MXPA06014092A - Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades neovasculares. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee composiciones y metodos para tratar enfermedades neovasculares, tales como enfermedades y tumores neovasculares retinianos, administrando a un paciente que padece de una enfermedad o tumor neovascular una cantidad inhibidora de desarrollo vascular de una combinacion de los farmacos supresores de angiogenesis que comprenden un fragmento angiostatico de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste de un inhibidor de senalizacion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de senalizacion de integrina. Las composiciones para uso en los metodos incluyen una mezcla intima de un fragmento angiostatico de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos uno de un inhibidor de senalizacion del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de senalizacion de integrina, juntos con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEOVASCULARES CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al tratamiento de enfermedades neovasculares, tales como enfermedades neovasculares retinianas. De manera más particular, esta invención se refiere a métodos para tratar enfermedad neovascular administrando a un paciente una combinación de fármacos angiostáticos y anti-angiogénícos, y a composiciones para uso en dichos métodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La gran mayoría de enfermedades que ocasionan pérdida catastrófica de la visión lo hacen como resultado de neovascularización ocular. Por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (ARMD por sus siglas en inglés) afecta a 12-15 millones de norteamericanos mayores de 65 años de edad y ocasiona pérdida visual en un 10-15% de estos como un efecto directo de neovascularización de la coroides (sub-retiniana) . La causa principal de pérdida de la visión para norteamericanos menores de 65 años de edad es diabetes; 16 millones de individuos en los E.U.A. son diabéticos y 40,000 por años padecen de complicaciones oculares de la enfermedad, con frecuencia como resultado de neovascularización retiniana. Aunque la foto-coagulación con rayo láser ha sido efectiva para evitar la pérdida visual severa en sub-grupos de pacientes diabéticos de alto riesgo, la incidencia global a 10 años de retinopatia permanece sustancialmente sin cambio. Para pacientes con neovascularización coroidal debido a ARMD o enfermedad ocular inflamatoria tal como histoplasmosis ocular, la foto-coagulación, con algunas excepciones, no es efectiva para prevenir la pérdida visual. Aunque desarrolladas recientemente, las terapias foto-dinámicas no destructivas mantienen la promesa de reducir temporalmente la pérdida individual en pacientes con neovascularización coroidal previamente intratable, únicamente 61.4% de los pacientes tratados cada 3-4 meses tienen visión mejorada o estabilizada en comparación con el 45.9% del grupo tratado con placebo. ARMD y retinopatía diabética son las causas principales de pérdida visual en países industrializados y lo hacen como resultado de neovascularización retiniana anormal. Debido a que la retina consiste de capas bien definidas de elementos neuronales, de la glía y vasculares, perturbaciones relativamente pequeñas tales como aquellas observadas en proliferación o edema vascular pueden llevar a un pérdida significativa de la función visual. Las degeneraciones retinianas heredadas, tales como retinitis pigmentosa (RP) también están asociadas con anormalidades vasculares, tales como estrechamiento de las arteriolas y atrofia vascular. Aunque se han logrado avances significativos para identificar los factores que promueven e inhiben la angiogénesis, actualmente no se dispone de tratamiento para tratar específicamente la enfermedad vascular ocular. Las degeneraciones heredadas de la retina afectan tantos como a 1 en 3500 individuos y se caracterizan por ceguera nocturna progresiva, pérdida de campo visual, atrofia del nervio óptico, atenuación arteriolar, permeabilidad vascular alterada y pérdida de visión central que con frecuencia avanza hasta ceguera completa (Heckenlively, J.R., editor, 1988; Retinitis pigmentosa, Filadelfia: JB Lippincott Co.). El análisis genético molecular de estas enfermedades ha identificado mutaciones en alrededor de 110 genes diferentes que dan razón solamente de un porcentaje relativamente pequeño de los individuos afectados conocidos (Humphries et al . , 1992, Science 256:804-808; Farrar et al . 2002, EMBO J. 21:857-864) . Muchas de estas mutaciones están asociadas con componentes enzimáticos y estructurales de la maquinaria de foto-transducción incluyendo rodoxina, GMPc fosfodiesterasa, periferina de rds, y RPE65. A pesar de estas observaciones, aún no existen tratamientos efectivos para desacelerar o revertir el avance de estas enfermedades degenerativas retinianas . Los avances recientes en terapias con genes han conducido a la reversión exitosa de los fenotipos de rds (Ali et al 2000, Nat . Genet . 25:306-310) y rd (Takahashi et al . 1999, J. Virol. 73:7812-7816) en ratones y el fenotipo RPE65 en perros (Acland et al . 2001, Na t . Genet . 28:92-95) cuando se suministra el transgen de tipo silvestre a los foto-receptores en el epitelio pigmentado retiniano (RPE por sus siglas en inglés) en animales con una mutación específica. La angiogénesis es el proceso mediante el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. En respuesta a señales químicas específicas, los capilares se ramifican a partir de vasos sanguíneos existentes, creciendo eventualmente en tamaño, según sea necesario para el organismo. Inicialmente, las células endoteliales, las cuales revisten los vasos sanguíneos, se dividen en una dirección ortogonal a los vasos sanguíneos existentes, formando un brote sólido. Las células endoteliales adyacentes forman después vacuolas grandes y las células se reaco odan de manera tal que las vacuolas se orientan por sí mismas extremo a extremo y con el tiempo se unen para formar el lumen de un nuevo vaso capilar (formación de tubo) .

La angiogénesis es estimulada por un número de condiciones, tales como en respuesta a una lesión, y virtualmente acompaña todo el crecimiento de tejido en organismos vertebrados tales como mamíferos. La angiogénesis también desempeña una función en algunos estados patológicos tales como algunos cánceres. Por ejemplo, el crecimiento de tumores requiere el crecimiento de vasos sanguíneos para proveer oxígeno y nutrientes al tejido tumoral en crecimiento. Además, la neovascularización ocular está asociada con la gran mayoría de enfermedades oculares que conducen a la pérdida catastrófica de la visión. La angiogénesis se puede detener o inhibir interfiriendo con las señales químicas que estimulan el proceso angiogénico. Por ejemplo, las células endoteliales angiogénicas producen proteasas para digerir la lámina basal que rodea a los vasos sanguíneos, abriendo de esta manera una ruta para el nuevo capilar. La inhibición de estas proteasas, o su formación, puede evitar que se formen nuevos vasos sanguíneos. De igual manera, las células del endotelio proliferan en respuesta a las señales químicas. Las señales de proliferación particularmente importantes incluyen las familias de proteínas del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) , y del factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) . VEGF ha demostrado estar implicado en la vascularización de algunos tumores. La interferencia con estos procesos de señalización de proliferación también puede inhibir la angiogénesis. Muchos factores están involucrados en la angiogénesis. Las moléculas del factor de crecimiento de fibroblasto tanto ácido como básico son mitógenos para las células del endotelio y otros tipos celulares. Un mitógeno altamente selectivo para las células del endotelio vascular es VEGF. En el adulto normal, la angiogénesis está estrictamente regulada, y está limitada a la curación de heridas, embarazo y ciclos uterinos. La angiogénesis se activa mediante moléculas angiogénicas específicas tales como el factor de crecimiento de fibroblasto básico y ácido (FGF), VEGF, angiogenina, factor de crecimiento transformante (TGF) , factor a de necrosis tumoral (TNF-a) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) . La angiogénesis puede ser suprimida por moléculas inhibidoras tales como interferón-a, tromboespondina-1, angiostatina y endostatina. Es el equilibrio de estos estimuladores e inhibidores de origen natural lo que controla la vasculatura capilar normalmente latente. Cuando este equilibrio se altera, tal como en algunos estados patológicos, se induce a que las células del endotelio capilar proliferen, igren y finalmente se diferencien.

La angiogénesis desempeña una función central en una variedad de enfermedades incluyendo cáncer y neovascularización ocular. El crecimiento y metástasis sostenidos de una variedad de tumores también han demostrado ser dependientes del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos hospederos en el tumor en respuesta a factores angiogénicos derivados de tumor. La proliferación de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a una variedad de estímulos se presenta como el hallazgo dominante en la mayoría de enfermedades oculares y como aquel de la ceguera incluyendo retinopatía diabética proliferativa, ARMD, glaucoma rubeótico, queratitis intersticial y retinopatía de pre-madurez. En estas enfermedades, el daño tisular puede estimular la liberación de factores angiogénicos que dan como resultado la proliferación capilar. VEGF juega un papel dominante en la neovascularización del iris y en retinopatías neovasculares. Aunque los reportes claramente muestran una correlación entre los niveles de VEGF infraoculares y la neovascularización ocular retinopática isquémica, FGF probablemente también participa. Se sabe que FGF básico y ácido están presentes en la retina adulta normal, aún cuando los niveles detectables no están correlacionados consistentemente con la neovascularización. Esto se puede deber en gran parte al hecho que FGF se une muy fuertemente a los componentes cargados de la matriz extracelular y podría no estar fácilmente disponible en una forma que se pueda difundir fácilmente que pueda ser detectada mediante pruebas estándar de fluidos infraoculares . Una ruta final común en la respuesta angiogénica implica intercambio de información mediada por integrina entre una célula del endotelio vascular en proliferación y la matriz extracelular. Esta clase de receptores de adhesión, denominados integrinas, se expresan como heterodímeros que tienen una sub-unidad a y ß en todas las células. Una de dichas integrinas, avß3, es el miembro más promiscuo de esta familia y permite que las células del endotelio interactúen con una amplia variedad de componentes de la matriz extracelular. Los antagonistas de péptido y de anticuerpo de esta integrina inhiben la angiogénesis induciendo selectivamente la apoptosis de las células del endotelio vascular en proliferación. Existen dos rutas de angiogénesis dependientes de citocina y se puede definir por su dependencia sobre distintas integrinas de célula vascular, avß3 y «ßs- Específicamente, la angiogénesis inducida por FGF básico y VEGF dependen de las integrinas avß3 y avßsr respectivamente debido a que los antagonistas de anticuerpo de cada integrina bloquean selectivamente una de estas rutas angiogénicas en los modelos de córnea de conejo y de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) . Los antagonistas de péptido que bloquean todas las integrinas av inhiben la angiogénesis estimulada por FGF y VEGF. Mientras que los vasos sanguíneos oculares humanos normales no despliegan ninguna integrina, las integrinas avß3 y «vßs son desplegadas en forma selectiva en vasos sanguíneos en tejidos provenientes de pacientes con enfermedad ocular neovascular activa. Aunque únicamente avß3 se observa en forma consistente en tejido proveniente de pacientes con ARMD, avß3 y avß5 están ambas presentes en tejidos provenientes de pacientes con retinopatía diabética proliferativa. Los antagonistas peptídicos de integrinas administrados sistémicamente bloquean la formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo de ratón de vasculogénesis retiniana. Por lo tanto, los agentes anti-angiogénicos tienen una función para tratar la degeneración retiniana para evitar los efectos dañinos de estos factores tróficos y de crecimiento. Los agentes angiogénicos también tienen participan en la promoción de la vascularización deseable para retardar la degeneración retiniana incrementando el flujo sanguíneo a las células. Inmensos esfuerzos de investigación han contribuido al entendimiento del mecanismo de angiogénesis durante el avance de la enfermedad, y como resultado de estos estudios, se han evaluado, o actualmente están siendo evaluados, un gran número de moléculas angiostáticas en pruebas clínicas. Sin embargo, hasta la fecha, los resultados provenientes de estas pruebas clínicas han sido desalentadores, y los beneficios provenientes de estos tratamientos anti-angiogénicos en los pacientes cuando mucho han sido mínimos. Podría ser necesario considerar muchos factores antes que las terapias angiostáticas finalmente se tornen útiles. Los mecanismos compensadores normalmente presentes en la naturaleza podrían hacer que al final las monoterapias angiogénicas sean obsoletas. Los fármacos angiostáticos generalmente eligen como blanco una sola citocina o ruta angiogénica intracelular. In vivo, la angiogénesis probablemente es iniciada por la señalización combinada de rutas múltiples. Por lo tanto, bloquear una sola ruta podría ser insuficiente para evitar la angiogénesis durante el tratamiento de enfermedades neovasculares. Para complicar más las cosas, también es probable que al bloquear una sola ruta se induzca compensación y funciones incrementadas de otras rutas angiogénicas . Actualmente se ha descubierto que una administración concurrente de una combinación de compuestos angiostáticos que elijan como blanco rutas diferentes incrementa la potencia angiostática y también interfiere con los mecanismos compensadores naturales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones y un método para tratar una enfermedad neovascular, tal como una enfermedad neovascular retiniana, administrando a un mamífero que padece de una enfermedad neovascular una cantidad de una combinación de fármacos supresores de angiogénesis suficiente para inhibir la formación de nuevos vasos sanguíneos. Estos fármacos pueden ser una combinación de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y un agente terapéutico. De preferencia, el agente terapéutico es un inhibidor de señalización de VEGF, un inhibidor de señalización de integrina, o una combinación de los mismos. De manera adicional, el agente terapéutico puede comprender un esferoide angiostático, un agente antineoplásico, un agente anti-bacteriano, un agente antiviral, y un agente anti-inflamatorio, y similares. De preferencia, el mamífero es un humano. Una modalidad de método particularmente preferida comprende administrar a un mamífero que padece de una enfermedad neovascular una cantidad inhibidora del desarrollo vascular de una mezcla de fármacos que comprende un fragmento angiostático de TrpRS (por ejemplo, el fragmento TI, el fragmento T2, o el fragmento de TrpRS mini descrito en la presente invención) y por lo menos un compuesto que se selecciona a partir de un inhibidor de señalización de VEGF y un inhibidor de señalización de integrina. Otra modalidad preferida para este propósito es la combinación triple de fragmento angiostático T2-TrpRS, un inhibidor de señalización de VEGF tal como el aptámero de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina tal como un inhibidor de señalización de integrina ctvß3 y oCvßs. Una combinación triple particularmente preferida comprende el fragmento T2 de TrpRS de humano, un aptámero de VEGF específico para VEGF-165 (por ejemplo, pegaptanib sódico), y un inhibidor de señalización de integrina (Xvß3 y ovßs peptidomimético (por ejemplo, compuesto (1) descrito en la presente invención) . Esta combinación triple particular presenta un fuerte efecto sinergista sobre la inhibición de neovascularización en el ojo mamífero. Las enfermedades neovasculares que pueden ser tratadas mediante los métodos de la presente invención incluyen, sin limitación, enfermedades oculares tales como enfermedades degenerativas retinianas, enfermedades degenerativas vasculares de la retina, retinopatías isquémicas, hemorragias vasculares, fuga vascular, y coroidopatías en mamíferos neonatos, juveniles, o completamente maduros. Los métodos de la presente invención también se pueden utilizar para tratar enfermedades neovasculares tales como cánceres de tumor sólido (por ejemplo cáncer de pulmón, cáncer de tejido mamario, y cáncer de próstata) y artritis reumatoide, por ejemplo. Una composición terapéutica útil para inhibición de angiogénesis, y por lo tanto para el tratamiento de enfermedades neovasculares, comprende una mezcla de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) , un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y un vehículo para la misma. De manera opcional, las composiciones terapéuticas de la presente invención también pueden incluir uno o más de un esferoide angiostático, un agente anti-neoplásico, un agente anti-bacteriano, un agente antiviral, y un agente anti-inflamatorio, y agentes terapéuticos similares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra las secuencias de aminoácido de fragmentos angiostáticos de triptofanil-ARNt sintetasa denominados como T2-TrpRS, SEQ ID NO: 1 y T2-TrpRS-GD, SEQ ID NO: 2 (un mutante del mismo) . La figura 2 muestra las secuencias de aminoácido de fragmentos angiostáticos de triptofanil-ARNt sintetasa denominados como mini-TrpRS, SEQ ID NO: 3 y Tl-TrpRS, SEQ ID NO: 4. La figura 3 muestra la secuencia de aminoácido de TrpRS de longitud completa (SEQ ID NO: 5) e indica la posición de los fragmentos TI, T2 y Mini de la misma. La figura 4 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 1 inyectados por vía intravítreo con PBS. La figura 5 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 1 inyectados por vía intravítreo con (A) concentración 0.5x (10 mg/ml) del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) ; (B) una concentración Ix (2 mg/ml) del aptámero de VEGF compuesto (2) ; y (C) una combinación del compuesto (1) inhibidor de señalización de integrina y compuesto (2) aptámero de VEGF. La figura 6 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 2 inyectados por vía intravítreo con solución salina regulada con fosfatos (PBS) . La figura 7 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 2 inyectados por vía intravítreo con concentración O.lx (0.05 mg/ml) de T2-TrpRS. La figura 8 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 2 inyectados por vía intravítreo con concentración O.lx del aptámero de VEGF compuesto (2). La figura 9 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 2 inyectados por vía intravítreo con una combinación de concentración O.lx de T2-TrpRS y concentración O.lx del aptámero de VEGF compuesto (2). La figura 10 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 3 inyectados por vía intravítreo con PBS . La figura 11 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 3 inyectados por vía intravítreo con una concentración Ix de T2-TrpRS. La figura 12 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 3 inyectados por vía intravítreo con una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 13 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 3 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 14 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 4 inyectados por vía intravítreo con solución salina regulada con fosfatos (PBS) . La figura 15 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 4 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de T2-TrpRS. La figura 16 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 4 inyectados por vía intravítreo con una concentración 0.5x del aptámero de VEGF compuesto (2). La figura 17 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 4 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración Ix de T2-TrpRS y concentración 0.5x del aptámero de VEGF compuesto (2). La figura 18 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 5 inyectados por vía intravítreo con PBS. La figura 19 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 5 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de T2-TrpRS. La figura 20 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 5 inyectados por vía intravítreo con una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 21 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 5 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 22 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con PBS. La figura 23 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de T2-TrpRS. La figura 24 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 25 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 26 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración lx del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 27 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 28 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 6 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración Ix de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) , y una concentración normal del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 29 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 7 inyectados por vía intravítreo con PBS. La figura 30 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 7 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de T2-TrpRS. La figura 31 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 7 inyectados por vía intravítreo con una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 32 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 7 inyectados por vía intravítreo con una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 33 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 7 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) y una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 34 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 7 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) , y una concentración lx del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 35 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones de control del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con PBS . La figura 36 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 37 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 38 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de T2-TrpRS. La figura 39 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una concentración lx de cada uno de T2-TrpRS e inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) . La figura 40 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una concentración Ix de cada uno del inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) y aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 41 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración Ix de cada uno de T2- TrpRS y aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 42 muestra microfotografías de las capas vasculares primaria y secundaria de retinas de ratones del ejemplo 9 inyectados por vía intravítreo con una combinación de una concentración lx de cada uno de los inhibidores T2-TrpRS, inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) , y aptámero de VEGF compuesto (2) . La figura 43 es una representación gráfica de datos provenientes de un experimento de dosificación de T2- TrpRS . La figura 44 es una representación gráfica de datos provenientes de un experimento de dosificación de aptámero de VEGF.

La figura 45 es una representación gráfica de datos que muestra la inhibición de formación de plexo vascular profundo como una función de la concentración óptima administrada de aptámero de VEGF y compuesto T2-TrpRS, solos y en combinación. La figura 46 es una representación gráfica de datos provenientes de experimentos de • dosificación de antagonista de integrina avß3 y avßs- La figura 47 es una representación gráfica de datos que muestra la inhibición de formación de plexo vascular profundo como una función de la concentración óptima administrada de un antagonista de integrina avß3 y avß5 de tipo molécula pequeña y T2-TrpRS, solos y en combinación. La figura 48 es un sumario gráfico de datos que muestra la inhibición de formación de plexo vascular profundo a diversas combinaciones de terapias. La figura 49 es una representación gráfica de datos que muestra el grado de inhibición de formación de plexo vascular profundo a diversas combinaciones de terapias . La figura 50 es una serie de microfotografías de las capas vasculares primaria y profunda (secundaria) a diversas terapias y combinaciones de las mismas a los niveles de dosificación mostrados en la figura 49.

La figura 51 es una representación gráfica de los niveles de inhibición de formación de plexo vascular con terapia de combinación triple a diversos niveles de dosificación. La figura 52 es una representación gráfica similar a la figura 51 pero que muestra inhibición de >75%, >90% y 100%. La figura 53 es una representación gráfica de los niveles de inhibición de formación de plexo vascular que compara monoterapias contra terapias de combinación a diversos niveles de dosificación. La figura 54 es una representación gráfica de niveles de inhibición de >75%, >90% y 100% de formación de plexo vascular que compara monoterapias contra terapias de combinación a diversos niveles de dosificación. La figura 55 es una representación gráfica de datos que muestra un área de penachos neovasculares como una función de diversas monoterapias así como de una terapia de combinación triple utilizando una sola inyección de un agente o agentes terapéuticos. La figura 56 es similar a la figura 55, pero muestra datos provenientes de una inyección doble de un agente o agentes terapéuticos. La figura 57 es una representación gráfica de datos que muestra áreas de penachos neovasculares como una función de varias monoterapias, terapias dobles y una terapia triple. La figura 58 es una serie de microfotografías que muestra retinas de ratón tratadas con compuestos angiostáticos en forma individual y en combinación. La figura 59 muestra la estructura del aptámero de VEGF compuesto (2) (SEQ ID NO: 6), pegaptanib sódico; y La figura 60 muestra una gráfica de supervivencia para ratas portadoras de tumor tratadas con una composición de la invención (cuadrados) contra ratas de control tratadas únicamente con PBS (triángulos) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una composición apropiada para tratar una enfermedad neovascular comprende un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y un agente terapéutico. De preferencia, el agente terapéutico comprende por lo menos un agente anti-angiogénico que se selecciona a partir del grupo que consiste de un inhibidor de señalización de VEGF (por ejemplo, un aptámero de VEGF) y un inhibidor de señalización de integrina (por ejemplo, antagonista de integrina angiostático) . Los fragmentos angiostáticos preferidos de TrpRS incluyen un fragmento de 43 kDa (por ejemplo, el fragmento T2, "T2-TrpRS",SEQ ID NO: 1; un mutante de T2-TrpRS, "T2-TrpRS-GD", SEQ ID NO: 2; de los cuales ambos se muestran en la figura 1) , un fragmento de 48 kDa tal como la TrpRS truncada conocida como mini-TrpRS (SEQ ID NO: 3, mostrado en la figura 2) , y un fragmento de 46 kDa tal como la TrpRS truncada conocida como Tl-TrpRS (SEQ ID NO: 4, mostrado en la figura 2) . La secuencia de residuo de aminoácido de T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2), difiere de SEQ ID NO: 1 en dos sustituciones de residuo de aminoácido (es decir, S121G y Y122D) . La secuencia de residuo de aminoácido de TrpRS de longitud completa de humano (SEQ ID NO: 5) se muestra en la figura 3, junto con una indicación de la posición de los fragmentos Ti, T2 y mini de la misma. Sin estar limitado a la teoría, se cree que los fragmentos angiostáticos de TrpRS pueden formar dímeros no covalentes (véase por ejemplo, Yu et al . J. Biol . Chem. 2004, 279:8378-8388), los cuales pueden contribuir a la actividad biológica de los fragmentos. Por consiguiente, cualquier referencia en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas a un fragmento angiostático de TrpRS (por ejemplo, Tl-TRpRS, T2-TrpRS, mini-TrpRS) se debe considerar como una referencia a la forma monomérica, la forma dimérica, o una mezcla de las mismas . Los inhibidores de señalización de integrina preferidos son antagonistas de avß3 y o¡vßs, incluyendo péptidos de RGD, tales como aquellos descritos en la patente E.U.A. No. 5,693,612, patente E.U.A. No. 5,766,591, patente E.U.A. No. 5,767,071, patente E.U.A. No. 5,780,426, y patente E.U.A. No. 6,610,826, cuyas descripciones relevantes se incorporan en la presente invención para referencia, y antagonistas de integrina peptidomiméticos tales como aquellos descritos en la patente E.U.A. No. 5,614,531, patente E.U.A. No. 5,614,535, patente E.U.A. No. 6,326,403, patente E.U.A. No. 6,455,529, patente E.U.A. No. 6,521,646, patente E.U.A. No. 6,559,144, patente E.U.A. No. 6,576,637, patente E.U.A. No. 6,602,876, patente E.U.A. No. 6,645,991, y patente E.U.A. No. 6,649,613, cuyas descripciones relevantes se incorporan en la presente invención para referencia. Un inhibidor de señalización de integrina peptidomimético particularmente preferido es un compuesto que tiene la fórmula del compuesto (1) , disponible de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania) como EMD 472523.

Compuesto (1) Los inhibidores de señalización de VEGF preferidos incluyen aptámeros selectivos de VEGF (oligonucleótidos de unión a proteína) , de preferencia aptámeros resistentes a nucleasa que se unen a VEGF-165, tales como los aptámeros de tipo 2' -fluoropirimidina basados en ARN que se unen a VEGF-165 descritos por Ruckman et al . J. Biol . Chem. 1998, 273:20556-20567 (cuya descripción relevante se incorpora en la presente invención para referencia) , y similares; anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de los mismos que se unen a VEGF, tal como el anticuerpo Rhu disponible de Genentech (San Francisco, CA) y un fragmento Fab del mismo (RhuFab V2) ; receptores de VEGF solubles tales como VEGFRl soluble; y moléculas pequeñas de ARN interferentes (siRNA por sus siglas en inglés) que eligen como objetivo a VEGF o sus receptores, tales como el siRNA descrito por Reich et al . Mol . Vis . 2003; 9:210-216 (cuya descripción relevante se incorpora en la presente invención para referencia) . Los inhibidores de señalización de VEGF preferidos son aptámeros de VEGF resistentes a nucleasa, de manera más preferida aptámeros de tipo 2' -fluoropirimidina basados en ARN específicos para VEGF-165, tales como pegaptanib sódico (compuesto (2) ) , el cual es un oligonucleótido polietoxilado que tiene la siguiente fórmula (SEQ ID NO: 6; figura 59, R en la figura 59 es una cadena de polietilenglicol (PEG) de 40 kiloDaltons) : 5' -40K PEG- (C5) amino-enlazador-CfGmGmArArUfCfAm- GmüfGmAmAmUfGmCfüfUfAmUfAmCfAmUfCfCfGm3' -3' dT en la cual Cf= 2' fluoro C Ar = 2'OH (ribo) A üf = 2' fluoro U 3'-3'dT = desoxiT invertido Am = 2OMe A (C5) amino-enlazador = enlazador de pentilamino Gm = 2' OMe G 40K PEG = amida de polietilenglicol de 40K Un oligonucleótido polietoxilado de SEQ ID NO: 6 es vendido comercialmente bajo la marca registrada MACUGEN® por Eyetech Pharmaceuticals, Inc., y también se conoce como NX1838 o pegaptanib sódico. En una modalidad, la combinación de fármacos también incluye por lo menos un agente terapéutico adicional tal como un esferoide angiostático, un agente anti-neoplásico, un agente anti-bacteriano, un agente antiviral, un agente anti-inflamatorio, y similares. Los ejemplos de esteroides angiostáticos apropiados incluyen acetato de anecortave y acetonida de triamcinolona . Los ejemplos de agentes antineoplásicos apropiados incluyen Aclarubicina; clorhidrato de Acodazol; Acronina; Adozelesina; Aldesleucina; Altretamina; Ambo icina; acetato de Ametantrona; Aminoglutetimida; Amsacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa; Asperlin; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; clohidrato de Bisantreno; dimesilato de Bisnafida; Bizelesina; sulfato de Bleomicina; Brequinar sódico; Bropirimina; Busulfan; Cactinomicina; Calusterona; Caracemida; Carbetímero; Carboplatina; Carmustina; clohidrato de Carubicina; Carzelesina; Cedefingol; Clorambucil; Cirolemicina; Cisplatina; Cladribina; mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; Dactinomicina; clorhidrato de daunorubicina; Decitabina; Dexormaplatina; Dezaguanina; mesilato de Dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel; Doxorubicina; clorhidrato de Doxorubicina; Droloxifeno; citrato de Droloxifeno; propionato de Dromostanolona; Duazomicina; Edatrexato; clorhidrato de Eflornitina; Elsamitrucin; Enloplatina; Enpromato; Epipropidina; clorhidrato de Epirubicina; Erbulozol; clorhidrato de Esorubicina; Estramustina; fosfato sódico de Estramustina; Etanidazol; aceite Et-yodado I 131; Etopósido; fosfato de Etopósido; Etoprina; clorhidrato de Fadrozol; Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; fosfato de Fludarabina; Fluorouracilo; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecin sódico; Gemcitabina; clorhidrato de Gemcitabina; Oro Aul98; Hidroxiurea; clorhidrato de Idarubicina; Ifosfamida; Imofosina; Inferieron Alfa-2a; Inferieron Alfa-2b; Inferieron Alfa-nl; Inferieron Alfa-n3; Inferieron Beta-la; Inferieron Gamma-Ib; Iproplatina; clorhidrato de Irinotecano; acetato de Lanreotido; Letrozol; acetato de Leuprólido, clorhidrato de Liarozol; Lometrexol sódico; Lomustina; clorhidrato de Losoxantrona; Masoprocol; Maitansina; clorhidrato de Mecloretamina; acetato de Megestrol; acetato de Melengestrol; Melfalan; Menogaril; Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato sódico; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcin; Mitocromin; Mitogilin; Mitomalcin; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; clorhidrato de Mitoxantrona; ácido micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatina; Oxisuran; Paclitaxel; Pegaspargasa; Peliomicina; Pentamustina; sulfato de Peplomicina; Perfosfamida; Pipobroman; Piposulfan; clorhidrato de Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfímero sódico; Porfiromicina; Prednimustina; clorhidrato de Procarbazina; Puromicina; clorhidrato de Puromicina; Pirazofurina; Riboprina; Rogletimida; Safingol; clorhidrato de Safingol; Semustina; Simtrazeno; Esparfosato sódico; esparsomicina 1, clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina; cloruro de estroncio Sr89; Sulofenur; Talisomicina; Taxano; Taxoide; Tecogalan sódico; Tegafur; clorhidrato de Teloxantrona; Temoporfina; Tenipósido; Teroxirona; Testolactona; tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofurina; Tirapazamina; clorhidrato de Topotecano; citrato de Toremifeno; acetato de Trestolona; fosfato de Triciribina; Trimetrexato; Glucuronato de Trimetrexato; Triptorelina; clorhidrato de Tubulozol; mostaza de Uracilo; Uredepa; Vapreótido; Verteporfina; sulfato de Vinblastina; sulfato de Vincristina; Vindesina; sulfato de Vindesina; sulfato de Vinepidina; sulfato de Vinglicinato; sulfato de Vinleurosina; tartrato de Vinorelbina; sulfato de Vinrosidina; sulfato de Vinzolidina; Vorozol; Zeniplatina; y Zinostatina; clorhidrato de Zorubicina. Los ejemplos de agentes anti-bacterianos apropiados incluyen, pero no se limitan a, penicilinas, aminoglucósidos, macrólidos, monobactams, rifamicinas, tetraciclinas, cloramfenicol, clindamicina, lincomicina, imipenem, ácido fusídico, novobiocina, fosfomicina, fusidato sódico, neomicina, polimixina, capreomicina, colistimetato, colistina, gramicidina, minociclina, doxiciclina, vanomicina, bacitracina, kanamicina, gentamicina, eritromicina y cefalosporinas . Los ejemplos de agentes anti-inflamatorios apropiados incluyen, pero no se limitan a, aspirina (ácido acetilsalicílico) , indometacina, indometacina sódica trihidratada, salicilamida, naproxen, colchicina, fenoprofen, sulindac, diflunisal, diclofenac, indoprofen y salicilamida sódica. Los ejemplos de agentes anti-virales apropiados incluyen, pero no se limitan a, metilamina de alfa-metil-P-adamantano, 1-D-ribofuranosil-l, 2, 4-triazol-3-carboxamida, 9- (2-hidroxi-etoxi)metilguanina, adamantanamina, 5-yodo-2'-desoxiuridina, trifluorotimidina, interferón, arabinósido de adenina, CD4, 3' -azido-3' -desoxitimidina (AZT), 9- (2-hidroxietoximetil) -guanina (aciclovir) , ácido fosfonofórmico, 1-adamantanamina, péptido T, y 2', 3'-didesoxicitidina. Un método particularmente preferido para tratar enfermedades neovasculares comprende administrar a un mamífero que padece de una enfermedad neovascular una cantidad inhibidora del desarrollo vascular de una combinación de fármacos que comprende T2-TrpRS, por lo menos un inhibidor de señalización de VEGF-165, y opcionalmente, por lo menos un inhibidor de señalización de integrina avß3 y avß5. Las enfermedades neovasculares que pueden ser tratadas mediante los métodos de la presente invención incluyen, sin limitación, enfermedades neovasculares del ojo (por ejemplo, enfermedades neovasculares de la retina y la coroides) , glaucoma rubeótico, pterigia, cánceres de tumor sólido (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de tejido mamario, y cáncer de próstata) , osteoartritis, artritis reumatoide, anomalías y malformaciones vasculares (por ejemplo, hemangiomas, linfangiomas, y similares), y psoriasis . El presente método para tratar enfermedades neovasculares retinianas en un mamífero de preferencia comprende inyectar por vía intra-vítreo en el ojo de un mamífero que padece de una enfermedad neovascular una cantidad inhibidora del desarrollo vascular de una combinación de composiciones anti-angiogénicas y angiostáticas que provean un fragmento angiostático de TrpRS, un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina. Este método se puede utilizar para tratar enfermedades oculares tales como enfermedades degenerativas vasculares, retinopatías isquémicas, hemorragias vasculares, fuga vascular, y coroidopatías en mamíferos neonatos, juveniles o completamente maduros. Los ejemplos de dichas enfermedades incluyen degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, presunta histoplasmosis ocular, retinopatía de pre-madurez, anemia de célula falciforme, hemangioma, pterigia, oclusión de vena retiniana central isquémica, oclusión de vena retiniana blanca, melanoma ocular, blastoma retiniano, y retinitis pigmentosa, así como daños a la retina. Otro aspecto de la presente invención es una composición terapéutica útil para el tratamiento de enfermedades neovasculares, la cual comprende un fragmento angiostático de TrpRS, un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En una modalidad preferida, la composición también comprende por lo menos un agente terapéutico adicional tal como un esferoide angiostático, un agente antineoplásico, un agente antibacteriano, un agente antiviral, un agente anti-inflamatorio, y similares. Un método para tratar una enfermedad neovascular comprende administrar a un mamífero que padece de una enfermedad neovascular una cantidad inhibidora del desarrollo vascular de una combinación de fármacos que comprende un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste de un inhibidor de señalización de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de señalización de integrina. En términos generales, una cantidad inhibidora del desarrollo vascular de una composición de la presente invención es por lo menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal y, en la mayoría de los casos, no mayor de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día para tratamientos sistémicos. De preferencia, la dosis está en el intervalo de aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal por día. Para tratamiento intra-vítreo ocular de pacientes humanos, la dosis preferida está en el intervalo de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 5 miligramos por ojo para un tratamiento dado. Las composiciones se pueden administrar en una sola dosis o en dosis múltiples con respecto al tiempo. El experto en la técnica de los campos médicos puede determinar la dosis terapéutica efectiva óptima de una composición de la presente invención, tomando en consideración el paciente particular, los fármacos presentes en la composición, el estado patológico, y otros factores que son bien conocidos en los campos médicos. Las composiciones terapéuticas de esta invención se pueden modalizar en una variedad de formas físicas. Estas formas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólidas, semi-sólidas, y líquidas, tales como tabletas, pildoras, polvos, soluciones o suspensiones líquidas, aerosoles, liposomas, supositorios, soluciones inyectables y para infusión y formas de liberación sostenida. El experto en la técnica de los campos médicos puede elegir una forma de dosificación apropiada dependiendo del modo pretendido de administración y de la enfermedad a ser tratada, utilizando principios farmacológicos bien conocidos en la técnica. Una composición terapéutica de conformidad con esta invención se puede administrar utilizando vías convencionales de administración, tales como vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intralesión, intra-esternón, intra-vítreo, intra-craneal, o en aerosol. También se pueden utilizar vías de administración tópicas, aplicando las composiciones en forma local a una parte particular del cuerpo (por ejemplo, ojo, piel, tracto intestinal inferior, vagina, recto) en casos en los que sea apropiado. Las composiciones terapéuticas también incluyen vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales que son conocidos por los expertos en la técnica. En términos generales, las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden formular y administrar utilizando métodos y composiciones similares a aquellas utilizadas para las clases individuales de ingredientes activos presentes en las composiciones. Los expertos en la técnica entenderán que las dosis convencionales pueden variar en función de los ingredientes activos particulares en la composición, así como de la salud, peso, edad, sexo, la condición o enfermedad del paciente y el modo deseado de administración.

Las composiciones terapéuticas de esta invención incluyen portadores, excipientes y vehículos farmacológicamente apropiados, farmacéuticamente aceptables. En general, estos vehículos incluyen soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados tales como solución salina regulada con fosfatos (PBS) . Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites no volátiles. Además, los vehículos para vía intravenosa pueden incluir reabastecedores de fluidos y nutrientes, y reabastecedores de electrolitos, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. También pueden estar presentes excipientes tales como conservadores y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y gases inertes. Los auxiliares de formulación, vehículos, otros excipientes y los métodos apropiados para formular composiciones farmacéuticas se describen en Remington r s Pharmaceutical Sciences, 14a edición, Mack Publishing Co., 1970, en particular la parte VIII, "Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture", páginas 1461-1762, cuyas descripciones relevantes se incorporan en la presente invención para referencia.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden empacar en botellas o frascos esterilizados de manera apropiada, ya sea en forma de dosificación unitaria o de dosis múltiples. Los contenedores de preferencia se sellan herméticamente después que se llenan con una composición de la invención. De preferencia, las composiciones se empacan en un contenedor que tenga un marbete fijado al mismo, cuyo marbete identifica los fármacos presentes en la composición, y porta un aviso en una forma prescrita por una agencia gubernamental tal como la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos de Norteamérica, que reflejen la aprobación de la composición conforme a las leyes apropiadas, información de dosificación, y similares. El marbete de preferencia contiene información acerca de la composición que sea útil para un profesional del cuidado de la salud que administra la composición a un paciente. El material de empaque también contiene de preferencia materiales informativos impresos que se refieren a la administración de la composición, instrucciones, indicaciones, y cualesquiera advertencias requeridas necesarias .

MÉTODOS Modelo de angiogénesis retiniana en ratón neonato Descripción del modelo Inmediatamente antes del nacimiento (día postnatal cero; "PO"), la vasculatura retiniana está virtualmente ausente en el ratón. Alrededor de cuatro semanas después del nacimiento (P28) la retina alcanza un patrón adulto de vasos sanguíneos reti íanos que coincide con el inicio de la visión. La neovascularización fisiológica de la retina ocurre durante este periodo a través de un patrón de desarrollo estereotípico, bifásico de angiogénesis. Durante la fase primaria de desarrollo vascular retiniano, los vasos sanguíneos peripapilares tipo rayo de rueda crecen en forma radial a partir de la arteria y vena retinianaa, conectándose entre sí progresivamente mediante un plexo capilar que se forma entre éstas. Este "plexo retiniano interior" crece en área, volumen y complejidad, en forma centrífuga, como una monocapa dentro de la capa de fibra nerviosa durante los primeros siete a diez días después del nacimiento. La segunda fase de formación de vasos sanguíneos retiñíanos comienza entre los días postnatales 7 (P7) y 10 (PÍO) cuando las ramificaciones colaterales brotan a partir de los capilares del plexo superficial y penetran en la retina en donde sus puntas se ramifican y anastamosan lateralmente para formar un "plexo vascular profundo" plano. Aunque el plexo vascular profundo está en su lugar alrededor de P14, éste experimenta remodelación exhaustiva desde P14 hasta P21. Es interesante mencionar que la formación de estas redes vasculares en el ratón neonato son sorprendentemente similares a los eventos que ocurren en el feto humano de tercer trimestre.

Ventajas y cuantificación del modelo La reproducibilidad del proceso de desarrollo retiniano de múrido y su fácil accesibilidad en los animales neonatos proveen una oportunidad para evaluar la eficacia de compuestos antiangiogénicos en un modelo de angiogénesis fisiológicamente relevante. Las ventajas adicionales del modelo de ratón neonato son la capacidad de evaluar cualitativa y cuantitativamente el efecto angiostático de antagonistas putativos de angiogénesis. La actividad angiostática se evalúa tomando como base el grado de angiogénesis en la capa vascular retiniana externa, profunda (capa secundaria) que se desarrolla entre P8 y P12. La apariencia de la red de vasos sanguíneos interior (capa primaria) se evalúa respecto al desarrollo normal y a signos de toxicidad. No se observan anormalidades en la capa vascular interior en ninguna de las pruebas efectuadas y descritas en la presente invención. La evaluación cualitativa de la vascularización de la capa secundaria se puede efectuar fotografiando con microscopio las capas superficial y profunda teñidas de manera apropiada de retinas extirpadas y determinando el porcentaje de ojos en los cuales se inhibe completa o parcialmente la formación de la capa vascular profunda. Todos los datos presentados en la presente invención se basan en el análisis cualitativo del porcentaje de ojos que demuestran un 75 a 100% de inhibición de formación de la red vascular retiniana profunda después del tratamiento. En la mayoría de los casos, también se provee el porcentaje de ratones que presentan > 95% y 100% de inhibición de formación de la red vascular retiniana profunda.

Preparación de las composiciones El inhibidor de señalización de integrina peptidomimético compuesto (1) se solubiliza en PBS a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml en PBS (concentración Ix) . T2-TrpRS se solubiliza en PBS a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml (concentración Ix) . El aptámero de VEGF (pegaptanib sódico; compuesto (2) ) se solubiliza en PBS a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml (concentración lx) para obtener una inyección de aproximadamente 1 µg/ojo a concentración Ix. Para todas las pruebas de combinación, los compuestos se preparan a 2 ó 3 veces la concentración Ix de cada material y después se combinan para producir una solución final que contiene cada compuesto individual a la misma concentración que si se utilizara solo (por ejemplo, lx, 0.5x, 0.25x o O.lx, como pudiera ser el caso) . Para todas las pruebas, se administra por vía intra-vítreo una sola inyección de 0.5 µl de soluciones de PBS de los fármacos sin considerar el número de compuestos que están siendo inyectados. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "O.lx" se refiere a un décimo de la concentración lx de un material dado, "0.25x" se refiere a un cuarto de la concentración Ix de un material dado, "0.5x" se refiere a un medio de la concentración lx de un material dado, etcétera para designaciones similares.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OÍR) en ratón Este modelo es descrito por Smith, L., Invest . Ophthalmol . Vis . Sci . 35, 101-111 (1994). Los ratones se colocan en hiperoxia (75% de 02) de P7 a P12, seguido por retorno a normoxia. Mientras se encuentran bajo hiperoxia, los vasos sanguíneos retiñíanos centrales se obliteran, y la vasculatura profunda no se puede formar. Después de regresar a normoxia, la retina se vuelve hipóxica y resulta la neovascularización patológica. La cuantificación de neovascularización en el modelo de OÍR implica la cuantificación de formación de penacho neovascular, así como la cuantificación de obliteración. Se preparan montajes intactos retinianos y los vasos sanguíneos de los mismos se tiñen con isolectina GS-IB4. Se efectúa la formación de imagen confocal, enfocando justo encima del plexo vascular superficial, y se elabora un montaje de cuatro cuadrantes. Se identifican los penachos neovasculares (Adobe PHOTOSHOP®) y se cuantifica el área de pixelación. Además, se trazan las áreas de obliteración (Adobe PHOTOSHOP®) , y se cuantifica el área de pixelación. Después se aplica el factor de conversión basado en la adquisición de imagen (resolución, tamaño, etc.) para obtener un valor en µm2.

Procedimiento general de prueba de angiogénesis Se utiliza una prueba de angiogénesis in vivo en el ratón neonato (Balb/C, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) para evaluar la actividad angiostática del inhibidor de señalización de integrina compuesto (1) , T2- TrpRS, y aptámero de VEGF compuesto (2) . Se efectúa la inyección íntra-vítreo y aislamiento de retina con un microscopio de disección (SMZ 645, Nikon, Japón) . Se crea una fisura en el párpado en el día postnatal 7 (P7) con un bisturí fino para exponer el glóbulo ocular para inyección. Las muestras (0.5 µl) se inyectan con una jeringa Hamilton equipada con una aguja de calibre 32 (Hamilton Company, Reno, NV) . La inyección se efectúa entre el ecuador y el limbo córneo. Durante la inyección, se monitorea la ubicación de la punta de la aguja mediante visualización directa para determinar que ésta esté en la cavidad vitrea. Los ojos con daño al cristalino o la retina inducido por la aguja se excluyen del estudio. Después de la inyección, los párpados se vuelven a posicionar para cerrar la fisura. En el día postnatal 12 (P12) , los animales se sacrifican mediante eutanasia y los ojos se extirpan totalmente. Después de aproximadamente 10 minutos en paraformaldehído (PFA) al 4% se extirpan la córnea, cristalino, esclerótica, y vitreo a través de una incisión en el limbo. La retina aislada se prepara para tinción mediante inmersión en metanol durante 10 minutos aproximadamente en hielo, seguido por bloqueo en suero fetal bovino al 50% (Gibco, Grand Island, NY) con suero normal de cabra al 20% (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) en PBS durante aproximadamente una hora en hielo. Los vasos sanguíneos se visualizan específicamente mediante tinción de la retina durante aproximadamente 18 horas a 4°C aproximadamente con un anticuerpo de conejo anti-colágena IV de ratón (Chemicon, Temecula, CA) diluido 1:200 en solución reguladora para bloqueo o con una isolectina conjugada fluorescente { Griffonia simplici folia, Molecular Probes) . Se incuba un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con ALEXA FLUOR® (Alexa) 594 (Molecular probes, Eugene, OR) (dilución 1:200 en solución reguladora para bloqueo) con la retina durante 2 horas aproximadamente a 4°C aproximadamente. Las retinas se montan después para evaluación microscópica con medio para montaje de desvanecimiento lento (Molecular Probes, Eugene, OR) .

EJEMPLO 1 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un inhibidor de señalización de integrina peptidomimético y un inhibidor de señalización de VEGF Siguiendo el Procedimiento General de la Prueba de Angiogénesis ("Procedimiento General") descrito anteriormente en la presente invención, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en el día postnatal 8 (P8) con cualquiera de una concentración 0.25x del compuesto (1) inhibidor de señalización de integrina (cinco ratones), una concentración 0.5x del aptámero de VEGF compuesto (2) (cinco ratones) , o una combinación de una concentración 0.25x del compuesto (1) y una concentración 0.5x del compuesto (2) (seis ratones). Como un control, otro grupo de seis ratones recibe solamente una inyección intravítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 1 y en las figuras 4 y 5.

TABLA 1 de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% PBS 100 0 0 0 0 Compuesto (2) 0.5x 20 20 20 20 40 Compuesto (1) O.lx 40 0.5 20 20 20 Combinación 0 17 0 0 83 EJEMPLO 2 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS y un inhibidor de señalización de VEGF Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración O.lx de T2-TrpRS (ocho ratones), una concentración O.lx del aptámero de VEGF compuesto (2) (ocho ratones), o una combinación de una concentración O.lx de T2-TrpRS y una concentración O.lx del compuesto (2) (diez ratones) . Como un control, otro grupo de ocho ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 2 y en las figuras 6, 7, 8, y 9.

TABLA 2 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS 100.0 0 0 0 0 0 0 comp. (2) O.lx 87.5 12.5 0 0 0 0 0 T2-TrpRS O.lx 50 37.5 12.5 0 0 0 0 Combinación 10 30 20 20 20 0 0 EJEMPLO 3 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS y un inhibidor de señalización de VEGF Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración lx de T2-TrpRS (ocho ratones) , una concentración Ix del aptámero de VEGF compuesto (2) (ocho ratones) , o una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración lx del compuesto (2) (diez ratones) . Como un control, otro grupo de seis ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 3 y en las figuras 10, 11, 12, y 13.

TABLA 3 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS 100 0 0 0 0 0 0 Compuesto (2) lx 37.5 12.5 12.5 12.5 25 0 0 T2-TrpRS Ix 12.5 12.5 0 12.5 62.5 12.5 12.5 Combinación 0 0 10 10 80 40 20 EJEMPLO 4 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS y un inhibidor de señalización de VEGF Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración lx de T2-TrpRS (ocho ratones), una concentración 0.5x del aptámero de VEGF compuesto (2) (diez ratones) o una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración 0.5x del compuesto (2) (diez ratones). Como un control, otro grupo de seis ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 4 y en las figuras 14, 15, 16, y 17.

TABLA 4 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS 66.6 16.7 16.7 0 0 0 0 Compuesto (2) 0.5x 60 30 0 0 10 0 0 T2-TrpRS lx 12.5 37.5 12.5 12.5 25 0 0 Combinación 0 0 10 10 70 30 20 EJEMPLO 5 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS y un inhibidor de señalización de integrina Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración Ix de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del compuesto (1) inhibidor de señalización de integrina o una combinación de una concentración Ix de T2-TrpRS y una concentración 0.5x del compuesto (1) , en grupos de seis ratones para cada régimen de tratamiento. Como un control, otro grupo de cuatro ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 5 y en las figuras 18, 19, 20, y 21.

TABLA 5 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50 '-75% 75-100% >95% 100% PBS : 50 25 25 0 0 0 0 Compuesto ( 1 ) 0 . 5x 50 33 . 3 16. 7 0 0 0 0 T2-TrpRS lx 33 . 3 16. 7 33 . 3 0 16. 7 16. 7 0 Combinación 0 33.3 16. 7 0 50 16. 7 0 EJEMPLO 6 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS , un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración lx de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del compuesto (1) inhibidor de señalización de integrina, una concentración lx del aptámero de VEGF compuesto (2) , una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración 0.5x del compuesto (1) , una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración lx del compuesto (2), o una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del compuesto (1), y una concentración lx del compuesto (2) , en grupos de ocho ratones para cada régimen de tratamiento. Como un control, otro grupo de ocho ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 6 y en las figuras 22, 23, 24, 25, 26, 27, y 28.

TABLA 6 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS 100 0 0 0 0 0 0 Compuesto (1) 0.5x 50 12.5 12.5 12.5 12.5 0 0 Compuesto (2) Ix 37.5 25 12.5 25 0 0 0 T2-TrpRS lx 50 25 12.5 12.5 0 0 0 T2-TrpRS + comp. (2) 25 25 25 0 25 25 12.5 T2-TrpRS + comp. (1) 50 0 0 0 50 37.5 25 T2-TrpRS + (1) y (2) 0 0 0 0 100 87.5 75 EJEMPLO 7 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS, un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración Ix de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del compuesto (1) inhibidor de señalización de integrina, una concentración lx del aptámero de VEGF compuesto (2) , una combinación de una concentración 0.5x del compuesto (1) y una concentración lx del compuesto (2) , o una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS, una concentración 0.5x del compuesto (1), y una concentración Ix del compuesto (2), en grupos de ocho ratones para cada régimen de tratamiento. Como un control, otro grupo de seis ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 7 y en las figuras 29, 30, 31, 32, 33, y 34 TABLA 7 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS LOO 0 0 0 0 0 0 Compuesto (1 ) 0. 5x 12 2..55 25 12.5 12.5 37.5 0 0 Compuesto ( 2 ) lx 25 25 0 12.5 37.5 0 0 T2-TrpRS lx 25 12.5 12.5 0 50 12.5 0 Compuesto (1) + (2) 0 12.5 12.5 25 50 25 25 T2-TrpRS + (1) y (2) 0 0 0 0 100 62.5 50 EJEMPLO 8 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS y un inhibidor de señalización de VEGF Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos en P4 con cualquiera de una concentración Ix de T2-TrpRS (diez ratones), una concentración 0.25x del aptámero de VEGF compuesto (2) (once ratones), o una combinación de una concentración lx de T2-TrpRS y una concentración 0.25x del compuesto (2) (once ratones). Como un control, otro grupo de ocho ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 8.

TABLA 8 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS ?00 Ó" 0 0 0 0 0 Compuesto (2) 0.25x 54 . 5 36. 4 0 0 9 . 1 0 0 T2-TrpRS Ix 30 30 20 10 10 0 0 combinación 18 . 2 18 . 2 9 . 1 18 . 2 27 . 3 0 0 EJEMPLO 9 Tratamiento de ojos de ratón neonato con una combinación de un fragmento angiostático de TrpRS , un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos (en grupos de ocho ratones cada uno) en P4 con cualquiera de una concentración lx de T2-TrpRS, una concentración lx del compuesto (1) inhibidor de señalización de integrina, una concentración lx del aptámero de VEGF compuesto (2) , una combinación de una concentración Ix de T2-TrpRS y una concentración lx del compuesto (1) , una combinación de una concentración Ix del compuesto (1) y una concentración lx del compuesto (2) , o una combinación de una concentración Ix de T2-TrpRS, una concentración lx del compuesto (2), y una concentración Ix del compuesto (2) . Como un control, otro grupo de ocho ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 9 y en las figuras 35-42.

TABLA 9 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS 75 25 0 0 0 0 0 Compuesto (1) Ix 25 12.5 12.5 37.5 12.5 0 0 Compuesto (2) Ix 25 0 12.5 12.5 50 25 12.5 T2-TrpRS lx 12.5 0 25 12.5 50 12.5 0 Comp. (1) + T2-TrpRS 0 12.5 12.5 25 50 25 12.5 Comp. (1) + (2) 12.5 12.5 0 12.5 62.5 62.5 50 T2-TrpRS + comp. (2) 0 12.5 12.5 12.5 62.5 37.5 25 T2-TrpRS + (1) + (2) 0 25 0 0 75 75 62.5 EJEMPLO 10 Tratamiento de ojos de ratón neonato con dosis variables de un fragmento angiostático de TrpRS Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos (en grupos de ocho a doce ratones cada uno) en P4 con T2- TrpRS, a concentraciones de O.lx (8 ratones), 0.3x (12 ratones) , lx (12 ratones) , 2x (12 ratones) , y 3x (12 ratones) . Como un control, otro grupo de 10 ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 10.

TABLA 10 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% PBS 100 0 0 0 0 T2-TrpRS O.lx 75 25 0 0 0 T2-TrpRS 0.3x 33.3 16.7 8.3 16.7 25 T2-TrpRS lx 8.3 16.7 25 8.7 41.7 T2-TrpRS 2x 8.3 25 0 16.7 41.7 T2-TrpRs 3x 66.7 25 8.7 0 0 EJEMPLO 11 Tratamiento de ojos de ratón neonato con dosis variables de un fragmento angiostático de TrpRS Siguiendo el Procedimiento General, se inyectan por vía intra-vítreo los ojos de ratones Balb/C neonatos (en grupos de seis a catorce ratones cada uno) en P4 con T2-TrpRS, a concentraciones de 0.3x (6 ratones), Ix (14 ratones), 2x (8 ratones), 3x (7 ratones), y 5x (6 ratones). Como un control, otro grupo de 10 ratones recibe solamente una inyección intra-vítreo de PBS. En P12, los ratones se sacrifican mediante eutanasia y las retinas se extirpan a partir de los ojos inyectados, se tiñen, se montan y se evalúan microscópicamente como se describe en el Procedimiento General. Se evalúa la vascularidad de la capa secundaria (vascular retiniana exterior) tomando como base el porcentaje de vascularización en comparación con los ojos de control. Los resultados se muestran en la tabla 11.

TABLA 11 % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% PBS 60 40 0 0 0 T2-TrpRS 0.3x 33.3 16.7 0 0 50 T2-TrpRS lx 14.3 14.3 7.1 14.3 50 TABLA 11 (cont.) de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% T2-TrpRS 2x 12.5 12.5 12.5 12.5 50 T2-TrpRS 3x 14.3 14.3 14.3 28.5 28.5 T2-TrpRs 5x 16.6 33.3 33.3 16.6 0 Los datos para ratones que presentan >95% y 100% de inhibición en los ejemplos anteriores demuestran que incluso las composiciones que comprenden por lo menos dos materiales que se seleccionan a partir del grupo que consiste de un fragmento angiostático de TrpRS, un inhibidor de señalización de VEGF, y un inhibidor de señalización de integrina obtienen inesperadamente mayor eficacia para la inhibición de neovascularización en el modelo de ojo de ratón neonato que los niveles esperados de inhibición a partir de los efectos aditivos simples de la combinación de componentes individuales . Esto también se hace evidente cuando se combinan los resultados de los diversos ejemplos como en la tabla 12, la cual compila los resultados de los ejemplos a concentraciones de Ix hasta 2x del compuesto (1) inhibidor de integrina, 0.5x a lx del aptámero de VEGF compuesto (2), y Ix de T2-TrpRS, así como las composiciones de la presente invención (valores de inhibición en negritas en la tabla 12) que comprenden combinaciones de por lo menos dos de compuesto (1) , compuesto (2) y T2-TrpRS. El número de ratones en cada grupo se indica entre paréntesis para cada agrupamiento. Los datos en la tabla 12 claramente muestran un nivel inesperadamente más alto de inhibición de formación de vaso sanguíneo en la capa vascular profunda para ojos de ratón tratados con las composiciones de la presente invención en comparación con los niveles de inhibición de los tratamientos con los inhibidores individuales por sí mismos o la suma numérica de los mismos.

TABLA 12 Datos combinados provenientes de los ejemplos % de inhibición 0-10% 10-25% 25-50% 50-75% 75-100% >95% 100% PBS (38 ratones) 84.2 10.5 573 0 Ó" Ó" 0 lx-2x compuesto (1) 33.3 20 13.3 16.7 16.7 0 0 (30 ratones) Ix compuesto (2) 39.1 20 7.6 11.9 21.4 4.7 2.4 (30 ratones) lx T2-TrpRS 23.9 17.4 15.2 8.7 34.8 8.7 2.2 (46 ratones) Compuesto (1) + T2- 18.2 13.6 9.1 9.1 50 27.3 13.6 TrpRS (22 ratones) Compuesto (1) + (2) 6.3 12.5 6.3 18.8 56.3 43.7 37.5 (16 ratones) T2-TrpRS + comp. (2) 5.6 11.1 13.9 8.3 61.1 33.3 19.4 (36 ratones) T2-TrpRS + (1) + (2) 0 8.3 0 0 91.7 79.2 62.5 (24 ratones) Los resultados de los ejemplos 10 y 11 (tablas 10 y 11) muestran que la eficacia de T2-TrpRS llega a un máximo a concentración lx a 2x aproximadamente y no provee que más del 50% de los ratones tengan 75-100% inhibición en la capa vascular profunda. La eficacia comienza a declinar a una concentración de 2x y mayor. Por lo tanto, incluso con dosis crecientes, T2 no provee más de aproximadamente 50% de eficacia al nivel de 95-100% de inhibición.

EJEMPLO 12 Efectos sinergistas de la administración de fragmento angiostático de T2-TrpRS, aptámero de VEGF e inhibidor de señalización de integrina «vß3 y QCyßs peptidomimético Para estudiar el efecto de combinar diferentes moléculas angiostáticas, se utilizan tres compuestos angiostáticos que se sabe eligen como blanco rutas angiogénicas críticas, pero separadas, : un antagonista de integrina avß3 y avß5 de tipo molécula pequeña (compuesto (1); "EMD 472523" obtenido a partir de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) , un antagonista de VEGF165 (compuesto (2); pegaptanib sódico), y una forma truncada de Triptófano-ARNt sintetasa (T2-TrpRS, obtenida a partir de Angiosyn Inc., La Jolla, CA) . Aunque el mecanismo exacto de acción para T2-TrpRS no ha sido esclarecido completamente, su mecanismo de acción no está vinculado directamente al antagonismo de VEGF o integrina. Se utiliza el modelo de angiogénesis retiniana en ratón neonato para evaluar la eficacia de cada monoterapia, y de diversas combinaciones de estos compuestos individuales. Como se indicó anteriormente en la presente invención, los ratones nacen sin una vasculatura retiniana. Durante las primeras tres semanas después del nacimiento se desarrolla una vasculatura tipo adulto. La vasculatura retiniana forma tres distintos plexos planos en los cuales el plexo vascular superficial se desarrolla durante la primera semana post-natal. En el día post-natal 8 (P8), los vasos sanguíneos del plexo superficial se ramifican y migran hacia el plexo profundo en el borde externo de la capa nuclear interior. Para evaluar las propiedades angiostáticas de cada monoterapia o solución de combinación, se efectúan inyecciones intra-vítreo en P7, cuando la formación de la red superficial está casi completa, pero antes que comience la formación de los plexos profundos. Después se analizan los efectos sobre la formación de los plexos vasculares profundos cinco días después (P12) . Se califica el grado de inhibición para cada retina inyectada como 0-10%, 10-25%, 25-50%, 50-75%, o 75-100% (Figura 48) y el grupo de 75-100% de inhibición se separa adicionalmente en niveles de >90% y 100% de inhibición (Figura 49) . Se evalúa la apariencia de los plexos vasculares primarios previamente formados, así como la morfología retiniana global, respecto a signos de toxicidad.

Preparación de la muestra El antagonista de integrina avß3 y o¡vß5 (compuesto (1) ) se guarda como polvo liofilizado en un desecador a temperatura ambiente (I. .) o -20°C (V.A. ) , y se solubiliza en PBS lx libre de ARNasa, estéril inmediatamente antes del uso. El aptámero de VEGF (compuesto (1) ) se sintetiza como un compuesto conjugado con PEG de 40 kDa (Transgenomic Inc, Boulder, CO) tomando como base la información publicada, Bridonneau, et al . , J. Chromatogr. B . Diomed. Sci . App . 726: 237-47 (1999). Se determina que el compuesto es puro mediante cromatografía líquida de fase inversa. Las concentraciones reportadas en la presente invención se refieren a la concentración final del aptámero de VEGF activo en lugar de la concentración total del compuesto conjugado con PEG y se determinan mediante análisis espectrofotométrico a 260/280 nm. El péptido de T2-TrpRS se elabora como un compuesto recombinante como se describe en Otani, et al . , Proc . Nati Acad. Sci . , USA 99: 178-183 (2002) y solicitud provisional de patente E.U.A no. de serie 60/598,019 presentada el 2 de agosto de 2004, las cuales se incorporan en la presente invención para referencia en sus totalidades. El producto purificado se guarda en glicerol al 50% a -20°C, y se dialisa en PBS lx estéril inmediatamente antes del uso. Las soluciones de combinación se preparan creando inicialmente soluciones de reserva 3x de cada compuesto individual. Los compuestos se mezclan después entre sí, y con PBS en casos en los que sea apropiado, para elaborar una solución final que contenga cada compuesto deseado a una concentración equivalente a cada concentración de monoterapia correspondiente.

Inyecciones intra-vítreo Todo el trabajo en animales se apega a los lineamientos de protocolo estrictos para el cuidado de humanos y para el uso de animales. Se efectúan las inyecciones intra-vítreo, se extirpan las retinas, y se visualiza la vasculatura. Se induce OÍR de conformidad con el protocolo descrito por Smith, et al . , Invest . Ophthalmol . Vis . Sci . , 35: 101-111 (1994), mediante exposición de crías de 7 días post-natales (P7) y sus madres a un ambiente de 75% de oxígeno (hiperoxia) durante 5 días, seguido por un regreso a aire ambiental (normoxia) . Las inyecciones intra-vítreo se efectúan en P12, inmediatamente después de regresar a normoxia y las retinas se analizan en P17. Los vasos sanguíneos se tiñen utilizando isolectina GS-IB proveniente de Griffonia simplicifolia (lectina GS) , conjugada con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, dilución 1:150 en PBS). Las imágenes confocales se toman utilizando una lente objetivo 4x, enfocando cuidadosamente justo por encima de la membrana limítrofe interior de la retina, haciendo prominentes los penachos neovasculares pre-laminares . Se adquieren cuatro imagines traslapadas a partir de cada retina y cada imagen individual se convierte a un tamaño de 5.08 x 5.08 cm con 300 pixeles por pulgada. Las áreas de los penachos neovasculares son cuantificadas por individuos enmascarados utilizando montajes intactos retiñíanos. Los penachos se seleccionan específicamente, tomando como base su apariencia característica y la intensidad más alta de la tinción con isolectina, utilizando la herramienta "varita mágica" en el software Adobe PHOTOSHOP®. Después se determina el área total en pixeles. Las áreas de formación de penacho neovascular se normalizan con respecto a retinas de OÍR de control inyectadas con PBS.

Dosificación Los experimentos de dosificación se efectúan primero para determinar la dosis efectiva máxima para cada compuesto individual. Se encuentra que cada compuesto tiene una curva de eficacia con forma de campana con dosis efectivas óptimas de 5-10 µg (10-20 nmoles) por ojo para el antagonista de integrina (Figura 46), 1.0-2.0 µg (108-215 pmoles) por ojo para el aptámero de VEGF (Figura 44), y 0.25-0.5 µg (5.2-10.4 pmoles) por ojo para T2-TrpRS (Figura 43) . Después se efectúan inyecciones de cada monoterapia a la dosis óptima, y de soluciones que contienen combinaciones apropiadas de cada compuesto a dosis equivalentes para comparar las actividades angiostáticas. A las dosis individuales máximas, alrededor de 35% de las retinas no se ven afectadas por inyección de cualquiera del antagonista de integrina o el aptámero de VEGF. El otro 67% de las retinas básicamente cae uniformemente dentro del intervalo de 10-25%, 25-50%, 50-75%, o 75%-100% (Tabla 13A más adelante) . La inhibición de la red vascular profunda con el péptido T2-TrpRS es ligeramente mejor. El 24% de las retinas inyectadas con péptido T2-TrpRS desarrolla un plexo vascular profundo completo, normal mientras que el 35% de las retinas inyectadas con péptido T2-TrpRS presenta alrededor de 75% de inhibición en comparación con 17% y 21% para el antagonista de integrina y el aptámero de VEGF respectivamente (Tabla 13A más adelante) . Cuando los compuestos angiostáticos se inyectan en combinación, los efectos angiostáticos sobre la neovascularización son asombrosos. Cada combinación doble, antagonista de integrina + T2-TrpRS, antagonista de integrina + aptámero de VEGF, y T2-TrpRS + aptámero de VEGF, demuestra una mejora significativa de la actividad angiostática con respecto a las monoterapias . Significativamente menos retinas son resistentes al tratamiento angiostático utilizando las terapias de combinación. La neovascularización se inhibe casi en un 75% en la mayoría de las retinas tratadas con cualquiera de las combinaciones dobles (Tabla 13A más adelante) . Cuando todos los tres compuestos se inyectan juntos a las mismas dosis óptimas que las de las inyecciones de monoterapia correspondientes (combinación triple lx) , casi 90% de las retinas tienen >75% de inhibición. A diferencia de las retinas tratadas con monoterapia o combinación doble, todas las retinas tratadas con la combinación triple presentan algún grado de inhibición neovascular. Además, solamente 8% de las retinas inyectadas sigue sin presentar algún nivel significativo de neovascularización. Se observa inhibición de angiogénesis casi completa en el otro 92% de las retinas inyectadas con el compuesto de combinación triple (Tabla 13A más adelante; Figura 48) . Las diferencias en eficacia angiostática se tornan incluso más pronunciadas cuando la categoría de >75% de inhibición se sub-clasifica en niveles de >90% de inhibición y 100% de inhibición (Figura 49) . Casi el 80% de las retinas inyectadas con la combinación triple tiene más de 90% de inhibición de formación de plexo vascular profundo y 63% tiene 100% de inhibición de neovascularización en donde no se puede observar incluso un solo brote neovascular. Esto es una mejora sustancial con respecto tanto a las monoterapias que demuestran 100% de inhibición en <5% de las retinas tratadas y las terapias de combinación doble. Además, el plexo vascular superficial de muchas de las retinas tratadas con combinación triple tienen semejanza con aquellos de una retina normal en P7 en lugar de retinas en P12, lo que indica que también se evita el crecimiento vascular adicional dentro del plexo superficial mediante la combinación triple inmediatamente después de la inyección. No se observa inhibición de crecimiento del plexo superficial en cualquier retina tratada con monoterapia o terapia doble. Los vasos sanguíneos más centrales del plexo vascular superficial ya formados antes de la inyección permanecen normales, lo que indica niveles insignificantes de toxicidad a la vasculatura pre-existente. Además, no se observan signos de toxicidad neuronal, y la morfología retiniana permanece sin alteración, lo que indica que no ocurren efectos secundarios negativos observables por inyección de la solución de combinación triple. Las imágenes de los plexos vasculares superficial y profundo provenientes de un experimento representativo completo se muestran en la figura 50. Para analizar el sinergismo, y para evaluar si se puede mantener la actividad angiostática potente utilizando dosis más bajas de la combinación triple, se analizan diluciones en serie. La combinación triple sigue siendo bastante efectiva para inhibir la angiogénesis cuando se diluye hasta 100 veces (combinación triple O.Olx) (Tabla 13B más adelante; Figuras 52 y 53) . Cuando la combinación triple se elabora combinando los compuestos individuales a un décimo de su dosis óptima, casi el 80% de las retinas tratadas sigue presentando >75% de inhibición, y 50% de las retinas presentan inhibición completa (100%) de neovascularización. A las concentraciones O.lx (1 µg/ojo de antagonista de integrina, 0.2 µg/ojo de aptámero de VEGF, y 0.025 µg/ojo de T2-TrpRS) , la inhibición de neovascularización por parte de los compuestos angiostáticos individuales es insignificante (Tabla 13C más adelante; Figura 54) . Se observa alguna eficacia después de la inyección de la combinación doble de O.lx de T2-TrpRS y O.lx de aptámero de VEGF. Sin embargo, a pesar del hecho que esta combinación es el angiostático más efectivo de todas las combinaciones dobles evaluadas, la actividad angiostática sigue siendo mínima en comparación con los niveles de inhibición observados por inyección de la combinación triple O.lx.

TABLA 13A A. Experimento de combinación en modelo de angiogénesis en ratón neonato Porcentaje de retinas con los niveles indicados de inhibición neovascular.

TABLA 13B B. Experimento de dilución en serie de la combinación triple TABLA 13C C. Experimento de monoterapia contra combinación a dosis bajas EJEMPLO 13 Efectos sinergistas de una "terapia triple' El modelo en ratón de retinopatía inducida por oxígeno (OÍR) descrito anteriormente en la presente invención es un modelo bien aceptado de neovascularización inducida por hipoxia en la retina. Los cambios vasculares asociados son consistentes, reproducibles y cuantificables . En años recientes, el uso de este modelo se ha extendido al estudio general de vasculopatías isquémicas relacionadas con la enfermedad e intervenciones anti-angiogénicas relacionadas. Para estudiar las propiedades sinergistas de estos compuestos angiostáticos en un modelo más patológico de angiogénesis, se analizan los efectos de monoterapias y terapias de combinación sobre la formación de neovascularización patológica en el modelo OÍR en ratón. Para los experimentos iniciales, se utilizan las dosis óptimas obtenidas a partir del modelo de angiogénesis neonato. En cada caso, las terapias de combinación demuestran actividades angiostáticas mejoradas en comparación con las monoterapias. Sin embargo, debido a las actividades angiostáticas de cada monoterapia, es difícil determinar si los resultados de combinar los diversos compuestos son sinergistas o simplemente aditivos. Por lo tanto, tomando como base los resultados observados utilizando el modelo de angiogénesis retiniana en ratón neonato que demuestran eficacias equivalentes de las terapias de combinación a dosis relativamente bajas, se evalúan cada monoterapia y las diversas terapias de combinación a un décimo de las dosis óptimas. De nuevo, la concentración de cada compuesto en las soluciones de combinación es equivalente a la concentración de mono-terapia correspondiente. A las concentraciones más bajas, no se observa inhibición significativa de formación de penacho neovascular patológica después de los tratamientos de monoterapia. Sin embargo, se observan reducciones significativas en formaciones de penacho neovascular utilizando cada combinación doble (Figura 57) . Cuando el antagonista de integrina se combina con el péptido 12-TrpRS, la formación de penacho patológico se reduce en > 50%. La combinación del antagonista de integrina con el aptámero de VEGF reduce la formación de penacho en > 40%. Cuando el péptido T2-TrpRS se combina con el aptámero de VEGF, la neovascularización patológica se reduce en casi 80% en comparación con retinas tratadas con control. Muchas de las retinas tratadas con la combinación doble T2-TrpRS/aptámero de VEGF se ven casi normales virtualmente sin neovascularización patológica evidente (Figura 58) . Se demuestra un incremento dramático en la actividad angiostática combinando compuestos angiostáticos múltiples que eligen como blanco distintas rutas de angiogénesis. Se observan actividades angiostáticas fuertes tanto en un modelo de desarrollo como en un modelo patológico de angiogénesis incluso después de combinar los compuestos a dosis que no tienen actividad mono-terapéutica. Esto sugiere un efecto sinergista en lugar de un efecto simplemente aditivo. Estos datos también sugieren que podría ser necesario elegir como blanco rutas múltiples para terapia anti-angiogénica clínica efectiva y podría proveer un nuevo paradigma para el tratamiento de enfermedades neovasculares. De preferencia, se combinan por lo menos dos terapias anti-angiogénicas (por ejemplo, una combinación de inhibidor de señalización de VEGF, tal como un aptámero de VEGF, combinado con un fragmento angiostático de TrpRS, tal como el fragmento T2 de TrpRS, y opcionalmente un antagonista de integrina. Mediante elección como blanco e inhibición de tres rutas angiogénicas separadas, se obtiene inhibición casi completa de angiogénesis en dos modelo separados de angiogénesis. Le inhibición completa de neovascularización puede ser importante para el tratamiento efectivo de enfermedades relacionadas con angiogénesis utilizando terapias angiostáticas. En los modelos de la presente invención, incluso los mejores resultados provenientes de inyecciones de monoterapia generalmente bloquean solamente el 50-75% de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Esto significa que en la mayoría de los casos, aún se desarrolla una cantidad significativa de neovascularización. En contraste, dos tercios de las retinas de ratón neonato inyectadas con la terapia de combinación triple tienen inhibición de formación neovascular completa al 100% (Tabla 13) . De igual manera, en el modelo OÍR de angiogénesis patológica, una porción grande de los ratones tratados demuestra poca o ninguna formación de penacho neovascular patológico (Figura 58). Durante el tratamiento de cáncer, podrían ser necesarios niveles elevados de inhibición de angiogénesis para ocasionar la inanición completa de las células de tumor y evitar el crecimiento adicional del tumor. Las monoterapias que solamente inhiben el 50% de crecimiento neovascular probablemente sólo reduzcan, en lugar de eliminar, el oxígeno y los nutrientes disponibles para las células de tumor que crecen rápidamente. Aunque esto inicialmente podría desacelerar el crecimiento, podría no ser suficiente para evitar el crecimiento adicional del tumor. En estos casos, las terapias de combinación que pueden lograr la inhibición completa de neovascularización podrían mejorar en gran manera los resultados de las terapias anti-angiogénicas durante los tratamientos de cáncer. Además, utilizando dosis relativamente bajas al tiempo que se mantiene el potencial angiostático fuerte, se puede reducir al mínimo la posibilidad de efectos secundarios adversos generados por los tratamientos angiostáticos. Juntos, los datos anteriores demuestran la utilidad benéfica de combinar moléculas angiostáticas diferentes para el tratamiento de neovascularización asociada con la enfermedad. Las composiciones de la presente invención, que comprenden un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) , un inhibidor de señalización de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) , y un inhibidor de señalización de integrina, y los métodos de uso de las mismas, proveen un régimen de tratamiento novedoso y sorpresivamente eficaz para enfermedades neovasculares, en particular para enfermedades neovasculares del ojo.

EJEMPLO 14 Tratamiento de un tumor El glioblastoma multiforme es un tumor cerebral maligno incurable, normalmente fatal dentro de un año de la diagnosis. Se utiliza la línea celular 9L de gliosarcoma de rata como un modelo para gliomas malignos. En ambas formas de glioma, el tumor está altamente vascularizado y se infiltra dentro del tejido cerebral normal. El animal no tratado que recibe un bolo de células 9L intra-cerebralmente tiene un tiempo de supervivencia de aproximadamente 3 semanas, una vez que se implantan las células de tumor. En el día 0, los tumores 9L intracerebrales se establecen mediante inoculación estereotáctica de aproximadamente 50,000 células en aproximadamente 2 µl de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Life Technologies, Gaithersburg, MD) en el lóbulo frontal derecho de ratas Fisher CD 344 que previamente han sido anestesiadas con cetamina y xilazina. En el día 6, se inyecta en forma estereotáctica un bolo de 10 µl de una composición de la invención (4.5 mg/l de T2-TrpRS, 30 mg/l del compuesto (1) , y 6 mg/l del compuesto (2) ; pegaptanib sódico) durante un lapso de 2 minutos aproximadamente en la misma región del cerebro en la que se implantaron las células 9L. Después de inyectar el bolo, se inserta una bomba en una cavidad subcutánea entre los omóplatos. Se inserta un catéter conectado mediante tubería a la bomba en el mismo agujero barrenado que se hace para introducción de las células 9L, y se fija en su lugar. Cada bomba tiene una velocidad de flujo de aproximadamente 8 µl por hora. Se bombea continuamente una cantidad adicional de la composición de la invención dentro del cerebro de cada animal durante 24 horas aproximadamente. El bombeo continuo distribuye la composición a través del hemisferio completo del cerebro en el cual se han implantado las células de tumor. Nueve ratas reciben la composición de la invención y nueve ratas reciben solamente PBS como un grupo de control . En el día 13, se hace una incisión entre los omóplatos, y la bomba se retira y se reemplaza con una bomba nueva. El tratamiento con la composición de la invención o PBS se reanuda durante 24 horas adicionales con la bomba nueva a las mismas velocidades de flujo de bombeo. Se presenta un incremento de 21 por ciento en la supervivencia para ratas tratadas con la composición de la invención en comparación con el grupo de control tratado con PBS (véase Figura 60) . Se pueden efectuar numerosas variaciones y modificaciones de las modalidades descritas anteriormente sin alejarse del alcance y campo de las características novedosas de la invención. No se pretenden o se deben inferir limitaciones con respecto a las modalidades específicas ilustradas en la presente invención.

Claims (36)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Una composición apropiada para tratar una enfermedad neovascular, la cual comprende un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y un agente terapéutico.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene un tamaño molecular de no más de 48 KDa aproximadamente.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene un tamaño molecular de no más de 46 KDa aproximadamente.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene un tamaño molecular de no más de 43 KDa aproximadamente.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene una secuencia de residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el agente terapéutico comprende por lo menos un agente anti-angiogénico que se selecciona a partir del grupo que consiste de un aptámero de VEGF y un antagonista de integrina angiostático.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque dicho por lo menos un agente anti-angiogénico comprende un aptámero de VEGF-165.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el aptámero de VEGF-165 es un aptámero de VEGF-165 de tipo 2' -fluoropirimidina basado en ARN.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el aptámero de VEGF-165 de tipo 2 ' -fluoropirimidina basado en ARN es pegaptanib sódico.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque dicho por lo menos un agente anti-angiogénico comprende un antagonista angiostático, peptidomimético de integrina avß3 o integrina avß5.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el antagonista peptidomimético de integrina avß3 o integrina avß5 es un compuesto que tiene la fórmula del compuesto (1) :

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente terapéutico comprende por lo menos un agente que se selecciona a partir del grupo que consiste de un esferoide angiostático, un agente antineoplásico, un agente antibacteriano, un agente antiviral, y un agente antiinflamatorio .

13. Una composición que comprende un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos un agente anti-angiogénico que se selecciona a partir del grupo que consiste de un aptámero de VEGF y un antagonista de integrina angiostático.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene la secuencia de residuo de aminoácido de SEQ ID N0:1 o SEQ DD NO: 2.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dicho por lo menos un agente anti-angiogénico comprende un aptámero de VEGF-165.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el aptámero de VEGF-165 es un aptámero de VEGF-165 de tipo 2'-fluoropirimidina basado en ARN.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el aptámero de VEGF-165 de tipo 2' -fluoropirimidina basado en ARN es pegaptanib sódico.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque dicho por lo menos un agente anti-angiogénico comprende un antagonista angiostático de integrina avß3 o integrina avßs.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el antagonista angiostático de integrina avß3 o integrina avß5 tiene la fórmula del compuesto (1) :

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque dicho por lo menos un agente anti-angiogénico comprende pegaptanib sódico y tiene la fórmula del compuesto (1) :

21.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, que comprende también por lo menos un agente terapéutico que se selecciona a partir del grupo que consiste de un esferoide angiostático, un agente antineoplásico, un agente antibacteriano, un agente antiviral, y un agente anti-inflamatorio.

22.- La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS es un dímero.

23.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fragmento angiostático de TrpRS es un dímero.

24.- Un método para el tratamiento de una enfermedad neovascular, el cual comprende administrar a un mamífero que padece de una enfermedad neovascular una cantidad inhibidora de desarrollo vascular de una combinación de fármacos que comprende un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste de un inhibidor de señalización del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de señalización de integrina.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene una secuencia de residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4; el inhibidor de señalización del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es pegaptanib sódico; y el inhibidor de señalización de integrina es un compuesto que tiene la fórmula del compuesto (1) :

26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el mamífero es un humano .

27.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la enfermedad es una enfermedad neovascular retiniana.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la combinación de fármacos se administra mediante inyección intra-vítreo en el ojo de un mamífero que padece de una enfermedad neovascular retiniana.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la enfermedad se selecciona a partir del grupo que consiste de una retinopatía isquémica, una hemorragia vascular, una fuga vascular, una coroidopatía, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, presunta histoplasmosis ocular, retinopatía de premadurez, anemia de célula falciforme, y retinitis pigmentosa.

30.- Un método para el tratamiento de un tumor, que comprende administrar a un mamífero que padece de un tumor una cantidad inhibidora de desarrollo vascular de una combinación de fármacos que comprende un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste de un inhibidor de señalización de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de señalización de integrina.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el fragmento angiostático de TrpRS tiene una secuencia de residuo de aminoácido que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, y SEQ ID NO: 4.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el inhibidor de señalización del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es pegaptanib sódico.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el inhibidor de señalización de integrina es un compuesto que tiene la fórmula del compuesto (1) :

34.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el mamífero es un humano .

35.- Una composición farmacéutica que comprende una composición de conformidad con la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma.

36.- Una composición farmacéutica que comprende una composición de conformidad con la reivindicación 13, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la misma. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones y métodos para tratar enfermedades neovasculares, tales como enfermedades neovasculares retinianas y tumores, administrando a un paciente que padece de una enfermedad o tumor neovascular una cantidad inhibidora de desarrollo vascular de una combinación de los fármacos supresores de angiogénesis que comprenden un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste de un inhibidor de señalización del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de señalización de integrina. Las composiciones para uso en los métodos incluyen una mezcla íntima de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) y por lo menos uno de un inhibidor de señalización del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y un inhibidor de señalización de integrina, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. T2-TrpRS (SEQ ID NO: 1) MSAKGIDYDKLIWFGSSKIDKE INRIERATGQRPHHFLRRGIFFSH^ HVGHLIPFIFTKWLQDVFOTPLVIQ T^^ FYKN KIQKHVTFNQV GIFGFTDSDCIGKISFPAIQAA^^ APRIGYPKPA HSTFFPALQGAQTKKISASDPNSSIF TDTAKQIKTKvlTKHAFSGGRDTIE?HRQFGGNCDVDVSF MYLTFFLEDDDK EQIRKDYTSGANILTGELKKA^^ T2- rpRS -GD (SEQ ID NO: 2) o MSAKGIDYDiaiVRFGSSKIDKE INRIERATGQRPHHFLRRGIFFSHRDMNQVLDAYENiOCPFYLYTGRGPSSE FYKNVVKIQKHVTFNQVKGIFGFTDSDCIGKISFPAIQAAPSFSNSFPQIFRDRTDIQCLIP<^IDQDPYFRMTRDV APRIGYPKPA LHSTFFPALQGAQT MSASDPNSSIFLTDTAKQIKTKVNKHAFSGGRDTIEEHRQFGGNCDVDVSF YLTFFLEDDDKLEQIRKDYTSGAiiLTGELKKALIEV QP IAEHQARRKEV^ FIG.1