-
Verfahren zur fermentatven Spaltung von Transportformen von Chemotherapeutika,
insbesondere Cancerostatica Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen
Spaltung von Chemotherapeutia, insbesondere Cancerostatika, das für die Chamotherapie
von Krevserkrankungen von Bedeu-tung ist, Für die chemische Behandlung von Krebskrankheiten
werden bestimmte chemische Substanzen angewendet, die als Cancerostatica und Cytostatica
bezeichnet werden0 Es handelt sich hierbei um alkylierende Substanzen, wie Lostderivate
(Endoxan, Sarkolysin, Degranol), Antimetabolite des Nukleinsäure stoffwechsels (Azauridin
Cytosinarabinosid, 5'-Fluoruracil), Mitosegifte xne Colchicin und bestimmte Antibiotika.
(Lit. 1 bis 7 und 9). Diese Substanzen werden -mit wenig Ausnahinen in der freien
Wirkform dem krebskranken Patienten oral oder parenteral zugeführt Infolge der meist
sehr hohen Giftigkeit dieser Stoffe nicht nur für Krebszellen, sondern annähernd
im gleichen Ausmaß auch für le benswichtige Normalzellen, z.B. das Knochenmark (Blut
regeneration), die Organe der immunologischen Abwehr (Milz, Thyrnus) und den Darm
ist die Anwendbarkeit und die therapeutische $Wirkung dieser chemischen Substanzen
sehr starl; eingeschränkt Je gen dieser hohen Giftwirkung dieser Stoffe ist die
Verabfolgung der für die völlige Ausheilung der Krebsgeschwülste erfonderlichen
Doise bei krebspatienten im fortreschrittenen Krankheitszustand nicht möglich, da
hierbei eine tödliche Vergiftung erfolgen würde.
-
einige Cancerostatica, z.B. das Endoxan, werden in kaschierter, wenig
giftiger Form appliziert, die Giftung erfolgt jedoch nocht im Tumor, sondern in
den Normalorganen, meist der Leber (Lit. 1 und 8). Das hat zur Folge, daß gleichzeitig
mit der Krebsgeschwulst auch des Normalgewebe
des Körpers von der
Giftwirkung betroffen wird, fast genau so wie bei den berei-ts in voll Oegifteten
Zustand applizierten mittel.
-
Es ist also festzustellen, daß das Ziel der Krebs-Chemotherapie, maximale
Schädigung der Krebszellen, ohne gleichzeitig Schädigung der normalen Organe und
Gewebe des Tumorträgers bisher nicht oder in nur ungenügendem Maße erreicht werden
konnte.
-
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zu finden,
das die Fermentative Spaltung von Transportformen der ChemotherapeutiL-a, insbesondere
Cancerostatica, erlaubt. Dieses Verfahren soll u.a0 geeignet sein, Krebsgeschwülste
im menschlichen und tierischen Organismus gezielt anzugreifen, ohne daß die normalen
Gewebe des Körpers eine das Leben des Gesamtorganismus beeintrgende Schädigung erfahren.
-
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die ferlentative
Spaltung im schwech sauren Mediumk, vorzugsweise im pH-Dereich 6,6-7,0 durchgeführt
wind. Zur Durchführung des Verfahrens sind a) die zur Herstellung der Transportformen
der Chemotherapeutika, insbesondere Gancerostatica, geeigneten Schutzgruppen und
b) die zu den betreffenden Transportformen spezifisch passenden Fermente zu finden.
-
Die zur Abspaltugn im schwuch sauren Medium geeigneten Schutzgruppen
sind vorzugsweise so zu wählen, daß die entstehende Transportform des Chemothempeutikums
für menschliches und tierisches Gewebe ungiftig ist.
-
Die spezifischen Fermente werden vorzugsweise so gewählt, daß sie
ausschließlich oder starL bevorzugt in erfindungsgemäß verwendeten schwach sauren
Milieu wirken und im pH-Bereich der Normalorgane und der Blutes (~ 7,4) nicht oder
nur noch in geringem Haße wirksam sind.
-
Als therapeutisch nutzbare Transportformen mit der gleichzeitigen
Eigenschaft eines spezifischen Fermentsubstrates werden verschiedene Derivate von
ira sauren Bereich günstig spaltbaren Phosphamiden, ß-Xylosiden, ß-Arabinosiden,
Nannosiden, B-Glukosiden, α-Galaktosiden, B-Glukurjoniden, Gallussäureestern,
sauren Carbonsäureestern, Peptiden und Sulfatestern von folgenden Kategorien der
Cancerostatica verwendet: a) Alkylantien vom Typ des (bis-Chloräthyl)-hydroxyanilins,
Degranols, Endoxans, Sarkolysins ; b) Cancerostatischen Mukleinsäureantimetaboliten,
z.B.
-
Hydroxyharnstoff, Azaserin, antimetabolischen Nukleosiden und Nukleinsäurebasen,
wie Cytosinarabinosid, 5-Fluoruridin, 6-Fluoruracil und c) Aminosäureantimetaboliten
und Folsäure-Antagonisten.
-
Weiterhin B-Xyloside, Arabinoside, B-Glukoside, B-Glukuronide sowie
Phosphatester verschiedener arnmatischer Substanzen wie halogenierter Plienole und
Phenolderivate mit hoher Giftwirkung auf Tumorzellen und günstiger pH-Abhängigkeit
der fermentativen Spaltung (z.B. α - und B-Naphthol-ß-Glukosid, o-kre sol-ß-Glukosid),
sowie Transportformen obiger fermentspezifischer Art aus mitosehemmenden Antibiotika
und Alkaloiden. Als Fermente werden vorzugsweise körperfremde Fermente verwendet,
z.B.
-
saure Phosphatasen, Phosphamidasen, ß-Xylosidasen, ß-Arabionsidasen,
ß-Glukosidasen, Mannosidasen, α-Galaktosidasen, ß-Glukuronidasen, Tannasen,
Esterasen, verschiedene Proteasen und Peptidasen, Sulfatasen.
-
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Mrebstherapie
beruht darauf, daß die von marburg entdeckte starke Glykolyse des Tumorgewebes infolge
der Milchsäurebildung und deren Anreicherung im Tumor eine pH-Wert-Verschiebung
nach der sauren Seite im Krebsgewebe hervorruft.
-
Die praktische Durchführung der Therapie erfolgt in folgender Weise
: Die Transportform des Chemotherapeutikums wird z., oral oder intravenös appliziert.
Durch die gleichzeitige parenterale (intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale)
Applikation eines zu dieser Transportform als Substrat spezifisch passenden Ferments,
das infolge der besonderen Milieuabhängigkeit seiner Wirkung ausschließlich oder
stark bevorzugt im jeweiligen Krankheitsherd (Krebsgewebe) wirksam ist, wird in
diesem vorrangig - durch Abspaltung der die Toxität und spezifische Wirkung kaschierenden
Molekühlgruppen ungiftige Transportform des applizierten Chernotherapeutikums in
die therapeutische Wirkform umgewandelt.
-
Für die Anwendung dieses Verfahrens für die Krebstherapie ist also
eine starke Säuerung des Tumorgewebes von entscheidender Bedeutung. Eine starke
Steigerung der H-Ionen-Konzentration im Tumor und damit eine Erhöhung der SeleL-tivität
der fermentativen Giftung in einer auf den Tumor lokalisierten und damit die Gefahr
eines hyperglykämischen Schocks weitgehend vermeidbaren Form, verbessert und erweitert
die Anwendungsmöglichkeiten des Verfahrens.
-
Diese Steigerung kann durch eine formentative, pH-abhängige Spaltung
einer säurefreisetzenden Substanz erreicht werden, z.B. durch : - die Kombination
vcn bevorzugt i:n sauren Bereich spaltender Invertase mit rohrzucher als Substrat,
wobei Glukose gebildet wird, die zu einer starken Steigerung der Milchsäurebildugn
im Tumpr führt, oder - durch Verwendung von saurer Sulfatase in der Mombination
mit Glukose-6-sulfat oder Rohrzuckersulfst, wobei Glukose und H2SO4 frei wird, oder
- von saurer Phosphatase mit verseniedenen Phosphatestern, speziell phesphorylierter
Glukose oder Phosphatestern, anderer Zucker, wobei H3PO4 geliefeat wird sowie durch
weitere im sauren Bereich Glukose oder Säuren freisetzende Porment-Substra@@@@@@@lonen.
-
Zusätzliche Möglichkeiten zur weiteren Optimierung der Selektivität
des erfindungsgemäßen Transportform-Enzymverfahrens bei der Therapie von Krebserkrankungen
bei einer zusätzlichen Schutswirkung der Normalgewebe, speziell der für die ummunologische
Abwehr und Blutbildung wichtigen Organe (Milz, Thymus,Knochenmark) ergeben sich
auf folgende Weise : - durch Drosselung einer evtlO Restgiftung der Transportform
in den betreffenden Normalorganen durch eine -Steigerbung der Alkalität ihrer Gewebsflüssigkeit
durch gleichzeitige Applikation von natürlichen oder artifiziellen basischen Polymeren
(zoBo basischen Proteinen, wie Protaninen oder Histonen oder von basischen NH2 Gruppen
enthaltenden Polysacchariden), wodurch die Aktivität der bevorzugt im sauren Bereich
wirksamen giftenden Enzyme in den Nermalorganen noch weiter gedrosselt werden kann.
-
- durch gleichzeitige Applikation von Substrat-Ferment-Kombinationen
durch die im sauren Bereich Substanzen, z.B. Histamin, freigesetzt werden, durch
welche die durchlässigkeit der Gefäßkapillaren im Tumor für Fermente und Substrate
gesteigert wird (z.B. die Kombination einer im sauren Bereich wirksamen Histidindecaroxylase
mit Histidin als Substrat).
-
- durch zusätzliche Applikation von im neutralen oder schwach alkalischen
pH-Bereich bevorzugt wirkenden Fermenten, die sich in den Organen der Blutbildung
und immunologischen Abwehr (Milz, Thymus, Knochenmark) besonders anreichern und
hier a) das bereits gegiftete Cancerostaticum durch ferientativen Abbau inaktivieren
(z.B. Inaktivierung von Purinantimetaboliten vom Typ des 8-Azaguanin, 6-Mercaptopurin
oder 6-Chlorpurin durch Purindesaminasen [Guanase] oder durch Xanthinoxydase) ;
b) die Giftwirkugn des Antimetaboliten auf die genannten Nommalgewebe dadurch stark
eingeschränkt wird, daß aus einer stoffwechselinaktien Transportform des entsprechenden
normalen Metaboliten, dieser in ausereichenden Mengen in den geannten Normalorganen
fermentativ freigesetzt wird und auf dem Wege der kompetitven Hemmung den
toxischen
Effekt des Antimetaboliten aufhebt (z.B. Freisetzung von normalen Cytosinnukleosiden
durch Spaltung von Cytosinribosid-ß-Galaktosid durch zugeführte ß-Galaktosidaseund
dadurch bedingte Aufhebung der Giftwirkung des Antimetaboliten Oytosinarabinosid).
-
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Therapie von Krebserkrankungen
übe rwinde t die bisherigen Schwierigkeiten, die sich aus der hohen allgemeinen
und lebensgefährdenden Giftwirkung der bisherigen Cancerostatica ergeben haben,
Dem Organismus wird eine für die Hormalorgane völlig oder nahezu ungiftige chemische
Substanz zugeführt, die durch die gleichzeitige Verabfolgung einer zweiten Substanz
ausschließlich im Erebsgewebe gegiftet wird. Das Normalgewebe bleibt verschont und
selbst bei hoher Dosierung der Antikrebssubstanz tritt Leine lebensbedrohliche Gefährdung
ein.
-
Weiterhin ist das Verfahren insbesondere zur gezielten Abtötung der
Krebszellen bei Menschen und Tieren anwendbar, bei denen die Krankheit bereits weiter
fortgeschritten ist und stärkere Ausbreitung im Organismus vorliegt.
-
íDs sind besonders die Stadien, in denen Operationen und Bestrahlungen
weitgehend unwirksam sind. Infolge der selektiven Giftung können vor allem Krebskrankheiten
im Stadium der metastasierung mit dem neuen Verfahren erfolgreich behandelt werden.
-
Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen erläutert
werden: In den Fig. 1 bis 4 ist die pH-Abhängigkeit der Spaltung der Transportfofl-rnflen
von Chemotherapeutika durch verschiedene Fermente dargestellt, wobei die Werte für
pH 6,0 und 7,4 verglichen werden. Die abszisse stellt den pH-Wert und die Ordinate
den Prozentsatz der Spaltung dar.
-
Ansatz gem. Fig. 1 1) substrat : a) Phenyl-ß-D-glukosid 0,5 g b) o-Kresyl-ß-D-glukosid
0,5 5 2) Rerment : ß-Glukosidase aus Mandeln (S Salycin E/mg Protein) 50 µ g/ml
3)
Phosphatpuffer 5,0 - 7,4 4) Inkubation 30° C/60' (Minuten) Bestimmung der freigesetzten
Glukose mittels der Glukose-Oxydase-Methode 50 Relation der pH-abhängigen Fermentwirkung
bei Substrat 1a) 6,0:7,4 = 13,1 Relation der pH-abhängigen Fermentwirkung bei Substrat
1b) 6,0:7,4 = 6,6:1 Ansatz gen. Pig. 2 1) Substrat: ß-Napthyl-ß-D-Glukosid 4 mg/ml
2) Ferinent: ß-Glukosidase aus mandeln ( 3 Salycin B/mg Protein) 50 G /ml 3) Inkubation
in Pufferlösung 5,2 - 7,4, 300 C/30' 4) Bestimmung der freigesetzten Glukose mittels
der Glukose -Oxydase -Methode 5) Relation der pH-abhängigen Fermentwirkung 6,0:7,4
7:1 Ansatz gem. Fig. 3 1) Substrat : 4-Methylumbelliferyl-ß-Xylosid 100 µg/ml 2)
Ferment : Encymanreicherung aus Aspergillus niger nach Züchtung auf Hitze-hydrolisierter
Reiskleie 1 µg/ml 3) Phosphatpuffer differenter pH-Stufen (6,0-7,4); 300 C 4) Fluorometrische
Pestiiiuiiung des freigesetzten 4-; thylumbellife rons 5) Relation der pH-abhängigen
Fermentwirkung 6,0:7,4 = 12:1 Ansatz gem. Fig. 4 1) Substrat : p-Mitrophenylphosphat,
Konz. 7,5 mMol 2) Ferment : Aus kartoffeln mittels (NH4)2 SO4 - Fällung und Säulenchromatographie
gewonnene saure Phosphatase : 200 µg/ml 3) Inkubation bei den verschiedenen pH-Werten
bei 37° C/5' pH 6,0 : Acetatpuffer pH 6,0 : Imidazolpuffer 4) spektrophotometrische
Bestimmung des freigesetzten p-Hitrophenols bei 395 mm Wellenlänge 5) Relation der
pH-abhängigen Fermetnwirkung 6,0:7,4 = 11:1 Fig. 5 bis 13 zeigt die Anwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens für eine Abtötung von Aszites-Krebszellen in vitro.
-
Die Abisse gibt die Inkubationszeit (einwirkzeit) in Stunden (h),die
Ordinate den Prozensatz der abgetöteten Krebszellen an. Murve A stallt das Substrat
+ Pemment bei pH 6,0 und Aurve das Subatent + Lerment bei pH 7,4 dar. Murve C ist
substrat ohne Ferment bei 6,0 und Murve D Substrat ohne Ferment bei pH 7,4.
-
Ansatz gem. Fig. 5 1) Substrat: Cyclohexyl-ß-D-Glukosid Endkonzentration
2 % 2) Ferment : ß-Glukosidassaus Mandeln ( 3 Salycin E/mg) 1 mg/ml 3) Medium :
physiolog. NaCl-lösung-Serum (20 %) -Phosphatpuffe-Gemische + 0,5 % Glukose 4) 5
mg Aszites-Ca-Zellen (Frischgewicht/ml) 5) Temperatur 37° C/Schüttelapparat Einwirkungszeit
7/h 6) Relation der Krebs zellen abtötenden Wirkung pH 6,0 : 7,4 20 : 1 Ansatz gem.
Fig. 6 1) Substrat : 6-Brom 2-Naphtyl-ß-D-Glukosid Endkonzentration 0,1 % 2) Ferment
; ß-glukosidase aus Mandeln (3 Salycin E/mg) Protein) 50 µg/ml 3) Medium : physiol.
NaCl-Lösung - Serum (20 %) -isotonische Phosphatpuffer (30 %) - Gemisch + 0,5 %
Glukose 4) Ehrlich-Aszites-CA-Zellen 5mg Frischgewicht pro ml 5) Temperatur 37°
C/Schüttelapparat Eintirkungszeit 5 h 6) Relation der Krebszellen abtötenden Wirkung
pH 6,0:7,4 12:1 satz Zem. Fig. 7 1) Substrat : 3,5 Dichlorphcnyl-ß-D-Glukosi (gesättigt
= 0,2 %/ml) 2) Ferment : ß-Glukosidase aus Mandeln ( 3 Salycin E/mg Protein) 50
µg Fermentprotein/ml 3) Medium : Physiolog. NaCl-Lösung-Serum (10 %) isoten. Phosphatpuffer
(30 %) - Gemisch + 0,5 % Glukose 4) Ehrlich-Ascites-Ca-Zellen 5 mg Frischgewicht/ml
5) Temperatur 37°/Schättelapparat, Einwirkungszeit 2 h 60 Relation der abtötenden
Wirkung zwischen pH 6,0:7,4 4,3:1
Ansatz gem. Fig. 8 1) Substrat
: ß-Naphtyl-D-glukosid, Endkonzentration 0,5 % 20 Ferment : ß-Glukosidase aus Mandeln
( 3 Salycin E/mg Protein) 100 µg/ml 3) Medium ; isoton. NaCl-lösung-Kälberserum
(50 %) Phosphatpuffer (20 %) - Gemisch (pH 6,0 bzw.
-
7,4) + 0,5 Glukose 40 Ehrlich-Ascites-Ca-Zellen (5 mg Frischgewicht/ml)
5) Temperatur 370 C/Schüttelapparat Inkubationszeit 4,5 h 6) Relation der Krebszellen
abtötenden Wirkung pH 6,0:7,4 4:1 Ansatz gemO Fig. 9 1) Substrat: Anilinlost-ß-Glukosid
in para Stellung Endkonzentration 0,2 % 2) Ferment : 13-Glukosidase aus I.Iandeln
( 3 Salycin E/mg) 0,5 mgj/m.
-
3) Medium : physiolog. NaCl-Lösung + 30 isoton. Phosphatpuffer pH
6,0 bzw. 7,4 + 0,5 % Glukose 4) Ehrlich-Aszites-Ca, 5 mg Frischgewicht pro ml 5)
Temperatur 370 C/Schüttelapparat ; Einwirkungszeit 4 h 6) Relation der abtätenden
Wirkung A: B 3,6 : 1 Ansatz gemO Fig. 10 1) Substrat: Phenyl-ß-D-Glukosid, Endkonzentration
2 % 2) Ferment : ß-Glukosidase aus Mandeln ( 3 Salycin E/mg) 0,4 % Endkonzentration
3) Glukose 0,2 ;; Endkonzentration - ketogluarat 0,2 % Endkonzentration 4) pH beim
Start aller Proben 7,4 (Einstellung mit schwachem Puffer) 5) Ehrlich-Ascites~Krebszellen
20 mg Frischt/ml (2 mal auf der Zentrifuge gewaschen) Einwirkungszeit 3 h 6) Kurve
1 = Substrat + Ferment + Glukose Kurve 2 = Substrat + Ferment + -Ketoglutarat (keine
Glukose) = eckige Klammer 7) Relation der abtötenden Wirkung zwischen Kurve 1 und
2 5:1
Ansatz gem. Fig. 11 1) Substrat : ß-Nitrophenyl-ß-Xylosid,
Endkonzentration 0,2 % 2) Ferment : ß-Xylosidase aus Aspergillus niger 1 mg Fermentpräparat/ml
3) Medium : physiolog. NaCl-Lösung - Kälberserum (20 %) Phosphatpuffer (20 %) -
Gemisch + 0,2 % Glukose 4) Ehrlich-Ascites-Krebszellen 5 mg Frischgewicht/ml 5)
Temperatur 37° C/Schüttelapparat 6 h 6) Relation der Krebszellen abtötenden Wirkung
zwischen pH 6,0:7,4 12:1 Ansatz gem. Fig. 12 1) Substrat : Phenyl-ß-D-Glukorinid.
Endkonzentration 0,2 % 2) Ferment : ß-Glukuronidase-Präparation aus Kälberleber
2,5 mg/ml 3) Medium : isotonische NaCl-Lösung mit 25 % Phosphat puffer (pH 6,0 bzw.
7,3) + 0,2 % Glukose 4) ausgewaschene Ehrlich-Aszites-Ca-Zellen 5 mg Frischgewicht/ml
5) Temperatur 37° C/Schüttelapparat ; Einwirkungszeit 4 h 6) Relation der Krebszellen
abtötenden Wirkung pH 6,0:7,4 3,7:1 Ansatz gem. Fig. 13 1) Substrat : ß-Nitrophenylphosphat,
Endkonzentration 0,5 % 2) Ferment : Proteinfrakton aus Kartoffeln mit hoher Aktivität
an sauren Phosphatasen 0,1 mg Protein/ml 3) Medium : gepufferte physiolog. NaCl-Lösung
mit 0,2 % Glukose 4) Temperatur 37 % C/Schüttelapparat Einwirkungszeit 3 h 5) Relation
der Krebesellen abtötenden Wirkung pH 6,0:7,4 6:1
Fig. 14 zeigt
die unterschiedliche Abtötung von Krebs-und Normalzellen in vitro bei Gegenwart
von Glukose.
-
Ansatz 1) Substrat : Phenyl-ß-D-Glukosid, Endkonzentration 2 % 2)
Ferment : ß-Glukosidase aus Mandeln ( 3 Salycin E/mg Protein), 0,2 % Endkonzentration
3) Inkubationsmedium : isotonische NaCl-Lösung auf pEI 7,4 eingestellt mit 0,2 %
Glukose (Endkonzentration) 4) Zellen: a) Ehrlich-Ascites-Krebszellen 5 mg Frischge
wi cht /ml b) frische, mechanisch isolierte Thymus-und Milzzellen (Normalzellen)
der Maus 5 mg Frischgewicht/ml 5) Temperatur 37 % c/Schüttelapparat Einwirkungszeit
3 h 6) Kurve A = Krebszellen (Substrat + Ferment) = Normalzellen (Substrat + Ferment)
iSig 15 zeigt eine gezielte Glukoseversorgung von Krebszellen zum Zwecke einer weiteren
Optimierung der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
-
Ansatz 1) Ferment: Invertasepräparat auf Hefe (IIydrolyse von 100
Micromole Saccharose/ 1 Rinute / 55° / pH 4,5) 2 mg/ml 2) Substrat : Rohrzucker
1 % Endkonzentration (Ansatz A + 3) Glukose (Ansatz :D) 0,5 %1 Laktat (Ansatz B
+ C) 0,2 ; 30 Medium : physiol. NaCl-Lösung mit gerin er Phosphatpuffermenge auf
pII 7,4 in allen Ansätzen eingestellt 4) Temperatur 37° C/Schüttelapparat, Einwirkungszeit
5 h
5) Ansatz : Rohrzucker ; Invertase ; Glukese, Laktat A + +
- -B + - - + C - + - -D - - + -