NL9101359A - Nieuw saccharide-peptide-conjugaat, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat. - Google Patents
Nieuw saccharide-peptide-conjugaat, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9101359A NL9101359A NL9101359A NL9101359A NL9101359A NL 9101359 A NL9101359 A NL 9101359A NL 9101359 A NL9101359 A NL 9101359A NL 9101359 A NL9101359 A NL 9101359A NL 9101359 A NL9101359 A NL 9101359A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- saccharide
- cell activating
- peptide conjugate
- group
- peptide
- Prior art date
Links
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 title claims abstract description 134
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 claims abstract description 152
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 114
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 claims abstract description 67
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 53
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 53
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 57
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 55
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 29
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 28
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 26
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 26
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 claims description 25
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 18
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 13
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 claims description 10
- -1 bromoacetyl Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 7
- 238000007327 hydrogenolysis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 claims description 4
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- NKUZQMZWTZAPSN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-bromoacetate Chemical compound BrCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O NKUZQMZWTZAPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims description 2
- NKKPYEQGRMPARG-UHFFFAOYSA-N C(O)CN.[P] Chemical compound C(O)CN.[P] NKKPYEQGRMPARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100024482 Cell division cycle-associated protein 4 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000980898 Homo sapiens Cell division cycle-associated protein 4 Proteins 0.000 claims description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002017 heptosyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 claims 1
- 208000016021 phenotype Diseases 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 23
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 18
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 16
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N [(2r,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[[(3s,5s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-4,5-disulfo Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1C[C@@H]2CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H]1O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]1OS(O)(=O)=O LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 3
- RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N neolactotetraose Chemical group O([C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)O[C@@H]1[C@H]([C@H](O[C@H]([C@H](O)CO)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O[C@H](CO)[C@@H]1O)O)NC(=O)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RBMYDHMFFAVMMM-PLQWBNBWSA-N 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N (3S,8S,10R,13S,14S,17S)-17-isoquinolin-7-yl-N,N,10,13-tetramethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine Chemical compound CN(C)[C@H]1CC[C@]2(C)C3CC[C@@]4(C)[C@@H](CC[C@@H]4c4ccc5ccncc5c4)[C@@H]3CC=C2C1 IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N 0.000 description 2
- NPSVCXHBJVBBAD-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-n-(2-hydroxyethyl)acetamide Chemical compound OCCNC(=O)C(F)(F)F NPSVCXHBJVBBAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- RRSNDVCODIMOFX-MPKOGUQCSA-N Fc1c(Cl)cccc1[C@H]1[C@@H](NC2(CCCCC2)[C@@]11C(=O)Nc2cc(Cl)ccc12)C(=O)Nc1ccc(cc1)C(=O)NCCCCCc1cccc2C(=O)N(Cc12)C1CCC(=O)NC1=O Chemical compound Fc1c(Cl)cccc1[C@H]1[C@@H](NC2(CCCCC2)[C@@]11C(=O)Nc2cc(Cl)ccc12)C(=O)Nc1ccc(cc1)C(=O)NCCCCCc1cccc2C(=O)N(Cc12)C1CCC(=O)NC1=O RRSNDVCODIMOFX-MPKOGUQCSA-N 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- WXQCFKYWSKKNKY-UHFFFAOYSA-N benzyl n-(3-hydroxypropyl)carbamate Chemical compound OCCCNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 WXQCFKYWSKKNKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005574 benzylation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 2
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 2
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VAVNEUKAWUEHAG-UHFFFAOYSA-N (2,3,4,5,6-pentafluorophenyl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)OC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F VAVNEUKAWUEHAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxolane Chemical compound C1COCO1 WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 1-[2-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 0.000 description 1
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XRKDWAMMJRYGNL-UHFFFAOYSA-N C1(=CC=CC=C1)[Si](C)(C)[Mg]C Chemical compound C1(=CC=CC=C1)[Si](C)(C)[Mg]C XRKDWAMMJRYGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036756 Diphtheria carrier Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010093013 HLA-DR1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BGWQRWREUZVRGI-QQABCQGCSA-N L-glycero-alpha-D-manno-heptopyranose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWQRWREUZVRGI-QQABCQGCSA-N 0.000 description 1
- AAXCQFOXUJMCCW-PETQGJDISA-N LPS core Chemical group O([C@H]1[C@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@H]([C@@H]([C@@H](CO[C@]2(O[C@@H]([C@@H](OC3[C@H]([C@@H](OC4[C@H]([C@@H](OC5[C@@H]([C@@H](O[C@@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)OC6[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]6[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)O5)O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)COC5[C@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]([C@@H](O)CO)O5)O)O4)O)[C@H](OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCCN)[C@@H]([C@@H](O)CO)O3)O)[C@H](O[C@]3(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@]4(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OCCN)C4)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C3)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C2)[C@@H](O)CO)C(O)=O)O1)OP(O)(O)=O)OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1O AAXCQFOXUJMCCW-PETQGJDISA-N 0.000 description 1
- 101710167887 Major outer membrane protein P.IA Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- LQZMLBORDGWNPD-UHFFFAOYSA-N N-iodosuccinimide Chemical compound IN1C(=O)CCC1=O LQZMLBORDGWNPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005915 ammonolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000676 anti-immunogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010028495 asialoglycophorin Proteins 0.000 description 1
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000385736 bacterium B Species 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- QQVDYSUDFZZPSU-UHFFFAOYSA-M chloromethylidene(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)=CCl QQVDYSUDFZZPSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 229940126142 compound 16 Drugs 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007275 deallylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006264 debenzylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002143 fast-atom bombardment mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000005858 glycosidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000348 glycosyl donor Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- VJMRKWPMFQGIPI-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxyethyl)-5-(hydroxymethyl)-3-methyl-1-[2-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]methyl]-1-benzothiophen-7-yl]pyrazole-4-carboxamide Chemical compound OCC1=C(C(=O)NCCO)C(C)=NN1C1=CC=CC2=C1SC(CC=1C=C(C=CC=1)C(F)(F)F)=C2 VJMRKWPMFQGIPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- QRUBYZBWAOOHSV-UHFFFAOYSA-M silver trifluoromethanesulfonate Chemical compound [Ag+].[O-]S(=O)(=O)C(F)(F)F QRUBYZBWAOOHSV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N thiophosgene Chemical compound ClC(Cl)=S ZWZVWGITAAIFPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Nieuw saccharide-peptide-coniugaat. werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergeli.ik saccharide-peptide-coniugaat omvat.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een saccharide-peptide-conjugaat waarvan het saccharidedeel ten minste een van een lipopoly-saccharide (LPS) van een gramnegatieve bacterie afgeleid immuniteit verlenend B-cel activerend deel met ten minste één epitoop omvat en het peptidedeel ten minste een homoloog eiwit of een van een homoloog eiwit afgeleid peptide-fragment met een T-helpercel activerend deel met ten minste één epitoop omvat, (waarbij homoloog wil zeggen dat het B-cel activerende deel en het T-helpercel activerende deel in hetzelfde micro-organisme voorkomen). De uitvinding heeft eveneens betrekking op een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat en op een werkwijze ter bereiding van een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat.
Het is bekend dat vaccins van gezuiverde kapselpolysacchariden (CPS) beschermende immuniteit kunnen induceren. Deze immuniteit is afhankelijk van de leeftijd van de ingeënte persoon en is slechts van korte duur. De intrinsieke nadelen van kapselpolysacchariden als vaccins worden omzeild door de klassieke benadering kapselpolysacchariden of daarvan afgeleide oligosacchariden te koppelen met eiwitten (Goebel, W.F., en O.T. Avery I929 J. Exp. Med. 50:533_550 en Cruse, J.M. en R.E. Lewis (Erd.) 1989 Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Krager, 10:1-196). Het koppelen van polysacchariden aan eiwitten heeft tot gevolg dat het karakter van dit type antigeen verandert van thymus onafhankelijk in thymus afhankelijk. Dergelijke poly- of oligosaccharide-eiwitconjugaten zijn in het algemeen zeer immunogeen bij jonge kinderen en kunnen geheugen induceren.
Hier volgen een aantal voorbeelden van bekende saccharide-peptide-conjugaten:
Uit de Nederlandse octrooiaanvrage 86.023.25 zijn conjugaten van kapselpolysacchariden (CPS) van H. influenza b met tetanustoxoïde (TT) bekend.
Er zijn conjugaten bereid van kapselpolysacchariden van meningococcus groep A en C met tetanustoxoïde, welke conjugaten bij muizen en konijnen zeer immunogeen blijken te zijn ([Beuvery, E.C., A. Kaaden. V. Kanhai, en A.B. Leussink. 1983. Physicochemical and immunological characterization of meningococcal group A and C polysaccharide-tetanus toxoid conjugates prepared by two methods. Vaccine 1:31-36], [Beuvery, E.C., F Miedema, R van Delft en K. Haverkamp. 1983. Preparation and immunochemical characterization of meningococcal group C polysaccharide-tetanus toxoid conjugates as a new generation of vaccines. Infect. Immun. 40:39-45] en [Jennings, H.J. en H.C. Lugowski. 1981. Immunochemistry of groups A, B and C meningococcal polysaccharide-tetanus toxoid conjugates. J. Immunol. 127:1011-1018]).
Voor de groep B meningococcus is gezocht naar andere saccharide-peptide-con jugaten die bruikbaar kunnen zijn in een vaccin, aangezien kapselpolysacchariden van deze groep gramnegatieve bacteriën geen immuun-reactie geven. Hiertoe zijn saccharide-peptide-conjugaten gemaakt met gemodificeerd kapselpolysaccharide en dragereiwitten ([Jennings, H.J., R. Roy, en A. Gamian. 1986. Induction of meningococcus group B polysaccharide-specific IgG antibodies in mice using an N-proprionylated B polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J. Immunol. 137:1708-I713] en [Jennings. H.J. 1989. The capsular polysaccharide of group B Neisseria meningitidis as a vehicle for vaccine development. In Cruse, J. M., and R. E. Lewis, Conjugate Vaccines. Contrib. Microbiol. Immunol. Basel, Krager. 10:151-165]).
Men vermoedt echter dat anti groep B antilichamen (in het bijzonder IgG) in vivo kruisreactie vertonen met gastheerantigenen en dientengevolge zou het gebruik van een saccharide-peptide-conjugaat dat gemodificeerd kapselpolysaccharide van groep B meningococcus omvat de oorzaak van auto-immuunziekte kunnen vormen. Derhalve zijn de meeste onderzoeken die betrekking hebben op een vaccin tegen groep B meningococcus gericht op het potentiële gebruik van subkapselbestanddelen zoals buitenmembraaneiwitten (0ΜΡ) en lipopolysacchariden (LPS).
Zo beschrijven Jennings et al. conjugaten van tetanustoxoïde (TT) met van meningococcus LPS afgeleide gedefosforyleerde oligosacchariden (OS*). De immunogeniteit van deze OS*-TT-conjugaten werd in konijnen onderzocht (Infect. Immun. 43:407-412). Hierbij werd fosforethanolamine verwijderd van de meningococcus oligosacchariden (OS) door behandeling met waterstoffluoride. De gedefosforyleerde oligosacchariden werden vervolgens gekoppeld met tetanustoxoïde. Het aldus verkregen immunotype L3 0S-eiwitconjugaat was slechts enigszins immunogeen bij konijnen, hetgeen waarschijnlijk kan worden verklaard door verwijdering van de PEA-groepen.
In Infection and Immunity, maart 1991 blz 843“Ö51. beschrijven Verheul et al. de bereiding van meningococcus 0S-eiwit-conjugaten met tetanustoxoïde, waarbij de fosforethanolaminegroepen van de oligosacchariden gehandhaafd zijn.
In vrijwel alle oligosaccharide-peptideconjugaten die tot dusver bekend zijn is het saccharidedeel, dat B-cel activering verzorgt, gekoppeld aan een peptide dat T-helpercel activering verzorgt, waarbij saccharidedeel en peptidedeel afkomstig zijn van een ander organisme. Meestal wordt hiervoor een tetanus- of difteriepeptide gebruikt. Het gebruik van vaccins die conjugaten bevatten die aan dergelijke eiwitten zijn gekoppeld heeft als nadeel dat het zal kunnen leiden tot overgevoeligheid of tolerantie voor genoemde tetanus- of difteriedrager en zal kunnen leiden tot verminderde respons op het B-cel activerende deel. Het gebruik van saccharide-peptide-conjugaten die voorzien zijn van homoloog dragerpeptide of het homologe eiwit heeft dit nadeel niet en een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat zal bij contact met het micro-organisme in kwestie behalve B-cel geheugen tevens T-cel geheugen reactiveren. Door de koppeling van B-cel activerend deel aan een T-helpercel activerend deel dat afkomstig is van een homoloog eiwit of een daarvan afgeleid peptide-fragment wordt derhalve het nadeel van overgevoeligheid, tolerantie of suppressie die door het gebruik van saccharide-peptide-conjugaten, die een niet homologe peptidedrager omvatten, als bestanddelen van vaccins dreigt te ontstaan, vermeden.
Er zijn saccharide-peptide-conjugaten bekend die een homologe dragerpeptide omvatten. Paton et al. beschrijven conjugatie van pneumolysi-ne-toxoïde aan type 19F kapselpolysaccharide van Streptococcus pneumoniae (Infection and Immunity, juli 1991. biz 2297-2304).
Tevens zijn er saccharide-peptide-conjugaten bekend die een homoloog dragerpetide omvatten die als immuniteit verlenend B-cel activerend deel een saccharidedeel omvatten dat van een lipopolysaccharide (LPS) van een gramnegatieve bacterie is afgeleid. Een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat biedt als voordeel de mogelijkheid een vaccin te maken dat immuniteit verschaft tegen gramnegatieve bacteriën, waarvan de kapsel-polysacchariden geen of onvoldoende immuunreactie opwekken.
In Cohtrib. Microbiol. Immunol. Basel, Karger ,1989. vol 10, blz I66-I89 beschrijven Cryz, J.C. et al. vaccins tegen Pseudomonas aeruginosa die een saccharide-peptide-conjugaat omvatten dat gedetoxificeerde lipopolysaccharide van Pseudomonas aeruginosa immunotype 5 omvat, welke lipopolysaccharide gekoppeld is met diverse dragereiwitten. De drager-eiwitten kunnen zowel homoloog als niet homoloog zijn. De dragereiwitten die in dit artikel genoemd worden zijn tetanustoxoïde, toxine A en pili van Pseudomonas aeruginosa.
Het LPS van Pseudomonas aeruginosa wordt volgens dit artikel onschadelijk gemaakt door estergebonden vetzuren van Lipide A te verwijderen, zodat het serologisch actieve O-polysaccharidedeel kan worden opgenomen in een saccharide-peptide-conjugaat. Dergelijk gedetoxificeerd LPS (D-LPS) werd omgezet in een actieve ester door koppeling aan N-hydroxysucci-nimide en vervolgens werd de actieve ester gekoppeld aan een eiwit dat ter vergemakkelijking van de koppeling voorzien was van een spacer (1,4-diaminobutaan). Het D-LPS-TA-conjugaat was niet immunogeen maar het D-LPS-pili-conjugaat en het D-LPS-TT-conjugaat wel.
Een bacteriegroep waarvan kapselpolysacchariden geen of weinig immuunreactie opwekken is groep B meningococcus, een bacteriegroep die in vele landen meer dan 30% van de meningococcus ziektegevallen veroorzaakt (Poolman et al., The Lancet, september 1986, blz. 555"55δ). Zoals reeds beschreven omzeilt een vaccin dat een saccharide-peptide-conjugaat met een van meningococcus B lipopolysaccharide afgeleid immuniteit verlenend B-cel activerend deel omvat, een nadeel van saccharide-peptide-conjugaten die kapselpolysacchariden omvatten, namelijk het feit dat de aanzienlijke overeenkomst in structuur tussen de groep B-kapselpolysacchariden en menselijke glycolipiden kan leiden tot autoimmuunziekte.
Een saccharide-peptide-conjugaat dat als immuniteit verlenend B-cel activerend deel lipopolysaccharide omvat heeft echter ook nadelen. Lipopolysaccharide bevat toxische delen en een saccharide-peptide-conjugaat dat een lipopolysaccharide met toxische delen omvat zal eveneens toxisch zijn.
De onderhavige uitvinding heeft derhalve betrekking op een saccharide-peptide-conjugaat waarvan het saccharidedeel ten minste een van een lipopolysaccharide (LPS) van een gramnegatieve bacterie afgeleid immuniteit verlenend B-cel activerend deel met ten minste één epitoop omvat en het peptidedeel ten minste een homoloog eiwit of een van een homoloog eiwit afgeleid peptide-fragment met een T-helpercel activerend deel met ten minste één epitoop omvat, (waarbij homoloog wil zeggen dat het B-cel activerende deel en het T-helpercel activerende deel in hetzelfde organisme voorkomen) gekenmerkt doordat ten minste het B-cel activerende deel het LPS-oligosaccharide deel (core region) of een daarvan afgeleid fragment omvat.
Gebruik van een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat, dat als B-cel activerend deel de LPS "core region" of een daarvan afgeleid fragment omvat als bestanddeel van een vaccin, zal veiliger zijn dan gebruik van een saccharide-peptide-conjugaat dat natieve LPS omvat vanwege het ont breken van toxische delen. Een dergelijk "core" bevattend saccharide-peptide-conjugaat heeft het voordeel dat het een groter aantal verschillende LPS "core" B-cel activerende delen kan bevatten dan een SPC met natieve LPS dat toxisch wordt wanneer teveel van het toxische bestanddeel lipide A wordt ingebouwd.
De lipopolysacchariden van meningococcus zijn ook toxisch. Lipo-polysaccharide van meningococcus omvat drie delen. In figuur 1 wordt een LPS van meningococcus weergegeven. Het lipide A deel is toxisch en de lacto-N-neotetraose-eenheid, kan eventueel tot inductie van auto-anti-lichamen leiden. Het oligosaccharidedeel van meningococcus LPS, de zogenaamde "core region" is niet toxisch. De zogenaamde "inner core region" is dat deel van de "core region" van het oligosaccharidedeel van meningococcus LPS waarvan de lacto-N-neotetraose-eenheid ontbreekt. Een saccha-ride-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat een B-cel activerend deel omvat, dat de "core" oligosaccharide van meningococcus of een daarvan afgeleid fragment omvat, is een geschikt voorbeeld van een SPC volgens de uitvinding.
Een saccharide-peptide-conjugaat, dat in het van meningococcus afgeleide saccharidedeel geen toxische lipide A en evenmin de lacto-N-neotetraose-eenheid omvat, welke eenheid vanwege structuur overeenkomst met de gastheer eventueel tot inductie van auto-antilichamen kan leiden, is bekend uit het reeds geciteerde artikel van Jennings et al. Dit saccharide-peptide-conjugaat verschilt echter van het saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat de aanwezigheid van het tetanus toxoïde als peptidedeel in plaats van een homoloog eiwit of een daarvan afgeleid peptide fragment. De nadelen van een dergelijk niet-homoloog eiwit bevattend conjugaat zijn reeds hiervoor beschreven.
Men kan natieve LPS isoleren en vervolgens lipide A en de tetraose-eenheid verwijderen. Lipopolysaccharide (LPS) van meningococcus bijvoorbeeld kan worden geïsoleerd via de extractie werkwijze met heet water en fenol van Westphal (Westphal, 0. en Jann, J.K., 1965· Methods Carbohydr. Chem. 5. 83-91)· In het kort wordt LPS gehydrolyseerd in l#-azijnzuur totdat flocculatie optreedt. Lipide A wordt verwijderd door te centrifugeren en de oligosacchariden worden gezuiverd over een Biogel kolom. Vervolgens kan de hoofd-oligosaccharide worden gekoppeld aan het peptidedeel.
Men kan op een dergelijke wijze verkregen "core" oligosaccharide of een werkzame afgeleide daarvan opnemen in een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding.
Omdat het verkrijgen van een van natieve LPS afgeleid B-cel activerend deel een moeizaam proces is en het volledig zuiveren van de "core" oligosaccharide eveneens problematisch is, verdient het de voorkeur het B-cel activerende deel van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding te synthetiseren. Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding omvat met voorkeur derhalve een synthetisch B-cel activerend deel in het saccharidedeel.
De saccharide-peptide-conjugaten volgens de uitvinding zijn bij voorkeur geconjugeerd via een spacer. Dit heeft als voordeel dat geen intramoleculaire reacties optreden tussen de reactieve groepen van het saccharidedeel en het peptidedeel. Dergelijke reacties kunnen leiden tot een gewijzigde tertiaire structuur van het saccharidedeel en/of peptidedeel, met als gevolg verslechterde immuunwerking.
Een aantal LPS immunotype specifieke epitopen hebben hun werking te danken aan de aanwezigheid van ten minste een fosforethanolamine (PEA) groep. Derhalve verdient een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat een dergelijk B-cel activerend deel omvat de voorkeur wanneer PEA-groepen van het B-cel activerende deel van het saccharidedeel vrije aminogroepen omvatten. Een voorbeeld van een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat een immuunspecifiek B-cel activerend deel omvat, is een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding waarvan het saccharidedeel LPS van meningococcus met immunotype L3 omvat. Een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat, dat een immuunspecifieke epitoop van immunotype L3 omvat, zal bij voorkeur een B-cel activerend deel omvatten waarvan de PEA-groepen vrije aminogroepen hebben.
Saccharide-peptide-conjugaten volgens de uitvinding omvatten met voordeel een B-cel activerend deel dat kruisreactie kan geven met meer dan een immunotype. Een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding omvat zal bescherming geven tegen meer dan één immunotype.
Momenteel zijn twaalf verschillende typen lipopolysacchariden bekend voor meningococcus stammen (hetgeen overeenkomt met 12 immunotypen). De verschillen in de meningococcus LPS immunotypen zijn gelokaliseerd in het oligosaccharide deel van het LPS ("core region"). Sinds kort zijn de volledige primaire structuren van de oligosacchariden opgehelderd voor immunotypen Llt L2, L3, L5 en L^; deze worden weergegeven in figuur 2 (Difabio J.L. et al, 1990, Structure of the LI and L6 core oligosaccharide of Neisseria meningitidis. Can. J. Chem. 86:1029-103^;
Jennings, H.J. et al, 1987» Structure and Immunochemistry of meningococcal lipopolysaccharides, Anthonie van Leeuwenhoek 53:519“522; Michon, F. et al, I99O, Structure of the L5 lipopolysaccharide core oligosaccharide of Neisseria meningitidis, J. Biol. Chem. 256:7243-7247; Verheul, A.F.M. et al niet gepubliceerd, Infection and Immunity; in press). In figuur 3 zijn de structuren van de grootste Llt L2, L3, moleculen weergegeven.
Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat een of meer oligosacchariden met de structuren die in figuur 2 worden weergegeven omvat, is bruikbaar als bestanddeel van een vaccin dat tegen ten minste een immunotype van meningococcus is gericht. Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat ten minste het B-cel activerende deel van ten minste een van de oligosacchariden uit figuur 2 omvat kan derhalve met voordeel als bestanddeel van een vaccin, dat tegen ten minste een immunotype van meningococcus is gericht, worden gebruikt.
De oligosacchariden van de immunotypen verschillen in monosacchari-de-samenstelling, hoeveelheid en locatie van fosforethanolamine (PEA) groepen en de mate van acetylering van de a(l-*2) gebonden GlcNAc-eenheid of ander eenheden. Voor de meeste immunotypen is de basis-structuur van de oligosaccharide "core" gelijk (figuur 1 en figuur 2).
Omdat de "core" oligosacchariden van meningococcus LPS voor diverse immunotypen overeenkomsten vertonen, omvat de "core" meer dan een immunotype specifieke epitoop. Een SPC volgens de uitvinding dat een dergelijke "core" als B-cel activerend deel omvat, zal de voorkeur verdienen. Een dergelijk SPC volgens de uitvinding kan voor een aantal verschillende immunotypen tegelijk B-cel activerend werken. Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat voor een aantal immunotypen tegelijk B-cel activerend kan werken kan ook een afgeleid fragment omvatten, dat meer dan een immunotype specifieke epitoop omvat.
Het is ook mogelijk slechts een relevant gedeelte van de "core" oligosaccharide als fragment op te nemen in een SPC volgens de uitvinding, dat specifiek immuniteit voor een specifiek immunotype verschaft. Het is ook mogelijk in het saccharidedeel van een SPC volgens de uitvinding meer dan één B-cel activerend deel op te nemen, zodat een dergelijk SPC diverse specifieke immuniteit verlenende B-cel activerende delen omvat en dus immuniteit voor diverse specifieke immunotypen kan verschaffen.
Men kan met voordeel B-cel activerende delen met specifieke immuniteit verlenende werking tegen verschillende immunotypen of B-cel active- rende delen met kruisreactieve immuniteit verlenende werking in het saccharidedeel van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding opnemen. Het is mogelijk geworden goed gedefinieerde oligosacchariden met toenemende complexiteit en molecuulgewicht te synthetiseren, zodat oligosacchariden die een of meer B-cel activerende structuren omvatten gesynthetiseerd kunnen worden.
Van de meningococcus is bekend dat immunotypen L3 en L2 respectievelijk ongeveer 70¾ en 30% van de groep B meningococcus meningitis veroorzaken. Derhalve verdienen saccharide-peptide-conjugaten volgens de uitvinding de voorkeur die ten minste B-cel activerende delen van L3 en/of L2 immunotypen in het saccharidedeel van het saccharide-peptide-conjugaat omvatten. In een nog te publiceren abstract beschrijven Borrow, R. et al (Symposium 27-08-91, Bacterial Meningitis, Nottingham G.B.) dat immuno-type L37i9 specifiek geassocieerd is met invasieve ziekte, veroorzaakt door N.meningitidis, omdat zij bij 97¾ van de ziektegevallen deze epitoop waarnemen.
Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat ten minste een B-cel activerend deel van het saccharidedeel omvat dat een afgeleide is van
heeft specifieke immuniteit verlenende werking tegen immunotype L3.
Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat ook specifieke immuniteit verlenende werking tegen immunotype L3 vertoont, omvat als B-cel activerend deel van het saccharidedeel een oligosaccharide dat ten minste
omvat. Een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat dat bovendien in het B-cel activerende deel van het saccharidedeel ten minste één PEA-groep bevat verdient de voorkeur.
Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat als B-cel activerend deel in het saccharidedeel een oligosaccharide omvat met als uiteinde B-D-Glcp(l-4), α-D-GlcNAcp of L-a-D-Hepp(l-*5) heeft specifieke immuniteit verlenende werking tegen immunotype L2.
Een voorbeeld van een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding omvat als B-cel activerend deel van het saccharidedeel een afgeleide van de vertakte oligosaccharide
Een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat als B-cel activerende deel van het saccharidedeel de vertakte oligosaccharide
omvat, voldoet voor het verschaffen van een immuunreactie tegen immunotype L2.
Een saccharide-peptide-conjugaat dat de voorkeur verdient is een SPC volgens de uitvinding dat een B-cel activerend deel omvat dat ten minste kruisreactie vertoont met twee immunotypen van gram-negatieve bacteriën. Een voorbeeld van een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat vertoont ten minste kruisreactie met meningococcus immunotypen L2 en L3.
Een saccharide-peptide-conjugaat dat eveneens de voorkeur verdient is een SPC volgens de uitvinding dat een B-cel activerend deel omvat dat ten minste kruisreactie vertoont met meningococcus immunotypen Li en L3.
Een saccharide-peptide-conjugaat dat kruisreactie vertoont met ten minste immunotypen Llt h2 en L3> omvat als B-cel activerend deel in het saccharidedeel ten minste de vertakte oligosaccharide B-D-Glcp(l-»4)-[L-α-D-Hepp(l-3)]-L-a-D-Hepp). Een geschikt voorbeeld van een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding omvat tevens op de vertakte oligosaccharide B-D-Glcp(l-*4)-[L-a-D-Hepp(l-,3)]-L-a-D-Hepp) een PEA-groep op de 0-3 van de heptosyleenheid.
Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding, dat kruisreactie vertoont met meer immunotypen dan L^, L2 en L3i omvat als B-cel activerend deel in het saccharidedeel ten minste de vertakte oligosaccharide B-D-Glcp(l-4)-[L-a-D-Hepp(l-*3)]-L-a-D-Hepp) die voorzien is van een spacer die verbinding geeft met ten minste een ander immunotype specifiek B-cel activerend deel met ten minste een epitoop.
Een SPC volgens de uitvinding kan als B-cel activerend deel een saccharidedeel omvatten dat gesynthetiseerd en/of gemodificeerd is ten opzichte van een natuurlijk B-cel activerend deel voor een bepaald immunotype. Een dergelijk gesynthetiseerd en/of gemodificeerd B-cel activerend deel zal met voorkeur kruisreactie geven met diverse immunotypen en/of een verbeterde immuunreactie geven dan het overeenkomstige deel van het natuurlijke LPS.
Een dergelijk gesynthetiseerd en/of gemodificeerd B-cel activerend deel kan ontstaan door selectieve additie en/of deletie van bepaalde groepen en/of suikereenheden.
Een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding zal bij voorkeur als peptidedeel, met ten minste een T-helpercel activerend deel, een buitenmembraaneiwit (OMP) of ten minste een van een OMP afgeleid peptide-fragment, dat een T-helpercel activerend deel omvat, omvatten. Een vaccin dat een SPC volgens de uitvinding omvat, welk vaccin bescherming kan bieden tegen meningococcus, zal bij voorkeur een SPC volgens de uitvinding, dat een buitenmembraaneiwit of een daarvan afgeleid peptidefragment als T-helpercel activerend deel van meningococcus Klasse I omvat, omvatten. Op het Klasse I buitenmembraaneiwit van meningococcus H44/76 zijn vele herkenningsplaatsen onderzocht voor menselijke T-cellen.
De herkenningsplaatsen voor menselijke T-cellen in Meningococcus H 44/76 klasse 1 OMP zijn onderzocht. Voor systematische identificatie van T-cel epitopen zijn grote aantallen synthetische peptiden nodig.
In de afgelopen paar jaren is vaste-fase peptide-synthese (SPPS) aangepast om simultane bereiding van vele peptiden mogelijk te maken. Een werkwijze van SMPS die nauw verband houdt met traditionele SPPS is ont wikkeld door Houghthon (Houghton, R.A. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8l 3998). Bij deze benadering worden gebruikelijke vaste dragers in permeabele polypropyleenzakken in compartimenten opgenomen (de "theezak"-benadering).
Bij de koppelingsstap worden de zakjes gesorteerd in afzonderlijke houders die de geschikte aminozuuroplossingen bevatten. Het wassen en het verwijderen van de bescherming van het N-uiteinde worden in afzonderlijke houders uitgevoerd, die alle zakken bevatten. De peptiden worden bereid op een schaal van 10-20 mg. Holm en Meldal ( Holm, A. en Meldal, M. 1989. Multiple column peptide synthesis. In: Peptides 1988. Proc. 20th Eur. Pept. Symp. Jung, C. en Bayer, E. (red.), Walter de Gruyter & Co., Berlijn, blz 208-210) hebben manuele meervoudige kolomsynthese op een schaal van 1-5 mg beschreven, die zeer geschikt is voor immunologisch onderzoek. Volledige automatisering van dit type SMPS is bereikt ([Frank,R., Bosserhoff, A., Boulin, C., Epstein, A., Gausepohl, H. en Ashman, K., 1988. Biotechnology 6 1211],[Gausepohl, H., Kraft, M., Boulin, C. en Frank, R.W., 1990, Proc. XIth Am. Pept. Symp. Rivier, J. en Marshall, G. (red.) Escom, Nederland, blz 1003-1004] en [Schorrenberg, G., en Lang, R.E., 1990, Proc. XIth Am. Pept. Symp. Rivier, J. en Marshall, G. (red.) Escom, Nederland, blz 1029-1030). Tijdens het verloop van het onderzoek naar meningococcus T-cel epitopen is manuele SMP geïntroduceerd. Zeer recentelijk is een in de handel verkrijgbare simultane meervoudige peptidesynthese-inrichting beschikbaar gekomen. Deze inrichting maakt de geautomatiseerde simultane synthese van 48 peptiden op een schaal van 5-20 mg in ongeveer twee weken mogelijk.
Voor het identificeren van T-cel epitopen die in de klasse 1 0ΜΡ voorkomen, werd een reeks overlappende peptiden gesynthetiseerd. De reeks bestond uit 45 peptiden die de gehele eiwitsequentie van P1.7,l6 omvatten (20-meren met een overlap van 12 eenheden zie figuur 4). De peptiden werden onderzocht op herkenning door T-cellen van vrijwilligers waarvan HLA-type bepaald was. Vaccinatie van de vrijwilligers was niet nodig, aangezien T-cellen met specificiteit voor het meningococcus Klasse 1 eiwit in het periferale bloed van alle onderzochte donoren (n=27) kon worden waargenomen. Daarnaast vertoonden alle proefpersonen antilichaam-titers voor het meningococcus 0ΜΡ. Aangezien de proefpersonen een negatieve anamnese voor meningococcusziekte vertoonden, moest immuniteit zijn geïnduceerd door asymptomatische infecties ([Goldschneider, I., Gotschlich, E.C., en Artenstein, M.S., 1969» J. Exp. Med. 29.: 1307] en [Goldschneider, I., Gotschlich, E.C., en Artenstein, M.S., 1969, J. Exp. Med. 129: 1327])·
De reeks van 45 peptiden werd in lymfocytproliferatie-experimenten onderzocht. Resultaten van een representatief experiment dat werd uitgevoerd met mononucleaire cellen verkregen uit het periferale bloed, worden weergegeven in figuren 5 en 6. T-cel proliferatie werd waargenomen in aanwezigheid van 10 peptiden, hetgeen duidt op het voorkomen van T-cel epitopen in ten minste zes verschillende gebieden van het eiwit.
Teneinde de exacte grootte van de T-cel epitopen te definiëren en om de MHC-restrictie te onderzoeken, werden T-cel kloons gemaakt. Het klasse 1 OMP of een synthetisch peptide werden gebruikt voor de selectie van de kloons. Eerst werden PBMC van tevoren gestimuleerd met het antigeen. Na 7 dagen werden de cellen verzameld en gekloneerd door beperkende verdunning bij aanwezigheid van bestraalde APC's (PBMC) die een puls met het antigeen hadden ontvangen. Subklonering werd ten minste eenmaal uitgevoerd. Een voorbeeld van een peptide specifieke T-cel kloon wordt in tabel 1 getoond. Een positieve respons werd verkregen met twee 20-meren met een overlap van 12 residuen.
TABEL 1 T-cel herkenning van overlappende synthetische peptiden
Gedurende twee uren werden 5χ10ή APC’s (PBMC) met peptide geïncubeerd (2pg/putje) of als controle met media geïncubeerd in een volume van 100 μΐ/putje in microkweekplaten. Na bestraling (25GY), werden 2x10* T-cellen in een volume van 50 μΐ aan de putjes toegevoegd. Twee dagen later werden [3H]-thymidine toegevoegd en 16 uur later werd proliferatie gemeten in een vloeistof scintillatie telinrichting.
Standaard deviatie van de in triplo uitgevoerde experimenten overschreed nooit 10% van het gemiddelde. De stimulatie-index werd berekend als de verhouding van tellen per minuut bij aanwezigheid van Ag ten opzichte van tellen per minuut bij afwezigheid van Ag (afzonderlijke media). (-) In de tabel geeft een stimulatie-index van SI^2 weer.
De minimale sequentie van de epitoop die voor activering van de kloons vereist was werd bepaald. Hiertoe werden systematisch peptiden met een steeds kortere lengte (respectievelijk vanaf het N- en C-uiteinde) bereid en onderzocht in proliferatietests (tabel 2).
TABEL 2.
Het in kaart brengen van de epitopen van T-cel kloon AZ-16.14
Er werden analogen gemaakt van de minimale sequentie waarin één groep werd gesubstitueerd ten einde te bepalen welke groepen essentiëel waren voor T-cel herkenning en/of MHC-interactie. Er werden geen analogen herkend die alanine als substituent omvatten. Er waren echter wel conservatieve substituties mogelijk op posities 50» 51. 5^» 57 en 58 (tabel 3)· TABEL 3
Herkenning door T-cel kloon AZ-16.14 van analogen waarin één groep gesubstitueerd is
Onder toepassing van de benadering die beschreven is, werd een groot aantal T-cel epitopen geïdentificeerd bij klasse 1 OMP. Synthetische peptiden die deze T-cel epitopen bevatten, kunnen worden toegepast in een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding.
Ten einde een genetisch bepaald gebrek aan respons voor het drager-molecuul, het peptidedeel van het saccharide-peptide-conjugaat te vermijden, moet de MHC-restrictie van de T-cel epitopen worden onderzocht. In tegenstelling tot antilichamen kunnen T-cellen namelijk slechts een antigeen herkennen wanneer dit wordt gepresenteerd door antigeenpresen- terende cellen in associatie met MHC-moleculen. Aangezien verschillende individuen andere combinaties van MHC-allelen kunnen bezitten, kunnen de epitopen die door deze individuen kunnen worden herkend, verschillen.
Onder toepassing van T-cel kloons en antigeen presenterende cellen die van een panel van vrijwilligers, waarvan de HLA-type bepaald was, werden verkregen, werden restrictie-elementen bepaald. Herkenning van bepaalde peptiden was beperkt tot een afzonderlijk HLA-DR-molecuul. Andere peptiden herkenden meer dan één HLA-molecuul. Deze peptiden verdienen de voorkeur om te worden gebruikt in saccharide-peptide-conjugaten volgens de uitvinding, omdat een dergelijk peptide een saccharide-pepti-de-conjugaat geeft dat diverse HLA-fenotypes herkent. Een dergelijk SCP kan worden gebruikt als bestanddeel van een vaccin met het voordeel dat met een klein aantal constante peptidesequenties die dergelijke epitopen omvatten de meeste HLA-DR-fenotypen kunnen worden herkend. Het is ook mogelijk het gehele eiwit in een saccharide-peptide-conjugaat op te nemen om te bewerkstelligen dat meer dan 1 HLA-type wordt herkend door het SPC.
Uit de tabel met stimuleringsindexen blijkt dat de dodecameren met nummers 1, 7, 8, 9, 13. 23, 28, 32, 33. 35 t/m 39, 42 t/m 45 (figuur 6) een stimulatie-index van meer dan 15 vertonen. Derhalve is een bruikbaar saccharide-peptide-conjugaat een SPC volgens de uitvinding dat ten minste één T-helpercel-activerend deel met ten minste één epitoop omvat dat afgeleid is van ten minste een werkzaam deel van ten minste één van de dodecameren met nummers 1, 7. 8, 9. 13. 23. 28, 32, 33, 35 t/m 39» 42 t/m 45· Een voorbeeld van een saccharide-peptide-conjugaat dat een stimulatie-index van meer dan 15 vertoonde, is een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat als T-helpercel-activerend deel met ten minste één epitoop ten minste een werkzaam deel van de sequentie KISDFGSFI of een daarmee equivalente sequentie omvat. Zoals blijkt uit tabel 3 is een saccharide-peptide-conjugaat dat de sequentie KLSDFGSFI omvat eveneens in staat een goede stimulatie-index te leveren. Ook een saccharide-peptide-conjugaat dat als T-helpercel-activerend deel met ten minste één epitoop ten minste een werkzaam deel van de sequentie KISDYGSFI omvat, blijkt goed T-cel stimulerend te werken. Dit zijn voorbeelden van saccharide-peptide-conjugaten volgens de uitvinding, waarvan het T-helpercel-active-rende deel met ten minste één epitoop van het peptidedeel gemuteerd is, zodat beter contact gemaakt kan worden met een T-helpercelreceptor.
Het is gebleken dat een T-helpercel-activerend deel dat aan beide uiteinden van de epitoop wordt voorzien van lysinegroepen, een betere stimulatie leverde, wanneer gekeken werd naar de verhouding van dosis/respons (figuur 7)· Derhalve verdient een saccharide-peptide-con-jugaat volgens de uitvinding dat als T-helpercel-activerend deel met ten minste één epitoop aan beide uiteinden voorzien is van lysinegroepen de voorkeur.
In figuur 8 zijn een aantal peptide-sequenties weergegeven met de bijbehorende MHC-restrictie. Uit de figuur blijkt dat de peptide VPRISYAHGFDLIERGKKG HLA-DR1 en DR7 herkent. Een saccharide-peptide-con-jugaat volgens de uitvinding dat deze peptide-sequentie omvat, verdient de voorkeur omdat meer dan één HLA-fenotype wordt herkend.
De onderhavige octrooiaanvrage heeft ook betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding. Deze werkwijze omvat het koppelen van een saccharide, die ten minste een immuniteit verlenend B-cel activerend deel met ten minste één epitoop omvat, met een peptide, dat ten minste een T-helpercel activerend deel met ten minste één epitoop omvat, waarbij het T-helpercel activerende deel deel uitmaakt van een homoloog eiwit of een daarvan afgeleid peptidefragment, waarbij het B-cel activerende deel en het T-helpercel activerende deel in hetzelfde organisme voorkomen.
Men kan saccharide en peptide koppelen onder toepassing van algemeen bekende werkwijzen die men toepast voor het koppelen van saccharide en peptide bij bekende saccharide-peptide-conjugaten.
Voor het specifiek koppelen van koolhydraten is de aanwezigheid van geschikte groepen zoals een amino (-NH2), carbonzuur (-C00H), thiol (-SH) of een aldehyd (CHO) noodzakelijk binnen het koolhydraatantigeen (Dick, W.E. et al, 1989» Glycoconjugates of bacterial carbohydrate antigens. In Cruse J.M. en R.E. Lewis, Conjugate vaccines, Contrib. Microbiol. Immunol., Basel, Krager, 10:48-114). Deze groepen kunnen aanwezig zijn in het antigeen maar moeten vaak via chemische of enzymatische werkwijzen worden opgenomen. Het verdient de voorkeur een koppelingswijze toe te passen die resulteert in zo min mogelijke modificatie van het koolhydraatantigeen. Het gebruik van een specifiek aan te brengen spacer is hiervoor bevorderlijk. Het verdient de voorkeur zo min mogelijk de aanwezige epitoop of epitopen te vernietigen of ongewenste immuno-dominante neo-antigenen te genereren. De invloed van de koppelingswerkwijze op de immunologische eigenschappen van een oligosaccharide-peptideconjugaat is groot wanneer kleine oligosacchariden worden toegepast (Hoppner, W., et al , 19δ5. Study on the carbohydrate specificity of antibodies formed in rabbits to synthetic glycoproteins with the carbohydrate structure of asialoglycophorin A. Mol Immunol. 12:1341-1348).
De meeste bestaande vaccins zijn gebaseerd op kapselpolysacchariden of O-antigenen die bestaan uit zich herhalende eenheden van 1 tot 8 monosaccharide zodat de invloed van de koppeling kan worden geminimaliseerd door het gebruik van grotere oligosacchariden. Meningococcus LPS bevat geen herhalende eenheden en derhalve zal met name de keus van de kop-pelingswerkwijze bij het gebruik van meningococcus LPS van belang zijn voor de immunologische en immunochemische eigenschappen van het resulterende conjugaat.
Bij voorkeur koppelt men dus de saccharide aan het peptide via een spacer die aan de uiteinden reactieve groepen zoals NH2 en COOH bevat. Het gebruik van een spacer bij saccharide-peptide-conjugaten volgens de uitvinding heeft als voordeel dat de tertiaire structuur van het saccha-ridedeel niet gewijzigd wordt, hetgeen van belang is voor de immuun-werking van de saccharide.
Bij de meningococcus oligosacchariden zijn er twee groepen beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor het koppelen van een dergelijke oligosaccharide aan dragerpeptide: de vrije aminogroep van de fos-forethanolaminegroep (PEA-groep) en de carbonzuurgroep van de KDO-eenheid (figuur 1). De PEA-groep dient bij voorkeur niet te worden gebruikt voor de koppeling omdat deze groep waarschijnlijk deel uitmaakt van een aantal van de immunotype specifieke epitopen. Derhalve verdient het de voorkeur in een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding fosforethanol-aminegroepen te behouden met vrije aminogroepen. Gewoonlijk kunnen saccharide-peptide-conjugaten worden gemaakt op basis van het koppelen van de carbonzuurfunctie van de oligosaccharide aan de vrije aminogroepen van het peptide. Wanneer deze werkwijze wordt toegepast bij de meningococcus oligosaccharide kan dit resulteren in koppeling van oligosaccharide aan oligosaccharide of van oligosaccharide aan carbon-zuurgroepen van het peptide door de PEA-groep van de oligosaccharide. Jennings et al. (Infect. Immun. 43:407-412) hebben dit probleem opgelost door de PEA-groepen te verwijderen door behandeling met waterstof-fluoride. De gedefosforyleerde oligosacchariden werden vervolgens gekoppeld aan tetanustoxoïde door p-(4-aminofenyl)ethylamine als spacer aan het reducerende uiteinde op te nemen door middel van reductieve aminering (hetgeen leidde tot verlies van de ringstructuur van KDO), gevolgd door activering van de aminofunctie met thiofosgeen gevolgd door koppeling aan tetanustoxoïde. Dergelijke conjugaten met immunotype L2, L5 en L10 waren zeer immunogeen in konijnen terwijl die van L3 slecht immunogeen waren. Voor deze laatste groep blijkt het verlies van PEA- groepen en/of ringstructuur van de KDO-groep van belang te zijn voor de immuniteit en verdient het de voorkeur een saccharide-peptide-conjugaat met L3 oligosaccharide van meningococcus te maken waarbij de PEA-groepen en de KDO-ringstructuur van de meningococcus oligosaccharide zo min mogelijk zijn gemodificeerd.
Voor het bereiden van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding waarvan de B-cel activerende werking afhangt van de aanwezigheid van een of meer fosforethanol (PEA) groepen voldoen bovengenoemde werkwijzen niet. Voor het bereiden van dergelijke saccharide-peptide-conjugaten zijn additionele maatregelen nodig.
Een mogelijkheid voor het bereiden van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat het bovengenoemde probleem oplost is het gebruiken van een saccharidedeel dat synthetisch verkregen is.
Met de huidige technieken is het mogelijk oligosacchariden te synthetiseren. Bovendien, zoals eerder beschreven is in deze octrooiaanvrage, kan het, in het geval van saccharide-peptide-conjugaten die van LPS afgeleide oligosacchariden omvatten, voordelig zijn het B-cel activerende deel dat zich in de "inner core" van LPS bevindt te synthetiseren. Een ander voordeel van een synthetisch verkregen sacccharidedeel is gelegen in de mogelijkheid de minimale saccharide die B-cel activerend werkt in het SPC volgens de uitvinding op te nemen. Bovendien is het ook mogelijk een saccharidedeel te synthetiseren dat een minimale oligosaccharide omvat met kruisreactieve immuniteit verlenende werking. Het is ook mogelijk B-cel activerende delen te synthetiseren die een betere immuunwerking geven dan de natuurlijke oligosacchariden.
Men kan met een synthetisch verkregen saccharidedeel eenvoudiger de spacer op een specifieke plaats aanbrengen. Men kan tevens een of meer fosforethanol groepen inbouwen in het B-cel activerende deel ter verkrijging van een verbeterde immuunwerking.
Teneinde de spacer op een specifieke plaats in de saccharide aan te brengen verdient het de voorkeur de reactieve groepen van de saccharide van beschermende groepen te voorzien voordat men de spacer koppelt. De reactieve groep waar de koppeling met de spacer plaatsvindt voorziet men niet van een beschermende groep. Door deze werkwijze wordt voorkomen dat groepen die essentieel zijn voor de immuniteit verlenende werking tijdens het koppelen van de spacer worden verwijderd of gewijzigd.
Het verdient de voorkeur bij het bereiden van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding de reactieve groepen van de saccharide die tijdens de bereiding van het saccharide-peptide-conjugaat niet mogen reageren te voorzien van beschermende groepen P, en reactieve groepen van de saccharide die tijdens de bereiding van het saccharide-peptide- conjugaat specifiek moeten reageren te voorzien van beschermende groepen T, waarbij de beschermende groepen T selectief ten opzichte van elkaar en ten opzichte van de beschermende groepen P afgesplitst kunnen worden. Bij een dergelijke werkwijze is gebleken dat de combinatie van een allylgroep als beschermende groep T en een benzylgroep als beschermende groep P geschikt is. Voor een deskundige zullen andere geschikte combinaties die aan bovengenoemde eis voldoen voor de hand liggend zijn.
Men kan met voordeel bij de werkwijze volgens de onderhavige octrooiaanvrage als uitgangsprodukt een saccharide nemen die ten minste één hydroxylprecursor bevat. Een geschikte hydroxylprecursor voor deze werkwijze is de groep SiPh(CH3)2. Andere hydroxylprecursors kunnen uiteraard worden toegepast. Men kan een dergelijke hydroxylprecursor op een gewenst tijdstip omzetten tot een hydroxylgroep en deze eventueel gebruiken als reactieve groep waar een specifieke reactie kan plaatsvinden. In het geval van de groep SiPh(CH3)2 kan men de hydroxylgroep genereren door oxidatie met bijvoorbeeld HOOAc.
Bij de werkwijze volgens de uitvinding verdient het de voorkeur de reactieve groep aan het spacer-uiteinde, dat na koppeling met de saccharide vrij blijft, te voorzien van een beschermende groep Z. Hierdoor wordt het mogelijk de saccharide, die voorzien is van een spacer, aan diverse reacties ter modificatie te onderwerpen zonder dat de reactieve groep, die nodig is voor koppeling met het peptide, reactie ondergaat. Uiteraard dient de beschermende groep zodanig te worden gekozen dat deze aanwezig blijft tijdens de modificerende reacties. Men kan bijvoorbeeld de reactieve groep NH2 van een spacer voorzien van een beschermende groep Z zoals een benzyloxycarbonylgroep. Men kan ook de reactieve groep COOH van een spacer omzetten tot een estergroep. Er zijn talloze voorbeelden bekend uit de literatuur van beschermende groepen die op reactieve groepen van spacers kunnen worden aangebracht. (Met name in de Nederlandse octrooiaanvrage 86.023.25).
Voor het bereiden van een voorkeurs-saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding dat ten minste een PEA groep in het saccharidedeel omvat kan men een PEA groep op het B-cel activerende deel van het saccharidedeel aanbrengen. Men kan hiertoe een reactieve groep op ten minste één plaats van de saccharide fosforyleren en het gevormde fosfory-leringsproduct omzetten met een ethanolamine waarvan de aminogroep beschermd is door een groep, die verschilt van de beschermende groep Z
van de spacer. Het ethanolamine kan men op geschikte wijze beschermen met trifluoracetyl.
In figuren 9a, b en c wordt een bijzonder geschikt voorbeeld van de werkwijze volgens de uitvinding weergegeven. De stappen 13-16 geven een uitstekend voorbeeld van de fosforyleringsstap die men kan uitvoeren.
Bij de werkwijze volgens de uitvinding kan men de saccharide, die voorzien is van een beschermde spacer, vóór de koppeling aan het peptide activeren door de beschermende groep Z van de spacer te verwijderen, waarbij in de saccharide aanwezige PEA-groepen beschermd blijven.
Men kan hiertoe de saccharide met de daaraan gekoppelde beschermde spacer aan hydrogenolyse onderwerpen, waarbij zowel de beschermende groep Z van de spacer alsmede de hydroxyl beschermende groepen worden verwijderd, terwijl de PEA-groepen beschermd blijven.
Men kan de vrije reactieve groep van de spacer, die door Z werd beschermd, voorzien van een groep die specifieker reageert met het peptide dan de vrije groep van de spacer. Een mogelijkheid die goed voldoet is het in een thiolgroep omzetten van een vrije aminogroep van de spacer. Men kan een saccharidedeel dat gekoppeld is aan een spacer die een vrije thiolgroep bevat, conjugeren met een peptide dat gemodificeerd is met een groep die met sulfhydryl reactief is. Een geschikt voorbeeld van een dergelijke sulfhydryl reactieve groep is broomacetyl. Men kan de broom-acetyl groep gemakkelijk verkrijgen met N-succinimidylbroomacetaat.
Het verdient de voorkeur PEA-groepen van de saccharide voor en tijdens de koppeling met het (geactiveerde) peptide te beschermen en na de koppeling te verwijderen. Men kan de verwijdering van beschermende groepen zoals trifluoracetyl uitstekend uitvoeren door hydrolyse met een zwakke base zoals ammonia.
VOORBEELD
In het onderhavige voorbeeld is een werkwijze voor de bereiding van een saccharide-peptide-conjugaat volgens de uitvinding beschreven. Als B-cel activerend deel in het saccharidedeel is een fragment van de "inner core region" van het LPS-immunotype 6 gekozen. Verder is als T-helpercel bevattend deel van het peptidedeel de sequentie ^7~59 van een Meningococcus buitenmembraaneiwit gekozen. De werkwijze is weergegeven in figuren 9a,b en c.
De werkwijze omvatte de volgende stappen: reactie van (fenyl-dimethylsilyl)methylmagnesiumchloride (2) met het gemakkelijk toegankelijke allyltri-0-benzyl-a-D-manno-hexodialdo-l,5-pyranoside (1). Additie van verbinding 2 in 1,3-dioxolaan aan 1 in hetzelfde oplosmiddel geschiedde met hoge diastereofaciale selectiviteit, hetgeen het a-hydroxysilaanadduct van verbinding 3 leverde (d.p. £ 95/·) niet een opbrengst van 77#·
Benzylering van verbinding 3 gaf verbinding 4 en deallylering in twee stappen gaf homogene verbinding 5 niet een opbrengst van 68%. Behandeling van verbinding 5 niet Vilsmeier reagens leverde als glycosyldonor verbinding 6 die later werd gekoppeld met de LD-Hepp acceptor 11 die tevens de spacer omvatte, waarvan de synthese in schema 2 is uiteengezet.
Glycosylering van 3-(benzyloxycarbonylamino)-l-propanol (8) door het ethyl 1-thio-a-LD-Hepp derivaat verbinding 7. die in acht stappen uit 2,3,4,6,y-penta-O-acetyl-L-glycero-D-marmo-heptopyranosylbromide werd bereid bij aanwezigheid van N-jodosuccinimide (NIS) en katalytisch tri-fluormethaansulfonzuur (TfOH) gaf a-derivaat 9 niet een opbrengst van 80%. Zemplén-deacylering van verbinding 9 leverde verbinding 10 en daaropvolgende regioselectieve benzylering onder phase-transfer (fase-overdracht)-omstandigheden gaf verbinding 11 met een opbrengst van 85#. Stereospeci-fieke 1,2-trans-glycosylering van acceptor 11 door overmaat van donor 6 kon worden bereikt (zie Schema 3) onder toepassing van de promotor zil-vertriflaat, hetgeen na opwerking en zuivering door middel van silicagel-chromatografie homogene disaccharide 12 gaf met een opbrengst van 92# betrokken op verbinding 6. Bij deze werkwijze is de dimethyl(fenyl)silyl-maskerende groep in donor 11 verenigbaar met de glycosideringsomstandig-heden.
Tussenprodukt 12 werd in het donker geoxideerd, hetgeen verbinding 13 gaf met een opbrengst van 91#· Fosforylering van de vrije hydroxyl-groep in verbinding 13 gaf in drie stappen zonder isolatie van tussenpro-ducten de volledig beschermde gefosforyleerde disaccharide 16. De fosforylering van 13 met behulp van 1-H-tetrazool met het bifunctionele reagens 14 gaf als tussenprodukt fosforamidiet, dat in situ werd gecondenseerd en onder soortgelijke omstandigheden werd omgezet met overmaat 2-trifluoracetamidoethanol (15)· De fosfiettriëster (Óp 142,0 en 142,2 dpm) die aldus werd verkregen, werd onmiddellijk geoxideerd, hetgeen het fosfotriësterderivaat 16 met een opbrengst van 81# gaf (óp-3,1 en 3*2 dpm). Partiële verwijdering van de bescherming van verbinding 16 gaf in twee afzonderlijke stappen verbinding 18 met een opbrengst van 56#.
De vrije aminogroep van verbinding 18 werd vervolgens onderworpen aan verdere behandeling. Als eerste stap gaf ionogene debenzylering van de fosfotriëstergroep het geladen derivaat 17 (<5p 0,42 dpm). De tweede stap, de hydrogenolyse van de benzyloxicarbonyl- (Z) en benzylbeschermen-de groepen, leverde verbinding 18. De 1H- en 13C-NMR-gegevens van verbinding 18 kwamen overeen met de voorgestelde structuur.
De laatste stap in de bereiding van het suiker-peptide-conjugaat omvatte een omzetting in twee stappen van verbinding 18 in het thiolderi-vaat 20 gevolgd door in situ condensatie met het broomacetylpeptide 21 en vervolgens verwijdering van de trifluoracetylgroep van 22. Aldus gaf behandeling van verbinding 18 met het reagens pentafluorfenyl-S-acetyl-mercaptoacetaat na zuivering over Sephadex G-25 een homogene verbinding 19· Hydroxylamine werd aan een zuurstofvrije gebufferde oplossing die verbinding 19 en het peptidederivaat 21, dat via een vaste fase benadering bereid was (The W-bromoacetyl-Gly-Gly-elongated peptide sequence 47-59 of strain H44/76 class 1 outer membrane protein (i.e., 21) was prepared by continuous-flow solid-phase synthesis on a dimethoxybenzhydryl-amino-resin using Na-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)amino acid derivatives, according to standard procedures [Atherton, E. and Sheppard, R.C., solid phase peptide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford University Press, 1989]· The W-terminal bromoacetyl group was introduced during the last cycle of the synthesis [Robey, F.A. and Fields, R.L., Anal. Biochem. 1989. 177. 373]· After side-chain deprotection and cleavage from the solid support (TFA/H20, 93/5. 1*5 h, r.t.), the peptide was purified by semi-preparative reverse phase HPLC. FAB mass analysis gave a signal of the protonated molecular ion (MH+) at m/z 1680.0 (calcd. monoisotopic mass 1679·7) bevatte, toegevoegd.
HPLC-analyse van het ruwe reactiemengsel na 48 uur bij 20°C vertoonde inter alia de aanwezigheid van twee hoofdprodukten. Het produkt dat sneller elueerde werd gezuiverd door HPLC en daarna aan FAB MS analyse onderworpen. Het FAB massaspectrum vertoonde een signaal van een geproto-neerd molecuulion (MH*) bij m/z 2353.2, hetgeen goed overeenkwam met de voorgestelde structuur van het partiëel beschermde conjugaat 22. Ammono-lyse van 22, gevolgd door zuivering (HPLC), gaf een homogeen produkt dat, zoals bleek door FAB massaspectroscopie, een geprotoneerd molecuulion bij m/z 2257,0 vertoonde, hetgeen de volledige verwijdering van de trifluoro-acetylgroep en de identiteit van het saccharide-peptide-conjugaat bevestigde .
De spacer in dit voorbeeld is voorzien van een NH2-groep die beschermd is met een benzyloxycarbonylgroep (Z). Er bestaan talloze spacers met al of niet beschermde reactieve groepen die bij de werkwijze voor de bereiding van een SPC volgens de uitvinding kunnen worden toe gepast. In de Nederlandse octrooiaanvrage 8602325 over saccharide-pep-tide-conjugaten met saccharide van H-influenza B staan een aantal voorbeelden beschreven van reactieve groepen die bij de onderhavige werkwijze van toepassing kunnen zijn. Het moge duidelijk zijn dat aminogroep NH2 slechts een voorbeeld is. Spacers met reactieve groepen zoals beschreven in de geciteerde octrooiaanvrage zijn hierin door verwijzing opgenomen.
Ter verduidelijking geldt in het algemeen voor de werkwijze voor bereiding van een SPC volgens de uitvinding dat de fosforylering mogelijk is met vele fosfiet- of fosfaatreagentia in meerstaps-procedures met of zonder isolatie van tussenprodukten. Van groot belang is dat de bescherming van de aminogroep van ethanolamine niet gelijk is aan de bescherming van de reactieve groep van de spacer. In het voorbeeld is de aminogroep van de spacer beschermd met benzyloxycarbonyl (Z) en is de ethanolamine-groep beschermd met een trifluoracetylgroep. De Z-groep kan worden verwijderd door hydrogenolyse, waarbij trifluoracetyl stabiel is. Overigens wordt in het voorbeeld Z gelijktijdig met de Bn-groepen op de suiker verwijderd (Z en Bn geven dus geen orthogonale bescherming ten opzichte van elkaar).
Bij het verwijderen van de bescherming van fosfaatsuiker en spacer wordt eerst de fosfaatbescherming verwijderd. Fosfotriësters zijn labiel; diësters zijn stabiel(er). Om splitsing van de R-O-P of P-O-R' band in de triëster te voorkomen ("verkeerde afbraak") wordt zo spoedig mogelijk de P-O-Bn gesplitst. Daarna ondergaat produkt 17, het TFA-PEA-beschermde suiker - beschermde spacer conjugaat hydrogenolyse met H2 en een katalysator, waarbij produkt 18, het TFA-PEA-onbeschermde suiker - onbeschermde spacer conjugaat ontstaan. In deze stap vindt hydrogenolyse van de Z-groep en van de benzylgroep plaats.
Produkt 18 is geschikt voor conjugatie aan een peptide of een eiwit. De aminogroep van de spacer kan worden gekoppeld met aminogroepen in een peptide of een eiwit (bijvoorbeeld met glutaardialdehyd) of met carbon-zuurgroepen in een peptide of een eiwit (bijvoorbeeld met een carbodi-imide-derivaat). Dit type conjugaties, hoewel zij niet onbruikbaar zijn bij een werkwijze volgens de onderhavige octrooiaanvrage, verloopt echter chaotisch. Behalve de gewenste suiker-peptide-conjugatie treedt ook inter- en intramoleculaire verknoping op van peptide of eiwit en van primair conjugaat.
Met het synthetische antigeen 18 is een fijnzinniger aanpak mogelijk en verdient deze werkwijze derhalve de voorkeur. De spacer kan via de aminogroep selectief (PEA is immers beschermd) worden voorzien van een reactieve groep met een meer specifieke reactiviteit. In het voorbeeld is dit een beschermd thiol.
Produkt 19 kan bij milde pH met hydroxylamine worden omgezet in het vrije thiol.
Produkt 20 kan reageren met peptiden/proteïnen die zijn gemodificeerd met (een) "sulfhydryl-reactieve" groep(en).
Samenvattend wordt bij de werkwijze uit het voorbeeld de forforethanolamine (PEA)-groep ingebouwd. Tevens wordt uitsluitend de spaceraminogroep gemodificeerd met een S-acetylmercaptoacetylgroep. De aminogroep van de PEA is immers beschermd met een trifluoracetylgroep. De trifluoracetylgroep zou ook een andere groep mogen zijn. De latere conjugatie van saccharide met peptide verloopt dus bij de werkwijze uit het voorbeeld selectief via de spacer. De trifluoracetylgroep wordt pas na conjugatie verwijderd. De PEA-groep is van groot belang voor de immunologische eigenschappen (Verheul et all, Infect, and Immun. 53.. 843-85I. I99I) en daarom is een werkwijze waarbij de PEA-groep of -groepen worden beschermd en/of aangebracht, een werkwijze volgens de uitvinding die de voorkeur verdient.
Claims (57)
1. Een saccharide-peptide-conjugaat waarvan het saccharidedeel ten minste een van een lipopolysaccharide (LPS) van een gramnegatieve bacterie afgeleid immuniteit verlenend B-cel activerend deel met ten minste één epitoop omvat en het peptidedeel ten minste een homoloog eiwit of een van een homoloog eiwit afgeleid peptide-fragment met een T-helpercel activerend deel met ten minste één epitoop omvat, (waarbij homoloog wil zeggen dat het B-cel activerende deel en het T-helpercel activerende deel in hetzelfde micro-organisme voorkomen) met het kenmerk, dat het saccharidedeel als B-cel activerend deel het LPS oligosaccharide deel (core region) of een daarvan afgeleid fragment omvat.
2. Saccharide-peptide-conjugaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat ten minste het B-cel activerende deel met ten minste één epitoop gesynthetiseerd is.
3· Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het B-cel activerende deel met ten minste één epitoop is afgeleid van het oligosaccharide deel (inner core) van een LPS van Meningococcus.
4. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel met ten minste één epitoop en het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop zijn geconjugeerd via een spacer.
5· Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel met ten minste één epitoop en het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop zijn geconjugeerd met behoud van de vrije aminogroepen van in het B-cel activerende deel aanwezige fosforethanolamine (PEA)-groepen.
6. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat bij het B-cel activerende deel met ten minste één epitoop voor de conjugatie ten minste één PEA-groep is aangebracht .
7- Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop is afgeleid van een buitenmembraaneiwit (OMP).
8. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop is afgeleid van een Meningococcus Klasse I OMP.
9. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop is afgeleid van Meningococcus H44/76 Klasse I OMP.
10. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop is afgeleid van Meningococcus PI.7.16.
11. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste één T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop is afgeleid van ten minste een werkzaam deel van ten minste één van de dodecameren uit fig. X met nummers 1, 7. 8, 9. 13. 23, 28, 32, 33. 35 t/m 39. 42 t/m 45.
12. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het peptidedeel voor meer dan één HLA-feno-type herkenbaar is.
13. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop ten minste een werkzaam deel van de sequentie RTKISDFGSFIGFKG of van een daarmee equivalente sequentie omvat.
14. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop ten minste een werkzaam deel van de sequentie KISDFGSFI of een daarmee equivalente sequentie omvat.
15. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop gemuteerd is zodat beter contact gemaakt kan worden met MHC van een antigeen presenterende cel.
16. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat ten minste het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop gemuteerd is zodat beter contact gemaakt kan worden met een T-cel receptor.
17. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop ten minste een werkzaam deel van de sequentie KLSDFGSFI of van een daarmee equivalente sequentie omvat.
18. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop ten minste een werkzaam deel van de sequentie KISDYGSFI of van een daarmee equivalente sequentie omvat.
19. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het T-helpercel activerende deel met ten minste één epitoop gemuteerd is door deze aan beide uiteinden te voorzien van lysinegroepen.
20. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel is afgeleid van een oligosaccharidedeel van een LPS van Meningococcus met immunotype L3.
23· Saccharide-peptide-conjugaat volgens conclusie 21 of 22, met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel ten minste één PEA-groep bevat.
24. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de conclusies 1-19. met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel is afgeleid van een oligosaccharidedeel van een LPS van Meningococcus met immunotype L2.
25. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaandé conclusies, met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel als uiteinde B-D-Glcp(l-*4), α-D-GlcNAcp of L-a-D-Hepp(l-»5) heeft.
28. Saccharide-peptide-conjugaat volgens één van de conclusies 24-27, met het kenmerk, dat het B-cel activerende deel ten minste één PEA-groep bevat.
29. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het saccharidedeel kruisreactie vertoont met ten minste twee immunotypen van gram-negatieve bacteriën.
30. Saccharide-peptide-conjugaat volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat het conjugaat kruisreactie vertoont met ten minste immunotypen L2 en L3 van Meningococcus.
31. Saccharide-peptide-conjugaat volgens conclusie 29. met het kenmerk, dat het conjugaat kruisreactie vertoont met ten minste immunotypen Lx en L3 van Meningococcus.
32. Saccharide-peptide-conjugaat volgens een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het saccharidedeel ten minste de vertakte oligosaccharide B-D-Glcp(l-*4)-[L-a-D-Hepp(l-*3)]-L-a-D-Hepp) omvat.
33· Saccharide-peptide-conjugaat volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat de vertakte oligosaccharide B-D-Glcp(l-*4)-[L-a-D-Hepp(l-*3) ]-L-a-D-Hepp) een PEA-groep op de 0-3 van de heptosyl eenheid omvat.
34. Saccharide-peptide-conjugaat volgens conclusie 32 of 33. met het kenmerk, dat de vertakte oligosaccharide B-D-Glcp(l-*4)-[L-a-D-Hepp(l-*3) ]-L-a-D-Hepp) voorzien is van een spacer die verbinding geeft met ten minste een andere immunotypespecifiek B-cel activerend deel.
35· Werkwijze voor het bereiden van een saccharide-peptide-conjugaat volgens één van de voorgaande conclusies door een saccharide die ten minste een van een lipopolysaccharide (LPS) van een gramnegatieve bacterie afgeleid immuniteit verlenend B-cel activerend deel met ten minste één epitoop omvat te koppelen met een peptide dat ten minste een homoloog eiwit of een van een homoloog eiwit afgeleid peptide-fragment met een T-helpercel activerend deel met ten minste één epitoop omvat, (waarbij homoloog wil zeggen dat het B-cel activerende deel en het T-helpercel activerende deel in hetzelfde micro-organisme voorkomen) waarbij het saccharide deel als B-cel activerend deel het LPS oligosaccharide deel (core region) of een daarvan afgeleid fragment omvat.
36. Werkwijze volgens conclusie 35* waarbij men de saccharide via een spacer die aan de uiteinden reactieve groepen zoals NH2 en COOH bevat, koppelt aan het peptide.
37· Werkwijze volgens conclusie 35 of 36, waarbij de saccharide synthetisch verkregen is.
38. Werkwijze volgens één van de conclusies 35~37. waarbij men de reactieve groepen van de saccharide voorziet van beschermende groepen met uitzondering van de reactieve groep waar de koppeling met de spacer plaatsvindt en daarna de spacer koppelt aan de aldus beschermde saccharide.
39· Werkwijze volgens één van de conclusies 35“38, waarbij men de reactieve groepen van de saccharide die tijdens de bereiding van het saccharide-peptide-conjugaat niet mogen reageren voorziet van beschermende groepen P, en reactieve groepen van de saccharide die tijdens de bereiding van het saccharide-peptide-conjugaat specifiek moeten reageren voorziet van beschermende groepen T, waarbij de beschermende groepen T selectief ten opzichte van elkaar en ten opzichte van de beschermende groepen P afgesplitst kunnen worden.
40. Werkwijze volgens conclusie 39» waarbij de beschermende groep T een allylgroep is en de beschermende groep P een benzylgroep is.
41. Werkwijze volgens één van de conclusies 35-40, waarbij men als uitgangsprodukt een saccharide neemt die ten minste één hydroxylprecursor bevat.
42. Werkwijze volgens conclusie 4l, waarbij de hydroxylprecursor-groep de groep SiPh(CH3)2 is.
43. Werkwijze volgens één van de conclusies 35“42, waarbij men de reactieve groep aan het spacer-uiteinde, dat na koppeling met de saccharide vrij blijft, voorziet van een beschermende groep Z.
44. Werkwijze volgens conclusie 43. waarbij men de reactieve groep ? NH2 van de spacer voorziet van een benzyloxycarbonylgroep als beschermende groep Z.
45. Werkwijze volgens conclusie 43. waarbij men de reactieve groep COOH van de spacer omzet tot een estergroep.
46. Werkwijze volgens conclusies 42-45, waarbij men op een plaats van de saccharide die SiPh(CH3)2 als hydroxylprecursor bevat een hydroxyl-groep genereert door oxidatie met bij voorbeeld HOOAc.
47. Werkwijze volgens conclusies 35-^6, waarbij men een reactieve groep op ten minste één plaats van de saccharide fosforyleert en het gevormde fosforyleringsproduct omzet met een ethanolamine waarvan de aminogroep beschermd is door een groep, die verschilt van de beschermende groep Z van de spacer.
48. Werkwijze volgens conclusie 47, waarbij het ethanolamine is beschermd met trifluoracetyl.
49. Werkwijze volgens één van de conclusies 35“48, waarbij men de stappen volgens stappen 13-16 van het reactieschema van fig. 9 uitvoert.
50. Werkwijze volgens één van de conclusies 35“49. waarbij men de saccharide, die voorzien is van een beschermde spacer, activeert vóór de koppeling aan het peptide door de beschermende groep Z van de spacer te verwijderen, waarbij in de saccharide aanwezige PEA-groepen beschermd blijven.
51. Werkwijze volgens één van de conclusies 35_50. waarbij men de saccharide met de daaraan gekoppelde beschermde spacer onderwerpt aan hydrogenolyse, waarbij zowel de beschermende groep Z van de spacer alsmede de hydroxyl beschermende groepen worden verwijderd, terwijl de PEA-groepen beschermd blijven.
52. Werkwijze volgens conclusie 51. waarbij men de vrije reactieve groep van de spacer, die door Z werd beschermd, voorziet van een groep die specifieker reageert met het peptide dan de vrije groep van de spacer.
53. Werkwijze volgens één van de conclusies 35“52, waarbij men een vrije aminogroep van de spacer omzet in een beschermde thiolgroep. 5^. Werkwijze volgens conclusie 531 waarbij men het saccharide, dat gekoppeld is aan een spacer die een vrije thiolgroep bevat, conjugeert met een peptide dat gemodificeerd is met een met sulfhydryl reactieve groep. 55* Werkwijze volgens conclusie 5^. waarbij de met sulfhydryl reactieve groep broomacetyl is.
56. Werkwijze volgens conclusie 55. waarbij men de broomacetylgroep heeft verkregen met N-succinimidyl-broomacetaat.
57· Werkwijze volgens één van de conclusies 3^“56, waarbij men PEA-groepen van de saccharide voor en tijdens de koppeling met het (geactiveerde) peptide beschermt en na de koppeling verwijdert.
58. Werkwijze volgens conclusie 57. waarbij men de verwijdering uitvoert door hydrolyse roet zwakke base zoals ammonia.
59· Vaccin gekenmerkt door een werkzaam gehalte aan saccharide-pep-tide-conjugaat volgens een van de conclusies 1-3^ of aan een volgens de werkwijze van een van de conclusies 35~5δ verkregen saccharide-peptide-conjugaat.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL9101359A NL9101359A (nl) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | Nieuw saccharide-peptide-conjugaat, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat. |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL9101359 | 1991-08-07 | ||
NL9101359A NL9101359A (nl) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | Nieuw saccharide-peptide-conjugaat, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL9101359A true NL9101359A (nl) | 1993-03-01 |
Family
ID=19859591
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL9101359A NL9101359A (nl) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | Nieuw saccharide-peptide-conjugaat, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NL (1) | NL9101359A (nl) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994008021A1 (en) * | 1992-10-02 | 1994-04-14 | De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur | Immunogenic meningococcal lps and outer membrane vesicles and vaccine therefrom |
WO2005107798A1 (en) | 2004-05-11 | 2005-11-17 | De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Vws | NEISSERIA MENINGITIDIS IgtB LOS AS ADJUVANT |
US7585510B1 (en) * | 1999-09-30 | 2009-09-08 | Isis Innovation Limited | Vaccine |
-
1991
- 1991-08-07 NL NL9101359A patent/NL9101359A/nl not_active Application Discontinuation
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994008021A1 (en) * | 1992-10-02 | 1994-04-14 | De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur | Immunogenic meningococcal lps and outer membrane vesicles and vaccine therefrom |
US7585510B1 (en) * | 1999-09-30 | 2009-09-08 | Isis Innovation Limited | Vaccine |
WO2005107798A1 (en) | 2004-05-11 | 2005-11-17 | De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Vws | NEISSERIA MENINGITIDIS IgtB LOS AS ADJUVANT |
AU2005239963B2 (en) * | 2004-05-11 | 2011-01-06 | De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Vws | Neisseria meningitidis IgtB LOS as adjuvant |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pozsgay | Recent developments in synthetic oligosaccharide-based bacterial vaccines | |
AU669354B2 (en) | Synthetic haemophilus influenzae conjugate vaccine | |
US5811102A (en) | Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines | |
KR100628664B1 (ko) | 그람 음성균의 보존된 리포폴리사카라이드의 항원성 접합체, 및 이를 포함하는 백신 제형 및 약제학적 조성물 | |
AU2005302269B2 (en) | Modified streptococcal polysaccharides and uses thereof | |
HU218146B (hu) | Továbbfejlesztett meningokokkusz-poliszacharid-konjugátum vakcina | |
HUT64237A (en) | Improved vaccina preparatives | |
PL175595B1 (pl) | Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N.meningitidis, sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu oraz szczepionka przeciwko infekcji N.meningitidis | |
Liao et al. | Synthesis and immunological study of α-2, 9-oligosialic acid conjugates as anti-group C meningitis vaccines | |
KR19990022747A (ko) | 2, 5-안히드로-d-만노오스 터미널 구조를 갖는 항원성 b족 연쇄구균 타입 ⅱ 및 타입 ⅲ 다당류 및 그의 복합 백신 | |
US5780606A (en) | Neisseria meningitidis capsular polysaccharide conjugates | |
US20110229513A1 (en) | LPS Based Vaccines | |
MXPA03010283A (es) | Conjugados inmunogenicos de acido hialuronico de peso molecular bajo con toxinas de polipeptido. | |
Gotschlich | Meningococcal meningitis | |
Grandjean et al. | Investigation towards bivalent chemically defined glycoconjugate immunogens prepared from acid-detoxified lipopolysaccharide of Vibrio cholerae O1, serotype Inaba | |
NL9101359A (nl) | Nieuw saccharide-peptide-conjugaat, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk saccharide-peptide-conjugaat omvat. | |
US20160136285A1 (en) | An isolated immunogenic bacterial antigen and its use in the prevention and treatment of infections caused by gram-negative bacteria | |
Jennings | Chemically modified capsular polysaccharides as vaccines | |
US7527949B2 (en) | Polysaccharides of Helicobacter pylori | |
Tontini | Characterization of carbohydrate based vaccines | |
Theillet et al. | Multidisciplinary approaches to study O-antigen: antibody recognition in support of the development of synthetic carbohydrate-based enteric vaccines | |
Pequegnat | A Diagnostic Target Against Clostridium bolteae, Towards a Multivalent Vaccine for Autism-Related Gastric Bacteria |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A1B | A search report has been drawn up | ||
BV | The patent application has lapsed |