NL1013308C2 - Antimicrobiële enzymen in diervoeder. - Google Patents

Description

Antimicrobiële enzymen in diervoeder 5 Gebied van de uitvinding

Deze uitvinding heeft betrekking op het gebruik van antimicrobiële enzymen, zoals oxidasen en lysozym, en een meervoudig onverzadigd vetzuur (MOVZ) in voeders voor (monogastrische en niet-herkauwende) dieren ter bevordering van de groei en de verhouding in varkens, pluimvee, 10 vissen en mestkalveren.

Achtergrond van de uitvinding

Dieren zoals varkens, pluimvee, mestkalveren en vissen worden op intensieve wijze geteeld respectievelijk gekweekt voor de productie van 15 vlees, vis en eieren. Deze dieren krijgen een dieet dat allerlei basismaterialen van dierlijke of plantaardige oorsprong bevat, waardoor energie en eiwit worden geleverd. Het meeste voer dat wordt geconsumeerd, wordt commercieel geproduceerd door de mengvoederindustrie, maar een significant deel wordt op de boerderij 20 geproduceerd en direct, ..aan. de beesten gevoerd. Het voer wordt aangevuld met vitamines en mineralen om te voldoen aan de behoeften van dieren aan deze essentiële,voedingsstoffen. Voor pluimvee wordt het voer ook aangevuld met.coc_cidios_tatica om coccidiosis te voorkomen. Het gebruik van industrieel geproduceerde enzymen als voederadditieven is 25 bijna algemeen gebruikelijk geworden. Voorbeelden van dergelijke enzymen zijn o.a. fytasen, alfa-amylasen, proteasen en diverse enzymen die de celwand van planten afbreken, zoals β-glucanasen, endoxylanasen en mannanasen.

Deze enzymen worden gebruikt ter bevordering van de groei en van 30 de voederconversieverhouding en om de milieuvervuiling die wordt veroorzaakt door mest van varkens, pluimvee en vissen te verminderen.

1013308 -2-

De voederkosten vormen echter de belangrijkste kostenfactor bij de productie van dieren.

In de jaren '50 kwam men tot het besef dat de toevoeging van een kleine hoeveelheid antibiotica aan diervoeder tot verbeterde zoötechnische 5 resultaten leidde in monogastrische dieren. Heden ten dage worden antibiotica standaard als voederadditief toegepast. De manier waarop deze antibiotica werkzaam zijn bij de verbetering van de groei en de voederconversieverhouding is nog steeds niet geheel duidelijk. De generieke term voor deze klasse van voederadditieven is io groeibevorderaars. Voorbeelden van groeibevorderaars zijn o.a. virginiamycine, tylosine, flavomycine en avoparcine.

De resistentie van humane pathogene bacteriën tegen antibiotica neemt snel toe. Dit maakt het moeilijker mensen te genezen van bacteriële infecties. Diverse experts hebben het wijdverbreide gebruik van antibiotica 15 in diervoeder de schuld gegeven van de versnelde opbouw van resistentie tegen diverse antibiotica. Dit heeft ertoe geleid dat in Zweden het gebruik van alle antibiotica als groeibevorderaar in diervoeder verboden is, terwijl in Denemarken het gebruik van specifieke antibiotica, zoals avoparcine, als groeibevorderaar in diervoeder verboden is. Vanwege de druk die wordt 20 uitgeoefend door consumentenorganisaties en organisaties op het gebied van de gezondheidszorg zullen andere landen dit voorbeeld waarschijnlijk volgen . De voederindustrie is derhalve zeer geïnteresseerd in natuurlijke additieven met groeibevorderende effecten die geen therapeutische toepassingen voor mensen hebben.

25 Van bepaalde enzymen is bekend dat ze als antimicrobiële middelen werkzaam zijn, en deze kunnen toegepast worden bij het conserveren van voedsel. Glucose-oxidase is ook voorgesteld voor het bewaren van kuilvoer en ingekuild graan (WO-A-98/01694, Suomen Sokeri Oy).

Enzymen die de celwand van planten afbreken, zoals mannanase en 30 /?-glucanasen, worden gebruikt als voederadditief voor diëten met grote hoeveelheden /?-glucan en mannan om de door deze zetmeel-vrije 1013308 -3- polysacchariden veroorzaakte viscositeit in het maag-darmkanaal van monogastrische dieren te verminderen. Deze enzymen hebben ook een zekere mate van antischimmel activiteit, maar ze vertonen geen enkele antibacteriële activiteit.

5 Het antibacteriële enzym lysozym is ook als groeibevorderaar toegevoegd aan het voer voor monogastrische dieren (Latvietis, J.,ef al, In: Vitamine Zusatzstoffe in der Ernaehrung von Mensch und Tier, Symposium 5th (1995), onder redactie van Rainer Schubert et al., Jena, 28-29 september, ISBN 3.00.000361-4). Deze auteurs voegden uit eiwit io bereid lysozym toe aan het voer van slachtkuikens en mestkalveren. Gesteld werd dat de groei en de voederconversieverhouding werden verbeterd. Het concept van de toepassing van mengsels van antibacteriële enzymen in combinatie met enzymverbeteraars (bijv. MOVZs) is echter niet gepubliceerd.

15 Het is derhalve wenselijk voor boeren en voor de mengvoederindustrie om tegen minimale kosten en op duurzame wijze een optimale groei en een optimale voederconversieverhouding te verkrijgen, rekening houdend met de eisen van zowel consumentenorganisaties als organisaties op het gebied van de 20 gezondheidszorg.

Beschrijving van de Uitvinding

De onderhavige uitvinding verschaft een additiefsamenstelling voor diervoeder welke een mengsel van antimicrobiële enzymen omvat dat 25 synergetische effecten kan vertonen. Het effect van het of elk enzym kan verhoogd worden door de aanwezigheid van één of meer MOVZs. Dit kan leiden tot verbetering van de groei en verhouding van dieren zoals varkens, pluimvee, mestkalveren en water- of zeedieren zoals vissen en kan het mogelijk maken te werken zonder een antibioticum als 30 groeibevorderaar.

Een eerste aspect van de uitvinding heeft betrekking op een additiefsamenstelling voor diervoeder die geschikt is voor een f013308 -4- monogastrisch of niet-herkauwend dier, welke samenstelling ten minste twee antimicrobiële enzymen en (als enzymverbeteraar) een meervoudig onverzadigd vetzuur (MOVZ) bevat.

Bij voorkeur zijn één of twee van de enzymen antibacteriële 5 enzymen. Deze enzymen kunnen van verschillende types zijn en/of een verschillende activiteit hebben. Een, bijv. een eerste, enzym kan in staat zijn de celwand van bacteriën aan te tasten. Het enzym kan er een zijn dat peptidoglycanen aan kan tasten of af kan breken. Het enzym kan bijv. in staat zijn peptidoglycanen af te splitsen. Een enzym waaraan de voorkeur 10 wordt gegeven voor deze taak is lysozym. Dit (eerste) enzym kan aanwezig zijn in een concentratie die 50.000 tot 150.000, bijv. 70.000 tot 130.000, en in het optimale geval 90.000 tot 110.000 Shugar eenheden oplevert per kilogram (of eenheid) diervoeder. In gewichtstermen kan dit eerste enzym derhalve aanwezig zijn in een 15 hoeveelheid die een concentratie oplevert in het diervoeder van 1 tot 8 gram per kg voeder, bij voorkeur van 2 tot 7 gram per kg voeder en in het optimale geval van 3 tot 5 gram per kg voeder.

Het tweede enzym kan in staat zijn een verbinding te genereren die toxisch is voor de bacteriën. Dit kunnen dezelfde bacteriën zijn als, of 20 andere bacteriën dan, de bacteriën waarvan de celwanden aangetast of afgebroken kunnen worden door het eerste enzym. De verbinding is bij voorkeur een peroxide, bijv. waterstofperoxide. Enzymen waaraan derhalve de voorkeur wordt gegeven zijn oxidasen. Bijzondere voorkeur wordt gegeven aan glucose-oxidase. Dit tweede enzym kan aanwezig zijn 25 in een concentratie die 500 tot 1500, bij voorkeur 700 tot 1300, en in het optimale geval 900 tot 1100 Sarett E per kilogram (of eenheid) voeder oplevert. Dit tweede enzym kan derhalve bij voorkeur aanwezig zijn in een gewichtshoeveelheid die resulteert in een eindconcentratie in het diervoeder van 1 tot 8 gram per kg voeder, bij voorkeur van 2 tot 7 gram 30 per kg voeder, en in het optimale geval van 3 tot 5 gram per kg voeder.

f013308 -5-

Enzymen kunnen op de volgende manieren als antimicrobiële middelen fungeren: a) aantasting van de celwand b) vorming van een toxische verbinding 5 c) verwijdering van een essentiële voedingsstof; of d) inactivering van enzymen die essentieel zijn voor de groei.

Hieronder wordt elk van deze manieren achtereenvolgens besproken.

a) De structuur van microbiële celwanden varieert voor 10 schimmels, gisten, gram-negatieve en gram-positieve bacteriën. Men kan verschillende enzymen nodig hebben om de celwand van deze verschillende soorten micro-organismen aan te tasten. De celwand van schimmels en gisten, bijvoorbeeld, kan worden aangetast door mannanasen, chitinasen en betaglucanasen. De bacteriële celwand is 15 echter niet gevoelig voor deze enzymen vanwege een andere soort structuur. Gram-positieve organismen hebben een laagje peptidoglycan bedekt met wat eiwit, maar bestaat in wezen enkel uit peptidoglycan. Dit substraat kan afgebroken worden door de werking van lysozym (1,4-/?-acetylmuramidase), dat peptidoglycanen splitst tussen de C1 van N-20 acetylmuraminezuur en de CA van N-acetylglucosamine.

De peptidoglycanlaag is bedekt met een dichte laag lipopolysaccharide-eiwit-tweew99rdig kation-fosfolipide in gram-negatieve bacteriën. Deze laag kan de werkzaamheid van lysozym in gram-negatieve bacteriën belemmeren. Middelen die in staat zijn deze dichte 25 lipopolysaccharidelaag aan te tasten, stimuleren de werking van lysozym doordat ze het enzym toegang verschaffen tot de peptidoglycanlaag.

b) Oxidasen zijn in staat waterstofperoxide te produceren, hetgeen dodelijk is voor de^meeste micro-organismen. Glucose-oxidase, bijv., katalyseert de omzetting van glucose in gluconzuur en 30 waterstofperoxide. Xanthine-oxidase, aanwezig in melk, is eveneens in staat waterstofperoxide te vormen.

1013308 -6-

Andere antimicrobiële verbindingen die enzymatisch gevormd kunnen worden, omvatten hypothiocyanaat (geproduceerd door lactoperoxidase), chloraminen (geproduceerd door myeloperoxidase), vrije vetzuren (geproduceerd door lipase), meervoudig onverzadigde vetzuren, 5 lysofosfatidylcholine (geproduceerd door fosfolipase A2) en xylitol-5-fosfaat (geproduceerd door xylitolfosforylase). Deze lijst is echter verre van compleet.

c) Zuurstof kan uit de media verwijderd worden door middel van oxidasen zoals bijv. glucose-oxidase. Volledige verwijdering van zuurstof 10 verhindert de groei van aërobe micro-organismen.

d) Enzymen die essentieel zijn voor de groei van micro-organismen kunnen door middel van andere enzymen geïnactiveerd worden. Sulfhydryloxidasen zijn bijv. in staat enzymen te inactiveren die voor hun activiteit afhankelijk zijn van actieve sulfhydrylgroepen.

15 De samenstelling kan enzymverbeteraar omvatten, zoals een verbinding die de werking van het of elk antimicrobieel (bijv. antibacterieel) enzym significant kan verbeteren, bij voorkeur op synergetische wijze. De enzymverbeteraar kan één of meer meervoudig onverzadigde vetzuren, ook bekend als MOVZs, omvatten. Het of elk 20 MOVZ kan tot de n-3 of de n-6 familie behoren. Bij voorkeur is het een C18, C20 of C22 MOVZ. Het MOVZ kan verschaft worden in de vorm van een vrij vetzuur, zoals een vetzure ester (bijv. methyl- of ethylester), als een fosfolipide en/of in de vorm van een triglyceride.

MOVZs waaraan de voorkeur wordt gegeven zijn o.a. arachidonzuur 25 (ARZ), docosohexaeenzuur (DHZ), eicosapentaeenzuur (EPZ) en/of γ-linolzuur. Van deze heeft ARZ de voorkeur.

De MOVZs kunnen afkomstig zijn van een natuurlijke (bijv. plantaardige of uit de zee afkomstige) bron of afgeleid zijn van een enkele cel of microbiële bron. In het bijzonder kan het MOVZ geproduceerd 30 worden door een bacterie, schimmel of gist. De voorkeur wordt gegeven aan schimmels, bij voorkeur van de orde Mucorales, bijv. Mortieref/a, * 01330'® -7-

Pythium of Entomophtora. Bij voorkeur is ARZ afkomstig van MortiereUa alpina of Pythium insidosum.

Het MOVZ kan aanwezig zijn als een olie. Geschikte oliën met ARZ zijn te verkrijgen bij DSM N.V., Wateringseweg 1, Postbus 1, 2600 MA 5 Delft, Nederland, onder de handelsnaam VEVODAR™. Een andere commercieel verkrijgbare olie is ARASCO™ van Martek Corporation, 6480 Dobbin Road, Columbia, MD 21045, Verenigde Staten. Er zijn ook andere MOVZs beschikbaar, bijv. DHZ als een DHZ olie (DHASCO™ van Martek Corporation, of DHZ van Pronova, Noorwegen, onder het handelsmerk ίο EPAX™).

Het MOVZ is bij voorkeur aanwezig in een concentratie die het mogelijk maakt het aan het diervoeder toe te voegen zodat er een eindconcentratie verkregen wordt van 0,1 of 1 tot 1000, bijv. van 0,5 tot 50 of 1 tot 100, en bij voorkeur van 1 tot 10 gram per kilogram (of 15 eenheid) voeder.

Al de antimicrobiële enzymen kunnen op industriële schaal geproduceerd worden en/of kunnen recombinant zijn. Lysozym is commercieel verkrijgbaar, uit eiwit geïsoleerd, of kan recombinant zijn. Het of elk enzym kan in de natuur voorkomen of kan een (bijv. 2o recombinante) variant of mutant daarvan zijn.

Het of elk antibacteriële enzym wordt bij voorkeur recombinant geproduceerd zoals door expressie van een heteroloog gen of cDNA in een geschikt organisme, of anders door homologe (over-)expressie van een geschikt endogeen gen. Het glucose-oxidasegen, bijv., is tot overexpressie 25 gebracht in recombinante systemen.(WO-A-89/12675, Chiron). Lysozym (uit eiwit) kan recombinant tot expressie worden gebracht door expressie van het gen in Aspergillus niger (Archer, D.B. ef at., Bio/Technology 8: 741-745 (1990)). Lysozym-mutanten (geproduceerd door eiwitmodificatie die een betere hittebestendigheid en sterkere antimicrobiële werking 30 hebben, kunnen ook worden gebruikt .

1013308 -8-

De antimicrobiële enzymen die in de uitvinding gebruikt worden, zullen doorgaans ofwel enzymen zijn die geen natuurlijk bestanddeel vormen van het diervoeder ofwel aanwezig zijn in het voeder in een concentratie die afwijkt van de natuurlijke concentraties ervan.

5 Een tweede aspect van de onderhavige werkwijze heeft betrekking op een diervoedersamenstelling die ten minste twee antimicrobiële enzymen en een MOVZ omvat. Net als met de additiefsamenstelling kan een eerste enzym in staat zijn de celwand van bacteriën aan te tasten en kan een tweede enzym in staat zijn een verbinding te genereren die 10 toxisch is voor de bacteriën.

Een derde aspect van de uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een diervoedersamenstelling, welke werkwijze het toevoegen aan één of meer eetbare voedersubstantie(s) of -bestanddeel (-bestanddelen) omvat van twee of meer antimicrobiële 15 enzymen en een MOVZ, of een additief volgens het eerste aspect.

De enzymen en/of het MOVZ kunnen/kan afzonderlijk van de voedersubstantie(s) of -bestanddeel (-bestanddelen) toegevoegd worden aan de diervoedersamenstelling, individueel of in combinatie met andere voederadditieven. Als alternatief of daarnaast kan het of elk enzym 20 integraal deel uitmaken van een van de voedersubstanties. Dit aspect omvat zowel het bereiden van een voedersamenstelling met de twee enzymen en het MOVZ of het aanvullen van een bestaande voedersamenstelling met deze verbindingen.

Een methode voor de (exogene) toevoeging van het antimicrobiële 25 enzym aan diervoeder waaraan in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven, is het toevoegen van het of elk enzym als transgeen plantenmateriaal en/of (bijv. transgeen) zaad. Zo kan het enzym langs synthetische weg bereid zijn door middel van heterologe genexpressie, bijv. kan het gen dat codeert voor het gewenste enzym gekloneerd 30 worden in een plantexpressievector, onder controle van de geschikte plantexpressiesignalen, bijv. een weefsel-specifieke promotor, zoals een 1013308 -9- zaad-specifieke promotor. De expressievector die het gen bevat dat voor het enzym codeert, kan vervolgens getransformeerd worden in plantencellen, en getransformeerde plantencellen kunnen geselecteerd worden voor regeneratie in gehele planten. De aldus verkregen transgene 5 planten kunnen gekweekt en geoogst worden, en de delen van de planten die het (ten opzichte van de plant) heterologe enzym bevatten, kunnen opgenomen worden in een van de samenstellingen, als zodanig of na verdere bewerking. Er wordt hier verwezen naar WO-A-91/14772, waar algemene methoden beschreven worden voor de (heterologe) expressie io van enzymen in (transgene) planten, inclusief methoden voor zaad-specifieke expressie van enzymen. Het heterologe enzym kan in het zaad van de transgene planten zitten of het kan in andere plantendelen zitten, zoals wortels, stengels, bladeren, hout, bloemen, bast en/of vruchten.

Voor de toevoeging van het enzym in de vorm van transgeen 15 plantenmateriaal, bijv. transgeen zaad dat de antimicrobiële enzymen bevat, kan het noodzakelijk zijn het plantenmateriaal zodanig te bewerken dat het enzym beschikbaar wordt gemaakt, of tenminste dat de beschikbaarheid ervan wordt verbeterd. Zulke bewerkingsmethoden kunnen diverse mechanische (bijv. malen en/of pletten) technieken of 20 thermomechanische behandelingen zoals extrusie of expansie omvatten.

De antibacteriële enzymen kunnen aan de voedersamenstelling worden toegevoegd in een concentratie die varieert als functie van de dieetsamenstelling, het soort enzym en de diersoort waarvoor het voeder bestemd is.

25 Bij voorkeur bevatten de samenstellingen van de uitvinding geen antibiotica. De samenstelling(en) van de uitvinding kan (kunnen) ook vrij zijn van een minerale component (zoals zink en/of jodium) en/of een immunomodulerend middel (zoals ascorbinezuur). Hoewel elk van de twee antimicrobiële enzymen en het MOVZ alle geproduceerd kunnen worden 30 door een micro-organisme, is de samenstelling bij voorkeur vrij van micro-organismen die een van deze verbindingen hebben geproduceerd (of 1018308 -10- micro-organismen van Streptomyces). Verder kunnen in de samenstelling micro-organismen ontbreken die melkzuur produceren in het dier (bijv. micro-organismen van het geslacht Lactobacillus of Enterococcus).

Een vierde aspect van de onderhavige uitvinding heeft betrekking op 5 een werkwijze om de groei en/of voederconversieverhouding in een monogastrisch of niet-herkauwend dier te bevorderen, welke werkwijze het voeren van het dier omvat met ten minste twee antimicrobiële enzymen en een MOVZ of een voedersamenstelling volgens het eerste of tweede aspect of een voedersamenstelling die volgens het derde aspect 10 bereid kan worden.

Tot de geschikte dieren behoren boerderijdieren, monogastrische dieren en/of niet herkauwende dieren zoals varkens (of biggen), pluimvee (zoals kippen, kalkoenen), kalveren of mestkalveren of in het water (bijv. de zee) levende dieren (bijv. vissen).

15 Een vijfde aspect heeft betrekking op de toepassing van een samenstelling volgens het eerste aspect als een additief voor een voedersamenstelling voor monogastrische of niet-herkauwende dieren.

Eigenschappen en kenmerken van een aspect van de onderhavig uitvinding waaraan de voorkeur wordt gegeven zijn mutatis mutandis van 20 toepassing op een ander aspect.

De onderhavige uitvinding zal nu bij wijze van voorbeeld worden beschreven aan de hand van de volgende Voorbeelden, die ter illustratie gegeven worden en niet beperkend bedoeld zijn.

25 Vergelijkend Voorbeeld 1-4 en Voorbeeld 5

Karakterisering van antibacteriële enzymproducten

Glucose-oxidase (EC 1.1.3.4), een oxidase dat in staat is waterstofperoxide te genereren, werd onder de merknaam FERMIZYME GO™ als commercieel product verkregen van DSM/Koninklijke Gist-30 brocades, Bakery Ingredients Division, Postbus 1, 2600 MA DELFT, Nederland. Dit enzympreparaat vertoont een activiteit van 500 Sarett T013308 -11-

Eenheden per gram. Een Sarett Eenheid is de hoeveelheid enzym die een opname van 10 mm3 zuurstof per minuut veroorzaakt in een Warburg manometer bij 30°C in aanwezigheid van een overmaat zuurstof en 3,3% glucosemonohydraat in een fosfaatbuffer bij pH 5,9. Het enzym werd 5 geproduceerd door de schimmel Aspergillus niger.

Lysozym afkomstig van het eiwit van kippeneieren werd als commercieel product onder de handelsnaam DELVOZYME™ verkregen van DSM/Koninklijke Gist-brocades, Bakery Ingredients Division, Postbus 1, 2600 MA DELFT, Nederland. Het product bevat 5,1 x 106 Shugar io eenheden/ml product. Een Shugar eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die een vermindering van de extinctie van 0,001 per minuut veroorzaakt bij 450 nm en een pH van 6,2 bij 25°C in een suspensie van Micrococcus lysodeikticus (0,25 mg/l), verkrijgbaar bij Sigma Chemicals.

15

Karakterisering van arachidonzuur

Arachidonzuur (ARZ) werd ook verkregen van DSM/Koninklijke Gist-brocades onder de handelsnaam VEVODAR™. Dit heeft de vorm van een microbiële olie (ARZ-gehalte ten minste 35%), die verkregen wordt door 20 kweek van de schimmel Mortierel/a alpina.

Toepassing van antibacteriële enzymen in diervoeder voor pluimvee

We hebben proeven uitgevoerd met slachtkuikens om de werkzaamheid van glucose-oxidase en lysozym alleen en in combinatie te 25 testen. Mannelijke slachtkuikens (Ross) werden door ons van dag 1 tot dag 5 op een standaarddieet gezet. Op dag 5 selecteerden we dieren uit deze groep en verdeelden die over kooien. Het gewicht van de dieren en de variatie daarin werden gemeten. Het gemiddelde gewicht en de afwijking daarvan waren voor iedere kooi hetzelfde. Er werden vijftien 30 dieren in een kooi gehouden. De kooien bevonden zich in een kunstmatig verwarmd, geventileerd en verlicht kippenhok. Het vloeroppervlak van elke « 101330ff -12- kooi bedroeg 0,98 m2, en de vloeren waren van draadgaas. Het kippenhok was 24 uur per dag verlicht. Tijdens de periode van het experiment werd de lichtintensiteit geleidelijk teruggebracht. De temperatuur werd geleidelijk verlaagd van 28°C in de eerste week tot 23°C in de laatste 5 week van het experiment.' De vochtigheid in het kippenhok bedroeg ongeveer 60% gedurende de periode van het experiment. De dieren waren gevaccineerd tegen pseudo-vogelpest (met behulp van de sproeimethode) toen ze één dag en veertien dagen oud waren. Het experiment duurde 33 dagen en omvatte een periode van 5 dagen voorafgaande aan de test en io een testperiode van 28 dagen.

De experimentele diëten werden ad lib. aan de dieren aangeboden. Er was volop water beschikbaar. Het voer was koud gepelletiseerd (de temperaturen werden onder 65 °C gehouden) met een diameter van 3 mm.

15 Het experiment omvatte de volgende behandelingen.

1) basisdieet (negatieve controle) 2) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) 3) basisdieet + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) 4) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) + 20 lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) 5) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) + arachidonzuur (ARZ) tot een eindconcentratie van 1 g/kg voeder).

25 Elke behandeling werd zes maal herhaald (90 vogels in totaal per behandeling). De gewichtstoename en de voederconversie werden gemeten. De samenstelling van het voeder (basisdieet) dat werd gebruikt was: 30 i 1013308 -13-

Bestanddelen Gehalte (%)

Rogge 10

Tarwe 40

Sojaolie 1 5 Dierlijk vet 6

Cassave 4,3

Sojabonenmeel (45,4% ruw eiwit) 22

Gebrande sojabonen met volledig vetgehalte 10 Vleesmeel (58% ruw eiwit) 3 io Vitamines/premix 1

Kalksteen 0,9

Monocalciumfosfaat 1,2

Zout (NaCI) 0,3 D,L-methionine 0,2 15 ME slachtkuikens (KCal/kg) 2850

Ruw eiwit (%) 21,4

Ruw vet (%) 10,5

Lysine (beschikbaar, %) 1,23 (1,04)

Methionine + cysteine (beschikbaar, %) 0,90 (0,79) 2o De enzymen en arachidonzuur werden aan dit basisdieet toegevoegd door ze eerst te mengen met een drager.

De effecten van de antibacteriële enzymen en arachidonzuur op de groei en de verhouding in slachtkuikens van tussen 5 en 33 dagen oud worden hieronder aangegeven in Tabel 1.

25 T013308 -14- T abel 1 Μ Voor- Dieet Voeder- Groei Voeder- I Verbetering in beeld opname (g) conversie- | voederconver- (g) verhouding sieverhouding 1 Basisdieet 2760 1540 1,79 2 Basisdieet + 2750 1554 1,77 -0,02 glucose-oxidase "3 ~ Basisdieet + 2748 "1553 T/77 ^002 lysozym "4 Basisdieet + 2731 Ï589 1,72 ^Ö5 glucose-oxidase + lysozym 5 Basisdieet + 2710 1595 1,70 -0,09 oxidase + lysozym + arachidon-zuur

De toevoeging van één type antibacterieel enzym of een combinatie 5 van verschillende types antibacteriële enzymen leidden beide tot verbetering van de groei en de voederconversieverhouding in slachtkuikens. Wat echter belangrijker is, is dat er een synergetisch effect werd gevonden voor de combinatie van glucose-oxidase en lysozym op de voederconversieverhouding en opname van arachidonzuur in diëten met io antibacteriële enzymen resulteerde in een nog grotere verbetering.

15 101330® -15-

Veraeliikend Voorbeeld 6-9 en Voorbeeld 10

Toepassing ven antibacteriële enzymen in diervoeder voor varkens

In deze proef werd gebruik gemaakt van gekruiste varkens (gelijke aantallen gesneden beren en jonge zeugen; n = 100) met dezelfde leeftijd 5 en hetzelfde gewicht. Zij werden ondergebracht in ruimtes met ; klimaatbeheersing en hadden te allen tijde ad lib. toegang tot voedsel en water. De temperatuur van de ruimte werd in eerste instantie op 29°C ingesteld en werd na de tweede week met ongeveer 2°C per week verlaagd. De varkens werden ingedeeld in groepen die één van vijf io verschillende behandelingen kregen. In ieder hok zaten twee varkens, met 10 herhalingen (gewichtsblokken) per behandeling.

Het lichaamsgewicht en de voederconsumptie per hok werden wekelijks gemeten,

Het basisdieet was een typisch Amerikaans dieet, met de volgende 15 samenstelling:

Basismateriaal Gehalte (%)

Maïs 63,6

Sojabonenmeel 30,9

Vitamine premix 0,25 20 Sporenmineralen premix 0,1

Selenium premix 0,05

Dicalciumfosfaat ... 1,2

Zout (NaCI) 0,3

Kalksteen 3,6 25 Er werd geen antibioticum toegevoegd aan het voeder.

Het experiment omvatte de volgende behandelingen (Voorbeeld 6- 10): a) basisdieet (negatieve controle) b) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) 30 c) basisdieet + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) T013308 -16- d) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) e) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) + 5 arachidonzuur (ARZ) tot een eindconcentratie van 1 g/kg voeder).

De resultaten die werden verkregen met betrekking tot voedselopname, groei en verhouding worden hieronder aangegeven in Tabel 2.

10

Tabel 2

Effecten van antibacteriële enzymen en ARZ op de groei en de verhouding in groeiende varkens (lichaamsgewicht 23 tot 54 kg) IVoor- | Dieet I Dagelijkse Dagelijkse Voedsel- Verbetering beeld voedsel- toename conversie- in voedselopname (g) (kg) verhouding conversie- verhouding B I » i 6 Basisdieet 2,20 0,90 2,44 7 Basisdieet + 2,15 0,90 2,39 -0,05 glucose-oxidase 8 Basisdieet + 2,14 0,89 2,40 -0,04 lysozym 9 Basisdieet + 2,10 0,94 2,23 -0,21 glucose-oxidase + lysozym TÖ Basisdieet + 2^05 095 2J6 -0,28 oxidase + lysozym + arachidonzuur i 1013308 -17-

De toevoeging van één type antibacterieel enzym of combinaties van verschillende types antibacteriële enzymen vertoonde een gunstig effect op de dagelijkse toename en de verhouding. De combinatie van twee verschillende types antibacteriële enzymen (te weten glucose-5 oxidase en lysozym) resulteerde echter in een verrassend synergetisch effect op de verhouding en de toevoeging van arachidonzuur aan voeder met antibacteriële enzymen resulteerde in een verdere verbetering. Vergelijkend Voorbeeld 11-14 en Voorbeeld 15 De toepassing van antibacterieel enzym in visvoer 10 Met behulp van forellen (Oncorhynchus mykiss) werden de effecten van antibacteriële enzymsupplementen op groei en verhouding bestudeerd. De dieetsamenstelling die werd gebruikt was als volgt:

Basismateriaal Gehalte (%) 15 Sojabonenmeel 43

Sojabonen, onder druk gekookt 20

Tarwegluten 20,5

Visolie 12 L-lysine-HCI 0,8 20 D,L-methionine 0,2

Vitamine/mineralen premix 3,5

Er werd geen groeibevorderend antibioticum aan het voer toegevoegd.

Er werden experimenten uitgevoerd met 200 forellen met een 25 gemiddeld initieel lichaamsgewicht van 8,8 g/forel, die in 5 gelijke groepen werden ingedeeld. Deze 5 groepen kregen gedurende een periode van 53 dagen een dieet. De watertemperatuur werd constant op 15°C gehouden. Het dieet werd tweemaal daags verstrekt tot verzadiging om voederverliezen te vermijden. De gewichtstoename en de verhouding 30 werden bepaald.

1013308 15): -18-

Het experiment omvatte de volgende behandelingen (Voorbeeld 11- a) basisdieet (negatieve controle) b) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) 5 3) basisdieet + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) 4) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) 5) basisdieet + glucose-oxidase (1000 Sarett E/kg voeder) + lysozym (100.000 Shugar eenheden/kg voeder) + io arachidonzuur (ARZ) tot een eindconcentratie van 1 g/kg voeder).

De resultaten die werden verkregen met betrekking tot groei en worden hieronder aangegeven in Tabel 3.

-19-

IakeLS

Gewichtstoename, voedselopname en verhouding in forellen die 53 dagen lang gevoerd zijn met een dieet met een supplement van 5 antibacteriële enzymen + /-arachidonzuur

Voor- Dieet Voedsel- 1 Gewichts- Voedsel- II Verbetering beeld opname toename conversie- | in voedsel- (g/forel) (g/forel) verhouding I conversie- verhouding 11 Basisdieet 18,5 12,5 1,48 12 Basisdieet + 20,6 14,1 1,46 -0,02 glucose- oxidase 13 Basisdieet + 20,4 14,1 1,45 -0,03 lysozym 14 Basisdieet + 21,5 16,4 1.31 -0,17 glucose- oxidase + lysozym 15 Basisdieet + 22,9 18,4 1,24 -0,24 oxidase + lysozym + arachidonzuur

De verkregen resultaten laten de gunstige effecten zien die één type antibacterieel enzym of een combinatie van verschillende types antibacteriële enzymen heeft op de groei en de verhouding in forellen. De io combinatie van twee verschillende types antibacteriële enzymen vertoonde een synergetisch effect op de verhouding en de toevoeging van arachidonzuur aan diëten met antibacteriële enzymen resulteerde in een verdere verbetering.

1013308

Claims (23)

1. Additiefsamenstelling voor diervoeder die ten minste twee δ antimicrobiële enzymen en een meervoudig onverzadigd vetzuur (MOVZ) omvat.

2. Diervoedersamenstelling die ten minste twee antimicrobiële enzymen en een meervoudig onverzadigd vetzuur (MOVZ) omvat.

3. Samenstelling volgens conclusie 1 of 2 waarin het of elk io antimicrobieel enzym een antibacterieel enzym is,

4. Samenstelling volgens conclusie 3 waarin één of meer van de antibacteriële enzymen glucose-oxidase, sulfhydryloxidase, xanthine-oxidase, peroxidase of een lysozym omvat.

5. Samenstelling volgens conclusie 1 of 2 waarin één van de 15 enzymen in staat is de cel wand van bacteriën aan te tasten en/of een andere enzym in staat is een verbinding te genereren die toxisch is voor de bacteriën,

6. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin de enzymen een lysozym en een oxidase zijn.

7. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het MOVZ een n-3 of n-6 C18, C20 of C22 MOVZ omvat.

8. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het MOVZ de vorm heeft van een vrij vetzuur, vetzure ester, fosfolipide of triglyceride.

9. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het MOVZ arachidonzuur (ARZ) omvat.

10. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het of elk antibacteriële enzym afgeleid is van een dier, een dierlijk product, een plant of een micro-organisme.

11. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het of elk antibacteriële enzym van microbiële oorsprong is en/of een recombinant eiwit is. 1013308 -21-

12. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het of elk enzym afgeleid is van, geproduceerd is door, of aanwezig is in een micro-organisme zoals een bacterie, gist of (filamenteuze) schimmel.

13. Samenstelling volgens conclusie 11 waarin het micro- organisme van het geslacht Streptomyces, Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Candida, Aspergillus, Trichoderma, Penicullium, Mucor, Fusarium of Humicoia is.

14. Samenstelling volgens conclusie 13 waarin het micro-io organisme Streptomyces iividans, Escherichia co/i, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger of Mortierella alpina is.

15. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies waarin het enzym in plantenmateriaal zit dat eventueel uit een transgene plant verkregen is .

16. Samenstelling volgens conclusie 13 waarin de antibacteriële enzymen glucose-oxidase en/of lysozym in zaden van een transgene plant zitten.

17. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies die zodanig is aangepast dat ze 10 tot 10.000 Sarett Eenheden glucose- 20 oxidase per kg voeder en 1000 tot 1.000.000 Shugar eenheden lysozym per kg voeder omvat.

18. Samenstelling volgens één van de voorgaande conclusies die 1-1000 g arachidonzuur per kg voeder omvat.

19. Werkwijze voor de productie van een voedersamenstelling 25 voor een monogastrisch of niet-herkauwend dier, welk werkwijze omvat het toevoegen van twee antimicrobiële enzymen en een MOVZ aan, of het mengen van een voederadditiefsamenstelling volgens een van de conclusies 1 of 3 tot 18 met, één of meer eetbare voedersubstantie(s) of -bestanddeel (-bestanddelen). 1013308 -22-

20. Diervoedersamenstelling die een additiefsamenstelling volgens één van de conclusies 1 of 3 tot 18 en één of meer eetbare voedersubstantie(s) of -bestanddeel (-bestanddelen) omvat.

21. Werkwijze voor het bevorderen van de groei en/of verhouding in een monogastrisch of niet-herkauwend dier, welke werkwijze omvat het voeren van het dier met ten minste twee antimicrobiële enzymen en een MOVZ of een samenstelling zoals beschreven in een van de conclusies 1 tot 18 of 20. io

22. Werkwijze volgens conclusie 21 waarbij het dier een varken, pluimvee (kip, kalkoen), kalf of waterdier is.

23. Toepassing van een samenstelling volgens één van de conclusies 1, 3 tot 18 als additief voor een voedersamenstelling voor een monogastrisch dier. 15 f013308