NO300069B1

NO300069B1 - Hybrid DNA-sekvens kodende for fibronektinbindende protein, vektorer og mikroorganismer inneholdende denne samt fremgangsmåte ved fremstilling derav

Info

Publication number: NO300069B1
Application number: NO902082A
Authority: NO
Inventors: Magnus Hoeoek; Klas Joensson; Kjell Martin Lindberg; Lars Christer Signaes
Original assignee: Alfa Laval Agri Int
Priority date: 1989-05-11
Filing date: 1990-05-10
Publication date: 1997-04-01
Also published as: IE72968B1; JP3077993B2; NZ233614A; FI102768B1; ES2077666T3; US5652217A; DE69021263T2; CA2016521A1; DE69021263D1; AU630950B2; DK0397633T3; GR3017946T3; CA2016521C; ATE125867T1; FI102768B; EP0397633B1; NO902082D0; EP0397633A2; JPH03272687A; IE901696L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av et fibronektinbindende protein såvel som hybrid-DNA-molekyler, f.eks. plasmider eller fager omfat-

tende en nukleotidsekvens som koder for nevnte protein.

Videre angår oppfinnelsen mikroorganismer som omfatter

nevnte molekyler samt deres bruk ved fremstilling av nevnte protein.

Målet for foreliggende oppfinnelse er å erholde et fibronektinbindende protein.

Et ytterligere mål er å erholde nevnte protein ved hjelp av

en genetisk manipuleringsteknikk ved å bruke f.eks. et plasmid omfattende en nukleotidsekvens som koder for nevnte protein.

Ytterligere mål vil bli anskueliggjort utfra den følgende beskrivelse.

Bakgrunn for oppfinnelsen

WO-A1-85/05553 beskriver bakterielle celleoverflatepro-

teiner med fibronektin-, fibrinogen-, collagen- og/eller laminin-bindende virkning. Herved er det vist at forskjel-

lige bakte-rier har evne til å binde til fibronektin,

fibrinogen,

collagen og/eller laminin. Det er videre vist at fibronektinbindende protein har en molekylvekt på 165 kD og/eller

87 kD, hvorved det er sannsynlig at det mindre protein er

en del av det større.

Fibronektin er et stort glykoprotein (Mw ca 450 kD) med to subenheter som ligner hverandre, og som kan variere i molekylstørrelse avhengig av et komplisert sammensetnings-mønster av et precursor mRNA (1). Hovedfunksjonen av fibronektin som er funnet i kroppsvæsker, blodaggregater og ekstracellulære matriser, synes å være relatert til prote-inets evne til å overføre substratadhesjon av de fleste eukariote celler (2, 3, 4, 5).

I de senere 70-år fant Kuusela at fibronektin ikke bare samvirker med eukariote celler, men også binder seg til celler av Staphvlococcus aureus (6). Siden denne obser-vasjon har et antall patogene organismer blitt påvist å binde seg til fibronektin med en høy grad av spesifisitet og en høy affinitet, såsom streptokokker (gruppe A, C og G) , koagulase-negative stafylokokker, E. coli og Tre<p>onema <p>allidum. Fibronektin i den ekstracellulare matrise synes å virke som et substrat også for adhesjonen av forskjellige mikroorganismer. Bindingen av fibronektin kan for enkelte mikroorganismer representere et viktig trinn i koloniserin-gen av vertsvev og utvikling av infeksjon.

Flere forskjellige celleoverflatekomponenter har blitt antydet som fibronektinreseptorer på Gram-positive bakterier, innbefattende lipotekinsyre (8, 9) og protein (10). I tidligere studier har et fibronektinbindnede protein med en Mw på 187-210 kD blitt isolert fra S. aureus stamme Newman (11, 12) og forsøksvis identifisert som en fibronek-tinreseptor. Bindingsstedet i fibronektin for eukaryote celler har blitt lokalisert til et tetrapeptid (ArgGlyAspSer) i den sentrale del av begge de to subenheter som danner fibronektinet og som er forskjellige fra det bindende sete hos de fleste bakterier som hittil har blitt studert. Bakteriene synes å binde til fibronektin-suben-hetens amino-terminale 29 kDa-domene.

En eukaryot reseptor har blitt identifisert som et 140 kDa kompleks i cellemembranen, mens det bakterielle fibronektinbindende protein (FNBP) av Staphylococcus aureus stamme Newman (11, 12) har blitt identifisert som et 210 kDa protein. Fra tidligere studier (SE-A-8702272-9) har det blitt rapportert om kloning, ekspresjon og den fullstendige nukleotidsekvens av et gen (heri kalt gen 1) for et FNBP i

Staphy lococcus aureus.

I foreliggende søknad omhandles kloning, ekspresjon og nukleotidsekvensen av et ytterligere gen, gen 2, beliggende nedstrøms for den tidligere studerte og rapporterte fibronektinbindende proteinsekvens. For å karakterisere dette fibronektinbindende protein fra S. aureus ytterligere, har genet for dette protein blitt klonet i E. coli. Det fibronektinbindende domene i dette protein har også blitt lokalisert .

Beskriv else av oppfinnelsen

Det har nå overraskende blitt funnet at det er mulig å erholde et hybrid DNA-molekyl omfattende en nukleotidsekvens som koder for et protein eller et polypeptid med fibronektinbindende egenskaper. Som det fremgår av det nedenforstående, er den følgende nukleotidsevens tilstede i genet som koder for nevnte protein.-

idet denne nukleotidsekvens koder for det følgende protein som starter ved nukleotid nr. 128 i rekken ovenfor, hvorved de forutgående nukleotider er deler av signalsystemet:

I aminosyresekvensen av enkle bokstaver ovenfor har de følgende forkortelser blitt brukt:

A Ala, alanin

R Arg, arginin

N Asn, asparagin

D Asp, asparagussyre

C Cys, cystein

G Gly, glycin

E Glu, glutaminsyre

Q Gin, glutamin

H His, histidin

I Ile, isoleukin

L Leu, leukin

K Lys, lysin

M Met, metionin

F Phe, fenylalanin

P Pro, prolin

S Ser, serin

T Thr, treonin

W Trp, tryptofan

Y Tyr, tyrosin

V Val, valin

Ovenfor slutter nukleotidsekvensen for startsignalet ved nukleotid 235 og sekvensen som starter ved nukleotid nr. 1735 viser nukleotidsekvensen av den bindende region, som tilsvarer den følgende aminosyresekvens: Oppfinnelsen omfatter videre et plasmid eller fag omfattende en nukleotidsekvens som koder for nevnte fibronektinbindende protein, og som er i stand til å uttrykke det gitte genet.

Oppfinnelsen vedrører videre en mikroorganisme som inneholder minst ett hybrid DNA-molekyl i henhold til det ovenstående. Plasmidet pFROOl i en E. coli stamme 259 er blitt deponert ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) og har der fått deponeringsnummer DSM 4124.

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av et fibronektinbindende protein, hvorved minst ett hybrid DNA-molekykl ifølge det ovenstånde overføres til en mikroorganisme, mikroorganismen dyrkes i et vekstmedium og proteinet således dannet isoleres ved hjelp av affinitetskromatografi på en kolonne inneholdende fibronektin bundet til en uløselig bærer, fulgt av ionebytterkromatografi.

Passende bærerproteiner kan også kobles til aminosyresekvensen, såsom IgG-bindende områder av protein A.

Oppfinnelsen vil bli beskrevet i det følgende under henvis-ning til de angitte eksempler, men uten å være begrenset til disse.

Materialer oa metoder

Mikroorganisme- vekstmedium

For dyrkning av E. coli bakterier ble det følgende medium brukt. De angitte mengder gjelder for 1 liter medium.

Assay av fibronektinbindende protein ( FNBP)

Lysater av E. coli-kloner fremstilt i Tris-HCl-buffer, inneholdende lysozym EDTA som tidligere beskrevet (13), ble analysert for fibronektinbindende aktivitet ved å måle deres evne til å konkurrere med stafylokokk-celler for binding av det 12<5>I-merkede 29 kD NH2-teminale fragment av fibronektin. Mengden av FNBP som var i stand til å hemme binding til 50% er ansett å være en aktivitetsenhet. Bovint fibronektin ble fremskaffet av dr. S Johansson ved Depart-ment of Medical and Physiological Chemistry, Uppsala Uni-versitet, Sverige. Overnatt-kulturer av E. coli ble konsentrert 10 ganger, etterfulgt av lysis i 0,01M Tris-HCl, 0,001 EDTA, pH 7,9, 1 mg/ml lysozym. 100 iil lysat ble blandet med 100 y. 1 stafylokokkceller, 100 ptl <125>I bovin fibronektin (20000 cpm/ml) , 200 /xl PBS, og blandingen ble inkubert i 2 timer ved 20°C. Etter to gangers vask i PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05% Tween, ble blandigens radio-aktivitet målt i en gammateller.

Jodinering

125 -1-merking av fibronektin og f ibronektinf ragmenter ble utført ved å bruke kloramin-T-metoden.

Bakterielle stammer og - plasmider

E. coli TG-1 og DH-5alfa ble brukt som bakterielle vertsor-ganismer. Plasmidvektorene var pBR322 og pUC18. Tabell 1 inneholder en liste over plasmidene.

Medier og vekstbetingelser

E. coli kloner ble dyrket i Luria-medium (LB)m tilsatt ampicillin til 50 /xg/ml og omristet ved 37°C. Den optiske tetthet ble målt med et Linson 3,1 fotometer avlest ved 540 nm. S. aureus ble dyrket i Trypticase soyamedium (TSB).

Restriksionsendonukleaser og andre enzymer

Restriksonsenzymer T4 DNA-ligase og Bal31 ble innkjøpt fra Promega (Madison, WI), International Biotechnologies Inc.

(New Haven, CT) og Boehringer Mannheim Biochemicals Scandi-navia AB. Restriksjonskartlegging og fragmentisolering ble utført med LiCl4-ekstrahert plasmid DNA. Kloning i pUC18 ble utført som beskrevet av Maniatis et al. Dannelse av subkloner for sekvensering ble utført ved ExolII-fordøying ved å bruke Erase-a-Base System innkjøpt fra Promega. E. coli-kloner ble verifisert ved restrikssjonsanalyse, sekvensanalyse og blot-hybridisering. DNA-sekvensering ble foretatt ved dideoksynukleotidmetodene til Sanger et al. med sekvenase DNA-sekvenseringssettet kjøpt fra United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, og K/RT universal-sekvenseringssystemet kjøpt fra Promega. Sekvens-eringsprøvene ble analysert med kileformede geler ved å bruke 6% polyakrylamid. Computerprogrammer ble brukt for å nedtegne og analysere sekvensdataene.

Isoleringen av en E. coli-klon inneholdende gen 1 og deler av gen 2 for et FNBP fra S. aureus stamme 8325-4 er beskrevet tidligere. Plasmidet pFR050 ble konstruert fra S. aureus ved å spalte 8325-4 kromosomalt DNA med HindiII og Xbal. Fragmenter, 3-4 kbp i størrelse, ble isolert etter agarose-gel-elektroforese og ligert til pUC18. En klon inneholdende fnbB-sekvenser ble isolert ved kolonihybridisering ved å bruke et syntetisk oligonukleotid lokalisert nedstrøms for Hindlll-setet i fnbB som en prøve. Oligonukleotidet ble syntetisert med Applied Biosystems 380A oligonukleotid syntetisator ved å bruke fosfoamiditt-metoden. Computerprogrammer ble brukt for å nedtegne og analysere sekvensdataene .

Western blotting

Separerte komponenter ble elektroblottet på NC-ark (nitro-celluloseark) (Schleicher and Schnell) i 2 timer, 200 V, ved å bruke miniblot-systemet (LKB) og buffersystemet beskrevet av Towbin. Derpå ble NC-ark mettet med 1% BSA i TBS, pH 7,4, i 30 min, og inkubert med 2,4 /xg/ml bovin fibronektin i TBS, pH 7,4 i 2 timer. Etter vask 3 ganger med PBS-Tween (0,1%), ble NC-arkene inkubert med kanin anti bovin fibronektinserum fortynnet 1:1000, hvilket serum var en gave fra Biochemical Center, University of Uppsala, i 15 timer, fulgt av vask og endelig inkubering med et A perok-sydasekonjugat (fremstilt fra S. aureus A676 protein ved konjugering med pepperot-peroksydase (Boehringer) i et molart forhold på 1:2) i 1,5 time). Etter endelig vasking 3 ganger med PBS Tween og 1 gang med PBS, ble blottet frem-kalt med 4-klor-l-naftol (Sigma).

Kloning av et gen som koder for et andre fibronektinbindende protein

I vårt forutgående arbeide ble det beskrevet kloning, ekspresjon og bestemmelse av sekvensen av et gen som koder for et fibronektinbindende protein (gen 1). I en videre analyse av disse eldre sekvensdata ble det funnet et område beliggende nedstrøms for gen 1 som viste høy homologi ved begynnelsen av gen 1. For å bestemme om dette område ned-strøms for gen 1 oppviser en fibronektinbindende aktivitet ble et 2,8 kb PstI-fragment fra pFROOl inneholdende en sekvens som starter 68 0 bp nedstrøms for stoppkodonet for gen 1, innført i multilinkeren av pUC18. Med kjennskap til transkripsjonsretningen av gen 2 og dets leseramme (fra venstre mot høyre i fig. 1) er det mulig å fusere fragmentet i den korrekte leseramme til Lac-Z-promoteren av pUC18. Dette plasmid kalt pFR03 5 uttrykte fibronektinbindende aktivitet (tabell 1 nedenfor). Således eksisterer to forskjellige gener som koder for FnBP. Imidlertid, når pFR03 5 ble sekvensert, kunne det ikke bli funnet noe stopp-kodon i det innskutte S. aureus-DNA, og ved å sammenligne fnbA (gen 1) var det tydelig at det fullstendige fnbB ikke var tilstede. Ved å foreta Southern blots av kromosomalt DNA spaltet med HindiII alene og sammen med andre enzymer, ble det funnet at fordøying med HindiII sammen med Xbal vil danne et 3,5 kbp-fragment (innbefattende 65 bp allerede tilstede i pFR035), som høyst sannsynlig også ville inneholde den manglende 3'-del av fnbB. Fragmentet ble klonet som beskrevet ovenfor og ble kalt pFR050. Subkloner av plasmidet ble avledet ved fordøying av pFR035 med ExoIII fra den 3' ende i forskjellige tidsperioder med etter-følgende religering av DNA, som beskrevet i Materialer og Metoder, ovenfor.

Sekvensanalvse

En nukleotidsekvens på 1928 bp inneholdende et domene som

koder for et fibronektinbindende protein ble bestemt ved å sekvensere de overlappende subkloner avledet fra pFR035 og pFROOl (fig. 2). En åpen leseramme koder for et polypeptid på 94 0 aminosyrer, og starter med et GTG-kodon ved nukleo-

tid 520 og slutter ved enden av klonen ved nukleotid 3342

(fig. 2). FnbB, såvel som fnbA (gen 1) har to mulige initieringssignaler for transkripsjon og et potensielt ribosombindende sete (markert i fig. 2). Startkodonet er fulgt av en mulig signalsekvens som viser 95% homologi til den kodet for av fnbA (fig. 2 og 4). Ved sammenligning med FnBPA ligger signalsekvensens spaltningssete mellom andre

og tredje i rekken av tre alaninresiduer. Dette tilsvarer spaltningssetet for det native protein isolert fra S. aureus stamme Newman. Nedstrøms for signalsekvensen er det et område på ca 66 aminosyrer med en 75% homologi med samme strekning i fnbA. De følgende 444 aminosyrer har kun 40%

homologi overfor FnBPA og har flere delesjoner/innsetnin-

ger, slik at B-gjentagelsene funnet i FnBPA ikke observeres i FnBPB (fig. 2 og 4). Imidlertid er resten av peptidet

(394aa) nesten identisk med FnBPA, idet hovedforskjellen er delesjonen av 14 aminosyrer i FnBPB. Dette sterkt homologe område inneholder de samme gjentagelser- (D1-D4 og Wrl-5)

som er funnet i FnBPA, med unntak av at Wrl mangler. Wc-

regionen og det hydrofobe område M-domene såvel som den i hovedsak basisk C-terminale ende er konservert i FnBPB.

Ekspresjon av fibronektinbindende protein og identifisering av den bindende aktivitet

E. coli-klonene pFR035 og pFR03 6 og subklonene avledet ved å sløyfe gen 2-fragmentet av pFR035 ble lysert og undersøkt for fibronektinbindende proteinaktivitet i inhiberings-assayet. Lysater av begge kloner hemmer <125>I-merket fibronektin i å binde seg til S. aureus, mens subklonen pFR035e31 deletert fra den 3'terminal av gen-2-fragmentet, har mistet aktiviteten (fig. 3). Den fibronektinbindende proteinaktivitet er således lokalisert til aminosyrene nedstrøms for aminosyre nr. 53 5 (fig. 1). Ingen av disse kloner innbefatter D-gjentagelsene som har vist seg å være det eneste Fn-bindende domene i FnBPA. Dette vil innebære at FnBPB inneholder to forskjellige Fn-bindende domener, en region oppstrøms for aminosyre 60 0 og D-regionen.

Assay av FnBp. E. coli-kloner inneholdende forskjellige deler av fnbB ble analysert for Fn-bindende aktivitet ved å måle deres evne til å konkurrere med stafylokokke celler for binding av 125I-merkede intakte bovine Fn eller det 29 kDa N-terminale fragment. Overnatts-kulturer av E. coli ble konsentrert 10 ganger og lysert i 10 mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 7,9, 1 mg/ml lysozom. 100 1 supernatant av sentrifugert lysat ble blandet med 100 itl stafylokokke celler (5xl08) , 100 iil <125>I-bovin Fn (20.000 cpm, 190 MBq/mg) , 200 /il PBS og inkubert 2 timer ved 2 0°C. Etter vask av blandingen to ganger i PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05 Tween<L 20, ble radioaktiviteten bundet til de bakterielle celler målt i en gammateller.

Jodinering, <125>I-merking av Fn og Fn-fragmenter ble foretatt i henhold til kloramin-T-metoden.

Molekvlvektsbestemmelse

Western blotting av lysat fra pFR035 viser et bånd tilsvarende en molekylvekt på 100 kDa og flere bånd med lavere molekylvekt, som høyst sannsynlig er nedbrytningsprodukter av 100 kDa-produktet, siden et skift til lavere molekylvek-ter observeres ved lagring av materialet. Forskjellen som observeres ved behandlingen beror på det faktum at i pFR035 er FnBPB fusert til beta-Gal-proteinet, men i pFR03 6 bruker det sine egne initieringssignaler, slik at proteinene er noe forskjellige.

De presenterte data viser at S. aureus har to forskjellige gener som koder for FnBP. Startkodonet av fnbB ligger 682 bp nedstrøms for stoppkodonet av fnbA. Denne sekvens mellom fnbA og fnbB inneholder et mulig transkripsjonstermine-ringssignal, beliggende bare et par bp nedstrøms for nevnte stoppkodon, såvel som transkripsjonsinitieringssignaler, beliggende innen de 9 0 bp som ligger foran startkodonet i fnbB. Dette innebærer at genene translateres fra forskjellige messenger-RNa. Området mellom disse transkripsjonene signaler inneholder ikke noen åpne leserammer etter et ribo-somalt bindingssete på noen av kjedene. 350 bp-regionen oppstrøms for promotersekvensen av fnbB viser sterk homologi med det tilsvarende område av fnbA. I fnbA har bindingsaktiviteten blitt lokalisert til D-repetisjons-domenet (mellom aa 745 og 872) nær den cellevegg-assosierte del av molekylet, og en subklon hvor aminosyrene 746-1018 var utelukket, var Fn-bindingsnegativ. Når de to gener samenlignes, er det tydelig at det ikke er noe gjentagende område tilstede i pFR035 og pFR036. Likevel uttrykker begge Fn-bindende aktivitet, noe som indikerer at en ikke-homolog nukleotidsekvens er tilstede som koder for Fn-bindende aktivitet.

Ekspresjonen av det fibronektinbindende protein fra gen 2 i E. coli var lavere enn ekspresjonen av gen 1.

Det foreliggende fibronektinbindende protein kan brukes for " immunisering, hvorved proteinet fortrinnsvis i kombinasjon med et fusjonsprotein, for å danne et stort antigen til å reagere mot, injiseres i doser som forårsaker immunologisk reaksjon i vertsdyret. Således kan det fibronektinbindende protein brukes i vaksinering av drøvtyggere mot mastitis forårsaket av stafylokokk-infeksjoner.

Videre kan det fibronektinbindende protein bli brukt til å blokkere en infeksjon i et åpent hudsår ved sårbehandling under bruk av det fibronektinbindende protein i en suspen-sjon. Således kan det fibronektinbindende protein bli brukt for behandling av sår, f.eks. for å blokkere proteinresep-torer eller for immunisering (vaksinering). I sistnevnte tilfelle danner vertskroppen spesifikke antistoffer som kan beskytte mot invasjon av bakterielle stammer omfattende et slikt fibronektinbindende protein. Herved blokkerer anti-stoffene tilknytningen av de bakterielle stammer til skadet vev.

Eksempler på kolonisering av en vevskade er

a) kolonisering av sår i hud og bindevev, hvilke sår er forårsaket av mekanisk trauma, kjemisk skade og/eller

termisk skade; b) kolonisering av sår på mukøse membraner, såsom i munnhu-len eller i melkekjertlene, urinveiene eller vagina; c) kolonisering på bindevevsproteiner som har blitt ekspo-nert ved en minimal vevskade (mikrolesjon) i forbindelse

med epitel og endotel (mastitis, hjerteklappinfeksjon, hoftebyttings-kirurgi).

Når foreliggende FNBP eller polypeptidet blir brukt for det formål å immunisere (vaksinere) pattedyr innbefattende mennesket, er proteinet eller polypeptidet dispergert i steril isoton fysiologisk saltvannoppløsning, eventuelt under tilsetning av et farmasøytisk akseptabelt disperge-ringsmiddel. Forskjellige typer hjelpestoff kan videre brukes for å opprettholde frigivelsen i vevet og således eksponere proteinet eller peptidet over lengre tid til immunforsvarssystemet i kroppen.

En egnet dose for å oppnå immunisering, er 0,5-5 /xg FNBP - eller polypeptid pr. kilo kroppsvekt og injeksjon av immunisering. For å oppnå en varig immunisering bør vaksiner-ingen utføres mer enn én påfølgende gang med et intervall på en til tre uker, fortrinnsvis tre ganger.

Når foreliggende FNBP eller polypeptid blir brukt for topisk, lokal administrering, dispergeres proteinet i en isoton fysiologisk saltvannoppløsning til en konsentrasjon på 25-250 /xg pr. ml. Sårene blir så behandlet med en slik mengde som er nødvendig kun for å erholde en fullstendig fuktig av såroverflaten. For et gjennomsnittlig sår blir således kun et par ml oppløsning brukt på denne måte. Etter behandling med proteinoppløsningen blir sårene passende vasket med isotont saltvann eller en annen egnet sårbe-handlingsoppløsning.

Videre kan det fibronektinbindende protein såvel som det minimale fibronektinbindende setepolypeptid i foreliggende oppfinnelse bli brukt for å diagnostisere bakterielle infeksjoner forårsaket av stafylokokke stammer, hvorved et fibronektinbindende protein ifølge foreliggende oppfinnelse immobiliseres på et fast bæremiddel, såsom små latex- eller Sepharose<®->kuler, hvorved sera inneholdende antistoff til-lates å passere og reagere med FNBP således immobilisert. Agglutineringen måles så ved kjente metoder.

Videre kan FNBP eller polypeptidet bli brukt i en ELISA-test (Enzyme linked immuno sorbent assay); E. Engvall, Med. Biol. 55, 193 (1977)). Herved blir brønner i en polystyren mikrotiterplate belagt med FNBP og inkubert over natten ved 4°C. Platene blir så vasket grundig ved å bruke PBS inneholdende 0,05% Tween 20, og tørket. Seriell fortynning av pasientserum blir foretatt i PBS-Tween, tilsatt brønnene, og inkubert ved 30°C i 1,5 time. Etter rensing av henholds-vis antihuman IgG konjugert med et enzym eller et antibovin IgG konjugert med et enzym, blir pepperrot-peroksydase eller alkalisk fosfatase tilsatt brønnene og inkubert ved 30°C i 1,5 time, hvoretter, når IgG er blitt bundet til dette og etter rensing, et enzymsubstrat tilsettes, hen-holdsvis et p-nitrosulfat i tilfelle med alkalisk fosfatase, eller ortofenylendiaminsubstrat (OPD) i tilfelle peroksydase har blitt brukt. Platene med brønnene blir så renset ved å bruke en sitratbuffer inneholdende 0,055% OPD og 0,005% H202, og inkuberes ved 3 0°C i 10 min. Enzymreak-sjonen ble stoppet ved å tilsette en 4N oppløsning av H2S04 til hver brønn. Farge- utviklingen ble målt ved å bruke et spektrofotometer.

Avhengig av typen enzymsubstrat som er brukt, kan en fluorescensmåling også bli brukt.

En annen metode for å diagnostisere stafylokokke infeksjoner er å bruke DNA genprøve-metoden basert på FNBP-sekvensen eller polypepetidsekvensen. Derved festes de naturlige eller syntetiske DNA-sekvenser til et fast bæremiddel, såsom en polystyrenplate, som nevnt ovenfor, ved f.eks. å tilsette en melk til overflaten i tilfelle med diagnostise-ring av mastitis. DNA-genproben, eventuelt merket enzyma-tisk eller med et radioaktivt isotop, blir så tilsatt den faste plate-overflate omfattende DNA-sekvensen, hvorved DNA-genproben fester seg til sekvensen hvor den opptrer. Enzymet eller den radioaktive isotop kan så lett bli bestemt ved kjente metoder.

Ovenfor innbefatter uttrykket fibronektinbindende protein også polypeptidsekvensen, hvilken polypeptidsekvens danner det fullstendige proteins fibronektinbindende sete.

Claims

1. Hybrid-DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter den følgende nukleotidsekvens:

2. Plasmid eller fag, karakterisert ved at den omfatter en eller flere nukleotidsekvenser ifølge krav 1, og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

3. Plasmid ifølge krav 2, karakterisert ved at det er pFROOl inneholdt i E. coli stamme 259 med deponeringsnummer DSM 4124.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av et fibronektinbindende protein eller polypeptid, karakterisert ved at a) minst ett hybrid-DNA-molekyl ifølge krav 1 settes inn i en mikroorganisme, b) mikroorganismen dyrkes i et vekst-fremmende medium og c) det således dannede protein isoleres ved hjelp av affinitetskromatografi på en kolonne med fibronektin bundet til et uløselig bæremiddel, fulgt av ionebytterkromatografi.

5. Mikroorganisme, karakterisert ved at den inneholder minst et plasmid eller fag ifølge krav 2.

6. Mikroorganisme, karakterisert ve'd at den er transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, og er i stand til å uttrykke det gitte genet.

7. Mikroorganisme ifølge krav 6, karakterisert ved at den er en E. coli-stamme transformert med et rekombinant DNA-molekyl ifølge krav 1, og er i standtil å uttrykke det gitte genet, eksempelvis E. coli stamme 259 meddeponeringsnummer DSM 4124.