NO164866B - Reagens og forsoeksinnretning til bestemmelse av tilstedevaerelsen av leukocytter, esterase og protease i en proeve. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en reagens og en forsøks-innretning som er nyttig ved spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedeværelsen av f.eks. leukocytt-celler, esterase og protease. Oppfinnelsen er spesielt nyttig ved detektering av leukocytt-nivået i kroppsvæsker som f.eks. urin,

og reduserer det laboratoriearbeide som er nødvendig ved en slik analyse fra en arbeidsom telleprosedyre som er påkrevet ved mikroskopisk observasjon, til en rask, enkel dyppe- og avlesningsoperasjon.

Nærvær av unormalt høye nivåer av leukocytter i en pasients urin er en mulig indikasjon på slike patologiske tilstander som infeksjoner i nyrer eller urogenitaltrakten, eller andre dys funksjoner. Følgelig kan en informasjon om det nøyaktige leukocytt-nivåeti urinen være et uvurderlig verk-tøy for legen ved diagnose og behandling av slike sykdoms-tilstander .

Tradisjonelt har legestanden bygget på visuelle bestemmelses-teknikker til telling av leukocytt-populasjoner i urinse-aiinenter eller usentrifugert urin, dette er en fremgangsmåte som krever dyrt utstyrt, som f.eks. sentrifuge og mikroskop, samtidig som den er meget tidkrevende. Videre er de tradisjonelle teknikkene beheftet med den ulempen at bare intakte celler bestemmes. Leukocytter som finnes i urinsystemet er utsatt for betingelser som kan fremme omfattende cellelysering. F.eks. vet man at i urin med unormalt høy pH, kan leukocytt-halveringstiden være så lav som 60 minutter. Sidenlyserte celler ikke detekteres ved visuelle undersøkelsesmetoder, kan resultatet være feilaktig lave bestemmelser og falske negative resultater.

Av de to teknikkene for mikroskopisk leukocytt-analyse-urinsediment og ikke-sentrifugert, homogenisert urin,

er den førstnevnte klart, den mest ønskelige. Selv ori på-litelige resultater også kan oppnås ved den sistnevnte, benyttes urinsedimentobservas joner i de aller fleste til-

feller. Dette forutsetter at urinprøven sentrifugeres,

og sedimentet isoleres og underkastes mikroskopundersøkelse. Personen som utfører analysen, teller så antall leukocytter som kommer til syne i synsfeltet. Denne oppgaven komplise-res ytterligere ved nærvær av .andre urinkomponenter i:sedimentet, som f.eks. epitelceller og saltpartikler. Det' varierende innholdet av sedimentbestanddeler, sammen med andre kompliserende faktorer innbefattet ikke-homogenitet av prøven og forskjellig optisk oppløsningsevne i forskjellig mikroskoputstyr, kan føre til svært store feil iden-endelige bestemmelsen.

Det er således åpenbart at en rask, enkel fremgangsmåten

til leukocyttbestemmelse,en fremgangsmåte som kunne eliminere behovet for tidkrevende teknikker samt dyrt utstyrt, og-

som kunne tilveiebringe nøyaktige responser på esterase,. protease ellerJeukocytt-celler, uavhengig av om cellene er intakte eller Lyser te,ville utgjøre et meget stort fremskritt innen teknikkens stand. Foreliggende oppfinnelse, tilveiebringer et slikt fremskritt. Videre er den ikke basert på evnen til å se leukocytter, men på den enzymatiske aktiviteten de oppviser, følgelig er den i det vesentlige fri for de unøyaktighetene som er beskrevet ovenfor.

Før foreliggende oppfinnelse innbefattet fremgangsmåter

for bestemmelse av hydrolytiske bestanddeler kromogene estere som, når de ble hydrolysert ved esterase eller protease, ga et farget alkoholisk produkt, hvor den intakte esteren hadde en annen farge enn den frie alkoholen.

Mange av disse systemene innbefattet a>kseleratorforbindel-ser og diazoniumsalt-koblingsmidler.

Følgelig eksisterer det innen kjent teknikk en rekke referanser som beskriver anvendelsen av visse estere som, når de spaltes ved enzymatisk aktivitet, resulterer i dannelsen av farge eller andre detekterbare speedes. GB-PS 1.128.371 beskriver anvendelsen av indoksyl og tioindoksylestere som nyttige kromogene forbindelser ved deteksjon av hydrolytiske enzymer i kroppsvæsken. Enzymene spalter esteren slik at det genereres fritt indoksyl, som deretter oksyderes slik at det dimere produktet indigo dannes, dette er et lett observerbart blått fargestoff. En slik aktivitet sies å være forårsaket av, blant andre enzymer, cholinester-ase. I det nevnte patentet beskrives også at i tillegg til indoksyldelen av estersubstratet, velges syreradikalet med spesiell referanse til det enzymet som skal detekteres. F.eks. angis det at syreradikalet kan være acetat, laurat eller stearat, for deteksjon av henholdsvis esterase eller lipase. For detektering av enzymer som f. eks. fosfatase eller sulfatase, kan acylradikalet være uorganisk. Følge-lig beskriver det britiske patentet anvendelsen av kromogene estere som substrater for bestemmelse av estrolytiske enzymer, slike estere innbefatter indoksyl eller tioindoksyl, som den alkoholiske delen av esteren, acyldelen skreddersys for det spesielle enzymet som skal bestemmes.

Virkningen av omhyggelig valg av acylradikalet eksemplifise-res meget klart i to referanser som demonstrerer esterase-spesifisiteten for estere hvor acylradikalet innbefatter en N-beskyttet aminosyre eller et peptid. Følgelig angir Janoff et al.., Proe. Soc.. Exper. Bio. Med. 136::1045-1049 (1971) at alaninestere er spesifikke substrater for esterase oppnådd fra humane leukocytter. Spesifikt beskriver denne referansen at et ekstrakt av humane leukocyttgranuler er istand til å hydrolysere n-acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin metylester. Videre ble L-alanin-p-nitrofenylester på tilsvarende måte hydrolysert slik at man fikk den gule p-nitrofenol fargeformen.

Tilsvarende beskriver Sweetman et al.. Jour. Hist.. Soc, 22:327-339, anvendelsen av 1-naftyl N-acetyl-DL-alanin, 1-naftyl N-acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L-alanin og 1-naftyl-butyrat for å påvise nærværet av esterase.

US-PS 4.278763, kombinerer disse beskrivelsene og når frem til indoksyl og tioindoksylesterne av aminosyrer eller peptider som nok et eksempel på et tradisjonelt kolorogent substrat for leukocyttesteraseaktivitet. På samme måte som Janoff og Sweetman referansene, beskriver det nevnte patentet ekvivalensen mellom protease og esterase når det gjelder esterolytisk tilbøyelighet.

Dét er kjent at esterhydrolysereaksjoner kan aktiveres

ved nærværet av mange nukleofile midler, innbefattet en rekke alkholer. Følgelig øker hastigheten for hydrolyse av fenylacetat og p-nitrofenylacetat ved esterase med en faktor på 2,5-5,5 ved tilsats av metanol eller butanol.

(Greenzaid og Jencks, Biochemistry, 10(7), 1210-1222 (1971). Videre øker effekten med lengden av n-alkylgruppen. (Wynne og Shalatin, Eur. J. Biochem., 31:554-560 (1972) ).

Spesielt er denne aktiverende effekten av alkoholer observert med estere av aminosyrer. p-nitrofenyl-N-acetyl-L-alaninat hydrolyse aktiveres (akselereres) ved nærværet av metanol. (Fastrez og Fersht, Biochemistry, 12(11), 2025-2034 (1973). Alkoholer av høy molekylvekt øker hastigheten for esterase-indusert hydrolyse av p-nitrofenyl-t-BOC-L-tyrosinat. (Ashe og Zimmer, Biochem. and Biophys. Res Comm., 75(1), 194-199 (1977)). Beskrivelsen i US-PS 4.299.917beskriver andre kjente esterhydrolyseaktivatorer som f.eks. visse metallkomplekser, pyridinderivater og imidazoler.

Også kjent er anvendelsen av visse diazoniumsalter for kobling med fenoler og pseudofenoler slik at det dannes azofargestoffer. (Martinet og Dornier Compt Rent,. 170, 592 (1920)). En slik teknikk benyttes i en esteraseanalyse hvorved indoksylestere hydrolyseres via esterase slik at det dannes indoksyl, som i sin tur kobles med et diazoniumsalt slik at det tilsvarende azofargestoffet dannes.

(Holt og Hicks, J. Cell Biol 29, 261-366 (1966); Gossrau, Histochemistry, 57, 323-342 (1978); DE-OS-30 17 721.

For å oppsummere bakgrunnen for den teknologiske utviklingen som fører frem til foreliggende oppfinnelse, er flere fremgangsmåter kjent for analyse av hydrolytiske enzymer og leukocytt-celleri oppløsning. For bestemmelse av leukocytt-populasjoner, f.eks. i urin, har mikroskopi lenge vært den foretrukne fremgangsmåten. Følgelig måtte laboratorie-personalet fremstille mikroskopipreparater av en urinprøve og telle antallet leukocyttceller i synsfeltet i et mikroskop; dette er en fremgangsmåte som krever svært lang tid og dyrt utstyr som f.eks. mikroskop og sentrifuge.

Kjemiske og biokjemiske teknikker vinner i økende grad innpass som konkurrenter for mikroskopanalysen av leukocytter for diagnostiske formål, og er tidsbesparende verktøy i forskningslaboratorier. Kromogene estere som har utgjort hjørnestenen i kjemiske forsøk, innbefatter følgende alkoholiske- og acyldeler:

Anvendelsen av slike estere har vært understøttet av forskjellige hydrolyseakseleratorer, såvel som diazoniumsalt koblingsmidler. Som akseleratorer har mange alkanoler vært benyttet, det har også visse metallkomplekser, pyridinderivater og imidazoler. Diazoniumkationer som har egnede anioner ionisk bundet eller tilknyttet, er velkjente som koblingsmidler for slike anvendelser, hvorved alkoholen (fenolen) som dannes ved hydrolyse av esteren, kobles med diazoniumsaltet slik at det dannes et azofargestoff. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny forsøksreagens og innretning for bestemmelse av nærværet av leukocytter, esterase eller protease i en prøve. Reagensen er-kjenneteg-net ved at den innbefatter en ester som har strukturen

hvor

A er et N-blokkert aminosyreresidu eller et N-blokkert peptidsyreresidu,

X er 0, S eller NR',

R er aryl eller lavere alkyl,

R* er H eller lavere alkyl, og

R' er H, lavere alkyl eller aryl; og

et egnet bufferstoff, tilsatt i en mengde som gir en pH i området 7 til 10,

og eventuelt et diazoniumsalt koblingsmiddel hvor diazoniumsaltet fortrinnsvis er et dobbeltion som har strukturen

hvor

D~ er et anion,

G, som kan være like eller forskjellige, er H, lavere alkyl, eller aryl, eller,

hvor begge G sammen danner et kondensert ringsystem, og hvor B er H eller OH, og eventuelt en: akselerator.

Forsøksinnretningen innbefatter en bærermatriks :~som er inkorporert med den ovenfor omtalte reagensen... Fremgangsmåten for benyttelse av reagensen eller innretningen innbefatter at en prøve som mistenkes for å inneholde leucocytteeller, esterase eller protease, bringes i kontakt med reagensen eller forsøksinnretningen, og en detekterbar respons observeres.

Visse betegnelser som benyttes i foreliggende diskusjon, bør på dette punktet nevnes slik at deres betydning er klar. Følgelig tilveiebringes følgende definisjoner for å klargjøre omfanget av foreliggende oppfinnelse, og for å muliggjøre oppfinnelsens formulering og anvendelse.

Uttrykkene "N-blokkert-aminosyreresidu" og "N-blokkert-peptidresidu" krever definisjon av to grunner. "N-blokkert" refererer til kjemien for amingruppen av en aminosyre eller et peptid hvorved et hydrogenatom bundet til nitrogenatomet erstattes av en beskyttende gruppe som f.eks. acetyl, p-toluensulfonyl (tocyl), tert.-butyloksykarbonyl (t-BOC)

og andre kjente N-beskyttende grupper.

Ved betegnelsene "aminosyreresidu" og "peptid-residu" forstås en aminosyre eller et peptidmolekyl uten -0H i karbok-sylgruppen.

Ved uttrykket "aryl" menes et hvilket som helst ringsystem som inneholder aromatisitet. Inbefattet er slike 5- og 6-leddede ringer som pyrrol, fenyl, og pyridyl, såvel som sammensmeltede ringsystemer som f.eks. naftyl. Følgelig kan det aromatiske ringsystemet være heterocyklisk eller homocyklisk, og kan være substituert eller usubstituert, forutsatt at substituentgruppene ikke påvirker reagensens evne til å hydrolyseres i nærvær av leukocytteeller, esterase eller protease. Valget av slike substituenter er en rutinemessig bestemmelse med utgangspunkt i foreliggende beskrivelse.

Uttrykket "lavere alkyl" slik det benyttes i foreliggende beskrivelse, står for en alkyldel som inneholder 1-6 karbonatomer. Innbefattet i betydningen av laverealkyl er metyl, etyl, n-propyl, isoprbpyl, n-butyl, sec-butyl, tert.-butyl og alle isomerer av pentyl og heksyl. Disse kan være usubstituerte, eller de kan være substituerte, forutsatt at de ikke påvirker reagensens eller forsøks-innretningens evne til ådetektere leukocyttceller,. esterase eller protease.

Ved "egnet' bufferstoff" forstås en buffer som, når den bringes i kontakt med en vandig prøve, tilveiebringer en resulterende pH på minst 7. Fortrinnsvis er bufferen en som er istand til å produsere en pH i' området på

7-10, og, optimalt, 8,5-9,0. Borsyre-NaOH, bicin (N,N-bis/2-hydroksyetyl/-glycin eller CHES(2-/N-cykloheksyl-amino/etansulfonsyre) er eksempler på egnede bufférstoffer.

Uttrykket "akselerator" vedrører en hvilken som helst forbindelse som tjener til å øke hastigheten for hydrolyse av de kromogene esterne som er beskrevet ovenfor. Innbefattet er kjemisk så forskjellige stoffer som pyridin, imidazol og deres derivater; metallkomplekser av formelen D /B(CN) (NO) hvor D er alkalimetall, B er et tung-

m - n p-

metallion, p er 0 eller 1, m er 2-5, n er 4,8, og-m er summen av n og valensen av B; og alkoholer. Egnede alkoholer har fra 1 til 15 karbonatomer. Lineære alkholer foretrekkes fremfor forgrenede alkoholer, selv om også

de sistnevnte faller innenfor omfanget av oppfinnelsen.

Ved "sammensmeltet ringsystem" forstås to eller flere aromatiske ringer som deler et par karbonatomer. F.eks..i struk-

turen

kan begge G sammen danne det sammensmeltede ringsystemet hvor begge G tilsammen utgjør (CH)4- Nok et eksempel er

hvor begge G tilsammen utgjør (CH=CH-CH=N). Følgelig er det sammensmeltede ringsystemet polynukleært, aromatisk,

og kan være heterocyklisk eller homocyklisk.

Uttrykket "detekterbar respons" benyttes her i betydningen en forandring i, eller oppståen av, en parameter i et for-søkssystem som kan oppfattes, enten ved direkte observasjon eller instrumentelt; og som er en funksjon av nærværet av et spesifikt stoff i en vandig prøve. Noen detekterbare responser er forandring av, eller oppståen av, farge, fluore-scens, reflektans, pH, kjemiluminiscens og infrarødt spektrum.

Reagensen ifølge oppfinnelsen innbefatter en ester

og en buffer. Selv om det er stor valgfrihet, ved utvelg-elsen av disse bestanddelene, foreligger det foretrukne utførelser som gir optimale resultater, dvs. en høy grad av detekterbar respons som utvikles i løpet av kort tid.

Bade reagensen og forsøksinnretningen ifølge fore-

liggende oppfinnelse innbefatter en ester av formelen I

og en egnet buffer. Den foretrukne esteren er en hvor X er NR' og den foretrukne R'-substituenten er H. En annen foretrukket utførelse er hvor acyldeler, A, er et N-blokkert-aminosyreresidu, . spesielt N-blokkert-L-aZaninat. Det er spesielt foretrukket å benytte forbindelsen

som ester, hvor

rs er p-toluensulfonyl, dvs. forbindelse I hvor A er N-Ts-L-alaninat, R<*> er H, R er fenyl, og X er NH.

Som angitt ovenfor, innbefatter bufferstoffet en rekke forbindelser. Det foretrukne pH-området som skal tilveiebringes av bufferen er 7-10, med 8,5-9,0 som det optimale pH-området. For å oppnå dette optimale pH-området, foretrekkes det på det nåværende tidspunkt å benytte bbrsyre-NaOH, bicin (N,N-bis/2-hydroksyetyl/glycin), eller CHES(2-/N-cykloheksylamino/etansulfonsyre) som buffer.

Reagensen ifølge foreliggende oppfinnelse, kan, i

tillegg til esteren og bufferen, innbefatte forskjellige akseleratorer som definert ovenfor. Alkoholene er funnet å være spesielt nyttige til økning av den esterase- og protease-katalyserte hydrolysen av esterene diskutert ovenfor. Alkoholer som har 8-15 karbonatomer er foretrukket for dette formålet, mens dekanol, undekanol og dodekanol er foretrukket for anvendelse med forsøksinnretningen,

først og. fremst på grunn av deres lave flyktighet'-sammen-lignet med alkoholer av lavere molekylvekt.

Reagensen kan også innbefatte et di azoni umsalt som;;.

et koblingsmiddel. Diazoniumsaltets deltagelse i . detf.totale reaksjonsforløpet kan fremstilles på. følgende måte:;-.

hvor ArN+=N er diazoniumsaltet, og A, R, R<*> og X er som definert ovenfor. Reaksjonsproduktet VI er et azofargestoff som kan vise en dyp, distinkt farge.

Saltet ArN<+>=N kan ha et antall forskjellige betydninger. Generisk er det et aromatisk diazoniumsalt, og har som

sin generiske struktur følgende:

hvor R", som kan være like eller forskjellige, er H, lavere alkyl eller aryl, eller hvor to nabo R" sammen danner et kondensert ringsystem, under den forutsetning at en av R" er -N<+>= N, dvs. diazonium. Y er N eller CR". D~ er et anion som f.eks. et klorion, bromion eller andre egnede motioner til diazoniumdelen. Diazoniumsaltet som er selvstendig, dvs. et dobbeltion, tjener som et utmerket koblingsmiddel. Slike forbindelser har strukturen

hvor B er H, lavere alkyl eller OH; D er et kovalent bundet anion; G, som kan være like eller forskjellige, er H, lavere alkyl eller aryl, eller begge G kan sammen danne et kondensert ringsystem.

Følgelig er dobbeltionet et species av diazoniumsaltet

hvor motionet til diazoniumgruppene er kovalent bundet til ringsystemet. Eksempler på slike anioner innbefatter sulfonyl (S03 ), karbonyl (C02 ), fosfonyl (P03~), og andre. Det er funnet å være mest fordelaktig å benytte 1-diazo-2-naftol-4-sulfonat.

Reagensen beskrevet ovenfor kan benyttes som den

er til bestemmelse av leukocytter, esterase eller protease, eller den kan inkorporeres med en bærermatriks slik at det dannes en forsøksinnretning, der det tilveiebringes et verktøy for rask, pålitelig estimering'av nærværet av ' stoffet man ønsker å analysere. Bærermatriksen er vanligvis, men ikke nødvendigvis, et porøst stoff som f.eks. filterpapir. Andre kjente former for bærermatriksmaterialer er filt, porøse keramiske strimler, og vevede eller sammensmeltede glassfibre, (US-PS 3.846.247). Også foreslått er anvendelsen av tre, høy, svampmateriale og leirholdige stoffer (US-PS 3.552.928). Alternativt kan bærermatriksen være ikke-porøs som f.eks. forskjellige polymerfilmer,

glass o.l. Alle slike bærermatriksmaterialer kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, det kan også andre materialer. Det er funnet at filterpapir er spesielt velegnet.

I en foretrukket fremgangsmåte til fremstilling av innretningen, fuktes et stykke filterpapir med en vandig oppløsn-ing av bufferen. Denne første dyppe-oppløsningen kan også inneholde forskjellige bearbeidnings eksipienser som f.eks. et rensemiddel, et klebemiddel som f.eks. polyvinylpyrroli-don, og andre inerte bestanddeler.

Det impregnerte filterpapiret tørket så og fuktes:--med en andre dyppe-oppløsning, i aceton eller et annet ikke-vandig oppløsningsmiddel, som inneholder esteren og, om ønsket, akseleratoren og/eller diazoniumsal.tet. Det dobbelt impregnerte papiret tørkes så for annen gang, derved dannes en forsøksinnretning som er følsom for- nærværet av leukocytter og andre bestanddeler.

Den tørkede, reagens-holdige bærermatriksen, kan^monteres

på et oppbyggende materiale dersom dette ønskes.- En foretrukket utførelse av forsøksinnretningen, er'en filterpapir-bærermatriks inkorporert med. reagensen som beskrevet ovenfor, matriksen er festet til den ene siden

av et avlangt stykke av transparent polystyrenfilm. Matrik-

sen festes til filmen ved hjelp av en hvilken som helst egnet innretning, som f.eks. dobbeltklebende limbånd ("Double Stick" fra 3M), den andre enden av polystyrenfilmen tjener

som et håndtak. Ved bruk holdes en slik innretning i den frie enden av oppbygningsmaterialet bestående av polystyrenfilm, og enden som inneholder matriksen dyppes i prøven (f.eks. urin) og fjernes raskt. Enhver fargedannelse eller annen detekterbar respons observeres etter et forhånds-

bestemt tidsrom og sammenlignes med en referansestandard som svarer til responser på kjente konsentrasjoner av leukocytter eller andre bestanddeler som har esterase eller prote-aseaktivitet. Det er funnet at en inkuberingstid på

1-3 minutter vanligvis er tilstrekkelig til å tillate at fargeutviklingen finner sted i det reagens-holdige filter-

papiret.

Følgende eksempler er tilveiebragt for å lette forståelsen

og bruken av foreliggende oppfinnelse. Følgelig er fore-

trukne utførelser beskrevet i detalj og analyseresultater angitt.

I den eksperimentelle diskusjonen som følger, er følgende forkortelser benyttet:

g = gram

kg = kilogram

1 = liter

ml = milliliter

M = molar

mM = millimolar

N = normal

ekv. = ekvivalenter

mol = gram molekylformler (mol)

mmol = gram molekylformler x 10 ^ (millimol)

aq = vandig

hr = time

TLC = tynnsjiktkromatografi.

Infrarøde (IR) spektra ble tatt opp med et "Perkin Eimer modell 710E" eller "237" infrarødt spektrofotometer som oppløsninger i CHC1, med mindre annet er angitt; 1602

-lo

cm båndet av polystyrenfilm ble benyttet som en ytre kalibreringsstandard. Signalene er angitt som cm ^.

Protonmagnetiske resonans(^H NMR) spektra ble oppnådd ved 89,55 MHz ved å benytte et "JEOL FX-900" spektrometer eller ved 60 MHz ved å benytte et "Varian T-60" spektrometer; spektrene ble oppnådd i CDCl^ - oppløsning med mindre annet er angitt. Kjemiske forskyvninger er angitt i deler/million i feltet nedenfor den indre standarden tetrametylsilan.

Karbon-13 magnetiske resonans ("^C NMR) spektra ble oppnådd ved 22,5 MHz ved å benytte et "JEOL FX90Q" spektrometer med Fourier transformering, og full proton bred-bånds,støy-avkobling; spektrene ble oppnådd i CDCl^-oppløsning med mindre annet er angitt. Karbonforskyvninger er angitt

i deler/million i feltet nedenfor den interne standarden tetrametylsilan.

Massespektra (MS) ble oppnådd på et "Hewlett-Packard 5985A" spektrometer som kunne .opereres enten i en elektronstøt-(EI-electron impact) eller en rask atombombardement (FAB)-ffast atom bombardment)modus. Høy-oppløsnings massespektra ble oppnådd på et "AEI MS-902" spektrometer.

Organiske reagenser var fra Aldrich Chemical Company,og

ble benyttet uten ytterligere rensing med mindre annet er angitt. Uorganiske reagenser var av "ACS" kvalitet fra Fisher Scientific Company eller andre hovedforhandlere. Reaksjonsoppløsningsmidler var av "ACS" kvalitet; tetrahydrofuran (THF) var av "HPLC" kvalitet fra J.T.Baker Chemical Company. Saltvannsoppløsning refererer til en mettet vandig natriumkloridoppløsning.

Tynnsjiktkromatografi (TLC) ble utført ved å benytte silikagel "60F-254" plater fra E. Merck. Kolonnekromatografi ble utført ved å benytte E. Merck "Silicagel 60" (70-230 mesh). Alle smelte- cg kokepunkter som angis er ukorrigerte. Følgende forsøk ble utført for å illustrere syntesen av esteren i reagensen ifølge foreliggende oppfinnelse. Selv om disse forsøkene vedrørerspesif ikke utgangsmaterialer og sluttpro-dukter, antas det at fremgangsmåtene kan anvendes på et vidt område av species som innbefattes innenfor de generiske klassene av estere som her beskrives.

Eksempel 1

Syntese av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol (4).

Syntesen av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol illu-streres ved følgende reaksjonsskjema:

N-tosyl-L-alanin.

L-alanin (100 g, 1,11 mol) ble oppløst i 2,25 1 IN natrium-hydroksyd (aq), avkjølt til 5°C og omrørt mens en oppløsning av p-toluensulfonylklorid (218 g, 1,11 mol) oppløst i 450 ml toluen sakte ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 0 timer. Lagene ble separert og det avkjølte vandige laget ble surgjort til pH 1 med konsentrert saltsyre. Den hvite, faste forbindelen i overskriften ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket. Utbyttet 178,5 g (66%), smp. 134-5°C. IR (CHCl-^crrT<1> 1726, 1340 , 1165, 1095; ^ NMR (DMSO-Dg) 61,20 (d,J=7,3H), 2,40 (s,3H), 3,85 (p,J=8,lH), 6,4(br,s.lH)(C02H), 7,41 (d, /JAB_7=8,

2H), og 7,75 (d, /JAB_/=8,2H) (sentrum av diagrammet: 7,58; AVAR=20,49Hz), 8,03 (br d, J=8,1H) (NH).

N-tosyl-L-alaninylklorid.

Fremgangsmåte A.

En blanding av N-tosyl-L-alanin (12,4 g; 0,05 mol) og tionyl-klorid (25 ml) ble oppvarmet i 90 minutter ved 55°C, og deretter konsentrert på rotasjonsfordamperen ved 40°C.

Det faste røde residuet ble oppløst i 200 ml kokende CCl^, avfarget med 20 g ovnstørket "Norit 211", filtrert og avkjølt. Det kremfargede, faste stoffet i overskriften ble samlet ved filtrering, vasket med heksan og tørket. Utbyttet 8,48 g (65%) med smp. 101-101,5°C. IR (CHCl^cm<-1 >3360, 3260, 3025, 1775 , 1605, 1350 , 1170, 910 ; "'"H NMR (CDC13) 61,48 (d, J=7,3H), 2,43 (s, 3H),' 4,33 (p, j = 8,lH), 5,93

(br d, J=8,1H)(NH), 7,31 (d, /JAB_/=8, 2H) og 7,76 (d, /J,„ 7=8,2H) (sentrum av diagram: 7,53; AV,=26,83Hz?. — AB- AtS —

Analyse: beregnet, .for. C10H12ClNO3S: C, 45,89, H 4,62, N 5,35

funnet : C, 46,63, H 4,90, N 5,19.

Fremgangsmåte B.

En blanding av N-tosyl-L-alanin (3,1 g, 13 mmol) og tionyl-klorid (6 ml) ble oppvarmet i 90 minutter ved 50°C, deretter fortynnet med 50 ml tørr heksan. Blandingen ble raskt omrørt, avkjølt og det faste produktet ble filtrert. Utbyttet 3,15 g (93%), smp. 99-100°C. IR spektret var iden-tisk med det for det rekrystalliserte materialet fremstilt ved fremgangsmåte .A.

2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-hydrokanelsyre dikaliumsalt dihydrat (1).

En omrørt oppslemming av 1,0 kg trans-kanelsyre (6,75 mol)

i 4,5 1 aceton, ble behandlet først med NaHC03 (2,47 kg, 29,4 mol; 4 , 36 ekv. )deretter forsiktig med vann (4,5 liter). D'=n resulterende tykke blandingen ble behandlet dråpevis,

i løpet av et tidsrom på 1,5 - 2,0 timer, med en oppløsning av "OXON" monosulfatforbindelse (3,78 kg; inneholder 1,82 5 ekvivalenter av KHSOj.) i 0,4 mM vandig dinatriumetylendiamin tetraeddiksyre (EDTA) (14,5 liter; fremstilt ved å oppløse 2,17 g dinatrium EDTA dihydrat i 14,5 liter destillert vann). 1 ' 2. I løpet av denne tilsatsen, ble reaksjonstemperaturen holdt ved 24-27°C ved hjelp av et vannbad; reak-sjonens pH ble registrert å være ca. 7,4. Etter at tilsatsen var avsluttet, ble blandingen omrørt i ytterligere 0,5 timer, og deretter avkjølt til ca. 10°C. Reaksjonen ble surgjort med konsentrert HC1 (ca. 1,2 liter) til pH

= 2 mens temperaturen ble holdt ved ca. 10°C, og deretter behandlet med CH2C12 (5,05 1) og omrørt kraftig i 10 minutter. Etter at blandingen hadde fått sedimentere, ble det vandige laget dekantert av og det organiske laget, som inneholdt uoppløselige salter, bli filtrert gjennom papir J.O.Edwards et al., Photochem. Photobiol. 30, 63 (1979).

<2> R.Corci et al., J. Org. Chem. 45, 4758 (1980).

med avsugning. De filtrerte faste stoffene ble vasket med CH2C12 (1,9 l),og det vandige laget ble ekstrahert med dette filtratet. De filtrerte faste stoffene ble igjen vasket med CH2C12 (3,15 1) og det vandige laget ble ekstrahert med dette filtratet. De kombinerte CH2C12-lagene ble ekstrahert med en oppløsning av KOH (593,3 g) i vann (6,31 1) - forsiktig oppvarming til ca. 40°C er ofte påkrevet for å oppløse et fast stoff som kan separere fra under baseekstraksjonen. CH2C12 laget ble så ekstrahert med en oppløsning av KOH (99g) i vann (1,5 1) og de"kombinerte baseekstraktene ble behandlet med glycin (481,7'g; 6,416

mo; 0,95 ekv); det organiske laget ble kastet.

Oppløsningens pH ble regulert til 11,5 med 25% vandig KOH

og deretter oppvarmet til koking. Ca. 900 ml av»lavtkokende væske (aceton og vann) ble destillert av før damptempera-turen nådde 99°C, hvoretter blandingen ble kokt med tilbake-løp i 2 timer. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen ekstrahert med CH2C12 (3,15 1)., CH2C12 fasen ble kastet,

og den vandige fasen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk på et bad av 70°C. Residuet ble kokt' i 95%

E* OH '8,83 1) i 30 minutter, og fikk deretter avkjøles 1 -ngsomt under omrøring, hvorpå' produktet ble separert fra i form av fine krystaller. Disse ble filtrert, vasket med ny 95% EtOH (1,26 1) og tørket i en ovn ved 50-60°C, slik at man fikk forbindelsen i overskriften (1,77 kg; 74,6%) i form av hvite krystaller med smp. = 120-2°C (ukorrigert ) .

IR (KBr) cm"<1> 3420 (br.), 1590 (br..), 1410, 1130, 710;

1H NMR (D20-TSP) 6 3,1 (s, 2H), 3,89. (d, /JAB_/=4,1H) og 4,52 (d, / J^^ 7=4,1H) (sentrum for' diagram; 4,21; AV,=18,83

— Ari— Ars

Hz), 4,68 (s, 6H, utvekselbare protoner) 7,4 (s, 5H); TLC

Rf = 0,59 (EtOH; IM trietylammoniumbikarbonat, 7;3). Analyse: beregnet for C^H^NO.^,:: C 37 , 59, H 4,30, N 3,99

funnet : C 37,22, H 4,24, N 3,96.

N-acetyl-3-acetoksy-5-fenylpyrrol (2)

En suspensjon av 2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-hydro-kanelsyre dikaliumsalt dihydrat (1) (1,0 kg; 2,84 mol)

i pyridin (3,0 1) ble behandlet med eddiksyreanhydrid (4,0 1) ved romtemperatur under en atmosfære av inertgass. En mildt eksoterm reaksjon fulgte, og reaksjonstemperaturen steg eksponentielt til 60-70°C i løpet av et tidsrom på 1,5-2,5 timer. Straks reaksjonen begynte å avkjøles, ble blandingen oppvarmet til 120-123°C i 15 minutter, og fikk deretter avkjøles til romtemperatur i løpet av 1 time,

i løpet av dette tidsrommet ble pyridiniumacetat fraskilt som krystaller. Blandingen ble filtrert gjennom papir med avsugning og saltene ble vasket med EtASc inntil de var fargeløse; filtratet ble inndampet til tørrhet i vakuum.

Det mørkt røde residuet ble oppløst i EtOAc (3,0 1), vasket 3 ganger med vann (1,0 1 hver gang), tørket over MgSO^ og behandlet med "Darco-G60" (300 g). Etter omrøring i 30 minutter ble blandingen filtrert gjennom "Celite" og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at man fikk en rød-orange olje. Denne oljen ble oppløst i varm 2-propanol (1,2 1), fikk deretter langsomt kjøles til romtemperatur over natten, hvorpå et fast stoff ble separert fra. Det krystallinske produktet ble filtrert, vasket med 50% vandig 2-propanol og tørket i vakuum, slik at man fikk forbindelsen i overskriften (417 g; 60%) med smp.. 58-60°C (ukorrigert).

En del ble tatt opp i Et20, behandlet med "Norit 211", filtrert og konsentrert under redusert trykk; ved henstand ved 0°C ble fargeløse, små nåler separert fra. Disse ble filtrert, vasket med Et20/heksan (1:1) og vakuumtørket slik at man fikk den analytiske prøven med smp. = 60-62,5°C (ukorrigert).

IR(CHCl3)cm~<1> 3020, 1760, 1730, 1595, 1378, 1320, 1220 (br.), 1030, 960, 903; <1>H NMR (CDCl3) 6 2,23 (s, 3H), 7,42 (d, J=2, 1H); TLC Rf=0,56 (toluen:dioksan, 4:1).

Analyse;-beregnet for C14<H>13<N0>3<:> c 69,12; H 5,38; N 5,76

funnet : C 68,88; H 5,25; N 5,53.

3-hydroksy-5-fenylpyrrol (3).

En finfordelt porsjon av N-acetyl-3-acetoksy-5-fenylpyrrol (2) (36,8 g; 0,15 mol) ble renset for oksygen ved omrøring i en strøm av argon i 10 minutter, deretter suspendert',

i desoksydert MeOH (379 ml), avkjølt til -6°C (i et -15°C metanol (MeOH)/tørris-bad) under en atmosfære av inertgass og raskt behandlet med en iskald desoksydert oppløsning,

av 2N NaOH (300 ml). Reaksjonstemperaturen steg ved tilsats av base straks til 18°C, og etter ca. 3 minutter ble reaksjonsblandingen homogen. Ettersom reaksjonsblandingen ble avkjølt, ble forbindelsen(3) separert fra som fine krystaller. Etter 15 minutter ble det tilsatt en oppløsning av kald desoksydert 2M sitronsyre (150 ml), den resulterende blandingen ble omrørt i 10 minutter, og deretter filtrert. Det faste stoffet ble vasket grundig med desoksydert vann (200 ml), idet man omhyggelig unngikk å eksponere produktet mot luft, deretter tørket under vakuum over natten, slik at man fikk forbindelsen i overskriften (22,3 g; 93,6%)

i form av lyst rosa, små nåler.

IR (KBr) cm"<1> 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 1480, 1268, 1180, 742, 640; <1>H NMR (DMSO-D<6>) 66,1 (m, 1H), 6,3

(m, 1H), 7,0-7,7 (m, 5H), 8,0 (s, 1H), 10,4 (br s, 1H);

TLC Rf = 0,20-0,28 (EtOH_CHCl3# 1:9).

Analyse beregnet for C1QHgNO: C 75,45; H 5,70; N 8,80

funnet : C 75,30; H 5,69; N 8,67.

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol (4).

En oppløsning av vannfri tetrahydrofuran (THF, 450 ml), pyridin (43,8 ml); 0, 542 mol; 1,2 ekv.Jog trifluoreddiksyre (85,0 ml; 1,10 mol; 2,4ekv.) holdt ved 0°C under en atmosfære av inertgass, ble behandlet i 1 porsjon med 3-hydroksy-5-fenylpyrrol (3) (71,5 g; 0,45 mol; 1,0 ekv.) straks etterfulgt av dråpevis tilsats, i løpet av 5-10 minutter, av en oppløsning av nyfremstilt N-tosyl-L-alaninylklorid (141,0 g; 0,54 mol; l,2ekv.)i vannfri THF (450 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt i 15 minutter ved 0°C. Reaksjonen ble så stoppet ved tilsats av en oppløsning av 1,0

M vandig sitronsyre (315 ml) og EtOAc (1,35 1). Etter

kort blanding ble fasene separert og det organiske laget ble vasket med en oppløsning av vandig NaCl (360 ml; 0,18

g NaCl pr. ml vann). Det organiske laget ble så ekstrahert 2 ganger med en oppløsning av 5% vandig NaHCO^ (1,35.,1

hver gang), og deretter vasket med en annen porsjon av vandig NaCl (360 ml; 0,18 g NaCl pr. ml vann). Det rødbrune organiske laget ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter med MgS04 (101 g) og "Darco-G60" (143 g), deretter filtrert gjennom "Celite" og inndampet til tørrhet i vakuum fra et bad ved 37°C, slik at man fikk (4) i form av et hvit-rosa faststoff. Råproduktet ble nedmalt til et pulver og oppløst i varm (50°C) THF (250 ml), kraftig omrørt og fortynnet med n-heksan (250 ml). Omrøringen ble fortsatt i 1 time ved romtemperatur mens produktet krystalliserte. Det faste stoffet ble filtrert, vasket med toluen (ca.

1,0 1) inntil filtratet var fargeløst, deretter tørket i vakuum over natten, slik at man fikk forbindelsen i overskriften. (112 g; 65%) i form av et hvit pulver med smp.= 154,5-155°C.

IR (KC1) cm<_1> 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 770;

<1>H NMR (DMSO-d<6>) 61,33 (d, J=7, 3H), 2,36 (s, 3H), 4,13

(p, J=8, 1H), 6,25 (m, 1H), 6,73 (m, 1H), 7,05-7,50 (m,

5H), 7,5-7,85 (m, 4H), 9,42 (d, J=8, 1H), 11,18 (br s,

1H); <13>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 18,335, 21,001, 51,370, 98,061, 108,336, 123,423, 126,024, 126,610, 128,560, 128,756, 129,601, 132,397, 137,600, 138,380, 142,737, 169,919;

^a_/D = -70°C (c=l,ll, MeOH); TLC Rf = 0,45 (EtOAc:heksan, 1:1), TLC Rf = 0,40 (toluen:dioksan, 4:1).

Analyse?beregnet for <C>20H2Q<N>2<O>4<S:> c 62,48; H 5,24; N 7,29

funnet : C 62,42; H 5,27; N 7,30.

Eksempel 2.

Syntese av 3-(N-tosylalaninyloksy)-5-fenyltiofen (9).

En serie forsøk ble utført for å fremstille 3-hydroksy-5-fenyltiofen ved små modifikasjoner av angitte litteratur-fremgangsmåter (se nederst på siden).

De resulterende hydroksytiofen ble så acylert med N-tosyl-L-alaninylklorid slik at man fikk den tilsvarende N-tosyl-L-alaninatesteren med et utbytte på 46% (ikke optimalisert fremgangsmåte).

<3> P.Friedlander og S. Kielbasinski, Chem. Ber. 45, 3389

(1912).

<4> A.I.Kosak, R.J.F. Palchak, W.A. Steele og CM. Selwitz, J. Amer. Chem. Soc, 76, 4450 (1954).

3-fenyl-1,2-ditia-3-cyklopenten-5-on (5).

En suspensjon av 10 g etylcinnamat (56,82 mmol) og 10 g svovel ble oppvarmet til 250°C i 4 timer i en 50 ml flaske . utstyrt med et destillasjonshode og en beholder for å fjerne etanol som ble dannet under reaksjonen. Reaksjonsblandingen ble så avkjølt til 100°C og . tilsatt til 500 ml av tilbake-løpende etanol. Den resulterende utfellingen ble filtrert og suksessivt tr iturert med 500 ml kokende aceton og to ganger med 500 ml porsjoner av etanol. De kombinerte over-væskene ble konsentrert til et sort, fast stoff, som når det ble krystallisert fra metanol, ga mørkt brune nåler.

En andre omkrystallisering fra metanol ved benyttelse av "Norit" og filtrering gjennom "Celite" ga 2,023 g av lyst gule nåler med smp. 113-115°C.

IR (KBr) cm"<1> 1650, 1550 , 1390 , 1350 , 1130, 770 ; """H NMR

(60 m Hz, CDC13) 66,92 (s, 1H), 7,58 (m, 5H); TLC Rf =

0,5 (diklormetan).

Analyse; beregnet for CgH602S: C 55, 64 ; H 3,11

funnet : C 55,53; H 3,47.

cis-4-keto-6-fenyl-3,7-ditia-5-nonendionsyre (6).

En smeltet oppløsning av 35,48 g natriumsulfid nonahydrat (148 mmol) ved 94°C ble behandlet med 6,65 g 3-fenyl-l,2-ditia-3-cyklopenten-3-on (5) (34,23 mmol) tilsatt porsjons-vis i løpet av 5 minutter. Etter 15 minutter ble blandingen tilsatt til en iskald oppløsning som inneholdt 43,6 g brom-eddiksyre (314 mmol) i 60 ml vann justert til pH 8,7 med natriumkarbonat. Den resulterende oppløsningen ble holdt ved 0°C, pH 8,7 i 45 minutter, og ble deretter filtrert. Overvæsken ble holdt ved 0°C og surgjort til pH 3,7 med en 5N HC1 oppløsning. Den resulterende blandingen ble omrørt over natten ved 5°C. Overvæsken ble så dekantert,

og den resulterende oljen bletriturert med eter. Oljen ble fordampet med toluen inntil det ble dannet 6,98 g av et fargeløst skum (65%). Dette materialet ble benyttet uten ytterligere rensing.

En analytisk prøve ble oppnådd fra eterovervæsken, som

ved konsentrering, suksessive fordampninger med eddiksyre og toluen, og triturering med eter, ga lyst brune krystaller, smp. = 142,5-150°C.

IR (KBr) cm"<1> 1705, 1655; <1>H NMR (60 MHz, DMSO-Dg)

6 2,06 (s, CH3C02H forurensing) 3,30 (s, 2H), 3,77 (s,

2H), 5,67 (m, 2H)(OH), 6,37 (s, 1H), 7,43 (m, 5H); TLC

Rf= 0,85 (kloroform:metanol:eddiksyre, 5:5:1). Analyse; beregnet for C13H12<S>2°5<:> C 50'00; H 3'88

funnet : C 50,26, H 3,98.

3-hydroksy-5-fenyltiofen acetat (7).

En kraftig omrørt suspensjon av 3,40 g rå cis-4-keto-6-f enyl-3 , 7-ditia-5-nonendionsyre (6) (10,9 mmol), 3,40,. g natriumacetat (41,5 mmol), og 30 ml eddiksyreanhydrid ble oppvarmet under tilbakestrømning i 1 time. Blandingen ble så avkjølt og deretter filtrert og inndampet slik at man fikk en sort olje. Dette residuet ble oppløst i 75 ml etylacetat og ekstrahert 3 ganger med 50 ml porsjoner av iskald, mettet natriumbikarbonat oppløsning. Det organiske laget ble så vasket med saltvannsoppløsning, tørket over natriumsulfat, filtrert, og inndampet slik at man fikk 2,826 g av et sort, fast stoff. Råproduktet ble renset ved inndampingsdestillasjon ved 120-140°C, og 0,1 mm, slik at man fikk 1,235 g av en lys orange olje som størknet ved henstand (52%).

IR cm"<1> 1700, 1745; <1>H NMR (60 MHz, CDC13) S 2,-3 (S,

3H), 7,03 (d, J=Hz, 1H), 7,13 (d, J=2Hz, 1H); 7,23-7,73

(m, 5H); MS (EI, DIP) m/e 218 (M<+>, 12,6%); TLC Rf=0,48 (heksan:etylacetat, 5:1).

Analyse:, beregnet for <C>12H1QS02-^ H20: C 43,41; H 4,88

funnet : C 63,78; H 4 ,86.

3-hydroksy-5-fenyltiofen (8).

En blanding av 2,126 g 3-hydroksy-5-fenyltiofenacetat

(7) (9,74 mmol) og 80 ml metanol under en atmosfære av argon, ble behandlet med 11 ml IN NaOH. Etter 20 minutter ble reaksjonen stoppet ved tilsats av 11 ml IN HC1, inndampet ved 25°C, 12 mm, til et volum på ca. 50 ml, og behandlet med 100 ml etylacetat. Det organiske laget ble separert fra, vasket med saltvannsoppløsning, tørket over natriumsulfat, filtrert, og inndampet slik at man fikk et sort, fast stoff. Dette residuet ble oppløst i 75 ml etylacetat og tørket over MgSO^. Filtrering og inndamping ga et sort, fast stoff som ble triturert 4 ganger med varm heksan, slik at man ved avkjøling fikk en total mengde på 837 mg av et gult, fast stoff, smp. 74-75°C (49%). Den samlede moder-luten ble konsentrert slik at man fikk 0,87 g av et fast stoff som ble kromatografert over 100 g SiC^ og eluert med en heksan:etylacetat (7:1) oppløsningsmiddelblanding. Etter rekrystallisasjon ble det oppnådd ytterligere 380

mg av produktet, smp. 73,5-74°C. Det totale utbyttet var følgelig 1,217 g (71%), smp. 74,5-75°C (litteratur <3>,<4> 75°C, 78°C).

IR CM<_1> 3380, 1635; <1>H NMR (90 MHz, CDC13) 5 3,81 (s,

2H), 6,57 (s, 1H); 7,2-7,7 (m, 5H); MS (EI) m/e 176,0 (70,7%); TLC Rf = 0,23 (heksan:etylacetat, 1:5). Analyse.'beregnet for C-^HgOS: C 68,15; H 4,57

funnet : C 68,05; H 4,70

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenyltiofen (9).

En oppløsning som inneholdt 440 mg 3-hydroksy-5-fenyltiofen (8) (2,5 mmol) i 20 ml diklormetan og 0,61 ml pyridin (7,5 mmol) ved 0°C under en argonatmosfære, ble behandlet med en oppløsning som inneholdt 1,314 g N-tosyl-L-alaninylklorid (5 mmol) i 10 ml diklormetan tilsatt dråpevis i løpet av et tidsrom på 5 minutter. Reaksjonen ble omrørt i 0,5 timer ved 0°C, og ble så'tel lti 100 ml kloroform. Blandingen ble så suksessivt ekstrahert med 50 ml porsjoner av IN sitronsyre, vann, iskald natriumbikarbonatoppløsning, vann og saltvannsoppløsning. Blandingen ble så tørket over natriumsulfat, filtrert og inndampet til 1,78 g av en brun olje. Forsøk på krystallisering fra toluen etter behandling med 1,78 g "Norit" var ikke vellykket. Residuet ble så kromatografert på en 200 g kolonne av Si02 eluert med diklormetan ved en strømningshastighet på 10 ml/min. Fraksjoner som inneholdt produktet ble samlet og konsentrert slik at man fikk 951 mg av en rødlig olje. Produktet ble krystallisert fra toluen. Suksessive rekrystallisasjoner fra toluen ga en total mengde på 463 mg av produktet i form av et lyst, gult faststoff (46%), smp. 85-87°C.

IR (KC1) cm<_1> 1735, 1330, 1150; <1>H NMR (90 MHz, CDC13)

6 1,53 (d, J=7 Hz, 3H), 1,62 (s, 3H), 4,23 (m, 1H),,5,32 (d, J=9Hz, 1H), 6,84 (d, J=l,4 Hz, 1H), 6,88 (d, J=l,4

Hz, 1H), 7,23-7,83 (m, 9H); MS (FAB) m/e 402 (M + 1, 15%); TLC Rf = 0,20 (heksanetylacetat, 4:1).

Analyse'beregnet for C^H^NC^S: C 59 , 83 ; H 4,77; N 3,59.

funnet : C 59,60; H 4,77; N 3,43.

Eksempel 3.

Syntese av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-l-metyl-5-fenylpyrrol (13).

En serie forsøk ble utført på å fremstille esteren i overskriften, svarende til forbindelse (I) hvor Z er N-tosyl-L-alaninyl, R er fenyl, R<*> er H, X er NR' og R' er CH3. Reaksjonsskjemaet er som følger:

2-hydroksy-3-(N-metylkarboksymetylamino)-hydrokane1syre dikaliumsalt (10 ) .

En blanding av b-fenylglycidinsyre kaliumsalt (30 g; 0,15 mol), N-metylglycin (13,2 g; 0,15 mol), destillert vann (119 ml) og KOH oppløsning (9N; 22,3 ml) ble oppvarmet til tilbakestrømning i 3 timer, slik at man fikk en lys gul oppløsning. Reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet under redusert trykk ved 70°C. Residuet ble så krystallisert fra 95% EtOH (100 ml) slik at man fikk et hvitt,fast stoff som, etter tørking over natten under redusert trykk ved 110°C, ga 30,8 g av et hvitt, fast stoff (10) (utbytte 63%).

IR (KCL) cm<_1> 3360 (br), 1580, 1405 , 705 ; -""H NMR (CD3OD)

6 2,30 (s, 3H), 2,98 (s, 2H), 3,70 (d, J=3 Hz, 1H), 4,48

(d, J=3 Hz, 1H), 4,92 (s, 1H), 7,40 (s, 5H); TLC Rf = 0,51 (EtOH:IM trietylammoniumbikarbonat, 7:3). (Produktet hadde ikke noe smp under 270°C).

3-acetoksy-l-mety1-5-fenylpyrrol (11).

En blanding av 2-hydroksy-3-(N-metylkarboksymetylamino)-hydrokanelsyre dikaliumsalt (10) (15,2 g, 46 mmol), eddiksyreanhydrid (173 ml) og trietylamin (308 ml), ble oppvarmet til 90°C i 19 timer. Reaksjonsblandingen, som antok en dyp, brun farge, ble filtrert og det faste stoffet ble vasket med eter. Filtratet ble inndampet under redusert trykk, slik at man fikk et dyp-brunt residu som ble tatt opp i eter (300 ml) og vann (200 ml). Lagene ble separert og eterlaget ble vasket med en annen porsjon vann (200

ml). Eteroppløsningen ble så tørket over MgSO^, filtrert og konsentrert under redusert trykk, slik at man fikk 10,7 g av et brunt residu som ble renset ved inndampingsdestillasjon (120-135°C; 0,03 torr) og krystallisert fra eter, slik at man fikk 3,0 g av hvite krystaller (11) (utbytte 30%), smp = 64-65°C.

IR (CHC13) cm"<1> 2990, 1750, 1570, 1518, 1482, 1375, 1230 (br), 1024, 910, 700; <1>H NMR (CDC13) S 2,20 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 6,10 (d, J=2 Hz, 1H), 6,75 (d, 3=2 Hz, 1H), 7,35 (s, 5H); TLC Rf = 0,58 (heksan:EtOAc 7:3).

Analyse:beregnet for C13H13<N>02: C 72,54; H 6,10; N 6,44.

funnet : C 72,57; H 6,09; N 6,51.

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-l-metyl-5-metylpyrrol (13).

Til en blanding av desoksydert metanol (15,5 ml) og 3-acet-oksy-l-metyl-5-fenylpyrrol (11) (1,3 g, 6,2 mmol), under argon, ble det tilsatt desoksydert NaOH (2N, 12,5 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt på et isbad i 15 minutter. Deretter ble desoksydert sitronsyre (2M, 7 ml) tilsatt

og den resulterende blandingen ble omrørt på et isbad i 8 minutter. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk, deretter tilsatt 20 ml vann, og ekstrahert

2 ganger med etylacetat (EtOAC) (50 ml). EtOAc lagene ble samlet, tørket over MgSO^, filtrert og konsentrert under redusert trykk, slik at man fikk 3-hydroksy-l-metyl-5-fenylpyrrol (12) i form av et orange residu. Under argon ble det tilsatt en kald oppløsning av vannfri THF (12,4

ml), pyridin (0,6 ml, 7,4 mmol), 1,2 ek v.) og trif luoreddiksyre (1,2 ml, 15 mmol, 2,4ekv.) til det orange residuet, straks etterfulgt av tilsats av en oppløsning av nyfremstilt N-tosyl-L-alaninylklorid (1,2 g, 7,4 mmol, l,2ekv.) i vannfri THF (12,4 ml). Den resulterende blandingen ble omrørt 1 1 time ved 0°C. Deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsats av vandig sitronsyre (IM, 5 ml) og EtOAc (30 ml). Etter kortvarig blanding, ble lagene separert og det organiske laget ble suksessivt vasket med mettet NaCl oppløsning, 2 ganger med 5% NaHCO^ oppløsning og igjen med mettet NaCl oppløsning. EtOAc ekstraktet ble så tørket over MgSO^, behandlet med "Norit 211", filtrert og konsentrert under redusert trykk, slik at man fikk råproduktet (13) i form av et orange residu. Dette ble oppløst i heksan:EtOAc (1:1) (5 ml) og kromatografert på en kolonne (Si02, 100

g) ved eluering med heksan:EtOAc (7:3) slik at man fikk 1 g av (13) i form av en tykk, lys orange olje. En del

av dette råproduktet ble ytterligere renset ved semi-prepara-tiv HPLC (kolonne, "IBM silica", 1 cm x 25 cm; mobil fase, heksan:EtOAc 8:2; strømningshastighet, 4,0 ml/min; trykk, 10,34 torr) slik at man fikk en honningfarget, tykk olje (13) .

IR (film) cm 1 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770;

<1>H NMR (DMSO-do.) 6 1,28 (d, J=7 Hz, 3H), 2,36 (s, 3H),

3,58 (s, 3H), 5,85 (d, J=2 Hz, 1H), 6,15 (m, 1H), 6,74

(d, J=2 Hz, 1H), 7,30-7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J=8 Hz, 1H); <13>C NMR (DMSO-d.) & 18,205, 20,936, 34,917, 51,240, 100,598, 113.148, 126,544, 127,000, 128,105, 128,560, 129,601, 130.901, 132,202, 135,714, 138.315, 142.672, 169.724;

TLC Rf = 0,52 (toluen:dioksan 4:1); Høy-oppløsningsmasse-spektrum, c2i<H>22<N>2°4<S> krever m/e 398.1300, funnet m/e 398.1297.

Eksempel 4.

Syntese av 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-(p-klorfenyl)pyrrol (18) .

En serie forsøk ble gjennomført for å fremstille esterfor-bindelsen i overskriften svarende til forbindelse (I) hvor A er N-tosyl-L-alaninyl, R er p-klorfenyl, R<*> er H, X

er NR' og R' er H. Reaksjonsskjemaet er som følger:

trans-e-(p-klorfenyl)glycidinsyre (14).

Til en omrørt oppslemming av p-klorkanelsyre (68,5 g; 0,375 mol) i 260 ml aceton, ble det tilsatt NaHC03 (137

g; 1,63 mol), etterfulgt av langsom tilsats av 260 ml vann. Til denne blandingen ble det i løpet av et tidsrom på 2,5 timer ved 22-27°C, tilsatt en blanding av "Oxone" (211

g; 0,343 mol), 120 mg dinatrium EDTA og 805 ml vann. Etter 5 timer ble blandingen surgjort med 70 ml kald 12N HC1

for å bringe pH ned til ca. 2,5, og den ble så ekstrahert med 700 ml etylacetat. Ekstraktet ble vasket med saltvanns-oppløsning, tørket med MgSO^, filtrert og filtratet ble inndampet til tørrhet under vakuum. De hvite, faste stoffene ble krystallisert fra etylacetat: smp. 121-5°C (72,2 g,

97% utbytte). <1>H NMR (CDC13/DMS0-D6) 6 7,3 (m, 4H), 4,05

(d, J=2, 1H), og 3,4 (d, J=2, 1H).

Analyse;beregnet for CgH7C103: C 54,43: h 3,55; Cl 17,85

funnet : C 54 , 53 ; H 3,80; Cl 17,, 91

2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-p-klorhydrokanelsyre dikalsiumsalt dihydrat (15).

Til en oppløsning av KOH (85%) (46,7 g; 0,709 mol) og 400

ml vann ble det tilsatt glycin (25,9 g; 0,345 mol) etterfulgt av trans-B-p- klorfenyiglycidinsyre (14) (72,2 g; 0,3635 mol). Denne blandingen ble oppvarmet til 100°C

i 2 timer, avkjølt til romtemperatur og det ble tilsatt tilstrekkelig KOH til å heve pH til 12. Den uklare oppløs-ningen ble ekstrahert 3 ganger med etylacetat, disse ekstrak-tene ble så kastet; den klare, vandige oppløsningen (ca.

500 ml), ble inndampet til tørrhet under vakuum, ved hjelp av et vannnbad ved 70°C. De faste stoffene ble så oppløst i ca. 350 ml varm etanol, filtrert, og filtratet ble av-kjølt på et isbad i flere timer. De krystalliserte faste stoffene ble samlet ved filtrering og vasket med noe kald etanol; smp. 93-5°C med dekarboksylering ved 185°C (57,2g; 41%).

<1>H NMR (D20-TSP) 67,4 (s, 4H), 4,7 (s, 6H, utvekselbare protoner), 4,4 (d, J=4, 1H), 4,05 (d, J=4, 1H), og 3,1

(s, 2H).

Analyse: beregnet for Ci;LH10ClNO5K2 • 2H20: C 34,24; H 3,66;

N 3,63 Funnet : C 34,40; H 4,03; N 3,42.

N-acetyl-3-acetoksy-5-(p-klor fenyl)pyrrol (16).

Til 2-hydroksy-3-(karboksymetylamino)-p-klorhydrokanelsyre dikaliumsalt dihydratet (15) (10 g; 0,02591 mol) ble det tilsatt eddiksyreanhydrid (40 ml) og pyridin (30 ml).

Denne blandingen ble forsiktig oppvarmet til 35°C, ved denne temperaturen ble oppløsningen eksotermt oppvarmet til 67°C, derpå begynte temperaturen å falle og oppvarmingen ble gjenopptatt. Blandingen ble oppvarmet til 121-2°C (indre temperatur) i 1 time, og deretter avkjølt. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt ca. 30 ml etylacetat som utfelte det meste av pyridiniumacetatsaltet; dette saltet ble samlet ved filtrering og vasket med en liten mengden etylacetat. Filtratet ble så inndampet under vakuum til en olje og isvann ble tilsatt. Produktet ble så ekstrahert med eter og eterekstraktene ble suksessivt vasket 2 ganger med kald, fortynnet, vandig sitronsyre, kaldt vann, 3 ganger med kald, fortynnet, vandig NaHCO^, kaldt vann og saltvannsoppløsning, etterfulgt av tørking over MgS04 og filtrering. Filtratet ble behandlet med 10 g "Darco", omrørt i 20 minutter og deretter filtrert. Filtratet ble inndampet under vakuum til en olje. Til oljen ble det tilsatt 25 ml 2-propanol. Den resulterende oppløs-ningen ga, med avkjøling og skraping, blekt gule krystaller, smp. 69-71°C (3,4 g; 47%); TLC Rf=0,61 (toluen:dioksan, 95:5).., En analytisk prøve ble rekrystallisert fra 2-propanol, men ingen forandring i smp. ble observert.

IR (KC1) cm"<1> 1755 (C=0, ester) og 1730 (C=0, amid) <1>H

NMR (CLC13) 6 7,4 (m, 5H), 6,2 (d, J=2, 1H), 2,4 (s, 3H)

og 2,3 (s, 3H).

Analyse-; beregnet for C^H^CINC^: C 60 , 55, H 4,36; H 5,04

funnet : C 60,65; H 4,55; N 5,07.

3-hydroksy-5-(p-klorfenyl)pyrroi (17 ) .

En prøve av N-acetyl-3-acetoksy-5-p-klorfenylpyrrol (16)

(2,8 g; 0,01 mol) ble desoksyert i 10 minutter med en strøm

av N2. De faste stoffene ble så oppløst i desoksydert metanol (30 ml) som så ble avkjølt til -8°C. Deretter ble det straks tilsatt en kald, desoksydert oppløsning av NaOH (1,6 g; 0,04 mol) i 20 ml H20, denne oppløsningen ble så kort oppvarmet til 15°C og deretter straks avkjølt til -5°C; etter 25 minutter ble den klare oppløsningen behandlet med en kald, desoksydert oppløsning av sitronsyre (4,2 g; 0,02 mol) i 15 ml H20 og temperaturen steg kort til 5°C. Etter omrøring i 0,5 timer ved -5°C, ble de faste stoffene samlet ved filtrering og vasket med kald, desoksydert H20. Det svakt grønne produktet ble tørket unde.r vakuum ved romtemperatur over ?2®$ ^ ^ ere dager (1,3 g; 68%); TLC Rf=0,19 (CHCl^EtOH, 9:1); IR (KC1) viste ingen tegn på C=0 absorbsjon.

Analyse; beregnet for C^HgClNO-1/6 H20:

C 61,08; H 4,27; N 7,12

funnet C 61,36; H 4,44; N 6,85.

3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-(p-klorfenyl)pyrrol (18).

Til N2 desoksydert THF (15 ml) ble det tilsatt pyridin (0,65 ml; 0,008 mol), trifluoreddiksyre (1,27 ml; 0,0164 mol), og 3-hydroksy-5-p-klorfenylpyrrol (17) (1,3 g; 0,0065 mol). Oppløsningen ble avkjølt til 0°C til -4°C, og en N2 - desoksydert, avkjølt (0°C til -4°C) oppløsning av N-tosyl-L-alaninylklorid (2,1 g; 0,008 mol) i 15 ml THF ble tilsatt i løpet av 10 minutter. Etter at blandingen var holdt ved 0°C i 1 time, ble en blanding av is og 100 ml IN sitronsyre tilsatt. Denne blandingen ble ekstrahert med etylacetat og ekstraktet ble vasket 1 gang med kald saltvannsopp-løsning, 2 ganger med kald, fortynnet NaHCO^, og en gang med kald saltvannsoppløsning, hvoretter den ble tørket over MgS04 og filtrert. Filtratet ble behandlet med 2g "Darco" og omrørt i 10 minutter, filtrert og deretter ble filtratet konsentrert under vakuum til en rød-brun olje.

En andre behandling med 1,3 g "Darco" ga en lyst rødlig olje. Oljen ble oppløst i toluen;cykloheksan (4:1) og plassert i et kjøleskap over natten. Lyst lakserøde krystaller ble oppnådd. (1,45 g; 53%); smp. 113-5°C.

TLC Rf=+,47 (Et20); IR (KC1) cm"<1> 1740 (C=0, ester); <1>H

NMR (CDC13) 68,4 (br s, 1H), 7,8-7,2 (m, 8H), 6,7 (m, 1H), 6,2 (m, 1H), 5,5 (d, J=9, 1H), 4,2 (p, J=8, 1H), 2,4 (s,

3H), 1,4 (d, 3H); MS (EI, DIP) m/e 418 (M<+>, 2,3%) og 420

(M<+>, 0,8%).

Analyse.; beregnet for C20HigClN2O4S: C 57, 34 ; H 4,57; N 6,69

funnet : C 57,53; H 4,58; N 6,67.

En serie forsøk ble utført for å fremstille forsøksinnret-ninger ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor estersubstrat-ene omtalt ovenfor ble undersøkt med hensyn til følsomhet overfor leukocytter i urin. Innretningene innbefattet en liten firkant av filterpapir som inneholdt analysereagens-ene, papiret var montert på den ene enden av en polystyren-filmstrimmel. Filterpapiret var impregnert med buffer, esteren, en akselerator, og et diazoniumsalt-koblingsmiddel. Hver av innretningene ble funnet å vise en positiv reaksjon på leukocytter i urin.

Eksempel 5.

Forsøksinnretning hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenylpyrrol (4).

Det ble fremstilt en forsøka nnr et ni ng som var følsom overfor nærværet av leukocytter i urin. Innretningen innbefattet en liten firkant av filterpapir montert på den ene enden av en avlang strimmel av polystyrenfilm. Papiret ble impregnert med forskjellige bestanddeler som innbefattet en homogen ester, en akselerator og et diazoniumsalt. En 5,1

cm bred strimmel av "Eaton og Dickman nr. 20 5" filterpapir ble neddykket i en vandig oppløsning som inneholdt følgende:

Papiret ble så tørket i 7 minutter i en "Overly Air Foil" papirtørker ved 80-95°C ved et trykk i luftstrømmen på 2,54 cm ^O. Deretter ble det tørkede papiret neddykket i en acetonoppløsning som inneholdt

Etter denne impregneringen, ble papiret tørket i 10 minutter i en ventilert "Hotpack" ovn ved 55°C. Det ble oppnådd et grå-hvitt forsøkspapir.

Et stykke av det tørkede, impregnerte papiret ble kuttet

til en firkant med sidekant 0,51 cm og montert på den ene enden av en aksialt orientert polystyrenstrimmel med dimen-sjonen 10,2 cm x 0,51 cm. Montering av papiret ble oppnådd ved å benytte dobbeltklebende limbånd.

Eksempel 6.

Forsøksinnretning hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-5-fenyltiofen (9).

Det ble fremstilt en forsøksinnretning som var følsom overfor nærværet av leukocytter i urin, hvor 3-(N-tosyl-L-ala-ninyloksy )-5-fenyltiofen ble benyttet som indikator. Et stykke filterpapir ("Eaton og Dikeman nr. 205" ble neddykket i en vandig første oppløsning som inneholdt følgende:

Det impregnerte papiret ble tørket i en ovn med tvungen luftsirkulering i 30 minutter ved 70°C, hvoretter det ble avkjølt til romtemperatur og impregnert med en andre dyppe-oppløsning som var en acetonoppløsning med følgende innhold:

Det dobbelt impregnerte papiret ble så tørket i en ovn

med tvungen luftsirkulering i 5 minutter ved 50°C.

Det tørkede papiret ble kuttet til firkanter med sidekant 0,51 cm og montert på den ene enden av en polystyrenfilm med dimensjon 0,51 x 8,25 cm. Monteringen ble utført ved å benytte et dobbeltklebende limbånd fra 3M Company. For-søksinnretningen ble lagret i flasker som inneholdt 100 stk., sammen med silikagel og molekylærsikter, for å tilveiebringe tørking.

Eksempel 7.

Forsøksinnretning hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-l-metyl-5-fenylpyrrol (13).

Forsøksinnretningene ble fremstilt ifølge fremgangsmåten

i eksempel 6, hvor esterindikatoren var 3-(N-tosyl-L-alaninyloksy ) -l-metyl-5-f enylpyrrol , og koblingsmidlet var 1-diazonaftalen-4-sulfonat. Den vandige første dyppe-oppløsningen inneholdt:

Før impregnering av filterpapiret, ble oppløsningen titrert med NaOH til en pH på 9,0.

Den andre dyppe-oppløsningen i aceton inneholdt:

1,5% (volum/volum/ dodekanol.

Etter impregneringen i den første vandige dyppeoppløsningen ble papiret tørket i ca. 5 minutter ved ca. 80°C, og etter impregneringen i den andre dyppeoppløsningen på acetonbasis i ca. 5 minutter ved 70°C.

Det tørkede papiret ble montert som beskrevet i eksempel 6.

Eksempel 8.

Forsøksinnretningen hvor esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyl-oksy )-5-(p-klorfenyl)pyrrol (18).

Forsøksinnretninger ble fremstilt som i eksempel 7, bortsett fra at acetonoppløsningen isteden for fenylpyrrolen inneholdt 1,3 mM 3-(N-tosy1-L-alaninyloksy)-5-(p-klorfenyl) pyr roi.

Vurdering av forsøksinnretningene.

Forsøksinnretningene som ble fremstilt i de foregående eksemplene ble underkastet en vurdering vedrørende deres evne til å detektere leukocytter som finnes i urin.

Prøver ble fremstilt fra en normal menneskelig urinprøve.

En prøve tjente som en blindprøve, og leukocytter isolert fra en ny blodprøve ble tilsatt til 2 ekstra urinprøver, slik at man fikk konsentrasjoner på henholdsvis 0,10 og 85 leukocytter/ul.

Forsøksinnretningene ble raskt neddykket i, og fjernet

fra, prøven. To minutter senere ble innretningene observert ved hjelp av et spektrofotometer ved at man målte % reflektans ved forskjellige bølgelengder på 400-700 nm (nano-meter).

Resultatene viser at alle forsøksinnretningene klart demon-strerte observerbare forskjeller i lysreflektans svarende til forskjellige leukocyttnivåer i prøvene. Resultatene er gjengitt i følgende tabell:

Claims (9)

1. Reagens for spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease i en prøve, karakterisert ved at den innbefatter: en ester som har strukturen hvor A er et N-blokkert aminosyreresidu eller et N-blokkert peptidsyreresidu, X er 0, S eller NR', R er aryl eller lavere alkyl, R* er H eller lavere alkyl, og R' er H, lavere alkyl eller aryl; og et egnet bufferstoff, tilsatt i en mengde som gir en pH i området 7 til 10, og eventuelt et diazoniumsalt koblingsmiddel hvor diazonium- saltet fortrinnsvis er et dobbeltion som har strukturen hvor D~ er et anion, G, som kan være like eller forskjellige, er H, lavere alkyl, eller aryl, eller, hvor begge G sammen danner et kondensert ringsystem, og hvor B er H eller OH, og eventuelt en akselerator.;

2. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at X er NR'.;

3. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at A er en N-blokkert aminosyre.;

4. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at A er N-blokkert L-alaninat.;

5. Reagens ifølge krav 1, karakterisert ved at A er N-blokkert L-alaninat, R er fenyl, X er NR', og både R' og R<*> er H.

6. Reagens ifølge krav 1-5, karakterisert ved at akseleratoren er n-dekanol eller dodekanol.

7. Reagens ifølge krav 7 , karakterisert ved at saltet er l-diazo-2-naftol-4-sulfonat.

8. Forsøksinnretning til bestemmelse av tilstedeværelsen av leukocytter, esterase eller protease i en prøve, karakterisert ved at innretningen innbefatter en bærermatriks inkorporert med reagensen fra et hvilket som helst av kravene 1-7.

9. Anvendelse av en forsøksinnretning ifølge krav 8, for påvisning av tilstedeværelsen leukocytter, esterase eller protease i en prøve.