MXPA06001525A - Preparacion de peptidos de somatostatina. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un procedimiento para preparar analogos de somatostatina ciclica y los intermediarios lineales utilizados en este procedimiento.

Description

PREPARACION DE PEPTIDOS DE SOMATOSTATINA La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar análogos de somatostatina cíclicos y los intermediarios utilizados en este procedimiento. Más particularmente la. invención proporciona un procedimiento para la preparación de un análogo de somatostatina cíclica de la fórmula I. en donde R-i es alquileno de 2 a 6 átomos de carbono-NR3R4, alquileno de 2 a 6 átomos de carbono-guanidina, o alquileno de 2 a 6 átomos de carbono-COOH en donde cada uno de R3 y R4 es independientemente H, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, ?-hidroxi-alquileno de 2 a 4 átomos de carbono o acilo o R3 y R4 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un grupo heterocíclico el cual puede comprender un átomo heterogéneo adicional, y es -CH-CO-0-CH2 en donde Z¾ es O o S y R5 es fenilo opcionalmente substituido, o una sal del mismo. Cualquier acilo puede ser por ejemplo, RaCO- en donde Ra es H, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono o bencilo. Cuando NR3R4 forma un grupo heterocíclico, dicho grupo puede ser aromático o saturado y puede comprender un nitrógeno o un nitrógeno y un segundo átomo heterogéneo seleccionado de nitrógeno y oxígeno. Preferiblemente el grupo heterocíclico es por ejemplo, piridilo o morfolino. El alquileno de 2 a 6 átomos de carbono es prefer¡blemente-CH2-CH2. Cuando R5 es fenilo substituido, el anillo de fenilo puede ser substituido por halógeno, metilo, etilo, metoxi o etoxi, por ejemplo, en orto y/o para. Preferiblemente, R5 es fenilo no substituido. Los aminoácidos en las posiciones 2 y/o 5 pueden tener la configuración D o L. preferiblemente cada uno de ellos tiene la configuración L. Los compuestos de la fórmula I pueden existir, por ejemplo, en forma libre o de sal. Las sales incluyen sales de adición de ácido con por ejemplo, ácidos orgánicos, ácidos poliméricos o ácidos inorgánicos, por ejemplo con ácido clorhídrico, ácido acético, ácido láctico, ácido aspártico, ácido benzoico, ácido succínico o ácido pamo'ico, o por ejemplo sales de metal alcalino cuando R-i comprende un grupo COOH. Las sales de adición de ácido pueden existir como sales mono o divalentes, por ejemplo, dependiendo de si 1 o 2 equivalentes de ácido se agregan al Compuesto de la fórmula I en la forma de base libre. Las sales preferidas son la di-sal de aspartato o la mono-sal de pamoato. El procedimiento para la producción de acuerdo con la invención comprende un paso de ciclisación de un péptido lineal correspondiente en forma protegida. Ahora sorprendentemente se ha encontrado que le paso de ciclisación es particularmente dependiente de la selección de 2 aminoácidos terminal del péptido lineal correspondiente. Aparte de 6 posibilidades de ciclisación, sorprendentemente se ha encontrado que la ciclisación entre los aminoácidos 3 y 4, o 4 y 5, o 6 y 1 proporciona resultados significativamente importantes. La ciclisación entre los aminoácidos 4 y 5 es particularmente preferida. La ciclisación de acuerdo con la invención entre los aminoácidos 3 y 4, o 4 y 5, o 6 y 1 , se dirigen hacia el mejoramiento del rendimiento con cada isomerisación reducida en los sitios quirales. Además, estos pasos de ciclisación pueden ser llevados a cabo condiciones y reactivos menos rigurosas: por ejemplo, ciclisación a través del uso de una azida que puede ser evitada. En una primera modalidad de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de la fórmula I o una sal del mismo como se indicó anteriormente, que comprende ciclizar un análogo de somatostatina lineal de la fórmula II H^-CH-CG-Phe-Í^R^NIHCO-OJ-ProJ-ÍD or L)Phg-DTrp(R11 )-l_ys(4-NHR12)-OH ll CH2-R2 o la fórmula H-Lys(4-NHR12) -HN-CH-CO-Phe^H^-NHCO-OJ-ProHD or L)Phg-DTrp(R'11)-OH III CH2-R2 o la fórmula IV H^-ÍR^ HCO-OVProHD or L)Phg-DTrp(R11)-Lys(4-NHR12)-NH-CH-CO-Phe-OH IV CH2-R2 en donde R-¡ y R2 son como se definieron, cada uno de n y R12, independientemente, es un grupo protector amino por medio del cual cuando R-¡ comprende un NH2 terminal, este NH2 terminal también está protegido por el grupo protector amino, y en donde la remoción requerida del grupo(s) protector, y la recuperación de un compuesto de la fórmula I de esta manera se obtiene en forma libre o en la forma de sal. Los grupos protectores amino adecuados son por ejemplo, como se describe, por ejemplo, en "Protective Groups in Organic Síntesis", T.W. Greene y otros, John Wiley & Sons Inc., Segunda Edición, 1991. Ejemplos de dichos grupos protectores amino son por ejemplo, grupos acetilo o amino según utilizados en la síntesis de péptido, por ejemplo, ter-butoxi-carbonilo, carbobenzoxi, fluorenilmetiicarbonilo, aloxicarboniio, 1 -(4,4-dimetil-.26-dioxociclohexliden)etilo, 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxocilohexiliden)-3-metilbutilo, 4-metiltritilo, (W.C. Chan y P.D. White, Fmoc solid Phase Peptide Síntesis, Oxford University Press, 2000). La ciclisación puede convenientemente ser llevada a cabo en presencia de un derivado basado en fosfonio por su activación carboxi in s/'fu, por ejemplo, hexafluorofosfato 0-(benzotriazol-1 -il)N,N,N',N'-tetrametiluronio, hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxitris(pirrolidino)fosfonio, IM-óxido de tetrafluoroborato N-[(1H-benzotriazol-1 - il)(d¡metilamino)met i lenj-N-metilmetanaminio, exafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1 - iloxitris(pirroiidino)-fosfonio. Preferiblemente la reacción puede ser llevada a cabo en presencia de una base, por ejemplo, una amina orgánica, por ejemplo, amina de isopropil N-etilo, N-metilmorfolina, trietilamina o tribencil amina, y en presencia de un nucleófilo auxiliar, por ejemplo, 1-hidroxibenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, 3-hidroxi-3,4-dihidro-1 ,2,3-benzotriazina-4-ona o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol. La ciclisación de un compuesto de la fórmula II, III o IV necesita dirigirse hacia un compuesto de la fórmula I en forma protegida, es decir un compuesto de la fórmula I en donde uno o más o todos los grupos amino presentes en la molécula están protegidos por un grupo protector amino. Ejemplos de dichos compuestos son por ejemplo, ciclo[(2R-4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2- H-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-], ciclo[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2- NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-], y ciclo[(2S,4R)- 4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-]. Los grupos protectores amino pueden ser removidos de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo división, por ejemplo, con ácido trifluoroacético; 3M HCI, EtOAc, Me3CCI, fenol, CH2CI2; 10% H2S04, dioxano; bromocatecloroborano. Los compuestos de la fórmula II, III y IV o sales de los mismos son novedosos y forman parte de la invención. Estos compuestos pueden ser preparados enlazando juntos a través de un enlace de amida dos unidades de péptido, cada uno de estos conteniendo por lo menos un aminoácido en forma protegida o no protegida, en donde el enlace de amida es una forma deseada de la secuencia de aminoácido se obtiene según definida en la fórmula II, III, o IV. La síntesis puede ser realizada de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, en solución o a través de síntesis de fase sólida, iniciando con el primer aminoácido. En la síntesis de fase sólida, el primer aminoácido está unido a una resina, por ejemplo, una resina en base a poliestireno comercialmente disponible a través de un enlazador adecuado, por ejemplo, un enlazador el cual es divisible bajo condiciones de fusión para mantener la protección de cadena lateral intacta, por ejemplo, un enlazador en base al tritilo opcionalmente substituido, por ejemplo, ácido 4-(hidroxil-difen¡l-metil)benzoico, en donde uno de los grupos fenilo puede estar opcionalmente substituido, por ejemplo, por Cl. La construcción de la cadena de péptido deseada, ya sea en solución o a través de síntesis de fase sólida, puede ser efectuada en una forma convencional, por ejemplo, utilizando aminoácidos en donde los grupos amino terminal son Fmoc-protegidos, los grupos amino de cadena lateral estuvieron presentes estando protegidos con un diferente grupo protector amino, por ejemplo, Boc o CBO. Cuando la síntesis se efectúa a través de síntesis de fase sólida, el péptido construido entonces es removido de la resina de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, con ácido acético; ácido trifluoroacético; ácido acético-trifluoroetanol-diclorometano; hexafluoroisopropanol en diclorometano. Un procedimiento preferido para remover el péptido construido de la fase sólida, por ejemplo, cuando se utiliza un enlazador basado en trifilo no clorado, es por ejemplo, el tratamiento con metanol/diclorometano, preferiblemente a temperatura ambiente, o un tratamiento con cetona, por ejemplo, etil metil cetona, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 50°C. Ejemplos de compuestos de la fórmula II, III y IV son por ejemplo, H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH H-Lys(Boc)-D-Tyr(Bzl)-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Phe-OH H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D- Trp(Boc)-Lys(Boc)-OH H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH H-Tyr(Bzl)-P e-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH. Los compuestos de la formula II, III o IV pueden existir en la forma de sal como se describió anteriormente para los compuestos de la fórmula I. Los compuestos de la fórmula I son agonistas de somatostatina valiosos, y tienen propiedades farmacológicas interesantes como se describen en por ejemplo, WO 97/01579 o WO 02/10192, el contenido de los mismos describen las propiedades farmacológicas que están siendo incorporadas en la presente por referencia. Un compuesto preferido es ciclo [{(4-NH2-C2H4- H-CO-0)-Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Benc¡l)-Phe], o una sal del mismo. Las sales preferidas son el aspartato (mono o di-aspartato) o pamoato. Cuando se utiliza el procedimiento de la invención, una ciclisación produce el péptido lineal correspondiente de la fórmula II, III o IV más alto que 70% puede ser obtenido. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención. Todas las temperaturas están en °C. Las siguientes abreviaturas se utilizaron: Bzl =Bencilo DAEM =dieti!amina DICI =carbodiimida de diisopropilo DMF =N,N-d¡metilformamida DPPA =az¡da de difenilfosforilo EDIPA = amina de N-etil diisopropilo HBTU =hexafluorofosfato de 0-(benzotriazol-1 -il)-N, N ,?'-N'-tetrametiluronio HOBT =1-hidroxi-benzotriazo! IPA =alcohol isopropílico Phg =fenilglicina RT =temperatura ambiente TBME =éter ter-butilmetílico EJEMPLO 1 rH-Tyr(Bzl)-Phe-(2S.4R)-4-(Boc-NH-CH:>-CH?-NH-CO-0)-Pro-Phq-D- Trp-Lys(Boc)-OHl Se disolvieron 10.4 g de (FMOC-Tyr(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH) en100 mi de DMF- Se agregaron 2.0 mi de dietllamina a temperatura ambiente y la agitación continuó durante 4 horas a temperatura ambiente. La solución amarilla clara se evaporó a 40°C. Al residuo se le agregaron 150 mi de acetato de isopropilo. Se sembraron y agitaron durante 18 horas a temperatura ambiente, se filtraron y se lavaron con 20 mi de acetato de isopropilo. Se secaron a 40°C. HPLC 87.5% b.a.(17.6 minutos); ESI-MS: 1287.5 (M + Na)+; 1H-NMR(DMSO) (S.DMSO): 1.14(2H, m), 1.33 (2H, m), 1.37 (18H, m), 1.53 (1H, m), 1.64 (1 H, m), 2.06 (1H, m), 2.22 (1H, m), 2.78-3.15 (12H, m), 3.38 (1H, m), 3.79 (2H, br), 4.12 (1H, m), 4.55-4.75 (3H, m), 5.05 (2H, s), 5.15 (1H, d), 5.54 (1H, d), 6.75 (1H, br), 6.83 (1H, br), 6.89 (2H, d), 6.94 (1H, t), 6.99 (1H, s), 7.43 (2H, d), 7.10-7.50 (arom.H), 7.59 (1H, d), 8.14 (1H, d), 8.45-8.55 (2H, m), 8.60 (1H, d), 10.71 (1H, br). El compuesto utilizado como material de partida se preparó como sigue: a) Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe A una solución de 23.7 g de Z-D-Trp-OH en 230 mi de THF se agregaron 9.5 g de HOBt a temperatura ambiente. Se formó una solución incolora transparente. Entonces se agregaron 20.8 g de H- Lys(BOC)-OMe a temperatura ambiente seguido por 7.7 mi de N-metilmorfolina. La suspensión fina se enfrió a 0°C y se agregaron 11.4 mi de diisopropilcarbodiimida. Se agitó durante 1 hora a 0°C, después 3 horas a temperatura ambiente. Una solución de 7.0 g de ácido sulfúrico concentrado en 120 mi de agua se agregó a la suspensión. Se extrajo con 150 mi de acetato de etilo, se llevo a cabo la separación de las fases y se lavó la fase orgánica consecutivamente con 100 mi de salmuera saturada, 100 mi de salmuera al 25%, 5% de solución de carbonato ácido de sodio. Después la fase orgánica se secó sobre gS04 y se evaporó. El residuo se recolectó en 250 mi de acetato de ¡sopropilo y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La filtración y el secado a 40°C dieron 40.9 de Z-D-Trp-Lys(BOC)-O e, una sustancia blanca. Condiciones de HPLC: MN Nucleosil 100 A/C18; 5 mieras; 250 x 4 mm; fase A: 0.24% de ácido fosfórico, fase B acetonitrilo; gradiente: de 20 a 80% B en 30 minutos; longitud de onda 220 nm; velocidad de flujo 1.3 ml/minutos; Temperatura 35°; pureza 97.8% b.a. (24.2 minutos). b) H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe Se disolvieron 19.8 g (34.1 mmoles) de Z-D-Trp-Lys(BOC)-OMe en 220 mi de metanol, se agregaron 2.2 g de catalizador Pd/C al 19% y se hidrogenaron a temperatura ambiente. La hidrogenación se terminó después de 1 hora a temperatura ambiente, el catalizador se filtró y el filtrado se evaporó a 30°C; sólido blanco. HPLC: 98.1% b.a. (16.2 minutos). c) Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe Se mezclaron 17.0 g de H-D-Trp-Lys(BOC)-OMe con 80 mi de THF. Se agregaron 9.2 g de Z-Phg-OH a la suspensión de color gris a temperatura ambiente. Se agregaron 4.4 g de HOBT, enjuagando con 20 mi de THF. La solución amarilla turbia se enfrió a 0°C y se agregó una solución de 5.3 mi de DICI en 15 mi de THF dentro de los diez minutos. Se agitó durante 2 horas a 0°C, después 2 horas a temperatura ambiente. Después adición de 3.6 de una solución de ácido sulfúrico en 57 mi de agua, se extrajo con 70 mi de acetato de etilo, se lavó con agua, salmuera saturada, 5% de carbonato ácido de sodio, 25% de salmuera, se secó sobre MgS04, y se evaporó. El residuo blanco se agitó en 125 mi de acetato de isopropilo durante 2 horas a 40°C y la suspensión se filtró. El secado se hizo a 40 sustancia ligeramente amarilla. HPLC: 96.3% b.a. (25.3 minutos), d) H-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe Se disolvieron 23.4 g (23.8 mmoles) (Z-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) en 260 mi de metanol, 2.6 g de Pd/C al 10% se agregaron y se hidrogenó a temperatura ambiente y presión normal. Después de 3 horas de catálisis se filtró y el filtrado se evaporó a 30°C; sólido blanco. HPCL 95.9% b.a. (17.6 minutos) e) Z-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe Se disolvieron 11.1 g de éster bencílico de ácido (2S,4R)-4-(2-ter-butoxicarbonilaminoetilcarbamoiloxi)-pirrol¡din-1 - carboxílico y 19.0 g de H-Phg~D-Trp-Lys(BOC)-OMe en 290 mi de THF a temperatura ambiente. Se agregaron 3.32 g de HOBt y la solución turbia se enfrió a 0°C. Una solución de 4.56 mi de DICl en 90 mi de THF se agregó. Agitación durante 24 horas a 0°C. Después se agregó una solución de 2.2 g de ácido sulfúrico en 22 mi de agua a temperatura ambiente, la solución de color ligeramente de ópalo se agitó durante 15 minutos y después se vació gota a gota en 500 mi de agua. La suspensión blanca se evaporó a 50°C hasta que no se destiló más THF. Filtración de la suspensión y lavado del residuo 4 veces con 80 mi de agua cada una, después con 250 mi de metano y después dos veces con totalmente 80 mi de metanol. Secado durante la noche a 50°C. HPLC 91.0% b.a. (19.5 minutos). f) H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp- Lys(BOC)-OMe Se disolvieron 22.0 g (12.7 mmoles) de Z-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-O e en 220 mi de DMF y se agregaron 4.4 g de Pd/C al 10%. Hidrogenación durante 4 horas a temperatura ambiente. Después el catalizador se filtró y el filtrado se agregó a una mezcla de 600 g de hielo y 400 mi de agua. El producto precipitado se filtró y se lavó con agua. El secado a 30°C dio un sólido gris. HPLC: 970.0% b.a. (12.3 minutos). g) Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe Se disolvieron 5.1 g de Z-Phe-OH y 13.5 g de H-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe en 250 mi de THF, se agregaron 2.29 g de HOBT y la solución obscura se enfrió a 0°C. Se disolvieron 3.1 mi de DICI en 80 mi de THF y se agregaron a la mezcla de reacción a 0o. Agitación durante 24 horas a 0°C. La mezcla de reacción se agregó a 200 mi de ácido sulfúrico al 10%, los sólidos precipitados se filtraron y lavaron con agua. Después de la filtración el residuo se mezcló con 200 mi de metanol y la suspensión se filtró. Secado a 40°C. HPLC: 97.2% b.a. (21.1 minutos). h) H-Phe-t(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) Se disolvieron 8.5 g de Z-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe en 180 mi de DMF, se agregaron 4.5 g de Pd/C al 10% y la mezcla se hidrogenó a temperatura ambiente durante 6 horas. Después el catalizador se filtró y el filtrado se evaporó a 40°C. Al residuo (30 g) se agregaron gota a gota 600 mi de éter t-butil metílico a temperatura ambiente, la suspensión se filtró y el residuo se lavó con 300 mi de TB E. Secado a 40°C. HPLC 93.1% b.a. (16.6 minutos). i) FOMC-Tyr-(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc- H-CH2-CH2-NH-CO- )]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-O e) Se suspendieron 6.5 g de H-Phe[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe y 0.86 g de HOBT en 180 mi de THF y se enfriaron a 0°C. Se agregaron 5.5 I de LiBr y después 20 mi de THF. Después 1.18 mi de DICI disueltos en 50 mi de THF se agregaron y la suspensión oscura se agitó a 0°C durante 24 horas. El baño de enfriamiento se removió y la agitación continuó durante 24 horas. Después se agregaron una solución de 0.65 g de ácido sulfúrico y 6.5 mi de agua, después 160 mi de agua. Evaporación a 40°, filtración del residuo, lavado con agua hasta que el agua anterior tuvo un pH de 4.0. La torta del filtro se agitó en 30 mi de metanol, la suspensión se filtró y el residuo se lavó con 10 mi de metanol. El secado a 35° dio una sustancia gris. HPLC 95.4% b.a. (26.0 mi). 10) FOMC-Tyr-(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO- )]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OH) Se suspendieron 13.0 g de FOMC-Tyr-(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4- (Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp-Lys(BOC)-OMe) en 250 mi de THF. Se agregaron 7.3 g de LiBr y 75 mi de THF. Después se agregaron lentamente 8.7 mi de NaOH 1 molar a temperatura ambiente durante 20 minutos. La agitación a temperatura ambiente continuó por tres horas, después se agregaron 5 mi de NaOH 1 molar adicionales dentro de las siguientes 15 horas. La solución de la reacción final se agregó a una solución de 1.7 de ácido sulfúrico en 34 mi de agua. La mezcla de la fase 2 resultante se agregó a 50 mi de acetato de etilo. Después de la fase de separación la fase orgánica se lavó 3 veces con salmuera y después se evaporó. Al residuo se le agregaron 25 mi de DiF. La solución de DIF clara resultante se agregó a 260 mi de agua. La suspensión resultante se filtró y la torta de filtro se lavó tres veces con agua y se secó durante la noche a 40°. HPLC 71.9% b.a. (28.6 minutos).

EJEMPLO 2 Preparación de resina de poliestíreno de aminometílo de 4- (Cloro(difenil)metil)benzoilo La síntesis se llevó a cabo en un reactor de lotes de agitación 1 L operado manualmente equipado con fritura de vidrio sinterizado bajo nitrógeno. La resina de aminometilpoliestireno comercialmente disponible (30.4 g, 41.07 mmoles), pretratada con DMF, se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante la noche con una solución de ácido 4-(hidroxil-difenil-metil)benzoico (15.0 g, 49.28 mmoles, 1.2 equivalentes), hidroxibenzotriazol (HOBT) (7.54 g, 49.28 mmoles, 1.2 equivalentes) y DICI (12.43 g, 98.57 mmoles, 2.4 equivalentes) en 140 mi de DMF. Él solvente se removió a través de filtración a través del fritura bajo presión reducida, y la resina se lavó en turnos cinco veces con DMF y cinco veces con metanol. El secado al vacío a 40° produjo 44.69 g de resina. La resina se utilizó como material de partida para la siguiente síntesis de los hexapéptidos.

Procedimiento para la síntesis del péptido lineal protegido Los hexapéptidos lineales enlazados a resina se ensamblaron manualmente en la dirección C- a N a través de reacciones de acoplamiento repetitivas en un reactor de lotes de agitación equipado con fritura de vidrio sinterizado bajo nitrógeno. La resina de poliestireno de aminometilo 4-(Cloro(difenil)metil)benzoilo se utilizó como el material de partida y se llevó a cabo a través de un protocolo estándar que consiste de ciclos repetitivos de desprotección Na (20% p/p de dietilamina (DAEM) en DMF), lavados repetidos con DMF y IPK en turnos, y acoplamientos (DIPI/HOBT, DIEPA y DMF) a temperatura ambiente. Para hacer una ligera modificación de este procedimiento, se toma un cuidado especial para minimizar la racemisación de fenilglicina llevando a cabo un acoplamiento de este aminoácido a 0°C. Debido a la división del péptido lineal protegido completamente ensamblado a partir del soporte de su resina, la protección ?a-Fmoc es removida.

Fmoc-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-OH se sintetizó como se describen en WO 02/101192. Todos los otros aminoácidos están comercialmente disponibles.

Síntesis de H-Tyr-(Bzl)-Phe-[(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH a) Síntesis de Fmoc-Lys(Boc)-0-resina La resina de aminometil poliestireno de4-(Cloro(difenil)metil)benzoilo (20 g, 19.4 mmoles), pretratada con tolueno, se trató durante 4 hors con cloruro de acetilo (7.6 g, 97 mmoles) en tolueno a temperatura ambiente. Después de la filtración, el procedimiento se repitió durante la noche, a partir de esto, la resina se filtró y se lavó con tolueno y diciorometano. El acoplamiento se realizó con una mezcla de Fmoc-Lys(Boc)-OH (18.2 g, 38.8 mmoles, 2 equivalentes) y N-metilmorfolina (3.94 g, 38.8 mmoles, 2 equivalentes) durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de la filtración, la resina se lavó con D F e IPA tres veces en turnos y se secó al vacío para obtener 26.5 g de un Fmoc-Lys(Boc)-0-reina amarillenta con una capacidad de 0.566 mmoles/g (determinado con el método Fmoc). (Lit. método Fmoc: eienhofer, J.; Kaki, M; Heimer, E.P.

Lambros, T.J.; Makofske, R.C.; Chang, C.D. Int. J. Pep. Prot. Res. 1979, 13, 35). b) Resina-0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO~0)]-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H Se suspendió Fmoc-Lys(Boc)-0-resina (28.0 g, 19.96 mmoles) en DMF y se trató con una solución de DEAM en DMF (20% p/p) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de ser filtrado, el procedimiento se repitió y después se lavó con DMF e IPA tres veces en turnos, seguido por lavado tres veces con DMF. Este procedimiento de desprotección ?a-Fmoc y lavados se repitió después de cada paso de acoplamiento. El acoplamiento se llevó a cabo con una mezcla de aminoácido, HOBT y DIC1 el cual se agitó 30 minutos a temperatura ambiente, y después se agregó a la resina una vez. El acoplamiento se continuó hasta la terminación, es decir, hasta que la desaparición completa de los grupos amino residuales se monitorearon a través de la prueba de Ninhidrina "Kaiser" negativa. Después de haber sido acoplada, la resina se lavó 5 veces con DMF, y entonces estuvo lista para la protección Fmoc. Los siguientes derivados de aminoácido se acoplaron secuencialmente: Fmoc-D-Trp(Boc)-OH (16.81 g, 31.92 mmoies, 2 equivalentes), DI F (100 mi), HOBT (4.93 g, 32.24 mmoies, 2.02 equivalentes), DICI (5.35 g, 42.45 mmoies, 2.66 equivalentes). Fmoc-Phg-OH (11.92 g, 31.92 mmoies, 2 equivalentes), 70 mi de THF, HOBT (4.93 g, 32.24 mmoies, 2.02 equivalentes), DICI (5.35 g, 42.45 mmoies, 2.66 equivalentes). Se toma especial cuidado para minimizar la racemisación de la fenilglicina llevando a cabo el acoplamiento de este aminoácido a 0°C. Fmoc-ÍZS^R -ÍBoc-NH-CHz-CHa-NH-CO-OJ-Pro-OH (17.26 g, 31.92 mmoies, 2 equivalentes), 100 mi de DIF, HOBT (4.93 g, 32.24 mmoies, 2.02 equivalentes), DICI (5.35 g, 42.45 mmoies, 2.66 equivalentes). Fmoc-Phe-OH (12.36 g, 31.92 mmoies, 2 equivalentes), 100 mi de DIF, HOBT (4.93 g, 32.24 mmoies, 2.02 equivalentes), DICI (5.35 g, 42.45 mmoles, 2.66 equivalentes). Fmoc-Tyr(Bzl)-OH (15.75 g, 31.92 mmoles, 2 equivalentes), 100 mi de DIF, HOBT (4.93 g, 32.24 mmoles, 2.02 equivalentes), DICI (5.35 g, 42.45 mmoles, 2.66 equivalentes). Antes de la división del péptido lineal protegido completamente ensamblado de su soporte de resina, la protección ?a-fmoc se removió tratando la resina con una solución de DAEM en DMF (20% p/p) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de haber sido filtrada, el procedimiento se repitió y se lavó con DMF e IPA tres veces en turnos, seguido por lavados 3 veces con DMF. (El secado de la resina al vacío a 40°C dio una resina amarillenta). c) División del péptido linea! de su soporte de resina: H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)]-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH Ca) Método con AcO H/CH2CI2/H20 45/45/5 p/p/p La resina del péptido lineal protegido completamente ensamblado 0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (24.5 g) se suspendió en una mezcla de 150 mi de AcOH/CH2Cl2/H20 45/45/5 p/p/p y se agitó durante una hora a temperatura ambiente, se filtró y se lavó con CH2CI2. El filtrado se evaporó a sequedad, el residuo se agitó durante una hora con una mezcla de TBME y heptano 7/3 p/p, se filtró y se secó al vacío. Se obtuvo un sólido amarillento; contenido: 93.5% HPLC g/g; pureza 91.6% (F)-HPLC y 2.5% (F)-HPLC D-Phg- Epímero. La resina de poliestireno de aminometilo(4-(Cloro(difenil)metil)benzoilo se lavó 3 veces con nnetanol y se secó y se pudo volver a utilizar. Cb) Método con CH2CI2 y MeOH. La resina del péptido lineal protegido completamente ensamblada 0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc- H-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-P e-Tyr(Bzl)-H (6.2 g) se suspendió en una mezcla de 115 mi de CH2CI2/MeOH 1/1 p/p y se agitó durante tres días a temperatura ambiente, se filtró y se lavó con CH2CI2. El filtrado se evaporó a sequedad, el residuo se agitó durante una hora con una mezcla de TBME y heptano 7/3 p/p, se filtró y se secó al vacío. Contenido: 93.5% HPLC g/g; pureza 92.6% (F)-HPLC y 1.1% (F)-HPLC D-Phg-Epímero. La resina de (resina de aminometil poliestireno (4- (Cloro(difenil)metil)benzoilo) se lavó tres veces con metanol y se secó puede volverse a utilizar. Ce) Método con etil metil cetona/MeOH La resina del péptido lineal protegido completamente ensamblada 0-Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phe-Tyr(Bzl)-H (4.0 g) se suspendió en una mezcla de 24 mi de dietil metil cetona 1/1 p/p y se agitó durante 15 horas a 50°C, se filtró y se lavó con MeOH. El filtrado se evaporó a sequedad, el residuo se agitó durante una hora con una mezcla de TBME y 60 mi de heptano 7/3 p/p, se filtró y se secó al vacío.

Contenido: 88.1% HPLC g/g; pureza 95.2% (F)-HPLC y 1.8% (F)-HPLC D-Phg-Epímero. La resina de (resina de aminometil poliestireno (4-(Cloro(difenii)metil)benzoilo) se lavó tres veces con metanol y se secó puede volverse a utilizar. Purificación Para propósitos analíticos, los péptidos lineales se purificaron a través de cromatografía RP. Caracterización La estructura de una muestra analítica purificada a través de cromatografía RP se confirmó mediante FAB-MS, LC-MS, y datos NMR (DMSO en ppm, 1.16, 1.34, 1.55, 1.61, (3H), 1.66, 2.05, 2.20, 2.51, 2.83 (2H), 2.91, 2.96, 2.98, 3.02, 3.41, 3.78, 4.13, 4.61, 5.13, 5.51, 6.74, 6.83, 6.88, (2H), 7.01, (2H), 7.11 (2H), 7.38, 7.42 (2H), 7.49, 7.72, 8.01, 8.29, 8.48, 8.62, 8.75.) La configuración del aminoácido se determinó a través de análisis de aminoácido: el compuesto se hidrolizó bajo condiciones ácidas, se convirtió a derivados y la configuración de cada aminoácido individual se asignó a través de cromatografía de gas enantioselectiva/espectrometría de masas de ionización química. Una prueba adicional de la estructura es la conversión de los diferentes péptidos lineales para caracterizar bien el péptido cíclico.

Los siguiente compuestos se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento descrito. H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro- Phg-D~Trp(Boc)-OH; H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH H-(2S,4R)-4-(Boc- H-CH2-CH2-NH-CO-0)- Pro-Phg-D-Trp(Boc)Tyr(Bzl)-OH; H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-P g-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-OH; H-Tyr(Bzi)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-OH.

EJEMPLO 3 Ciclisación de los péptidos protegidos lineales para sintetizar Ciclor(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH CH7-NH-CO-0^-Pro-Phq-D-Trp(Boc)- Ciclisación de H-Phe~(2S,4R) -4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro- Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-OH Método de Azida Para la ciclisación, el fragmento lineal (2.5 g, 1.83 nnmoles) se disolvió en 391 mi de D F, se enfrió a -5o, se trató con EDIPA (0.47 g, 3.66 mmoles, 2 equivalentes) y DPPA (0.75 g, 2.75 mmoles, 1.5 equivalentes) y se agitó a temperatura ambiente hasta la terminación (aproximadamente, 20 horas). Se agregaron 391 mi de agua gota a gota a la mezcla de reacción, la precipitación se filtró y se lavó con agua hasta que no hubo azida detectable. Se obtuvieron 4.9 g sólido blanco húmedo en agua (Rf de HPLC idéntico a referencia), el cual se utilizó en la reacción de desprotección sin purificación adicional. El compuesto se caracterizó por comparación directa con un compuesto de referencia a través de HPLC.

Ciclisación de H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R) -4-(Boc-NH~CH2-CH2-NH-CO- 0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH a) Método HBTU a Para la ciclisación, el fragmento lineal (6.0 g, 3.5 mmoles) se disolvió en 780 mi de DMF, se enfrió a -5o, se trató con EDIPA (1.13 g, 8.75 mmoles, 2.5 equivalentes), HOBT (1.18 g, 8.75 mmoles, 2.5 equivalentes), HBTU (3.3 g, 8.78 mmoles, 25. equivalentes) y se agitó a temperatura ambiente hasta la terminación (aproximadamente, 2 horas). Se agregaron 391 mi de agua gota a gota a la mezcla de reacción a temperatura ambiente, la precipitación se filtró y se lavó con agua y heptano y se secó al vacío durante la noche. Se obtuvieron 5.4 g sólido amarillo blanco. El compuesto se caracterizó por comparación directa con un compuesto de referencia a través de HPLC. Contenido 55% p/p HPLC, pureza 78% (A%)-HPLC. b) Método HBTU b Para la ciclisación, el fragmento lineal (6.0 g, 4.16 mmoles) se disolvió en 60 mi de DMF se vació gota a gota en una mezcla de HOBT (4.15 g, 10.4 mmoles, 2.5 equivalentes), HBTU (4.15 g, 10.4 mmoles, 2.5 equivalentes) y EDIPA (1.41 g, 10.4 mmoles, 2.5 equivalentes) en 135 mi de DMF a -5o y se agitó a esa temperatura hasta la terminación (aproximadamente, 2 horas). Se agregaron 559 mi de agua gota a gota a la mezcla de reacción a temperatura ambiente, la precipitación se filtró y se lavó con agua y heptano y se secó al vacío durante la noche. Se obtuvo un sólido amarillo blanco. El compuesto se caracterizó por comparación directa con un compuesto de referencia a través de HPLC. Contenido 77% p/p HPLC, pureza 84% (A%)-HPLC. Los siguientes péptidos lineales se ciclizaron de acuerdo con el procedimiento anterior: H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-OH; H-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp-OH H-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-OH; H-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Try(Bzl)-OH; H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg- DTrp(Boc)-OH.

EJEMPLO 4 Síntesis de sal de ácido trif luoroacetico Ciclof f 2S.4R) -4-(Boc- NH-CH?-CH?-NH-CO-0)-Pro-Phq-D-Trp-Lvs-TyrfBzl)-Phe-1 Para la desprotección completa, el residuo (1.5 g, 0.79 mmoles) se disolvió a 0o en TFA/H20 95:5 (8.3 mi) la mezcla se agitó en frío durante 30 minutos. La mezcla de reacción fría se vació gota a gota en una mezcla de 29 mi de TBME y 13 mi de heptano a temperatura ambiente se agitó durante 2 horas. La precipitación se filtró, se lavó con TBME/Heptano 1:1 (p/p) y se secó al vacío. Se obtuvo un sólido de color beige, contenido 53% p/p HPLC, pureza: 79 (A%)-HPLC.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un compuesto de la fórmula en donde f¾! es alquileno de 2 a 6 átomos de carbono-NR3R4, alquileno de 2 a 6 átomos de carbono-guanidina, o alquileno de 2 a 6 átomos de carbono-COOH en donde cada uno de R3 y R4 es independientemente H, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, co~ idroxi-alquileno de 2 a 4 átomos de carbono o acilo o R3 y R4 forman junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos un grupo heterocíclico, el cual puede comprender un átomo heterogéneo adicional, y es Z-!-CHa-Rs, -CH-CO-0-CH2 5. en donde Zf es O o S y R5 es fenilo opcionalmente substituido, o una sal del mismo, que comprende la ciclización de un análogo de somatostatina lineal de la fórmula II H2N-CH-CO-P e-{4-(R1-NHCO-0)-Pro}-(D or DPhg-DTrpCR^ )-Lys(4-NHR12)-OH II CH2-R2 o la fórmula la fórmula IV H-{4-(R NHCO-0)-Pro}-(D or LJPhg-DTrpCR^ )-Lys(4-NHR12)-NH-9H-CO-Phe-OH en donde R-, y R2 son como se definieron, cada uno de Rf 1 y R12, independientemente, es un grupo protector amino, por lo que cuando R1 comprende un NH2 terminal, este NH2 terminal también está protegido por el grupo protector amino, y en donde la remoción requerida del grupo(s) protector, y la recuperación de un compuesto de la fórmula I de esta manera se obtiene en forma libre o en la forma de sal.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la ciciización de un análogo de somatostatina lineal de la fórmula II H2N-CH-CO-Phe-{4-(R1-NHCO-0)-Pro}-(D or L)Phg-DTrp(R11 )-Lys(4-NHR12)-OH ll CH2- 2 en donde R-) es -CH2-CH2-NR3R4, 2 es 4-benciloxi-fenilo, y R3, R4, R11 y R12 son como se definieron en la reivindicación 1, por lo cual R1 comprende un NH2 terminal, esta NH2 terminal también está protegida por un grupo protector amino, y en donde la remoción requerida del grupo(s) protector, y la recuperación de un compuesto de la fórmula I de esta manera se obtiene en forma libre o en la forma de sal en donde R-¡ es -CH2-CH2-NR3R4, R2 es 4-benciloxi-fenilo.

3. Un compuesto de la fórmula II H2N-CH-CO-Phe-{4-(R1-NHCO-0)-Pro}-(D or L)Phg-DTrp(R11 )-Lys(4-NHR12)-OH ll CH2-R2 o la fórmula III o la fórmula IV H-{4-(R1-NHCO-0)-Pro}-(D or L)Phg-DTrp(R11)-Lys(4-NHR12)-NH-CH-CO-Phe-OH H2-R2 en donde R y R2 son como se definieron en la reivindicación 1 , cada uno de R1( y R12, independientemente, es un grupo protector amino, por medio del cual cuando R1 comprende un NH2 terminal, este NH2 terminal también está protegido por el grupo protector amino, o una sal del mismo.

4. Un compuesto de la fórmula II de acuerdo con la reivindicación 3, en donde R-i es -CH2-CH2-NR3R4, R2 es 4-benciloxi-fenilo, y cada uno de R1¾ y R12, independientemente, es un grupo protector amino, por medio del cual cuando R comprende un NH2 terminal, este NH2 terminal también está protegido por el grupo protector amino, o una sal del mismo.

5. Un compuesto de la fórmula II de acuerdo con la reivindicación 3, que se selecciona de H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-DPhg-DTrp(Boc)-Lys(Boc)-OH, H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2-NH-CO-0)-Pro-Phg-DTrp-Lys(Boc)-OH y H-Tyr(Bzl)-Phe-(2S,4R)-4-(Boc-NH-CH2-CH2- H-CO-0)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)Lys(Boc)-OH o una sal del mismo.

6. Un procedimiento para la producción de un compuesto de la formula II, III o IV como se definió en la reivindicación 3, que comprende enlazar juntos a través de un enlace de amida dos unidades de péptido, cada uno de ellos contiene por lo menos un aminoácido en forma protegida o no protegida, en done la unión de amida está en tal forma que se obtiene la secuencia de aminoácido deseada según definida en la fórmula II, III o V, y en donde se requiere la remoción de por lo menos un grupo protector, y recuperar un compuesto de la fórmula II, III o IV de esta manera obtenido en forma libre o en forma de sal.