MXPA06009164A

MXPA06009164A - Dihidrotetrabenazinas y composiciones farmaceuticas que las contienen.

Info

Publication number: MXPA06009164A
Application number: MXPA06009164A
Authority: MX
Inventors: Ian Clarke; Robert Turtle; Grant Johnston; Robert Tridgett
Original assignee: Cambridge Lab Ltd
Priority date: 2004-02-11
Filing date: 2005-02-11
Publication date: 2007-01-26
Also published as: GB2410947B; ATE406370T1; EP1716145A1; DE602005009327D1; CN100591680C; ZA200607425B; PT1716145E; HK1098138A1; CA2555815A1; HRP20080564T3; WO2005077946A1; AU2005213525B2; NZ549105A; RU2365590C2; RS50660B; GB0403037D0; RU2006132329A; CN1980924A; EP1716145B1; GB2410947A

Abstract

La invencion proporciona nuevos isomeros de dihidrotetrabenazina, enantiomeros individuales y mezclas de los mismos en donde la dihidrotetrabenazina. Tambien se proporcionan metodos para la preparacion de los nuevos isomeros, composiciones farmaceuticas que los contienen y su uso en el tratamiento de desordenes de movimiento hipercinetico tal como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, tic, disquinesia tardia y sindrome de Tourette.

Description

DIHIDROTETRABENAZINAS Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LAS CONTIEN EN Esta invención se refiere a nuevos isómeros de dihidrotetrabenazina, composiciones farmacéuticas que los contienen, procesos para elaborarlos y sus usos terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Tetrabenazina (nombre químico: 1 ,3,4,6,7, 1 1 b-hexahidro-9, 10-dimetoxi-3-(2-metilpropil)-2H-benzo(a)quinozilin-2-ona) ha estado en práctica como un fármaco farmacéutico desde 1950.

Inicialmente utilizado como anti-psicótico, tetrabenazina se utiliza actualmente para tratar desórdenes de movimiento hipercinético tales como enfermedad de Huntington, hemiballismus, senil corea, tic, disquinesia tardía y síndrome de Tourette, véase por ejemplo, Jankovic eí al. , Am. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156(8): 1279-81 y Jankovic eí al., Neurology (1997) Feb; 48(2):358-62. La acción farmacológica principal de tetrabenazina es reducir el suministro de monoaminas (por ejemplo, dopamina, serotonina, y norepinefrina) en el sistema nervioso central al inhibir el transportador de monoamina vesicular humano isoforma 2 (hVMAT2).

El fármaco también bloquea los receptores de dopamina postsinápticos. Tetrabenazina es un fármaco seguro y eficaz para el tratamiento de una variedad de dseórdenes de movimiento hipercinético y, en contraste a la neuroléptica típica, no se ha demostrado que origine la disquinesia tardía. Sin embargo, la tetrabenazina si muestra un número de efectos secundarios relacionados a la dosis incluyendo los que originan la depresión, parkinsonismo, ansiedad, nerviosismo o ansiedad, insomnio y, en raros casos, síndrome maligno neuroléptico. Los efectos centrales de tetrabenazina se asemejan exactamente a aquellos de reserpina, pero difiere de reserpina en cuanto a que carece de actividad en el transportador VMAT1. La falta de actividad en el transportador VMAT1 significa que tetrabenazina tiene menos actividad periférica que la reserpina y por consecuencia no produce efectos secundarios relacionados a V AT1 tal como hipotensión. La estructura química de tetrabenazina es según se muestra en la Figura 1 de abajo.

Figura 1 - Estructura de tetrabenazina El compuesto tiene centros quirales en los átomos de carbono 3 y 1 1 b y de ahí en adelante, pueden teóricamente, existir en un total de cuatro formas isoméricas, según se muestra en la Figura Figura 2 - Posibles isómeros de tetrabenazina En la Figura 2, la estereoquímica de cada isómero se define utilizando la nomenclatura "R y " desarrollada por Cahn, Ingold y Prelog, véase Advanced Organic Chemistry por Jerry March, 4a edición, John Wiley & Sons, Nueva York, 1992, páginas 109-1 14. En la Figura 2 y en cualquier parte en esta solicitud de patente, las designaciones "R" o "S" se dan en atención a los números de posición de los átomos de carbono. De esta manera, por ejemplo, RS es una anotación corta para 3R, 1 1 bS. De igual forma, cuando tres centros quirales se presentan, como en las dihidrotetrabenazinas abajo descritas, las designaciones "R" o "S" se enlistan en cuanto a los átomos de carbono 2, 3 y 1 1 b. De esta manera, el isómero 2S,3R, 1 1 f)R se refiere en forma corta como SRR y así sucesivamente. La tetrabenazina comercialmente disponible es una mezcla racémica de los isómeros RR y SS y podría parecer que los isómeros RR y SS (de aquí en adelante referidos como trans-tetrabenazina individual o colectivamente debido a que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 1 1 b tienen una orientación relativa trans) son los isómeros más termodinámicamente estables. La tetrabenazina tiene de cierta forma escasa y biodisponibilidad variable. Se metaboliza mayormente por el metabolismo de primer paso, y poca o nada de tetrabenazina si ncambiar se detecta típicamente en la orina. El metabolito principal es dihidrotetrabenazina (nombre químico: 2-hidroxi-3-(2-metilpropil)-1 ,3,4,6,7, 1 1 b-hexahidro-9, 10-dimetoxi-benzo(a)quinolizina) que se forma por reducción del grupo 2-ceto en tetrabenazina, y se cree que es principalmente responsable para la actividad del fármaco (véase Mehvar eí al. , Drug Metab. Disp. 15, 250-255 (1987) y J. Pharm. Sci. , 76, No. 6, 461 -465 (1987)). Cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina se han definido previamente y caracterizado, todos ellos derivándose de los isómeros RR y SS más estables de la tetrabenazina principal y teniendo una orientación trans relativa entre los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 1 1 b) (véase Kilbourn eí al., Chilarity, 9:59-62 (1997) y Brossi eí al. , Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958). Los cuatro isómeros son (+)-a-dihidrotetrabenazina, (-)-a-dihidrotetrabenazina, (+)-ß-dihidrotetrabenazina y (-)-ß-dihidrotetrabenazina. Las estructuras de los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina conocidos se considera que se muestran en la Figura 3.

Figura 3 - Estructuras de isómeros conocidos de dihidrotetrabenazina Kilbourn eí al. (véase Eur. J. Pharmacol. , 278:249-252 (1995) y Med. Chem. Res. 5: 1 13-126 (1994)) investigaron la unión específica de isómeros de dihidrotetrabenazina radio-marcados individuales en el cerebro de rata conciente. Encontraron que el isómero (+)-a-[1 1C]dihidrotetrabenazina (2R,3R, 1 1 bR) acumulado en las regiones del cerebro asociadas con concentraciones más altas del transportador de dopamina de membrana neuronal (DAT) y el transportador de monoamina vesicular (VMAT2). Sin embargo, el isómero (-)-a-[11C]dihidrotetrabenzina esencialmente inactivo casi siempre se distribuyó uniformemente en el cerebro, sugiriendo que la unión específica a DAT y VMAT2 no estaba presentándose. Los estudios in vivo correlacionados con los estudios in Vitro que demostraron que el isómero de (+)- -[1 1C] dihidrotetrabenzina muestra un K¡ para [3H]metoxitetrabenazina >2000 pliegues más que el K¡ para el isómero (-)-a-[1 1C] dihidrotetrabenzina. A la fecha, hasta ahora los solicitante están concientes, los isómeros de dihidrotetrabenazina derivados de los isómeros RS y SR no estables (de aquí en adelante referidos individual o colectivamente como c/s-tetrabenazina debido a que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 1 1 b tienen una orientación relativa cis) de tetrabenazina no se han aislado y caracterizado previamente, y las actividades biológicas de estos compuestos no se han publicado aún.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado que los isómeros de dihidrotetrabenazina derivados de los isómeros RS y SR inestables (isómeros "cis") de tetrabenzina no son solamente estables sino tienen buenas propiedades biológicas inesperadamente. En particular, ciertos de los isómeros tienen configuraciones de receptor-actividad que son sugestivas de un número de ventajas sobre la tetrabenazina RR/SS actualmente en uso. Por ejemplo, varios de los isómeros, a pesar de que tienen alta afinidad para VMAT2, muestran unión mayormente reducida o imprudente de receptores de dopamina indicando que es probable que se originen aumento para los efectos secundarios dopaminérgicos encontrados con tetrabenazina. Ninguno de los isómeros mostraron inhibición del transportador de dopamina (DAT). Además, los estudios en ratas en varios de los isómeros han mostrado que carecen de los efecto secundarios sedativos no deseados asociados con tetrabenazina. La falta de actividad sedativa puede deberse a las muy bajas afinidades de algunos de los isómeros para receptores adrenérgicos. Además, mientras que uno de los efectos secundarios de tetrabenazina es depresión, varios de los isómeros de dihidrotetrabenazina muestran una afinidad para la proteína de transportador de serotonina (SERT) indicando que pueden tener actividad antidepresiva. De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, la invención proporciona 3, 1 1 b-c/s-dihidrotetrabenazina. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende 3-11 b-c s-dihidrotetrabenazina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona 3, 11 b-c/s-dihidrotetrabenazina en forma sustancialmente pura, por ejemplo, en una pureza isomérica de más de 90%, típicamente más de 95% y más preferentemente más de 98%. El término "pureza isomérica" en el presente contexto se refiere a la cantidad de 3, 1 1 b-c/s- dihidrotetrabenazina presente en relación a la cantidad total o concentración de dihidrotetrabenazina de todas las formas isoméricas. Por ejemplo, si 90% de ía dihidrotetrabenazina total presente en la composición es 3,11 b-c/s-dihidrotetrabenazina, entonces la pureza isomérica es 90%. La invención además proporciona una composición que comprende 3,11 b-c/s dihidrotetrabenazina sustancialmente libre de 3,1 1 b-írans- dihidrotetrabenazina, preferentemente conteniendo menos de 5% de 3, 1 I b-trans- dihidrotetrabenazina, más preferentemente menos de 3% de 3,11 b-írans- dihidrotetrabenazina, y más preferentemente menos de 1 % de 3, 1 1 b-írans- dihidrotetrabenazina. En otro aspecto, la invención proporciona 3, 1 1 b-c/s- dihidrotetrabenazina para utilizarse en la medicina o terapia, por ejemplo en el tratamiento de desórdenes de movimiento hipercinético tal como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, tic, disquinesis tardía y síndrome de Tourette, o en el tratamiento de depresión. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de 3, 1 1 b-c s- dihidrotetrabenazina para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de desórdenes de movimiento hipercinético tal como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, tic, disquinesia tardía y síndrome de Tourette, o el tratamiento de depresión. En un aspecto todavía adicional, la invención proporciona un método para la profilaxis o el tratamiento de un desorden de movimiento hipercinético tal como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, tic, disquinesia tardía y síndrome de Tourette, o el tratamiento de depresión en un paciente en necesidad de tal profilaxis o tratamiento, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéutica o profiláctica eficaz de 3, 1 1 b-c/s-dihidrotetrabenazina. El término "3, 1 1 b-c/'s" según se utiliza en la presente significa que los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 1 1 b de la estructura de dihidrotetrabenazina se encuentran en la orientación relativa cis. Los isómeros de la invención por lo tanto son los compuestos de la fórmula (I) y antipodos (imágenes espectrales) de los mismos.

Existen cuatro posibles isómeros de dihidrotetrabenazina que tienen la configuración 3,11b-c/s y estos son el isómero 2S,3S,11bR, el isómero 2R,3R,11bS, el isómero 2R,3S,11bR y el isómero 2S,3R,11bS. Los cuatro isómeros se han aislado y caracterizado y, en otro aspecto, la invención proporciona isómeros individuales de 3,11b-c/s- dihidrotetrabenazina. En particular, la invención proporciona: (a) el isómero 2S,3S,11bR de 3,11b-c/s- dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (la): (b) el isómero 2R,3R,11bS de 3,11b-c/s- dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (Ib): (c) el isómero 2S,3R,1 1 bS de 3, 1 1 b-c/s- dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (le): (Ic) Y (d) el isómero 2S,3R,1 1 bS de 3,1 1 b-c s- dihidrotetrabenazina que tiene la fórmula (Id): Los isómeros nuevos individuales de la invención pueden caracterizarse por sus propiedades espectroscópicas, ópticas y cromatográficas. Los isómeros preferidos son los isómeros dextrorotativos (+)• Sin implicar cualquier configuración o estereoquímica absoluta particular, los cuatro nuevos isómeros pueden caracterizarse como sigue: Isómero A La actividad óptica según se mide por ORD (metanol, 21 °C); levorotativo (-) Espectro IR (KBr sólido), espectro 1H-NMR (CDCI3) y espectro 13C-NMR (CDCI3) sustancialmente según se describe en la Tabla 1 .

Isómero B La actividad óptica según se mide por ORD (metanol, 21 °C); dextrorotativo (+) Espectro IR (KBr sólido), espectro 1 H-NMR (CDCI3) y espectro 13C-NMR (CDCI3) sustancialmente según se describe en la Tabla 1 .

Isómero C La actividad óptica según se mide por ORD (metanol, 21 °C); dextrorotativo (+) Espectro IR (KBr sólido), espectro 1 H-NMR (CDCI3) y espectro 13C-NMR (CDCI3) sustancialmente según se describe en la Tabla 2.

Isómero D La actividad óptica según se mide por ORD (metanol, 21 °C); levorotativo (-) Espectro IR (KBr sólido), espectro 1 H-N R (CDCI3) y espectro 13C-NMR (CDCI3) sustancialmente según se describe en la Tabla 2.

Los valores ORD para cada isómero se dan en los ejemplos de abajo pero se señala que tales valores se dan a manera de ejemplo y pueden variar de acuerdo al grado de pureza del isómero y la influencia de las variables tal como las fluctuaciones de temperatura y los efectos de moléculas de solvente residual. Los enantiómeros A, B, C y D pueden cada uno representarse en una forma sustancialmente enantioméricamente pura o como mezclas con otros enantiómeros de la invención. Los términos "pureza enantiomérica" y "enantioméricamente pura" en el presente contexto se refieren a la cantidad de un enantiómero dado de 3, 11 b-c/s-dihidrotetrabenazina presente en relación a la cantidad total o concentración de dihidrotetrabenazina de todas las formas isoméricas y enantioméricas. Por ejemplo, si 90% de la dihidrotetrabenazina total presente en la composición se encuentra en la forma de un enantiómero puro, entonces la pureza enantiomérica es 90%. A manera de ejemplo, en cada aspecto y modalidad de la invención, cada enantiómero individual seleccionado de los Isómeros A, B, C y D pueden presentarse en una pureza enantiomérica de al menos 55% (por ejemplo, al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o 100%). Los isómeros de la invención también pueden presentarse en la forma de mezclas de uno o más de los Isómeros A, B, C y D.

Tales mezclas pueden ser mezclas racémicas o mezclas no racémicas. Los ejemplos de mezclas racémicas incluyen la mezcla racémica de Isómero A e Isómero B y la mezcla racémica de Isómero C e Isómero D.

Sales Farmacéuticamente Aceptables Al menos que el contexto lo requiera de otra forma, una referencia en esta solicitud a la dihidrotetrabenazina y sus isómeros, incluye dentro de su alcance no solamente la base libre de la dihidrotetrabenazina sino también sus sales, y en particular sales de adición acida. Los ácidos particulares de los cuales las sales de adición acida se forman incluyen ácidos que tienen un valor pKa de menos de 3.5 y más usualmente menos de 3. Por ejemplo, las sales de adición acida pueden formarse de un ácido que tiene un pKa en el rango de +3.5 a -3.5. Las sales de adición acida preferidas incluyen aquellas formadas con ácidos sulfónicos tales como ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido sulfónico benceno, ácido tolueno-sulfónico, ácido sulfónico canfor y ácido sulfónico naftaleno. Un ácido particular del cual las sales de adición acida pueden formarse es ácido metanosulfónico. Las sales de adición acida pueden prepararse por los métodos descritos en la presente o métodos químicos convencionales tales como los métodos descritos en Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinreich Stahl (Editor), Camiile G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 páginas, Agosto 2002.

Generalmente, tales sales pueden prepararse al reaccionar la forma de base libre del compuesto con la base o ácido adecuado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, medio no acuoso tal como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetronitrilo se utilizan. Las sales son típicamente sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales que no son farmacéuticamente aceptables pueden también prepararse como formas de producto intermediario que pueden convertirse así en sales farmacéuticamente aceptables. Tales formas de sal no farmacéuticamente aceptable también forman parte de la invención.

Métodos para la Preparación de Isómeros de Dihidrotetrabenazina En un aspecto adicional, se proporciona un proceso (Proceso A) para preparar una dihidrotetrabenazina de la invención, cuyo proceso comprende la reacción de un compuesto de la fórmula (II): con un reactivo o reactivos adecuados para hidratar el enlace 2,3-doble en el compuesto de la fórmula (I I) y de ahí en adelante cuando se requiere separar y aislar una forma de isómero de dihidrotetrabenazina deseada. La hidratación del enlace 2,3-doble puede llevarse a cabo la hidroboración utilizando un reactivo de boro tal como diboro o un boro-éter (por ejemplo, boro-tetrahidrofurano (THF)) para dar un aducto de boro alquilo producto intermediario seguido por la oxidación del aducto de boro alquilo e hidrólisis en la presencia de una base. La hidroboración se lleva a cabo típicamente en un solvente no prótico polar seco tal como un éter (por ejemplo, THF), usualmente a una temperatura no elevada, por ejemplo, temperatura ambiente. El aducto de boro-alqueno típicamente se oxida con un agente oxidante tal como peróxido de hidrógeno en la presencia de una base proporcionando una fuente de iones de hidróxido, tal como hidróxido de amonio o un hidróxido de metal álcali, por ejemplo, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio. La secuencia de hidroboración-oxidación-hidrólisis de reacciones del Proceso A típicamente proporciona isómeros de dihidrotetrabenazina en los cuales los átomos de hidrógeno en las posiciones 2 y 3 tienen una orientación relativa trans. Los compuestos de la fórmula (II) pueden prepararse por la reducción de tetrabenazina para dar una dihidrotetrabenazina seguida por deshidratación de la dihidrotetrabenazina. La reducción de la tetrabenazina puede lograrse utilizando un reactivo de hidruro de aluminio tal como hidruro de aluminio de litio, o un reactivo de borohidruro tal como borohidruro de sodio, borohidruro de potasio o un derivado de borohidruro, por ejemplo, un borohidruro de alquilo tal como borohidruro de tri-sec-butilo litio. Alternativamente, la etapa de reducción puede efectuarse utilizando hidrogenación catalítica, por ejemplo, sobre un níquel Raney o catalizador óxido de platino. Las condiciones adecuadas para realizar la etapa de reducción se describen a mayor detalle abajo o pueden encontrarse en E. U. 2,843,591 (Hoffmann-La Roche) y Brossi eí al. , Helv. Chim. Acta. , vol. XLI, No. 193, pp1 793-1806 (1958). Debido a que la tetrabenazina utilizada como la materia prima para la reacción de reacción es típicamente una mezcla de los isómeros RR y SS (es decir, írans-tetrabenazina), la dihidrotetrabenazina formada por la etapa de reducción tendrá la misma configuración trans alrededor de las posiciones 3- y 1 1 b y tomarán la forma de uno o más de los isómeros de dihidrotetrabenazina conocidos mostrados en la Figura 3 de arriba. De esta manera, el Proceso A puede incluir tomar los isómeros conocidos de dihidrotetrabenazina, deshidratándolos para formar el alqueno (II) y después "rehidratando" el alqueno (II) utilizando las condiciones que dan lo nuevos isómeros de dihidrotetrabenazina cis requeridos de la invención. La deshidratación de la dihidrotetrabenazina para el alqueno (II) puede llevarse a cabo utilizando una variedad de condiciones estándares para deshidratar los alcoholes para formar alquenos, véase por ejemplo J. March (idem) páginas 389-390 y las referencias en la presente. Los ejemplos de tales condiciones incluyen el uso de agentes de deshidratación basados en fósforo tal como haluros de fósforo u oxihaluros de fósforo, por ejemplo, POCI3, y PCI5. Como una alternativa para dirigir la deshidratación, el grupo hidroxilo de la dihidrotetrabenazina puede convertirse en un grupo de salida L tal como halógeno (por ejemplo, cloro o bromo) y después someterse a condiciones (por ejemplo, la presencia de una base) para eliminar H-L. La conversión del grupo hidróxilo a un haluro puede lograrse utilizando los métodos bien conocidos por aquel experto en la materia, por ejemplo, por reacción con tetracloruro de carbono o tetrabromuro de carbono en la presencia de una fosfina de triarilo o trialquilo tal como fosfina de trifenilo o fosfina de tributilo. La tetrabenazina utilizada como la materia prima para la reducción para dar la dihidrotetrabenazina puede obtenerse comercialmente o puede sintetizarse por el método descrito en E.U. 2,830,993 (Hoffmann-La Roche). La invención también proporciona un proceso (Proceso B) para preparar una dihidrotetrabenazina de la invención, tal proceso comprende someter un compuesto de la fórmula (III): a condiciones para abertura de anillo del grupo 2,3-epóxido en el compuesto de la fórmula (III), y después se requiere separar y aislar una forma de isómero de dihidrotetrabenazina deseada. La abertura de anillo puede efectuarse de acuerdo con métodos conocidos para aberturas de anillo de epóxido. Sin embargo, un método actualmente preferido de abertura de anillo del epóxido es abertura de anillo reductiva que puede lograrse utilizando un agente reductor tal como borano-THF. La reacción con borano-THF puede llevarse a cabo en un solvente no prótico polar tal como un éter (por ejemplo, tetrahidrofuran) usualmente a temperatura ambiente, el complejo de borano así formado hidrolizándose subsiguientemente al calentar en la presencia de agua y una base a la temperatura de reflujo del solvente. Proceso B típicamente da origen a isómeros de dihidrotetrabenazina en los cuales los átomos de hidrógeno en las posiciones 2 y 3 tienen una orientación relativa cis. Los compuestos epóxido de la fórmula (III) pueden prepararse por epoxidación de un alqueno de la fórmula (II) de arriba. La reacción de epoxidación puede llevarse a cabo utilizando condiciones y reactivos bien conocidos por el químico experto, ver por ejemplo J. March (ídem), páginas 826-829 y referencias en la misma. Típicamente, un per-ácido tal como ácido meía-cloroperbenzóico ( CPBA), o una mezcla de un per-ácido y un agente oxidante adicional tal como ácido perclórico, puede utilizarse para originar epoxidación. Cuando los materiales iniciales para los procesos A y B anteriores son mezclas de enantiómeros, entonces los productos del proceso típicamente serán pares de enantiómeros, por ejemplo, mezclas racémicas, posiblemente junto con impurezas diastereoisoméricas. Los diastereoisómeros no deseados pueden removerse por técnicas tal como cromatografía (por ejemplo, HPLC) y los enantiómeros individuales pueden separarse por una variedad de métodos conocidos por el químico experto. Por ejemplo, pueden separarse por medio de: (i) cromatografía quiral (cromatografía en un soporte quiral); o (ii) formar una sal con un ácido quiral ópticamente puro, separando las sales de los dos diastereoisómeros por cristalización fraccional y después liberar la dihidrotetrabenazina de la sal; o (iii) formar un derivado (tal como un éster) con un agente de derivatización quiral ópticamente puro (por ejemplo, agente esterificante), separando los epímeros resultantes (por ejemplo, por cromatografía) y después convertir el derivado en dihidrotetrabenaziria. Un método para separar pares de enantiómeros obtenidos de cada Proceso A y B, y que se ha encontrado que es particularmente efectivo, es esterificar el grupo hidroxilo de la dihidrotetrabenazina con una forma ópticamente activa de ácido de Mosher, tal como el isómero R(+) mostrado abajo, o una forma activa del mismo: Los esteres resultantes de los dos enantiómeros de la dihidrotetrabenazina pueden entonces separarse por cromatografía (por ejemplo, HPLC) y los esteres separados hidrolizarse para dar los isómeros de dihidrotetrabenazina individuales utilizando una base tal como un hidróxido de metal álcali (por ejemplo, NaOH) en un solvente polar tal como metanol. Como una alternativa para usar mezclas de enantiómeros como los materiales iniciales en procesos A y B y después llevar a cabo la separación de enantiómeros subsiguientemente, los procesos A y B pueden cada uno llevarse a cabo en materiales iniciales de enantiómero conduciendo a productos en los cuales un enantiómero puro predomina. Los enantiómeros únicos de alqueno (II) pueden prepararse al someter tetrabenazina RR/SS a una reducción estereoselectiva utilizando borohidruro de tri-sec-butil de litio para dar una mezcla de enantiómeros SRR y RSS de dihidrotetrabenazina, separando los enantiómeros (por ejemplo, por cristalización fraccional) y después deshidratar un enantiómero único separado de dihidrotetrabenazina para dar predominante o exclusivamente un enatiómero único del compuesto de la fórmula (II). Los procesos A y B se ilustran en más detalle abajo en Esquemas 1 y 2, respectivamente. Esquema 1 El esquema 1 ilustra la preparación de isómeros de dihidrotetrabenazina individuales teniendo configuraciones 2S, 3S, 1 1 bR y 2R, 3R, 1 1 bS en las cuales los átomos de hidrógeno unidos a las posiciones 2 y 3 se instalan en una orientación relativa trans. Este esquema de reacción incluye el Proceso A definido arriba. El punto inicial para la secuencia de reacciones en el Esquema 1 es tetrabenazina (IV) comercialmente disponible que es una mezcla racémica de los isómeros ópticos RR y SS de tetrabenazina. En cada uno de los isómeros RR y SS, los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 1 1 b se instalan en una orientación relativa trans. Como una alternativa para utilizar el compuesto comercialmente disponible, tetrabenazina puede sintetizarse de acuerdo al procedimiento descrito en la patente de EE.UU. número 2,830,993 (ver en el ejemplo particular 1 1 ). La mezcla racémica de tetrabenazina RR y SS se reduce utilizando el agente reductor de borohidruro, borohidruro de tri-sec-butil de litio ("L-Selectride"), para dar una mezcla de los isómeros (V) conocidos 2S, 3R, 1 1 bR y 2R, 3S, 1 1 bS de dihidrotetrabenazina, de los cuales solamente el isómero 2S, 3R, 1 1 bR se muestra para simplicidad. Al utilizar L-Selectride más estéricamente demandante como el agente reductor de borohidruro en lugar de borohidruro de sodio, la formación de isómeros RRR y SSS de dihidrotetrabenazina se minimiza o suprime. Los isómeros (V) de dihidrotetrabenazina se reaccionan con un agente deshidratador tal como pentacloruro de fósforo en un solvente no prótico tal como hidrocarburo clorinado (por ejemplo, cloroformo o diclorometano, preferentemente diclorometano) para formar el compuesto (II) no saturado como un par de enantiómeros, solamente el enantiómero R del cual se muestra en el Esquema. La reacción de deshidratación se lleva a cabo típicamente a una temperatura inferior a temperatura ambiente, por ejemplo, a aproximadamente 0-5°C. El compuesto insaturado (II) se somete entonces a una re-hidratación estereoselectiva para generar la dihidrotetrabenazina (VI) y su imagen similar o antípodo (no mostrado) en el cual los átomos de hidrógeno en las posiciones 3 y 1 1 b se instalan en una orientación relativa cis y los átomos de hidrógeno en las posiciones 2 y 3 se instalan en una orientación relativa trans. La rehidratación estereoselectiva se realiza por un procedimiento de hidroboración utilizando borano-THF en tetrahidrofuran (THF) para formar un complejo de borano intermediario (no mostrado) que se oxida entonces con peróxido de hidrógeno en la presencia de una base tal como hidróxido de sodio. Una etapa de purificación inicial puede entonces llevarse a cabo (por ejemplo, por HPLC) para dar el producto (V) de la secuencia de reacción de rehidratación como una mezcla de los isómeros 2S, 3S, 1 1 bR y 2R, 3R, 1 1 bS de los cuales solamente el isómero 2S, 3S, 1 1 bR se muestra en el Esquema. Para separar los isómeros, la mezcla se trata con ácido de Mosher R(+), en la presencia de cloruro de oxalilo y dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano para dar un par de esteres diaestereoisoméricos (Vil) (de los cuales un diaestereoisómero se muestra) que puede entonces separarse utilizando HPLC. Los esteres individuales pueden entonces hidrolizarse utilizando un hidróxido de metal álcali tal como hidróxido de sodio para dar un isómero único (VI). En una variación de la secuencia de las etapas mostradas en el Esquema 1 , siguiendo la reducción de tetrabenazina RR/SS, la mezcla resultante de enantiómeros de dihidrotetrabenazina (V) puede separarse para dar los enantiómeros individuales. La separación puede llevarse a cabo al formar una sal con un ácido quiral tal como ácido (+) o (-) canfosulfónico, separar los diaestereoisómeros resultantes por cristalización fraccional para dar una sal de un enantiómero único y después liberar la base libre de la sal. El enantiómero de dihidrotetrabenazina separada puede deshidratarse para dar un enantiómero único de alqueno (II). La rehidratación subsiguiente del alqueno (II) dará entonces predominantemente o exclusivamente un enantiómero único de la cis-dihidrotetrabenazina (VI). Una ventaja de esta variación es que no incluye la formación de esteres de ácido Mosher y por lo tanto evita la separación cromatográfica típicamente utilizada para separar esteres de ácido de Mosher. El esquema 2 ilustra la preparación de isómeros de dihidrotetrabenazina individuales teniendo las configuraciones 2R, 3S, 1 1 bR y 2S, 3R, 1 1 bS en las cuales los átomos de hidrógeno unidos en las posiciones 2 y 3 se instalan en una orientación relativa cis. Este esquema de reacción incluye el Proceso B definido arriba. Esquema 2 PCI6 DCM (VIII) isómero único En el Esquema 2, el compuesto no saturado (II) se produce al reducir tetrabenazina para dar los isómeros (V) 2S, 3R, 1 1 bR y 2R, 3S, 1 1 bS de dihidrotetrabenazina y deshidratar con PCI5 en la manera descrita arriba en el Esquema 1 . Sin embargo, en lugar de someter el compuesto (II) a hidroboración, el enlace doble 2,3 se convierte en un epóxido por reacción con ácido meía-cloroperbenzóico (MCPBA) y ácido perclórico. La reacción de epoxidación se lleva a cabo convenientemente en un solvente de alcohol tal como metanol, típicamente a aproximadamente temperatura ambiente. El epóxido (Vil) se somete entonces a una abertura de anillo reductiva utilizando borano-THF como un agente reductor electrofílico para dar un complejo de borano intermediario (no mostrado) que se oxida entonces y separa con peróxido de hidrógeno en la presencia de un álcali tal como hidróxido de sodio para dar una dihidrotetrabenazina (VIII) como una mezcla de los isómeros 2R, 3S, 1 1 bR y 2S, 3R, 1 1 bS, de los cuales solamente 2R, 3S, 1 1 bR se muestra para simplicidad. El tratamiento de la mezcla de isómeros (VIH) con ácido de Mosher R(+) en la presencia de cloruro de oxalilo y dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano da un par de esteres epiméricos (IX) (de los cuales solamente un epímero se muestra) que puede entonces separarse por cromatografía e hidrolizarse con hidróxido de sodio en metanol en la manera descrita arriba en relación al Esquema 1. Los intermediarios químicos (II) y (III) se cree que son nuevos y representan un aspecto adicional de la invención.

Propiedades biológicas v usos terapéuticos Tetrabenazina ejerce sus efectos terapéuticos al inhibir el transportador de monoamina vesicular VMAT2 en el cerebro y al inhibir tanto receptores de dopamina pre-sinápticos y post-sinápticos. Los nuevos isómeros de dihidrotetrabenazina de la invención también son inhibidores de VMAT2, con Isómeros C y B produciendo el mayor grado de inhibición. Como tetrabenazina, los compuestos de la invención tienen solamente una baja afinidad para VMAT1 , la isoforma VMAT encontrada en los tejidos periféricos y algunas células endocrinas, indicando así que no deben producir los efectos secundarios asociados con reserpina. Los compuestos C y B también no muestran actividad inhibidora contra transferasa de O-metil de catecol (COMT), isoformas A y B de oxidasa de monoamina, e isoformas 1 d y 1 b de 5-hidroxitriptamina. De manera sorprendente, los isómeros C y B también muestran una separación remarcable de VAMT2 y actividad del receptor de dopamina en que aunque son altamente activos en la unión de VMAT2, ambos compuestos muestran solamente actividad de unión del receptor de dopamina no existente o débil y la actividad de unión DAT significativa. Esto sugiere que los compuestos pueden carecer de efectos secundarios dopaminérgicos producidos por tetrabenazina. Los isómeros C y B también ya sea son débilmente activos o inactivos como inhibidores de los receptores adrenérgicos y esto sugiere que los compuestos pueden carecer de los efectos secundarios adrenérgicos con frecuencia encontrados con tetrabenazina. De hecho, en estudios locomotores llevados a cabos en ratas, tetrabenazina mostró un efecto sedante relacionado con dosis, mientras que los efectos no sedantes se observan después de la administración de los isómeros B y C de dihidrotetrabenazina de la invención. Además, ambos Isómeros C e Isómero B son inhibidores potentes de la proteína transportadora de serotonina SERT. La inhibición de SERT es un mecanismo por el cual los antidepresores tal como fluoxetina (Prozac®) ejercen sus efectos terapéuticos. Por lo tanto, la habilidad de los Isómeros C y B para inhibir SERT indica que estos isómeros pueden actuar como antidepresores, en contraste marcado con tetrabenazina para lo cual la depresión es un efecto secundario bien reconocido. En la base de los estudios llevados a cabo a la fecha, se contempla que los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención serán útiles en la profilaxis o tratamiento de los estados de enfermedad y condiciones para las cuales tetrabenazina se utiliza actualmente o propone. De esta manera, a manera de ejemplo, y sin limitación, los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención pueden usarse para el tratamiento de desordenes de movimiento hipercinético tal como enfermedad de Huntington, hemibalismo, corea senil, desordenes tic, disquinesia tardía, distonia y síndrome de Tourette. También se contempla que los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de depresión. Los compuestos generalmente se administrarán a un sujeto en necesidad de tal administración, por ejemplo, un paciente animal o humano, preferentemente un humano. Los compuestos típicamente se administrarán en cantidades que son terapéutica o profilácticamente útiles y que generalmente no son tóxicos. Sin embargo, en ciertas situaciones, los beneficios de administrar un compuesto de dihidrotetrabenazina de la invención puede pesar más que las desventajas de cualquier efecto tóxico o efecto secundario, en cuyo caso puede considerarse deseable administrar compuestos en cantidades que se asocian con un grado de toxicidad. Una dosis diaria típica del compuesto puede estar en el rango de 0.025 miligramos a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal, por ejemplo, hasta 3 miligramos por kilogramo de peso corporal, y más típicamente 0.15 miligramos a 5 miligramos por kilogramo de peso corporal aunque dosis más altas o inferiores pueden administrarse donde se requiera. A manera de ejemplo, una dosis inicial de 12.5 mg puede administrarse 2 a 3 veces al día. La dosificación puede incrementarse por 12.5 mg al día cada 3 a 5 días hasta que la dosis efectiva y tolerada máxima se alcanza para el individuo como se determina por el médico. Por último, la cantidad de compuesto administrado está acorde con la naturaleza de la enfermedad o condición fisiológica tratándose y los beneficios terapéuticos y la presencia o ausencia de efectos secundarios producidos por un régimen de dosis dado, y será a discreción del médico.

Formulaciones Farmacéuticas La invención también proporciona compuestos de dihidrotetrabenazina como se define en la presente anteriormente en la forma de composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser en cualquier forma adecuada para administración oral, parenteral, tópica, intranasal, intrabronquial, oftálmica, ótica, rectal, intra-vaginal o transdérmica. Donde las composiciones se proponen para administración parenteral, pueden formularse para administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o para suministro directo en un tejido u órgano objetivo por inyección, infusión u otros medios de suministro. Las formas de dosificación farmacéuticas adecuadas para administración oral incluyen tabletas, cápsulas, grageas, pildoras, pastillas, jarabes, soluciones, rociadores, polvos, granulos, elixires y suspensiones, tabletas sublinguales, rociadores, hostias o parches y parches bucales. Las composiciones farmacéuticas conteniendo los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas, ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA. De esta manera, las composiciones de tableta pueden contener una dosificación unitaria de compuesto activo junto con un portador o diluyente inerte tal como una azúcar o un alcohol de azúcar, por ejemplo; lactosa, sucrosa, sorbitol o manitol; y/o un diluyente no derivado de azúcar tal como carbonato de sodio, fosfato de calcio, talco, carbonato de calcio, o una celulosa o derivado del mismo tal como celulosa de metilo, celulosa de etilo, celulosa de metil hidroxipropilo, y almidones tales como almidón de maíz. Las tabletas también pueden contener tales ingredientes estándares como agentes de unión y granulación tal como polivinilpirrolidona, desintegrantes (por ejemplo, polímeros degradables hinchables tal como carboximetilcelulosa degradada), agentes lubricantes (por ejemplo, estearatos), conservadores (por ejemplo, parabenos), antioxidantes (por ejemplo, BHT), agentes reguladores (por ejemplo fosfato o reguladores de citrato), y agentes efervescentes tales como mezclas de citrato/carbonato. Tales excipientes se conocen bien y no necesitan tratarse en detalle en la presente. Las formulaciones de cápsula pueden ser de la variedad de gelatina dura o gelatina suave y pueden contener el componente activo en forma sólida, semi-sólida o líquida. Las cápsulas de gelatina pueden formarse de gelatina animal o sintética o equivalentes derivados de planta de las mismas. Las formas de dosificación sólidas (por ejemplo, tabletas, cápsulas, etc) pueden revestirse o no revestirse, pero típicamente tienen un revestimiento, por ejemplo, un revestimiento de película protector (por ejemplo, una cera o barniz) o un revestimiento que controla la liberación. El revestimiento (por ejemplo, polímero tipo Eudragit™) puede diseñarse para liberar el componente activo a una ubicación deseada dentro del tracto gastro-intestinal. De esta manera, el revestimiento puede seleccionarse para degradar bajo ciertas condiciones pH dentro del tracto gastrointestinal, liberando así selectivamente el compuesto en el estómago o en el íleo o duodeno. En lugar de, o además de, un revestimiento, el fármaco puede presentarse en una matriz sólida comprendiendo un agente de control de liberación, por ejemplo, un agente que retrasa la liberación que puede adaptarse para liberar selectivamente el compuesto bajo condiciones de acidez variable o alcalinidad en el tracto gastrointestinal. Alternativamente, el material de matriz o revestimiento que retarda la liberación puede tomar la forma de un polímero erosionable (por ejemplo, un polímero anhídrido maléico) que se erosiona substancialmente de manera continua a medida que la forma de paso pasa a través del tracto gastrointestinal. Las composiciones para uso tópico incluyen pomadas, cremas, rociadores, parches, geles, gotas líquidas o inserciones (por ejemplo, inserciones intraoculares). Tales composiciones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos. Las composiciones para administración parenteral se presentan típicamente como soluciones aceitosas o acuosas estériles o suspensiones finas, o pueden proporcionarse en forma de polvo estéril finamente dividido para formarse extemporáneamente con agua estéril para inyección. Ejemplos de formulaciones para administración rectal o intra-vaginal incluyen pastillas y supositorios que puede, por ejemplo, formarse de un material ceroso o moldeable formado conteniendo el compuesto activo. Las composiciones para administración por inhalación pueden tomar la forma de composiciones en polvo inhalables o rociadores en polvo o líquidos, y pueden administrarse en forma estándar utilizando dispositivos inhaladores en polvo o dispositivos distribuidores en aerosol. Tales dispositivos se conocen bien. Para administración por inhalación, las formulaciones en polvo típicamente comprende el compuesto activo junto con un diluyente en polvo sólido inerte tal como lactosa. Los compuestos de la invención generalmente estarán presentes en forma de dosificación única y, como tal, típicamente contendrán suficiente compuesto para proporcionar un nivel deseado de actividad biológica. Por ejemplo, una formulación propuesta para administración oral puede contener de 2 miligramos a 200 miligramos de ingrediente activo, más usualmente de 10 miligramos a 100 miligramos, por ejemplo, 12.5 miligramos, 25 miligramos y 50 miligramos. El compuesto activo se administrará a un paciente en necesidad del mismo (por ejemplo, un paciente animal o humano) en una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico deseado.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la síntesis y propiedades de los compuestos de dihidrotetrabenazina de la invención. EJEMPLO 1 Preparación de Isómeros 2S. 3S. 1 1 bR v 2R. 3R, 1 1 Bs de Dihidrotetrabenazina 1A. Reducción de Tetrabenazina RR/SS 1 M L-Selectride en tetrahidrofurano (135 mi, 135 mmol, 2.87 e.q.) se agregó lentamente durante 30 minutos a una solución agitada de racemato RR/SS tetrabenazina (15 g, 47 mmol) en etanol (75 mi) y tetrahidrofurano (75 mi) a 0°C. Después de que la adición se completó la mezcla se agitó a 0°C por 30 minutos y después se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla se vertió en hielo triturado (300 g) y agua (100 mi) agregado. La solución se extrajo con éter de dietilo (2 x 200 mi) y los extractos etéreos combinados lavados con agua (100 mi) y parcialmente se secaron sobre carbonato de potasio anhidro. El secado se completó utilizando sulfato de magnesio anhidro y, después de la filtración, el solvente se removió a presión reducida (cubierta de la luz, temperatura de baño <20°C) para lograr un sólido amarillo pálido. El sólido se mezcló con éter de petróleo (30-40°C) y se filtró para lograr un sólido polvoso blanco (12 g, 80%). 1 B. Deshidratación de Tetrabenazina reducida 2?,3S,11bS Pentacloruro de fósforo (32.8 g, 157.5 mmol, 2.5 eq) se agregó en partes durante 30 minutos a una solución agitada del producto de tetrabenazina reducida del Ejemplo 1A (20 g, 62.7 mmol) en diclorometano (200 mi) a 0°C. Después de que la adición se completó, la mezcla de reacción se agitó a 0°C por un adicional de 30 minutos y la solución se vertió lentamente en 2M de solución de carbonato de sodio acuoso conteniendo hielo triturado (0°C). Una vez que la evolución de gas de ácido inicial había cesado la mezcla se basificó (ca. PH 12) utilizando carbonato de sodio sólido. La solución alcalina se extrajo utilizando acetato de etilo (800 mi) y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de la filtración el solvente se removió a presión reducida para lograr un aceite pardo, que se purificó por cromatografía de columna (sílice, acetato de etilo) para lograr el alqueno semi-puro como un sólido amarillo (10.87 g, 58%). 1 C. Hidratación del Alqueno Crudo del Ejemplo 1 B 2fi,3 11bS Una solución del alqueno crudo (10.87 g, 36.1 1 mmol) del Ejemplo 1 B en THF seco (52 mi) a temperatura ambiente se trató con 1 M de boro-THF (155.6 mi, 155.6 mmol, 4.30 eq) agregado en una manera de gota a gota. La reacción se agitó por 2 horas, agua (20 mi) se agregó y la solución se basificó a pH 12 con 30% de solución de hidróxido de sodio acuoso. La solución de peróxido de hidrógeno acuoso 30% (30 mi) a la mezcla de reacción de alcalina agitada y la solución se calentó a reflujo por 1 hora antes de dejarse enfriar. Se agregó agua (100 mi) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 250 mi). Los extractos orgánicos se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida para lograr un aceite amarillo (9 g). El aceite se purificó utilizando HPLC preparativo (Columna: Lichrospher Si60, 5 µm, 250 x 21.20 mm, fase móvil: hexano:etanol:diclorometano (85: 15:5); UV 254 nm, flujo: 10 mi min"1) a 350 mg por inyección seguido por la concentración de las fracciones de interés bajo vacío. El aceite de producto se disolvió así en éter y se concentró una vez bajo vacío para dar el racemato de dihidrotetrabenazina mostrado abajo como una espuma amarilla (5.76 g, 50%). 1 D. Preparación de derivados de éster de Mosher El ácido acético R-(+)-a-metoxi-a-trifluorometilo (5 g, 21.35 mmol), cloruro oxalilo (2.02 mi) y DMF (0.16 mi) se agregaron a diclorometano anhidro (50 mi) y la solución a temperatura ambiente por 45 minutos. La solución se concentró bajo presión reducida y el residuo se tomó en diclorometano anhidro (50 mi) una vez más. La solución resultante se enfrió utilizando un baño de agua fría y dimetilaminopiridina (3.83 g, 31 .34 mmol) se agregó seguido por una solución pre-seca (sobre cribas 4A) en diclorometano anhidro del producto sólido del Ejemplo 1 C (5 g, 15.6 mmol). Después de agitarse a temperatura ambiente por 45 minutos, se agregó agua (234 mi) y la mezcla se extrajo con éter (2 x 200 mi). El extracto de éter se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se pasó a través de una almohadilla de sílice y el produce se eluyó utilizando éter. El eluato de éter colectado se concentró bajo presión reducida para lograr un aceite que se purificó utilizando cromatografía de columna (sílice, hexano:éter (10: 1 )). La evaporación de las fracciones de columna colectadas de interés y la remoción del solvente a presión reducida dio un sólido que se purificó además utilizando cromatografía de columna (sílice:hexano:acetato de etilo (1 : 1 )) para dar tres componentes principales que se resolvieron parcialmente en valores máximas de éster Mosher 1 y 2. HPLC preparativa de los tres componentes (Columna:2 x Lichrospher Si60, 5 µm, 250 x 21 .20 mm, fase móvil:hexano:isopropanol (97:3), UV 254 nm; flujo: 10 mi min"1) a 300 mg de carga seguido por concentración de las fracciones de interés bajo vacío dio los derivados de éster de Mosher puros. Valor Máximo 1 (3.89 g, 46.5%) Valor Máximo 2 (2.78 g, 33%) Las fracciones correspondientes a los dos valores máximos se sometieron a la hidrólisis para liberar los isómeros de dihidrotetrabenazina individuales identificados y caracterizados como Isómeros A y B. Isómeros A y B cada uno se cree que tienen una de las siguientes estructuras 2S,3S,11W? 2í?l3R',11bS 1 E. Hidrólisis de Valor Máximo 1 para dar Isómero A 20% de solución de hidróxido de sodio acuoso (87.5 mi) se agregó a una solución de valor máximo 1 de éster Mosher (3.89 g, 7.27 mmol) en metanol (260 mi) y la mezcla se agitó y se calentó para reflujo por 150 minutos. Después de enfriarse a temperatura ambiente se agregó agua (200 mi) y la solución se extrajo con éter (600 mi), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después filtración, se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió utilizando acetato de etilo (200 mi), la solución se lavó con agua (2 x 50 mi), la fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración, se concentró bajo presión reducida para dar una espuma amarilla. Este material se purificó por cromatografía de columna (sílice, elución de gradiente de acetato de etilo:hexano (1 :1 ) a acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y el solvente se removió a presión reducida. El residuo se tomó en éter y el solvente se removió a presión reducida una vez más para dar Isómero A como una espuma blanco mate (1.1 g, 47%). Isómero A, que se cree que tiene ya sea la configuración 2S,3S,11 bR o 2R,3R,11 bS (la estereoquímica absoluta no se determinó), se caracterizó por 1H-NMR, 13C-NMR, IR, espectrometría de masa, HPLC quiral y ORD. Los datos IR, NMR y MS para Isómero A se establecen en la Tabla 1 y los datos de HPLC Quiral y de ORD se establecen en la Tabla 3. 1 F. Hidrólisis del Valor Máximo 2 para dar Isómero B 20% de solución de hidróxido de sodio acuoso (62.5 mi) se agregó a una solución de valor máximo 2 de éster Mosher (2.78 g, 5.19 mmol) en metanol (185 mi) y la mezcla se agitó y se calentó para reflujo por 150 minutos. Después de enfriarse a temperatura ambiente se agregó agua (142 mi) y la solución se extrajo con éter (440 mi), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después filtración, se concentró bajo presión reducida. El residuo se disolvió utilizando acetato de etilo (200 mi), la solución se lavó con agua (2 x 50 mi), ia fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración, se concentró bajo presión reducida. Éter de petróleo (30-40°C) se agregó al residuo y la solución se concentró bajo vacío una vez más para dar Isómero B como una espuma blanca (1.34 g, 81 %). Isómero B, que se cree que tiene ya sea la configuración 2S,3S, 1 1 bR o 2R,3R,1 1 bS (la estereoquímica absoluta no se determinó), se caracterizó por 1H-NMR, 13C-NMR, IR, espectrometría de masa, HPLC quiral y ORD. Los datos IR, NMR y MS para Isómero B se establecen en la Tabla 1 y los datos de HPLC Quiral y de ORD se establecen en la Tabla 3.

' EJEMPLO 2 Preparación de Isómeros 2R.3S.11 bR v 2S.3R.11 bS de Dihidrotetrabenazina 2A. Preparación de 2.3-Dehidrotetrabenazina Una solución que contiene una mezcla racémica (15 g, 47 mmol) de enantiómeros de tetrabenazina RR y SS en tetrahidrofurano se sometió a reducción con L-Selectride® por el método del Ejemplo 1A para dar una mezcla de los enantiómeros 2S,3R,11 bR y 2R,3S, 1 1 bS de dihidrotetrabenazina como un sólido polvoso blanco (12 g, 80%). La dihidrotetrabenazína parcialmente purificada se deshidrató así utilizando PCI5 de acuerdo al método del Ejemplo 1 B para dar una mezcla semi-pura de isómeros 11 bR y 1 1 bS de 2,3-dehidrotetrabenazina (el enantiómero 1 1 bR del cual se muestra abajo) como un sólido amarillo (12.92 g, 68%). 2B. Epoxidación del Alqueno Crudo del Ejemplo 2A A una solución agitada del alqueno crudo del Ejemplo 2A (12.92 g, 42.9 mmol) en metanol (215 mi) se agregó una solución de 70% de ácido perclórico (3.70 mi, 43 mmol) en metanol (215 mi). 77% de ácido 3-Cloroperoxibenzoico (15.50 g, 65 mmol) se agregó a la reacción y la mezcla resultante se agitó por 18 horas a temperatura ambiente protegida de la luz. La mezcla de reacción se vertió en solución de sulfito de sodio acuoso saturado (200 mi) y se agregó agua (200 mi).

Cloroformo (300 mi) se agregó a la emulsión resultante y la mezcla se basificó con bicarbonato de sodio acuoso saturado (400 mi). La capa orgánica se colectó y la fase acuosa se lavó con cloroformo adicional (2 x 150 mi). Las capas de cloroformo combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida para dar un aceite pardo (14.35 g, producción >100%-solvente probable permanece en el producto). Este material se utilizó sin mayor purificación. 2C. Abertura de Anillo Reductor del Epóxido de 2B 2S,3R11bS Una solución agitada de epóxido crudo del Ejemplo 2B (14.35 g, 42.9 mmol, asumiendo 100% de producción) en THF seco (80 mi) se trató lentamente con 1 M de boro/THF (184.6 mi, 184.6 mmol) durante 15 minutos. La reacción se agitó por dos horas, agua (65 mi) se agregó y la solución se calentó con agitación para reflujo por 30 minutos.

Después de enfriarse, 30% de solución de hidróxido de sodio (97 mi) se agregó a la mezcla de reacción seguido por 30% de solución de peróxido de hidrógeno (48.6 mi) y la reacción se agitó y se calentó a reflujo por un adicional de 1 hora. La mezcla de reacción fría se extrajo con acetato de etilo (500 mi) se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida para dar un aceite. Se agregó hexano (230 mi) al aceite y la solución se volvió a concentrar bajo presión reducida. El residuo aceitoso se purificó por cromatografía de columna (sílice, acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y el solvente se removió bajo presión reducida. El residuo se purificó una vez más utilizando cromatografía de columna (sílice, gradiente, hexano a éter). Las fracciones de interés se combinaron y los solventes se evaporaron a presión reducida para dar un sólido amarillo pálido (5.18 g, 38%). 2D. Preparación de derivados de éster Mosher del Isómeros de Dihidrotetrabenazina 2R.3S.1 1 bR v 2S.3R.1 1 bS El ácido acético R-(+)-a-metoxi-a-tp'fluorometilo (4.68 g, 19.98 mmol), cloruro oxalilo (1 .90 mi) y DMF (0.13 mi) se agregaron a diclorometano anhidro (46 mi) y la solución a temperatura ambiente por 45 minutos. La solución se concentró bajo presión reducida y el residuo se tomó en diclorometano anhidro (40 mi) una vez más. La solución resultante se enfrió utilizando un baño de agua fría y dimetilaminopiridina (3.65 g, 29.87 mmol) se agregó seguido por una solución pre-seca (sobre cribas 4A) en diclorometano anhidro (20 mi) del producto sólido del Ejemplo 2C (4.68 g, 14.6 mmol). Después de agitarse a temperatura ambiente por 45 minutos, se agregó agua (234 mi) y la mezcla se extrajo con éter (2 x 200 mi). El extracto de éter se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se pasó a través de una almohadilla de sílice y el produce se eluyó utilizando éter. El eluato de éter colectado se concentró bajo presión reducida para lograr un aceite que se purificó utilizando cromatografía de columna (sílice, hexano:éter (1 : 1 )). La evaporación de las fracciones de columna colectadas de interés y la remoción del solvente a presión reducida dio rosa (6.53 g). HPLC preparativa de los tres componentes (Columna:2 x Lichrospher Si60, 5 µm, 250 x 21 .20 mm, fase móvil:hexano:isopropanol (97:3), UV 254 nm; flujo: 10 mi min"1) a 100 mg de carga seguido por concentración de las fracciones de interés bajo vacío dio un sólido que se mezcló con éter de petróleo (30-40°C) y se colectó por filtración para dar los derivados de éster Mosher puros.

Valor Máximo 1 (2.37 g, 30%) Valor Máximo 2 (2.42 g, 30%) Las fracciones correspondientes a los dos valores máximos se sometieron a la hidrólisis para liberar los isómeros de dihidrotetrabenazina individuales identificados y caracterizados como Isómeros C y D. Isómeros C y D cada uno se cree que tienen una de las siguientes estructuras 2R.3S,11bR 2S,3R,11bS 2F. Hidrólisis de Valor Máximo 1 para dar Isómero A 20% de solución de hidróxido de sodio acuoso (53 mi) se agregó a una solución agitada de valor máximo 1 de éster Mosher (2.37 g, 4.43 mmol) en metanol (158 mi) y la mezcla se agitó y se calentó para reflujo por 150 minutos. Después de enfriarse se agregó agua (88 mi) a la mezcla de reacción y la solución resultante se extrajo con éter (576 mi). El extracto orgánico se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida. Acetato de etilo (200 mi) se agregó al residuo y la solución se lavó con agua (2 x 50 mi). La solución orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida. Este residuo se trató con éter de petróleo (30-40°C) y el sólido suspendido resultante se colectó por filtración. El filtrado se concentró a presión reducida y el segundo grupo de sólido suspendido se colectó por filtración. Ambos sólidos colectados se combinaron y se secaron bajo presión reducida para dar Isómeros C (1 .0 g, 70%). Isómero C, que se cree que tiene ya sea la configuración 2S,3S, 1 1 bR o 2R,3R,1 1 bS (la estereoquímica absoluta no se determinó), se caracterizó por 1H-NMR, 13C-NMR, IR, espectrometría de masa, HPLC quiral y ORD. Los datos IR, NMR y MS para Isómero C se establecen en la Tabla 2 y los datos de HPLC Quiral y de ORD se establecen en la Tabla 4. 2G. Hidrólisis del Valor Máximo 2 para dar Isómero B 20% de solución de hidróxido de sodio acuoso (53 mi) se agregó a una solución de valor máximo 2 de éster Mosher (2.42 g, 4.52 mmol) en metanol (158 mi) y ia mezcla se agitó por 150 minutos. Después de enfriarse se agregó agua (88 mi) a la mezcla de reacción y la solución resultante se extrajo con éter (576 mi). El extracto orgánico se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida. Acetato de etilo (200 mi) se agregó al residuo y la solución se lavó con agua (2 x 50 mi). La solución orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y después de la filtración el solvente se removió a presión reducida. Este residuo se trató con éter de petróleo (30-40°C) y el sólido naranja suspendido resultante se colectó por filtración. El sólido se disolvió en acetato de etilo:hexano (15:85) y se purificó por cromatografía de columna (sílice, gradiente acetato de etilo:hexano (15:85) a acetato de etilo). Las fracciones de interés se combinaron y el solvente se removió a presión reducida. El residuo se mezcló con éter de petróleo (30-40°C) y la suspensión resultante se colectó por filtración. El sólido colectado se secó bajo presión reducida para dar Isómero D como un sólido blanco (0.93 g, 64%). Isómero D, que se cree que tiene ya sea la configuración 2S,3S, 1 1 bR o 2R,3R, 1 1 bS (la estereoquímica absoluta no se determinó), se caracterizó por 1H-NMR, 13C-NMR, IR, espectrometría de masa, HPLC quiral y ORD. Los datos IR, NMR y MS para Isómero D se establecen en la Tabla 2 y los datos de HPLC Quiral y de ORD se establecen en la Tabla 4. En las Tablas 1 y 2, los espectros infrarrojos se determinaron utilizando el método de disco KBr. Los espectros 1 H NMR se llevaron a cabo en soluciones en cloroformo deuterizado utilizando un espectrómetro Varían Gemini NMR (200 MHz). Los espectros 13C NMR se llevaron a cabo en soluciones en cloroformo deuterizado utilizando un espectrómetro Varian Gemini NMR (50 MHz). Los espectros de masa se obtuvieron utilizando un espectrómetro de Micromasa Plataforma II (condiciones ES+). En las Tablas 3 y 4, las figuras de Dispersión Rotativa Óptica se obtuvieron utilizando un instrumento PolAAr2001 de Actividad Óptica en solución de metanol a 24°C. Las mediciones de tiempo de retención de HPLC se llevaron a cabo utilizando una cromatografía HP1050 HPLC con detección UV.

Tablas 1 v 2 - Datos Espectrópicos Tablas 3 v 4 - Cromatografía y Datos ODR EJEMPLO 3 Método Alternativo de Preparación de Isómero B y Preparación de Sal de Mesílato 3A. Reducción de Tetrabenzina RR/SS RR/SS tetrabepazina jj redución de L-Selectride 1 M L-Selectride en tetrahidrofurano (52 mi, 52 mmol, 1.1 e.q.) se agregó lentamente durante 30 minutos a una solución agitada fría (baño frío), de racemato de tetrabenazina (15 g, 47 mmol) en tetrahidrofurano (56 mi). Después de que la adición se completó, la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó por un adicional de seis horas. El análisis TLC (sílice, acetato de etilo) mostró solamente muy pocas cantidades menores de materia prima permaneciente. La mezcla se vertió en una mezcla agitada de hielo triturado (112 g), agua (56 mi) y ácido glacial acético (12.2 g). La solución amarilla resultante se lavó con éter (2 x 50 mi) y se basificó por la adición lenta de carbonato de sodio sólido (ca. 13g). Pet-éter (30-40°C) se agregó a la mezcla con agitación y el ß-DHTBZ crudo se colectó como un sólido blanco por filtración. El sólido crudo se disolvió en diclorometano (ca. 150 mi) y la solución resultante se lavó con agua (40 mi), se secó utilizando sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida a ca. 40 mi. Una suspensión gruesa de sólido blanco se formó. Pet-éter (30-40°C) (56 mi) se agregó y la suspensión se agitó por quince minutos a temperatura de laboratorio. El producto se colectó por filtración y se lavó en el filtro hasta que volverse nieve blanco utilizando pet-éter (30-40°C) (40 a 60 mi) antes de secarse a temperatura ambiente para producir ß-DHTBZ (10.1 g, 67%) como un sólido blanco. El análisis TLC (sílice, acetato de etilo) mostró solamente un componente. 3B. Preparación v Cristalización Fraccional de la sal de ácido canforsulfónico de ß-DHTBZ racémico El producto del Ejemplo 3A y 1 equivalente de ácido (S)- (+)-Canfor-10-sulfónico se disolvieron con el calentamiento en la cantidad mínima de metanol. La solución resultante se dejó enfriar y después se diluyó lentamente con éter hasta que la formación de la precipitación sólida resultante se completó. El sólido cristalino blanco resultante se colectó por filtración y se lavó con éter antes de secarse. La sal de ácido canforsulfónico de (10 g) se disolvió en una mezcla de etanol absoluto caliente (170 mi) y metanol (30 mi). La solución resultante se agitó y se dejó enfriar. Después de dos horas, el precipitado formado se colectó por filtración como un sólido cristalino blanco (2.9 g). Una muestra del material cristalino se agitó en un embudo separado con carbonato de sodio acuoso saturado en exceso y diclorometano. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se trituró utilizando pet.-éter (30-40°C) y la solución orgánica se concentró una vez más. El análisis de HPLC quiral de la sal utilizando una columna Chirex (S)-VAL y (R)-NEA 250 x 4.6 mm, y un hexano:etanol (98:2) eluyente a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto mostró que el ß-DHTBZ aislado se enriqueció en un enantiómero (e.e. ca. 80%). La sal de ácido canforsulfónico enriquecido (14 g) se disolvió en etanol absoluto caliente (140 mi) y propan-2-ol (420 mi) se agregó. La solución resultante se agitó y un precipitado comenzó a formarse dentro de un minuto. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y se agitó por una hora. El precipitado formado se colectó por filtración, se lavó con éter y se secó para dar un sólido cristalino blanco (12 g). El material cristalino se agitó en un embudo separado con carbonato de sodio acuoso saturado separado y diclorometano. La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se trituró utilizando pet-éter (30-40°C) y la solución orgánica se concentró una vez más para producir (después de secarse al vacío). (+)-ß-DHTBZ (6.6 g, ORD + 107.8°). El entantiómero aislado tiene e.e. >97%. 3C. Preparación de Isómero B Una solución de pentacloruro de fósforo (4.5 g, 21 .6 mmol, 1 .05 eq) en diclorometano (55 mi) se agregó constantemente durante diez minutos a una solución agitada, fría (baño de agua fría) del producto del Ejemplo 3B (6.6 g, 20.6 mmol) en diclorometano (90 mi). Cuando la adición se completó, la solución amarilla resultante se agitó por un adicional de diez minutos antes de verterse sobre una mezcla rápidamente agitada de carbonato de sodio (15 g) en agua (90 mi) y hielo triturado (90 g). La mezcla se agitó por un adicional de 10 minutos y se transfirió a un embudo separado. Una vez que las fases se habían separado, la capa de diclorometano café se removió, se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida para dar el producto intermediario alqueno crudo como aceite pardo (ca. 6.7 g). El análisis TLC (sílice, acetato de etilo) mostró que nada de (+)-ß-DHTBZ permaneció en el producto crudo. El alqueno crudo se tomó (atmósfera de nitrógeno seco) en tetrahidrofurano anhidro (40 mi) y una solución de boro en THF (1 M de solución, 2.5 eq, 52 mi) se agregó con agitación durante quince minutos. La mezcla de reacción se agitó así a temperatura ambiente por dos horas. El análisis TLC (sílice, acetato de etilo) mostró que nada de producto intermediario alqueno permaneció en la mezcla de reacción. Una solución de hidróxido de sodio (3.7 g) en agua (10 mi) se agregó a la mezcla de reacción resultante, seguida por una solución acuosa de peróxido de hidrógeno (50%, ca. 7 mi) y la mezcla de dos fases formada se agitó a reflujo por una hora. El análisis TLC de la fase orgánica en este momento (sílice, acetato de etilo) mostró la apariencia de un producto con Rf según se espera para Isómero B. Un componente no polar característico también se observó. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en un embudo separado. La capa orgánica superior se removió y se concentró bajo presión reducida para remover la mayoría de THF. El residuo se tomó en éter (estabilizado (BHT), 75 mi), se lavó con agua (40 mi), se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró, y se concentró bajo presión reducida para dar un aceite amarillo pálido (8.1 g). El aceite amarillo se purificó utilizando cromatografía de columuna (sílice, acetato de etilo:hexano (80:20) aumentando a 100% de acetato de etilo) y las fracciones de columna deseada se colectaron, se combinaron y se concentraron a presión reducida para dar un aceite amarillo que se trató con éter (estabilizado, 18 mi) y se concentró a presión reducida para dar Isómero B como una espuma sólida amarillo pálido (2.2 g). HPLC quiral utilizando las condiciones establecidas en el Ejemplo 3B confirmó que Isómero B se había producido en un exceso enantiomérico (e.e.) de más de 97%. La rotación óptica se midió utilizando un polarímetro Bellingham Stanley ADP220 y dio [aD] de +123.5°. 3D. Preparación de la Sal de Mesilato de Isómero B La sal de metanosulfonato de Isómero B se preparó al disolver una mezcla de 1 equivalente de Isómero B del Ejemplo 3C y 1 equivalente de ácido metanosulfónico en la cantidad mínima de etanol y después se agrega éter de dietilo. El precipitado blanco resultante que se formó, se colectó por filtración y se secó al vacío para dar la sal de mesilato en una producción de ca. 85% y una pureza (por HPLC) de ca. 96%.

EJEMPLO 4 Selección para actividad de unión de VMAT-2 utilizando un ensayo de unión de f3H1Díhidrotetrabenazina Dihidrotetrabenazina es un inhibidor selectivo y muy potente de VMAT-2, y se une con alta afinidad (rango nM) a este transportador vesicular. [3H]Dihidrotetrabenazina se ha utilizado exitosamente por varios años como un radioligando para marcar VMAT-2 en cerebro humano, de bovino y de roedor (por ejemplo, Scherman ef al., J. Neurochem. 50, 1131 -1136 (1988); Near ef al., Mol. Pharmacol. 30, 252-257 (1986); Kilbourn et al. Eur. J. Pharmacol. 278, 249-252 (1995); y Zucker er al. Life Sci. 69, 2311-2317 (2001 )). Los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D se probaron por su habilidad para inhibir el transportador VMAT-2 utilizando el ensayo abajo descrito.

Métodos y Materiales Las membranas del cerebro anterior (cepa Wistar) se prepararon esencialmente según se describe por Chazot et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 45, 605-610. Las membranas vesiculares estriadas de rata adulta se prepararon esencialmente según se describe por Roland et al. (2000), JPET 293, 329-335. 10 µg de Membranas se incubaron a 25°C con [3H] dihidrotetrabenazina (18-20 nM) en 50 mM de HEPES pH 8.0 (regulador de ensayo), por 60 minutos, y el radioligando unido se colectó por filtración rápida bajo vacío en filtros de fibra de vidrio GF/B. La unión no específica se determinó en muestras paralelas en la presencia de 2 µM de tetrabenazina no marcada. La radioactividad se contó en fluido de escintilación en un contador ß. Un rango de concentración completa (unidades log y mitad log) de cuatro compuestos de prueba (Isómeros A, B, C y D) se ensayaron (rango: 10"11 - 10"4M) en triplicado. Los compuestos de prueba y tetrabenazina se disolvieron en DMSO a una concentración concentrada de 10 mM, y las diluciones después se prepararon en regulador de ensayo. Tres experimentos independientes se realizaron por cada compuesto. Los datos se analizaron y se fijaron por curva utilizando el paquete GraphPad Prism 3.2.

Resultados Inicialmente, una preparación de membrana de cerebro anterior de rata adulta P2 (Chazot ef al. , 1993) se preparó y se ensayo según se describe en el protocolo original. Esto produjo un bajo nivel de actividad de unión especíica. Una preparación vesicular estriada de rata adulta se preparó así, lo cual produjo un nivel importante de sitios de unión [3H]Dihidrotetrabenazina específica estable (5-6 pmol/mg de proteína). Esto se compara bien con datos publicados (Roland et al. 2000). Esta preparación se utilizó para todos los ensayos subsecuentes.

Tabla 5 - Parámetros de unión de competencia para los compuestos de prueba Los datos son promedio + SD para tres experimentos independientes. Los valores K se determinaron en base a un valor KD estriado de rata de 1 .2 nM (Roland et al., 2000). La configuración farmacológica global en términos de valores K? globales es Isómero C > Isómero B > Isómero D >> Isómero A. Notablemente, tanto Isómero B como Isómero A produjeron curvas de competencia superficiales, que se ajustaron mejor a un modelo de unión de dos sitios. Isómero A mostró un sitio de alta afinidad (K?=59 nM) y de baja afinidad (Ki <5.9 µM de afinidad), cada uno contribuyendo a aprox. 50% de los sitios en total. Esto puede indicar que el Isómero A puede diferenciarse entre los sitios de unión de VMAT-2 estriados diferentes.

EJEMPLO 5 Ensayos Funcionales de VMAT A. Ensayo Funcional VMAT2 Se prepararon las vesículas sinápticas estriadas de rata esencialmente según se describe en el Ejemplo 3. De esta manera, una preparación de membrana estriada de rata P2 (Chazot ef al. , 1993) se volvió a suspender y se homogenizó en agua destilada de agua fría. La osmolaridad se restauró por adición de 25 mM de HEPES y 100 mM de tartrato de potasio (pH 7.5, 4C). La preparación se centrifugó así por 20 minutos a 20,000 x g (4°C). La fracción S3 resultante se removió, se agregó sulfato de magnesio (para dar una concentración final de 1 mM, pH 7.5, 4°C), y la mezcla se centrifugó a 100,000 x g por 45 minutos. La fracción P4 final contiene las vesículas sináptica para el ensayo. Una alícuota de 100 µl (aprox. 2.5 µg de proteína) de vesículas sináptica se preincubó con concentraciones crecientes de los compuestos de prueba C y B (preparados frescos como una solución de 10"2 M en DMSO) por 30 minutos (rango de concentración 10"9M - 10"4M), y después por 3 minutos en el regulador de ensayo (25 mM de HEPES, 100 mM de tartrato de potasio, 1.7 mM de ácido ascórbico, 0.05 mM de EGTA, 0.1 mM de EDTA, 2 mM de ATP-Mg2+, pH 7.5), en la presencia de [3H]dopamina (30 nM de concentración final) a 30°C. La reacción se terminó así por adición de regulador de ensayo de regulador de agua fría pH 7.5, conteniendo 2 mM de MgSO4 en lugar de 2 mM de ATP-Mg2+, y la rápida filtración lograda a través de filtros Whatman se enjuagó en 0.5% de polietilenoimina. Los filtros se lavaron tres veces con regulador frío utilizando un Colector Brandel. La radioactividad atrapada en los filtros se contó utilizando un contador de escintilación y la unión no específica se determinó al medir la toma de [3H]dopamina vesicular a 4°C. El método se basó en aquel descrito en Ugarte YV ef al. (2003) Eur. J. Pharmacol. 472, 165-171. La toma VMAT-2 selectiva se definió utilizando 10 µM de tetrabenazina. Tanto el Compuesto C (IC50 aparente = 18 + 2 nM) como el Compuesto B (IC50 aparente = 30 + 3 nm) inhibió la toma [3H]dopamina en vesículas estriadas de rata por medio del transportador VMAT-2 con afinidades funcionales (configuración C>B) similares a sus afinidades de unión respectivas determinadas utilizando el ensayo de unión de [3H]Dihidrotetrabenazina.

B. Ensayo Funcional de VMAT1 Existen tejidos nativos muy limitados que poseen VMAT1 solo, en aislamiento de VMAT2. Sin embargo, la tetrabenazina muestra a Imenos una afinidad mayor de 200 pliegues para VMAT2 en comparación a VMAT1 , y esta discriminación puede utilizarse para bloquear la influencia de VMAT2 en el ensayo funcional (Ericsson et al. (1996) PNAS (USA) 93.5166-5171 ). Las células de cromafina adrenales se aislaron de ratas SD adultas jóvenes esencialmente según se describe en Moshharov et al. (2003) J Neurosci. 23, 5835-5845. De esta manera, las glándulas adrenales se cortaron en PBS frío, la cápsula y la corteza de las glándulas se removieron y las médulas restantes se molieron. Después de lavados múltiples con PBS, el tejido se incubó con solución IA de colagenasa libre de Ca2+ (250U/ml) por 30 minutos a 30°C con agitación suave. El tejido digerido se enjuagó tres veces y las células disociadas se centrifugaron a 3000 rpm para formar una pastilla, que se volvió a suspender en PBS. La fracción vesicular se aisló en una forma idéntica a aquella descrita para la preparación del cerebro. 100 µl (aprox. 2.5 µg de proteína) de vesículas sinápticas se preincubaron con concentraciones crecientes de compuesto de prueba (preparado según se describe previamente para ensayo de unión) por 30 minutos (rango de concentración 10"9M - 10"4M). El ensayo se realizó por 3 minutos a 30°C en el regulador de ensayo (25 mM de HEPES, 100 mM de tartrato de potasio, 1.7 mM de ácido ascórbico, 0.05 mM de EGTA, 0.1 mM de EDTA, 2 mM de ATP-Mg2+, pH 7.5), en la presencia de [3H]dopamina (30 nM de concentración final). La toma [3H]dopamina se midió en la presencia de 10 µM de tetrabenazina (selectivamente bloquea VMAT2 en esta concentración). La toma no específica se determinó al medir la toma [3H]dopamina vesicular a 4°C. La reacción se terminó así por adición de regulador de ensayo de regulador de agua fría pH 7.5, conteniendo 2 mM de MgSO4 en lugar de 2 mM de ATP-Mg +, y la filtración rápida lograda a través de filtros Whatman se enjuagó en 0.5% de polietilenoimina. Los filtros se lavaron tres veces con regulador frío utilizando un Colector Brandel y la radioactividad atrapada en los filtros se contó utilizando un contador de escintilación líquida. En la presencia de 10 µM de Tetrabenazina, tanto el Compuesto B como el Compuesto C inhibieron escasamente la toma de [3H]dopámina, los valores IC50 siendo mayores a 10"5M para ambos compuestos. Esto indica que ambos compuestos tienen una baja afinidad de VMAT-1. Además, los datos muestran que ambos compuestos tienen al menos 2 órdenes de selectividad de magnitud para VMAT-2 sobre VMAT-1.

EJEMPLO 6 Estudios de Unión de Proteína del Receptor y Transportador Los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D se sometieron a ensayos de unión específica para probar su habilidad para unirse a las proteínas de los receptores y transportador abajo descritas. Los resultados se establecen en la Tabla 6. (a) Receptor Adrenérgica a2A-' Referencia: S. Uhlen ef al. J. Pharmacol. Exp. Ther. , 271 : 1558-1565 (1994) Fuente: células de insecto recombinante humanas Sf9 Ligando: 1 nM [3H]MK-912 Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 60 minutos @ 25°C Regulador de incubación: 75 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 12.5 mM de MgCI2, 2 mM de EDTA Ligando no Específico: 10 µM de WB-4101 Kd: 0.6 nM B ax^ 4.6 pmol/mg de proteína Unión específica: 95% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (b) Receptor Adrenérgica a2B: Referencia: S. Uhlen ef al. J. Pharmacol. Exp. Ther. , 33 (1 ): 93-1 -1 (1998) Fuente: células de insecto recombinante humanas CHO-K1 Ligando: 2.5 nM [3H]Rauwolscine Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 60 minutos @ 25°C Regulador de incubación: 50 mM de Tris-HCI, 1 mM de EDTA, 12.5 mM de MgCI2, pH 7.4, 0.2% de BSA a 25°C Ligando no Específico: 10 µM de Prazosin Kd: 2.1 nM Bmax: 2.1 pmol/mg de proteína Unión específica: 90% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (c) Receptor Dopamina D^ Referencia: Dearry ef al. , Nature, 347:72-76 (1990) Fuente: células CHO recombinantes humanas Ligando: 1 .4 nM [3HJSCH23390 Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 2 horas @ 37°C Regulador de incubación: 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 150 nM de NaCI, 1 .4 nM de ácido ascórbico, 0.001 % de BSA Ligando no Específico: 10 µM de (+)-butaclamol Kd: 1 .4 nM Bmax: 0.63 pmol/mg de proteína Unión específica: 90% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (d) Receptor Dopamina D2L: Referencia: Bunzo ef al. , Nature, 336:783-787 (1998) Fuente: células CHO recombinantes humanas Ligando: 0.16 nM [3H]Spiperona Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 2 horas @ 25°C Regulador de incubación: 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 150 nM de NaCI, 1 .4 nM de ácido ascórbico, 0.001 % de BSA Ligando no Específico: 10 µM de Haloperidol Kd: 0.08 nM Bma?: 0.48 pmol/mg de proteína Unión específica: 85% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (e) Receptor Dopamina D3: Referencia: Sokoloff ef al. , Nature, 347: 146-151 (1990) Fuente: células CHO recombinantes humanas Ligando: 0.7 nM [3H]Spiperona Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 2 horas @ 37°C Regulador de incubación: 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 150 nM de NaCI, 1 .4 nM de ácido ascórbico, 0.001 % de BSA Ligando no Específico: 25 µM de S(-)-Sulpiride Kd: 0.36 nM Bma?: 1 .1 pmol/mg de proteína Unión específica: 85% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (f) Receptor Imidazolina l2 (Central): Referencia: Brown ef al. , Brit. J. Pharmacol. , 99:803-809, (1990) Fuente: corteza cerebral de rata Wistar Ligando: 2 nM [3H]idazoxan Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 30 minutos @ 25°C Regulador de incubación: 50 mM de Tris-HCI, 0.5 mM de EDTA, pH 7.4 a 25°C Ligando no Específico: 1 µM de Idazoxan Kd: 4 nM Bmax: 0.14 pmol/mg de proteína Unión específica: 85% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (g) Receptor Sigma s^ Referencia: Ganapathy ef al. , Pharmacol. Exp. Ther. , 289:251 -260, (1999) Fuente: células jurkat humanas Ligando: 8 nM [3H]Haloperidol Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 4 horas @ 25°C Regulador de incubación: 5 mM de K2HPO4/KH2PO4 regulador pH 7.5 Ligando no Específico: 10 µM de Haloperidol Kd: 5.8 nM Bmax: 0.71 pmol/mg de proteína Unión específica: 80% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (h) Receptor Sigma s2: Referencia: Hashimoto ef al. , Eur. J. Pharmacol. , 236: 159-163, (1993) Fuente: cerebro de rata Wistar Ligando: 3 nM [3H]lfenprodil Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 60 minutos @ 37°C Regulador de incubación: 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4 Ligando no Específico: 10 µM de lfenprodil Kd: 5.8 nM Bmax: 1 .3 pmol/mg de proteína Unión específica: 85% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (i) Transportador Serotonina (SERT) : Referencia: Gu et al. , J. Biol. Chem. , 269(10):7124-7130, (1994) Fuente: células recombinantes humanas HEK-293 Ligando: 0.15 nM [125l]RTI-55 Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 3 horas @ 4°C Regulador de incubación: 100 mM de NaCI, 50 mM de Tris HCI, 1 µM de Leupeptina, 10 µM de PMSF, pH 7.4 Ligando no Específico: 10 µM de Imipramina Kd: 0.17 nM BmaX: 0.41 pmol/mg de proteína Unión específica: 95% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (j) Transportador Dopamina (DAT): Referencia: Giros ef al., Trenes Pharmacol. Sci. , 14, 43-49 (1993) Gu ef al. , J. Biol. Chem., 269(10):7124-7130 (1994) Fuente: células recombinantes humanas CHO Ligando: 0.15 nM [125l]RTI-55 Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de incubación/Temp: 3 horas @ 4°C Regulador de incubación: 100 mM de NaCI, 50 mM de Tris HCI, 1 µM de Leupeptina, 10 µM de PMSF, pH 7.4 Ligando no Específico: 10 µM de Nomifensina Kd: 0.58 nM Bmax: 0.047 pmol/mg de proteína Unión específica: 90% Método de Cuantificación: Unión de radioligando Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima Tabla 6 EJEMPLO 7 Ensayos de Enzima Los isómeros B y C se probaron por su habilidad para inhibir las enzimas incluidas en el procesamiento de monoaminas en el SNC, principalmente Transferasa Catecol O-Metilo (COMT), Oxidasa Monoamina A y Oxidasa Monoamina B. Los métodos de ensayo utilizado se describen abajo y los resultados se establecen en la Tabla 7. (a) Inhibición de Transferasa Catecol O-Metilo (COMT) Fuente: hígado porcino Substrato: 3 mM de catecol + S-adenosil-L-[3H]-metionina Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de pre-incubación/Temp: Ninguno Tiempo de incubación: 60 minutos @ 37°C Regulador de incubación: 100 mM de fosfato de potasio, 10 mM de MgCI2, 3 mM de DTT que contiene 12 unidades/ml de deaminasa adenosina, pH 7.4 Método de cuantificación: Cuantificación de [3H]giacol. Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima (b) Inhibición de Oxidasa Monoamina MAO-A Fuente: humana recombinante Substrato: 50 µM de kinuramina Vehículo: 1 % de DMSO Tiempo de pre-incubación/Temp: 15 minutos @ 37°C Tiempo de incubación: 60 minutos @ 37°C Regulador de incubación: 100 mM de KH2PO4, pH 7.4 Método de cuantificación: Cuantificación espectrofluorimétrica de 4-hidroxiquinolina Criterio de importancia: >50% de estimulación o inhibición máxima Tabla 7 EJEMPLO 8 Ensayos Celulares La habilidad de isómeros B y C para inhibir la toma de serotonina (5-hidroxitriptamina) por células de riñon embriónico humanas se midió utilizando las siguientes condiciones de ensayo: Objetivo: células humanas HEK-293 Vehículo: 0.4% de DMSO Tiempo de Incubación/Temp: 10 minutos @ 25°C Regulador de Incubación: 5 mM de Tris-HCI, 7.5 mM de HEPES, 120 mM de NaCI, 5.4 mM de KCI, 1.2 mM de CaCI2, 1.2 mM de MgSO , 5 mM de glucosa, 1 mM de ácido ascórbico, pH 7.1 Método de Cuantificación: Cuantificación de toma [ H]serotonina Criterio de importancia: >50% de inhibición de toma [3H]serotonina en relación a la respuesta de fluxetina.

Resultados El compuesto B se mostró que era un antagonista y produjo 56% de inhibición de toma de serotonina a una concentración de 10 µM. El compuesto B tuvo un IC5o de 7.53 µM. El compuesto C también se mostró que era un antagonista y produjo 86% de inhibición de toma de serotonina a una concentración de 10 µM. El compuesto B tuvo un IC50 de 1 .29 µM.

EJEMPLO 9 Ensayo de Unión 5-HT I ? R La habilidad del Compuesto B y el Compuesto C para unirse a receptores 5-HT 1 D/I B se probó utilizando un ensayo basado en el descrito por Millan, MJ ef al. (2002) Pharmacol. Biochem. Behav. 71 , 589-598. [N-metil 3H] GR-125743 se utilizó como el radioligando para ambos receptores 5-HT1 D como 5-HT1 B. Las membranas P2 del cerebro anterior de rata SD adulta (Chazot ef al. , 1993) se utilizaron para el ensayo. El regulador de ensayo utilizado fue 50 mM de Tris-HCI pH 7.7 a temperatura ambiente conteniendo 4 mM de cloruro de calcio, 0.1 % de ácido ascórbico y 10 µM de pargilina, 5-HT (10 µM) se utilizó para definir la unión no específica. La incubación con 1 nM [3H]GR-125743 se llevó a cabo por una hora a temperatura ambiente, y la reacción se terminó por filtración rápida utilizando un Colector Brandel a través de los filtros GF/B pre-remojados en 0.1 % de polietilenoimina, seguida por tres lavados con regulador de agua fría (complementado con 0.1 % de BSA). Un rango de dosis de 10"10-10~4 se utilizó. Las curvas de competencia resultantes se analizaron utilizando el paquete GraphPad Prism 4. Ambos compuestos B y C mostraron escaso desplazamiento de unión [3H] [N-metil] GR-125743 a las membranas de cerebro anterior de rata (valores IC50 >10"4M), sugiriendo que tanto B como C tienen una baja afinidad para los receptores 5-HT 1 D/B- EJEMPLO 10 Determinación de la Permeabilidad Intestinal de Dihidrotetrabenazina Isómeros A, B, C v D utilizando el Ensayo de Absorción Caco-2 El ensayo de absorción Caco-2 es un sistema bien establecido para la estimación in Vitro de la absorción intestinal in vivo de fármacos - véase Meunier ef al., Cell Biology and Toxicology, 11 :187-194, Wils ef al., Cell Biology and Toxicology, 10:393-397, y Gres ef al., Pharm Sci, 15(5):726-732. El ensayo depende de la habilidad de las células Caco-2 para diferenciarse en entericitos cuando se cultivan en un filtro imcroporoso por un período de aproximadamente 21 días. Durante el período de cultivo, las células Caco-2 superan cambios morfológicos espontáneos y bioquímicos, que producen una monocapa polarizada con un borde de cepillo bien definido en la superficie apical, así como también articulares celulares estrechas. Por lo tanto, estas células pueden utilizarse como un modelo in Vitro para el análisis de permeabilidad de fármaco. La absorción a través de la monocapa de Caco-2 puede medirse en dos direcciones: apical-a-basolateral o basolateral-a-apical, al agregar el compuesto a la cámara apical o basolateral, respectivamente. En diversos puntos de tiempo, las muestras se colectan del receptor-cámara para el análisis para la velocidad de absorción según se mide por el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) a través de la monocapa. El valor Papp refleja una combinación de la permeabilidad del artículo de prueba a través de ambas trayectorias, transcelulares (a través de las membranas celulares) y las paracelulares (a través de las articulaciones estrechas entre las células). La contribución relativa de estas trayectorias depende de pKa, coeficiente de división (Log D), radio molecular, y carga del artículo de prueba a un pH dado. Los valores Papp pueden utilizarse así para clasificar-ordenar los compuestos por su permeabilidad a través de las monocapas de Caco-2. Los coeficientes de permeabilidad aparente {Papp) de los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina A, B, C y D a 50 µM se determinaron utilizando el modelo de absorción de Caco-2 y se clasificaron en relación a los compuestos de referencia de baja, media y alta permeabilidad. Los estándares de referencia radio-marcados mannitol (bajo), ácido salicílico (medio) y testosterona (alta) se utilizaron para establecen un orden de clasificación de la permeabilidad. El valor Papp de cada artículo de prueba de dihidrotetrabenazina se estimó al medir su concentración en los compartimientos del donador y receptor después de 1 hora. La absorción se determinó a pH 7.4 a través de las monocapas celulares en la dirección apical-a-basolateral. Las células Caco-2 utilizadas para estimar los valores Papp crecieron por 26 días en inserciones de Transwell en placas de 12 cavidades. La integridad de monocapa se verificó antes y después del ensayo de absorción por los métodos de resistencia eléctrica transepitelial (Ohm-cm2) y Amarillo Lucifer.

Materiales y Métodos Las soluciones concentradas de mannitol, ácido salicílico y testosterona se prepararon en metanol a 50 mM. En el día del ensayo, los estándares de referencia se diluyeron en solución de sal balanceada de Hank (HBSS), pH 7.4 a una concentración final de 50 µM. 14C-mannitol, 3H-testosterona y ácido 14C-salicílico radio-marcados se agregaron así a sus medios no marcados correspondientes para tener una actividad específica final de 0.35-0.65 µCi/mL. Las muestras de isómero de dihidrotetrabenazina se prepararon a una concentración de 50 mM en DMSO. Cada solución concentrada se diluyó además en regulador HBSS (pH 7.4) a una concentración de trabajo final de 50 µM. Las suspensiones de célula de Caco-2 se prepararon como sigue. Un frasco de célula inicial de Caco-2 No. ID 29-080299 del número de paso 29 (Colección de Cultivo de Tipo Americano) (VA, USA) se descongeló y se colocó en cultivo en un matraz de 1 50 cm2 que contiene el medio de cultivo Caco-2. En confluencia, el medio de cultivo se removió y las células se lavaron con 5 mi de PBS. Las células se desunieron siguiendo la adición y la incubación con 0.25% de tripsina-EDTA (2.0 mi por matraz) por aproximadamente 10 minutos a 37°C. La desunión de las células se monitoreó bajo un microscopio y se detuvo por la adición de 10 mL de medio de cultivo Caco-2. La viabilidad celular y la concentración se valoraron por el método de exclusión de azul triptano. Una vez que la densidad de célula y viabilidad se determinaron, las células Caco-2 se diluyeron en medio de cultivo a una concentración de trabajo final de 2.0 x 105 células/ml. El medio de cultivo Caco-2 contuvo Medio Eagle Modificado de Dulbecco, 10% de suero de bovino fetal, 100 µM de aminoácidos no esenciales, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de streptomicina. Las membranas de policarbonato costar (0.4 µm de tamaño de poro) se pre-equilibraron con medio de cultivo de Caco-2 por 1 hora en una incubadora con cubierta de agua a 37°C con 5% de CO2. El contenido de la cámara apical se removió y se reemplazó con 500 µl de suspensión de célula Caco-2 (200 000 células/ml). Las células además se mantuvieron en cultivo por 26 días en una incubadora con cubierta de agua de 37°C con 5% de CO2. Antes del ensayo, todas las monocapas se lavaron dos veces con HBSS y su resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se midió con un metro Millicel-ERS. Los valores TEER obtenidos en la ausencia de células se substrajeron como señal anterior. Solamente la monocapa con los valores TEER sobre 150 Ohm-cm2 se utilizaron para el experimento del ensayo de absorción. Todos los experimentos de absorción se condujeron en triplicado a pH 7.4. La velocidad de absorción de cada estándar de referencia y artículo de prueba de dihidrotetrabenazina se valoró en la dirección apical-a-basolateral. Las alícuotas (100 µl) de cada solución de trabajo (estándares de referencia y artículos de prueba a 50 µM) se fijaron al inicio del ensayo para la determinación de la concentración inicial (C0). Los experimentos de absorción se iniciaron al reemplazar el contenido de la cámara del donador con 500 µl de Solución de Sal Balanceada de Hank conteniendo artículos de prueba o compuestos de referencia. Las células se regresaron a la incubadora CO2 para el ensayo de absorción. Las muestras de 100 µl se colectaron de las cámaras del receptor y donador después de 1 hora y se utilizaron par determinar el porcentaje de recuperación. Los estándares de referencia radio-marcados, mannitol, ácido salicílico y testosterona se utilizaron como controles de calidad y para la clasificación comparativa de los artículos de prueba de dihidrotetrabenazina. Al final del experimento de absorción, la integridad de cada monocapa celular se valoró al monitorear la pérdida de Amarillo Lucifer del lado apical-a-basolateral. Todas las soluciones se removieron de las cámaras, apical y basolateral. Las cámaras basolaterales se rellenaron con 1.5 mi de HBSS fresco, mientras que las cámaras apicales se llenaron con 0.5 mi de 120 µg/ml de solución de Amarillo Lucifer. Las células se regresaron a la incubadora por un período de 1 hora, después de lo cual las muestras de 100 µl se colectaron y se cuantificaron de manera espectrofotométrica con el lector de placas SpectraMax 340PC a 428 nm. Un volumen de 20 µl de cada muestra radio-marcada se agregó a 10 mi de cocktail de escintilación (ScintiSafe 30%) y se contó por hasta 5 minutos con un analizador de escintilación líquida (1900CA Tri-Carb). Las incubaciones de célula Caco-2 se analizaron para la presencia de dihidrotetrabenazina utilizando un método de cromatografía líquida al azar/espectrometría de masa (LC-MS/MS). Los coeficientes de permeabilidad aparentes se calcularon utilizando la ecuación Papp=dQ/dt x 1/A x 1/C0 (cm/seg) en la cual dQ/dt es la velocidad de difusión del compuesto (µg/seg o área de integración/seg), A es el área de superficie de membrana de célula total (cm2) y C0 es la concentración inicial (µg/mL o área de integración/seg). Los valores Papp apical-a-basolateral de los diferentes artículos de prueba de dihidrotetrabenazina se compararon con los valores Papp determinados para los estándares de referencia. Los resultados se muestran en la tabla 8. Los compuestos C, D y A de dihidrotetrabenazina tienen un valor Papp respectivo de 21.14 x 10"6, 24.87 x 10"6 y 25.52 x 10"6 cm/seg, el cual es comparable al estándar de referencia de testosterona. El compuesto B tiene un valor Papp de 1 1.98 x 10~6 cm/seg, el cual es similar al estándar de referencia de ácido salicílico.

Tabla 8 Los compuestos C, D, y A tienen un valor Papp cercano al valor de testosterona, indicando que estos compuestos tienen alta permeabilidad en el modelo caco-2 mientras que el Compuesto B tiene un valor Papp entre los valores de ácido salicílico y testosterona, indicando que tiene una permeabilidad media en el modelo Caco-2. Estos resultados sugieren que los cuatro isómeros de dihidrotetrabenazina deberán absorberse altamente a través del epitelio intestinal in vivo.

EJEMPLO 1 1 Comparación de las Propiedades Sedativas de Tetrabenazina v los Isómeros B v C de Dihidrotetrabenazina Se llevó a cabo un estudio en ratas para determinar si los isómeros de dihidrotetrabenazina de la invención tienen propiedades sedativas. Los efectos de los isómeros en la actividad locomotora espontánea en ratas se compararon con los efectos producidos por tetrabenazina y haloperidol utilizando los métodos establecidos abajo.

Métodos Las ratas Sprague-Dawley macho, (Charles River Laboratorios, Saint-Germanin/L'Arbresle, Francia), pesando 200-250 g al inicio del estudio, se utilizaron para los estudios. Las ratas sé alojaron, 2 o 3 por caja, en cajas tipo III Makrolon, en un cuarto adaptado con las siguientes condiciones ambientales: temperatura: 20 + 2°C, humedad: mínimo 45%, cambios de aire: >12 por hora, ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h [a las 7:00 am]. Las ratas se dejaron aclimatarse a sus condiciones por al menos cinco días antes del comienzo del estudio. Las ratas recibieron alimentos (Dietex, Vigny, Francia, ref. 81 1002) y agua (agua residual en agua de botella) ad libitum. Las soluciones de cada compuesto de prueba en aceite de maíz se prepararon frescamente en el día del experimento. Haloperidol se preparó en hidroxietilcelulosa, 0.5% en agua desmineralizada. Ya sea el vehículo o los compuestos de prueba se administraron como una dosis única (0.3, 1 , 3 y 10 mg/kg, 2 mL/kg i.p.). El compuesto de referencia haloperidol (1 mg/kg) se administró i.p. (2 mL/kg). Los animales se colocaron en cajas de plexiglass bajo una cámara de video en un cuarto con intensidad de baja luz (máxima 50 luz). En cuarenta y cinco minutos y 3 horas después de la administración, la actividad locomotora se determinó durante períodos de 20 minutos utilizando un analizador de video-imagen (Videotrack, View Point, Francia). La actividad locomotora se registró en el grupo de referencia (haloperidol) a 1 hora después de la administración. El número y la duración de movimientos ambulatorios y duración de inactividad se midió. Al final de la medición de actividad locomotora (45 minutos y 3 horas), el despertar y cierre palpebral se registraron como sigue en la caja de plexiglás: Cierre palpebral: 0: párpados (normal) bien abiertos 1 : párpados ligeramente caídos 2: ptosis, párpados cayéndose aproximadamente a la mitad 3: párpados completamente cerrados Despertar: 1 : muy bajo, estupor, coma, poca o nada de respuesta 2: bajo, algo de estupor, «lerdo>>, algo de movimiento de cuerpo y cabeza 3: de cierta forma bajo, ligero estupor, algunos movimientos exploradores con período de inmovilidad 4: normal, alerta, movimiento exploradores/congelamiento lento 5: de cierta forma alto, ligera excitación, tenso, revoloteo repentino o congelamiento 6: muy alto, hiper alerta, excitado, ataques repentinos de ejecución o movimientos corporales El número de casos y duración (en segundos) de movimiento ambulatorios (largos) y la duración de períodos de inactividad (segundos) se determinó durante dos períodos de 20 minutos (45 minutos y 3 horas después de la administración) utilizando un analizador de video imagen (VideoTrack, ViewPoint, Lyon, Francia). El rastreo de imágenes se realizó utilizando una cámara de video colocada arriba de la caja de plexiglás, registrando la actividad locomotora global. Las imágenes registradas con la cámara de video se digitalizaron y la colocación del centro de gravedad de la manchas de imagen digitales se rastreó y se analizó utilizando el siguiente método: la velocidad de desplazamiento del centro de gravedad de la mancha se midió y dos valores de umbral se fijaron para definir el tipo de movimiento: umbral 1 (alta velocidad) y umbral 2 (baja velocidad). Cuando el animal se movió y la velocidad de desplazamiento del centro de gravedad de la mancha fue arriba del umbral 1 , el movimiento se consideró como el movimiento ambulatorio. Cuando el animal permaneció inactivo, la velocidad fue abajo del umbral 2, el movimiento se consideró como inactividad. Los resultados se expresaron como los promedios + SEMs de los 12 valores individuales. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando ANOVA (una vía) y prueba de Dunnett y con la prueba no paramétrica de Kruskal-Wailis seguido por una prueba U de Mann & Whitney para la cotación de sedación. Un valor p de <0.05 se tomó como que indica importancia.

Protocolo Tamaño de grupo n=12 Grupo 1 : referencia, haloperidol (1 mg/kg i.p.) Grupo 2: grupo de control de vehículo (2 ml/kg í.p.) Grupo 3: tetrabenazina (0.3 mg/kg i.p.) Grupo 4: tetrabenazina (1 mg/kg i.p.) Grupo 5: tetrabenazina (3 mg/kg i.p.) Grupo 6: tetrabenazina (10 mg/kg i.p.) Grupo 7: Isómero C (0.3 mg/kg i.p.) Grupo 8: Isómero C (1 mg/kg i.p.) Grupo 9: Isómero C (3 mg/kg i.p.) Grupo 10: Isómero C (10 mg/kg i.p.) Grupo 11 : Isómero B (0.3 mg/kg i.p.) Grupo 12: Isómero B (1 mg/kg i.p.) Grupo 13: Isómero B (3 mg/kg i.p.) Grupo 14: Isómero B (10 mg/kg i.p.) Resultados **Diferente de manera importante del grupo de Vehículo (p, 0.01 ) de ANOVA una vía seguida por prueba de Dunnett. Los resultados demuestran que tetrabenazina produce un efecto sedativo dependiente de dosis 45 minutos y 3 horas después de la administración mientras que el Isómero B y el Isómero C muestran nada de efectos sedativos en cualquier momento, a pesar de que el isómero C muestre un efecto hiperlocomotor no importante y sencillo 3 horas después de la administración.

EJEMPLO 12 Composiciones Farmacéuticas (i) Formulación de Tableta-I Una composición de tableta que contiene una dihidrobenazina de la invención se prepara al mezclar 50 mg de dihidrotetrabencina con 1 97 mg de lactosa (BP) como diluyente, y 3 mg de estearato de magnesio como un lubricante y que comprende para formar una tableta en la manera conocida. (¡i) Formulación de Tableta-ll Una composición de tableta que contiene una dihidrobenazina de la invención se prepara al mezclar el compuesto (25 mg) con óxido de hierro, lactosa, estearato de magnesio, almidón de maíz blanco y talco, y que comprende para formar una tableta en la manera conocida. (iii) Formulación de Cápsula Una formulación de cápsula se prepara al mezclar 100 mg de dihidrotetrabenazina de la invención con 100 mg de lactosa y rellenar la mezcla de reacción en cápsulas de gelatina dura opacas estándares.

Equivalentes Será fácilmente aparente que numerosas modificaciones y alteraciones pueden hacerse a las modalidades específicas de la invención abajo descrita sin alejarse de los principios que somete la invención. Todas de tales modificaciones y alteraciones se pretende que es comprendan por esta aplicación.

Claims

REIVINDICACIONES 1. 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina. 2. 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina en forma sustancialmente pura, por ejemplo a una pureza isomérica de más de 90%, típicamente más de 95% y más preferentemente más de 98%. 3. 3,11b-c/s-dihidrotetrabenaz¡na según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que se encuentra en una forma (+)-¡somérica. 4. Una composición que comprende 3,11b-c/'s-dihidrotetrabenazina sustancialmente libre de 3,1 Ib-frans-dihidrotetrabenazina. 5. Una composición que comprende 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina y que contiene menos de 5% de 3,11b-frans-dihidrotetrabenazina, preferentemente menos de 3% de 3,11b-frans-dihidrotetrabenazina, y más preferentemente menos de 1% de 3,11b-frans-dihidrotetrabenazina. 6. Una composición según la reivindicación 4 o la reivindicación 5 en donde el 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina es un (+)-. isómero. 7. El isómero 2S,3S,11bf? de 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina teniendo la fórmula (la): 8. El isómero 2R,3R,11bS de 3,11b-c/'s-dihidrotetrabenazina teniendo la fórmula (Ib): (Ib) 9. El isómero 2S,3/?,11bS de 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina teniendo la fórmula (le): 10. El isómero 2S,3R,11bS de 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina teniendo la fórmula (Id): 11. Un isómero de 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina teniendo un valor ORD [a ] de -114.6° cuando se mide en metanol a 21°C. 12. Un isómero de 3,11b-c/s-dihidrotetrabenazina teniendo un valor ORD [a ] de aproximadamente +123° cuando se mide en metanol a 21 °C. 1 3. Un isómero de 3, 1 1 b-c/s-dihidrotetrabenazina teniendo un valor ORD [aD] de +150.9° cuando se mide en metanol a 21 °C. 14. Un isómero de 3, 1 1 b-c/'s-dihidrotetrabenazina teniendo un valor ORD [aD] de -145.7° cuando se mide en metanol a 21 °C. 15. Un isómero de dihidrotetrabenazina teniendo las características espectroscópicas establecidas en la Tabla 1 en la presente y las cromatográficas y opcionalmente las características ORD establecidas en la Tabla 3 en la presente. 16. Un isómero de dihidrotetrabenazina teniendo las características espectroscópicas establecidas en la Tabla 2 en la presente y las cromatográficas y opcionalmente las características ORD establecidas en la Tabla 4 en la presente. 17. Isómero A de Dihidrotetrabenazina teniendo las características espectroscópicas establecidas en la Tabla 1 en la presente, las características cromatográficas establecidas en la Tabla 3 en la presente, y teniendo actividad óptica levorotativa. 18. Isómero B de Dihidrotetrabenazina teniendo las características espectroscópicas establecidas en la Tabla 1 en la presente, las características cromatográficas establecidas en la Tabla 3 en la presente, y teniendo actividad óptica dextrorotativa. 19. Isómero C de Dihidrotetrabenazina teniendo las características espectroscópicas establecidas en la Tabla 2 en la presente, las características cromatográficas establecidas en la Tabla 4 en la presente, y teniendo actividad óptica dextrorotativa. 20. Isómero D de Dihidrotetrabenazina teniendo las características espectroscópicas establecidas en la Tabla 2 en la presente, las características cromatográficas establecidas en la Tabla 4 en la presente, y teniendo actividad óptica levorotativa. 21. Una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la forma de una base libre. 22. Una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 en la forma de una sal de adición acida. 23. Una dihidrotetrabenazina según la reivindicación 22 en donde la sal es una sal de sulfonato de metano. 24. Una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes para utilizarse en la medicina o terapia, por ejemplo, en el tratamiento de desórdenes de movimiento hipercinético tales como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, disquinesia tardía y síndrome de Tourette, o el tratamiento de depresión. 25. Una composición farmacéutica que comprende una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 26. El uso de una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de desórdenes de movimiento hipercinético tales como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, disquinesia tardía y síndrome de Tourette, o el tratamiento de depresión. 27. Un método para la profilaxis o tratamiento de un desorden de movimiento hipercinético tal como enfermedad de Huntington, hemiballismus, corea senil, tic, disquinesia tardía y síndrome de Tourette, o el tratamiento de depresión, en un paciente en necesidad de tal profilaxis o tratamiento, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéutica o profiláctica eficaz de una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23. 28. Un proceso para preparar una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, cuyo proceso comprende la reacción de un compuesto de la fórmula (II): con un reactivo o reactivos adecuados para hidratar el enlace 2,3-doble en el compuesto de la fórmula (II) y de ahí en adelante cuando se requiere separar y aislar una forma de isómero de dihidrotetrabenazina deseada. 29. Un proceso para preparar una dihidrotetrabenazina según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, cuyo proceso comprende someter un compuesto de la fórmula (I I I): a condiciones para abertura de anillo del grupo 2,3-epóxido en el compuesto de la fórmula (III), y después se requiere separar y aislar una forma de isómero de dihidrotetrabenazina deseada. 30. Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (II I) según se define en la reivindicación 29 cuyo proceso comprende reaccionar un compuesto de alqueno de la fórmula (II) según se define en la reivindicación 27 con un agente oxidante (tal como un ácido peroxi) adecuado para formar una grupo epóxido. 31 . Un proceso para preparar un compuesto de la fórmula (I I) según se define en la reivindicación 28 cuyo proceso comprende deshidratar una 3, 1 1 -frans-dihidrotetrabenazina con un agente de deshidratación tal como un haluro de fósforo o oxihaluro de fósforo. 32. Un compuesto de la fórmula (II): 33. Un compuesto de la fórmula (III): 34. Un éster de ácido Mosher de un compuesto según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.