prøvens tilstedeværelse er detektert, fjernes potensialet og inkubasjonsperioden initieres. I løpet av denne perioden kan eventuelt en vibratoranordning 31 aktiveres for oppnåelse av agitasjon av reagensene for å forbedre oppløsning (en in-kubasjonsperiode på 20-45 sek. blir hensiktsmessig benyttet for bestemmelse av glukose, og ingen vibrasjon er normalt nødvendig). Et elektrisk potensial blir deretter påsatt ved delen 27 av prøvecellen til elektrodene 24 og 26, og strømmen gjennom prøven måles og vises på displayanordninen 16.

For i full utstrekning å trekke fordel av det ovenfor omtalte apparat blir den nødvendige kjemi for selvtestingssystemene inkorporert i et tørt reagenslag som er anbragt på engangscellen, hvilket danner en fullstendig sensor for den til-siktede analytt. Den elektrokjemiske engangscellen er konstruert ved laminering av plastmateriale og ikke-ledende materiale på en slik måte at det foreligger et nøyaktig definert arbeidselektrodeareal. Reagenslaget blir enten direkte belagt på cellen eller fortrinnsvis inkorporert (belagt) i en bærermatrise slik som filterpapir, membranfilter, vevet stoff eller ikke-vevet stoff, som deretter plasseres inne i cellen. Når en bærermatrise anvendes, så kan dens porestørrelse og hulromvolum justeres for tilveiebringelse av den ønskede nøyaktighet og mekaniske understøttelse. Generelt gir membranfilteret eller ikke-vevede stoffer de beste materialene for reagenslagbæreren. Porestørrelser på 0,45-50 pm og hulromvolum på 50-90$ er hensiktsmessig. Beleggformu-leringen innbefatter vanligvis et bindemiddel slik som gelatin, karagen, metylcellulose, polyvinylalkohol, polyvinyl-pyrrolidon, osv. som virker slik at oppløsningen av reagen sene forsinkes inntil reagenslaget har adsorbert mesteparten av fluidet fra prøven. Konsentrasjonen av bindemiddelet er generelt av størrelsesorden 0,1-10$, idet 1-4$ er foretrukket .

Reagenslaget suger opp en fiksert mengde av prøvefluidet når det påføres på overflaten av laget og eliminerer derfor ethvert behov for forhåndsmål ing av prøvevolum. Videre, i kraft av måling av elektrisk strøm istedenfor reflektert lys, så er det ikke nødvendig å fjerne blodet fra overflaten av reagenslaget før måling slik tilfelle er med refleksspektro-skopisystemer. Mens fluidprøven kan påføres direkte på overflaten av reagenslaget for å lette spredning av blod over hele overflaten av reagenslaget, så innbefatter sensoren fortrinnsvis et dispergerende, spredende eller vekevirkningsgivende lag. Dette laget som generelt er et ikke-vevet stoff eller adsorberende papir, er anordnet over reagenslaget og virker slik at blodet hurtig fordeles over reagenslaget. I noen anvndelser kan dette dispergerende laget innbefatte ytterligere reagenser.

For glukosebestemmelse ble celler som utnytter den koplanare design, konstruert med reagenslaget inneholdende følgende formuleringer:

Det ble tilberedt ved belegging av et membranf ilter med en oppløsning av sammensetningen ovenfor og lufttørking. Reagenslaget ble deretter oppskåret i strimler som akkurat passer vindusåpningen i cellene og disse strimlene ble deretter plassert over elektrodene som er eksponert innenfor vinduene. Et vekevirkningsgivende lag av et ikke-vevet rayonstoff ble deretter plassert over dette reagenslaget og holdt på plass med en overliggende tape.

For å bevise anvendelsen av teknologien ifølge foreliggende oppfinnelse ble et stort antall eksempler utført i en vandig oppløsning ved 25°C. Elektrolytten besto av en fosfatbuffer av pH 6,8 som besto av ca. 0,1 molar totalt fosfat og 0,5 M kaliumkloridreagens. Potensialene har referanse til en nor-mal hydrogenelektrode (NHE). I disse testene ble det funnet at ethvert potensial mellom +0,8 og 1,2 volt (vs NHE) er egnet for kvantifisering av hydrokinon når benzoekinon benyttes som oksydasjonsmiddel. De begrensende strømmer er proporsjonale med hydrokinonkonsentrasjoner i området mellom 0,0001 M og 0,050 M.

Bestemmelse av glukose ved Cottrell-strøm (it) mikrokrono-amperometri med foreliggende fremgangsmåte oppnås i reaksjonen av hydrokinon til benzoekinon. Cottrell-strøm forfaller med tiden i overensstemmelse med ligningen:

Hovedforskjellen mellom disse to teknikker består i påsetting av det passende regulerte potensial etter at glukose-benzoekinon-reaksjonen er fullstendig og korrelering av glukosekonsentrasjoner med Cottrell-strømmer målt ved en fastsatt tid deretter. Strøm-tid-avlesningen er vist på fig. 8. Proporsjonalitet mellom glukosekonsentrasjoner og Cottrell-strømmer (registrert ved t = 30 sek. etter påsetting av potensialet) er vist på fig. 7.

Det skal påpekes at Cottrell-kronoamperometri av metabolitter trenger den dobbelte sikring av enzymatisk katalyse og elektrolyse ved regulert potensial. Glukonsyreutbytter på 99,9+ prosent ble oppnådd i nærvær av glukoseoksydase. Samtidig ble ekvivalente mengder av benzoekinon redusert til hydrokinon, hvilket hensiktsmessig ble kvantifisert i hvi-lende oppløsninger, ved stasjonære palladium-tynnfilmanoder eller prøveceller.

Resultatene av disse mange tester demonstrerer foreliggende mikrokronoamperometriske metodikk og dens anvendelighet for glukose-selvovervåking av diabetikere.

I en for nærværende foretrukket utførelse av oppfinnelsen som anvender ferrocyanid, ble det foretatt en rekke forsøk som viste visse forbedrede operasjonsmuligheter.

Under henvisning til fig. 9 så vises et skjematisk diagram av en foretrukket krets 15 for bruk i apparatet 10. Kretsen 15 innbefatter en mikroprosessor og LCD-panel 16. Arbeids- og referanseelektrodene på prøvecellen 20 tilveiebringer kontakt ved kontakter W (arbidselektrode) og R (referanseelektrode), respektivt. Spenningsreferanse 41 er forbundet med batteriet 42 gjennom en analog hovedbryter 43. Strøm fra elektrodene W og R omdannes av den regulerbare motstanden 44, og spenning-til-frekvensomdanneren 46 som er elektrisk forbundet med mikroprosessoren. Andre kretser som er åpenbare for en fag-mann kan naturligvis benyttes for oppnåelse av oppfinnelsens fordeler.

Når det gjelder fig. 10, så består cellen 400 av koplanare arbeids- 426 og referanse- 424 elektroder laminert mellom et øvre 422 og nedre 426 ikke-ledende materiale. Laminering er på et adhesivlag 425. Det øvre materiale 422 innbefatter en utstanset åpning 428 som sammen med bredden på arbeids-eleketrodematerialet definerer arbeidselektrodearealet og tilveiebringer (med et overlappende reagenslag som ikke er vist) cellens prøvetagningsåpning. Ved en ende av cellen 400 er det et åpent areal 427 lik endestillingen 27.

Effektiviteten ved bruk av apparatet ifølge oppfinnelsen for tilveiebringelse av en anordning for selvtesting i hjemmet av pasienter slik som diabetikere (i den foretrukne utførelsen), vil fremgå fra følgende tabell hvor teknologien ifølge foreliggende oppfinnelse er sammenlignet med fire kommersielt tilgjengelige enheter. Som det fremgår er foreliggende oppfinnelse enklere, og i dette tilfelle frembringer enkelthet overensstemmelse i resultater.

Glukosesystem- sammenligninger

Med spesiell hensyn til bestemmelsen av kolesterol under anvendelse av foreliggende oppfinnelse, kan den generaliserte kjemi illustreres som:

Skjema I

hvor enzymene kolesterolesterase (CE) og kolesteroloksydase (CO) katalyserer reaksjonene 1 og 2 respektivt, og CO tillater elektronoverføring med en rekke forskjellige elektroaktive par (oks. og red.)'Reaksjon 2 er ny ved at elektron-

akseptorer andre enn dioksygen kan benyttes for å oksydere kolesterol i nærvær av enzymet kolesteroloksydase. Reakjon 1 er velkjent for fagfolk på området, og er nødvendig for bestemmelse av totalt kolesterol (fritt kolesterol og kolesterolestere). Reaksjon 3 er en elektrooksydasjons-prosess for undersøkelse og kvantifisering av kolesterolen.

Ved bruk av alternative oksydasjonsmidler ifølge oppfinnelsen blir de spesifikke reaksjonene:

A:

Reaksjon 1 ovenfor

B:

Reaksjon 1 ovenfor

Kolesteroloksydase (CO) fra en rekke forskjellige kilder vil katalysere elektronoverføring fra kolesterol til en rekke forskjellige oksydasjonsmidler inkludert benzoekinon, benzoe-kinonderivater slik som metylbenzoekinon, etylbenzoekinon, klorbenzoekinon, orto-benzoekinon (oksydert fra katekol), benzoekinonsulfonat, og kaliumferricyanid. Det er også for-ventet at enzymet vil tillate elektronoverføring med andre alternative oksydasjonsmidler. Som vist i reaksjon 3 kan det reduserte produktet deretter overvåkes amperometrisk for den kvantitative bestemmelse av kolesterol.

Kilder for enzymet som katalyserer oksydasjonen av kolesterol med alternative oksydasjonsmidler, inkluderer CO fra Nocardia, Streptomyces, Schizophyllum, Pseudomonas og Brevibacterium; og under eksperimentelle betingelser i forbindelse med disse er det mulig på hurtig måte å katalysere oksydasjonen av kolesterol med benzoekinon eller med hvilket som helst av de andre oksydasjonsmidlene i en viss grad avhengig av enzymets kilde. F.eks. vil CO fra Streptomyces hurtig katalysere substratoksydasjon med benzoekinon i fosfatbuffer i nærvær av hvilket som helst av en rekke forskjellige av de overflateaktive midlene inkludert oktylglukonopyranocid og CHAPSO; den samme reaksjonen under identiske betingelser med CO fra enten Brevibacterium eller Nocardia er langsommere. Både Nocardia- og Brevibacterium-kilder er imidlertid aktive katalysatorer for kolesteroloksydasjon ved hjelp av alternative oksydasjonsmidler under andre betingelser.

Oksydasjonsmiddelet spiller også en rolle hvor enzymet er mest aktivt. F.eks. vil kolesteroloksydase fra Nocardia hurtig katalysere substratoksydasjon med benzoekinon i 0,2 molar Tris-buffer og 3 g/3 1 CHAPSO, men er langsommere med ferricyanid under identiske betingelser; Brevibacterium-kilden for enzymet er relativt inaktiv med fericyanid i Tris-buffer med en rekke forskjellige overflateaktive midler, men når benzoekinon anvendes som oksydasjonsmiddel, er reaksjonen meget hurtig. Alternativt vil Schizophyllum-kilden for enzym CO hurtig katalysere oksydasjonen av kolesterol i fosfatbuffer med enten ferricyanid eller benzoekinon og med en rekke forskjellige overflateaktive midler som aktivatorer.

Som angitt vil kolesteroloksydase katalysere oksydasjonen av kolesterol med ferricyanid. Ytterligere eksempler der CO katalyserer kolesteroloksydasjon med ferricyanid innbefatter en Nocardia-kilde i Tris-buffer med en rekke forskjellige overflateaktive midler inkludert natriumdeoksykolat, natriumtaurodeoksykolat, CHAPS, Thesit, og CHAPSO. Videre vil CO fra Nocardia også katalysere substratoksydasjon med ferricyanid i fosfatbuffer med natriumdioktylsulfosuksinat, natriumdeoksykolat, natriumtaurodeoksykolat og Triton X-100. Bufferkonsentrasjonen er 0,1-0,4 molar. Konsentrasjonen av overflateaktivt middel for maksimum aktivitet for oksydase-enzymet varierer med hver detergent. Med f.eks. deoksykolat eller taurodeoksykolat er enzymet i 0,2 M Tris mest aktivt med detergent i området 20-90 millimolar. Enzymkatalytisk aktivitet observeres imidlertid opptil og gjennom en 10$ konsentrasjon. Med oktylglukonopyranocid inntreffer maksimumaktiviteten til enzymet med oksydasjonsmiddelet ferricyanid ved en detergentkonsentrasjon på ca. 1,2$, men enzymet opprettholder fremdeles aktivitet ved høyere og lavere konsentrasjoner av det overflateaktive middelet.

Både esterase og CO krever et overflateaktivt middel for høy aktivitet. Spesifikke overflateaktive midler innbefatter natriumdeoksykolat, natriumtaurodeoksykolat, natriumgluko-deoksykolat, CHAPS (3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-l-propansulfonat), CHAPSO (3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-2-hydroksy-l-propansulfonat), oktylglukonopyranocid, oktyl-tioglukonopyranocid, nonylglukonopyranocid, dodecylglykono-pyranocid, Triton X-100, dioktylsulfosuksinat, Thesit (hydroksypolyetoksydodekan) og lecitin (fosfatidylkolin). Buffere som er akseptable for at denne reaksjonen skal inn-treffe med enzymet, innbefatter fosfat, TRIS, MOPS, MES, HEPES, tricin, bicin, ACES, CAPS og TAPS. Et alternativt generalisert reaksjonsskjema for målingen av kolesterol i serum og andre biologiske fluider er gitt i:

Skjema II

hvor Oks og Redg virker som et elektron-formidlerpar mellom kolesterolen og det elektroaktive paret Oksg/Redg. I dette tilfelle behøver Oks^og Red^ikke være elektroaktive siden de ikke må delta i elektrooksydasjonsprosessen (reaksjon 6). Fra både et termodynamisk og kinetisk synspunkt må imidlertid dette paret med hjelp av enzymet kolesteroloksydase kunne

akseptere elektroner fra kolesterol og viderebefordre dem til det elektroaktive paret (Oksg/Redg).

Spesifikke eksempler på denne kjemi innbefatter:

Eksempel 1

Reaksjon 1 ovenfor

Skjema II er nyttig når reaksjonshastigheten for kolesterol med det elektroaktive oksydasjonsmiddelet som i skjema I er så langsom at den utelukket dens bruk i en praktisk sensor. Som nevnt ovenfor er skjema II også nyttig når selve elektronformidleren (Oks^/Red^) enten ikke er elektroaktiv eller utviser dårlig elektrokjemi under betingelser for enzymkjemi. Det er under disse betingelsene at skjema II er særlig anvendelig. Andre elektronformidlere (Oks^/Redi) mellom kolesterol og ferricyanid for bruk i skjema II kan muligens innbefatte fenazinetosulfat, fenazinmetosulfat, tetrametylbenzidin, derivater av benzoekinin, naftokinon og naftokinonderivater, antrakinon og antrakinonderivater, katekol, fenylendiamin, tetrametylfenylendiamin, og andre derivater av fenylendiamin.

Videre, mens det skal forstås at den oksyderte formen av elektron-viderebefordreren aksepterer elektroner fra kolesterol, så kan enten den oksyderte eller den reduserte formen av formidleren inkorporeres i sensoren forutsatt at den reagerer hurtig med både kolesterol og ferricyanid. Der-som den reduserte formen er tilstrekkelig stabil og den oksyderte formen ikke er tilstrekkelig stabil, så kan reduksjons-middelet inkorporeres i sensoren i relativt liten mengde (sammenlignet med analytten som skal bestemmes) og fremdeles gi elektron-viderebefordring. Dette forårsaker imidlertid et tilsvarende bakgrunns signal som det må tas hensyn til. Re-duksjonsmiddelet må også isoleres fra ferrocyanid i sensoren ved inkorporering i et separat reagenslag.

Flere formuleringer av de ovenfor angitte kjemiske forbindelser som omfatter både skjema I og skjema II, har blitt fremstilt som tørre filmer på membraner. Disse membranene anbringes i sensoren som så kan benyttes for bestemmelse av kolesterol. En foretrukket formulering av reagensene som involverer skjema II, består av følgende

Kolesterolesterase å 400 enheter/ml

Kolesteroloksydase fra Streptomyces å 200 enheter/ml

0,05 molar kaliumferricyanid

0,5 molar kaliumklorid

0,2 molar fosfat, pE 6,9

3 g/dl CEAPSO

2 g/dl gelatin

og 0,0001 molar hydrokinon (i det spredende eller vekevirkningsgivende lag).

De tilveiebragte konsentrasjoner er de for oppløsningene som er belagt på porøse bærere, filterpapir eller membraner; disse konsentrasjonene reetableres når membranen suger opp serum- eller fullblod-prøven. For kolesterolbestemmelser er det nødvendig med større porestørrelser i filterbæreren enn det som benyttes for glukose. Grunnen til dette er at kolesterolen befinner seg i serumet i store lipoproteiner (kyl omikroner, LDL, VLDL og EDL) som må trenge gjennom de forskjellige lagene i sensoren inntil de når reagensene. De overflateaktive midlene vil i større utstrekning bryte disse naturlige micellene opp i mindre miceller, hvilket gir et større totalt overflateareal på hvilket enzymene katalyserer reaksjonen. P.g.a. instabiliteten av benzoekinon blir en liten mengde hydrokinon, som er mer stabil i kraft av sitt lavere damptrykk, inkorporert i sensoren for å hjelpe elektronformidling mellom kolesterol og ferricyanid. Ved innføring av serumprøven i sensoren "blir hydrokinonen oksydert til benzoekinon; benzoekinonen er da fri til å oppta elektroner fra substratet og sirkulere dem til ferricyanid. Under disse betingelsene er reaksjonshastigheten til kolesterol med en liten mengde benzoekinon hurtigere enn den med et stort overskudd av ferricyanid.

En alternativ og foretrukket formulering av reagenser som benytter skjema II som an inkorporeres i reagenslaget til sensoren, er:

Kolesteroloksydase fra Streptomyces å 200 enheter/ml

Lipase fra Candida å 500 enheter/ml

3 g/dl CHAPSO

0,02 molar TRIS, pH 7,5

0,05 molar kaliumferricyanid

0,5 molar kaliumklorid

0,05 molar MgCl2

2 g/dl gelatin

og 0,001 molar hydrokinon (i det spredende laget).

Magnesiumsaltet i denne formuleringen øker stabiliteten til esteraseenzymet i det fosfatfrie reagenslaget. Lipase hjelper oppbrytningen av lipoproteinene. Med disse tørre reagenslagene inkorporert i sensoren og ved anvendelse av den beskrevne evalueringsmetodikk, ble følgende resultater oppnådd.

Disse resultater viser den kvantitative responsen for sensoren til serumkolesterolnivåer.

En alternativ og foretrukken utførelse av sensoren som benytter skjema I, tilveiebringes av reagenssammensetninger:

Kolesterolesterase å 400 enheter/ml

Kolesteroloksydase fra Nocardia å 200 enheter/ml

1 g/dl Triton X-100

0,1 molar TRIS-buffer, pH 8,6

0,2 molar kaliumferricyanid

0,5 molar kaliumklorid

0,02 molar MgCl2

2 g/dl gelatin

eller

kolesterolesterase å 200 enheter/ml

kolesteroloksydase fra Streptomyces å 200 enheter/ml 0,06 molar natriumdeoksykolat

0,1 molar TRIS-buffer, pH 8,6

0,2 molar kaliumferricyanid

0,5 molar kaliumklorid

2 g/dl gelatin.

Claims (1)

1. Prøvecelle (20, 120, 400) for bestemmelse av konsentrasjonen av en valgt forbindelse i en vandig væskeprøve,karakterisert vedat den omfatter a) en metallisert første elektrode (26, 126, 226, 426 ) som virker som en arbeidselektrode (26, 126, 226, 426), b) en metallisert andre elektrode (24, 124, 224, 424 ) som virker som en referanse-elektrode eller en pseudoreferanse-elektrode (24, 124, 224, 424) hvor nevnte andre elektrode (24, 124, 224, 424) er operativt forbundet med nevnte første elektrode (26, 126, 226, 426); c) i det minste ett ikke-ledende lagelement (22, 122, 222, 422) som har en åpning (21, 121, 221, 428) derigjennom, hvor det ikke-ledende lagelementet (22, 122, 222, 422) er anordnet i kontakt med minst en av nevnte elektroder (26, 126, 226, 426, 24, 124, 224, 424) og hvor nevnte ikke-ledende lagelement (22, 122, 222, 422) er forseglet mot minst en av nevnte første (26, 126, 226, 426) og andre elektrode (24, 124, 224, 424 ) til dannelse av et kjent elektrodeareale med nevnte åpning (21, 121, 221, 428) slik at åpningen (21, 121, 221, 428) danner en brønn for mottak av nevnte vandige prøvevæske og for tillatelse av anbringelse av nevnte væske i det kjente elektrodearealet i kontakt med nevnte første elektrode (26, 126, 226, 426) og andre elektrode (24, 124, 224, 424 ), idet cellen (20, 120, 400 ) også innbefatter et reagenslag beliggende inne i nevnte celle dannet av nevnte åpning (21, 121, 221, 428) hvor reagenslaget inneholder et oksydasjonsmiddel, en buffer og et bindemiddel, hvorved innholdet i brønnen (21, 121, 221, 428) kan utsettes for en forutbestemt katalysert reaksjon; d) anordning for påsetting av et potensiale over nevnte elektroder etter at den forutbestemte katalyserte reaksjonen har forløpt vesentlig til fullendelse; og e) anordning for måling av den resulterende Cottrell-strømmen etter påsetting av nevnte potensiale.

2 . Prøvecelle (20, 120, 400) ifølge krav 1,karakterisert vedat reagenslaget er et lag av nevnte oksydasjonsmiddel, buffer og bindemiddel belagt på en porøs matrise og hvor matrisen befinner seg inne i cellen (20, 120,

400 ).

3. Prøvecelle (20, 120, 400) ifølge krav 1,karakterisert vedat reagenslaget er en blanding av nevnte oksydasjonsmiddel, buffer og bindemiddel avsatt direkte i cellen (20, 120, 400).

4 . Prøvecelle (20, 120, 400 ) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat oksydasjonsmidlet er egnet, i nærvær av nevnte enzym, til å oksydere den valgte forbindelsen under nevnte forutbestemte reaksjon og er valgt fra gruppen bestående av benzoquinon, ferricyanid, ferricinium, kobolt-(III)-orthofenantrolin og kobolt-(III)-dipyridyl.

5 . Prøvecelle (20, 120, 400 ) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4,karakterisert vedat bufferen er valgt fra fosfat, TEIS, MOPS, MES, HEPES, tricin, bicin, ACES, CAPS og TAPS.

6. Prøvecelle (20, 120, 400 ) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5,karakterisert vedat reagenslaget også innbefatter et enzym.

7. Prøvecelle (20, 120, 400 ) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat den første elektroden (26, 126, 226, 426) består av et ikke-ledende substrat belagt med et metall.

8. Prøvecelle (20, 120, 400 ) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7,karakterisert vedat den andre elektroden (24, 124, 224, 424 ) består av et ikke-ledende substrat belagt med et metall.

9. Prøvecelle (20, 120, 400) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8,karakterisert vedat den andre elektroden (24, 224, 424) er en pseudoreferanse-elektrode og at de første (26, 126, 226, 426) og andre (24, 124, 224, 424) elektrodene er av samme edelmetall.

10. Prøvecelle (20) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat det første ikke-ledende lagelementet (22, 222) som har en åpning (21, 221) derigjennom, befinner seg på nevnte første elektrode (26, 226), og nevnte første elektrode (26, 226) befinner seg på nevnte andre elektrode (24, 224) og at nevnte andre elektrode (24, 224) befinner seg på et annet ikke-ledende lagelement (23, 223).

11. Prøvecelle (120) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat et første ikke-ledende lagelement (122, 222) innbefatter flere innhakk (131, 132, 232) deri, som ekesponerer og definerer et elektrisk kontaktområde på nevnte første elektrode (126, 226) og at nevnte første elektrode (126, 226) har et innhakk (133, 134) deri for å eksponere og definere et elektrisk kontaktområde på nevnte andre elektrode (124, 224).

12. Prøvecelle ifølge krav 10,karakterisert ved at den første elektroden (226) er foldet, idet tilsvarende åpninger i hver fold danner en brønn beregnet for innhold av nevnte væskeprøve, nevnte første elektrode (226) er anbragt i forhold til nevnte første ikke-ledende lag (222)-element slik at åpningen i nevnte første ikke-ledende lag (222) befinner seg ved siden av nevnte åpninger i den første elektroden (226).

13. Prøvecelle (400) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat nevnte første (426) og andre elektroder (424) er anordnet på koplanar måte på et enkelt substrat.

14. Prøvecelle (120) ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9,karakterisert vedat den andre elektroden (124) har en sirkulær åpning deri, og at nevnte åpning (121) i nevnte lagelement (122) er konsentrisk med nevnte åpning i den andre elektroden (124) og nevnte åpning i den andre elektroden (124) har mindre diameter enn åpningen (121) i lagelementet (122), hvorved det defineres et sirkulært funksjonelt elektrodeområde på den andre elektroden (124), og at nevnte første elektrode (126) befinner seg under den andre elektroden (124) slik at nevnte åpning i den andre elektroden (124) eksponerer og definerer et funksjonelt elektrodeområdet på nevnte første elektrode (126).

15 . Apparat for måling av forbindelser i en vandig væskeprøve,karakterisert vedat det omfatter: a. et hus (11, 12) som har en adgangsåpning (19) derigj ennom, b. en prøvecelle (20, 120, 400) som kan mottas i nevnte adgangsåpning (19) i huset (11, 12), hvor prøvecellen (20, 120, 400) er definert ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, c. anordning for dannelse av en elektrisk krets mellom nevnte første elektrode (26, 126, 226, 426) og nevnte andre elektrode (24, 124, 224, 424) gjennom den vandige prøvevæs-ken og d. anordning for visuell fremvisning av en måling av nevnte vandige prøvevæske oppnådd ved hjelp av apparatet.

16. Apparat ifølge krav 15,karakterisert vedat nevnte anordning i cellen for måling av Cottrell-strøm gjennom den vandige prøvevæsken inkluderer en mikroprosessor .

17. Apparat ifølge krav 16,karakterisert vedat det også omfatter anordning for initiering av et elektrisk potensiale ved innføring av den vandige prøvevæsken for å detektere tilstedeværelsen av nevnte vandige prøvevæske, idet nevnte initieringsanordning også har anordning for signa-lering til nevnte mikroprosessor for å begynne en reaksjons-timing-sekvens når tilstedeværelsen av den vandige prøvevæs-ken detekteres og anordning for fjerning av nevnte potensiale under nevnte reaksjons-timing-sekvens.

18. Fremgangsmåte for målig av mengden av en valgt forbindelse i kroppsvæsker,karakterisert veda) tilveiebringelse av en målecelle (20, 120, 400 ) som har en første (26, 126, 226, 426) og en andre elektrode (24, 124, 224, 424) og nevnte celle (20, 120, 400) inneholdende et oksydasjonsmiddel og en buffer, b) anbringelse av en væskeprøve som skal testes i nevnte celle (20, 120, 400), c) rekonstituering av nevnte oksydasjonsmiddel og buffer med nevnte væskeprøve for å utvikle en forutbestemt katalysert reaksjon, d) reaksjonen får forløpe til vesenetlig fullendelse, e) påsetting av et potensiale over nevnte elektroder (26, 126, 226, 426, 24, 124, 224, 424) og prøve, og f) måling av den resulterende Cottrell-strøm for å bestemme konsentrasjonen av nevnte valgte forbindelse som er tilstede i prøven.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisert vedat den valgte forbindelse velges fra glukose, kolesterol, TSH, T4, hormoner, antiarrytmiske-, antiepilep-tiske- og ikke-terapeutiske legemidler.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18 eller 19,karakterisert vedat oksydasjonsmidlet er et materiale valgt fra benzoquinon, ferricyanid, ferricinium, kobolt-(III)-orthofenantrolin og kobolt-(III)-dipyridyl.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18-20,karakterisertved at den innbefatter tilveiebringelse som nevnte første elektrode (26, 126, 226, 426) av en arbeidselektrode (26, 126, 226, 426) og som nevnte andre elektrode (24, 124, 224, 424) av en elektrode som virker som en referanse-elektrode eller en pseudoreferanse-elektrode (24, 124, 224, 424).

22. Fremgangsmåte ifølge krav 18-21,karakterisertved at den også innbefatter tilveiebringelse i nevnte celle (20, 120, 400) av et enzym som en katalysator for nevnte katalyserte reaksjon.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 18-22,karakterisertved at den innbefatter valg av nevnte buffer fra fosfat, TRIS, MOPS, MES, HEPES, tricin, bicin, ACES, CAPS og TAPS.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisertved at - den valgte forbindelsen er glukose og kroppsvæsken er blod, - målecellen (20, 120, 400) i trinn (a) innbefatter ytterligere et enzym for katalyse av den katalyserte reaksjonen, - rekonstitueringstrinnet (c) rekonstituerer nevnte oksydasjonsmiddel, nevnte buffer og nevnte enzym med nevnte blodprøve for frembringelse av den forutbestemte reaksjonen og - potensialet over nevnte elektroder (26, 126, 226, 426, 24, 124, 224, 424) i trinn (e) påsettes etter vesentlig fullfør-ing av reaksjonen.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat oksydasjonsmidlet er egnet, i nærvær av nevnte enzym, for å oksydere den valgte forbindelsen under den forutbestemte reaksjonen og velges fra benzoquionon, ferricyanid, ferricinium, kobolt-(III)-orthofenantrolin og kobolt-(III)-dipyridyl.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24 eller 25,karakterisert vedat den innbefatter tilveiebringelse som nevnte første elektrode (26, 126, 226, 426) av en arbeidselektrode (26, 126, 226, 426) og som nevnte andre elektrode (24, 124, 224, 424) av en elektrode som virker som en referanse-elektrode eller en pseudoreferanse-elektrode (24, 124, 224, 424).

27. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 24-26,karakterisert vedat den innbefatter tilsetning som nevnte enzym av glukoseoksydase.

28. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 24-27,karakterisert vedat den i trinn b) nevnte anbringelse av blodprøven som skal testes i cellen (20, 120,

400) utvikler en strøm og initierer et inkubasjonstrinn, og at reaksjonen i trinn d) får forløpe med en åpen krets mellom nevnte første (26, 126, 226, 426 ) og andre elektrode (24, 124, 224, 424).