NL8700783A

NL8700783A - Werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten.

Info

Publication number: NL8700783A
Application number: NL8700783A
Authority: NL
Original assignee: Wessanen Nederland Bv
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1987-04-02
Publication date: 1988-11-01
Also published as: AU1415388A; NZ224080A; AU617103B2

Description

. N.0. 34260 1 *%

Werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten.

Als uitvinders worden genoemd; E.C. Verbree, A Ykema en H. Smit.

5

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten door het in een medium cultiveren van een vetproducerend microorganisme en vervolgens het uit het microorganisme 10 winnen van de daarin geaccumuleerde vetten.

Een der meest gewaardeerde plantaardige vetten is cacaoboter. Dit is een in de natuur voorkomend produkt, dat gewonnen wordt uit zaden van de cacaoboom (Theobroma cacao). Meer in het bijzonder is cacaoboter een produkt, dat grotendeels opgebouwd is uit l,3-diverzadigde-2-onverzadig-15 de triglyceriden, welke stearine-, olie- en palmitinezüur als vetzuur-componenten bevatten. Gezien de algemeen erkende unieke eigenschappen van cacaoboter, waarvan echter het aanbod, kwaliteit en prijs sterk fluctueert, is de behoefte aan dit produkt nog steeds groeiend en kan de natuurlijke produktie van dit produkt niet of nauwelijks meer aan de 20 vraag voldoen. Alhoewel in de toenemende behoefte aan cacaoboter gedeeltelijk kan worden voorzien door analoga met een vergelijkbare triglyce-ride-opbouw (cacaoboter-equivalenten), leveren deze geen werkelijke bijdrage tot de oplossing van het probleem daar deze analoga, naast een palmitinezuur-oliezuur-palmitinezuurrijke (POP-rijke) palmoliecomponent 25 voor een aanzienlijk deel op stearinezuur-oliezuur-stearinezuurrijke (SOS-rijke) exotische vetten zoals Sheavet en Tengkawan zijn gebaseerd, waarvan de eigenschappen, prijs en beschikbaarheid een duidelijke beperking inhouden. Gezocht is derhalve naar een alternatieve bereidingswijze voor cacaoboter-equivalenten, resp. voor de exotische SOS-rijke cömpo-30 nent daarvan, welke zowel een goede en constante kwaliteit als een lage kostprijs bezitten.

Bekend is, dat vetten en oliën bereid kunnen worden met behulp van olie/vetproducerende microorganismen zoals algen, bacteriën, schimmels en gisten. Dergelijke microorganismen synthetiseren de lipiden tijdens 35 het normale verloop van het cellulaire metabolisme. Getracht is nu die microorganismen alsook media en procesomstandigheden te vinden, welke op economische schaal een produktie van dergelijke cacaoboter-equivalenten of componenten daarvan mogelijk maken.

In de stand der techniek zijn velerlei voorstellen betreffende de 40 bereiding van cacaoboter-equivalenten aangedragen. Bijvoorbeeld is uit 8”ï /» — ·>· J i t. ·' Γ 2 « % de Nederlandse octrooiaanvrage 78.04549 een werkwijze voor het micro-biëel bereiden van als cacaoboter-surrogaat te gebruiken vetten bekend, waarbij het medium voor het vetproducerende microorganisme een gemengde koolstofbron bevat, die uit ten minste een stearylderivaat en ten minste 5 een palmitylderivaat, een oleylderivaat en een saccharide bestaat. Als voor de omzetting geschikte microorganismen worden stammen van de genera Candida, Torulopsis, Trichosporon, Pichia en Sporobolomyces genoemd. Een dergelijke werkwijze bezit echter het nadeel, dat een medium dient te worden toegepast, dat aan bepaalde hoge eisen dient te voldoen. 10 Dergelijke media zijn echter kostbaar zodat de werkwijze volgens deze Nederlandse octrooiaanvrage 78.04549 niet of nauwelijks op economische schaal kan worden toegepast.

Uit het Europese octrooischrift 0.005.277 is een microbiologische bereidingswijze van oliën en vetten bekend, welke gebaseerd is op: 15 a) het bereiden van een groeimedium, waarin de koolstofbron vetzuren met 10-20 koolstofatomen bevat, b) het inocculeren van het groeimedium met olieproducerende gistcellen, zoals stammen van de genera Rhodosporidium, Lipomyces, Candida, Saccharomyces, Endomyces en Rhodotorula, 20 c) het aëroob cultiveren van de gistcellen bij een pH tussen 4,0 en 6,0 en een temperatuur van 20-40°C, d) het afscheiden van de gecultiveerde cellen uit het groeimedium, en e) het winnen van de olie uit de gecultiveerde cellen.

Als voorbeelden van dergelijke als koolstofbron te gebruiken vetzuren 25 worden palmitine-, olie- en stearinezuur en mengsels hiervan genoemd. Ook aan deze laatstgenoemde werkwijze kleeft het nadeel, dat deze voor de bereiding van een cacaoboter-equivalent vanwege het benodigde substraat niet op economische wijze kan worden uitgevoerd. In dit verband wordt nog gewezen op de in de hoofdconclusie vermelde zinsnede, dat de 30 samenstelling van de gesynthetiseerde olie afhankelijk is van de verhouding tussen het in het medium aanwezige verzadigde vetzuur ten opzichte van het daarin aanwezige onverzadigde vetzuur.

Uit de Amerikaanse octrooischriften 4.485.172 en 4.485.173 zijn eveneens werkwijzen hekend voor het bereiden van vetten en oliën met 35 behulp van vetproducerende microorganismen, waarbij in het substraat als koolstofbron ten minste een vetzuur met 10-20 koolstofatomen dient te worden toegepast. Met voordeel worden als koolstofbron palmitine-, olie-en stearinezuur of mengsels hiervan toegepast, waarbij de relatieve concentratie van deze zuren echter zodanig wordt ingesteld, dat 40 cacaoboter-equivalenten kunnen worden bereid. Voorts wordt in het 6 S U 0 / 8 > 3 Λ *

Amerikaanse octrooischrift 4.485.173 ook de toepassing vermeld van een desaturase-enzym-inhibitor, welke een hogere verhouding van stearinezuur ten opzichte van oliezuur in de bereide triglyceriden bevordert. Aangegeven wordt» dat deze inhibitor de desaturatie van stearinezuur in olie-5 zuur sterk vermindert. Als geschikte gisten worden stammen van de genera Rhodosporidium, Lipomyces, Candida» Endomyces» Saccharomyces» Rhodo-torula, Trichosporon en Torulopsis genoemd. Daar voor het bereiden van cacaoboter-equivalenten substraten dienen te worden toegepast, waarin een koolstofbron met bovenaangeduide specifieke samenstelling dient te 10 worden toegepast, wordt naar voren gebracht, dat de toepassing van de uit deze Amerikaanse octrooischriften bekende werkwijzen in economisch opzicht niet haalbaar geacht wordt.

Uit het Amerikaanse octrooischrift 4.235.933 is een werkwijze voor het bereiden van oliën met behulp van een olieproducerende stam van 15 Candida curvata bekend, waarbij als goedkoop substraat een door ultrafiltratie verkregen weipermeaat wordt toegepast. Als voorbeelden van toe te passen microorganismen worden de stammen Candida curvata stam D, ATCC No. 20509 en Candida curvata stam R» ATCC No. 20508 toegepast. Het bij deze werkwijze verkregen produkt bezit echter een ten opzichte van 20 cacaoboter onvoldoende kwaliteit vanwege een te hoog gehalte aan onverzadigde vetzuren en wordt derhalve in diervoeder verwerkt.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het op économisch rendabele wijze bereiden van cacaoboterequivalenten of componenten daarvan doordat men als microorganisme een mutant van een vetproducerend 25 gist behorende tot een der geslachten Apiotrichum» Candida, Crypto-coccus , Endomyces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodo-torula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Thorulopsis, Trichosporon en Yarrowia toepast, waarin het voor de omzetting van stearinezuur in oliezuur verantwoordelijke enzymsysteem genetisch geheel of gedeeltelijk is 30 geblokkeerd·

In het kader van de uitvinding wordt onder de term "cacaoboter-equivalent" een vetmengsel verstaan, dat voor meer dan 25%, bij voorkeur meer dan 50%, opgebouwd is uit l,3-diverzadigde-2-onverzadigde triglyceriden, welke al dan niet verzadigde vormen van C^g- en C^g-vet-35 zuren als vetzuurcomponenten bevatten. Voorts wordt onder de term "component van een cacaoboter-equivalent" een vetmengsel verstaan, dat voor meer dan 25%, bij voorkeur meer dan 50%, opgebouwd is uit 1,3-di-verzadigde-2-onverzadigde triglyceriden, welke verzadigde en onverzadigde vormen van Cjg-vetzuren als vetzuurcomponenten bevatten.

40 De bij de werkwijze volgens de uitvinding toe te passen mutanten 87 0 07 8 3 4 k» 4 van vetproducerende gistsoorten zoals met voordeel Apiotrichum curvatum, ook wel desaturase-mutanten genoemd, worden door middel van mutagenisa-tie verkregen. Deze mutagenisatie kan bijvoorbeeld met behulp van chemische mutagentia zoals N-methyl-N’-nitrose-guanidine, ethylmethaan-5 sulfonaat of door middel van bestraling met UV-licht worden uitgevoerd. De screening van de desaturase-mutant kan geschieden door toepassing van voedingsbodems, waaraan wel of geen oliezuur is toegevoegd.

In het kader van de uitvinding worden eerst die mutanten geïsoleerd, waarin het enzym desaturase, dat de omzetting van stearinezuur in 10 oliezuur katalyseert, niet werkzaam is. De op deze wijze geïsoleerde desaturase-mutanten zijn voor hun groei afhankelijk van de toevoeging van oliezuur aan het groeimedium. In dit verband wordt mede naar voren gebracht, dat uitgaande van de geïsoleerde absolute desaturase-mutanten, waarbij het desaturase volledig geremd is, eventueel na inductie met een 15 mutagens, partiële desaturase-mutanten waarbij het desaturase gedeeltelijk geremd is, geïsoleerd zijn, die deze oliezuurbehoefte niet meer bezitten.

De morfologie van de geïsoleerde absolute desaturase-mutanten is, gezien onder een fase-contrast-microscoop, duidelijk verschillend van 20 die van het wilde type Apiotrichum curvatum (ATCC 20509). Sommige mutant-cellen zijn groter en hebben een duidelijke neiging tot de vorming van pseudomycelia. Onder vetproducerende condities worden in deze desaturase-mutanten bij aanwezigheid van beperkte hoeveelheden oliezuur niet zoals bij het wilde type intracellulaire oliedruppels 25 waargenomen, maar een korrelige structuur die duidt op vast vet bij de gehanteerde kweektemperatuur van 30°C.

De resultaten in schudcultures en fermentorkweken wijzen erop dat de absolute desaturase-mutanten in aanwezigheid van geringe hoeveelheden oliezuur en de partiële desaturase-mutanten ook in afwezigheid van olie-30 zuur, een vrij normale groeifase en vetproductiefase doorlopen.

Een van de absolute desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum ATCC 20509 is onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn gedeponeerd.

Daar desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum oliezuur nodig 35 hebben voor de synthese van membraanlipiden hebben partiële revertanten van desaturase-mutanten de voorkeur, aangezien deze slechts gedeeltelijk in de desaturase-activiteit geremd zijn en derhalve in staat zijn bij afwezigheid van oliezuur te groeien. Dit voordeel manifesteert zich in een gunstige invloed op de kostprijs van het groeimedium.

40 In aansluiting op het bovenstaande kan dan bij de werkwijze volgens Ü 7 Γ 7 'i 5 de uitvinding als substraat goedkope wei of weipermeaten of molasses worden toegepast. Voor het verkrijgen van een juiste C/N-verhouding kan bijvoorbeeld NH4+ aan het groeimedium worden toegevoegd. Door gebruik te maken van fed batchkweken en met name partial recycle kweken van 5 Apiotrichum curvatum in weipermeaat konden zeer hoge vetproductiesnelhe-den worden bereikt op grond waarvan een economisch rendabele productie van gistlipiden binnen bereik is gekomen.

Uit de analyseresultaten kan worden afgeleid, dat het met behulp van de mutanten volgens de uitvinding mogelijk is triglyceriden te 10 bereiden die een percentage verzadigde vetzuren bezitten, dat vergelijkbaar is met dat van cacaoboter.

Ter verdere illustratie van de uitvinding worden de onderstaande voorbeelden vermeld; deze voorbeelden dienen niet beperkend te worden uitgelegd.

15

Voorbeeld I

A) Isolatie procedure welke is toegepast voor het verkrijgen van desaturase-mutanten van de vetproducerende gistsoort Apiotrichum 20 curvatum ATCC 20509.

In de onstaande tabel A volgt een weergave van de parameters, welke bij het verkrijgen van desaturase-mutanten van Apiotrichum curvatum in acht zijn genomen. Als stam is Apiotrichum curvatum ATCC 20509 toege-25 past, welke overeenkomt met de in het bovenstaande besproken Amerikaanse octrooischrift 4.235.933 vermelde stam Candida, curvata ATCC 20509.

.87C.v78 3

V

* 6

TABEL A

Isolatiemethode van absolute desaturase-mutanten 5 Uitgangsstam: Apiotrichum curvatum ATCC 20509

Mutagens: N-methyl-N'-nitro-guanidine dosis: 500-1000 microgram NG/ml incubatiemedium: 0.1 M fosfaatbuffer pH 7.0 groeifase: knopvormende cellen 10 dichtheid suspensie: E550 = 10 incubatietijd: 30-180 min.

incubatietemperatuur: 30°C

q aantal behandelde cellen: 2.10 % overleving: 0.0014 - 0.025% 15 aantal desaturase mutanten: 6 mutantfrequentie: 1 per 16.000 a 1 per 80.000 B) Isolatieprocedure, welke is toegepast voor het verkrijgen van partiële desaturase-mutanten, waarbij is uitgegaan van een absolute 20 desaturase-mutant van de vetproducerende gistsoort Apiotrichum curvatum ATCC 20509.

In onderstaande tabel B volgt een weergave van de parameters welke voor het verkrijgen van partiële desaturase-mutanten in acht zijn geno-25 men. Als stam is de bij het CBS onder nummer CBS 199.87 gedeponeerde absolute desaturase-mutant van Apiotrichum curvatum ATCC 20509 toegepast.

ft ί r- "7 f% / V V f o 5 7 é

TABEL B

Isolatiemethode van partiële desaturase-mutanten 5 Uitgangsstam: Absolute desaturasemutant CBS 199.87

Mutagenese: NG

dosis: 200-500/ug/ml incubatiemedium: 0.1 M fosfaatbuffer pH 7.0 groeifase: logarithmisch 10 dichtheid suspensie: ^660 = incubatietijd: 30-120 min.

temperatuur tijdens incubatie: 30°C

% overleving: 0,00008 - 2,5% (dubbel) mutant frequentie: 1 per 140.000 tot 1 per 1.500.000 15 8" Γ ' · r< 3 Η 8 i

Voorbeeld II

Toepassing van de geïsoleerde absolute mutant en van daaruit geïsoleerde partiële desaturase-mutanten alsmede een analyse van het bereide 5 produkt.

In een continu geroerd fermentatievat, voorzien van een beluch-tingsleiding en pH-regelapparatuur wordt een reinculture van een absolute of partiële desaturase-mutant van Apiotrichum curvatum ATCC 20509 10 geënt op een medium met de volgende samenstelling:

Glucose 10 g

Oliezuur 0 tot 0.12 g

Tween 80 0 tot 0.3 g 15 NH4CI 0.25 g KH2PO4 3.5 g

Na2HP04 1.0 g

MgS04 0.75 g

Gistextract 0.75 g 20 CaCl2 50 mg

FeClg 5 mg

ZnS04 0.5 mg

Water 1 liter

25 De cellen werden gekweekt bij pH 5.0, bij een temperatuur van 30°C

en werden geoogst nadat de glucose in het groeimedium was verbruikt. De lipiden werden geëxtraheerd met organische oplosmiddelen en geanalyseerd op triglyceriden-samenstelling en vetzuursamenstelling (volgens algemeen gangbare methoden).

30 In onderstaande Tabel C worden de proefresultaten weergegeven van een absolute desaturase-mutant, gegroeid in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden oliezuur en van een drietal partiële desaturase-mutanten volgens de uitvinding in vergelijking met die van het wilde type (Apiotrichum curvatum ATCC 20509).

35 f* “V ei Λ j>. v / 8 ó 9

Cv *

* 1 1 JJ vDOX'd-VD'tfVDvDCncn-tftO

" .o ...........

S om ^Kt-om^r-iOOOr-ic^m CO T-ι CO I—I IT) O' Ό

M W

0 a>

ό Έ ^ jsi ^OO.OOi-l r-lOO'O'OO

tic co I 1 ^ O n s » N H « ^ N (O

& 2 2 o ° ^«Or,vn^ooo^;oS

,ϋ öo •o c

•H *H

r—i r—I Q) r-i

*J <U

r-l +J

(U 00 ei c Ό 01 0) B öo ca ® ^ rvj c^oonoomcgin-vroo S 3 m I I «„ = hS s ós -s^r 0 0 0 "?; (U *j 1 1 01 <u Λ > 0) ÖO 01 Ό 01 . £: ο·-<ΟΟΟΟί-ΙΝνΟΌι-·__ 5tJ · CMOCO ^N,

- S SS 1-- K) " ον Η,η B o O H S O

§00 SS OOOIA OU COC^ ino» υ -pc « -Η i—ï ^ tii w m m PQ Ö 1-j <; o rH ΓΗ _ ® Soon ΟΟνΟΟΟιίσ.ΟΟ<·00 SS »» o 8 3 333333333333

i S 53 ÓÖÖS °s-3S''-oonCS

*t4

M C

W i-t ° ai r-.

3 s “ ÏÏ o Ό ooincococor-r-cor-<rcO

g 3 SS όόόκτ °£°£σ'Γ'^ΟΟΜ2£ f> cö co C ai (U Ό

•U

S-fc Λ .

> J3 0Ί C

(ü ecu m ecu 3

00 > Η N

C < W C

ι-I ÖO 0) 0) rH C <ü > Ό 1 S I Φ 01 g> £ g n tl n SS5 - 00 o c > n ?, 8 3 n^“

O CJ O Sj *3 U

B 01 01 ö C mm tO ÖO

CO C. «v S Λ S NU

CO >> 00 00 λ C- m MM

u c w os-ow aiw 3 £ ÖOÖOÜWC > 3 01 -1.-Ί.301 ^ N C -3 W O U 01 B Ss« £ u, u 3 00 60 3 S 11 l> n nCöocm * * 11 j J lis ? - 333 g g g g S ï S S ï 5 3 2 S S 5 : 5 § 3 s ” μ s ï rn ÖOÖOÖO>>OUUUUUUUOÜi<^** 87 0 0 7 8 3

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van als cacaoboter-equivalent of als component van een cacaoboter-equivalent te gebruiken vetten door het in 5 een medium cultiveren van een vetproducerend microorganisme en vervol-gens het uit het microorganisme winnen van de bereide vetten, met het kenmerk, dat men als microorganisme een mutant van een stam behorende tot een der geslachten Apiotrichum, Candida, Cryptococcus, Endomyces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharo-10 myces, Sporobolomyces, Thorulopsis, Trichosporon en Yarrowia toepast, waarin het voor de omzetting van stearinezuur in oliezuur verantwoordelijke enzymsysteem genetisch geheel of gedeeltelijk is geblokkeerd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als microorganisme een mutant van Apiotrichum, Candida, Cryptococcus, Endo- 15 myces, Hansenula, Lipomyces, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporobolomyces, Thorulopsis, Trichosporon en Yarrowia toepast, waarin het voor de omzetting van stearinezuur in oliezuur verantwoordelijke enzymsysteem genetisch gedeeltelijk is geblokkeerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men als 20 microorganisme een mutant van de soort Apiotrichum curvatum toepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men als microorganisme een mutant van de stam Apiotrichum curvatum ATCC 20509 toepast.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men als 25 microorganisme de mutant van Apiotrichum curvatum toepast, welke onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn is gedeponeerd.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men als microorganisme een partiële desaturase-mutant toepast, welke afgeleid is 30 uit de absolute desaturase-mutant, die onder het nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn is gedeponeerd.

7. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat men als medium wei-permeaat plus eventueel oliezuur en een in water oplosbaar ammoniumzout toepast.

8. Cacaoboter-equivalent of een component daarvan, verkregen over eenkomstig de werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-7.

9. Genot- en voedingsmiddelen, welke het cacaoboter-equivalent of een component daarvan volgens conclusie 8 bevatten.

10. De mutant van de soort Apiotrichum curvatum, welke onder het 40 nummer CBS 199.87 bij het Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baarn is gedeponeerd. 870 07 8 ^ ****