NL9401082A - Werkwijze voor het detecteren van mutaties. - Google Patents

Description

WERKWIJZE VOOR HET DETECTEREN VEN MUTATIES

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van mutaties in het genoom van een individu.

Het genetische materiaal verschilt van individu tot individu, omdat elk genoom uniek is. Genetische variatie kan vastgesteld worden door middel van hybridisatie-analyse na electroforetische scheiding van DNA-fragmenten, die gegenereerd zijn door het fragmenteren van bijvoorbeeld het genoom-DNA. Het electroforetische patroon kan van de gel overgebracht worden naar een nitrocellulose-filter. Door middel van een bijvoorbeeld radioactief gelabelde probe kunnen de delen van het genoom die met de probe hybridiseren met behulp van een röntgenfoto van het filter zichtbaar gemaakt worden. De positie van het zichtbaar gemaakte fragment is een maat voor de grootte van het fragment.

Wanneer bij het gebruik van één probe de positie van een band varieert tussen individuen is er sprake van polymorfisme. Polymorfisme wordt veroorzaakt door mutaties in bepaalde gebieden in het genoom. Dergelijke mutaties kunnen basesubstituties, maar ook inserties en deleties zijn. Door dergelijke mutaties wordt het loopgedrag van een fragment in een gel beïnvloedt. Polymorfisme kan bijvoorbeeld gebruikt worden voor het identificeren van een individu, zoals bij vaderschapsbepalingen en in de forensische geneeskunde.

Een hoge mate van polymorfisme wordt over het algemeen aangetroffen in niet-coderende delen van het genoom. In de genen komt logischerwijze minder polymorfisme voor. Genen kunnen echter wel enigszins gemuteerd zijn. Dergelijke mutaties kunnen leiden tot mutaties in de gecodeerde eiwitten of zelfs volledige inactivatie van het gen. Dergelijke fenomenen kunnen bepaalde ziektebeelden of andere afwijkingen veroorzaken. Bepaalde polymorfe gebieden, die zeer nabij de gemuteerde genen gelegen zijn kunnen samen met deze genen, die bijvoorbeeld erfelijke ziekten veroorzaken, overerven. Polymorfisme kan in dergelijke gevallen gebruikt worden bij het opsporen van de defecte genen.

Omdat niet alle defecte genen gekoppeld zijn aan polymorfe gebieden en omdat informatie omtrent mutaties in coderende gebieden zelf belangrijk kan zijn voor de analyse van de genetische basis van bepaalde ziekten is het van belang om ook die mutaties in de coderende gebieden zelf te kunnen opsporen.

Zoals boven reeds vermeld, wordt bij het opsporen van variaties in het genoom over het algemeen gebruik gemaakt van de electroforetische scheiding van DNA-fragmenten op een gel. De scheiding kan in één of twee dimensies plaats vinden, waarbij een tweedimensionale scheiding vaak een betere resolutie van de fragmenten geeft.

De werkwijze voor het bepalen van DNA-sequentie-variaties door middel van een tweedimensionale polyacrylami-degel is bekend uit Europees octrooi 349.024. Bij deze werkwijze wordt dubbelstrengs DNA geknipt met één of meerdere restrictie-enzymen. De verschillende fragmenten worden door middel van electroforese in twee richtingen gescheiden op basis van twee onafhankelijke criteria, bijvoorbeeld lengte en basepaarsequentie. Door het overbrengen van het schei-dingspatroon naar een nitrocellulose filter, het met de gescheiden fragmenten laten hybridiseren van een radioactieve probe en het vervolgens autoradiograferen van het filter kan het scheidingspatroon zichtbaar gemaakt worden.

Bij de bekende werkwijze verschijnen de fragmenten in de vorm van een donkere vlek op de film. De positie van een fragment is specifiek voor zijn lengte en basepaarsamen-stelling. Tussen fragmenten die op dezelfde plaats terecht komen kan echter geen onderscheid gemaakt worden. Met de bekende methodes kan dus slechts één set fragmenten tegelijk geanalyseerd worden.

Daarnaast is de bekende werkwijze door de verschillende stappen zeer arbeidsintensief. Bovendien is voor elke te onderzoeken set DNA-fragmenten naast een aparte gel en een apart filter ook nog een röntgenfilm nodig. Deze materialen en ook de voor ontwikkeling van de film benodigde chemicaliën brengen uiteraard ook extra kosten roet zich mee. Afvalchemicaliën zijn tevens milieubelastend en radioactieve probes kunnen schadelijk zijn voor de gezondheid van degene die ermee werkt. Bovendien ontstaat bij het werken met radioactieve probes radioactief afval. Daarnaast kan het resultaat van het experiment pas na enige tijd verkregen worden.

Het is het doel van de uitvinding een werkwijze voor het detecteren van mutaties in DNA van één of meer individuen te verschaffen, waarbij op eenvoudige en snelle wijze DNA van verschillende individuen tegelijkertijd onderzocht kan worden.

Dit wordt door de uitvinding bereikt door het detecteren van mutaties in het genoom van een individu, omvattende de stappen: a) het amplificeren van tenminste één te onderzoeken fragment uit het genoom; b) het koppelen van een voor het individu uniek label aan het (de) geamplificeerde DNA-fragment (en); c) het verschaffen van (een) van een ander uniek-label voorzien(e), met het (de) te onderzoeken fragment(en) overeenkomend(e) referentiefragment (en); d) het mengen van het (de) fragment (en) en het (de) referentiefragment(en); e) het vervolgens door middel van electroforese scheiden van het mengsel; f) het zichtbaar maken van de unieke labels; en g) het vergelijken van het labelpatroon van het (de) testen fragment (en) met het labelpatroon van het (de referentiefragment(en).

Het voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat meerdere personen of meerdere genen op één enkele polyacrylamidegel gescanned kunnen worden. Dit spaart naast veel tijd ook materiaal en wordt er minder af val gegenereerd. Bovendien is het resultaat direct na de scheiding reeds beschikbaar.

Bij voorkeur is de scheiding een tweedimensionale scheiding, waarbij het mengsel in één richting wordt ge- scheiden op basis van verschillen in grootte en in de andere richting op basis van verschillen in basepaarsamenstelling van de fragmenten. De scheiding in de tweede dimensie kan bijvoorbeeld plaats vinden in een denaturerende gradiënt. Fragmenten met een hoog GC-gehalte zullen bij een hogere concentratie van het denaturerende middel uitsmelten en stoppen dan fragmenten met een hoog AT-gehalte. Op deze wijze worden verschillen in basepaarsamenstelling zichtbaar gemaakt. Een tweedimensionale scheiding heeft daardoor een hogere resolutie dan een ééndimensionale scheiding.

In een praktische uitvoering van de werkwijze worden de te onderzoeken DNA-fragmenten met behulp van een DNA-amplificatiemethode vermenigvuldigd. Een dergelijke amplificatiemethode is bijvoorbeeld de polymerasekettingre-actie (PCR). Met de geamplificeerde fragmenten wordt een heteroduplexing uitgevoerd. Vervolgens worden de fragmenten van een individu van een voor dat individu specifiek label, bijvoorbeeld een fluorochroom, voorzien. Daarna worden de fragmenten op een polyacrylamidegel in twee richtingen gescheiden.

Bij de scheiding zullen identieke fragmenten van verschillende personen op exact dezelfde plaats in de gel terechtkomen. Wanneer vervolgens het label zichtbaar gemaakt wordt zullen fragmenten, die ten opzichte van het overeenkomende niet- (of anders) gemuteerde fragment van een tweede individu gemuteerd zijn, op een andere plaats in de gel terechtgekomen. Nu is zichtbaar welk fragment één of meer mutaties bevat doordat de twee labels niet samenvallen.

Bij voorkeur is het label een fluorochroom dat na met zichtbaar of onzichtbaar licht van een bepaalde golflengte te zijn aangeslagen terugvalt onder uitzending van licht met een voor dat fluorochroom specifieke golflengte. Daarnaast kan iedere andere chemische verbinding gebruikt worden, die aan een DNA-molecuul gekoppeld kan worden, op de één of andere manier aangeslagen kan worden en binnen korte tijd onder uitzending van licht met een specifieke golflengte terugvalt naar de grondtoestand.

Het aanslaan kan eventueel ook plaatsvinden met behulp van electromagnetische straling.

De labels kunnen ook onafhankelijk van elkaar of in elke gewenste combinatie zichtbaar gemaakt worden. Zo zouden bijvoorbeeld de patronen van een groot aantal patiënten één voor één met de controle vergeleken kunnen worden.

Het "uniek label" wordt verder ieder ander molecuul bedoeld dat zich door middel van een waarneembaar kenmerk onderscheidt van andere overeenkomende moleculen. Naast fluorochromen valt daarbij te denken aan elementen, die elk een uniek NHR-spectrum vertonen. Voorbeelden van te gebruiken elementen zijn goud, zilver, nikkel, ijzer etc..

De fragmenten van een persoon worden dan voorzien van een voor die persoon uniek element dat later met behulp van bijvoorbeeld NMR, röntgendiffractie of andere technieken onderscheiden kan worden.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het label gevormd door fluorochromen, die na excitatie elk licht met een duidelijk waarneembare kleur uitzenden. Wanneer de set DNA-fragmenten van één patiënt met een geel fluorochroom gelabeld wordt en de controle met een blauw fluorochroom zullen samenvallende fragmenten aanleiding geven tot groene spots. In geval van een mutatie zal enerzijds een blauwe spot op de plaats van het niet-gemuteerde gen en anderzijds een gele spot op een geheel andere plaats waarneembaar zijn.

Wanneer de DNA-fragmenten van meerdere patiënten, welke per persoon gelabeld zijn met een voor die patiënt specifiek label, tezamen met een controle op een gel gebracht worden kan tegelijkertijd het DNA van een groot aantal patiënten onderzocht worden. Niet alleen wordt de tijdrovende stap van het overbrengen van de fragmenten naar een nitrocellulosefilter, het hybridiseren en vervolgens autoradiograferen, hiermee vermeden maar tevens bestaat nu de mogelijkheid om met behulp van één gel een groot aantal patiënten tegelijk te screenen. Dit spaart naast materiaal ook tijd. Een bijkomend voordeel is dat doordat de fragmen- ten niet overgebracht hoeven te worden naar een filter er ook geen fragmenten meer verloren kunnen gaan.

De uitvinding betreft verder een inrichting voor het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding. De inrichting bestaat uit een drager voor een gel, een aan één zijde van de gel geplaatste lichtbron, die licht uitzendt met een zodanig golflengtebereik dat alle in het labelpa-troon voorkomende exciteerbare labels daarmee aangeslagen kunnen worden, een aan de andere zijde van de gel geplaatst filter, dat het door de lichtbron uitgezonden licht niet en het door de exciteerbare labels uitgezonden licht wel doorlaat, en middelen voor het waarnemen van het patroon van door de exciteerbare labels uitgezonden licht.

Het labelpatroon kan uiteraard ook met het oog waargenomen worden. In geval van een klein aantal patiënten met duidelijk onderscheidbare kleurlabels is dat nog wel doenlijk. Wanneer echter het aantal patiënten groter wordt en de labels minder gemakkelijk van elkaar te onderscheiden zijn bevat de inrichting bij voorkeur een scanner, die de door elke spot uitgezonden golflengten kan detecteren.

Bij voorkeur is de inrichting verder voorzien van een verwerk ingseenheid voor het analyseren van het door de waarnemingsmiddelen waargenomen lichtpatroon. Wanneer het mogelijk is de scheiding te standaardiseren kunnen de resultaten automatisch vergeleken worden met in de verwerkings-eenheid opgeslagen gegevens. Hierdoor kan de diagnostiek voor een groot deel geautomatiseerd worden.

Wanneer het gewenst is het uitgezonden labelpatroon vast te leggen kan de inrichting tevens een registra-tie-eenheid bevatten. Hierbij valt te denken aan een foto-of videocamera.

Toepassingen van de uitvinding worden bijvoorbeeld gevonden in de prenatale of preconceptieve diagnostiek.

In de begeleidende figuren 1 en 2 wordt het principe van de uitvinding geïllustreerd. In figuur 3 wordt schematisch een uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding getoond.

De figuren 1 en 2 worden besproken in het bijgaande voorbeeld.

Figuur 3 toont een schematisch overzicht van een uitvoeringsvorm volgens de uitvinding. De gel 1 bevindt zich op een niet getoonde drager. De drager kan een aparte drager zijn maar ook gevormd worden door één of beide glasplaten van de oorspronkelijke gelopstelling. Daarnaast kan de gel ook direct op het filter geplaatst worden. Hierbij doet het filter dienst als drager. Aan één zijde van de gel bevindt zich een filter 2. Aan de andere zijde bevindt zich een lichtbron 3 met een geschikt golflengtebereik, bijvoorbeeld een UV-lamp. Aan de van de gel af gekeerde zijde van het filter bevindt zich een scanner 4. Het filter 2 laat het door de lamp 3 uitgezonden en door de gel vallende licht niet door naar de scanner 4. Het door de fluorochromen in de gel 1 geëmitteerde licht wordt echter wel doorgelaten. Met behulp van de scanner kan vastgesteld worden op welke plaats welke golflengte wordt uitgezonden. Aan de hand van die gegevens kan het spotpatroon geanalyseerd worden.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van de bijgaande voorbeelden, die hierbij slechts als illustratie gegeven worden en niet de bedoeling hebben de uitvinding op enigerlei wijze te beperken.

VOORBEELD 1

In dit voorbeeld wordt het gen dat gemuteerd aanleiding geeft tot de ziekte cystische fibrose vergeleken met het overeenkomende niet-gemuteerde gen. Door middel van PCR wordt een amplificatie van de exons van het gen uitgevoerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van primers die hybri-diseren met de uiteinden van de verschillende exons. De op deze wijze gevormde fragmenten van het gemuteerde gen, die in hoofdzaak de gehele exons omvatten, worden gelabeld met een geel licht-emitterend fluorochroom. De fragmenten die gevormd zijn uitgaande van het niet-gemuteerde gen worden met een blauw licht-emitterend fluorochroom gelabeld.

De beide sets fragmenten worden vervolgens gemengd en op een tweedimensionale polyacrylamidegel gescheiden. Na de scheiding wordt de gel belicht waardoor de fluorochromen worden aangeslagen. Het vervolgens door de fluorochromen uitgezonden gele en blauwe licht wordt gedetecteerd als een groene vlek op plaatsen waar de fragmenten identiek zijn, als een blauwe vlek op een plaats waar een fragment van het niet-gemuteerde gen terechtgekomen is, en als een gele vlek op plaatsen waar de gemuteerde fragmenten van het gemuteerde gen aanwezig zijn.

Het resultaat wordt getoond in de figuren IA t/m IC. Figuur IA is een gel met alleen de fragmenten van een patiënt. De fragmenten van het niet-gemuteerde gen worden zichtbaar gemaakt in de gel in figuur 1B. Figuur IC toont de combinatie van beide gels.

Hierin worden de verschillende kleuren aangeduid zoals aangegeven in het onder staande overzicht.

VOORBEELD 2

In dit experiment wordt op dezelfde wijze als in voorbeeld 1 een niet-gemuteerd gen gecombineerd met twee verschillende gemuteerde genen. Het niet-gemuteerde gen is opnieuw gelabeld met een blauwe kleurstof, de gemuteerde genen zijn gelabeld met respectievelijke rode en een groene fluorochromen. De mengkleur van deze drie kleuren licht is wit. Na belichting wordt op alle plaatsen waar zich fragmenten van de drie individuen bevinden wit licht uitgezonden. Het grootste deel van de fragmenten is niet waarneembaar.

Een gemuteerd fragment van de met rood gelabelde persoon is zichtbaar als een rode lichtvlek. Op de oorspronkelijke plaats van dat fragment blijft slechts de combinatie van blauw en groen over omdat het rode licht daar verdwenen is. Op de plaatsen waar het groene licht verdwenen is blijft een paarse vlek over terwijl de groene vlek op een andere plaats zichtbaar is.

In de figuren 2A t/m 2D wordt het resultaat van het bovenstaande experiment schematisch geïllustreerd.

Hierin worden de verschillende kleuren aangeduid zoals aangegeven in het onder staande overzicht.

De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze en inrichting waarmee op snelle en eenvoudige wijze een groot aantal individuen op mutaties in hun genoom onderzocht kan worden. De uitvinding is met name van belang voor de diagnostiek, maar is daartoe niet beperkt.

Claims (11)

1. Werkwijze voor het detecteren van mutaties in het genoom van een individu, omvattende de stappen: a) het amplificeren van tenminste één te onderzoeken fragment uit het genoom; b) het koppelen van een voor het individu uniek label aan het (de) DNA-fragment(en); c) het verschaffen van (een) van een ander uniek-label voorzien(e), met het (de) te onderzoeken fragment(en) overeenkomend (e) ref erentief ragment (en); d) het mengen van het (de) fragment (en) en het (de) referentiefragment(en); e) het vervolgens door middel van electroforese scheiden van het mengsel; f) het zichtbaar maken van de unieke labels; en g) het vergelijken van het labelpatroon van het (de) testen fragment (en) met het labelpatroon van het (de referentiefragment(en).

2. Werkwijze volgens conclusie l, met het kenmerk, dat de scheiding wordt uitgevoerd door middel van tweedimensionale electroforese, waarbij het mengsel in één richting wordt gescheiden op basis van verschillen in grootte en in de andere richting op basis van verschillen in basepaar-samenstelling van de fragmenten

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het DNA wordt geamplificeerd door middel van de PCR-techniek.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het unieke label een fluorochroom is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het fluorochroom zichtbaar gemaakt wordt met behulp van licht.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het unieke label een chemisch element is.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het chemisch element zichtbaar gemaakt wordt met behulp van NMR- of röntgendiffractietechnieken.

8. Inrichting voor het zichtbaar maken van een labelpatroon, bijvoorbeeld gegenereerd met behulp van de werkwijze volgens één der conclusies 1-5, omvattende een drager voor een gel, een aan één zijde van de gel geplaatste lichtbron, die licht uitzendt met een zodanig golflengtebe-reik dat alle in het labelpatroon voorkomende exciteerbare labels daarmee aangeslagen kunnen worden, een aan de andere zijde van de gel geplaatst filter, dat het door de lichtbron uitgezonden licht niet en het door de exciteerbare labels uitgezonden licht wel doorlaat, en middelen voor het waarnemen van het patroon van door de exciteerbare labels uitgezonden licht.

9. Inrichting volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de middelen voor het waarnemen van het uitgezonden lichtpatroon worden gevormd door een scanner.

10. Inrichting volgens conclusie 8 of 9, verder omvattende een verwerkingseenheid voor het analyseren van het door de waarnemingsmiddelen waargenomen lichtpatroon.

11. Inrichting volgens één der conclusies 8-10, verder omvattende een registratie-eenheid voor het registreren van het lichtpatroon.