NO133088B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til mikrobiologisk hydrering, dehydrering, hydroksylering og avspaltning av sidekjeder av steroider.

Den foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte til mikrobiologisk hydrering, dehydrering, hydroksylering og side-kjedeavspaltning av steroider ved hjelp av sporer som er oppstått ved fermentering, og mere spesielt en forbedring som består i at forbindelsene fremstilles med sporer i det vesentlige fri for vegetativt vekstmateriale, dvs. mycelin og mesk som er fremkommet under gjæringen, og i det vandig medium som i hovedsaken er fritt for næringsstoffer. Fremgangsmåten kan tillempes til å innføre oksygen i steroider eller i disses intermediære forbindelser og til innføring av dobbeltbindinger i steroider eller deres intermediære.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte til mikrobiologisk fremstilling av steroider ved hjelp av sporer som er frembrakt av vegetativt vekstmateriale under fermentering i et næringssubstrat, be-stående i at sporene skilles fra det vegetative vekstmateriale og næringsstoffer som inneholdes i gjæringssubstratet, hvorpå den mikrobiologiske fremstilling foregår i et i det vesentlige vekstmaterialfritt og næringsfritt vandig medium.

Tidligere har man for det meste utført mikrobiologisk fremstilling av kjemiske

forbindelser av steroidtypen i et gjærings-medium som inneholder slike næringsstoffer som maisvørter, soyamel og lignende, sammen med melasse, sakkarose osv. (for å skaffe assimilerbare kilder for både nitrogen og karbon) og i nærvær av det fremkomne mycelium og den mesk som er opp-

stått under gjæringen. (Se U.S. patent nr.

2 753 290 og U.S. patent nr. 2 793 162). Den

mikrobiologiske fremstilling av forbindelser av steroidtypen er også blitt gjort med både myceliet alene og mesken alene. Man har også foreslått å bruke den væske som samr ler seg oppå opphakket mycelium. (Se U.S. patent nr. 2 602 769, særlig eksempel 18 i spalte 33—34). Som fremhevet i dette eksempel ga den væske som fløt oppå (S 11) adskillig omdannelse, mesken (BF) ga bed-re omdannelse, og myceliumresten ga fullstendig omdannelse.

Utvinning av de omdannete steroider fra et komplekst utgjæret medium bød på åpenbare problemer. Utvinning med godt utbytte enten fra den vegestative vekst som inneholder mycelium, eller fra den utgjæ-rete mesk som inneholder organiske næringsstoffer, som begge er forurenset med biprodukter av gjæringen, byr også på problemer. I betraktning av dette har man innen faget søkt etter fremgangsmåter til forbedret utvinning (f. eks. ekstraksjon) såvel som midler til å utføre omdannelsen med enzymene selv, fri for mycelium <p>g mesk. Hva dette siste angår er det ikke berettet om noen tilfredsstillende enzym-ekstrakt som gir fullstendig omdannelse, og av denne grunn bruker man ved teknisk fremstilling enten hele det fermenterte medium som inneholder både mycelin og mesk, eller myceliet alene, eller mesken alene, fremstilt ved filtrering av den ut-gj ærete mesk.

Under våre undersøkelser over omdannelsen av fett, f. eks. melkefett, til meget aromarike forbindelser med muggsopp av penicilliumtypen, f. eks. P. roqueforti, la vi merke til at den gjæringsperiode hvor det ble brukt vegetativt inoculum (muggceller i mycelform i et næringssubstrat) var relativt kort, f. eks. 2 dager, sammenlignet med gjæringsperioden når det ble brukt mugg-komidier eller konidiesporer, f. eks. 4 dager. Vi la også merke til at gjæringsperioden med f. eks. 7 dager gammelt, sporeholdig vegetativt inoculum eller sporer alene var lenger enn det som trengtes med ungt, f. eks. 2 dager gammelt, idet vesentlige spore-fritt vegetativt inoculum. Dette lot til å stadfeste noe man lenge hadde antatt, nemlig at sporer i seg selv, i sammenlig-ning med de stoffskiftemessig meget aktive sterke, unge mycelieceller var så å si in-aktive, dvs. relativt inerte eller i dvaletil-stand. Ved fortsatte undersøkelser viste denne antagelse seg å være uriktig.

Denne oppdagelse av sporeaktivitet på fettsyreområdet førte videre til den oppdagelse at sporer som var fri for næringssubstrat, omfattende både mycelium og utgjæret mesk, kunne brukes alene til omdannelse av steroider på forskjellige må-ter, som nærmere beskrevet nedenfor.

De sporer som brukes i den foreliggen-i de oppfinnelse kan lett fåes av vegetative celler (mycelium) som har fått vokse i 4 til 6 dager i neddykket kultur med lufttil-gang (f. eks. rysting) i vandig maisvørter-laktose eller et annet næringssubstrat som leverer assimilerbart karbon og nitrogen overensstemmende med kjente fremgangsmåter innen faget. De sporer som produse-res av de gamle vegetative celler høstes ved først å sile gjennom et osteklede for å fjerne det meste av myceliet og derpå filtrere gjennom glassull for å fjerne resten av myceliet. Sporene i filtratet utvinnes ved sentrifugering, og de vaskes så med vann for å fjerne eventuelt gjenværende næringssubstrat. De kan lagres i tørr tilstand eller suspendert i destillert vann og opp-bevart ved 4°C. Man kan standardisere sus-pensjonen så den inneholder f. eks. omkring en milliard sporer pr. ml. Man kan også la sporene vokse på en overflatekultur, f. eks. næringsagar, og etter at sporene er skrapt av og suspendert i vann kan de fåes i meget nær ren form ved filtrering, sentrifugering o. 1. som beskrevet ovenfor. Man bør bruke overflatekulturer der hvor orga-nismen ikke eller bare dårlig danner sporer i neddykket kultur. Fungusarter av klassen Mucorales, f. eks. Rhizopus nigricans, avgir ikke sine sporer i væskekultur, og sporer av denne fungus som skal brukes i henhold til oppfinnelsen bør derfor lages ved overflatekultur som ovenfor nevnt. Hvis man ikke på forhånd vet hvilken fremgangsmåte som er best egnet til høy sporeproduksjon, kan man lett fastslå dette ved en forberedende prøve.

De følgende eksempler tjener til å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Et glukose-neopepton næringssubstrat (Sabourada medium) som var gjort fast med 2 pst. agar ble først podet med Aspergillus ochraceus etter vanlig fremgangsmåte og dyrket ved ca. 30°C i omtrent 5 dager. De sporer som fremkom i løpet av denne tid ble vasket av overflaten av det oppvokste vegetative mycel med destillert vann. Den vandige suspensjon, som var forurenset med noe mycelium og næringssubstrat ble filtrert gjennom glassull for å fjerne myceliet sammen med eventuelt uoppløst substrat, og sentrifugert for å ut-vinne sporene. De oppløselige bestand-deler av substratet som ble tilbakeholdt av sporene ble så fjernet ved å suspendere dem i destillert vann og sentrifugere for å ut-vinne sporene. Denne vasking (ved at sporene påny suspenderes i destillert vann og sentrifugeres) kan gjentas hvis det er nød-vendig eller ønsket, for å være sikker på at sporene i alt vesentlig er fri for alt for-urensende næringssubstrat og mycelium.

De sporer man fikk på denne måten ble suspendert i destillert vann pufret med ca. 1 pst. fosfatpuffer til pH 6,5—7,0, så det fremkom en suspensjon med ca. 1—10 mil-liarder sporer pr. ml. Til ca. 20 ml av denne suspensjon i en 125 ml erlenmeyerkolbe ble det så satt 1 mg progesteronglykol oppløst i

1 ml propylenglykol. Siden glykolet er

blandbart med vann og progesteronet ikke, faller progesteronet ut av oppløsningen som en fin suspensjon når det settes til den pufrede vandige oppløsning. Den fremkomne spore-progesteronsuspensjon ble så luftet ved rysting i et roterende ryste-apparat med ca. 150 omdreinger pr. minutt med ca. 6,35 mm radius i 12 timer ved omkring 25°C.

Ved slutten av denne tid ble suspen-sjonene med sporer og steroid ekstrahert

med kloroform og ekstrakten sentrifugert for å fjerne uoppløselig stoff og den vandige fase fra kloroformen. Den fremkomne sporefri klare ekstrakt inneholder det ønskede 11-alfa-hydroksyprogesteron og man utvant lett steroidet ved å drive av kloroformen under redusert trykk. Undersøkel-se av produktet sammenlignet med en

kjent, ekte prøve av 11-alfa-hydroksyprogesteron, viste at så å si 100 pst. av progesteronet var blitt omdannet til det ønskede 11-alfa-hydroksyderivat. Dette viser at den 12 timers tid som var brukt til omdannelse, var tilstrekkelig og antyder at ennu kortere tid muligens kan brukes til å fullføre introduksjonen av en hydroksyl-gruppe i progesteron med sporer av A. ochraceus i et medium som i det vesentlige er fritt for mycelium og næringssubstrat. I praksis kan man avpasse forholdet mellom tid og sporekonsentrasjon så den passer til spesielle arbeidsforhold.

Eksempel 2.

Dette eksempel er utført på samme måte som eksempel 1 med sporer stam-mende fra en 10—14 dager gammel kultur av Septomyxa affinis, og Reichsteins forbindelse S i en fosfatpuffer ved pH 7. Etter 24 timer ble den fremkomne A-l-forbindelse (forbindelse S med en 1—2 dobbeltbinding) utvunnet slik som beskrevet i eksempel 1. I dette eksempel undergår steroidmolekylet dehydrogenering, og det innføres en dobbeltbinding i molekylet.

For hurtig omdannelse ved sporenes hjelp bør forbindelsen være til stede med liten partikkelstørrelse. Dette oppnår man lett ved å oppløse steroidet f. eks. i et inert organisk oppløsningsmiddel som er blandbart med vann såsom lavere alkoholer (me-tanol, ethanol etc), vannoppløselige gly-koler, aceton eller lignende, hvorpå denne organiske oppløsning settes til den vandige sporesuspensjon. Når dette gjøres vil som ovenfor nevnt steroidet falle ut av opp-løsningen i den ønskede form som en fin suspensjon. Man får også en lett utvinning av det omdannede steroid med det ønskede høye utbytte ved å bruke organiske opp-løsningsmidler som lett oppløser steroidet, siden det ikke finnes noen vegetativ vekst (mycelium) eller noen mesk med gjenværende næringsstoffer og heller ingen komplekse biprodukter som er dannet under gjæringen. Videre er det av meget stor betydning at sporene etter bruken lett kan gjenvinnes og brukes påny. I dette øyemed bør steroidet i reaksjonsblandingen for-trinnsvis bringes i oppløsning med et opp-løsningsmiddel som er blandbart med vann, såsom propylenglykol, hvorpå blandingen sentrifugeres til gjenvinning av sporene, hvorpå det sporefri medium underkastes ekstraksjon for utvinning av steroidet som ovenfor angitt. De gjenvunne sporer, som helst bør vaskes med vann, kan brukes opp igjen hvis de oppbevares i et medium som mangler ett eller flere av de stoffer som får sporene til å spire. Fremgangsmåten med å bruke bare sporer, og oppdagelsen av at de kan brukes om igjen, representerer klare forbedringer i forhold til de gjær-ingsprosesser som er brukt tidligere.

Fremgangsmåten kan utføres med rent oksygen såvel som med luft under omdannelsen av steroidene. Lufttilførselen kan også skje hvis man ryster med de oksygen-holdige gasser under trykk. En liten mengde KCN (0,65 M) eller CO kan tilsettes sporemediet under omdannelsen, og også en liten mengde (f. eks. 0,5 pst.) glukose. I alminnelighet har man funnet at en liten mengde oksyderbar substant som glukose, eddiksyre, melkesyre og lignende vil øke utbyttet. Disse modifikasjoner kan også hjelpe til en hurtig eller fullstendig omdannelse av steroidene, men hvis man bruker glukose eller lignende er det viktig at mediet holdes fritt for assimilerbart nitrogen for å hindre spiring.

På en måte i likhet med den ovenfor beskrevne kan man få sporer frie for mycelium og næringssubstrat av forskjellige organismer, og disse kan brukes til gjennom-føring av i og for seg kjente hydreringer, dehydreringer, hydroksyleringer og sidekje-deavspaltninger av steroider. I så fall må de i det følgende beskrevne litteratursteder modifiseres overensstemmende med oppfinnelsen. Dette vil si at det vegetativt vok-sende materiale som er nevnt i litteratur - stedene erstattes med sporer av angjelden-de fungi, i det vesentlige fri for mycelium og næringssubstrat, idet dette siste erstattes med ett i hovedsaken næringsfritt medium.

Som eksempel anføres følgende mikrobiologiske modifikasjoner av steroider: 1. Reduksjon av progesteron til A4-preg- nen-20|3-ol-3-on med Streptomyces lavendulae. Fried. J. et al., J. Am. Chem. Soc, 75: 5764 (1953). 2. Dehyrogenering av sekundære alkoholer.

a. A5-androsten-3|3,17f5-diol til testo-steron med Proactinomyces erythro-polis. Turfitt, G. E., Biochem. J. 0:79

(1946).

b. østradiol til østron med Streptomyces albus. Welsh, M. et al., Compt. rend soc. biol., 142:1QU (1948). 3. Hydroksylering i 1-stilling.

A4-androsten-3,17-dion til A4-andro-sten-la-ol-3,17-dion med Penicillium sp., Dodson, R. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 79:3921 (1957). 4. Hydroksylering i 2-stilling.

A4-pregnen-17ci,21-diol-3,20-dion til

A4-pregnen-2|3,17a,21-triol-3,20-dion med Streptomyces sp., Herzog, H. L. et

al., J. Am. Chem. Soc, 79:3922 (1957). 5. Hydroksylering i 6-stilling. Propesteron til A4-pregnen-6|3-ol-3,20-dion med Streptomyces aureofaciens. Fried, J. et al., Recent Progr. Hormone Res. 11:151 (1955). Se også Dulaney, E. L. et al., Mycologia, 47:464 (1955);

Fried, J. et al., J. Am Chem. Soc. 74: 3962 (1952); Meister, P. D. et al., J. Am. Chem. Soc, 75:416 (1953) og Eppstein, S. H. et al., J. Am. Chem. Soc. 75:408

(1953) omfattende mikroorganismene

Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger

og Rhizopus arrhizus.

6. Hydroksylering i 7 stilling. Progesteron til A4-pregnen-7a-ol-3,20-dion med Phycomyces blakesleanus. Fried et al., U.S. patent 2 753 290. Se også Meystre, C. et al., Heiv. Chim. Acta. 38:381 (1955) som brukte en art av Peziza til en lignende reaksjons-type på deoksycorticosteron. 7. Hydroksylering i stillingene 10, 11 eller 12. a. 19-nor-progesteron til lOg-hydrok-syl-19-norprogesteron med Rhizopus. nigricans. Pedersons, R. L. et al., J. Am. Chem. Soc, 75:1512 (1956). b. Progesteron til A4-pregnen-lla-ol-3,20-dion med Rhizopus arrhizus. Peterson, D. H. et al., J. Am. Chem., Soc. 74:1871 (1952). Se også Peterson, D. H. et al., J. Am. Chem. Soc 75:412 (1953). c. Reichsteins forbindelse S (A4-preg-nen-17a-21-diol-3,20-dion) til hydrocortison (A4-pregnen-ll|3,17a,21-triol-3,20-dion) med Cunninghamella bla-kesleeana. Hanson, F. R. et al., J. Am. Chem. Soc, 75:5369 (1953). Se også Shull, G. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 77:763 (1955) og Thoma et al., U.S. patent 2 793 162 omfattende lignende re-aksjoner med Curvularia lunata, Tri-chothecium roseum og Coniothyrium helleborine. d. Progesteron til A4-pregnen-12|3-ol-3,20-dion og det beslektede 12(3,15|3-diol med Calnectria decora. Schubert, Al et al., Ber. 90:2576 (1957). 8. Hydroksylering i andre stillinger er beskrevet i Meister, P. D. et al., Abstrs., 123rd meeting Am. Chem. Soc. (1953), Fried et al., U.S. patent 2 753 290, Ca-merino, B. et al., Gazz. Chem. ital, 86: 1226 (1956), Meystre, C. et al.. Heiv. Chim. Acta 35:381 (1955), Perlman D. et al., J. Am. Chem. Soc. 74:2126 (1952), Thoma, R. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 79:4818 (1957), Dulaney, E. L. et al.,

Appl. Microbiol. 3:372 (1955), Meystre, C. et al., Heiv. Chim. Acta, 37:1548

(1954), Mc Aleer, W. J. et al., Arch. Biochem. Biophys., 62:109 (1956).

9. Dehydrogenering.

Hydrocortison til A'-4-pregnadien-llj3, 17a,21-triol-3,20-dion med Streptomyces lavendulae. Fried et al., U.S. patent 2 793 164. Se også Mobile, A. et al., J. Am. Chem. Soc. 77:4184 (1955), Vischer, E. et al., Heiv. Chim. Acta, 35:835 og 38: 1502 (1955) som brukte henholdsvis Alternaria sp. og Didymella lycoperici. Se også Spero et al., J. A. C. S. 75:6213

(1956) angående bruk av Septomyxa

affinis, som i eksempel 2 ovenfor for å innføre en 1—2 dobbeltbinding.

10. Avbygning av sidekjede.

Progesteron til A'-4-androstadien-3,20-dion med Streptomyces lavendulae. Peterson, G. E. et al., J. Bact. 74:684

(1957) . Se også Vischer, E. et al., beret-ning om Fusarium solani og F. cauca-sicum i Experienta 9:371 (1953) som innfører en 1—2 dobbeltbinding med spaltning av sidekjeden. Se også Turfitt, G. E., Biochem. J. 42:376 (1948). Se også U.S. patentene nr. 2 602 769, 2 649 400, 2 649 401, 2 649 402, 2 695 260, 2 735 800, 2 753 290, 2 762 747, 2 768 928, 2 789 940, 2 802 775, 2 809 919, 2 812 285 og 2 830 937 som innbefatter mikroorganismer som danner sporer som kan brukes i et vegetativt vekst^næringsfritt medium iføl-ge de beskrevne fremgangsmåter. Som ovenfor anført utføres prosessene overensstemmende med de fremgangsmåter som er beskrevet under ovenstående hen-visninger med unntagelse av at (1) det vegetative vekstmateriale som er brukt i den refererte prosess erstattes med sporer av den samme organisme i det vesentlige frie for vegetativt vekststoff, og (2) at det vandige næringssubstrat eller den mesk som brukes i den omtalte prosess erstattes med et vandig medium, som i alt vesentlig er fritt for næringsstoffer. Den tid som kreves til fullstendig omdannelse med sporer (og som man i hvert tilfelle lett kan fastslå ved preliminærforsøk) blir i alminnelighet betydelig forkortet, og utbyttet vesentlig økt i forhold til de tidligere fremgangsmåter. Bortsett fra tidsgevinsten er utvinningen av det modifiserte stoff med godt utbytte (som igjen kan utføres på samme måte som i den refererte prosess) meget lettere fra den relativt rene reak-sjonsblanding ifølge oppfinnelsen enn fra de tidligere fermenteringsblandinger som inneholder vegetativt vekstoff, organiske næringsstoffer, biprodukter av disse osv. Rensning av den modifiserte forbindelse etter isoleringen er også meget lettere ved fremgangsmåten etter oppfinnelsen enn det er mulig fra de sterkt forurensede blan-dinger som ble brukt ved de tidligere fremgangsmåter. Av det ovenstående vil det fremgå at fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse med anvendelse av sporer kan brukes i ethvert tilfelle hvor man tidligere har brukt mycelium og mesk fremkommet ved fermentering av de organsimer som hittil er blitt anvendt. Bruk av et steroid med en 11-methylengruppe og sporer av Aspergillus (se Murray et al., U.S. patent 2 649 402) og Penicillium (se Murray et al., U.S. patent 2 649 400) og slike organismer som Septomyxa affinis som innfører 1—2 dobbeltbindinger, kan nevnes som eksempel og er blandt de foretrukne typer.

Man kan få i stand to omdannelser samtidig ved å bruke sporer av forskjellige

fungi. Forskjellen kan være så liten som bare forskjellige stammer av den samme fungus, eller så stor som en forskjell i klasse. Enn videre kan forskjellen være frembrakt ved mutasjon av en bestemt organisme.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til mikrobiologisk hydrering, dehydrering, hydroksylering og avspaltning av sidekjeder av steroider, karakterisert ved at man fremkaller omdannelsen ved sporer som er skilt fra mycel og kulturvæske og derefter vasket, i ett i det vesentlige næringsfritt medium, hvor sporene ikke kan spire.