NL8100280A - PROCESS FOR DEGRADING PROTEINS WITH PROTEINASES. - Google Patents

Description

n.c. 29.705 t ^-i 1 *· Λ '."erkwijze voor het afbreken van proteïnen net proteïnasen.n.c. 29705 t ^ -i 1 * · Λ '. "Approval for the degradation of proteins with proteinases.

De meeste voedingsproteïnen, in het bijzonder de biologisch hoogv/sardige, bezitten een globaire structuur, bijvoorbeeld de melkproteïnen, de eiproteïnen, de proteïnen van het spiersarco-plasma, de graanproteinen en de meeste andere plantenproteïnen.Most dietary proteins, especially the biologically high, have a global structure, for example, the milk proteins, the egg proteins, the muscle amino plasma proteins, the grain proteins and most other plant proteins.

5 Sij kunnen op bekende wijze ontsloten en door de enzymen van het organisme zonder problemen gemetaboliseerd worden.Sij can be digested in a known manner and metabolized without problems by the enzymes of the organism.

Anders gedragen zich als regel de structuurproteïnen zoals collageen, keratine, elastine enz., die niet zonder meer voor de voeding, in het bijzonder voor de voeding van de mens productief 10 gemaakt worden.Otherwise, as a rule, the structural proteins such as collagen, keratin, elastin, etc., which are not simply made productive for food, in particular human food, behave.

Bij niet direkt technisch bruikbare proteïnen leidt vaak een (enzymatische) hydrolyse tot beter bruikbare produkten, in het bijzonder kunnen als regel een verbeterde oplosbaarheid in het zure traject en algemeen verbeterde technologische eigenschappen 15 bereikt worden.In the case of proteins which are not directly technically usable, an (enzymatic) hydrolysis often leads to more useful products, in particular an improved solubility in the acid range and generally improved technological properties can generally be achieved.

De problematiek, die bij het ten nutte maken van proteïnen kan optreden, wordt aan de hand van het caseïne toegelicht. Kiet-gemodificeerd caseine-proteïne heeft bijvoorbeeld in het pH-tra-ject if - 5, dat een groot deel van de consumptiedranken en vruch-20 tendesserts bezit, een zeer geringe Oplosbaarheid. Het gevolg is een uitvlokken van het proteïne, wat enerzijds het aanzien van de dranken en door het in elkaar zakken van opgeklopte massa's de desserts op een hoogst onwelkome wijze verandert, anderzijds een onaangename, zandige smaak teweeg brengt.The problems that can arise in the utilization of proteins are explained with the aid of casein. For example, tick-modified casein protein has very low solubility in the pH range if-5, which contains a large portion of the consumption drinks and fruit desserts. The result is a flocculation of the protein, which on the one hand changes the appearance of the drinks and, due to the collapse of whipped masses, the desserts in a highly unwelcome manner, and on the other hand produces an unpleasant, sandy taste.

25 De techniek geeft zich met nadruk moeite voor het zuiveren en modificeren van proteïnen zoals soja-, mais-, bloed-, vis-, melkproteïnen met het oog op de voeding. In het middelpunt van de onderzoekingen staat in het bijzonder de enzymatische hydrolyse van de proteïnen. De hydrolyse van de proteïnen leidt tot de af-30 braak van het proteïne-macromolecuul in kleinere peptiden en eventueel tot aminozuren. Cok structuurproteïnen zijn in de kring van de te onderzoeken alternatieve proteïnen betrokken.The technique puts particular emphasis on purifying and modifying proteins such as soy, corn, blood, fish, and milk proteins for nutrition. The research focuses in particular on the enzymatic hydrolysis of the proteins. The hydrolysis of the proteins leads to the degradation of the protein macromolecule into smaller peptides and optionally amino acids. Structural proteins are also involved in the circle of the alternative proteins to be investigated.

De eigenschappen van een proteïne-hydrolysaat hangen vanzelfsprekend af van de afbrskingsgraad. Hen maat voor de afbrekings-35 graad is bijvoorbeeld het percentage peptide-bindingen, dat bij het afbraakproces v;erd verbroken (D.H. = Degree of Hydrolysis).The properties of a protein hydrolyzate naturally depend on the degree of degradation. Their measure of the degradation degree is, for example, the percentage of peptide bonds that are broken during the degradation process (D.H. = Degree of Hydrolysis).

Bij een eerste benadering geldt, dat bij een vooraf gegeven proteïne en een vooraf gegeven protease de eigenschappen van het pro- 8100280 *' * 2 teïnehydrolysaat door de DH-waarde vastgelegd zijn, die door het verbruik van natriumhydroxide bij een constante pH gedurende de hydrolyse bepaalbaar is.In a first approximation, with a predetermined protein and a predetermined protease, the properties of the protein 81002 * * 2 protein hydrolyzate are determined by the DH value, which is determined by the consumption of sodium hydroxide at a constant pH during hydrolysis. is determinable.

Een van de grootste hindernissen bij het nuttige gebruik van 5 proteïne-hydrolysaten in de voeding, in het bijzonder de voeding van de mens, ligt op het gebied van de smaak. De smaak van zuiver proteïne is gewoonlijk tamelijk neutraal. De met een proteïne van bepaalde herkomst geassocieerde smaak is als regel van niet pro-teïne-achtige smaakstoffen afkomstig en het is veelal noodzakelijk 10 deze smaakstoffen te verwijderen om een algemene toepasbaarheid van de proteïne-hydrolysaten te waarborgen.One of the major obstacles to the beneficial use of protein hydrolyzates in food, especially human food, is in the field of taste. The taste of pure protein is usually quite neutral. The taste associated with a protein of particular origin is generally derived from non-protein-like flavors and it is often necessary to remove these flavors to ensure general applicability of the protein hydrolyzates.

De beslissende moeilijkheid ligt in de bittere smaak van de proteïne-hydrolysaten. De intens. bittere smaak van de proteïne-hydrolysaten kan in de voor de consumptie bestemde voedingsmiddels len nauwelijks gemaskeerd worden. In feite heeft deze bitterheid tot dusverre verhinderd, dat het tot een uitgebreide toepassing van dergelijke proteïne-hydrolysaten bij de voeding kwam.The decisive difficulty lies in the bitter taste of the protein hydrolysates. The intense. bitter taste of the protein hydrolysates can hardly be masked in the foodstuffs intended for consumption. In fact, this bitterness has hitherto prevented the widespread use of such protein hydrolyzates in the diet.

De tekenen wijzen erop, dat de oorzaken van de bittere smaak met het proteïne-substraat samenhangen en niet met het toegepaste 20 enzym. Bepaalde proteïnen (zoals caseïne) geven vrijwel zonder uitzondering bitter smakende hydrolysaten, waar tegenover gelatine bij een ana-loge behandeling met dezelfde enzymen hoogstens weinig bitter smakende hydrolysaten geeft.The signs indicate that the causes of the bitter taste are related to the protein substrate and not to the enzyme used. Certain proteins (such as casein) give, almost without exception, bitter-tasting hydrolysates, whereas gelatin in an analogue treatment with the same enzymes gives at the most little bitter-tasting hydrolysates.

In het kader van de onderhavige aanvrage wordt als "bitter-25 punt" dat gehalte aan oplosbaar proteïne-hydrolysaat (in procenten van het uitgangsproteïne) gedefinieerd, bij proeven waarvan voor het eerst een bittere smaak wordt vastgesteld.For the purposes of the present application, as "bitter-25 point", that content of soluble protein hydrolyzate (in percent of the starting protein) is defined in experiments which first detect a bitter taste.

Het probleem van de bittere smaak van hydrolysaten is tot dusverre in hoofdzaak bij caseïne alsmede soja-, tarwe- en raais-30 proteïnen opgetreden, maar kan intussen ook bij intensief onderzoek van andere alternatieve proteïne-bronnen verschijnen.The problem of the bitter taste of hydrolyzates has hitherto mainly arisen with casein as well as soy, wheat and rye proteins, but can now also appear with intensive research of other alternative protein sources.

Gevonden werd nu, dat door toevoeging van koolhydraten aan enzymatische uitgangsprodukten de proteïnen tot proteïne-hydrolysaten kunnen worden afgebroken, die tot een grote hydrolytische 35 afbrekingsgraad geen of hoogstens een te verwaarlozen geringe bittere smaak bezitten. De met de werkwijze volgens de uitvinding bereikte werking, kan niet of slechts in geringe mate op een "verdringen" van de bittere door een zoete smaak berusten, omdat blijkbaar de zoete smaak van de toe te voegen koolhydraten op ifO geen enkele wijze een noodzakelijke voorwaarde is voor het intre- 8100280 3 * < den van de progressieve werking volgens de onderhavige uitvinding. Voor het aibreken van de proteïnen zijn zoals bekend proteasen geschikt, zowel dierlijke als plantaardige, alsook van microbiele herkomst (zie ïïllaanns Encyklopadie der technischen Chemie, 5 4e druk, Band 10, blz. 51? - 522, Verlag Chemie, 1975)· Als plantaardige enzymen worden papaïne, ficine en bromelaïne genoemd. Als dierlijke proteasen worden pancreas-proteasen, pancreatine, trypsine, chymotrypsine en pepsine genoemd.It has now been found that by adding carbohydrates to enzymatic starting products, the proteins can be broken down into protein hydrolysates, which have little or no negligible minor bitter taste to a high degree of hydrolytic degradation. The effect achieved with the process according to the invention cannot, or only slightly, be based on a "displacement" of the bitter by a sweet taste, because apparently the sweet taste of the carbohydrates to be added is in no way a necessary condition is for entering the progressive action of the present invention. As is known, proteases, both animal and vegetable, as well as of microbial origin, are suitable for the analysis of the proteins (see Illaann's Encyclopadie der Technische Chemie, 5 4th edition, Vol. 10, p. 51 - 522, Verlag Chemie, 1975). plant enzymes are called papain, ficin and bromelain. As animal proteases, pancreatic proteases, pancreatin, trypsin, chymotrypsin and pepsin are mentioned.

Van de grootste betekenis zijn ongetwijfeld de proteasen van 10 microhiële oorsprong. ïïeliswaar zijn meer dan honderd verschillende soorten als bron voor proteasen in de octrooiliteratuur aangegeven, maar onder commerciële aspecten werd de keuze tot dusverre verminderd tot enkele ’weinige soorten, in het bijzonder van het type Bacillus, Streptomyces, Aspergillus, Rhizopus, Mucor en enkele 15 vertegenwoordigers van de macrofungi. Van het genus Bacillus voorden in het bijzonder B. subtills, amyloliquifaciens, licheniforais, thermoproteolyticus en alkalophilus van het genus streptomyces de vertegenwoordigers S. fradiae, griseus en rectus, van het genus Aspergillus de vertegenwoordigers flavus-oryzae, saitoi en niger, 20 van het genus Mucor de vertegenwoordiger pusillus en miehei alsmede Endothia parasitica en Tramstes sanguinea genoemd.The proteases of 10 microhial origin are undoubtedly of greatest significance. Although more than a hundred different species have been identified as a source of proteases in the patent literature, the selection has hitherto been narrowed down to a few species, in particular of the Bacillus, Streptomyces, Aspergillus, Rhizopus, Mucor and some species. representatives of the macrofungi. Of the genus Bacillus, in particular B. subtills, amyloliquifaciens, licheniforais, thermoproteolyticus and alkalophilus of the genus streptomyces represented the representatives S. fradiae, griseus and rectus, of the genus Aspergillus the representatives flavus-oryzae, saitoi and niger, 20 of the genus genus Mucor called the representative pusillus and miehei as well as Endothia parasitica and Tramstes sanguinea.

Er wordt echter aan herinnerd, dat de toepassing op het voe-dingsgebied tot enzymen beperkt dient te zijn, waarvan de niet bezwaarlijkheid buiten twijfel staat. Bijvoorbeeld is een ambte-25 lijke verklaring van geen bezwaar (GRAS-Clearance) in de USA op dit toepassingsgebied slechts voor enzymen uit B. subtilis, A. oryzae en A. niger naast papaïne en pancreasenzymen aanwezig.However, it should be recalled that the nutritional application should be limited to enzymes, the inconvenience of which is beyond doubt. For example, an official statement of no objection (GRAS Clearance) in the USA in this field of application is present only for enzymes from B. subtilis, A. oryzae and A. niger in addition to papain and pancreatic enzymes.

Zoals bekend wordt bij de proteasen een onderscheiding naar hun pE-werkingstraject gemaakt (zie ïïllmann loc.cit.). Als alka-30 lisch proteasen worden proteasen met een plï-werkingstraject van 7-11, overwegend net een activiteitsmaximum in het traject 10-11 aangeduid. In het bijzonder genoemd worden de Subtilisinen. in het bijzonder subtilisine Carlsberg en subtilisine Novo. Neutrale proteïnasen zijn in het traject tussen een pH van 6 en 9 35 'werkzaam met een activiteitsmaximum meestal tussen pH 7 en 8.As is known, the proteases are distinguished according to their pE mode of action (see Illmann loc.cit.). Alkaline proteases are referred to as proteases with a pI mode of action of 7-11, predominantly just an activity maximum in the range 10-11. Particularly mentioned are the Subtilisins. in particular subtilisin Carlsberg and subtilisin Novo. Neutral proteinases are active in the range between a pH of 6 and 9 35 'with an activity maximum usually between pH 7 and 8.

Genoemd worden bijvoorbeeld het enzymeomplex pronase uit Streptomyces griseus, het uit 3. thermoproteolyticus verkregen enzym thermolysine en de uit 3. subtilis verkregen neutrale bac-t eri ënamylase.Mention is made, for example, of the enzyme complex pronase from Streptomyces griseus, the enzyme thermolrinsin obtained from 3. thermoproteolyticus and the neutral bacterium erylaylase obtained from 3. subtilis.

10 Zure proteasen, die overwegend van fungi afkomstig zijn, 8100280 * * h hebben hun werkingsmaximum in het pE-traject 2-5. Als voorbeelden worden de zure proteasen uit A..saitoi, A. niger, A. orvzae, Trametes sanguinea en Mucor pusillus genoemd. Ook het pepsine (verkregen uit maagslijmvlies) is een zuur protease. De werkwijze-5 parameters, zoals pH (buffer), temperatuur, toevoegsels en hulpstoffen alsmede werkwijze-duur bij de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding worden in de eerste plaats door het toegepaste enzym respectievelijk de toegepaste enzymen en het substraat bepaald. Zij zijn in het algemeen bekend.Acid proteases, predominantly from fungi, 8100280 * h have their action maximum in the pE range 2-5. As examples, the acidic proteases from A..saitoi, A. niger, A. orvzae, Trametes sanguinea and Mucor pusillus are mentioned. Pepsin (obtained from gastric mucosa) is also an acidic protease. The process parameters, such as pH (buffer), temperature, additives and auxiliaries, as well as process duration in the implementation of the process according to the invention are primarily determined by the enzyme used, the enzymes used and the substrate, respectively. They are generally known.

10 De volgens de uitvinding toepasbare koolhydraten zullen zowel a) neutrale als b) zure (carbonzuurgroepen bevattende) koolhydraten en wel oligomere: en polymere verbindingen omvatten, voor zover deze in water oplosbaar respectievelijk in water zwelbaar (verdikkingsmiddelen) en voor zover zij fysiologisch zonder bezwaar zijn. 15 Onder oligomeren (oligosacchariden) worden als regel de door condensatie van 2-7 monosacchariden gevormde eenheden verstaan. Als neutrale koolhydraten worden als voorbeeld genoemd: oligomeren en polymeren, die uit glucose- en/of fructose-eenheden zijn opgebouwd, zoals: 20 bijvoorbeeld oplosbare zetmeelsoorten, dextrine, oligosacchariden, oplosbare derivaten van cellulose zoals carboxymethylcellulose, maltodextrine, enz., oligomeren en polymeren, die uit galactose, anhydrogalactose en sulfaatesters van galactose zijn opgebouwd, zoals carrageen en de carragenaten, oligomeren en polymeren, die 25 uit mannose en/of galactose zijn opgebomvd, zoals bijvoorbeeld Johannesbroodpitmeel, guarpitmeel; als zure koolhydraten worden als voorbeeld genoemd: bijvoorbeeld pectine of pectinezuren (pectaten), oligomeren en polymeren uit D-mannuronzuur en L-güluronzuur, zoals bijvoorbeeld 30 alginezuur respectievelijk alginaten, polymerenmengsels uit galacturonzuur, arabinose, galactose, xylose, zoals bijvoorbeeld tragant.The carbohydrates usable according to the invention will comprise both a) neutral and b) acidic (carboxylic acid-containing) carbohydrates, namely oligomeric and polymeric compounds, insofar as these are water-soluble or water-swellable (thickeners) and if they are physiologically free of objection to be. Oligomers (oligosaccharides) are generally understood to mean units formed by condensation of 2-7 monosaccharides. As neutral carbohydrates are mentioned by way of example: oligomers and polymers, which are made up of glucose and / or fructose units, such as: for example soluble starches, dextrin, oligosaccharides, soluble derivatives of cellulose such as carboxymethyl cellulose, maltodextrin, etc., oligomers and polymers made up of galactose, anhydrogalactose and sulfate esters of galactose, such as carrageenan and the carrageenates, oligomers and polymers bumped out of mannose and / or galactose, such as, for example, locust bean gum, guar gum; as acidic carbohydrates are mentioned by way of example: for example pectin or pectic acids (pectates), oligomers and polymers from D-mannuronic acid and L-guluronic acid, such as, for example, alginic acid or alginates, polymer mixtures from galacturonic acid, arabinose, galactose, xylose, such as, for example, tragant.

Op praktische gronden worden onder de volgens de uitvinding toepasbare koolhydraten in de eerste plaats koolhydraten verstaan, 33 die volgens de levensmiddelenwet zijn toegelaten (zie Kuhnert-On practical grounds, the carbohydrates applicable according to the invention are primarily carbohydrates, 33 which are permitted under the Food Law (see Kuhnert-

Polert-Schroeter "Lebensraittelzusatzstoffe", Deutscher Fachverlag, Frankfurt 1978).Polert-Schroeter "Lebensraittelzusatzstoffe", Deutscher Fachverlag, Frankfurt 1978).

De volgens de uitvinding toe te voegen koolhydraten worden als regel in de gewichtsverhouding 3 ' 1 tot 1 : 100, bij voorkeur i*0 in de gewichtsverhouding 2 : 1 tot 1 : 30, in het bijzonder bij 8100280 5 fc 4 voorkeur 1 : 1 tot 1 : 5, betrokken op het proteïne, toegepast.The carbohydrates to be added according to the invention are as a rule in the weight ratio 3 '1 to 1: 100, preferably i * 0 in the weight ratio 2: 1 to 1: 30, in particular at 8100280 5 fc 4 preferably 1: 1 to 1: 5 based on the protein.

Ook voor de proteasen dient te gelden, zoals reeds vermeld, als dat zij zonder bezwaar ingebeeld kunnen ’worden.The proteases should also apply, as already mentioned, if they can be imagined without objection.

De voorkeur verdienen het pancreasproteïnase, papaïne, voorts 5 alkalische en neutrale bacteriën-proteasen alsmede fungi-proteasen.Preferred are pancreatic proteinase, papain, furthermore alkaline and neutral bacteria proteases as well as fungi proteases.

De dosering bedraagt in het algemeen 0,01 -5 gew.>a, bij voorkeur 0,1-2 gew.iS, in het bijzonder bij voorkeur 0,25 - 1 gew./o, betrekken op het substraat, waarbij vanzelfsprekend de aard en de activiteit van het enzym in aanmerking genomen dient te worden als-10 mede tot een bepaalde graad soort en voorbehandeling van het substraat. Bij de praktische uitvoering van de enzymatische werkv/ijze kan in ruime mate gebruik gemaakt worden van de werkwijzen en ervaringen van de stand der techniek.The dosage is generally 0.01-5 wt.%, Preferably 0.1-2 wt.%, Especially preferably 0.25-1 wt.%, Based on the substrate, the nature and activity of the enzyme should be taken into account as well as up to a certain degree of type and substrate pretreatment. In the practical implementation of the enzymatic process, extensive use can be made of the methods and experiences of the prior art.

De werkwijze volgens de uitvinding zal aan de hand van een 15 voorbeeld van de bereiding van een hydrolysaat uit caseïne nader toegelicht worden:The method according to the invention will be further elucidated on the basis of an example of the preparation of a hydrolyzate from casein:

Caseïne kan in het zure pH-traject, zoals reeds vermeld, door enzymatische hydrolyse niet voor 100 % in oplossing worden gebracht, zonder dat een intensieve bitter-sraaak optreedt. Zoals 20 reeds vastgesteld beïnvloedt het enzym deze bevinding niet op beslissende wijze. Omdat het vermogen, een bittere smaak waar te nemen, van individu tot individu enigszins varieert, diende de smaakproef door een en dezelfde proefpersoon zo mogelijk in een vergelijkbare toestand te worden uitgevoerd.Casein cannot be 100% solubilized by enzymatic hydrolysis in the acidic pH range, as already mentioned, without an intensive bitter touch occurring. As has already been established, the enzyme does not decisively influence this finding. Since the ability to perceive a bitter taste varies slightly from individual to individual, the taste test should be conducted in a similar condition by one and the same subject, if possible.

25 3r werd telkens als volgt te werk gegaan: Het verloop van de enzymatische hydrolyse wordt door titratie met loog (1 N NaOK) gecontroleerd en een titratie-curve wordt opgesteld. Gelijktijdig wordt het optreden van de bittere smaak afhankelijk van de incubatietijd (proefname ongeveer elke 2 minuten) bepaald, zodat het 50 als nbitterpunt!' aangeduide, voor het eerst optreden van de bittere smaak telkens met het bijbehorende punt op de titratie-curve en daarmee öe corresponderende hyörolysegraad van het proteïne gecorreleerd kan worden.The procedure was always as follows: The course of the enzymatic hydrolysis is checked by titration with caustic solution (1 N NaOK) and a titration curve is drawn up. At the same time, the occurrence of the bitter taste is determined depending on the incubation time (test approximately every 2 minutes), so that it is 50 as bitter point! ' indicated, the first occurrence of the bitter taste in each case can be correlated with the corresponding point on the titration curve and the corresponding degree of hyolysis of the protein.

Voor de bepaling van de oplosbaarheid van het proteïne wordt 35 de proteine-oplossing met een verdund zuur op een pH van 5 gebracht en ter activering van de enzymen tot 90 - 100°C verhit.To determine the solubility of the protein, the protein solution is brought to a pH of 5 with a dilute acid and heated to 90-100 ° C to activate the enzymes.

Het bij de pH 5 optredende proteïne-neerslag wordt gecentrifugeerd en het proteïne-gefealte in het restant wordt met behulp van de hiureet-methode bepaald.The protein precipitate which occurs at pH 5 is centrifuged and the protein defect in the remainder is determined by the hiureet method.

kO Gevonden werd nu, dat volgens de werk’vijze van de uitvinding 8 1 00 2 8 0 * - 6 door toevoeging van koolhydraten aan de enzymatische uitgangspro- dukten een zeer grote hydrolyse-graad bereikt kan worden voordat de bittere smaak optreedt. De in de volgende voorbeelden gevonden resultaten zijn in de volgende tabel samengevat: 5 Afbraak van caseïne met pancreasproteïnase A bij _pH 8,5 (0,5 betrokken op caseïne)_It has now been found that, according to the method of the invention, a very high degree of hydrolysis can be achieved before the bitter taste occurs by adding carbohydrates to the enzymatic starting products. The results found in the following examples are summarized in the following table: 5 Degradation of casein with pancreatic proteinase A at _pH 8.5 (0.5 based on casein) _

Substraat Bij het bitterpunt Incubatie- % oplosbaar pro- tijd teïne , .Substrate At the bittering point Incubation% soluble pro time tein,.

(nun.)(nun.)

bij pH 5 ml NaOIIat pH 5 ml NaOII

caseïne (5/0 37 1,2 7 caseïne (5$) + 3°f° maltodextrine 51 2,4 16 ·· * \ caseïne (5/0 + 2% alginezuur 55 2,4 18 caseïne (5/0 + 2% opl. zetmeel tot 70 > 4)0 % 60 caseïne (5/0 + 2°/o pectinezuur 56 4»0 32 *) caseïne (3%) + 1# appelpectine 55 3j4 24 ·· *) caseine (3%) + 1% guar 3»3 24 caseïne (5%) + 2°/o carrageen 2,3 15casein (5/0 37 1.2 7 casein (5 $) + 3 ° f ° maltodextrin 51 2.4 16 ·· * \ casein (5/0 + 2% alginic acid 55 2.4 18 casein (5/0 + 2% sol starch to 70> 4) 0% 60 casein (5/0 + 2 ° / o pectic acid 56 4 »0 32 *) casein (3%) + 1 # apple pectin 55 3j4 24 ·· *) casein (3 %) + 1% guar 3 »3 24 casein (5%) + 2 ° / o carrageenan 2.3 15

Afbraak van caseïne met alk.bacterienproteïnase _bij pH 8,5 (1 /0 betrokken op caseïne)_____Degradation of casein with alkbacteria proteininase _ at pH 8.5 (1/0 based on casein) _____

Substraat Bij het bitterpunt Incubatie- % oplosbaar pro- tijd teïne , .Substrate At the bittering point Incubation% soluble pro time tein,.

(mm.)(mm.)

bij pH 5 ml NaOHat pH 5 ml NaOH

caseïne (5%) 39 1,2 10 ♦* ♦ \ caseïne (3%) + 2% opl. zetmeel 63 2,9 33 ·· * \ caseine (5%) + 2% pectinezuur 65 2,7 40 .. * > caseine (5%) + 1$ appelpectine 3,8 39 caseïne (3%) + guar J 3,1 31 *) betrokken op caseïne-oplossing 8100280 Ύ'-- ƒ .7casein (5%) 39 1.2 10 ♦ * ♦ \ casein (3%) + 2% sol. starch 63 2.9 33 ·· * \ casein (5%) + 2% pectic acid 65 2.7 40 .. *> casein (5%) + 1 $ apple pectin 3.8 39 casein (3%) + guar J 3 , 1 31 *) based on casein solution 8100280 Ύ '- ƒ .7

Afbraak van caseïne met neutraal bacteriénproteinase (0,5 ίο) (bacteriënprotease ΓΓ) bij pK 6,5Degradation of casein with neutral bacterial proteinase (0.5 ίο) (bacteria protease ΓΓ) at pK 6.5

Substraat Bij het bitterpunt Incubatie- % oplosbaar pro- tijd teïne , . \ (mm.) bij pïï 5 ml NaOÏÏ caseïne (5¾) 44 0,5 30 caseïne (5¾) + 2¾ opl. zetmeel 56 0,8 45Substrate At the bittering point Incubation% soluble pro time tein,. (mm.) for 5 ml of NaOI casein (5¾) 44 0.5 30 casein (5¾) + 2¾ sol. starch 56 0.8 45

Afbraak van caseïne met fungi-protease (0,5 ;s) (uit A» oryzae) bij pH 8,5Degradation of casein with fungi protease (0.5; s) (from A »oryzae) at pH 8.5

Substraat Bij het bitterpunt Incubatie- fo oplosbaar pro- tijd teïne , . % (mm. jSubstrate At the bitter point Incubation fo soluble pro time tein,. % (mm. j

bij pH 5 ml NaOEat pH 5 ml NaOE

caseïne (5¾) 50 2,7 15 caseïne (5¾) + 2¾ opl. zetmeel 88 3»6 23 *casein (5¾) 50 2.7 15 casein (5¾) + 2¾ sol. starch 88 3 »6 23 *

Afbraak van caseïne met zure fungi-protease (5 50 (uit A. niger) bij pH 6,5Degradation of casein with acidic fungi protease (5 50 (from A. niger) at pH 6.5

Substraat Bij het bitterpunt Incubatie- % oplosbaar pro- tijd teïne , . % (mm.)Substrate At the bittering point Incubation% soluble pro time tein,. % (mm.)

bij pïï 5 ml NaOHat 5 ml of NaOH

caseïne (5¾) 30 0,5 30 caseïne (5¾) + 2¾ opl. zetmeel 40 1,9 45 *) betrokken op caseïne-oplossing 8100280 ~ ......- . ..... acasein (5¾) 30 0.5 30 casein (5¾) + 2¾ sol. starch 40 1.9 45 *) based on casein solution 8100280 ~ ......-. ..... a

Voorbeelden:Examples:

Enzymatische hydrolyse van de proteïnen, a. Toegepaste·apparatuurEnzymatic hydrolysis of the proteins, a. Applied equipment

Metrohm pH-staat-eenheid met, 5 1. pH-meter E 603, Fa. Metrohm, Herisau 2. Impulsomat S 473, Metrohm, Herisau 3. Dosimat E 535/4, Fa· Metrohm, Herisau schrijver thermostaatreservoir (ifO°C) 10 2 roermotoren 2 prope-llerroerdeis' (0 = 4 cm , 0 = 1 cm) fotometer (540 nm) centrifuge (<·^ 4200 opm) ïïltra-Turrax 15 b. Toegepaste enzymen.Metrohm pH state unit with .5 1. pH meter E 603, Fa. Metrohm, Herisau 2. Impulsomat S 473, Metrohm, Herisau 3. Dosimat E 535/4, Fa · Metrohm, Herisau writer thermostat reservoir (ifO ° C) 10 2 stirring motors 2 propeller stirrer requirements (0 = 4 cm, 0 = 1 cm ) photometer (540 nm) centrifuge (<4200 rpm) Îltra-Turrax 15 b. Applied enzymes.

Pancreasprotease APancreatic protease A

alkal. bacteriënproteïnase, alkal. fungi-proteinase neutrale - " - , zure fungi-proteïnase c. Uitvoering van de proef.alkal. bacteria proteinase, alkal. fungi-proteinase neutral -, - acidic fungi-proteinase c. Test run.

2020

In 220 ml gedestilleerd water worden bij kamertemperatuur onder toepassing van de Ïïltra-Turrax 11 g caseïne respectievelijk hatrium-caseïnaat geroerd en met 6 N NaOH op de gewenste pH-waarde gebracht (overeenkomend met het pH-optimum van de enzymwerking). Als gunstig is 4 uren bewaren bij kamertempera-23 tuur gebleken; de oplossing kan evenwel ook een nacht worden bewaard.11 g of casein and hatrium caseinate are stirred at room temperature in 220 ml of distilled water at room temperature and adjusted to the desired pH value with 6 N NaOH (corresponding to the pH optimum of the enzyme action). Storage at room temperature for 23 hours has been found to be favorable; however, the solution can also be stored overnight.

De oplossing wordt in een temperatuur regelbaar reactiereser-’ voir van ongeveer 250 ml gebracht, met 700 - 100 omwentelingen per minuut geroerd, op 40°C gebracht en de pH wordt even--30 tueel nageregeld. Vervolgens worden 3 ral van een enzymoplos- sing toegevoegd, die bij de verdunning in het milieu de gewenste enzymconcentratie betrokken op het substraat (bijvoorbeeld 0,5 %> respectievelijk 1,0 % betrokken op het caseïne) geeft. De door de enzymatische hydrolyse vrijgemaakte amino-35 zuren respectievelijk oligopeptiden worden met 1 N NaOH door middel van de pH-staat getitreerd (constante pH). Het verbruik aan natriumhydroxide wordt voortdurend door de schrijver opgetekend. De smaakverandering wordt door een met een interval van 2 minuten uitgevoerde proefneming en beproeving 8100280 g ^ ===-^- gevolgd. Voor de bepaling van de oplosbaarheid van het proteïne worden door de enzymto©voeging (nulwaarde) elke 15 minuten en bij het bitterpunt 20 ml aan het reactiereservoir onttrokken, met ^ N zoutzuur ingesteld en in het waterbad 5 tot 90 - 100°C verwarmd. (Men brengt daartoe de ingestelde suspensie in een reagensglas, dat vooraf reeds in een kokend waterbad stond en laat ongeveer 10 - 15 minuten in het waterbad staan).The solution is placed in a temperature adjustable reaction vessel of about 250 ml, stirred at 700-100 rpm, brought to 40 ° C and the pH adjusted optionally. Then 3 rals of an enzyme solution are added, which, upon dilution in the environment, give the desired enzyme concentration relative to the substrate (e.g. 0.5%> 1.0% based on the casein, respectively). The amino-35 acids or oligopeptides released by the enzymatic hydrolysis are titrated with 1 N NaOH by means of the pH state (constant pH). The sodium hydroxide consumption is continuously recorded by the author. The change in taste is followed by a trial and test of 8100-280 g ^ === - ^ - performed at an interval of 2 minutes. To determine the solubility of the protein, 20 ml are withdrawn from the reaction vessel by the enzyme addition (zero value) every 15 minutes and at the bittering point, adjusted with 1N hydrochloric acid and heated in the water bath from 5 to 90-100 ° C. (The adjusted suspension is placed in a reagent glass previously placed in a boiling water bath and left to stand in the water bath for about 10-15 minutes).

Worden de proeven vervolgens als toevoegsels aan vruchtensap-10 pen toegepast, dat moet citroenzuur voor het instellen toe gepast worden. Alle verkregen proeven worden na het terugstellen op een pH van 5 bij if200 omwentelingen/minuut gecentrifugeerd. Het restant wordt voor de proteïne-bepaling gebruikt.If the tests are then used as additives to fruit juices, citric acid must be used before adjustment. All the tests obtained are centrifuged after resetting to a pH of 5 at if200 rpm. The remainder is used for the protein determination.

De proteïne-bepaling heeft plaats volgens de biureet-methode 15 * (gemodificeerd volgens A.G. Gornall c.s., J. Biol. Chem. 177, (19^9) 751 : S gecorrigeerd = - (E^ + E^) E^ = extinctie van de proef, E^ = eigen kleur van de proefoplossing, E^ = eigen kleur van de kopersulfaat-oplossing.The protein determination is carried out according to the biuret method 15 * (modified according to AG Gornall et al., J. Biol. Chem. 177, (19 ^ 9) 751: S corrected = - (E ^ + E ^) E ^ = extinction of the test, E ^ = own color of the test solution, E ^ = own color of the copper sulphate solution.

d. Resultaten.d. Results.

2020

De proefresultaten kunnen uit de voorafgaande tabel ontleend worden. Het bitterpunt wordt bij een aanzienlijk hoger percentage aan oplosbaar proteïne vastgesteld dan bij afwezigheid van het volgens de uitvinding mede toegepaste koolhydraat. In het geval van de caseïne-hydrolyse door middel van pc ^ pancreasproteïnase A kan bij toepassing van 2 % oplosbaar zet meel een vrijwel dubbel zo grote omzetting tot oplosbaar proteïne plaats hebben, voordat het bitterpunt bereikt wordt.The test results can be taken from the previous table. The bitter point is determined at a considerably higher percentage of soluble protein than in the absence of the carbohydrate co-used according to the invention. In the case of the casein hydrolysis by means of pc pancreatic proteinase A, when using 2% soluble starch, conversion to soluble protein can be almost twice as high before the bittering point is reached.

Van doorslaggevende praktische betekenis is intussen, dat tot ongeveer 70 # van het caseïne (met fungi-protease zelfs aan-30 zienlijk meer) op deze wijze tot proteinehydrolysaten kan worden omgezet, die volgens de tot nu toe verkregen resultaten onbeperkt voor de voeding geschikt zijn.In the meantime, it is of decisive practical importance that up to about 70% of the casein (with fungi protease even considerably more) can be converted in this way into protein hydrolysates, which according to the results obtained so far have unlimited nutritional value. .

81002808100280

Claims (13)

1. Werkwijze ter bereiding van voor de voeding geschikte hydrolysaten uit proteïne-substraten door hydrolyse onder toepassing van proteolytische enzymen, m e t het k en m e r k, 5 dat men gelijktijdig met de proteolytische enzymen oplosbare koolhydraten en/of in water sterk opzwelbare koolhydraten toevoegt.1. Process for the preparation of food-grade hydrolysates from protein substrates by hydrolysis using proteolytic enzymes, characterized in that soluble carbohydrates and / or water-swellable carbohydrates are added simultaneously with the proteolytic enzymes. 2. Werkwijze volgens conclusie 1 voor de bereiding van hydrolysaten uit proteïne-substraten zonder bittere smaak met een ten opzichte van het bij niet-gemodificeerde enzymatische afbraak bij 10 het bitterpunt vastg^stelde gehalte aan oplosbare hydrolyse-produk-ten van het proteïne aanzienlijk verhoogde gehalte, m et het kenmerk, dat men gelijktijdig met de proteolytische enzymen oplosbare koolhydraten en/of in water sterk opzwelbare koolhydraten gebruikt en de hydrolyse tot nog beneden het met de gemodifi- 15 ceerde enzymatische afbraak overeenkomende bitterpunt uitvoert.2. Process according to claim 1 for the preparation of hydrolyzates from protein substrates without bitter taste, with a significantly increased content of soluble hydrolysis products of the protein compared to the content of soluble hydrolysis products of the protein, determined in the case of unmodified enzymatic degradation. content, characterized in that soluble carbohydrates and / or water-swellable carbohydrates are used simultaneously with the proteolytic enzymes and the hydrolysis is carried out to below the bitter point corresponding to the modified enzymatic degradation. 3. Werkwijze volgens conclusies 1 en 2, met het kenmerk, dat men als proteïne-substraat caseïne en/of soja-proteïne en/of proteïne uit granen respectievelijk mais toepast.Process according to claims 1 and 2, characterized in that casein and / or soy protein and / or protein from cereals or corn are used as the protein substrate. 4. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 3, 'met het 20 kenmerk, dat de gewichtsverhouding koolhydraat tot proteïne-substraat 3 : 1 tot Ί : 100, bij voorkeur 2 : 1 tot 1 : 30, in het bijzonder bij voorkeur 1 : 1 tot 1 : 5 bedraagt.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the weight ratio of carbohydrate to protein substrate is 3: 1 to Ί: 100, preferably 2: 1 to 1: 30, in particular preferably 1: 1 to 1: 5. 5. Werkwijze volgens conclusies 1 tot If, m e t het kenmerk, dat men als koolhydraat oplosbaar zetmeel toepast.5. Process according to claims 1 to If, characterized in that soluble starch is used as carbohydrate. 6. Werkwijze volgens conclusies 1 tot if, met het kenmerk, dat men als koolhydraat maltodextrine toepast.6. Process according to claims 1 to if, characterized in that maltodextrin is used as carbohydrate. 7. Werkwijze volgens conclusies 1 tot if, met het kenmerk, dat men als koolhydraat alginezuur toepast.Process according to Claims 1 to if, characterized in that alginic acid is used as carbohydrate. 8. Werkwijze volgens conclusies 1 tot if, met het 30 kenmerk, dat men als koolhydraat guar respectievelijk Johannisbroodpitmeel toepast.8. Process according to claims 1 to if, characterized in that guar or locust bean gum are used as carbohydrate. 9. Werkwijze volgens conclusies 1 tot if, met het kenmerk, dat men als koolhydraat carrageen respectievelijk carragenaten toepast.Process according to Claims 1 to if, characterized in that the carbohydrate used is carrageenan or carrageenates. 10. Werkwijze volgens conclusies 1 tot if, met het kenmerk, dat men als koolhydraat pectine respectievelijk pectinezuur toepast.Process according to Claims 1 to 1, characterized in that the carbohydrate used is pectin or pectic acid. 11. Werkwijze volgens conclusies 1 tot if, met het kenmerk, dat men als koolhydraat oplosbare cellulosederi- 40 vaten toepast. 810028011. Process according to claims 1 to 1, characterized in that as carbohydrate soluble cellulose derivatives are used. 8100280 12. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 4, met het kenmerk, dat men als koolhydraat tragant toepast. 1J. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 12, met het kenmerk, dat de hydrolyse tot een gehalte aan oplosbare 5 hydrolyse-produkten van het proteïne, dat ten minste 10 % hoger ligt dan het bij de niet-gemodificeerde enzymatische hydrolyse bij het bitterpunt vastgestelde gehalte, wordt uitgevoerd.Process according to claims 1 to 4, characterized in that tragant is used as carbohydrate. 1J. Process according to claims 1 to 12, characterized in that the hydrolysis to a content of soluble hydrolysis products of the protein, which is at least 10% higher than the content determined in the unmodified enzymatic hydrolysis at the bitter point, executed. 14. Werkwijze volgens conclusie 5i met het kenmerk, dat de hydrolyse tot een gehalte aan oplosbare hydrolyse-10 produkten van het proteïne, dat ten minste 20 % hoger ligt dan het bij da niet-gemodificeerde enzymatische hydrolyse bij het bitterpunt vastgestelde gehalte, wordt uitgevoerd. * Jfc jz * * 810028014. Process according to claim 5i, characterized in that the hydrolysis is carried out to a content of soluble hydrolysis products of the protein, which is at least 20% higher than the content determined at the bitter point in the unmodified enzymatic hydrolysis. . * Jfc jz * * 8100280