JP2003126236A - 損傷された眼球組織の再生のための生分解性高分子から製造された多孔性支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 損傷された眼球部位に埋込することにより、
損傷された眼球部位に眼球組織を再生させて損傷された
眼球組織を治癒するための、生分解性高分子から製造さ
れた多孔性支持体に関する。 【解決手段】 本発明の損傷された眼球組織再生用多孔
性支持体は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロ
ラクトン、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカルボ
ネート及びこれらの共重合体からなる群から選択される
１種類以上の生分解性高分子から製造され、空隙の孔径
が１０〜８００μmであり、空隙率が５０〜９９％であ
る。損傷された眼球部位、即ち角膜、結膜及び鞏膜に本
発明の多孔性支持体を埋込して副作用を惹起することな
く眼球組織を再生/治癒することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、損傷された眼球部位に
埋込することにより、損傷された眼球部位に眼球組織を
再生させて損傷された眼球組織を治癒するための、生分
解性高分子から製造された多孔性支持体に関する。

【０００２】更に具体的に、本発明は、ポリグリコール
酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノ
ン、ポリトリメチレンカルボネート及びこれらの共重合
体からなる群から選択される１種類以上の生分解性高分
子から製造された、空隙の孔径が約１０〜８００μmで
あり、空隙率が約５０〜９９％である、損傷された眼球
組織再生用多孔性支持体を提供する。

【０００３】

【従来の技術】眼球は全体的に鞏膜（sclera）により囲
まれており、瞳の前の部分は、光が通過する角膜（corn
ea）と、角膜と鞏膜を連結し、眉の内部の瞼結膜まで連
結された袋状の結膜（conjunctiva）とで構成されてい
る。

【０００４】角膜は厚さが１〜１．２mmであり、神経は
分布されているものの、血管のない透明な膜として光を
屈折透過させる。角膜は組織学的に上皮、ボウマン膜、
間質、デスメ膜、内皮の５層で構成されており、上皮は
損傷を受けると１〜２日内に素早く再生されるが、内皮
は再生し難い。結膜及び鞏膜には血管があり、大部分繊
維細胞で構成された膜として容易に再生される。角膜と
結膜は眼球の前方に露出されているため、外傷、火傷、
化学薬品により損傷されることがあり、更に種々の病変
及び感染によし組織壊死が発生することがある。鞏膜は
内部に位置しているが、やはり病変及び感染により損傷
されることがある。損傷された角膜上皮、結膜及び鞏膜
は容易に回復するが、回復速度が速すぎると瘢痕（sca
r）が生じやすい。

【０００５】損傷された角膜を治療するには、一般的に
は、死体から採取して移植する方法が非常に成功的に行
なわれているが、生体角膜の供給が不足し、また患者に
スティーブンス-ジョンソン（Stevens-Johnson）疾病
（涙不足症）などの疾病があれば失敗し易い。人工物質
で製造された人工角膜については長期間研究されてきた
にも拘わらず、未だ臨床的に成功率が非常に低い（T.
V. Chirilaら、J. Biomed. Mater. Res., 28, 745, 199
4など参照）（非特許文献１参照）。即ち、移植された
人工角膜が剥がれたり、鞏膜が壊死し、周囲組織が腐っ
て行くなどの合併症により失敗率が高い。これは、人工
角膜として用いられる材料の生体適合性（biocompatibi
lity）が優れておらず、生体角膜との接合力が弱いため
である。このような問題点を解決するために、米国特許
（第 5,836,313号, E.Perezら）（特許文献１参照）に
は角膜組織（コラーゲン）とヒドロゲル（hydrogel、ポ
リエチレンオキシドなど親水性高分子の架橋体）が複合
結合された人工角膜が記述されているが、実際の臨床で
適用された結果はない。角膜の損傷がそれ程大きくない
場合や、レーザ施術後の副作用、炎症、感染された角膜
の治療の場合には、羊膜（胎盤の最内側膜として胎児を
取り囲んでいる薄い半透明膜）でその部位を被覆するこ
と方法が行なわれており、これにより炎症が減少し、細
胞の成長を促進させて効果的に治癒されることも可能で
ある（米国特許第6,143,315号, M.X.Wangら参照）（特
許文献２参照）。しかし、このような方法は損傷部位が
大きい場合や、損傷の程度が酷い場合には適用できない
という限界がある。

【０００６】一方、損傷された結膜を治療する方法も完
全ではない。現在、病変のある結膜を除去した後、下に
露出された鞏膜を覆うために周辺の結膜を引張って縫合
させる結膜表面再建術が行われているが、これは美容
上、機能上の障害をもたらし、病変があまりにも広範囲
な場合には手術が不可能である。

【０００７】近来、生分解性高分子支持体（scaffold）
を利用して損傷された生体組織や臓器を再生する組織工
学（tissue engineering）が盛んに研究されている。こ
のような場合、生分解性高分子支持体としては、多孔性
（porous）物質が用いられ、その内外部に細胞が付着し
て成長しながら支持体が徐々に分解消滅される。現在、
支持体の化学的な性質／表面物性と細胞の付着／成長の
相関関係、支持体の空隙（pore）サイズの効果、細胞の
付着及び養育条件などに関して多くの研究が進行されて
いる。現在、このような組織工学技術を利用して人工皮
膚と人工肝が成功しており、軟骨と人工骨、人工血管、
人工膀胱、人工心臓弁膜、神経再生に対する研究が盛ん
に展開されている（R. C. Thomasonら、Adv. Polym. Sc
i., 122,245, 1995など参照）（非特許文献２参照）。
角膜も組織工学研究の対象の一つであるが、未だ実験段
階であり、実用には長期間が要されている（L. Germain
ら、Pathobiology, 67, 140, 1999など参照）（非特許
文献３参照）。

【０００８】前記生分解性高分子としては、ポリグリコ
ール酸、ポリ乳酸などの合成高分子及びこれらの共重合
体、又はヒアルロン酸、キトサンなどの天然高分子及び
これらの混合物からなる群から選択される材料が使用さ
れている。

【０００９】このような多孔性支持体としては、高分子
の繊維不織布（fiber mesh）を用いたり、又は塩浸出
法、乳化凍結乾燥法、相分離法、高圧気体膨張法、塩発
泡法などにより製造されている。

【００１０】このような生分解性高分子支持体の役割
は、３次元的に組織が付着して成長することができ、細
胞の成長及び新たな組織形成に必要な栄養分と特定の成
長因子を伝達することである。窮極的には細胞の増殖、
成長と共に細胞外の基質が分泌されて新たな組織が形成
され、高分子支持体は徐々に分解されて完全に消滅され
るため、細胞群と細胞外の基質のみで構成された新たな
組織代替物が完成される。従って、このような生分解性
高分子支持体は無毒であり、組織に対する生体適合性
（tissue compatibility）に優れていなければならず、
機械的な強度が充分で細胞が付着して成長する間は形態
を維持しなければならない反面、分解速度が適当で細胞
の成長と共に分解消滅する必要がある。従って、組織工
学の対象に応じて前記合成高分子が適当な割合で混合さ
れた組成の共重合体が多用される。特に、グリコール
酸、乳酸及びカプロラクトンで構成された共重合体は入
手し易く、物性及び分解速度に関する資料が多いため最
も多く使用されている。

【００１１】多孔性生分解性高分子支持体に細胞が付着
して成長する工程は非常に重要である。細胞の付着は細
胞の種類と材料の化学的な組成と表面の物性（特に材料
の疎水性/親水性）、空隙の孔径及び細胞の付着方法に
よって差が大きい。一般的に合成高分子は疎水性である
ため細胞付着（更に細胞が含有された培養液の濡れ性
（wetting））が少ない。

【００１２】反面、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサ
ンなどの天然高分子は親水性が大きいため細胞の付着が
多いが、機械的な強度が弱く、分解速度の調節が困難で
ある。従って、疎水性高分子の表面を物理的及び化学的
な方法で親水化する方法（J.Gaoら、J. Biomed. Mater.
Res., 42, 417, 1998など参照）（非特許文献４参照）
又は天然高分子をコーティングして使用する方法（M.
D. M. Evansら、J. Biomed. Mater. Res., 56, 461, 20
01など参照）（非特許文献５参照）などが報告されてい
る。

【００１３】付着された細胞が成長する速度と細胞の生
理学的な活性度も前述の要素により差が大きいが、細胞
の付着と成長速度が必ずしも比例するものではない。そ
の中でも空隙の孔径と分布が細胞の成長を決定する非常
に重要な要素であり、空隙が互いに連結された（inter-
connecting）構造であると、栄養液が支持体の内部まで
均一に浸透して細胞が良好に成長する。

【００１４】上記のような生分解性高分子を用いて多孔
性支持体を製造する方法としては種々のものがある。繊
維不織布（nonwoven mesh）には空隙が多く、表面積が
広いため頻繁に使用されている。より容易な方法は、生
分解性高分子の有機溶媒溶液に、これには溶解しない塩
などの粒子を混合してキャスティングした後に溶媒を除
去し、水で塩粒子を溶出除去する塩浸出法（solvent-ca
sting/particulate- leaching method）で、塩粒子のサ
イズと混合比率を調節することにより多様な空隙の孔径
と空隙率（porosity）を有する多孔性構造を得ることが
できる。

【００１５】これ以外にも、生分解性高分子溶液にアン
モニウムビカルボネート（酸性水溶液や高温の水と反応
して二酸化炭素とアンモニアガスに分解される）粒子を
混合してマトリックスを作り、有機溶媒を一部除去した
後、高温の蒸留水に浸漬して塩を発泡させて除去する塩
発泡法（gas foaming/salt leaching）、高分子の有機
溶媒溶液/水の乳化液（emulsion）を凍結乾燥して有機
溶媒と水を除去する乳化凍結乾燥法（emulsion freeze-
drying）、高分子の有機溶媒溶液に昇華性物質又は溶解
度が異なる溶媒を追加し、昇華又は温度変化による相分
離（phase separation）により多孔性支持体を製造する
相分離法、有機溶媒を使用しない方法として生分解性高
分子を鋳型に入れ圧力を加えてペレットを作り、適当な
温度で高圧の炭酸ガスを生分解性高分子に注入した後、
徐々に圧力を下げてマトリックス内の炭酸ガスを放出さ
せて空隙を形成する高圧気体膨張法（high pressure ga
sexpansion）などが報告されている。

【００１６】

【特許文献１】米国特許第５８３６３１３号明細書

【特許文献２】米国特許第６１４３３１５号明細書

【非特許文献１】ティー・ブイ・キリラ（T. V. Chiril
a）ら、「ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテ
リアル・リサーチ（Journal of Biomedical Material R
esearch）」、（米国）、1994年、第28巻、ｐ．745

【非特許文献２】アール・シー・トマソン（R. C. Thom
ason）ら、「アドバンス・イン・ポリマー・サイエンス
（Advances in Polymer Science）」、ドイツ、1995
年、第122巻、ｐ．245

【非特許文献３】エル・ジャーマイン（L. Germain）
ら、「パソバイオロジー（Pathobiology）」、（スイ
ス）、1999年、第67巻、ｐ．140

【非特許文献４】ジェイ・ガオ（J. Gao）ら、「ジャー
ナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ
（Journal of Biomedical Material Research）」、
（米国）、1998年、第42巻、ｐ．417

【非特許文献５】エム・ディー・エム・エバンス（M.
D. M. Evans）ら、「ジャーナル・オブ・バイオメディ
カル・マテリアル・リサーチ（Journal of Biomedical
Material Research）」、（米国）、2001年、第56巻、
ｐ．461

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、損傷された角膜、結膜及び鞏膜などの眼球部位に埋
込することにより副作用を惹起することなく、損傷され
た眼球部位に眼球組織を再生させて損傷された眼球組織
を治癒させるための、生分解性高分子から製造された多
孔性支持体を提供することである。

【００１８】本発明者らは、グリコール酸、乳酸、カプ
ロラクトン、ジオキサノン又はトリメチレンカルボネー
トで製造された生分解性高分子共重合体を使用し、前述
したような製造方法により製造した空隙の孔径が約１０
〜８００μmであり、空隙率が約５０〜９９％である多
孔性支持体が、眼球組織再生用多孔性支持体として優れ
た効果を有することを発見した。

【００１９】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポ
リジオキサノン、ポリトリメチレンカルボネート及びこ
れらの共重合体からなる群から選択される１種類以上の
生分解性高分子から製造された、空隙の孔径が約１０〜
８００μm、より好ましくは約５０〜６００μmであり、
空隙率が約５０〜９９％、より好ましくは約７５〜９７
％である、損傷された眼球組織再生用多孔性支持体に関
する。

【００２０】前述のように、組織工学に使用される生分
解性多孔性高分子支持体は無毒であり、組織に対する生
体適合性に優れていなければならず、機械的な強度が充
分で細胞が付着して成長する間は形態を維持しなければ
ならない反面、分解速度が適当で細胞の成長と共に分解
消滅する必要がある。本発明の多孔性支持体に使用する
高分子は、グリコール酸、乳酸、カプロラクトン、ジオ
キサノン、又はトリメチレンカルボネートで組成された
高分子及びこれらの共重合体である。ポリグリコール酸
は強度は大きいが、分解が非常に速くて３ヶ月以内に完
全に分解される。ポリ乳酸は、強度は大きいが、分解が
非常に遅くて完全に分解するのに６ヶ月〜１年を要す
る。ポリカプロラクトンは強度が弱く、分解速度がポリ
乳酸より遅い。本発明の多孔性支持体に使用する高分子
の分子量は、好ましくは約１０，０００〜５００，００
０であり、より好ましくは約１５，０００〜４００，０
００である。分子量が小さすぎると、強度が小さくな
り、早く分解される一方、分子量が大きすぎると、分解
速度が遅くなる。

【００２１】従って、本発明の多孔性支持体において
は、好ましくは適合な強度及び分解速度を有する前記合
成高分子の２成分以上の共重合体をより効果的に使用す
ることができる。このような共重合体は、グリコール
酸、乳酸、カプロラクトン、ジオキサノン、及びトリメ
チレンカルボネートの２成分共重合体；例えば、ポリ
（乳酸／グリコール酸）、ポリ（グリコール酸／カプロ
ラクトン）、ポリ（グリコール酸／ジオキサノン）、ポ
リ（グリコール酸／トリメチレンカルボネート）、ポリ
（乳酸／カプロラクトン）、ポリ（乳酸／ジオキサノ
ン）、ポリ（乳酸／トリメチレンカルボネート）、ポリ
（カプロラクトン／ジオキサノン）、ポリ（カプロラク
トン／トリメチレンカルボネート）又はグリコール酸、
乳酸、カプロラクトン、ジオキサノン、及びトリメチレ
ンカルボネートの３成分以上の共重合体から選択され得
る。特に、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリ（グリコ
ール酸／カプロラクトン）、及びポリ（乳酸／カプロラ
クトン）は、機械的な強度に優れ、体内で８〜１２週内
に分解するため、本発明の多孔性支持体においては非常
に好ましい。

【００２２】また本発明の多孔性支持体においては、空
隙の孔径は、約１０〜８００μm、より好ましくは約５
０〜６００μmであり、空隙率は、約５０〜９９％、よ
り好ましくは約７５〜９７％である。かかる空隙の孔径
と空隙率を有することで、本発明の多孔性支持体は、優
れた眼球組織再生効果を示す。

【００２３】このような合成高分子を用いて多孔性支持
体を製造する方法は、前述のように繊維不織布利用法、
塩浸出法、塩発泡法、乳化凍結乾燥法、相分離法、又は
高圧気体膨張法から選択することができる。この中で最
も容易な方法は塩浸出法であり、生分解性高分子を有機
溶媒に溶解し、その有機溶媒には溶解しない食塩などの
水溶性無機塩の粒子を混合してキャスティングした後に
溶媒を除去し、水を使用して塩粒子を溶出除去する方法
である。また、水溶性無機塩の替わりに水溶性デンプン
を用いることもできる。食塩が粒子サイズの調節が容易
であり、水によく溶解するので好ましく使用することが
できる。添加される塩粒子のサイズと混合比率を調節す
れば、多様な空隙の孔径と空隙率を有する多孔性構造の
支持体を得ることができる。前記の合成高分子は、ベン
ゼン、トルエン、クロロホルム、テトラヒドロフランな
ど及びこれらの混合溶媒に容易に溶解し、通常使用され
る濃度は約０．３〜２０重量／体積％である。

【００２４】塩以外に有機溶媒に溶解しない塩の粒子な
ども使用することができるが、塩が最も入手し易く、種
々のサイズの粒子に容易に作ることができるため便利で
ある。本発明で好ましく使用しうる塩の粒径及び（生分
解性高分子溶液に対する）混合率は、それぞれ約２０〜
６００μm及び約５０〜９９重量／体積％である。

【００２５】このような方法で製造した本発明の多孔性
支持体は、機械的な強度に優れ、分解速度が調節できる
という長所がある。そしてこのような多孔性支持体の表
面にコラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン及び羊膜抽出
物又はこれらの混合物をコーティングすることにより、
表面の親水性を増加させ、細胞の初期付着及び成長を更
に促進させることもできる。コラーゲン、ヒアルロン
酸、キトサン及び羊膜抽出物又はこれらの混合物の約
０．０１〜５重量／体積％水溶液に多孔性支持体を浸漬
してコーティングした後、凍結乾燥するか、又は５０℃
以下で真空乾燥する。あるいは、コーティングされたコ
ラーゲンなどの天然高分子が洗い流されることを防止す
るためにコーティング後にグルタルアルデヒド又は水溶
性カルボジイミド溶液中で６時間以上反応させて架橋化
してもよい。

【００２６】あるいは、合成高分子の代わりにコラーゲ
ン、ヒアルロン酸、及びキトサンのような天然高分子、
並びにこれらの混合物を利用して多孔性支持体を製造す
ることもできる。これらの高分子の水溶液又は弱酸性溶
液（場合によっては羊膜抽出物を含有）を−２０℃で凍
らせた後、凍結乾燥して多孔性支持体を製造し、グルタ
ルアルデヒド又は水溶性カルボジイミド溶液中で６時間
以上反応させて架橋化する。

【００２７】このようにして調製した本発明の多孔性支
持体は、損傷された眼球組織を再生させる効能を有する
ため、必要に応じて薄膜などの形態にし、必要に応じて
適宜改質して、損傷された眼球部位をそれで被覆すると
ともに、眼球を物理的な接触から保護することによっ
て、損傷された眼球部位の眼球組織の再生を促進するこ
とができる。本発明の多孔性支持体をどのような形態に
して、どのように損傷された眼球部位に適用するかは、
損傷の大きさ、程度等に応じて適宜決定することができ
る。

【００２８】製造したこれらの多孔性支持体に、試験管
内（in vitro）で眼球上皮細胞（corneal epithelial c
ell）及び基質繊維芽細胞（stromal fibroblast）を付
着させて１日、４日、及び７日間培養させた結果、これ
らの細胞が大きく成長することを発見した。細胞粘着及
び成長は電子顕微鏡とＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン（hemato
xylin）＆エオシン（eosin））染色で測定／分析し、細
胞から分泌された蛋白質の量をELISA（enzyme-linked i
mmunosorbent assay）方法で定量して細胞の生理的な活
性を評価した。更に、天然高分子から製造された支持
体、及びコラーゲンなどでコーティングされた支持体
が、コーティングされていない支持体に比べて細胞が数
等に大きく成長させていることを確認した。

【００２９】ウサギの眼球表面、即ち、結膜、角膜又は
鞏膜の表面の一部を意図的に損傷させた部位に、このよ
うな多孔性支持体を埋込して観察した結果、重度の炎症
や大きな瘢痕無しに新たな眼球組織が再生し、欠損され
た部位を代替することにより損傷部位を治癒した事実を
確認した。

【００３０】

【実施例】下記の実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明がこれらの実施例により制限されるも
のではない。

【００３１】〔生分解性高分子多孔性支持体の製造及び
コーティング方法〕 ＜方法１＞ ポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体（Ｐ
ＬＧＡ）−塩浸出法 ＰＬＧＡ（乳酸／グリコール酸＝５０／５０、分子量：
４０，０００〜７５，０００）を溶媒（クロロホルム）
に３重量／体積％で溶解させた。次いで、塩をひき、篩
にかけて種々のサイズ（０〜５０μm、５０〜１００μ
m、１００〜４００μm、４００〜８００μm）に分別し
た塩を、塩：ＰＬＧＡ溶液の重量比がそれぞれ５０：５
０、７０：３０、９０：１０、９５：５になるように混
合して１０cmペトリ皿に注ぎ、冷凍室で溶媒を蒸発させ
た。得られた薄膜（厚さ：０．５〜１．５mm）を４８時
間蒸留水で塩を溶出させて図１のように空隙が互いに連
結された多孔性支持体を製造した。支持体の平均空隙の
孔径は５０〜８００μmであり、空隙率は４５〜９８％
であった。

【００３２】＜方法２＞ ポリ（グリコール酸／カプロ
ラクトン）共重合体（ＰＧＣＬ）−乳化凍結乾燥法 ＰＧＣＬ（グリコール酸／カプロラクトン＝５０／５
０、分子量：１３０，０００）をトルエンに５重量／体
積％で溶解させた後、水を添加して超音波機器（sonica
tor）で完全に混合して乳化させた。この乳化溶液を液
体窒素で凍結させた後、真空下で乾燥させて平均空隙の
孔径が５０〜８００μmであり、空隙率が４５〜９８％
である多孔性支持体を製造した。得られた多孔性支持体
は厚さ０．５〜１．５mmであり、図１のように空隙が互
いに連結された構造を保有した。

【００３３】＜方法３＞ ＰＬＧＡ又はＰＧＣＬ多孔性
支持体の表面改質 ＜方法１＞で得られたＰＬＧＡ多孔性支持体を０．１重
量％コラーゲン溶液に６時間浸漬してコーティングした
後、２重量％カルボジイミド水溶液に１８時間浸漬して
化学的な架橋処理を行なった（ＰＬＧＡ／コラーゲン支
持体）。また、同様な方法で０．１重量％のヒアルロン
酸溶液でコーティングしたＰＬＧＡ／ヒアルロン酸支持
体を製造した。更に、コラーゲンを塗布した後、更にヒ
アルロン酸溶液をコーティングして凍結乾燥させたＰＬ
ＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸支持体も製造した。ま
た、０．１重量％のコラーゲン溶液にコラーゲンの１／
１０重量の羊膜粒子を混合して羊膜成分が含有された懸
濁液を製造し、これにＰＬＧＡ支持体を浸漬してコーテ
ィングを施したＰＬＧＡ／コラーゲン／羊膜支持体を製
造した。また、ヒアルロン酸を塗布した後、羊膜成分が
含有されたコラーゲン懸濁液で処理したＰＬＧＡ／コラ
ーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支持体も製造した。

【００３４】＜方法２＞で得られたＰＧＣＬ多孔性支持
体も前記と同様な方法で表面を改質してそれぞれＰＧＣ
Ｌ／コラーゲン、ＰＧＣＬ／ヒアルロン酸、ＰＧＣＬ／
コラーゲン／ヒアルロン酸、及びＰＧＣＬ／コラーゲン
／羊膜支持体を製造した。

【００３５】〔多孔性支持体への細胞付着及び成長実
験〕コラーゲン、ヒアルロン酸、及び羊膜で改質された
それぞれのＰＬＧＡ及びＰＧＣＬ支持体を利用して眼球
上皮細胞と基質繊維芽細胞の培養を行い、それぞれの細
胞粘着率と増殖率を電子顕微鏡とＨ＆Ｅ染色法で比較し
た。

【００３６】眼球上皮細胞は、ダルベッコ改質イーグル
培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）に１％ペ
ニシリン、１０％牛胎児血清、１×ＭＥＭアミノ酸、１
×ＭＥＭビタミン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸を添加し
て製造した培地を、基質繊維芽細胞は、ダルベッコ改質
イーグル培地Ｆ１２に４０μg/mlゲンタマイシン（gent
amicin）、１５％牛胎児血清、５μg/mlインシュリン、
０．１μg/mlコレラ毒素及び１０ng/mlヒトEGFを添加し
て製造した培地をそれぞれ使用し、５％炭酸ガス濃度下
で３７℃飽和湿度で培養した。眼球上皮細胞及び基質繊
維芽細胞を利用した増殖時間（doubling time）の測定
は約８週にかけて行い、眼球上皮細胞は第１の亜融合状
態（subconfluent state）に到達するまで約４週間かか
った。それぞれの細胞は、継代培養に入る前に細胞濃度
１×１０⁵個/mlの懸濁液２００μlをそれぞれ５mlの培
地を入れた６ウェルプレートに接種した後、３７℃、５
％炭酸ガス雰囲気の細胞培養器で培養した。このような
プレートを２０個ずつ準備した。各プレート中で培養し
た細胞を２４時間置きに分離して単一細胞懸濁液を作っ
た後、コールタカウンタ（Coulter counter）で５回ず
つカウントし、細胞数が２倍及び４倍に到達する時間を
測定した。

【００３７】支持体をＵＶ照射５分、７０％ＥｔＯＨに
１時間浸漬して滅菌した。細胞培養器内で支持体に細胞
を５時間粘着させた後、１mlの培地を添加し、培地は２
日ごとに交換しながら細胞を培養した。細胞の初期粘着
率を高めるために細胞を動的方法で粘着させた。即ち、
３７℃、５％炭酸ガス細胞培養器の内部に１００rpmで
固定された振盪器（orbital shaker）を設置し、多孔性
支持体を、４×１０⁶cells/mlの細胞濃度に調節した眼
球上皮細胞と基質繊維芽細胞の懸濁液に入れて動的状態
で細胞を付着させた。表面の改質による眼球上皮細胞と
基質繊維芽細胞の粘着と増殖を比較観察するために、そ
れぞれ１日、４日及び７日間培養して電子顕微鏡とＨ＆
Ｅ染色で観察した。電子顕微鏡用試片は２．５％グルタ
ルアルデヒド溶液で４時間固定し、Ｈ＆Ｅ染色用試料は
７０％、８０％、９０％及び１００％エタノールで順次
的にそれぞれ２０分間脱水した後、完全に真空乾燥し
た。

【００３８】＜実施例１＞＜方法１＞で得られた多様な
空隙の孔径のＰＬＧＡ多孔性支持体を０．５×０．５×
０．７mm³のサイズで準備した。３７℃、５％炭酸ガス
細胞培養器内に設置した振盪器（１００rpmで固定）を
使用してPLGA支持体を４×１０⁶cells/ml濃度の眼球上
皮細胞の懸濁液に浸漬し、眼球上皮細胞を動的培養法で
支持体に粘着させた。それぞれ１日、４日、及び７日間
体外培養して電子顕微鏡、Ｈ＆Ｅ染色及びＥＬＩＳＡ方
法で眼球上皮細胞の粘着と増殖を比較分析した。

【００３９】ＰＬＧＡ多孔性支持体の空隙の孔径及び空
隙率による眼球上皮細胞の粘着及び増殖の結果は、それ
ぞれ表１及び表２に表した通りである。表１において、
空隙の孔径が小さい場合、細胞粘着率が低く、細胞の増
殖も遅いことを表し、１００μm以上の空隙の孔径で高
い粘着及び増殖が示された。更に、表２において空隙率
が高いほど細胞の粘着や増殖が高く示された。

【００４０】

【表１】

【００４１】

【表２】

【００４２】＜実施例２＞＜方法２＞で得られた多様な
空隙の孔径と空隙率を有するＰＧＣＬ多孔性支持体に＜
実施例１＞と同様な方法で基質繊維芽細胞を粘着させ、
体外培養した。空隙の孔径及び空隙率による基質繊維芽
細胞の粘着及び増殖結果は、下記表３に表した通り＜実
施例１＞の結果と類似した。

【００４３】

【表３】

【００４４】＜実施例３＞ 眼球上皮細胞の体外培養 ＜方法３＞で得られた表面改質ＰＬＧＡ／コラーゲン、
ＰＬＧＡ／ヒアルロン酸、ＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒア
ルロン酸、ＰＬＧＡ／コラーゲン／羊膜、及びＰＬＧＡ
／コラーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支持体と、改質され
ていない対照群ＰＬＧＡ支持体とを＜実施例１＞で記述
した方法で眼球上皮細胞を動的培養法で沈着させ、５時
間後に粘着された細胞の数を測定し（表４）、１日、４
日、及び７日間体外培養して眼球上皮細胞の粘着と増殖
を電子顕微鏡とＨ＆Ｅ染色法で比較観察した。

【００４５】表４から分るように、表面が改質されたＰ
ＬＧＡ多孔性支持体が未処理対照群に比べて高い初期細
胞粘着率を表し、特にＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒアルロ
ン酸及びＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支
持体が優れた結果を表した。図１の電子顕微鏡写真及び
図２のＨ＆Ｅ染色法で観察したように、多孔性支持体の
内部にも眼球上皮細胞が均一に成長されていることが確
認でき、ＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸及びＰＬ
ＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支持体において
より多くの細胞が均一に成長している結果を確認した。

【００４６】

【表４】

【００４７】＜実施例４＞＜方法２＞で得られた表面改
質ＰＧＣＬ／コラーゲン、ＰＧＣＬ／ヒアルロン酸、Ｐ
ＧＣＬ／コラーゲン／ヒアルロン酸、ＰＧＣＬ／コラー
ゲン／羊膜及びＰＧＣＬ／コラーゲン／ヒアルロン酸／
羊膜支持体を＜実施例１＞で記述した方法と同様に基質
繊維芽細胞を動的培養法で粘着させ、それぞれ１日、４
日、及び７日間体外培養して電子顕微鏡とＨ＆Ｅ染色法
で分析した。

【００４８】下記表５に表した通り、＜実施例３＞の結
果と類似して表面が改質されたＰＧＣＬ多孔性支持体が
対照群に比べて基質繊維芽細胞の粘着が高く、支持体の
内部に更に多くの細胞が均一に増殖されていることが確
認できた。

【００４９】

【表５】

【００５０】＜実施例５＞ ウサギによる動物実験 体外実験で優れた細胞適合性を表した表面改質ＰＬＧＡ
及びＰＧＣＬ多孔性支持体の治療効果をウサギによる動
物実験で評価した。ウサギの角膜、結膜、又は鞏膜の一
部組織を７mmのサイズで円型切除機を利用して除去した
（図３）。同一のサイズの多孔性支持体をＵＶ照射及び
７０％エタノールで滅菌した後、損傷させた部位に移植
して組織の再生を免疫細胞学的に評価し、多孔性支持体
を使用しない場合と比較して治癒効果及び治癒後の結膜
の収縮を分析した。支持体の移植後、周囲組織から細胞
が支持体の表面及び内部に成長して組織が再生すること
を数週〜数ヶ月にかけて観察し、経時変化による角膜上
皮の再生とコラーゲンの沈着など組織の形成を確認し
た。角膜の場合には患部及び支持体上に更に新生血管生
成抑制効果がある羊膜を覆った。

【００５１】図４に示されているように、損傷された結
膜部位にＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支
持体を移植した２週後に結膜が再生して治癒しているの
が確認された。再生した組織部位を切断してＨ＆Ｅ染色
法で分析した結果、細胞（図５で濃く示されている部
分）が支持体の内部に均一に成長しており、一部分解さ
れずに残っている多孔性支持体（白い部分）も観察され
た（図５参照）。角膜輪部から結膜円蓋までの長さを測
定して組織の収縮を観察した結果、高分子支持体を移植
していない対照群の場合は組織が２５％収縮したことに
対し、高分子支持体を移植した場合は６％のみが収縮
し、正常的な眼球運動が可能であることを観察した。３
ヶ月後には正常な結膜組織が完全に再生していることを
確認した。

【００５２】同様な方法で損傷させた角膜、鞏膜及び結
膜の組織部位に種々の表面改質ＰＬＧＡ及びＰＧＣＬ多
孔性支持体を移植した結果、損傷された組織が良好に再
生していることが確認された。

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、損傷された眼球部位、
即ち角膜、結膜及び鞏膜に本発明の多孔性支持体を埋込
すると、副作用を惹起することなく眼球組織を再生/治
癒することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】表面改質ＰＬＧＡ支持体に７日間培養した眼球
上皮細胞断面の電子顕微鏡写真。

【図２】表面改質ＰＬＧＡ支持体に７日間培養した眼球
上皮細胞断面のＨ＆Ｅ染色写真。

【図３】結膜再生動物実験の概略図。

【図４】ＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支
持体移植２週後の細隙灯検査及びフルオレセイン染色に
より結膜が再生されたことを示す写真。

【図５】ＰＬＧＡ／コラーゲン／ヒアルロン酸／羊膜支
持体移植２週後のＨ＆Ｅ染色写真。

フロントページの続き (72)発明者 金 壽鉉 大韓民国ソウル特別市江南区蚕院洞61−１ 韓信アパート345−706 (72)発明者 李 ▲さん▼▲よん▼ 大韓民国ソウル特別市江南区駅三洞689− ２ パームビラＢ−203 (72)発明者 金 在燦 大韓民国ソウル特別市松坡区可楽洞 宇星 アパート３−305 (72)発明者 呉 定煥 大韓民国ソウル特別市江南区開浦第２洞 開浦住公アパート418−312 Ｆターム(参考） 4C081 AB21 BA13 BA16 BB03 CA161 CA191 CA201 CD082 CD092 CD122 DA02 DB05 DB06 DC03

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプ
   ロラクトン、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカル
   ボネート及びこれらの共重合体からなる群から選択され
   る１種類以上の生分解性高分子から製造された、空隙の
   孔径が１０〜８００μmであり、空隙率が５０〜９９％
   である、損傷された眼球組織再生用多孔性支持体。
2. 【請求項２】 眼球部位が、角膜、結膜及び鞏膜からな
   る群から選択されるものである、請求項１記載の支持
   体。
3. 【請求項３】 生分解性高分子が、ポリ（乳酸／グリコ
   ール酸）、ポリ（乳酸／カプロラクトン）及びポリ（グ
   リコール酸／カプロラクトン）からなる群から選択され
   るものである、請求項１記載の支持体。
4. 【請求項４】 その表面にコラーゲン、ヒアルロン酸、
   キトサン、羊膜抽出物又はこれらの混合物がコーティン
   グされた、請求項１記載の支持体。
5. 【請求項５】 空隙の孔径が５０〜６００μmである、
   請求項１記載の支持体。