SE454403B - Anvendning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framstellning av sarbehandlingsmedel - Google Patents

Description

1D 15 20 25 30 35 454 403 2 Hos människa förorsakar sådana bakteriestammar bl.a. hjärt- klaffsinfektioner, men även andra infektioner såsom den all- mänt kända "sjukhussjukan", dvs. oftast en infektion av öppet sår, som svårligen läker, kan utsöndra stora mängder var och som kan kräva reoperation. Särskilt drabbar hjärtklaffsinfek- tioner redan utsatta riskgrupper inom sjukvården.

Med sår avses en vävnadsskada där det normalt täckande epitel- cellagret och andra ytstrukturer skadats genom mekanisk, ke- misk eller annan påverkan. Begreppet sår kan härvid uppdelas i två huvudtyper: ytliga sår och djupa sår. Med ytliga sår avses trauma på kroppens yta eller en yta i direkt anslutning till kroppens hålrum, dvs. mag/tarmkanalen, munhålan, urin- vägarna, mjölkgångar, etc. Med djupa sår avses trauma i krop- pens inre förorsakat av kraftigt yttre våld eller genom kiru- giska ingrepp i olika organ.

Då ett sår uppstår exponeras i sårvävnaden fibronektin, fib- rinogen, kollagen och/eller laminin. Dessa proteiner bildar tillsammans med s.k. proteoglykaner en nätverksstruktur i oli- ka stödjevävnader och är den struktur på vilken bindvävsceller (fibroblaster) och epitelceller växer ut vid en naturlig sår- läkning.

Den naturliga sårläkningen kan emellertid förhindras genom kolonisering av patogena bakterier, främst pyogena kocker och i andra hand andra patogener, såsom §¿ coli och andra gramne- gativa, stavformiga bakterier.

Exempel på sådan kolonisering av en våvnadsskada är: i) kolonisering av sår i hud och bindväv, vilka sår fram- kallats genom mekaniskt våld, kemisk skada och/eller ter- misk skada; ii) kolonisering av sår på slemhinnor, såsom i munhåla eller i bröstkörtlar, urinvägar eller vagina; iii) kolonisering på bindvävsproteiner, vilka exponerats genom 10 15 20 25 30 35 454 403 ; 3 minimal vâvnadsskada (mikrolesion) i anslutning till epi- tel och endotel (mastiter, hjärtklaffsinfektion).

| Beskrivning av föreliggande uppfinning.

Det har nu överraskande visat sig möjligt att framställa sår- behandlingsmedel i enlighet med föreliggande uppfinning, vil- ken karaktäriseras av, att cellyteproteinet erhållits genom odling av fibronektin, fibrinogen, kollagen och/eller laminin- bindande bakteriestam på ett fast eller flytande medium, iso- lering av den så erhållna bakteriestammen, tvättning av isole- rad bakteriestam med en saltlösning, sönderdelning av den tvättade bakteriestammen; rening av fibronektin-, fibrinogen~, kollagen-, och/eller lamininbindande komponent genom affini- tetskromatografi på immobiliserat fibronektin, fibrinogen, kollagen respektive laminin bundet till en kromatografigel och eluering av det fibronektin~, fibrinogen-, kollagen- och- /eller lamininbindande cellyteproteinet.

Sådana cellyteproteiner kan därvid användas för behandling av sår, exempelvis för blockering av proteinreceptorer eller för immunisering (vaccination). Kroppen bildar i det senare fallet specifika antikroppar, som kan skydda mot invasion av bakteriestammar innehållande sådant cellyteprotein. Antikrop- parna blockerar härvid bakteriestammarnas vidhäftning till skadad vävnad.

Uppfinningens ytterligare karaktäristika framgår av hithörande patentkrav.

Genom föreliggande uppfinning uppnås att patogena bakterie- stammar effektivt kan förhindras att kolonisera traumatisk sårvävnad.

Vid användning av föreliggande cellyteprotein i immuniserings- syfte (vaccinering) i däggdjur, inkl. människa, dispergeras proteinet i en steril isoton koksaltlösning, eventuellt under tillsats av ett farmaceutiskt acceptabelt dispergeringsmedel. 10 -15 20 25 30 35 454 403 4 á Lâmplig dosering för immunisering är 0,5-4 /ug cellyteprotein I per kg kroppsvikt och immuniseringsinjektion. För âstadkomman- E de av en varaktig immunisering bör vaccinering ske i tre kon- I sekutiva tillfällen med 1-3 veckors mellanrum. I övrigt förfa- res i enlighet med vetenskap och beprövad praxis för immunise- ring.

Vid användning av föreliggande cellyteprotein för topisk, lo- kal application, dispergeras proteinet i isoton koksaltlösning 5 till en koncentration av 25-200 /ug/ml. Sâren behandlas däref- ter endast med sâ stor mängd som behövs för att fullständigt våta sârytan. Till ett normalsâr åtgår pâ så sätt nâgra milli- liter lösning. Efter behandling med proteinlösning tvättas såren lämpligen med isoton koksaltlösning eller annan lämplig sârbehandlingslösning.

Nedan visas immunisering av unga kor mot mastit. Topisk an- vändning av cellyteprotein kan också utnyttjas för att för- hindra mastiter, genom att juver/spenar behandlas med en lös- ning innehâllande cellyteprotein, vilka blockerar patogena mastitskapande organismer att fästa.

Helt i enlighet med uppfinningen kan ocksâ användning ske med en blandning av cellyteproteiner med olika bindande egenska- per, speciellt om en infekterande bakteriestams bindningsegen- skaper är okända, och det föreligger ett stort behov av att snabbt hindra en massiv bakteriell infektionsepidemi; eller infektionen är förorsakad av en blandning av bakterier.

Uppfinningen kommer nedan att närmare âskâdliggöras med hän- visning till nâgra utföringsexempel.

Exempel.

En stam av Staphylococcus aureus, som binder till fibronektin, odlades pâ ett flytande medium (TS-buljong), tryptikas-soya- -extrakt (OXOID Ltd., England).

Efter avslutad tillväxt isolerades bakterierna genom centrifu- '10 15 20 25 30 35 454 403 S gering och tvättades med en saltlösning (0,97.' NaCl i vatten).

Bakterierna sönderdelades därefter medelst ett bakteriolytiskt enzym (LYSOSTAPHINR, Sigma, 5 mg/liter cellkultur). De fibro- nektinbindande komponenterna isolerades därefter genom affini- tetskromatografi på immobiliserat fibronektin bundet till en dextrangel nektinbindande komponenterna eluerades därefter genom att tillföra chaotropa joner (exempelvis NaSCN, KSCN) i vattenlös- ning. Eluering kan ocksâ ske med en sur Lösning, ättikssyra- Lösning, med pH<3.

Fibronektinbindande komponenter bestående av proteiner med molekylvikterna inom intervallet 11.000 - 165.000, företrädes- vis 40.000 - 165.000, isolerades. Proteinerna kan innehålla en kolhydratdel, varvid det dock är proteindelen som är fibro- nektinbindande, vilket visas genom att effekten helt försvin- ner efter behandling med proteas eller uppvärmning till so-1oo°c. 454 403 6 Erhâllna proteinkomponenters aminosyrasammansättning framgår av tabell nedan: Tabelt Aminosyra rester per 1000 aminosyror MH=165kD Mw= 87kD Asparginsyra 146 134 Threonin 107 103 Serin 65 78 Glutamin 171 151 Prolin 62 58 Gtycin 79 84 Atanin 46 47 *Mcysfein 2,3 n.d.

Valin 78 86 a)Methionin 5.8 n.d.

Isöteucin 47 38 Leucin 40 46 Tyrosin 23 41 FenyLaLanin 20 36 b)Tryptofan 24 31 Histidin 32 30 Lysin 63 66 Arginin 12 -- a)Aminosyror bestämda efter permyrsyraoxidation av prov. b)Aminosyra beräknad från absorbans vid 280 nm och tyrosinin- nehâtl. n.d. = inte bestämd.

I exemplet ovan har affinitetskromatografi använts för rening~ /isotering av proteinet. Andra biokemiska separationsmetoder är jonbytarkromatografi jämte moLekyLsiktning; eLektrofores inkt. isotakofores; eLektrofokusering. 10 15 20 25 30 35 454 403 7 Konventionell odling av §¿ aureus ger ett cellyteprotein en- ligt ovan. För en effektiv industriell produktion av receptor för vaccin och annan vård torde det dock krävas kloning av genen i lämplig organism för att erhålla höga utbyten.

Renframställt fibronektinbindande cellyteprotein har visat sig vara immunogent vid immunisering av kanin och nötkreatur och har därvid framkallat antikroppsbildning.

Försök 1 Vaccination av SRB-kvigor (1:a kalvs-kor) med fibronektinbin- dande protein enligt exemplet ovan.

Tre SRB-kvigor (Svensk Rödbrokig Boskap) vaccinerades subku- tant i thorakalregionen med 400 /ug fibronektinbindande kompo- nent (MW 165.000 och 87.000). Dessa injektioner upprepades tvâ gånger med 14 dagars intervall. Antikroppsbestämningar i serum och i mjölk medelst ELISA-metodik (Enzyme Linked Immu- no Sorbent Assay) visade ett mycket kraftigt immunsvar påvis- bart i höga spädningar av mjölk och serum redan vid tidpunkten för andra immuniseringen.

Tvâ veckor efter den andra injektionen, dvs. vid tidpunkten för den tredje immuniseringsinjektionen bedömdes immunsvaret vara tillräckligt stimulerat för att genomföra en experimen- tell juverinfektion (mastit) hos de tre djuren. Dessa tre djur liksom tvâ kontrolldjur ur samma besättning utsattes för en experimentell juverinfektion med en starkt juverpatogen stam isolerad frân akut bovin mastit (§¿ aureus) i avsikt att fram- kalla mastit hos de fem djuren. Försöket utfördes genom att 500 bakterier från en bakteriekultur odlade i ett buljongme- ovan) tvättades, uppslammades i en ste- dium (TS-buljong; jfr. ril isotonisk koksaltlösning och därefter sprutades upp i spen-och juvercistern medelst standardiserad injektionsteknik. 10 15 20 25 30 35 454 403 Följande resultat erhölls: i) mycket sparsam växt endast i vissa mjölkprover från vac- cinerade djur; mycket höga bakterietal i flertalet mjölkprover från icke-vaccinerade djur; iii) cellhaltbestämningar visade generellt låga celltal hos de vaccinerade djuren; iv) cellhaltsbestämningar visade generellt höga celltal hos de icke-vaccinerade djuren; v) de vaccinerade djuren visade oförändrade mjölkningsvoly- mer; vi) de icke-vaccinerade djuren visade markant minskade mjölkningsvolymer (>10%); vii) bestämning av akutiasreaktanter typ "C reactive pro- tein", samt albumin hos de vaccinerade djuren visade ingen förändring av värdena mot situationen före inoku- lering; viii) bestämning av akutfasreaktanter typ "C reactive pro- tein", samt albumin hos de icke-vaccinerade djuren visa- de kraftigt förhöjda värden.

Det erhållna resultatet visar att antikroppar mot fibronektin- bindande protein utsöndras i juver och finns i tillräcklig mängd i Lokala sârlesioner för att steriskt förhindra att in- fekterande bakteriestams ytreceptorer binder till exponerat fibronektin i juvervävnaden.

Försök 2 Blockering av infektion i öppet sâr genom särbehandling med fibronektinbindande cellyteprotein från §¿ aureus. 10 15 20 25 30 35 454 403 9 Standardiserade sârskador (2x2 cm) framkallades på ryggen hos grisar (20-25 kg) med s.k. dermatom. Dessa sår i tvâ rader om 8 sår pâ vardera sidan om ryggraden utsattes för en termisk skada, (250°C, 3 min). Efter termisk behandling täcktes såren med steril kompress under 1,5 tim, varefter såren infekterades med §¿ aureus, stam SA 113(83A). Sâren pâ ena sidan av rygg- raden behandlades före bakteriekontaminering med fibronektin- bindande cellyteprotein enligt exemplet ovan, löst i steril isotonisk koksaltlösning (100 /ug/ml NaCl-lösning). I pâ detta sätt förbehandlade sår förhindrades utveckling av infektion genom att samtidigt tvätta såren 2 ggr om dagen med steril isotonisk koksaltlösning. Icke-behandlade sår uppvisade i lesionerna inom 2-4 dagar svåra infektioner trots tvättning låkte 2 ggr per 24 tim med NaCl-lösning, infektioner som ej obehandlade med antibiotika under en veckas observationstid.

Resultatet av detta försök visar att genom att förbehandla lesioner med 100 /ug/ml i NaCl blockeras ytexponerat fibro- nektin pâ sådant sätt att infektioner förhindras. Applicerade bakterier kan lätt avlägsnas genom spolning, vilket är omöj- ligt i icke cellyteproteinbehandlade sår.

Förutom fibronektin har andra bindvävsbindande proteiner de- tekterats hos olika mikroorganismer, som binder till de bind- vävsstrukturer, som finns hos människa och djur, nämligen kol- lagen och Laminin enligt nedan givna uppställning: Fibronektin Kollagen Laminin Stafylokocker + + -1) (olika arter) Streptokocker + + + (grupp A, C, G, H, ev. B) Escherichia Egil + -1) + 1) ännu ej testat + anger förekomst 10 15 20 25 30 35 454 403 10 Försök 3 Bindning av stafylokocker till immobiliserat fibronektin - en modell att simulera bindning till traumatisk sârvävnad (ki- _rurgiska sår och mastit).

En plastyta behandlades med olika serum proteiner, såsom albu- min och fibronektin. Plastytan inkuberades därefter med res- pektive protein uppslammat i en natriumfosfatbuffrad koksalt- lösning (0,2 M natriumfosfat, pH 7,4, och 0,145 M NaCl) under 2 tim vid rumstemperatur. Plastytan torkades sedan genom pâ- blâsning av luft medelst fläkt. Därefter utsattes behandlad yta för stafylokocker (stam SA 113(83A)) i buffert respektive slammade i närvaro av bovin mjölk. Redan efter ett par minuter konstaterades upptag av bakterier i bâda dessa testsystem me- dan däremot yta behandlad pâ samma sätt med albumin i samma och tio ggr högre koncentrationer av proteinlösningar ej visar ett aktivt bakterieupptag (obehandlad yta är däremot hydrofob och binder stafylokocker ospecifikt). Bindning av stam SA 113(83A) kan hämmas genom att bakterien först inkuberas med antisera erhållna från kanin vaccinerade med renat receptor- protein.

Försök 4 Pâ liknande sätt har en yta behandlats med laminin och däref- ter som ovan tillförts bakterier, i detta fall en grupp A streptokockstam. Det har då visats att streptokockstammen bin- der.

Försök S En plastyta behandlades med fibronektin (immobiliserat) i en- lighet med Försök 3 ovan. Därefter behandlades ytan med cell- yteprotein (MH 85.000) enligt Exempel 1 ovan löst i fysiolo- gisk koksaltlösning, 100 /ug/ml. Därefter behandlades ytan med stafylokocker (stam SA 113(83A)) uppslammade i en buffert (fosfatbuffert, 0,2 M Na-fosfat, pH 7,4, och 0,145 M NaCl).

Efter behandlingen med stafylokocker sköljdes plastytan av med fysiologisk koksaltlösning för eliminering av löst bundna bakterier. Vid efterföljande analys konstaterades att någon m 10 15 20 25 30 35 454 403 11 aktiv bindning av stafylokocker ej skett. Analys företogs ge- nom bestämning av bakteriecell massa ATP (adenosintrifosfat) medeLst bioluminiscensmetodik. I korthet tillgâr analysen så att plastytan inkuberas med 50 /ul 1,25 N triklorättikssyra för att extrahera ut ceLLuLärt ATP. Mängden ATP bestäms och jämföres med en standardkurva för ATP 1 en Luminometre 1250 (LKB-Produkter, Bromma, Sverige).

Claims (8)

10 15 20 25 30 35 454 403 12 PATENTKRAV.

1. Användning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrino- gen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framställning av ett mot sârpatogena bakteriestammar med fib- ronektin-, fibrinogen-, kollagen- och/eller lamininbindande egenskaper verksamt profylaktiskt eller terapeutiskt särbe- handlingsmedel, varvid cellyteproteinet erhållits genom odling av fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller laminin- bindande bakteriestam pâ ett fast eller flytande medium, iso- lering av den så erhållna bakteriestammen, tvättning av isole- rad bakteriestam med en_saltlösning, sönderdelning av den tvättade bakteriestammen; rening av fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande komponent genom affini- tetskromatografi på immobiliserat fibronektin, fibrinogen, kollagen respektive laminin bundet till en kromatografigel och eluering av det fibronektin-, fibrinogen-, kollagen och- /eller lamininbindande cellyteproteinet.

2. Användning enligt krav 1, kännetecknad av, att cellytepro- teinet utgöres av ett genom odling av en fibronektinbindande bakteriestam erhållet protein, varvid proteinet har en mole- kylvikt av 11.000-165.000, företrädesvis 40.000-165.000.

3. Användning enligt krav 1, kännetecknad av, att cellytepro- teinet utgöres av ett genom odling av en fibrinogenbindande bakteriestam erhållet protein.

4. Användning enligt krav 1, kännetecknad av, att cellytepro- teinet utgöres av ett genom odling av en kollagenbindande bak- teriestam erhållet protein.

5. S. Användning enligt krav 1, kännetecknad av, att cellytepro- teinet utgöres av ett genom odling av en lamininbindande bak- teriestam erhållet protein.

6. Användning enligt krav 2, kännetecknad av, att cellytepro- teinet utgöres av ett genom odling av en fibronektinbindande stam av Staphylococcus aureus. *IX 10 15 20 25 30 35 454 403 13

7. Användning enligt ett eller flera av krav 1-6, kännetecknad av, att för immuníseríng verksamt sârbehandtíngsmedel fram- ställes.

8. Användning enligt ett eller flera av krav 1-6, kånnetecknad av, att ett för topisk behandLing verksamt sârbehandlingsmedet framstältes.