NL8203316A - Farmaceutische preparaten met menselijk pro-insuline. - Google Patents

Description

5 3684-356 Ned. ” ' P & c

Farmaceutische preparaten met menselijk pro-insuline.

Diabetes mellitus is een metabolische ziekte, die gekenmerkt wordt door het falen van lichaamsweefsels koolhydraten met de normale snel-heid te oxideren. Zijn belangrijkste faktor is een gebrek aan insuline. Tijdens de laatste 60 jaren zijn mensen, die aan diabetes lijden, in sterke 5 mate geholpen doordat zij geregelde hoeveelheden insuline toegediend ; kregen. Tot dusver is het door diabetici gebruikte insuline geisoleerd uit dierlijke pancreasklieren, in het algemeen van runderen en varkens.

Runder- en varkensinsuline verschillen beide in hun struktuur van insuline, r r dat gevormd wordt door de menselijke pancreas. Recentelijk is het door 10 recombinant DNA methodologie mogelijk geworden insuline te produceren, dat identiek is aan dat, wat door de menselijke pancreas gevormd wordt. De toepassing van dergelijk insuline maakt het voor de diabeticus mogelijk het natuurlijke systeem nauwkeuriger na te bootsen dan tot dusver mogelijk was.

15 Desondanks heeft men reeds lang ingezien, dat toediening van insuline aan de diabeticus op zichzelf niet voldoeiide is om de normale metabolische toestand te herstellen en/of te handhaven. Hoewel insuline zijn uitgesproken effekt heeft op het metabolisme van koolhydraten, brengt diabetes mellitus verdere afwijkingen met zich mee, die voor het grootste 20 deel of alle verband houden met de strukturenfunktie van bloedvaten. De tekortkomingen, die tot deze afwijkingen leiden, worden zelden volledig gekorrigeerd door gebruikelijke insulinetherapie.

De abnormaliteiten in de vaten, die verband houden met diabetes, worden vaak "complicaties vein diabetes" genoemd. Zij bestaan in het alge-25 meen uit microangiopathische veranderingen, die tot beschadigingen van het netvlies en de nier leiden. Neuropathie is een andere diabetische compli-catie, die al dan niet direkt of indirekt verband kan houden met de ver-melde microangiopathische veranderingen. Voorbeelden van specifieke ver- . schijnselen van complicaties van diabetes zijn (1) ziekten van het oog, 30 zoals retinopathie, cataractvorming, glaucoom en extra-oculaire spierver-lammingen; (2) mondziekten, zoals gingivitis, een verhoogd · voorkomen van tandcaries, periodontale ziekte en sterke resorptie van het tandkasbeen; (3) motorische, sensorische en autonome neuropathie; (4) ziekte van de grote vaten; (5) microangiopathie; (6) huidziekten, zoals xanthoma dia-35 beticorum, necrobiosis lipoidica diabeticorum, furunculose, mycose en pruritisf (7) nierziekten, zoals diabetische; glomerulosclerose, arteriolaire nefrosclerose en pyelonefritis; en (8) moeilijkheden tijdens de zwangerschap, ,., S20 3 3 1 6 t , - 2 - zoals een verhoogd voorkomen van grote baby's, doodgeborenen, miskramen, neonatale sterfgevallen en congenitale afwijkingen.

Vele of wellicht alle van de diabetische complicaties zijn het gevolg van het falen van insuline alleen om het lichaam tot zijn natuur-5 lijke hormonale balans terug te brengen.

De uitvinding heeft betrekking op farmaceutische preparaten, die natuurlijke hormonale homeostase in diabetische toestand nauwkeuriger be-reiken en handhaven dan het geval kan zijn door toediening van insuline.

Zodoende heeft de uitvinding betrekking op een farmaceutisch pre-10 paraat, dat menselijk pro-insuline bevat in kombinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager.

Het essientiele bestanddeel van de farmaceutische preparaten van de uitvinding is menselijk pro-insuline.

De toediening van menselijk pro-insuline onder toepassing van een 15 preparaat volgens de uitvinding veroorzaakt een natuurlijker benutting van glucose en een betere regeling van de glucosespiegel in het bloed, waardoor de hierboven beschreven ongunstige diabetische complicaties verminderd wor-den.

Menselijk pro-insuline is beschikbaar via verschillende wegen, 20 waaronder organische synthese, isolering uit menselijke pancreas volgens gebruikelijke methoden en meer recentelijk volgens recombinant DNA methodiek.

Algemeen genomen wordt bij de bereiding van pro-insuline onder toepassing van recombinant DNA methodiek zo te werk gegaan, dat men door isolering, constructie of een kombinatie van beide een DNA-reeks verkrijgt 25 die codeert voor de aminozuurreeks van menselijk pro-insuline. Het DNA voor menselijk pro-insuline wordt dan in afleesfase ingevoerd in een ge-schikte drager voor clonen en tot uitdrukking brengen. De drager wordt toe-gepast voor het transformeren van een geschikt microorganisme, waarna dit getransformeerde microorganisme onderworpen wordt aan fermentatie-omstandig-30 heden, die leiden tot (a) de produktie van verdere kopieeh van de gen voor pro-insuline bevattende vector en (b) het tot uitdrukking brengen van pro-insuline of een voorprodukt van pro-insuline.

In het geval dat het tot uitdrukking gebrachte produkt een voorprodukt van pro-insuline is, bevat dit in het algemeen de aminozuurreeks 35 van menselijk pro-insuline, die aan zijn amino-einde verbonden is met een fragment van een eiwit, dat normaliter wordt uitgedrukt in de gen-volgorde, waarin het gen voor pro-insuline is ingevoerd. De aminozuurreeks voor pro-insuline is aan het eiwitfragment gebonden via een specifiek splitsbare plaats, in een representatief geval methionine. Dit produkt wordt gewoonlijk 8203316 * t - 3 - een gefuseerd genprodukt genoemd.

De aminozuurreeks van pro-insuline wordt nit het gefuseerde genprodukt afgesplitst met behulp van broomcyaan, waarna de cysteine-sulfhydryl-gedeelten van de aminozuurreeks van pro-insuline gestabiliseerd worden door 5 oxnzetting in de overeenkomstige S-sulfonaten.

Het verkregen pro-insuline S-sulfonaat wordt gezuiverd en het gezuiverde pro-insuline S-sulfonaat wordt daarna in pro-insuline omgezet door vorming van de drie op de juiste plaatsen gelegen disulfidebindingen.

Het verkregen pro-insulineprodukt wordt gezuiverd.

10 Zoals reeds vermeld, zijn de preparaten van de uitvinding ge- schikt voor het bevorderen van het bereiken van natuurlijke hormonale homeostase, waardoor zij de erkende diabetische complicaties voorkomen of aan-zienlijk verminderen of vertragen. Men heeft ingezien, dat sommige diabetici niet in staat zijn insuline op doelmatige wijze te ontvangen door subcutane 15injectie, wegens de aanwezigheid van proteasen op de plaats van de injectie, die de insuline snel ontleden voordat deze de gelegenheid heeft gekregen in de bloedbaan geabsorbeerd en naar de receptorplaatsen vervoerd te worden. Wanneer men aan deze diabetici al insuline toedient, moet dit geschieden door intraveneuze injectie. De benodigde herhaalde intraveneuze injecties 20zijn ongewenst wegens hun schadelijke effekt op de aderen vein de ontvanger en de daarmee gepaard gaande infekties. Gevonden werd, dat menselijk pro-insuline niet wordt afgebroken door deze insuline afbrekende proteasen, zodat het door subcutane injectie kan worden toegediend. Zijn stabiliteit en derhalve zijn beschikbaarheid bevorderen het bereiken van een natuurlijke 25hormonale homeostase,

Ook is waargenomen bij recent onderzoek [Podlecki c.s., Diabetes, 31, Suppl. 2, 126¾ (1982)] dat menselijk pro-insuline naar binnen wordt gevoerd in doelweefsels, bijv. .vetcellen. Hoewel zijn bijzondere intracellu-laire werking op moleculaire schaal nog niet bepaald is, ondersteunen deze 30bevindingen verder de hier gegeven leer, dat menselijk pro-insuline een ak-tieve rol speelt bij en noodzakelijk is voor het bereiken van natuurlijke hormonale homeostase.

Schluter c.s., Diabetes 31_, Suppl. 2, 135a (1982) beschrijven onderzoeken, die aantonen dat de receptorbinding van menselijk insuline 35versterkt wordt door de aanwezigheid van menselijk pro-insuline. Deze resul-taten ondersteunen weer verder de hier gegeven leer, dat de beschikbaarheid en aanwezigheid van menselijk pro-insuline leidt tot het bevorderen of her-stel van natuurlijke hormonale homeostase.

De hoeveelheid van de preparaten van de uitvinding, die nodig 8203316 - 4 - ' .

is om natuurlijke hormonale homeostase te handhaven of om een toestand te bereiken, die natuurlijke hormonale homeostase bij de diabetes patient verder benadert, hangt uiteraard af van de ernst van de diabetische toestand. Bovendien loopt de hoeveelheid uiteen in afhankelijkheid van de toedienings-5 weg. Ten slotte dient de hoeveelheid van het toegediende preparaat en de frequentie van de toediening beslist te worden door de behandelende genees-heer. Er van uitgaande dat 1 mg. menselijk pro-insuline circa 3,5 eenheden menselijke insuline aktiviteit verschaft, is echter in het algemeen de dosering van het menselijk pro-insuline zo, dat circa 0,02 tot circa 5 10 eenheden menselijke insuline aktiviteit per kg. lichaamsgewicht per dag verschaft worden en bij voorkeur circa 0,1 tot circa maar 1 eenheid menselijke insuline aktiviteit per kg. lichaamsgewicht en per dag.

Het preparaat wordt parenteraal toegediend, wat subcutaan, intra-musculair en intraveneus omvat. De preparaten van de uitvinding bevatten 15 het aktieve bestanddeel, menselijk pro-insuline, samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager daarvoor en desgewenst andere therapeutische bestanddelen. De hoeveelheid aktief bestanddeel in het preparaat kan uiteenlopen van circa 99,99 tot circa 0,01 gew.%. De drager moet in die zin aanvaardbaar zijn, dat hij verenigbaar is met andere komponenten van het preparaat en 20 niet schadelijk is voor de ontvanger daarvan,

Preparaten van de uitvinding, die geschikt zijn voor parenterale toediening omvatten geschikt steriele waterige oplossingen en/of suspensies van de farmaceutisch aktieve bestanddelen, welke oplossingen of suspensies bij voorkeur isotonisch worden gemaakt met het bloed van de ontvanger.., 25 in het algemeen onder toepassing van natriumchloride, glycerol, glucose, mannitol, sorbitol e.d. bekende middelen. Bovendien kunnen de preparaten een groot aantal hulpmiddelen bevatten, zoals buffermiddelen, conserveer-middelen, dispergeermiddelen, middelen die een snel begin van de werking bevorderen, middelen die een lange duur van de werking bevorderen en andere 30 dergelijke middelen. Representatieve conserveermiddelen zijn bijv. fenol, m.cresol, methyl p.hydroxybenzoaat e.a. Representatieve buffers zijn bijv. natriumfosfaat, natriumacetaat, natriumcitraat en andere bekende buffers.

Bovendien kan men een zuur, bijv. zoutzuur, of een base, bijv. natriumhydroxide, toepassen om de pH te regelen. In het algemeen kan de 35 pH van het waterige preparaat uiteenlopen van circa 2 tot circa 8 en bij voorkeur van circa 6,8 tot circa 8,0.

Andere geschikte toevoegsels zijn bijv. tweewaardig zinkion, dat indien het aanwezig is, in het algemeen aanwezig is in een hoeveelheid van circa 0,1 mg. tot circa 3 mg. per 100 eenheden menselijk pro-insuline, 8203316 / , - 5 - en prortaginezout (bi jv. in de vorm van 2ijn sulfaat), dat indien het aan-wezig is, in het algemeen aanwezig is in een hoeveelheid van circa 0,5 mg. tot circa 20 mg. per 100 eenheden menselijk pro-insuline.

Voorbeelden van specifieke farmaceutische preparaten van de uit-5 vinding worden in de onderstaande uitvoeringsvoorbeelden verschaft.

voorbeeid I

Neutraal regulair menselijk pro-insulinepreparaat [40 eenheden 3 (E) menselijk pro-insuline per cm (ml)].

Ter bereiding van 10 ml van het preparaat mengt men 10 Menselijk pro-insuline (3,5 E/mg) 114 mg. (400 E)

Fenol, gedestilleerd 20 mg.

Glycerol 160 mg.

Water en 10-%'s zoutzuur of 10-%'s natronloog in een voldoende hoeveelheid ter bereiding van een preparaat met een volume van 10 ml en een uiteindelijke 15 pH van 7,0-7,8.

voorbeeid n

Preparaat met protamine, zink, menselijk pro-insuline [40 E menselijk pro-insuline per ml].

Ter bereiding van 10 ml van het preparaat mengt men 20 Menselijk pro-insuline (3,5 E/mg) 114 mg. (400 E)

Fenol, gedestilleerd 25 mg.

Zinkoxide 0,95-3,8 mg.

Glycerol 160 mg.

Protaminesulfaat 32-64 mg.

25 Natriumfosfaat, kristallen 38 mg.

Water en 10-¾1s zoutzuur of 10-%1s natronloog in een voldoende hoeveelheid ter verkrijging van een volume Vein het preparaat van 10 ml en een uiteindelijke pH van 7,1-7,4.

voorbeeid hi 30 Isofaan protamine en menselijk pro-insuline bevattend preparaat [40 E menselijk pro-insuline per ml].

Ter bereiding van 10 ml van het preparaat mengt men Menselijk pro-insuline (3,5 E/mg) 114 mg. (400 E) m.Cresol, gedestilleerd 16 mg.

35 Fenol, gedestilleerd 6,5 mg.

Glycerol 160 mg.

Protaminesulfaat 9,6-19,2 mg.

Natriumfosfaat, kristallen 38 mg.

Water en 10-%·s zoutzuur of 10-%'s natronloog voldoende ter verkrijging 8203316 - 6 - van een volume van het preparaat van 10 ml en een uiteindelijke pH van 7,1-7,4.

Voorbeeld IV

1 Preparaat met zink en menselijk pro-insuline [40 E menselijk pro-5 insuline per ml].

Ter bereiding van 10 ml ,van een preparaat mengt men Menselijk pro-insuline (3,5 E/mg) 114 mg.(400 E)

Natriumacetaat, watervrij 16 mg.

Natriumchloride, korrelvormig 70 mg.

10 Methyl-p.hydroxybenzoaat 10 mg.

Zinkoxide 1-8 mg.

Water en 10-%’s zoutzuur of 10-%'s natronloog in voldoende hoeveelheid ter verkrijging van een volume van het preparaat van 10 ml en een uiteindelijke pH van 7,2-7,5.

8203316

Claims (2)

1. 2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het tweewaardig zinkion bevat.
2. 3. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het protaminezout bevat. 8203316