NL7920107A - Van beta-glucuronidase-activiteit en/of ph afhankelijke farmaceutische preparaten, werkwijzen ter bereiding daarvan en toepassing daarvan voor de selectieve behandeling van ziekten. - Google Patents

Description

i S 5709-1 PCT.

79 2 0 1 0 7

Van β-glucuronidase-activiteit en/of pH afhankelijke farmaceutische preparaten, werkwijzen ter bereiding daarvan en toepassing daarvan voor de selectieve behandeling van ziekten.

Technisch gebied

De uitvinding heeft betrekking op de behandeling van tumoren, die β-glucuronidase-activiteit vertonen, met behulp van glucuroniden met toxische aglyconen en meer in het bijzonder op een verbetering van dergelijke 5 werkwijzen, waarbij scbade aan de nieren wordt uitgeschakeld. De toxische aglyconen kunnen een nitrilegroep bevatten. De uitvinding heeft verder betrekking op de behandeling van bepaalde bacteriënirifecties met β-glucuro-nidase-activiteit. Voorts heeft de uitvinding betrekking op een nieuwe klasse van glucuroniden, waarvan de activiteit van de aglyconen of de op-10 losbaarheid in water afhankelijk is van de pH, benevens op een werkwijze ter bereiding van dergelijke glucuroniden. Tevens heeft de uitvinding betrekking op een nieuw, nitrilegroep bevattend glucuronide. Ten slotte heeft de uitvinding eveneens betrekking op een diagnostische urinalyseproef, waarmee de aanwezigheid van tumoren met β-glucuronidase-activiteit bepaald 15 kan worden.

Achtergrond van de stand der techniek

In de literatuur zijn vele verslagen verschenen over de algemene conceptie om een direkt transport van een voor tumorcellen giftig middel te verschaffen naar tumoren met β-glucuronidase-activiteit door het middel te 20 koppelen met glucuronzuur. Onder dergelijke verslagen zijn te noemen: M. Von Ardenne c.s. Agressologie, 1976, 17, 5, 261-264; DDR-octrooischrift 122.386; Duits Offenlegungsschrift 22 12 014; Sweeney c.s., Cancer Research, 31, 477-478, april 1971; Baba c.s., Gann, 69, 283-284, 1978; en C.R. Ball, Blochem. 'Pharm., 23, 3171-3177 (1974).

25 Het artikel van Von Ardenne stelt algemeen vele soorten aglyconen voor, die gekoppeld kunnen worden aan glucuronzuur en actief zullen zijn ter plaatse van de tumor. Deze omvatten in het algemeen alkyleringsgroepen, antimetabolieten, cytotoxinen, membraan-actieve (lytische) groepen, stimuleringsmiddelen voor de glycolyse, ademhalingsremmers, anorganische en 30 organische zuren en middelen voor het stoppen van de celcyclus. Het DDR-octrooischrift suggereert eveneens vele van dergelijke combinaties, waaronder 5-fluoruracil-glucuronide, methotrexaat-glycyronide, 6-mercapto-pureen-glucuronide, aniline-mosterd-glucuronide en vele andere. Het Duitse Offenlegungsschrift noemt ook een groot aantal glucuroniden. Het artikel 35 van Sweeney heeft betrekking op de anti-tumorwerkzaamheid van mycofenol-zuur^-D-glucuroniden. Het artikel van Baba heeft betrekking op de anti- 7920107 ή - 2 - tumorwerkzaamheid van 5-fluoruracil-O-β-D-glucuronide en het artikel van Ball heeft betrekking op de anti-tumorwerkzaamheid van p.hydroxyaniline-mosterd-glucuronide.

Ook is beschreven, dat de selectiviteit van dit transportmechanisme 5 verbeterd kan worden door hyperacidificatie van de tumorcellen. Het bovengenoemde artikel van Von Ardenne, benevens het DDR-octrooischrift erkennen duidelijk het belang en de uitvoerbaarheid van hyperacidificatie van de tumorcellen bij toepassing van het gluruconidemechanisme. Het artikel van Von Ardenne spreekt van een methode, die een pH-verschil van ten minste 10 1 pH-eenheid geeft en derhalve als basis voor selectiviteit kan worden toe gepast. Het artikel heeft betrekking op het bereiken van omstandigheden van een constante toestand na hyperacidificatie, waarbij de pH van de hersenen 7,0 en de pH van het tumorweefsel circa 5,5 - 6,0 bedraagt. Zie ook M. Von Ardenne c.s., Pharmazie, 32 (2): 74-75, 1977.

15 ü. Bicker, Nature, 252, december 20-27, 1974, blz. 726-727, merkt in het bijzonder op, dat lysosomaal enzym β-glucuronidase een optimale pH van 5,2 bezit en dat ter verkrijging van een anti-tumorwerkzaamheid van glucuro-niden de pH verlaagd moet worden, bijvoorbeeld door toediening van glucose. Er wordt een nadere beschrijving gegeven van experimenten, die aantonen, 20 dat de hyperacidificatie door glycose nodig is om een aanmerkelijke ontkoppeling van glucuroniden te verkrijgen.

Zelfs met hyperacidificatie van de tumorcellen volgens bekende methoden, bijvoorbeeld door toediening van glucose, bestaat er echter nog een moeilijkheid, namelijk dat andere organen en lichaamsweefsels, die een 25 natuurlijk voorkomende hoge β-glucuronidase-activiteit bezitten, eveneens de toxische aglyconen loslaten en zodoende schade veroorzaken aan gezonde weefsels. Dit is vooral een probleem bij de nier, die normaliter een omgeving met zure pH bezit.

In het Britse octrooischrift 788.855 is gesuggereerd, dat mandelo-30 nitrile-β-D-glucuronzuur gebruikt zou kunnen worden voor de behandeling van kwaadaardige gezwellen, aangezien β-glucuronidase overheersend voorkomt in kwaadaardige weefsels en selectief mandelonitrile-β-D-glucuronzuur aantast ter plaatse van de kwaadaardige gezwellen onder afsplitsing van cyaanwaterstof. Het Amerikaanse octrooischrift 2.985.664 heeft eveneens be-35 trekking op mandelonitrile-β-D-glucuronzuur en een werkwijze ter bereiding daarvan. Deze verbindingen zijn door de houders van de bovengenoemde oc-trooischriften Laetrile genoemd.

Het is echter gebleken, dat geen van de werkwijzen ter bereiding van deze verbinding, die in de bovengenoemde octrooischriften vermeld zijn, 7920107

V

- 3 - reproduceerbaar zijn. De onderhavige uitvinder heeft nu gevonden, dat pogingen om prunasine te oxideren het glucuronide van amandelzuur geven, omdat de CN-groep instabiel is. Pogingen om mandelonitrile te condenseren met glucuronzuur of glucuronolacton of tetra-acetylglucuronolacton-haloge-5 nide mislukten, omdat het mandelonitrile de neiging heeft te polymeriseren.

Een artikel door C. Fenselau c.s. in Science 198 (4317) 625-627, 1977, getiteld "Mandelonitrile β-Glucuronide: Synthesis and Characterization" bevestigt dat de in de oorspronkelijke octrooischriften beschreven synthese niet gereproduceerd is. Dit artikel bevestigd eveneens, dat hoevel de naam 10 Laetrile oorspronkelijk was gegeven aan mandelonitrile-β-D-glucuronide, deze verbinding niet voorkomt in de Mexicaanse preparaten, die als Laetrile in de handel worden gebracht. Het hoofdbestanddeel van de thans als Laetrile in de handel gebrachte preparaten is amygdaline, dat gemakkelijk bereid kan : worden uit materiaal van natuurlijke bron, zoals pitten van abrikozen, 15 amandelen en andere leden van de prunusfamilie. Amygdaline kan echter niet door het enzym β-glucuronidase gesplitst worden.

Het artikel van Fenselau beschrijft een werkwijze voor de biosynthese van mandelonitrile β-D-glucuronzuur. Hoewel deze werkwijze bevredigend kan zijn voor de bereiding van de verbinding op laboratoriumschaal, is een der-20 gelijk biosynthetische werkwijze zonder twijfel zeer moeilijk en duur te commercialiseren.

De bij de chemische synthese van mandelonitrile β-D-glucuronzuur optredende problemen bestaan ook voor de synthese van ieder glucuronide, waarvan het aglycon een sterke elektronenacceptor is. De reden hiervan is, 25 dat het glucuronide tijdens de klassieke werkwijze gedeconjugeerd (gehydro-lyseerd) wordt.

Voordat een glucuronidebehandeling wordt toegepast, moet er een diagnose zijn van tumoren met β-gluronidase-activiteit. De literatuur (bijvoorbeeld het bovengenoemde artikel van Sweeney) suggereert het uit-30 voeren van een biopsie om de aanwezigheid van een dergelijk β-glucuronidase te bepalen. Het zou gewenst zijn de aanwezigheid van dergelijke tumoren met β-glucuronidase-activiteit te kunnen bepalen met behulp van een eenvoudige urineproef.

Vermelding van uitvinding 35 De uitvinding beoogt derhalve de bezwaren van het bekende te over winnen .

Ook beoogt de uitvinding een verbeterde behandeling van kwaadaardige gezwellen te verschaffen.

Verder beoogt de uitvinding een verbeterde werkwijze te verschaffen 7920107

V

- 4 - voor de behandeling van kwaadaardige gezwellen met een grote β-glucuroni-dase-activiteit.

Voorts beoogt de uitvinding een dergelijke verbeterde werkwijze te verschaffen, die selectief toxisch is voor tumorcellen, maar gezond weef-5 sel niet schaadt.

Daarnaast beoogt de uitvinding een dergelijke verbeterde werkwijze te verschaffen, waarbij de tumorcellen selectief behandeld worden met nitrile-groepen bevattende verbindingen met daarbij optredende therapie, ten einde de mogelijkheid van cyanidevergiftiging in de rest van het lichaam te ver-10 mijden.

Bovendien beoogt de uitvinding nieuwe verbindingen en farmaceutische preparaten te verschaffen, die een zeer geringe toxiciteit bezitten voor het organisme als geheel, maar zeer sterk selectief toxisch zijn voor tumorcellen en in het bijzonder voor tumorcellen met een grote β-glucuroni-15 dase-activiteit.

Tevens beoogt de uitvinding een diagnostische methode te verschaffen onder toepassing van radioactieve isotopen voor het selectief merken van tumorcellen, zodat zowel primaire tumorcellen als metastasen exact geloca-liseerd kunnen worden. Daarbij beoogt de uitvinding tevens een werkwijze 20 te verschaffen ter bereiding van de verbindingen, die bij dergelijke be-handelingsprocessen toegepast kunnen worden. Nog verder beoogt de uitvinding een werkwijze te verschaffen ter bereiding van mandelonitrile-β-Ο-glucuronzuur door een totale chemische synthese.

Verder beoogt de uitvinding een werkwijze te verschaffen voor het on-25 derzoek van de urine ten einde de aanwezigheid van tumoren met β-glucuro-nidase-activiteit te bepalen.

Voorts beoogt de uitvinding een werkwijze en mengsels te verschaffen voor de behandeling van bacterie-infecties, wanneer de bacteriën β-glucuro-nidase-activiteit vertonen.

30 Deze en andere doeleinden van de uitvinding zullen duidelijker worden met behulp van de onderstaande algemene en meer gedetailleerde beschrijving van de uitvinding.

Gevonden werd nu, dat de selectiviteit van glucuronideverbindingen ten opzichte van tumoren sterk verhoogd kan worden en dat de mogelijke 35 ontkoppeling van de toxische aglyconen in normale delen van het lichaam sterk verminderd kan worden door aan de patiënt vóór of gelijktijdig met de toediening van het glucuronide een alkaliniserend middel toe te dienen, dat de pH in de rest van het lichaam op een waarde van circa 7,4 houdt.

Het is bekend, dat bij een pH van 7,4 en hoger de β-glucuronidase-activiteit 7920107 > - 5 -

V

vrijwel nihil is. Zodoende zal de toediening van alkalisch makende middelen, zoals bicarbonaten of andere basische zouten, de β-glucuronidase-activiteit, die op natuurlijke wijze voorkomt in bepaalde gezonde weefsels, zoals de nieren, de milt en de lever, sterk verminderen of uitschakelen.

5 Een dergelijke toediening van alkaliniserend middel vermindert echter niet de aciditeit van de tumorcellen zelf wegens de natuurlijke lage pH van de tumorcellen, het mechanisme van voorafgaande hyperacidificatie en het gebrek aan aanmerkelijke bloedperfusie door de tumorgebieden, benevens door andere mogelijke mechanismen. In de literatuur is zelfs gesuggereerd, dat 10 bicarbonaat in feite de aciditeit van de kankercellen zal verhogen; P.M. Gullino c.s., J.N.C.I., 34, 6, 857-869 (1965).

Aangezien de β-glucuronidase-activiteit van de tumorcellen verhoogd wordt door zuur maken en de β-glucuronidase-activiteit van de rest van het lichaam, in het bijzonder van de nieren, in sterke mate wordt uitgeschakeld 15 door alkilinisatie, worden de toxische aglyconen uitsluitend vrijgemaakt op de plaats van het gezwel zelf, ten gevolge van de ontkoppeling van de glucuronide door inwerken van β-glucuronidase. Zonder de stap van het alkalisch maken kunnen aanzienlijke hoeveelheden toxische materialen vrijgemaakt worden, bijvoorbeeld in de nieren, en de zo vrijgekomen toxische 20 aglyconen kunnen aanmerkelijke schade aan deze organen veroorzaken. Zodoende kan men uitsluitend door toepassing van de uitvinding glucuroniden van verbindingen, die toxisch zijn voor tumorcellen, klinisch met een grote mate van veiligheid toepassen. Hoe groter de toxiciteit van de aglyconen, des te belangrijker is de alkalinisatiestap.

25 Een verder kenmerk van de uitvinding is de toepassing van bepaalde nieuwe glucuronideverbindingen, die bijzonder geschikt zijn voor toepassing bij de uitvinding wegens het aanzienlijke pH-verschil tussen de tumorcellen en het omringende gezonde weefsel. Als het aglycon actiever is bij een lagere pH of niet-polair is in zure toestand en uitsluitend polair wordt 30 in alkalische omstandigheden, dat wil zeggen dat het aglycon. oplosbaar in water is bij pH-waarden boven circa 7 en oplosbaar in vet is bij pH-waarden beneden 7, wordt de selectiviteit van de uitvinding verder verhoogd. Onder toepassing van deze nieuwe verbindingen is, zelfs als er elders in het lichaam een deconjugatie optreedt, het aglycon in water oplosbaar ten ge-35 volge van de alkalische pH en wordt het snel uit het systeem gespoeld. In het lage traject van de hypergeacidificeerde tumorcellen wordt het aglycon echter daadwerkelijk aan de tumorcellen gehecht en niet oplosbaar gemaakt en weggespoeld. Zelfs als een zekere hoeveelheid aglycon verwijderd raakt van de plaats van de tumorcellen, komtdeze hoeveelheid direkt in een alka- 7920107 > - 6 - lische omgeving en wordt derhalve in water oplosbaar, zodat het materiaal snel uit het lichaam verwijderd wordt.

Onder de nieuwe glucuroniden van deze soort zijn .te noemen: 2.4-di-nitrofenol-β-D-glucuronzuur, 4-chloor m.cresol-p-D-glucuronzuur, 4.6-di-5 nitro o.cresol-β-D-glucuronzuur, 4-chloor 3.5-xylanol-β-D-glucuronzuur, chloorthymol-β-D-glucuronzuur, 2-fenyl 6-chloorfenol-β-D-glucuronzuur, 5-chloor 7-jood 8-chinolinol-β-D-glucuronzuur en podofyllotoxine^-D-glu-curonzuur. Het chloor-m.cresol-β-D-glucuronzuur is van bijzonder belang, aangezien het in alkalische omgeving daadwerkelijk zijn toxische activiteit 10 verliest.

Afgezien van de bruikbaarheid bij een anti-tumorbehandeling, bezitten deze nieuwe verbindingen en alle andere glucuronideverbindingen met cyto-toxische aglycohen ook een antibacteriële werkzaamheid, in het bijzonder tegen soorten van bacteriën met glucuronidase-activiteit. Zo is bijvoor- ::·· 15 beeld bekend, dat streptococcus-, staf.ylococcus- en E. coli-bacteriën β-glucuronidase-activiteit bezitten. Wanneer derhalve de glucuroniden in contact komen met deze bacteriën, worden zij ontkoppeld en werken de cyto-toxische aglyconen giftig op de bacteriën.

Er is vermeld, dat de optimale pH van het bacteriële β-glucuronidase 20 hoger ligt dan de optimale pH van het β-glucuronidase van normale gezonde inwendige organen, zoals lever, milt, nier enz. Wanneer derhalve het lichaam alkalisch wordt gemaakt volgens de hierboven beschreven methode, wordt de β-glucuronidase-activiteit van de organen in sterke mate uitgeschakeld, terwijl die van de bacteriën ondanks het alkalisch maken nog 25 aanwezig is. Het toegediende glucuronide wordt dan uitsluitend tot zijn actieve vorm gedeconjugeerd ter plaatse van de infectie. Aangezien tumorcellen niet behandeld worden voor deze toepassing, is geen hyperacidificatie-behandeling nodig.

Hoewel de bovenbeschreven glucuronideverbindingen de voorkeur verdie-30 nen voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding, dient erop gewezen te worden, dat de glucuroniden van ieder anti-tumormiddel, met inbegrip van die, welke reeds in de literatuur als geschikt zijn voorgesteld, bij de werkwijze volgens de uitvinding met groter voordeel toegepast kunnen worden, aangezien de selectiviteit daarvan verhoogd wordt door de stap van 35 het alkalisch maken. Niet-beperkende voorbeelden van verbindingen, waarvan er sommige wellicht reeds bekend waren, die eveneens bij de onderhavige uitvinding gebruikt kunnen worden, ook al hadden zij tot dusver geen bekende differentiëring van toxiciteit of oplosbaarheid, die pH-afhankelijk is, zijn: 5-fluoruraci-0-β-D-glucuronzuur, p.hydroxyaniline-mosterd^-D- 7 9 2 0 1 0 7 \ - 7 - \ glucuronzuur, methotrexaat-β-D-glucuronzuur, floxuridine-β-D-glucuronzuur, cytarabine-β-D-glucuronzuur, melfalan-β-D-glucuronzuur, hydroxyureum-β-D-glucuronzuur , adriamycine-β-D-glucuronzuur, Thiouracil-β-D-glucuronzuur, chloorfenol-β-D-glucuronzuur, methacylonitrile-β-D-glucuronzuur, fluorazijn-5 zuur-β-D-glucuronzuur enz.

Andere de voorkeur verdienende glucuronide voor toepassing volgens de uitvinding zijn die, waarvan de aglyconen hun toxische effect uitoefenen op de kankercellen bij het celmembraan. De anti-tumortoxiciteit van vele gebruikelijke anit-kankermiddelen vereist, dat zij tot de kern van de mito-10 chondiën in de cel doordringen. Bij vroegere chemotherapeutische processen voor de behandeling van kanker moesten de geneesmiddelen zo ontworpen worden, dat zij uitsluitend kankercellen aantasten en niet alle andere cellen van het lichaam, waarmee zij in contact komen. Dit is de reden, dat in het verleden bijzondere moeite gedaan is om anti-neoplastische middelen te ont-15 wikkelen, die de celdeling storen. Vele van deze middelen moeten daadwerkelijk de kern van de kankercel binnentreden om werkzaam te zijn. Voor dergelijke middelen moet men derhalve altijd bang zijn, dat zij zonder wijziging door het membraan van de kankercel getransporteerd worden alvorens zij hun toxische effecten kunnen uitoefenen.

20 Bij toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding is het niet van belang, dat de toxiciteit van het middel uitsluitend gericht is tegen kankercellen en niet op alle gezonde cellen van het menselijk lichaam, dank zij het feit dat met de werkwijze volgens de uitvinding het aglycon uitsluitend wordt vrijgemaakt ter plaatse van het kankergezwel. Derhalve is 25 een bijzonder geschikt aglycon een aglycon, dat zijn celtoxiciteit uitoefent door het celmembraan zelf aan te tasten. Op deze wijze behoeft men geen rekening te houden met het transportmechanisme van het middel door het membraan. Doordat het membraan wordt aangetast wordt verder de aard van het membraan gewijzigd en wijzigen zich ook de antigene eigenschappen van de 30 cellen. Derhalve helpt het immunologische systeem van de gastheer het toxische middel om de gastheer van deze cellen te bevrijden. Derhalve moet een veel lagere dosis gebruikt worden.

Voorbeelden van aglyconen, die dit effect uitoefenen, zijn fenol en cresol. Derhalve zijn bijzonder geschikte glucuroniden voor toepassing bij 35 de werkwijze volgens de uitvinding bijvoorbeeld fenol-β-D-glucuronzuur en cresol-β-D-glucuronzuur.

Ook kan men andere stappen nemen om de β-glucuronidase-activiteit bij de tumorcellen te verhogen. Een methode om dit uit te voeren is de temperatuur van de toxische cellen ten tijde van de behandeling te verhogen. Dit 7920107 - 8 - kan geschieden door de temperatuur van het gehele lichaam te verhogen, bijvoorbeeld door toepassing van een pyrogeen middel of door uitsluitend de temperatuur in het gebied van de toxische cellen te verhogen, bijvoorbeeld door straling met microgolven of door elektrische stroom. Een verhoging van 5 de temperatuur verhoogt de β-glucuronidase-activiteit en dit vermeerdert zodoende de doelmatigheid van de deconjugatie van de glucuroniden. Het is bekend, dat de temperatuursverhoging van 3®C tot een verhoging van de β-glucuronidase-activiteit van 50 % leidt.

Als bekende pyrogene middelen zijn te noemen etiocholanolon, progeste-10 ron, dinitrofenol, dinitrocresol enz. Dinitrofenol en dinitrocresol zijn beide ook cytotoxisch, zoals hieronder nader beschreven wordt. Derhalve verdient de toepassing van deze verbindingen de voorkeur, in het bijzonder wanneer zij als het glucuronide worden toegediend. Dit geeft het resultaat, dat als het glucuronide gedeconjugeerd wordt ter plaatse van de tumor, het 15 aglycon niet alleen de werking heeft het eiwit van het cytoplasma te denatureren, maar tevens een direkte temperatuursverhoging te geven in het gebied van de tumorcellen, waardoor de doelmatigheid van verdere deconjugatie sterk verhoogd wordt.

Een plaatselijke hyperthermie in het gebied, dat verdacht wordt van 20 tumorcellen, verdient de voorkeur boven een algemene hyperthermie, omdat een algemene hyperthermie ook de β-glucuronidase-activiteit in gezonde cellen zal verhogen. Wegens de alkalinisatiestap is dit echter geen overwegend probleem. Als de hyperthermie plaatselijk is, verschaft dit een verdere mate van zekerheid, dat de glucuroniden uitsluitend ter plaatse 25 van de tumor gedeconjugeerd worden. De toepassing van een microgolfbehandeling, die gericht is op de van een tumor verdachte plaats, is een geschikte manier om plaatselijke hyperthermie te bereiken. Wegens de verschillende elektrische weerstand van tumorcellen is een andere methode om enige mate van plaatselijke hyperthermie te bereiken het doorleiden van 30 een geringe elektrische stroom door het lichaam.

Een verdere manier om de β-glucuronidate-activiteit selectief bij tumorcellen te verhogen is door toediening van oestrogeen aan vrouwelijke patiënten of van testosteron aan mannelijke patiënten. Er is vermeld, dat deze verbindingen β-glucuronidase-activiteit induceren in trofoblastische 35 cellen. Van bepaalde tumorcellen is bekend, dat zij trofoblastisch zijn; deze methode is derhalve bijzonder geschikt voor die cellen. De stap van het alkalisch maken zal daarbij schade voorkomen voor gezonder trofoblastische cellen.

Een ander kenmerk van de uitvinding heeft betrekking op de werkwijze 7920107 \ - 9 - ter bereiding van de glucuroniden. Er werd gevonden, dat het onmogelijk is om volgens de klassieke methoden conjugaten van glucuronzuur te bereiden, wanneer het aglycon een sterke elektronenacceptor is, aangezien deze verbindingen eerst bereid moeten worden als de methylester van het glucuron-5 zuur en het niet mogelijk is om volgens de klassieke methoden de methylester in het zuur om te zetten zonder het aglycon te deconjugeren. Hoewel bij een verwante werkwijze in het Amerikaanse octrooischrift 2.985.664 bariumethoxide voor dit doel is voorgesteld, werd gevonden dat barium-methoxide niet werkt. Er werd nu echter gevonden, dat wanneer men barium-10 hydroxide gebruikt, de methylester van het aglycon van het glucuronide omgezet kan worden in het bariumzout en dat het bariumzout in het vrije zuur kan worden omgezet met behulp van zwavelzuur zonder deconjugatie van het glucuronide. Bovendien wordt verwijdering van de beschermende acetylgroepen bij deze zelfde stap bereikt, waardoor de noodzaak voor een afzonderlijke 15 stap voor het vervullen van deze functie wordt uitgeschakeld.

Deze nieuwe stap met behulp van bariumhydroxide kan ook worden toegepast bij de chemische synthese van mandelonitrile-β-D-glucuronzuur. Deze werkwijze mislukt echter, wanneer men tracht mandelonitrile-β-glucuronzuur te synthetiseren door te trachten het methyl(tri-O-acetyl a-D-glucopyrano-20 syDhalogehide-uronaat met mendelonitrile te condenseren, omdat het mandelonitrile de neiging heeft te polymeriseren in plaats van de hemi-acetaal-.binding met het glucuronzuur te vormen.

Bij de synthesemethode van mandelonitrile β-D-glucuronzuur volgens de onderhavige uitvinding zet men amandelzuur eerst om in amandelzuuramide 25 door een reactie met gasvormige ammoniak. Het amandelzuuramide wordt daarna met het methyl(tri-O-acetyl β-D-glucopyranosyl)bromide-uronaat omgezet tot de methylester van amandelzuuramide-triacetylglucuronzuur. Deze verbinding kan dan met azijnzuuranhydride gemengd worden, waarbij het amandelzuuramide wordt omgezet in mandelonitrile. Door behandeling met bariumhydroxide en 30 zwavelzuur verkrijgt men het mandelonitrile β-D-glucuronzuur.

Een ander kenmerk van de uitvinding is gelegen in een verdere veiligheidsmaatregel, waardoor de gezonde weefsels van het lichaam beschermd worden tegen mogelijke afgifte van cyaanwaterstof uit nitrilegroepen bevattende aglyconen. Deze maatregel wordt bij voorkeur uitgevoerd naast de 35 bovenbeschreven maatregel voor wat betreft het instellen van de pH. Zelfs met een dergelijke bescherming tegen deconjugatie van het glucuronide in andere delen van het lichaam dan tumoren, heeft men bezorgdheid uitgedrukt over mogelijke cyanidevergiftiging bij toepassing van nitrilegroepen bevattende glucuroniden. Zo werd bijvoorbeeld in een artikel van E.S. Schmidt c.s., 7920107 - 10 - J.A.M.A. 239 (10):943-7, 6 maart 1978 voorspeld, dat er een verhoogd voorkomen van cyanidevergiftiging bij mensen zal optreden, wanneer Laetrile (amygdaline) gemakkelijker beschikbaar komt. Het is niet bekend of het het gehele nitrilegroepen bevattende aglycon, mandelonitrile, is, dat het gif-5 tige effect op de tumorcellen uitoefent of dat het het cyaanwaterstofzuur is, dat vrijkomt bij ontleding van mandelonitrile. Theoretisch neemt men echter aan, dat het het gehele nitrilegroepen bevattende aglycon is, dat het toxische effect op de tumorcellen uitoefent. Derhalve is het van belang de rest van het lichaam te beschermen tegen mogelijke afgifte van 10 cyaanwaterstof uit de nitrilegroepen bevattende aglyconen. Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door gelijktijdige toediening van natriumthio-sulfaat, wanneer men glucuroniden van nitrilegroepen bevattende aglyconen gebruikt. Het is bekend, dat natriumthiosulfaat een tegengif is voor cyanidevergiftiging. Natriumthiosulfaat zet bij aanwezigheid van het enzym 15 rodanase cyaanwaterstof om in natriumthiocyanaat.

Aangenomen wordt, dat de gelijktijdige toediening van natriumthiosulfaat om twee redenen de toxiciteit van het aglycon ter plaatse van het kankergezwel niet beïnvloedt. In de eerste plaats tast natriumthiosulfaat zelfs bij aanwezigheid van rodanase het mandelonitrilemolecuul zelf niet 20 aan. Wanneer het derhalve het gehele mandelonitrilemolecuul is, dat toxisch is voor de kankercellen, zal de aanwezigheid van natriumthiosulfaat deze toxiciteit niet nadelig beïnvloeden. Zelfs als het het cyaanwaterstof is, dat toxisch is voor de kankercellen wanneer dit vrijkomt ter plaatse van de kankercellen, is voorts in de literatuur gesuggereerd, dat kankercellen 25 geen rodanase bevatten, zie M. Lupo c.s., "Critical Review of Studies on Malignant Diseases", Minerva Med. 67 (30) 1973-1981, 1976. Derhalve beschermt de gelijktijdige toediening van natriumthiosulfaat normale cellen tegen cyanidevergiftiging, maar heeft geen nadelige invloed op de aantasting van de tumorcellen door het cyanide.

30 Wegens het betrekkelijk ontbreken van toxiciteit van glucuronide- verbindingen en wegens het mechanisme van de uitvinding, waardoor het toxische aglycon uitsluitend vrijkomt ter plaatse van de tumor en voorts in verband met de bescherming die de uitvinding biedt tegen mogelijke afgifte van cyaanwaterstof op andere delen van het lichaam, is het volkomen 35 mogelijk glucuroniden of andere toxische nitrilegroepen bevattende aglyconen toe te passen bij de werkwijze volgens de uitvinding. Een dergelijke verbinding is methacrylonitrile-p-D-glucuronzuur.

Wegens het zuur-alkalische verschil tussen de tumorcellen en de rest van het lichaam, dat met de werkwijze volgens de uitvinding bereikt kan 7920107 - 11 - worden, is het mogelijk bepaalde verbindingen te gebruiken, die cytoplas-mische eiwitten denatureren of de energietoevoer van de cellen direkt beïnvloeden zonder dat het glucuronzuur eerst geconjugeerd wordt. Dit kan echter alleen worden uitgevoerd, als de verbinding er een is, waarvan de 5 activiteit of oplosbaarheid afhankelijk is van de pH. Voorbeelden van dergelijke verbindingen zijn 2.4-dinitrofenol, chloor m.cresol, 4.6-dinitro o.cresol, 4-chloor 3.5-xylanol, chloorthymol, 2-fenyl 6-chloorfenol, 5-chloor 7-jood 8-chinolinol en podofyllotoxine. De toepassing van deze verbindingen direkt zonder ze eerst met glucuronzuur te conjugeren zou 10 bijzonder waardevol zijn bij de behandeling van tumoren, waarvan geen p^glucuronidase-activiteit is aangetoond.

Een ander kenmerk van de uitvinding heeft betrekking op de uiterst hoge tumorselectiviteit, die volgens de uitvinding bereikt kan worden. In verband met de selectiviteit kan men, wanneer een of meer van de atomen 15 van het aglycon uitgewisseld wordt tegen een radioactief isotoop, een plaatselijke radioactiviteit uitoefenen. Deze methode is niet alleen van belang vóór diagnostische doeleinden om de tumor en zijn metastasen op te sporen, maar wanneer men een isotoop kiest met β-stralingsactiviteit, kan deze methode eveneens gebruikt worden voor een lokale bestralingsbehande-20 ling ter plaatse van het kankergezwel. Deze toepassing van radioactieve isotopen is bijzonder belangrijk wanneer men een aglycon gebruikt, waarvan bekend is, dat het in zure toestand niet-polair is en in alkalisch toestand polair. Wanneer deze eigenschap bestaat, hoopt het aglycon zich op ter plaatse van het gezwel, niet alleen wegens zijn β-glucuronidase-activiteit, 25 maar ook wegens zijn onoplosbaarheid in water ter plaatse van het kankergezwel. Tegelijkertijd worden de verbindingen met de radioactieve isotopen van de rest van het lichaam weggespoeld. Bij toepassing van p.joodfenol-β-D-glucuronzuur wordt een aglycon gevormd, p.joodfenol, dat aan deze behoeften voldoet. Men kan een radioactief isotoop van jodium als jodiumbe- 131

30 standdeel van deze verbinding toepassen. Bij voorkeur gebruikt men I

133 voor het merken en I voor de behandeling, aangezien het eerstgenoemde isotoop rijker is aan gammastraling, terwijl het laatstgenoemde rijker is aan β-straling. Om te voorkomen, dat het jodium naar de schildklier migreert, kan een behandeling vooraf met niet-radioactieve Lugol's oplossing worden 35 toegepast om de schildklier te verzadigen.

Een andere verbinding, die gemakkelijk radioactief gemerkt kan worden, is het glucuronide van fenylsulfazool. Een radioactief zwavelatoom kan gebruikt worden. Deze verbinding migreert niet naar de schildklier en het aglycon is niet oplosbaar in water.

7920107 \ - 12 - Vóór de behandeling van patiënten volgens de uitvinding dient men er zich van te verzekeren, dat de betrokken soort tumor een grote β-glucuro-nidase-activiteit bezit. Dit kan op een aantal wijzen geschieden. Eén methode is om tumorcellen, die bij een biopsie verkregen zijn, op β-glucuro-5 nidase-activiteit te onderzoeken. Als een dergelijke proef positief is, kan men de farmaceutische preparaten van de uitvinding toedienen.

Een tweede methode is de toediening van een glucuronide, waarvan het aglycon gemerkt is met een radioactief isotoop. Wanneer bij een volledige aftasting van het lichaam blijkt, dat het radio-isotoop op specifieke ge-10 bieden van het lichaam wordt opgehoopt, wijst dit niet alleen op de plaats van de tumor, maar ook op het feit, dat de tumor voldoende β-glucuronidase-activiteit bezit om het glucuronide te deconjugeren. Nadat dit bepaald is, kan men de juiste hoeveelheid van het te kiezen glucuronide toedienen. Als er geen tumoren aanwezig zijn of als de tumoren van een type zijn zonder 15 β-glucuronidase-activiteit, treedt er geen ophoping van radio-isotoop in het lichaam op, aangezien de alkalinisatiestap van de uitvinding alle gebruikelijke β-glucuronidase-activiteit uitschakelt, zodat het isotoop door het lichaam heen loopt.

Een andere methode voor het diagnostiseren van tumoren, die behandel-20 baar zijn met behulp van de uitvinding, is een onderzoek op de aanwezigheid van vrij glucuronzuur in de urine. Hoewel de aanwezigheid van glucuroniden in de urine gebruikelijk is, is de aanwezigheid van vrij glucuronzuur in de urine en in het bijzonder de aanwezigheid van toenemende hoeveelheden glucuronzuur bij onderzoek over een periode van verscheidene dagen, 25 een sterke aanwijzing van de aanwezigheid van tumoren met β-glucuronidase-activiteit. De hypothese is, dat de aanwezigheid van vrij glucuronzuur in de urine bij kankerpatiënten veroorzaakt wordt door de inwerking van β-glucuronidase in de kankercellen op de intercellulaire filamenten en het bindweefsel. Glucuronzuur is een reactieprodukt met een dergelijke activi-30 teit, omdat de draden tussen de cellen en het bindweefsel samengesteld zijn uit polymeren, waarvan glucuronzuur een element vormt en die bekende substraten zijn voor het enzym β-glucuronidase.

Een werkwijze voor het onderscheiden van vrij glucuronzuur van geconjugeerde glucuroniden in de urine is een ander kenmerk van de uitvinding.

35 Zowel glucuroniden als glucuronzuur geven een chromogeen complex met tetra-boraat in geconcentreerd zwavelzuur, dat met m.hydroxydifenyl reageert onder vorming van een gekleurd, in water oplosbaar complex. Wanneer men bij een alkalische pH loodacetaat toevoegt, slaan de glucuroniden neer en door toevoeging van ditizon (dithiosemicarbazon) verkrijgt men een stabiel com- 7920107 - 13 - \ plex met de overmaat lood. Derhalve kan een optische oplezing verkregen worden, die representatief is voor de hoeveelheden totale glucuroniden en vrij glucuronzuur nadat tetraboraat en m.hydroxydifenyl zijn toegevoegd. Daarna kan men een tweede aflezing verkrijgen nadat de geconjugeerde glucu-5 roniden en de overmaat lood uit de waterfase verwijderd zijn door toevoeging van basisch loodacetaat en nadat ditizon is toegevoegd. In plaats daarvan kan men de geconjugeerde glucuroniden verwijderen door reactie met bariumhydroxide. De toevoeging van bariumhydroxide aan het urinemonster veroorzaakt precipitatie van de geconjugeerde glucuroniden, maar niet van 10 het vrije glucuronzuur. Na centrifugeren en filtreren worden de geconjugeerde glucuroniden verwijderd en wat overblijft is slechts het vrije glucuronzuur. Daarna kan men een aflezing verkrijgen, die representatief is voor de hoeveelheid vrij glucuronzuur. Deze alternatieve werkwijze vermijdt de noodzaak van de toepassing van ditizon.

15 Beste wijze van uitvoering van de uitvinding

Hoewel vele glucuronideverbindingen met aglyconen, die giftig zijn voor kankercellen, theoretisch in de literatuur beschreven zijn, zijn er zeer weinig daadwerkelijk geproduceerd. De reden daarvan is, dat zij zeer moeilijk te synthetiseren zijn, in het bijzonder als het aglycon een sterke 20 elektronenacceptor is. De verbeterde werkwijze van de uitvinding vermijdt deze moeilijkheid en maakt het mogelijk conjugates van glucuronzuur van bijna ieder type aglycon te bereiden. Men kan de standaardmethoden toepassen voor het vormen van de methylester van de triacetylglucuronzuur-conju-gaten, maar vaak is het bijzonder moeilijk om van de triacetyl-methylester 25 naar het glucuronzuur-conjugaat te komen. Dit probleem is opgelost door behandeling volgens de werkwijze van de uitvinding.

De glucuroniden volgens de werkwijze van de uitvinding en voor toepassing bij de werkwijze volgens de uitvinding kunnen gesynthetiseerd worden uit methyl(tri-0-acetyl β-D-glucopyranosylbromide)-uronaat, dat het 30 actieve glucuronzuur is en gevormd wordt volgens het artikel van G.N. Bollenback c.s., J. Am. Chem. Soc., 77,3310 (1955). Deze verbinding wordt met het aglycon gecondenseerd in een oplossing van chinoline, fenol, methylcyanide of methylnitriet, gekatalyseerd met zilveroxide of zilver-carbonaat. Een andere condensatiemethode is toepassing van natrium- of 35 kaliumhydroxide als condensatiemiddel in een oplossing in water en aceton. Het reactieschema is in de tekening weergegeven met (lj, waarin ROH het gewenste aglycon is.

Als de methylester van het glucuronide gewenst wordt, kunnen de beschermende azijnzuurgroepen verwijderd worden met watervrij natriummethoxide 7 9 2 0 1 0 7 - 14 - of watervrij bariummethoxide volgens de reactie (2).

Het zuur kan gevormd worden door de triacetylmethylester met barium-hydroxide te behandelen onder vorming van het bariumzout volgens reactie (3).

Dit bariumzout van het glucuronide slaat neer. Een equimoleculaire op-5 lossing van zwavelzuur maakt het vrije glucuronzuur vrij volgens reactie (4).

Voorbeeld I toont de bereiding van 2.4-dinitrofenol-β-D-glucuronzuur. Voorbeeld I - Synthese van 2.4-dinitrofenol-β-D-glucuronzuur

Men bereidde methyl-(2.3.4-tri-0-acetyl β-D-glucopyranosylbromide)-uronaat volgens de werkwijze van G.N. Bollenback c.s., J. Am. Chem. Soc.

10 77, 3310 (1955). Men behandelde 4 g methyl(tri-O-acetyl β-D-glucopyranosyl bromide) -uronaat in aceton (80 ml) en 8,9 g 2.4-dinitrofenol. met 5n kalium-hydroxide (9 ml) en hield de oplossing 24 uren op 25®C, waarna men hem verdunde met 3 volumina chloroform. De chloroform-acetonlaag werd met water gewassen en gedroogd. Na verwijdering van het oplosmiddel en tweemaal her-15 kristalliseren uit aceton verkreeg men het methyl 2.3.4-tri-O-acetyl β-D-glucopyranosyluronaat van 2.4-dinitrofenol.

De vrije zuurvorm van de verbinding werd verkregen door het 2.4-dinitrof enyl-methyl (tri-O-acetyl β-D-glucopyranosylbromide)-uronaat met een halve molaire hoeveelheid bariumhydroxide te behandelen onder vorming van 20 het bariumzout. Dit bariumzout van het glucuronide slaat neer als een wit amorf materiaal. Een equimoleculaire oplossing van maakt het vrije glucuronide vrij. Door destillatie van de bovenstaande vloeistof verkreeg men heldergeel-bruine kristallen met een smeltpunt van 179 - 180®C. Deze verbinding werd met β-glucuronidase geincubeerd en gaf 2.4-dinitrofenol, 25 waarmee bevestigd werd, dat het eindprodukt inderdaad 2.4-dinitrofenol-β-D-glucuronzuur is.

De andere glucuroniden volgens de uitvinding, bijvoorbeeld chloor m.cresol^-D-glucuronzuur, 4.6-dinitro o.cresol-β-D-glucuronzuur, 4-chloor 3.5-xylanol-β-D-glucuronzuur, chloorthymol-β-D-glucuronzuur, 2-fenyl 30 6-chloorfenol-β-D-glucuronzuur, 5-chloor 7-jood 8-chinolinol-β-D-glucuronzuur en podofyllotoxine-β-D-glucuronzuur, benevens p.joodfenol^-D-glucuron-zuur en fenylsulfazool-β-D-glucuronzuur kunnen op overeenkomstige wijze bereid worden door een stoechiometrische overmaat van het aglycon met het methyl-(tri-O-acetyl a-D-glucopyranosylbromide)-uronaat in 5n kaliumhydro-35 xide om te zetten en de reactie-oplossing 24 uren bij kamertemperatuur te houden. Daarna verdunt men de oplossing met 3 volumina chloroform, wast de chloroform-acetonlaag met water en droogt. Na verwijdering van het oplosmiddel worden de verkregen kristallen behandeld met een halve molaire hoeveelheid bariumhydroxide onder vorming van het bariumzout, dat vervolgens 7920107 - 15 - met een equimolaire oplossing van zwavelzuur behandeld wordt om het vrije glucuronide te vormen.

De vrije zuurvorm van het glucuronide of een zout daarvan, dat onder de gebruiksomstandigheden ioniseert, is de voorkeursvorm van de verbinding 5 om volgens de uitvinding gebruikt te worden. Farmaceutisch aanvaardbare esters kunnen echter eveneens gebruikt worden, hoewel in de meeste gevallen te verwachten is, dat hun activiteit wat geringer is wegens hun relatief geringere affiniteit voor β-glucuronidase. Dit geldt in het bijzonder voor aglyconen, die sterke elektronenacceptors zijn. Wanneer derhalve hier ver-10 der gesproken wordt over "glucuronideverbinding" wordt hieronder niet alleen de vrije glucuronzuurvorm van het conjugaat verstaan, maar ook farmaceutisch aanvaardbare zouten en esters daarvan, zoals hierboven beschreven, zowel in dit voorbeeld als in volgende voorbeelden.

Voorbeeld II - Synthese van mandelonitrile-β-D-glucuronzuur 15 Mandelonitrile-β-D-glucuronzuur kan volgens de uitvinding gesyntheti seerd worden uit methyl (tri-O-acetyl a-D-glucopyranosylbromide).-uronaat, dat de actieve vorm is van glucuronzuur en bereid kan worden volgens het artikel van G.N. Bollenback c.s., J. Am. Chem. Soc. 77, 3310 (1955). Aangezien deze verbinding niet direkt geconjugeerd kan worden met mandeloni-20 trile, wordt eerst amandelzuuramide gevormd. Deze verbinding wordt gevormd door gasvormig NH^ bij 0°C in amandelzuur te laten borrelen, zoals weergegeven in reactie (5).

Het amandelzuuramide wordt aan het methyl(tri-O-acetyl β-D-glucopyra-nosyl)bromide-uronaat toegevoegd in een oplossing van fenol, die gekataly-25 seerd is door een kleine katalytische hoeveelheid zilveroxide. Behalve fenol kan men als oplosmiddel chinoline, methylnitrile of methylcyanide gebruiken. Als katalysator kan men ook zilvercarbonaat gebruiken. Een andere condensatiemethode is toepassing van natrium- of kaliumhydroxide als condensatiemiddel in een oplossing in water en aceton. Bij voorkeur ge-30 bruikt men een stoechiometrische overmaat amandelzuuramide. De reactie-oplossing wordt op kamertemperatuur gehouden gedurende 24 uren of tot de reactie voltooid is. De reactie is in de tekening weergegeven met (6).

Daarna mengt men de bovenstaande oplossing met azijnzuuranhydride in een molverhouding van 1:1 en verwarmt het mengsel 30 minuten op 70 ®C om 35 het amandelzuuramide in mandelonitrile om te zetten volgens reactie (7).

Het zuur wordt .gevormd door de volgens reactie (7) verkregen tricetyl-methylester om te zétten met een 0,5 molaire hoeveelheid 0,5n bariumhydro-xide, dat langzaam aan deze oplossing wordt toegevoegd onder vorming van een wit neerslag. Bij voorkeur voegt men een overmaat bariumhydroxide toe 7920107 \ - 16- tot· geen verder neerslag meer optreedt. De reactie kan worden weergegeven als reactie (8) in de tekening.

Door toevoeging van een zelfde volume 0,5n zwavelzuur, gevolgd door 20 minuten koelen in ijswater komt het vrije glucuronide vrij volgens 5 reactie (9).

Het mengsel wordt daarna gefiltreerd en de bovenstaande vloeistof wordt onder verlaagde druk gedroogd en uit ether gekristalliseerd.

Voorbeeld III - Synthese van methacrylonitrile-β-D-glucuronzuur

Methacrylonitrile-β-D-glucuronzuur of andere glucuroniden van nitrile-10 groepen bevattende cytotoxische verbindingen kunnen volgens de uitvinding bereid worden op een overeenkomstige wijze als beschreven in Voorbeeld II, hoewel de omzettingsstap van methacrylonitrile in methacrylamide vóór de condensatie met methyl(tri-O-acetyl a-D-glucopyranosylbromide)-uronaat niet nodig is, aangezien er bij methacrylonitrile niet hetzelfde polymerisatie-15 probleem bestaat als bij mandelonitrile. In het algemeen is de voorkeurswerkwijze bij direkte condensatie van het aglycon om een stoechiometrische overmaat van het aglycon (methacrylonitrile: in hét geval van methacrylonitrile- β-D-glucuronzuur) in te stellen ten opzichte van het methyl (trirO-acetyl a-D-glucopyranosylbromide)-uronaat in 5n kaliumhydroxide en de reac-20 tie-oplossing 24 uren op kamertemperatuur te houden. Daarna verdunt men de oplossing met 3 volumina chloroform, wast de chloroform-acetonlaag met water en droogt. Na verwijdering van het oplosmiddel worden de verkregen kristallen met een halve molaire hoeveelheid bariumhydroxide behandeld om het bafiümzout te vormen, dat vervolgens met een equimoleculaire oplossing van 25 zwavelzuur behandeld wordt om het vrije glucuronide te verkrijgen.

oorbeeld IV - Acute intraveneuze toxiciteit voor konijnen van mandelonitrile-β-D-glucuronzuur NZW-konijnen met lichaamsgewichten van 2000 - 3200 g voor de wijfjes en 2200 - 3800 g voor de mannetjes ontvingen een intraveneuze injectie met 30 een oplossing van mandelonitrile-β-D-glucuronzuur. Konijnen, die uitsluitend fysiologische zoutoplossing geïnjecteerd kregen, dienden als controle.

De oplossing van mandelonitrile-β-D-glucuronzuur bevatte 10 % mandelonitrile.

Tijdens de waarnemingsperiode van 14 dagen werd aantekening gehouden van alle sterfgevallen en tekenen van toxiciteit. Tabel A geeft de resulta-35 ten van de ruwe bepaling van het traject.

7920107 \ - 17 -

Tabel A - Mortaliteitsgegevens voor groepen konijnen (2 per groep) na intraveneuze injectie met DMBG-oplossing.

Ruwe bepaling van het traject

Dosis Mortaliteitsverhouding, aantal doden 5 ml/kg per aantal behandelde dieren_ 0,25 0/2 0,5 1/2 1,0 2/2 2,0 2/2 10 4,0 2/2

De resultaten van de ruwe bepaling van het traject, zoals weergegeven in Tabel A, wijzer erop dat de gemiddelde dodelijke intraveneuze dosis (LD-50) in het gebied van 0,23 - 2 ml per kg lichaamsgewicht lag.

Daarna werd het onderzoek uitgebreid tot grotere groepen konijnen 15 (5 mannetjes en 5 wijfjes per groep) om de gemiddelde lethale dosis exacter te bepalen. Tabel B geeft de mortaliteitsgegevens voor deze grotere groep.

Tabel B - Mortaliteitsverhouding van konijnen na intraveneuze injectie met DMBG-oplossing. Volledige proef - Gewichtstraject: Wijfjes 2000 - 3200 g, mannetjes 2200- 3800 g.

20 Dosis Mortaliteitsverhouding, Tijdstip vari dood na behandeling ml/kg aantal doden/aantal _ onderzochte dieren_ Aantal dieren Aantal uren

Mannetjes 0,44 0/5 - 0,66 2/5 2 <3 25 1,0 3/5 3 <3 1.5 4/5 4 <3 2.25 5/5 5 <3

Wijfjes 0,44 0/5 0,66 2/5 2 <3 30 1,0 5/5 5 <3 1.5 5/5 5 <3 2.25 5/5 5 <3

Als tekenen van reactie op de behandeling, die 2 minuten na de toediening werden waargenomen, zijn te noemen ataxie en verlamming. Twee minuten 35 later stierven enkele dieren van de groep met hoge dosis. Alle sterfgevallen van alle groepen traden binnen 3 uren na de toediening op. De overlevende dieren vertoonden gedurende de volgende 14 dagen geen klinische symptomen. Bij autopsie van alle dieren werden geen duidelijke grove pathologische wijzigingen gevonden.

7920107 - 18 -

De acute gemiddelde dodelijke intraveneuze dosis (LD 50) en het betrouwbaarheids interval bij een significantie van 95 %, berekend volgens de methode van C.S. Weil, 1052, Biometrics, 8:249, van een 10-procents oplossing van mandelonitrile^-D-glucuronzuur voor konijnen zijn blijkens be~ 5 rekening als volgt:

Mannetjes: 0,84187 (0,78087-0,90287) ml/kg lichaamsgewicht Wijfjes: 0,6873 (0,64417-0,73043) ml/kg lichaamsgewicht

Uit de bovenstaande gegevens valt aan te nemen, dat de maximale veilige dosis in de orde van 0,44 ml/kg lichaamsgewicht ligt en er wordt aan-10 genomen, dat deze grens in de humane therapie niet overschreden dient te worden.

Vóór een therapeutische behandeling met verbindingen van de uitvinding moet de aanwezigheid van. een tumor met een grote β-glucuronidase-activiteit diagnostisch worden vastgesteld. De meest positieve wijze om definitief 15 vast te stellen of een tumor met een grote β-glucuronidase-activiteit aanwezig is, is het uitvoeren van een biopsie en een onderzoek van de verkregen tumorcellen op β-glucuronidase-activiteit. Dit is uiteraard voor de meeste soorten gezwellen niet uitvoerbaar. Een andere wijze van diagnose op de aanwezigheid van tumoren met β-glucuronidase-activiteit is het uit-20 voeren van een urineproef om de aanwezigheid van vrij glucuronzuur te bepalen. Normale patiënten vertonen 200 - 400 mg vrij glucuronzuur per 24 uren in de urine. Kankerpatiënten met goed ontwikkelde tumoren, die β-glucuro-nidase-activiteit bezitten, vertonen een hoeveelheid van meer dan 2000 tot 7000 mg vrij glucuronzuur per 24 uren. Wanneer men derhalve de proef van 25 de uitvinding toepast en men vindt meer dan 400 mg vrij glucuronzuur per 24 uren, is dit een uitstekende aanwijzing voor de aanwezigheid van tumoren met een grote β-glucuronidase-activiteit.

Een negatieve uitslag bij deze urineproef betekent niet definitief, dat de aanwezigheid van tumoren met β-glucuronidase-activiteit is uitgeslo-30 ten, omdat tumoren, zelfs als zij β-glucuronidase-activiteit bezitten, in hun beginstadia wellicht niet voldoende vrij glucuronzuur afgeven om een positieve uitslag van de urineproef te geven. Daarom moet de urineproef herhaald worden en als een toenemende hoeveelheid vrij glucuronzuur gevonden wordt, is dit een andere aanwijzing voor de aanwezigheid van een tumor 35 met β-glucuronidase-activiteit. Een voorbeeld van de methode ter bepaling van de hoeveelheid vrij glucuronzuur in de urine wordt in Voorbeeld V gegeven.

Voorbeeld V - Proef op glucuronzuur in urine

Zowel glucuroniden als glucuronzuur geven een. chromogeen complex met 7920107 - 19 - \ tetraboraat en geconcentreerd zwavelzuur, dat met m.hydroxydifenyl reageert onder vorming van een gekleurd, in water oplosbaar complex. Voorts slaan glucuroniden neer met basisch loodacetaat, wanneer de pH 8 bedraagt, terwijl het vrije glucuronzuur niet beïnvloed wordt door het loodacetaat. Door 5 complexvorming van de overmaat lood met dithiocarbizon wordt een stabiel complex met lood gevormd, dat verwijderd kan worden, zodat vrij glucuronzuur achterblijft.

Bij 10 ml van een urinemonster voegt men 0,ln ammonia tot een pH van 8 bereikt is. Daarna voegt men een overmaat van een verzadigde oplossing 10 van basisch loodacetaat toe, waardoor de geconjugeerde glucuroniden worden neergeslagen. Daarna wordt het monster gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof afgescheiden. Daarna behandelt men 2 ml van de bovenstaande vloeistof met 10 ml van 10-procents dithiocarbizon (ditizon) in chloroform om de overmaat lood te verwijderen. Nadat men gewacht heeft tot de schei-15 ding voltooid is, wordt de waterfase afgescheiden. Bij 0,2 ml van de waterfase voegt men 1,2 ml natriumtetraboraat in geconcentreerd H^SO^. Het mengsel wordt grondig gemengd in een reageerbuis en in fijngemaakt ijs afge-koeld. Daarna wordt de reageerbuis 5 minuten in kokend water verwarmd en direkt daarna in ijs afgekoeld tot hij koud wordt. Vervolgens voegt men 20 20 μΐ 0,15 % m.hydroxydifenyl in 0,5 % NaOH toe. Na 5 minuten wachten wordt de optische dichtheid bij een golflengte van 520 nm afgelezen. De verkregen aflezing geeft de in de urine aanwezige hoeveelheid vrij glucuronzuur aan.

De totale hoeveelheid vrij en geconjugeerd glucuronzuur wordt eenvou-25 dig bepaald door het monster direkt met tetraboraat en hydroxydifenyl te behandelen zonder eerst de vrije glucuroniden te verwijderen. Door aflezing bij een golflengte van 520 nm verkrijgt men een aanwijzing van de totale hoeveelheid geconjugeerde glucuroniden en vrij glucuronzuur, die aanwezig zijn.

30 Voorbeeld VA - Proef op glucuronzuur in urine

Bij 10 ml van een urinemonster voegt men 0,ln ammonia tot een pH van 8 bereikt is. Daarna voegt men een overmaat bariumhydroxide toe, waardoor de geconjugeerde glucuroniden worden neergeslagen. Het monster wordt daarna gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof wordt gefiltreerd. Bij 35 0,2 ml van de gefiltreerde vloeistof voegt men 1,2 ml natriumtetraboraat in geconcentreerd ^SO^. Het mengsel wordt in een reageerbuis goed gemengd en in fijngemaakt ijs gekoeld. De reageerbuis wordt daarna 5 minuten in kokend water verwarmd en direkt daarop in ijs afgekoeld tot hij koud is. Vervolgens voegt men 20 j3.1 0,15 % m.hydroxydifenyl in 0,5 % NaOH toe. Na 792 0 1 0 7 - 20 - 5 minuten wachten wordt de optische dichtheid bij een golflengte van 520 nm afgelezen. De verkregen aflezing geeft de hoeveelheid in de urine aanwezig vrij glucuronzuur aan.

De relatieve hoeveelheid van het totaal van geconjugeerde glucuroniden 5 en vrij glucuronzuur, dat aanwezig is, kan op dezelfde wijze worden bepaald als hierboven beschreven in Voorbeeld V.

Voorbeeld VI - Werkwijze voor het toedienen van glucuronidetherapie

Nadat is vastgesteld, dat de patiënt een gezwel met β-glucuronidase-activiteit heeft, is de eerste stap van de behandeling toediening van een 10 dosis glucose, bijvoorbeeld 100 g honing, glucose of een andere suiker.

Circa 1 uur later begint men intraveneus een oplossing in te druppelen, die circa 10 % glucose en 60 milli-equivalent natriumbicarbonaat in gedestilleerd water bevat. Men dient circa 1 liter toe, aannemende dat er geen contra-indicaties zijn, en men controleerd de pH van de urine om te bepa-15 len dat deze een pH-waarde van circa 7,4 bereikt heeft. Hiermee wordt een systeem gevestigd, dat alkalisch gemaakt is, en nu is het veilig om het glucuronide toe te dienen. Men liet daarna nog een liter van dezelfde glu-cose-bicarbonaatoplossing toe, die echter ook de gewenste hoeveelheid glucuronide bevat. Dit wordt naar behoefte dagelijks herhaald. Als een glucu-20 ronide van een nitrilegroepen bevattend, cytotoxisch aglycon gebruikt wordt, dient men direkt vóór, tijdens of na de toediening van het glucuronide 50 ml van een 25-procents oplossing van natriumthiosulfaat toe, bij voorkeur intraveneus door langzaam indruppelen. Het natriumthiosulfaat wordt bij voorkeur opgenomen in de glucose-bicarbonaat-glucuronide-25 oplossing, die intraveneus wordt ingedruppeld. De toediening hiervan kan echter ook daarna worden voortgezet om een grotere veiligheidsmarge te verkrijgen.

Als er contra-indicaties bestaan voor de toediening van bicarbonaat, kan men een anti-zuurmiddel oraal toedienen. Het belangrijke kriterium is, 30 dat de pH van de urine circa 7,4 moet worden en tijdens de behandeling zo moet blijven.

De hyperacidificatie van de tumorcellen wordt veroorzaakt door een hyperglycemische toestand in de patiënt. Derhalve kan men ieder hypergly-cemisch middel toepassen als hyperacidificatiemiddel, bijvoorbeeld fructose, 35 galactose, lactose of glucagon. Verder dient men te beseffen, dat deze hyperglycemische toestand op iedere bekende wijze tot stand kan worden gebracht. Wanneer de patiënt bijvoorbeeld een diabeticus is, kan de toestand teweeg worden gebracht door de toediening van insuline te verminderen.

Ieder middel, dat de pH van de urine tot circa 7,4 verhoogt, kan als 7920107

V

- 21 - alkalisch makend middel gebruikt worden, bijvoorbeeld natrium- of kalium-bicarbonaat of -citraat of andere basische zouten of anti-zuurmiddelen. Hoewel het de voorkeur verdient ze intraveneus toe te dienen, kunnen zij ook oraal worden toegediend.

5 Bij de uitdrukking "circa 7,4", die hier gebruikt, wordt met betrekking tot het in de rest van het lichaam te handhaven pH-niveau, dient men te bedenken, dat men ook een pH-waarde iets boven of beneden 7,4 mag toepassen, hoewel dit niet de voorkeur verdient. Wanneer de pH daalt beneden 7,4, neemt de β-glucuronidase-activiteit toe (tot de optimale pH bereikt is).

10 Voorts is de rest van het lichaam bij een pH beneden pH 7,0 niet alkalisch, maar zuur. Boven 7,4 neemt het gevaar van alkalose toe zonder dat enige belangrijke verdere afname in β-glucuronidase-activiteit optreedt. Een pH-waarde van 7,4 verdient de voorkeur, aangezien dit een fysiologische pH is, die niet schadelijk kan zijn voor het lichaam; ook is bekend, dat de 15 β-glucuronidase-activiteit in gezonde organen bij deze pH-waarde vrijwel nihil is.

De dosering van de glucuroniden dient bewaakt te worden ter vermijding van mogelijke neveneffecten ten gevolge van massieve afgifte van toxinen, veroorzaakt door de stervende kankercellen. Het kan de voorkeur verdienen 20 de behandeling met glucuroniden uit te voeren in korte tijdsverlopen van enige dagen met tussenpozen van enige dagen, ten einde eventuele toxinen, die door de stervende kankercellen zijn vrijgemaakt de gelegenheid te geven het lichaam te verlaten alvorens de verdere behandeling wordt voortgezet.

Behalve intraveneus kunnen de glucuroniden worden toegediend volgens 25 iedere methode van parenterale toediening. De glucuroniden dienen echter niet oraal te worden toegediend, aangezien het bekend is, dat p-glucuroni-dase in het spijsverteringskanaal aanwezig is. Het natriumthiosulfaat kan echter oraal worden toegediend, als een goede, pas in de darm uiteenvallende bekleding verschaft wordt om afgifte in de maag te vermijden.

30 De aan een patiënt toe te dienen hoeveelheid glucuronide moet empirisch bepaald worden en loopt uiteen in afhankelijkheid van de conditie van de patiënt. Eerst kunnen betrekkelijk geringe hoeveelheden glucuronide worden toegediend met regelmatig stijgende dagelijkse doses, als geen ongunstige effecten worden waargenomen. Natuurlijk dient de maximale dosis, die veilig 35 is voor toxiciteit, zoals bepaald volgens gebruikelijke toxiciteitsproeven bij dieren, nooit te worden overschreden.

Het is duidelijk, dat alle tumorcellen met β-glucuronidase-activiteit behandeld kunnen worden volgens de uitvinding, terwijl de resterende organen van het lichaam beschermd worden door de stap van het alkalisch maken.

7920107 \ - 22 -

Als tumoren waarvan bekend is dat zij β-glucuronidase-activiteit bezitten zijn te noemen: vaste borsttumoren en hun metastasen, bronchogeencarcinoom en zijn metastasen en lymfomen. Ook is bekend, dat neoplasmen, die geen grote β-glucuronidase-activiteit bezitten en derhalve niet volgens de uit-5 vinding behandeld kunnen worden, leukemie omvatten. Er dient echter op gewezen te worden, dat deze lijst geen aanspraak maakt op volledigheid en dat de literatuur vele andere tumoren noemt met β-glucuronidase-activiteit. Onverschillig echter of het reeds uit de literatuur bekend is dat een bepaalde tumor β-glucuronidase-activiteit bezit, kan dit gemakkelijk bepaald 10 worden volgens de verschillende diagnosemethoden, die in de onderhavige beschrijving besproken zijn en wanneer gevonden wordt, dat de tumor β-glucuronidase-activiteit bezit, kan de therapeutische behandeling van de uitvinding doelmatig worden toegepast.

Wanneer het gewenst is hyperthermie te veroorzaken om de β-glucuroni-15 dase-activiteit te verhogen, dient men een methode te kiezen, waarmee de temperatuur zoveel mogelijk verhoogd wordt zonder risico voor schade aan gezonde delen van het lichaam, bijvoorbeeld de ogen. Een verhoging van circa 2QC voor de gehele lichaamstemperatuur en zelfs 4,5°C voor plaatselijke hyperthermie verdient de voorkeur. De hyperthermie dient wat de tijd 20 betreft zodanig te worden ingesteld, dat hij circa een uur duurt op het tijdstip van de grootste glucuramideconcentratie ter plaatse van het gezwel. Wanneer bijvoorbeeld een plaatselijke microgolfbehandeling gekozen wordt, dient deze circa ½ uur na het begin van het intraveneus indruppelen van het glueuronimide te beginnen en gedurende circa éen uur te worden 25 voortgezet. De juiste dosering van bekende pyrogene middelen om de gewenste mate van hyperthermie te bereiken, zijn aan de deskundige bekend of kunnen gemakkelijk empirisch bepaald worden. Zo zal bijvoorbeeld voor dinitra-fenol een dosis van circa 30 mg/dag geschikt zijn.

Wanneer oestrogeen of testosteron moet worden toegedierid, zal een 30 dosis van 5-15 mg/kg lichaamsgewicht per dag de gewenste inductie van β-glucuronidase-activiteit teweegbrengen.

Voorbeeld VII - Werkwijze voor het toedienen van radioisotopen

Als een met een radioactief isotoop gemerkt aglycon moet worden toegediend, kan het merken volgens iedere op zichzelf bekende methode worden 35 uitgevoerd. Uitsluitend voor diagnostische doeleinden kan men betrekkelijk geringe hoeveelheden van deze gemerkte glucuroniden toedienen. Overigens worden zij op dezelfde wijze toegediend als in Voorbeeld VI beschreven voor niet-gemerkte glucuroniden. Het aftasten van het lichaam te bepalen of een deel van het radioactief gemerkte aglycon door het lichaam wordt 7920107 - 23 - vastgehouden geeft een aanwijzing of een tumor met β-glucuronidase-activi-teit aanwezig is en geeft ook aan waar de tumor of metastasen daarvan gevonden kunnen worden. Zoals reeds vermeld, zijn gammastralen afgevende iso-131 topen, zoals I, voor dit doel bijzonder geschikt.

5 De radioactief gemerkte glucuroniden kunnen ook worden toegepast voor een bestralingstherapie in situ, in het bijzonder als een isotoop gebruikt 133 wordt met een grote activiteit voor β-straling, bijvoorbeeld I. Dit geeft het tweeledige effect, dat de kankercellen niet alleen worden aangetast door de toxische aglyconen, maar ook door de β-straling. Opnieuw zal 10 de wijze van toediening dezelfde zijn als hierboven beschreven in Voorbeeld VI.

Een andere toepassing van de uitvinding is gelegen in het gebruik van het borium bevattende aglycon. Het is reeds bekend, dat als boriumatomen gebombardeerd worden met neutronen, zij worden afgebroken tot lithium met 15 bijbehorende afgifte van positronen. Als de boriumatomen op dat tijdstip aan tumorweefsel gebonden zijn, worden de positronen abrupt door het tumor-weefsel geabsorbeerd en dat is dodelijk voor dit weefsel. Deze werkwijze zal bijzonder waardevol zijn, als de boriumatomen volgens de werkwijze van de uitvinding uitsluitend geconcentreerd zijn bij de tumorcellen.

20 Voorbeeld VIII - Werkwijze voor het toedienen van een pH-afhankelijke therapie

Als volgens de werkwijze van Voorbeeld VI de tumorcellen gehyperacidi-ficeerd zijn en het gezonde weefsel alkalisch is gemaakt, zal er een zuur-alkalisch pH-verschil tot stand zijn gebracht tussen de tumorcellen en ge-25 zonde cellen. Zodoende kunnen verbindingen, waarvan de activiteit of oplosbaarheid afhankelijk is van de pH, direkt worden toegediend zonder eerst geconjugeerd te worden met een glucuronide. Dergelijke verbindingen tasten selectief de zuurgemaakte tumorcellen aan zonder de rest van het lichaam, die een alkalische pH heeft, te schaden.

30 Evenals bij de werkwijze van Voorbeeld VI wordt aan de patiënt eerst oraal een dosis van een hyperglycemisch middel toegediend, bijvoorbeeld 100 g honing, glucose of een andere suiker. Circa 1 uur later begint men intraveneus een oplossing in gedestilleerd water in te druppelen, die circa 10 % glucose en 60 milli-equivalent natriumbicarbonaat bevat. Men 35 dient circa 1 liter toe, aannemende dat er geen contra-indicaties zijn, en controleert de pH van de urine om te bepalen dat deze een waarde van circa 7,4 bereikt heeft. Hiermee is vastgesteld, dat het systeem alkalisch is gemaakt en dat het nu veilig is om de in zuur milieu actieve verbinding toe te dienen. Men dient vervolgens nog een liter van dezelfde glucose- 7920107 \ - 24 - bicarbonaatoplossing toe, die nu echter ook de gewenste hoeveelheid in zuur actieve verbinding bevat. Dit wordt naar behoefte dagelijks herhaald.

Verbindingen als 2.4-dinitrofenol, 4.6-dinitro o.cresol, 4-chloor 3.5-xylanol, chloorthymol, 2-fenyl 6-chloorfenol, 5-chloor 7-jood 8-chino-5 linol en podofyllotoxine zijn alle in water oplosbaar bij alkalische pH-waarden en in vet oplosbaar bij zure pH-waarden. Wanneer derhalve de verbindingen op de bovenbeschreven wijze worden toegediend, veroorzaken zij geen aanmerkelijke schade aan gezond weefsel, omdat zij betrekkelijk snel door het systeem uitgespoeld worden. Ter plaatse van het tumorweefsel met 10 een zure pH komen deze verbindingen echter uit de waterige oplossing en oefenen hun cytotoxische of energietoevoer teweegbrengende werking uit op de tumorcellen.

Verbindingen als chloor m.cresol, benevens 4.6-dinitro o.cresol, 4-chloor 3.5-xylanol:, chloorthymol en 2-fenyl 6-chloorfenol zijn meer ac-15 tief bij een lagere pH. Derhalve zal toediening van deze verbindingen met gelijktijdige hyperacidificatie van de tumorcellen en alkalisch maken van de rest van het lichaam zelfs nog minder schadelijk voor het gezonde weefsel zijn, aangezien hun activiteit verminderd wordt bij de pH van het gezonde weefsel.

20 De dosering van de niet-glucuronideverbindingen volgens deze uitvoe ringsvorm van de uitvinding ligt in het algemeen iets lager dan van de overeenkomstige glucuroniden, aangezien de glucuronidevorm van de verbindingen aanmerkelijk minder giftig is dan de vrije verbindingen. De juiste dosering moet empirisch bepaald worden afhankelijk van de toestand van de 25 patiënt. Eerst moet een betrekkelijk kleine dosis worden toegediend met steeds hoger wordende dagelijke doseringen, als geen nadelige effecten worden waargenomen. Uiteraard inag de maximale, tegen toxiciteit veilige dosering, die met gebruikelijke toxiciteitsproeven bij dieren bepaald is, nooit overschreden worden.

30 Andere zuurmakende en alkalisch makende middelen, zoals hierboven be schreven met betrekking tot de uitvoeringsvorm met glucuronide, kunnen ook bij de onderhavige uitvoeringsvorm worden toegepast.

Voorbeeld IX - Werkwijze voor antibacteriële toediening

De toediening van glucuronide kan worden toegepast bij de behandeling 35 van bacterie-infecties, als bekend is, dat de betrokken bacteriën β-glucu-ronidase-activiteit bezitten. Voorbeelden van dergelijke bacteriën zijn streptococci, staphylococci en E. coli. De behandelingsmethode van dergelijke bacterie-infecties zal overeenkomen met de in Voorbeeld VI beschreven werkwijze, echter met dit verschil, dat geen hyperacidificatie nodig is.

7920107 \ - 25 -

Dit is het geval, omdat bacteriële β-glucuronidase actief is bij hogere pH-waarden dan β-glucuronidase van normale gezonde inwendige organen. Verder zou een dergelijke hyperacidificatiestap de pH van de bacteriën niet beïnvloeden, aangezien het mechanisme daarvan specifiek is voor tumor-5 cellen.

De eerste stap bij antibacteriële toediening is een intraveneus indruppelen van gedestilleerd water en 60 milli-equivalent natriumbicarbonaat. Men dient circa 1 liter toe en controleert de pH van de Urine om te bepalen, dat deze een waarde van circa 7,4 bereikt heeft. Op dezelfde wijze 10 dient men nog een liter van dezelfde bicarbonaatoplossing toe, die ditmaal echter ook de gewenste hoeveelheid glucuronide bevat. Deze behandeling kan zo nodig dagelijks herhaald worden.

Het alkalisch makende middel kan ook oraal worden toegediend en men kan ieder middel toepassen, dat het lichaam zodanig alkalisch maakt, dat 15 de pH van de urine circa 7,4 wordt. Het glucuronide dient niet oraal te worden toegediend, maar het kan volgens ieder middel van parenterale toediening worden toegediend.

Bepaalde bekende antibacteriële middelen met ongunstige neveneffecten kunnen eveneens als glucuroniden volgens de werkwijze van de uitvinding wor-20 den toegediend, ten einde deze ongunstige effecten te verminderen of uit te schakelen. Zo is bijvoorbeeld bekend, dat chlooramfenicol een verminderend effect op beendermerg heeft, dat niet optreedt, als het glucuronide gebruikt wordt. Neomycine is een bekend antibacterieel middel, dat niet inwendig kan worden toegediend wegens zijn toxiciteit. Het kan echter oraal 25 worden toegediend voor de behandeling van bacterie-infecties met een hoge β-glucuronidase-activiteit, wanneer het eerst geconjugeerd wordt met glucu-ronzuur.

De diagnostische werkwijze met aglycon, dat gemerkt met radio-isotoop, welke werkwijze hierboven beschreven is voor diagnose van een tumor, kan 30 ook worden toegepast om het bestaan en de plaats van bacterie-infecties te bepalen. Wanneer een patiënt bijvoorbeeld klaagt over pijn in het gebied van de appendix, kan men de radioactief gemerkte glucuroniden toedienen.

Als geen ophoping van isotoop in dit gebied gevonden wordt, kan een door bacteriën met β-glucuronidase-activiteit veroorzaakte ontsteking worden 35 uitgeschakeld als oorzaak van de pijn. In de meeste gevallen wordt ontsteking bij appendicitis veroorzaakt door infectie met bacteriën met β-glucuronidase-activiteit. Andere toepassingen van een dergelijke diagnostische werkwijze zullen voor de deskundigen eveneens duidelijk zijn.

Behalve de bovenbesproken glucuronideverbindingen kan men ieder bekend 7920107

V

\ - 26 - conjugeerbaar antibioticum met glucuronzuur koppelen om toegepast te worden tegen β-glucuronidase bevattende infecties. Dit heeft het voordeel, dat de hoeveelheid vrij antibioticum, dat in de bloedsomloop circuleert, sterk verminderd wordt. Het enige antibioticum, dat vrijkomt, wordt vrij-5 gemaakt ter plaatse van de infectie. Derhalve kan men veel kleinere doses toedienen. Derhalve kunnen de glucuroniden van de uitvinding dienen als een inwendig toegediend plaatselijk werkend antibioticum. Wegens de bekende β-glucuronidase-activiteit in het spijsverteringskanaal, dient geen glucu-ronide oraal te worden toegediend, hoewel iedere methode van parenterale 10 toediening toelaatbaar is.

Als bekend is, dat het antibiotische aglycon geen enkel effect op de nieren heeft, kan de stap van het alkalisch maken worden weggelaten. Van vele antibiotica is echter bekend, dat zij in zekere mate nefrotoxisch zijn, en zodoende is de stap van het alkalisch maken van belang om de nieren te 15 beschermen.

Voorbeeld X - Biosynthese van mandelonitrile-ft-D-glucuronzuur

Men bereidt 22 ml oplossing van 5 % mandelonitrile (banzaldehyde-cyanohydrien) in propyleenglycol en dient een intramusculaire injectie van deze oplossing toe aan een ezel of een geit. De urine over 24 uur wordt 20 verzameld en met azijnzuur aangezuurd tot pH 4. Daarna wordt de urine gefiltreerd door een filter van glasvezels ënhet filtraat wordt behandeld volgens één van de drie hieronder beschreven verschillende methoden: A. Men voegt een verzadigde oplossing van loodacetaat aap'i het filtraat toe. Het witte neerslag, dat verschijnt, wordt met een centrifuge afge-25 scheiden en er wordt gefiltreerd. Het filtraat wordt met NH^ alkalisch gemaakt tot pH 8 en daarna wordt een verzadigde oplossing van basisch loodacetaat toegevoegd. Het neerslag wordt met kouder water gewassen en men laat gasvormig erin borrelen, waarna het zwarte neerslag van lood-sulfide wordt afgescheiden. Het filtraat wordt onder verlaagde druk ver-30 dampt tot het volume tot een derde verminderd is. Men verkrijgt een bruine pasta, die in absolute alcohol wordt opgelost; de oplossing laat men een nacht staan. De oplossing wordt gefiltreerd en het filtraat wordt onder verlaagde druk ingedampt, waarna ether wordt toegevoegd. Het mandelonitrile-β-D-glucuronzuur wordt uit de etheroplossing gekristalliseerd.

35 B. De urine wordt met zoutzuur aangezuurd tot pH 4 en door een filter van glasvezels gefiltreerd. Daarna droogt men de oplossing onder verlaagde druk en lost het residu op in ether, waarna men herkristalliseerd uit de etheroplossing.

C. Men voegt een oplossing van 0,ln bariumhydroxide in water aan de urine 7 9 2 0 1 0 7 \ - 27 - toe. Het witte neerslag van het bariumzout van het mandelonitrile-glucuro-nide wordt daarna in koud water gewassen en geroerd en men voegt 0,ln zwavelzuur toe. Een onoplosbaar neerslag van bariumsulfaat wordt verwijderd en de resterende vloeistof wordt onder verlaagde druk gedroogd en daarna 5 wordt het produkt herkristalliseerd uit een etheroplossing.

Aangezien mandelonitrile zeer giftig is en slechts een zeer kleine hoeveelheid ervan kan worden toegediend, kan men de volgende semi-biosyn-thetische werkwijze toepassen.

Men mengt 20 g amandelzuuramide (2-hydroxybenzamide) met voeder voor 10 geiten of ezels en verzamelt de urine van de dieren gedurende 24 uren. Het amandelzuuramide-glucuronide wordt afgescheiden volgens een van de hierboven beschreven methoden. Daarna voegt men azijnzuuranhydride toe en slaat het glucuronide (2.3.4-triacetaat-glucopyranose-mandelonitrile) met barium-hydroxide neer. Het barium wordt verwijderd met zwavelzuur en het glucuro-15 nide wordt onder verlaagde druk gewonnen, als hierboven beschreven.

Het zal de deskundigen duidelijk zijn, dat men binnen het raam van de uitvinding talrijke wijzigingen kan aanbrengen en dat de uitvinding niet beperkt is tot wat in de bovenstaande beschrijving beschreven is.

7920107

Claims (42)

1. 2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men als alka lisch makend middel een alkalimetaalbicarbonaat of -citraat gebruikt.
2. 3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een verbinding gebruikt, waarin het aglycon een groter effect uitoefent in een zure omgeving dan in een alkalische omgeving of oplosbaar in water is in een 20 alkalische omgeving en onoplosbaar of slechts weinig in water oplosbaar is in een zure omgeving.
3. 4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men de glucuronideverbinding kiest uit: 2.4-dinitrofenol-β-D-glucuronzuur, 4-chloor m. cresol-β-D-glucuronzuur, 4.6-dinitro o.cresol-β-D-glucuronzuur, 4-chloor 25 3.5-xylanol-β-D-glucuronzuur, chloorthymol-β-D-glucuronzuur, 5-chloor 7-jood 8-chinolinol-β-D-glucuronzuur, podofyllotoxine-β-D-glucuronzuur, 2-fenyl 6-chloorfenol-β-D-glucuronzuur, p.joodfenol-β-D-glucuronzuur en fenylsulfazool-β-D-glucuronzuur.
4. 5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het aglycon een 30 radio-isotoop bevat, dat in staat is voldoende straling af te geven om in situ een radiotherapeutisch effect te verschaffen.
5. 6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de straling in hoofdzaak β-straling is.
6. 7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het glucuronide 131 133 35 een met I of met I gemerkt p.joodfenol-β-D-glucuronzuur is.
7. 8. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het glucuronide 35 een met S gemerkt fenylsulfazool-β-D-glucuronzuur is.
8. 9. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het hyper-acidificeren van de tumorcellen uitvoert door toediening van een hypergly- 7920107 - 29 - cemisch middel in een voldoende hoeveelheid öm de tumorcellen te hyper-acidificeren.
9. 10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men het hyper-glycemische middel kiest uit glucose, fructose, galactose, lactose en 5 glucagon.
10. 11. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men het hyper-glycemische middel oraal of intraveneus toedient.
11. 12. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het alkalisch makende middel oraal of intraveneus toedient.
12. 13. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men het alkalisch makende middel toedient vóór de toediening van de glucuronideverbinding en de glucuronideverbinding toedient nadat bepaald is, dat de pH van de urine van de patiënt circa 7,4 bedraagt, en de toediening van het alkalisch makende middel voortzet tijdens tijdens de toediening van de glucuronidever-15 binding.
13. 14. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de glucuronideverbinding toedient door intraveneus indruppelen.
14. 15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men het alkalisch makende middel in het intraveneuze druppelpreparaat opneemt.
15. 16. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat men de glucuro nideverbinding toedient door intraveneus indruppelen en het hyperglycemi-sche middel en het alkalisch makende middel in het intraveneuze druppelpreparaat opneemt.
16. 17. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de glucuro-25 nideverbinding oraal toedient in een vorm, die voorkomt dat de verbinding in de maag wordt afgegeven.
17. 18. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de glucuronideverbinding kiest uit fenol-β-D-glucuronzuur en cresol-β-D-glucuronzuur.
18. 19. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het aglycon van 30 de glucuronideverbinding een nitrilegroep bevat en dat men tevens aan de patiënt een voldoende hoeveelheid natriumthiosulfaat toedient om als tegengif voor cyanidevergiftiging te dienen.
19. 20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat men het natriumthiosulfaat toedient in een hoeveelheid van circa 50 ml van een 25-procents 35 oplossing daarvan.
20. 21. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat het glucuronide mandelonitrile-β-D-glucuronzuur is.
21. 22. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat het glucuronide methacrylonitrile-β-D-glucuronzuur is. 7920107 % - 30 - *
22. 23. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men voorts ten minste op het tijdstip van maximale glucuronideconcentratie bij de tumor hyperthermie teweegbrengt op ten minste de plaats van de te behandelen tumor in een voldoende mate om de β-glucuronidase-activiteit op die plaats 5 aanzienlijk te verhogen zonder de totale gezondheidstoestand van de patiënt in aanmerkelijke mate te beïnvloeden.
23. 24. Werkwijze volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat men de hyperthermie plaatselijk bij de tumor teweegbrengt door toediening van het glucuronide van een pyrogeen middel, door een behandeling met microgolven 10 of door 'een elektrische stroom door het lichaam te leiden.
24. 25. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men verder oestrogeen of testosteron praktisch gelijktijdig met het glucuronide toedient.
25. 26. Werkwijze voor het behandelen van tumoren met lagere pH-waarden dan 15 de omringende weefsels, met het kenmerk, dat men: de tumorcellen hyperacificeert; aan de patiënt een alkalisch makend middel toedient in een voldoende hoeveelheid om de pH van de niet-tumorweefsels van de patiënt op een waarde van circa 7,4 te houden; en 20 een verbinding toedient, die alleen bij een pH beneden 7 toxisch voor tumorcellen is of die toxisch voor tumorcellen is en onoplosbaar in water is bij een pH beneden 7.
26. 27. Werkwijze volgens conclusie 26, met hét kenmerk, dat men de toegediende verbinding kiest uit 2.4-dinitrofenol, chloor m.cresol, 2.6-dinitro 25 o.cresol, 4-chloor 3.5-xylanol, chloorthymol, 2-fenyl 6-chloorfenol, 5-chloor 7-jood 8-chinilonol en podofyllotoxine.
27. 28. Werkwijze voor het behandelen van door bacteriën met β-glucuronidase-activiteit veroorzaakte infecties, met het kenmerk, dat men: aan de patiënt een alkalisch makend middel toedient in een voldoende hoe-30 veelheid om de pH van de inwendige weefsels van de patiënt op een waarde van circa 7,4 te houden; en een glucuronideverbinding, waarvan het aglycon toxisch is voor bacterie-cellen, in een tegen bacteriën werkzame hoeveelheid toedient, waardoor de β-glucuronidase-activiteit van de bacteriecellen deconjugatie > 35 van het glucuronide ter plaatse van de infectie veroorzaakt en daar het aglycon vrijmaakt.
28. 29. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat de bacterie-infectie een infectie is van streptococci, stafilococci of E. coli.
29. 30. Werkwijze volgens conclusie 29, met het kenmerk, dat het aglycon 7920107 v V - 31 - van de glucuronideverbinding een nitrilegroep bevat en dat men voorts aan de patiënt een voldoende hoeveelheid natriumthiosulfaat toedient om als tegengif voor cyanidevergiftiging te dienen.
30. 31. Verbinding gekenmerkt door het glucuronide van een cytotoxisch agly-5 con, dat een groter toxisch effect in zure omgeving dan in alkalische omgeving uitoefent of oplosbaar in water is in een alkalische omgeving en onoplosbaar of slechts weinig oplosbaar in water is in een zure omgeving.
31. 32. Verbinding volgens conclusie 31, gekozen uit 2.4-dinitrofenol-β-D-glucuronzuur, chloor m.cresöl-p-D-glucuronzuur, 4.6-dinitor o.cresol- 10 β-d-glucuronzuur, 4-chloor 3.5-xylanol^-D-glucuronzuur, chloorthymol-β-D-glucuronzuur, 2-fenyl 6-chloorfenol^-D-glucuronzuur, 5-chloor 7-jood 8-chinölinol^-D-glucuronzuur, podofyllotoxine^-D-glucuronzuur, p.joodfenol-β-D-glucuronzuur enfenylsulfazool^-D-glucuronzuur.
32. 33. Methacrylonitrile-β-D-glucuronzuur.
33. 34. Werkwijze voor het diagnostiseren van de aanwezigheid van tumorcel len met β-glucuronidase-activiteit, met het kenmerk, dat men: de tumorcellen hyperacidificeert; aan de patiënt een voldoende hoeveelheid van een alkalisch makend middel toedient om de pH van de niet-tumorweefseis van de patiënt op een waarde 20 van circa 7,4 te houden; een glucuronideverbinding toedient, waarvan het aglycon een radio-isotoop bevat, dat in staat is voldoende straling uit te zenden om gedetecteerd te worden door een aftasting op straling van het volledige lichaam; en het gehele lichaam van de patiënt aftast om de aanwezigheid en plaats van 25 een eventueel daarin geïmmobiliseerd radioactief aglycon te bepalen.
34. 35. Werkwijze voor het bepalen van de hoeveelheid vrij glucuronzuur in urine, met het kenmerk, dat men: het urinemonster behandelt met een voldoende hoeveelheid van een verzadigde oplossing van basisch loodacetaat om neerslaan van alle aanwezige glu-30 curoniden te veroorzaken; het neerslaan van de bovenstaande vloeistof scheidt; een voldoende hoeveelheid dithiocarbizon aan de bovenstaande vloeistof toevoegt om overmaat lood te verwijderen; de waterfase afscheidt; 35 aan de waterfase een tetraboraatverbinding in geconcentreerd zwavelzuur toevoegt om een chromogeen complex te vormen en het produkt van de voorafgaande stap omzet met m.hydroxydifenyl om een gekleurd, in water oplosbaar complex te vormen, waarvan de kleurdichtheid in direkte relatie staat tot de hoeveelheid vrij glucuronzuur in het monster. 7920107 ► - 32 - V
35. 36. Werkwijze voor het bepalen van de hoeveelheid vrij glucuronzuur in urine, met het kenmerk, dat men: het urinemonster met een voldoende hoeveelheid bariumhydroxide behandelt om neerslaan van alle aanwezige geconjugeerde glucuroniden te veroorzaken; 5 het neerslag van de bovenstaande vloeistof scheidt; aan de bovenstaande vloeistof een tetraboraatverbinding in geconcentreerd zwavelzuur toevoegt om een chromogeen complex te vormen en het produkt van de voorafgaande stap omzet met m.hydroxydifenyl om een gekleurd, in water oplosbaar complex te vormen, waarvan de kleurdichtheid in 10 direkte relatie staat tot de hoeveelheid vrij glucuronzuur in het monster.
36. 37. Werkwijze voor de vorming van conjugaten van vrij glucuronzuur met aglyconen, die sterke elektronenacceptoren zijn, met het kenmerk, dat men: het aglycon condenseert met methyl(tri-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl)haloge-nide-uronaat onder vorming van de methylester van het aglycon-tri-O-acetyl- 15 β-D-glucuronzuur; aan het produkt van deze condensatiestappen voldoende hoeveelheid bariumhydroxide toevoegt om een neerslag te vormen; dit neerslag afscheidt; het neerslag behandelt met een voldoende hoeveelheid zwavelzuur om het neer-20 slaan van bariumsulfaat te voltooien; de bovenstaande vloeistof van het produkt van deze behandelingsstap verwijdert; en deze bovenstaande vloeistof droogt ter verkrijging van het vrije glucuron-zuur-conjugaat van het aglycon.
37. 38. Werkwijze voor de bereiding van mandelonitrile-D-glucuronzuur, met het kenmerk, dat men: amandelzuuramide condenseert met methyl(tri-O-acetyl-a-D-glucopyranosyl)-halogenide-uronaat onder vorming van de methylester van amandelzuuramide-tri-O-acetyl-β-D-glucuronzuur; 30 het produkt van deze condensatiestap bij een voldoende hoge temperatuur en gedurende een voldoende lange tijd met azijnzuuranhydride behandelt om de methylester van mandelonitrile-tri-O-acetyl-β-D-glucuronzuur te vormen; aan het produkt van deze reactiestap een voldoende hoeveelheid bariumhydo-xide toevoegt om een wit neerslag te vormen; 35 dit neerslag afscheidt; het neerslag met een voldoende hoeveelheid zwavelzuur behandelt om het neerslaan van bariumsulfaat te voltooien; de bovenstaande vloeistof van het produkt van deze behandelingsstap verwijdert; en 7920107 V - 33 - V de bovenstaande vloeistof droogt onder verkrijging van mandelonitrile-β-Ό-glucuronzuur.
38. 39. Werkwijze voor het uitvoeren van een diagnose van de aanwezigheid van bacteriecellen met β-glucuronidase-activiteit, met het kenmerk, dat men: 5 aan de patiënt een voldoende hoeveelheid van een alkalisch makend middel toedient om de pH van de patiënt op een waarde van circa 7,4 te houden; een glucuronideverbinding toedient, waarvan het aglycon een radio-isotoop bevat, dat in staat is voldoende straling uit te zenden om gedetecteerd te worden door stralingsaftasting van het volledige lichaam; en 10 het gehele lichaam van de patiënt aftast ter bepaling van de aanwezigheid en plaats van een eventueel daarin geïmmobiliseerd radioactief aglycon.
39. 40. Farmaceutisch preparaat, gekenmerkt door een waterige oplossing van: een tegen tumoren werkzame hoeveelheid van een glucuronideverbinding, waarvan het aglycon toxisch is voor tumorcellen; 15 een hyperglycemisch middel in een voldoende hoeveelheid om bij toediening daarvan tumorcellen te hyperacidificeren; en een alkalisch makend middel in een voldoende hoeveelheid om de pH-waarde van niet-tumorweefsels van de patiënt bij toediening op circa 7,4 te houden.
40. 41. Preparaat volgens conclusie 40, met het kenmerk, dat de glucuronide verbinding een verbinding is, waarvan het aglycon een groter toxisch effect in zure omgeving dan in alkalische omgeving uitoefent of in water oplosbaar is in een alkalische omgeving en onoplosbaar of slechts weinig oplosbaar in water is in een zure omgeving.
41. 42. Preparaat volgens conclusie 40, met het kenmerk, dat het aglycon van de glucuronideverbinding een nitrilegroep bevat en dat het preparaat tevens natriumthiosulfaat bevat in een voldoende hoeveelheid om als tegengif voor cyanidevergiftiging te dienen.
42. 43. Preparaat volgens conclusie 42, met het kenmerk, dat de glucuronide-30 verbinding mandelonitrile^-D-glucuronzuur of methacrylonitrile^-D-glucu-ronzuür is. ? 9 2 0 1 0 7