MXPA99010152A - Derivados de hidroxiamida del acido 5-oxo-pirrolidina-2-carboxilico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula, en la que R1, R2 y R3 son como se han definido anteriormente, a composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento.

Description

DERIVADOS DE HIDROXI AMIDA DEL ACIDO 5-OXO-PIRROLIDINA-2- CARBOXILICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a derivados de hidroxiamida del ácido 5-oxo-pirrolidina-2-carboxíl¡co, y a composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento. Los compuestos de la presente invención son inhibidores de zinc-metaloendopeptidasas, especialmente aquellas que pertenecen a las subfamilias de las metzincinas del tipo metaloproteinasa matriz (también denominada MMP o matrixina) y del tipo reprolisina (también conocida como adamilsina) (Rawling y col., Methods in Enzimologv, 248, 183-228 (1995) y Stocker y col., Protein Science. 4, 823-840 (1995)). La subfamilia MMP de enzimas, contiene actualmente diecisiete miembros (MMP-1 , MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 , MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19, MMP-20). Las MMP son en su mayor parte bien conocidas por su papel en la regulación del matabolismo de las proteínas de la matriz extracelular y como tales pueden desempeñar papeles importantes en procesos fisiológicos normales tales como la reproducción, el desarrollo y la diferenciación. Además, las MMP se expresan en muchas situaciones patológicas en las que está ocurriendo un metabolismo anormal del tejido conjuntivo. Por ejemplo, se ha demostrado que MMP-13, una enzima con potente actividad degradando el colágeno de tipo II (el principal colágeno de los cartílagos), está excesivamente expresada en cartílago osteroartrítico (Mitchell y col., J. Cin. Invest. 97, 761 (1996)). Otras MMP (MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-12) también están excesivamente expresadas en cartílago osteoartrítico y cabe esperar que la inhibición de algunas de estas MMP aminore o bloquee la pérdida acelerada de cartílago típica de las enfermedades de las articulaciones tales como la osteoartritis o la artritis reumatoide. Las reprolisinas de los mamíferos se conocen como ADAM (A Disintegrin And Metaloproteinase) (Wolfberg y col., J. Cell Biol.. 131 , 275-278 (1995)) y contienen un dominio de desintegrina además de un dominio como el de metaloproteinasa. Hasta la fecha, se han identificado veintitrés ADAM distintas. ADAM-17, también conocida como la enzima que convierte el factor-alfa de necrosis de tumor (TACE), es la ADAM que mejor se conoce. ADAM-17 (TACE) es responsable de la escisión del factor-alfa de necrosis de tumor (TNF-a, también conocido como caquectina) unido a la célula. Se reconoce que TNF-a está implicado en muchas enfermedades infecciosas y autoinmunes (W. Friers, FEBS Letters. 285, 199 (1991)). Más aún, se ha indicado que TNF-a es el mediador principal de la respuesta inflamatoria observada en sepsia y choque séptico (Spooner y col., Clinical Immunoloqy and Immunopathology, 62 S11 (1992)). Hay dos formas de TNF-a, una proteína de la membrana de tipo II de masa molecular relativa 26.000 (26 kD) y una forma soluble, de 17 kD, generada a partir de la proteína unida a la célula por escisión proteolítica específica. La forma soluble de 17 kD de TNF-a es liberada por la célula y está asociada con los efectos deletéreos de TNF-a. Esta forma de TNF-a también es capaz de actuar en sitios distantes del sitio de síntesis. Así, los inhibidores de TACE impiden la formación de TNF-a soluble e impiden los efectos deletéreos del factor soluble. Algunos compuestos selectos de la invención son potentes inhibidores de agrecanasa, una enzima importante en la degradación de agrecán del cartílago. También se piensa que la agrecanasa es una ADAM. La pérdida de agrecán de la matriz del cartílago es un factor importante en el progreso de enfermedades de las articulaciones tales como osteoartritis y artritis reumatoide, y es de esperar que la inhibición de agrecanasa aminore o bloquee la pérdida de cartílago en estas enfermedades. Otras ADAM que han mostrado expresión en situaciones patológicas incluyen ADAM TS-1 (Kuno y col., J. Biol. Chem., 272, 556-562 (1997)) y ADAM 10, 12 Y 15 (Wu y col., Biochem. Biophvs. Res. Comm., 235, 437-442, (1997)). Por conocimiento de la expresión, de los sustratos fisiológicos y de la asociación de los incrementos de ADAM con la enfermedad, se apreciará el significado completo del papel de la inhibición de esta clase de enzimas. Las enfermedades en las que una inhibición de MMP y/o ADAM proporcionará beneficios terapéuticos incluyen: artritis (incluidas la osteoartritis y la artritis reumatoide), enfermedad del intestino inflamado, enfermedad de Crohn, enfisema, síndrome de dificultad respiratoria aguda, asma, neumopatía obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad por trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica de contacto, cáncer, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad períodontal, epidermolisis bullosa, osteoporosis, desligamiento de implantes de articulaciones artificiales, aterosclerosis (incluida la ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma de aorta (incluido el aneurisma de aorta abdominal y el aneurisma de aorta cerebral), insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, traumatismo cefálico, lesión en la médula espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfremedad de Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o de la cognición, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, lesión corneal, degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsia, choque séptico y otras enfermedades caracterizadas por la expresión de metaloproteinasas o ADAM. Esta invención también se refiere aun método de uso de los compuestos de la invención en el tratamiento de las enfermedades anteriores en mamíferos, especialmente seres humanos, y a las composiciones farmacéuticas útiles para ello.

Es reconocido que se expresan diferentes combinaciones MMP y ADAM en diferentes situaciones patológicas. Por tanto, puede preferirse inhibidores con selectividades específicas para ADAM y/o MMP individuales para enfermedades individuales. Por ejemplo, la artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria de las articulaciones, caracterizada por niveles excesivos de TNF y por la pérdida de los constituyentes de la matriz de la articulación. En este caso, un compuesto que inhiba TACE y agrecanasa así como MMP tales como MMP-13 puede ser la terapia preferida. En cambio en una enfermedad menos inflamatoria de las articulaciones tal como la osteroartritis, pueden preferirse compuestos que inhiban las MMP que degradan la matriz, tales como MMP-13 pero no TACE. Los autores de la presente invención también han descubierto que es posible idear inhibidores con actividad metaloproteasa diferencial. Concretamente, por ejemplo, los autores de esta invención han sido capaces de idear moléculas que inhiben selectivamente metaloproteasa-13 (MMP-13) con preferencia sobre MMP-1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos de fórmula: en la que R1 es alquilo (Ci-Cß), arilo {CQ-CW), heteroarilo (C2-C9), aril (CT-CIO) alquilo (C -C6), aril (C6-C?0) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) alquilo (C?-C6), heteroaril (C2-C9) arilo (Ce-Cío), heteroaril (C2-C9), ariloxi (C6-C?0) alquilo (C?-C6), ariloxi (C6-C?0) arilo (C6-C?0), ariloxi (C6-C?o) heteroarilo (C2-C9), heteroariloxi (C2-C9) alquilo (C?-C6), heteroariloxi (C2-C9) arilo (C6-C?o), heteroariloxi (C2-C9) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?0) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) alquil (C?-C6) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?o) alcoxi (C?-C6) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) alcoxi (CrC6) heteroarilo (C -C9), ariloxi (C6-C?0) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?o), ariloxi (C6-C10) alquil (CrC6) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?o), heteroaril (C2-C9) alquil (C?-C6) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) alcoxi (C -C6) arilo (C6-C?0), heteroaril (C2-C9) alcoxi (CrC6) heteroarilo (C2-C9), heteroariloxi (C -Cg) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?o), heteroariloxi (C2-Cg) alquil-(C Ce) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?o) aril (C6-C10)- alquilo (C?-C6) o aril (C6-C?0) alcoxi (C C6) alquilo (Ci-Cß), donde cada uno de dichos restos arilo (Ce-C o) o heteroarilo (C2-C9) está opcionalmente sustituido, con uno o más sustituyentes por anillo, en cualquiera de los átomos de carbono del anillo que sean capaces de formar un enlace adicional, seleccionándose independientemente dichos sustituyentes entre fluoro, cloro, bromo, alquilo (C?-C6), alcoxi (C?-C6), perfluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalcoxi (C1-C3) y ariloxi (C6-C 0); y R2 y R3 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (C?-C6) y CH -arilo (C6-C?o); y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los compuestos preferidos de la presente invención son los compuestos en que R1 es arilo (C6-C?o), ariloxi (C6-C?0) arilo (C6-C?o), aril (C6-C10) arilo (C6-C?o), ariloxi (C6-C?0) heteroarilo (C -C9), heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?0) alcoxi (CrC6) arilo (C6-C10), heteroariloxi (C2-C9) arilo (C6-C10), aril (Cd-Cio) alcoxi (C1-C6) heteroarilo (C2-C9), heteroariloxi (C2-C9) heteroarilo (C2-C9), aril (Ce-Cío) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) arilo (C6-C?0), heteroaril (C2-C9) alcoxi (C?-C6) arilo (C6-C?0), o heteroaril (C2-Cg) alcoxi (Ci-Cß) heteroarilo (C2-Cg), donde cada uno de dichos restos arilo (Ce-Cío) o heteroarilo (C2-C9) de dicho arilo (Ce-Cío), ariloxi (Ce-Cío) arilo (CT-C O), aril (Ce-Cío) arilo (Cß-C10), ariloxi (C6-C?o) heteroarilo (C2-C9), heteroarilo (C2-Cg), aril (C6-C?0) alcoxi (C?-C6) arilo (Ce-Cío), heteroariloxi (C2-C9) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) alcoxi (C Ce) heteroarilo(C2-C9), heteroariloxi (C2-Cg) heteroarilo (C2-Cg), aril {C&-C10) heteroarilo (C2-Cg), heteroaril (C2-Cg) arilo (C6-C?o), heteroaril (C2-Cg) alcoxi (CrC6) arilo (C6-C?o), o heteroaril(C2-Cg) alcoxi (Ci-Cß) heteroarilo (C2- Cg), está opcionalmente sustituido, con uno o más sustituyentes por anillo (preferiblemente uno a tres sustituyentes, lo más preferiblemente 0-2 sustituyentes), en cualquiera de los átomos de carbono del anillo que sean capaces de formar un enlace adicional, seleccionándose independientemente dichos sustituyentes entre fluoro, cloro, bromo, alquilo (Ci-Cß), alcoxi (Ci-Cß), perfluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalcoxi (C1-C3) y ariloxi (Ce-Cío); y sus sales farmacéuticamente aceptables. En otra realización, R2 y R3 son hidrógeno. En una realización adicional, uno o ambos de R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo^-Ce) y CH2-arilo (C6-C?0). El término "alquilo", según se utiliza aquí y salvo indicación en contrario, incluye radicales hidrocarbonados monovalentes saturados que tienen restos lineales, ramificados o cíclicos o combinaciones de ellos. El término "alcoxi", según se utiliza aquí, incluye grupos O-alquilo en el que "alquilo" es como se ha definido anteriormente. El término "arilo", según se utiliza aquí y salvo indicación en contrario, incluye un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático por eliminación de un hidrógeno, tal como fenilo o naftilo, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo formado por fluoro, cloro, bromo, perfluoroalquilo (C?-C6) (incluido trifluorometilo), alcoxi (C?-C6), ariloxi (C6-C?o), perfluoroalcoxi (C1-C3) (incluidos trifluorometoxi y difluorometoxi) y alquilo (Ci-Cß).

El término "heteroarilo", según se utiliza aquí y salvo indicación en contrario, incluye un radical orgánico derivado de un compuesto heterocíclico aromático por eliminación de un hidrógeno, tal como piridilo, furilo, pirrolilo, tienilo, isotiazolilo, imidazolilo, bencimidazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, pirimidilo, quinolilo, isoquinolilo, benzofurilo, isobenzofurilo, benzotienilo, pirazolilo, ¡ndolilo, isoindolilo, purinilo, carbazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, benzotiazolilo o benzoxazolilo, opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes seleccionados del grupo formado por fluoro, cloro, trifluorometilo, alcoxi (C?-C6), ariloxi (C6-C?0), trifluorometoxi, difluorometoxi y alquilo (CI-CT). Heteroarilos preferidos incluyen piridilo, furilo, tienilo, isotiazolilo, pirazinilo, pirimidilo, pirazolilo, isoxazolilo, tiazolilo u oxazolilo. Los heteroarilos más preferidos incluyen piridilo, furilo o tienilo. El compuesto de fórmula I puede tener centros quirales y, por lo tanto, existir en diferentes formas enantiómeras. Esta invención se refiere a todos los isómeros ópticos, tautómeros y estereoisómeros de los compuestos de fórmula I y sus mezclas. Compuestos más preferidos de la presente invención son compuestos de fórmula I con la estereoquímica Compuestos más preferidos de la presente invención son compuestos de fórmula I, en la que R1 es arilo (C6-C?o), ariloxi (C6-C?o) arilo (C6-C?o), heteroariloxi (C2-Cg) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) alcoxi (CrC6) arilo (Ce-Cío) opcionalmente sustituidos, preferiblemente sustituidos con uno a tres sustituyentes (lo más preferiblemente cero o un sustituyente) seleccionados independientemente entre hidrógeno, fluoro, cloro, alquilo (C?-C6) o alcoxi (d- Cß). Cuando el compuesto de fórmula I posee un sustituyente, ese sustituyente está lo más preferiblemente en posición para u orto del anillo terminal. Compuestos preferidos específicos de fórmula I se seleccionan del grupo formado por: hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopírrolidina-2-carboxílico, e hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorofenoxi)-fenil-5-oxopirrolidina-2-carboxílico. Otros compuestos de fórmula I se seleccionan del grupo formado por: hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-(4-fenoxi-fenil)pirrol¡dina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-clorofenoxi)-fenil]-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[3-(4-clorofenoxi)fenil-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[3-(4-fluorofenoxi)-fenil-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-[4-(piridin-4-iloxi)-fenil]pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-bífenil-4-il-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4'-fluorobifenil-4-il)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-(4-fenetilfenil)-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorobenciloxi)-fenil]-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(3,5-difluorobencil-oxi)fenil]- 5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxibencil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4'-fluorobifen¡l-4-ilmetil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-naftalen-2-il-5-oxo-pirrolid¡na-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorofenoxi)-fenil]-2,4-dimetil-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorofenoxi)-fenil]-4-met¡l- 5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4R)-4-bencil-5-oxo-4-(4-fenoxifenil)-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-clorofenoxi)-fenil]-4-metil- 5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, e hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-clorofenoxi)-fenil]-2,4-dimeil-5-oxo-pirrolidina-2-carboxíl¡co. La presente invención también se refiere a las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I. Los ácidos se utilizan para preparar las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de los compuestos, en forma de bases, de esta invención mencionados anteriormente son aquellos que forman sales de adición de ácido no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, acetato, lactato, citrato, citrato ácido, tartrato, bitartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato, benzoato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato [es decir, sales de 1 ,1'-metilen-bis-(2-h¡drox¡-3-naftoato)].

La invención también se refiere a sales de adición de bases de fórmula I. Las bases químicas que se pueden utilizar como reactivos para preparar sales con bases farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I que tienen naturaleza acida son aquellas que forman sales de bases no tóxicas con tales compuestos. Tales sales de bases no tóxicas incluyen, pero sin limitarse a ellas, las que se derivan de cationes farmacológicamente aceptables tales como cationes de metales alcalinos (v.g., potasio y sodio) y cationes de metales alcalinotérreos (v.g., calcio y magnesio), sales de adición de amonio o de aminas solubles en agua tales como N-metilglucamina-(meglum¡na) y las sales de (alcanol inferior) amonio y otras bases de aminas orgánicas farmacéuticamente aceptables. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición seleccionada del grupo formado por artritis (incluidas osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad del intestino inflamado, enfermedad de Crohn, enfisema, neumopatía obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad por trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica de contacto, cáncer, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad períodontal, epidermolisis bullosa, osteoporosis, desligamiento de implantes de articulaciones artificiales, aterosclerosis (incluida la ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma de aorta (incluido el aneurisma de aorta abdominal y el aneurisma de aorta cerebral), insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, traumatismo cefálico, lesión en la médula espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, depresión, neurotapía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o de la cognición, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, lesión corneal, degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsia, choque séptico y otras enfermedades caracterizadas por actividad de metaloproteinasas y otras enfermedades caracterizadas por actividad de reprolisina mamífera en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende una cantidad de un compuesto de fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente eficaz en tales tratamientos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica para la inhibición de a) metaloproteinasas de la matriz u otras metaloproteinasas implicadas en la degradación de la matriz, o b) una reprolisina de mamífero (tal como agrecanasa o ADAM TS-1 , 10, 12, 15 y 17, lo mas preferiblemente ADAM-17) en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. La presente invención también se refiere a un método para tratar una condición seleccionada del grupo formado por artritis (incluidas osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad del intestino inflamado, enfermedad de Crohn, enfisema, neumopatía obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxidad por transplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica de contacto, cáncer, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad períodontal, epidermolisis bullosa, osteoporosis, desligamiento de implantes de articulaciones artificiales, aterosclerosis (incluida la ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma de aorta (incluido el aneurisma de aorta abdominal y el aneurisma de aorta cerebral), insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, traumatismo cefálico, lesión en la médula espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o de la cognición, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, lesión corneal, degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsia, choque séptico y otras enfermedades caracterizadas por actividad de metaloproteinasa y otras enfermedades caracterizadas por actividad de reprolisinas de mamíferos en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad de un compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo eficaz para tratar dicha condición. La presente invención también se refiere a un método para la inhibición de a) metaloproteinasas de la matriz u otras metaloproteinasas implicadas en la degradación de la matriz, o b) una reprolisina de mamífero (tal como agrecanasa o ADAM TS-1 , 10, 12, 15 y 17, preferiblemente ADAM- 17) en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. La invención también abarca composiciones farmacéuticas que contienen profármacos de los compuestos de fórmula I. Esta invención también abarca métodos de tratamiento o prevención de enfermedades que se pueden tratar o prevenir por inhibición de metaloproteinasas de la matriz o inhibición de reprolisina mamífera, que comprende administrar profármacos de compuestos de fórmula I. Los compuestos de fórmula I que tienen grupos amino, amido, hidroxi o carboxi libres se pueden convertir en profármacos. Los profármacos incluyen compuestos que contienen un resto de aminoácido o una cadena polipeptídica de dos o más (v.g., dos, tres o cuatro) restos de aminoácido que están unidos convalentemente a través de enlaces peptídicos a grupos amino, hidroxi o carboxi libres de los compuestos de fórmula I. Los restos de aminoácido incluyen los 20 aminoácidos naturales, designados corrientemente por símbolos de tres letras y también incluyen 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvalina, beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico, citrulina, homocisteína, homoserina, ornitina y metionina-sulfona. Los profármacos también incluyen compuestos que contienen carbonatos, carbamatos, amidas y esteres alquílicos que están unidos covalentemente a los sustituyentes anteriores de fórmula I a través de la cadena lateral del profármaco que contiene un carbono carbonílico. Un experto en la materia apreciará que los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Un experto en la materia también apreciará que cuando se utilicen los compuestos de la invención en el tratamiento de una enfermedad específica los compuestos de la invención se pueden combinar con diversos agentes terapéuticos existentes utilizados para esa enfermedad. Para el tratamiento de artritis reumatoide, los compuestos de la invención se pueden combinar con agentes tales como inhibidores de TNF-a, tales como anticuerpos monoclonales anti-TNF y moléculas de inmunoglobulina receptoras de TNF (tales como Enbrel®), metotrexato en bajas dosis, lefunimida, hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina u oro por vía oral o parenteral. Los compuestos de la invención también se pueden utilizar en combinación con agentes terapéuticos existentes para el tratamiento de osteoartritis. Agentes adecuados para utilizarlos en combinación incluyen los agentes antiinflamatorios no esteroidales (aquí en lo sucesivo NSAID) clásicos tales como piroxicam, diclofenac, ácidos propiónicos tales como naproxeno, flubiprofeno, fenoprofeno, cetoprofeno e ¡buprofeno, fenamatos tales como ácido mefenámico, indometacina, sulindac, apazona, pirazolonas tales como fenilbutazona, salicilatos tales como aspirina, inhibidores de COX-2 tales como celecoxib y rofecoxib, analgésicos y terapias intraarticulares tales como corticosteroides y ácidos hialurónicos tales como hialgán y sinvisc. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con agentes anticancerosos tales como endostatina y angiostatina o fármacos citotóxicos tales como adriamicina, daunomicina, cis-platino, etoposido, taxol, taxotere y alcaloides, tales como vincristina y antimetabolitos tales como metrotexato. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con agentes cardiovasculares tales como bloqueantes de los canales del calcio, agentes que reducen el nivel de lípidos tales como estatinas, fibratos, beta-bloqueantes, inhibidores de ACE, antagonistas del recpertor 2 de angiotensina e inhibidores de la agregación de plaquetas. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con agentes con acción sobre el SNC tales antidepresivos (como la sertralina), fármacos anti-parkinsonianos (tales como deprenil, L-dopa, requip, miratex, inhibidores de MAOB tales como selegina y rasagilina, inhibidores de comP tales como Tasmar, inhibidores de A-2, inhibidores de la reabsorción de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas de nicotina, agonistas de dopamina e inhibidores de óxido nítrico-sintasa neuronal) y fármacos anti-Alzheimer tales como Aricept, tacrina, inhibidores de COX-2, propentofilina o metrifonato. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con agentes para la osteoporosis tales como droloxifeno o fosomax y agentes inmunosupresores tales como FK-506 rapamicina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los siguientes esquemas de reacción ilustran la preparación de los compuestos de la presente invención. Salvo indicación en contrario, R1, R2, R3 en los esquemas de reacción y en la siguiente discusión se definen como antes. El esquema de reacción 1 muestra la síntesis de compuestos en los que R2 es hidrógeno, alquilo (C?-C6) o Ch2-arilo (C6-C?0) y R3 es hidrógeno.

ESQUEMA 1 Con referencia al esquema 1 , los compuestos de fórmula I se preparan a partir de derivados de ácido hidroxámico de fórmula II, por eliminación del grupo p3 protector de hidroxiamida. Cuando p3 es bencilo, la eliminación del grupo protector de hidroxiamida se lleva a cabo por hidroxigenólisis utilizando paladio catalítico sobre sulfato de bario en un disolvente polar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C, es decir, temperatura ambiente, durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, preferiblemente aproximadamente 3 horas. Cuando p3 es distinto de bencilo, la eliminación se facilita tal como se describe en Greene y Wuts, "Protective Groups in Orqanic Sinthesis" (Wiley Interscience, 2a ed.) (1991), véase el capítulo 2. El compuesto de fórmula II se prepara a partir de un compuesto de fórmula lll por eliminación del grupo protector p , donde p1 es como se define más adelante. Cuando p1 es un grupo protector t-butoxicarbonilo, la eliminación se efectúa utilizando un ácido en un disolvente inerte. Cuando p1 es distinto de t-butoxicarbonilo, la eliminación se efectúa como se describe en Greene y Wuts, id- Págs. 397-405 (Wiley Interscience, 2a ed.) (1991 ). Los ácidos adecuados incluyen ácido clorhídrico y trifluoroacético, preferiblemente ácido clorhídrico. Disolventes, adecuados incluyen cloruro de metileno, éter dietílico o cloroformo, preferiblemente cloruro de metileno. La reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida en el intervalo de aproximadamente -25°C a 50°C, preferiblemente la temperatura puede fluctuar de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (es decir, a temperatura ambiente). La reacción se efectúa a lo largo de un período de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 2 horas, preferiblemente aproximadamente 30 minutos. El derivado de ácido hidroxámico de fórmula lll se prepara a partir de un ácido carboxílico de fórmula IV por reacción con un derivado de hidroxilamina adecuadamente protegido de fórmula p3-ONH2, en el que p3 es como se define por Greene y Wuts, id., y hexafluorofosfato de (benzotriazol- 1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio en presencia de una base a temperatura ambiente, en un disolvente polar. Las bases adecuadas incluyen trietilamina, N-metilmorfolina o diisopropiletilamina, preferiblemente diisopropiletilamina. Los disolventes adecuados incluyen THF, cloruro de metileno, N,N-dimetilformamida o N-metilpirrolidin-2-ona, preferiblemente cloruro de metileno. Grupos protectores p3 específicos incluyen bencilo, t-butildimetilsililo, trimetilsililo, 2-(trimetilsilil)etilo o alilo. La reacción mencionada anteriormente se efectúa durante un período de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente aproximadamente 16 horas. La temperatura de la reacción mencionada anteriormente varía de aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C, preferiblemente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (temperatura ambiente). El ácido carboxílico de fórmula IV se prepara por oxidación de un alcohol de fórmula V en presencia de ácido peryódico y trióxido de cromo catalítico, en un disolvente polar. Los disolventes adecuados incluyen acetonitrilo o agua, preferiblemente acetonitrilo húmedo (con 0.75 por ciento de agua). Las temperaturas adecuadas para la reacción citada anteriormente fluctúan de aproximadamente -10°C a aproximadamente 25°C, preferiblemente la temperatura es aproximadamente 0°C. La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 0.5 horas. Se describen condiciones de oxidación alternativas en Zhao y col. Tet Let. 39, 5323-5326 (1998). El alcohol de fórmula V se prepara a partir de un compuesto de fórmula VI por eliminación de los grupos protectores en p2, donde p2 es como se define más adelante. Cuando p2 es terc-butildimetilsililo, la reacción se efectúa por hidrólisis suave en presencia de ácido mineral acuoso diluido y un disolvente tal como éter dietílico. Los ácidos minerales acuosos adecuados incluyen ácido clorhídrico o ácido sulfúrico diluido, preferiblemente ácido clorhídrico 0.5 molar. La reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0°C a 50°C; preferiblemente la temperatura pueda variar de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (es decir, a temperatura ambiente). La reacción se efectúa a lo largo de un período de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 48 horas, preferiblemente aproximadamente 16 horas. El compuesto de fórmula VI, en la que R2 es alquilo (C?-C6) o CH2-arilo(C6-C?o), se prepara a partir de un compuesto de fórmula Vil haciendo reaccionar Vil con un agente alquilante de fórmula R2-Z, donde Z es bromo o yodo, y una base fuerte tal como diisopropilamiduro de litio o (bis) trimetilsililamiduro de litio (preferiblemente diisopropilamirudo de litio) en un disolvente inerte tal como éter dietílico o tetrahidrofurano (preferiblemente tetrahidrofurano). La reacción se lleva a cabo a una temperatura de -78°C, a 0°C, preferiblemente -78°C durante un período de 1 a 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. El compuesto de la fórmula Vil se prepara a partir de un compuesto de fórmula VIII por hidrogenación en atmósfera de hidrógeno en presencia de un catalizador en un disolvente inerte a la reacción.

Catalizadores adecuados incluyen paladio sobre sulfato de bario, paladio sobre carbono, hidróxido de paladio sobre carbono o negro de humo. El catalizador preferido es hidróxido de paladio sobre carbono. Los disolventes adecuados incluyen un alcohol tal como etanol, metanol, o ¡sopropanol, preferiblemente metanol. La reacción mencionada anteriormente se puede realizar a una presión de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atmósferas, preferiblemente alrededor de 3 atmósferas. Las temperaturas adecuadas para la reacción mencionada anteriormente varían de aproximadamente 20°C (temperatura ambiente) a aproximadamente 60°C, preferiblemente la temperatura puede fluctuar de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (es decir, temperatura ambiente). La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 5 horas, preferiblemente alrededor de 3 horas. Alternativamente, la reducción se puede realizar utilizando condiciones para disolver metales o utilizando L-SELEC-TRIDE.

El compuesto de la fórmula VIII se puede preparar a partir de un compuesto de fórmula IX por acoplamiento de Suzuki, preferiblemente por reacción con un ácido borónico de fórmula: HCL .OH E> I en presencia de un catalizador y una base en un disolvente adecuado. Los catalizadores adecuados incluyen acetato de paladio (II), tetrakis(trifenilfosfeno)paladio y tetrakis-[tris-(2-metoxifenil)-fosfina]paladio, preferiblemente tetrakis(trifenilfosfeno)palad¡o. Las bases adecuadas incluyen carbonato de sodio acuoso, carbonato de potasio acuoso o carbonato de cesio acuoso, preferiblemente carbonato de sodio acuoso. Los disolventes adecuados incluyen éteres, tolueno y hexano, preferiblemente tolueno. Las temperaturas adecuadas para la reacción mencionada anteriormente fluctúan de aproximadamente 20°C (temperatura ambiente) a aproximadamente 110°C, preferiblemente la temperatura puede fluctuar de aproximadamente 75°C a aproximadamente 110°C. La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los acoplamientos de Suzuki son bien conocidos por los expertos en la materia, tal como se describe en Suzuki, Puré Appl. Chem., 63, 419-422 (1991), Tetrahedron, 263 (1997) y Chem. Rev.. 95, 2457-2483 (1995). También se pueden preparar ácidos borónicos por métodos bien conocidos por los expertos en la materia, tal como los descritos en Carón y col., JOC. 63, 2054-2055 (1998). Los compuestos de fórmula VIII también se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula IX por reacción con reactivos organometálicos de fórmula R1-M, donde M es magnesio, litio, estaño, zinc, cobre o boro, en presencia de un catalizador metálico de transición apropiado tal como un catalizador basado en paladio o níquel. El compuesto de fórmula IX, donde L es bromo o yodo, se puede preparar a partir de un compuesto de fórmula X por reacción con una base, bromuro de fenilselenilo y un agente halogenante, seguido de oxidación en presencia de peróxido de hidrógeno. Las bases adecuadas incluyen bis-(trimetilsilil)amiduro de litio o diisopropilamiduro de litio, preferiblemente, b¡s(trimetilsilil)amiduro de litio. Los agentes halogenantes adecuados incluyen 1 ,2-di-bromotetracloroetano o N-yodosuccinamida, preferiblemente 1 ,2-dibromotetracloroetano. Las temperaturas adecuadas para la reacción mencionada anteriormente fluctúan de aproximadamente -78°C a aproximadamente -30°C, preferiblemente la temperatura es aproximadamente -78°C. La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 5 horas, preferiblemente alrededor de 3 horas. La etapa de oxidación se efectúa a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 50°C, preferiblemente en torno a la temperatura ambiente. La etapa de oxidación mencionada anteriormente es completa en el transcurso de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los disolventes adecuados para la etapa de oxidación incluyen cloruro de metileno. Otras condiciones para la reacción mencionada anteriormente se describen en Fray y col., JOC, 61 , 3362-3374 (1996). Los compuestos de fórmula X, donde p1 y p2 son grupos protectores como los descritos por Greene y Wuts, supra, son conocidos o se pueden preparar por métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Un ejemplo de un método de preparación de un compuesto de fórmula X, en la que p1 es terbutoxicarbonilo y p2 es t-butildimetilsililo, se describe en Yoda y col., Tetrahedron, 7(7), 2113-2116 (1996). Los grupos protectores p1 adecuados incluyen terc-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, metoxicarbonilo, 2-(trimetilsilil)etiloxicarbonilo, trifluoroacetilo o 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo. Los grupos protectores p2 adecuados incluyen t-butildifenilsililo, bencilo, metoximetilo (MOM) o tetrahidropiranilo. El esquema 2 muestra la síntesis de compuestos en los que R2 es hidrógeno y R3 es alquilo (C?-C6) o CH2-arilo (C6-C?0).

ESQUEMA 2 Con referencia al esquema 2, los compuestos de fórmula I se prepararon a partir de derivados de ácido hidroxámico de fórmula XI por eliminación del grupo p3 protector de hidroxiamida. Cuando p3 es bencilo, la eliminación del grupo protector de hidroxiamida se lleva a cabo por hidrogenólisis utilizando paladio catalítico sobre sulfato de bario en un disolvente polar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C es decir, temperatura ambiente, durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, preferiblemente aproximadamente 3 horas. Cuando p3 es distinto de bencilo, la eliminación se facilita tal como se describe en Greene y Wuts, supra. El compuesto de fórmula XI se prepara a partir de un compuesto de fórmula XII por tratamiento con un ácido en un disolvente inerte. Ácidos adecuados incluyen ácido clorhídrico y ácido trifluoroacético, preferiblemente ácido clorhídrico. Disolventes adecuados incluyen cloruro de metileno, éter dietílico o cloroformo, preferiblemente cloruro de metileno. La reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente -25°C a 50°C; preferiblemente la temperatura puede variar de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (es decir, temperatura ambiente). La reacción se efectúa a lo largo de un período de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 2 horas, preferiblemente aproximadamente 30 minutos. El derivado de ácido hidroxámico de fórmula XII se prepara a partir de un compuesto de ácido carboxílico de fórmula XIII por reacción con un derivado de hidroxilamina adecuadamente protegido de la fórmula p3- ONH2, donde p3 es como se define en Greene y Wuts, id., y hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi) tris (dimetilamino) fosfonio en presencia de una base, a temperatura ambiente, en un disolvente polar. Las bases adecuadas incluyen trietilamina, N-metilmorfolina o diisopropiletilamina, preferiblemente diisopropiletilamina. Los disolventes adecuados incluyen THF, cloruro de metileno, N,N-dimetilformamida o N metilpirrolidin-2-ona, preferiblemente cloruro de metileno. Los grupos protectores p3 específicos incluyen bencilo, t-butildimetilsililo, trimetilsililo, 2-(trimetilsilil)etilo o alilo. La reacción mencionada anteriormente se efectúa durante un período de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. La temperatura de la reacción mencionada anteriormente varía de aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C, preferiblemente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (temperatura ambiente). El compuesto de fórmula XIII se prepara a partir de compuestos de fórmula XIV por hidrogenación en atmósfera de hidrógeno en presencia de un catalizador en un disolvente inerte a la reacción. Catalizadores adecuados incluyen paladio sobre sulfato de bario, paladio sobre carbono, hidróxido de paladio sobre carbono o negro de humo. El catalizador preferido es hidróxido de paladio sobre carbono. Los disolventes adecuados incluyen un alcohol tal como etanol, metanol o isopropanol, preferiblemente metanol. La reacción mencionada anteriormente se puede realizar a una presión de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atmósferas, preferiblemente alrededor de 3 atmósferas. Las temperaturas adecuadas para la reacción mencionada anteriormente varían de aproximadamente 20°C (temperatura ambiente) a aproximadamente 60°C, preferiblemente la temperatura puede fluctuar de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (es decir, temperatura ambiente). La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 5 horas, preferiblemente alrededor de 3 horas. Alternativamente, la reducción se puede realizar utilizando condiciones para disolver metales. El compuesto de fórmula XIV se puede preparar a partir de un compuesto de fórmula XV por acoplamiento de Suzuki, preferiblemente por reacción con un ácido borónico de fórmula: HCL .OH I R 1 en presencia de un catalizador y una base en un disolvente adecuado. Los catalizadores adecuados incluyen acetato de paladio (II), tetrakis (trifenilfosfeno) paladio y tetrakis-[tr¡s-(2-metoxifenil)-fosfina]palad¡o, preferiblemente tetrakis (trifenilfosfeno) paladio. Las bases adecuadas incluyen carbonato de sodio acuoso, carbonato de potasio acuoso o carbonato de cesio acuoso, preferiblemente carbonato de sodio acuoso. Los disolventes adecuados incluyen éteres, tolueno y hexano, preferiblemente tolueno. Las temperaturas adecuadas para la reacción mencionada anteriormente fluctúan de aproximadamente 20°C (temperatura ambiente) a aproximadamente 110°C, preferiblemente la temperatura puede fluctuar de aproximadamente 75°C a aproximadamente 110°C. La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los compuestos de fórmula XIV también se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula XV por reacción con reactivos organometálicos de fórmula R1-M, donde M es magnesio, litio, estaño, zinc, cobre o boro, en presencia de un catalizador metálico de transición apropiado tal como un catalizador basado en paladio o níquel. Los compuestos de fórmula XV, donde L es bromo o yodo, se pueden preparar a partir de compuestos de fórmula XVI por reacción con una base, bromuro de fenilselenilo y un agente halogenante, seguido de oxidación en presencia de peróxido de hidrógeno. Las bases adecuadas incluyen bis-(trimetilsilil) amiduro de litio o diisopropilamiduro de litio, preferiblemente, bis (trimetilsilil) amiduro de lito. Los agentes halogenantes adecuados incluyen 1 , 2-dibromotetracloroetano o N-yodosuccinamida, preferiblemente 1 ,2-dibromotetracloroetano. Las temperaturas adecuadas para la reacción mencionada anteriormente fluctúan de aproximadamente -78°C a aproximadamente -30°C, preferiblemente la temperatura es aproximadamente -78°C. La reacción es completa en el transcurso de aproximadamente 0.5 horas a aproximadamente 5 horas, preferiblemente alrededor de 3 horas. La etapa de oxidación se efectúa a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 50°C, preferiblemente en torno a la temperatura ambiente. La etapa de oxidación mencionada anteriormente es completa en el transcurso de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los disolventes adecuados para la etapa de oxidación incluyen cloruro de metileno. Otras condiciones para la reacción mencionada anteriormente se describen en Fray y col., supra. Los compuestos de fórmula XVI se preparan a partir de compuestos de fórmula XVII por reacción de compuestos de fórmula XVII con dicarbonato de di-terc-butilo en presencia de una base tal como trietilamina o diisopropiletilamina, preferiblemente trietilamina, y una cantidad catalítica de 4-dimetilaminopiridina en un disolvente inerte tal como cloruro de metileno, cloroformo o tetrahidrofurano, preferiblemente tetrahidrofurano. La reacción se lleva a cabo a una temperatura de 0°C a 50°C, preferiblemente alrededor de 25°C, durante 1 a 48 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los compuestos de fórmula XVII se preparan a partir de compuestos de fórmula XVIII calentando los compuestos de fórmula XVIII en agua o en una mezcla de tetrahidrofurano, metanol y agua, constituida de manera que XVIII sea soluble. Esta reacción se lleva a cabo a una temperatura de 50°C a 180°C durante un período de 1 a 48 horas, preferiblemente 16 horas. Los compuestos de fórmula VXIII se preparan a partir de los compuestos de fórmula XIX haciendo reaccionar el derivado de aminoácido de fórmula XIX con acrilato de metilo y una base tal como carbonato de potasio, carbonato de cesio o hidróxido de cesio hidratado, preferiblemente carbonato de potasio, en presencia de cloruro de benciltrietilamonio, en un disolvente tal como acetonitrilo o cloruro de metileno, preferiblemente acetonitrilo. La reacción se lleva a cabo a una temperatura de 0°C a 50°C, preferiblemente alrededor de 25°C durante 1 a 24 horas, preferiblemente alrededor de 2 horas. Los compuestos de fórmula XIX son conocidos o se pueden preparar por métodos bien conocidos por los expertos en la materia. El esquema 3 muestra la síntesis de compuestos de la invención en los que R2 y R3 son independientemente alquilo (C?-C6) o CH2-arilo (Cß-C10).

ESQUEMA 3 XXIII XXII Con referencia al esquema 3, los compuestos de la fórmula I se preparan a partir de derivados de ácido hidroxámico de fórmula XX por eliminación del grupo p3 protector de hidroxiamida. Cuando p3 es bencilo, la eliminación del grupo protector de hidroxiamida se lleva a cabo por hidrogenólisis utilizando paladio catalítico sobre sulfato de bario en un disolvente polar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C, es decir, temperatura ambiente, durante un período de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 5 horas, preferiblemente 3 horas. Cuando p3 es distinto de bencilo, la eliminación se facilita tal como se describe en Greene y Wuts, supra. Los derivados de ácido hidroxámico de fórmula XX se preparan a partir de compuestos de ácido carboxílico de fórmula XXI por reacción con un derivado de hidroxilamina adecuadamente protegido de la fórmula p3-ONH2, donde p3 es como se define en Greene y Wuts, id., y hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi) tris (dimetilamino) fosfonio en presencia de una base, a temperatura ambiente, en un disolvente polar. Las bases adecuadas incluyen trietilamina, N-metilmorfolina o diisopropiletilamina, preferiblemente diisopropiletilamina. Los disolventes adecuados incluyen THF, cloruro de metileno, N,N-dimetilformamida o N-metilpirrolidin-2-ona, preferiblemente cloruro de metileno. Los productos protectores p3 específicos incluyen bencilo, t-butildimetilsililo, trimetilsililo, 2-(trimetilsilil) etilo o alilo. La reacción mencionada anteriormente se efectúa durante un período durante un período de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. La temperatura de la reacción mencionada anteriormente varía de aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C, preferiblemente de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (temperatura ambiente). Los compuestos de la fórmula XXI se preparan a partir de compuestos de fórmula XXII haciendo reaccionar compuestos de fórmula XXII con una base tal como hidróxido de litio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, preferiblemente hidróxido de litio, en una mezcla de agua, etanol y tetrahidrofurano (constituida de manera que XXII sea soluble). La reacción se lleva a cabo a una temperatura de reacción de 20°C a 60°C, preferiblemente alrededor de 25°C durante 1 a 48 horas, preferiblemente alrededor de 2 horas. Los compuestos de fórmula XXII se preparan a partir de compuestos de fórmula XXXIII por tratamiento en un ácido en un disolvente inerte. Los ácidos adecuados incluyen ácido clorhídrico y trifluoroacético, preferiblemente ácido clorhídrico. Los disolventes adecuados incluyen cloruro de metileno, éter dietílico o cloroformo, preferiblemente cloruro de metileno. La reacción se lleva a cabo en una temperatura en el intervalo de aproximadamente -25°C a 50°C; preferiblemente, la temperatura puede variar de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C (es decir, temperatura ambiente). La reacción se efectúa a lo largo de un período de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 2 horas, preferiblemente alrededor de 30 minutos.

Los compuestos de fórmula XXIII se preparan a partir de compuestos de fórmula XXIV haciendo reaccionar XXIV con un agente alquilante de fórmula R2-Z, donde Z es bromo o yodo, y base fuerte tal como diisopropilamiduro de litio o (bis) trimetilsililamiduro de litio (preferiblemente diisopropilamiduro de litio) en un disolvente inerte tal como éter dietílico o tetrahidrofurano (preferiblemente tetrahidrofurano). La reacción se lleva a cabo a una temeperatura de -78°C a 0°C, preferiblemente -78°C durante un período de 1 a 24 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los compuestos de fórmula XXIV se preparan a partir de compuestos de fórmula XIII haciendo reaccionar compuestos de fórmula XIII con yoduro de metilo y una base tal como carbonato de potasio o carbonato de cesio, preferiblemente carbonato de cesio, en un disolvente inerte tal como dimetilformamida o acetona, preferiblemente dimetilformamida. La reacción se efectúa a una temperatura de 0°C a 50°C, preferiblemente alrededor de 25°C. Tiempo de reacción: 1 a 48 horas, preferiblemente alrededor de 16 horas. Los compuestos de fórmula I que tienen naturaleza básica pueden formar una amplia gama de sales diferentes con diversos ácidos orgánicos o inorgánicos. Aunque estas sales deben ser farmacéuticamente aceptables para administración a animales, a menudo es deseable en la práctica aislar inicialmente un compuesto de fórmula I a partir de la mezcla de reacción como una sal farmacéuticamente inaceptable y después simplemente convertirla en el compuesto en forma de base libre por tratamiento en un reactivo alcalino, y subsiguientemente convertir la base libre en una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos de los compuestos en forma de base de esta invención se preparan fácilmente tratando el compuesto en forma de base con una cantidad sustancialmente equivalente del ácido mineral u orgánico elegido, en un medio disolvente acuoso o en un disolvente orgánico adecuado tal como metanol o etanol. Tras una evaporación cuidadosa del disolvente, se obtiene la sal sólida deseada. Los ácidos que se utilizan para preparar las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de los compuestos en forma de base de esta invención son aquellos que forman sales de adición de ácidos no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato o bisulfato, fosfato o fosfato ácido, acetato, lactato, citrato o citrato ácido, tartrato o bi-tartrato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, sacarato, benzoato, metanosulfonato y pamoato [es decir, sales de 1 ,1 '-metil-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)]. Los compuestos de fórmula I que también son de naturaleza acida, son capaces de formar sales de bases con diversos cationes farmacológicamente aceptables. Ejemplos de estas sales incluyen sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos y particularmente las sales de sodio y potasio. Todas estas sales se preparan por técnicas convencionales. Las bases químicas que se utilizan como reactivos para preparar las sales de bases farmacéuticamente aceptables de esta invención son aquellas que forman sales de bases no tóxicas con los compuestos ácidos descritos aquí de fórmula I. Estas sales de bases no tóxicas incluyen las derivadas de cationes farmacéuticamente aceptables tales como sodio, potasio, calcio y magnesio, etc. Estas sales se pueden preparar fácilmente tratando los correspondientes compuestos ácidos con una solución acuosa que contiene los cationes farmacológicamente aceptables, y después evaporando la solución resultante a sequedad, preferiblemente a presión reducida.

Alternativamente, también se pueden preparar mezclando las soluciones alcanólicas inferiores de los compuestos ácidos y el alcóxido de metal alcalino deseado juntos, y evaporando después la solución resultante hasta sequedad de la misma manera que antes. En cualquier caso, preferiblemente se emplean cantidades estequiométricas de reactivos con objeto de garantizar la integridad de la reacción y máximos rendimientos del producto. La capacidad de los compuestos de fórmula I o sus sales farmacéuticamente aceptables, (denominados también en lo sucesivo compuestos de la presente invención) para inhibir metaloproteinasas o reprolisina mamífera y, consecuentemente, demostrar su eficacia para tratar enfermedades caracterizadas por metaloproteinasa o la producción de factor de necrosis de tumor se demuestra por los siguientes ensayos in vitro.

ENSAYOS BIOLÓGICOS Inhibición de colagenasa humana (MMP-1) Se activa colagenasa recombinante humana con tripsina. La cantidad de tripsina se optimiza para cada lote de colagenasa-1 , pero una reacción típica utiliza la siguiente relación: 5 µg de tripsina por 100 µg de colagenasa. La tripsina y la colagenasa se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se añade un exceso de cinco veces (50 mg/10 mg de tripsina) del inhibidor de tripsina de soya. Se preparan soluciones madre (10 mM) de los inhibidores en dimetiisulfóxido y después se diluyen utilizando el siguiente esquema: 10 mM ? 120 µM ? 12 µM ? 1.2 µM ? 0.12 µM. Después se añaden 25 µl de cada concentración por triplicado a pozos apropiados de una placa microfluor de 96 pozos. La concentración final de inhibidor será una dilución 1 :4 después de la adición de enzima y sustrato. Se crean testigos positivos (con enzima y sin inhibidor) en los pozos D7-D12 y testigos negativos (sin enzima y sin inhibidor) en los pozos D1-D6. Se diluyen colagenasa-1 a 240 ng/ml y después se añaden 25 ml a pozos apropiados de la placa microfluor. La concentración final de colagenasa en el ensayo es 60 ng/ml. Se prepara sustrato (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me)-His-Ala-Lys (NMA)-NH2) como una solución madre 5mM en dimetiisulfóxido y después se diluye a 20 µM en regulador de pH. El ensayo se inicia por adición de 50 ml de sustrato por pozo de la placa microfluor para dar una concentración final de 10 mM. Se toman lecturas de la fluorescencia (excitación a 360 nm, emisión a 460 nm) a tiempo 0 y después a intervalos de 20 minutos. El ensayo se efectúa a temperatura ambiente con un tiempo de ensayo típico de 3 horas. Después se representa gráficamente la fluorescencia frente al tiempo tanto para el blanco como para las muestras que contienen colagenasa (se calcula la media de los datos para determinaciones por triplicado). Se elige un punto de tiempo que proporcione una buena señal (al menos cinco veces mayor que el blanco) y que esté en una parte lineal de la curva (normalmente en torno a los 120 minutos) para determinar los valores Cl50. Se utiliza el tiempo cero como blanco para cada compuesto a cada concentración y estos valores se restan de los datos a 120 minutos. Los datos se representan gráficamente como concentración de inhibidor frente a % de testigo (fluorescencia del inhibidor dividida por la fluorescencia de la colagenasa sola x 100). Se determinan los valores CI5o a partir de la concentración de inhibidor que da una señal que es 50% del testigo. Si resulta que los valores CI50 son menores que 0.03 mM, entonces los inhibidores se ensayan a concentraciones de 0.3 mM, 0.03 mM y 0.003 mM.

Inhibición de gelatinasa (MMP-2) Se activa gelatinasa de 72 KD recombinante humana (MMP-2, gelatinasa A) durante 16-18 horas con acetato p-aminofenil-mercúrico 1 mM (a partir de una solución madre 100 mM recién preparada en NaOH 0.2 N) a 4°C, con balanceo suave. Soluciones madre de inhibidores en dimetiisulfóxido 10 mM se diluyen en serie en regulador de pH (TRIS 50 mM, pH 7.5, NaCI 200 mM, CaCI2 5 mM, ZnCI2 20 µM y 0.02% (v/v) de BRIJ-35 utilizando el esquema siguiente: 10 mM ? 120 µM ? 12 µM ? 1.2 µM ? 0.12 µM. Si es necesario se preparan diluciones adicionales siguiendo este mismo esquema. En cada ensayo se utiliza un mínimo de cuatro concentraciones de inhibidor para cada compuesto. Después se añaden 25 µl de cada concentración a pozos triplicados de una placa microfluor con 96 pozos negros de fondo en U. Como el volumen final de ensayo es 100 µl, las concentraciones finales de inhibidor son el resultado de una dilución 1:4 adicional (es decir 30 µM ? 3 µM ? 0.3 µM ? 0.03 µM, etc.). También se preparan por triplicado un blanco (sin enzima y sin inhibidor) y un testigo positivo en enzima (con enzima y sin inhibidor). La enzima activada se diluye a 100 ng/ml en regulador de pH, se añaden 25 µl por pozo a los pozos apropiados de la microplaca. La concentración final de enzima en el ensayo es 25 ng/ml (0.34 nM).

Una solución madre en dimetiisulfóxido 5 mM de sustrato (Mca- Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2) se diluye. en regulador de pH a 20 µM. El ensayo se inicia por adición de 50 µl de sustrato diluido dando una concentración final de ensayo de sustrato 10 µM. A tiempo cero, se toma una lectura de la fluorescencia (excitación a 320; emisión a 390) inmediatamente y se toman lecturas subsiguientes cada quince minutos a temperatura ambiente con un lector de placas de pozos múltiples PerSeptive Biosystems CytoFluor, con la ganancia a 90 unidades. Se representa el valor medio de fluorescencia de la enzima y el blanco frente al tiempo. Se elige uno de los primeros puntos de tiempo de la parte lineal de esta curva para hacer las determinaciones de CI50. El punto de tiempo cero para cada compuesto a cada dilución se resta del último punto de tiempo y los datos se expresan entonces como porcentaje del testigo de enzima (fluorescencia del inhibidor dividido por fluorescencia del testigo positivo en enzima x 100). Los datos se representan gráficamente como concentración de inhibidor frente a porcentaje de testigo de enzima. Los valores Cl50 se definen como la concentración de inhibidor que da una señal que es 50% del testigo positivo en enzima.

Inhibición de actividad de estromelisina (MMP-3) Se activa estromelisina recombinante humana (MMP-3) estromelisina-1) durante 20-22 horas con acetato p-aminofenil-mercúrico 2 mM (a partir de una solución madre 100 mM recién preparada en NaOH 0.2 N) a 37°C. Soluciones madre en dimetiisulfóxido 10 mM de los inhibidores se diluyen en serie en regulador de pH (TRIS 50 mM, pH 7.5, NaCI 150 mM, CaC 10 mM y 0.05% de BRIJ-35 (v/v)) utilizando el siguiente esquema: 10 mM ? 120 µM ? 12 µM ? 1.2 µM ? 0.12 µM. Si es necesario se preparan diluciones adicionales siguiendo este mismo esquema. En cada ensayo se utiliza un mínimo de cuatro concentraciones de inhibidor para cada compuesto. Después se añaden 25 µl de cada concentración a pozos triplicados de una placa microfluor con 96 pozos negros de fondo en U. Como el volumen final de ensayo es 100 µl, las concentraciones finales de inhibidor son el resultado de una dilución 1 :4 adicional (es decir 30 µM ? 3 µM ? 0.3 µM ? 0.03 µM, etc.). También se preparan por triplicado un blanco (sin enzima y sin inhibidor) y un testigo positivo en enzima (con enzima y sin inhibidor). La enzima activada se diluye a 200 ng/ml en regulador de pH, se añaden 25 µl por pozo a los pozos apropiados de la microplaca. La concentración final de enzima en el ensayo es 50 ng/ml (0.875 nM). Una solución madre en dimetiisulfóxido 10 mM de sustrato (Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys(Dnp)-NH2) se diluye en regulador de pH a 6 µM. El ensayo se inicia por adición de 50 µl de sustrato diluido dando una concentración final de ensayo de sustrato 3 µM. A tiempo cero, se toma una lectura de la fluorescencia (excitación a 320; emisión a 390) inmediatamente y se toman lecturas subsiguientes cada quince minutos a temperatura ambiente con un lector de placas de pozos múltiples PerSeptive Biosystems CytoFluor, con la ganancia a 90 unidades. Se representa el valor medio de fluorescencia de la enzima y el blanco frente al tiempo. Se elige uno de los primeros puntos de tiempo de la parte lineal de esta curva para hacer las determinaciones de Cl50. El punto de tiempo cero para cada compuesto a cada dilución se resta del último punto de tiempo y los datos se expresan entonces como porcentaje del testigo de enzima (fluorescencia del inhibidor dividido por fluorescencia del testigo positivo en enzima x 100). Los datos se representan gráficamente como concentración de inhibidor frente a porcentaje de testigo de enzima. Los valores CI50 se definen como la concentración de inhibidor que da una señal que es 50% del testigo positivo en enzima.

Inhibición de MMP-13 Se activa MMP-13 recombinante humana con APMA (acetato p-aminofenil-mercúrico) 2 mM durante 2.0 horas, a 37°C y se diluye a 240 ng/ml en regulador de pH (Tris 50 mM, pH 7.5, cloruro de sodio 200 mM, cloruro de calcio 5 mM, cloruro de zinc 20 mM, 0.02% de BRIJ 35). Se añaden 25 µl de enzima diluida por pozo de una placa microfluor de 96 pozos. La enzima se diluye después en una relación 1 :4 en el ensayo por adición de inhibidor y sustrato para dar una concentración final en el ensayo de 60 ng/ml.

Se preparan soluciones madre (10 mM) de inhibidores en dimetiisulfóxido y después se diluyen en regulador de pH, siguiendo el esquema de dilución de inhibidor para inhibición de colagenasa 1 humana (MMP-1): Se añaden 25 µl de cada concentración por triplicado a la placa microfluor. Las concentraciones finales en el ensayo son 30 mM, 3 mmM, 0.3 mmM y 0.03 mmM. Se prepara sustrato (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys (NMA)-NH2) como para la inhibición de colagenasa humana (MMP-1) y se añaden 50 µl a cada pozo para dar una concentración final de ensayo de 10 µM. Se toman lecturas de fluorescencia (excitación a 360 nM; emisión a 450 nM) a tiempo 0 y cada 5 minutos durante 1 hora. Se establecen testigos positivos y testigos negativos por triplicado, como se ha indicado en el ensayo MMP-1. Los valores de Cl50 se determinan como para la inhibición de colagenasa humana (MMP-1). Si resulta que CI50 son menores que 0.03 mM, después se ensayan los inhibidores a concentraciones finales de 0.3 mM, 0.03 mM, 0.03 mmM, 0.003 mmM y 0.0003 mM.

Inhibición de la producción de TNF La capacidad de los compuestos o de sus sales farmacéuticamente aceptables para inhibir la producción de TNF y, consecuentemente, demostrar su eficacia para tratar enfermedades que implican la producción de TNF, se demuestra por el siguiente ensayo in vitro: Se aislaron células mononucleares humanas a partir de sangre humana anti-coagulada utilizando una técnica de separación Ficoll-hypaque en una etapa. (2) Las células mononucleares se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con cationes divalentes y se resuspendieron a una densidad de 2 x 106/ml en HBSS que contenía 1 % de BSA. Los recuentos diferenciales determinados utilizando el analizador Abbott Cell Dyn 3500 indicaron que los monocitos fluctuaban de 17 a 24% de las células totales en estas preparaciones. Se distribuyeron partes alícuotas de 180 µl de la suspensión de células en placas de 96 pozos de fondo plano (Costar). Las adiciones de compuestos y LPS (100 ng/ml de concentración final) dieron un volumen final de 200 µl. Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Después de cuatro horas de incubación a 37°C en una incubadora de CO2 humidificada, las placas se retiraron y centrifugaron (10 minutos a aproximadamente 250 x g) y los líquidos sobrenadantes se separaron y ensayaron para determinar TNFa utilizando el kit R&D ELISA.

Inhibición de la producción de TNF-a soluble La capacidad de los compuestos o de sus sales farmacéuticamente aceptables para inhibir la liberación celular de TNF-a y, consecuentemente, demostrar su eficacia para tratar enfermedades que implican la dis-regulación de TNF-a soluble se indica por el siguiente ensayo in vitro: MÉTODO PARA LA EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA RECOMBINANTE QUE CONVIERTE TNF-a Expresión de TACE recombinante Un fragmento de ADN que codifica la secuencia señal, el preprodominio, el prodominio y el dominio catalítico de TACE (aminoácidos 1-473), se puede amplificar por reacción en cadena de la polimerasa utilizando un banco de ADNc de pulmón humano con molde. El fragmento amplificado se clona después en vector pFastBac. La secuencia de ADN del inserto se confirma para las dos cadenas. Un bacmido preparado utilizando pFastBac en E. coli DHIOBac se transfecta en células insectiles SF9. Después, las partículas de virus se amplifican a las fases P1 , P2 y P3. El virus P3 se infecta tanto en las células insectiles Df9 como High Five y se propaga a 27°C durante 48 horas. Se recoge el medio y se utiliza para ensayos y purificación adicional.

Preparación de sustrato extinguido fluorescente: Se prepara un sustrato TNF-a peptídico modelo (LY-Leucina-Alanina-Glutamina-Alanina-Valina-Arginina-Serina-Serina-Lisina (CTMR)-Arginina (LY = amarillo Lucifer; CTMR = carboxitetrametil-rodamina)) y se estima la concentración por la absorbancia a 560 nm (E56o, 60.000 M-1CM-1) de acuerdo con el método de Geoghegan, KF, "Improved method for converting an unmodified peptide to an energy-transfer sustrate for a proteinase" Bioconjuqate Chem. 7, 385-391 (1995). Este péptido abarca el sitio de escisión en pro-TNF que es escindido in vivo por TACE.

Expresión de TACE recombinante Un fragmento de ADN que codifica la secuencia señal, el preprodominio, el prodominio, y el dominio catalítico de TACE (aminoácidos 1-473), se puede amplificar por reacción en cadena de la polimerasa utilizando un banco de ADNc de pulmón humano como molde. El fragmento amplificado se clona después en vector pFastBac. La secuencia de ADN del inserto se confirma para las dos cadenas. Un bacmido preparado utilizando pFastBac en E. coli DHIOBac se transfecta en células insectiles SF9. Después, las partículas de virus se amplifican a las fases P1 , P2 y P3. El virus P3 se infecta tanto en las células insectiles Df9 como High Five y se propaga a 27°C durante 48 horas. Se recoge el medio y se utiliza para ensayos y purificación adicional.

Reacción enzimática La reacción, llevada a cabo en una placa de 96 pozos (Dynatech), comprende 70 µl de solución reguladora de pH (Hepes-HCI 25 mM, pH 7.5, más ZnCI2 20 µM), 10 µl de sustrato extinguido fluorescente 100 µM, 10 µl de una solución (al 5%) en DMSO de compuesto de ensayo y una cantidad de enzima r-TACE que provocará 50% de escisión en 60 minutos -en un volumen total de 100 µl. La especificidad de la escisión enzimática en el enlace amido entre alanina y valina se verifica por HPLC y espectrometría de masas. Las velocidades iniciales de escisión se vigilan midiendo la velocidad de incremento en la fluorescencia a 530 nm (excitación a 409 nm) a lo largo de 30 minutos. El experimento se controla como sigue: 1) en cuanto a la fluorescencia de fondo del sustrato; 2) en cuanto a la fluorescencia del sustrato completamente escindido; 3) en cuanto a la extinción o aumento de la fluorescencia de soluciones que contienen compuesto de ensayo. Los datos se analizan como sigue. Las velocidades de las reacciones "testigo" que contienen compuesto de no ensayo se promediaron para establecer el 100% del valor. La velocidad de la reacción en presencia de compuesto de ensayo se comparó con la velocidad en ausencia de compuesto y se tabuló como "porcentaje respecto del testigo que contiene compuesto de no ensayo". Los resultados se representan gráficamente como "% de testigo" frente a log de la concentración de compuesto y se determina un punto semimáximo o valor CI50. Todos los compuestos de la invención tienen CI50 menor que 1 µM, preferiblemente menor que 50 nM. Los compuestos más preferidos de la invención son al menos 100 veces menos potentes contra MMP-1 que en el ensayo de TACE anterior.

Ensayo como monocitos humanos Se aislaron células mononucleares humanas a partir de sangre humana anti-coagulada utilizando una técnica de separación Ficoll-hypaque en una etapa. (2) Las células mononucleares se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) con cationes divalentes y se resuspendieron a una densidad de 2 x 106/ml en HBSS que contenía 1 % de BSA. Los recuentos diferenciales determinados utilizando el analizador Abbott Cell Dyn 3500 indicó que los monocitos fluctuaban de 17 a 24% de las células totales en estas preparaciones. Se dividieron en alícuotas 180 m de la suspensión de células en placas de 96 pozos de fondo plano (Costar). Las adiciones de compuestos y LPS (100 ng/ml de concentración final) dieron un volumen final de 200 µl.

Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Después de cuatro horas de incubación a 37°C en una incubadora de CO2 humidificada, las placas se retiraron y centrifugaron (10 minutos a aproximadamente 250 x g) y los líquidos sobrenadantes se separaron y ensayaron para determinar TNFa utilizando el kit R&D ELISA.

Ensayo de agrecanasa Se aislan condrocitos porcinos primarios de cartílago de articulación por digestión secuencial con tripsina y colagenasa seguida por digestión con colagenasa durante una noche, y se cultivan en placa a 2 x 105 células por pozo en placas de 48 pozos con 5 µCi/ml de 35S(1000 Ci/mmol)-azufre en placas revestidas con colágeno de tipo I. Se deja que las células incorporen el marcador en su matriz de proteoglicano (aproximadamente 1 semana) a 37°C, bajo una atmósfera con 5% de CO2.

La noche antes de iniciar el ensayo, las monocapas de condrocitos se lavan dos veces en DMEM/1 % de PSF/G y después se dejan incubar en DMEM/1% de FBS durante una noche. A la mañana siguiente, los condrocitos se lavan una vez en DMEM/1 % de PSF/G. El lavado final se deja asentar sobre las placas en la incubadora mientras se están haciendo las diluciones. Los medios y las diluciones se pueden hacer como se describe en el cuadro siguiente.

Se marcan las placas y sólo se utilizan los 24 pozos interiores de la placa. Sobre una de las placas, se designan varias columnas como IL-1 (sin fármaco) y Testigo (sin IL-1 y sin fármaco). Estas columnas testigo se cuentan periódicamente para vigilar la liberación de 35S-proteoglicano. Se añaden a los pozos (450 µl) los medios Testigo e IL-1 seguidos por compuesto (50 µl) con objeto de iniciar el ensayo. Las placas se incuban a 37°C, con una atmósfera que contiene 5% de CO2. Cuando la liberación es 40-50% (cuando CPM del medio IL-1 es 4-5 veces el del medio testigo) según se estima por recuento por centelleo del líquido (LSC) de muestras de medio, se termina el ensayo (9-12 horas). Se retira el medio de todos los pozos y se pone en tubos de centelleo. Se añade material de centelleo y se adquieren los recuentos radiactivos (LSC). Para solubilizar las capas de células, se añaden 500 µl de solución reguladora de pH de digestión con papaína (Tris 0.2 M, pH 7.0, EDTA 0.5 mM, DTT 5 mM, y 1 mg/ml de papaína) a cada pozo. Las placas con solución de digestión se incuban a 60°C durante una noche. La capa de células se retira de las placas al día siguiente y se pone en tubos de centelleo. Después se añade el material de centelleo y se someten a recuento las muestras (LSC). Se determina el porcentaje de recuentos liberados a partir del total presente en cada pozo. Se hacen las medias de los triplicados, restando de cada pozo el fondo de testigo. El porcentaje de inhibición de compuesto se base en las muestras IL-1 como 0% de inhibición (100% de recuentos totales).

Para administración a mamíferos, incluidos seres humanos, para la inhibición de metaloproteinasas de la matriz o la producción de factor de necrosis de tumor (TNF), se puede utilizar una gama de rutas convencionales, incluidas la oral, parenteral (v.g. intravenosa, intramuscular o subcutáneas), bucal, anal y tópica. En general, los compuestos de la invención (también conocidos aquí en lo sucesivo como los compuestos activos) se administrarán a dosis diarias entre aproximadamente 0.1 y 25 mg/kg de peso corporal del sujeto que hay que tratar, preferiblemente alrededor de 0.3 a 5 mg/kg.

Preferiblemente, el compuesto activo se administrará oral o parenteralmente. Sin embargo, necesariamente habrá alguna variación en la dosificación dependiendo de la condición del sujeto que se esté tratando. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para cada sujeto en particular. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en una amplia gama de formas de dosificación diferentes, en general los compuestos terapéuticamente activos de esta invención están presentes en dichas formas de dosificación a niveles de concentración que fluctúan de aproximadamente 5.0% a aproximadamente 70% en peso. Para administración oral, se pueden emplear tabletas que contienen diversos excipientes tales como celulosa microcristalina, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dicálcico y glicina, con diversos disgregantes tales como almidón (y preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), ácido algínico y ciertos silicatos complejos, junto con aglutinantes de granulación como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arábiga.

Adicionalmente, a menudo son muy útiles agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco, con fines de formación de comprimidos. También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina; los materiales preferidos a este respecto también incluyen lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para administración oral, el ingrediente activo se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o saborizantes, colorantes, y, si se desea, agentes emulsionantes y/o de suspensión, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones similares de los mismos. En el caso de animales, ventajosamente están contenidos en un pienso para animales o en el agua de bebida a una concentración de 5-5.000 ppm, preferiblemente de 25 a 500 ppm. Para administración parenteral (uso intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo o intravenoso) habitualmente se prepara una solución inyectable estéril del ingrediente activo. Se pueden emplear soluciones de un compuesto terapéutico de la presente invención ya sea en aceite de ajonjolí o de cacahuete o en propilenglicol acuoso. Las soluciones tendrán que ajustarse y regulárseles el pH adecuadamente, preferiblemente a un pH mayor que 8, si es necesario, y el diluyente líquido primero se hará isotónico. Estas soluciones acuosas son adecuadas para fines de inyección intravenosa. Las soluciones oleosas son adecuadas para fines de inyección ¡ntraarticular, intramuscular, y subcutánea. La preparación de todas estas soluciones en condiciones estériles se lleva a cabo fácilmente por técnicas farmacéuticas clásicas bien conocidas por los expertos en la materia. En el caso de animales, los compuestos se pueden administrar intramuscular o subcutáneamente a niveles de dosificación de aproximadamente 0.1 a 50 mg/kg/día, ventajosamente 0.2 a 10 mg/kg/día dados en una sola dosis o en hasta 3 dosis divididas. Los compuestos activos de la invención también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, v.g., que contienen bases convencionales para supositorios, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Para administración intranasal o administración por inhalación, los compuestos activos de la invención son aportados convenientemente en forma de una solución o suspención a partir de un envase pulverizador con bomba que es apretado o bombeado por el paciente, o como una presentación de pulverización de aerosol a partir de un contenedor presurizado o nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, v.g. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para aportar una cantidad medida. El envase presurizado o nebulizador puede contener una solución o suspención del compuesto activo. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (hechos de, por ejemplo, gelatina) para uso en un inhalador o insuflador, que contengan una mezcla en polvo de un compuesto de la invención y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los siguientes ejemplos ilustran la preparación de los compuestos de la presente invención. Los puntos de fusión se dan sin corregir. Los datos de RMN se dan en partes por millón (d) y con referencia a la señal típica del deuterio en el disolvente de la muestra (deuterocloroformo salvo indicación específica en contrario). Los reactivos comerciales se utilizaron sin más purificación. THF significa tetrahidrofurano. DMF significa N.N-dimetilformamída. Cromatografía significa cromatografía en columna realizada utilizando 32-63 mm de gel de sílice y se ejecuta en condiciones de presión de nitrógeno (cromatografía ultrarrápida). La temperatura de la habitación o ambiental designa 20-25°C. Toda las reacciones no acuosas se llevaron a cabo en atmósfera de nitrógeno por conveniencia y para maximizar los rendimientos. Concentración a presión reducida significa que se utilizó un evaporador rotatorio.

EJEMPLO 1 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopirrolidína-2- carboxílico Etapa A: Ester terc-butílico de ácido (5R)-3-bromo-5-(terc-butildimet¡ls¡laniloximet¡l)-2-oxo-2,5-dih¡dro-p¡rrol-1 -carboxílico Una solución de éster terc-butílico de ácido 2-(terc-butildimet¡lsilaniloximet¡l)-5-oxop¡rrolid¡na-1 -carboxílico (16.5 gramos, 50 mmol) en tetrahidrofurano (800 ml) se enfrió en un baño a -78°C. Se añadió lentamente una solución 1 M de bis (trimetilsilil) amiduro de litio de tetrahidrofurano (100 ml, 100 mmol). Después de agitar durante 2 horas, se añadió una solución de bromuro de fenilselenilo (14.16 gramos, 60 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml) y, después de 15 minutos, se añadió una solución de 1 ,2-di-bromotetracloroetano (19.5 gramos, 60 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1.5 horas más mientras se enfriaba a -78°C y la reacción se extinguió por adición de una solución saturada de cloruro de amonio. Se añadieron agua y éter dietílico. La fase acuosa se separó y se extrajo con éter dietílico. Las capas orgánicas combinadas se concentraron en un aceite anaranjado que se disolvió en cloruro de metileno (1.000 ml). Se añadió una solución acuosa al 30% p/v de peróxido de hidrógeno (20 ml) y la mezcla se agitó vigorosamente durante una noche. Se añadió agua (50 ml). La capa acuosa se separó y extrajo con cloruro de metileno. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron hasta obtener un aceite anaranjado.

Se aisló el compuesto del título (12.0 gramos, 59%) por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo primero con una mezcla 1 :1 de hexano y cloruro de metileno y después con cloruro de metileno a solas. 1H RMN (CDCI3): d 7.31 (d, J=2.3 Hz, 1 H), 4.56-4.53 (m, 1 H), 4.08 (dd, J=3.4, 10.0 Hz, 1H), 3.74 (dd, J=6.2, 10.0 Hz, 1 H), 1.53 (s, 9H), 0.83 (s, 9H), 0.01 (s, 3H), 0.00 (s, 3H). 13C RMN (CDCI3): d 164.0, 149.1 , 146.3, 118.2, 83.6, 62.8, 61.8, 28.0, 25.6, 18.0, -5.6, -5.7.

Etapa B: Ester terc-butílico de ácido (5R)-5-(terc-butil-dimetilsilan¡loximetíO-3-(4-metoxifenil)-2-oxo-2,5-dihidropirrol-1 -carboxílico El complejo de dietanolamina de ácido 4-metoxifenilborónico (2.5 gramos, 11 mmol) se agitó en una mezcla de éter diisopropílico (50 ml) y solución acuosa 1.5 M de ácido clorhídrico (30 ml) durante 2 horas. Después de la separación de la capa acuosa, se añadió tolueno (50 ml) y la mezcla se concentró para separar la mayor parte del éter diisopropílico. Se añadieron éster terc-butílico de ácido (5R)-3-bromo-5-(terc-butil-dimetilsilaniloximetiI)-2-oxo-2,5-dihidropirrol-1 -carboxílico (3.0 gramos, 7.38 mmol), tolueno (150 ml), y una solución de carbonato de sodio (850 mg, 8 mmol) en agua (20 ml). Después de purgar la solución de oxígeno, se añadieron tetrakis (trifenilfosfeno) paladio (0) (250 mg) y la mezcla se calentó a reflujo durante 2.5 horas. La mezcla se enfrió y diluyó con tolueno y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró para dar un aceite pardo. El compuesto del título (1.7 gramos, 53%) se aisló por cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno. 1H RMN (CDCI3): d 7.74 (d, J=8.9 Hz, 2H), 7.24 (d, J=2.5 Hz, 1 H), 6.88 (d, J=8.9 Hz, 2H), 4.57-4.54, (m, 1 H), 4.17 (dd, J=3.6, 9.6 Hz, 1 H), 3.79 (s, 3H), 3.72 (dd, J=6.6, 9.6 Hz, 1H), 1.55 (s, 9H), 0.82 (s, 9H), 0.02 (s, 3H), 0.01 (s, 3H).

Etapa C: Ester terc-butílico de ácido (3S, 5R)-5-h¡droximetil-3-(4-metoxifenil)-2-oxopirrolidina-1 -carboxílico Una solución de éster terc-butílico de ácido (5R)-5-(terc-butil-d¡met¡lsilan¡lox¡metil)-3-(4-metoxifen¡l)-2-oxo-2,5-d¡h¡dropirrol-1 -carboxílico (1.7 gramos, 3.9 mmol) en etanol (100 ml) se trató con negro de paladio (300 mg) y se hidrogenó en un sacudidor Parr™ a 3 atmósferas de presión durante una noche. El catalizador se separó por filtración y el disolvente se evaporó para dar éster terc-butílico de ácido (3S, 5R)-5-(terc-butil-dimetilsilaniloxi-metil)-3-(4-metoxifenil)-2-oxopirrolidina-1 -carboxílico como un aceite. Este se disolvió en tetrahidrofurano (40 ml) y se trató con una solución acuosa de ácido clorhídrico 0.5 M (7.2 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche, se detuvo con una solución saturada de carbonato de sodio y se extrajo dos veces con cloruro de metileno. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron para dar un aceite. El compuesto de título (551 mg, 48%) se aisló por cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con hexano al % en acetato de etilo. 1H RMN (CDCI3): d 7.15 (d, J=8.7 Hz, 2H), 6.84 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.18-4.13 (m, 1 H), 3.81-3.65 (m, 4H), 3.76 (s, 3H, solapado), 2.58-2.51 (m, 1 H), 1.96-1.87 (m, 1 H), 1.52 (s, 9H).

Etapa D: Ester terc-butílico de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopirrolidina-1 ,2-dicarboxílico Se preparó una solución madre que contiene 12.0 gramos de ácido peryódico y trióxido de cromo (24 mg) en acetonitrilo húmedo (0.75% en volumen de agua). Una porción de esta solución (9.6 ml) se añadió a una solución de éster terc-butílico de ácido (3S, 5R)-5-hidroximetil-3-(4-metoxifenil)-2-oxopirroIidina-1-carboxílico (510 mg, 1.58 mmol) en acetonitrilo húmedo (0.75% en volumen de agua) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 2 horas y después se extinguió la reacción por adición de una solución de fosfato sódico dibásico (1.2 gramos) en agua (20 ml). La mezcla se extrajo con acetato de etilo y el extracto orgánico se lavó con solución acuosa de bisulfito de sodio y salmuera. Después de secar sobre sulfato de magnesio, el disolvente se evaporó para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco, 518 mg (98%). 1H RMN (CDCI3): d 8.56 (s ancho, 1 H), 7.13 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.82 (d, J=8.6 Hz, 2H), 4.58 (t aparente, J=8.3 Hz, 1 H), 3.78-3.73 (m, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.86-2.79 (m, 1 H), 2.13-2.05 (m, 1 H), 1.45 (s, 9H). 13C RMN (CDCI3): d 176.2, 173.2, 159.0, 149.4, 129.2, 129.0, 114.2, 84.3, 56.8, 55.2, 47.9, 30.2, 27.8. MS: m/z 334 (M-1 ), 234. MQ = +4.4° (c = 1.12, CHCI3).

Etapa E: Ester terc-butílico de ácido (3S, 5R)-5-benciloxicarbamoil-3-(4-metoxifen¡0-2-oxop¡rrolidina-1 -carboxílico A una solución de éster 1 -terc-butílico de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-pxopirrolid¡na-1 ,2-d¡carboxílico (305 mg, 0.91 mmol), diisopropiletilamina (0.35 ml, 2.0 mmol) e hidrocloruro de O-bencilhidroxilamina (160 mg, 1.0 mmol) en cloruro de metileno (20 ml) se añadió hexafluoroborato de (benzotriazol-1-iloxi) tris (dimetilamino)-fosfonip (443 mg, 1.0 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Después de la dilución con cloruro de metileno, la mezcla se lavó con solución acuosa de bicarbonato de sodio saturado, agua y salmuera. La solución se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró hasta obtener un sólido blanco, a partir del cual se aisló el compuesto del título (294 mg, 73%) por cromatografía ultrarrápida eluyendo con 25% de hexano en acetato de etilo. MS: m/z 439 (M-1), 339.

Etapa F: Benciloxiamida del ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopirrolidina- 2-dicarboxílico Se burbujeó gas cloruro de hidrógeno durante 3 minutos a través de una solución de éster terc-butílico de ácido (3S, 5R)-5-benciloxicarbamoil-3-(4-metoxifenil)-2-oxopirrolidina-1 -carboxílico (270 mg, 0.61 mmol) en cloruro de metileno (40 ml). Después de agitar durante 10 minutos más, el disolvente se evaporó para dejar una espuma blanca. El compuesto del título (169 mg, 80%) se aisló por cromatografía ultrarrápida (eluyendo con acetato de etilo) y recristalización en una mezcla de acetato de etilo y hexano. 1H RMN (CDCI3): d 10.40 (s ancho, 1 H), 7.30-7.23 (m, 5H), 7.15 (s ancho, 1 H), 7.04 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.76 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.79-4.72 (m, 2H), 3.89 (t aparente, J=7.3 Hz, 1 H), 3.70 (s, 3H), 3.45 (t aprente, J=9.6 Hz, 1H), 2.77-2.69 (m, 1 H), 2.06-1.98 (m, 1 H). 13C RMN (CDCI3): d 179.1 , 169.3, 158.8, 134.9, 130.0, 129.3, 129.2, 128.7, 128.5, 114.2, 78.1 , 55.2, 53.9, 46.6, 34.6. MS: m/z 341 (M+1). [ato = +39.9° (c = 0.91 , CHCI3).

Hidroxiamida de ácido (2R. 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopirrolidina-2-carboxíl¡co Una solución de benciloxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico (150 mg, 0.44 mmol) en metanol (15 ml) se trató con paladio al 5% sobre sulfato de bario (40 mg) y se hidrogenó en un sacudidor Parr™ a 3 atmósferas de presión durante 2.5 horas. El catalizador se separó por filtración y el disolvente se evaporó para dar un sólido. El compuesto del título (106 mg, 96%) se aisló por cristalización en una mezcla de acetato de etilo y hexano. 1H RMN (DMSO-de): d 10.77 (s ancho, 1H), 8.97 (s ancho, 1H), 8.01 (s ancho, 1 H), 7.14 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.84 (d, J=8.4 Hz, 2H), 3.91 (t aparente, J=7.8 Hz, 1 H), 3.69 (s, 3H), 3.53 (t aparente, J=7.8 Hz, 1 H), 2.67-2.58 (m, 1 H), 1.92-1.84 (m, 1 H). MS: m/z 249 (M-1).

EJEMPLO 2 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-r4-(4-fluorofenoxi)-fenill-5- oxopirrolidina-2 -carboxílico Se prepara de acuerdo con el método del ejemplo 1 partiendo del complejo de ácido 4-(4-fluorofenox¡) fenilborónico con dietanolamina. 1H RMN (DMSO-d6): d 10.78 (s ancho, 1 H), 8.98 (s ancho 1 H), 8.06 (s, 1H), 7.23 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.19-7.15 (m, 2H), 7.02-6.98 (m, 2H), 6.89 (d, J=8.7 Hz, 2H), 3.91 (t aparente, J=7.8 Hz, 1 H), 3.59 (t aparente, J=9.8 Hz, 1H), 2.67-2.60 (m, 1 H), 1.94-1.86 (m, 1 H). 13C RMN (DMSO-de): d 176.0, 167.8, 157.6 (d, J=240 Hz), 155.2, 152.3, 134.8, 129.4, 119.9 (d, J=9 Hz), 117.5, 116.0 (d, J=23 Hz), 51.4, 45.5 33.6. MS: m/z 329 (M-1).

WD =+24.3° (c = 1.14, MeOH).

EJEMPLO 3 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4'-fluorobifenil-4-il)-5-oxo-pirrolidina-2- carboxílico Se prepara de acuerdo con el método del ejemplo 1 partiendo del complejo de ácido 4'-fIuorobifen-4-ilborónico con dietanolamina. Recristalizado en metanol, p.f.: 193-202°C. 1H RMN (DMSO-de): d 10.77 (s ancho, 1 H), 8.97 (s ancho 1 H), 8.08 (s, 1 H), 7.67-7.63 (m, 2H), 7.55 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.32 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.24 (t aparente, J=8.8 Hz, 2H), 3.95 (t aparente, J=7.8 Hz, 1 H), 3.65 (t aparente, J=9.7 Hz, 1 H), 2.71-2.64 (m, 1 H), 2.00-1.93 (m, 1 H). MS: m/z 313 (M-1). Análisis calculado para C17H15FN2?3.1/2H2O: C, 63.15; H, 4.99; N, 8.66. Encontrado: C, 62.83; H, 5.48; N, 8.39.

EJEMPLO 4 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-r3-(4-Fluorofenoxi)-fen¡p-5-oxo- pirrolidina-2 -carboxílico Se prepara de acuerdo con el método del ejemplo 1 partiendo del complejo de ácido 3-(4-fluorofenoxi)fenilborónico con dietanolamina. Recristalizado en acetato de etilo, p.f.: 151-152°C. 1H RMN (DMSO-de): d 10.79 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.28 (t aparente, J=7.9 Hz, 1 H), 7.22-7.18 (m, 2H), 7.04-7.01 (m, 3H), 6.93 (s, aparente, 1 H), 6.78 (dd, J=2.5, 8.3 Hz, 1 H), 3.91 (t aparente, J=7.6 Hz, 1H), 3.62 (t aparente, J=9.8 Hz, 1 H), 2.69-2.62 (m, 1 H), 1.95-1.87 (m, 1 H). MS: m/z 329 (M-1). [a]D =+17.9° (c = 1.00, MeOH). Análisis calculado para C?7H?5FN2O4: C, 61.82; H, 4.58; N, 8.48. Encontrado: C, 61.85; H, 4.59; N, 8.40.

EJEMPLO 5 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-naftalen-2-il-5-oxo-pirrolidina-2- carboxílico Se prepara de acuerdo con el método del ejemplo 1 partiendo de ácido 2-naftilborónico. Recristalizado en ecetato de etilo/metanol, p.f.: 197-199°C. 1H RMN (DMSO-de): d 10.82 (s ancho, 1H), 9.00 (s 1 H), 8.14 (s, 1H), 7.86-7.83 (m, 3H), 7.75 (s, aparente, 1 H) 7.46-7.42 (m, 3H), 4.00 (t aparente, J=7.6 Hz, 1H), 3.80 (t aparente, J=9.6 Hz, 1H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.10-2.03 (m, 1 H). MS: m/z 269 (M-1). MD = 0o (c = 0.33, MeOH). Análisis calculado para C?5H?4N2O3: C, 66.66; H, 5.22; N, 10.36. Encontrado: C, 66.43; H, 5.41 ; N, 10.10.

EJEMPLO 6 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-(4-fenetilfen¡l)-pirrolidina-2- carboxílico Se prepara de acuerdo con el método del ejemplo 1 partiendo de ácido 4-estirilfenilborónico. (El doble enlace estirílico se reduce a un grupo fenetilfenilo al mismo tiempo que se hidrogena el doble enlace de 2-oxo-2,5-dihidropirrol). 1H RMN (DMSO-de): d 10.78 (s ancho, 1 H), 8.97 (s 1 H), 8.03 (s, 1H), 7.24-7.22 (m, 4H), 7.14 (s aparente, 5H), 3.92 (t aparente, J=7.4 Hz, 1 H), 3.55 (t aparente, J=9.9 Hz, 1 H), 2.82 (s aparente, 4H), 2.67-2.60 (m, 1H), 1.95-187 (m, 1 H). MS m/z 325 (M+1).

EJEMPLO 7 Hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxo-pirrolidina-2- carboxílico Etapa A: Ester terc-butílico de ácido (5R)-3-(4-benciloxifeniD-5-(terc-butildimet¡lsilan¡loximetil)-2-oxo-2, 5-dihidro-pirrol-1-carboxíico El complejo de ácido 4-fenetilfenilborónico con dietanolamina (8.25 g, 27.8 mmol) se agitó en una mezcla de éter dietílico (165 ml) y solución acuosa de HCl 3 M (66 mi) durante 3 horas. Después de la separación de la capa acuosa, se añadió tolueno (100 ml) y la mezcla se concentró para separar la mayor parte del éter dietílico. Se añadieron éster terc-butílico de ácido (5R) -3- bromo -5- (terc-butil-dimetilsilaniloximetil) - 2-oxo - 2, 5-dihidropirrol -1- carboxílico (7.5 g, 18.5 mmol) y una solución de Na2CO3 (1.25 g, 11.8 mmol) en agua (25 ml). Después de purgar la solución de oxígeno, se añadió tetrakis (trifenilfosfeno) paladio (0) (424 mg) y la mezcla se calentó a reflujo durante 18 h. La mezcla se enfrió y diluyó con tolueno y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO y se concentró para dar un aceite oscuro. El compuesto del título (5.5 g, 58%), se aisló como un sólido amarillo pálido por cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con éter dietílico al 15% en hexano.

Etapa B: Ester terc-butílico de ácido (3S, 5R)-3-('4-benciloxifenil)-5-(terc-butildimetilsilan¡loximet¡l)-2-oxo pirrolidina-1 -carboxílico Una solución de éster terc-butílico de ácido (5R)-3-(4-enciloxífen¡l)-5-(terc-butildimetilsilanilox¡metil)-2-oxo-2,5-dihidro-pirrol-1-carboxílico (2.0 g, 3.92 mmol) en acetato de etilo (40 ml) y hexano (40 ml) se trató con hidróxido de paladio al 20% sobre carbono (200 mg) y se hidrogenó en un sacudidor Parr™ a 3 atmósferas de presión durante 2 horas. El catalizador se separó por filtración y el disolvente se evaporó para proporcionar el compuesto del título como un aceite amarillo (2.0 g, 100%).

Etapa C: Ester terc-butílico de ácido (3S, 5R)-3-(4-benciloxifenil)-5-hidroximetil-2-oxo-pirrol¡dina-1 -carboxílico Una solución de éster terc-butílico de ácido (3S, 5R)-3-(4-benciloxifenil)-5-(terc-butildimetilsilaniloximetil)-2-oxo-pirrolidina-1 -carboxílico (2.0 g, 3.91 mmol) en tetrahidrofurano (45 ml) se enfrió en un baño de hielo. Se añadió una solución acuosa de HCl 0.5 M (7.8 ml, 3.9 mmol) y la mezcla, resultante se dejó calentar a temperatura ambiente mientras se agitaba durante una noche. Después de un tiempo total de reacción de 24 horas, se añadió una solución acuosa saturada de NaHC?3. La mezcla se extrajo dos veces con éter dietílico y las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO y se concentraron hasta obtener un aceite. El compuesto del título, un aceite incoloro (1.02 g, 65%), se aisló por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con acetato de etilo al 50% en hexano.

Etapa D: Acido (2R, 4S)-4-(4-benciloxífenil)-5-oxo pirrolidina-2-carboxílico Se preparó una solución que contenía 6.0 g de ácido peryódico y trióxido de cromo (13 mg) en acetonitrilo húmedo (60 ml; 0.75% en volumen de agua). Una porción de esta solución (15 ml) se añadió gota a gota a una solución de éter terc-butílico de ácido (3S, 5R)-3-(4-benciloxifenil)-5-h¡drox¡metil-2-oxo-p¡rrolidina-1 -carboxílico (1.02 g, 2.57 mmol) en acetonitrilo húmedo (15 ml; 0.75% en volumen de agua) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 2 horas. En ese momento, se añadió más solución de ácido peryód ico/trióxido de cromo (5 ml). Se continuó la agitación a 0°C durante 1 hora más. Después de extinguir la reacción con una solución de fosfato de sodio dibásico (720 mg) en agua (12 ml), la mezcla se extrajo dos veces con éter dietílico. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución acuosa de bisulfito de sodio (440 mg en 10 ml de agua y salmuera). Después de secar sobre MgSO , el disolvente se evaporó para dar un sólido amarillo que se recogió en cloruro de metileno (100 ml) y se enfrió en un baño de hielo. Se burbujeó gas cloruro de hidrógeno a través de la solución fría durante 2 minutos y la mezcla resultante se agitó a °C durante 1 hora. El disolvente y HCl se evaporaron para dar un sólido a partir del cual se aisló el compuesto del título, 226 mg (28%), por trituración con una mezcla de cloruro de metileno, éter dietílico y acetato de etilo. El filtrado de la trituración se disolvió en una solución acuosa saturada de NaHCO3 y se lavó dos veces con éter dietílico. Después de una acidulación cuidadosa con una solución acuosa de HCl 6 M, la capa acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron MgSO4 y se concentraron para proporcionar más cantidad del compuesto del título, 123 mg (15%).

Etapa E: (2-Trimetilsilaniletoxi) amida de ácido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico A una solución de ácido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico (330 mg, 1.06 mmol), N-metilmorfolina (0.25 ml, 2.3 mmol) e hidrocloruro de O-(2-trimetilsililetil) hidroxilamina (220 mg, 1.30 mmol) en CH2CI2 (20 ml) se añadió hexafluoroborato de (benzotriazol- 1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio (560 mg, 1.27 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. Después de diluir con CH2CI2, la mezcla se lavó secuencialmente con solución acuosa de HCl 0.5 M, agua, solución acuosa saturada de NaHCO3 y salmuera. La solución se secó sobre MgSO4 y se concentró hasta obtener un sólido blanco que se trituró con acetato de etilo y se dejó a un lado. El filtrado de la trituración se concentró y cromatografió sobre gel de sílice eluyendo con metanol al 5% en cloroformo. Las fracciones que contenían el compuesto del título se combinaron y concentraron para dar un sólido blanco que se combinó con el sólido obtenido directamente a partir de la mezcla bruta del producto. La muestra se agitó en agua durante una noche. El compuesto del título se recogió por filtración y se secó. El rendimiento fue 194 mg (43%).

Etapa F: Acido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxo-p¡rrolidina-2-carboxílico A una suspensión de (2-trimetils¡laniletoxi)amida de ácido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxo-pirrolid¡na-2-carboxílico (95 mg, 0.22 mmol) en cloruro de metileno, se añadió eterato de trifluoruro de boro (0.86 µl, 0.68 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 75 minutos. Durante este período, el sólido suspendido se disolvió completamente y el producto precipitó. La reacción se extinguió por adición de solución acuosa saturada de NH CI. El compuesto del título se recogió por filtración, lavando bien con acetato de etilo y agua, y se secó. El rendimiento fue 56 mg (78%). 1H RMN (DMSO-de): d 10.74 (s ancho, 1 H), 8.95 (s ancho, 1 H), 8.00 (s ancho, 1 H), 7.70-7.27 (m, 5H), 7.13 (d, J=8.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J=8.0 Hz, 2H), 5.04 (s aparente, 2H), 3.89 (t aparente, J=7.7 Hz, 1 H), 3.51 (t aparente, J=9.7 Hz, 1 H), 2.64-2.57 (m, 1 H), 1.91-1.83 (m, 1H). MS: m/z 325 (M-1).

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de fórmula: en la que R1 es alquilo (Ci-Cß), arilo (Ce-Cío), heteroarilo (C2-Cg), aril (Ce-Cío) alquilo (C-i-Cß), aril (C6-C o) arilo (C6-C?o), aril (C6-C?0) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) alquilo (Ci-Cß), heteroaril (C2-C9) arilo (C6-C?0), heteroaril (C2-C9) heteroarilo (C2-C9), ariloxi (C6-C?0) alquilo (C?-C6), ariloxi (C6-C?0) arilo (C6-C?o), ariloxi (C6-C?o) heteroarilo (C2-C9), heteroariloxi (C2-Cg) alquilo (C1-C6), heteroariloxi (C2-C9) arilo (C6-C?o), heteroariloxi (C2-C9) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?o) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) alquil-(CrC6) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?0) alcoxi (C?-C6) arilo (C6-C?o), aril (C6-C o) alcoxi (C?-C6) heteroarilo (C2-C9), ariloxi (C6-C?0) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?0), ariloxi (C6-C?o) alquil-(C?-C6) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) - alquil (C C6) arilo (C6-C?o), heteroaril (C2-C9) alquil (C?-C6)-heteroarilo (C2-C ), heteroaril (C2-C9) alcoxi (C C6) arilo (C6-C?0), heteroaril (C2-C9) alcoxi (C C6) heteroarilo (C2-C9), heteroariloxi (C2-C9) alquil (C?-C6) arilo (C6-C?0), heteroariloxi (C2-C8) alquil-(C?-Ce) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?0) aril (C6-C?0) alquilo (d-Cß) o aril (C6-C?0) alcoxi (Ci-Cß) alquilo (Ci-Cß), donde cada uno de dichos restos arilo (C6-C 0) o heteroarilo (C -Cg) está opcionalmente sustituido, con uno o más sustituyentes por anillo, en cualquiera de los átomos de carbono del anillo que sean capaces de formar un enlace adicional, seleccionándose independientemente dichos sustituyentes entre fluoro, cloro, bromo, alquilo (C?-C6), alcoxi (C?-C6), perfluoroalquilo (C1-C3), perlfuoroalcoxi (C1-C3) y ariloxi (C6-C?0); y R2 y R3 se seleccionan independientemente entre H, alquilo (CrC6) y CH2-arilo (C6-C?0); o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2.- Un compuesto según la reivindicación 1 , en el que R1 es arilo (Ce-Cío), ariloxi (C6-C?0) arilo (C6-C?0), aril (C6-C?0) arilo (C6-C?0), ariloxi (Cedo) heteroarilo (C2-C9), heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?o) alcoxi (Ci-Cß) arilo (C6-C?o), heteroariloxi (C2-Cg) arilo {Cß-C10), aril (C6-C?0) alcoxi (Ci-Cß) heteroarilo (C2-Cg), heteroariloxi (C2-Cg) heteroarilo (C2-C9), aril (Ce-Cío) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C ) arilo (Cß-C10), heteroaril (C -Cg) alcoxi (CrC6) arilo (C6-C?0), o heteroaril (C2-Cg) alcoxi (C -C6) heteroarilo (C2-C9), donde cada uno de dichos restos arilo (C6-C?0) o heteroarilo (C2-C9) de dicho ar¡lo(C6-C?0), ariloxi (C6-C?o) arilo (C6-C?0), aril (Cß-C10) arilo (C6-C?0), ariloxi (C6-C?0) heteroarilo (C2-Cg), heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C o) alcoxi (C?-C6) arilo (C6-C?0), heteroariloxi (C2-Cg) arilo (C6-C?0), aril (Cd-Cio) alcoxi (Ci-Cd) he-teroarilo (C2-C8), heteroariloxi (C2-C8) heteroarilo (C2-C9), aril (C6-C?o) heteroarilo (C2-C9), heteroaril (C2-C9) arilo (C6-C10), heteroaril (C2-C8) alcoxi (C -C6) arilo (C6-C?0), o heteroaril (C2-Cg) alcoxi (d- Cß) heteroarilo (C2-C9), está opcionalmente sustituido, con uno o más sustituyentes por anillo que sean capaces de formar un enlace adicional, seleccionándose independientemente dichos sustituyentes entre fluoro, cloro, bromo, alquilo (C?-C6), alcoxi (C?-C6), perfluoroalquilo (C1-C3), perfluoroalcoxi (C1-C3) y ariloxi (Ce-Cío); o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

3.- Un compuesto de fórmula I con la estereoquímica: r

4.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R1 es arilo (Ce-Cío) opcionalmente sustituido.

5.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R1 es ariloxi (C6-C?o) arilo (Ce-Cío) opcionalmente sustituido.

6.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R1 es heteroariloxi (C2-Cg) arilo (Ce-Cío) opcionalmente sustituido.

7.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R1 es aril (C6-C10) alcoxi (C?-C6) arilo (Ce-Cío) opcionalmente sustituido.

8.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el dicho sustituyente opcional de R1 es hidrógeno, fluoro, cloro, alquilo (C -C6) o alcoxi (C?-C6).

9.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que dicho sustituyente opcional de R1 está en la posición para del anillo terminal.

10.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R1 está en la posición orto del anillo terminal.

11.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que R2 y R3 son hidrógeno.

12.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que uno o ambos de R2 y R3 se seleccionan independientemente entre alquilo (C?-C6) y CH2 - arilo (C6-C?o).

13.- Un compuesto según la reivindicación 3, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo formado por: hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxifenil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorofenoxi)-fenil]-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-(4-fenoxifenil)-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S) - 4 - [4 - (4 - clorofenoxi) -fenil] -5 -oxopirrolidina -2 -carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[3-(4-clorofenoxi)-fenil-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[3-(4-fluorofenoxi)-fenil-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-[4-(4-piridin-4-ilox¡)-fen¡l]pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-bifenil-4-il-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4'-fluorobifenil-4-il)-5-oxop¡rrolidina-2-carboxíl¡co, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-benciloxifenil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-5-oxo-4-(4-fenetilfenil)-pirrol¡d¡na-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorobenciloxi)-fenil]-5-oxop¡rrol¡d¡na-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(3,5-difluorobencil-oxi)fenil]-5-oxopirrolina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4-metoxibencil)-5-oxopirrolid¡na-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-(4'-fluorobifenil-4-ilmetil)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-naftalen-2-il-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-fluorofenoxi)-fenil]-2,4-dimetil-5-oxo-p¡rrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S) - 4 - [4 - (4 -fluorofenoxi) -fenil] - 4 -metil - 5 - oxo - pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4R)-4-bencil-5-oxo-4-(4-fenoxifenil)-pirrolidina-2-carboxílico, hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-clorofenox¡)-fenil]-4-metiI-5-oxo-pirrolidina-2-carboxílico, e hidroxiamida de ácido (2R, 4S)-4-[4-(4-clorofenoxi)-fenil]-2,4-dimetil-5-oxo-p¡rrol¡dina-2-carboxílico.

14.- Una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición seleccionada del grupo formado por artritis (incluidas osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad del intestino inflamado, enfermedad de Crohn, enfisema, neumopatía obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad por trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica de contacto, cáncer, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad periodontal, epidermolisis bullosa, osteoporosis, desligamiento de implantes de articulaciones artificiales, aterosclerosis (incluida la ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma de aorta (incluido el aneurisma de aorta abdominal y el aneurisma de aorta cerebral), insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, traumatismo cefálico, lesión en la médula espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o de la cognición, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, lesión corneal, degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsia y choque séptico en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende una cantidad de un compuesto de la reivindicación 1 eficaz en tales tratamientos y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15.- El uso de un compuesto según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una condición seleccionada del grupo formado por artritis (incluidas osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad del intestino inflamado, enfermedad de Crohn, enfisema, neumopatía obstructiva crónica, enfermedad de Alzheimer, toxicidad por trasplante de órganos, caquexia, reacciones alérgicas, hipersensibilidad alérgica de contacto, cáncer, ulceración de tejidos, restenosis, enfermedad periodontal, epidermolisis bullosa, osteoporosis, desligamiento de implante de articulaciones artificiales, aterosclerosis (incluida la ruptura de la placa aterosclerótica), aneurisma de aorta (incluido el aneurisma de aorta abdominal y el aneurisma de aorta cerebral), insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, apoplejía, isquemia cerebral, traumatismo cefálico, lesión en la médula espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos y crónicos), trastornos autoinmunes, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, mejora nootrópica o de la cognición, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, angiogénesis ocular, lesión corneal, degeneración macular, curación anormal de heridas, quemaduras, diabetes, invasión tumoral, crecimiento tumoral, metástasis tumoral, cicatrización corneal, escleritis, SIDA, sepsia y choque séptico en un mamífero, incluido un ser humano.

16.- Una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición que se pueda tratar por inhibición de metaloproteinasas de la matriz en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende una cantidad de un compuesto de la reivindicación 1 eficaz en dicho tratamiento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.}

17.- Una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición que se pueda tratar por inhibición de una reprolisina mamífera en un mamífero, incluido un ser humano, que comprende una cantidad de un compuesto de la reivindicación 1 eficaz en dicho tratamiento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18.- El uso de un compuesto de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la inhibición de metaloproteinasas de la matriz en un mamífero, incluido un ser humano.

19.- El uso de un compuesto de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para la inhibición de una reprolisina mamífera en un mamífero, incluido un ser humano.