ES2331342B1 - Uso de la proinsulina para la elaboracion de una composicion farmaceutica neuroprotectora, composicion terapeutica que la contiene y sus aplicaciones. - Google Patents
Uso de la proinsulina para la elaboracion de una composicion farmaceutica neuroprotectora, composicion terapeutica que la contiene y sus aplicaciones. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2331342B1 ES2331342B1 ES200601314A ES200601314A ES2331342B1 ES 2331342 B1 ES2331342 B1 ES 2331342B1 ES 200601314 A ES200601314 A ES 200601314A ES 200601314 A ES200601314 A ES 200601314A ES 2331342 B1 ES2331342 B1 ES 2331342B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- proinsulin
- nucleotide sequence
- sequence
- activity
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
Abstract
Uso de la proinsulina para la elaboración de una
composición farmacéutica neuroprotectora, composición terapéutica
que la contiene y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere al uso de un
compuesto inductor de la actividad de la proinsulina,
preferentemente la proinsulina humana, para la elaboración de un
medicamento o composición farmacéutica para la prevención y el
tratamiento de condiciones, desórdenes o enfermedades
neurodegenerativas en las que se produzca muerte celular
programada, preferentemente patologías neurodegenerativas del
sistema nervioso central y periférico, y más preferentemente del
grupo de enfermedades heredodegenerativas conocidas como retinosis
pigmentaria. El compuesto activador puede estar constituido por una
molécula química, un péptido, una proteína o una secuencia de
nucleótidos.
Description
Uso de la proinsulina para la elaboración de una
composición farmacéutica neuroprotectora, composición terapéutica
que la contiene y sus aplicaciones.
La presente invención está dentro del campo de
la Biomedicina y más concretamente en el desarrollo de compuestos
terapéuticos. En particular, la invención se refiere al uso
específico de la molécula proinsulina para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la
retina como la retinosis pigmentaria, así como de otras afecciones
neurodegenerativas.
Las enfermedades neurodegenerativas comprenden
una variedad de desórdenes progresivos del sistema nervioso
central de origen genético-hereditario, traumático,
esporádico o senil. La gran mayoría de las enfermedades
neurodegenerativas presentan muerte celular programada de neuronas
y/o células de glía en su origen o su progresión. Dicho proceso de
muerte, que constituye una etapa irreversible del daño al tejido
nervioso, aparece independientemente de la causa primaria del
desorden, sea genética, traumática, esporádica o senil.
Numerosos factores de crecimiento juegan un
papel fundamental en la regulación del balance entre la vida y la
muerte de diversos tipos celulares, incluidos neuronas y células de
glía. Entre ellos, los miembros de la familia de la insulina que
incluyen la insulina, su precursor proinsulina, y los
IGF-I e IGF-II
(Varela-Nieto, I., de la Rosa, E.J., Valenciano,
A.I., and Leon, Y. (2003) Cell death in the nervous system: lessons
from insulin and insulin-like growth factors. Mol
Neurobiol 28: 23-50). La retina forma
parte del sistema nervioso central y es un modelo bien establecido
para el estudio tanto de procesos fisiológicos como patológicos del
sistema nervioso, por esta razón es un modelo celular empleado en
la presente invención. Uno de los procesos patológicos más
importantes estudiados en la retina es el denominado Retinosis
Pigmentaria ya que esta patología comprende un amplio grupo de
desórdenes hereditarios de la retina y representa una de las
mayores causas de ceguera en el mundo, con una incidencia
aproximada de una persona entre 4.000. Aunque se han caracterizado
más de 120 loci implicados y hay distintas etiologías, en todos los
casos se produce una pérdida crónica y progresiva por muerte
celular programada de las neuronas de la retina, en concreto de los
fotorreceptores, llevando a los individuos a la ceguera.
Actualmente no hay tratamiento para la Retinosis Pigmentaria y por
el momento se están abordando estrategias de neuroprotección,
terapia génica, neurorreparación y bioingeniería solamente en
modelos animales con degeneración, como los ratones rd, las ratas
RCS y otros modelos en perros, gatos, cerdos e, incluso,
Drosophila. El ratón rdl (rod degeneration) fue uno de los primeros
modelos para el estudio de mecanismos celulares y moleculares que
determinan la degeneración celular, habiéndose llegado a determinar
la naturaleza apoptótica de la muerte de los fotorreceptores
(Chang, G.Q., Hao, Y., and Wong, F. (1993) Apoptosis: final common
pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant
mice. Neuron 11: 595-605). Los
diferentes ratones rd proporcionan un modelo ideal para el ensayo
de nuevas aproximaciones terapéuticas al tratamiento de las
distrofias hereditarias de la retina, ya que permiten estudiar el
proceso degenerativo de los fotorreceptores desde un punto de vista
molecular, celular y genético.
Las intervenciones de terapia génica tienden a
reintroducir una copia funcional del gen mutado causante de la
neurodegeneración. Se han realizado progresos con adenovirus
recombinantes o vectores virales asociados a adenovirus. En
concreto, la reposición de la subunidad \beta de la
fosfodiesterasa de cGMP específica de bastones (I3PDE) en el ratón
rd neonatal, logrando un rescate histológico del fenotipo rd de, al
menos, 6 semanas (Bennett, J., Tanabe, T., Sun, D., Zeng, Y.,
Kjeldbye, H., Gouras, P., and Maguire, A.M. (1996) Photoreceptor
cell rescue in retinal degeneration (rd) mice by in vivo
gene therapy. Nat Med 2: 649-654).
Sin embargo, esta terapia requiere la identificación inequívoca del
gen mutado en cada paciente, lo que en la actualidad sólo es
posible en el 40% de los casos (Wang, D.Y., Chan, W.M., Tam, P.O.,
Baum, L., Lam, D.S., Chong, K.K., Fan, B.J., and Pang, C.P. (2005)
Gene mutations in retinosis pigmentaria and their clinical
implications. Clin Chim Acta 351:
5-16).
El transplante de células madre neuronales o
precursores con el fin de desarrollar nuevos fotorreceptores
constituye la finalidad de las terapias de neurorreparación. Los
nuevos fotorreceptores tienen que restablecer las conexiones
apropiadas con las neuronas de la retina interna.
La neuroprotección inducida mediante tratamiento
con factores de crecimiento persigue evitar la muerte celular
asociada al proceso neurodegenerativo. Se han probado diferentes
formas de administración en varios modelos animales con
degeneración de retina. Los primeros intentos consistieron en
inyecciones intravítreas de varias proteínas recombinantes en ratas
o ratones con degeneración de retina (Faktorovich, E.G., Steinberg,
R.H., Yasumura, D., Matthes, M.T., and LaVail, M.M. (1990)
Photoreceptor degeneration in inherited retinal dystrophy delayed
by basic fibroblast growth factor. Nature 347:
83-86; LaVail, M.M., Unoki, K., Yasumura, D.,
Matthes, M.T., Yancopoulos, G.D., and Steinberg, R.H. (1992)
Multiple growth factors, cytokines, and neurotrophins rescue
photoreceptors from the damaging effects of constant light. Proc
Natl Acad Sci U S A 89: 11249-11253).
Estos experimentos demostraron que el FGF2 enlentecía la
degeneración de fotorreceptores en ratas RCS (Royal Collage of
Surgeon). Varios factores de supervivencia, incluyendo el FGF2,
FGF1, BDNF y CNTF, disminuyen la muerte de fotorreceptores inducida
por daño luminoso (LaVail, M.M., Yasumura, D., Matthes, M.T.,
Lau-Villacorta, C., Unoki, K., Sung, C.H., and
Steinberg, R.H. (1998) Protection of mouse photoreceptors by
survival factors in retinal degenerations. Invest Ophthalmol Vis
Sci 39: 592-602). Inyecciones
intravítreas de análogos de CNTF en modelos de ratón con
degeneraciones hereditarias de la retina (modelo Q433ter, rd y nr;
terminología usada para designar ciertos modelos de ratones con
retinosis pigmentaria) resultaron en una evidente mejora de algunas
degeneraciones. El efecto neuroprotector por análogos de CNTF
también se ha comprobado en estudios en gatos con distrofia de
conos-bastones autosómica dominante, en los que
inyecciones intravítreas de CNTF tenían efectos beneficiosos
(Chong, N.H., Alexander, R.A., Waters, L., Barnett, K.C., Bird,
A.C., and Luthert, P.J. (1999) Repeated injections of a ciliary
neurotrophic factor analogue leading to long-term
photoreceptor survival in hereditary retinal degeneration.
Invest Ophthalmol Vis Sci 40:
1298-1305).
Otra aproximación ha sido utilizar vectores de
terapia génica para expresar factores de supervivencia en retinas
de ratones o ratas con degeneración de retina. En dos modelos de
ratones, el rd y el Prph2Rd (mutación recesiva en periferina)
(Travis, G.H., Brennan, M.B., Danielson, P.E., Kozak, C.A., and
Sutcliffe, J.G. (1989) Identification of a
photoreceptor-specific mRNA encoded by the gene
responsible for retinal degeneration slow (rds). Nature
338: 70-73; Connell, G., Bascom, R., Molday,
L., Reid, D., McInnes, R.R., and Molday, R.S. (1991) Photoreceptor
peripherin is the normal product of the gene responsible for
retinal degeneration in the rds mouse. Proc Natl Acad Sci U S
A 88: 723-726.), las inyecciones
subretinianas de vectores adenovirales que codificaban para una
forma secretable de CNTF retrasaron la muerte de fotorreceptores
(Cayouette, M., and Gravel, C. (1997)
Adenovirus-mediated gene transfer of ciliary
neurotrophic factor can prevent photoreceptor degeneration in the
retinal degeneration (rd) mouse. Hum Gene Ther 8:
423-430; Cayouette, M., Behn, D., Sendtner, M.,
Lachapelle, P., and Gravel, C. (1998) Intraocular gene transfer of
ciliary neurotrophic factor prevents death and increases
responsiveness of rod photoreceptors in the retinal degeneration
slow mouse. J Neurosci 18: 9282-9293).
Por su parte, la expresión transgénica de BDNF en la retina, que
no resulta apenas activo por inyecciones intravítreas, retrasa la
neurodegeneración en ratones Q344ter (Okoye, G., Zimmer, J.,
Sung, J., Gehlbach, P., Deering, T., Nambu, H., Hackett, S., Melia,
M., Esumi, N., Zack, D.J., and Campochiaro, P.A. (2003) Increased
expression of brain-derived neurotrophic factor
preserves retinal function and slows cell death from rhodopsin
mutation or oxidative damage. J Neurosci 23:
4164-4172; Sung, C.H., Makino, C., Baylor, D., and
Nathans, J. (1994) A rhodopsin gene mutation responsible for
autosomal dominant retinosis pigmentaria results in a protein that
is defective in localization to the photoreceptor outer segment.
J Neurosci 14: 5818-5833). Estos
resultados, asimismo, evidencian que, además de los problemas
técnicos, una inyección intravítrea puntual puede ser insuficiente
para tener efecto neuroprotector. Por su parte el CNTF, que por un
lado sí tiene efecto neuroprotector con una sola inyección, ha
resultado ser contraproducente cuando se induce su expresión
prolongada mediante vectores AAV codificando para la forma
secretable de CNTF, en ratones Prph2Rd y dos ratas transgénicas con
degeneración de retina (Liang, F.Q., Aleman, T.S., Dejneka, N.S.,
Dudus, L., Fisher, K.J., Maguire, A.M., Jacobson, S.G., and
Bennett, J. (2001) Long-term protection of retinal
structure but not function using RAAV.CNTF in animal models of
retinosis pigmentaria. Mol Ther 4:
461-472) ya que la función de los fotorreceptores
empeoraba según un análisis por ERG.
Teniendo en cuenta todas las estrategias
anteriormente expuestas la presente invención proporciona una
solución práctica a los sistemas empleados hasta el momento. Con
anterioridad se han puesto de manifiesto funciones de supervivencia
de la insulina distintas a su función metabólica en el embrión de
pollo, ya que la insulina, en forma de su precursor proinsulina, se
expresa durante el desarrollo antes de que exista un esbozo
pancreático. Durante el desarrollo del sistema nervioso, la
proinsulina regula múltiples procesos celulares. En el embrión
temprano es un factor de supervivencia, como se comprobó en un
estudio inhibiendo la expresión del gen de la proinsulina o de su
receptor mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (Morales,
A.V., Serna, J., Alarcon, C., de la Rosa, E.J., and de Pablo, F.
(1997) Role of prepancreatic (pro)insulin and the insulin
receptor in prevention of embryonic apoptosis. Endocrinology
138: 3967-3975). Su bloqueo mediante
anticuerpos también aumenta el número de células apoptóticas en la
retina de embrión de pollo (Díaz, B., Serna, J., De Pablo, F., and
de la Rosa, E.J. (2000) In vivo regulation of cell death by
embryonic (pro)insulin and the insulin receptor during early
retinal neurogenesis. Development 127:
1641-1649), mientras que su adición exógena al
embrión reduce el número de células apoptóticas
(Hernandez-Sanchez, C., Mansilla, A., de la Rosa,
E.J., Pollerberg, G.E., Martinez-Salas, E., and de
Pablo, F. (2003) Upstream AUGs in embryonic proinsulin mRNA control
its low translation level. Embo J 22:
5582-5592). La molécula aislable de los embriones
de pollo es proinsulina, el producto primario de traducción del
gen, cuya actividad metabólica es pequeña, alrededor del
5-10% de la actividad de la insulina.
En las enfermedades neurodegenerativas crónicas
las neuronas y/o las células de glía van muriendo de forma
progresiva. Normalmente la sintomatología de la enfermedad se
manifiesta cuando se han muerto bastantes células. De ahí, la
importancia de determinar moléculas eficaces que favorezcan la
supervivencia celular para mantener una función visual
relativamente normal. Aunque hay muchos tipos de enfermedades
neurodegenerativas, cada una con una etiología diferente, todas
cursan con una muerte final de las células afectadas. Esta muerte
es del tipo programada, habiendo a su vez distintos tipos de
muerte, ya sea apoptótica o no. A diferencia de los daños agudos,
donde las células están en buen estado inicialmente antes del
daño, en las enfermedades crónicas, las células conllevan un daño
intrínseco que va a hacer que vayan muriendo en un momento
determinado cuando ya no puedan soportar el daño y/o no puedan
llevar a cabo la función que deben desempeñar.
Un objeto de la presente invención lo constituye
el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina,
en adelante uso de un compuesto inductor de la presente invención,
para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica
para la prevención y el tratamiento de condiciones, desórdenes o
enfermedades neurodegenerativas en las que se produzca muerte
celular programada, preferentemente patologías neurodegenerativas
del sistema nervioso central y periférico, y más preferentemente del
grupo de enfermedades heredodegenerativas conocidas como retinosis
pigmentaria.
Un objeto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la
proinsulina en el que el compuesto inductor es una secuencia de
nucleótidos, en adelante uso de la secuencia de nucleótidos
proinsulina de la presente invención, que permite la expresión de
una proteína o péptido neuroprotector, y que está constituida por
una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NO1),
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la
actividad de la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos está
constituida por la SEQ ID NO1 que codifica para la proinsulina
humana.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de
la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos de d) es un vector
de expresión, en adelante uso del vector de expresión proinsulina
de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos o una
construcción genética codificante de una proteína proinsulina capaz
de inducir neuroprotección.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de
la proinsulina en el que el compuesto inductor es una célula
eucariota, preferentemente humana, en adelante uso de células
proinsulina de la invención, modificada genéticamente y que
comprende la secuencia de nucleótidos, la construcción o el vector
de expresión proinsulina de la invención y que puede expresar y
liberar de forma adecuada la proteína proinsulina al medio
extracelular.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la
proinsulina en el que el compuesto inductor es una proteína o
péptido, en adelante uso de la proteína proinsulina de la presente
invención, que presenta actividad neuroprotectora, y que comprende
una o varias secuencias de aminoácidos pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO2),
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la
invención en el que el compuesto inductor es la proteína
proinsulina humana (SEQ ID NO2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o medicamento para el
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
alteraciones neurodegenerativas, en adelante composición
farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto
inductor de la actividad de la proinsulina de la invención, en
cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Una realización particular de la invención lo
constituye una composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una o
varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NO1),
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a), y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de nucleótidos está constituida por la SEQ
ID NO1, que codifica para la proinsulina humana.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye una composición farmacéutica de la
invención en la que la secuencia de nucleótidos es un vector de
expresión de la proinsulina humana.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una
proteína o un péptido codificado por la secuencia, construcción
genética o vector proinsulina de la invención.
Una realización particular de la invención lo
constituye una composición farmacéutica de la invención en la que
la proteína o péptido inductor de la actividad de la proinsulina
pertenece al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO2),
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a), y b), y
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de aminoácidos está constituida por la
proinsulina humana (SEQ ID NO2).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una
célula, preferentemente humana, y más preferentemente una célula del
sistema nervioso central, transformada por la secuencia,
construcción o vector de expresión de proinsulina de la
invención.
Otro objeto de la invención lo constituye el uso
de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de
la composición farmacéutica de la invención, en un método de
tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente un ser
humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología
neurodegenerativa del sistema nervioso central o periférico que
afecta a seres humanos, en la que se produzca muerte celular
programada, consistente en la administración de dicha composición
terapéutica en dosis adecuada que permita atenuar dicha
neurore-
generación.
generación.
\vskip1.000000\baselineskip
Teniendo en cuenta que la mayoría de las
afecciones neurodegenerativas, en particular en la Retinosis
Pigmentaria, no tienen un tratamiento eficaz y/o efectivo, la
presente invención proporciona una solución alternativa.
La presente invención se basa en que los
inventores han demostrado que la proinsulina - factor de
crecimiento de la familia de la insulina, normalmente conocida por
ser la forma precursora de la insulina - es, además, un factor de
supervivencia celular en procesos de neurodegeneración crónica, en
particular en los procesos de neurodegeneración retiniana que
tienen lugar en la retinosis pigmentaria.
Como modelo de degeneración de retina se ha
elegido los ratones rd10 (Pdeb^{rd10-/-}), que portan una
mutación homocigota recesiva en el exón 13 de la enzima
fosfodiesterasa de GMP cíclico específica de bastones, lo que
provoca una alteración en la función de esa enzima, lo que lleva a
la muerte celular progresiva de los fotorreceptores, y la
consiguiente degeneración secundaria del resto de tipos celulares de
la retina, principalmente los conos.
Se han generado dos líneas de ratones
transgénicos que expresan la proteína proinsulina humana y
homocigotos recesivos para la mutación rd10, los ratones
Proins/rd10^{-/-} (Ejemplo 1.1). Estos ratones Proins/rd10^{-/-}
con degeneración de la retina, producen proinsulina humana de forma
constitutiva en el músculo estriado - que no se procesa a insulina
- que se detecta en suero y no está sujeta a la regulación normal
del páncreas por niveles de glucosa. Esto provoca que el animal
tenga niveles circulantes mantenidos de proinsulina humana, sin
depender de dosis, del estado del producto antes de la
admistración- ya que al ser de producción endógena no se degrada
como puede ser un producto comercial-, y del modo y momento de la
inyección. Esto ha permitido no hacer estudios de farmacocinética
para ver como administrarlo.
La presencia de proinsulina humana en músculo y
suero en los ratones Proins/rd10^{-/-} de ambas líneas se
comprobó con un kit de detección ELISA contra la proinsulina
humana. Además, se midió la glucemia, y se comprobó que la
proinsulina no tiene efectos metabólicos indeseados. Por otro lado,
se ha comprobado mediante inyección subcutánea de proinsulina
humana que dicha proinsulina es capaz de llegar a la retina neural
(identificación de la proinsulina mediante el kit de ELISA en
extractos de retina), lo que implica que es capaz de pasar la
barrera hematorretiniana.
Los efectos de la hiperproinsulinemia de los
ratones Proins/rd10^{-/-} en la neurodegeneración retiniana se
identificaron de diversas maneras. En primer lugar, se observó
histológicamente el estado de la retina (Ejemplo 1). En los ratones
transgénicos para proinsulina humana y homocigotos para rd10 la
degeneración se retrasa y se ha comprobado que a P32 en la retina
se mantienen mayor número de bastones, conos y conexiones
sinópticas, y que el estado de la retina es mejor (Ejemplo 1).
El hecho de que en los ratones además se
mantenga el estado de la retina mejor por más tiempo, es
beneficioso. Si además de enlentecer el proceso de muerte celular
en las células propiamente dañadas (los bastones de la retina) se
mantiene en mejor estado el resto de la retina, como por ejemplo
evitando la muerte de los conos que no tienen un daño intrínseco,
sino que degeneran secundariamente, se están mejorando varios
aspectos de la enfermedad. En este caso en concreto, si se mantiene
los conos por más tiempo, aunque los bastones acaben por degenerar,
se mantiene la visión diurna, aunque la nocturna se vaya perdiendo,
y eso significa calidad de vida en un paciente con retinosis
pigmentaria.
Posteriormente, se analizó la función visual con
los cinco tipos estandarizados de electrorretinogramas a lo largo
del proceso degenerativo, comparando los ratones transgénicos con
controles rd10, y se ha comprobado que en los ratones
Proins/rd10^{-/-} todavía a P55 siguen teniendo algo de función
visual, cosa que en los ratones rd10 desaparece a P35, con lo que
se puede concluir que la respuesta visual es mejor y se prolonga
más en el tiempo en los ratones Proins/rd10^{-/-}(Ejemplo
2). Además, los ratones transgénicos Proins/rd10^{-/-} llegan a
tener ERG comparables a ratones sanos, al menos en visión fotópica
(diurna) a P30 (Ejemplo 2, Figura 4).
Por otro lado, en la presente invención se
observa que la utilización de proinsulina en una forma de
administración que permite niveles fisiológicos mantenidos en el
tiempo permite que la proinsulina ejerza su función neuroprotectora
(ver Ejemplo 1.4), al contrario de lo que se observa con
administraciones puntuales. Con respecto a esto último se han
probado administraciones puntuales de proinsulina subcutáneas e
intravítreas, pero no fueron exitosas en la mejora de la
neurodegeneración retiniana probablemente al no obtenerse niveles
estables y mantenidos en el tiempo.
Otra ventaja adicional es que la proinsulina no
tiene los efectos metabólicos de la insulina y, por lo tanto, se
puede administrar a pacientes que no tienen alterado el metabolismo
de la glucosa. Aunque en estudios in vitro la insulina
también presenta actividad antiapoptótica, su actividad metabólica
normal hace inviable su utilización para un tratamiento como el
aquí descrito. El hecho de que se sea la proinsulina circulante
sérica la que logre este rescate, indica que es un buen
tratamiento, ya que hace que sea de fácil administración. La
aplicación de la proinsulina sería un tratamiento tanto preventivo
como sofocante de enfermedad neurodegenerativa, ya que evita la
muerte de las neuronas dañadas.
En resumen, niveles séricos crónicos de
proinsulinemia (1-15 pM), obtenidos mediante
expresión transgénica de proinsulina humana controlada por el
promotor de la cadena ligera de la miosina, que también podrían ser
obtenidos mediante otras formas de administración, por ejemplo,
inyección subcutánea de proinsulina humana vehiculizada en soportes
de liberación lenta o vectores de expresión aprobados para terapia
génica, son capaces de alcanzar la retina y atenuar la
neurodegeneración de los fotorreceptores en el modelo genético de
ratones rd10.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de
la proinsulina, en adelante uso de un compuesto inductor de la
presente invención, para la elaboración de un medicamento o
composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de
condiciones, desórdenes o enfermedades neurodegenerativas en las
que se produzca muerte celular programada, preferentemente
patologías neurodegenerativas del sistema nervioso central y
periférico, y más preferentemente del grupo de enfermedades
heredodegenerativas conocidas como retinosis pigmentaria.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "compuesto inductor de la actividad de la proinsulina"
se refiere a una molécula que mimetiza, incrementa la intensidad o
prolonga la duración de la actividad neuroprotectora de la proteína
proinsulina humana. Un compuesto activador puede estar constituido
por una molécula química, un péptido, una proteína o una secuencia
de nucleótidos, así como aquellas moléculas que permiten la
expresión de una secuencia de nucleótidos codificante de una
proteína con actividad neuroprotectora.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "actividad neuroprotectora" se refiere a la atenuación
del proceso de muerte celular programada de las células
primariamente afectadas en la enfermedad neurodegenerativa, y/o de
las células secundariamente afectadas por la neurodegeneración, y/o
a la potenciación de la actividad neurofuncional de las células
remanentes.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "enfermedad neurodegenerativa" se refiere una
enfermedad, desorden o patología perteneciente, entre otras a
título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson, esclerosis múltiple, retinosis pigmentaria, demencia de
cuerpos de Lewy, Esclerosis lateral amiotrófica, atrofias
espinocerebelosas, demencia frontotemporal, enfermedad de Pick,
demencia vascular, enfermedad de Huntington, enfermedad de Baten,
lesión en médula espinal, degeneración macular y glaucoma.
Así, un objeto particular de la invención lo
constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la
proinsulina en el que el compuesto inductor es una secuencia de
nucleótidos, en adelante uso de la secuencia de nucleótidos
proinsulina de la presente invención, que permite la expresión de
una proteína o péptido neuroprotector, y que está constituida por
una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NO1),
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia mostrada en la presente memoria, por ejemplo, mediante la
introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de
la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia, y que permita la
codificación de un péptido o proteína capaz de mimetizar la
actividad de la proinsulina humana (SEQ ID NO2).
A partir de la información descrita en la
presente invención y en el estado de la técnica, un técnico experto
en el sector de la técnica puede aislar o construir una secuencia
de nucleótidos análoga a las descritas en la presente invención
para su posterior utilización.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos
comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de
identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un
85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. La forma
preferente de la secuencia de nucleótidos a utilizar es la
secuencia de nucleótidos de proinsulina de origen humano (SEQ ID
NO1) y sus derivados.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "secuencia de nucleótidos" se refiere a una secuencia
de DNA, cDNA o mRNA.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la
actividad de la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos está
constituida por la SEQ ID NO1 que codifica para la proinsulina
humana.
La secuencia de nucleótidos definida en el
apartado d) se corresponde con una construcción génica y con vector
de expresión génica que permite la expresión de una proteína
proinsulina. En el caso de la construcción génica, construcción
génica proinsulina de la invención, también puede comprender, en
caso necesario y para permitir un mejor aislamiento, detección o
secreción al exterior de la célula del péptido expresado, a una
secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido susceptible
de ser utilizado con fines de aislamiento, detección o secreción
de dicho péptido. Por tanto, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye una construcción génica que comprende,
además de la secuencia de nucleótidos proinsulina de la invención,
cualquier otra secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o
secuencia peptídica que permita el aislamiento, la detección o la
secreción al exterior de la célula del péptido expresado, por
ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención, una secuencia de polihistidina (6xHis), una secuencia
peptídica reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo,
para su identificación), o cualquier otra que sirva para purificar
la proteína de fusión resultante por cromatografía de
inmunoafinidad: péptidos etiqueta tales como c-myc,
HA, E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual.
Ed. Harlow and David Lane (1999). Cold Spring Harbor Laboratory
Press. New York. Capítulo: Tagging proteins. Pp.
347-377).
La secuencia de nucleótidos y la construcción
génica descritas previamente pueden ser aisladas y obtenidas por
un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en
el estado de la técnica (Sambrook et al. ``Molecular
cloning, a Laboratory Manual 2^{nd} ed., Cold Sping Harbor
Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3). Dichas
secuencias de nucleótidos pueden estar integradas en un vector de
expresión génica que permite la regulación de la expresión de la
misma en condiciones adecuadas en el interior de las células.
Por tanto, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la
actividad de la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos de d)
es un vector de expresión, en adelante uso del vector de expresión
proinsulina de la invención, que comprende una secuencia de
nucleótidos o una construcción génica codificante de una proteína
proinsulina capaz de inducir neuroprotección. Un ejemplo de una
realización particular lo constituye el uso de un vector de
expresión elaborado en la presente invención en el que la expresión
se regula mediante un promotor específico de músculo y la secuencia
de nucleótidos SEQ ID NO1 (ver Ejemplo 1).
En general, un vector de expresión comprende,
además de la secuencia de nucleótidos o de la construcción
genética descritas en la invención, un promotor que dirige su
transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, ABAD,
ret, etc.), preferentemente tisular, al que está operativamente
enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan
y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del
producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación
de transcripción (t1t2, etc.), señal de poliadenilación,
origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS),
secuencias codificantes de reguladores transcripcionales,
(enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers),
represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados
pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades
de cada caso concreto entre plásmidos de expresión, vectores
virales (DNA o RNA), cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que
pueden contener, además, marcadores utilizables para seleccionar
las células transfectadas o transformadas con el gen o genes de
interés. La elección del vector dependerá de la célula huésped y
del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de
realización particular de la presente invención dicho vector es un
plásmido o un vector viral. La obtención de dicho vector puede
realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en
la materia al igual que para la transformación de microorganismos y
células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos
ampliamente conocidos - transformación química, electroporación,
microinyección, etc. - descritos en diversos manuales [Sambrook,
J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.]. Una estrategia podría ser la de utilizar
lentivirus para infectar las células diana, tal y como ya esta
siendo intentado en otro tipo de terapias (Ralph GS, Binley K, Wong
LF, Azzouz M, Mazarakis ND (2006) Gene therapy for
neurodegenerative and ocular diseases using lentiviral vectors.
Clin Sci (Lond) 110: 37-46).
Los sistemas de expresión génica pueden permitir
o no la integración del nuevo material genético en el genoma de la
célula huésped. De esta forma, tanto la secuencia de nucleótidos,
la construcción génica o el vector de expresión proinsulina pueden
utilizarse como un medicamento para proteger células humanas,
preferentemente neuronas y/o células gliales humanas afectadas de
una alteración neurodegenerativa, en un procedimiento de
tratamiento y profilaxis de terapia génica de un ser humano
afectado por una enfermedad que cursa con alteraciones neuronales
y/o gliales. Estos sistemas de expresión génica una vez
administrados a un ser humano afectado por una enfermedad
neurodegenerativa pueden introducirse de forma general o específica
en células tisulares donde, una vez integradas en el genoma
celular, permiten la expresión de una proteína proinsulina, la cual
una vez secretada al medio extracelular alcanza el sistema nervioso
central donde llevaría a cabo su acción neuroprotectora (ver
ejemplos).
Por otro lado, estos sistemas de expresión
génica pueden ser utilizados para transformar también células
humanas fuera del cuerpo humano, autólogas o heterólogas con
respecto al potencial receptor, convirtiéndose estas células en
compuestos inductores de la proinsulina una vez que se administren
a un ser humano enfermo de una enfermedad neurodegenerativa ya que
expresan y liberan proteína proinsulina con actividad
neuroprotectora de neuronas y/o células gliales humanas.
Así, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la
actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una
célula eucariota, preferentemente humana, en adelante uso de
células proinsulina de la invención, modificada genéticamente y que
comprende la secuencia de nucleótidos, la construcción o el vector
de expresión proinsulina de la invención y que puede expresar y
liberar de forma adecuada la proteína proinsulina al medio
extracelular.
Estas células pueden ser transformadas,
infectadas o transfectadas mediante dichas secuencias de
nucleótidos por técnicas de ingeniería genética conocidas por un
experto en la materia. [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis,
T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory]. Las herramientas biofarmacéuticas y los
procedimientos de terapia génica son suficientemente conocidas por
un experto del sector de la técnica de tal forma que con la
información descrita en la presente invención pueden desarrollarse
sin excesivo esfuerzo.
Otra realización particular sería el uso de una
célula humana transformada mediante la secuencia de nucleótidos de
la proinsulina humana (SEQ ID NO1), proveniente de distintas
estipes celulares, preferentemente del sistema nervioso central y
más preferentemente una neurona que puede utilizarse como células
regeneradoras de tejidos humanos.
Además, otro objeto particular de la invención
lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de
la proinsulina en el que el compuesto inductor es una proteína o
péptido, en adelante uso de la proteína proinsulina de la presente
invención, que presenta actividad neuroprotectora, y que comprende
una o varias secuencias de aminoácidos pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO2),
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a)
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia mostrada en la presente memoria, por ejemplo, mediante la
introducción de sustituciones de aminoácidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más aminoácidos, la
adición de uno o más aminoácidos en cualquiera de los extremos de
la molécula o la deleción de uno o más aminoácidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia, y que mimetice la
actividad neuroprotectora de la proinsulina humana.
A partir de la información descrita en la
presente invención, un técnico experto en el sector de la técnica
puede aislar o construir una secuencia de aminoácidos análoga a las
descritas en la presente invención.
En general, una secuencia de aminoácidos análoga
es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos
comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa
que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de
identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un
85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la
invención en el que el compuesto inductor es la proteína
proinsulina humana (SEQ ID NO2).
Otro objeto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica o medicamento para el
tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
alteraciones neurodegenerativas, en adelante composición
farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto
inductor de la actividad de la proinsulina de la invención, en
cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son
los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia
y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones
terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar
neuroprotección, calculada para producir el efecto deseado y, en
general, vendrá determinada, entre otras causas, por las
características propias de los compuestos, incluyendo la edad,
estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y
de la ruta y frecuencia de administración.
En otra realización particular, dicha
composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o
suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser
administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo
cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica
adecuada a la vía de administración elegida. En una realización
particular, la administración de la composición terapéutica
proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por
vía oral, por inhalación nasal, por vía intraperitoneal,
subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas
de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios
para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en
el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993,
Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto o agente neuroprotector pertenece al siguiente
grupo: secuencia, construcción genética o vector de expresión
proinsulina que permiten la expresión de una proteína o péptido con
actividad proinsulina.
Una realización particular de la invención lo
constituye una composición farmacéutica de la invención en la que
el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una o
varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente
grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NO1),
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de nucleótidos está constituida por la SEQ
ID NO1, que codifica para la proinsulina humana.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye una composición farmacéutica de la
invención en la que la secuencia de nucleótidos es un vector de
expresión de la proinsulina humana.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una
proteína o un péptido codificado por la secuencia, construcción
genética o vector proinsulina de la invención.
Una realización particular de la invención lo
constituye una composición farmacéutica de la invención en la que
la proteína o péptido inductor de la actividad de la proinsulina
pertenece al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO2),
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b), y/o c).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención
en la que la secuencia de aminoácidos está constituida por la
proinsulina humana (SEQ ID NO2).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la
que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una
célula, preferentemente humana, y más preferentemente una célula del
sistema nervioso central, transformada por la secuencia,
construcción o vector de expresión de proinsulina de la
invención.
Otro objeto de la invención lo constituye el uso
de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de
la composición farmacéutica de la invención, en un método de
tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente un ser
humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología
neurodegenerativa del sistema nervioso central o periférico que
afecta a seres humanos, en la que se produzca muerte celular
programada, consistente en la administración de dicha composición
terapéutica en dosis adecuada que permita atenuar dicha
neuro-
regeneración.
regeneración.
La composición farmacéutica de la presente
invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma
aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la
invención en un método de tratamiento de una enfermedad
neurodegenerativa perteneciente al siguiente grupo: enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, demencia de
cuerpos de Lewy, Esclerosis lateral amiotrófica, atrofias
espinocerebelosas, demencia frontotemporal, enfermedad de Pick,
demencia vascular, enfermedad de Huntington, enfermedad de Baten y
lesión en médula espinal.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la
invención en un método de tratamiento de una enfermedad
neurodegenerativa perteneciente al siguiente grupo: retinosis
pigmentaria, degeneración macular y glaucoma.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática del inserto de cDNA del gen de la preproinsulina humana
y del plásmido pMLC-hIns. (A) Se muestra una
representación esquemática de la secuencia de DNA que está
insertada en el plásmido. Corresponde al cDNA del gen de la
proinsulina humana. En el esquema se muestra el mRNA del gen de 462
pares de bases (pb), que está formado por tres exones (exon1= E1,
exón2= E2, exón 3= E3). La secuencia de DNA insertada es la que se
traduce, la ORF (del inglés "open reading frame") de 347 pb.
Las zonas flanqueantes no traducidas, (5'UTR y 3'UTR) no están
insertadas en la construcción. La proteína que se traduce es la
preproinsulina de 110 aminoácidos (aa). Esta proteína consta de un
péptido señal (pep.señal), la cadena B, el péptido C y la cadena A.
El péptido señal se elimina, quedando la molécula proinsulina. (B)
El plásmido contiene el inserto descrito en el apartado anterior
1.A, que codifica para la proteína preproinsulina de 110
aminoácidos (zona gruesa en negro), bajo el control transcripcional
del promotor constitutivo muscular MLC1 (Miosin Light Chain) de
las fibras de cadena ligera de la miosina del músculo estriado.
Este plásmido es el utilizado para producir las dos líneas de
ratones transgénicos productores de proinsulina humana que se
cruzaron para alcanzar homocigosis para rd10.
La Figura 2 muestra secciones de criostato de
12 \mum de ojos de ratones a P32 donde se aprecia el estado de
bastones y conos que evidencian con distintos marcadores el avance
de la degeneración. Ratón control silvestre (A y D), ratón
transgénico productor de proinsulina y rd10 homocigoto,
Proins/rd10^{-/-}, (B y E) y ratón rd10 homocigoto control (C y
F). La capa nuclear externa (CNE) donde se sitúan los núcleos de
los bastones y conos. La capa nuclear interna (CNI) es donde se
encuentran los núcleos de células bipolares, amacrinas, horizontales
y Müller. Para el marcaje de conos se utilizó una aglutinina
marcada con el fluorocromo Alexa 488, cuya reacción muestra los
segmentos externos (flecha de arriba) y los pies sinópticos de los
conos (flecha de abajo). La barra representa 45 \mum.
La Figura 3 muestra secciones de criostato de
12 \mum de ojos de ratones a P32 donde se aprecia el estado de
las conexiones sinópticas. Ratón control silvestre (A), ratón
transgénico productor de proinsulina y rd10 homocigoto,
Proins/rd10^{-/-} (P), y ratón rd10 homocigoto control (C). Se
muestran las capas nucleares CNE, CNI y la capa de células
ganglionares (CCG). Entre ellas se sitúan las capas plexiformes
donde se producen las conexiones sinópticas, capa plexiforme
externa (CPE) y capa plexiforme interna (CPI). La figura muestra el
marcaje inmunohistoquímico con el anticuerpo SV2 que marca las
conexiones sinópticas en general. La barra representa 45
\mum.
La Figura 4 representa los resultados de los
registros electrorretinográficos realizados a P30. Ratón
silvestre (wt), ratón Rd10^{-/-} control y ratón
Proins/rd10^{-/-}, tanto de la línea 1 (L1) como de la línea 2
(L2). Para cada animal se muestran ejemplos de las respuestas
electrorretinográficas registradas en condiciones escotópicas
(nocturnas), originadas en los bastones (fila superior) y respuestas
mixtas (fila intermedia). Se muestran asimismo las respuestas
electrorretinográficas registradas en condiciones fotópicas
(diurnas), originadas en conos (fila inferior). Nótese la mayor
amplitud de las respuestas obtenidas en ratones Proins/rd10^{-/-}
de ambas líneas (L1 y L2) en comparación con las respuestas de los
ratones rd10^{-/-}.
La Figura 5 muestra los resultados de los
registros electrorretinográficos realizados a diferentes días.
Ratón silvestre (wt), ratón Rd10^{-/-} control y ratón
Proins/rd10^{-/-}, a diferentes días de desarrollo postnatal: P35,
P45 y P55. En A se muestra para cada tipo de animal y a los
distintos tiempos de desarrollo postnatal, ejemplos de las
respuestas registradas en condiciones escotópicas, exclusiva de
bastones (-2,55 log cd\cdots\cdotm^{-2}) y respuestas mixtas
(1,48 log cd\cdots\cdotm^{-2}). En B se muestra también para
cada tipo de animal y a los distintos tiempos de desarrollo
postnatal, ejemplos de las respuestas registradas en condiciones
fotópicas, generada en conos (1,48 log
cd\cdots\cdotm^{-2}).
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan aquí sirven para ilustrar la naturaleza de la presente
invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines
ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la
invención que aquí se reivindica.
Tras obtener varias líneas de ratones
transgénicos productores de proinsulina humana, bajo el control del
promotor constitutivo de la cadena ligera de la miosina (MLC1) del
músculo estriado, cuyo bagaje genético era 50% C57B1/6 y 50% SJL,
se cruzaron sucesivamente con ratones homocigotos rd10 (100%
C57B1/6). Con esto se consiguió homogeneizar el bagaje genético
hasta llegar a un porcentaje superior al 95% C57B1/6 y obtener
ratones Proins/rd10^{-/-}. Esto se consiguió a partir del sexto
retrocruce, obteniéndose dos líneas principales, L1 y L2 (en los
ejemplos siguientes se ha utilizado animales L2, mientras que los
resultados descritos en la Figura 4 ERG a P30, se han llevado a
cabo también con animales de la L1; los análisis de proinsulinemia
y glucemia se han realizado en ambos).
En la presente invención se entiende por ratón
silvestre al ratón utilizado como control. No tiene ninguna
alteración. Es comercial y su nombre es C57B1/6J, procedente de los
laboratorios Jackson.
Se entiende por Ratón rd10 a los ratones
comerciales que llevan la mutación en el gen de la fosfodiesterasa
de GMP cíclico específica de bastones, cuyo nombre comercial es
Pdeb^{rd10-/-}, procedente de los laboratorios Jackson.
Se entiende por Ratón Proins/rd10^{-/-} a los
ratones generados por cruce que son ratones rd10 y transgénicos
productores de proinsulina humana bajo el promotor del músculo
estriado MLC1. La construcción introducida en estos ratones lleva
el cDNA de la proteína proinsulina humana controlada por el
promotor muscular de la miosina de cadena ligera, cuya expresión es
constitutiva (Figura 1B, SEQ ID NO1). Se observa una variabilidad
en la expresión, que se puede deber a la distinta penetrancia del
transgénico. Esto se correlaciona bastante con la producción de
proinsulina humana que se encuentra en suero.
La construcción utilizada para generar el ratón
transgénico consistió en un plásmido (pMLC-hIns) de
un tamaño de 6,4 kb. La expresión va mediada por el promotor
muscular constitutivo, de la cadena ligera de la miosina (MLC). El
cDNA del gen de la proinsulina humana esta clonado entre los dos
sitios EcoRI (Figura 1B).
Genotipaje. El DNA genómico se obtuvo de los
tejidos según la técnica descrita por Miller y cols, 1988 (Miller,
S.A., Dykes, D.D. and Polesky, H.F. (1988) A simple salting out
procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic
Acids Res, 16, 1215.). Las colas de ratones destetados
se digirieron en 0,5 ml de tampón de lisis
(Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, EDTA 20 mM, SDS 0,5% y NaCl
200 mM) con 0,3 mg de Proteinasa K (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania). Tras precipitar el DNA, se cortó con la enzima HindIII
(Roche). Se utilizaron 10 pg de DNA genómico que se digirieron con
la enzima HindIII en un volumen de 50 \mul finales, durante toda
la noche a 37ºC. Se cargaron en cada pocillo individual de un gel
de agarosa al 1% de 12 cm de largo para una buena separación de
tamaño. Previo a la transferencia se preparó el gel con las
siguientes soluciones: primero 15 minutos con solución de
depurinación (0,5 M HCl), después 30 minutos con solución de
desnaturalización (0,5 N NaOH y 1,5 M NaCl), y finalmente 30
minutos con solución de neutralización (0,5 M
Tris-HCl, pH 8). Con este tratamiento se consigue la
fragmentación del DNA, lo que facilita su transferencia. Se
utilizaron membranas de nylon (Schleicher & Schuell
BioSciencie, USA) y el DNA se fijó a la membrana por radiación UV
en el horno Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU).
La transferencia húmeda se realizó durante toda la noche a
temperatura ambiente.
Para el genotipaje, se utilizó una sonda marcada
radiactivamente con ^{32}P en la base dCTP contra la secuencia
del cDNA de proinsulina humana insertada en la construcción. El
molde para hacer la sonda se sacó del propio plásmido, digiriendo
con EcoRI (Roche).
El inserto liberado tras la digestión del
constructo con EcoRI, se purificó por el kit DNA extraction
(Millipore). El marcaje de la sonda se realizó utilizando el Kit
Random primer (Stratagene), en presencia de
[^{32}P]dCTP. Posteriormente, la sonda se purificó en
columnas Microspin G25 (Amershan Pharmacia Biotech).
La membrana se prehibridó a 65ºC con una
solución que contiene 50% formamida, Denhardt 1x (0,02% de Ficol,
0,02% de polivinilpirrolodona y 0,02% de BSA), 1% de SDS, SSC 5x
(0,15 M de NaCl y 15 mM de citrato sódico a pH 7,2) y 0.1 mg/ml de
DNA de esperma de salmón durante al menos 2 horas; posteriormente
se hibridó a 65ºC toda la noche con la solución de prehibridación,
a la que se le añadieron 1.5 x10^{6} cpm/ml de la sonda. Se
realizaron dos lavados de 15 minutos con SSC 2x a temperatura
ambiente, otro de 30 minutos con SSC2x 1% SDS y un último de 30
minutos con SSC 2x y 0,1% de SDS a 62,5ºC.
Una vez lavados los filtros, sin dejar que se
secaran, se envolvieron en un plástico tipo GLAD y se expusieron
entre dos pantallas de amplificación (Genescreen plus, DuPont) a
una película fotográfica de 18x24 cm, tipo Kodak Biomax MS (Eastman
Kodak Company, Rochester, NY, EE.UU.). Se requirió un tiempo de
exposición de 3-4 días para obtener una señal
nítida. La sonda producida contra el cDNA de la proinsulina humana
detectó una banda de 1,5 Kb en el gel de DNA genómico.
Los ratones rd10 tienen una mutación puntual
localizada en el exón 13 del gen de la enzima fosfodiesterasa 6 de
GMP cíclico específica de bastones. En los ratones silvestres
existe en esa localización un sitio de corte con la enzima Cfol. En
el caso de los mutantes, desaparece el lugar de corte de la enzima.
Esto permitió un control de la técnica de genotipaje
intrínseco.
Se realizó la PCR sobre genómico con los
siguientes cebadores:
3'-CTTTCTATTCTCTGTCAGCAAAGC-5'
(Oligo A, SEQ ID NO3) y
3'-CATGAGTAGGGTAAACATGGTCTG-5'
(Oligo B, SEQ ID NO4) que amplificaron un fragmento de 97 pb.
Después el producto de PCR se sometió a digestión con la enzima
CfoI (Roche) durante dos horas a 37ºC. Después se fraccionó en un
gel de agarosa Metaphor al 3%. Los ratones silvestres mostraron dos
bandas, tras la digestión, de 54 y 43 pb. Los ratones homocigotos
rd10 dieron una sola banda de 97 pb, ya que la enzima no corta el
amplicón y los ratones heterocigotos rd10/+ mostraron tres bandas
(de un alelo que se corta y el otro no). En este gen no se encontró
ningún tipo de variabilidad entre individuos, lo cual se traduce
en que la degeneración sigue un patrón estándar que se suele
cumplir de la misma manera para todos los individuos que la
poseen.
A todos los ratones se les midió la glucemia con
tiras reactivas (Accu-Chek, Roche) tras 12 horas de
ayuno. Los niveles normales de un ratón suelen estar entre 100 y
200 mg/dl. En los dobles mutantes Proins/rd10^{-/-} se encontró
una variación de entre 80 y 150 mg/dl, que no se correlacionaba
directamente con los niveles de proinsulinemia.
Para la detección de los niveles de producción
de proinsulina humana por los ratones transgénicos, se utilizó un
ensayo comercial ELISA (Linco Research, MO, EEUU) que detecta
específicamente la proinsulina humana.
Se analizaron músculo y suero, tanto de ratones
transgénicos como controles. En el caso del suero, se siguieron
todas las recomendaciones del fabricante, pero en el caso del
músculo, se requirió una previa extracción proteica con un tampón
de lisis (50 mM de Tris-HCl pH 7,0, 100 mM de NaCl
y 0,1% de Tritón) y una cuantificación de la misma con el kit BCA
(Pierce, Rockford, IL, EEUU).
La proinsulina humana detectada en los extractos
de músculo siempre fue muy elevada y se tuvo que corregir por la
cantidad de proteína. La proinsulina humana detectada en suero
osciló entre 1 y 15 pM. Esta concentración se midió en un volumen
de 20 \mul, de acuerdo con las instrucciones del kit. Las medidas
se hicieron sistemáticamente a P30. Esto nos indicó que los ratones
transgénicos Proins/rd10^{-/-}, producen proinsulina humana en
músculo y que esta se vierte a la circulación sanguínea desde donde
es capaz de llegar a la retina neural.
En ratones P32 se analizó la histología de la
retina (figura 2), comparando ratones silvestres que no sufren
degeneración (A y D), ratones Proins/rd10^{-/-} (B y E) y ratones
rd10^{-/-} (C y F), que sí sufren degeneración. A P32, momento en
que la degeneración está muy avanzada en las retinas de ratones
rd10^{-/-}, se analizó el número de células fotorreceptoras que
hay por columna, el estado y abundancia de conos y el estado de las
sinapsis (Figura 3). Se pretendía de esta manera comprobar el
estado de la retina en general y del avance de la degeneración con
distintos marcadores.
Todos los tejidos se embebieron en
Tissue-tec (Sakura Finetek Europe B.U. Países
Bajos), se congelaron en nieve carbónica y se conservaron a -80ºC
hasta su procesamiento. Se realizaron secciones de criostato a 12
\mum de grosor. Se recogieron en portas cubiertos con
poli-L-lisina (Fisher Biotech,
Pittsburgh, EEUU) y se mantuvieron a -80ºC hasta su
utilización.
En todos los casos, fuera cual fuese la tinción
a realizar, tras sacar los portas del congelador, se dejaron a
temperatura ambiente durante media hora y se fijaron con
paraformaldehido (PFA) al 4% durante 20 minutos, tras lo cual se
lavaron con PBS.
Se decidió marcar los conos que quedaban, porque
como degeneran secundariamente, sin tener ninguna mutación, podían
dar una idea del estado de la retina y su mantenimiento. Por su
parte, para ver el progreso de la degeneración en los bastones,
sólo había que contar el número de filas de células que quedaban en
el grosor de la capa nuclear externa (CNE). Para el marcaje de
conos, se utilizó una aglutinina marcada con el fluorocromo Alexa
488 (Molecular Probes, Eugene, OR, EEUU) durante 2 horas en una
solución de PBS con BSA al 0.1%. Los lavados se hicieron con una
solución que contenía MgCl_{2} 1 mM y CaCl_{2} 1 mM. Con ello
se detectaron los segmentos externos de los conos y los terminales
axónicos de los mismos.
Los ratones controles silvestres sin
degeneración, tienen entre ocho y doce filas de núcleos en la CNE
(figura 2D). El número de conos, que llevan los segmentos externos
y también los botones sinópticos de estos mismos en la CPE, es
bastante representativo por la tinción con aglutinina observada en
la CPE (Figura 2A). En el ratón rd10^{-/-} control el número de
filas de bastones en la CNE fue bastante pequeño, entre 1 y 2
filas, ya que la degeneración en este punto estaba bastante
avanzada (Figura 2F). Lo más sorprendente es que los conos ya
habían empezado a degenerar en este punto, aunque no están
primariamente afectados por la mutación (Figura 2C). Se observó
como apenas aparecieron segmentos externos de conos y los botones
sinópticos de los mismos redujeron bastante su número. En los
ratones Proins/rd10^{-/-} se observaron 5-6 filas
de núcleos de bastones en este caso, que fue uno de los ratones en
los que se detectó mayor proinsulinemia (Figura 2E). El estado de
los conos fue muy bueno; de hecho se asemejaba a los ratones
silvestres. Se pueden ver los segmentos externos de los mismos y
los botones sinópticos en la CPE que denotan muy buena preservación
de conos (Figura 2B). Se observó una variedad en la conservación de
la CNE que se correlaciona con el nivel de proinsulina en
sangre.
Además, se analizó el estado de las capas
plexiformes (Figura 3), donde tienen lugar las conexiones
sinópticas de las neuronas, porque lo que se desea con este
tratamiento con proinsulina no solo es evitar o retrasar la muerte
de la degeneración sino que las células que se mantengan vivas, ya
tengan el daño intrínseco o se alteren secundariamente, y sean
funcionales. Para la tinción con el anticuerpo SV2 (del inglés
sinaptical vesicle 2), los cortes de criostato, tras la fijación
con PFA al 4%, se permearon con tritón x-100 al
0,1% y se bloquaron con NGS (normal goat serum) al 10% en PBS
durante 1 hora. El anticuerpo SV2, a una dilución 1:50, se une a
una proteína de las vesículas sinópticas, marcando así las capas
plexiformes de la retina (capa plexiforme externa, CPE, y la capa
plexiforme interna, CPI). Se incubó a 4ºC toda la noche en la
solución de bloqueo. La incubación con el anticuerpo secundario
conjugado con Alexa 488 (1/200) se realizó 1 hora a temperatura
ambiente. Tras los correspondientes lavados con PBS, se montaron
las secciones con medio de montaje con DAPI, para contrateñir los
núcleos.
Se observó expresión en las dos capas
plexiformes de la retina, la externa (CPE) y la interna (CPI)
(Figura 3). La capa plexiforme interna, donde suceden las
conexiones de las interneuronas bipolares con las neuronas que
proyectan al cerebro, las células ganglionares, mostró bastante
tinción y buen estado en los tres casos. La diferencia se encontró
en la capa plexiforme externa, donde están las conexiones de las
células fotorreceptoras con las interneuronas bipolares,
principalmente. La CPE estaba bastante definida e intensa en el
ratón silvestre control (Figura 3A) y en el ratón transgénico
Proins/rd10^{-/-} (Figura 3B). El ratón control rd10 mantuvo la
tinción en la CPI, pero la CPE conservó poca tinción y bastante
desorganizada (Figura 3C). En este ratón control rd10^{-/-}
incluso se encontraron intentos de proyecciones de sinapsis entre
las capas nucleares, debido a la desorganización y a que las
neuronas que quedan pierden su sinapsis con los fotorreceptores.
Esto indicó que el estado funcional de la retina en los ratones
Proins/rd10^{-/-} es mejor que en los ratones con degeneración
rd10^{-/-} sin tratamiento.
Esto demuestra que en el ratón transgénico
Proins/rd10^{-/-} la proinsulina humana es capaz de mantener las
conexiones sinópticas por más tiempo que en la situación de
degeneración sin tratamiento. Esto implicaría que, además de
retardar la muerte de las células en degeneración, las mantiene en
buen estado y son capaces de ejercer su función biológica.
Las mejoras observadas histológicamente en los
ratones Proins/rd10^{-/-} con respecto a los rd10^{-/-} son más
patentes con los registros electrorretinográficos posteriores
(Figuras 4 y 5).
Por otro lado, para analizar el valor de los
niveles de proinsulina en el efecto neuroprotector se llevaron a
cabo ensayos con modelos diferentes al daño crónico y progresivo
que se encuentra en los modelos genéticos de las enfermedades
neurodegenerativas de la retina y de otras partes del sistema
nervioso, así como en los asociados a senilidad. Así, se realizaron
estudios preliminares donde se provocaba la muerte de células
ganglionares de la retina en ratas adultas mediante un daño agudo -
corte del nervio óptico- y se les administró proinsulina humana por
vía subcutánea. Este tratamiento produjo un leve retraso de la
muerte de las células ganglionares, hasta el momento inevitable en
este paradigma de daño agudo (datos no mostrados). Igualmente, se
administró mediante inyección subcutánea e intravítrea proinsulina
humana como tratamiento en estos ratones rd10, pero la degeneración
no se detuvo (datos no mostrados). Estos resultados indican que la
proinsulina sérica es capaz de alcanzar zonas dañadas del sistema
nervioso central y ejercer acciones neuroprotectoras únicamente
cuando se alcanzan niveles mantenidos y prolongados.
\newpage
Aunque los ratones se mantienen siempre en
ciclos de 12 horas de luz y oscuridad, para el estudio
electrorretinográfico, los ratones fueron adaptados a la oscuridad
durante toda la noche. A título informativo los conos están
encargados de la visión fotópica (diurna) y los bastones de la
escotópica (nocturna). Los ratones se anestesiaron bajo una luz
tenue roja con una inyección intraperitoneal de una solución que
contenía ketamina (a razón de 95 mg/kg) y xylazina (a razón de 5
mg/kg). Las pupilas fueron dilatadas con una gota de una solución
que contenía 1% de tropicamida (Colircusí Tropicamida, Alcon Cusí,
SA, El Masnou, Barcelona, España). El electrodo de registro es una
lente que se colocó sobre el ojo del ratón. El electrodo de
referencia se colocó en la boca, y el electrodo de tierra se
dispuso en la cola. Los animales anestesiados se situaron en una
caja de Faraday y se procedió a realizar todos los experimentos de
naturaleza escotópica en absoluta oscuridad. Se registraron así las
respuestas electrorretinográficas inducidas por flashes de luz de
baja intensidad producidos por un estimulador Ganzfeld, permitiendo
registrar las respuestas originadas sólo en bastones (respuesta de
bastones) o conos y bastones (respuesta mixta) en adaptación a la
oscuridad. La intensidad de los estímulos luminosos utilizados se
ajustaron a valores comprendidos entre los -4 y los 1,52 log
cd\cdots\cdotm^{-2}. La intensidad de luz se determinó
mediante un fotómetro (Mayo Monitor USB) a nivel del ojo. Para cada
intensidad de estímulo, se promediaron un máximo de 64 respuestas.
El intervalo entre estímulos luminosos varía dependiendo de la
intensidad, así, para estímulos de baja intensidad (-4 log
cd\cdots\cdotm^{-2}) el tiempo entre estímulos se ajustó a 10
segundos y para estímulos de elevada intensidad (1,52 log
cd\cdots\cdotm^{-2}) fue de 60 segundos. Con el fin de
registrar las respuestas aisladas de cono, se adaptó el animal a
condiciones fotópicas. Bajo estas condiciones, el intervalo entre
los flashes de luz se fijó en 1 segundo.
Las señales eléctricas procedentes de la retina
se amplificaron y filtraron entre 0,3 y 1000 Hz con un
amplificador Grass (CP511 AC amplifier, Grass Instruments, Quincy,
MA). Las señales se digitalizaron (PC-card ADI
instruments, CA). Los registros se almacenaron en el ordenador para
su posterior análisis.
Las respuestas mediadas por bastones se
registraron en condiciones de adaptación a la oscuridad, ante la
aplicación de flashes de luz de intensidades comprendidas entre -4
y los -1,52 log cd\cdots\cdotm^{-2}. Las respuestas mixtas
generadas por conos y bastones se registraron ante la aplicación de
flashes de luz de intensidades comprendidas entre -1,52 y 0,48 log
cd\cdots\cdotm^{-2}. También se aislaron los potenciales
oscilatorios, mediante la aplicación de filtros eléctricos
comprendidos entre 100 y 1000 Hz. La respuesta mediada por los
conos se registró en condiciones de adaptación a la luz (luz de
fondo de el registro de 30 Cd\cdotm^{-2}), ante la aplicación de
flashes de luz de intensidades comprendidas -0,52 y 2 log
cd\cdots\cdotm^{-2}. Las respuestas Flicker (30 Hz) se
registraron en adaptación a la luz, ante estímulos de 1,48 log
cd\cdots\cdotm^{-2}.
En la Figura 4 se muestran las respuestas
electrorretinográficas registradas tanto en adaptación a la
oscuridad (c.escotópicas) como en adaptación a la luz (c.fotópicas)
de ratones silvestres (WT), rd10^{-/-} controles y
Proins/rd10^{-/-} obtenidas a P30, tanto de la línea 1 como de la
línea 2.
Por otro lado, en la Figura 5, se muestran los
registros electrorretinográficos correspondientes a ratones
silvestres (wt), rd10 controles y Proins/rd10^{-/-} de la línea 2
obtenidos a distintos tiempos de desarrollo postnatal (P35, P45 Y
P55). Se muestran de forma separada los registros obtenidos en
condiciones escotópicas (adaptación a la oscuridad) y fotópicas
(adaptación a la luz). Se observó como los ratones silvestres
generaron respuestas electrorretinográficas escotópicas (bastones)
y fotópicas (conos) de gran amplitud a P35. En los ratones
rd10^{-/-} controles las respuestas fueron nulas a P35, tanto las
respuestas generadas en bastones, como en conos. Los ratones
Proins/rd10^{-/-}, mantuvieron respuestas electrorretinográficas
fotópicas y escotópicas muy significativas a P35 y consiguieron
mantener cierto grado de respuesta hasta P55. Así, se observó que
la respuesta visual era mejor en los ratones transgénicos
Proins/rd10^{-/-} y se prolonga más en el tiempo.
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS, UNIVERSIDAD DE ALCALÁ DE HENARES, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE BARCELONA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE LA PROINSULINA PARA LA
ELABORACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA NEUROPROTECTORA,
COMPOSICIÓN TERAPÉUTICA QUE LA CONTIENE Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ProIns
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (64)..(393)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctttctattc tctgtcagca aagc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgagtagg gtaaacatgg tctg
\hfill24
Claims (14)
1. Uso de un compuesto inductor de la actividad
de la proinsulina caracterizado porque dicho compuesto
inductor de la actividad de la proinsulina es:
i) una secuencia de nucleótidos que permite la
expresión de una proteína o péptido neuroprotector, y que está
constituida por una o varias secuencias de nucleótidos
pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NO:1);
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) que codifica un péptido o proteína capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana;
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) que codifica un péptido o proteína capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana; y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a a), b) y/o c),
o
ii) una proteína o péptido que presenta
actividad neuroprotectora y que comprende una o varias secuencias
de aminoácidos pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO:2);
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana;
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana; y
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a a), b), y/o c);
o
iii) una célula eucariota humana modificada
genéticamente que comprende cualquiera de las secuencias de
nucleótidos de i) o un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos o una construcción genética que contiene
la secuencia descrita en i) d) y que puede expresar y liberar de
forma adecuada la proinsulina humana o un análogo o fragmento de la
misma al medio extracelular,
para la elaboración de un medicamento o
composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de
condiciones, desórdenes o enfermedades neurodegenerativas en las
que se produzca muerte celular programada, preferentemente
patologías neurodegenerativas del sistema nervioso central y
periférico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de un compuesto inductor según la
reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad
neurodegenerativa pertenece al siguiente grupo: la enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, retinosis
pigmentaria, demencia de cuerpos de Lewy, Esclerosis lateral
amiotrófica, atrofias espinocerebelosas, demencia frontotemporal,
enfermedad de Pick, demencia vascular, enfermedad de Huntington,
enfermedad de Baten, lesión en médula espinal, degeneración macular
o glaucoma.
3. Uso de un compuesto inductor de la actividad
de la proinsulina según la reivindicación 1, caracterizado
porque la secuencia de nucleótidos de i) d) está constituida por
una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos
que codifica la proinsulina humana (SEQ ID NO:1).
4. Uso de un compuesto inductor de la actividad
de la proinsulina según la reivindicación 1, caracterizado
porque la secuencia de nucleótidos de i) d) está constituida por un
vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos o
una construcción genética codificante de una proteína proinsulina
capaz de inducir neuro-
protección.
protección.
5. Uso de un compuesto inductor de la actividad
de la proinsulina según la reivindicación 4, caracterizado
porque el vector de expresión contiene la secuencia de nucleótidos
SEQ ID NO:1 y un promotor específico de tejido, preferentemente de
músculo.
\newpage
6. Uso de un compuesto inductor de la actividad
de la proinsulina según la reivindicación 1, caracterizado
porque la célula eucariota es una célula humana transformada
mediante la secuencia de nucleótidos que codifica la proinsulina
humana (SEQ ID NO:1).
7. Composición farmacéutica para el tratamiento
de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con
alteraciones neurodegenerativas caracterizado porque
comprende un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina
caracterizado porque dicho compuesto inductor de la
actividad de la proinsulina es
i) una secuencia de nucleótidos que permite la
expresión de una proteína o péptido neuroprotector, y que está
constituida por una o varias secuencias de nucleótidos
pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NO:1);
- b)
- una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) que codifica un péptido o proteína capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana;
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) que codifica un péptido o proteína capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana; y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a a), b) y/o c);
o
ii) una proteína o péptido que presenta
actividad neuroprotectora, y que comprende una o varias secuencias
de aminoácidos pertenecientes al siguiente grupo:
- a)
- una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO:2);
- b)
- una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana;
- c)
- un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana; y
- d)
- una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a a), b), y/o c),
o
iii) una célula eucariota humana modificada
genéticamente que comprende cualquiera de las secuencias de
nucleótidos de i) o un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos o una construcción genética que contenga
la secuencia descrita en i) d) y que puede expresar y liberar de
forma adecuada la proinsulina humana o un análogo o fragmento de la
misma al medio extracelular,
en cantidad terapéuticamente efectiva junto con,
opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de d) está constituida por una construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proinsulina
humana (SEQ ID NO:1).
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de d) es un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos o una construcción génica codificante de
una proteína proinsulina capaz de inducir neuroprotección.
10. Composición farmacéutica según la
reivindicación 9, caracterizada porque el vector de
expresión contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:1 y un
promotor específico de tejido, preferentemente de músculo.
11. Composición farmacéutica según la
reivindicación 7, caracterizada porque la célula eucariota
es una célula humana transformada mediante la secuencia de
nucleótidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO:1).
12. Uso de la composición farmacéutica según las
reivindicaciones 7-11 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o la profilaxis, de una enfermedad,
desorden o patología neurodegenerativa en la que se produce muerte
celular programada.
\newpage
13. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 12, caracterizado porque la enfermedad
neurodegenerativa pertenece al siguiente grupo: enfermedad de
Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, demencia
de cuerpos de Lewy, Esclerosis lateral amiotrófica, atrofias
espinocerebelosas, demencia frontotemporal, enfermedad de Pick,
demencia vascular, enfermedad de Huntington, enfermedad de Baten y
lesión en médula espinal.
14. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 13, caracterizado porque la enfermedad
neurodegenerativa pertenece al siguiente grupo: retinosis
pigmentaria, degeneración macular y glaucoma.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200601314A ES2331342B1 (es) | 2006-05-22 | 2006-05-22 | Uso de la proinsulina para la elaboracion de una composicion farmaceutica neuroprotectora, composicion terapeutica que la contiene y sus aplicaciones. |
US12/227,554 US20100330042A1 (en) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Use of Proinsulin for the Preparation of a Neuroprotective Pharmaceutical Composition, Therapeutic Composition Containing it and Applications Thereof |
JP2009511534A JP4727748B2 (ja) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | 神経保護医薬組成物の製造のためのプロインスリンの使用、それを含む治療組成物、およびそれらの応用 |
CA2652983A CA2652983C (en) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Use of proinsulin for the preparation of a neuroprotective pharmaceutical composition, therapeutic composition containing it and applications thereof |
ES07765882T ES2433389T3 (es) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Uso de la proinsulina para la elaboración de una composición farmacéutica neuroprotectora, composición terapéutica que la contiene y sus aplicaciones |
EP07765882.1A EP2042189B1 (en) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Use of proinsulin for the preparation of a neuroprotective pharmaceutical composition, therapeutic composition containing it and applications thereof |
AU2007253212A AU2007253212B2 (en) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Use of proinsulin for the preparation of a neuroprotective pharmaceutical composition, therapeutic composition containing it and applications thereof |
PCT/ES2007/070097 WO2007135220A1 (es) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Uso de la proinsulina para la elaboración de una composición farmacéutica neuroprotectora, composición terapéutica que la contiene y sus aplicaciones |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200601314A ES2331342B1 (es) | 2006-05-22 | 2006-05-22 | Uso de la proinsulina para la elaboracion de una composicion farmaceutica neuroprotectora, composicion terapeutica que la contiene y sus aplicaciones. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2331342A1 ES2331342A1 (es) | 2009-12-29 |
ES2331342B1 true ES2331342B1 (es) | 2010-10-13 |
Family
ID=38722988
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200601314A Expired - Fee Related ES2331342B1 (es) | 2006-05-22 | 2006-05-22 | Uso de la proinsulina para la elaboracion de una composicion farmaceutica neuroprotectora, composicion terapeutica que la contiene y sus aplicaciones. |
ES07765882T Active ES2433389T3 (es) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Uso de la proinsulina para la elaboración de una composición farmacéutica neuroprotectora, composición terapéutica que la contiene y sus aplicaciones |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07765882T Active ES2433389T3 (es) | 2006-05-22 | 2007-05-21 | Uso de la proinsulina para la elaboración de una composición farmacéutica neuroprotectora, composición terapéutica que la contiene y sus aplicaciones |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100330042A1 (es) |
EP (1) | EP2042189B1 (es) |
JP (1) | JP4727748B2 (es) |
AU (1) | AU2007253212B2 (es) |
CA (1) | CA2652983C (es) |
ES (2) | ES2331342B1 (es) |
WO (1) | WO2007135220A1 (es) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110021974A1 (en) * | 2010-10-05 | 2011-01-27 | Shantha Totada R | Retinitis pigmentosa treatment and prophalaxis |
WO2014011210A1 (en) | 2012-07-11 | 2014-01-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav-mediated gene therapy for rpgr x-linked retinal degeneration |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZW17382A1 (en) * | 1981-08-27 | 1982-11-17 | Lilly Co Eli | Human proinsulin pharmaceutical formulations |
US5652214A (en) * | 1989-06-05 | 1997-07-29 | Cephalon, Inc. | Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs |
US5667968A (en) * | 1989-08-30 | 1997-09-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Prevention of retinal injury and degeneration by specific factors |
EP0788512B1 (en) * | 1994-07-08 | 1999-03-24 | The Trustees Of Dartmouth College | Proinsulin peptide compounds for detecting and treating type i diabetes |
AU8508398A (en) * | 1998-07-15 | 2000-02-07 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Treatment of diabetes with synthetic beta cells |
DE10055857A1 (de) * | 2000-11-10 | 2002-08-22 | Creative Peptides Sweden Ab Dj | Neue pharmazeutische Depotformulierung |
US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
JP2005534650A (ja) * | 2002-06-11 | 2005-11-17 | ザ バーナム インスティテュート | エリスロポイエチンおよびインスリン様増殖因子の神経保護的相乗作用 |
-
2006
- 2006-05-22 ES ES200601314A patent/ES2331342B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-05-21 AU AU2007253212A patent/AU2007253212B2/en not_active Ceased
- 2007-05-21 JP JP2009511534A patent/JP4727748B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-05-21 US US12/227,554 patent/US20100330042A1/en not_active Abandoned
- 2007-05-21 WO PCT/ES2007/070097 patent/WO2007135220A1/es active Application Filing
- 2007-05-21 CA CA2652983A patent/CA2652983C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-05-21 ES ES07765882T patent/ES2433389T3/es active Active
- 2007-05-21 EP EP07765882.1A patent/EP2042189B1/en not_active Not-in-force
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CORROCHANO SÁNCHEZ, S. et al. "{}Insulina y muerte celular programada: expresión y efectos durante la neurogénesis en la retina de ratón"{}. XI Congreso de la Sociedad Española de Biología Celular. Cádiz, 3-6 Noviembre 2005. Página 90, comunicación. * |
DÍAZ, B. et al. "{}Apoptotic cell death of proliferating neuroepithelial cells in the embryonic retina is prevented by insulin"{}. EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE. Mayo 1999. Vol. 11, N$^{o}$. 5, páginas 1624-1632; todo el documento. * |
DÍAZ, B. et al. "{}In vivo regulation of cell death by embryonic (pro)insulin and the insulin receptor during early retinal neurogenesis"{}. DEVELOPMENT. 15.04.2000. Vol. 127, N$^{o}$. 8, páginas 1641-1649; todo el documento. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009537612A (ja) | 2009-10-29 |
CA2652983A1 (en) | 2007-11-29 |
EP2042189A1 (en) | 2009-04-01 |
AU2007253212A1 (en) | 2007-11-29 |
EP2042189B1 (en) | 2013-06-26 |
JP4727748B2 (ja) | 2011-07-20 |
EP2042189A4 (en) | 2010-02-17 |
ES2331342A1 (es) | 2009-12-29 |
US20100330042A1 (en) | 2010-12-30 |
WO2007135220A1 (es) | 2007-11-29 |
AU2007253212B2 (en) | 2012-09-27 |
CA2652983C (en) | 2016-07-19 |
ES2433389T3 (es) | 2013-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Petters et al. | Genetically engineered large animal model for studying cone photoreceptor survival and degeneration in retinitis pigmentosa | |
JP4524230B2 (ja) | 遺伝的に改変された細胞を含む生体適合性免疫隔離カプセル | |
Petersen-Jones et al. | Dog models for blinding inherited retinal dystrophies | |
Al-Shawi et al. | Expression of the Ror1 and Ror2 receptor tyrosine kinase genes during mouse development. | |
Leaver et al. | Cooperative effects of bcl‐2 and AAV‐mediated expression of CNTF on retinal ganglion cell survival and axonal regeneration in adult transgenic mice | |
Stieger et al. | Gene therapy for vision loss—recent developments | |
Hu et al. | In vivo CRISPR/Cas9-mediated genome editing mitigates photoreceptor degeneration in a mouse model of X-linked retinitis pigmentosa | |
BR112014010091B1 (pt) | Ácido nucleico, vetor viral, preparação farmacêutica, uso destes, método para produção de uma proteína rdcvf, e método in vitro ou ex vivo de secreção de uma proteína rdcvf a partir de uma célula | |
US20220347321A1 (en) | Expression of neuropeptides | |
US20230128029A1 (en) | Neurokinin antagonists and uses thereof | |
ES2836133T3 (es) | Composiciones y métodos para modular la excitabilidad neuronal y el comportamiento motor | |
Huang et al. | Nrn1 overexpression attenuates retinal ganglion cell apoptosis, promotes axonal regeneration, and improves visual function following optic nerve crush in rats | |
ES2331342B1 (es) | Uso de la proinsulina para la elaboracion de una composicion farmaceutica neuroprotectora, composicion terapeutica que la contiene y sus aplicaciones. | |
US20040224409A1 (en) | Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | |
Huang et al. | Intraocular gene transfer of ciliary neurotrophic factor rescues photoreceptor degeneration in RCS rats | |
WO2002022162A1 (fr) | Remede contre la sclerose laterale amyotrophique | |
Vasquez et al. | Replication-Deficient Adenovirus Vector Transfer ofgfpReporter Gene into Supraoptic Nucleus and Subfornical Organ Neurons | |
Yokoyama et al. | Genomic structure and functional characterization of NBPhox (PMX2B), a homeodomain protein specific to catecholaminergic cells that is involved in second messenger-mediated transcriptional activation | |
Seki et al. | Adenoviral gene transfer of aspartoacylase ameliorates tonic convulsions of spontaneously epileptic rats | |
JPH09510357A (ja) | 酸性繊維芽細胞成長因子(aFGF)をコードする組み換えアデノウィルス | |
Humphries et al. | Hereditary Retinopathies: Progress in Development of Genetic and Molecular Therapies | |
JPH09510358A (ja) | 脳−誘導神経栄養因子(bdnf)をコードする組み換えアデノウィルス | |
Swing et al. | Parkin interacting substrate zinc finger protein 746 is a pathological mediator in Parkinson’s | |
Wei | Neural stem cell-based GDNF and CNTF for the treatment of retinal degeneration in a mouse model of CLN7 disease | |
De la Rosa et al. | Use of proinsulin for the preparation of a neuroprotective pharmaceutical composition, therapeutic composition containing it and applications thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20091229 Kind code of ref document: A1 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2331342B1 Country of ref document: ES |
|
FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20211117 |