CN105612258B - 半乳寡糖的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及半乳寡糖(GOS)的酶促制备。提供了用于由乳糖制备GOS的方法，其包括(i)使乳糖进料与固定化β‑半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)接触和(ii)允许进行GOS合成，其中所述乳糖进料是结晶乳糖的水性浆料。

Description

半乳寡糖的生产
本发明涉及用于制备半乳寡糖(galacto-oligosaccharide，GOS)的方法。GOS(也称为寡聚半乳糖基乳糖、寡聚半乳糖、寡聚乳糖或反式半乳寡糖(transgalactooligosaccharide，TOS))是一种重要的食品成分[1]。由于GOS具有不可消化性，因此其属于益生元组群(group of prebiotics)。益生元被定义为通过刺激结肠中有益细菌的生长和/或活性而对宿主产生有益影响的不易消化的食品成分。GOS当添加至婴儿配方乳(infant milk formula)时复制人乳之促双歧杆菌生长作用(bifidogenic effect)的能力(不仅在细菌数量方面，而且对于结肠微生物丛的代谢活性也如此)已使对其生产以及在多种食品和制药过程中应用的关注显著提高。例如，GOS存在于市售可得的产品中，例如用于婴儿和成人两者的食品，范围从婴儿配制品到用于严重疾病的食品。
顾名思义，GOS的合成通常涉及多个由β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖水解酶；EC3.2.1.23)催化的半乳糖基转移过程，β-半乳糖苷酶使用乳糖作为半乳糖基供体，使用乳糖或中间体GOS物类作为半乳糖基接受体。
潜在的机制示于方案1中。简言之，酶和半乳糖基供体(乳糖，β-D-Galp-(1，4)-β-D-Glcp)初始形成瞬时半乳糖基-酶复合物(En--Galp)并随后形成真正的共价半乳糖基-酶复合物(En-Galp)，其从该复合物释放葡萄糖分子(β-D-Glcp)。然后，另一半乳糖基接受体(乳糖β-D-Galp-(1，4)-β-D-Glcp或其他GOS物类)与该复合物在活性中心结合并一般用其非还原端(乳糖的半乳糖基部分)对该半乳糖基-酶复合物(En-Galp)进行亲核攻击，由此导致形成DP3 GOS物类，其一般表达为β-D-Galp-(1→n)-β-D-Galp-(1，4)-β-D-Glcp产物，其中n表示糖苷键的位置，其根据酶来源和所应用的反应条件可以是2、3、4或6。
Figure BDA0000935318340000021
方案1.通过β-半乳糖苷酶催化之乳糖通过β-1，4糖苷键的延伸的GOS合成机制的示意图。
随着反应的进行(参见方案1)，越来越多的半乳糖基部分被转移至现有的GOS物类，导致形成具有不同聚合度(degree of polymerization，DP)的GOS物类。因此，GOS一般可表达为(Gal)m-Glc(其中根据酶来源和所应用的反应条件，m通常在2至9之间变化)。除≥DP3 GOS物类之外，新的DP2物类(例如异乳糖)通常被认为是β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移作用的初级产物。通过β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移形成的这些新DP2物类可进一步参与形成高等DP GOS物类，因而使GOS产物谱复杂化，如下文所讨论。
尽管酶β-半乳糖苷酶在食品和乳制品工业中具有多种应用，但是酶的中度稳定性是阻碍生物催化剂在工业规模上进行一般性实施的限制之一。探索其作为催化剂的全部潜能的研究已产生多种用于酶稳定化的合适策略。例如，已通过多种方法(例如物理吸附、捕获和共价结合方法)将酶固定在不同的支持物上。还已表明，固定化对降低β-半乳糖苷酶的生产抑制具有有利作用。此外，酶固定化有利于酶的可重复使用性和GOS合成过程的持续操作。
众所周知，β-半乳糖苷酶催化的GOS合成在动力学上受到控制[2]。这意味着，在某个时间点形成的半乳寡糖实际量在很大程度上取决于乳糖和/或GOS的期望合成反应相对于不期望水解反应的相对速率。这进而不仅依赖于乳糖浓度而且还依赖于所形成的GOS物类，并且再者还依赖于酶与由合成和水解产生的产物的相互作用。
因此，多种GOS物类不仅可用作进一步GOS合成的接受体而且还可用作水解底物。水解反应一般将在反应后期占优势，此时已经过GOS浓度的峰值并且反应混合物中主要底物乳糖的浓度降低至较低值。另一方面，当积累越来越多的产物时还可发生生产抑制，导致GOS合成或GOS水解被抑制。
使用β-半乳糖苷酶来提高由乳糖合成GOS的产率的多种因素在本领域中是已知的。有关GOS的生产、特性和应用的综述，参见Torres等。用于半乳糖基转移的反应条件应为高乳糖浓度、高温和反应介质中的低水活性。温度、底物浓度和酶来源在寡糖的酶促合成中发挥重要作用。然而，初始乳糖浓度的影响可大得多。关于使用高度浓缩的起始乳糖溶液，已表明最大GOS产率在很大程度上主要受初始乳糖浓度的影响，直至浓度范围为30％至40％(w/v)。一般来说，用越高的初始乳糖浓度可产生越多且越大的半乳寡糖(GOS)。由于乳糖的溶解度在室温下相对较低但随着温度的升高明显提高，因此一般期望高温。
较高的温度可有益于较高的寡糖产率。当在高初始乳糖浓度并因此在高温下操作时，高温下的高产率是一个额外优势。另一方面，固定化β-半乳糖苷酶用于合成GOS的潜能(例如通过高效再循环来降低酶的成本贡献、易于操作和控制过程以及实现持续过程)已得到广泛认可。然而，固定化β-半乳糖苷酶用于生产GOS的工业用途尚未报道。Urretia等的研究实例中表明，当在重复分批操作下使用高酶剂量(约18％的乳糖(w/w))在50％(w/w)乳糖溶液中于60℃下进行反应时，固定化环状芽孢杆菌(B.circulans)β-半乳糖苷酶是可再循环的。
因此，一般优选的是在高初始乳糖浓度的条件使用固定化酶来进行GOS合成以实现高GOS产率并降低水解副反应[3，4，5]。
然而，本发明人发现，从在研究环境中进行的优化研究获得的结果并不总是为工业规模的GOS合成提供良好指示，例如在食品工业中，其中通常出于经济原因而使用相对低的酶浓度(和/或较小量的固定化酶)和长(＞20小时)孵育时间以实现高生产率和高时空产率(space-time yield)。特别地，他们观察到，在重复分批操作中在60℃下使用高度浓缩(55％w/w)的乳糖溶液作为GOS合成的乳糖进料(feed)导致在第二个操作循环之后固定化酶损失约95％的初始活性LU。
因此，他们开始着手开发用于在工业规模进行GOS合成的改进的反应条件，其允许重复地再使用固定化酶同时保留相当的酶活性且不牺牲高GOS产率和成本有效性操作。
令人惊奇地发现，上述目的可通过使用结晶乳糖的浆料(slurry)代替高度浓缩的溶解乳糖溶液作为乳糖进料来实现。更具体地，当将55％w/w的乳糖浆料与固定化酶在58℃下孵育24小时时，在第三个反应循环之后保留20％的初始LU酶活性(如下文限定的作为LU测量)。在初始的六个批次期间，最终的GOS含量高于60％(dm)。不期望受任何理论的限制，推断：认为通过在高温下完全溶解制备的常规高度浓缩乳糖溶液是“亚稳定”溶液，其在长时间孵育期间在较低反应温度下将经历重结晶。这导致在酶载体的表面上和孔中形成乳糖晶体，可能不仅导致可利用性降低而且还导致固定化酶失活(变性)。令人惊奇的是，这可通过使用“预结晶”乳糖的混悬液而避免，其中乳糖晶体用作底物库并且溶解的乳糖可自由地进入酶载体的孔中。因此，通过使用“预结晶”的乳糖可阻止酶变性且无需通过将结晶乳糖预加热至较高温度来使乳糖完全溶解，由此导致可持续的工业过程。
因此，本发明提供了用于由乳糖制备半乳寡糖(GOS)的方法，其包括使乳糖进料与β-半乳糖苷酶接触，所述β-半乳糖苷酶优选地被固定在固体载体上；以及允许进行GOS合成，其中所述乳糖进料是结晶乳糖的水性浆料(aqueous slurry)。
本文中使用的术语“水性浆料”指不溶性乳糖晶体的含水混合物(混悬液)，即其中并非所有乳糖都溶解并且其中可溶性乳糖的浓度等于其在给定反应温度下的溶解度的组合物。如上所述，乳糖的溶解度强烈依赖于温度。图1示出了乳糖在中性pH的水中的溶解度-温度关系。
通常来说，用于本发明的水性乳糖浆料包含17％至75％(w/w)的乳糖。实际上，浆料中的高乳糖含量可在反应器中产生浓缩产物，这需要较低的能量来进一步浓缩以获得75％(w/w)的成品GOS糖浆。因此，出于经济原因和极好的DOS产率两者，优选地乳糖浆料总共包含50％至70％(w/w)的乳糖。例如，水性乳糖浆料包含至少53％(w/w)，优选至少55％(w/w)的乳糖。通过提高反应混合物的干物质总含量而不牺牲酶稳定性，本发明的方法提供了非常高的生产率和GOS输出/每反应器体积。
用于本发明的浆料容易地通过将结晶乳糖(一水合物)添加至水性液体来制备。技术人员将能够基于乳糖溶解度曲线来计算在给定温度下获得浆料所需的乳糖浓度，例如，可使用以下经验等式来计算在给定反应温度(T)下的可溶性乳糖：
乳糖的溶解度＝0.003＊T^2+0.2713＊T+9.778。
相应地，58℃下的乳糖溶解度计算为35.6％(w/w)。因此，不溶性乳糖晶体的百分比将为乳糖浓度与58℃下的乳糖溶解度的差值。以此方式，反应体系中存在的不溶性乳糖晶体的百分比计算为19.4％(55％减去35.6％)(w/w)。
通常来说，可在室温下将适量的乳糖添加至缓冲溶液并加热至期望的反应温度。也可将乳糖添加至水，之后通过添加苛性溶液(NaOH)或缓冲溶液将乳糖浆料的pH调节为约pH 3.5至pH 7.5的工作pH范围，其在酶活性的范围之内。
技术人员将认识到，各固定化β-半乳糖苷酶的最佳pH依赖于其来源和固定化方法的类型，并且所述最佳pH在酶促转化期间可降低。因此，需要在酶促转化期间对pH进行调节，例如通过逐步添加苛性溶液或者通过pH固定模式(pH stat mode)。
如上所述，与采用高度浓缩的乳糖溶液的常规方法相比，本发明的方法无需对乳糖进行充分加热以使乳糖完全溶解。这不仅降低了与加热步骤相关的能量消耗以及由此产生的操作成本，而且还避免了乳糖溶液的不期望颜色改变：外观更加呈微黄色。
然而，实际上，可能还期望使乳糖完全溶解以除去可存在于乳糖晶体中的不溶性蛋白质聚集体或不溶性矿物盐(例如磷酸钙或柠檬酸钙)。因此，当然还可如下制备乳糖浆料：将乳糖进料加热至高温(T1)以使乳糖溶解并除去上述不溶性颗粒，之后冷却至期望的反应温度(T2)以使溶解的乳糖结晶析出。如下文所示，加热＞58％(w/w)的完全溶解乳糖溶液并随后冷却至约60℃的温度导致乳糖的自发结晶。
良好晶体的形成及晶体生长是萃取和纯化乳糖的关键。在低于93.5℃的温度下，α-乳糖从超饱和溶液中结晶产生多种晶体形状。所获得的常见晶体形状类似于棱镜(prism)和战斧(tomahawk)形状，较硬且仅微溶。高于93.5℃时，β-乳糖结晶析出，其通常呈面不平坦的菱形。一分子的水与乳糖的结晶α-形式相关，因此将其称为一水合物。然而，在高于120℃的温度和真空下，该水分子损失并且形成高度吸水的α-乳糖酸酐。当在20℃下将乳糖溶解于水中时，发生变旋(mutarotation)，即α-和β-端基异构体相互转化以产生62.7％β-乳糖的溶液。由于α-乳糖是溶解度低得多的物类，因此浓缩该溶液导致α-乳糖沉淀并且发生进一步的变旋以维持相同的平衡位置。
本发明的方法优选地包括使用食品级或药用级的乳糖，或者介于食品与药用级乳糖之间的精制乳糖。食品级乳糖如下制备：将乳清或渗出物(乳清蛋白浓缩生产的共产物)浓缩至超饱和溶液并使乳糖结晶析出，然后移出并干燥乳糖晶体。结晶以及研磨和分级筛选的特殊过程产生具有不同颗粒尺寸分布的乳糖类型。现今，工业界提供了数种类型的乳糖(从超细到超粗晶体)以用于所有应用。乳糖含量不低于99％，并且硫酸盐灰分含量不超过0.3％，两者均基于干重。10％溶液的pH不小于4.5或超过7.5。
为了获得精制乳糖或药用级乳糖，必需进行精制过程。这涉及将乳糖晶体重新溶解并用未使用过的活性炭(virgin activated carbon)处理溶液，所述活性炭吸附很多溶质，包括核黄素和多种蛋白质。还吸附称为
Figure BDA0000935318340000061
胨(proteose peptone)的一组多肽，其来自β-酪蛋白。这些胨通过纤溶酶(其是从奶牛的血流迁移到***中的乳中的蛋白酶)的作用产生。通过临时调节溶液的pH，其他蛋白质也可被吸附到活性炭上。通过絮凝和过滤除去碳，然后弃掉。在结晶、通过离心后续分离晶体以及冷水洗涤和干燥之后，获得高纯度的白色药用级乳糖。对晶体进行研磨或筛选以得到具体特定颗粒大小分布的产物。
在使乳糖浆料与包含固定化β-半乳糖苷酶的制备物接触之后，将所得反应混合物在有利于GOS合成的条件下进行孵育。技术人员将理解，所选择的反应温度应同时有利于GOS合成和酶稳定性。因此，最佳温度为可以以经济上最佳的方式使固定化酶再循环的温度，例如对于所选择的各固定化β-半乳糖苷酶，当达到固定化酶的半衰期时对固定化酶进行处理。通常来说，在约20℃至约60℃的反应温度下进行GOS合成。在一个实施方案中，在40℃至60℃、优选45℃至55℃(例如在约50℃)下进行该反应。
孵育反应混合物直至已获得期望的GOS量。根据孵育条件和所使用固定化酶的量，根据本发明的GOS合成一般允许进行0.5至100小时。然而，GOS的工业生产一般需要与有关的其他操作单元(例如纯化、去矿质、脱色等)进行合理的整合。因此，出于实际和经济原因，优选地在至少6或10小时、优选12至36小时的反应期期间进行工业规模的GOS合成。例如，由于高GOS产率和酶稳定性提高，本发明的方法可使用约18至24小时的孵育时间来适当地实施。由于反应器中具有大量固定化酶将降低生产率和时空产率，因此这允许在员工工作日内进行灵活调整而同时消除了对高酶量的需求。
例如，固定化β-半乳糖苷酶的剂量可以以多至30LU/克初始乳糖、优选多至25LU/克的量使用、更优选以约10至20LU/克的量使用。如本文中所使用的，一个乳糖酶单位(lactase unit，LU)定义为在40℃、pH6.0下在早期反应阶段每分钟释放1μ摩尔葡萄糖的酶量。当通过乳糖酶水解乳糖时，其被转化为葡萄糖和半乳糖。半乳糖酶活性通过测量所释放葡萄糖的量来确定。
存在数种方式来如本发明中所公开的使用乳糖“浆料”反应来进行GOS合成。在第一实施方案中，将浆料置于单独的反应器中并通过微型过滤器保留不溶性乳糖晶体。然后，将溶解的乳糖泵送至固定化β-半乳糖苷酶所在的填充床反应器(packed bed reactor，PBR)。使PBR的出口返回至反应器。以此方式，在一定时间之后，乳糖将完全溶解并且可获得高GOS浓度。
在第二实施方案中，将乳糖晶体逐渐添加至GOS溶液。乳糖溶解并将其泵送至PBR，溶解的乳糖将被转化为GOS。
在第三实施方案中，不一次添加所有的不溶性乳糖晶体使得在搅拌反应混合物时不会遇到困难。例如，将乳糖晶体直接添加至现存的反应混合物以补充已溶解并完全转化为GOS的初始存在乳糖晶体。在目测到乳糖晶体随着反应的进行而消失/溶解时，可添加更多的乳糖晶体以继续反应直至可获得高(例如高至75％)的GOS溶液。
应理解，本发明的方法可使用来自很多种来源(例如微生物、植物和动物)的β-半乳糖苷酶来实施。认为微生物(例如细菌、真菌和酵母)是用于工业应用的β-半乳糖苷酶的优选来源。有关合适微生物来源的综述，参见参考文献Panesar 2010。优选地，β-半乳糖苷酶分离自选自以下的微生物：米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、S.singularis、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)和大肠杆菌(E.coli)。一些酶对合成具有特定链长度和键接取向的寡糖具有高特异性。例如，来源于环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶对β-1，4键表现出高特异性并且进而通过半乳糖基转移主要产生β-1，4连接的半乳糖基寡糖(GOS)，而来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-半乳糖苷酶主要产生β-1，6GOS。用环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶(其可从Daiwa Kasei，Amano，Japan以市售酶制备物
Figure BDA0000935318340000081
的形式获得)获得非常好的结果。
本发明方法的特征在于将乳糖浆料与固定化β-半乳糖苷酶一起孵育。酶固定化的多种方式在本领域中是已知的。所述方法通常包括多孔载体，β-半乳糖苷酶通过共价结合、通过物理吸附(电荷-电荷相互作用或范德华相互作用)、通过凝胶包封或其组合被固定到所述多孔载体上。参考文献Panesar 2010的表2提供了对不同来源的β-半乳糖苷酶和固定化方法的综述。此外，还可应用无载体的固定化酶，例如CLEC(交联酶晶体)或CLEA(交联酶聚集体)[6，7]。
本发明不限于任何类型的酶固定化。然而，考虑到操作的容易性和酶分子不会泄露到反应混合物中，优选可促进酶的直接共价结合的载体。
如下文中所示，用通过共价结合至固体载体而固定化的β-半乳糖苷酶获得良好的结果。优选地，所述固体载体为活化的丙烯酸类聚合物(acrylic polymer)，优选官能化的聚甲基丙烯酸类基质(functionalized polymethacrylate matrix)。例如，可使用六亚甲基氨基官能化聚甲基丙烯酸类基质(Sepabeads)或大孔丙烯酸类环氧活化树脂(如Eupergit C250L)。
在反应已进行至期望的水平之后，可通过本领域中已知的方法终止GOS合成。例如，通过过滤或者通过借助安装在反应器底部的筛子滞留固定化酶的颗粒来使固定化β-半乳糖苷酶与反应混合物的剩余物物理分离。
如上文所说明的，本发明的方法有利地用于涉及GOS合成的数个连续批次(“循环”)的重复分批操作***。另外，由于通过使用乳糖浆料作为乳糖进料避免了在GOS合成反应期间发生乳糖结晶的不利影响，因此本发明的方法允许固定化酶在数个批次期间再循环。这实现了半连续操作和酶的多次重复使用。
因此，在一个实施方案中，方法在第一GOS合成循环之后还包括以下步骤：(a)洗涤固定化β-半乳糖苷酶；(b)任选地储存经洗涤的固定化β-半乳糖苷酶，直至进一步使用；和(c)如下进行一个或更多个后续的GOS合成循环：使步骤(a)的经洗涤固定化β-半乳糖苷酶与乳糖浆料接触使得所述酶得以再循环。
在进行酶洗涤之前，通常将酶从包含GOS的反应混合物中物理分离。例如，如果用于GOS合成的酶以“茶包”样小袋使用，则可简单地将茶包从反应混合物中取出。或者，可在洗涤期间将GOS从反应器中移出而固定化酶仍保留在反应器中。
例如，用去矿质水和/或GOS合成反应中使用的相同缓冲液洗涤酶数次。可通过用约pH 4.5的乙酸溶液洗涤来对固定化酶进行消毒以例如降低微生物计数。可将所述酶储存在缓冲液中在低于10℃、优选为约4℃的温度下。合适的缓冲液包括pH 5.5至pH 7.5范围内的那些。例如，在重复使用之前，将所述酶在4℃下储存在0.1M K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH6.0至pH 7.0中。在一个实施方案中，本发明的方法包括采用再循环的固定化β-半乳糖苷酶进行至少5个、优选至少8个，更优选至少10个GOS合成循环。
在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含结晶乳糖的水性浆料并且包含固定在固体载体上的β-半乳糖苷酶。优选的乳糖浓度、酶来源和酶浓度在上文中公开。
附图说明
图1：乳糖的溶解度和温度曲线。
图2：使用乳糖浆料(■)或乳糖溶液(◆)作为乳糖进料的固定化β-半乳糖苷酶EC-HA催化的GOS合成的活性保留比较。
实验部分
下文中的实施例例示了在使用固定化β-半乳糖苷酶来制备GOS中使用乳糖浆料代替高度浓缩的乳糖溶液的有利效果。
实施例1(比较例)：使用乳糖溶液(55％)的在固定化的来自环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)的β-半乳糖苷酶下的GOS合成
实验条件：
将35克乳糖添加至25克的0.1M K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH 6.3并在95℃下使其完全溶解，然后冷却至58℃。随后，添加2.7克比活性为131.16LU/克固定化酶的通过戊二醛偶联固定在市售载体(Sepabeads EC-HA)上的载体结合酶以起始酶促反应。酶剂量为10.2LU/克乳糖。
在24小时的反应时间之后，过滤GOS，将固定化酶用去矿质水洗涤并在重复使用之前在4℃下储存于0.1M K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH 6.0至pH 7.0中。
如Coulier等(J.Agric.Food Chem.2009，57，8488-8495)和Warmerdam等(ApplBiochem Biotechnol(2013)170：340-358)先前所述分析碳水化合物(半乳糖、葡萄糖、乳糖和GOS)。
第一批次和第二批次之后的剩余酶活性和GOS产率总结于表1中。显著地，固定化酶的剩余活性仅为初始LU活性的5.4％，表明固定化酶迅速变性。
表1.对在完全溶解的乳糖溶液中使用固定化β-半乳糖苷酶进行GOS合成的总结。
Figure BDA0000935318340000101
实施例2：在本发明的乳糖浆料(55％w/w)反应体系中使用固定化的来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的GOS合成。
实验条件：
将70克乳糖直接添加至51克的0.1M K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH6，随后将反应混合物加热至反应温度58℃(并维持至少1小时)并添加12克比活性为141.8LU/克固定化酶的通过戊二醛偶联固定在市售载体(Sepabeads EC-HA)上的载体结合酶以起始酶促反应。酶剂量为15.2LU/克乳糖。
在24小时的反应时间之后，过滤GOS，将固定化酶用去矿质水洗涤并在重复使用之前在4℃下储存于0.1M K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH 6.0至pH 7.0中。
表2.对在乳糖浆料(55％w/w)中用固定化的来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶以连续模式进行GOS合成的总结
Figure BDA0000935318340000111
实施例3(比较例)：使用乳糖浆料(65％，w/w)反应体系的使用游离的来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶的GOS合成。
实验条件：
将85克乳糖直接添加至65克的0.1M K2HPO4/KH2PO4缓冲液，pH6，随后将反应混合物加热至反应温度58℃(并维持至少1小时)并添加85mg溶解于2ml去矿质水中的游离β-半乳糖苷酶Biolacta N5(Amano)以起始酶促反应。酶剂量为5LU/克乳糖。
用定轨振荡器(orbit shaker)在水浴中孵育反应混合物。24小时的反应之后，最终反应混合物中的GOS含量仅为40％，并且反应混合物中仍剩余大量不溶性乳糖。这表明，在这样的高乳糖浓度浆料体系中，游离酶的活性低于固定化酶。
实施例4：在乳糖浆料(65％，w/w)反应体系中使用固定化的来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶(载体-环氧Eupergit C250L)的GOS合成
向200g具有20mM柠檬酸钾缓冲液，pH7.0的乳糖浆料添加8g在Eupergit C 250L上Biolacta N5的固定化β-半乳糖苷酶并在60℃下进行孵育。用磁力搅拌器搅拌反应混合物。酶剂量为7LU/克乳糖。
24小时之后，发现反应混合物完全澄清并且GOS含量为57％。
该结果表明高浆料浓度和固定化酶的组合对工业过程的GOS合成而言是理想的；(i)不需要使乳糖完全溶解，并且(ii)当来自反应器之产物的浓度还接近最终产品的浓度(GOS糖浆，75％(w/w))时，最终产品的浓缩消耗较少能量。
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Claims (19)

1.用于由乳糖制备半乳寡糖（GOS）的方法，其包括：
(i)在室温下将乳糖晶体溶解在水相中以提供结晶乳糖的水性浆料，所述水性浆料包含至少53%（w/w）的乳糖；
(ii)将所述结晶乳糖的水性浆料在20℃至60℃的期望反应温度下反应；
(iii)使所述结晶乳糖的水性浆料与固定在多孔载体上的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）β-半乳糖苷酶接触；和
(iv)允许进行GOS合成，从而由乳糖制备GOS。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性浆料包含53%至75%（w/w）的食品级或药用级乳糖。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性浆料包含53%至70%（w/w）的食品级或药用级乳糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述水性浆料包含55%至75%（w/w）的乳糖。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水性浆料的pH为pH 6至pH 7.5。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中GOS合成在40℃至60℃的反应温度下进行。
7.根据权利要求中1至4任一项所述的方法，其中GOS合成在至少6小时的反应期期间进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其中GOS合成在12至36小时的反应期期间进行。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶以多至30 LU/克初始乳糖的量使用。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶以多至25 LU/克初始乳糖的量使用。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶以10至20 LU/克初始乳糖的量使用。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中β-半乳糖苷酶通过共价结合、通过电荷-电荷相互作用或通过凝胶包封固定在所述多孔载体上。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶被固定在活化的丙烯酸类聚合物载体上。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶被固定在官能化的聚甲基丙烯酸类基质上。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶被固定在六亚甲基氨基官能化聚甲基丙烯酸类基质或大孔丙烯酸类环氧活化树脂上。
16.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其在第一GOS合成循环之后还包括以下步骤：
(a) 用水和/或缓冲液洗涤固定化β-半乳糖苷酶；
(b) 任选地储存经洗涤的固定化β-半乳糖苷酶，直至进一步使用；和
(c) 如下进行至少一个后续的GOS合成循环：将步骤(a)的经洗涤固定化β-半乳糖苷酶与乳糖浆料接触以使所述固定化β-半乳糖苷酶得以再循环。
17.根据权利要求16所述的方法，其涉及利用经再循环的固定化β-半乳糖苷酶进行至少5个GOS合成循环。
18.根据权利要求17所述的方法，其涉及利用经再循环的固定化β-半乳糖苷酶进行至少8个GOS合成循环。
19.根据权利要求17所述的方法，其涉及利用经再循环的固定化β-半乳糖苷酶进行至少10个GOS合成循环。
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