MXPA06003014A - Kid3 y anticuerpos de kid3 que se unen a este. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona la identificacion y caracterizacion de enfermedades y canceres asociados con el epitope KID3. La invencion tambien proporciona una familia de anticuerpos monoclonales que se unen al KID3, metodos de diagnostico y tratamiento de varios canceres humanos y enfermedades que expresan KID3.

Description

KID3 Y ANTICUERPOS DE ID3 QUE SE UNEN A ESTE CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el campo de la biología y la inmunoterapia . De manera más específica, se relaciona con un epítope novedoso KID3 , asociado con enfermedades y cánceres, y anticuerpos policlonales y monoclonales y otros polipéptidos que se unen al KID3. La invención se proporciona además para el diagnóstico y/o tratamiento de una variedad de enfermedades y cánceres humanos asociados con el ID3 usando antagonistas, moduladores y péptidos que se unen al KID3 , incluyendo anticuerpos anti-KID3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Además de sus usos conocidos en diagnóstico, los anticuerpos han mostrado ser útiles como agentes terapéuticos. Por ejemplo, la inmunoterapia, o el uso de anticuerpos para propósitos terapéuticos han sido usados en los años recientes para tratar el cáncer. La inmunoterapia pasiva implica el uso de anticuerpos monoclonales en tratamientos del cáncer. Véase, por ejemplo, Cáncer: Principies and Practice of Oncology, 6ta Edición (2001) Cap. 20 pp. 495-508. Esos anticuerpos pueden tener actividad biológica terapéutica inherente tanto para la inhibición Ref: 171201 directa del crecimiento o sobrevivencia de células tumorales o por su capacidad para reclutar la actividad asesina de células naturales del sistema inmune del cuerpo. Esos agentes pueden ser administrados solos o en conjunto con radiación o agentes quimioterapéuticos . El Rituximab y Trastuzumab, aprobados para el tratamiento de linfoma no Hodgkin y cáncer de mama, respectivamente, son dos ejemplos de esos agentes terapéuticos. De manera alternativa, los anticuerpos pueden ser usados para producir conjugados de anticuerpo donde el anticuerpo esté ligado a un agente tóxico y dirija ese agente al tumor uniéndose específicamente al tumor. La ozogamicina gemtuzumab es un ejemplo de un conjugado de anticuerpo aprobado usado para el tratamiento de la leucemia. Los anticuerpos monoclcnales que se unen a células cancerosas y tienen usos potenciales para diagnóstico y terapia han sido discutidos en publicaciones. Véanse, por ejemplo, las siguientes solicitudes de patente las cuales describen, ínter alia, algunos pesos moleculares de proteínas blanco: Patente Estadounidense No. 6,054,561 (200 kD c-erbB-2 (Her2) , y otros antígenos desconocidos de 40-200 KD de tamaño) y Patente Estadounidense No. 5,656,444 (proteina oncofetal de 50 kD y 55 kD) . Los ejemplos de anticuerpos en ensayos clínicos y/o aprobados para el tratamiento de tumores sólidos incluyen: Trastuzumab (antígeno: 180 kD, HER2/neu) , Edrecolomab (antígeno: 40-50 kD, Ep-CAM) , glóbulos antigrasa de leche humana (HMFG1) (antlgeno >200 kD, Mucina HMW) , Cetuximab (antígenos: 150 kD y 170 kD, receptor de EGF) , Alemtuzumab (antígeno: 21-28 kD, CD52) , y Rituximab (antlgeno: 35 kD, CD20) . El antígeno blanco del trastuzumab (receptor Her-2) , el cual es usado para tratar el cáncer de mama, y el cetuximab (receptor de EGF) , el cual está en ensayos clínicos para el tratamiento de varios cánceres, se presentan en algún nivel detectable en un gran número de tejidos adultos humanos normales incluyendo la piel, colon, pulmón, ovario, hígado y páncreas . El margen de seguridad en el uso de esos agentes terapéuticos es proporcionado posiblemente por la diferencia de nivel de expresión o en el acceso de o actividad del anticuerpo en esos sitios. Otro tipo de inmunoterapia es la inmunoterapia activa, o vacunación, con un antígeno presente sobre un cáncer específico o un plásmido recombinante o constructo de ADN que dirige la expresión del antígeno, el cual evoca entonces la respuesta inmune en el individuo, es decir, para inducir al individuo para producir activamente anticuerpos contra su propio cáncer. La inmunización activa no ha sido usada tan frecuentemente como inmunoterapia pasiva o inmunotoxinas . Han sido sugeridos varios modelos de progreso de enfermedades (incluyendo el cáncer) . Las teorías van desde las causadas por un solo evento ineficaz/de transformación hasta la evolución de un tipo de tejido "como una enfermedad" o "como un cáncer" que se incrementa conduciendo finalmente a uno con una capacidad completamente patógena o maligna. Algunos argumentan que con el cáncer, por ejemplo, un solo evento mutacional es suficiente para producir una enfermedad maligna, mientras que otros argumentan que también son necesarias alteraciones subsecuentes. Algunos otros han sugerido que el incremento de la carga mutacional y el grado del tumor son necesarios tanto para el inicio como para el progreso de la neoplasia vía eventos de mutación-selección continuos a nivel celular. Algunos blancos del cáncer se encuentran únicamente en tejidos tumorales, mientras que otros están presentes en tejidos normales y son sobrerregulados y/o sobreexpresados en tejidos tumorales. En esas situaciones, algunos inventores han sugerido que la sobreexpresion está ligada a la adquisición de la enfermedad maligna, mientras que otros sugieren que la sobreexpresion es únicamente un marcador de una tendencia a lo largo de una trayectoria hacia un estado de incremento de la enfermedad. Un anticuerpo de diagnóstico y/o terapéutico ideal sería específico para un antígeno presente sobre un gran número de cánceres, pero ausente o presente solo a bajos niveles en cualquier tejido normal. El descubrimiento, caracterización, y aislamiento de un antígeno novedoso que este asociado específicamente con cánceres sería útil de muchas maneras. Primero, el antígeno podría ser usado para producir anticuerpos monoclonales contra el antígeno. Un anticuerpo idealmente tendría actividad biológica contra células cancerosas y podría reclutar la respuesta del sistema inmune para antígenos externos . Un anticuerpo podría ser administrado como un agente terapéutico solo o en combinación con los tratamientos actuales o usados para preparar inmunoconjugados ligados a agentes tóxicos. Un anticuerpo con la misma especificidad pero con actividad biológica baja o ausente cuando se administre solo podría también ser útil dado que el anticuerpo podría ser usado para preparar un inmunoconjugado con un rápido isótopo, un toxina, o un agente quimioterapéutico o liposoma que contenga un agente quimioterapéutico, con el conjugado siendo biológicamente activo en virtud del anticuerpo que dirige la toxina a las células que contienen antígeno. En un aspecto deseable para un anticuerpo de diagnóstico y/o terapéutico ideal es el descubrimiento y caracterización de un antígeno que está asociado con una variedad de cánceres. Existen unos cuantos antígenos que son expresados sobre un número de tipos de cáncer (por ejemplo, el antígeno "pan-canceroso") que tienen expresión limitada sobre células no cancerosas. El aislamiento y purificación de esos antígenos sería útil para producir anticuerpos (por ejemplo, de diagnóstico o terapéuticos) que hagan blanco sobre el antígeno. La unión de un anticuerpo al antigeno "pan-canceroso" podría ser capaz de hacer blanco en una variedad de cánceres encontrados en diferentes tejidos en contraste con un anticuerpo contra un antígeno asociado únicamente con un tipo específico de cáncer. El antígeno también sería útil para descubrir fármacos (por e emplo, moléculas pequeñas) y para la caracterización adicional de la regulación, crecimiento y diferenciación celular. La regulación de la glicosilación y glicosilación diferencial han sido cada una implicadas en el progreso y pronóstico del cáncer. Los determinantes carbohidratados de la superficie celular pueden experimentar alteraciones drásticas durante la transformación maligna'. Los antígenos de Lewis son ejemplos de determinantes carbohidratados que están asociados con varios cánceres . El uso de anticuerpos monoclonales específicos para determinantes carbohidratados como los antígenos de Lewis han mostrado ser efectivos en la regulación del potencial metastásico con células in vitro (Liu, et al. , 2001) . Lo que se necesita son blancos novedosos sobre la superficie de células enfermas y/o cancerosas que puedan ser usadas para diagnosticar y tratar esas enfermedades y/o cánceres con anticuerpos y otros agentes que reconozcan específicamente los blancos de la superficie celular. Existe una necesidad adicional, sobre la base de los descubrimientos descritos aqui, de anticuerpos novedosos y otros agentes que reconozcan específicamente blancos sobre la superficie de células que puedan modular, ya sea reduciendo o mejorando las actividades promotoras de enfermedades del KID3. Un objetivo de esta invención es identificar antagonistas del KID3 humano que sean capaces de inhibir sus actividades asociadas con enfermedades. Otro objetivo es proporcionar compuestos novedosos para usarse en el ensayo del KID3 , y para usarse como inmunógenos o para seleccionar anticuerpos anti-KID3 humano . Como será descrito con mayor detalle más adelante, los inventores de la presente han descubierto un epítope novedoso, el cual puede se referido aquí como KID3, identificado como el epítope blanco de los antagonistas, moduladores y anticuerpos novedosos proporcionados aquí .

SUMARIO DE LA INVENCION La invención proporciona antagonistas, moduladores y anticuerpos monoclonales de KID3 , que se unen al KID3 , el cual es expresado en una variedad de cánceres humanos . En un aspecto, la invención es una familia de anticuerpos monoclonales que se unen al KID3. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo monoclonal anti-KID3 que es producido por la línea de células anfitrionas (KIDNEY.3.11E8.2AI1) depositada en Diciembre 18, 2002 en la American Type Culture Collection con la Designación Depósito de Patente de PTA-4860. En otro aspecto más, la invención es un método para generar un anticuerpo monoclonal anti-KID3 reactivo con células enfermas y/o cancerosas, que comprende los pasos de: (a) inmunizar a un mamífero anfitrión con un inmunógeno,- (b) obtener linfocitos del mamífero; (c) fusionar linfocitos (b) con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma; (d) cultivar el hibridoma de (c) para producir anticuerpos monoclonales ,- y (e) separar los anticuerpos para seleccionar solo aquellos anticuerpos que se unan a células o líneas celulares enfermas y/o cancerosas pero que no se unan a células o líneas celulares no cancerosas o normales, o se unan a células normales a un nivel más bajo o en una forma diferente . En otro aspecto, la invención es un método para generar un anticuerpo anti-KID3 que comprende cultivar una célula anfitriona que codifique para ese anticuerpo o progenie del mismo bajo condiciones que permitan la producción del anticuerpo, y purificar el anticuerpo anti-KID3. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para generar cualquiera de los anticuerpos (o polipéptidos) descritos aquí expresando uno o más polinucleótidos que codifiquen para el anticuerpo (el cual puede ser expresado por separado como una sola cadena ligera o pesada, o ambas de una cadena ligera y una pesada sean expresadas de un vector) en una célula adecuada, generalmente seguido por la recuperación y/o aislamiento del anticuerpo o polipéptidos de interés . En otro aspecto, la invención es un anticuerpo anti-KID3 o un polipéptido (el cual puede o no ser un anticuerpo) que inhibe competitivamente la unión preferente de un anticuerpo anti-KID3 al KID3. En algunas modalidades, la invención es un anticuerpo o un polipéptido (el cual puede ser o no un anticuerpo) que se une preferentemente al mismo o epítopes diferentes sobre KID3 como otros anticuerpos anti-KID3. En otro aspecto más, la invención es una composición que comprende KID3 unido por un anticuerpo especifico para un epítope de KID3. En una modalidad, el anticuerpo es el anti-KID3. En otras modalidades, son administrados dos o más anticuerpos anti-KID3, con esos anticuerpos trazándose a dos o más epitopos diferentes de KID3 , o de manera alternativa los anticuerpos pueden ser multivalentes , uniéndose a un epítope de KID3 y a una célula blanco diferente. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-KID3 está ligado a un agente terapéutico o una marca detectable.

En otro aspecto, la invención es un anticuerpo que comprende un fragmento o región de un anticuerpo anti-KID3. En una modalidad, el fragmento es una cadena ligera del anticuerpo. En otra modalidad, el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo. En otra modalidad más, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo. En otra modalidad más, el fragmento contiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una cadena ligera y/o una cadena pesada del anticuerpo. En otro aspecto la invención proporciona polipéptidos (los cuales pueden o no ser anticuerpos) que comprenden cualquiera de los siguientes: a) una o más CDR (o fragmentos de las mismas) de la cadena ligera o pesada; b) tres CDR de la cadena ligera; c) tres CDR de la cadena pesada; d) tres CDR de la cadena ligera y tres CDR de la cadena pesada; e) la región variable de la cadena ligera; f) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-KID3. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado comprende una o más CDR de un anticuerpo anti-KID3 no humano. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado se une al mismo o un epitope diferente como otros anticuerpos KID3. Generalmente, un anticuerpo humanizado de la invención comprende uno o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, o fragmentos de las mismas) las cuales son la misma y/o derivadas de las CDR del anticuerpo KID3 no humano original. En algunas modalidades, el anticuerpo humano se une al mismo o un epítope diferente como otros anticuerpos anti-KID3. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-KID3 no humano y regiones constantes derivadas de regios constantes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano. En otro aspecto, la invención es un polinucleótido aislado que codifica para un anticuerpo mu-anti-KID3 que es producido por una célula anfitriona con un número de depósito de la ATCC No. ???-4860, o progenie de la misma. Esta invención abarca polipéptidos de anticuerpo que tienen las " actividades de unión biológicas o inherentes de cualquiera de los anticuerpos especificados anteriormente. En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican para cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo) así como cualesquier otros polipéptidos descritos aqui . En otro aspecto, la invención es una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos (incluyendo cualquiera de las anticuerpos descritos aquí) o polinucleótidos descritos aquí, como composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-KID3 ligado a un agente quimioterapéutico, un anticuerpo que comprende un fragmento de un anticuerpo anti-KID3, un anticuerpo humanizado de un anticuerpo anti-KID3 no humano, o un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de regiones variables de un anticuerpo anti-KID3 no humano y regiones constantes derivadas de regiones constantes de un anticuerpo humano, a un anticuerpo humano con una o más propiedades de un anticuerpo anti-KID3 no humano, o cualquiera de los anticuerpos anti-KID descritos aquí ligados a un agente quimioterapéutico (como una porción radioactiva) y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención es una composición que comprende un anticuerpo anti-KID3 unido al KID3 presente sobre células enfermas o cancerosas. En modalidades preferidas, la célula cancerosa es seleccionada del grupo que consiste de células de cáncer de ovario, pulmón, próstata, pancreático, colon y mama. En algunas modalidades, la célula cancerosa está aislada. En algunas modalidades, la célula cancerosa es una muestra biológica. En general, la muestra biológica es de un individuo, como un humano. En otro aspecto, la invención es un método para diagnosticar enfermedades en un individuo detectando KID3 sobre células del individuo particularmente enfermedades o trastornos asociados " con respuestas inflamatorias o autoinmunes en individuos . En otros aspectos de la invención, se proporciona métodos para modular respuestas inflamatorias o autoinmunes en individuos . Las enfermedades y condiciones resultantes de trastornos inflamatorios y autoinmunes pueden ser sometidos a tratamiento usando las composiciones y métodos de la invención incluyen, a manera de ilustraciones y limitaciones, esclerosis múltiple, meningitis, encefalitis, apoplejía, u otros traumas cerebrales, enfermedad del intestino inflamatorio, incluyendo la colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn's, miastemia gravis, lupus, artritis reumatoide, asma, diabetes juvenil aguda, demencia relacionada con el SIDA, aterosclerosis, nefritis, retinitis, dermatitis atópica, psoriasis, isquemia miocárdica, y daño pulmonar agudo mediado por leucocitos. Otras indicaciones más para el uso terapéutico de ' anticuerpos y otros agentes terapéuticos de la invención incluyen la administración a individuos en riesgo de órganos o rechazo de injertos. En años recientes ha habido una considerable mejora en la eficacia de las técnicas quirúrgicas para transplantar tejidos y órganos como la piel, ríñones, hígado, corazón, pulmón, páncreas y medula ósea. Quizá el problema más sobresaliente principal es la falta de agentes satisfactorios para inducir inmunotolerancia en receptores al aloinjerto u órgano transplantado. Cuando son transplairtadas células u órganos alogénicos a un anfitrión (es decir, el donador y el receptor son individuos diferentes de la misma especie) , el sistema inmune anfitrión probablemente monte una respuesta inmune a los antígenos externos en el transplante (enfermedad anfitrión contra injerto) conduciendo la destrucción del tejido transplantado. En otro aspecto, la invención es un método para diagnosticar si el individuo tiene cáncer que comprende determinar si existe expresión del KID3 sobre células seleccionadas del individuo, donde la expresión del KID3 sobre las células es indicativa de cáncer. En algunas modalidades la expresión del KID3 es determinada usando un anticuerpo anti-KID3. En algunas modalidades, el método implica detectar el nivel de expresión de KID3 de las células. El termino "detección" como se usa aquí incluye la detección (medición de niveles) cualitativo y/o cuantitativo con o sin referencia a un control . En otro aspecto más, la invención es un método para diagnosticar cáncer en un individuo detectando el KID3 sobre o liberado de células del individuo, donde el cáncer es seleccionado del grupo que incluye pero no se limita a tumores de la glándula adrenal, canceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumores astrocíticos , cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transitorias) cáncer óseo (adatnantinoma, quistes óseos aneurismales , osteocondroma, osteosarcoma) , cáncer de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de células renales cromofóbicas , carcinoma de célula transparente, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redonda pequeñas desmoplásicas , ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cánceres del conducto de la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumor de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma de células renales papilares) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular) linfornas, cáncer de pulmón, méduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cáncer de ovario, cánceres pancreáticos, carcinomas tiroides papilares, tumores paratiroideos, cánceres pediátricos, tumores del revestimiento de los nervios periféricos, faeocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal. Tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido blando, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma timico, timoma, cáncer metastásico tiroideo y cánceres uterinos (carcinoma del cervix, carcinoma endometrial, y leiomiomas). En otro aspecto, la invención es un método para ayudar al diagnóstico del cáncer (pero, sin limitarse a cáncer de ovario, pulmón, próstata, pancreático, colon o mama) en un individuo, que comprende determinar la expresión del KID3 es una muestra biológica del individuo. En algunas modalidades, la expresión del KID3 es determinado usando un anticuerpo anti-KID3. En algunas modalidades, el método es detectar el nivel de expresión de KID3 de células . El KID3 liberado del cáncer puede contribuir a los niveles elevados de KID3 o una porción de los mismos, siendo detectable en fluidos corporales (por ejemplo, sangre, saliva o secreciones mucosas de intestino). En otro aspecto más, la invención es un método para tratar un cáncer administrando una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une a KID3 de manera suficiente para reducir el crecimiento de células cancerosas . En algunas modalidades el anticuerpo es un anticuerpo anti-KID3. En ciertas modalidades, las células cancerosas son seleccionadas del grupo que incluye pero no se limita a tumores de la glándula adrenal, cáncer asociado con el SIDA, sarcoma de las partes blandas alveolares, tumores astrociticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transitorias) , cáncer óseo (adamantinoma, quistes óseos aneurismales , os eocondroma, osteosarcoma) , cáncer de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de células renales cromofóbicas, carcinoma de célula transparentes, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutanéos, tumores de células redonda pequeñas desmoplásicas, ependimomas , tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cánceres del conducto de la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumor de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma de células renales papilares) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular) linfornas, cáncer de pulmón, méduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cáncer de ovario, cánceres pancreáticos, carcinomas tiroides papilares, tumores paratiroideos, cánceres pediátricos, tumores del revestimiento de los nervios periféricos, faeocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal. Tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido blando, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma timico, timoma, cáncer metastásico tiroideo y cánceres uterinos (carcinoma del cervix, carcinoma endometrial, y leiomiomas) . En ciertas modalidades preferidas las células cancerosas son seleccionadas del grupo de tumores sólidos que incluyen pero no se limitan a cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, sarcoma, cáncer metastásico renal, cáncer metastásico tiroide y carcinoma de células transparentes . En otro aspecto más, la invención es un método para retardar el desarrollo de metástasis en un individuo que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad efectiva de al menos de una familia de anticuerpos que se unen específicamente a KID3. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-KID3. En otro aspecto la invención es un método para inhibir el crecimiento y/o proliferación de células cancerosas in vi tro o en un individuo que comprende administrar una cantidad efectiva de una compasión que comprende un anticuerpo anti-KID3 asociado con (incluyendo el ligado a) un agente quimioterapeutico al cultivo o muestra celular, o al individuo. En otro aspecto más, la invención es un método para proporcionar un agente terapéutico a una célula cancerosa a un individuo administrando una cantidad efectiva de al menos un miembro de la familia de anticuerpos es cual se une específicamente al KID3. En otras modalidades. El anticuerpo anti-KID3 es proporcionado a un individuo en combinación con (incluyendo el ligando a) otro agente terapéutico. En algunas modalidades el anticuerpo anti-KID3 es un anticuerpo humanizado derivado de un anticuerpo nombrado aquí (de manera general, pero no necesariamente, que comprende una o más CDR parciales o intactas del anticuerpo) . En algunas modalidades el anti-KID3 es un anticuerpo humano con o más propiedades el anticuerpo nombrado. En algunas modalidades, el agente quimioterapeutico (como una toxina o una molécula radioactiva) es proporcionado a las células cancerosas (se internaliza) . En algunas modalidades, el agente es la saporina. En otro aspecto, la invención es un método para tratar el cáncer en un individuo, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo anti-KID3 asociado con (incluyendo ligado a) un agente quimioterapéutico al individuo.

La presente invención proporciona además métodos para modular, ya sea mejorando o reduciendo, la asociación del KID3 con un par de señalización citoplásmica. La asociación del KID3 con un par de señalización citoplásmica puede ser impactada por el contacto con una molécula de KID3 que se presente sobre una superficie celular, con un agente que module la unión del par de señalización al KID3. Los agentes que bloquean o reducen la asociación de ID3 con sus pares de unión y/o señalización pueden ser usados para modular procesos biológicos y patológicos que estén implicados en las respuestas inflamatoria o inmune mediadas por el KID3. Los procesos patológicos que implican esta acción incluyen el crecimiento celular asociado con tumores y la inducción de muerte celular vía apoptosis, necrosis, oncosis u otras vías de muerte celular. Los agentes pueden ser probados por su capacidad para bloquear, reducir, mejorar o de otro modo modular la asociación del KID3 con un par de unión, un anticuerpo KID3. Específicamente, un agente puede ser probado para modular esa interacción incubando un peptido que comprenda el sitio de interacción del ID3 (típicamente en su conformación nativa como existe sobre células vivientes intactas) con un par de unión y un agente de prueba, y determinar si el agente de prueba reduce o mejora la unión del par de unión al peptido KID3.

Los agonistas, antagonistas y otros moduladores de la función del ID3 están incluidos expresamente dentro del alcance de esta invención. Esos agonistas, antagonistas y moduladores son polipéptidos que comprenden uno más de los sitios determinantes antigénicos en el KID3 , o comprenden uno o más fragmentos de esos sitios, variantes de esos sitios, o peptidomiméticos de esos sitios. Esos compuestos agonistas, antagonistas y moduladores de KID3 son proporcionados en forma lineal o cíclica, y opcionalmente comprenden al menos un aminoácido residual que comúnmente no se encuentra en la naturaleza o al menos un isostero de amida. Esos compuestos pueden ser glicosilados . Los agonistas, antagonistas y otros moduladores de la función del KID3 de esta invención son usados, de manera deseable en todas las modalidades y métodos descritos anteriormente con referencia a los anticuerpos. Otros aspectos de esta invención se relacionan con el epitopo novedoso identificado y referido aquí como KID3. éste epítope es adecuado para usarse como un inmunógeno y como una variedad de propósitos de investigación, diagnóstico y terapéuticos. En ciertos aspectos, la invención es un método para ayudar al diagnóstico de enfermedades en un individuo, que comprende los pasos de (i) ensayar la presencia del KID3 en una muestra de sangre o tejido obtenida del individuo; (ii) detectar si la muestra tiene un incremento en la cantidad del marcador KID3 en relación a una muestra de sangre o tejido normal (no enferma) ; y (iii) correlacionar un incremento en la cantidad del marcador con un diagnóstico positivo o correlacionar la ausencia de un incremento de la cantidad del marcador con un diagnóstico negativo de la enfermedad. En ciertas modalidades, el marcador es detectado usando un anticuerpo anti-KID3. En ciertas modalidades, el método es efectuado por una técnica seleccionada del grupo que consiste de formación de imágenes con radionúclidos, citometría de flujo e inmunohistoquímica .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los ríñones de algunos de los animales que tienen células de tumor de colon humano Colo205 implantadas en el modelo de cápsula de riñon. Los paneles superiores de la Figura 1 son de animales control (sin tratar) mientras que los paneles inferiores son de animales tratados . La Figura 2 es una gráfica que muestra el porcentaje de respuesta de las células de tumor de colon Colo205 y HT-29 en el modelo de xenoinj erto de cápsula de riñon a la administración sistémica de anticuerpos anti-KID3. La Figura 3 muestra la eficacia de un anticuerpo anti-KID3 sobre la linea de células tumorales de colon humano Colo205 en el modelo subcutáneo. La Figura 4 muestra los resultados graficados de varios experimentos que ilustran la inhibición in vitro de líneas celulares de carcinoma de colon humano crecidas en una monocapa por anticuerpo anti-KID3. La Figura 5 muestra la actividad in vitro de un anticuerpo anti-KID3 combinado con los agentes quimioterapéuticos Irinotecan y 5FU. La Figura 6 es una gráfica que muestra el efecto de mu-anti-KID3 y Mab-ZAP (un anti-IgG conjugado con saporina) sobre el crecimiento de la línea celular de carcinoma de colon humano Colo205. La Figura 7 muestra la secuencia de ácido nucleico de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal anti-KID3 mu~anti-KID3 , incluyendo la secuencia señal nativa. Se incluyó la traducción de la proteína correspondiente encima de la secuencia de ADN. Las Figuras 8A-8B muestran la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada Gl del anticuerpo monoclonal anti-KID3 mu-anti-KID3 , incluyendo la secuencia señal nativa. Se incluye la traducción de la proteína correspondiente encima de la secuencia de ADN.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención proporciona un epítope de carbohidrato novedoso --KID3-- que puede ser usado como un inmunógeno o directamente como un agente de diagnóstico o terapéutico. Además, la invención proporciona anticuerpos monoclónales , polipéptidos y otras composiciones para diagnosticar y tratar varias enfermedades, incluyendo cánceres humanos asociados con la expresión y/o sobreexpresión de KID3. 2. Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro de las destrezas de la técnica. Esas técnicas son explicadas completamente en la literatura, como, Molecular Cloning: A ahoratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed. , 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, y D. G. Newell, eds . , 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir y C. C.

Blackwell, eds . ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds.,.1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty. , ed. , IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies : a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); üsing antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (N. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993) .

II. Definiciones "KID3 " se refiere a un epitope de carbohidrato novedoso, contra el cual están dirigidos los anticuerpos de la presente invención. El epitope KID3 es aquella estructura carbohidratada unida por anticuerpos anti-KID3, sin limitación o con referencia a la proteína o polipéptido u otra estructura a la cual esté unida. El KID3 está presente sobre el colon o varios tipos de carcinomas. Actualmente se cree que el KID3 puede ser sobreexpresado en ciertas células de cáncer en comparación con sus contrapartes de tejido normal . El KID3 es un carbohidrato ligado en N de acuerdo a lo determinado por la pérdida de unión del anticuerpo anti- ID3 después del tratamiento de las proteínas que expresan KID3 con N-glicanasa. Los estudios hasta la fecha indican que el KID3 no es uno de los carbohidratos asociado con el carcinoma del grupo sanguíneo de Le is o mucina reportados previamente, de acuerdo a lo determinado por los ensayos de unión directa y competencia cruzada. El análisis de Western blot de extractos de membrana de línea celular de tumor humano como anticuerpos anti-KID3 mostró que el KID3 está presente sobre una variedad de proteínas asociadas con la membrana en el intervalo de peso molecular de aproximadamente 25 kDa hasta más de 250 kDa. El patrón en banda de la reactividad del KID3 determinado por las líneas sensibles al anticuerpo anti-KID3 {in vivo e in vi tro) Colo201, Colo205, SU86.86 y SNU-16 abarca el intervalo completo de 25 kDa a >250 kDa y parece cualitativamente distinto del observado para la mayoría de las líneas celulares tumorales insensibles al anticuerpo anti-KID3, las cuales parecen expresar únicamente un subconjunto de esas proteínas asociadas con el KID3. Datos no mostrados indican que las proteínas que expresan KID3 soportan la unión de E-cadherina a través de un sitio de interacción novedoso previamente no atribuido a la unión y función de la E-cadherina. El término "RAAG 12" se refiere a un epítope KID3 novedoso. Los términos "RAAG 12", "epítope de KID3" y "KID3" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. El término "epítope" se refiere a la región molecular sobre la superficie de un antígeno capaz de producir una respuesta inmune y de combinarse con el anticuerpo específico producido por esa respuesta. Los términos "epítope" y "determinante antigénico" se usan de manera intercambiable en la presente solicitud. Los agonistas, antagonistas y otros moduladores de la función del KID3 están incluidos expresamente dentro del alcance de esta invención. Esos agonistas, antagonistas y moduladores son polipéptidos , peptidomíméticos, moléculas pequeñas, u otros compuestos o composiciones que interactúan con uno o más de los sitios determinantes antigénicos en el KID3 , o fragmentos de epítope o variantes del ID3. Esos agonistas, antagonistas y compuestos moduladores del ID3 se proporcionan en forma lineal o cíclica, y opcionalmente comprende al menos un aminoácido residual que no se encuentra comúnmente en la naturaleza o al menos un isostero de amida. Esos compuestos pueden ser glicosilados o tener otras modificaciones postraslacionales . De manera más específica, los términos "agonista del KID3" "antagonista" o "modulador" como se usan aquí se definen como cualquier compuesto que (1) sea capaz de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y sus ligandos nativos o un anticuerpo anti- ID3; (2) sea capaz de unirse al KID3 humano y sus ligandos nativos o un anticuerpo anti-KID3; (3) contiene un determinante antigénico que puede ser usado para producir anticuerpos capaces de unirse al KID3 y sus ligandos nativos o un anticuerpo anti-¦ KID3 ; (4) contiene un determinante antigénico que puede ser usado para seleccionar anticuerpos capaces de unirse al KID3 humano y sus ligandos nativos o un anticuerpo anti- ID3; (5) contiene un determinante antigénico que puede ser usado para producir anticuerpos capaces de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y sus ligandos nativos o un anticuerpo anti-KID3; (6) contiene un determinante antigénico que puede ser usado para seleccionar anticuerpos capaces de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y sus ligandos nativos o un anticuerpo anti-KID3. Los agonistas, antagonistas y moduladores del ID3 incluyen variantes de KID3 , agonistas, antagonistas, peptidomiméticos de KID3 y moléculas pequeñas. Los agonistas, antagonistas y moduladores del KID3 también incluyen anticuerpos anti-KID3 y variantes de inmunoglobulina, inmunoglobulinas quiméricas, e inmunoglobulinas humanizadas en anticuerpos KID3 reactivos contra el KID3 humano, incluyendo variantes de sustitución, supresión y adición de carbohidratos o cualquier combinación de los mismos. Los agonistas, antagonistas y moduladores del KID3 de esta invención se basan en la identificación de los inventores de los determinantes antigenicos implicados en la unión del KID3 humano a sus ligandos nativos o a anticuerpos anti-KID3. De este modo, la invención proporciona agonistas, antagonistas y moduladores del KID3 con estructuras moleculares que duplican o imitan uno o más de los dominios de la unión del KID3 del anticuerpo anti-KID3. Como se usa aquí, el término "variante del KID3" denota cualquier variante del carbohidrato del KID3 humano, ¦ incluyendo variantes de sustitución, supresión y adición de azúcares o cualquier combinación de los mismos que interactúen con cualquier agonista, antagonista o modulador del KID3. También se incluye en la definición cualquier fragmento de una molécula variante de KIE3 que comprenda las regiones variantes de la molécula. Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a un blanco, como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de epítope, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa aquí, el término abarca no únicamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (como Fab, Fab' , F(ab') 2/ Fv) de una sola cadena (ScFv) , mutantes de los mismos, variantes naturales, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un sitio de reconocimiento de epítope de la especificidad referida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de epitope de la especificidad requerida. Un wanticuerpo monoclonal" se refiere a una población de anticuerpos homogénea donde el anticuerpo monoclonal está comprendido de aminoácidos (naturales y no naturales) que están implicados en la unión selectiva de un epítope. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo epítope. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no únicamente anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) de una sola cadena (ScFv) , mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de epítope de la especificidad requerida y la capacidad para unirse a un epítope. No pretende limitarse con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en la cual se produce (por ejemplo, hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, animales transgénicos , etc.)- El término incluye inmunoglobulinas completas así como los fragmentos, etc, descritos anteriormente bajo la definición de "anticuerpo" . Los anticuerpos "humanizados" se refieren a una molécula quimérica, generalmente preparada usando técnicas recombinantes, que tienen un sitio de unión del epítope derivado de inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula sobre la base de la estructura y/o de la secuencia de inmunoglobulina humana. El sitio de unión de antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados sobre dominios constantes o solo con las regiones determinantes de la complementaríedad (CDR) injertadas sobre regiones estructurales apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión de epítope pueden ser naturales o modificados por una o más sustituciones de aminoácido. Esto elimina la región constante como un inmunógeno en individuos humanos, pero la posibilidad de una respuesta inmune a la región variable ajena permanece (LoBuglio, A. F. et al., (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:4220-4224). Otro método se enfoca no solamente sobre proporcionar regiones constantes derivadas de humano sino la modificación en las regiones variables así como la reformación de las mismas tan estrechamente como sea posible a la forma humana. Se sabe que las regiones variables de ambas cadenas pesada y ligera contienen tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) las cuales pueden variar en respuesta a los epítopes en cuestión y determinar la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones estructurales (FR) las cuales están relativamente conservadas en una especie dada y que putativamente proporcionan un andamio para las CDR. Cuando son preparados anticuerpos no humanos con respecto a un epítope particular, las regiones variables pueden ser "reforzadas" o "humanizadas" injertando CDR derivadas de anticuerpos no humanos sobre las FR presentes en el anticuerpo humano a ser modificado. La aplicación de este método a varios anticuerpos ha sido reportada por Sato, K. , et al., (1993) Cáncer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al., (1988) Nature 332 ; 232-327 ; Verhoeyen, M. , et al., (1988) Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A., et al., (1991) Protein Engineering 4: 773-3783; Maeda, H . , et al., (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S.D. et al., (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:4181-4185; Tempest., P. R. et al., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co., M. S. et al., (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88: 2869-2873; Cárter, P. et al., (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:4285-4289; y Co, M. S. et al., (1992) J. Immunol 148:1149-1154. En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados, preservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado el cual contiene las seis CDR de los anticuerpos de ratón) . En otras modalidades, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) las cuales están alteradas con respecto al anticuerpo original, las cuales también son llamadas una o más CDR "derivadas" de una o más CDR del anticuerpo original . Un epítope "unido específicamente" o "se une preferiblemente" (usado de manera intercambiable aqui) a un anticuerpo o polipéptido que es un término bien comprendido en la técnica y los métodos para determinar de esa unión específica o preferible también son conocidos en la técnica. Se dice que una molécula exhibe "unión especifica" o "unión preferible" sin reacción o se asocia de manera frecuente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular de lo que lo hace con células o sustancias alternativas. Un anticuerpo "se une específicamente" o se "une preferiblemente" a un blanco si se une con mayor afinidad, avidez, más facilidad y/o con mayor duración de lo que se une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específica o preferiblemente a un epítope de KID3 es un anticuerpo que se une a este epítope de KID3 con mayor afinidad, avidez, mayor facilidad, y/o con mayor duración de lo que se une a otros epítopes de ID3 o epítopes no ID3. También se comprende leyendo esta definición que, un anticuerpo (porción o epitope) que se une • específica o preferiblemente a un primer blanco puede o no unirse específicamente o preferiblemente a un segundo blanco. Por lo tanto "la unión especifica" o "unión preferible" no necesariamente requiere (aunque pueden incluirse) una unión exclusiva. De manera general, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa de la unión preferente. El término "inmunológicamenté activo" se refiere a un epitope que es o se refiere a que "sigue siendo inmunológicamente activo con capacidad de un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-KID3) para unirse al epitope bajo condiciones diferentes, por ejemplo, después de que el epitope ha sido sometido a condiciones reductoras y desnaturalizantes. Diferentes funciones biológicas están asociadas con los anticuerpos anti- ID3 incluyendo, pero sin limitarse, a la capacidad para unirse al KID3 incluyendo el KID3 presente sobre células cancerosas, incluyendo pero sin limitarse a células de cáncer de ovario, próstata, pancreático, pulmón, colon, mama) ; la capacidad para unirse a una porción del KID3 que es expresada sobre la superficie de una célula viviente in vitro o in vivo; la capacidad para proporcionar un agente quimioterapéutico para células cancerosas (como células de cáncer de ovario, próstata, pancreático, colon, o mama) que expresan KID3 ; la capacidad para proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable en células cancerosas que expresan KID3 ; la capacidad para afectar un evento de muerte celular vía apoptosis, necrosis, oncosis u otras vías de muerte celular. "Oncosis" o un evento "oncótico" es una forma de muerte celular que puede distinguirse de la apoptosis. La Oncosis fue usada por primera vez en 1910 para describir la muerte celular isquémica de osteocitos (Trump, et al., 1997) Las células oncóticas se caracterizan por el .linchamiento celular y de los organelos, vacuolización e incremento de la permeabilidad de la membrana. La oncosis usualmente ocurre rápidamente después de una lesión, con cambios rápidos dando como resultado alteraciones en la forma y volumen celular. El mecanismo molecular y bioquímico que subyace a la oncosis no ha sido elucidado aún completamente. En algunos sistemas, parece que la oncosis puede resultar de canales de iones desregulados en la membrana celular y disminución de los niveles de ATP celular, conduciendo a un influjo de sodio, causando el hinchamiento y lisis celular (Barros, et al. 2001). Como se discute aquí, el KID3 o anticuerpos de KID3 , así como los otros agentes, agonistas, antagonistas, moduladores y polipéptidos (incluyendo los anticuerpos) descritos pueden tener cualquiera de una o más de esas características o efectos biológicos.

Un "anticuerpo equivalente a un anti-KID3" o polipéptido equivalente al anti-KID3" se refiere a un anticuerpo o un polipéptido que tiene una o más funciones biológicas asociadas con un anticuerpo anti-KID3, como por ejemplo, la especificidad de unión. Como se usa aquí, "agente" se refiere a un compuesto biológico, farmacéutico o químico. Los ejemplos no limitantes incluyen una molécula orgánica o inorgánica simple o compleja, con un péptido, una proteína, un oligonucleótido, un anticuerpo, un derivado, de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un derivado de vitamina, carbohidrato, una toxina, o un compuesto quimioterapéutico . Pueden ser sintetizados varios compuestos, por ejemplo, moléculas pequeñas y oligómeros (por ejemplo, oligopéptidos y oligonucleótidos) , y compuestos orgánicos sintéticos basados en varias estructuras centrales. Además, varías fuentes naturales pueden proporcionar compuestos a seleccionar, como extractos de plantas o animales, y similares. Un experto puede reconocer fácilmente que no existe límite a la naturaleza estructural de los agentes de la presente invención. Los agentes que son empleados en un método de la invención pueden ser seleccionados de manera aleatoria o diseñados de manera racional. Como se usa aquí, se dice que un agente seleccionado de manera aleatoria cuando el agente es elegido aleatoriamente son considerar las secuencias específicas implicadas en la asociación del KID3 con sus pares de unión nativos o anticuerpos conocidos. Un ejemplo de agente seleccionado aleatoriamente es el uso de una biblioteca química o una biblioteca peptídico combinada. Como se usa aquí, se dice que un agente es seleccionado o diseñado de manera racional cuando el agente es elegido sobre una base no aleatoria que toma en cuenta la secuencia del sitio blanco y/o su conformación en relación con la acción del agente. Los agentes anti-KID3 bloquean la interacción KID3/anti-KID3. Esta invención también abarca a agentes que actúan en los sitios de interacción entre el KID3 y su par de unión nativo, aunque otros ligandos y sus sitios de interacción con el KID3 activo también son abarcados dentro del alcance de esta invención, ya sea que son conocidos actualmente o identificados posteriormente. Los agentes pueden ser seleccionados de manera racional y diseñados de manera racional y utilizando las secuencias peptídicas o estructuras carbohidratadas que constituyan los sitios de contacto del complejo receptor/ligando y/o KID3/anticuerpo anti-KID3. Por ejemplo, un agente seleccionado de manera racional puede ser un péptido o carbohidrato cuya estructura es idéntica a la del ID3 como es expuesto sobre la superficie de una célula viviente en su ambiente nativo. Ese agente reducirá o bloqueará la asociación del anticuerpo anti-KID3 con el ID3 , o la asociación del KID3 con su ligando nativo, según se desee, por la unión al anticuerpo ID3 o al ligando nativo. Como se usa aqui, el término "marcado" con respecto al anticuerpo, pretende abarcar la marcación directa del anticuerpo por acoplamiento (es decir, enlazado físicamente) es una sustancia detectable, como un agente radiactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) ) al anticuerpo, asi como la marcación directa de la sonda o anticuerpo por reactividad por una sustancia detectable. Como se usa aqui, el término "asociación", con respecto al anticuerpo, incluye la unión covalente o no covalente o unión a un agente (por ejemplo, agente quimioterapéutico) . El anticuerpo puede ser asociado con un agente (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) por unión directa o unión indirecta via la unión a una plataforma común, puesto que el anticuerpo dirige la localización del agente a la célula cancerosa a la cual se une el anticuerpo y donde el anticuerpo y agente no se disocia sustancialmente bajo condiciones fisiológicas, de modo que el agente no sea dirigido a la misma célula cancerosa a la cual se une el anticuerpo o de modo que no disminuya la potencia del agente. Una "Muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo y puede ser usada en un ensayo de diagnóstico o verificación. La definición abarca muestras de saliva, sangre y otros líquidos de origen biológico, muestras de tejido sólido como un espécimen para ¦ biopsia o cultivos tisulares o células derivadas de los mismos, y la progenie de las mismas, por ejemplo, células obtenidas de una muestra de tej ido recolectada de un individuo que se sospecha tiene cáncer, y en modalidades preferidas de tejido de ovario, pulmón, próstata, páncreas, colon y mama. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su procuramiento, como por tratamiento con reactivos, solubilizacion o enriquecimiento de ciertos componentes, como proteína, polinucleótidos , o inclusión en una matriz semisólida o sólida para propósitos de corte . El término "muestra biológica" abarca una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos, muestras de tejido. Una "célula anfitriona" incluye una célula individual o cultivo de células que puede ser o ha sido recipiente para vectores para incorporar insertos polinucleotídicos . Las células anfitrionas incluyen la progenie de una sola célula anfitriona y la progenie puede no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico) a la célula madre original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una célula anfitriona incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido de esta invención. Como se usa aquí, "retrasar el desarrollo de la metástasis" significa diferir, impedir, disminuir, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la metástasis. Este retraso puede ser de varias longitudes de tiempo, dependiendo de la historia del cáncer y/o el individuo que esté siendo tratado. Gomo es evidente para un experto en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, dado que el individuo no desarrolla la metástasis . Una "cantidad efectiva" de una composición farmacéutica en una modalidad, es una cantidad suficiente para producir resultados benéficos o deseados incluyendo, sin limitación, resultados clínicos como contracción del tamaño del tumor (en el contexto del cáncer, por ejemplo cáncer de mama o próstata) , retardo de la muerte celular cancerosa, retraso del desarrollo de metástasis, disminución de los síntomas resultantes de la enfermedad, incremento de la calidad de vida de aquellos que padecen enfermedad, disminución de la dosis u otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, aumento del efecto de otros medicamentos como vía direccionamiento y/o internalización, retraso del progreso de la enfermedad y/o prolongación de la sobrevivencia de los individuos. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para propósitos de esta invención, una cantidad efectiva de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para reducir la proliferación de (o destruir) células cancerosas y para reducir y/o retrasar el desarrollo, o crecimiento de metástasis de células cancerosas, ya sea directa o indirectamente. En algunas modalidades, una cantidad efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no ser lograda en conjunto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. De este modo, una "cantidad efectiva" puede ser considerada en el contexto de la administración de uno o más agentes quimioterapeuticos, y puede considerarse que un solo agente dado en una cantidad efectiva si, en conjunto con uno o más de otros agentes, puede dar o ser logrado un resultado deseable. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades efectivas de cada componente está dentro de la experiencia de la técnica. Las dosis típicas comprenden de 0.1 a 100 mg/kg/peso corporal. Las dosis preferidas comprenden de 1 a 100 mg/kg/peso corporal. Las dosis más preferidas comprenden de 10 a 100 mg/kg/peso corporal . Como se usa aquí, se dice que una molécula de ácido nucleico o agente, anticuerpo, composición o célula, etc.. está "aislada" cuando la molécula de ácido nucleico, agente, anticuerpo, composición o célula, etc. está sustancialmente separada de moléculas de ácido nucleico, anticuerpos, agentes, composiciones, o células, etc. contaminantes de su fuente original . Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente un "mamífero, de manera más preferible un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales para deportes, mascotas, primates, ratones y ratas. Los términos "polipéptido" "oligopéptido" , "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable aquí para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por entidades diferentes a aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, forforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente marcador. También incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales), etc., así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Debe comprenderse que, debido a que los polipeptidos de esta invención se basan en un anticuerpo, los polipeptidos pueden ocurrir como cadenas individuales o cadenas asociadas . También abarcados dentro del alcance de la invención se encuentran los peptidomiméticos de agonistas, antagonistas y moduladores de KID3 (incluyendo anticuerpos anti-KID3) descritos aquí. Esos peptidomiméticos incluyen péptidos, donde al menos un aminoácido residual está sustituido con un aminoácido residual que no se encuentra de manera común en la naturaleza, como el isómero D del aminoácido o especies alquiladas en N del aminoácido. En otras modalidades, los peptidomiméticos se construyen reemplazando al menos un enlace amida (--C ( .dbd.O) -- H--) en un agonista, antagonista o moduladores del ID3 con un isostero de amida. Los isosteros de amida adecuados incluyen --CH.sub.2--NH--, --CH.sub.2--S--, --CH.sub.2- S(0).sub.n-- (donde n es 1 ó 2) , - -CH . sub .2 --CH. sub.2-- , --CH.dbd.CH-- (E o Z) , --C(. dbd.O) --CH.sub.2--, - -CH (CN) --NH-- , --C (OH) --CH. sub. 2--, y --0--C ( .dbd.O) --NH-- . Los enlaces amida en un agonista, antagonista o modulador de KID3 , son candidatos adecuados para el reemplazo con isosteros de amida incluyen ' enlaces que son hidrolizables por las esterasas o proteasas endógenas del sujeto pretendido en el tratamiento con agonista, antagonista, o modulador de KID3. Los peptidomiméticos pueden tener características estructurales similares a las de los carbohidratos para incrementar más efectivamente su similitud con el KID3 nativo. Como se usa aquí, "sustancialmente puro" se refiere al material que es al menos 85% (es decir, libre de contaminantes, de manera más preferible al menos 90% puro, de manera más preferible al menos 95% puro, de manera más preferible al menos 98%, de manera más preferible al menos 99% puro, o más puro. "Toxina" se refiere a cualquier sustancia, que produzca una respuesta adversa dentro de una célula. Por ejemplo, una toxina dirigida a una célula cancerosa tendría un efecto adverso, algunas veces dañino, sobre la célula cancerosa. Los ejemplos de toxinas incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, caliquemicina, y maitansinoides . Como se usa aquí, "tratamiento" o "tratar" es un método para obtener resultados benéficos o deseados, incluyendo y preferiblemente resultados clínicos. Para los propósitos de esta invención, los resultados benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducción de la proliferación de (o destrucción) de células cancerosas u otras células enfermas, reducción de la metástasis de células cancerosas encontradas en cánceres, contracción del tamaño del tumor, disminución de los síntomas resultantes de la enfermedad, incremento de la calidad de vida de aquellos que padecen de la enfermedad, disminución de la dosis u otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, retraso del progreso de la enfermedad y/o prolongación de la sobrevivencia de los individuos.

III. Métodos para producir anticuerpos y polipéptidos Los métodos para producir anticuerpos monoclonales son conocidos en la técnica. El método que puede ser empleado es el método de Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) o una modificación del mismo. Típicamente, los anticuerpos monoclonales son desarrollados en especies no humanas, como ratones. En general, se usan un ratón o rata para la inmunización pero también pueden ser usados otros animales. Los anticuerpos son producidos inmunizando ratones con una cantidad inmunogénica de células, extractos de células, o preparaciones de proteínas que contienen KID3. El inmunógeno puede ser, pero no se limita a, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, ácidos nucleicos o tejido. En otra modalidad, son usadas células epiteliales de riñon fetal humano. En otra modalidad, son usadas células progenitoras de vejiga o pancreáticas humanas. Los métodos para aislar y cultivar células de riñon fetal humano se detallan en el Ejemplo 1. Las células usadas para la inmunización, por ejemplo, células de riñon fetal humano, vejiga o células progenitoras pancreáticas humanas, pueden ser cultivadas durante un periodo de tiempo (al menos 24 horas) antes de su uso como inmunógeno. Las células (por ejemplo, células de riñon fetal humano, vejiga o células progenitoras pancreáticas) pueden ser usadas como inmunógenos por sí mismas o en combinación con un adyuvante no desnaturalizante, como el Ribi . En general, las células que permanecerán intactas y preferiblemente viables cuando sean usadas como inmunógenos . Las células intactas pueden permitir que los epítopes sean detectados mejor que las células rotas por el animal inmunizado. El uso de adyuvantes desnaturalizantes o severo, por ejemplo, adyuvante de Freud, puede romper las células de riñon fetal humano u otras y por lo tanto muy desalentadores . El inmunógeno puede ser administrado múltiples veces a intervalos periódicos como, bisemanalmente o semanalmente, o puede ser administrado de tal manera que mantenga la viabilidad en el animal por ejemplo, en un tejido recombinante) . El ejemplo 2 describe los métodos usados para generar anticuerpos anti-KID3 y pueden ser usados para generar otros anticuerpos monoclonales, que se unan al KID3. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales que se unen al ID3 son obtenidos usando células anfitrionas que sobreexpresan KID3 como un inmunógeno. Esas células incluyen, a manera de ejemplo y sin limitación, células de riñon fetal humano y células de cáncer de colon humano.

Para verificar la respuesta al anticuerpo, puede ser obtenida una muestra biológica pequeña (por ejemplo, sangre) del animal y probarla por el título de anticuerpo contra el inmunógeno. Los nodos linfáticos de bazo y/o varios pueden ser removidos y disociados en células pequeñas. Si se desea, las células de bazo pueden ser tamizadas (después de la remoción de células no específicamente adherentes) aplicando una suspensión celular a una placa o a un pozo recubierto con el epítope. Las células B, que expresan inmunoglobulina unida a la membrana específica para el epítope, se unirán a la placa, y no serán enjuagadas con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o las células de bazo disociadas, pueden entonces ser fusionadas con células de mieloma (por ejemplo, X63-Ag8.653 y aquellas del Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, CA) . Puede ser usado polietilen glicol (PEG) para fusionar células de bazo o linfocitos con células de mieloma para formar un hibridoma. El hibridoma es entonces cultivado en un medio selectivo (por ejemplo, medio con hipoxantina, aminopterina, timidina, en otras circunstancias conocido como "medio ???" . Los hibridomas resultantes son entonces cultivados por dilución limitante, y son ensayados por la producción de anticuerpos que se unen específicamente al inmunógeno (por ejemplo, la superficie en las células de riñon fetal humano, superficie de líneas celulares cancerosas, Ag- LD3, secciones de vejiga fetal, etc.) usando FACS o imraunohistoquimica (tamiz IHC) . Los hibridomas que secretan anticuerpo monoclonal seleccionados son entonces . cultivados in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo tisular o reactores de fibra huecos) o in vivo (por ejemplo, como ascitos en ratones) . El ejemplo 3 proporciona detalles adicionales acerca de los métodos utilizados para obtener y seleccionar un anticuerpo anti- ID3. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, pueden ser usadas células B inmortalizadas con EBV para producir anticuerpos monoclonales de la invención objetivo. Los hibridomas son expandidos y subclonados, si se • desea, y los sobrenadantes son ensayados por la actividad antiinmunógeno por procedimientos de ensayo convencionales (por ejemplo, FACS, IHC, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, inmunoensayo de fluorescencia, etc.). En otra alternativa, el anticuerpo monoclonal anti- KID3 y cualquier otro anticuerpo equivalente puede ser secuenciado y producido de manera recombinante por cualesquier métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, humanización, uso de ratones transgénicos para producir anticuerpos completamente humanos, tecnología de presentación de fagos, etc.). En una modalidad, el anticuerpo monoclonal anti- ID3 es secuenciado y la secuencia polinucleotidica es entonces clonada en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica para el anticuerpo de interés puede ser mantenido en un vector en una célula anfitriona y la célula anfitriona puede entonces ser expandida y congelada para su uso futuro. La Figura 7 muestra el ácido nucleico y la secuencia de proteína traducida correspondiente de la cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal anti-KID3 mu-anti-KID3 que incluye la secuencia señal nativa. La secuencia señal nativa es de los aminoácidos 1-20, los residuos nucleotídicos 1-60. La región variable de la cadena ligera está en los aminoácidos 21-131, los residuos nucleotídicos 61-393. La región constante kappa humana está en los aminoácidos 132-238, los residuos nucleotídicos 394-714. El codon sin sentido está en los residuos nucleotídicos 715-717. La Figura 8 muestra la secuencia de ácido nucleico y de la proteína traducida correspondiente de la cadena pesada Gl del anticuerpo monoclonal anti-KID3 mu-anti-KID3 que incluye la secuencia señal nativa. La secuencia señal nativa está en los aminoácidos 1-18, los residuos nucleotídicos 1-54. La región variable de la cadena pesada está en los aminoácidos 19-138, los residuos nucleotídicos 55-414. La región constante gamma 1 humana está en los aminoácidos 139-468, los residuos nucleotídicos 415-1404. El codon sin sentido está en los residuos nucleotídicos 1405-1407.

La secuencia polinucleotídica del anticuerpo monoclonal anti-KID3 y cualquier otro anticuerpo equivalente puede ser usado para la manipulación genética para generar un anticuerpo "humanizado", para mejorar la afinidad, otras características del anticuerpo. "El principio general en la humanización del anticuerpo implica retener la secuencia básica de la porción de unión del epitope del anticuerpo, barriendo a la vez el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpo humano. Existen cuatro pasos generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Esos son: (1) determinar la secuencia nucleotídica y de aminoácidos predicha en los dominios variables ligero y pesado del anticuerpo iniciales (2) designar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir cual región estructural del anticuerpo usar durante el proceso de humanización (3) las metodologías/ técnicas de inmunización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; y 6,331,415. Han sido descritas numerosas moléculas de anticuerpos "humanizados" que comprenden un sitio de unión de epitope derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor o de roedor modificadas y sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR) asociadas fusionadas a dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter et al. Nature 34-9: 293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci . USA 86: 4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol . 138: 4534-4538 (1987), y Brown et al. C ncer Res. 47: 3577-3583 (1987). Otras referencias describen CDR de roedor injertadas en una región estructural (FR) de soporte humana antes de la fusión con el dominio constante del anticuerpo humano apropiado. Véase, por ejemplo, Riechmann et al. Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239: 1534-1536 (1988), y Jones et al. Nature 321: 522-525 (1986). Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones estructurales de roedor revestidas de manera recombinante . Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea No. 519,596. Esas moléculas "humanizadas" son diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica indeseable hacia moléculas de anticuerpo anti-humano de roedor, lo cual limita la duración y efectividad de las aplicaciones terapéuticas de aquellas entidades en receptores humanos . Otros métodos de anticuerpos inmunizantes que también pueden ser utilizados son descritos por Daugherty et al., Nucí. Acids Res., 19: 2471-2476 (1991) y en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; y 5,866,692. La invención también abarca fragmentos de región variable de cadena simple ("scFv") de anticuerpos de esta invención, como el mu-anti-KID3. Los fragmentos de la región variable de una sola cadena son producidos ligando las regiones variables de cadena ligera y/o pesada usando un péptido enlazante corto. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426 describe ejemplos de péptidos enlazantes que forman puentes de aproximadamente 3.5 nm entre el carboxi terminal de una región variable y el amino terminal de la otra región variable. Han sido diseñados y usados enlazantes de otras secuencias, Bird et al. (1988) . Los enlazantes pueden a su vez ser modificados para funciones adicionales, como la unión de fármacos o la unión a soportes sólidos. Las variantes de una sola cadena pueden ser producidas de manera recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, puede ser usado un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, puede ser introducido un plásmido adecuado que contenga el polinucleotido que codifique para el scFv en una célula anfitriona adecuada, ya sea eucariótica, como células de levadura, plantas, insectos o mamífero, o procariótica, como E. coli. Los polinucleótidos que codifican para el scFv de interés pueden ser producidos por manipulaciones de rutina como la ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede ser aislado usando la técnica de purificación de proteínas estándar conocidas en la técnica. La invención incluye modificaciones a los agonistas, antagonistas, moduladores y anticuerpos de KID3 , incluyendo anticuerpos y polipéptidos funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente sus propiedades y variantes que tienen una actividad mejor o menor. La modificación de los polipeptidos es una práctica de rutina en la técnica y no necesita ser descrita con detalle aquí. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de aminoácidos residuales, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos que no cambian de manera dañina significativamente la actividad funcional, o el uso de análogos químicos. Los aminoácidos residuales que pueden ser sustituidos de manera conservativa por otros incluyen pero no se limitan a: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina asparagina/ glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina . .Esos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados , así como polipéptidos con otras modificaciones postraslacionales, como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos serán conservativas, es decir, que el aminoácido sustituido tendrá propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Esas sustituciones conservativas son conocidas en la técnica, y anteriormente han sido proporcionados ejemplos. Las modificaciones de aminoácidos pueden ir de cambios o modificaciones de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión. Otros métodos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Pueden ser utilizadas modificaciones, por ejemplo, para la unión de marcas para inmunoensayos, como la unión de entidades radioactivas para radioinmunoensayo . Los polipéptidos modificados se producen usando procedimientos establecidos en la técnica y pueden ser tan usados o separados usando métodos estándar conocidos en la técnica. La invención también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los polipéptidos y anticuerpos de esta invención. En una modalidad, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región de la cadena ligera variable y al menos 10 aminoácidos de la región de la cadena pesada variable. En otra modalidad, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra modalidad, el polipéptido de fusión contiene una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado con la ATTC como describe aqui . Para propósitos de esta invención, una protelna de fusión de anticuerpo contiene uno o más polipéptidos anti-KID3 y otra secuencia de aminoácidos a la cual no esta unida la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homologa de otra región. El polipéptido anti-KID3 y otros agonistas, antagonistas y moduladores de KID3 pueden ser creados por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, de manera sintética o recombinante . Un método para producir agonistas, antagonistas y moduladores del péptido KID3 implican la síntesis química del polipéptido, seguida por el tratamiento bajo condiciones oxidantes apropiadas para obtener la conformación nativa, es decir, los enlaces disulfuro correctos . Esto puede lograrse usando metodologías bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (véase Kelley, .F. & Winkler, M. E. in Genetic Engineering Principies and Methods, Setlow, J. K. , ed., Plenum Press, N. Y.., vol 12, pp 1-19 (1990) Stewart, J. M. & Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford, III. (1984); véase también las Patentes Estadounidenses Nos. 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; y 3,862,925). Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados de manera conveniente usando la síntesis peptídica en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1964); Houghten, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 82:5132 (1985)). En otra alternativa más, los anticuerpos completamente humanos pueden ser obtenidos usando ratones comercialmente disponibles que han sido modificados para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. Los animales transgénicos que son diseñados para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más robusta también pueden ser usados para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Los ejemplos de esa tecnología son el Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y HuMAb-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ) . En una alternativa, los anticuerpos pueden ser producidos de manera recombinante y expresados usando cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos pueden ser producidos de manera recombinante aislando primero los anticuerpos producidos a partir de animales anfitriones, obteniendo la secuencia genética, y usando la secuencia genética para expresar el anticuerpo de manera recombinante en las células anfitrionas (por ejemplo, células CHO) . Puede ser empleado otro método para expresar las secuencia de un anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Los métodos de expresión de anticuerpos de manera recombinante en plantas o leche ya han sido descritos . Véase, por ejemplo Peeters, et al. (2001) Vaccine 19:2756; Lonberg, N. y D. Huszar (1995) Int. Rev. Immunol 13:65; y Pollock, et al. (1999) J" Immunol Methods 231:147. Los métodos para producir derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de una sola cadena, etc., son conocidos en la técnica. En otra alternativa, los anticuerpos pueden ser producidos de manera recombinante por la tecnología de presentación de fagos. Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; y Winter et al., Annu. Rev. Inmuno1. 12: 433-455 (1994) . Los anticuerpos o proteínas de interés pueden ser sometidos a secuenciamiento por degradación de Edman, la cual es bien conocida por aquellos expertos en la técnica. La información peptídica generada de la espectrometría de masas o degradación de Edman puede ser usada para diseñar sondas o cebadores que sean usados para clonar la proteína de interés . Un método alternativo para clonar la proteína de interés es por "tamizado" usando KID3 purificado o porciones del mismo en células que expresan el anticuerpo o proteína de interés. El procedimiento "tamizado" es conducido obteniendo una biblioteca de ADNc de tejidos o células que expresan el anticuerpo o proteína de interés sobreexpresando el ADNc en un segundo tipo de célula y separando las células transíectadas del segundo tipo de célula para una unión especifica al ID3. Las descripciones detalladas de los métodos usados en la clonación de genes de mamífero que codifican para proteínas en la superficie celular por "tamizado" pueden encontrarse en la técnica. Véase, por ejemplo, Aruffo, A. y Seed, B. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84,8573-8577 (1987) y Stephan, J. et al., Endocrinology 140: 5841-5854 (1999) . Los ADNc que codifican para anticuerpos anti-KID3, y otros agonistas, antagonistas y moduladores del péptido KID3 pueden ser obtenidos transcribiendo de manera inversa los ARNm de un tipo particular de células de acuerdo a métodos estándar en la técnica. Específicamente, el ARNm puede ser aislado usando varias enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo a los procedimientos expuestos en Sambrook, et al. supra o extraídos por resinas de unión de ácido nucleico comercialmente disponible siguiendo las instrucciones acompañantes proporcionadas por el fabricante (por ejemplo, Qiagen, Invitrogen, Promega) . Los ADNc sintetizados son entonces introducidos en un vector de expresión para producir el anticuerpo o proteína de interés en la célula de un segundo tipo. Esto implica que un vector de expresión debe ser replicado en las células anfitrionas como episomas o como una parte integral del ADN cromosorna1. Los vectores de expresión adecuados incluyen pero no se limitan a plásmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados , retrovirus y cósmidos. Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden ser introducidos en la célula anfitriona por cualquiera de un números de medios apropiados, incluyendo la electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio,. DEAE u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, donde el vector es un agente infeccioso como un vaccinia virus) . La elección de los vectores o polinucleótidos de introducción con frecuencia dependerá de las características de la célula anfitriona. Puede ser usada cualquier célula anfitriona capaz de sobreexpresar ADN heterólogo para propósitos de aislar los genes que codifican para el anticuerpo, polipéptido o proteina de interés. Los ejemplos no limitantes de células anfitrionas de mamífero incluyen pero no se limitan a células COS, HeLa, y CHO . Preferiblemente, las células anfitrionas expresan los ADNc a un nivel de aproximadamente 5 veces más, de manera más preferible 10 veces más, de manera más preferible 20 veces más que el del anticuerpo endógeno correspondiente o proteína de interés si esta presente, en las células anfitrionas . La selección o separación de las células anfitrionas para una unión específica al KID3 se efectúa por medio de un inmunoensayo o FACS . Puede ser identificada una célula que sobreexprese un anticuerpo o proteina de interés . También están disponibles varias técnicas que pueden ahora ser empleadas para producir agonistas, antagonistas y moduladores de péptido KID3 mutante que codifiquen para adiciones, supresiones, o cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante en relación al agonista o molécula moduladora del péptido KID3 original . La invención incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de esta invención. Los polipéptidos de esta invención pueden ser producidos por procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden ser producidos por métodos proteoliticos y otros métodos de degradación de los anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos individuales o de fusión) como se describió anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos son especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, son producidos de manera conveniente por síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles. Por ejemplo, el polipéptido anti-KID3 podría ser producido por un sintetizador de polipéptido automatizado empleando el método en fase sólida.

VII. IV. Métodos para seleccionar o separar polipéptidos y anticuerpos monoclonales Pueden ser usados varios métodos para separar o seleccionar polipéptidos y anticuerpos monoclonales que se unan al KID3. Debe comprenderse que "unión" se refiere a la unión biológica o inmunológica revelante, es decir, la unión es específica para el determinante antigénico único para el cual es codificada la molécula de inmunoglobulina, o a la cual está dirigida el polipéptido. No se refiere a la unión no específica que puede ocurrir cuando sea usada una inmunoglobulina a una concentración muy alta contra un blanco no específico. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales son seleccionados por su unión al KID3 usando técnicas de selección o separación estándar. De esta manera, se obtuvo el anticuerpo monoclonal anti-KID3. De acuerdo con el tratado de Budapest, ha sido depositado un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales anti-KID3 en la American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd. , Manassas VA 20110-2209 en Diciembre 18, 2002 con la designación de Depósito de Patente de PTA-4860. Los anticuerpos monoclonales que se unen al KID3 son seleccionados por su unión a tejidos cancerosos y células no cancerosas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales que se unen al KID3 y que también reaccionan de manera cruzada con células o tejidos cancerosos humanos, pero no a células o tejidos normales en el mismo grado, son seleccionados . Un método que puede ser empleado para la separación o selección es la inmunohistoquímica (IHC) . Las técnicas inmuno-químicas estándar son conocidas por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, Animal Cell Culture Methods (J. P. Mather y D. Barnes, eds., Academic Press, Vol. 57, Ch. 18 y 19, pp. 314-350,1998). Las muestras biológicas (por ejemplo, tejidos) pueden ser obtenidos de biopsias, autopsias o necropsias. Para determinar si el KID3 esta en la presente solo sobre células cancerosas, pueden ser usados anticuerpos anti-KID3 para detectar la presencia del ID3 sobre tejidos de individuos con cáncer, mientras que otros tejidos no cancerosos del individuo que padece cáncer o tejidos de individuos sin cáncer son usados como control. El tejido puede ser incluido en una sustancia sólida o semisólida que evite daño durante el congelamiento (por ejemplo gel de agarosa u OCT) y entonces cortado para su tinción. Pueden ser usados cánceres de diferentes órganos y a diferentes grados para seleccionar anticuerpos monoclonales . Los ejemplos de tejidos que pueden ser usados para propósitos de selección o separación incluyen pero no se limitan a ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, cerebro, corazón, hígado, estómago, nervios, vasos sanguíneos, huesos, tracto digestivo superior y páncreas. Los ejemplos de los diferentes tipos de cáncer pueden ser usados para propósitos de selección o separación incluyen pero no se limitan a carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, adenosarcomas, linfornas y leucemias.

En otra alternativa más, pueden ser usadas líneas de células cancerosas como SK-0v-3 (ATCC #HTB 77) , LnCap (ATCC #CRL-1740) , A549 (ATCC #CCL 185) , PA C-1 (ATCC #CRL 1469), SK-BR-3 (ATCC #HTB 30), SK-MES-1 (ATCC #HTB 58) , HT-29 (HTB- 38), SW 480 (ATCC #CCL 228), AsPC-1 (ATCC #CRL 1682), Capan-1 (ATCC #HTB 79), CFPAC-1 (ATCC #CRL 1918), HPAP-II (ATCC #CRL-1997) , HS-700T (ATCC #HTB 147) , ES-2 (ATCC #CRL-1978), PC-3 (ATCC #CRL 1435), Du-145 (ATCC #HTB-81) , Calu3 (ATCC #HTB-55) , A498 (ATCC # CRL-7908) , Caki-2 (ATCC # HTB-47), 786-0 (ATCC # CRL-1932), Hs 7S6T (ATCC # HTB-134) , MCF7 (ATCC # HTB-22), BT-474 (ATCC # HTB-20) , Rav CA130 (linea de cáncer de pulmón patentada y desarrollada en Raven Biotechnologies , inc . ) , Rav 9926 (línea de cáncer pancreático patentada y desarrollada en Raven) y 22Rvl (ATCC #;CRL-2505) y células normales de sus tejidos respectivos para separar o seleccionar anticuerpos monoclonales que son específicos para tejido cancerígeno. Pueden ser usados cultivos celulares primarios, a de bajo pase, derivados de tejidos normales de diferentes órganos, incluyendo pero sin limitarse a células de ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, músculo liso aórtico y células endoteliales como controles negativos. Las células cancerosas o no cancerosas pueden hacerse crecer sobre portaobjetos o cubreobjetos de vidrio o sobre superficies de plástico, o preparadas en CellArray*114 como se describe en la WO 01/43869, y seleccionada por la unión del anticuerpo usando IHC como se describió anteriormente para tejidos. De manera alternativa, las células pueden ser removidas de la superficie del crecimiento usando medios no proteolíticos y centrifugando el sedimento, el cual es entonces incluido y tratado como tejidos para el análisis por IHC como se describió anteriormente. Las células pueden ser inoculadas en animales inmunodeficientes , un tumor que se permita crecer, y entonces este tumor puede ser cosechado, incluido y usado como una fuente de tejido para el análisis por IHC. En otra alternativa, pueden ser seleccionadas o separadas células incubando con el anticuerpo primario, un anticuerpo "reportero" secundario ligado a una molécula fluorescente y entonces analizado usando una máquina clasificadora de células activada por fluorescencia (FACS) . Pueden ser utilizados varios sistemas de detección diferentes para detectar la unión de los anticuerpos a secciones o cortes de tejido. Típicamente la inmunohistoquímica implica la unión de un anticuerpo primario al tejido y entonces un anticuerpo secundario reactivo contra las especies en el anticuerpo primario generado y conjugado un marcador detectable (por ejemplo, peroxidasa de rábano, HRP, o diaminobencedina, DAB) . Un método alternativo que puede ser usado es anticuerpos complementarios de imagen especular policlonales o polyMICA. La técnica poly ICA (Anticuerpos Complementarios de Imagen Especular policlonales) , descrita por D.C. Mangham y P.G. Isaacson (Histopathology (1999) 35 (2) : 129-33) , puede ser usada para probar la unión de anticuerpos primarios (por ejemplo, anticuerpos anti-KID3) a tejidos normales y cancerosos. Varios tipos de kits de detección polyMICAMR se encuentran comercialmente disponibles de The Binding Site Limited (P. 0. Box 4073 Birmingham B29 6AT Inglaterra) . El producto No. HK004.D es un kit de detección polyMICA1® el cual usa el cromágeno DAB. El producto No. HK004.A es un kit de detección polyMICA1^ el cual usa el cromágeno AEC. De manera alternativa, el anticuerpo primario puede ser marcado directamente con el marcador detectable . El primer paso en la separación o selección en HIC para seleccionar un anticuerpo apropiado es la unión de anticuerpos primarios producidos en ratones (por ejemplo, en anticuerpos anti-KID3) para uno o más inmunógenos (por ejemplo, muestras de células o tejidos) . En una modalidad, la muestra de tejido es de corte de un tejido congelado de diferentes órganos. Las muestras de células o tejidos pueden ser cancerosas o no cancerosas. Los tejidos congelados pueden ser preparados, cortados, con o sin fijación y efectuarse la HIC por cualquiera de un número de métodos conocidos por un experto en la técnica. Véase por ejemplo, Stephan et al. Dev. Biol. 212: 264-277 (1999), y Stephan et al. Endocrinology 140: 5841-54 (1999) V. Métodos de caracterización de anticuerpos anti-KID3 Pueden ser usados varios métodos para caracterizar anticuerpos anti-KID3. Un método es el identificar el epítope al cual se une . El mapa del epítope puede ser logrado sintetizando los carbohidratos centrales que constituyen el KID3. Esos carbohidratos sintetizables también pueden ser unidos sintéticamente a moléculas portadoras como la albúmina de suero bovino (BSA) o albúmina de suero humano (HSA) para constituir "neoproteínas" . La síntesis de neoproteínas se encuentra comercialmente disponible de varias fuentes, por ejemplo, Lundonia Biotech AB (Lund, Suecia) y Dextra Laboratorios (Reading, Reino Unido) . Esas neoproteínas pueden entonces ser usadas como blanco de separación o selección en el descubrimiento de otros anticuerpos anti-KID3. Otro método que puede ser usado para caracterizar un anticuerpo anti-KID3 es el uso de ensayos competitivos con •otros anticuerpos que se sabe se unen al mismo epítope, es decir, el KID3 para determinar si los anticuerpos anti-KID3 se unen al mismo epítope que otros anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos comercialmente disponibles para el KID3 pueden estar disponibles y pueden ser identificados usando los ensayos de unión enseñados aquí . Los ensayos competitivos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y aquellos procedimientos y datos ilustrativos se detallan mejor en los Ejemplos. Los anticuerpos anti-KID3 pueden ser caracterizados mejor por los tejidos, y por el cáncer o tipo de tumor al cual se unen.

VI. Métodos de diagnóstico del cáncer usando anticuerpos anti-KID3 y moduladores de KID Los anticuerpos monoclonales para ID3 producidos por los métodos descritos aquí pueden ser usados para identificar la presencia o ausencia de células cancerosas en una variedad de tejidos, incluyendo pero sin limitarse a, ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñon, páncreas, piel, tiroides, cerebro, corazón, hígado, estómago, nervios, vasos sanguíneos, hueso, tracto digestivo superior, para propósitos de diagnóstico. Los anticuerpos monoclonales para KID3 producidos por los métodos descritos aquí también pueden ser usados para identificar la presencia o ausencia de células cancerosas, o el nivel de determinante antigénico de las mismas, que se encuentran circulando en la sangre después de su liberación de un tumor sólido. Esos determinantes antigénicos circulantes pueden ser un epítope KID3 intacto, o un fragmento del mismo que retenga la capacidad para ser detectado de acuerdo a los métodos enseñados aquí . Esa detección puede ser efectuada por análisis FACS usando métodos estándar comúnmente usados en la técnica.

Esos casos pueden implicar la formación de un complejo entre el ID3 y un anticuerpo que se une específicamente al KID3. Los ejemplos de esos anticuerpos incluyen pero no se limitan a aquellos anticuerpos monoclonales anti-KID3 producidos por el hibridoma depositado en la ATCC con la designación PTA-4860. La formación de ese complejo puede ser in vitro o in vivo. Sin ser limitado por la teoría, el anticuerpo monoclonal anti-KID3 puede unirse al KID3 y puede entonces internalizarse. En una modalidad preferida de los métodos de diagnóstico de esta invención, el anticuerpo porta una etiqueta de marca detectable. Los ejemplos de etiquetas o marcas que pueden ser usadas incluyen un agente radioactivo o un fluoróforo, como el fluoroisotiocianato o ficoeritrina . Como con otros anticuerpos conocidos usados comercialmente para propósitos de diagnóstico terapéutico, el epitope blanco de esta invención es expresado ampliamente en tejido normal. También es sobrerregulado en algunos tumores. Por lo tanto, una dosis de gotas particulares de liberación de los anticuerpos de esta invención como las usadas para agentes de diagnóstico o terapéuticos serán diseñadas para tumor o estado de enfermedad particular humano, así como para el individuo particular que este siendo tratado. Un método de uso de anticuerpos para el diagnóstico es la formación de imagen del tumor in vivo ligando el anticuerpo a un agente radioactivo o radioopaco, administrando el anticuerpo al individuo y usando una máquina de rayos X u otra formadora de imágenes para visualizar la localización del anticuerpo marcado en la superficie de las células cancerosas que expresan el epítope. El anticuerpo es administrado a una concentración que promueve la unión a condiciones fisiológicas. Las técnicas in vitro para la detección de KID3 son de rutina en la técnica e incluyen ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunoprecapitaciones , ' inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA) , radioinmunoensayo (RIA) , y análisis de Western blot . En aspectos de esta invención, los métodos de formación de imágenes radioactivas de tumores son neoplasmas, o de medir la efectividad de un método de tratamiento con un anticuerpo marcado radioactivamente, comprende el paso de administrar un anticuerpo específico del tumor marcado radiactivamente a un individuo después de ir siguiendo la práctica de esta invención. El anticuerpo marcado radioactivamente puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal que comprende una marca radioactiva, seleccionada preferiblemente del grupo que consiste de Tecnecio-99m, Indio-111, Yodo-131, Renio-186, Renio-188, Samario-153, Lutecio-177, Cobre-64, Escandio-47, Itrio-90. Los anticuerpos monoclonales marcados con radionúclidos terapéuticos como el Yodo-131, Renio-188, Holmio-166, Samario-153 y Escandio-47 , los cuales no comprenden la inmunorreactividad de los anticuerpos y no son degradados in vivo, son especialmente preferidos . El experto en la técnica apreciará que se conocen otros isótopos radioactivos, y pueden ser adecuados para aplicaciones específicas. La formación de imágenes radioactivas puede ser conducida usando una tomografxa computalizada de emisión fotónica simple (SPECT) , Tomografxa de Emisión Positrónica (PET) , Tomografxa Computarizada (CT) o Formación de Imágenes de Resonancia Magnética (MRI) . LA formación de imágenes correlativa, la cual permite una mayor definición anatómica de la ubicación de metástasis localizables por la formación de imágenes radionmunológica, es también contemplada. En otros métodos, las células cancerosas son removidas y el tejido preparado para su inmunohistoquímica por métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, incluyendo en un compuesto congelante, congelando y cortando, con o sin fijación; fijación e inclusión en parafina con o sin varios métodos de recuperación y contratinción del epitope) . Los anticuerpos monoclonales también pueden ser usados para identificar células cancerosas en diferentes etapas de desarrollo. Los anticuerpos también pueden ser usados para determinar cuales tumores individuales expresan el epitope sobre su superficie a un nivel predeterminado y son de este modo candidatos para inmunoterapia usando anticuerpos dirigidos contra el epítope. Los anticuerpos deben reconocer cánceres primarios y metastáticos de ovario, próstata y páncreas y cánceres primarios de pulmón que expresen KID3. Como se usa aquí, la detección puede incluir la detección cualitativa y/o cuantitativa y puede incluir comparar el nivel medido a una célula normal por un nivel incrementado de expresión de KID3 en células cancerosas. La invención también proporciona métodos para ayudar a diagnóstico del cáncer (como cáncer de ovario, pulmón, pancreático, próstata, colon o mama) en un individuo usando cualquier anticuerpos que se una a KID3 y cualesquier otros métodos que puedan ser usados para determinar el nivel de expresión de KID3. Como se usa aquí, los métodos para "ayudar al diagnóstico" significa que esos métodos ayudan a efectuar una determinación clínica con respecto a la clasificación, o naturaleza, del cáncer, y pueden o no ser concluyentes con respecto al diagnóstico definitivo. En consecuencia, un método para ayudar al diagnóstico del cáncer puede comprender el paso de detectar el nivel de KID3 en una muestra biológica del individuo y/o determinar el nivel de expresión de KID3 en la muestra. Los anticuerpos que reconocen el epítope o una porción del mismo también pueden ser usados para crear inmunoensayos de diagnóstico para detectar los determinantes antigénicos liberados o secretados de células cancerosas vivientes o muertas en fluidos corporales, incluyendo pero sin limitarse a, sangre, saliva, ¦orina, fluido pulmonar o fluido ascitico. No todas las células en un tumor de interés particular expresarán KID3, y las células cancerosas en otros tejidos pueden expresar KID3 , de este modo un individuo es seleccionado, de manera deseable por la presencia o ausencia de KID3 sobre células cancerosas para determinar la utilidad de la inmunoterapia en el individuo. Los anticuerpos anti- KID3 producidos por los métodos descritos aquí pueden ser usados para determinar si el individuo diagnosticado con cáncer puede ser considerado candidato para inmunoterapia usando anticuerpos dirigidos contra KID3. En una modalidad, una muestra de tumor canceroso o una biopsia puede ser probada por la expresión de KID3 , usando anticuerpos dirigidos contra KID3. Los individuos con células cancerosas que expresen KID3 son candidatos adecuados para inmunoterapia usando anticuerpos dirigidos contra ID3. La tinción con anticuerpo anti-KID3 también puede ser usada para distinguir tejidos cancerosos de tejidos normales. Los métodos de uso de anticuerpos anti-KID3 para propósitos de diagnóstico son útiles tanto antes como después de cualquier forma de tratamiento anticáncer, por ejemplo, .quimioterapia o terapia de radiación, para determinar cuales tumores más probablemente responderán a un tratamiento dado, diagnóstico para individuos con cáncer, subtipo del tumor del tumor u origen de la enfermedad mestastática, y expresión de la enfermedad o respuesta al tratamiento. Las composiciones de esta invención también son adecuadas para el diagnóstico de estado de enfermedades diferentes al cáncer, usando los métodos descritos de manera general anteriormente en aplicación con otras células enfermas (no cancerosas) . Los estados de enfermedad adecuados para usarse en los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades o trastornos asociados con respuestas inflamatorias o autoinmunes en individuos . Los métodos descritos anteriormente pueden ser usados para modular respuestas inflamatorias o autoinmunes en individuos . Las enfermedades y condiciones resultantes de la inflamación y trastornos autoinmunes puede ser sometidas a diagnóstico y/o tratamiento usando las composiciones y métodos de la invención incluyen, a manera de ilustración y sin limitación, esclerosis múltiple, meningitis, encefalitis, apoplejía, otros traumas cerebrales, enfermedad del intestino inflamatorio incluyendo la colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, miastenia gravis, lupus, artritis reumatioide, asma, diabetes juvenil aguda, demencia asociada con el SIDA, aterosclerosis, nefritis, retinitis, dermatitis atópica, psoriasis, isquemia miocárdica y daño pulmonar mediado por leucocitos .

Otras indicaciones más para el diagnóstico y/o uso terapéutico de anticuerpos y otros agentes terapéuticos de la invención incluyen la administración a individuos en riesgo de rechazo de órganos o injertos. En años recientes ha habido una mejora considerable en la eficiencia de las técnicas quirúrgicas para transplantar tejidos y órganos como la piel, riñon, hígado, corazón, pulmón, páncreas y medula ósea. Quizá el problema sobresaliente principal es la falta de agentes satisfactorios para inducir inmunotolerancia en el receptor al aloinjerto u órgano transplantado. Cuando son transplantadas células u órganos alogénicos en un anfitrión (es decir, el donador y el donado son individuos diferentes de la misma especie) , el sistema inmune del anfitrión probablemente monte una respuesta inmune a los determinantes antigénicos externos en el transplante (enfermedad de anfitrión contra injerto) conduciendo a la destrucción del tejido transplantado. Los usos descritos en cualquier parte en esta solicitud que expongan su uso para anticuerpos anti-KID3 también abarcan el uso de otros agonistas de KID3, antagonistas y moduladores como se describe aguí. En esas modalidades, los agonistas, antagonistas u otros moduladores de anticuerpos de ID3 son sustituidos para los anticuerpos de KID3 en los pasos descritos, y las alteraciones dentro del alcance del practicante experto común se hacen para adaptar el método a la composición moduladora de KID3 sustituida.

VII. Composiciones de esta invención Esta invención también abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos anti-KID3, polipeptidos derivados de anticuerpos anti-KID3, polinucleótidos que comprenden la secuencia que codifica para anticuerpos anti-KID3, y otros agentes como se describe aquí. Como se usa aquí, las composiciones, comprenden además uno o más anticuerpos, polipéptidos y/o proteínas que se unen a KID3 , agonistas, antagonistas, moduladores de KID3 , y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican para uno o más anticuerpos, polipéptidos y proteínas que se unen al KID3. La invención proporciona además conjugados de cualquier agonista, antagonista o modulador de KID3, estructuras químicas adicionales que soportan la función o funciones pretendidas del agonista, antagonistas o modulador de KID3 particular. Esos conjugados incluyen un agonista, antagonista o modulador de KID3 unido covalentemente a una macromolécula como cualquier matriz de soporte sólido, insoluble usada en los procedimientos de diagnóstico, separación o selección y purificación discutidos aquí. Los materiales de matriz adecuados incluyen cualquier sustancia que sea químicamente inerte, que tenga alta porosidad y que tenga un gran número de grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con ligandos peptídicos . Los ejemplos de materiales de matriz y procedimientos para la preparación de conjugados de matriz-ligando son descritos en Dean et al. (eds) Affinity Chromatography: A Practical Approach, IRL Press (1985) ; Lowe, "An Introduction to Affinity Chromatography", en Work et al. (eds) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol . 7, Parte II, North-Holland (1979); Porath et al., "Biospecific Affinity Chromatography", en Neurath et al. (eds), The Proteins, 3ra ed., Vol. 1, pp. 95-178 (1975); y Schott, Affinity Chromatography, Dekker (1984) . También se proporcionan aquí conjugados de agonistas, antagonistas o moduladores de KID3, y cualquier porción reportera usada en los procedimientos de diagnóstico discutidos aqui . Los agentes agonistas, antagonistas o moduladores de KID3, proteínas y polipéptidos de esta invención, incluyendo los anticuerpos anti-KID3, son identificados y caracterizado mejor por cualquier (uno o más) de los siguientes criterios: (a) capacidad para unirse al ID3 (incluyendo el KID3 sobre células cancerosas, incluyendo pero sin limitarse a células de cáncer de ovario, próstata, pancreático, pulmón, colon o mama) ; (b) capacidad para inhibir completamente la unión preferente de un anticuerpo anti-KID3 conocido al KID3 , incluyendo la capacidad para unirse preferiblemente al mismo epitope de KID3 al cual se une preferiblemente el anticuerpo original; (c) capacidad para unirse a una porción del KID3 que está expuesta sobre la superficie de una célula viviente ín vitro o in vivo,- (d) capacidad para unirse a una porción del KID3 que está expuesta sobre la superficie de células cancerosas vivientes, como pero sin limitarse a células de cáncer de ovario, próstata, pancreático, pulmón, colon, mama; (e) capacidad para proporcionar un agente quimioterapéutico o marcador detectable a células cancerosas (como pero sin limitarse a células de cáncer de ovario, próstata, pancreático, pulmón, colon o mama) que expresen KID3 ; (f) capacidad para proporcionar un agente terapéutico a células cancerosas (como pero sin limitarse a células de cáncer de ovario) que expresen KID3. En algunas modalidades, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo que es producido por una célula anfitriona con un número de depósito de la ATCC Nos. PTA-4860, o la progenie de la misma. La presente invención también abarca varias formulaciones de anticuerpos producidos por esos hibridomas depositados y anticuerpos equivalentes o fragmentos polipeptídicos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fe, etc.), anticuerpos quiméricos, una sola cadena (ScFv) , mut ntes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de cualquiera de esos anticuerpos equivalentes que comprenda un epítope (KID3) , sitio de reconocimiento de la especificidad requerida. La invención también proporciona anticuerpos que presentan una o más de las características biológicas de un miembro de la familia del anti-KID3. Los anticuerpos equivalentes de la familia del anti-KID3 (incluyendo los anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos) , fragmentos polipeptídicos y polipéptidos que comprenden cualquiera de esos fragmentos son identificados y caracterizados por cualquiera (uno o más) de los cinco criterios descritos anteriormente . En algunas modalidades, los anticuerpos, polipéptidos y proteínas de la invención que se unen al KID3 son anticuerpos, polipéptidos y proteínas que inhiben de manera competitiva la unión preferente de un anticuerpo anti-KID3 especificado aquí al KID3. En algunas modalidades, los anticuerpos, los polipéptidos y las proteínas se unen preferiblemente a algún epítope de KID3 como se une preferiblemente el anticuerpo mu-anti- ID3. En consecuencia, la invención proporciona cualquiera de las siguientes (o composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden cualquiera de los siguientes) : (a) un anticuerpo producido por la célula anfitriona con un número de depósito identificado anteriormente o su progenie; (b) una forma humanizada de ese anticuerpo; (c) un anticuerpo que comprende una o más de las regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada de ese anticuerpo; (d) un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables homologas o derivadas de regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de ese anticuerpo, y regiones constantes homologas o derivadas de regiones constantes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano; (e) un anticuerpo que comprende una o más de las CDR de cadena ligera y/o cadena pesada (al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de esos anticuerpos,- (f) un anticuerpo que comprende una cadena pesada y/o ligera de ese anticuerpo; (g) un anticuerpo humano que es equivalente a ese anticuerpo. Una forma humanizada del anticuerpo puede no tener CDR idénticas a las del anticuerpo original, o el anticuerpo producido por una célula anfitriona con un número de depósito identificado anteriormente. La determinación de las regiones CDR está también dentro de la experiencia de la técnica. En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo el cual comprende al menos CDR que es sustancialmente homologa a al menos una CDR, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos 5 CDR de un anticuerpo producido por uno de los hibridomas depositados identificados anteriormente (o en algunas modalidades, sustancialmente homologa a las 6 CDR de uno de esos anticuerpos, o derivado de uno de esos anticuerpos) , o un anticuerpo producido por la célula anfitriona con un número de depósito identificado anteriormente. Otras modalidades incluyen anticuerpos que tienen al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR que son sustancialmente homologas a al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de un anticuerpo producido a partir del hibridoma depositado como se identifica aqui, o derivado de ese anticuerpo. Debe comprenderse, para propósitos de invención, la especificidad de unión y/o actividad total (la cual puede ser en términos de liberación de un agente quimioterapéutico a o en células cancerosas para reducir el crecimiento y/o proliferación de células cancerosas, para inducir la muerte celular apoptotica en la célula cancerosa, para retrasar el desarrollo de la metástasis, y/o tratamiento paliativo) es generalmente retenida, aunque el grado de actividad puede variar en comparación con un anticuerpo producido por un hibridoma depositado (o puede ser mayor o menor) . La invención también proporciona métodos para producir cualquiera de esos anticuerpos . Los métodos para producir anticuerpos son conocidos en la técnica y se describen aquí . La invención también proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de la invención. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una o más de las regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una o más CDR de cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende tres CDR de la cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos del anticuerpo que tiene cualquiera de los siguientes: al menos 5 aminoácidos contiguos de una secuencia del anticuerpo original, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos, donde al menos 3 de los aminoácidos son de una región variable del anticuerpo. En una modalidad, la región variable es de una cadena ligera del anticuerpo original . En otra modalidad, la región variable es de una cadena pesada del anticuerpo. En otra modalidad, los 5 (o más) aminoácidos contiguos son de una región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo. En algunas modalidades de esta invención, las células de esta invención que expresan KID3 , una porción de KID3 , anticuerpos anti-KID3 u otros polipéptidos de unión de KID3 de esta invención son administradas directamente a un individuo para modular su actividad biológica de ID3 in vivo.

Métodos de uso de moduladores de KID3 y anticuerpos anti-KID3 para propósitos terapéuticos. Los anticuerpos monoclonales para ID3 pueden ser usados para propósitos terapéuticos en individuos con cáncer u otras enfermedades. La terapia con anticuerpos anti-KID3 puede implicar la formación de complejos tanto in vi tro como in vivo como se describió anteriormente. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales anti-KID3 pueden unirse a y reducir la proliferación de células cancerosas . Debe comprenderse que el anticuerpo es administrado a una concentración que promueve la unión a condiciones fisiológicas (por ejemplo, in vivo) . En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales para KID3 pueden ser usados para la inmunoterapia dirigida a células cancerosas de diferentes tejidos como el colon, pulmón, mama, próstata, ovario, páncreas, riñon y otros tipos de cánceres como el sarcoma. En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales para KID3 solos pueden unirse a y reducir la división celular en células cancerosas. En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales para KID3 pueden unirse a células cancerosas y retrasar el desarrollo de metástasis. En otra modalidad, a un individuo con cáncer se le da un tratamiento paliativo con anticuerpo anti-KID3. El tratamiento paliativo de un individuo con cáncer implica el tratamiento o disminución de los síntomas adversos de la enfermedad, o síntomas iatrogénicos resultantes de otros tratamientos dados para la enfermedad sin afectar directamente la progresión del cáncer. Esto incluye tratamientos para soportar el dolor, apoyo nutricional, problemas sexuales, distensión fisiológica, depresión, fatiga, trastornos psiquiátricos, náuseas, vómito, etc . En esas situaciones, el anticuerpo anti-KID3 puede ser administrado con agentes que mejoren o dirijan la respuesta inmune de un individuo, como un agente que refuerce la ADCC. Puede efectuarse la modificación del patrón de glicosilación de anticuerpo anti- ID3 para reforzar o reducir la ADCC. LA glicosilación diferencial de los anticuerpos ha mostrado incrementar la respuesta ADCC (Patente Estadounidense 6,502,684). La disminución de la fucosilación sobre anticuerpos también está asociada con el incremento de la respuesta de ADCC (Yamane-Ohnuki , et al., 2004) . Las modificaciones que reducen la ADCC también son comúnmente conocidas en la técnica y son aplicables aquí en algunas modalidades . En otra modalidad, el anticuerpo anti-KID3 está conjugado con o asociado con una molécula radioactiva, toxina, (por ejemplo, caliqueamicina) , „ molécula quimioterapéutica, liposomas u otras vesículas que contengan compuestos quimioterapéuticos y se administra a un individuo que necesite de ese tratamiento para que esos compuestos hagan blanco en la célula cancerosa que contiene el epítope reconocido por el anticuerpo de este modo eliminar células cancerosas o enfermas . Sin limitarse a ninguna teoría particular, el anticuerpo anti- ID3 es internalizado por la célula que contiene el KID3 en su superficie, liberando de este modo la porción conjugada a la célula para inducir el efecto terapéutico. En otra modalidad más, el anticuerpo puede ser empleado como terapia adyuvante al momento de la remoción quirúrgica de un cáncer que exprese el epítope para retrasar el desarrollo de la metástasis. El anticuerpo también puede ser administrado antes de la cirugía (terapia neoadyuvante) en un individuo con un tumor que exprese el epítope para hacer disminuir el tamaño del tumor y de este modo permitir o simplificar la cirugía, separar el tejido durante la cirugía, y/o hacer disminuir la desfiguración resultante . Se contempló la dosificación del ciclo celular en la práctica de esta invención. En esaS modalidades, es usado un agente quimioterapéutico para sincronizar el ciclo celular del tumor u otras células enfermas blanco a una etapa predeterminada. Posteriormente, se efectúa la administración del anticuerpo anti-KID3 de esta invención (solo o con una porción terapéutica adicional) . En modalidades alternativas, es usado un anticuerpo anti-KID3 para sincronizar el ciclo celular y reducir la división celular antes de la administración de una segunda ronda de tratamiento; la segunda ronda puede ser la administración de un anticuerpo anti- ID3 y/o una porción terapéutica adicional. Los agentes quimioterapeuticos incluyen moléculas •radioactivas, toxinas, también referidas como citotoxinas o agentes citotóxicos, los cuales incluyen cualquier agente que sea dañino a la viabilidad de las células cancerosas, agentes, y liposomas u otras vesículas que contengan compuestos quimioterapéuticos . Los ejemplos de agentes quimioterapeuticos adecuados incluyen pero no se limitan a 1- deshidrotestosterona, 5-fluorouracilo descarbacina, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes, alopurinol sódico, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC) ) , agentes antimitóticos , cis-diclorodiamin platino (II) (DDP) cisplatino) , diamino dicloro platino, antraciclinas , antibióticos, antimetabolitos , asparaginasa, BCG viva (intravesical) , fosfato sódico de betametasona y acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfan, leucouorina cálcica, caliqueamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU) , carmustina (BSNU) , Clorambucilo, Cisplatino, Cladribina, Colchicina, estrógenos conjugados, Ciclofosfamida, Ciclotosfamida, Citarabina, Citarabina, citocalasina B, Citoxan, Dacarbacina, Dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , daunirrubicina HCL, citrato de daunorrubicina, denileucina diftitox, Dexrazoxano, Dibromomanitol , dihidroxi antracin diona, Docetaxel, mesilato de dolasetron, doxorrubicina HCL, dronabinol, L-asparaginasa de E. coli, emetina, epoetina alfa, L-asparaginasa de Erwinia, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato sódico de estramustina, bromuro de etidio, etinil estradiol, etidronato, factor etopósido citrororum, fosfato de etopósido, filgrastima, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folinico, gemcitabina HCL, glucocorticoides , acetato de goserelina, gramicidina D, granisetron HCL, hidroxiurea, idarrubicina HCL, ifosfamida, interferon alfa-2b, irinotecan HCL, letrozol, leucovorin cálcico, acetato de leuprolida, levamisol HCL, lidocaina, lomustina, maitansinoid, mecloretamina HCL; acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalan HCL, ' mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotida, ondansetron HCL, paclitaxel, pamidronato disódico, pentostatina, pilocarpina HCL, plimicina, polifeprosan 20 con implante de carmustina, porfimer sódico, procaina, procarbacina HCL, propranolol, rituximab, sargramostima, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, tenipósido, tenopósido, testolactona, tetracaina, tioepa clorambucilo, tioguanina, tiotepa, topotecano HCL, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoina, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, y tartrato de vinorelbina. En una modalidad preferida, la citotoxina es especialmente efectiva en dividir o dividir rápidamente células, de modo que las células que no se dividan están relativamente protegidas de los efectos tóxicos . Los anticuerpos de la invención pueden ser internalizados dentro de las células enfermas o de carcinoma a las cuales están unidas y por lo tanto son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, liberación a las toxinas celulares que necesiten ser internalizadas por su actividad adversa. Los ejemplos de esas toxinas incluyen, pero no se limitan a, saporina, caliqueamicina, auristatina, y maitansinoide . Los anticuerpos, polipéptidos u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico de esta invención pueden ser asociados (incluyendo conjugados o ligados) a una molécula radioactiva, una toxina, u otros agentes terapéuticos, o a liposomas u otras vesículas que contengan agentes terapéuticos covalente o no covalentemente, directa o indirectamente. El anticuerpo puede ser ligado a la molécula radioactiva, la toxina, o la molécula quimioterapéutica en cualquier lugar a lo largo del anticuerpo tanto el anticuerpo pueda unirse a su ID3 blanco . Una toxina o un agente quimioterapeutico puede ser acoplado (por ejemplo, unido covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, vía un grupo enlazante, o de manera alternativa, vía una molécula enlazante con sitios de unión, apropiados, como una molécula plataforma como se describe en la Patente Estadounidense 5,552,391). La toxina y el agente quimioterapeutico de la presente invención pueden ser acoplados directamente a las proteínas blanco particulares usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posea un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, como un grupo amino o sulfhídrilo, uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un grupo saliente (por ejemplo, un haluro) sobre el otro. Los anticuerpos o polipéptidos u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico de esta invención también pueden ser ligados a un agente quimioterapéutico vía un microportador . Un microportador se refiere a una partícula biodegradable o no biodegradable la cual es insoluble en agua y que tiene un tamaño de menos de aproximadamente 150, 120 o 100 µp? de tamaño, de manera más común de menos de aproximadamente 50-60 µp?, preferiblemente de menos de aproximadamente 10, 5, 2.5, 2 o 1.5 µp?. Los microportadores incluyen "nanoportadores" , los cuales son microportadores que tienen un tamaño de menos de aproximadamente 1 µ?t?, preferiblemente de menos de aproximadamente 500 nm. Esas partículas son conocidas en la técnica. Los microportadores en fase sólida pueden ser partículas formadas a partir de polímeros naturales biocompatibles , polímeros sintéticos o copolímeros sintéticos, los cuales pueden incluir o excluir microportadores formados de agarosa o agarosa reticulada, así como otros materiales biodegradables conocidos en la técnica. Los microportadores en fase sólida biodegradables pueden ser formados de polímeros que sean biodegradables (por ejemplo, poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) y copolímeros de los mismos) o erosionables (por ejemplo poli (orto esteres como el 3 , 9-dietiliden-2 , 4 , 8 , 10-tetraoxaespiro [5.5] undecano (DETOSU) o poli (anhídridos) , como poli (anhídridos) de ácido sebásico) bajo las condiciones fisiológicas de un mamífero. Los microportadores también pueden estar en fases líquidas (por ejemplo, basados en aceite o lípidos) , como liposomas, iscomas (complejos estimulantes inmunes), las cuales son complejos estables de colesterol, y fosfolípido, saponina activa como adyuvante) sin determinantes antigénicos, o gotas o miscelas encontradas en emulsiones aceite en agua o agua en aceite, siempre que los microportadores en fase líquida sean biodegradables . Los microportadores en fase liquida biodegradables típicamente incorporan un aceite biodegradable, un número de los cuales son conocidos en la técnica, incluyendo el escualeno y aceites vegetales. Los microportadores son típicamente de forma esférica, pero los microportadores que se desvían de la forma esférica también son aceptables (por ejemplo, elipsoide, o forma de varilla, etc.) . Debido a su naturaleza insoluble (con respecto al agua) , los microportadores son filtrables de agua y son lesiones basadas en agua (acuosas) . Los conjugados de la presente invención que comprenden un anticuerpo, polipéptido u otro agente terapéutico o de diagnóstico de esta invención pueden incluir un enlazante bifuncional que contiene un grupo capaz de acoplarse a un agente tóxico o agente quimioterapéutico y a un grupo capaz de acoplarse al anticuerpo . Un enlazante puede funcionar como un separador para distanciar un anticuerpo de un agente para evitar la interferencia con las capacidades de unión. Un enlazante puede ser escindido o no escindible. El enlazante también puede servir para incrementar la reactividad química de un sustituyente o un agente o un anticuerpo, y de este modo incrementar la eficiencia del acoplamiento. Un incremento en la reactividad química también puede facilitar el uso de los agentes, o grupos funcionales sobre los agentes, lo cual en otras circunstancias no sería posible. El enlazante bifuncional puede ser acoplado al anticuerpo por medios que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el enlazante que contiene una porción de éster activa, como un N-hidroxisuccinimida éster, puede ser usado para acoplarse a los residuos de lisina en el anticuerpo vía un enlace amida. En otro ejemplo, un enlazante que contiene una amina nucleofílica o residuo de hidracina puede ser acoplado a los grupos aldehido producidos por la oxidación glicolitica de los residuos de carbohidrato del anticuerpo. Además de esos métodos directos de acoplamiento, en enlazante puede ser acoplado directamente al anticuerpo por medio de un ¦portador intermedio como un aminodextrano . En esas modalidades el enlace modificado es vía lisina, carbohidrato, o un portador intermedio. En una modalidad, el enlazante se acopla selectivamente al sitio a los residuos tiol libres en la proteína. Las porciones que son adecuadas para acoplarse selectivamente a grupos tiol sobre proteínas son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos incluyen compuestos disulfuro, compuesto de -halocarbonilo y -halocarboxilo y maleimidas. Cuando una función de amina nucleofílica está presente en la misma molécula como un grupo a-halo carbonilo o carboxilo existe el potencial de que ocurra la ciclización vía la alquilación intramolecular de la amina. Los métodos para evitar este problema son bien conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, para la preparación de moléculas en las cuales las funciones amina y a-halo están separadas por grupos inflexibles, como grupos arilo o trans-alquenos , que hacen la ciclización indeseable estereoquímicamente desfavorecida. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6,441,163 para la preparación de conjugados de ' maitansinoides y anticuerpos vía una porción disulfuro. Uno de los enlazantes escindibles que pueden ser usados para la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco es un enlazante lábil al ácido basado en ácido cis-acon£tico que toma ventaja del ambiente ácido de los diferentes compartimientos intracelulares como los endosomas encontrados durante la endocitosis mediada por el receptor y los lisosomas. Véase, por ejemplo, Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102: 1048-1054 (1981) para la preparación de conjugados de daunorrubicina con portadores macromoleculares ; Yang et al., J. Nati. Canc. Inst. 80: 1154-1159 (1988) para la preparación de conjugados de daunorrubicina a un anticuerpo anti-melanoma; Dillman et al., Cáncer Res. 48: 6097-6102 (1988) para el uso de un enlazante lábil al ácido en una forma similar para preparar conjugados de daunorrubicina con un anticuerpo anti-células T; Trouet et al., Proc. Nati. Acad. Sel. 79: 626-629 (1982) para enlazar daunorrubicina a un anticuerpo via un brazo separador peptídico.

Un anticuerpo (o polipéptido) u otros agentes terapéuticos o de diagnóstico en esta invención pueden ser conjugados (enlazados) a una molécula radioactiva .por cualquier método conocido en la técnica. Para una discusión de los métodos para marcar radioactivamente anticuerpos véase "Cáncer Therapy with Monoclonal AntibodiesT" , D. . Goldenberg ed. (CRC Press, Boca Ratón, 1995) . De manera alternativa, el anticuerpo puede ser conjugado a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo como es descrito por Segal en la Patente Estadounidense No. 4,676,980. La formación de anticuerpos reticulados puede dirigir el sistema inmune a tipos específicos de células,, por ejemplo, células cancerosas o enfermas que expresen ID3. Esta invención también proporciona métodos para retrasar el desarrollo de metástasis en un individuo con cáncer (incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de próstata, pulmón, mama, ovario, pancreático, o de colon) usando un anticuerpo anti-KID3 u otras modalidades que se unen al KID3 enlazando a un agente quimioterapéutico . En algunas modalidades, el anticuerpo es una forma humanizada o quimérica de un anticuerpo anti-KID3 no humano. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser empleado como terapia adyuvante al momento de la remoción quirúrgica de un cáncer que exprese el epitope para retrasar el desarrollo de la metástasis. El anticuerpo o anticuerpo asociado con un agente guimioterapéutico también puede ser administrado antes de la cirugía (terapia neoadyuvante) en un individuo por un tumor que exprese el epítope para hacer disminuir el tamaño del tumor y de este modo permitir o simplificar la cirugía, aislar el tejido durante la cirugía y/o hacer disminuir la desfiguración resultante. En otra modalidad más, cualquiera de las modalidades de unión de KID3 descritas anteriormente aquí puede unirse a células cancerosas que expresen KID3 e induce un evento de muerte celular en las células cancerosas que expresan KID3. En algunos casos el evento de muerte celular es a través de una vía apoptótica, o a través de una vía necrótica, o a través de una vía oncótica. En otra modalidad más, cualquiera de las modalidades de unión de KID3 descritas aquí puede unirse a células cancerosas que expresen KID3 e induce una respuesta inmune activa contra células cancerosas que expresan KID3. En algunos casos, la respuesta inmune activa puede producir la muerte de las células cancerosas (por ejemplo, la unión del anticuerpo a las células cancerosas induce la muerte celular apoptótica), o inhibe el crecimiento (por ejemplo, bloquea el progreso del ciclo celular) de las células cancerosas. En otros casos, cualquiera de los anticuerpos novedosos descritos aquí puede unirse a células cancerosas y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) puede eliminar las células cancerosas a las cuales se unen los anticuerpos anti- ID3. En consecuencia, la invención proporciona métodos para estimular una respuesta inmune que comprende administrar cualquiera de las composiciones descritas aquí . En algunos casos, la unión del anticuerpo también puede activar respuestas inmunes celulares y humorales y reclutar más células asesinas naturales o incrementar la producción de citocinas (por ejemplo, IL-2, IFN-?, IL-12, TNF-a, TNF-ß, etc.) que activan además el sistema inmune del individuo para destruir células cancerosas . En otra modalidad, los anticuerpos anti-KID3 pueden unirse a células cancerosas, y macrófagos y otras células fagociticas pueden opsonizar. las células cancerosas. Varias formulaciones de anticuerpos anti-KID3 o fragmentos de los mismos pueden ser usados para la administración. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-KID3 o fragmentos de los mismos pueden ser administrados puros. Además del agente farmacológicamente activo, las composiciones de la presente invención pueden contener excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, adecuados, que comprenden excipientes y auxiliares que son bien conocidos en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente efectiva o que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden ser usadas farmacéuticamente para proporcionarse al sitio de acción. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como un diluente. Los excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsificantes, sales de diferentes osmolaridad, agentes encapsulantes, amortiguadores y mej oradores de la penetración de la piel. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos y forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, pueden ser administradas suspensiones de los compuestos activos cuando sea apropiado para suspensiones inyectables oleosas. Los solventes o vehículos lipofilicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de ajonjolí, esteres de ácido graso sintéticos, por ejemplo oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetil celulosa sódica, sorbitol, y/o dextrano. Opcionalmente , la suspensión también puede contener estabilizadores. También pueden ser usados liposomas para controlar el agente para llevarlo a la célula. La formulación farmacéutica para administración sistémica de acuerdo a la invención puede ser formulada para administración enteral, parenteral o tópica. En realidad, los tres tipos de formulaciones pueden ser usados simultáneamente para lograr la administración sistémica del ingrediente activo. Los excipientes así como las formulaciones para la liberación parenteral y no parenteral de fármaco se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy vigésima •edición Mack Publishing (2000) . Las formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, pildoras, tabletas, incluyendo tabletas recubiertas, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones en forma de liberación controlada de las mismas. Generalmente, esos agentes son formulados para la administración por inyección (por ejemplo, intraperitoneal- mente, intravenosa, subcutánea, intramuscularmente, etc.) aunque también pueden ser usadas otras formas de administración (por ejemplo, oral, mucosa, etc) en consecuencia los anticuerpos KID3 son combinados preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares . El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, temporización y repetición, dependerán del individuo particular y la historia médica de ese individuo.

Generalmente, una dosis de al menos aproximadamente 100 ug/kg de peso corporal, de manera más preferible de al menos aproximadamente 250 ug/kg de peso corporal, de manera aún más preferible de al menos aproximadamente 750 ug/kg de peso corporal , de manera aún más preferible al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, de manera aún más preferible de menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, de manera aún más preferible de al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal es administrada. Consideraciones empíricas, como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosis. Los anticuerpos, los cuales son compatibles con el sistema inmune humano, como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos pueden se usados para prolongar la' vida media del anticuerpo y para evitar que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmune del anfitrión. La frecuencia de la administración puede ser determinada y ajustada durante el curso de la terapia, y se basa en la reducción del número de células cancerosas, manteniendo la reducción de las células cancerosas, reducción de la proliferación de las células cancerosas, o retraso del desarrollo en metástasis. De manera alternativa, las formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos anti-KID3 pueden ser apropiadas. Varias formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida son conocidos en la técnica.

En una modalidad, las dosis para anticuerpos anti-KID3 pueden ser determinadas empíricamente en individuos a los que se les ha dado una o más administraciones. A los individuos se les dan dosis crecientes de un anticuerpo anti-KID3. Para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-KID3 puede ser seguido un anticuerpo del estado de enfermedad cancerosa específica. Esas incluyen mediciones directas de tamaño del tumor vía palpitación u observación, medición indirecta del tamaño del tumor por rayos x u otras técnicas de formación de imágenes; una mejora de acuerdo a lo evaluado por una biopsia de tumor directa y examen microscópico de la muestra de tumor; la medición de un marcador tumoral indirecto (por ejemplo, PSA para el cáncer de próstata) , una disminución en el dolor o parálisis; mejora en habla, visión, respiración u otra discapacidad asociada con el tumor; incremento del apetito; o un incremento en la calidad de vida de acuerdo a lo medido por pruebas aceptadas o prolongación de la sobrevivencia. Será evidente a un experto en la técnica que la dosis variará dependiendo del individuo, el tipo de cáncer, la etapa del cáncer, ya sea que el cáncer haya comenzado a metastasizar a otros lugares en el individuo, y los tratamientos pasados y concurrentes que sean usados . Otras formulaciones incluyen formas de liberación adecuadas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, soportes como liposomas. Véase por ejemplo, Mahato et al. (1997) Pharm Res. 14:853-859. Las preparaciones liposomales incluyen, pero no se limitan a, citofectinas, vesículas multilamelares y vesículas unilamelares . En algunas modalidades puede estar presente más de un anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales . Esas composiciones pueden contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco diferentes anticuerpos que sean reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas , sarcomas o adenosarcomas . El anticuerpo Anti-KID3 pueden ser mezclado con uno o más anticuerpos reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas o adenosarcomas en órganos, incluyendo pero sin limitarse a ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, hueso, tracto digestivo superior y páncreas. En una modalidad, se usa una mezcla de diferentes anticuerpos anti-KID3. Una mezcla de anticuerpos como son con frecuencia denotados en la técnica, pueden ser particularmente útiles para tratar una amplia gama de poblaciones de individuos. Los siguientes ejemplos se usan para ilustrar, pero no para limitar la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Preparación de células de riñon humano como un inmunógeno. Se obtuvieron ríñones fetales humanos, con una edad gestacional de entre 10 hasta 18 semanas de Advanced Biosciences Research en Alameda County, California. Los ríñones fueron procurados y transportados al laboratorio en medio de cultivo tisular sobre hielo húmedo. Inmediatamente después del arribo, los ríñones fueron transferidos a medio de lavado (PBS frió que contenía penicilina/estreptomicina y gentamicina) . Las membranas externas fueron removidas con fórceps y los ríñones fueron lavados brevemente en etanol al 70%, entonces enjuagados dos veces en medio de lavado. Los ríñones fueron cortados en cubos de 1 mm con tijeras quirúrgicas en un disco de cultivo seco de 100 mm. Las piezas de tejido fueron colocadas en 10 mi de un medio libre de suero definido referido aquí, I/3P. El medio usado para este ejemplo contenían los siguientes componentes cloruro de calcio (CaCl2) a 0.18 g/L, cloruro de potasio (KC1) at 0.298 g/L, nitrato de potasio ( 03) a 0.000012629 g/L, sulfato de magnesio (MgS04) (anhidro) a 0.068 g/L, cloruro de magnesio-6H20 a 0.037 g/L, cloruro de sodio (NaCI) at 6.2 g/L, bicarbonato de sodio (NaHC03) a 1.2 g/L, fosfato de sodio (NaH2P04-H20) a 0.043 g/L, fosfato de sodio dibásico (Na2HP04) a 0.088 g/L, seleniuro de sodio (NaSe03-S¾0) a 0. 000012629 g/L, metavanadato de amonio at 0.000000351 g/L, ácido molibdico-4¾0 (amonio) a 0.00000372 g/L, sulfato cúprico-5H20 a 0.00000075 g/L, Sulfato ferroso-7H20 a 0.0002502 g/L, sulfato de manganeso a 4.53E-08 g/L, sulfato de zinc-7H20 a 0.0002589 g/L, fructosa a 2 g/L, Hepes a 3.57 g/L, putrescina-2HCl a 0.0000483 g/L, ácido tióctico a 0.0000618 g/L, piruvato de sodio a 0.11003 g/L, ácido linoleico a 0.00002523 g/L, L-alanina a 0.020173 g/L, L-asparagina (base libre) a 0.0175 g/L, L-asparagina-¾0 a 0.0045 g/L, L-arginina-HCl a 0.12201 g/L, ácido L-aspártico a 0.024993 g/L, L-cistina-2HCl a 0.06398 g/L, L-cisteina-HCl-H20 a 0.005268 g/L, L-ácido glutámico a 0.056913 g/L, L-glutamina a 0.6 g/L, glicina a 0.023253 g/L, L-histidina HCl-¾0 a 0.035691 g/L, L-isoleucina a 0.074682 g/L, L-leucina a 0.077436 g/L, L-lisina-HCl a 0.113162 g/L, L-metionina a 0.022344 g/L, L-fenilalanina a 0.047688 g/L, L-prolina a 0. 038359 g/L, L-serina a 0.032553 g/L, L-treonina a 0.070073 g/L, L-triptófano a 0. 011812 g/L, L-tirosina (sal disódica) a 0. 0751688 g/L, L-valina 0.069316 g/L, biotina a 0. 000011299 g/L, D-Ca pantotenato a 0.0028714 g/L, cloruro de colina a 0.006988 g/L, ácido fólico a 0.0031972 g/L, I-inositol a 0.010446 g/L, niacinamida a 0. 00281098 g/L, piridoxal HC1 a 0.0028 g/L, piridoxina-HCl a 0.00001851 g/L, riboflavina a 0.00029128 g/L, tiamina HCL at 0.0029011 g/L, vitamina B 12 a 0.0000499 g/L, pH a 7.2, osmolalidad a 295 mM. Aunque pueden usarse una variedad de medios de cultivo celular usados usualmente en la práctica de esta invención las modalidades preferidas actualmente usan medios de cultivo celular libres de suero, basados en fructosa. Esos medios pueden encontrarse en la Solicitud Estadounidense No. 60/504,674, la descripción de la cual se incorpora aquí en su totalidad. Las piezas de tejido fueron transferidas a un tubo de centrífuga de 15 mi y las piezas de tejido fueron centrifugadas a lOOOxg durante 5 minutos. Las piezas de tejido fueron resuspendidas en medio I/3F que contenía insulina (10 ug/ml) transferrina (10 ug/ml) , factor de crecimiento epidérmico (20 ng/ml) , somatotropina (0.005 lU/ml) , extracto de pituitaria de cerdo (0.2%), suero de pollo (0.1%), gentamicina (100 ug/ml), penicilina/ estreptomicina (Ix) y colagenasa/dispasa (0.1%) y se incubaron a 4°C durante la noche. Al siguiente día, las piezas de tejido digeridos fueron centrifugadas a lOOOxg durante 5 minutos y lavadas dos veces con medio I/3F. El sedimento fue resuspendido en 10 mi de medio I/3F que contenía insulina en (10 ug/ml) , transferrina (10 ug/ml) , factor de crecimiento epidérmico (20 ng/ml) , somatotropina (0.005 lU/ml) , extracto de pituitaria de cerdo (0.2%) y suero de pollo (0.1%) y se cultivaron en placas de 10 cm recubiertas con fibronectina . Bajo esas condiciones de cultivo, las células de riñon fetal humano unidas se unieron a placas recubiertas con sustrato y crecieron como una monocapa. El medio de cultivo fue cambiado dos veces a la semana.

Para cosechar las células, las raonocapas celulares fueron enjuagadas una vez con solución salina de Hanks libre de calcio y magnesio incubadas en EDTA- a lOmM en solución salina de Hanks a 37°C durante 15 minutos. Las células fueron desprendidas en las células de cultivo pipeteando suavemente. La suspensión celular fue sedimentada por centrifugación a lOOOxg durante 5 minutos. El sobrenadante fue removido y las células fueron resuspendidas en medio libre de suero (medio I/3F) con adyuvante no desnaturalizante cuando fue apropiado.

Ejemplo 2. Generación de anticuerpos monoclonales Se rehidrató un adyuvante no desnaturalizante (Ribi, R730, Corixa, Hamilton MT) a 4 mi en solución amortiguada con fosfato. Entonces se diluyeron 100 µ? de ese adyuvante rehidratado con 400 µ? de solución salina equilibrada de Hank y esta fue posteriormente mezclada solamente con algo de sedimento celular del Ejemplo 1 para ser usada para la inmunización. La porción restante del sedimento celular fue preparada en solución salina equilibrada de Hank para la inmunización en solución como anteriormente pero sin adyuvante. Se inyectaron aproximadamente 106 células de riñon fetal humano por ratón en ratones Balb/c vía pata, aproximadamente una o dos veces a la semana. El programa de inmunización preciso es el siguiente: Día 0 inmunización más Ribi, día 3, inmunización más Ribi, día 7, inmunización más Ribi, día 38, inmunización menos Ribi, día 42, inmunización menos Ribi, día 45, inmunización menos Ribi. Día 49, inmunización menos Ribi. Día 56, inmunización menos Ribi. Día 63, inmunización menos Ribi. Día 82 en grado para prueba de título, día 84, inmunización menos Ribi. Día 87 inmunización más Ribi, día 94, inmunización más Ribi. Día 101, refuerzo de perfusión (sin Ribi) . Día 104 cosecha de nodos para fusión. Al día 82, se extrajo una gota de sangre de la cola de cada animal inmunizado para probar el título de anticuerpos contra células de riñon fetal humano usando análisis FACS . Cuando el título alcanzo al menos 1:2000, los ratones fueron sacrificados en una cámara de C02 y seguido por dislocación cervical . Se cosecharon los nodos linf ticos para la preparación del hibridoma. Los linfocitos de ratones con el título más alto fueron fusionados con la línea de mieloma de ratón línea X63-Ag8.653 usando polietilen glicol 4000 al 35%. Al día 10 después de la fusión, los sobrenadantes de hibridoma fueron separados por la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para células de riñon fetal humano por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) . El medio condicionado de cada hibridoma fue incubado durante 30 días con alícuota de células de riñon fetal humano. Después de la incubación, la células fueron cosechadas, resuspendidas en 0.1 de diluente e incubadas con 1 µt?/t?? de fragmentos (Fab')2 conjugado con FITC de anti-IgG de ratón de cabra durante 30 min a 4°C. Las células fueron lavadas, resuspendidas en 0.5 mi en diluente de FACS y analizadas usando el analizador celular FACScan (Becton Dickinson San José, CA) . Los clones de hibridoma fueron seleccionados para su expansión, clonación y caracterización adicionales sobre la base de su unión a la superficie de una o más líneas celulares de cáncer de acuerdo a lo evaluado por FACS . Se seleccionó un idridoma que produce un anticuerpo monoclonal designado como mu-anti-KID3 que se une a un epítope designado como KID3.

Ejemplo 3. Purificación de anticuerpos anti-KID3 incluyendo mu-anti-KID3. Se desprendieron células de riñon fetal humano de matraces de cultivo tisular en presencia de EDTA 10.0 mM, se centrifugaron a 1400 rpm durante 5 minutos y resuspendxeron en PBS que contenía BSA a 1% y EDTA 2 mM (diluente de FACS) . Las células fueron contadas y ajustadas a 107 células/ml . Se incubaron aproximadamente 0.1 mi de células con 100 µ? de sobrenadante de hibridoma en 100 µ? de diluente de FACS durante 30 min a 37°C. Los anticuerpos monoclonales que se unieron a las células de riñon fetal humano fueron purificados del sobrenadante de cultivo tisular usando cromatografía de afinidad con proteína-G. Se usaron los siguientes materiales para el proceso de purificación del anticuerpo: sobrenadante de cultivo tisular de hibridoma, amortiguador de unión de IgG Immunopure (G) IgG (Pierce #21011 Rockford, IL) , Amortiguador de Elución de IgG Immunopure (Pierce #21009) , HC1 concentrado (para ajusfar el pH) , 1 litro de PES (polieter sulfona) , de Corning, filtro de 0.22 µt? (Corning #431098, Corning, ??) , el Sistema GradiPrac de Amersham Pharmacia (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) , Proteína-G Sepharose 4 de flujo rápido (Amersham Pharmacia #17-0618-02) , amortiguador de separación del cual es 3M KSCN/Tris 50 mM pH 7.8, y PBS (solución salina amortiguada con fosfato) Tris 3M pH 9.0. Para purificar el anticuerpo anti-huKID3 de ratón referido aquí como mu-anti- KID3 , el volumen de sobranadante fue medido y se le agregó un volumen igual de amortiguador de unión al sobrenadante. La mezcla se dejo equilibrar a temperatura ambiente. El sobrenadante fue aclarado haciendo pasar a través de un filtro de 0.22 µp?. El sobrenadante fue cargado sobre una columna de proteína-G usado el sistema GradiFrac (Pharmacia Biotech) . La columna fue lavada con 5-10 volúmenes de columna de amortiguador de unión. Los anticuerpos monoclonales fueron eluidos con amortiguador de elución y se recolectaron doce fracciones de 2 mi. Se obtuvieron lecturas de D028o de las fracciones y las fracciones que contenían los anticuerpos monoclonales fueron reunidas . Las fracciones de anticuerpo monoclonal eluidas fueron neutralizadas agregando un volumen de 1/20 de Tris 3M. La muestra fue dializada en IX PBS a 4°C (con tres cambios de amortiguador de al menos tres horas por cambio) . Los anticuerpos monoclonales purificados fueron filtrados de manera estéril (0.2 uM) y almacenados a 2-8°C. Después de la purificación del anticuerpo monoclonal mu-anti-KID3 del sobrenadante de hibridoma, se probó nuevamente la unión a células de riñon fetal humano. Las muestras de células fueron preparadas como se describió anteriormente y se incubaron con el anticuerpo purificado a varias concentraciones. Después de la incubación las células fueron lavadas, resuspendida en 0.1 mi de diluente en incubadas con 1 µg de fragmento F(ab' )2 conjugado con FITC o anti-IgG de ratón de cabra durante 30 min a 4°C. Las células lavadas, resuspendidas en 0.5 mi de diluente de FACS y analizadas usando el clasificador celular FACScan (Becton Dickinson San José, CA) . Una desviación a la derecha del histograma del FACScan indicó que el anticuerpo purificado estaba unido aún a las células de riñon fetal humano. En otros experimentos, se probó la unión de mu-anti-KID3 al KID3 usando una ELISA con células vivas. Se uso el siguiente método, aunque son aplicables otros métodos comúnmente conocidos en el campo. Células (SKOV3, SKBR3 , S MES, SW480, HT-29, t HPAF-II-todas compradas de ATCC, Bethesda, MD) se hicieron crecer de suero bovino fetal al 10% (FBS) que contenía medios hasta la confluencia sobre placas de cultivo tisular de 96 pozos tratadas con cultivo tisular (Falcon) . Las células fueron lavadas libres de medio de cultivo e incubadas con 50 µ? de los anticuerpos deseados a una concentración deseada en solución salina y equilibrada de Hank (HBSS) con un contenido de 1% de BSA y 0.1% de azida de sodio durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron entonces lavadas tres veces con 100 µ? por pozo de HBSS antes de incubar con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (50µ1 por pozo diluido en HBSS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas finalmente con HBSS y se agregó sustrato de cambio de color (sustrato MB , KPL) a la placa a ???µ? por pozo. La reacción de cambio de color fue detenida con la adición de ???µ? por pozo de ácido fosfórico de 1M . Las placas reveladas fueron leídas O.D. 450nm. El hibridoma productor del anticuerpo mu-anti-KID3 tiene una designación a ATCC de PTA-4860.

Ejemplo 4. Métodos in nohistoquímicos Se incluyeron muestras de tejido congeladas de pacientes de cáncer en compuesto OCT y se congelaron rápidamente en isopentano con hielo seco. Se cortaron tres secciones con un microtomo Leica 3050 CM a un espesor de 5 µt? y se montaron congeladas sobre portaobjetos recubiertos con vectabound. Las secciones fueron fijadas con etanol a -20°C y se dejaron secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. Las secciones fijadas fueron almacenadas a -80°C hasta su uso. Para la inmunohistoquxmica , las secciones de tejido fueron recuperadas e incubadas primero en amortiguador de bloqueo (PBS, 5% de suero de cabra normal, 0.1% de Tween 20) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y entonces se incubaron con el mu- anti - KID3 y anticuerpos monoclonales de control diluidos en amortiguador de bloque (1 µg/ml) durante 120 minutos. Las secciones fueron entonces lavadas con el amortiguador de bloqueo. Los anticuerpos monoclonales unidos fueron detectados con conjugados de anti-IgG de ratón de cabra + IgG (H+L) F (ab' ) 2 peroxidasa y el sustrato de peroxidasa diaminobencidina (1 mg/ml , Sigma cat . No. D 5637) en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M pH 5.05 y peróxido de hidrógeno al 0.003% (Sigma cat. No. H1009) . Los portaobjetos obtenidos fueron contrateñidos con hematoxilina examinados bajo el microscopio Nikon. En algunos casos, se usaron tejidos fijados en formaldehído incluidos en parafina para la inmunohistoquímica después de y se emplearon métodos de recuperación del determinante antigénico apropiados. Uno de esos métodos de recuperación del determinante antigénico se describe en Mangham y Isaacson, Histopathology 35:129-33 (1999). Pueden ser usados otros métodos de recuperación y/o detección del determinante de antigénico por un experto en la técnica. Los resultados se obtuvieron de experimentos similares usando tejidos congelados o, donde es apropiado, tejido agitado con recuperación de antígeno y recuperación de poliMICA. Se avaluó la unión del anticuerpo anti-KID3 a una variedad de tejidos normales y cancerosos. En todos los casos, la unión del anticuerpo en tejidos fijados control se correlacionó con los tejidos congelados. Los resultados de los tejidos congelados fueron usados únicamente si no eran iguales a la de los controles . Por conveniencia, un sumario del resultado combinado de varios experimentos usando tejido quirúrgico diferente de cada fuente se muestra a continuación en la tabla 1. El número de tumores que se unen a mu-anti-KID3 / número total probado se lista y el porcentaje de unión positiva se muestra entre paréntesis.

Tabla 1 : Sumario de la Incidencia de la Unión del mu-anti- KID3 sobre Tipos de Tumores Mayores Tipo de Tumor Porción positiva Adenocarcinoma de colon 13/15 (87%) Adenocarcinoma de páncreas 5/5 (100%) Carcinoma de ovario 5/5 (100%) Adenocarcinoma de mama 6/20 (30%) Adenocarcinoma prostética 7/18 (39%) Pulmón (células no pequeñas) 7/20 (35%) Carcinoma de células renales 4/13 (31%) Adenocarcinoma, NOS 1/2 (50%) Carcinoma, NOS 2/5 (40%) Carcinoma de células escamosas (met; 1/1 (100%) sitio primario desconocido) Carcinoma tiroide 0/2 Carcinoma de vejiga 0/1 Carcinoma sarcomatoide 0/1 Osteosarcoma 0/1 Sarcoma de Ewings 0/1 Sarcoma sinovial monofásico 0/1 Melanoma/sarcoma de células transparentes 0/4 Se separaron o seleccionaron muestras de tejido adicionales para caracterizar mejor la expresión del KID3 expresando IHC y anticuerpos anti-KID3. En resumen, más del 90% de muestras clínicas de adenocarcinoma de colon, gástrico y pancreático humano unieron anticuerpos anti-KID3, indicando la expresión del KID3. Más del 64% de las muestras evaluadas expresaron KID3 uniformemente (definas como más del 75% de tinción en el epitelio tumoral) a través del epitelio tumoral . La variabilidad epitelial no queratinizante normal (menos del 10% hasta la uniformidad) expresó KID3 en tejidos múltiples, los cuales son típicamente tejidos de los cuales surgen adenocarcinomas KID3 positivos correspondientes. La mayoría de los tejidos humanos de los sistemas cardiovascular, endocrino, hematolinfático , neuromuscular y nervioso central no expresan KID3. El patrón de expresión del ID3 en tumores difiere del que corresponde al epitelio normal . La mayoría de la expresión del KID3 en epitelio normal es en el citoplasma, mientras que la expresión de KID3 de membrana en epitelio polarizado normal, como en el colon y estómago, se restringió predominantemente a la membrana apical. En contraste, tumores como los adenocarcinomas gástrico y de · colon tienen a expresar KID3 sobre otros dominios de membrana, progresando del bazo lateral en tumores bien definidos a la expresión a través de toda la superficie de la membrana en tumores pobremente diferenciados .

Ejemplo 5. Resultados de la inmunohistoquímica Se usó el anticuerpo monoclonal mu-anti-KID3 para probar la reactividad con varias lineas celulares de diferentes tipos de tejidos. Los resultados se calificaron como para una tinción positiva débil, "++" para una tinción positiva moderada, "+++" para una tinción positiva fuerte y ,-?? para una tinción negativa. Los resultados de la inmunohistoquímica se obtuvieron usando la tecnología CellArray1*1, como se describe en la WO 01/43869. Se removieron células de diferentes líneas celulares establecidas de la superficie de crecimiento sin usar proteasas, empaquetadas e incluidas en compuesto OCT. Las células fueron congeladas y cortadas, entonces teñidas usando un protocolo de IHC estándar. Los resultados de la unión del anticuerpo mu-anti-KID3 a varias líneas celulares normales y tumorales humanas establecidas se recopilaron por conveniencia en la Tabla 2. Los experimentos representados en la Tabla 2 incluyen FACS, ELISA de células vivientes, y experimentos de unión con CellArray™ usando los métodos descritos aquí .

Tabla 2. Unión del Anticuerpo mu-anti-KID3 a Lineas de Células Tumorales y Normales Humanas Establecidas Nombre ATCC# Organo Tipo de célula Reactividad con mu- de la anti-KID3 célula Arreglo FACS ELISA con celular células vivientes BT-474 HTB-20 Mama Carcinoma - + - ductal HMEC CC-2551* Mama Epitelial mamaria humana normal MCF-7 HTB-22 Mama Adenocarcinoma - + - MDA-MB- HB-25 Mama Carcinoma -175-VII ductal MDA-MB- HB-27 Mama Adenocarcinoma - 361 SK-BR-3 HTB-30 Mama Adenocarcinoma - - - Colo- CCL-222 Colon Adenocarcinoma + + ++ 205 colorrectal de los ascitos HT-29 HTB-38 Colon Adenocarcinoma + + ++ colorrectal Nombre ATCC# Organo Tipo de célula Reactividad con mu- de la anti-KID3 célula Arreglo FACS ELISA con celular células vivientes huSBT RAVEN Colon Linea de cáncer + colorrectal desarrollada en Raven SW480 CCL-228 Colon Adenocarcinoma - + - colorrectal SW-948 CCL-237 Colon Adenocarcinoma + colorrectal HuVEC Primario Células Adulto humano - endoteliales normal 293 CRL-1573 Riñon Transformada con ADN de adenovirus 5 786-0 CRL-1932 Riñon Adenocarcinoma + de células renales ?-498 HTB- 4 Riñon Carcinoma - - - Nombre ATCC# Organo Tipo de célula Reactividad con mu- de la anti-KID3 célula Arreglo FACS ELISA con celular células vivientes Caki-2 HTB-47 Riñon Carcinoma de + + células transparentes COS-7 CRL-1651 Riñon, Transformada mono negro con virus SV40 africano 9979 RAVEN Pulmón Línea de cáncer +/- pulmonar desarrollada en Raven ?-549 CCL-185 Pulmón Carcinoma - + - Cal30 RAVEN Pulmón Carcinoma de - - células pequeñas pulmonares humanas CaLu3 HTB-55 Pulmón Adenorcacinoma - + + Nombre ATCC# Organo Tipo de célula Reactividad con mu- de la anti-KID3 célula Arreglo FACS ELISA con celular células vivientes SK-MES- HTB-58 Pulmón Carcinoma - - - 1 escamoso ES-2 CRL-1978 Ovario Carcinoma - - - OV-90 CRL- Ovario Adenocarcinoma + + 11732 OVCA2 RAVEN Ovario Linea del cáncer de ovario desarrollada en Raven SK-OV3 HTB-77 Ovario Adenocarcinoma - + - 9926 RAVEN Páncreas Adenocarcinoma - - - AsPC-1 CRL-1682 Páncreas Adenocarcinoma - HPAF-II CRL-1997 Páncreas Adenocarcinoma - + - Hs 700T HTB-147 Páncreas Adenocarcinoma - + - SÜ-86- CRL-1837 Páncreas Carcinoma + ++ 86 ductal Nombre ATCC# Organo Tipo de célula Reactividad con mu- de la anti-KID3 célula Arreglo FACS ELISA con celular células vivientes 22Rvl CRL_2505 Páncreas Carcinoma - DU 145 HTB-81 Próstata Adenocarcinoma - + - LNCaP CRL-1740 Próstata Carcinoma - + - PC3 CRL-1435 Próstata Adenocarcinoma +/- TDH-1 Raven Próstata Linea de cáncer +/- de próstata desarrollada en Raven Hs 746T HTB-135 Estómago Carcinoma - - - NC1-N87 CRL-5822 Estómago Carcinoma + + + SNU-16 CRL-5947 Estómago Carcinoma . + *CC-2551 Bio-Whittaker Ejemplo 6. Unión de zaa-anti-KID3 a tejidos tvmorales y normales Se congelaron y mataron tejidos normal y tejidos tumorales (humanos) obtenidos por resección quirúrgica como en el Ejemplo 4. Se cortaron criosecciones con un microtomo Leica 3050 CM a un espesor de 5 µ?? y se montaron congeladas sobre el portaobjetos recubierto con vectabound. La secciones fueron fijadas con etanol a -20°C y se dejaron secar al aire durante la noche a temperatura ambiente. Los portaobjetos fueron examinados bajo un microscopio Nikon. Se usó un equipo de detección PolyMICAMR para determinar la unión del mu-anti-KID3 al tejido. Se usó anticuerpo primario mu-anti-KID3 a una concentración final de 1 µg/ml. Los resultados se codificaron como 1+' para una tinción positiva débil, 2+' para una tinción positiva moderada, 3+' para una tinción positiva fuerte y ?-? para una tinción negativa. La función focal se indicó como "Foc". Los resultados se la tinción de tejido normales con mu-anti-KIDS se muestran en la Tabla 3. La Tabla 4 muestra la unión de anticuerpo mu-anti-KID3 a muestras de tejido tumoral.

Tabla 3. Sumario de la Unión de mu-anti-KID3 a Tejidos Normales tejidos Nivel de tinción por Comentarios IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Adrenal Negativo Medula ósea Sin señal por encima El fondo muestra 3+ del fondo células dispersas cerebro Negativo tejidos Nivel de tinción por Comentarios IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Mama 3+50% del epitelio Tinción apical y ductal/lobular célula total Colon 3+ mucosa Duodeno 3+ mucosa Corazón Negativo Riñon 3+ túbulos dispersos (ductos recolectantes) Hígado 3+ ductos biliares Pulmón 2+ pocas células alveolares; epitelio bronqueal raro 2-3+ Ovario Focal (<10%) +epitelio folicular Páncreas 3+ ductos; +/- minoría de acinos Próstata 3+ focal (< 5%) epitelio 1+ focal (-50%) epitelio tejidos Nivel de tinción por Comentarios IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Músculo Negativa esquelético Piel 3+ subconjunto de glándulas sudoríparas Bazo Sin señal por encima El fondo muestra 3+ del fondo células dispersas Estómago 2+ células foveolares Tiroide Negativo Utero 3+ epitelio Endometrio en fase superficial proliferativa Tabla 4. Sumario de la Unión de mu-anti-KID3 a Tejidos Tumorales Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Colon AdenoCA; 27FD Foc l-3+(<10%) pobremente dif AdenoCA; mod dif 1C62 3+ Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) AdenoCA, 4ECD Foc 3+(<10%) pobremente dif AdenoCA; mod dif 13FB Foc 3+ (-20%) AdenoCA; mod dif 689F 2+ AdenoCA; grado 2 358 3+ AdenoCA; grado 3 832 Foc 2-3+ AdenoCA; grado 2 1047 Foc 1-2+ (-10%) Met adeno; grado 216 Foc 2-3+ (-50%) Met a ovario NR Adeno; grado 2 1110 2+ 3+ estroma Met adeno; grado 1567 +/- 2-3+ mucina; el no reportado tumor es met para el hígado Met adeno; grado 1237 3+ Met para el NR hígado Met adeno; grado 374 +/- Foc mucina +; NR met en el sitio es pulmonar Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Adeno met; grado 1781 +/- a 1+ Met para el 3 sitio es groin Páncreas AdenoCA; mod dif 2D19 3+ ÁdenoCA; mod dif 38AC 2+ Algo de necrosis AdenoCA ductal; 7378 3+ pobremente dif Adeno ductal; 71FA 1-3+ (mayormente 3+ estroma pobremente dif 1+) Adeno ductal; 736D +/- a 1+ 3+ estroma pobremente dif Pulmón SCC; mod dif E27 Neg SCC; pobremente 34B Foc 3+ (<10%) dif Célula grande, 380E Foc 2+ (<1%) grado NR Célula grande, 1495 Neg grado NR Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Adeno; 62C4 Foc 3+ (-30%) Tejido pequeño pobremente dif Adeno; mod dif 425 Neg Macrófagos 3+ disperso Adeno; mod- 273 Foc 2-3+ (-30%) pobremente dif SCC grado 3 1191 Neg AdenoCA; grado 606 Neg NR SCC; grado 2 602 Neg SCC; grado 3 265 Foc 1+ (-30%) SCC; grado NR 41 Neg AdenoCA; grado 2 680 Foc 3+ (-40%) Parcialmente necrótico SCC; grado 3 917 Neg SCC; grado 2 597 Neg Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Célula no 942 Neg pequeña; grado 3 SCC; grado 3 749 Neg Adeno met; grado 401 Foc 3+ (-50%) Met para pleura 2 pulmonar Mama Ductal; SBR 5277 Neg grado II Ductal; nuc3; 1537 2+ hist 3 AdenoCA nos; 1520 Neg nuc3, hist3 AdenoCA nos; 1691 Neg nuc3, hist3 Ductal; nuc3; 702 Neg hist3 Ductal; nuc2; 5140 Neg hist2 Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Ductal; nuc3; 1531 Neg hist3 DVIS; nuc 3 5119 1-2+ (-60%) Ductal; grado 1442 Neg diferente de 2 (6-7) Ductal; nuc3; 5148 Foc +/- (-20%) hist3 Ductal; nuc3; 90D Neg hist3 Ductal; Grado 805A Neg III Lobular; nuc 1; 2F25 2+ hist2 Ductal; grado 6AB3 Neg III Próstata Adeno; gleason 9344 +/- a 1+ 3+3 Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Adeno; gleason 5110 Neg 4+5 Adeno; gleason 1626 Neg 4+3 Adeno; gleason 5749 +/- a 1+ 4+5 Adeno; gleason 1597 Neg 4+5 Adeno; gleason 6722 +/- a 1+ 4+5 Adeno; gleason 1703 Neg +/- hiperplasia 3+3 Adeno; gleason 846 Neg 3+4 Adeno; gleason 481 Neg 4+5 Adeno; gleason 5093 +/- a 1+ 3+4 Tipo de tumor Muestra Nivel de tinción Comentarios ID de IHC (Bajo: 1+ a Alto: 3+) Adeno; gleason 521U Neg 4+3 Adeno; gleason 1886 Neg 3+4 Adeno; gleason 1137U Foc 2+ (<10%) 3+5 Adeno; gleason 1D2C Neg 4+5 Ovario AdenoCA serous, 2C18 Rare 1-2+ («1%) FIGO grado 2 Adeno serous; BOE Few 1-2+ (<5%) pobremente dif AdenoCA serous, 3EB7 Foc 2+ (<10%) grado R AdenoCA serous, 5562 Foc 2-3+ (-40%) FIGO grado 3 Riñon RCC; Fuhrman 3 2907U Foc 2-3+ «10%) de 4 Ejemplo 7. Aislamiento de proteínas que contienen KED3 Para identificar el epitope el cual mu-anti-KID3 fue reactivo se efectúo un experimento de inmunoprecipitación (Ippt) . Para la Ippt, se lisaron 30 matraces de 175cm2 de células Colo205 con 30 mi de amortiguador de lisis total (lml por matraz) . El amortiguador de lisis consistió de solución salina equilibrada de Hank' s (HBSS) fortificada con 2% de Tritón X-100, con gel inhibidor de proteasa (1 tableta por 5ml/de amortiguador de lisis de mini EDTA completo libre de cocktail de proteasa (Roche Molecular Biochemicals) ) , 0.1% de azida de sodio, PMSF 2mM. El lisado celular fue centrifugado a 24,000xg durante 30 minutos a 4°C antes de ser pasado sobre una columna consistente de 1 mi de proteína G (Amersham Pharmacia) . El lisado de Colo205 preaclarado fue entonces incubado con la mu-anti-KID3 absorbido sobre proteína (se preincubaron 10µ9 de mu-anti-KID3 durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5µ1 de proteína G) durante 2 horas a 4°C. Las perlas (tanto las perlas de proteína G preaclarada como las perlas con mu-anti-KID3 han absorbido proteína G) fueron entonces lavadas tres veces con amortiguador de lisis antes de la elusión con 30 µ? de amortiguador de muestreo con SDS (3% de SDS, 20% de glicerol,, DTT lOmM, 2% de azul de Bromofenol, Tris 0.0M, pH8.0) Entonces se resolvieron 25 µ? de eluato por SDS-PAGE y se visualizaron a través de la tinción. Se resolvieron 5µ1 de eluato por SDS-PAGE y transfirieron adicionalmente a nitrocelulosa para western blotting. Las manchas fueron entonces sondeadas con mu-anti-KID3 y reveladas usando un kit Western Blotting (Invitrogen Cat No. WB7103) para confirmar el reconocimiento del epítope. Por Western blotting usando mu-anti-KID3 contra IgG de ratón y eluatos de mu-anti-KID3 , las proteínas fuertemente glicosiladas únicas para el eluato de mu~anti-KID3 que fluctúan a 90kDa a 250kDa fueron observadas. Por la tinción de commassie, se observó un número de frotis únicos pero muy claros de mu-anti-KID3 típicos de proteínas fuertemente glicosiladas de aproximadamente lOOkDa hasta aproximadamente 200kDa. Las bandas de proteína teñidas del gel de SDS-PAGE se escindieron usando cuchillas de escarpelo limpias y se colocaron en tubos de Eppendor limpios. Las bandas escindidas fueron almacenadas a -20°C hasta ser usadas para a la identificación de protelna por espectrometría de masas.

Ejemplo 8. Caracterización del epítope al cual se une el mu-anti—KID3 usando espectrometría de masa en serie (MS/MS) El apitope al cual se une el mu-anti—KID3 fue aislado como se describe en el Ejemplo 7 y se sometió a espectrometría de masas en serie de acuerdo al método de Kane et al., 2002. Las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE, y el gel fue teñido con el reactivo de azul de Commassie coloidal (Invitrogen) . Las proteínas de interés fueron digeridas en gel con tripsina. Los péptidos trípticos fueron secuenciados por cromatografía de líquidos microcapilar MS/MS sobre un espectrómetro de masas de (termo-Finnnigan LCDQ DECA XP) , como se describe en Wu et al., 2000. De manera alternativa, también pueden ser usados otros métodos comúnmente conocidos de espectrometría de masas, como la espectrometría de masas MALDI en la práctica de esta invención.

Los resultados de los experimentos de espectrometría de masa indicaron que las bandas específicas de mu-anti-KID3 consistieron de varias proteínas.

Ejemplo 9. Otros experimentos de caracterización para identificar KID3 Para examinar las propiedades de los carbohidratos ~ de proteínas con KID3 , se sometieron preparaciones de proteínas de dos tamaños diferentes (una preparación que contenía proteínas que fluctúan de 85-100 kDa y la otra preparación que contenía proteínas de más de 100 kDa) reactivas con el mu-anti-KID3 a desglicosilación usando N- glicanasa, O-glicanasa, sialiadasa, y fucosidasa (Prozyme, CA) . Se usaron los siguientes métodos de los protocolos del fabricante, aunque otros métodos comúnmente conocidos en el campo son aplicables. La preparación de proteína de 85 kDa- 100 kDa tratada con N-glicanasa no mostró actividad con el mu-anti-KID3 cuando se resolvió por Western blot usando mu-¦ anti-KID3. La preparación de proteína de >100 kDa tratada con N-glicanasa mostró una reducción de aproximadamente el 60% en la reactividad del mu-anti-KID3 cuando se resolvió por Western blot usando mu-anti-KID3. El tratamiento adicional de la preparación de proteína de >100 kDa tratada con N- glicanasa no mostró reactividad de mu-anti- KID3 cuando se resolvió por Western blot usando mu-anti-KID3. Esos resultados indican que probablemente el KID3 sea un carbohidrato ligado en N, el cual puede o no contener fucosa. Las proteínas purificadas que contienen KID3 fueron inmovilizadas sobre pozos microtituladores (NUNC Maxisorb, NUNC) y bloqueados con HBSS que contenía 1% de BSA. A las placas bloqueadas se introdujeron anticuerpos dirigidos contra antlgenos de Lewis LeA, LeB, LeX, y LeY en ambas formas no sialilada y sialilada (Calbiochem, San Diego, CA) . Esos anticuerpos fueron usados a 20 µg ml, 50µ1/???? y se dejaron unir a las proteínas que contienen KID3 durante 1 hora a temperatura ambiente, diluidas en amortiguador de bloqueo. Después de un tiempo de una hora de ' incubación, la placa fue lavada con HBSS y anticuerpos secundarios conjugados con H P (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Pennsylvania) usados a 1:1000 en HBSS fueron introducidos a la mitad de las condiciones sobre la placa. La otra mitad fue introducida en una mezcla de estreptavidina conjugada con HRP (a 2µg/ml) de mu-anti-KID3 biotinilado a 2 µg/ml a un volumen de 50 µ?/????. El mu-anti-KID3 biotinilado fue diluido en HBSS y ambos del anticuerpo secundario y el mu-anti-KID3 se dejaron interactuar sobre la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final del tiempo de incubación de 30 minutos, las placas fueron lavadas con HBSS y se les agregaron 100 µ?/???? de solución de sustrato (sustrato TMB, KPL, Cleveland, OH) a cada pozo. Se observó el cambio de color y se detuvo después de 5 minutos a temperatura ambiente con 100 µ? de ácido fosfórico 1M. La placa fue leída a una D.O. de 450 nm. Los datos obtenidos del experimento indican que las proteínas que expresan KID3 son reconocidas por anticuerpos dirigidos contra el antígeno de Lewis LeA. El anticuerpo contra LeA, sin embargo, fue incapaz •de competir por el mismo sitio de unión que el mu-anti-KID3. Esto indicarla que el KID3 puede ser encontrado concurrentemente con LeA pero es en realidad un antígeno de Lewis independiente del epítope .

Ejemplo 10. Efecto del mu-antí-KID3 sobre la línea celular de cáncer de colon La capacidad de los anticuerpos para reducir el número de células in vitro cuando crecen como una monocapa puede ser evaluada usando monocapas celulares que crecieron en presencia o ausencia de cantidades variables de anticuerpo purificado de prueba o control y el cambio en el número de células evaluado usando MTT. El MTT es un tinte que mide la actividad de enzimas mitocondriales y se correlaciona con un número relativo de células viables. Las células de interés fueron cultivadas y se hicieron crecer en medio de crecimiento F12/DMEM (1:1) suplementado con 10% de suero bovino fenal en placas de 96 pozos. Las siguientes líneas celulares fueron cultivadas con las siguientes densidades en pozos por triplicado de un disco de 96 pozos: Colo205 y Calu3 , a 1500 y 1800 células/pozo, respectivamente. Inmediatamente después de cultivar, se agrego mu-anti-KID3. Las células fueron incubadas a 37°C en un incubador humidificado a 5% C02/aire durante 5 dias . Al final del ensayo, se disolvió el MTT en PBS (5mg/ml) y se agregó directamente a los pozos a una dilución 1:10. Las placas fueron colocadas nuevamente en el incubador durante 4 horas . Después de la incubación, el medio fue removido y se agregaron 100 µ? de DMSO para solubilizar el MTT precipitado. Las placas fueron leídas a 540 sobre el lector de placas. El mu-anti~KID3 inhibió el crecimiento de las células de cáncer de colon Colo205 en una forma dependiente de la dosis a través de la inducción de muerte celular oncótica. Sin embargo, el mu-anti-KID3 no inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón Calu3 (a las cuales el mu-anti-KID3 no inhibe) o HT29 (otra línea de cáncer de colon que expresa bajo niveles de ID3) a la concentración final de 10 µg/ml. Los resultados de varios experimentos in vi tro miden la capacidad de un anticuerpo anti-KID3 de acuerdo a los métodos de este ejemplo se muestran en la Figura 4. La Figura 5 muestra la actividad in vitro de un anticuerpo anti-KID3 combinado con los agentes quimioterapéuticos Irinotecan y 5FU.

Ejemplo 11. Internalización del mu-anti-KID3 y anti-IgG de ratón conjugado con toxina El Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA) es un anti-IgG de ratón conjugado con saporina, una toxina que inhibe la síntesis de proteína. Esta toxina es impermeable a la membrana celular. Si un anticuerpo monoclonal se une a un determinante antigénico de la superficie celular que sea internalizable , el conjugado de toxina puede unirse al anticuerpo monoclonal e internalizarse, matando eventualmente a la célula. Siendo ¦dependiendo de la internalización para la demostración de actividad tóxica, el Mab-ZAP puede servir para evaluar si o no un epítope de superficie dado servirá como un blanco adecuado para cualquier toxina que dependa de la internalización para expresar efectos tóxicos celulares. Por ' lo tanto, el Mab-ZAP sirve como modelo para toxinas dependientes de la internalización como los maitansinoides y las caliqueamicinas . Para probar la internalización del mu-anti-KID3 y el anti-IgG de ratón conjugado por saporina por células tumorales y efectuar la eliminación de las células tumorales después de la internalización de la saporina, fueron removidas células de tumor de colon humano, Colo205 de matraces patrón con EDTA 10 mM y centrifugadas. Las células fueron resuspendidas a 50,000/ml en medio apropiado y 100 µ? cultivados por pozo en placas de 96 pozos. El anticuerpo mu-anti-KID3 fue agregado inmediatamente a los pozos apropiados, como un concentrado lOx, para obtener una concentración final de 10 µg/ml. Después de 15 minutos a temperatura ambiente se agregó Mab-ZAP (Cat. # IT-04, Advanced Targeting Systems, San Diego CA) a los pozos apropiados como un concentrado lOx, para obtener una concentración final de 0.001 nM a 10 nM. Después de 4 días de crecimiento, se agregó MTT (5 mg/ml de PBS patrón, dilución de 1:10 en el pozo) durante 4 horas a 37 °C. El medio fue entonces removido de todos los pozos y se agregaron 100 µ?/???? de DMSO. Las placas fueron agitadas suavemente para solubilizar el precipitado de MTT azul y las placas fueron leídas en un lector de placas a 540 nm. Hubo una disminución de tinción en MTT en Colo205 en presencia de mu-anti-KID3 en comparación con la tinción en ausencia de mu-anti-KID3 cuando se agregó Mab-ZAP por encima de 0.01 nM, indicando que el crecimiento de las células de tumor de colon humano Colo205 fue inhibidor en presencia de mu-anti-KID3 y Mab-ZAP, y el mu-anti-KID3 y el anti-IgG de ratón conjugado con toxina se internalizaron en Colo205. Cuando se usó Mab-ZAP a 10 nM, hubo una disminución de aproximadamente 90% en la tinción con MTT, correspondiente a una inhibición de aproximadamente 90% del crecimiento de Colo205 por unión de mu-anti-KID3 y Mab-ZAP. Los resultados del experimento de internalización de acuerdo a los métodos de este ejemplo se muestran en la Figura 6.

Ejemplo 12. Eficacia el anticuerpo anti-KID3 con células de tumor de colon humano (Colo205 y HT29) en ratones sin pelo. Se injertaron células de tumor de colon humano bajo la cápsula renal en ratones sin pelo (nu/nu) . Para los animales tratados las células de tumor Colo205 injertadas en el riñon izquierda y las células tumorales HT29 fueron injertadas en el riñon derecho. Se hizo un injerto en cada riñon (500k células en gel de colágeno) . El injerto se dejó crecer durante dos días . Se inyecto anticuerpo monoclonal anti-KID3, clon mu-anti-KID3 , entraperitonealmente a una carga de 100 mg/kg por dosis el día 3, seguida por tres dosis posteriores cada dos días. Los ratones control fueron inyectados con solución salina únicamente. Tres días después de la inyección final los animales fueron sometidos a eutanasia y los ríñones con los injertos fueron examinados. Los injertos y un área alrededor de ellos fueron entonces fijados en incluidos en bloques de parafina y cortados a través de toda el área del injerto. En otros experimentos siguiendo protocolos similares, se establecieron tumores Colo205 ( 500k células en gel de colágeno bajo la cápsula renal) durante 2 días, seguido por una dosis con una carga de 100mg/kg el día 3, y dosis de -50 mg/kg cada dos días. En esos experimentos, los ríñones fueron cosechados cuatro días después de última dosis . Los ríñones de algunos de los animales que tenían células de tumor de colon humano Colo205 implantadas en el modelo de cápsula renal se muestran en la Figura 1. Los paneles superiores de la Figura 1 son de animales control (no tratados>) mientras que los paneles inferiores son de animales tratados con KID3. La Figura 2 muestra una representación gráfica de los resultados de los experimentos de cápsula renal que evalúan la respuesta de células de tumor de colon Colo205 en el modelo de cápsula renal a anticuerpos anti—KID3. En esa Figura. (CR) indica una respuesta completa, que significa que no se observaron células tumorales en ninguna sección; PR indica una respuesta parcial que significa un tamaño de tumor resultante de < 50% del control; y un R indica sin respuesta que mide un tamaño de tumor resultante de 50-100% del tumor control. Los resultados mostrados en la Figura 1 se calificaron como aquellos que dan una respuesta parcial, y se marcaron como Coló 205-2.

Ejemplo 13. Eficacia, antitumoral del anticuerpo KID3 en un modelo subcutáneo de tumores del colon humano. Este estudio fue diseñado para probar los datos antitumorales de respuesta a la dosis de un anticuerpo anti- KID3 en un modelo subcutáneo de cáncer de colon. Se uso ' fluoracilo, un agente quimioterapéutico citotóxico, o como control positivo. Se tripsinizaron células de carcinoma de colon humano Colo205 cultivadas, se lavaron en medios, se centrifugaron y se resuspendienron en medios a 100 millones de células por mililitro de medios (5 millones de células por volumen de 0.05 mL) , entonces se mezclaron un volumen igual de Matrigel® para un volumen de inyección de 0.1 mL. Se dosificaron 72 ratones homozigóticos NCR.nu/nu intraperitonealmente durante el estudio. Los grupos fueron (1) control con solución salina a 0.2 mL, dos veces semanalmente para 10 tratamientos (2) un anticuerpo anti-KID3 a 50 mg/kg, dos veces a la semana durante 10 tratamientos, (3) Fluoracil (5FU) , 50 mg/kg una vez a la semana durante 4 tratamientos, (4) Fluorouracilo (5FU) 35 mg/kg una vez a la semana durante 4 tratamientos, (5) un anticuerpo anti-KID3 a 50 mg/Kg dos veces a la semana durante 10 tratamientos, más Fluorouracilo (5FU) 50 mg/kg una vez a la semana durante -4 tratamientos, (4) Fluorouracilo (5FU) , 35 mg/kg, una vez a la semana durante 4 tratamientos, (5) un anticuerpo anti-KID3 a 50 mg/kg dos veces a la semana durante 10 tratamientos, más ¦ Fluorouracilo (5FU) a 50 mg/kg dos veces por semana durante 10 tratamientos, (6) un anticuerpo anti-KID3 a 50 mg/kg dos veces a la semana durante 10 tratamientos, más Fluorouracilo (5FU) 35 mg/kg una vez a la semana durante 4 tratamientos . El crecimiento del tumor con el tiempo fue evaluado para determinar la actividad antitumoral . Los tumores fueron palpables antes del inicio de la terapia. Los animales que respondieron al tratamiento con anticuerpo fueron mantenidos después de cesar el tratamiento para determinar el tiempo para que creciera nuevamente el tumor. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 3. Puede observarse que todos los grupos de tratamiento fueron más eficaces que la solución salina en la inhibición del crecimiento de las células tumorales. Debe comprenderse que los ejemplos y modalidades descritas aquí son para propósitos ilustrativos únicamente y que serán sugeridos varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos por aquellos expertos en la técnica y se incluirán dentro del espíritu y punto de vista de esta solicitud. Todas las publicaciones, patentes y Solicitudes de Patentes citadas aquí se incorporan por lo tanto como referencia en su totalidad para todos los propósitos en el mismo grado que si cada publicación, Patente o Solicitud de Patente individual fuera indicada de manera específica individual, incorporada como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención sin que resulte claro de la presente descripción de la invención.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de unión de epitope del mismo sustancialmente purificado, caracterizado porque se une específicamente al KID3, y tiene al menos una o más de las siguientes características : a. la capacidad de unirse al ID3 sobre una célula cancerosa. b. capacidad de unirse a una porción del KID3 que está expuesto sobre la superficie una célula viviente in vi tro o in vivo; c . capacidad de proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable a una célula cancerosa que expresa KID3 ; y d. capacidad de proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable en una célula cancerosa que expresa KID3
2. 2. El polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de unión de epitope purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula cancerosa es seleccionada del grupo que consiste de células de tumores de la glándula adrenal , cánceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumores astroclticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transitorias) cáncer óseo (adamantinoma, quistes óseos aneurismales , osteocondroma, osteosarcoma) , cáncer de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos, cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de células renales cromofóbicas , carcinoma de células transparentes, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redondas pequeñas desmoplásicas , ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mioxoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cánceres del conducto de la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica estacional, tumor de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma de células renales papilares) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos benignos, cáncer de hígado (epatoblastoma carcinoma hepatocelular) , linfomas, cáncer de pulmón, meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, cáncer de ovario, cánceres pancreáticos, carcinomas tiroideos papilares, tumores paratiroideos , cánceres pediátricos, tumores del revestimiento de los nervios periféricos, faeocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdiomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido blando, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, tioma, cáncer metastásico tiroideo y cánceres uterinos (carcinoma del cérvix, carcinoma endometrial, y leiomiomas).
3. 3. El polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de unión de epítope purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunoglobulina es seleccionada del grupo que consiste de anticuerpo anti-KID3 no humano, un anticuerpo humanizado de un anticuerpo anti-KID3 no humano, un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de regiones variables de un anticuerpo anti-KID3 no humano y regiones constantes derivadas de regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con una o más propiedades de un anticuerpo anti- ID3 no humano.
4. 4. Una secuencia de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica para el polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de unión de epítope del mismo de conformidad con la reivindicación 1.
5. 5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico está ligado operativamente a un promotor.
6. 6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el promotor y el ácido nucleico están contenidos en un vector de expresión.
7. 7. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es polipéptido es un anticuerpo monoclonal .
8. 8. Una linea celular, caracterizada porque es transfectada, transformada o infectada con un vector que contiene un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación .
9. 9. Un método para producir un polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de unión de epitope del mismo, sustancialmente purificado, caracterizado porque comprende los pasos de : a. Hacer crecer una línea celular transformada con el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4 bajo condiciones en las cuales el polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de unión de epitope es expresado; y b. Cosechar el polipéptido o fragmento de inmunoglobulina expresado.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la línea celular es un hibridoma.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porgue el hibridoma es el ATCC No. PTA-4860.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es polipeptido de inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal .
13. 13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una dosis terapéuticamente efectiva de una inmunoglobulina o fragmento de unión de epítope purificado de conformidad con la reivindicación 1, junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. 14. Una composición farmacéutica, caracterizada porgue comprende una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión de epítope del mismo que se une específicamente al KID3 , y tiene al menos una o más de las siguientes características: a. la capacidad de unirse al KID3 sobre una célula cancerosa; b. la capacidad de unirse a una porción del KID3 que está expuesto sobre la superficie de una célula viviente in vitro o in vivo. c. la capacidad de proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable a una célula cancerosa que expresa ID3 ; y d. capacidad para proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable en una célula cancerosa que expresa KID3 ; junto con un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable .
15. 15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende una porción terapéutica adicional.
16. 16. Una línea celular aislada, caracterizada porque consiste de la ATCC No. PTA-4860, o progenie de la misma .
17. 17. Un método para proporcionar un agente quimioterapéutico a una célula cancerosa, caracterizado porque comprende administrar una composición que comprende un anticuerpo anti-KID3 asociado con el agente quimioterapéutico donde la célula cancerosa es seleccionada del grupo que consiste de células de tumores de la glándula adrenal, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumores astrocíticos, cáncer de ve iga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transitorias) cáncer óseo (adamantinoma, quistes óseos aneurismales, estocondroma, os eosarcoma) , cáncer de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de células renales cromofóbicas, carcinoma de células transparentes, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redondas pequeñas desmoplásicas, ependimotnas, tumores de Ewing, condrosarcoma mioxoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cánceres del conducto de la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica estacional, tumor de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de islote, sarcoma de aposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma de células renales papilares) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos benignos, cáncer de hígado (epatoblastoma, carcinoma hepatocelular) linfornas, cáncer de pulmón, meduloblas oma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos , cáncer de ovario, cánceres pancráticos, carcinomas tiroideos papilares, tumores paratiroideos, cánceres pediátricos, tumores del revestimiento de los nervios periféricos, faeocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdiomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido blando, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, tioma, cáncer metastásico tiroideo y cánceres uterinos (carcinoma del cérvix, carcinoma endometrial, y leiomiornas) .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es administrado a un individuo.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque es hibridoma es el ATCC No. PTA-4860 o la progenie del mismo.
20. 20. Un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas en un individuo, caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo anti-KID3 asociado con una agente quimioterapéutico al individuo, donde la célula cancerosa es seleccionada del grupo que consiste de células de tumores de la glándula adrenal, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumores astrocíticos , cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transitorias) cáncer óseo (adamantinoma, quistes óseos aneurismales, estocondroma, osteosarcoma) , cáncer de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de células renales cromof bicas, carcinoma de células transparentes, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redondas pequeñas desmoplásicas , ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mioxoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta osslum, displasia fibrosa del hueso, cánceres del conducto de la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica estacional, tumor de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma de células renales papilares) , leucemias, lipom /tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos benignos, cáncer de hígado (epatoblastoma carcinoma hepatocelular) linfornas, cáncer de pulmón, meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, cáncer de ovario, cánceres pancráticos, carcinomas tiroideos papilares, tumores paratiroideos, cánceres pediátricos, tumores del revestimiento de los nervios periféricos, faeocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdiomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido blando, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, tioma, cáncer metastásico tiroideo y cánceres uterinos (carcinoma del cérvix, carcinoma endometrial, y leiomiomas).
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es proporcionado a las células cancerosas .
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo anti-KID3 es una anticuerpo monoclonal expresado por el hibridoma es el ATCC No. PTA-4860 o la progenie del mismo.
23. 23. Un método para detectar la presencia o ausencia de una célula cancerosa es un individuo, caracterizado porque comprende poner en contacto las células del individuo con un anticuerpo anti-KID3 y detectar un complejo de KID3 de las células y el anticuerpo, si lo hay, donde la célula cancerosa es seleccionada del grupo que consiste de células de tumores de la glándula adrenal, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte blanda alveolar, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transitorias) cáncer óseo (adamantinoma, quistes óseos aneurismales , estocondroma, osteosarcoma) , cáncer de cerebro y médula espinal, tumores cerebrales metastásicos , cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosareorna, dordoma, carcinoma de células renales cromofóbicas , carcinoma de células transparentes, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redondas pequeñas desmoplásicas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mioxoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ossium, displasia fibrosa del hueso, cánceres del conducto de la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica estacional, tumor de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de islote, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma de células renales papilares) , leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos benignos, cáncer de hígado (epatoblastoma, carcinoma hepatocelular) , linfomas, cáncer de pulmón, meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos , cáncer de ovario, cánceres pancráticos, carcinomas tiroideos papilares, tumores paratiroideos, cánceres pediátricos, tumores del revestimiento de los nervios periféricos, f eocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma unveal posterior, trastornos hematológicos raros, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdiomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido blando, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, tioma, cáncer metastásico tiroideo y cánceres uterinos (carcinoma del cérvix, carcinoma endometrial, y leiomiornas) .
24. 24. Un agente caracterizado porque bloquea una de las siguientes interacciones entre el ID3 y un par de unión de ID3: a. la capacidad de unirse al KID3 sobre una célula cancerosa; b. la capacidad de unirse a una porción del KID3 que está expuesto sobre la superficie de una célula viviente in vitro o in vivo. c. la capacidad de proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable a una célula cancerosa que expresa ID3 ; y d. capacidad para proporcionar un agente terapéutico o marcador detectable en una célula cancerosa que expresa KID3 ;
25. 25. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una dosis terapéuticamente efectiva de un agente de conformidad con la reivindicación 24, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
26. 26. Un modulador de KID3 , caracterizado porque tiene al menos una de las siguientes características: a. la capacidad de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y un ligando de KID3 nativo; b. la capacidad de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y el anticuerpo anti-KID3. c. la capacidad de unirse al ID3 humano; d. la capacidad de unirse a un ligando nativo de KID3. e . la capacidad de unirse a un aticuerpo anti-KID3. f . contiene un sitio determinante antigénico que puede ser usado para producir anticuerpos capaces de unirse al KID3 humano, un ligando de KID3 nativo o un anticuerpo anti-KID3. g. contiene un sitio determinante antigénico que puede ser usado para separar o seleccionar anticuerpos capaces de unirse al KID3 humano, ligandos de KID3 nativos o un anticuerpo anti-KID3; h. contiene un sitio determinante antigénico que puede ser usado para producir anticuerpos capaces de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y un ligando de KID3 nativo o entre el KID3 y un anticuerpo anti-KID3. i . contiene un sitio determinante antigénico que puede ser usado para separar o seleccionar anticuerpos capaces de perturbar o bloquear la interacción entre el KID3 humano y un ligando de KID3 nativo o entre el ID3 y un anticuerpo anti-KID3.