NO157176B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive 18-substituerte pregn-4-en-2, 30-dioner. - Google Patents

Description

Aldosteron er et steroid hormon som syntetiseres

i zona glumerulosa-cellene i binyrene. Den primære biolo-

giske funksjon av denne forbindelse er reguleringen av salt-

retensjon, og i særdeleshet spiller aldosteron en hoved-

rolle når det gjelder regulering av reabsorpsjon av natrium-

ioner fra urin av nyren. Således er en mangel på enzymet som er ansvarlig for syntesen av aldosteron et karakteris-

tisk trekk ved pasienter med salttapende syndrom, mens pri-

mær hyperaldosteronisme kan resultere.fra hyperbiosyntese av aldosteron som bevirkes av en adrenocortikal tumor eller administreringen av visse legemidlet Hyperaldosteronismen kan innbefatte hypertensjon, hypokalemia, alkalosis, musel-

svekkelse, polyuria og polydipsia. Ved behandling av hyper-

aldosteronisme og tilstandene forbundet med denne ville det være mulig ved blokkering av den enzymatiske syntese av aldosteron.

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangs-

måte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelser av formelen

hvori Z er hydrogen eller hydroxy; og R er 1,2-propadienyl eller 2-alkynyl inneholdende opp til 6 carbonatomer.

Propadienylgruppen kan også kalles allenyl og har

følgende struktur:

Da carbonet med den frie valens også vil være 18-carbonet

i et pregnanskjelett i forbindelsene fremstilt ifølge opp-

finnelsen, kan slike forbindelser også betraktes som 18-

vinylidenpregnaner. 2-alkynylgruppen har en trippelbinding ved det andre carbon i forhold til den fri valens og kan illustreres ved følgende struktur:

hvori R' er hydrogen eller alkyl inneholdende opp til 3 carbonatomer. Eksempler på 2-alkynylgrupper er 2-propynyl, 2-butynyl, 2-pentynyl eller 2-hexynyl selv om 2-propynyl er foretrukket.

De nye forbindelser kan fremstilles fra et egnet pregnan-18-al. 3- og 20-carbonylgruppene som vanligvis er til stede i de anvendte utgangsmaterialer, beskyttes vanligvis som ketalet, fortrinnsvis det som erholdes under anvendelse av et glycol. Nærmere bestemt kan de beskyttede forbindelser erholdes ved behandling av det egnede pregnan-3,20-dion med ethylenglycol i nærvær av et spor av syre. Alternativt kan det være mulig å beskytte 3-stillingen ved reduksjon av 3-ketonet til alkohol med lithiumaluminium-hydrM etterfulgt av omsetning med t-butyldimethylsilyl-klorid under dannelse av den tilsvarende ether. Enhver tilstedeværende hydroxygruppe kan være beskyttet som den tilsvarende acetylester selv om det skal bemerkes at enhver forbindelse inneholdende en 11-hydroxygruppe kan eksistere i form av et acetal med 18-oxogruppen.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at

(a) en forbindelse av formel I hvori R er 1-acetoxy-2-propynyl og 3- og 20-carbonylgruppene og enhver Z-hydroxygruppe er hensiktsmessig beskyttet, omsettes med

lithium (butyl) (1-pentynyl)cuprat under dannelse av en forbindelse med en 13-allenylgruppe, etterfulgt av fjerning av enhver ketal-beskyttende gruppe ved behandling med syre, og fjerning av enhver ester-beskyttende gruppe ved alkalisk hydrolyse; (b) en forbindelse av formel I hvori R er 3-klor-2-propenyl og 3- og 20-carbonylgruppene og enhver Z-hydroxygruppe er hensiktsmessig beskyttet, omsettes med en sterk base under dannelse av en forbindelse med en 13-(2-propynyl)-gruppe, etterfulgt av fjerning av enhver ketal-beskyttende gruppe ved behandling med syre, og fjerning av enhver estér-beskyttende gruppe ved alkalisk hydrolyse.

Propadienylforbindelsene kan erholdes fra den angitte pregnen-18-al ved en serie av reaksjoner som kan illustreres som følger:

Det ovenfor angitte eksempel viser bare C- og D-ringene av steroidet i en forbindelse uten noen hydroxy-substituenter. Spesifikt omsettes 18-alet med ethynylmagnesiumbromid under dannelse av den tilsvarende 13-(1-hydroxy-2-propynyl)-forbindelse. Denne omdannes deretter til den tilsvarende ester under anvendelse av et anhydrid slik som eddiksyreanhydrid og behandling av esteren med lithium-(butyl) (1-pentyl)cuprat gir den tilsvarende 13-(propadienyl)-forbindelse. Enhver beskyttende gruppe slik som 2 0-ketalgruppen, fjernes deretter ved standard metoder slik som behandling med p-toluensulfonsyre og aceton eller hydrogenklorid i vandig methanol under dannelse av de ønskede propadienylprodukter. Den beskyttende ketalgruppe kan også fjernes på liknende måte fra 13-(1-hydroxy-2-propynyl)-forbindelsene beskrevet tidligere som mellomprodukter, og dette gir forbindelsene av formel I med samme substitusjon ved 13-stillingen.

For å oppnå 13-(2-propynyl)-forbindelsene anvendes 18-carboxaldehyd i følgende serier av reaksjoner:

Igjen er bare C- og D-ringene av et enkelt molekyl vist. Det angitte 18-carboxaldehyd kan erholdes fra det tilsvarende nitril ved reduksjon med diisobutylaluminiumhydrid, eller det kan erholdes fra 18-alet som tidligere angitt ved omsetning med (methoxymethylen)-trifenylfosforan etterfulgt av Hg++ katalysert hydrolyse. 18-carboxaldehydet omsettes med (klormethylen)trifenylfosforan under dannelse av den tilsvarende 13-(3-klor-2-propenyl)-forbindelse som en blanding av cis- og trans-isomere. Klor-forbindelsen dehydro-halogeneres deretter under anvendelse av en sterk base slik som lithiumdiisopropylamid eller lithiumamid i ammoniakk, under dannelse av propynylforbindelsen, og enhver beskyttende ketalgruppe fjernes til slutt ved standardmetoder slik som behandling med p-toluensulfonsyre i nærvær av aceton.

Foreliggende forbindelser er aldosteroninhibitorer, dvs. de inhiberer syntesen av aldosteron. De er således anvendbare ved behandling av hyperaldosteronisme og forskjel-lige tilstander hvori en reduksjon av den økende mengde av aldosteron som er ansvarlig for tilstanden vil være gunstig. Nærmere bestemt er de anvendbare ved den generelle behandling av hyperaldosteronisme og enhver tilknyttet ødem og/ eller natriumretensjon enten dette er resultatet av kropps-lige forstyrrelser eller det er et resultat av administrering av et visst middel. Som et resultat av deres effekt på faktorer som er ansvarlige for ødem og/eller natriumretensjon, vil forbindelsene være anvendbare som diuretiske midler.

Aktiviteten av de nye forbindelser som aldosteroninhibitorer kan demonstreres ved følgende prosedyre som måler inhiberingen av enzymer i syntesen av aldosteron.

Adrenocortikal mitochondrial fraksjoner fra kveg ble fremstilt ved differensialsentrifugering og anvendt som en kilde for adrenal steroid hydroxylase. Enzym incuberings-mediet inneholdt 8,5 mM MgCl2, 2,7 mM CaCl, 3,13 mM KC1,

7,59 niM NaCl og var buffret til pH 7,0 med 10 mM fosfatbuffer. Et NADPH-utviklende system innbefattes som gjør bruk av

0,5 mM NADP<+>, 2,5 mM glucose-6-fosfat og 1,0 enhet glucose-6-fosfat-dehydrogenase i forsøksbuffer.

Tritium-merket desoxycorticosteron eller corticosteron (40 - 60 Ci/mM spesifikk aktivitet) ble oppløst i prøvebuffer for å gi en prøvekonsentrasjon på 1 yCi i 100 yliter buffer. Forbindelser som skulle testes som enzyminhibitorer oppløses i enten ethanol eller dimethyl-sulfoxyd og fortynnes med buffer for å gi en prøvekonsentra--4 -9

sjon varierende fra 10 til 10 M.

Testforbindelsene vurderes med hensyn til tidsav-hengig enzyminhibering. Forbindelsen i 100 yl buffer settes til 35 ml sentrifugerør inneholdende 600 yl NADPH utviklende system. Preincuberingen startes ved tilsetning av 700 yl mitochondrial fraksjon (vanligvis 2 - 4 mg protein/ml).

Disse komponenter blandes og preincuberes i en Dubnoff metabolisk rister i 0, 10, 20 eller 40 minutter ved 37° C under en atmosfære av 95:5, 02CO2- Etter preincuberings-perioden tilsettes 100 yl av det tritium-merkede substrat ved en konsentrasjon på minst 3 ganger Km for enzymet til prøverørene. Incuberingeri fortsettes i ytterligere 10 minutter. Enzymreaksjonen stoppes ved tilsetning av 10 ml av methanol:kloroform (1:1 v/v). Ikke-radiomerket bærer, desoxycorticosteron, corticosteron, 18-hydroxy-corticosteron og aldosteron tilsettes. Kloroformfasen fjernes, fordampes til tørrhet, oppløses i 50 yl klorofrm og tilføres til silicagel TLC-plater. Etter standard kromatografiske prose-dyrer lokaliseres steroidflekkene via UV-belysning. Hver TLC-flekk overføres til en væske scintillasjonsampulle, steroidet løses fra silicaen med ethanol før tilsetningen av væskeformig scintallasjonstellevæske. Radioaktiviteten av enzymproduktene måles ved 3-scintillasjonsspektrometer og graden av inhibering av aldosteronsyntesen beregnes derfra.

Desoxycorticosteron anvendes som substratet i prøvene for spesifikt å bedømme effektene av inhibitorer på 113-hydroxylasesystem. Substrater for 18-oxygenasesystemet er corticosteron for 18-hydroxylase og 18-hydroxycortico-steron for 18-hydroxydehydrogenase.

Farmasøytiske data

Når enkelte forbindelser ble testet ved en test som

gjør bruk av adrenocorticale mitochondriale fraksjoner som beskrevet i US patentskrift nr. 4.293.548, ble følgende resul-tater observert:

For å oppnå den ønskede effekt, slik som en

diuretisk effekt, kan forbindelsene

administreres oralt, parenteralt, for eksempel intramuskulært og subcutant, til en pasient med behov for behandling. Uttrykket pasient menes å omfatte varmblodige dyr, pattedyr, rotter, mus, hunder, katter, hester, griser,

kuer, sau og mennesker. Forbindelsene kan administreres alene eller hensiktsmessig blandet i form av et farmasøy-tisk preparat til den pasient som skal behandles. Mengden av administrert forbindelse vil variere med strengheten av tilstariden og gjentatt behandling kan være ønskelig. For oral og parenteral administrering er mengden av administrert forbindelse, dvs. den diuretisk effektive mengde fra 0,1 til 150 mg/kg kroppsvekt pr. dag og fortrinnsvis fra 1 til 50 mg/kg kroppsvekt pr. dag. Enhetsdoser for oral eller parenteral administrering kan eksempelvis inneholde fra 5 til 200 mg aktiv bestanddel. Forbindelsene kan administreres

alene eller i kombinasjon med hverandre.

For oral administrering kan forbindelsene formuleres i faste eller flytende preparater slik som kapsler, piller, tabletter, pastiller, pulvere, løsninger, suspensjo-ner eller emulsjoner. Den faste enhetsdoseringsform kan være en kapsel som kan være av vanlig gelatintype inneholdende den aktive forbindelse og en bærer, smøremidler og inerte fyllstoffer slik som lactose, sucrose og maisstivelse. I en annen utførelsesform kan en aktiv forbindelse tablet-teres med vanlige tablettbaser slik som lactose, sucrose og maisstivelse i kombinasjon med bindemidler slik som acacia, maisstivelse eller gelatin, oppløsende midler slik som potet-stivelse eller algininsyrer og et smøremiddel slik som stea-rinsyre eller magnesiumstearat.

For parenteral administrering kan forbindelsene administreres som injiserbare doser av en løsning eller suspensjon av forbindelsen i et fysiologisk akseptabelt for-tynning smidde 1 med en farmasøytisk bærer som kan være en steril væske slik som vann-i-olje med ellen uten tilsetning av et overflateaktivt middel og andre farmasøytisk aksep-table hjelpestoffer. Eksempler på oljer som kan anvendes i disse preparater er de fra petroleum, animalsk, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, for eksempel peanøttolje, soya-bønneolje og mineralolje. Generelt er vann, saltvann, vandig dextrose og beslektede sukkerløsninger, ethanoler og glycoler slik som propylenglycol eller polyethylenglycol, foretrukne væskebærere, i særdeleshet for injiserbare løs-ninger.

Forbindelsene kan administreres i form av en depot-injeksjon eller implantpreparat som kan formuleres på en slik måte at man muliggjør forlenget frigivelse av den aktive bestanddel. Den aktive bestanddel kan presses til pellets eller små sylindre og implanteres subcutant eller intramuskulært som depotinjeksjoner eller implantater. Implantater kan anvende inerte materialer slik som bioned-brytbare polymerer og syntetiske siliconer, for eksempel Silastic v5).

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. I eksemplene er alle temperaturer angitt i grader Celsius medmindre annet er angitt, og alle deler og prosenter er på vektbasis.

Hvor beskrivelsen av et bestemt prosesstrinn er angitt i generelle termer, er prosedyren basert på en vel anerkjent reaksjon og er hovedsakelig den samme som beskrevet i detalj annet sted i eksemplene. Således er omdannelsen av ketoner til ketaler beskrevet i eksempel 2, mens omdannelsen av et ketal tilbake til et keton er beskrevet i eksempel 1. Eksempel 1 inneholder også en beskrivelse av fremstillingen og bruken av lithium (butyl)(1-pentynyl)cuprat [P. Baret et al., Tetrahedron, 35, 2931, (1979)].

Eksempel 1

En løsning av 3,0 g 3,3,20,20-bis(ethylendioxy)-pregn-5-en-18-al i 35 ml tetrahydrofuran ble avkjølt til 0°C, og en løsning av 7,2 mmol ethynylmagnesiumbromid i tetra-hydrof uran ble dråpevis tilsatt. Når tilsetningen var full-ført, ble blandingen oppvarmet til tilbakeløpskokning i 1 time, ble avkjølt og fortynnet med ether, og den resulterende løsning ble helt over på en isavkjølt mettet vandig løsning av ammoniumklorid. Det organiske lag ble fraskilt, vasket grundig med vann og derpå med saltvann, og ble tørket hvorpå løsningsmidlet ble fordampet. Residuet ble kromatografert på silicagel under anvendelse av hexan/ethylacetat under dannelse av 3,3,20,20-bis(ethylendioxy)-18-ethynylpregn-5-en-18-ol.

2,2 g av den ovenfor erholdte 18-hydroxyforbindel-se ble løst i 25 ml pyridin og ble derpå kjølt til 0° C.

610 mg eddiksyreanhydrid ble tilsatt, og blandingen fikk oppvarmes langsomt til romtemperatur over natten. Blandingen ble deretter fortynnet med ether og vasket med IN saltsyre, mettet natriumbicarbonat og saltvann, og ble deretter tørket. Løsningsmidlet ble fordampet og residuet tørket

grundig under høyvakuum under dannelse av 18-acetoxy-3,3,20,20-bis(ethylendioxy)-18-ethynylpregn-5-en som ble anvendt direkte i det neste trinn.

Til en suspensjon av 6,6 g 1-pentynylkobber i

110 ml ether ble tilsatt n-butyllithium (23 ml av en 2,2 M hexanløsning) ved -40° C. Den resulterende oppslemming av lithium (butyl)(l-pentynyl)cuprat ble opprettholdt ved denne temperatur i 1 time og ble deretter avkjølt til -70° C. En løsning av 18-acetoxyforbindelsen erholdt i det foregående avsnitt i 15 ml ether ble tilsatt. Etter 6 minutter ved -70° C ble 2 ml methanol tilsatt, etterfulgt av mettet vandig ammoniumkloridløsning. Blandingen ble deretter fortynnet med ether og filtrert gjennom Celite. Det organiske lag ble fraskilt, vasket med IN saltsyre, og mettet vandig natriumbicarbonat, og ble deretter tørket og konsentrert.

Det resulterende residuum ble kromatografert på silicagel under anvendelse av ethylacetat/hexan under dannelse av 3,3,20,20-bis(ethylendioxy)-18-vinylidenpregn-5-en som ble omkrystallisert fra methylenklorid/hexan.

En løsning av 1,1 g av 18-vinylidenforbindelsen erholdt i foregående avsnitt i 15 ml aceton ble behandlet med en katalyttisk mengde p-toluensulfonsyre over natten ved romtemperatur. Den resulterende løsning ble konsentrert og residuet ble løst i ether. Etherløsningen ble vasket med mettet, vandig natriumbicarbonat og deretter med saltvann og tørket, og løsningsmidlet ble fordampet. Residuet ble renset ved kromatografi på silicagel under anvendelse av ethylacetat/hexan, etterfulgt av omkrystallisering fra methylenklorid/hexan under dannelse av 18-vinylidenpregn-4-en-3,20-dionf smp. 104,5-106°C. Denne forbindelse har følgende

strukturformel:

Eksempel 2

En blanding av 3,5 g 18-cyano-3,3-ethylendioxy-pregn-5-en-20-on, ,2,8 g ethylenglycol, 0,2 g p-toluensulfonsyre og 4 5 ml benzen ble kokt under tibakeløpskjøling i 16 timer under anvendelse av en Dean-Stark-vannfelle. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt, vasket med vandig mettet natriumcarbonat, vann og saltvann, og ble deretter tørket hvorpå lsøningsmidlet ble fordampet. Det urene restprodukt ble løst i vannfri tetrahydrofuran og kjølt til

-70° C. Diisobutylaluminiumhydrid (9,1 ml av en IM løsning) ble dråpevis tilsatt, og løsningen fikk oppvarmet langsomt til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med ether og helt over i vandig IN saltsyre. Ether-laget ble fraskilt, vasket med IN saltsyre, natriumbicarbonat og saltvann, og ble tørket, hvorpå løsningsmidlet ble fordampet. Residuet ble renset ved kromatografi på silicagel, og ble omkrystallisert under dannelse av 3,3,20,20-bis(ethylen-dioxy ) pregn-5-en-18-carboxaldehyd. En løsning av lithiumdiisopropylamid ble fremstilt fra 0,67 g diisopropylamin og 2,9 ml 2,2 M hexan-løsning av n-butyllithium i 10 ml tetrahydrofuran, og ble avkjølt til -70° C og deretter tilsatt til en løsning av 2,3 g (klor-methyl)trifenylfosfoniumklorid i 10 ml tetrahydrofuran.

Til den resulterende [(klormethylen)trifenylfosforan]-løsning ble tilsatt en løsning av 2,8 g 3*3,20,20-bis(ethy-lendioxy )pregn-5-en-18-carboxaldehyd i 10 ml vannfri tetra-hydrof uran. Blandingen fikk deretter oppvarmes til romtemperatur før den ble tilsatt vann og ekstrahert med ether. Etherekstraktet ble tørket og konsentrert, og produktet ble renset ved kromatografi på silicagel under dannelse av 18-(2-klorethenyl)-3,3,20,20-bis(ethylendioxy)pregn-5-en som

en blanding av cis- og trans-isomerer.

En løsning av lithium-diisopropylamid ble fremstilt fra 0,3 g diisopropylamin og n-butyllithium i 10 ml tetrahydrofuran ved -70° C, og til denne kalde lsøning ble tilsatt en løsning av 1,5 g av 2-klorethenylforbindelsen erholdt ovenfor, i 5 ml tetrahydrofuran. Blandingen ble omrørt ved -70° C i 1,5 timer og ble deretter tilsatt vandig mettet ammoniumklorid. Blandingen ble ekstrahert med ether og etherekstraktet ble vasket med 1 N saltsyre, mettet vandig natriumbicarbonat og saltvann. Løsningen ble deret-tet tørket og løsningsmidlet fordampet. Det urene residuum 3,3,20,20-bis(ethylendioxy)-18-ethynylpregn-5-en ble løst i 25 ml aceton, en katalytisk mengde p-toluensulfonsyre ble tilsatt, og blandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Acetonet ble deretter fordampet og residuet løst i kloroform. Kloroformløsningen ble tørket med mettet natriumbicarbonatløsning og tørket, og løsningsmidlet ble fordampet. Det erholdte residuum ble kromatografert på silicagel under anvendelse av ethylacetat/hexan under dannelse av 18-ethynylpregn-4-en-3,20-dion som ble ytterligere renset ved omkrystallisering fra methylenklorid/hexan, smp. 164-169°C. Denne forbindelse har følgende strukturformel:

Eksempel 3

En løsning av 4,2 g 18-ethynylpregn-4-en-3,20-dion i 125 ml methanol ble avkjølt til 0° C, og 950 mg natriumborhydrid ble tilsatt. Den resulterende blanding ble omrørt ved 0° C i 1 time, og fikk deretter oppvarmes til romtemperatur i ytterligere 1 time. Eddiksyre ble deretter tilsatt og løsningen konsentrert. Det resulterende residuum ble suspendert i ethylacetat, vasket med vann, vandig natriumbicarbonat og saltvann, og ble tørket hvorpå løsningsmidlet ble fordalmpet. Residuet ble løst i 400 ml kloroform, 42 g aktivert mangandioxyd ble tilsatt, og den resulterende suspensjon ble omrørt i 24 timer. Det uorga-niske faste materiale ble fjernet ved filtrering gjennom Celite, og filterkaken ble vasket grundig med varm kloroform. Filtratet ble konsentrert og residuet renset ved omkrystallisering fra aceton/hexan under dannelse av 18-ethynyl-20-hydroxypregn-4-en-3-on.

Denne forbindelse ble først behandlet med ethylenglycol og p-toluensulfonsyre i benzen, og ble deretter oxy-dert med pyridiniumklorchromat under dannelse av 3,3-ethylen-dioxy-18-ethynylpregn-5-en-20-on.

En blanding av 3,8 g 3,3-ethylendioxy-18-ethynyl-pregn-5-en-20-on og 4,4 g blytetraacetat i 50 ml eddiksyre ble oppvarmet til 70° C i 24 timer. Blandingen ble deretter avkjølt og helt over på vann og ble ekstrahert med ether. Etherekstraktet ble vasket med vann, vandig natriumbicarbonat og saltvann, ble deretter tørket og konsentrert. Residuet ble kromatografert på silicagel under anvendelse av ethylacetat/hexan under dannelse av 21-acetoxy-3,3-ethylendioxy-18-ethynylpregn-5-en-2 0-on.

Det ovenfor angitte produkt ble behandlet først med aceton og p-toluensulfonsyre og deretter med natrium-hydroxyd i ethanol under dannelse av 18-ethynyl-21-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dionT smp. 167-170°C. Denne forbindelse har følgende strukturformel: