FI85989B

FI85989B - Komposition och anordning foer bestaemning av leukocyter, esteras och proteas i ett prov.

Info

Publication number: FI85989B
Application number: FI851355A
Authority: FI
Inventors: Paul F Corey; James H Pendergrass; A Christopher Skjold; Lonnie Stover
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1984-04-06
Filing date: 1985-04-03
Publication date: 1992-03-13
Also published as: FI851355L; ES8706337A1; DK153585A; ES541870A0; NO164866C; ATE43640T1; IL74635A0; DK153585D0; EP0157326B1; EP0157326A3; FI851355A0; NO164866B; IE850869L; AU4076985A; EP0157326A2; NO851225L; DK160948B; US4657855A; CA1238560A; DE3570696D1

Description

1 85989

Koostumus ja laite leukosyyttien, esteraasien ja proteaa-sien määrittämiseksi näytteestä Tämä keksintö koskee uutta koostumusta ja koelaitet-5 ta, joka on käyttökelpoinen analysoitaessa koenäytteestä analyyttien, kuten leukosyyttisolujen, esteraasin ja prote-aasin läsnäoloa.

Keksintö on erityisen käyttökelpoinen määritettäessä leukosyyttien määrää kehon nesteissä, kuten virtsassa, ja 10 muuttaa sellaisen analyysin laboratoriomenetelmän vaivalloisesta, mikroskooppitutkimusta vaativasta menetelmästä nopeaksi, helpoksi kasta-ja-lue -operaatioksi.

Epänormaalin korkea leukosyyttimäärä potilaan virtsassa osoittaa mahdollisesti sellaisia patologisia tiloja 15 kuten munuaisten tai virtsateiden ja sukuelinkanavan tulehdusta tai muuta toimintahäiriötä. Sen mukaisesti tarkka tieto virtsan leukosyyteistä voi olla tavattoman arvokas keino lääkärille sellaisten tautien diagnoosissa ja hoidossa.

20 Perinteisesti on lääkärien ammattikunta luottanut visuaalisiin määritysmenetelmiin leukosyyttipopulaation laskemiseksi virtsan laskeumassa tai sentrifugoimattomassa virtsassa, menetelmään, joka vaatii kalliin laitteiston, kuten sentrifuugin ja mikroskoopin, sekä kohtuuttomat kus-- 25 tannukset kliinikon osalta. Lisäksi perinteiset menetelmät kärsivät siitä haitasta, että vain vahingoittumattomat solut määritetään. Virtsajärjestelmässä olevat leukosyytit joutuvat olosuhteisiin, jotka voivat edistää laajaa solun liukenemista. Tiedetään esimerkiksi, että virtsoissa, joi-30 den pH on epänormaalin korkea, leukosyyttien puoliintumis-aika voi olla niinkin alhainen kuin 60 minuuttia. Koska liuenneet solut eivät tule määritetyiksi visuaalisessa määritysmenetelmässä, saattaa tulla tulokseksi virheellisen matalia määrityksiä ja vääriä negatiivisia tuloksia.

. 35 Kahdesta mikroskooppisesta leukosyyttien analyysime- 2 85989 netelmästä - virtsan laskeuma ja ei-sentrifugoitu, homogenisoitu virtsa - edellinen on selvästi halutuin. Vaikka luotettavat tulokset voivat suosia jälkimmäistä, virtsan laskeuman tutkimista käytetään valtavassa enemmistössä ta-5 pauksia. Se vaatii sen, että virtsanäyte voidaan sentrifu-goida ja laskeuma eristetään ja tutkitaan mikroskoopissa. Analyytikko laskee sitten näkökentässä olevien leukosyyttien lukumäärän. Tämä tehtävä on vielä monimutkaisempi sen johdosta, että laskeumassa esiintyy muita virtsan kompo-10 nentteja, kuten epiteelisoluja ja suolapartikkeleita. Las keuman ainesosien vaihteleva sisältö liitettynä muihin monimutkaistaviin tekijöihin, mukaanlukien näytteen epähomo-geenisuus ja erilaiset optiset tekijät mikroskooppilait-teesta johtuen, voivat johtaa valtaviin virheisiin lopulli-15 sessa määrityksessä.

Niinpä on ilmeistä, että nopea, helppo leukosyyttien määritysmenetelmä, sellainen, joka voisi eliminoida aikaa kuluttavien menetelmien tarpeen, sekä kustannuksia vaativan laitteen ja joka tarjoaisi käyttöön tarkat reaktiot este-20 raasille, proteaasille tai leukosyyttisoluille, olkoot so lut vahingoittumattomia tai liuenneita, edustaisi todella merkittävää parannusta alan tilanteessa. Tämä keksintö tarjoaa käyttöön sellaisen parannuksen. Lisäksi se perustuu, ei kykyyn nähdä leukosyytit, vaan siihen entsymaattiseen • 25 vaikutukseen, joka niillä on ja on siksi olennaisesti vapaa : yllä kuvatuista epätarkkuuksista.

Ennen tätä keksintöä menetelmät hydrolyyttisten ana-lyyttien määrittämiseksi sisälsivät kromogeenisiä esterei-tä, jotka esteraasilla tai proteaasilla hydrolysoitaessa 30 tuottivat värillisen alkoholituotteen, käsittelemättömän esterin ollessa eri väristä kuin vapaa alkoholi. Monet näistä systeemeistä sisälsivät katalysaattoriyhdisteitä ja : j diatsoniumsuolaa kytkevinä aineina.

Alan aikaisemmassa tutkimuksessa on joukko viittei-35 tä, joissa kuvataan tiettyjen estereiden käyttö, jotka ent- 3 85989 symaattisesti pilkottuna saavat aikaan värin tai muun havaittavan reaktiotuotteen muodostumisen. GB-patentti nro 1 128 371 kuvaa indoksyyli- ja tioindoksyyliestereiden käytön kromogeeneinä määritettäessä hydrolyyttisiä entsyymejä 5 kehon nesteistä. Entsyymit pilkkovat esterin, josta syntyy vapaa indoksyyli, joka sitten hapettuu muodostaen dimeeri-sen indigotuotteen, joka helposti havaitaan sinisestä väristä. Sellaisen vaikutuksen sanotaan johtuvan muiden entsyymien ohella koliiniesteraasista. Tämä patentti kuvaa 10 myös, että esterisubstraatin indoksyyliosan lisäksi happo-radikaali valitaan ottaen erityisesti huomioon määritettävä entsyymi. Esimerkiksi, on mainittu, että happoradikaali voi olla asetaatti, lauraatti tai stearaatti määritettäessä esteraasia tai lipaasia, tässä järjestyksessä. Määritettä-15 essä sellaisia entsyymejä kuin fosfataasi tai sulfataasi asyyliradikaali voi olla epäorgaaninen. Niinpä GB-patentti kuvaa kromogeenisten esterien käytön substraatteina määritettäessä esterolyyttisiä entsyymejä kuten estereitä, jotka sisältävät indoksyylin tai tioindoksyylin esterin alkoholi-20 osana, asyyliosan ollessa räätälöity sopivaksi määritettävälle entsyymille.

Asyyliradikaalin huolellisen valinnan vaikutusta ei missään ole selvemmin esimerkein esitetty kuin kahdessa viitteessä, jotka kuvaavat esteraasin spesifisyyttä este-25 reille, joissa asyyliradikaali käsittää N-suojatun aminohapon tai peptidin. Niinpä Janoff, et.ai., Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 136:1045-1049 (1971) osoittavat, että alaniini-esterit ovat spesifisiä substraatteja esteraasille, joka saadaan ihmisen leukosyyteistä. Erityisesti tässä viittees-30 sä osoitetaan, että ihmisen leukosyyttiraeuute pystyy hydrolysoimaan n-asetyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-alaniini-metyyliesterin. Lisäksi L-alaniini-p-nitrofenyyliesteri hydrolysoitiin samoin, jolloin saatiin keltainen p-nitro-fenolivärimuoto.

.’ . 35 Samoin osoittavat Sweetman et.ai., Jour. His. Soc., 4 85989 22:327-339 1-naftyyli-N-asetyyli-DL-alaniinin, 1-naftyyli-N-asetyyli-L-alanyyli-L-alanyyli-L-alaniinin ja 1-naftyyli-N-butyraatin käytön esteraasin läsnäolon määrittämiseen.

US-patentti nro 4 278 763, Boehringer Mannheim GmbH, 5 yhdistää nämä esitykset ja päätyy aminohappojen tai peptidien indoksyyli- tai tioindoksyyliestereihin vielä eräänä esimerkkinä perinteisestä värinmuodostussubstraatista leu-kosyyttiesteraasiaktiivisuuden määrityksessä. Samoin kuin Janoffin ja Sweetmanin viitteissä osoittaa Boehringerin 10 patentti proteaasin ja esteraasin ekvivalenttisuuden niiden esterolyyttisessä vaikutuksessa.

Tiedetään, että esterin hydrolyysireaktioita voidaan aktivoida monien nukleofiilisten aineiden läsnäololla, mukaanluettuna lukemattomat alkoholit. Niinpä esteraasin ai-15 heuttaman fenyyliasetaatin ja p-nitrofenyyliasetaatin hyd-rolyysinopeus nousee 2,5 - 5,5 -kertaiseksi lisäämällä metanolia tai butanolia. Greenzaid and Jencks, Biochemistry, 10(7), 1210-1222 (1971). Lisäksi vaikutus kasvaa n-alkyyliryhmän pituuden kasvaessa. Wynne and Shalatin, Eur. 20 J. Biochem., 31:554-560 (1972).

Erityisesti tämä alkoholien aktivoiva vaikutus on havaittu aminohappojen estereillä. p-nitrofenyyli-N-asetyy-li-L-alaninaatti-hydrolyysiä aktivoidaan (kiihdytetään) metanolin läsnäololla. Fastrez and Fersht, Biochemistry 25 12(11), 2025-2034 (1973). Suurimolekyylipainoiset alkoho lit nostavat esteraasin aiheuttamaa p-nitrofenyyli-t-BOC-L-tyrosinaatin hydrolyysiä. Ashe and Zimmer, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 75(1), 194-199 (1977). US-patentti nro 4 299 917 kuvaa muita tunnettuja esterihydrolyysin ak-30 tivoijia kuten tiettyjä metallikomplekseja, pyridiinijoh-dannaisia ja imidatsoleita.

Tunnettua on myös tiettyjen diatsoniumsuolojen käyt-tö sitomaan fenoleita ja pseudofenoleita atsovärien tuottamiseksi. Martinet and Dornier Compt. Rend., 170, 592 35 (1920). Sellaista tekniikkaa käytetään esteraasianalyysis- 5 85989 sä, jossa indoksyyliesterit hydrolysoidaan esteraasin avulla indoksyylin valmistamiseksi, joka sitten vuorostaan liitetään diatsoniumsuolan kanssa muodostamaan vastaava atso-väri. Holt and Hicks, J. Cell Biol. 29, 261-366 (1966); 5 Gossrau, Histochemistry, 57, 323-342 (1978); West German Offenlegungsschrift nro 30 17 721, kirjattu 9. toukokuuta 1980.

Yhteenvetona teknisestä taustasta, joka johtaa tähän keksintöön, tunnetaan useita menetelmiä hydrolyyttisten 10 entsyymien ja leukosyyttisolujen määrittämiseksi liuoksessa. Leukosyyttipopulaatioiden mittaamiseksi esimerkiksi virtsassa on mikroskooppi kauan ollut edullinen menetelmä. Niinpä vaadittiin suorittajaa tekemään mikroskooppiin sopivia objektilaseja virtsanäytteestä ja laskemaan leukosyyt-15 tisolujen lukumäärän mikroskoopin näkökentässä; menetelmä, joka vaatii kohtuuttomat aikakustannukset ja kalliin laitteen, kuten mikroskooppi ja sentrifuugi.

Kemialliset ja biokemialliset menetelmät ovat nopeasti asettaneet mikroskoopin kyseenalaiseksi leukosyyt-20 tien analysoinnissa diagnostiikassa ja ovat aikaa säästäviä keinoja tutkimuslaboratoriossa. Kromogeeniset esterit, jotka ovat muodostaneet kemiallisten kokeiden keskeisen osan, sisältävät seuraavat alkoholi- ja asyyliosat: 25 Alkoholi (fenoli )osat Asvvlirvhmät indoksyyli asetaatti tioindoksyyli butyraatti p-nitrofenyyli lauraatti α-naftoli stearaatti 30 aminohappo peptidi

Sellaisia estereitä hyväksi käyttäviä kemiallisia : : : menetelmiä on kiihdytetty erilaisilla hydrolyysikatalysaat- - 35 toreilla sekädiatsoniumsuola-kytkentöaineilla. Katalysaat- 6 85989 toreina on käytetty monia alkanoleja sekä tiettyjä metalli-komplekseja, pyridiinijohdannaisia ja imidatsoleja. Diatso-niumkationit, joissa on sopivat anionit ionisesti sitoutuneena tai niihin liittyneinä, ovat hyvin tunnettuja kytke-5 vinä aineina sellaisiin kemiallisiin menetelmiin, joissa esterin hydrolyysissä muodostunut alkoholi (fenoli) liitetään yhteen diatsoniumsuolan kanssa muodostamaan atsoväri.

Tämä keksintö koskee uutta koekoostumusta ja -laitetta leukosyyttien, esteraasin tai proteaasin läsnäolon 10 määrittämiseksi koenäytteestä. Koostumukselle on tunnusomaista, että se sisältää esterin, jonka rakenne on xr jossa A on N-suojattu aminohappojäännös tai N-suojattu pep-tidijäännös, kuten N-tosyyli-L-alaninyyli, X on S tai NR’, 20 jossa R' on H tai alempi alkyyli, R on substituoitu tai substituoimaton fenyyli, R* on H tai alempi alkyyli; ja puskurialneen, jonka pH on ainakin noin 7.

Koostumus voi myös sisältää katalysaattorin (kuten alkanoyyli, jossa on 1 - 15 hiiliatomia) ja/tai diatsonium-25 suolan kytkevänä aineena.

Koelaite käsittää kantajamatriisin liitettynä esteriin ja puskuriin, ja voi lisäksi sisältää katalysaattorin ja/tai kytkevän aineen.

. . Menetelmä koostumuksen tai laitteen käyttämiseksi 30 käsittää leukosyyttisoluja, esteraasia tai proteaasia sisältäväksi epäillyn koenäytteen saattamisen kosketuksiin koostumuksen tai koelaitteen kanssa ja havaittavan reaktion Vtoteamisen.

Tietyt tässä esityksessä käytetyt termit tulee tässä 35 tapauksessa mainita sen varmistamiseksi, että lukija on 7 65989 tietoinen niiden kulloisestakin merkityksestä. Niinpä seu-raavat määritelmät annetaan selvittämään tämän keksinnön suojapiiriä, ja mahdollistamaan sen toteuttamisen ja käytön.

5 Ilmaisut "N-suojattu aminohappojäännös" ja "N-suo- jattu peptidijäännös" vaativat määritelmän kahdessa merkityksessä. "N-suojattu" viittaa aminohapon tai peptidin amiiniryhmän kemiaan, jossa typpiatomiin sitoutunut vety korvataan suojaryhmällä kuten asetyylillä, p-tolueenisul-10 fonyylillä (tosyyli), tert-butyylioksikarbonyylillä (t-BOC) ja muilla N-suojaryhmillä, joita alalla tunnetaan.

Termeillä "aminohappojäännös" ja "peptidijäännös" tarkoitetaan aminohappo- tai peptidimolekyyliä ilman sen karboksyyliryhmän OH:ta.

15 Ilmaisulla "aryyli" tarkoitetaan mitä tahansa ren- gassysteemiä, joka on aromaattinen. Termiin kuuluvat sellaiset 5- ja 6-jäseniset renkaat kuten pyrroli, fenyyli ja pyridyyli, sekä kondensoidut rengassysteemit kuten naf-tyyli. Niinpä aromaattinen rengassysteemi voi olla hete-20 rosyklinen tai homosyklinen, ja voi olla substituoitu tai substituoimaton sillä edellytyksellä, että substituentti-ryhmä(t) eivät ole ristiriidassa koostumuksen kyvyn kanssa hydrolysoitua leukosyyttisolujen, esteraasin tai proteaasin läsnäollessa. Sellaisten substituenttien valinta on labora-·*: 25 torion rutiinimääritys, kun tunnetaan tämä julkaisu.

Ilmaus "alempi alkyyli" tässä julkaisussa käytettynä on alkyyliosa, joka sisältää noin 1-6 hiiliatomia. Alemman alkyylin merkitykseen sisältyvät metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, n-butyyli, sek.-butyyli, tert.-bu-30 tyyli ja kaikki pentyylin ja heksyylin isomeerit. Nämä voivat olla substituoimattomia tai ne voivat olla substituoi-tuja sillä edellytyksellä, että eivät ole ristiriidassa koostumuksen tai koelaitteen kyvyn kanssa havaita leuko-: syyttisoluja, esteraasia tai proteaasia.

: 35 8 65989 "Sopivalla puskuriaineella" tarkoitetaan puskuria, joka koenäytteen liuoksen kanssa kosketuksiin saatettaessa antaa tulokseksi pH:n, joka on ainakin noin 7. Edullisesti puskuri on sellainen, joka pystyy tuottamaan pH:n alueella 5 noin 7 - 10 ja optimaalisesti 8,5 - 9,0. Boorihappo-NaOH, bisiini (N,N-bis[2-hydroksietyyli]-glysiini, tai CHES(2-[N-sykloheksyyliamino]etaanisulfonihappo) ovat esimerkkejä sopivista puskuriaineista.

Ilmaus "katalysaattori" koskee mitä hyvänsä yhdis-10 tettä, joka auttaa nostamaan tässä kuvattujen kromogeenis-ten esterien hydrolyysinopeutta. Sellaisia ovat kemiallisesti vaihtelevat aineet kuten pyridiini, imidatsoli ja niiden johdannaiset; metallikompleksit, joilla on kaava Dm[B(CN)n(NO)p], jossa D on alkalimetalli, B on raskasme-15 talli-ioni, P on 0 tai 1, m on 2 - 5, n on 4 - 8 ja m on n:n ja B:n valenssin summa; ja alkoholit. Sopivilla alkoholeilla on 1 - noin 15 hiiliatomia. Lineaariset alkoholit ovat edullisempia kuin haarautuneet alkoholit, vaikka jälkimmäiset sisältyvät keksinnön alueeseen.

20 "KondensoiduIIa rengassysteemillä” tarkoitetaan kahta tai useampaa aromaattista rengasta, jotka jakavat hiiliatomiparin. Esimerkiksi rakenteessa NZ + 25 0—D- tm molemmat G:t voivat yhdessä muodostaa kondensoidun rengas-:-·· systeemin ^ + s30 S03~ jossa molemmat G:t yhdessä muodostavat 4CH>4:n. Toinen esi-35 merkki on 9 85989

X

(ΘΐοΓ αν) 5 S03 jossa molemmat G:t yhdessä muodostavat 4CH*CH-CH*N>:n. Kondensoitu rengassysteemi on siten polynukleaarinen, aromaattinen ja voi olla heterosyklinen tai homosyklinen.

Ilmaus "havaittava reaktio" on tässä tarkoitettu 10 merkitsemään muutosta parametrissä tai sen ilmaantumista koementelmäsysteemissä, joka pystytään havaitsemaan, joko suoralla havainnolla tai laitteella mittaamalla; ja joka on koenäytteessä olevan spesifisen analyytin läsnäolon funktio. Eräitä havaittavia reaktioita ovat muutos värissä tai 15 sen ilmaantuminen, fluoresenssi, reflektanssi, pH, kemilu-minensenssi ja infrapunaspektrit.

Keksinnön mukainen koostumus käsittää esterin ja puskurin. Vaikkakin näitä ainesosia valittaessa on suuri liikkumisvara, kustakin on olemassa edullisia toteutusmuo-20 toja, joilla saavutetaan maksimoituja tuloksia, s.o. erittäin hyvin havaittava reaktio kehittyy lyhyessä ajassa. Tätä optimointia voidaan vielä edistää liittämällä koostumukseen katalysaattori ja/tai diatsoniumsuola.

Sekä keksinnön mukaisessa koostumuksessa että koe-: 25 laitteessa on kaavan I mukainen esteri ja sopiva puskuri.

: Edullinen esteri on sellainen, jossa X on NR' ja edullinen R'-substituentti on H. Toinen edullinen suoritusmuoto on sellainen, jossa asyyliosa A on N-suojattu aminohappojäännös, erityisesti N-suojattu-L-alaninaatti. Erityisen edul-30 lista on käyttää esterinä yhdistettä 0

II

_JD—C — CH CH_ Λ0 A ‘ O;!» (OTi " " 10 85989 jossa Ts on p-tolueenisulfonyyli, s.o. yhdiste I, jossa A on N-Ts-L-alaninaatti, R* on H, R on fenyyli ja X on NH.

Kuten edellä on mainittu, puskuriaineessa voi olla paljon yhdisteitä. Edullinen pH-alue, joka puskurin on tar-5 koitus aikaansaada, on noin 7-10, jolloin 8,5 - 9,0 on optimi-pH-alue. Tämän optimi-pH-alueen saavuttamiseksi on nykyään edullista käyttää boorihappo-NaOH:ta, bisiiniä (N,N-bis[2-hydroksietyyli]glysiiniä tai CHES(2-[N-syklohek-syyliamino]etaanisulfonihappoa) puskurina.

10 Keksinnön mukainen koostumus voi esterin ja puskurin lisäksi sisältää erilaisia katalysaattoreita, kuten aikaisemmin on määritelty. Alkoholien on havaittu olevan erityisen käyttökelpoisia nostamaan esteraasin ja proteaasin katalysoimaa estereiden hydrolyysiä, josta tässä on puhuttu.

15 Alkoholit, joissa on 8 - 15 hiiliatomia, ovat edullisia tähän tarkoitukseen, kun taas dekanoli, undekanoli ja dode-kanoli ovat edullisia käytettäväksi koelaitteen kanssa, ensisijaisesti sen takia, että niillä on alhaisempi haihtu-vuus verrattuna alkoholeihin, joilla on matalampi molekyy-20 lipaino.

Koostumus voi sisältää myös diatsoniumsuolan kytkevänä aineena. Diatsoniumsuolan osallistuminen kokonaisreak-tioyhtälöön voidaan esittää seuraavasti: ··' : 25 Ά if° A analyytti ^ R -f° rAxJ> h2) ^ -AXJ * >·-·* ·*·*· p * n

: ; -1-f RA_^OH

Jl J + Ar-N+ = N—* j l| (VI) ! :*: R^X ^ k'*'N^Si-N-Ar A ! 30 jossa ArN+«N on diatsoniumsuola, ja A, R, R* ja X ovat . . edellä määriteltyjä. Reaktiotuote VI on atsoväri, joka voi olla syvän, selvästi erottuvan värinen.

Suola ArN*-N voi sisältää valtavasti eri merkityk-35 siä. Yleensä se on aromaattinen diatsoniumsuola ja sillä on seuraava yleinen rakenne: n 85989 R" D"n. ^em - (VI!)

KJ I D

5 R" ' R" jossa R,f, sama tai erilainen, on H, alempi alkyyli tai aryyli, tai jossa kaksi vierekkäistä R’’:a yhdessä muodostavat kondensoidun rengassysteemin sillä ehdolla, että yksi 10 R'':sta on -N*=N, s.o. diatsonium. Y on N tai CR'' . D' on anioni kuten kloridi, bromidi tai muu sopiva vastaioni diatsoniumosalle.

Diatsoniumsuola, joka on itsenäinen, s.o. kahtaisio-ni, toimii erinomaisena kytkevänä aineena. Sellaisilla yh-15 disteillä on rakenne

V

D* (Vili)

20 G

jossa B on H, alempi alkyyli tai OH; D' on kovalenttisesti sitoutunut anioni; G, sama tai erilainen, on H, alempi alkyyli tai aryyli, tai jossa molemmat G:t yhdessä muodostavat kondensoidun rengassysteemin.

: 25 Niinpä kahtaisioni on diatsoniumsuolan laji, jossa vastaioni diatsoniumryhmälle on kovalenttisesti sitoutunut rengassysteemiin. Esimerkkejä sellaisista anioneista ovat sulfonyyli (S03"), karbonyyli (C02‘), fosfonyyli (P03") ja muut. On havaittu edullisimmaksi käyttää l-diatso-2-nafto-. . 30 li-4-sulfonaattia.

Yllä kuvattua koostumusta voidaan käyttää yksinään . . leukosyyttien, esteraasin tai proteaasin määrittämiseen, tai se voidaan liittää yhteen kantajamatriisin kanssa muodostamaan koelaitteen, jolloin se tarjoaa käyttöön keinon 35 nopeaan, luotettavaan analyytin läsnäolon arviointiin. Kan- i2 85989 tajamatriisi on tavallisesti, mutta ei välttämättä, huokoinen aine, kuten suodatinpaperi. Muita alalla tunnettuja kantajamatriisin materiaalimuotoja ovat huopa, huokoiset keraamiset suikaleet ja kudotut tai ei-kudotut lasikuidut 5 (US-patentti nro 3 846 247). On myös esitetty puun, kankaan, sieniaineen ja savimaisten aineiden käyttöä (US-patentti nro 3 552 928). Vaihtoehtoisesti kantajamatriisi voi olla huokoseton, kuten erilaiset polymeerikelmut, lasi ja vastaavat. Kaikki sellaiset kantajamateriaalit ovat mahdol-10 lisiä käytettäviksi tässä keksinnössä, kuten ovat muutkin. On havaittu, että suodatinpaperi on erityisen sopivaa.

Edullisessa menetelmässä laitteen valmistamisessa palanen suodatinpaperia kostutetaan puskurin vesiliuoksella. Ensimmäiseen kastamiseen tarkoitettu liuos voi myös si-15 sältää erilaisia valmistusaineita, kuten pinta-aktiivisen aineen, liistausaineen, kuten polyvinyylipyrrolidonin, ja muita inerttejä aineosia.

Kyllästetty suodatinpaperi kuivataan sitten ja kostutetaan toiseen kastamiseen tarkoitetulla liuoksella, ase-20 tonissa tai muussa vedettömässä liuottimessa, joka sisältää esterin ja haluttaessa katalysaattorin ja/tai diatsonium-suolan. Kahdesti kyllästetty paperi kuivataan sitten toisen kerran ja näin muodostuu koelaite, joka on herkkä leukosyyttien tai muiden analyyttien läsnäololle.

: 25 Kuivattu, reagenssia sisältävä kantajamatriisi voi olla kiinnitetty taustamateriaaliin haluttaessa. Koelaitteen edullisessa toteutusmuodossa suodatinpaperikantaj amat-riisi on yhdistetty koostumuksen kanssa, kuten edellä on kuvattu, matriisin ollessa kiinnitetty yhdeltä sivulta pit-30 känomaiseen palaseen läpinäkyvää polystyreenikalvoa. Matriisi kiinnitetään kalvoon millä tahansa sopivalla keinol-^ . la, kuten kaksipuolisella teipillä (Double Sticl^, saata- vissa 3M-yhtiöstä), toisen polystyreenikalvon pään toimiessa kahvana. Käytettäessä tällaista laitetta pidetään taus-35 ta-aineena olevan polystyreenikalvon vapaasta päästä ja 13 85989 matriisipää upotetaan koenäytteeseen (esim. virtsa) ja poistetaan nopeasti. Värinmuodostus tai muu havaittava reaktio havaitaan ennaltamäärätyn ajan kuluttua ja sitä verrataan vertailustandardiin, joka vastaa reaktioita tun-5 netuilla leukosyyttien tai muiden esteraasi- tai proteaasi-aktiivisuutta omaavien analyyttien konsentraatioita. On havaittu, että noin 1-3 minuutin inkubaatio on tavallisesti riittävä mahdollistamaan värin kehittymisen ilmeneminen reagenssia sisältävässä suodatinpaperissa.

10 Seuraavat esimerkit annetaan lukijan edelleen autta miseksi tämän keksinnön toteutuksessa ja käyttämisessä. Edulliset toteutusmuodot kuvataan siis kokeellisina yksityiskohtina ja analysoidaan tuloksien suhteen. Esimerkit on tarkoitettu vain valaiseviksi, eikä niiden ole millään ta- 15 voin tarkoitus rajoittaa tässä kuvatun ja oikeuksia vaaditun keksinnön aluetta.

Seuraavassa kokeellisen osan kuvauksessa on käytetty annettuja lyhenteitä: g = gramma 20 kg = kilogramma L = litra mL = millilitra M = moolinen mM - millimoolinen : 25 N 1 normaalinen eq = ekvivalenttia mol = kaavan grammamolekyylit (moolia) mmol - kaavan grammamolekyylit x 10‘3 (millimoolia) aq = vesiliuos - 30 hr = tuntia TLC = ohutkerroskromatografia

Infrapunaspektrit (IR) saatiin Perkin-Elmerin Model 710B tai 237 - infrapunaspektrofotometrillä liuoksina • ‘ ; 35 CHCl3:ssa, ellei toisin ole huomautettu; polystyreenikalvon · · 85989 vyöhykettä 1602 cm-1 käytettiin ulkoisena kalibrointistan-dardina. Signaalit on annettu cm'1:ssa.

Protonimagneettiset resonanssispektrit (LH NMR) saatiin 89,55 MHz:llä käyttäen JEOL FX-900 -spektrometriä tai 5 60 MHz:llä käyttäen Varian T-60 -spektrometriä; spektrit saatiin CDC13-liuoksessa, ellei toisin ole huomautettu. Kemialliset siirtymät ilmoitetaan miljoonasosissa sisäisestä standardista tetrametyylisilaanista alaspäin.

Hiili-13-magneettiset resonanssispektrit (13C NMR) 10 saatiin 22,5 MHzrllä käyttäen JEOL FX900 -spektrometriä

Fourier-muunnoksella ja täydellisellä protonin leveän vyöhykkeen kohinan dekoplauksella; spektrit saatiin CDC13-liuoksessa, ellei ole toisin huomautettu. Hiilen siirtymät ilmoitetaan miljoonasosissa sisäisen standardin tetrametyy-15 lisilaanin alapuolelta.

Massaspektrit (MS) saatiin Hewlett-Packard 598A-spektrometrillä toimimalla joko elektronitörmäyksellä (El) tai nopean atomin pommituksella (FAB). Korkeaerotuskykyiset massaspektrit saatiin AEI MS-902 -spektrometrillä.

20 Orgaaniset reagenssit saatiin Aldrich Chemical Com panyltä ja käytettiin puhdistamatta, ellei toisin ole ilmoitettu. Epäorgaaniset reagenssit olivat ACS-reagenssilaa-tua Fisher Scientific Companyltä tai muulta suurelta myyjältä. Reaktioliuottimet olivat ACS-reagenssilaatua; tetra-·· : 25 hydrofuraani (THF) oli HPLC-laatua J.T. Baker Chemical Companyltä. Suolaliuos viittaa kyllästettyyn natriumkloridin vesiliuokseen.

Ohutkerroskromatografia (TLC) suoritettiin käyttäen silikageeli 60F-254-levyjä E. Merckiltä. Pylväskromatogra-- 30 fia suoritettiin käyttäen E. Merckin Silica Gel 60:ä (70 - 230 meshiä). Kaikki ilmoitetut sulamispisteet ja kiehumispisteet ovat korjaamattomia.

Seuraavat kokeet suoritettiin tämän keksinnön esterin synteesin valaisemiseksi. Koska nämä kokeet koskevat : 35 tiettyjä lähtöaineita ja lopputuotteita, uskotaan menetel- is <55989 mien olevan käyttökelpoisia laajalla ainealueella mukaanluettuna tässä julkaistujen esterien yleisluokka.

3- (N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolin synteesi (4) 5 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolin synteesiä valaistaan seuraavassa reaktiokaaviossa:

COOH ^COOH

- cr ö>

KOH/EtCH

15 ✓coo" K*

m - + Glysiini ÖJ

m Λ=τν >'co°K K0H’

2H 0 .0» QT

20 2 Sh^cooV ^

Ac20

Pyridiini 12Cf C

N/ . 25

_/OH

i—r°~AC I ]T

^ JL j) 1) Na0H,Me0H/H-0 ^ r^\r^N ———> K ] h - (2) Lv )J I °°c 30 ^ ac 2) h3o+ ♦ * il 0 0-C-CH-CH. |l f41 S jj N %_I5i_ ci-c-ch-ch3

- -- /V /k WI s y Ny N

fT^Vf V H Ts Pyridiini · TFA / \ K)J H 0° C H Ts 16 85989 N-tosyyli-L-alaniini L-alaniini (100 g; 1,11 moolia) liuotettiin 2,25 Iraan 1 N natriumhydroksidia (aq), jäähdytettiin 5°C:een ja sekoitettiin samalla kun p-tolueenisulfonyylikloridin 5 liuos (218 g; 1,11 moolia) liuotettuna 450 mlraan tolueenia lisättiin hitaasti. Seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 20 h. Kerrokset erotettiin ja jäähdytetty vesikerros tehtiin happamaksi pHrhon 1 konsentroidulla vetykloridihapol-la. Otsikon yhdiste valkoisena kiinteänä aineena kerättiin 10 suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin. Saanto 178,5 g (66 %), sp. 134-5°C. IR (CHCl3) cm"1 1726, 1340, 1165, 1095; 1H NMR (DMSO-Dg)J 1,20 (d,J = 7,3H), 2,40 (s,3H), 3,85 (p, J = 8,1 H) , 6,4 (br, s, 1H) (C02H) , 7,41 (d,/JAB7 = 8, 2H) ja 7,75 (d,/JAB7=8,2H) ./näytteen keskus: 7,58 VAB=20,49 15 Hz/, 8,03 (br d,J = 8,1 H) (NH).

N-tosyyli-L-alaninyylikloridi Menetelmä A

N-tosyyli-L-alaniinin (12,4 g; 0,05 mol) ja tionyy- likloridin (25 ml) seosta kuumennettiin 90 minuuttia 55°C:ssa, 20 ja konsentroitiin sitten pyörivässä haihduttajassa 40°C:ssa.

Punainen kiinteä jäännös liuotettiin 200 mlraan kiehuvaa (R) CCl^ , väri poistettiin 20 g :11a uunikuivattua ΝθΓίυ^211 (American Norit Co., Inc.), suodatettiin ja jäähdytettiin. Kerman värisenä kiinteänä aineena otsikon tuote kerättiin '.· ; 25 suodattamalla, pestiin heksaanilla ja kuivattiin. Saanto : 8,48 g (65 %) , sp. 101-101,5°C. IR (CHCl3) cm"1 3360 , 3260, :***: 3025, 1 775, 1605, 1 350, 1 170, 910; 1H NMR (CDC13) £ 1 ,48 (d, J = 7,3H) , 2,43 (s, 3H) , 4,33 (p,J = 8,lH), 5,93 (br d, : J = 8,1 H) (NH) , 7,31 <d,£JAB7=8, 2H) ja 7,76 (d,/1^=8,2H) 30 /näytteen keskus: 7,53 ; Δ νΑΒ=26,83Ηζ7·

Anal. lask. C1 H12C1N03S: lie: C, 45,89; H, 4,62; N, 5,35 . . Saatu: C, 46,63; H, 4,90; N, 5,19

Menetelmä B

\ N-tosyyli-L-alaniinin (3,1 g; 13 mmol) ja tionyyli- • · o :/.: 35 kloridin (6 ml) seosta kuumennettiin 90 min. 50 C:ssa, lai- mennettiin sitten 50 ml :11a heksaania. Seosta sekoitettiin nopeasti, jäähdytettiin ja kiinteä tuote suodatettiin.

i7 85989

Saanto 3,15 g (93 %) sp. 99-100°C. IR-spektri oli identtinen menetelmällä A valmistetun, uudelleenkiteytetyn tuotteen kanssa.

2-hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)hydrokanelihapon 5 dikalsiumsuolan dihydraatti (1)

Sekoitettu liete, jossa oli 1,0 kg trans-kanelihappoa (6,75 mol) 4,5 l:ssa asetonia, käsiteltiin ensin NaHCO^tlla (2,47 kg; 29,4 mol; 4,36 ekv.), sitten varovasti vedellä (4,5 1). Saatu paksu seos käsiteltiin pisaroittain, 1,5 - 10 2,0 tunnin aikana, OXONE^ (Dupont Co.) monosulfaattiyhdis-

teen liuoksella (3,78 kg sisältää 1,825 ekv. KHSO^) 0,4 mM

dinatriumetyleenidiamiinitetraetikkahapon vesiliuoksessa (EDTA) (14,5 1; valmistettu liuottamalla 2,17 g dinatrium 1 2 EDTA-dihydraattia 14,5 l:aan tislattua vettä). ' Tämän 15 lisäyksen aikana reaktiolämpötila pidettiin 24-27°C:ssa käyttäen vesihaudetta; reaktion pH:n huomattiin olevan 7,4.

Kun kaikki oli lisätty, seosta sekoitettiin vielä 0,5 tuntia, jäähdytettiin sitten noin 10°C:een. Reaktio tehtiin happamaksi kons. HCl:llä (^1,2 1) pH:hon 2 samalla kun lämpötila pidet-2® tiin 10°C:een vaiheilla, ja sitten käsiteltiin ^20^:11¾ (5,05 1) ja sekoitettiin kiivaasti 10 minuuttia.

Kun seoksen oli annettu asettua, vesikerros dekantoi-tiin pois ja orgaaninen kerros, joka sisälsi liukenemattomia suoloja, suodatettiin paperin läpi imun avulla. Suodatetut . 2^ kiinteät aineet pestiin C^C^slla (1,9 1) ja vesikerros uu- ; .·. tettiin tällä suodoksella. Suodatetut kiinteät aineet pes- ··- tiin taas CH2Cl2:lla (3,15 1) ja vesikerros uutettiin täl lä suodoksella. Yhdistetyt CH2Cl2_kerrokset uutettiin liuoksella, jossa oli KOH (593,3 g) vedessä (6,31 1) - lievä läm- : 30 1 35 J.O. Edwards, et ai. Photochem. Photobiol. 30, 63 (1979) V·; 2 R· Corci, et ai. J. Org. Chem. 45, 4758 (1 980).

18 85989 niittäminen n. 40°C:een vaaditaan usein kiinteän aineen liuottamiseksi, joka voi erottua emäsuuton aikana. CH2Cl2-kerros uutettiin sitten KOH:n (99 g) liuoksella vedessä (1,5 1) ja yhdistetyt emäsuutteet käsiteltiin glysiinillä (481,7 g; 5 6,416 mol; 0,95 ekv.); orgaaninen kerros heitettiin pois.

Liuoksen pH säädettiin 11,5:ksi 25 % KOH-vesiliuoksel-la ja kuumennettiin sitten kiehuvaksi. Noin 900 ml matalalla kiehuvaa nestettä (asetoni ja vesi) tislattiin pois ennen kuin höyryn lämpötila saavutti 99°C, jonka jälkeen seosta 10 palautusjäähdytettiin 2 tuntia. Jäähdytyksen jälkeen reaktio- seos uutettiin Cl^Cl^lla (3,15 1), CH2Cl2-faasi heitettiin pois ja vesifaasi haihdutettiin kuiviin alipaineessa 70uC:een hauteessa. Jäännöstä keitettiin 95 % EtOH:ssa (8,83 1) 30 minuuttia, annettiin sitten jäähtyä hitaasti sekoittaen, jol-15 loin tuote erottui hienoina kiteinä. Nämä suodatettiin, pes tiin tuoreella 95 % EtOH:lla (1,26 1) ja kuivattiin 50-60°C:ssa uunissa, jolloin saatiin otsikon yhdiste (1 ,77 kg; 74,6 %) valkoisina kiteinä, joiden sp. oli 120-2°C (korjaamaton).

IR (KBr) cm"1 3420 (br.), 1590 (br.), 1410, 1130, 710; 1H NMR 20 (D20-TSP) 3,1 (s, 2H) , 3,89 (d,/J^/ =4 ,1 H) ja 4,52 (d,/JAB/ = 4,1 H) (näytteen keskus 4,21;Δ VAB = 18,83 Hz.), 4,68 (s, 6H, vaihdettavat protonit), 7,4 (s, 5H); TLC Rf = 0,59 (EtOH:1M trietyyliammoniumbikarbonaatti, 7:3).

Anal. Lask. ^5N07K2:lie: C, 37,59; H, 4,30; N, 3,99 . 25 Saatu: C, 37,22; H, 4,24; N, 3,96 . N-asetyyli-3-asetoksi-5-fenyylipyrroli (2)

Suspensiota, jossa oli 2-hydroksi-3-(karboksimetyyli- • ·. amino)hydrokanelihapon dikaliumsuolan dihydraattia (1) (1,0 kg; 2,84 mol) pyridiinissä (3,0 1), käsiteltiin etikkahapon anhyd- : 30 ridillä (4,0 1) ympäristön lämpötilassa inerttikaasuilmakehäs- sä. Lievä eksoterminen reaktio tapahtui ja reaktiolämpötila nousi eksponentiaalisesti 60-70°C:een 1,5 - 2,5 tunnin aikana.

:/·! Heti kun reaktio alkoi jäähtyä, seosta kuumennettiin 120 ~ ··1 o : : : 123 C:een 15 minuutiksi, annettiin sitten jäähtyä ympäristön . 35 lämpötilaan 1 tunnin aikana, jona aikana pyridiniumasetaatti erottui kiteinä. Seos suodatettiin paperin läpi imun avulla ja suolat pestiin EtOAc:llä kunnes olivat värittömiä; suodos i9 85989 haihdutettiin kuiviin vakuumissa.

Tumman punainen jäännös liuotettiin EtOACren (3,0 1), pestiin kolmesti vedellä (1,0 1) kerrallaan), kuivattiin

MgSO^rn yllä ja käsiteltiin DarcJ^-G60 (ICI Americas, Inc.) 5 (300 g:lla). Kun oli sekoitettu 30 minuuttia, seos suodatet- © tiin Celite :n läpi (Johns-Manville) ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin punertavan oranssia öljyä. Tämä öljy liuotettiin lämpimään 2-propanoliin (1,2 1), annettiin sitten jäähtyä hitaasti ympäristön lämpötilaan yön yli, jolloin kiinteä aine erottui. Kiteinen tuote suodatettiin, pestiin 50 % 2-propanolin vesiliuoksella, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin otsikon yhdiste (417 g; 60 %) sp. = 58 -60°c (korjaamaton). Erä siirrettiin Et20:hon, käsiteltiin Norit 211:llä, suodatettiin ja konsentroitiin alipainees-1® sa; seistessä 0°C:ssa erottui pieniä neuloja. Nämä suodatet tiin, pestiin Et20/heksaanilla (1:1) ja vakuumikuivattiin, jolloin saatiin analyyttinen näyte, jonka sp. oli 60-62,5°C (korjaamaton).

IR (CHC13) cm-1 3020, 1760, 1730, 1595, 1378, 1320, 1220 20 (br.), 1030, 960, 903; 1H NMR (CDC13)& 2,23 (s, 3H) , 2,27 (s, 3H), 6,18 (d, J = 2, 1 H), 7,35 (s, 5H) , 7,42 (d, J=2, 1H); TLC Rf = 0,56 (tolueenidioksaani, 4:1).

Anal. Lask. C1 ^ 3NC>3: lie: C, 69,12; H, 5,38; N, 5,76

Saatu: C, 68,88; H, 5,25; N, 5,53 25 • 3-hydroksi-5-fenyylipyrroli (3) : .·. Hienojakoisesta erästä N-asetyyli-3-asetoksi-5-fenyy- lipyrrolia (2) (36,8 g; 0,15 mol) poistettiin happi sekoittamalla virtaavassa argonvirrassa 10 minuuttia, suspendoi-. . tiin sitten deoksygenoidussa MeOH:ssa (379 ml), jäähdytet- - ^ tiin -6°C:een (-15°C:isessa metanoli (MeOH)/kuiva jää -hau- teessä) inerttikaasuilmakehässä ja käsiteltiin nopeasti jääkylmällä 2N NaOH:n deoksygenoidulla liuoksella (300 ml). Reaktiolämpötila nousi välittömästi emäslisäyksen aikana : : : 18°C:een, ja ^3 minuutin kuluttua reaktioseos tuli homogee- 35 : niseksi. Kun reaktioseosta jäähdytettiin, yhdiste (3) erot- tui hienoina kiteinä. 15 minuutin kuluttua lisättiin kylmä 2M deoksygenoitu sitruunahappoliuos (150 ml), saatua seosta 1 · « · • · · i 20 85989 sekoitettiin 10 minuuttia, ja suodatettiin sitten. Kiinteä aine pestiin kauttaaltaan deoksygenoidulla vedellä (200 ml), huolehtien siitä, että tuote joutui mahdollisimman vähän ilmalle alttiiksi, kuivattiin sitten vakuumissa yön yli, jolloin 5 saatiin otsikon yhdiste (22,3 g; 93,6 %) vaaleanpunaisina pieninä neuloina.

IR (KBr) cm'1 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 1480, 1268, 1 180, 742, 640; 1H NMR (DiMSO-D6) 6,1 (m, 1H) , 6,3 (m, 1 H) , 7,0 - 7,7 (m, 5H) , 8,0 (s, III), 10,4 (br s, 1H); 10 TLC Rf = 0,20 - 0,28 (EtOH:CHCl3, 1:9).

Anal. Lask. C1()H9NO:lle: C, 75,45; H, 5,70; N, 8,80

Saatu: C, 75,30; H, 5,69; N, 8,67 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrroli (4) Liuos, jossa oli vedetöntä tetrahydrofuraania (THF, 15 450 ml), pyridiiniä (43,8 ml; 0,542 mol; 1,2 ekv.) ja trifluo- rietikkahappoa (85,0 ml; 1,10 mol; 2,4 ekv.), pidettiin 0°C:ssa inerttikaasuilmakehässä, käsiteltiin yhdessä erässä 3-hydroksi-5-fenyylipyrrolilla (3) (71,5 g; 0,45 mol; 1,0 ekv.) ja sen jälkeen välittömästi lisättiin pisaroittain 5-10 mi-20 nuutin aikana juuri valmistettu N-tosyyli-L-alaninyyliklori- diliuos (141,0 g; 0,54 mol; 1,2 ekv.) vedettömässä THF:ssä (450 ml). Saatua seosta sekoitettiin 15 minuuttia 0°C:ssa. Reaktio pysäytettiin sitten lisäämällä liuos, jossa oli 1,0 M sitruunahapon vesiliuosta (315 ml) ja EtOAc (1,35 1).

: ·- 25 Lyhyen sekoittamisen jälkeen faasit erotettiin ja orgaaninen : kerros pestiin NaCl:n vesiliuoksella (360 ml; 0,18 g NaCl ral;ssa vettä). Orgaaninen kerros uutettiin seuraavaksi kahdes-ti 5 % NaHC03:n vesiliuoksella (1,35 1 kummallakin kerralla), : .·. ja pestiin sitten toisella erällä NaCl:n vesiliuosta (360 ml; ’IV 30 0,18 g NaCl ml:ssa vettä). Punertavan ruskeaa orgaanista ker- rosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 15 minuuttia MgSO^:n (101 g) ja Darco G60:n (143 g) kanssa, suodatettiin '· " sitten Celiten läpi ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa v ' 37°C:n hauteesta, jolloin saatiin (4) vaaleanpunaisen-valkoi- :'V 35 sena kiinteänä aineena. Karkea tuote jauhettiin jauhoksi ja liuotettiin lämpimään THF:ään (50°C) (250 ml) , sekoitet tiin kiivaasti ja laimennettiin n-heksaanilla (250 ml). Se- • · · • · « · • * 2i 85989 koittamista jatkettiin 1 tunti ympäristön lämpötilassa, kun tuote kiteytyi. Kiinteä aine suodatettiin, pestiin tolueenilla (n. 1,9 1) kunnes suodos oli väritöntä, kuivattiin sitten vakuumissa yön yli, jolloin saatiin otsikon tuote (112 g; 65 %) valkoisena jauheena, jonka sp. = 154,5 - 155°C.

IR (KC1) cm'1 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 770; 1H NMR (DMSO-d6)£ 1,33 (d, J=7, 3H), 2,36 (s, 3H), 4,13 (p, J=8, 1 H) , 6,25 (m, 1 H) , 6,73 (m, 1H), 7,05 - 7,50 (m, 5H), 7,5 - 7,85 (m, 4H), 8,42 (d, J=8, 1H), 11,18 (br s 1 H); 13C NMR (DMSO-d6) ppm 18,335, 21 ,001 , 51 ,370, 98,061, 108,336, 123,423, 126,024, 126,610, 128,560, 128,756, 129,601, 132,397, 137,600, 138,380, 142,737, 169,919; M7 = -70°C (c = 1,11, MeOH); TLC Rf = 0,45

D

(EtOAc:heksaani, 1:1); TLC Rf = 0,40 (tolueenidioksaani, 4:1) .

Anal. Lask. ^-20^201^^^:lie: C, 62,48; H, 5,24; N, 7,29

Saatu: C, 62,62; H, 5,27; N, 7,30 3-(N-tosyylialaninyylioksi)-5-fenyylitiofeenin synteesi (9)

Suoritettiin sarja kokeita 3-hydroksi-5-fenyylitio- fenin valmistamiseksi pienillä muunnoksilla kirjallisuudes- 3 4 sa julkaistuihin menetelmiin ' esitettynä pääpiirteittäin seuraavalla sivulla. Saatu hydroksitiofeeni asyloitiin sit-ten N-tosyyli-L-alaninyylikloridilla, jolloin saatiin vastaa-va N-tosyyli-L-alaninaattiesteri 46 %:n saannolla (optimoi-maton menetelmä).

: 3. P. Friedlander and S. Kielbasinski, Chem. Ber. 45 , 3389 :V: (1912) 4. A.I. Kosak, R.J.F. Palchak, W.A. Steele and C.M. Selwitz, J. Amer. Chem. Soc. 76, 4450 (1954) 22 85989

^ COOC,H

I) Γ-Ϋ° , Qr -j-, ify·'·' '*

240° C

a. ,Va,S

u

!)· BrCH,CC0H

10 p 11 = 8.7 ' f

__-AC

s J ^ Ac2° ^ [j ^S^CnoH

is yr ^ Qr^coo. f5)

NaOH

H 20

Me OH

20 0 I Cl-C-CH-CH.

1 9 on N Π [J rT l/ N ,_/0-C-OI-CH, r/jr a ‘ .-25 l^J (*) CH2C12 (Qj H Ts : Pyridiini (°) 23 85989 3-fenyyli-1,2-ditia-3-syklopenten-5-oni (5) Suspensiota, jossa oli 10 g etyylikinnamaattia (56,82 mmol) ja 10 g rikkiä, kuumennettiin 250°C:ssa 4 tuntia 50 ml:n pullossa, joka oli varustettu tislaus-® laitteella ja säiliöllä reaktion aikana syntyvän etanolin poistamiseksi. Reaktioseoksen annettiin sitten jäähtyä 100°C:een ja lisättiin 500 ml:aan palautusjäähdytyksessä olevaa etanolia. Saatu sakka suodatettiin ja trituroitiin peräkkäin 500 ml :11a kiehuvaa asetonia ja kahdesti 500 ml:n erillä etanolia. Yhditetyt sakan yllä olleet nesteet konsentroitiin kiinteäksi mustaksi aineeksi, joka kiteytettiin metanolista, jolloin saatiin tummanruskeita neuloja. Toinen kiteytys metanolista Noritia käyttäen ja suodatus Celiten läpi antoi 2,023 g vaalean keltaisia neuloja, sp. 113-115°C.

15 IR (KBr) cm"1 1650, 1550, 1390, 1350, 1130, 770; 1H NMR

(60 m Hz, CDCl^^ö, 92 (s, 1H) , 7,58 (m, 5H) ; TLC Rf = 0,5 (dikloorimetaani).

Anal. Lask. CgHg02S:lle: C, 55,64; H, 3,11

Saatu: C, 55,53; H, 3,47 20 cis-4-keto-6-fenyyli-3,7-ditia-5-noneenidihappo (6) Sulatettu liuos, jossa oli 35,48 g natriumsulfidinona-hydraattia (148 mmol) 94°C:ssa, käsiteltiin 6,65 g:lla 3-fenyyli-1,2-ditia-3-syklopenten-3-onia (5) 34,23 mmol) li-;··' : sättynä pienissä erissä viiden minuutin aikana. Viidentois- · : ta minuutin kuluttua seos lisättiin jääkylmään liuokseen, : ’.·* joka sisälsi 43,6 g bromietikkahappoa (314 mmol) 60 ml:ssa H20 säädettynä pH:hon 8,7 natriumkarbonaatilla. Saatu liuos ‘ : säilytettiin 0 C:ssa, pH:ssa 8,7 45 minuuttia, ja suoda- tettiin sitten. Sakan yllä oleva neste pidettiin 0°C:ssa • ‘ 30 ja tehtiin happamaksi pH:hon 3,7 5N HCl-liuoksella. Saa- .·. : tua seosta sekoitettiin yön yli 5°C:ssa. Sakan yllä ole- ... va neste dekantoitiin sitten ja saatu öljy trituroitiin eetterillä, öljy haihdutettiin tolueenin kanssa, kunnes ’ · -* saatiin 6,98 g väritöntä vaahtoa (65 %). Tämä aine käytet- ... 35 • tiin ilman lisäpuhdistusta.

24 85989

Eetteripitoisesta sakan yllä olevasta nesteestä saatiin analyyttinen näyte, joka konsentroitaessa, sen jälkeen haihdutettaessa etikkahapon ja tolueenin kanssa, ja tritu-roitaessa eetterin kanssa antoi vaaleanruskeita kiteitä, 5 sp. 142,5 - 150°C.

IR (KBr) cm"1 1705, 1655; 1H NMR (60 MHz, DMSO-Dg) £ 2,06 (s, CH3C09H-epäpuhtaus) 3,30 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 5,67 (m, 2H) (OH), 6,37 (s, 1H), 7,43 (m, 5H); TLC Rf = 0,85 (kloroformi:metanoli:etikkahappo, 5:5:1).

Anal. Lask. Cl3H12S20,.:lle: C, 50,00; H, 3,88

Saatu: C, 50,26; H, 3,98 3-hydroksi-5-fenyylitiofeeniasetaatti (7)

Voimakkaasti sekoitettu suspensio, jossa oli 3,40 g ^ karkeata cis-4-keto-6-fenyyli-3,7-ditia-5-noneenidihappoa (6) (10,9 mmol) 3,40 g natriumasetaattia (41,5 mmol), ja 30 ml etikkahapon anhydridiä, kuumennettiin palautusjäähdytyksessä tunnin ajan. Seoksen annettiin jäähtyä ja suodatettiin sitten ja haihdutettiin, jolloin saatiin musta öljy.

Tämä jäännös liuotettiin 75 ml:aan etyyliasetaattia ja uutettiin kolmesti 50 ml:n erillä jääkylmää kyllästettyä natrium-bikarbonaattiliuosta. Orgaaninen kerros pestiin sitten suolaliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatin yllä, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 2,826 g kiinteätä mustaa __ ainetta. Karkea tuote puhdistettiin haihdutustislauksella * o ; 120-140 C:ssa ja 0,1 mm:ssä, jolloin saatiin 1,235 g vaa lean oranssia öljyä, joka kiteytyi seistessään (52 %).

IR cm"1 1700, 1745; 1H NMR (60 MHz, CDC13) J 2,23 (s, 3H) , ; 7,03 (d,J=2Hz , 1 H) , 7,13 (d,J = 2Hz, 1H); 7,23 - 7,73 (m, 5H) ; - - 3Q MS (EI, DIP) m/e 218 (M+, 12,6 %); TLC Rf = 0,48 (heksaa- ni:etyyliasetaatti, 5:1).

\i Anal. Lask. C12H1QS02.1/2 H20:lle: C, 63,41; H, 4,88

Saatu: C, 63,78; H, 4,86 .· . 3-hydroksi-5-fenyylitiofeeni (8) 33 Seos, jossa oli 2,126 g 3-hydroksi-5-fenyylitiofeeni- ·.’ asetaattia (7) (9,74 mmol) ja 80 ml metanolia argonilmakehäs- sä, käsiteltiin 11 ml:lla 1 N NaOH. 20 minuutin kuluttua reak- • · · « f 25 85989

tio pysäytettiin lisäämällä 11 ml 1 N HCl, haihdutettiin 25°C: ssa, 12 mm, suunnilleen 50 ml:n tilavuuteen, ja käsiteltiin 100 ml:11a etyyliasetaattia. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin suolaliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatin 5 yllä, suodatettiin, ja haihdutettiin, jolloin saatiin musta kiinteä aine. Tämä jäännös liuotettiin 75 rahaan etyyliasetaattia ja kuivattiin MgSO^rn yllä. Suodatus ja haihdutus antoivat mustan kiinteän aineen, joka trituroitiin neljästi kuuman heksaanin kanssa, jolloin jäähdytettäessä saatiin 10 kaikkiaan 837 mg keltaista kiinteätä ainetta, sp. 74-75°C

(49 %). Yhdistetyt emäliuokset konsentroitiin, jolloin saatiin 0,87 g kiinteätä ainetta, joka kromatografioitiin 100 g :11a Si02 eluoituna liuotinseoksella heksaani:etyyliasetaatti (7:1). Uudelleenkiteytyksen jälkeen saatiin vielä 15 380 mg tuotetta, sp. 73,5 - 74°C. Yhdistetty saanto oli siis 1,217 g (71 %), sp. 73,5 - 75°C (kirj.3,4 75°C, 78°C).

IR cm-1 3380 , 1 635; 1H NMR (90 MHz, CDCl3)(f3,81 (s, 2H) , 6,57 (s, 1 H), 7,2 - 7,7 (m, 5H) ; MS (EI) m/e 176,0 (70,7 %) ; TLC Rf = 0,23 (heksaani:etyyliasetaatti, 1:5).

20 Anal. Lask. C10HgOS:lle: C, 68,15; H, 4,57

Saatu: C, 68,05; H, 4,70 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylitiofeeni (9) . .·. Liuos, joka sisälsi 440 mg 3-hydroksi-5-fenyylitio- ‘ feenia (8) (2,5 mmol) 20 ml:ssa dikloorimetaania ja 0,61 ml ."V 25 pyridiiniä (7,5 mmol) 0°C:ssa argon-ilmakehässä, käsitel- ' \ tiin liuoksella, joka sisälsi 1,314 g N-tosyyli-L-alaninyy- likloridia (5 mmol) 10 ml:ssa dikloorimetaania lisättynä ·· · pisaroittain viiden minuutin aikana. Reaktion annettiin .·.· sekoittua 0,5 tuntia 0°C:ssa, ja kaadettiin sitten 100 30 ml:aan kloroformia. Seos uutettiin sitten peräkkäin 50 ml:n erillä 1N sitruunahappoa, vettä, jääkylmää natriumbikarbo-naattiliuosta, vettä ja suolaliuosta. Seos kuivattiin sit-. ten natriumsulfaatin yllä, suodatettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 1,78 g ruskeata öljyä. Kiteytysyritys toluee-35 nista sen jälkeen kun oli käsitelty 1,78 g:lla Noritia, ei : · : onnistunut. Jäännös kromatografiointiin sitten 200 g:n pyl- väällä Si02:a eluoituna dikloorimetaanilla virtausnopeudel- 26 85989 la 10 ml/minuutti. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin 951 mg punertavaa öljyä. Tuote kiteytettiin tolueenista. Peräkkäiset uudelleen-kiteytykset tolueenista antoivat kaikkiaan 463 mg tuotetta 5 keltaisena kiinteänä aineena, (46 %), sp. 85-87°C.

IR (KC1) cm'1 1735, 1330, 1150; 1H NMR (90 MHz, CDCl3) <$ 1,53 (d, J = 7 Hz, 3H) , 1,62 (s, 3H) , 4,23 (m, 1H), 5,32 (d, J = 9 Hz, 1 H) , 6,84 (d, J = 1,4 Hz, 1 H) , 6,88 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,23 - 7,83 (m, 9H) ; MS (FAB) m/e 402 (M + 10 1,15 %); TLC Rf = 0,20 (heksaanietyyliasetaatti, 4:1).

Anal. Lask. gN04S: lie: C, 59,83; H, 4,77; N, 3,59

Saatu: C, 59,60; H, 4,77; N, 3,43 3-(N-tosvyli-L-alaninyylioksi)-1-metyyli-5-fenyyli-pyrrolin (13) synteesi 15 Suoritettiin sarja kokeita otsikon esterin valmista miseksi vastaten yhdistettä (I), jossa A on N-tosyyli-L- ★ alaninyyli, R on fenyyli, R on H, X on NR' ja R' on CH^. Roaktiokaavio on souraava: 27 85989 to x o + \ u: -1 \ to • ' x O z _u + O _ u ox / O ( u -m \_ o \ < U4 //—Λ υ *-5 -> (O) -¾ = f o O t^ —

o X

<_> u o ^ M « fN) ' '

X O XX

u ™ o /—> X to to

to \ Z\y Ό X

XX ^ X U tn U O · U ιλ , h

X X / (_j-Z

+ 2 U—X I \ ^ · v 0=U \

. > X 0=U \ , X

• · o o · X O

..: : o \ rH v • · U ——... k) U ---> κι :;v \ s:_5 ---> z — g S o o Hb o

C\J

* . w • * 28 85989 2- hydroksi-3-(N-metyylikarboks imetyyliamino)hydro-kanelihapon dikaliumsuola (10)

Seosta, jossa oli J3-fenyyliglysidihapon kaliumsuo-laa (30 g; 0,15 moolia), N-metyyliglysiiniä (13,2 g; 0,15 5 moolia), tislattua vettä (119 ml) ja KOH-liuosta (9N; 22,3 ml), kuumennettiin palautusjäähdytyksessä 3 tuntia, jolloin saatiin vaalean keltainen liuos. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin alipaineessa 70°C:ssa. Jäännös kiteytettiin sitten 95 % EtOH:sta (100 ml), jolloin saatiin valio koinen kiinteä aine, josta yön yli alipaineessa 110°C:ssa kuivattamisen jälkeen saatiin 30,8 g valkoista kiinteätä ainetta (10) (saanto 63 %).

IR (KC1) cm"1 3360 (br), 1580, 1405, 705; 1H NMR (CD3OD) 2,30 (s, 3H) , 2,98 (s, 2H) , 3,70 (d, J = 3 Hz, 1H), 4,48 15 (d, J=3 Hz, 1 H), 4,92 (s, 1H), 7,40 (s, 5H) ; TLC Rf = 0,51 (EtOH:1M trietyyliammoniumbikarbonaatti 7:3). Tuot- o teella ei ollut sulamispistettä 270 C:n alapuolella).

3- asetoksi-1-metyyli-5-fenyylipyrroli (11)

Seosta, jossa oli 2-hydroksi-3-(N-metyylikarboksi- 20 metyyliamino)-hydrokanelihapon dikaliumsuolaa (10) (15,2 g, 46 mmol), etikkahapon anhydridiä (173 ml) ja trietyyliamii-nia (308 ml), kuumennettiin 90°C:ssa 19 tuntia. Reaktioseos, joka tuli väriltään syvän ruskeaksi, suodatettiin ja kiin-··· teä aine pestiin eetterillä. Suodos haihdutettiin alipai- 25 neessa, jolloin saatiin syvän ruskea jäännös, joka siir rettiin eetteriin (300 ml) ja veteen (200 ml). Kerrokset erotettiin ja eetterikerros pestiin toisella erällä vettä (200 ml). Eetteriliuos kuivattiin sitten MgS04:n yllä, suodatettiin ja konsentroitiin alipaineessa, jolloin saa-qn tiin 10,7 g ruskeata jäännöstä, joka puhdistettiin haihdu-: tustislauksella (120-1 35°C; 0,03 torria) ja kiteytettiin eetteristä, jolloin saatiin 3,0 g valkoisia kiteitä (11) (saanto 30 %) sp. = 64-65°C.

.'· IR (CHC1,) cm"1 2990, 1750, 1570, 1518, 1482, 1375, 1230 "35 J 1 ...* (br), 1024 , 910 , 700; H NMR (CDC13) 2,20 (s, 3H) , 3,58 (s, 3H), 6,10 (d, J=2 Hz, 1H), 6,75 (d, J=2 Hz, 1H), 7,35 (s, 5H); TLC Rf = 0,58 (heksaani:EtOAc 7:3).

29 85989

Anal. Lask. ^ 3NC>2: lie: C, 72,54 ; H, 6,10; N, 6,44

Saatu: C, 72,57; H, 6,09; N, 6,51 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-1-metyyli-5-fenyyli-pyrroli (13) 5 Seokseen, jossa oli doeksygenoitua metanolia (15,5 ml) ja 3-asetoksi-1-metyyli-5-fenyylipyrrolia (11) (1,3 g, 6,2 mmol), argonissa, lisättiin deoksygenoitua NaOH:ta (2N, 12,5 ml). Reaktioseosta sekoitettiin jäähauteessa 15 minuuttia. Sitten lisättiin deoksygenoitua sitruunahap-*0 poa (2M, 7 ml) ja saatua seosta sekoitettiin jäähauteessa 8 minuuttia. Reaktioseos konsentroitiin alipaineessa, sitten lisättiin 20 ml vettä ja uutettiin kahdesti etyyliasetaatilla (EtOAc) (50 ml). EtOAc-kerrokset yhdistettiin, kuivattiin MgSO^in yllä, suodatettiin ja konsentroitiin alipaineessa, 15 jolloin saatiin 3-hydroksi-1-metyyli-5-fenyylipyrrolia (12) oranssina jäännöksenä. Argonissa lisättiin oranssiin jäännökseen kylmä liuos, jossa oli vedetöntä THF (12,4 ml), pyridii-niä (0,6 ml; 7,4 mmol, 1,2 ekv.) ja trifluorietikkahappoa (1,2 ml, 15 mmol, 2,4 ekv.), ja sen jälkeen lisättiin välit-tömästi liuos, jossa oli juuri valmistettu liuos N-tosyyli-L-alaninyylikloridia (1,2 g, 7,4 mmol, 1,2 ekv.) vedettömässä THF:ssä (12,4 ml). Saatua seosta sekoitettiin yksi tunti 0°C:ssa. Sitten reaktio pysäytettiin lisäämällä sitruu- -: nahapon vesiliuosta (1M, 5 ml) ja EtOAc (30 ml) . Lyhyen .' . ‘. 25 .: sekoittamisen jälkeen kerrokset erotettiin ja orgaaninen ker- : V ros pestiin peräkkäin kyllästetyllä NaCl-liuoksella, kahdes- ti 5 % NaHCO^-liuoksella ja jälleen kyllästetyllä NaCl-liuok- : sella. EtOAc-uute -uivattiin sitten MgSO^in yllä, käsitel- tiin Norit 211:11a, suodatettiin ja konsentroitiin ali)?ai-30 neessa, jolloin saatiin karkea tuote (13) oranssina jäännök- : senä. Tämä liuotettiin heksaani:EtOAc-seokseen (1:1) (15 ml) ·.·* ja kromatografioitiin pylväällä (S1O2, 100 g) eluoimalla heksaani EtOAc:lla (7:3), jolloin saatiin 1 g (13):a paksu- na vaalean oranssina öljynä. Erä tätä karkeata tuotetta puh-35 distettiin edelleen puolivalmistavalla HPLC:llä (pylväs, IBM-piihappo, 1 cm x 25 cm; liikkuva faasi, heksaani:EtOAc 8:2, virtausnopeus 4,0 ml/min; paine 0,2 psi) , jolloin saatiin hunajan värinen paksu öljy (13).

3o 85989 IR (filmi) cm’1 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770; 1H NMR (DMSO-dg) <$ 1,28 (d, J = 7 Hz, 3H) , 2,36 (s, 3H) , 3,58 (s, 3H), 5,85 (d, J=2 Hz, 1H), 6,15 (m, 1H), 6,74 (d, J=2 Hz, 1H), 7,30 - 7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J=8 Hz, 1H); 5 13C NMR (DMSO-d6) ^18,205, 20,936, 34,917, 51,240, 100,598, 113,148, 126,544, 127,000, 128,105, 128,560, 129,601, 130,901, 132,202, 135,714, 138,315, 142,672, 169,724; TLC Rf = 0,52 (tolueeni:dioksaani 4:1); Korkea-erotuskykyi-nen massaspektri, vaatii m/e 398,1300, saatu 10 m/e 398,1297.

3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)-pyrrolin (18) synteesi

Suoritettiin sarja kokeita otsikon esterin valmistamiseksi vastaten yhdistettä (I), jossa A on N-tosyyli-L- k 15 alaninyyli, R on p-kloorifenyyli, R on H, X on NR' ja R' on H. Reaktiokaavio on seuraava: 31 85989

f COOH ^COOH

, .0:,¾ ” «-Cl <«

Glysiini koh/h2o pH = 11.5

10 V

_^OAc HO γ COO" K+

^ Ac2° N^C00~K + · 2H-,O

JLv J\ I pyridiini J^^/J I

15 Cl^ Ac 121-2° Cl^~^ H

U6) (IS)

NaOH

CH,0H

ύ H,0 20 ψ ^ 0

rOH O II

w II ._fSO-C - CH -CFL

" , „v - Χ'.ο'/Α-

CFjCOOH

' \ (1?) pyridiini (iö)

THF

: trans-^- (p-kloorifenyyli)glysidihappo (14) 30 Sekoitettuun lietteeseen, jossa oli p-kloorikanelihap- - poa (68,5 g; 0,375 mol) 260 ml:ssa asetonia, lisättiin NaHCO^ra (137 g; 1,63 mol) ja sen jälkeen lisättiin hitaasti 260 ml vettä. Tähän seokseen lisättiin 2,5 tunnin aikana 22-27°C:ssa seos, .· jossa oli OXONE*Ka (211 g; 0,343 mol), 120 mg dinatrium EDTA:a .··. 35 ja 805 ml vettä. Viiden tunnin kuluttua seos tehtiin happamak si 70 ml :11a kylmää 12 N HC1, joka sai pH:n laskemaan noin 2,5:een ja sitten se uutettiin 700 mlrlla etyyliasetaattia.

32 85989

Uute pestiin suolaliuoksella, kuivattiin MgSO^:llä, suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Kiinteät aineet kiteytettiin etyyliasetaatista: sp. 121-5°C.

(72,2 g; 97 ΐ saanto). ^ NMR: (CDClj/DMSO-Dg) <£ 7,3 (ra, 4H), 5 4,05 (d, J=2, 1 H), ja 3,4 (d, J = 2, 1H).

Anal. Lask. CgH^ClO^:lie: C, 54,43; H, 3,55; Cl, 17,85

Saatu: C, 54,53; H, 3,80; Cl, 17,91 2-Hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)-p-kloorihydroka-nelihapon dikaliumsuolan dihydraatti (15) ^ Liuokseen, jossa oli KOH (85 %) (46,7 g; 0,709 mol) ja 400 ml vettä, lisättiin glysiiniä (25,9 g; 0,345 mol) ja sen jälkeen trans-^-p-kloorifenyyliglysidihappoa (14) (72,2 g; 0,3635 mol). Tätä seosta kuumennettiin 100°C:ssa kaksi tuntia, jäähdytettiin huoneenlämpöön ja riittävästi KOH:a lisät-tiin pH:n nostamiseksi 12:een. Samea liuos uutettiin kolmesti etyyliasetaatilla, joka uute sitten heitettiin pois; kirkas liuos (noin 500 ml) haihdutettiin vakuumissa kuiviin käyttäen 70° vesihaudetta. Kiinteät aineet liuotettiin sitten noin 350 ml:aan kuumaa etanolia, suodatettiin, ja suodos jäähdy- 20 tettiin jäähauteessa useita tunteja. Kiteytynyt kiinteä aine kerättiin suodattamalla ja pestiin pienellä määrällä kylmää etanolia: sp. 93-5°C dekarboksyloiden l85°C:ssa (57,2 g; 41 %) .

1H NMR (D20-TSP) 7,4 (s, 4H) , 4,7 (s, 6H, exchangable 25 protons), 4,4 (d, J=4, 1H), 4,05 (d- J=4, 1H), ja 3,1 (s, 2H).

Anal. Lask. C..H.nClNOcK_.2H-0:lie: C, 34,24; H, 3,66; I I 1U 5 2 2 N, 3,63

Saatu: C, 34,40; H, 4,03; N, 3,42 30 N-asetyyli-3-asetoksi-5-(p-kloorifenyyli)pyrroli (16) : 2-hydroksi-3-(karboksimetyyliamino)-p-kloorikaneliha- • · pon dikaliumsuolan dihydraattiin (15) (10 g; 0,02591 mol) lisättiin etikkahapon anhydridiä (40 ml) ja pyridiiniä (30 ml). Tätä seosta kuumennettiin lievästi 35°C:een jol-35 loin liuoksessa tapahtui eksoterminen reaktio, joka nosti lämpötilan 67°C:een, joka sitten alkoi laskea, jolloin läm-.mitys jälleen aloitettiin. Seosta kuumennettiin 121-2°C:ssa 33 85989 (sisäinen lämpötila) yksi tunti ja jäähdytettiin sitten. Reaktioseokseen lisättiin noin 30 ml etyyliasetaattia, joka saosti suurimman osan pyridiniumasetaattisuolasta; tämä suola kerättiin suodattamalla ja pestiin pienellä määrällä ® etyyliasetaattia. Suodos haihdutettiin sitten vakuumissa öljyksi ja lisättiin jäävettä. Tuote uutettiin eetterillä ja eetteriuutteet pestiin peräkkäin kahdesti kylmällä laimealla sitruunahapon vesiliuoksella, kylmällä vedellä, kolmesti kylmällä, laimealla NaHC03:n vesiliuoksella, kylmäl-lä vedellä ja suolaliuoksella, ja kuivattiin sen jälkeen MgSO^:n yllä ja suodatettiin. Suodos käsiteltiin 10 g:11a Darcoa, sekoitettiin 20 minuuttia ja suodatettiin sitten. Suodos haihdutettiin vakuumissa öljyksi, öljyyn lisättiin 25 ml 2-propanolia. Saadusta liuoksesta saatiin jäähdyttä-15 mällä ja raaputtamalla vaalean keltaisia kiteitä, sp. 69 - 71°C (3,4 g; 47 %); TLC Rf = 0,61 (tolueeni:dioksaani, 95:5). Analyyttinen näyte uudelleenkiteytettiin 2-propano- lista, mutta muutosta sp:ssä ei havaittu.

IR (KC1) cm 1 1755 (C=0, esteri) ja 1730 (C=0, amidi); 20 1 H NMR (CDC13) £ 7,4 (m, 5H), 6,2 (d, J=2, 1H), 2,4 (s, 3H) ja 2,3 (s, 3H).

Anal. Lask. 2^1Ν03 :lle: C, 60,55; H, 4,36; N, 5,04

Saatu: C, 60,65; H, 4,55; N, 5,07 • · · : 3-hydroksi-5- (p-kloorifenyyli)pyrroli (17) . . 25 V: : N-asetyyli-3-asetoksi-5-p-kloorifenyylipyrrolinäyte • .'· (16) (2,8 g; 0,01 mol) deoksygenoitiin kymmenen minuutin ·:**: ajan N2~virralla. Kiinteä aine liuotettiin sitten deoksy- • genoituun metanoliin (30 ml) , joka sitten jäähdytettiin -8°C:een. Lisättiin heti deoksygenoitu NaOH-liuos (1,6 g; • 3 0 0,04 mol) 20 ml:ssa H20, joka liuos sitten kuumennettiin m-m : vähäksi aikaa 15°C:een ja jäähdytettiin sitten välittömäs- ti -5°C:een; 25 minuutin kuluttua kirkas liuos käsiteltiin kylmällä deoksygenoidulla sitruunahappoliuoksella (4,2 g; 0,02 mol) 15 ml:ssa H~0 ja lämpötila nousi vähäksi aikaa — 35 o^o - : 5 C:een. Kun oli sekoitettu 0,5 tuntia -5 C:ssa kiinteä ai- ;·*·. ne kerättiin suodattamalla ja pestiin kylmällä deoksygenoi- *..I dulla Ho0:lla. Vaalean vihreä tuote kuivattiin vakuumissa 34 85989 huoneenlämmössä P20j-:n yllä useita päiviä (1,3 g; 68 %); TLC Rf = 0,19 (CHCl3:EtOH; 9:1); IR (KC1) ei osoittanut merkkejä absorptiosta C=0:lle.

Anal. Lask. C._HoClN0·1/6H„0:lie: C, 61,08; H, 4,27; N, 7,12 1 U ö l.

5 Saatu: C, 61,36; H, 4,44; N, 6,85 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)pyr-roli (18)

Ha deoksygenoituun THF:ään (15 ml) lisättiin pyri-diiniä (0,65 ml; 0,008 mol), trifluorietikkahappoa (1,27 ml; 10 0,0164 mol) ja 3-hydroksi-5-p-kloorifenyylipyrrolia (17) (1,3 g; 0,0065 mol). Liuos jäähdytettiin 0°C - 4°C:een ja N2:lla deoksygenoitu, jäähdytetty (0°C - -4°C) N-tosyyli-L-alaninyyli-kloridiliuos (2,1 g; 0,008 mol) 15 ml:ssa THF lisättiin 10 minuutin aikana. Kun liuosta oli pidetty tunti 15 0°C:ssa, lisättiin seos, jossa oli jäätä ja 100 ml 1 N sitruunahappoa. Tämä seos uutettiin etyyliasetaatilla ja uute pestiin kerran kylmällä suolaliuoksella, kahdesti kylmällä laimealla NaHC03:lla, ja kerran kylmällä suolaliuoksella, jonka jälkeen se kuivattiin MgSO^:n yllä ja suodatettiin.

20 Suodos käsiteltiin 2 g :11a Darcoa ja sitä sekoitettiin kym menen minuuttia, suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuu-missa punertavan ruskeaksi öljyksi. Toinen käsittely 1,3 g:11a Darcoa antoi vaalean punertavan öljyn. Öljy liuotettiin to-* : lueeni: sykloheksaaniin (4:1) ja pantiin jääkaappiin yöksi.

- 25 Havaittiin vaalean lohenpunaiset kiteet. (1,45 g; 53 %) ; sp. 11 3-5°C .

TLC Rf = 0,47 (Et20) ; IR (KC1) cm'1 1740 (C=0, esteri); ; 1H NMR (CDCl3)<f8,4 (br, s, 1H), 7,8- 7,2 (m, 8H) , 6,7 IV (m, 1 H) , 6,2 (m, 1H), 5,5 (d, J=9, 1H), 4,2 (p, J = 8, 1 H) , 30 2,4 (s, 3H), 1,4 (d, 3H); MS (EI, DIP) m/e 418 (M+, 2,3 %) ja 420 (M+, 0,8 %).

♦ · :Λ: Anal. Lask. C2()H1 gClN204S:lle: C, 57,34 ; H, 4,57; N, 6,69 ; Saatu: C, 57,33; H, 4,58; N, 6,67 : Erilaisten koelaitteiden valmistus ja käyttö /··. 35 Suoritettiin sarja kokeita tämän keksinnön koelait- Y teiden valmistamiseksi, joissa aikaisemmin esitettyjä este- risubstraatteja kokeiltiin niiden reaktioiden suhteen virt- 35 85989 sassa oleviin leukosyytteihin. Laitteet käsittivät pienen neliönmuotoisen palasen suodatinpaperia, joka sisälsi koe-reagensseja, paperin ollessa kiinnitetty polystyreenikalvo-liuskan toiseen päähän. Suodatinpaperi oli kyllästetty pus-5 kurilla, esterillä, katalysaattorilla ja diatsoniumsuolalla kytkevänä aineena. Jokaisella testatulla laitteella havaittiin olevan positiivinen koe leukosyyteille virtsassa.

Koelaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyIloksi) -5-fenyylipyrroli (4) 10 Valmistettiin koelaite, joka oli herkkä leukosyyt tien läsnäololle virtsassa. Laite käsitti pienen neliönmuotoisen palasen suodatinpaperia kiinnitettynä pitkulaisen polystyreenikalvosuikaleen toiseen päähän. Paperi oli kyllästetty erilaisilla aineilla mukaanluettuna kromogeeninen 15 esteri, katalysaattori ja diatsoniumsuola. 2 tuumaa (n. 5 cm) leveä suikale Eaton and Dickmanin^t 205 suodatinpaperia upotettiin vesiliuokseen, joka sisälsi seuraavia aineita: 0,4 M boraatti-NaOH-puskuri pH = 8,6 2.0 % (w/v) polyvinyylipyrrolidoni K-30'

20 0,2 % (w/v) Bioterge AS-4C

0,25 M NaCl

Paperi kuivattiin sitten 7 minuuttia Overly Air Foil-paperinkuivaajassa 175-200°F:ssa (n. 79-93°C). Ilmanvirtaus-- paineessa 1 tuuma (2,5 cm) H20. Sitten kuivattu paperi kas- : 25 tettiin asetoniliuokseen, joka sisälsi 2.0 % (v/v) n-dekanolia 0,75 mM 2-metoksi-4-morfoliinibentseenidiatsoniumkloridia 0,5 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylipyrrolia Tämän kyllästyksen jälkeen paperi kuivattiin 10 mi-'·’ 30 nuuttia ilmastoidussa Hotpack^-uunissa 130°F:ssa (n. 54°C) .

Saatiin harmahtavan valkoinen koepaperi.

·.*·: Palanen kuivattua, kyllästettyä paperia leikattiin : neliönmuotoiseksi palaseksi, joka oli 0,2 tuumaa (n. 0,5 cm) .·. : sivultaan ja kiinnitettiin pitkittäin suunnatun, mitoil- 35 taan 4 tuumaa x 0,2 tuumaa (n. 10 cm x 0,5 cm) olevan polysty- reenikalvon toiseen päähän. Paperin kiinnittämiseen liuskaan : *.· käytettiin Double Stick-kaksipuolista teippiä (3M-yhtiö) .

36 65989

Koelaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyli-oksi)-5-fenyylitiofeeni (9)

Valmistettiin koelaite, joka oli herkkä leukosyyttien läsnäololle virtsassa, jossa indikaattorina käytet-5 tiin 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylitiofeenia. Pa lanen suodatinpaperia (Eaton & Dickman^T205) upotettiin vesipitoiseen ensimmäiseen liuokseen, joka sisälsi seuraavaa: 0,4 M boraatti-NaOH-puskuri (pH = 8,5) 0,4 M NaCl 10 1,5 % (w/v) polyvinyylipyrrolidoni (K-30)

Kyllästetty paperi kuivattiin paineilmauunissa 30 minuuttia 70°C:ssa, jonka jälkeen sen annettiin jäähtyä huoneenlämpöön ja kyllästettiin toisella kastoliuoksella, jossa oli asetoniliuosta, joka sisälsi: 15 0,75 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyylitiofeenia 0,75 mM 2-metoksi-4-morfoliinibentsecnidiatsoniumkloridia, sinkkikloridin kaksoissuolaa 0,5 % (v/v) n-dekanolia

Kahdesti kyllästetty paperi kuivattiin sitten paine-20 ilmauunissa 5 minuuttia 50°C:ssa.

Kuivattu paperi leikattiin neliön muotoisiin palasiin, jotka olivat sivultaan 0,2 tuumaa (n. 0,5 cm) pitkiä ja kiinnitettiin mitoiltaan 0,2 x 3,25 tuumaa (n. 0,5 x • 8 cm) olevan polystyreenikalvon toiseen päähän. Kiinnittä- .'. 25 minen suoritettiin käyttäen Double Stickiä, kaksipuolista teippiä 3M-yhtymältä. Koelaitetta säilytettiin pulloissa, joissa oli 100 kussakin, yhdessä silikageelin ja molekyyli-. suodattimey kanssa, jotka varmistivat kuivana pysymisen.

'*.* Koelaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyyli- 30 oksi)-1-metyyli-5-fenyylipyrroli (13)

Valmistettiin koelaitteet, seuraten menetelmää edel- • · » · . '' lisessä kokeessa, joissa esteri-indikaattori oli 3-(N-to- • · · .· * syyli-L-alaninyylioksi)-1-metyyli-5-pyrroli ja kytkevä ai- : ne oli 1-diatsonaftaleeni-4-sulfonaatti. Ensimmäinen vesi- -··. 35 pitoinen kastoliuos sisälsi: 37 85989 0,4 M boorihappoa 2,0 % (w/v) polyvinyylipyrrolidonia (K-30) 0,2 % (v/v) Bioterge AS-40 0,25 M NaCl 5 Ennen suodatinpaperin kyllästämistä liuos titrattiin

NaOH:lla pHrhon 9,0.

Toinen kastoliuos asetonissa sisälsi: 0,75 mM 1-diatsonaftaleeni-2-sulfonaattia 1,3 mM 1-metyyli-3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fenyyli-10 pyrrolia 1,5 % (v/v) dodekanolia

Ensimmäisessä vesiliuoksessa kyllästämisen jälkeen paperi kuivattiin noin 5 minuuttia noin 80°C:ssa, ja noin o 5 minuuttia 70 C:ssa kyllästämisen jälkeen toisessa asetoni-15 kastoliuoksessa.

Kuivattu paperi kiinnitettiin kuten kokeessa 3-(N-to-syylialaninyylioksi)-5-fenyylitiofeenin synteesi (9).

Koelaite, jossa esteri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi) -5-(p-kloorifenyylipyrroli (18) 20 Koelaite valmistettiin kuten edellisessä kokeessa paitsi että asetoniliuos sisälsi fenyylipyrrolin sijasta 1,3 mM 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p-kloorifenyyli)pyrrolia .

Koelaitteen arviointi ' 25 Koelaitteet, jotka valmistettiin kokeissa kappaleessa erilaisten koelaitteiden valmistus ja käyttö, arvioitiin nii- _____; den kyvyn suhteen havaita leukosyyttien läsnäolo virtsassa.

. . Koenäytteet valmistettiin normaalista ihmisen virtsa- koostumuksesta. Yksi näyte toimi sokeanäytteenä ja leukosyy- · 30 tit, jotka oli saatu juuri otetusta verestä, lisättiin kah teen virtsanäytteeseen, jolloin saatiin konsentraatiot 0, 10 *. *: ja 75 leukosyyttiä/^ul, tässä järjestyksessä : Koelaitteet upotettiin nopeasti ja poistettiin koenäyt- : teestä. Kaksi minuuttia myöhemmin laitteet tutkittiin käyttäen 35 spektrofotometriä mittaamaan %-taittuminen eri aallonpituuk- *·" silla 400-700 nm (nanometriä) .

38 8 5 9 8 9

Tiedot osoittavat, että kaikki koelaitteet osoittivat selvästi erotettavat erot valon taittumisessa vastaten erilaisia leukosyyttimääriä koenäytteissä. Tiedot on esitetty seuraavassa taulukossa: 5

Leukosyyttien 10 konsentraatio %-taittaminen

Koe n:ro (solua/^ul) 555 nmrssä

Koelaite, jossa esto- 0 ri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksij-5-fe- 10-12 nyylipyrroli (4)1 15 Koelaite, jossa este- 0 6$

ri on 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-fe- iU

nyylitiofeeni (9) 65 42

Koelaite, jossa esteri o 67 on 3-(N-tosyyli-L-ala-ninyylioksi)-1-metyy- li-5-fenyylipyrroli 75 60 (13)

Koelaite, jossa esteri o 61 on 3-(N-tosyyli-L-alaninyylioksi)-5-(p- 10 ’ 25 kloorifenyylipyrroli 7 5 4 2 ·.·. (18) k Näköhavainto: muodostui purppuranpunainen väri konsentraa-;/ tiossa 10-12 solua/^ul; sokeanäyte ei antanut värinmuutosta · * · 1

Claims

39 85989

1. Koostumus leukosyyttien, esteraasin tai proteaa-sin määrittämiseksi koenäytteestä, tunnettu siitä, 5 että se sisältää esterin, jonka rakenne on R* -r°'h xr

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että X on NR'.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että A on N-suojattu aminohappo.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, 25 tunnettu siitä, että A on N-suojattu L-alaninaat-ti.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että A on N-suojattu L-alaninaat-ti, R on fenyyli, X on NR', ja sekä R' että R* ovat H.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen koos tumus, tunnettu siitä, että koostumus sisältää lisäksi kiihdyttimen.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että kiihdytin on alkoholi, jossa 35 on 1-15 hiiliatomia. 40 85989

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi diatsoniumsuolan kytkevänä aineena.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, 5 tunnettu siitä, että mainittu diatsoniumsuola on kahtaisioni, jolla on rakenne N2 + 10 gJ^b T&f-*- G jossa

15 D* on anioni, G, sama tai erilainen, on H, alempi alkyyli, tai aryyli tai jossa molemmat G-ryhmät yhdessä muodostavat kondensoidun rengassysteemin ja 20 jossa B on H tai OH.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että mainittu suola on l-diatso-2-naftoli-4-sulfonaatti.

10. X jossa A on N-suojattu aminohappojäännös tai N-suojattu pep- 15 tidijäännös, kuten N-tosyyli-L-alaninyyli, X on S tai NR', jossa R' on H tai alempi alkyyli, R on substituoitu tai substituoimaton fenyyli, R* on H tai alempi alkyyli; ja puskuriaineen, jonka pH on ainakin noin 7.

11. Koelaite leukosyyttien, esteraasin tai proteaa-25 sin määrittämiseksi koenäytteestä, tunnettu siitä, että laite käsittää kantajamatriisin yhdessä jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukaisen koostumuksen kanssa.

12. Menetelmä leukosyyttien, esteraasin tai prote-aasin läsnäolon määrittämiseksi koenäytteestä, t u n - 30. e t t u siitä, että näyte saatetaan kosketukseen patenttivaatimuksen 11 mukaisen koelaitteen kanssa ja havaittava reaktio todetaan. « 85989