MXPA98004836A - Hidrogel de copolimero de acrilamida implantablepara usos terapeuticos - Google Patents

Abstract

El hidrogel es un copolímero de un metacrilamida o acrilamida N-substituida, un agente reticulante y un azúcar complejo o derivado, un péptido de adhesión de tejido o un polímero conjugado con anticuerpos, siendo el polímero heterogéneo, elásticamente deformable y que tiene un contenido de agua en equilibrio de cuando menos aproximadamente 80%. Puede usarse para la regeneración de tejidos y para la reparación deórganos, por ejemplo en un sistema nervioso de desarrollo o adulto.

Description

HIDROGEL DE COPO IMERO DE ACRILAMIDA IMPLANTABLE PARA USOS TERAPÉUTICOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un hidrogel polimérico. Más particularmente la presente invención se refiere a un hidrogel polimérico implantable poroso para usos terapéuticos, por ejemplo que puede usarse para el reemplazo de tejidos internos de cualquier porción de órganos suaves, para la curación de heridas, para la regeneración de tejidos y para la_ reparación de órganos en general, especialmente en el sistema nervioso central en desarrollo y adulto, y terapias similares. La invención se dirige especialmente a un hidrogel polimérico, que al implantarse se vuelve una matriz poroso que esta rellena de fluidos biológicos y moléculas para formar un hidrogel organoide, y se integra progresivamente en el huésped por medio del crecimiento de tejido y vasos sanguíneos. La invención también se refiere a un método para introducir células de tejidos vivos, células precursoras o células genéticamente modificadas dentro del hidrogel polimérico para producir materiales biohibridos que son útiles para los cultivos celulares tri-dimensionales o reconstrucción de tejidos. La invención también se refiere a un método para la producción del hidrogel de polímero de acuerdo con la invención y a materiales biohibridos producidos por medio del método mencionado antes . Finalmente la presente invención se refiere a un método para tratar partes dañadas del sistema nervioso central, especialmente la médula espinal y el nervio óptico, o los nervios periféricos u otros tejidos por medio de la implantación de un hidrogel polimérico o los materiales biohibridos de acuerdo con la invención. El transplante de órganos actualmente es la única alternativa de aliviar las daños orgánicos y restaurar o mejorar la función y desempeño de los órganos . Sin embargo algunas desventajas de las terapias de transplante de órganos son la potencial transmisión de enfermedades de donador a receptor, la escasez y la limitada disponibilidad de órganos donados, y las posibles reacciones cruzadas inmunológicas . Así por ejemplo el trasplante de la médula espinal no es ni clínica ni biológicamente factible y consecuentemente no hay tratamiento para los pacientes de SCI, mientras que en los Estados Unidos solamente hay 250,00 pacientes crónicamente paralizados con un aumento de 10,000 nuevos pacientes cada año. Por otro lado, el implante, transplante o la inyección de células en el cuerpo para reemplazar o restaurar las células o partes de tejidos orgánicos faltantes no puede lograr apropiadamente la formación de nuevos tejidos debido a la falta de una matriz extracelular de apoyo como un marco de tejido necesario para la expansión del tej ido y la organización en un estructura integrada en contacto con el órgano huésped. Además las células necesitan colocarse en un medio fisiológicamente equivalente que facilite la difusión de los nutrientes, oxígeno, componentes humorales y celular para mantener la alta viabilidad celular y el potencial de crecimiento después del implante. Los hidrogeles porosos de la presente invención son matrices poliméricas porosas deformables saturadas con liquido intersticial o agua y así proporcionar el marco de tejido necesario y el espacio hidratado a través del cual las células pueden proliferar y ensamblarse en arquitecturas de tejidos supracelulares en una estructura histológica correcta para obtener un neotejido funcional. Se han descrito en la literatura diferentes estrategias experimentales de trasplantes intraespinales en la literatura como intentos de restaurar daños en la médula espinal (modelos de animales) , usando varios materiales de implantes que pueden agruparse en dos amplias categorías de implantes: (1) tejidos biológicos y (2) materiales de prótesis. En la categoría (1) se incluye el uso de injertos de tejidos de donadores, ya sea singeneticos autoinjertos o homoinjertos, aloinjertos o xenoinjerto, para puentear lesiones de la médula espinal tal como tejido neural fetal, ya sea (a) como un injerto solido (por ejemplo Bregaman, Dev. Brain Res., 34, 265, 1987; Holeu y Reier, J. Comp. Neurol. 269, 535, 1988) o (b) injertos en suspensión incluyendo células de tejidos neurologicos mezclados (por ejemplo Goldberg and Bernstein, 81,303, 1991); Células de sch ann combinadas con neuronas sensoriales cultivadas (Kuhlengel et al. J. Comp. Neurol. 293, 74, 1990) ; astrocitos inmaduros (por ejemplo Bemstein and Goldberg, Res.Neurol .Neusosci, 2. 261, 1991); precursores de células de tejidos neurales precursores de tejidos neurales (Monteros et al., Dev. Neurosci, 14, 98, 1992) y familias celulares establecidas inmortalizadas (Zompa et al, Int. J.Drv. Neurosci., 11, 535, 1993) segmentos de nervios periféricos incluyendo tejido no-neuronal cultivado ( rathall et al., Acta Neuropathol . , 57,59, 1982) o con tejido neuronal embrionico (Horvat et al., Res.Neurol., Neurosci, 2, 289, 1991). Para la categoría (2) materiales de prótesis que han descritos incluyen matrices de colágeno puro (de la Torre y Goldsmith, Brain Res., Bull., 35, 418, 1994; Marchand and oerly, Neurosci, 35,46,1990; Gelderg, Brain Res. 511, 80, 1990) que contiene agentes neuroactivos (Goldsmith and de la Torre, Brain Res., 589, 217, 1992) o incluyendo injertos neurales cultivados (Bernstein and Goldberg, Brain Res . 377, 403, 1986); implantes de nitrocelulosa tratados (Schreyer and Hones, Dev.Brain. Res., 35,291, 1987; Houle and Johnson, Neurosci .Lett .103, 17, 1989); implantes de colágeno (Paino et . al., J.Neurocytol . 23,433,1991) y canales de guía de polímeros de poli (acrilonitrilo-cloruro de vinilo)) (Xu et al., .Comp.Neurol . , 351,145,1995) incluyendo células de Schwann. Esos intentos se enfocan en la promoción de la regeneración axonal usando varios substratos de tejidos como fuentes de nuevos axones o usando substratos de prótesis complejos para sostener u guiar los axones crecientes y no tratan el punto clínicamente relevante de la reparación de médula espinal o tejido cerebral por medio de la regeneración de el total del tejido huésped y remodelado de la curación de heridas, por ejemplo después de retirar el tejido necrotico cicatrizado después de el daño. Los hidrogeles poliméricos han sido descritos como implantes en el sistema nervioso (Woerly et al., Biomaterials, 11,97,1990; oerlly et al., Biomaterials, 12,197, 19991; Woerly et al., J. Neural Transpl . Plast. 3, 21, 1992; Woerly et al., Cell Transpl., 2, 229, 1993; Woerly et al., J. Neural Transpl. Plast., 5, 245, 1995) . Esos hidrogeles se prepararon por medio de polimerización de radicales libres en agua, usando persulfato de amonio y metabisulfito o persulfato de sodio y ácido ascorbico como iniciadores redox con metacrilato de hidroxilo (pHEMA) , metacrilato de glicidilo (pGMA) o metacrilamida de n-hidroxipropilo (pHPMA) o una composición que incluye los monomeros anteriores con un agente reticulante que sea etileno glicol, ddimetracrilato de tetraetileno glicol, metileno-bis-acrilamida. Esos geles típicamente son homogéneos y ópticamente transparentes con una porosidad bimodal incluyendo poros abiertos (volumen de poro accesible) y cerrados como se muestran por medio de porosimetria de mercurio y microscopías de barrido electrónico típicamente la estructura porosa de esos geles se forma de capilares cilindricos paralelos de sección transversal circular como se muestra en la figura 1 con un diámetro de poros promedio de 7 a 13 µm. La porosidad fraccional esta en el rango de 50% a 85% para hidrogeles de pHEMA, 60 a 65% para hidrogeles de pGMA y 70 a 94% para hidrogeles de pHPMA. Cuando menos 50% del volumen de poro del hidrogel esta ocupado por poros de 1.2 a 4 µm para pHEMA, 6 a 13 µm para pGMA y 10 a 14 µm para pHPA. Se encontró que su actividad biológica dependía de la introducción o copolimerizacion del colágeno en la red reticulada. El solicitante experimento la implantación en el cerebro que mostró que un grado de reparación del tejido que puede lograrse de acuerdo con el grado de crecimiento en las matrices de gel homogéneas . Esta reacción es variable de acuerdo con la composición del monomero y los grupos funcionales agregados. Sin embargo los hidrogeles homogéneos frecuentemente induce la formación de la cápsula fibrosa que tienen a aislar el implante del huésped. Esto se debe a las propiedades mecánicas de esos geles que no coinciden lo suficiente con aquellas del tejido neural viviente así como la fracción de pequeño volumen de macroporos. En la médula espinal esos hidrogeles homogéneos no se integran en el huésped y son encapsulados rápidamente por medio del tejido conectivo y la cicatriz sin penetración de los axones o componentes de tejido como se muestra en la figura 2. Además hay una consideración física que limita el área de superficie que puede generarse un parámetro importante para la interacción de tejido exitosa generada por los poros cilindricos en esos geles homogéneos. Para un volumen fijo de gel, el área de superficie alcanza un limite que es el radio máximo de un poro sencillo que ocupa el volumen total del gel. Por otro lado, aumentar la superficie al disminuir el tamaño de los poros conducirá a una disminución del volumen de huecos total que es incompatible con el crecimiento del tejido y la acumulación de biomasa . Harvey et al., en Brain Res., 671, 119,1995 describe una esponja polimérica de poli (2-hidroxietil metacrilato) que se usa como implante cerebral par ala regeneración de tejido y crecimiento del axon. Este producto se usa mejor con la adición de colágeno a la red polimérica como bioadhesivo de tejidos y después de la inclusión de células de Sch ann. La patente de EE.UU. no. 4,902,2954 describe un proceso para preparar un tejido artificial de células de tejido de páncreas . El proceso incluye la polimerización de precursores de matriz, precursores de gel y promotores con células viables en fase acuosa. Todos los precursores poliméricos así como los promotores son compuestos biológicos susceptibles a la rápida biodegradacion en el cuerpo y no tienen una estabilidad a largo plazo después de la implantación. Bellarkonmda R.; Ranieri J.P.; Bouche, N.; Aebischer, P. ("Hydrogel-Based Three-dimensional Matriz for Neural Cells", J. Biomed, Mat .Res.1995, 29, 663-671) describen una técnica para inmovilizar las células de tejido neural en agarosa y geles equivalentes extracelulares (Matrigelrar) . Esos materiales son biológicos y biodegradables . Krewson, CE.; Chung, S.W.; Dai, .; Saltzman, W.M. ("Cell Aggegation an Neurite Growth in Gels of Extracellular Matrix Molecules"Biotec nol .Bioeng. 1994, 43, 555-562) describe una técnica en la cual las células PC12 se suspenden en geles de colágeno solas o combinadas con fibrotectina o laminina y en geles de agarosa y colágeno. Esos geles son biodegradables. Cascoe, M.G.; Laus, M. ; Ricci, D.; Sbarbati del Guerra, R. ("Evaluation of poly(vinyl alcohol) hidrogels as a component of hybrid atificial Tissues:, J.Ma.Sci .mat .med. 1995, 6, 71-75) describe una tecnología usando hidrogeles de poli (vinilacohol) , físicamente reticulados en los cuales las células fibroblasticas se introducen en un ciclo de congelación-descongelación. Wald, H.L.; Srakinos, G. Lyman, M.D.; Mikos, AG.Vacanti, J.P. Langer, R. ("Cell seeding in porous transplantation", Biomat 1993, 14, 270-278) describen un proceso para envolver células de hepatocitos en espumas poliméricas degradables de poli (ácido L-lactico) por medio de una técnica de microinyeccion. Esta técnica no proporciona una matriz no-degradable y no permite la distribución uniforme de células en la matriz polimérica. Mikos, A.G.; Bao, Y.; Cima, L.G.; Ingber, D.E.; Vacanti, J.P.; Langer, R. ("Preparation of polyglycolic acid bonded fiber structures for cell attachment and transplantation", J.Biomed. Met. Res. 1993, 27, 183-189) describen un proceso para construir redes de poly(glycolic acid) con fibras unidas a hepatocitos cultivados . Este polímero es biodegradable y el proceso para introducir las células en la matriz es diferente a la de atrapado. Puerlacher, W.C.; Mooney, D. Langer, R.; Upton, J.Vacanti, J.P. Vacanti, C.A. ("Design of Nasoseptal Cartilage Replacements Synthetized from Biodegradable Polymers and Chondrocytes", Biomat, 194, 15,774-778) y Freed, L.E.Marquis, J.C.; Nohria, A.Emmanual; Mikos, A.G.; Langer, R. ( "Neocartilage formation in vitro an in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers", J.Bio ed.Mat .Res .1993, 2711-23). Esas referencias describen un proceso para introducir células condrocitos en ácido poliglicolico (PGA) o polilactico (PLLA) o matrices PGA-PLLA por medio de la acción capilar. Este proceso da materiales poliméricos biodegradables aunque las células no se distribuyen uniformemente en el polímero y no permite el controlar la densidad celular. Cao, Y.; Vcanti, J.P.; Ma, X.; Paige; K.T.; Upton, J. ; Chowanski, Z.'; Schloo, B., Langer, R.; Vacanti, C.A.

("Generation of Neo-Tendon Using Synthetic Polymers Seeded with Tenocytes;, Transpl. Proc. 1994., 26, 3390-3391) describe un porceso para sembrar células tenocitos en mallas no tejidas de ácido poliglicolico. Moonery, D.J.; Park,S.; Kaufman, P.M.; Sano, K.; McNamara, K.; Vacanti, J.P.; Langer, R. ("Biodegradable Sponge for Hepatocyte Transplantation", J.Biomed, Mat.Res. 1995, 29, 959-965) y Takieda, T.; Kim, T.H.; Lee, S.K.; Langer, R.;Vacanti, J.O. ("Hepatocite transplantation in biodegradable polymer scaffolds using the Baltimatian Dog model of Hyperuricosuria", Transpl. Proc. 1995, 27, 6350636) describe un proceso para absorber células hepatocitos en laminas de fieltros de polímero de ácido poliglicolico o en esponjas poliméricas fabricadas de ácido polilactico y alcohol polivinilo y de ácido polilatico ácido glicolico por medio de adsorbción y acción capilar. Este proceso da un polímero biodegradable aunque las células no se distribuyen uniformemente en el polímero y no permiten el control de la densidad celular. Woerly, S; Plant, G.W.; Harvey, A.R. ("Cultured Rat Neuronal and Glial Cells Entrapped within Hydrogel Polymer Matrices: A Potential Tool for Neural Tissue Replacement", Neurosci.Lett . 1996, 205, 197-201) describe un procedimiento para atrapar células de tejidos neurales en geles poliméricos transparentes homogéneos de poli [N- (2-hidroxipropil) -metacrilamida] que puede contener col geno como substrato de unión. Este procedimiento incluye la adición de una suspensión celular a la mezcla polimérica y la polimerización de la mezcla células-polimeros a la temperatura ambiente o en una incubadora mantenida a 37°C. El gel resultante es ópticamente transparente y las células se dispersan aleatoriamente dentro del gel reticulado. Los estudios inmunocistoquimicos indicaron que la viabilidad celular después de 6 días in vitro vario de entre 0 y 6%. Es un objeto de la presente invención el prevenir las desventajas de la técnica anterior usando una prótesis no biológico tal como un hidrogel polimérico no degradable, que actúa como material llenador de espacio y como constructor de substratos que estimulan la regeneración del tejido, morfogénesis y remodelacion en una estructura integrada al órgano. Es otro objeto de la presente invención el mejorar la curación del tejido en la formación de tejido que puede lograrse al controlar la proliferación celular, la infiltración celular y la organización de tejidos dentro de una matriz polimérica estable. Es otro objeto de la presente invención el proporcionar la regeneración de tejidos por medio de matrices poliméricas que tendrían un gran beneficio y un importante impacto clínico y económico para las personas que sufren de daños a 1 médula espinal (SCI) y cerebrales o una médula espinal defectuosa congenita (espina bifida) . Es otro objeto de la invención el proporcionar matrices poliméricas para la regeneración del nervio óptico y de los nervios periféricos . Es otro objeto de la presente invención el proporcionar matriz de hidrogel polimérica sintética no degradable con una estructura porosa anisotropica, un área de superficie efectiva y buena adhesividad al tejido y compatibilidad y que se diseña para implantarse en una estructura de tejido suave, especialmente en el sistema nervioso, y que progresivamente se vuelve parte del órgano. Es otro objeto de la presente invención el proporcionar el uso de matrices poliméricas sintéticas con estructura porosa controlada y que porta agentes activos en la superficie . Es un objeto primario de la presente invención el proporcionar una matriz polimérica que este hecha de un hidrogel polimérico insoluble en agua que se use en estado hinchado como prótesis para la regeneración del tejido para la reparación de un órgano suave. Es otro objeto de la invención el proporcionar un método para la producción de un producto de hidrogel en un molde que tenga la forma del dispositivo de prótesis final. Es otro objeto de la presente invención el resolver una o mas de las desventajas de la técnica anterior y proporcionar una neuroprotesis que pueden implantarse en el cerebro o médula espinal usando procedimientos quirúrgicos estándar.

Es otro objeto de la invención el proporcionar un método por medio de lo cual las células o células genéticamente modificadas pueden introducirse en redes poliméricas. Es otro objeto de la presente invención el proporcionar una mezcla polimérica que puede mezclarse con células vivientes, combinando las características físicas de la matriz poliméricas con un comportamiento parecido al hidrogel (porosidad, estabilidad superficies guía, permeabilidad) y con factores biológicos celulares (por ejemplo factores de crecimiento) . Otro objeto de esta invención es el de proporcionar dispositivos biohibridos que pueden usarse para reemplazar parte del tejido de órganos suaves . Otro objeto de la presente invención es el de proporcionar un sistema de cultivo tridimensional que puede usarse para cultivar una variedad de células in vitro durante un período de tiempo prolongado. Otro objeto de la invención es el de proporcionar matrices de soporte para la unión de las moléculas biológicamente activas a tejidos u órganos. Es otro objeto e la presente invención el proporcionar hidrogeles porosos que son matrices poliméricas porosas deformables saturadas con fluido intersticial o agua, proporcionando el marco de tejido necesario y el espacio hidratado a través del cual las células pueden proliferar y ensamblarse en arquitecturas supercelulares en una estructura histológica correcta para dar un tejido funcional. Otro objeto de la presente invención es el de proporcionar un componente para sistemas de liberación controlada de fármacos y macro-moléculas, especialmente substancias infamatorias tal como indometacina, estimuladores de citocina, tales como lipopolisacaridos bacterianos, esteroides tales como prenisolona de metilo y factor neuroactivos, tales como factores de crecimiento de fibroblasto. Es otro objeto de la invención el proporcionar un material que presente una fuerte bio-adhesividad y propiedades hemostáticas adecuadas para la colocación de tejido suave interno, unión rápida y al mismo tiempo hemostasis. Es un objeto primario de la presente invención el proporcionar una matriz polimérica que tenga estabilidad mecánica y química para apoyar implantes a largo plazo en el cuerpo sin la degradación que de otra forma podría dañar la nueva red de tejido que ha crecido en la matriz en reemplazo de una parte del órgano. También es otro objeto de la presente invención el proporcionar una matriz con conformidad mecánica para permitir que el operador corte, reduzca y maneje la matriz polimérica sin cambiar la estructura interna y las propiedades mecánicas de la matriz . Oro objeto de la presente invención es el de proporcionar un material hinchable que alta capacidad de hinchamiento en medio acuoso que pueda adsorber cantidades importantes de material biológico de interés para la presente invención, tales como moléculas de adhesivo, tales como moléculas CAM y Ll, o moléculas de guia tales como semaforinas o netrinas disueltas en unsolvente adecuado de tal forma que las moléculas se adsorben subsecuentemente en la superficie de la red de la matriz polimérica. De acuerdo con la invención se proveen nuevos hidrogeles poliméricos hidrofilicos que son capaces deformar matrices poliméricas porosas, suaves, altamente absorbentes que sean elásticamente deformables y poseen un contenido de agua en equilibrio de cuando menos aproximadamente 80%, preferentemente cuando menos 96%. También se han provisto de acuerdo con la invención mezclas poliméricas que pueden mezclarse con células vivas. La invención se refiere a un hidrogel polimérico para uso terapéutico que es un copolimero de (a) una metacrilamida o acrilamida N-substituida, (b) un agente reticulante y (c) un material polimerizable seleccionado del grupo consistente de un azúcar, un derivado de azúcar, un peptido de adhesión a tejido, proteínas de moléculas di erenciables de tejido tal como proteínas morfogeneticas oseas y un conjugado polimérico con anticuerpos contra derivados de lípidos, que es elásticamente deformable y posee un contenido de agua en equilibrio de cuando menos aproximadamente 80%, preferentemente cuando menos 96%. Preferentemente, la metacrilamida o acrilamida N-substituida (a) se selecciona del grupo consistente de metacrilamidas y acrilamidas de N-monoalquilo y N,N-dialquilo, el agente reticulante consiste de acrilamida o sus precursores, y el material polimerizable (c) es un azúcar que se selecciona del grupo consistente de glucoamina, N-acetil glucosamina y un derivado N-acetilo de ácido neuraminico y sus formas poliméricas tales como ácido polisialico. La invención también se refiere a un método para preparar un hidrogel polimérico para el uso terapéutico que consiste en (a) disolver un agente reticulante en un solvente formador de poros con un iniciador de polimerización de radical libre para formar una solución, (b) agregar una metacrialamida o acrilamida n-substituida a la solución obtenida en (a) para formar una mezcla y (c) agregar una solución de un azúcar, un derivado de azúcar, un peptido de adhesión de tejido, proteínas morfogeneticas o peptidos bioactivos derivados, o un conjugado polimérico con anticuerpos contra los derivados de lípidos a la mezcla obtenida en (b) . De acuerdo con una modalidad preferida, el método consiste en disolver azo-bisisobutironitrilo y bisacrilamida de metileno en el solvente para formar una solución mezclando la solución con metacrilamida de N-2- (hidroxipropil) metacrilamida agregar glucosamina o NLacetilglucosamina o ácido N- acetilneuraminico, y retirar los productos residuales de bajo peso molecular y residuos de iniciador. De acuerdo con otra modalidad, el método también consiste en agregar células de tejido vivo o células genéticamente modificadas al producto obtenido en (C) y efectuar la polimerización de las células dentro del producto. De acuerdo con otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar tejidos cerebral dañado o células genéticamente modificadas al producto obtenido en (c) y efectuar la polimerización de las células dentro del producto. De acuerdo con otra modalidad, el hidrogel polimérico de acuerdo con la invención consiste de células o células genéticamente modificadas polimerizadas. De acuerdo con otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar tejidos cerebrales dañados o daños a la médula espinal que consiste en remover el tej ido cerebral o médula espinal dañados en un humano o animal y reemplazar el tejido cerebral o médula espinal dañados con un hidrogel polimérico de acuerdo con la invención. El hidrogel de acuerdo con la invención es un material es un material heterogéneo covalentemente reticulado, no transparente que preferentemente muestra una estructura de fase transparente formada de partículas poliméricas de aproximadamente 1 a 10, preferentemente 3 a 5 µm para proporcionar un área de una porosidad relativamente gruesa (macroporos) en donde se pretende que el hidrogel forme un interfaz con un tejido huésped y una porosidad relativamente fina (mesoporos) en donde se pretende que forme una interfaz con el tejido creciente. Esto da como resultado una estructura en forma de esponja con una estructura macroporosa; una porosidad fraccionada de por ejemplo cuando menos 80 a 90% ( volumen de introducción de mercurio del volumen total de gel) ; un rea de superficie especifica en el marco de preferentemente cientos de mVgramo de gel; un diámetro de poro medio (volumen) de por ejemplo aproximadamente 15 a 35 µm, un volumen poroso para poros iguales o mayores que 10 µm igual al 90-95% de la porosidad fraccionada del hidrogel siendo la fraccionmayor del volumen de poro total del gel ocuparo por un régimen de poroo de 10 a 50µm; un carácter hiperporoso (porosidad fraccional del gel de cuando menos 50% del volumen del poro) de 20-30µm. La macroestructura y porosidad del los hidrogeles puede manipularse al controlar el tamaño de las partículas y la estructura porosa que depende de la composición y las propiedades del solvente formador de poros usado, la fracción volumétrica de polímero, la interacción polímero-solvente, la temperatura de polimerización y las propiedades del monomero reticulante usado . La acumulación exitosa de biomasa y la interacción celular es resultado e tal interacción superficie/volumen óptima como se muestra con los datos de porosimetria de mercurio que da como resultado la micro- y mesoporosidad de las partículas psliméricas. Un aspecto final importante del material es su naturaleza abierta y su capacidad de interconexión adecuada para la acumulación de células de biomasa e interacción celular/molecular con el tejido vivo. Bajo la microscopía electrónica de barrido como se muestra en la figura 3 , esos geles heterogéneos típicamente muestran una estructura tridimensional coloidal con un poro no circular y la pared del sistema de poros que es representada por la contigüidad de la superficie de agregados poliméricos, como los mostrados en los dibujos. El área de superficie efectivo es una función de la porosidad de la superficie de las partículas. En contraste a los geles homogéneos, una ventaja principal de esos geles heterogéneos es que el área de superficie generado por las partículas es virtualmente ilimitado como el tamaño de los agregados (1) disminuye de tal forma que el área de superficie es inversamente proporcional a 1. También en comparación a los hidrogeles homogéneos, los hidrogeles heterogenos de la presente invención muestran un volumen de poroso mucho mayor y por lo tanto son mas efectivos para la infiltración celular y la acumulación de biomasa. Además y en comparación a los hiodrogeles homogéneos los hidrogeles de acuerdo con la invención tienen propiedades mecánicas que se asemejan a aquellas del tejido neurologico adulto y en desarrollo.

Esas matrices de hidrogel tienen arquitecturas especificas al tejido reales debido a que la interacción celular da como resultado una red de tejido organizado a través de las estructuras de gel, los llamados hidrogeles organoides. Las matrices poliméricas pueden formarse por medio de la precipitación simultanea o polimerización precipitada y copolimerizacion reticulada de una cantidad efectiva de cada uno de los siguientes componentes (i) metacrilamidas N-substituidas tales como N-monoalquilmetacrilamidas o acrilamidas N-substituidas tales como N-monoalquilacrilamidas o acrilamidas N,N-disubsituidas tales como N,N-dialquilacrilamidas; (ii) un agente reticulante tal como acrilamida o sus precursores de compuestos de divinilo, y similares; (iii) un iniciador de polimerización de radical libre, tal como azobisisobutironitrilo, varios peróxidos, ácido ascorbico, peroxisulfatos compuestos azo substituidas y similares que son bien conocidos a los expertos en la técnica, en cantidades que pueden variar entre 0.01 a 2% en peso con respecto al copolimero o terpolimero; (iv) azucares complejos tales como glucosamina o N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina o ácido N-acetilneuraminico o ácido polisialico u otros derivados de azucares o oligopeptidos de adhesión de tejidos que contengan secuencias tales como Arg-Gly-Asp, Ile-Lys-Val-Ala-Val, Ala-His-Ala-Val-Ser-Glu, Tyr-Ole-Gly-Ser-Arg, oligopeptidos derivados de moléculas diferenciadoras de tejido (por ejemplo proteínas morfogeneticas) o conjugados poliméricos con anticuerpos contra mielina y lípidos asociados con axones y sus derivados en un solvente preferentemente acetona/sulfoxido de dimetilo, acetona o acetona/etanol . Los grupos alquilo preferentemente tienen uno o dos átomos de carbono, por ejemplo hidroxialquilo Ct a C2 y radicales alquilamino. El termino N substituido como se usa aquí incluye substituyentes C1-8 que pueden contener OH, un grupo amino o una combinación de los mismos . La reacción se realiza generalmente a una temperatura de 40 a 60°C en recipientes de polimerización que consiste de ampolletas selladas durante un período de aproximadamente 12 horas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una vista microscópica de u gei homogéneo; La figura 2 es una vista microscópica de un gel homogéneo implantado en la médula espinal; La figura 3 es una vista microscópica de un gel heterogéneo de HPMA; La figura 4 es una vista microscópica de un gel de la figura 3 implantado en tejido nervioso. EJEMPLO 1: AIBN (azobisisobutironitrilo ) (1.2 % p/p) y bisacrilamida metileno (1 % mol) se disuelven en acetona seca. la solución se mezcla con N-2-metacrilamida (hidroxipropilo) en una proporción de volumen del 30% HPMA con una mezcla de acetona/sulfoxido de dimetilo (93: 7 v/v ) . Se disuelve N-metacriloil glucosamina (5% en peso) o l-metil-2-metacrilolimeoetilo -2-acetamido-2-desoxi-beta-D-glucosido (6.5% en peso ) o ácido 2- (l-metil-2-metacriloilamidoetil] 5-acetamido -3,5-didesoxi-D-glicero-alfa-D-galacto-2-nonulopiranosidonico (5.2% en peso) o ácido metacriloilglicilglicilarginilglicilaspartico (1.45 en peso) en dimetilsulfoxido y se agrega a la mezcla de polimerización la mezcla se homogeniza completamente y se carga en una jeringa y se inyecta en ampolletas. La mezcla de reacción se purga entonces con nitrógeno y las ampolletas se sellan con llama, con el objeto de evitar la evaporación del solvente, la mezcla puede primeramente congelarse en una mezcla de hielo seco etanol antes de aplicar fuego a las ampolletas . Las ampolletas selladas se sumergen en un baño de agua a 50°C por 24 h. Preferiblemente, de acuerdo con la invención, los productos residuales de peso molecular bajo, tales como monomeros no reaccionados, oligomeros que no se incluyeron en el trabajo y trazas de iniciador se retiran del producto hidrogel antes de su uso. Esto puede conseguirse sumergiendo los xerogeles en etanol por 20 horas, luego en una mezcla de etanol / agua (1:1, v/v) por 20 horas y en agua destilada por una semana y la tasa de extracción es baja, preferentemente cero.Otro aspecto importante de la presente invención es evitar la contaminación. La preparación del gel polimérics se hace preferentemente en una cámara de biopeligro (biohazard) con un flujo de aire filtrado. Los pasos de lavado se realizan usando materiales estériles y las geles se almacenan a 4o C en agua destilada estéril. Para formar un dispositivo híbrido que incluya tanto el dispositivo polímero como las células de tejido de donador, las células pueden inocularse en la estructura porosa de hidrogel polimérico por micropunturas de la red polimérica usando una jeringa Hamilton conteniendo la suspensión celular La introducción de las células en el hidrogel polimérico puede hacer en vitro o en vivo siguiendo el tiempo adecuado después de la implantación del hidrogel en el área del órgano buscado. las células pueden aislarse del cerebro humano o del tejido muscular o de material de autopsia. EJEMPLO 2: Inoculación de célula en hidrogel PHPMA in vitro. Las neuronas fueron aisladas de los hemisferios cerebrales de un embrión de rata libre de meninges y vasos de sangre en DMEM, y se aplastaron en fragmentos pequeños de tejido, los tejidos fueron mecánicamente disociados con una pipeta Pasteur en un tubo centrífugo conteniendo DMEM, El supernatante se salvo y los fragmentos de tejido asentados fueron agitados con una pipeta Pasteur que había sido pulida al fuego para angostar la punta. Después de varios ciclos de resuspensión /disociación de célula, el supernatante del deposito fue centrifugado, y las células se concentraron a 10s células por lOOµl de medio. La fracción se mantiene en hielo hasta que se usa para el entrapamiento de la célula. Para una penetración eficiente y confiable de las células dentro del hidrogel polimérico, las células fueron introducidas en una jeringa Hamilton unida a un dispositivo micromanipulador y se inocularon con un daño de presión mínimo a la concentración deseada dentro de los geles PHPMA hinchados bajo un microscopio binocular y en condiciones asépticas. Los hidrogeles conteniendo células se mantienen a un volumen mínimo de medio de cultivo y se incuban a 37°C y 5% C02 en una atmosfera húmeda. Una vez que las celdas han alcanzado el grado apropiado de crecimiento, el dispositivo híbrido puede trasplantarse al cerebro para facilitar la reconstrucción del tejido y la reparación. la mezcla de polímero puede mezclarse con células vivientes, combinando así las características físicas de la matriz polimérica con el comportamiento tipo hidrogel (porosidad, estabilidad, superficies de guía, permeabilidad) y factores biológicos celulares ( por ejemplo , factores de crecimiento) . la introducción de las células en la matriz polimérica se consigue por un proceso de entrampamiento de gel a una temperatura bajo cero, esto es, criopolimerización, que rinde una matriz porosa dentro de la cual las células están inmovilizadas y pueden alcanzar reorganizción, crecimiento y/o diferenciación para una transplantación subsecuente . El solvente debe ser una solución isotónica o medio de cultivo de tejido del tipo que se usa comúnmente en los cultivos de célula y tejido combinado con un crioprotector conveniente (glicerol/sulfoxido de dimetilo) o glicerol o DMSO o polivinilpirrolidona o almidón hidroxietilo, carboximetilcelulosa) . El proceso permite controlar las densidades finales de las células que van desde unas cuantas células a densidades de células que se aproximan a la densidad de células del tejido, aproximadamente 109 a 1010 células por centímetro cubico. El proceso permite también variar y controlar la porosidad de la matriz al variar la tasa de enfriamiento y la temperatura de la mezcla de polimerizaciór: conteniendo células ( nitrógeno líquido o isopentano enfriado) . El proceso rinde una estructura esponjosa macroporosa de criogel con un tamaño de poro que permite la difusión de nutrientes y macromoleculas (por ejemplo, factores de crecimiento) y de las células atrapadas dentro de la matriz de gel polimérica y migración de las células, y un volumen de poro adecuado para una acumulación efectiva de biomasa, expansión (división de las células) y organización (contacto célula a célula) durante el desarrollo del tejido y la maduración) EJEMPLO 3 : Atrapamiento de gel de astrocitos por criopolimerización de HPMA. Los astrocitos fueron obtenidos por la incubación de cortezas cerebrales de ratas de dos días de nacidas en una solución de 0.1 5 tripsina- EDTA, 0.001% DNAsa en DMEM amortiguada con Hepes por 30 min. a 37°C y disociación mecáanica. las células se hicieron placa en recipientes de plástico a 106 celdas / 10 ml y se mantuvieron a 37°C en DMEM con 10% de Suero bovino fetal. Después de 7 días en vitro, los astrocitos se cosecharon y suspendieron e una solución de sal balanceada Hank (HBSS, pH 7.4) conteniendo 20% glicerol, se concentró a 10s por 100 µ 1 y se mantuvo a 6° C. El procedimiento de atrapado se realizó desde un gabinete de flujo laminar, usando materiales estériles. La solución de prepolimerización consistía de 0.69 g de N- ( 2-hidroxipropil) metacrilamida y 0.010 g de bisacrilamida metileno disuelta en 2.3 ml de HBBS conteniendo 20% de glicerol, y como iniciadores, persulfato de amonio (100 mg/ml HBSS; 4.3X 10"3M) con diamina de N,N,N',N'- tetrametiletileno diluida en HBBS (1:1, v/v HBBS:3.3x 10"5M) . El pH se ajustó a 7.0 con HCl 0.1 N y la solución de pre-polimerización perdió el aire por nitrógeno y se pre-enfríó a 4° C antes de usarse. Las células fueron suspendidas en la mezcla de pre-polimero de alta densidad a una densidad de 10d células por mililitro y la mezcla se mezcló cuidadosamente y se inyectó usando una jeringa Hamilton entre dos placas de vidrio pre- enfriadas separadas por 0.75mm con hule de silicona como sellante para un volumen final de 3 ml . El molde sé enfrió a -170 °C aproximadamente 1 minuto sumergiéndolo en nitrógeno líquido , y se dejaron por 3 minutos en nitrógeno líquido antes de su transferencia a un baño de agua enfriada a -15°C. La reacción de polimerización realizó durante 5 h. en el baño de agua enfriado, después los moldes se enjuagaron en un baño de hielo a 37°C . Después de la desintegración del hielo, las geles fueron retiradas delmolde, lavadas con HBSS para retirar el agente crioprotector y los productos de la reacción que no reaccionaron y se pusieron en discos circulares con un diámetro de 0.8mm . Los discos de gel se incubaron a 37°C y 5% de C02 en una atmosfera humedificada en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de antibióticos ( estreoptomicina-penicilina) . Este método para la fabricación de tejidos híbridos de hidrogel polimérico tiene dos ventajas principales en comparación al procedimiento presentado por Woerly y asoc. (1996) : prevención de daño a la célula de membrana por la polimerización a baja temperatura, y la formación de una estructura de poro fija ( hidrogel heterogéneo ) . Como resultado las células son atrapadas dentro de la matriz polimérica con una estructura de andamio para la organización, área superficial interna grande, suficientes espacios vacíos para la expansión de las células y permeabilidad aumentada. Además la mezcla de polímero de célula puede conservarse almacenada una vez que se ha congelado para una polimerización subsecuente como ya se ha descrito. En cualquier etapa del desarrollo de la célula, la matriz híbrida resultante consiste de una fase sólida que comprende la matriz porosa, las células y la matriz extracelular de la célula, y una fase fluida correspondiente al medio de cultivo de la célula y a los fluidos extracelulares . Como será apreciado por el técnico, este procesos diferente del llamado procedimiento de "encapsulamiento de célula" que usa técnicas de micro o macro encapsulación, y en donde las células son simplemente encerradas en una membrana de polímero que tiene una forma esférica de diámetro variable. En este escrito el termino "célula" pretende incluir los fragmentos de tejido, las acumulaciones de células, células solas de origen embrionario, neonatal o adulto, células modificadas genéticamente, ya sea células primarias o células inmortalizadas, líneas de células inmortalizadas de línea de células existentes en tumores o líneas de células de precursor inmortalizadas, o células de especie o progenitor, células de precursor seleccionadas de factor de crecimiento de cualesquiera tejidos y órganos. El proceso y el producto de esta invención son adecuados para preparar una amplia variedad de tejidos artificiales u órganos artificiales para la transplantación o los sistemas de cultivo de tres dimensiones.

ENSAYO 1 La tolerancia biológica de los hidrogeles de polímero de la invención se estudio por la implantación en la cuerda espinal transectada y en las lesiones cerebrales de las ratas . Muestras para el ensayo fueron tomadas de 1 semana hasta 10 meses después de la implantación. La tolerancia biológica fue excelente. Macroscópicamente, los estudios han mostrado que esta formulación hidrogel de polímero promueve la reestructuración del tejido y una regeneración axonal en el lugar de implantación en la médula espinal hemi y transectada y así alcanzar una restauración de la continuidad del tejido de hasta el 100% (Fig. 4) . los datos se sumarizan como sigue: (i) integración del hidrogel y restauración de la continuidad del órgano el hidrogel, conserva el volumen de la lesión constante de modo que un nuevo tejido puede desarrollarse y reemplazar la lesión al adherirse con su superficie porosa a la herida; (ii) interface suave con la superficie total disponible del polímero; cicatrizado mínimo y ausencia de cavitación cistica en el tejido adyacente huésped; (iv) crecimiento por dentro de un red de tejido basado en glial dentro de la red de polímero reforzando la anexión del implante al huésped; (v) crecimiento por dentro de células de origen heterogéneo; (vi) crecimiento por dentro capilar; (vii) deposición de moléculas de matriz extracelular (colágeno, fibronectina y la inina) en la superficie de la red del polímero como se ve por la histoquímica de inmunidad, y ( viii) crecimiento axonal a través del bioimplante. Los estudios de espectroscopia infrarroja de los hidrogeles explantados muestran que el espectro infrarrojo del hidrogel nativo no implantado ha sido sustituido por características infrarrojas típicas de compuestos de lípido y proteínas similares al tejido espinal adyacente, confirmando que los elementos de tejido de médula espinal están integrados a la red porosa del hidrogel . ENSAYO 2 El procedimiento de criopolimerización permitió generar geles heterogéneos con estructura macroporosa fija en donde las células se inmovilizan. Los estudios usando la técnica de etiquetado de célula, tal como etiquetado de célula o inmunocitoquímica , muestran que las células son distribuidas uniformemente a través de la red del polímero y a diferentes niveles dentro de las geles, ya sea con células aisladas individualmente o arregladas en pequeños acumulamientos de pocas células . Las células que sobreviven fueron positivamente manchadas con inmunidad durante tres semanas en una incubación in vitro con perfiles antigenicos de desarrollo de células de tejido neural. Por lo tanto, los astrocitos aislados de cerebro neonatal de ratas pueden atraparse dentro de hidrogeles hidrofilicos por la reacción de criopolimrización con altos niveles de retención y las células atrapadas pueden sobrevivir y normalmente diferenciarse como lo hacen en condiciones de cultivo de una capa; después de 10 días in vitro, la viabilidad de las células atrapadas es del 90% usando técnicas de etiquetado de células. Además las células son funcionales ya que sintetizan laminina y fibronectina dentro de la matriz del polímero como lo hacen en los cultivos de una capa. Se pretende que el hidrogel polimérico se use principalmente como un expansor del tej ido y como base de formación de tejido para reemplazar defectos del tejido o falta de tejido de los órganos blandos del cuerpo, que resulten ya sea de un trauma o una manipulación quirúrgica o de una mala conformación congénita, al promover la formación de un nuevo tejido funcionalmente integrado al órgano. También se pretende que se use para una trabajo de ingeniería de saneamiento de curación de herida, remodelado de tejido, regeneración de tejido, desarrollo de órganos blandos tales como hígado, páncreas, piel, músculo. También puede usarse en combinación con otros materiales para la regeneración y reparación osea. Otra aplicación del hidrogel de polímero es desarrollar procedimientos para proveer una terapia para desordenes neurologicos específicamente humanos, y el hidrogel polimérico puede usarse de dos maneras de acuerdo a la naturaleza y al tipo de enfermedad y a la extensión del defecto funcional . Primeramente puede usarse como una placa de regeneración de tejido o un portador de célula después de la incorporación de un injerto celular. El hidrogel polimérico de acuerdo con la invención se pretende que por ejemplo se use para tratar un defecto ocasionado o congénito de áreas especificas del cerebro y la médula espinal en la etapa de desarrollo o en la etapa adulta (esto es, daño en la médula espinal), o cualquier mal funcionamiento del parte del tejido neural y reemplazar el tejido cerebral o el tejido de la médula espinal con el hidrogel de polímero que se ha descrito. El hidrogel de polímero de acuerdo con la invención también es útil para reconstruir circuitos neuronales que están asociados con trayectorias axonales en el sistema nervioso central en la edad de desarrollo o en la etapa adulta. Por ejemplo, los circuitos de septohipocampal que están incluidos en el funcionamiento de la memoria que se dañan por ejemplo con el mal de Alzheimer o los circuitos nigro-estriatales que a^ incluyen en el mal de Parkinson o parte del estriato en el mal de Huntington, o en disfunciones hormonales/reproductoras incluyendo el sistema anatómico hipofiso -hipotalamo . Esto se realiza por el retiro quirúrgico de la parte defectuosa del tejido cerebral y con la implantación de gel de acuerdo con la invención preferiblemente con un injerto de célula neural con el objeto de inducir la formación de nuevos circuitos axonales funcionales. De la misma manera, malformaciones que resulten en un mal funcionamiento de los circuitos de la médula espinal (por ejemplo espina bífida) pueden tratase retirando la parte anormalmente formada del órgano y reemplazándola por el neurogel de acuerdo con la presente invención,preferiblemente con un injerto celular neuronal . Otra aplicación del hidrogel de acuerdo con la invención es el tratamiento del nervio óptico y los nervios periféricos al inducir de la misma manera el recrecimiento axonal a través del hidrogel de polímero de la invención. Se comprende que la presente invención no queda limitada a las modalidades preferidas descritas anteriormente y que son posibles modificaciones sin salir del espíritu y alcance de la presente invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un hidrogel polimérico para uso terapéutico, el hidrogel es un copolimero de (a) una metacrilamida o acrilamida N-substituida, (b) un agente reticulante y (c) un material polimerizable seleccionado del grupo consistente de un azúcar, un derivado de azúcar, un peptido de adhesión a tejido, proteínas de moléculas diferenciables de tejido tal como proteínas morfogeneticas oseas y un conjugado polimérico con anticuerpos contra derivados de lípidos, que es elásticamente deformable y posee un contenido de agua en equilibrio de cuando menos aproximadamente 80%.
2. 2. - Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual (a) la metacrilamida o acrilamida N-substituida se selecciona del grupo consistente de metacrilamidas y acrilamidas de N-monoalquilo y N,N-dialquilo, (b) el agente reticulante consiste de acrilamida o sus precursores, y (c) el material polimerizable es un azúcar que se selecciona del grupo consistente de glucosamina, N-acetil glucosamina y un derivado N-acetilo de acido neuraminico.
3. 3.- Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el alquilo contiene 1 a 2 átomos de carbono.
4. 4. - Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 3 , en el cual el alquilo es un radical hidroxialquilo o aminoalquilo.
5. 5. - Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el contenido de agua en equilibro es de cuando menos 96%.
6. 6.- Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el hidrogel es reticulado covalentemente, substancialmente no transparente y constituye un material heterogéneo .
7. 7. - Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual el hidrogel muestra una estructura de fase transparente formada de partículas poliméricas de aproximadamente 1 a 10 µm proporcionando un área de porosidad relativamente gruesa en la cual el hidrogel se pretende forma una interfaz con un tejido huésped y de porosidad relativamente fina en donde se pretende que forme una interfaz con el tejido creciente.
8. 8. - Un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura macroporosa con una porosidad fraccional de cuando menos 80 a 90%, un área de superficie especifico de cuando menos 100m2/gramo de gel; un diámetro de poro medio de aproximadamente 15 a 35 µm, un volumen poroso para poros que miden cuando menos 10 µm igual al 100% de la porosidad fraccionada del hidrogel y un carácter hiperporoso de 20-30µm.
9. 9.- Un método para preparar un hidrogel polimérico para el uso terapéutico, que consiste en (a) disolver un agente reticulante en un solvente formador de poros con un iniciador de polimerización de radical libre para formar una solución, (b) agregar una metacrialamida o acrilamida n-substituida a la solución obtenida en (a) para formar una mezcla y (c) agregar una solución de un azúcar, un derivado de azúcar, un peptido de adhesión de tejido, proteínas morfogeneticas o peptidos bioactivos derivados, o un conjugado polimérico con anticuerpos contra los derivados de lípidos a la mezcla obtenida en (b) bajo condiciones efectivas para dar el gel polimérico.
10. 10.- Un método de acuerdo con la reivindicación 9, que consiste en disolver azobisisobuturonitrilo y bisacrilamida metileno en el solvente, para formar una solución, mezclar la solución con metacrilamida de N-2- (hidroxipropilo) , agregar glucosamina o N-acetil glucosamina o acido N-acetilneruaminico y retirar los productos residuales de bajo peso molecular y las huellas de iniciador.
11. 11.- Método de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual el agente reticulante se selecciona del grupo consistente de acrilamida, sus precursores y agentes reticulantes de divinilo.
12. 12.- Método de acuerdo con la reivindicación 9 en el cual el iniciador de polimerización se selecciona del grupo consistente de azobisisobituronitrilo, peróxidos, acido ascorbico, peroxisulfatos y compuestos aza substituidos y se usa en cantidades entre 0.01 y 2% en peso con respecto al hidrogel polimérico formado.
13. 13.- Método de acuerdo con la reivindicacio 12, en el cual la solución de material polimerizable consiste de un azúcar complejo.
14. 14.- Método de acuerdo con la reivindicación 13, en el cual el azúcar complejo se selecciona del grupo consistente de glucosamina, N-acetil glucosamina, derivados de N-acetilo de acido neuraminico, acido polisialico y galactoseno.
15. 15.- Método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la solución de material polimerizable consiste de un peptido de adhesión de tejido.
16. 16.- Método de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la solución de material polimerizable consiste de un polímero conjugado con anticuerpos contra los derivados de lípidos.
17. 17.- Método de acuerdo con la reivindicación 12 que se realiza a una temperatura entre 40 y 60°C durante aproximadamente 12 horas .
18. 18.- Método de acuerdo con la reivindicación 9, que consiste en agregar células de tejidos vivos o células genéticamente modificadas al producto obtenido en (c) y efectuar la polimerización de las células con el producto.
19. 19. - Un hidrogel polimérico copolimerizado de acuerdo con la reivindicación l, en donde las células de tejidos vivos o células modificadas genéticamente se polimerizan en el.
20. 20.- Un método para tratar tejidos cerebrales o médula espinal dañados que consiste en retirar el tejido cerebral o médula osea dañados en un humano o animal y reemplazar el tejido cerebral o médula osea dañado con un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 1.
21. 21.- Un hidrogel copolimérico para uso terapéutico, el hidrogel es un copolimero de (a) una metacrilamida o acrilamida N-substituida, (b) un agente de enlace cruzado y (c) un material tejido-adhesivo polimerizable.
22. 22.- Método para tratar tejido cicatrizantes, dañado o funcionalmente defectuoso en un mamífero, que consiste en retirar el tejido cicatrizantes, dañado o funcionalmente defectuoso y reemplazarlo con un hidrogel polimérico de acuerdo con la reivindicación 1.
23. 23.- Método de acuerdo con la reivindicación 22, para reconstituir los circuitos neuronales que se asocian con trayectorias axonales en el sistema nervioso central.
24. 24.- Método de acuerdo con la reivindicación 22, para el tratamiento de daños traumáticos del nervio óptico y los nervios periféricos .