MXPA06012391A - Inhibidores de caspasa-2 y sus aplicaciones biologicas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a nuevos inhibidores de caspasa-2 selectivos que reconocen la caspasa-2 y previenen y bloquean su actividad en base al siguiente elemento principal: 2,6-difluorofenil ester 2-Quinolinilcarbonil-L-Valinil-L-Aspartil(ester de metilo)-L-Valinil-L-Alaninil L-Aspartil(ester de metilo) (SEQ1) y derivados del mismo, SEQ 1 correspondiente a las formulas (Ia) o (Ib). La aplicacion de dichos inhibidores para prevenir y tratar enfermedades que incluyen caspasa-2.

Description

INHIBIDORES DE CASPASA-2 Y SUS APLICACIONES BIOLÓGICAS La invención se refiere a inhibidores de caspasa-2 y sus aplicaciones biológicas, particularmente para el tratamiento de isquemia cerebral global y focal.

I/CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención está en el campo de biología medicinal y química y se refiere a nuevos compuestos, y composiciones farmacéuticas, que inhiben caspasa-2 pro-apoptótica (Nedd-2; Ich-1) , para tratar enfermedades y lesiones donde la actividad de caspasa-2 se implica. De manera más precisa: (a) La invención se refiere a medios, métodos y productos, para bloquear, prevenir o tratar muerte celular, particularmente muerte celular cerebral in vivo . (b) La invención se refiere al descubrimiento de que la caspasa-2 es un punto de verificación principal corriente arriba para inhibición de muerte celular neuronal (especialmente apoptosis) in vi tro y en situación patológica in vivo incluyendo lesiones por hipoxia-isquemia (H-I) cerebral y situaciones como apoplejía que resultan en daños cerebrales (en neuronas u otras células no neuronales) : por ejemplo, MCAO (Oclusión de Arteria Cerebral Media) , global (como una consecuencia de reducción del flujo sanguíneo o hipoxia durante paro cardiaco o lesiones cardiovasculares) o focal, transitoria o permanente, adulto o H-1 neonatal, isquemia con o sin hipoxia y/o hipoglicemia, H-1 con o sin reperfusión. (c) La invención se refiere al descubrimiento que inhibidores de caspasa-2 selectivos (por ejemplo, Qco-VDVAD-dfp) previenen o disminuyen muerte celular cerebral in vivo. (d) La invención se refiere al descubrimiento de que los inhibidores de caspasa-2 selectivos (por ejemplo, Qco-VDVAD-dfp) previenen o disminuyen muerte celular cerval en situaciones patológicas in vivo incluyendo lesiones isquémicas después de H-I neonatal transitoria focal. (e) La invención se refiere al descubrimiento de que inhibidores de caspasa-2 selectivos (por ejemplo, Qco-VDVAD-dfp) previenen o disminuyen muerte celular cerebral en situaciones patológicas in vivo incluyendo isquemia de adulto global cerebral después de hipoxia por reducción de flujo sanguíneo durante paro cardiaco o lesiones cardiovasculares. (f) La invención se refiere a nuevas aplicaciones para nuevos inhibidores de caspasa-2 específicos incluyendo suministro local (intracerebroventricular, intrahipocampal , por ejemplo) o administración sistémica (intraperitoneal, intravenosa....) para reducir muerte celular cerebral durante situaciones patológicas en las cuales el flujo sanguíneo y presión de oxígeno se perturban, es decir, isquemia global o focal cerebral (transitoria o permanente) .

II/DATOS QUE SOPORTAN LA INVENCIÓN La invención se refiere a medios, métodos y productos, para bloquear, prevenir o tratar muerte celular, particularmente muerte celular neuronal . Muerte celular neuronal ocurre durante la embriogénesis para remover exceso de neuronas para asegurar conexiones pre- y post -sinápticas apropiadas y para permitir la formación de un cerebro adulto funcional . Además de la muerte post -mitót ica relacionada con el envejecimiento normal, los factores mutacionales genéticos o ambientales pueden inducir muerte neuronal en el humano adulto durante lesiones agudas (por ejemplo, hipoxia- isquemia , apoplejía, lesión de médula espinal, trauma) o enfermedades neurodegenerativas crónicas. La muerte celular asociada con estos desordenes puede ocurrir por tres mecanismos distintos, mostrando características morfológicas y bioquímicas de necrosis, autofagia o apoptosis. Ambas muertes neuronales, fisiológicas y patológicas, con frecuencia se asocian con regulación de apoptosis defectuosa y trayectorias de señalización que conducen a este mecanismo de suicido celular activo pueden dividirse en trayectorias dependientes de proteasa específica (caspasa) de aspartato de cisteinilo contra independientes de caspasa en células de mamífero. Apoptosis neuronal es un mecanismo de suicidio celular activo que puede dividirse en fases secuenciales , incluyendo inicio, decisión, ejecución y degradación. Esta cascada de eventos se maneja por la activación de una maquinaria específica, que incluye tanto la activación de las proteasas específicas de aspartato (caspasas) dependientes de cisteína y el mitocondrión que puede actuar como un organelo regulador decisivo (o amplificador) . En realidad, las alteraciones mitocondriales incluyen pérdida de gradiente electroquímico de la membrana interior mitocondrial (??m) y liberación de factores apoptogénicos tales como citocomo c, Smac/Diablo y Factor Induciendo Apoptosis. Una vez liberados de mitocondria, estos efectores accionan el desmantelado nuclear y citoplásmico independiente de caspasa y/o dependiente de caspasa. Por lo tanto, los factores mitocondriales combinados con caspasas contribuyen a la fase de degradación de apoptosis, resultando en encogimiento celular, condensación nuclear, emisión de cuerpos apoptóticos y apariencia de señales de "cómeme" tales como transubicación de serinas de fosfatidilo a la hojuela exterior de la membrana de plasma antes de fagocitosis. La contribución respectiva de mitocondria, caspasas y otros eventos durante apoptosis neuronal in vi tro o in vi vo aún no resulta, particularmente con respecto a lesiones similares a apoplejía o isquémicas. Como se ilustra, los inventores proporcionan medios útiles y moléculas permitiendo inhibir actividad de caspasa-2 in vi tro y in cell ul a , al utilizar ensayos de caspasas in vi tro específicos y privación de suero en cultivo neuronal como un modelo experimental relevante a isquemia in vi vo .

Los nuevos inhibidores de caspasa-2 selectivos de la invención, que reconocen caspasa-2 y previenen y bloquean su actividad, se basan en la siguiente estructura: 2 -Quinolinilcarbonil-L-Valinil -L-Aspartil (éster de metilo) -L-Vanilil-L-Alaninil -L-Aspartil (éster de metilo) 2,6-difluorofenil éster (SEQl) . Una molécula preferida corresponde a SEQ 1. Otras moléculas preferidas comprenden estructuras II dos XIX como se indican, particularmente, en las Tablas 1 a 14. Otro objeto de la invención es proporcionar nuevos productos (moléculas o formulaciones) que inhiben actividad de caspasa-2 pro-apoptótica e inducen citoprotección . Otro objeto de la invención es proporcionar productos y composiciones farmacéuticas y métodos de tratamientos de enfermedades y lesiones donde la caspasa-2 se incluye . Los inventores han desarrollado péptidos específicos farmacológicos, preferentemente pero no exclusivamente moléculas a base de pentapéptido , para inhibición directa de actividad de caspasa-2 para atenuar muerte celular in vi tro e in vi vo mediada por caspasa-2. Tales inhibidores son capaces de prevenir o bloquear la actividad de caspasa-2 en muerte celular. Dichas células son neuronas, o células neuronales, o células no neuronales. Los inhibidores definidos arriba son útiles para inhibición in vi vo de actividad de caspasa-2 para proporcionar efecto neuroprotector o cerebroprot ector . También son útiles para inhibición in vi vo de actividad de caspasa-2 para proporcionar efecto citoprotector . De acuerdo a un aspecto, la invención se refiere a un método para prevenir muerte celular en el cerebro después de lesiones isquémicas (globales o focales) . Como se ilustra por los ejemplos, la invención proporciona medios, métodos y productos, para bloquear o prevenir o tratar muerte celular, particularmente en el cerebro lesionado (isquémico) . Como se ilustra, los inventores demuestran que el inhibidor de caspasa-2 específico (dosis inyectada intraperitoneal única) induce reducción de infarto importante en lesión cerebral de hipoxia- isquemia transitoria neonatal. La reducción de volumen de infarto se obtiene cuando la administración del inhibidor de caspasa-2 antes o después del inicio isquémico. Los efectos ci toprotectores proporcionados por el inhibidor no se median por regulación de temperatura (hipo o hipertérmico ) . Pero la actividad de caspasa-2 in vi vo o procesamiento de caspasa-2 se elimina después de la inyección del inhibidor. Como se ilustra, los inventores demuestran que la administración intracerebroventricular (ICV) específica de inhibidor de caspasa-2 (dosis única) resulta en incremento parcial de coloración de intensidad de Cresil -Violeta , ausencia de toma de Fluoro Jade B en células dañadas, una mejora o conservación de morfología nuclear (Hoechst 33342) así como también una mejora considerable en la conducta de ratas tratadas con inhibidor (realimentación postisquemia: puntuación más alta en pruebas considerando actividad y reactividad espontánea) . Los efectos citoprotectores y conductuales proporcionados por el inhibidor no se median por regulación de temperatura (hipo o hipotérmico) .

De acuerdo con otro aspecto, la invención también se refiere a moléculas capaces de prevenir actividad de caspasa-2 y composiciones farmacéuticas útiles para tratar enfermedades y lesiones donde la caspasa-2 se incluye. Las moléculas sintetizadas se introducen en humano o animal, bajo condiciones para inhibición de caspasa-2. La etapa de introducción comprende modificaciones químicas de moléculas como vehículos adecuados o se realiza por inyección . De acuerdo con lo anterior, es otro objeto de la invención proporcionar composiciones farmacéuticas conteniendo inhibidores de caspasa-2 específicos . Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un inhibidor de caspasa-2 como se define arriba, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de inhibidores se realiza (pero no se limita a) por suministro oral, nasal, local (intracerebroventricular , intrahipocampal , u otro intracerebral , implantación intracerebral de instrumentación para suministro mecánico tal como de Gelfoam® impregnado con compuestos o composiciones farmacéuticas, por ejemplo) o vía sistémica (intraperitoneal, intravenosa...), o suministro intracerebral o como aerosol para reducir muerte celular cerebral in vi vo . La invención también se refiere al uso de dichos inhibidores de caspasa-2 para hacer fármacos para prevenir o tratar patologías incluyendo actividad de caspasa-2. Las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para prevenir, reducir y tratar patologías con muerte celular, particularmente en lesiones por H-I y lesiones cerebrales en situaciones similares a apoplejía: por ejemplo, H-I (isquemia con o sin hipoxia/hipoglicemia), global o focal, transitoria o permanente, adulta o neonatal con origen en nivel cerebral o cardiaco, con o sin reperfusión, o MCAO (Oclusión de Arteria Cerebral Media) . Las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para: prevenir y/o tratar apoptosis durante enfermedades degenerativas crónicas, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia espinobulbar , enfermedad de prión, demencia, o - prevenir y/o tratar apoptosis de pericito retinal, glaucoma de apoptosis de neuronas retínales, daños retínales resultantes de isquemia local, retinopatía diabética, o prevenir y/o tratar epilepsia, o - prevenir y/o tratar apoptosis durante lesión de médula espinal, o para prevenir y/o tratar apoptosis resultante de lesión cerebral traumática, isquemia retinal o prevenir y/o tratar apoptosis durante situaciones patológicas de isquemia cerebral focal, o proporcionar efecto cerebroprotector , prevenir y/o tratar apoptosis mediada por célula asesina natural y célula T citotóxica asociada con enfermedad autoinmune y rechazo de transplante, o prevenir y/o tratar muerte celular de células cardiacas incluyendo falla . cardiaca, cardiomiopat ía , infección viral o infección bacteriana del corazón, isquemia miocardial, infarto miocardial, e isquemia miocardial, injerto de by-pass de arteria coronaria, o prevenir y/o tratar toxicidad de fármaco mitocondrial, por ejemplo como un resultado de quimioterapia o terapia de VIH, prevenir y/o tratar muerte celular durante infección viral o infección bacteriana, o prevenir y/o tratar inflamación o enfermedades inflamatorias, enfermedad de intestino inflamatorio, sepsis y ataque séptico, o prevenir muerte celular de etapas de folículo a ovocito, de etapas de ovocito a huevo maduro y esperma (por ejemplo, métodos para congelar y transplantar tejido ovárico, fecundación artificial), o conservar fertilidad en mujeres y hombres después de quimioterapia, o conservar fertilidad en animales hembra y macho, o para prevenir y/o tratar, degenerescencia macular y glaucima, o para prevenir y/o tratar hepatitis aguda, hepatitis activa crónica, hepatitis B, y hepatitis C, o prevenir y/o tratar pérdida de cabello, y dicha pérdida de cabello debido a calvicie de patrón macho, radiación, quimioterapia o tensión emocional, o tratar o mejorar el daño de la piel (debido a exposición a alto nivel de radiación, calor, quemaduras, químicos, sol, y enfermedades autoinmunes) , o prevenir muerte celular de células de médula ósea en síndromes mielodisplásticos (MDS), o - prevenir y/o tratar pancreatisis , o prevenir y/o tratar síndrome respiratorio, o prevenir y/o tratar osteoartrit is , artritis reumatoide, soriasis, glomerulonefrit is , - ateroesclerosis, y enfermedad de injerto contra huésped, o prevenir y/o tratar estados de enfermedad asociados con un incremento de apoptosis, o - prevenir muerte celular en vegetales (por ejemplo: plantas, flores, talofitos (hongos, alga marina) ... ) . El término "tratamiento o tratar" como se utiliza en la presente significa un planteamiento para obtener resultados benéficos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Los resultados clínicos benéficos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más síntomas o condiciones, disminución de grado de enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de enfermedad, prevenir difusión de enfermedad, retraso o disminución de progresión de enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total) , ya sea detectable o indetectable . "Tratar" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. La invención también se refiere a método de tratamiento de patologías con muerte celular, particularmente isquemia y lesiones por apoplejía, comprendiendo la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica tal como se define arriba. Características y ventajas precisadas de la invención se dan en los siguientes datos con referencia a las figuras, que representan: III/PÉPTIDOS E INHIBIDORES DE PSEUDOPÉPTIDOS DE CASPASA-2 1. Qco-VDVAD-dfp Qco-VDVAD-dfp (SEQ1) es un pseudopéptido (MW: 827) que inhibe selectivamente caspasa-2 in vi tro recombinante de humano (IC50= 80 nM) pero no otras cisteínas -proteasas . Combina VDVAD de pentapéptido ( (L-Valinil-L-Aspartil-L-Vanilil -L- Alaninil-L-Aspartil substituido en residuos de aspartato por porciones de grupos 0-metilo (OMe) ) , quinolinilcarbonil y estructuras de éster de 2,6- difluorofenil . Su fórmula es la/Ib de acuerdo a la posición del VD (OMe ) VAD (OMe ) -Oph substituido en el núcleo de quinolina: por ejemplo, 2- Quinolinilcarbonil -L-Valinil -L-Aspartil (éster de metilo) -L-Vanilil-L-Alaninil-L-Aspartil (éster de metilo) 2 , 6-difluorofenil éster (II, n=0) . la Ib ?? = O, I II 2 -Quinolinilcarbonil -L-Val inil-L-Aspartil (éster de metilo) -L-Vanilil -L-Alaninil - -Aspartil (éster de metilo) 2 , 6 -difluorofenil éster=SEQl 2. Modificación de cadenas laterales de aminoácido y grupos funcionales Otros nuevos inhibidores de caspasa-2 selectivos de la invención se basan en estructura III de abajo: III en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido es ya sea L o D ; (ii) R1 y R2 son un átomo de hidrógeno, átomo de deuterio, arilo C?_2o alifático, substituido o nosubstituido , cicloalquilo, naftilo, naftilo substituido, 2 -benzoxazolilo , 2-oxazolilo substituido, (CH ) ncicloalquilo , ( CH2) nfenilo , (CH2)nfenilo substituido, (CH2)n(l- o 2-naftilo), (CH2) nheteroarilo, CH2N2 , CH2Y, OH, OR, NH2 NHR, NR2, SR, COR, C02R, CONR2 , CH2OCOR, CH20-CO arilo, CH20-C(0) arilo substituido (ej: 2,6-dimetilbenzoiloximetil ) , CH20-C(0) arilo substituido, CH20-C(0) heteroarilo, CH20-C(0) heteroarilo substituido o CH20P0R2; o (iií) R3 , R4 , R5 y R6 son las cadenas laterales de uno de los veinte aminoácidos (excluyendo cisteína) . Por ejemplo, los pentapéptidos también pueden ser análogos de Leu-Asp-Glu- Ser-Asp . R3 , R4 , R5 y R6 son también C?_20 alifático, cicloalquilo, naftilo, naftilo substituido, 2-benzoxazolil , 2-oxazolilO substituido, (CH2) nCicloalquilo, (CH2 ) nfenilO , (CH2)n fenilo substituido, (CH2)n(l- ° 2-naftilo) , (CH2) nheteroarilo, CH2N2 , (CH2)nZ, CH2OCOR, CH2OCO (arilo) , CH2OCO (arilo substituido) , CH OCO (heteroarilo) , CH2OCO (heteroarilo substituido) o CH2OPOR2; (iv) R7 es un átomo de hidrógeno y R8 es R, U, CO(CH2)nNH(U) , C0(CH2)nS(U) (v) U es (no ) substituido (2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8 - ) quinolinilo , alquilo de cadena recta o ramificada C?-20, ( CH2) ncicloalquilo , (CH2 ) nfenilo , (CH2)n fenilo substituido, (CH2)n(l- o 2- naftilo), (CH2) nheteroarilo , o un grupo marcador tal como marcadores de fluoróforo o marcadores útiles en microscopía electrónica; particularmente, biotin, dinitrofenil (DNP) , yodoacetamidas , DTNB , COR (ej. 2-quinolinilcarbonilo) , COOR, CO (CH2) nNH ( Z) , derivados de Acridina (rojo, amarillo, naranja....) , derivados de Fluoresceina (fluoresceina , FITC, FAM (carboxifluoresceina) , 5- (y-6) -carboxinaftof iuoresceina , carboxifluoresceina, BCECF, naptofluoresceina ....), tintes Oregon Green® (2', 7'-dif luorofluorescein) (Oregon Green® 488, Oregon Green® 514...), BODIPY® (4 , 4 -difiuoro- 5 , 7-dimet il -4 -bora-3a, 4a- ácido diaza- s- indaceno-3 -propiónico) dyes (BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 630/650, BODIPY 630/665 ), Bimane, derivados de Coumarin (aminometilcoumarin (AMC) , AMCA, aminocoumarin, diet ilaminocoumarin hidroximetil coumarin; hidroxicoumarin, metoxicoumarin, AFC, ...), derivados de Cianin (ficocianin, alof icocianin (APC) , CY3.18, CY5.18, Cy2 , Cy3 , Cy3.5 , Cy5 , Cy5.5 , Cy7... ) , derivados de Erit in/Ficoeritrin (R-Ficoeritrin (PE), B-Ficoeritrin ...) , conjugados APC/PE-Cy (conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, conjugados APC-Cy7....), derivados de Calcein (calcein, SNAFL calcein .... ) , DANS , DANSA, Azul Cascada, amarillo Lucifer, NBD , Rojo 613, FluorX, derivados de Rodamina (Rodamina 123, Rodamina 110, Rodamina B, Rodamina 6A, Rodamina 6G, TRITC, X-Rodamina, sulforodamin, Rodamina Rojo-X, Lissamine™ rodamina B, DHR, Rodamina Verde....) , PerCP, Texas Rojo, TruRed, Alexa Fluor® (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750....), derivados de Q-DOTs™ (655,605, 585,525, ...), SNARF, derivados de Zenon™ (Zenon™ Alexa Fluor® 350, Zenon™ Alexa Fluor® 488, Zenon™ Alexa Fluor® 555, Zenon™ Alexa Fluor® 594, Zenon™ Alexa Fluor® 647, Zenon™ Aloficocianin, Zenon™ Biotin-XX, Zenon™ R-Ficoeritrin, ); NBD, Texas Red®, tintes QSY® (QSY® 7, QSY® 9, QSY® 35, QSY® 21), Hoechst (33342, 33258), DAPI, Cromomicin A3 , Mitramicin, SYTOX (Azul, Verde, Naranja) , Etdio, Etidio Bromuro, 7-AAD, tintes TOTO, tintes YOYO, tintes TO-PRO, tintes BOBO, tintes JO-PRO, tintes LO-PRO, tintes PO-PRO, tintes YO-PRO, Tiazol Naranja, Yoduro de Propidio (PI), LDS 751, tintes Indo® (Indo-1...) , tintes Fluo® (Fluo-3...), DCFH, pNA, SYBR verde II, SyPro (Naranja, Rubí), EDANS, IR800, Dil, DiO, DiD, derivados de SNARF®, tintes Fura, tintes QUIN, partículas NANOGOLD, maleimida NANOGOLD, AlexaFluor FluoroNANOGOLD, AlexaFluor FluoroNANOGOLD s treptavidin , malaquita verde, Dabcil, Dabsil, amarillo cascada, dansil, Dapoxil, PyMPO, Pireno, derivados de benzoxadiazola , microesferas fluorescentes marcadas con strepavidin-/neutravidin- ) biot in, conjugado de fluorescein alojado en CMNB de s treptavidin, calcofluor blanco, rojo nilo, Y66F, Y66H, EBFP, GFP tipo silvestre, mutantes QFP H9/P4/P9/P1 l/W, GFPuv, ECFP, Y66W, S65A, S65C, S65L, S65T, EGFP, EYFP, ECFP, DsRedl, DsRed2 , partículas NANOGOLD®, streptavidin-Nanogold® , Monomaleido Nanogold®, Mono-Sulfo-NHS-Nanogold® , Monoamino Nanogold®, Nanogold® positiva/negativamente cargado (NN, NHSN, NHSNA, NHSNS) , Nanogold® no funcionalizado , Monomaleido Nanogold®, Mono-Sulfo-NHS-Nanogold® , Monoamino Nanogold®, Nanogold® no funcional, conjugados Nanogold®, Nanogold®- streptavidin, lípido-Nanogold (Palmitoil Nanogold®, DPPE Nanogold®, Palmitoil Undecagold, DPPE Undecagold) , Ni-NTA-Nanogold® , Alexa Fluor® 488 FluoroNanogold , Alexa Fluor® 594 FluoroNanogold, Fluorescein FluoroNanogold, HRP substrato-Nanogold. (vi) R7 y R8 también se toman juntos con el nitrógeno de intervención para formar un anillo heterocíclico tal como tetrahidroquinolina substituda o no substituida, tetrahidroisoquinolina , dihidroacridina , benzazepina, pirrolidina, morfolina, tiomortolina , piperazina, piperidina, dihidropiridina, benzimidazola , imidazola, imidazolina, pirróla, pirrolidina, pirrolina, pirazola, pirazolina, pirazolidina, triazola, piperidina, morfolina, tiomorfolina, piperazina, carbazola, fenotiazina, fenoxazina, dihidrofenazina , dihidrocinolina , dihidroquinoxalina , dihidronafthiridina , tetrahidronaftiridina, dihidroacridina , indola, isoindola, dihidroindola , indolina, indazola, purina, 9 , 10 -dihidrofenantrídina , 5H-dibenzo [b, f ] azepina, 10,11 -dihidro - 5H-dibenzo [b, f] azepina, ß-carbolina, pirido[4,3-b] indola, 2 , 3 , 9 - triazofluoreno , 9-tia-2,10-diazaantraceno, tieno [3, 2b] pirróla, dihidrofenantrina . (vii) R es un átomo de hidrógeno, grupo alifático C?_20, arilo, arilo substituido (ej: 4- nitrofenilo o derivados de coumarina) , hetetoarilo (ej . 2-piridina) , heteroarilo substituido, cicloalquilo, naftilo, naftilo substituido, ( CH2 ) ncicloalquilo , (CH2) nfenilo , (CH2)n fenilo substituido (ej: 2,6-dihalofenilo) , (CH2)n(l- o 2- naftilo), (CH2)n heteroarilo o (no) substituido (2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8-) quinolinilo, f luorenmet ilo ; (viii) Y es un grupo de salida electronegativo incluyendo halógenos tales como grupos F, Cl , Br o I, arilo o alquilosulfoniloxi , trifluorometanosulfoniloxi , OR, SR, COOR, 0P(0)R2 en donde R es un grupo alifático, un grupo arilo, un grupo aralquilo, un grupo carbocíclico , un grupo carbocíclico de alquilo, o un grupo heterocíclico; (ix) Z es un halógeno (F, Cl , Br o I), CN, OH, OR, NH2, NHR, NR2, SR, COR, C02R, C0NR2 , (x) n es 0 a 20; Como se utiliza en la presente, las siguientes definiciones deben aplicarse al menos que se indique de otra manera. Las abreviaciones Q y OPH son para quinolinilcarbonilo y 2,6-difluorofenoxi respectivamente. El término "alifático" en la presente significa hidrocarburos C?_20 ramificados o de cadena recta que se saturan completamente o que contienen una o más unidades de insaturación . El término "alquilo" utilizado solo o como parte de una porción más grande se refiere tanto a cadenas rectas como ramificadas conteniendo uno a veinte átomos de carbono. El término "arilo" se refiere a grupos de anillo aromático policíclico o monocíclico teniendo cinco a catorce átomos, tales como fenilo, naftilo o antrilo. El término "grupo heterocíclico" se refiere a sistemas de anillo monocíclico o policíclico saturado o no saturado conteniendo uno o más heteroátomos y un tamaño de anillo de tres a nueve tales como furanilo, tienilo, pirrolilo pirrolinilo, pirrolidinilo, dioxolanilo oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, imidazolinilo imidazol idinilo , pirazolilo, pirazolinilo pirazolidinilo , isoxalolilo, isotiazolilo oxadiazolilo , dioxanilo, morfolinilo, ditianilo t iomorfolinilo , piridazinilo , pirimidinilo pirazinilo, piperazinilo, triazinilo, tritianilo indolizinilo , indolilo, isoindolilo, indolinilo benzofuranilo, benzotiofenilo , indazolilo benzamidazolilo , benztiazolilo , purinilo quinolizinilo, quinolinilo, isoquinolinilo cinolinilo, eftalazinilo , quinazolinilo quinoxalinilo , 1 , 8 -naft iridinilo , pteridinilo quinucl idinilo , carbazolilo, acridinilo fenazinilo, fenotiazinilo , o f enoxazinil . "Heteroarilo" se refiere a un anillo heterocíclico que es aromático. El término "grupo carbocíclico " se refiere a sistemas de anillo de carbono policíclico o monocíclico no saturado de tres a catorce carbonos que pueden fusionarse con grupos arilo o heterocíclico. Un alifático, alquilo, arilo, heteroarilo (ej: quinolina), heterociclilo, o carbociclilo , utilizados solos o como parte de una porción más grande, se refiere a grupos substituidos o no substituidos. Cuando se substituyen, estos grupos pueden contener uno o más subst ituyentes . Estos substituyentes pueden ser halógeno (F, Cl , Br, I), OH, U, CO (CH2) nNH (U) , CO (CH2)nS (U) , OR, SR, NH2/ NHR, NR2 , OCOR, OP(0)R2 en donde R es un grupo alifático, un grupo arilo o substituido, un grupo aralquilo, un grupo carbocí clico , un grupo carbocíclico alquilo, un grupo heterocíclico o un radio-isótopo (ej: I125, H3, S35, C14, P33, P32, Cr51, Ca45, Fe59, Ni63, Ba133, Cs137, Eu152, Ra226, Xe133, tecnetio 99, talio 201) . Filamentos FITC para isotiocianato de fluorescein. 3. Bioisostéros o isósteros de péptido (a) Esta invención también se refiere a análogos carba de la fórmula IV.1 a IV .7 (Tabla 1) en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D; (ii) n, R, R1, R2, R3, R , R5 , R6 , R7, R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 1. Análogos carba de VDVAD de pentapéptido (compuestos IV.1 a IV.7) No ESTRUCTURA (b) La invención también se refiere a análogos de quetometileno de la fórmula V.I a V.7 (Tabla 2) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1 , R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8, U, Y y Z son como se describe previamente. Tabla 2. Análogos de quetometileno de VDVAD de pentapéptido (compuestos V.I a V.7) No ESTRUCTURA (c) La invención también se refiere a análogos de depsi-péptidos de la fórmula general VI y VII en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) X es O o NH y al menos una X un átomo de oxígeno (iii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba (iv) R9 es un átomo de hidrógeno, (2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8-) quinolinilo, alquilo ramificado o de cadena recta C?_20, (CH2 ) ncicloalquilo , (CH2 ) nfenilo , ( CH2) nfenilo substituido, (CH2)n(l- o 2-naftilo), (CH2 ) nhet eroarilo , OCOR o OCNHR.

VI VI? (d) La invención también se refiere a análogos de hidroxietileno de la fórmula VIII.1 a VIII.7 (Tabla 3) , en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 3. Análogos de hidroxietileno de VDVAD (compuestos VIII.1 a VIII.7) No. ESTRUCTURA (e) La invención también se refiere a análogos de pentapéptido de la fórmula IX.1 a IX .6 (Tabla 4) , en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , Rs , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 4. Análogos reducidos de VDVAD (compuestos IX.1 a IX.6) No ESTRUCTURA (f) La invención también se refiere a análogos no saturados de la fórmula X.I a X.7 (Tabla 5) en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , Rs , R7, R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 5. Análogos no saturados de VDVAD (compuestos X.I a X.7) No. ESTRUCTURA 7 4 (g) La invención también se refiere a ß-péptidos, ?-péptidos, urea, y análogos de carbamatos de la fórmula XI .1 a XI .9 (Tabla 6) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) X es CH2, NH, 0 (iii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 6. Análogos no saturados XI .1 a XI .9 No . ESTRUCTURA ? 4. Análogos limitados de pentapéptido de VDVAD La invención también se refiere a análogos limitados de pentapéptido de VDVAD mostrado en las tablas 7 a 14. En estos compuestos el arilo, heteroarilo o heterociclilo se refiere a grupos substituido o no substituido. Cuando es substituido, estos grupos pueden contener uno o más substituyentes. Estos substituyentes pueden ser halógeno (F, Cl , Br, I), OH, U, CO(CH2)nNH(U) , CO ( CH2 ) nS (U) , OR, SR, NH2 , NHR, NR2, OCOR, OP(0)R2 en donde R y U son como se describe arriba. (a) La invención también se refiere a 3-aminopiridin- 2 (1H) -onas, 3 -aminopirazin-2 (1H) -onas , 5 -aminopirimidin-4 (3H) -onas , piridazin-3(2H)-onas, -aminopiridazin-3 (2H) -onas , 5-amino-l,2,4-triazin-6(lH)-onas, 5 - amino -1 ,2,3-triazin-4(3H)-onas y 6-amino-l , 2 , 3 , 4 - tetrazin-5 (4H) -onas XII.1 a XII.15 (Tabla 7) como análogos limitados de pentapéptido de VDVAD en los cuales (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) W, X y Y son CH, C o N; (iii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe previamente. Tabla 7. Análogos limitados de VDVAD (compuestos XII .1 a XII .15) No. ESTRUCTURA (b) La invención también se refiere a 3-aminopiperidin-2 -onas , 3 -aminopiperazin-2 -onas , 5-amino-tetrahidropirimidin-4 (1H) onas, 4-aminopiperazin-3 -onas , 6 -amino- 1,2, 4- triazinan-5 -onas, 5 -amino- 1 , 2 , 4 - triazinan- 6-onas , 5-amino-1 , 2 , 3 - triazinan-4 - onas y 6 -amino-1 , 2 , 3 , 4 -tetrazinan-5-onas XIII.1 a XIII.15 (Tabla 8) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) W, X y Y son CH2 , NH, O o S; (iii) n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 8. Análogos limitados de VDVAD (compuestos XIII .1 a XIII .15) No. ESTRUCTURA 4 (c) Compuestos de esta invención también incluyen 3 -amino-3 , 4-dihidroquinolin- 2 (1H) -onas XIV.1 a XIV.15 (Tabla 9) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6, R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe previamente. Tabla 9. Análogos limitados de VDVAD (compuestos XIV.1 a XIV.15) No ESTRUCTURA (d) La invención también se refiere a 4-amino-l,2-dihidroisoquinolin-3 (4H) -onas XV .1 a XV.15 (Tabla 10) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe previamente . Tabla 10. Análogos limitados de VDVAD (compuestos XV .1 a XV .15 ) No. ESTRUCTURA ? ? (e) La invención también se refiere a 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3 -carboxamidas XVI .1 a XVI.15 (Tabla 11) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6, R7 , R8, U, Y y Z son como se describe previamente. Tabla 11. Análogos de VDVAD limitados (compuestos XVI .1 a XVI .15) No ESTRUCTURA 2 ? (f) La invención también se refiere a 4-amino-1 , 2 , 4 , 5 - tetrahidrobenzo [c] azepin-3 -onas XVII.1 a XVII .15 en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe previamente. Tabla 12. Análogos de VDVAD limitados (compuestos XVII .1 a XVII .15) No. ESTRUCTURA (g) La invención se refiere a 1,2,3,4-tetrahidronaftálenos XVIII.1 a XVIII.15 en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D; (ii) n, R, Ra , R2 , R3 , R4 , R5 , R6, R7, R8, U, Y y Z son como se describe previamente . Tabla 13. Aminoácidos XVIII.1 a XVIII.15 limitados No. ESTRUCTURA (h) La invención también se refiere a 2,3-dihidro-lH-indenos XIX.1 a XIX.15 (Tabla 14) en la cual (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. Tabla 14. Análogos de VDVAD limitados (compuestos XIX.1 a XIX.15) No. ESTRUCTURA ? Dichos inhibidores de caspasa-2 se obtienen ventajosamente por una vía sintética como se ilustra en los ejemplos. Los derivados de la estructura dados en los esquemas 1-3 se obtendrán por el experto en la materia al utilizar métodos clásicos de síntesis química. Otras características y ventajas de la invención se darán a continuación con referencia a las Figuras 1 a 11, que representa, respectivamente : Figura 1: la especificidad in vi tro y eficiencia de Qco-VDVAD-dpf ; Figura 2: la estabilidad de formulación : determinación HPLC. Qco-VDVAD-dfp; Figura 3 : la inhibición selectiva de caspasa-2 por Qco-VDVAD-dfp previene fuertemente la muerte celular e infarto cerebral de neonatos de rata sometidos a lesión cerebral isquémica; Figura 4: la inhibición in vi vo de actividad de caspasa-2 y procesamiento de caspasa-2 por Q-VDVAD-OPH durante lesión cerebral isquémica neonatal; - Figura 5 : la muerte celular en hipocampo y corteza de modelo de ratas isquémicas (4VO) ; Figura 6 : el impacto de isquemia en CA3 , circunvolución dentus (DG) y corteza (COR) ; - Figura 7: la cuantif icación de muerte celular 72 h después de isquemia; - Figura 8 : la no toxicidad de Qco-VDVAD-dfp en ratas no isquémicas; Figura 9 : la neuroprotección por Qco-VDVAD-dfp 72 h después de isquemia (4VO) en el hipocampo de la rata adulto joven; Figura 10: el efecto cuantitativo de Qco-VDVAD-dfp 72 h después de isquemia; y Figura 11: las pruebas fisiológicas y de conducta.

. Qco-VDVAD-dfp es un inhibidor de caspasa-2 selectivo 5.1 Sección experimental 5.1.1 Ensayos de actividad de caspasa in vi tro . Las caspasas recombinantes de humano 1 a (25 U; QuantiZyme™ Assay System, BIOMOL, Plymout, Pennsilvania , USA) se pre-incuban 30 min a 37°C con Qco-VDVAD-dfp en regulador de ensayo (50 mM HEPES, pH 7.4, lOOmM NaCl , 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, lmM EDTA3 10% glicerol) y se mezcla con substratos de caspasa fluorogénica correspondientes (500 µM; BIOMOL) : Ac-YVAD-AMC (caspasa-1), Ac-VDVAD-AMC (Caspase-2), Ac-DEVD-AMC (caspasa-3/7) , Ac- EHD- AMC (caspasa-4/5 ) , Ac-VEID-AMC (caspasa-6), Ac-IETD-AMC (caspasa-8), Ac-LEHD- AMC (caspasa-9) , o Ac-IETD-AMC ( caspasa- 10 ) . El desdoblamiento del substrato se valora en un lector de microplacas de fluorescencia (TECAN, Genios; emisión 510 nm, excitación 405 nm) y valor IC50 se determina de las curvas sigmoides de respuesta a dosis. La actividad específica de cada caspasa se controla internamente con los inhibidores específicos correspondientes (1-2 µM, BIOMOL y MPBioMedical s ) . Otros ensayos in vi tro se realizan en CEREP o con procedimientos CEREP para pruebas a base de granzima y calpainas) . La determinación de IC50 se determina al incubar la concentración creciente de Qco-VDVAD-dfp con caspasa-2 recombinante en 100 µl regulador de ensayo (50 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, lmM EDTA, 10% glicerol) . El desdoblamiento de 50 µM VDVAD-AMC por caspasa-2 recombinante (125 U) se mide después de 30 min a 37°C en un lector de microplacas de fluorescencia al monitorear la emisión de fluorescencia a 510 nm en excitación a 405 nm. 5.1.2 Aislamiento, cultivo de neuronas corticales primarias e inducción de apoptosis. Las neuronas corticales primarias se cultivan de embriones de ratones E14 SWISS (Janvier) . Los ratones se sacrifican por dislocación cervical y los embriones se remueven por cesárea. Las cortezas cerebrales se extraen y los tejidos se trituran mecánicamente 15 veces en medio L15 (Gibco BRL) al utilizar puntas de 1000 µl (Eppendorf ) , los residuos se remueven, y la suspensión de la célula se centrífuga a 850 rpm por 10 min. Las neuronas se colocan por 2 días a una alta densidad (7.105 células vivas por cm2) en Medio Básico de Eagle (Eurobio) complementado con 1% glutamina, 5% suero de caballo (HS, Eurobio) y 2.5% suero de bovino fetal (FCS, Eurobio) en placas de 6 o 24 cavidades (Sarstedt), o cubre objetos en cámaras de 4 cavidades Lab-Te ® (Nalge Nunc Internationnal ) , previamente revestidos con lmg/ml polietil-enimina (Sigma) . En DIV3 , el medio se cambia diario y las neuronas se mantienen en medio completo N5 conteniendo 180 mg/1 glucosa, 5% HS y 1% FCS, y 3 µM citosina ß -D-arabinofuranosida (Sigma) y 1 µM 5 -met il - 10 , 11 -dihidro-5H-dibenzociclohepten-5 , 10-imina maleato (MK.-801, Sigma) . La pureza de cultivo (> 95%) se controla con un anticuerpo monoclonal de Proteína Asociada con anti-Microtúbulo (MAP -2, Sigma) y anticuerpo cuerpo policlonal de Proteína Acida Fibrilar anti-Glial (GFAP, Dako) . Las neuronas se cultivan hasta 6 DIV en placa de 24 cavidades y se someten a privación de suero. Brevemente, las neuronas cultivadas en medio completo N5 se enjuagan rápidamente 3 veces en N5 sin suero, e incuban por 24 hrs en medio N5 sin sueron, en ausencia o presencia de Qco-VDVAD-dfp. 5.1.3 Ensayos de Apoptosis. El análisis se realiza en neuronas adherentes previamente coloreadas por microscopía de fluorescencia (FM) (microscopio de fluorescencia invertido DM IRB, Leica, Rueil-malmaison, Francia) equipada con una lámpara de arcio corta de mercurio 100 W y un objetivo a X 40 N PLANO L o una inmersión en agua X 100 N PLANO objectivo. Usualmente, los estudios cuantitativos se realizan tanto por FM en aproximadamente 200-600 células/campo al clasificar 5-10 campos seleccionados al azar por experimento y citometría de flujo (FC) para rendimiento más alto de la muestra. El análisis FC de apoptosis se realiza después de tripsinización de neuronas coloreadas al utilizar un citómetro FACSCalibur de 3 colores equipado con un láser de argón de 488 nm enfriado con aire 15 mW (Becton Dickinson) . Caspasa-2 activada se detecta utilizando péptidos conjugados con FAM específicos (llamados FLICA: Equipos de Actividad de Caspasa de fluorescencia CaspaTag™, Q-Biogen, Illkirch, Francia; Equipos de Detección de Caspasa ApoFluor™, MP BioMedicals) : FAM-VDVAD-fmk . La pérdida de viabilidad se valora por incorporación de 7-AAD (Sigma) . 5.1.4 Estudios de formulación. El compuesto Qco-VDVAD-dfp (SEQl) es soluble en excipientes Tween 20 o Pluronc F-68 excipients. La estabilidad se sigue por 7 días a RT o después de congelar/descongelar la solución acuosa comprendiendo varios 10-100 % de excipientes al utilizar HPLC (Varían ProStar 410 equipado de Nucleosilo Qs (8 µm, 3.9 x 150 mm) con detección a 214 nm) . 5.2 Resultados Qco-VDVAD-dfp es un inhibidor de caspasa-2 selectivo (IC50=65-80 nM) sin reactividad cruzada contra otras caspasas o al menos 32 otras proteasas relacionadas o enzimas incluidas en transducción de señal y metabolismo neuronal, trayectoria de óxido nítrico o metabolismo de prostanglandina (Figura 1) . Qco-VDVAD-dfp es permeato de célula debido a que previenen la actividad de caspasa-2 durante la privación del suero en cultivos neuronales corticales. Además, Qco-VDVAD-dfp previene la muerte neuronal a 24 hors en este paradigma de muerte celular dependiente de caspasa-2 experimental. (Figura 1) . Además Qco-VDVAD-dfp es adecuado para administración de humano o animal debido a su alta solubilidad en mezclas a base de Tween 20 o Pluronic-F68. No se encuentra degradación de Qco-VDVAD-dfp cuando se deja a temperatura ambiente hasta 7 días o después del congelamiento/descongelamiento (Figura 2) . Estos datos se ilustran por las siguientes figuras: Figura 1. Figura 1: Eficiencia y especificidad in vi tro de Qco-VDVAD-dpf . (a) En especificidad in vi tro de Qco-VDVAD-dfp en un panel de caspasas recombinantes de humano (1 a 10; 50U) . Ensayos de desdoblamiento in vi tro se realizan con 0.1 µM de Qco-VDVAD-dfp (n=3; histogra as indican % de actividad de caspasa ± SD) . (b) IC50 (concentración que previene 50% de desdoblamiento de Ac-VDVAD-AMC por C2 recombinante de humano C2 (125 U) ) rango de determinación contra caspasa-2 de humano recombinante: 65-80 nM (n=3 con diferentes grupos) , (c) efecto citoprotector de Qco-VDVAD-dfp en neuronas privadas de suero (SD) 24h. Qco-VDVAD-dfp previene la actividad de caspasa-2 y muerte celular en 24 hrs (n=3) . (d) Perfil inhibidor de Qco-VDVAD-dfp (1 µM) determinado en otras 32 ensayos farmacológicos in vi tro relacionado con proteasa, transducción de señal y metabolismo neuronal, la trayectoria de óxido nítrico o metabolismo de prostanglandina (n=2) .

Figura 2. Estabilidad de formulación: determinación HPLC. Qco-VDVAD-dfp (5.10-3 M en regulador filológico conteniendo 20 % de Tween 20) no se degrada a RT después de 7 días. IV. Efectos de Qco-DVAD-dfp en ratas después de isquemia cerebral focal Intro El ataque es la tercer causa más común de muerte en adultos en el mundo desarrollado, y una causa importante de mortalidad y morbidez neurológica crónica en niños . Muchos ataques en niños pasan en el periodo perinatal, poco antes del nacimiento o dentro del mes después. El riesgo de ataque isquémico en la madre también incrementa el tiempo de nacimiento, y es 34 veces más común en los 2 días antes y 1 día después del suministro que más temprano en el embarazo o en el estado de no embarazo. La vulnerabilidad pesada a ataque isquémico tanto en la madre como en el niño, y también a trombosis en sitios no cerebrales se relaciona probablemente a la activación de mecanismos coagulantes por parto presumiblemente una adaptación evolucionaría a disminuir el riesgo de hemorragia en este tiempo crucial .

El ataque isquémico perinatal. es un evento cerebrobascular alrededor del tiempo de nacimiento con evidencia radiológica o patológica de infarto a la arteria focal. La mayoría de los ataques perinatales ocurren en el territorio de la arteria cerebral media (MCA) . Existe una predominancia de lesiones del hemisferio izquierdo, que puede causarse por diferencias hemodinámicas de una arteria de ducto patente, o una vía más directa incluyendo la carótida común izquierda. La distribución de infarto cerebral difiere de alguna manera con infartos de pretérmino en edad gestacional tienden a tener lesiones multifocales incluyendo las ramas corticales o lent iculostriato de MCA, mientras que los infantes de término completo tienden a tener oclusiones de la rama principal . 1. Modelo experimental 1.1 Modelo de isquemia focal unilateral transitorio Ratas Wistar recién nacidas (madre más 4 crías por litro) se obtienen de Janvier (Le Genest-St- Isle, Francia) cuando las crías tenían 3-4 días de edad. Las crías se alojan con su madre bajo un ciclo de luz-oscuridad 12:12 h con alimento y agua libremente disponible. El experimento animal se conduce de acuerdo con las directrices de la Comunidad Francesa y Europea para el cuidado y uso de animales experimentales. Isquemia se realiza en ratas de 7 días de edad (17-21 g) , como se describe previamente (Renolleau et al, 1998) . Las crías de rata se anestesian con una inyección intraperitoneal de hidrato cloral (350 mg/kg) . Las ratas anestesiadas se colocan en su espalda y una incisión media se hace en el cuello para exponer la artería carótida común izquierda. Las ratas se colocan entonces en el lado derecho y una incisión oblicua en la piel se hace entre la oreja y el ojo. Después de la escisión del músculo temporal, el hueso craneal se remueve de la sutura a un nivel por debajo del arco zigomático. Entonces, la arteria cerebral media izquierda, expuesta solo después de su apariencia sobre la fisura rinal , se coagula al nivel inferior de la vena cerebral . Después de este procedimiento, un pasador se coloca para ocluir la arteria carótida común izquierda. Las ratas se colocan entonces en un incubador para evitar hipotermia. Después de 50 min, el pasador se remueve. La restauración de flujo sanguíneo carótida se verifica con la ayuda de un microscopio. Las incisiones de piel en el cuello y cráneo se cierran entonces. Durante el procedimiento quirúrgico, la temperatura corporal se mantiene a 37-38°C. Las crías se transfieren en un incubador (32°C) hasta la recuperación después a sus madres . Qco-VDVAD-dfp se administra intraperitonealmente a una dosis variando de 0.001 a 10 mg/kg 5-15 min antes del inicio isquémico o 1 h después de isquemia. Los animales de control recibieron un volumen equivalente de 0.9% salina conteniendo 10% DMSO (n=15), el vehículo se requirió para solubilizar los inhibidores de caspasa (grupo tratado por vehículo) . La tasa de mortalidad durante isquemia o antes de la muerte no difiere entre Qco-VDVAD-dfp y grupos tratados con vehículo (< 4%) . Las ratas se matan 48 horas después de la reperfusión y los cerebros se remueven. La lesión por infarto (zona pálida) se clasifica visualmente por un observador relacionado con el tratamiento de animales . Los cerebros sin una zona pálida isquémica clara se observan bajo un vidrio de magnificación. Aquellos no mostrando oclusión MCA clara se descartan . Dieciséis secciones del estrato anterior a hipocampo posterior (correspondientes a placas 9 a 27 en altas de cerebro de rata de Paxino) se seleccionan, toman a intervalos igualmente espaciados de 0.5-mm. Las áreas de lesión se miden en sección coloreadas con violeta cresil utilizando un analizador de imágenes (software de imagen NIH) , y las distancias entre secciones coronarias respectivas se utilizan para calcular el volumen de infarto. Las secciones cerebrales se procesan para rompimientos de filamento de ADN (ensayo TÚNEL) utilizando el Equipo de Detección de Muerte Celular de Fluoresceína in si tu (Roche, Meilan, Francia) de acuerdo a las instrucciones del fabricante . Para análisis Túnel, los cerebros se fijan entonces 2 días en 4% formaldehído regulado. Cincuenta micrómetros de secciones cerebrales coronarias se cortan en un crioestato y recolectan en portaobjetos revestidos con gelatina. El análisis estadístico se realiza como sigue. Asumiendo un riesgo beta de 0.2 y un riesgo alfa de 0.05, se estima que 15-16 animales en cada grupo fueron necesarios para detectar un 50% de reducción de volumen de infarto entre dos grupos. Debido a que tres grupos de animales se comparan en los experimentos, estos valores son solamente informativos. Una lista predeterminada con bloques de seis animales se utiliza al azar a animales entre los tres grupos. Un investigador relacionado con la condición del tratamiento toma las mediciones . La diferencia entre los medios se valora por la prueba de comparación múltiple no paramétrica de Kruskall -Wallis , seguido por la prueba de Newman-Keul para valores no paramétricos . Consideramos que las diferencias son significativas al 5% de nivel { P< 0 05 ) . 1.2 Desdoblamiento VDVAD-AMC in vi tro en lisatos cerebrales y desdoblamiento de caspasa-2 por análisis Western blot Extracción de proteína y análisis Western Blot Los hemisferios cerebrales se lisan en 10 mM Hepes, 5mM MgC12 , 42 mM KCl , lmM DTT, 0.5 % CHAPS complementado por cocktail de inhibidores de proteasa completa (Roche, Meilan, Francia) al utilizar un pote manual en hielo. Los homogenatos se centrifugan a 10000 g/4°C por 10 min antes de mantener el sobrenadante. La concentración de proteína se determina utilizando prueba BCA. Las proteínas (50 µg) se separan en 12.5% geles de poliacrilamida y transfieren a membranas de PVDF (Amersham) . Inmunocoloración se revela utilizando ECL (Amersham Pharmacia Biotech) . El anticuerpo de caspasa-2 anti-ratón monoclonal (52 kDa; 11B4, Alexis Biochemicals) se utiliza a una dilución 1:1000; actina (42kDa; Sigma; anticuerpo diluido 1:5000) se utiliza como un control de carga igual. La actividad de caspasa-2 (100 µg muestra cerebral de proteína) se valora en 100 µl regulador de ensayo (50 mM HEPES, pH 7.4, lOOmM NaCl, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, ImM EDTA, 10% glicerol) . El desdoblamiento de 50 µM VDVAD-AMC por caspasa-2 recombinante se mide después de 2h a 37°C en un lector de microplacas de fluorescencia al monitorear la emisión de fluorescencia a 510 nm en la excitación a 405 nm . Para inhibición de actividad de VDVADasa, los inhibidores (2 µM) se pre-incuban 30 min a 37°C en presencia de caspasa-2 antes de la incubación subsiguiente con 50 µM VDVAD-AMC (30 min, 37°C) . No se observa antecedente de fluorescencia notable con VDVAD-AMC solo . 2. Resultados En este modelo isquémico focal unilateral transitorio, las crías de rata experimentan oclusión de arteria cerebral media izquierda, permanente en asociación con oclusión transitoria de la artería de carótida común izquierda con reperfusión. Los cerebros se analizan entonces 48 horas después, un punto de tiempo en el cual el infarto se estabiliza sin edema significativo (no más de 1.5%) . Isquemia indujo un volumen de infarto de 55.0 ± 3,4 mm3 , que representa un 22.1 ± 1.4% daño en el hemisferio ipsilateral lesionado. Los volúmenes de infarto aparecieron normalmente distribuidos (entre 15 y 26 %) (Figura 3) . Una dosis única de Qco-VDVAD-dfp (5 mg/kg; i.p.) se administra a crías de rata antes del inicio isquémico. Esta dosis única indujo una reducción al 74% altamente significativa en volumen de infarto (5.7 ± 2.3%, p<0.01 ( (media=0.5) en comparación con el grupo de control (V=22.1 ± 1.4%, media=21) en la prueba de Newman-Keul) (Figura 3) . De manera interesante, en los 12 animales estudiados, cuatro animales tratados con Qco-VDVAD-dfp despliegan protección intermedia (V=16.5+1.32%) y ocho animales despliegan ya sea protección completa o un infarto más pequeño muy marcado (media= 0.5%) , visible solamente al nivel de la arteria cerebral intermedia (niveles correspondientes a las placas 12 y 13) pero no en aquella del dorsal) e hipocampo (placa 21) en comparación con los animales de control isquémico (Figura 3) . Una dosis única de Qco-VDVAD-dfp (0.1 mg/kg; i.p.) se administra 1 h después de MCAO (correspondiente al inicio de la reperfusión) a crías de rata. Esta dosis única indujo una reducción al 44% altamente significativa en volumen de infarto (9.95±2.8 %, p<0.01 en comparación con el grupo de control (V=22.64+1.6 %) en la prueba de Newman-Keul) (Figura 3) . Además, el marcado final de muesca dUTP de transferasa terminal (TÚNEL) se disminuye significativamente en animales tratados con Qco-VDVAD-dfp (Figura 3) . El efecto proporcionado por Qco-VDVAD-dfp no se media por regulación de la temperatura corporal (Figura 3) . Finalmente, Qco-VDVAD-dfp objetivo en caspasa-2 in vi vo : inhibe la actividad de caspasa-2 así como también el procesamiento de caspasa-2 en el cerebro de crías de rata isquémico (Figura 4) . Demostramos que la caspasa-2 es un objetivo relevante con buen pronóstico neuroprotector en ataque neonatal, ya que la inactivación in vi vo de caspasa-2 resulta en reducción masiva de volumen de infarto durante isquemia focal transitoria. Sugerimos que caspasa-2 puede ser un objetivo válido para prevención in vi vo de encefalopatía isquémica-hipóxica en el ataque en nacimiento y perinatal, un cuidado de salud principal en recién nacidos humanos . Estos datos se ilustran por las siguientes figuras: Figura 3 : Inhibición de caspasa-2 selectiva por Qco-VDVAD-dfp fuertemente previene la muerte celular e infarto cerebral de neonatos de rata sometidos a lesión cerebral isquémica. (a. Panel izquierdo) los volúmenes de infarto promedio 48 hrs después de isquemia en las tratas tratados con vehículo (n=17) y Qco-VDVAD-df (i.p., 5 mg/kg; n=12) (promedio±SEM) . Qco-VDVAD-dfp induce 74% de reducción ( * * *=p<0.001 , prueba ruskall -Wallis) cuando se administra 5-15 min antes del inicio isquémico; (a, panel derecho) tratamientos de Qco-VDVAD-dfp proporcionan 2 grupos desplegando alta/total (altura) o baja protección (cuatro) . Los datos de volumen de infarto único se diagraman. Las barras horizontales negritas y delgadas representan la media y promedio del grupo, respectivamente. (b) Las secciones coronarias coloreadas con violeta cresilo representativas de animales en 48 hrs después de reperfusión al nivel de hipocampo dorsal (placa 21, altas de cerebro de rata de Paxino) y comisura anterior (placa 12) . Líneas rayadas indican área de infarto. La flecha indica la ausencia de infarto en animal tratado con Qco-VDVAD-dfp. La barra representa 130 µm. (c, panel izquierdo) volúmenes de infarto promedio 48 hrs después de isquemia en ratas tratadas con vehículo (n=22) y Qco-VDVAD-dfp (i.p., 0.1 mg/kg; n=19) (promedio±SEM) . Qco- VDVAD-dfp induce 44% de reducción ( * * *=p< 0.001 , prueba Kruskall -Wallis ) cuando se administra lh después de inicio isquémico. (c, panel derecho) datos de volumen de infarto único se diagraman. Las barras horizontales negritas y delgadas representan la media y promedio del grupo, respectivamente. (d) Muerte celular en la corteza ipsilateral de animales tratados con vehículo y Qco-VDVAD-dfp. Micrográficas de fluorescencia representativas (de la placa 12) después de marcado de ADN de extremo 3 ' OH in si tu (barra: 100 µm) . (e) Temperatura corporal se mide antes y después de la administración de Qco-VDVAD-dfp (pre y postisquemia) . Figura 4: Las crías de rata isquémicas se tratan con 5 mg/kg (i.p) de Qco-VDVAD-dfp. Los animales se sacrifican en 24 hrs . Los homogenatos del cerebro se someten a ensayo de actividad de caspasa-2 y análisis western blot. IL: hemisferio lesionado ipsilateral, CL : hemisferio no lesionado contralateral , (a) Determinación de la actividad de caspasa-2 en vehículo contra ratas tratadas con Qco-VDVAD-dfp. (b) Análisis Western blot de procesamiento de caspasa-2 en homogenatos cerebral de ratas tratadas con vehículo contra las tratadas con Qco-VDVAD-dfp. V. Efectos de Qco-DVAD-dfp en ratas después de isquemia cerebral global La isquemia cerebral global es una condición que puede inducirse después de paro cardiaco o perturbaciones cardiovasculares, y que resulta en reducción de flujo sanguíneo e hipoxia. Las lesiones aparecen en regiones cerebrales selectivamente vulnerables y las neuronas pueden dañarse por apoptosis durante tal isquemia cerebral global. La isquemia global también resulta en pérdida difundida y global de metabolitos de energía combinados con edema cerebral difuso y daño global . Los mecanismos incluidos en crecimiento de lesión pueden incluir activación de proteasa de cisteína (caspazas) , excitotoxicidad, depolarizaciones post -infarto , lactacidosis , perturbaciones microcirculatorias , y desacoplamiento de metabolismo de flujo entre otros. Si algunas caspasas (ej ecutadoras) pueden activarse durante isquemia global, nadie puede comentar el papel de caspasa-2 en tales situaciones patológicas. Recientemente, hemos desarrollado un nuevo inhibidor de caspasa-2 selectivo ( 2 -Quinolinilcarnonil -L-Valinil -L-Aspartil (éster de metilo) -L-Vanilil -L-Alaninil -L-Aspartil (éster de metilo) 2 , 6 -dif luorofenil éster, nombrado Qco-VDVAD-dfp, que proporciona fuerte neuroprotección in vi vo durante isquemia cerebral neonatal. Aquí investigamos sus efectos mediados citoprotectores contra lesiones cerebrales ocurriendo después del paro cardiaco y beneficios relacionados con la conducta. De esta manera, probamos el efecto de Qco-VDVAD-dfp en un modelo experimental in vi vo de isquemia cerebral global y transitoria (4V0, oclusión de cuatro vasos) en la rata adulto joven, en base a Pulsinelli (1979) . 1 Modelo experimental 1.1 Modelo VO Isquemia cerebral global se induce por oclusión de cuatro vasos (4V0) de acuerdo a método derivado de Pulsinelli (Pulsinelli et al . , 1982; Pulsinelli and Buchman, 1988) en ratas adultas jóvenes (machos Wistar de 10-12 semanas, 320 g +/-10 g; Janvier) . El primer día, la cabeza de ratas anestesiadas se coloca en las barras de oreja estereotáxica y se inclina hacia abajo a aproximadamente 30° al horizontal. Después de una incisión media al nivel de la espina cervical, ambas arterias vertebrales se exponen bajo microscopio y después se coagulan por aguja electrocauteriana a través de la foramina alar al nivel de la primer vértebra cervical. Ambas carótidas comunes se exponen entonces 24 h después y se sujetan por 20-30 min (las ratas caen en coma cuando la electrocauterización de ambas arterias vertebrales se ha desarrollado bien) . Las arterias carótidas se separan entonces para permitir la reperfusión del flujo sanguíneo. El vehículo y Qco-VDVAD-dfp (II, n=0) se administran al nivel del ventrículo cerebral izquierdo en los primeros quince minutos de isquemia (oclusión de carótida) . Las ratas se dejan en su caja con agua y alimento ad l ibi tum . 1.2 Estimación de ci toprotección La pérdida - selectiva de células vulnerables y efectos de Qco-VDVAD-dfp (intracerebroventricular (ICV) administrado) se ha evaluado en 72 h. Las ratas se sacrifican y el cerebro se fija por perfusión trans- cardiaca con paraformaldehído . Las partes del cerebro frontal (25 µm) se filamentan por violeta cresilo o colorean por Hoechst 33342 y Fluoroj ade B para valorar la muerte celular en el hipocampo y en la corteza. Violeta cresilo es un titen rosa-rojo que marca Nissl de cuerpo citoplámico (estructuras de retículo endoplásmico) y núcleos en células vivas resultando de esta manera en pálido o ausencia de coloración en células muriendo. La toma de Fluoro JadeB (fluorescencia verde) es posible solamente en células que tienen membrana de plasma permeable, de esta manera más característica de muertes muriendo. Hoechst 33342 (fluorescencia azul) marca núcleos de todas las células y permite apreciar los cambios de morfología nuclear durante la muerte celular. Las células se cuentan al nivel de cánula, así como también a 650 µm y 780 µm después de la cánula (eje antero-post erior ) en el hemisferio cerebral izquierdo. Las células se cuentan en tres pedazos sucesivos en tales niveles en el hipocampo (CAÍ, CA3 , Dentus gyrus) y corteza. Los pedazos coloreados con violeta cresilo se observan bajo luz blanca (microscopio Nikon Eclipse E 800M equipado con objetivos x40 y x20 y software LEICA IM50) . Ambos pedazos coloreados con Fluoro Jade B y Hoechst se observan bajo un microscopio de fluorescencia invertido Leica DMIRB con objetivo x40 y software LEICA IMIOOO/Qfluorobase (filtro de excitación BP 340-80 combinado con filtro de emisión LP 425 para Hoechst; filtro de excitación BP 480/40 combinado con filtro de emisión BP 515-560 para Fluoro Jade B) . 1.3 Estimación de ganancia conductual La temperatura corporal se mide durante procedimiento quirúrgico el día 1 (de anestesia en la etapa 1) (electrocaut erización vertebral y colocación de cánula) y etapa 2 (aislamiento de carótida) del procedimiento quirúrgico. La temperatura corporal también se mide 0, 10, 20 minutos después del comienzo de isquemia el día 2. La temperatura se mide 24, 48, 72H post -isquemia y antes de anestesia final para perfusión el día 5. Los estudios conductuales (alimentación, actividad espontánea y reactividad) se realizan y evalúan por puntuación. Alimentación: observación de estómago contiene el día 5 Si realiment ación=l ; sin realimentación=0 Actividad espontánea: conducta general de animales en su caja (alternancia de fases activa contra inactiva) y reacción a compresión) . Vivacidad=l; Más o menos vivacidad=0.5 ; nada o poca de vivacidad=0. Reactividad: los animales son sensibles y reactivos a ruido y se mueven al origen del ruido. Si es curioso=l; si es relativamente curioso=0.5; si no es muy curioso=0. 2 Resultados Figuras 5-7 muestran que la muerte celular ocurre al nivel de CAÍ en el hipocampo (y un poco en la corteza) de 72h de ratas post-isquémicas de adulto: 90-100% de células han perdido su marcado con violeta cresilo y tienen morfologías celulares anormales, 40-60% mostraron alteración nuclear, y 40-50% FluoroJade B en (CAla,b y sub áreas c) de cerebro isquémico. Ninguna señal de la muerte celular se encuentra en CA3 , DG (Dentus girus) (también en CA2 y CA4 , datos no mostrados) . La isquemia también se controla por la presencia de células microgliales que muestran formas de palo (microglia residente) o falco (microglia migrante invadiendo el cerebro después de la ruptura de la barrera de cerebro sanguínea) . Figura 8 no muestra muerte celular (abajo del umbral basal: 10%) en ratas no isquémicas (icv) tratadas con 60-600 ng de Qco-VDVAD-dfp cualquiera que sea el nivel de observación en el hipocampo o en la corteza: ausencia de células negativas de violeta cresilo, ausencia de núcleos anormales, sin incorporación de Fluoro Jade B. De esta manera, Qco-VDVAD-dfp no es tópicamente tóxica en 60-600 ng . Figuras 9-10 muestran los efectos citoprotectores de Qco-VDVAD-df al nivel de CAÍ en cerebros isquémicos. En contraste agudo- a ratas isquémicas, los animales tratados con Qco-VDVAD-dfp tienen menos núcleos anormales (núcleos más grandes y menos retraídos) y pocas células incorporaron Fluorojade B (entre 10-20% en lugar de 50-60%) . De esta manera, los pedazos coloreados se parecen muy fuertemente a los no isquémicos. Además, la intensidad de coloración violeta cresilo se restaura parcialmente al nivel de animal no isquémica, pero sin recuperación total de la morfología celular. Los efectos de Qco-VDVAD-dfp fueron independientes de efectos reguladores en temperatura (Figura 11) . Qco-VDVAD-dfp tiene efectos benéficos en la conducta general de rata tratada isquémica debido a que estas ratas tienen una mejor puntuación que las ratas no tratadas; fueron más activas, más reactivas a ruido y las alimentan (Figura 11 ) . Estos datos se ilustran por las siguientes figuras: Figura 5: La muerte celular en hipocampo y corteza de modelo de ratas isquémicas (4V0) . A: muerte celular en hipocampo (CAÍ, CA3 , DG) y corteza de 72h ratas adultas post-isquémicas . Isquemia cerebral transitoria y global se induce por oclusión de 4 vasos (4V0; n=5) . Las ratas se tratan (icv) con DMSO (aquí, 7,255%; 0.7255% no mostrados) . Los pedazos se colorean por violeta cresilo. B. Muerte celular en el hipocampo (CAÍ) de 72h ratas adultas post-isquémicas. Isquemia cerebral global y transitoria se induce por oclusión de 4 vasos ( (4VO; n=5) . Las ratas se tratan (icv) con DMSO (7,255%) . Los pedazos se colorean por Hoechst 33432 (núcleos azules) y micrográf icas de fluorescencia Fluoro Jade B (núcleos verdes y citoplasma) . C: Alta magnificación de micrográficas de fluorescencia Hoechst y Fluoro Jade B (tamaños son incrementados por 2 y 6 veces, respectivamente) . D: Activación de Microglial como un marcador de isquemia. Las células microgliales muestran formas de palo (microglia residente) o falco (microglia migrante invadiendo el cerebro después de la ruptura de la barrera de cerebro sanguínea) . Figura 6: Impacto de isquemia en CA3 , Dentus gyrus (DG) y corteza (COR) . Muerte celular en el hipocampo (CA3, DG) y corteza (COR) en 72h post-isquemia en ratas adultas. Isquemia cerebral global y transitoria se induce por oclusión de 4 vasos ((4VO; n=5) . Las ratas se tratan (icv) con DMSO (aquí, 7,255%; 0.7255% no mostrados) . Los pedazos son co- coloreados por Fluoro Jade B/Hoechst en nivel CAÍ (n=5) . Figura 7: Cuantif icación de muerte celular en 72h post-isquemia. Muerte celular en el hipocampo (CAÍ, CA3 , DG,) y corteza (COR) en 72h post-isquemia en ratas adultas. Isquemia cerebral global y transitoria se induce por oclusión de 4 vasos ( (4V0; n=5) . Las ratas se tratan (icv) con DMSO (aquí, 7,255%; 0.7255% no mostrados) (n=5) . A: Cuantif icación de células positivas de violeta cresilo al nivel de inyección de DMSO o TRP6 (1), 650 µm después (2) o 780 µm después (3) . B: Cuantificación de núcleos anormales valorados por coloración Hoechst en el hipocampo (CAla,b,c/ CA3 , DG) y corteza (COR) de cerebros isquémicos y no isquémicos. C: Cuantificación de células positivas Fluoro Jade B en el hipocampo (CAla b,c CA3 , DG) y corteza (COR) de cerebros isquémicos y no isquémicos. Figura 8: No toxicidad de Qco-VDVAD-dfp en ratas no isquémicas. Muerte celular en el hipocampo (CAÍ, CA3 , DG3 ) y corteza (COR) en 72h después de administración icv de DMSO (aquí, 7,255%; 0.7255% no mostrados) o Qco-VDVAD-dfp (60 o 600 ng) (n=5) en ratas no isquémicas. A: Cuantificación de células positivas violetas cresilo en presencia de dosis crecientes de TRP6 al nivel de inyección de DMSO o Qco-VDVAD-dfp (1), 650 µm después (2) o 780 µm después (3) . B: Cuantif icación de núcleos anormales valorados por coloración Hoechst en el hipocampo (Cala,b,c, CA3 , DG) y corteza (COR) de ratas tratadas con vehículo y Qco-VDVAD-dfp. C: Cuantificación de células positivas Fluoro Jade B en el hipocampo (CAla,b,c CA3 , DG) y corteza (COR) de cerebros isquémicos y no isquémicos. Figura 9: Neuroprotección por Qco-VDVAD-dfp en 72 h post-isquemia (4VO) en el hipocampo de la rata adulta joven. A: Micrográficas (x400) representativas para CAÍ y sus sub-áreas (CAla,CAlb, CAlc) en ratas isquémicas tratadas con vehículo (DMSO 0.7255 %) o tratadas con Qco-VDVAD-dfp (60 ng) contra animales no isquémicos non- (tratados con vehículo) . Los pedazos se colorean con violeta cresilo (línea superior), Hoechst (núcleos azules en columnas izquierdas) o Fluoro Jade B (fluorescencia verde en columnas derechas) .

B: Alta magnificación (6 veces) de micrográficas de Hoechst y Fluoro Jade B.

Figura 10: Efecto cuantitativo de Qco-VDVAD-dfp en 72 h post-isquemia. Muerte celular en el hipocampo (CAÍ, CA3 , DG,) y corteza (COR) en 72h post-isquemia en ratas adultas. Isquemia cerebral global y transitoria se induce por oclusión de 4 vasos ((4V0; n=5) . Las ratas se tratan (icv) con DMSO (aquí, 7,255%; 0.7255% no mostrados) o Qco-VDVAD-dfp (60 o 600 ng) (n=5) . A: Cuantificación de células positivas violetas cresilo en presencia de dosis crecientes de TRP6 al nivel de inyección de DMSO o Qco-VDVAD-dfp (1) , 650 µm después (2) o 780 µm después (3) . B: Cuantificación de núcleos anormales valorados por coloración de Hoechst en el hipocampo (CAla?b/C, CA3 , DG) y corteza (COR) de ratas tratadas con vehículo o tratadas con Qco-VDVAD-dfp. C: Cuantif icación de células positivas Fluoro Jade B en el hipocampo (CAla,b,c, CA3 , DG) y corteza (COR) de cerebros isquémicos y no isquémicos. Figura 11: Pruebas fisiológicas y conductuales. A: Estudios fisiológicos. Medición de temperatura corporal de anestesia a la etapa 1 (electrocauterización vertebral y colocación de cánula) y etapa 2 (aislamiento de carótida) de procedimiento quirúrgico durante el día 1; 0, 10, 20 minutos después del inicio de isquemia el día 2; 24, 48, 72H post-isquemia y antes de anestesia final para perfusión el día 5. B: Estudios conductuales: promedio de parámetros por grupo. Alimentación: observación de estómago contiene el día 5, si ha realimentación=l , si no hay realiment ación=0 : Actividad espontánea: conducta general de animales en su caja (alternada de fases activas contra inactivas) y reacción a compresión) , Vivacidad=l, Más o menos vivacidad=0.5 , Nada o poca vivacidad=0; Reactividad: animales son sensibles y reactivos a ruido y se mueven al origen del ruido. Si es curioso=l, Si es relativamente curioso=0.5, Si no es muy curioso=0. C: Estudios conductuales : puntuación total (suma de puntuaciones totales por grupo) . Ejemplo: Obtención de inhibidores de caspasa-2 de estructura II Las etapas principales utilizadas para la síntesis se resumen en los esquemas 1 a 3 Referencias Bibliográficas Pulsinelli WA, aldman S, Ra linson D, Plum F, Modérate hyperglycemia augments ischemic brain damage : a neuropatologic study in te rat . Neurology. 1982, 32 , : 1239- 1246. Pulsinelli .A., Buchman A.M. (1988) . The Four-vessel Occlusion Rat Model: Metod for Complete Occlusion de vertebral arteries and control of collateral circulation. Stroke. 19, 913- 914 Renolleau, S., D. Aggoun-Zouaoui , Y. Ben-Ari , and C. Charriaut -Marlangue . 1998. A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat: morphological changes indicative of apoptosis. Stroke 29: 1454-1461.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Nuevos inhibidores de caspasa-2 selectivos que reconocen caspasa-2 y previenen y bloquean su actividad en base a la siguiente estructura : 2 -Qui olinilcarbonil -L-Val ini 1 - L-Aspartil (éster de met ilo) - L-Vanilil-L-Alaninil - L-Aspartil (éster de metilo) 2 , 6 -difluorofenil éster (SEQ1) y derivados del mismo, SEQ 1 correspondientes a las fórmulas la o Ib: la Ib 2. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1 en base a la estructura II :
2. II 3. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1 en base a la estructura III:
3. III en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido es ya sea L o D ; (ii) R1 y R2 son un átomo de hidrógeno, átomo de deuterio, arilo C?_2o alifático, substituido o nosubst ituido , cicloalquilo, naftilo, naftilo substituido, 2 -benzoxazolilo, 2-oxazolilo substituido, (CH2 ) ncicloalquilo , ( CH2 ) nfenilo ,
4. (CH2)nfenilo substituido, (CH2)n(l- o 2-naftilo), (CH2) nheteroarilo, CH2N2 , CH2Y, OH, OR, NH2, NHR, NR2, SR, COR, C02R, CONR2 , CH2OCOR, CH20-CO arilo, CH20-C(0) arilo substituido (ej: 2,6-dimetilbenzoiloximetil) , CH20-C(0) arilo substituido, CH20-C(0) heteroarilo, CH20-C(0) heteroarilo substituido o CH20P0R2 ; (iii) R3 , R4 , R5 y R6 son las cadenas laterales de uno de los veinte aminoácidos (excluyendo cisteína) . Por ejemplo, los pentapéptidos también pueden ser análogos de Leu-Asp-Glu-Ser-Asp . R3 , R4 , R5 y R6 son también C1-2o alifático, cicloalquilo, naftilo, naftilo substituido, 2-benzoxazolil , 2-oxazolilO substituido,
5. (CH2) ncicloalquilo, (CH2 ) nfenilO , (CH2)n fenilo substituido, (CH2)n(l- o 2-naftilo),
6. (CH2)„heteroarilo, CH2N2 , (CH2)nZ, CH2OCOR, CH2OCO (arilo) , CH2OCO (arilo substituido) , CH2OCO (heteroarilo) , CH2OCO (heteroarilo substituido) o CH2OPOR2; (iv) R7 es un átomo de hidrógeno y R8 es R, U, CO(CH2)nNH(U) , CO(CH2)nS(U) (v) U es (no) substituido (2-, 3-, 4-, 5-, 6-,
7. 7- o
8. 8 - ) quinolinilo , alquilo de cadena recta o ramificada C?_20, (CH2 ) ncicloalquilo , (CH2 ) nfenilo , (CH2)n fenilo substituido, (CH2)n(l- o 2- naftilo), (CH2) nheteroarilo, o un grupo marcador tal como marcadores de fluoróforo o marcadores útiles en microscopía electrónica; (vi) R7 y R8 también se toman juntos con el nitrógeno de intervención para formar un anillo heterocíclico tal como tetrahidroquinolina substituda o no substituida, tetrahidroisoquinolina, di idroacridina , benzazepina, pirrolidina, morfolina, tiomortolina , piperazina, piperidina, dihidropiridina, benzimidazola, imidazola, imidazolina, pirróla, pirrolidina, pirrolina, pirazola, pirazolina, pirazolidina, triazola, piperidina, morfolina, tiomorfolina, piperazina, carbazola, fenotiazina, fenoxazina, dihidrofenazina, dihidrocinolina , dihidroquinoxalina , dihidronafthiridina , tetrahidronaftiridina, dihidroacridina, indola, isoindola, dihidroindola , indolina, indazola, purina, 9 , 10 -dihidrofenantridina , 5H-dibenzo [b , f] azepina , 10 , 11 -dihidro- 5H-dibenzo [b, f] azepina, ß-carbolina, pirido[4,3-b]indola, 2 , 3 ,
9. 9 - triazofluoreno , 9-tia-2,
10. 10-diazaantraceno , tieno [3, 2b] pirróla , dihidrofenantrina . (vii) R es un átomo de hidrógeno, grupo alifático C?-20 arilo, arilo substituido (ej : 4- nitrofenilo o derivados de coumarina) , hetetoarilo (ej . 2-piridina) , heteroarilo substituido, cicloalquilo, naftilo, naftilo substituido, (CH2) ncicloalquilo , (CH2) nfenilo , (CH2)n fenilo substituido (ej: 2,6-dihalofenilo) , (CH2)n(l- o 2- naftilo), (CH2)n heteroarilo o (no) substituido (2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8-) quinolinilo, fluorenmet ilo ; (viii) Y es un grupo de salida electronegativo incluyendo halógenos tales como grupos F, Cl , Br o I, arilo o alquilosulfoniloxi , trifluorometanosulfoniloxi , OR, SR, COOR, OP(0)R2 en donde R es un grupo alifático, un grupo arilo, un grupo aralquilo, un grupo carbocíclico , un grupo carbocíclico de alquilo, o un grupo heterocíclico; (ix) Z es un halógeno (F, Cl , Br o I ) , CN, OH, OR, NH2/ NHR, NR2, SR, COR, C02R, C0NR2 , (x) n es 0 a 20; 4. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura IV, comprendiendo análogos carba de la fórmula IV.1 a IV.7, en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (Ü) n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z on como se describe arriba. No. ESTRUCTURA 5. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1 , en base a la estructura V, comprendiendo análogos de cetometileno del pentapéptido de VDVAD, de fórmula V.l a V.7, en donde (i) la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; (ii) n, R, R1, R2, R3, R4 , Rs , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. No. ESTRUCTURA 6. Nueva caspasa-2 selectiva de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura VI, comprendiendo análogos de péptidos depsi de fórmula VI : la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - X es 0 o NH y al menos una X un átomo de oxígeno - n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7, R8 , U, Y y Z son como se describe arriba - R9 es un átomo de hidrógeno, (2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8-) quinolinilo, alquilo de cadena recta o ramificada Ca-2o, (CH2 ) ncicloalquilo , (CH2) nfenilo, ( CH2 ) nfenilo substituido, ( CH2 ) n ( 1 - o 2- naftilo) , (CH2)nheteroarilo, OCOR o OCNHR . VI VII 7. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1 , en base a la estructura VII comprendiendo análogos de péptidos depsi de fórmula VI, : la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o K; - X es O o NH y al menos una X un átomo de oxígeno - n, R, R1, R2, R3, R4, R5, Rs , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba - R9 es un átomo de hidrógeno, (2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- o 8-) quinolinilo, alquilo de cadena recta o ramificada C?„20, (CH2) ncicloalquilo , (CH2) nfenilo , (CH2)nfenilo substituido, (CH2)n(l- o 2-naftilo), (CH2) nheteroarilo , OCOR o OCNHR. VII 8. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura VIII, comprendiendo análogos de hidroxietileno de fórmula VIII.1 a VIII.7, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero s ya sea L o D — n, R, R , R , R , R , R , R , R / # U, Y y Z son como se describe arriba. No. ESTRUCTURA 9. Nuevos inhibidores de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura IX, comprendiendo análogos de pentapéptido reducidos de fórmula IX .1 a IX. 6, en donde : la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6, R7, R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. No. ESTRUCTURA 10. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura X, comprendiendo análogos no saturados de fórmula X.l a X.7, en donde: la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; — n, R, R , R , R , R R R , R / R , U, Y y Z son como se describe arriba. No. ESTRUCTURA
11. 11. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XI, comprendiendo beta-péptidos, gamma-péptidos , urea y análogos de carbamatos de fórmula XI .1 a XI.9, en donde: la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - X es CH2, NH, 0 - n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba. No ESTRUCTURA
12. 12. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XII, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XII .1 a XII.15, en donde : la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - , X y Y son CH, C o N; — , R, R , R , R , R / , , ? R , U, Y y Z son como se describe previamente No. ESTRUCTURA
13. 13. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XIII, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XIII.1 a XIII.15, en donde : la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ¡ - W, X y Y son CH2 , NH, O o S ; - n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , Re , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe arriba No. ESTRUCTURA
14. 14. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XIV, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XIV.1 a XIV.15, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , R6 , R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe previamente. No. ESTRUCTURA ? ? 4
15. 15. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XV, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XV .1 a XV.15, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; — n, R, R , R , R , R / R R ; / R # U, Y y Z son como se describe previamente. No. ESTRUCTURA ???
16. 16. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XVI, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XVI .1 a XVI.15, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - n, R, R1, R2, R3, R4, R5 , RG, R7 , R8 , U, Y y Z son como se describe previamente No. ESTRUCTURA ? 30
17. 17. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XVII, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XVII.1 a XVII.15, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D; — n, R, R , R , R , R , R R , R , R , , Y y Z son como se describe previamente No. ESTRUCTURA 33
18. 18. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XVIII, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XVIII.1 a XVIII.15, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D ; - n , R , R1, R2, R3, R4, R5 , R6, R7, R8 , U, Y y Z son como se describe previamente No. ESTRUCTURA 7
19. 19. Nuevos inhibidores selectivos de caspasa-2 de acuerdo a la reivindicación 1, en base a la estructura XIX, comprendiendo análogos limitados de VDVAD, de fórmula XIX.1 a XIX.15, en donde la configuración absoluta de cada aminoácido o su isóstero es ya sea L o D; — n, R, R , R R , R , R / / R / R ; U, Y y Z son como se describe previamente ESTRUCTURA J
20. 20. Composiciones farmacéuticas comprendiendo una cantidad efectiva de al menos un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en asociación o no con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 21. Composiciones farmacéuticas según la reivindicación 20, para administración por suministro oral, nasal, local ( intracerebroventricular , intrahipocampal , otro suministro intracerebral, implantación intracerebral de instrumentación para suministro mecánico) o sistémico (por ejemplo: intraperitoneal, intravenoso.... ) o suministro intradérmico , suministro intratecal o como aerosol para reducir muerte celular cerebral in vi vo . 22. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para prevenir o bloquear actividad de caspasa-2 en muerte celular . 23. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 22, en donde dichas células son neuronas, o células de neurona o células no neuronales. 24. Composiciones farmacéuticas de la reivindicación 20 o 21, para proporcionar efecto cerebroprotector o neuroprotector . 25. Composiciones farmacéuticas de la reivindicación 20 o 21, para proporcionar efecto citoprotector. 26. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones isquémicas después de isquemia focal cerebral . 27. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones isquémicas después de isquemia focal cerebral como una consecuencia de MCAO . 28. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones isquémicas después de isquemia focal cerebral como una consecuencia de ataques en el nacimiento o en el periodo perinatal . 29. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones isquémicas después de isquemia focal cerebral como una consecuencia de trombosis en sitios no cerebrales. 30. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de infarto arterial focal. 31. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de lesiones isquémicas en el territorio de la arteria cerebral media (MCA) o hemisferio cerebral izquierdo, causadas por diferencias hemodinámicas de una arteria del ducto patente, o una vía más directa incluyendo la carótida común izquierda. 32. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de lesiones multifocales isquémicas incluyendo las ramificaciones corticales o lent iculoestriato de MCA, u oclusión de la ramificación principal . 33. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de situación patológica incluyendo lesiones isquémicas después de isquemia global cerebral como una consecuencia de reducción de flujo sanguíneo o hipoxia durante paro cardiaco o lesiones cardiovasculares. 34. Composiciones farmacéuticas de acuerdo a la reivindicación 20 o 21, para el tratamiento de situación patológica incluyendo situación patológicas en la cual el flujo sanguíneo y presión de oxígeno se perturban, que resulta en daños cerebrales (transitorios o permanentes) .