MXPA04010522A - Polipeptidos y vias biosinteticas. - Google Patents
Polipeptidos y vias biosinteticas.Info
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Abstract
Se describen los metodos y las composiciones que pueden ser utilizados para elaborar la monatina a partir de glucosa, triptofano, acido indol-3-lactico, indol-3-piruvato y acido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutarico. Se describen tambien los metodos para producir los intermediarios del indol-3-piruvato y el acido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutarico. Las composiciones proporcionadas incluyen moleculas de acido nucleico, polipeptidos, estructuras quimicas y celulas. Los metodos incluyen los procesos in vitro e in vivo, y los metodos in vitro incluyen las reacciones quimicas.
Description
POLIPEPTIDOS Y VIAS BIOSINTETICAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta descripción proporciona los polipéptidos y las vías biosintéticas que son útiles en la producción de indol-3-piruvato, ácido 2-hidroxi-2- ( indol-3-ilmetil ) -4-cetoglutárico (MP) y/o monatina. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Piruvato de indol El indol-3-piruvato es un antioxidante fuerte que se cree contra-ataca la tensión oxidativa en tejidos con altas concentraciones de oxigeno (Politi et al. "Recent advances in Tryptophan Research", editado por G.A. Filippini et al. Plenum Press, Nueva York, 1996, pp. 291-8) . El indol-piruvato o piruvato de indol también es un intermediario en una vía para producir el ácido indol acético (IAA) , la hormona auxina principal para el desarrollo de las plantas (factor de promoción de crecimiento difundible) . IAA es activo en cantidades de submicrogramos en una gama de procesos fisiológicos que incluyen dominancia apical, tropismos, alargamiento de las raices, inducción de la división de las células cambiales e iniciación de las raices. Las auxinas sintéticas son utilizadas en horticultura para inducir enraizamiento y para promover el establecimiento y desarrollo del fruto. A altas concentraciones las auxinas sintéticas son REF: 158373 herbicidas efectivos contra plantas de hoja ancha. Las auxinas naturales producidas por la fermentación pueden ser consideradas más ambientalmente amigables que los herbicidas químicamente producidos. Los reguladores del crecimiento tuvieron ventas mundiales en 1999 de 0.4 billones de libras (1.4 mil millones de dólares). Algunos ejemplos de patentes sobre el ácido indolacético y derivados del mismo incluyen: la Patente de los Estados Unidos No. 5,843,782: Micropropagación de plantas de rosa, auxina utilizada en medio de cultivo; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,952,231: Micropropagación de plantas de rosa. Además de las utilidades relacionadas a las plantas, el ácido indolacético es útil en aplicaciones farmacéuticas. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,173,497: "Método para la preparación de los ácidos alfa-oxopirrolo[2 , 3 -B]indol-acéticos y derivados" propone el uso de estos compuestos en el tratamiento del deterioro de la memoria tal como aquel asociado con enfermedad de Alzheimer y la demencia senil. El mecanismo propuesto en la Patente de los Estados Unidos No. 5,173,497 es que estos compuestos inhiben el polipéptido acetilcolinesterasa e incrementa los niveles de acetilcolina en el cerebro. El indol-3-carbinol es producido a partir del ácido indol-3-acético por la oxidación catalizada por la peroxidasa, y puede ser fácilmente convertido a diindolilmetano . Se reportan que ambos compuestos eliminan las toxinas y promueven la promoción de hormonas benéficas para la salud de las mujeres. Derivados de triptofa.no D-triptofano clorado ha sido identificado como un endulzante no nutritivo, y existe interés creciente en conseguir también otros derivados. La monatina es un endulzante natural que es similar en composición al aminoácido triptofano. Este puede ser extraído de las cortezas de las raíces de un arbusto de Sudáfrica, Sclerochiton ilicifolius, y es promisorio en la industria de los alimentos y bebidas como un endulzante de alta intensidad. Algunos ejemplos de patentes sobre monatina incluye: la Patente de los Estados Unidos No. 5994559 Síntesis de endulzante natural de alta intensidad monatina-A, Patente de los Estados Unidos No. 4975298 compuestos de 3- (1-amino-1, 3-dicarboxi-3-hidroxi-but-4-il) -indol, patente de los Estados Unidos No. 5128164 composición para el consumo humano que contiene los compuestos 3- (1-amino-l, 3 -dicarboxi-3 -hidroxi-but-4-il) -indol ; y la patente de los Estados Unidos No. 5128482 proceso para la producción de 3 -1 ( 1-amino-l , 3 -dicarboxi-3-hidroxi-but-4-il) indol . Algunos de los precursores de la monatina descritos en la presente pueden también ser útiles como endulzantes sintéticos o como intermediarios en la síntesis de derivados de mona na. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La descripción proporciona varias rutas biosintéticas para la elaboración de monatina a partir de glucosa, triptofano, ácido indol -3 -láctico y/o a través de los precursores de monatina tales como el indol -2 -piruvato y el 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4 -ceto-glutárico . Las secuencias de polipéptidos y de ácidos nucleicos que pueden ser utilizadas para elaborar la monatina, el indol-3-piruvato, y el ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-ceto-glutárico son también descritas. La monatina puede ser producida a través del indol -3-piruvato, el ácido 2-hidroxi-2- (indol -3 -ilmetil) -4-ceto-glutárico (precursor de monatina, MP, la forma alfa-ceto de la monatina) , el ácido indol-3-láctico, triptofano, y/o glucosa (FIG. 1) . Se describen los métodos para producir o elaborar la monatina o sus intermediarios mostrados en las FIGS. 1-3 y 11-13 que involucran la conversión de un sustrato a un primer producto, y luego la conversión del primer producto a un segundo producto y así sucesivamente, hasta que se crea el producto final deseado. Las FIGS. 1-3 y 11-13 muestran productos intermediarios potenciales y productos finales en cajas. Por ejemplo, una conversión de un producto a otro, tal como glucosa a triptofano, triptofano a indol-3 -piruvato, indol-3-piruvato a MP, MP a monatina o ácido indol-3-láctico (indol- lactato) a indol -3 -piruvato , puede ser realizado mediante el uso de estos métodos. Estas conversiones pueden ser facilitadas química o biológicamente. El término "convertir" se refiere al uso ya sea de medios químicos o de polipéptidos en una reacción que cambia un primer intermediario a un segundo intermediario. El término "conversión química" se refiere a las reacciones que no son activamente facilitadas por los polipéptidos. El término "conversión biológica" se refiere a las reacciones que son activamente facilitadas por los polipéptidos. Las conversiones pueden tener lugar in vivo o in vitro. Cuando se utilizan conversiones biológicas, los polipéptidos y/o las células pueden ser inmovilizados sobre soportes tales como mediante acoplamiento químico sobre soportes poliméricos. La conversión puede ser lograda utilizando cualquier reactor conocido para una persona de experiencia ordinaria en la técnica, por ejemplo en un reactor por lotes o en un reactor continuo. Son proporcionados también los métodos que incluyen poner en contacto un primer polipéptido con un sustrato y elaborando un primer producto, y luego poniendo en contacto el primer producto creado con un segundo polipéptido y creando un segundo producto, y luego poniendo en contacto el segundo creado, con un tercer polipéptido y creando un tercer producto, por ejemplo la monatina. Los polipéptidos utilizados y los productos producidos son mostrados en las FIGS. 1-3 y 11-13. Los polipéptidos, y sus secuencias de codificación, que pueden ser utilizados para revisar las conversiones mostradas en las FIGS. 1-3 y 11-13, son también descritos. En algunos ejemplos, los polipéptidos que tienen una o más mutaciones puntuales que permiten especificidad de sustrato y/o actividad de los polipéptidos que van a ser modificados, se utilizan para elaborar la monatina. Las células aisladas y recombinantes que producen la monatina son también descritas. Estas células pueden ser cualquier célula tal como una planta, animal, bacteria, levadura, alga, arqueobacterias o células de hongos. En un ejemplo particular, las células descritas incluyen una o más de las siguientes actividades, por ejemplo dos o más o tres o más de las siguientes actividades: triptofano-aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromático) -aminotransferasa (EC 2.6.1.5), aminotransferasa de sustratos múltiples (EC 2.6.1-), aspartato-aminotransferasa (EC 2.6.1.1), triptofano-deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato-transaminasa (EC 2.6.1.28), oxidasa de L-aminoácido (EC 1.4.3.2), triptofano-oxidasa (sin número EC, Hadar et al., J.
Bacteriol 125:1096-1104, 1976 y Furuya et al., Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), D-aminoácido deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D-aminoácido-oxidasa (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferasa (EC 2.6.1.21), sintasa/liasa (EC 4.1.3-), tal como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.17) o 4-hidroxi-2-oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.16), sintasa/liasa (4.1.2-), D-triptofano aminotransferasa (Kohiba y Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón 1990) , fenilalanina-deshidrogenasa (EC 1.4.1.20) y/o glu amato-deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) . En otro ejemplo más, las células incluyen uno o más, por ejemplo, dos o más, o tres o más, de las siguientes actividades: indol-lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.1110), R- 4-hidroxifenil-lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.222), 3- (4) -hidroxifenilpiruvato-reductasa (EC 1.1.1.237), lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol- 5-il) lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.111), lactato oxidasa (EC 1.1.3-), sintasa/liasa (4.1.3-) tal como 4-hidroxi-4-metil -2 -oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.17) o 4-hidroxi-2-oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.16), sintasa/liasa (4.1.2.-), triptofano-deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato-transaminasa (EC 2.6.1.28), triptofano-aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromático) - aminotransferasa (EC 2.6.1.5), aminotransferasa de sustratos múltiples (EC 2.6.1-), aspartato-aminotransferasa (EC 2.6.1.1), fenilalanina-deshidrogenasa - (EC 1.4.1.20), glutamato-deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), D- aminoácido-deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D- riptofano- aminotransferasa y/o D-alanina-aminotransferasa (EC 2.6.1.21) . Además, las células descritas pueden incluir uno o más de las siguientes actividades, por ejemplo dos o más o tres o más de las siguientes actividades: triptofano-aminotransferasa (EC 2.6.1.27), tirosina (aromático) -aminotransferasa (EC 2.6.1.5), aminotransferasa de sustratos múltiples (EC 2.6.1-), aspartato-aminotransferasa (EC 2.6.1.1), triptofano-deshidrogenasa (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato-transaminasa (EC 2.6.1.28), L-aminoácido-oxidasa (EC 1.4.3.2), triptofano-oxidasa (sin número EC) , D-aminoácido-deshidrogenasa (EC 1.4.99.1), D-aminoácido-oxidasa (EC 1.4.3.3), D-alanina-aminotransferasa (EC 2.6.1.21), indol-lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenil-lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.222), 3- (4) -hidroxifenilpiruvato-reductasa (EC 1.1.1.237), lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.111), lactato-oxidasa (EC 1.1.3.-), sintasa/liasa (4.1.3-), tal como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.17) o 4-hidroxi-2- oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.16), sintasa/liasa (4.2.1-), glutamato-deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanina-deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), y/o D-triptofano- aminotransferasa . La monatina puede ser producida mediante un método que incluye poner en contacto el triptofano y/o el ácido indol -3- láctico con un primer polipéptido, en donde el primer polipéptido convierte el triptofano y/o el ácido indol -3-láctico a indol -3 -piruvato (ya sea la forma D o la forma L del triptofano o el ácido indol-3-láctico puede ser utilizado como el sustrato que es convertido a indol-3 -piruvato; una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que los polipéptidos elegidos para este paso muestran idealmente la especificidad apropiada) , poniendo en contacto el indol-3-piruvato resultante con un segundo polipéptido, en donde el segundo polipéptido convierte el indol -3 -piruvato a ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4 -cetoglutárico (MP) , y poniendo en contacto el MP con un tercer polipéptido, en donde el tercer polipéptido convierte MP a monatina. Los polipéptidos ejemplares que pueden ser utilizados para estas conversiones son mostrados en las FIGS. 2 y 3. Otro aspecto más de la invención proporciona las composiciones tales como MP, las células que contienen al menos dos polipéptidos, o algunas veces al menos tres o al menos cuatro polipéptidos, que son codificados sobre al menos una secuencia exógena de ácido nucleico. Estos y otros aspectos de la descripción son aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y de los ejemplos ilustrativos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG.l muestra las vías biosintéticas utilizadas para producir la monatina y/o el indol -3 -piruvato . Una vía produce el indol -3 -piruvato vía el triptofano, mientras que otra más produce el indol 3 -piruvato vía el ácido indol -3-láctico. La monatina es subsecuentemente producida vía el intermediario de ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico (MP) . Los compuestos mostrados en recuadros son sustratos y productos producidos en las vías biosintéticas. Las composiciones adyacentes a las flechas son cofactores, o reactivos que pueden ser utilizados durante la conversión de un sustrato a un producto. El cofactor o el reactivo utilizado dependerá del polipéptido utilizado para el paso particular de la vía biosintética. El cofactor PLP (piridoxal-5 ' -fosfato) puede catalizar las reacciones independientemente de un polipéptido, y por lo tanto, al proporcionar meramente PLP puede permitir la progresión del sustrato hasta el producto. La FIG. 2 es un diagrama más detallado de la vía biosintética que utiliza el intermediario de MP. Los sustratos para cada paso en las vías son mostrados en los recuadros. Los polipéptidos que permiten la conversión entre los sustratos son listados adyacentemente a las flechas entre los sustratos. Cada polipéptido es descrito por su nombre común y en un número de clase enzimática (EC) . La FIG. 3 muestra un diagrama más detallado de la vía biosintética de la conversión del ácido indol-3 -láctico a indol-3-piruvato. Los sustratos son mostrados en recuadros, y los polipéptidos que permiten la conversión entre los sustratos son listados adyacentes a la flecha entre los sustratos. Cada polipéptido es descrito por su nombre común y un número de la clase enzimática (EC) . La FIG. 4 muestra una posible reacción para elaborar P por medios químicos . Las FIGS . 5A y 5B son cromatogramas que muestran la identificación por LC/MS de la monatina producida enzimáticamente . La FIG. 6 es un espectro de masa de electrorrocío de la monatina enzimáticamente sintetizada. Las FIGS. 7A y 7B muestran cromatogramas de los análisis de iones hijos por LC/MS/MS de la monatina producida en una mezcla enzimática. La FIG. 8 es un cromatograma que muestra la medición de masa de alta resolución de la monatina producida enzimáticamente.
Las FIGS. 9A-9C son cromatogramas que muestran la separación quiral de (A) R-triptofano, (B) S-triptofano, y (C) monatina producida enzimáticamente . La FIG. 10 es un diagrama de barras que muestra la cantidad relativa de la monatina producida en células bacterianas después de la inducción con IPTG. El signo (-) indica una falta de adición de sustrato (no se agregó triptofano o piruvato) . Las FIGS. 11-12 son diagramas esquemáticos que muestran las vías utilizadas para incrementar el rendimiento de la monatina producida a partir del triptofano o del indol-3 -piruvato . La FIG. 13 es un diagrama esquemático que muestra una vía que puede ser utilizada para incrementar el rendimiento de la monatina producida a partir del triptofano o del indol-3 -piruvato . LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos listadas en el listado de secuencias anexo, se muestran utilizando las abreviaturas de una sola letra estándares, para las bases nucleotídicas, y el código de tres letras para los aminoácidos . Únicamente una hebra de cada secuencia de ácido nucleido es mostrada, pero se entiende que la hebra complementaria es incluida por cualquier referencia a la hebra mostrada.
SEQ ID NOS. : 1 y 2 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una aminotransferasa de Sínorhizobium meliloti, respectivamente (el gen tatA, llamado una aminotransferasa de tirosina o aromático en la literatura) . SEQ ID NOS. : 3 y 4 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una tirosina-aminotransferasa de Rhodobacter sphaeroides (2.4.1), respectivamente (por homología con tatA (SEQ ID NOS. : 1 y 2) que se predice es una "aspartato-aminotransferasa" por software genómico. SEQ ID NOS.: 5 y 6 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una aminotransferasa de Rhodobacter sphaeroides (35053) , respectivamente (nuevo, clonado con base en 2.4.1 secuencia SEQ ID NOS.: 3 y 4) . SEQ ID NOS.: 7 y 8 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una aminotransferasa de amplios sustratos (bsat) proveniente de Leishmania major, respectivamente . SEQ ID NOS. : 9 y 10 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una aminotransferasa de aromático (araT) de Bacillus subtilis, respectivamente. SEQ ID NOS.: 11 y 12 muestran nuevas secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de una aromático-aminotransferasa (araT) de Lactobacillus amylovorus, respectivamente (por homología identificada como una aromático-aminotransferasa) . SEQ ID NOS. : 13 y 14 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de una aminotransferasa de sustratos múltiples (msa) proveniente de R. Sphaeroides (35053) , respectivamente (identificada como una aminotransferasa de sustratos múltiples por homología al No. de Acceso AAAE01000093.1 , pb 14743-16155 y No. de Acceso ZP00005082.1) . SEQ ID NOS.: 15 y 16 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de D-alanina-aminotransferasa (dat) de B. subtilis . SEQ ID NOS.: 17 y 18 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de tatA de S. eliloti. SEQ ID NOS.: 19 y 20 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de araT de B. subtilis. SEQ ID NOS.: 21 y 22 muestran cebadores utilizados para clonar las secuencias de aminotransferasa de sustratos múltiples de Rhodobacter sphaeroides (2.4.1. y 35053). SEQ ID NOS.: 23 y 24 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia bsat de Leishmania major. SEQ ID NOS.: 25 y 26 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de araT de Lactobacillus amylovorus.
SEQ ID NOS.: 27 y 28 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de tatA de R. Sphaeroides (ambas 2.4.1 y 35053) .
SEQ ID NOS.: 29 y 30 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de aspC de E. coli (secuencia de genes Genbank No. de Acceso: AE000195.1, secuencia de proteína Genbank No. de Acceso: AAC74014) . SEQ ID NOS. : 31 y 32 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la aromático-aminotransferasa (tyrB) de E. coli, respectivamente. SEQ ID NOS..- 33 y 34 muestran cebadores utilizados para clonar la secuencia de tyrB de E. coli. SEQ ID NOS.: 35-40 muestran cebadores utilizados para clonar los polipéptidos con actividad de 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (KHG) (EC 4.1.3.16) . SEQ ID NOS. : 41 y 42 muestran las secuencias de ácidos nucleicos de la triptofanasa (tna) de E. coli y tirosina-fenol -liasa (tpl) de Ci trobacter freundii que codifican para las proteínas P00913 (GI:401195) y P31013 (GI:401201), respectivamente . SEQ ID NOS. : 43-46 muestran cebadores utilizados para clonar los polipéptidos de triptofanasa y los polipéptidos de ß-tirosinasa (tirosina-fenol-liasa) . SEQ ID NOS.: 47-54 muestran cebadores utilizados para mutar los polipéptidos de triptofanasa y los polipéptidos de ß-tirosinasa . SEQ ID NOS.: 55-64 muestran cebadores utilizados para clonar los polipéptidos con actividad de 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.17). SEQ ID NOS. : 65 y 66 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (proA) de C. testosteroni , respectivamente . SEQ ID NOS.: 67-68 muestran cebadores utilizados para clonar la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (proA) de C. testosteroni en un operón con aspC de E. coli en pET30 Xa/LIC. SEQ ID NOS.: 69-72 muestran cebadores utilizados para clonar aspC de E. coli y proA de C. testosteroni en pESC-his.
SEQ ID NOS.: 73-74 muestran las secuencias agregadas al extremo 5' de los cebadores utilizados para clonar los genes descritos en la presente. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS DIVERSAS MODALIDADES Abreviaturas y términos Las siguientes explicaciones de los términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente descripción, y para guiar a aquellos de experiencia ordinaria en la técnica en la práctica de la presente descripción. Como se utiliza en la presente, "que comprende" significa "que incluye" y las zonas singulares "un" o "uno" o "una" o "el, la, los, las" incluyen las referencias plurales a no ser que el contexto lo dicte claramente de otro modo. Por ejemplo, la referencia a "que comprende una proteína" incluye una o una pluralidad de tales proteínas, y la referencia a "que comprende las células" incluye la referencia a una o más células equivalentes de las mismas conocidas por aquellos expertos en la técnica, y así sucesivamente. A no ser que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados que son comúnmente comprendidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser utilizados en la práctica o prueba de la presente descripción, se describen en seguida los métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean limitantes. Otras características y ventajas de la descripción - son aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones. ADNc (ADN complementario) : Una pieza de ADN que carece de los segmentos de no codificación, internos (intrones) y las secuencias reguladoras que determinan la transcripción. El ADNc puede ser sintetizado en el laboratorio mediante transcripción inversa del ARN mensajero extraído de las células . Sustitución conservadora: Una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, 2,5 ó 10 residuos) para los residuos de aminoácidos que tienen similares propiedades bioquímicas. Típicamente, las sustituciones conservadoras tienen poco o ningún impacto sobre la actividad de un polipéptido resultante. Por ejemplo, idealmente, un polipéptido de triptofano-aminotransferasa que incluye una o más sustituciones conservadoras conserva la actividad de triptofano-aminotransferasa . Puede ser producido un polipéptido para contener una o más sustituciones conservadoras mediante la manipulación de la secuencia de nucleótidos que codifica para ese polipéptido utilizando, por ejemplo, procedimientos estándares tales como la mutagénesis dirigida al sitio o PCR. Las variantes sustitucionales son aquellas en las cuales al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos ha sido removido y en su lugar ha sido insertado un residuo diferente. Los ejemplos de aminoácidos que pueden ser sustituidos por un aminoácido original en una proteína, y que son considerados como sustituciones conservadoras incluyen: Ala sustituida con ser o thr; arg sustituido con gln, his, o lys; asn sustituido con glu, gln, lys, his, asp; asp sustituido con asn, glu, o gln; cys sustituido con ser o ala; gln sustituido con asn, glu, lys, his, asp, o arg; glu sustituido con asn, gln lys o asp; gly sustituido con pro; his sustituido con asn, lys, gln, arg, tyr; ile sustituido con leu, met, val, phe; leu sustituido con ile, met , val, phe lys sustituido con asn, glu, gln, his, arg; met sustituido con ile, leu, val, phe; phe sustituido con trp, tyr, met, ile o leu; ser sustituido con thr, ala; thr sustituido con ser o ala; trp sustituido con phe, tyr; tyr sustituido con his, phe, o trp; y val sustituido con met, ile, leu. La información adicional respecto a las sustituciones conservadoras pueden ser encontradas en, entre otros sitios, Ben-Bassat et al., {J. Bacterial, 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., {Protein Sci. 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988, (WO 00/67796 (Curd et al), y en los libros de textos estándares de genética y biología molecular. Exógenos: El término "exógeno (a) " como se utiliza en la presente, con referencia al ácido nucleico y una célula particular, se refiere a cualquier ácido nucleico que no se origina de una célula particular como se encuentra en la naturaleza. De este modo, el ácido nucleico de origen natural es considerado como exógeno para una célula una vez que se introduce dentro de la célula. El ácido nucleico que es de origen natural puede ser también exógeno para una célula particular. Por ejemplo, un cromosoma completo aislado de una célula de la persona X es un ácido nucleico exógeno con respecto a una célula de la persona Y una vez que el cromosoma es introducido dentro de la célula de Y. Funcionalmente Equivalente: Que tiene una función equivalente. En el contexto de una enzima, las moléculas funcionalmente equivalentes incluyen diferentes moléculas que conservan la función de la enzima. Por ejemplo, los equivalentes funcionales pueden ser proporcionados por alteraciones en la secuencia en una secuencia enzimática, en donde el péptido con una o más alteraciones secuenciales conserva una función del péptido no alterado, tal que éste conserva su actividad enzimática. En un ejemplo particular, una triptofano-aminotransferasa funcionalmente equivalente conserva la habilidad para convertir el triptofano a indol-3-piruvato . Ejemplos de alteraciones de secuencias incluyen, pero no están limitados a, sustituciones conservadoras, supresiones, mutaciones, desplazamientos estructurales e inserciones. En un ejemplo, un polipéptido dado se enlaza a un anticuerpo, y un equivalente funcional es un polipéptido que se enlaza al mismo anticuerpo. De este modo, un equivalente funcional incluye los péptidos que tienen la misma especificidad de enlace que un polipéptido, y que puede ser utilizado como un reactivo en lugar del polipéptido. En un ejemplo, un equivalente funcional incluye un polipéptido donde la secuencia de enlace es discontinua, en donde el anticuerpo se enlaza a un epitopo lineal. De este modo, si la secuencia peptídica es MPELANDLGL (aminoácidos 1-10 de la SEQ ID No. : 12) un equivalente funcional incluye epitopos discontinuos, que pueden aparecer como sigue (** = cualquier número de aminoácidos de intervención) : NH2-**-][**p**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH. En este ejemplo, el polipéptido es funcionalmente equivalente a los aminoácidos 1-10 de la SEQ ID No. : 12 si la estructura tridimensional del polipéptido es tal que éste puede enlazarse a un anticuerpo monoclonal que se enlaza a los aminoácidos 1-10 de la SEQ ID No.: 12. Hibridación: El término "hibridación" como se utiliza en la presente se refiere a un método de prueba para la complementariedad en la secuencia nucleotídica de dos moléculas de ácido nucleico, con base en la habilidad de ADN y/o el ARN complementarios de una sola hebra, para formar una molécula dúplex. Las técnicas de hibridación en ácidos nucleicos pueden ser utilizados para obtener un ácido nucleico aislado dentro del alcance de la invención. En resumen, cualquier ácido nucleico que tenga alguna homología para una secuencia descrita en la SEQ ID No. : 11, puede ser utilizado como una sonda para identificar un ácido nucleico similar mediante hibridación bajo condiciones de exigencia moderada a alta. Una vez identificado, el ácido nucleico puede ser luego purificado, secuenciado y analizado para determinar si éste está dentro del alcance de la presente descripción. La hibridación puede ser realizada mediante el análisis de Southern o de Nothern, para identificar la secuencia de ADN o ARN respectivamente, que se híbrida a una sonda. La sonda puede ser marcada con una biotina, digoxigenina, un polipéptido, o un radioisótopo tal como 32P. El ADN o ARN que va a ser analizado puede ser electroforáticamente separado sobre un gel de agarosa o de poliacrilamida, transferido a nitrocelulosa , nailon u otra membrana adecuada, e hibridado con la sonda utilizando técnicas estándares bien conocidas en la técnica tales como aquellas descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al, (1989) Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY. Típicamente, una sonda es al menos de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, una sonda correspondiente a una secuencia contigua de 20 nucleótidos descrita en la SEQ ID No.: 11, puede ser utilizada para identificar un ácido nucleico idéntico o similar. Además, pueden ser utilizadas sondas más largas o más cortas de 20 nucleótidos. La descripción también proporciona las secuencias aisladas de ácido nucleico que son al menos de aproximadamente 12 bases de longitud (por ejemplo, al menos aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, ó 5000 bases de longitud) y se hibridan, bajo condiciones de hibridación, a la hebra en sentido o anti-sentido de un ácido nucleico que tiene la secuencia descrita en la SEQ ID No. : 11. Las condiciones de hibridación pueden ser condiciones dé hibridación moderada o altamente exigentes. Para fines de esta descripción, las condiciones de hibridación moderadamente exigentes significan que la hibridación es realizada aproximadamente a 42 °C en una solución de hibridación que contiene KP0 25 mM (pH 7.4), 5X SSC, 5X de solución de Denhart, 50 µg/mL de ADN sonicado desnaturalizado de esperma de salmón, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, y 1-15 ng/mL de la sonda (aproximadamente 5 x 107 cpm/µg) , mientras que los lavados son realizados aproximadamente a 50 °C con una solución de lavado que contiene 2X SSC y 0.1% de dodecilsulfato de sodio. Las condiciones de hibridación altamente exigentes significan que la hibridación es realizada aproximadamente a 42 °C en una solución de hibridación que contiene KP04 25 mM (pH 7.4), 5X SSC, 5X solución de Denhart, 50 µg/mL de ADN de esperma de salmón, sonicado, desnaturalizado, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano, y 1-15 ng/mL de la sonda (aproximadamente 5 x 107 cpm/µg) , mientras que los lavados son realizados aproximadamente a 65 °C con una solución de lavado que contiene 0.2X SSC y 0.1% de dodecilsulfato de sodio. Aislado: El término "aislado" como se utiliza en la presente, con referencia al ácido nucleico, se refiere a un ácido nucleico de origen natural que no está inmediatamente contiguo con ambas de las secuencias con las cuales éste está inmediatamente contiguo (uno sobre el extremo 5' y uno sobre el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del cual se deriva. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser, sin limitación, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, con la condición de que una de las secuencias de ácido nucleico normalmente encontradas inmediatamente flanqueando esa molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural, es removida o es ausente. De este modo, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación un ADN recombinante que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independientemente de otra secuencias, así como el ADN recombinante que es incorporado dentro de un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo un retrovirus, adenovirus o herpes virus) , o dentro del ADN genómico de un procariote o eucariote. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.
El término "aislado" como se utiliza en la presente con referencia al ácido nucleico, también incluye cualquier ácido nucleico de origen no natural, ya que las secuencias de ácido nucleico de origen no natural no son encontradas en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma de origen natural. Por ejemplo, el ácido nucleico de origen natural tal como un ácido nucleico manipulado por ingeniería genética es considerado como ácido nucleico aislado. El ácido nucleico manipulado por ingeniería genética puede ser elaborado utilizando clonación molecular común o técnicas de síntesis químicas de ácidos nucleicos. El ácido nucleico de origen no natural, aislado, puede estar independiente de otras secuencias, o estar incorporado dentro de un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus, o herpes virus) o el ADN genómico de un procariote o eucariote. Además, el ácido nucleico de origen no natural puede incluir una molécula de ácido nucleico que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión. Será aparente para aquellos expertos en la técnica que un ácido nucleico existente entre los cientos a millones de otras moléculas de ácido nucleico, dentro, por ejemplo, de las bibliotecas de ADNc o bibliotecas genómicas, o rebanadas de gel que contienen una digestión de restricción de ADN genómico, no ha de ser considerado un ácido nucleico aislado.
Ácido nucleico: El término "ácido nucleico" como se utiliza en la presente abarca el ARN y el ADN incluyendo, sin limitación, ADNc, ADN genómico, y ADN sintético (por ejemplo, químicamente sintetizado) . El ácido nucleico puede ser de doble hebra o de hebra simple. Donde es de hebra simple, el ácido nucleico puede ser la hebra en sentido o la hebra antisentido. Además, el ácido nucleico puede ser circular o lineal . Operablemente enlazada: Una primera secuencia de ácido nucleico está "operablemente enlazada" con una segunda secuencia de ácido nucleico siempre que la primera secuencia de ácido nucleico sea colocado en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción de la secuencia de codificación. En general, las secuencias de ADN operablemente enlazada están contiguas y, donde sea necesaria unen dos regiones de codificación de polipéptidos, en la misma estructura de lectura. Modificaciones de Péptido: La presente descripción incluye enzimas, así como las modalidades sintéticas de las mismas. Además, los análogos (moléculas orgánicas no peptídicas) , derivados (moléculas peptídicas químicamente funcionalizadas obtenidas comenzando con las secuencias peptídicas descritas) y las variantes (homólogos) que tienen la actividad enzimática deseada pueden ser utilizadas en los métodos descritos en la presente. Los péptidos descritos en la presente incluyen una secuencia de aminoácidos, que puede ser ya sea los L- y/o D-aminoácidos , de origen natural y de otro modo. Los péptidos pueden ser modificados por una variedad de técnicas químicas para producir derivados peptídicos que tienen esencialmente la misma actividad que los péptidos no modificados y que tienen opcionalmente otras propiedades deseables. Por ejemplo, los grupos de ácidos carboxílico de la proteína, ya sea carboxilo-terminal o de cadena lateral, pueden ser proporcionados en la forma de una sal de un catión farmacéuticamente aceptable, o esterificados para formar un éster de 1 a 16 átomos de carbono, o convertidos a una amida de la fórmula NR1R2 en donde Rl y R2 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo de 1 a 16 átomos de carbono, o combinados para formar un anillo heterocíclico, tal como un anillo de 5 ó 6 miembros. Los grupos amino del péptido, ya sea amino-terminal o de' cadena lateral, pueden estar en la forma de una sal por adición del ácido farmacéuticamente aceptable, tal como las sales orgánicas de los ácidos acético, benzoico, toluensulfónico, maleico, tartárico, y otras sales orgánicas, o pueden ser modificados a alquilo de 1 a 6 átomos de carbono o dialquilamino o convertidos posteriormente a una amida.
Los grupos hidroxilo de las cadenas laterales de los péptidos pueden ser convertidos a alcoxi de 1 a 16 átomos de carbono o un éster de 1 a 16 átomos de carbono utilizando técnicas bien reconocidas. Los anillos del fenilo y fenólicos de las cadenas laterales de los péptidos pueden ser sustituidos con uno o más átomos de halógeno, tales como flúor, cloro, bromo o yodo, o con alquilo de 1 a 16 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 16 átomos de carbono, ácidos carboxílicos y ésteres de los mismos, o amidas de tales ácidos carboxílicos. Los grupos metileno de las cadenas laterales peptídicas pueden ser extendidos a alquílenos homólogos de 2 a 4 átomos de carbono. Los tioles pueden ser protegidos con cualquiera de un número de grupos protectores bien reconocidos tales como los grupos acetamida. Aquellos expertos en la técnica también reconocen los métodos para introducir estructuras cíclicas dentro de los péptidos de esta descripción para seleccionar y proporcionar constreñimientos conformacionales a la estructura, que dan como resultado estabilidad aumentada. Por ejemplo, una cisteína C- o N-terminal puede ser agregada al péptido, de modo que cuando se oxida el péptido contendrá un enlace disulfuro, generando un péptido cíclico. Otros métodos de ciclización de péptidos incluyen la formación de tioéteres y amidas y ésteres carboxilo- y amino-terminales . Las modalidades peptidomiméticas y organomiméticas están también dentro del alcance de la presente descripción, con lo cual el arreglo tridimensional de los constituyentes químicos de tales péptidos- y organomiméticos imitan el arreglo tridimensional de la cadena principal peptxdica y las cadenas laterales de los aminoácidos componentes, dando como resultado tales péptidos- y organomiméticos de las proteínas de esta descripción, que tienen actividad enzimática detectable. Para aplicaciones de modelación en computadora, un farmacóforo es una definición tridimensional idealizada de los requerimientos estructurales para la actividad biológica. Los péptidos- y organomiméticos pueden ser diseñados para ajustar cada farmacóforo con el software de modulación por computadora actual (utilizando el diseño de fármacos ayudado por computadora o CADD) . Ver Walters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs" , en Klegerman & Gorves (eds) , Pharmaceutical Biotechnology, 1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp. 165-74 y Ch. 102 en Munson (ed) , Principies of Pharmacology, 1995, Chapman & Hall, para descripciones de las técnicas utilizadas en CADD. También incluidos dentro del alcance de las descripciones están los miméticos preparados utilizando tales técnicas. En un ejemplo, un mimético imita la actividad enzimática generada por una enzima o una variante, fragmento o fusión de la misma. Sondas y cebadores: Las sondas y cebadores de ácido nucleico pueden ser preparadas fácilmente con base en las secuencias de aminoácidos y en las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la presente. Una "sonda" incluye un ácido nucleico aislado que contiene un marcador detectable o una molécula reportera. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no están limitados a, isótopos radioactivos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, y polipéptidos . Los métodos para la marcación y guía en la elección de los marcadores apropiados para diversos propósitos en, por ejemplo, Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. ed. , vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, y Ausubel et al (ed) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and iley-Interscience, Nueva York (con actualizaciones periódicas), 1987. Los "cebadores" son típicamente moléculas de ácido nucleico que tienen diez o más nucleótidos (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que tienen entre aproximadamente 10 nucleótidos y aproximadamente 100 nucleótidos) . Un cebador puede ser recocido a una hebra complementaria de ácido nucleico objetivo mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ácido nucleico objetivo y luego extendido a lo largo de la hebra de ácido nucleico objetivo mediante, por ejemplo, una ADN-polimerasa polipeptídica . Los pares de cebadores pueden ser utilizados para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y otros métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica. Los métodos para preparar y utilizar las sondas y los cebadores se describen, por ejemplo, en las referencias tales como Sambrook et al. (ed) , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed. , vol, 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989; Ausubel et al. (ed) , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (con actualizaciones periódicas), 1987; e Innis et al. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares de cebadores de PCR pueden ser derivados de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante le uso de programas de computadoras destinados para ese propósito tales como Primer (Versión 0.5, ® 1991, hitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass) . Una persona de experiencia en la técnica apreciará que la especificidad de una sonda o cebador particular se incrementa con la longitud, pero que una sonda o cebador puede estar en el intervalo de tamaño de una secuencia de longitud completa hasta secuencias tan cortas como de cinco nucleótidos consecutivos. De este modo, por ejemplo, un cebador de 20 nucleótidos consecutivos puede recocerse a un objetivo con una mayor especificidad que un cebador correspondiente únicamente de 15 nucleótidos. De este modo, con el fin de obtener mayor especificidad, las sondas y cebadores pueden ser seleccionados los cuales comprenden, por ejemplo, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 100 , 150 , 200, 250, 300, 350, 400, 450 , 500, 550,
600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100,
1150 , 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600,
1650 , 1700, 1750 , 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150,
2200 , 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650,
2700 , 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200,
3250 , 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700,
3750 , 3800, 3850 , 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250,
4300 , 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750,
4800 , 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300,
5350. , 5400, 5450, o más nucleótidos consecutivos. Promotor: Un arreglo de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de ácido nucleico. Un promotor incluye las secuencias necesarias de ácido nucleico cercanas al sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso de un promotor tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor puede incluir el aumentador distal o los elementos represores que pueden ser localizados tanto como a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Purificado: El término "purificado (a) " como se utiliza en la presente no requiere pureza absoluta; más bien, se pretende que éste sea un término relativo. De este modo, por ejemplo, una preparación purificada de polipeptido o de ácido nucleico puede ser una en la cual el polipeptido o ácido nucleido de interés, respectivamente, está a una mayor concentración que el polipeptido o ácido nucleico estaría en su ambiente natural dentro de un organismo. Por ejemplo, una preparación polipeptídica puede ser considerada purificada si el contenido de polipéptido en la preparación representa al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ó 99% del contenido total de proteína de la preparación. Recombinante : Un ácido nucleico "recombinante" es uno que tiene (1) una secuencia que no es de origen natural en el organismo en el cual se expresa o (2) una secuencia elaborada mediante una combinación artificial de dos secuencias más cortas, de otro modo separadas. Esta combinación artificial es frecuentemente lograda mediante síntesis química o más comúnmente, por manipulación artificial de los segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" se utiliza también para describir las moléculas de ácido nucleico que han sido artificialmente manipuladas, pero que contienen las mismas secuencias reguladoras y las regiones de codificación que son encontradas en el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico. Identidad Secuencial : La similitud entre las secuencias de aminoácidos es expresada en términos de la similitud entre las secuencias, de otro modo denominada como la identidad secuencial. La identidad secuencial es frecuentemente medida en términos de la identidad porcentual (o similitud u homología) ; entre mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos o variantes de un péptido, tal como SEQ ID No.: 12, poseen un grado relativamente alto de identidad secuencial cuando se alinean utilizando métodos estándares. Los métodos de alineamiento de las secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineamiento se describe en: Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman y unsch, J". Mol. Biol. 48:443-53, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85:2444-8, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237-44, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90, 1988; y Altschul et al., iVature Genet. 6:119-29, 1994. La Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica de NCBI (BLASTMR) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para la Información en Biotecnología (NCI, Bethesda, MD) y en la Internet, para el uso en conexión con los programas de análisis secuencial, blastp, blastn, blastx, tbalstn y tblastx. Las variantes de un péptido son típicamente caracterizadas por posesión de al menos 50% de identidad secuencial contada sobre el alineamiento de longitud completa con la secuencia de aminoácidos utilizando NCBI Blast 2.0, blastp con espacios vacíos, ajustado a los parámetros por omisión. Para comparaciones de las secuencias de aminoácidos de más de 30 aminoácidos, la función de secuencias Blast 2 es empleada utilizando la matriz BLOSUM62 por omisión, ajustada a los parámetros por emisión (existencia de espacio vacío costo de 11, y por un espacio vacío de residuo costo de 1) . Cuando se alinean los péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos) el alineamiento es realizado utilizando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 ajustada a los parámetros por omisión (penalidades de 9 por espacio vacío abierto, de 1 por espacio vacío de extensión) . Las proteínas con similitud aún mayor a las secuencias de referencia mostrarán identidades porcentuales cada vez mayores cuando se evalúen mediante este método, tal como al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o incluso al menos 99% de identidad secuencial . Cuando menos de la secuencia completa está siendo comparada para la identidad secuencial, los homólogos y variantes típicamente poseerán al menos 80% de identidad secuencial sobre ventanas cortas de 10-20 aminoácidos, y pueden poseer identidades secuenciales de al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% ó 98%, dependiendo de su similitud a la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad secuencial sobre tales ventanas cortas, se describen en el sitio de la red que es mantenido por el Centro Nacional para la Información en Biotecnología en Bethesda, Maryland. Una persona de experiencia en la técnica apreciará que estos intervalos de identidad secuencial son proporcionados para guía únicamente; es completamente posible que podrían ser obtenidos homólogos fuertemente significativos que caigan fuera de los intervalos proporcionados . Pueden ser utilizados métodos similares para determinar la identidad porcentual de la secuencia de una secuencia de ácido nucleido. En un ejemplo particular, una secuencia homologa es alineada a una secuencia nativa, y el número de concordancias es determinado por el conteo de número de posiciones donde un nucleótido o residuo de aminoácido idéntico es presentado en ambas frecuencias. La identidad secuencial porcentual es determinada al dividir el número de concordancias ya sea entre la longitud de la secuencia descrita en la secuencia identificada (por ejemplo, SEQ ID No. : 11) , o por una longitud articulada (por ejemplo, 100 nucleótidos consecutivos o residuos de aminoácidos provenientes de una secuencia descrita en una secuencia identi icada) , seguido por la multiplicación del valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que tienen 1166 concordancias cuando se alinea con la secuencia descrita en la SEQ ID No.: 11 es 75.0 por ciento idéntica a la secuencia descrita en la SEQ ID No.: 11 (por ejemplo, 1166+1554*100=75.0). Se nota que el valor de identidad secuencial porcentual es redondeado al décimo más cercano. Por ejemplo, 75.11, 75.12, 75.13 y 75.14 se redondean a 75.1, mientras que 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 y 75.19 se redondean hasta 75.2. Se nota también que el valor de longitud será siempre un número entero. En otro ejemplo más, una secuencia objetivo que contiene una región de 20 nucleótidos que se alinea con 20 nucleótidos consecutivos provenientes de una secuencia identificada como sigue, contiene una región que comparte 75% de identidad secuencial a aquella secuencia identificada (por ejemplo, 15+20*100-75) . 1 20 Secuencia objetivo: AGGTCGTGTACTGTCAGTCA
Secuencia de identidad: ACGTGGTGAACTGCCAGTGA
Agente de enlace especifico: Un agente que es capaz de enlazarse específicamente a cualquier polipéptido descrito en la presente. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales humanizados), y fragmentos de anticuerpos monoclonales tales como Fab, F(ab')2/ y Fv así como cualquier agente capaz de enlazarse específicamente a un epitopo de tales polipéptidos . Los anticuerpos para los polipéptidos proporcionados en la presente (o fragmentos, variantes o fusiones de los mismos) pueden ser utilizados para purificar o identificar tales polipéptidos. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos proporcionadas en la presente permiten la producción de agentes de enlace basados en anticuerpo específico, que reconocen los polipéptidos descritos en la presente . Los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden ser producidos para los polipéptidos, porciones de los polipéptidos o variantes de los mismos. Óptimamente, los anticuerpos producidos contra uno o más epitopos sobre un antígeno polinucleotídico detectarán específicamente ese polipéptido. Es decir, los anticuerpos producidos contra un polipéptido particular, podrían reconocer y enlazarse a ese polipéptido particular, y podrían sustancialmente no reconocer o no enlazarse a otros polipéptidos. La determinación de que un anticuerpo se enlaza específicamente a un polipéptido particular, es realizada mediante cualquiera de un número de métodos de inmunoensayos estándares; por ejemplo, transferencia de Western (Ver, por ejemplo, Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2a. ed. , vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) .
Para determinar que una preparación dada de anticuerpo (tal como una preparación producida en un ratón contra un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID No . : 12) detecta específicamente el polipéptido apropiado (por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID No. : 12) mediante transferencia de Western, la proteína celular total puede ser extraída de las células y separada mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida . La proteína celular total separada puede ser luego transferida a una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa) , y la preparación de anticuerpo incubada con la membrana. Después de lavar la membrana para eliminar los anticuerpos no específicamente enlazados, la presencia de los anticuerpos específicamente enlazados puede ser detectada utilizando un anticuerpo secundario apropiado (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón) conjugado a un polipéptido tal como la fosfatasa alcalina (ya que la aplicación de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3 -indolilo/nitro azul de tetrazolio da como resultado la producción de un compuesto densamente coloreado de azul por la fosfatasa alcalina inmunolocalizada . Los polipéptidos sustancialmente puros, adecuados para el uso como un inmunógeno pueden ser obtenidos de las células transfectadas, las células transformadas o las células de tipo silvestre. Las concentraciones de polipéptidos en la preparación final pueden ser ajustadas, por ejemplo, mediante concentración sobre un dispositivo de filtro Amicon, al nivel de unos pocos microgramos por mililitro. Además, los polipéptidos en el intervalo de tamaño de los polipéptidos de longitud completa hasta polipéptidos que tienen tan pocos como nueve residuos de aminoácidos, pueden ser utilizados como inmunógenos. Tales como polipéptidos pueden ser producidos en el cultivo celular, pueden ser sintetizados químicamente utilizando métodos estándares, o pueden ser obtenidos mediante la escisión de los polipéptidos grandes en polipéptidos más pequeños que pueden ser purificados. Los polipéptidos que tienen tan pocos como nueve residuos de aminoácidos de longitud pueden ser inmunogénicos cuando son presentados a un sistema inmune en el contexto de una molécula de Complejo Mayor de Histocompatibilidad ( HC) tal como la molécula MHC de la clase I o MHC de la clase II . En consecuencia, los polipéptidos que tienen al menos, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, o más residuos de aminoácidos consecutivos de cualquier secuencia de aminoácidos descrita en la presente pueden ser utilizados como inmunógenos para producir anticuerpos . Los anticuerpos monoclonales para cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente, pueden ser preparados a partir de hibridomas murinos de acuerdo al método clásico de Kohler y Milstein (Nature 256:495-7, 1975) o un método derivado del mismo. El antisuero policlonal que contienen anticuerpos para los epitopos heterogéneos de cualquier polipéptido descrito en la presente, puede ser preparado mediante la inmunización de animales adecuados con el polipéptido (o fragmento del mismo) , que puede ser no modificado o modificado para aumentar la inmunogenicidad . Un protocolo efectivo de inmunización para conejos puede ser encontrado en Vaitukaitis et al. (J. Clin. Endocrinol . Metab. 33:988-91, 1971). Se puede utilizar fragmentos de anticuerpo en lugar de anticuerpos completos, y pueden ser fácilmente expresados en células hospederas procarióticas . Los métodos para elaborar y utilizar porciones inmunológicamente efectivas de anticuerpos monoclonales, también denominadas como "fragmentos de anticuerpo" son bien conocidos e incluyen aquellos descritos en Better y Horowitz Metods Enzymol . 178:476-96, 1989), Glockshuber et al., (Bioche istry 29:1362-7, 1990), Patente de los Estados Unidos No. 5,648,237 ("Expresión de Fragmentos Funcionales de Anticuerpo"), Patente de los Estados unidos No. 4,946,778 ("moléculas que se Enlazan a la Cadena Polipeptídica Simple"), Patente de los Estados Unidos No. 5,455,030 ("inmunoterapia Utilizando Moléculas que se Enlazan a Polipéptidos de Cadena Simple"), y referencias citadas éstas . Transformada: Una célula "transformada" es una célula dentro de la cual ha sido introducida una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, mediante técnicas de biología molecular. La transformación abarca todas las técnicas mediante las cuales una molécula de ácido nucleico pueda ser introducida dentro de tal célula incluyendo, sin limitación, la transfección con un vector viral, la conjugación, la transformación con un vector plasmídico, y la introducción de ADN desnudo mediante electroporación, lipofección y aceleración de pistolas de partículas. Variantes, fragmentos o proteínas de fusión: Las proteínas descritas, incluyen variantes, fragmentos y fusiones de las mismas. Las secuencias de ADN (por ejemplo SEQ ID No. : 11) que codifican para una proteína (por ejemplo SEQ ID No.: 12), la proteína de fusión o un fragmento o variante de una proteína, pueden ser manipuladas mediante ingeniería genética para permitir que la proteína sea expresada en células eucarióticas , bacterias, insectos y/o plantas. Para obtener la expresión, la secuencia de ADN puede ser alterada y operablemente enlazada a otras secuencias reguladoras. El producto final, el cual contiene las secuencias reguladoras y la proteína, es denominado como un vector. Este vector puede ser introducido dentro de células eucarióticas, bacterianas, de insecto y/o células vegetales. Una vez dentro de la célula el vector permite que la proteína sea producida. Una proteína de fusión que incluye una proteína, tal como una triptofano-aminotransferasa (o variante, polimorfismo, mutante o fragmento de la misma) , por ejemplo, la SEQ ID No.: 12, enlazada a otras secuencias de aminoácidos que no inhiben la actividad deseada de la proteína, por ejemplo la habilidad para convertir el triptofano a indol-3-piruvato. En un ejemplo, las otras secuencias de aminoácidos no son mayores de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 25, 30 ó 50 aminoácidos de longitud. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que una secuencia de ADN puede ser alterada de numerosas formas sin afectar la actividad biológica de la proteína conjugada. Por ejemplo, puede ser utilizada PCR para producir variaciones en la secuencia de ADN que codifica para una proteína. Tales variantes pueden ser variantes optimizadas para preferencia de codón en una célula hospedera utilizada para expresar la proteína, u otros cambios en la secuencia que faciliten la expresión. Vector: Una molécula de ácido nucleico como es introducida dentro de una célula, con lo cual se produce una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permitan replicarse dentro de la célula, tal como un origen de replicación. Un vector puede también incluir uno o más genes marcadores seleccionarles y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Panorama General de la Vías Biosintéticas Como se muestra en las FIGS . 1-3 y 11-13, pueden ser utilizadas muchas vías biosintéticas para producir la monatina o sus intermediarios tales como el indol-3 -piruvato o el MP. Para la conversión, de cada sustrato (glucosa, triptofano, ácido indol-3-acético, indol-3 -piruvato, y MP) a cada producto (triptofano, indol-3 -piruvato, MP y monatina) pueden ser utilizados varios polipéptidos diferentes. Además, estas reacciones pueden ser llevadas a cabo in vivo, in vitro o a través de una combinación de reacciones in vivo y reacciones in vitro tales como las reacciones in vitro que incluyen las reacciones químicas no enzimáticas. Por lo tanto, las FIGS. 1-3 y 11-13 son ejemplares y muestran diferentes y múltiples vías que pueden ser utilizadas para obtener los productos deseados . Glucosa a Triptofano Muchos organismos pueden sintetizar triptofano a partir de glucosa. La o las construcciones que contienen el o los genes necesarios para producir monatina, MP, y/o indol-3-piruvato a partir de la glucosa y/o el triptofano, pueden ser clonadas dentro de tales organismos. Se muestra en la presente que el triptofano puede ser convertido a monatina.
En otros ejemplos, un organismo es manipulado mediante ingeniería genética utilizando los polipéptidos conocidos para producir triptofano, o sobreproducir triptofano. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,371,614 (incorporada por referencia en la presente) describe una cepa de E. coli transformada con un plásmido que contiene un operón de triptofano de tipo silvestre. Los títulos máximos del triptofano descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,371, S14 son de aproximadamente 230 ppm. Similármente , el documento WO 8701130 (incorporado por referencia en la presente) describe una cepa de E. coli que ha sido genéticamente manipulada por ingeniería para producir triptofano y discute la producción fermentativa cada vez mayor del L-triptofano . Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los organismos capaces de producir triptofano a partir de la glucosa son también capaces de utilizar otras fuentes de carbono y energía que pueden ser convertidos a glucosa o fructosa-6-fosfato, con resultados similares. Las fuentes de carbono y de energía ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, sucrosa, fructosa, almidón, celulosa o glicerol. Triptofano a Indol-3-piruvato Se pueden utilizar varios polipéptidos para convertir el triptofano a indol -3 -piruvato . Los polipéptidos ejemplares incluyen los miembros de las clases de enzimas (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1. y 2.6.1.21. Estas clases incluyen los polipéptidos denominados triptofano-aminotransferasa (también denominada L-fenilalanina-2 -oxoglutarato-aminotransferasa, triptofano-transaminasa, transaminasa 5-hidroxitriptofan-cetoglutárica, hidroxitriptofano-aminotransferasa , L-triptofano-aminotransferasa, L-triptofano-transaminasa, y L-triptofano-2-oxoglutarato-aminotransferasa) que convierte en L-triptofano y el 2 -oxoglutarato a indol -3 -piruvato y L-glutamato; la D-triptofano-aminotransferasa que convierte el D-triptofano y un 2-oxoácido a indol-3 -piruvato y un aminoácido; la triptof no-deshidrogenasa (también denominada NAD(P) -L-triptofano-deshidrogenasa, L-triptofano-deshidrogenasa, L-Trp-deshidrogenasa, TDH y L-triptofano :NAD (P) oxidorreductasa (desaminación) que convierte el L-triptofano y el NAD(P) a indol-3 -piruvato y NH3 y NAD (P) H; la deshidrogenasa del D-aminoácido que convierte los D-aminoácidos y FAD a indol-3 -piruvato y H3 y FADH2; la triptofano-fenilpiruvato-transaminasa (también denominada L-triptofano-ot-cetoisocaproato-aminotransferasa y L-triptofano-fenilpiruvato-aminotransferasa) que convierte el L-triptofano y el fenilpiruvato a indol-3-piruvato y L-fenilalanina; la oxidasa del L-aminoácido (también denominada como oxidasa de ofio-amino-ácido, y oxidorreductasa de L-aminoácido : oxígeno (desaminación) ) que convierte un L-aminoácido y H20 y 02 a un 2-oxoácido y NH3 y H202; La oxidasa de D-aminoácido (también denominada como oxidasa de ofio-aminoácido y oxidorreductasa de D-aminoácido : oxigeno (desaminación)) que convierte un D-aminoácido y H20 y 02 a un 2-oxoácido y NH3 y H202 y la triptofano-oxidasa que convierte el L-triptofano y el H20 y 02 a indol-3-piruvato y H3 y H202. Estas clases también contienen la tirosina (aromático) -aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa , D-aminoácido- (o D-alanina) -aminotransferasa, y la aminotransferasa amplia (de sustrato múltiple) las cuales tienen múltiples actividades de aminotransferasa, algunas de las cuales pueden convertir el triptofano y un 2-oxoácido a indol-3-piruvato y un aminoácido . Once miembros de la clase de aminotransferasa que tienen tal actividad son descritos más adelante en el Ejemplo 1, incluyendo una novedosa aminotransferasa mostrada en la SEQ ID Nos.: 11 y 12. Por lo tanto, esta descripción proporciona las secuencias aisladas de ácido nucleico y de proteína que tienen al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o incluso al menos 99%, de identidad secuencial a la SEQ ID No.: 11 y 12. También abarcados por esta descripción están los fragmentos y las fusiones de la SEQ ID Nos. : 11 y 12 que conservan actividad de aminotransferasa o codifican para una proteína que tiene actividad de aminotransferasa . Los fragmentos ejemplares incluyen, pero no están limitados al menos a 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 ó 100 nucleótidos contiguos de la SEQ ID No.: 11 o al menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ó 350 aminoácidos contiguos de la SEQ ID No.: 12. Las secuencias descritas (y las variantes, fragmentos y fusiones de las mismas) pueden ser parte de un vector. El vector puede ser utilizado para transformar células hospederas, con lo cual se producen células recombinantes que pueden producir indol -3-piruvato a partir de triptofano, y en algunos ejemplos pueden producir además MP y/o monatina. Son conocidas las L-aminoácido-oxidasas (1.4.3.2) y las secuencias pueden ser aisladas a partir de varias diferentes fuentes, tales como Vípera lebetine (sp P81375) , Ophiophagus hannah (sp P81383) , Agkistrodon rhodostoma (sp P81382) , Crotalus atrox (sp P56742) , Burkholderia cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas renhardtii , Mus usculus, Pseudomonas syringae, y Rhodococcus str. Además, las triptof no-oxidasa son descritas en la literatura y pueden ser aisladas, por ejemplo, de Coprinus sp. SF-1, la col china con enfermedad de raíz en forma de cachiporra, Arabidopsis thaliana, e hígado de mamífero. Un miembro de la clase de L-aminoácido-oxidasa que puede convertir el triptofano a indol-3 -piruvato se discute más adelante en el Ejemplo 3, así como las fuentes alternativas para la clonación molecular. Muchos genes de la D-aminoácido-oxidasa son disponibles en las bases de datos para la clonación molecular. Son conocidas las triptofano-deshidrogenasas , y pueden ser aisladas por ejemplo, de la espinaca, Pisum sativum, Prosopis juliflora, chícharo, mesquite, trigo, maíz, tomate, tabaco, Chromobacterium violaceum, y lactobacilos . Son conocidas muchas secuencias del gen de la D-aminoácido-deshidrogenasa . Como se muestra en las FIGS. 11-13, si se utiliza una aminoácido-oxidasa tal como la triptofano-oxidasa para convertir el triptofano a indol-3-piruvato, puede ser agregada catalasa para reducir o incluso eliminar la presencia del peróxido de hidrógeno. Indol-3-lactato a Indol-3 -piruvato La reacción que convierte el indol-3-lactato a indol-3 -piruvato puede ser catalizada por una variedad de polipéptidos , tales como los miembros de las clases 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.-, o 1.1.1.111. La clase 1.1.1.110 de los polipéptidos incluye las indol-lactato-deshidrogenasas (también denominado ácido indolacético :NAD+-oxidorreductasa) . Las clases 1.1.1.27, 1.1.1.28 y 1.1.2.3 incluyen las lactato-deshidrogenasas (también denominadas deshidrogenasas de ácido láctico, lactato :NAD+-oxidorreductasa) . La clase 1.1.1.222 que contiene la (R) -4 -hidroxifenil-lactato-deshidrogenasa (también denominada deshidrogenasa de lactato-D-aromático, deshidrogenasa de lactato-R-aromático y R-3-(4-hidroxifenil) lactato-NAD (P) +-2 -oxidorreductasa) y la clase 1.1.1.237 contiene 3 - (4-hidroxifenilpiruvato) reductasa
(también denominada como hidroxifenilpiruvato) reductasa y 4-hidroxifenil-lactato:NAD+-oxidorreductasa) . La clase 1.1.3.-contiene lactato-oxidasas y la clase 1.1.1.111 contiene (3-imidazol-5-il) lactato-deshidrogenasas (también denominadas (S) -3- (imidazol -5-il) lactato:NAD (P) ""-oxidorreductasa) . Es probable que varios de los polipéptidos en estas clases permitan la producción del indol-3-piruvato a partir del ácido indol-2-láctico. Los ejemplos de esta conversión son proporcionados en el Ejemplo 2. Las relaciones químicas pueden también ser utilizadas para convertir el ácido indol-3-láctico a indol-3 -piruvato . Tales reacciones químicas incluyen un paso de oxidación que puede ser logrado utilizando varios métodos, por ejemplo: oxidación con aire utilizando el catalizador B2 (China Chemical Repórter, v. 13, no. 28, p. 18(1), 2002), perclorato y permanganato diluidos, o peróxido de hidrógeno en presencia de catalizadores metálicos. Indol-3 -piruvato a ácido 2-hidroxi-2- (indol-3 -ilmetil) -4-cetoglutárico (MP) Varios polipéptidos conocidos pueden ser utilizados para convertir el indol-3-piruvato a P. Las clases de polipéptidos ejemplares incluyen 4.1.3-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 y 4.1.2.-. Estas clases incluyen las sintasas-liasas carbono-carbono, tales como las aldolasas que catalizan la condensación de dos sustratos de ácido carboxílico. Los péptidos de la clase EC 4.1.3- son las sintasas-liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando sustratos de oxoácido (tales como el indol-3-piruvato) como el electrófilo, mientras que EC 4.1.2- son sintasas/liasas que forman enlaces carbono-carbono utilizando sustratos de aldehido (tales como benzaldehído) como el electrófilo. Por ejemplo, el polipéptido descrito en la Patente Europea EP 1045-029 (EC 4.1.3.16, 4 -hidroxi-2 -oxoglutarato-glioxilato-liasa también denominada 4-hidroxi-2-oxoglutarato-aldolasa, 2 -oxo-4 -hidroxiglutarato-aldolasa o KHG-aldolasa) convierte el ácido glioxílico y el piruvato al ácido 4-hidroxi-2-cetoglutárico y la polipéptido-4-hidroxi-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (EC 4.1.3.17 también denominada como 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-piruvato-liasa o aldolasa ProA) , condensa dos cetoácidos tales como dos piruvatos a 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato. Las reacciones que utilizan estas liasas son descritas en la presente. Las FIGS. 1-2 y 11-13 muestran diagramas esquemáticos de estas reacciones en las cuales una molécula de 3 átomos de carbono es combinada con el indol-3 -piruvato. Muchos miembros de EC 4.1.2- y 4.1.3-, particularmente polipéptidos que utilizan PLP, pueden utilizar moléculas de 3 átomos de carbono que son aminoácidos tales como serina, cisteína, y alanina, o derivadas de las mismas. Las condensaciones de aldol catalizadas por representantes de EC 4.1.2- y 4.1.3-requieren la molécula de tres átomos de carbono de esta vía para ser piruvato o un derivado de piruvato. No obstante, otros compuestos pueden servir como la fuente de 3 átomos de carbono y ser convertidos a piruvato. La alanina pueden ser transaminada por muchas transaminasas que utilizan PLP incluyendo muchas de aquellas mencionadas anteriormente, para producir piruvato. El piruvato y el amoniaco pueden ser obtenidos mediante reacciones de beta-eliminación (tales como aquellas catalizadas por la triptofanasa o ß-tirosinasa) de L-serina, L-cisteína, y derivados de serina y de cisteína con suficientes grupos salientes, tales como O-metil -L-serina, 0-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteína, S-alquil-L-cisteína, 0-acil -L-serina y 3 -cloro-L-alanina . El aspartato puede servir como una fuente de piruvato en las reacciones de beta-liasa mediadas por PLP tales como aquellas catalizadas por la triptofanasa (EC 4.1.99.1) y/o la ß-tirosinasa (EC 4.1.99.2, también denominada tirosina-fenol -liasa) . La velocidad de la reacción de beta-liasa puede ser incrementada al realizar la mutagénesis dirigida al sitio sobre los polipéptidos (4.1.99.1-2) como se describe por Mouratou et al (J". Biol. Chem. 274:1320-5, 1999) y en el Ejemplo 8. Estas modificaciones permiten que los polipéptidos acepten sustratos de aminoácido dicarboxílico . El lactato puede también servir como una fuente de piruvato, y es oxidado a piruvato por la adición de lactato-deshidrogenasa y un cofactor oxidado o lactato-oxidasa y oxígeno. Los ejemplos de estas reacciones se describen más adelante. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 2 y en las FIGS. 11-13, la aldolasa ProA puede ser puesta en contacto con el indol -3 -piruvato cuando el piruvato es utilizado como la molécula de 3 átomos de carbono . El MP puede también ser generado utilizando reacciones químicas, tales como las condensaciones de aldol proporcionadas en el Ejemplo 5. MP a Mona ina La conversión de MP a monatina puede ser catalizada por uno o más de: triptofano-aminotransferasas (2.6.1.27), triptofano-deshidrogenasas (1.4.1.19), D-aminoácido-deshidrogenasas (1.4.99.1), glutamato-dehidrogenasas
(1.4.1.2-4), fenilalanina-deshidrogenasa (EC 1.4.1.20), triptofano-fenilpiruvato-transaminasas (2.6.1.28), o más en general miembros de la familia de aminotransferasas (2.6.1.-) tales como la aspartato-aminotransferasa (EC 2.6.1.1), tirosina (aromático) aminotransferasa (2.6.1.5), D-triptofano- aminotransferasa o D-alanina (2.6.1.21) aminotransferasa (FIG. 2). Once miembros de la clase de las aminotransferasas se describen en seguida (Ejemplo 1) , incluyendo un nuevo miembro de la clase mostrada en la SEQ ID Nos.: 11 y 12, y las reacciones que demuestran la actividad de la aminotransferasa y de las enzimas deshidrogenasas , se proporcionan en el Ejemplo 7. Esta reacción puede ser también realizada utilizando reacciones químicas. La aminación del cetoácido (MP) es realizada por aminación reductiva utilizando amoniaco y cianoborohidruro de sodio. Las FIGS. 11-13 muestran polipéptidos adicionales que pueden ser utilizados para convertir MP a monatina, así como la provisión de rendimientos incrementados de monatina a partir de indol-3-piruvato o triptofano. Por ejemplo, si se utiliza aspartato como entrenador de amino, la aspartato-aminotransferasa puede ser utilizada para convertir en el aspartato oxaloacetato (FIG. 11) . El oxaloacetato es convertido a piruvato y dióxido de carbono por una descarboxilasa, tal como oxaloacetato de descarboxilasa (FIG. 11) . Además, si se utiliza lisina como el donador de amino, la lisina-epsilon-aminotransferasa puede ser utilizada para convertir la lisina a alisina (FIG. 12) . La alisina es espontáneamente convertida a l-piperideina-6-carboxilato (FIG. 12) . Si un polipéptido capaz de catalizar las reacciones de aminación reductiva (por ejemplo, glutamato- deshidrogenasa) se utiliza para convertir MP a monatina, un polipéptido que puede reciclar NAD(P)H y/o producir un producto volátil (FIG . 13) puede ser utilizado, tal como la formiato-deshidrogenasa . Consideraciones Adicionales en el Diseño de la Vías Biosintéticas Dependiente de cuáles polipéptidos sean utilizados para generar el indol-3 -piruvato, MP y/o monatina, cofactores, sustratos y/o polipéptidos adicionales pueden ser proporcionados para que la célula productora aumente la formación del producto. Eliminación de peróxido de hidrógeno El peróxido de hidrógeno (H202) es un producto que, si es generado, puede ser tóxico para las células productoras y puede dañar a los polipéptidos o los intermediarios producidos. La L-aminoácido-oxidasa descrita anteriormente genera H202 como un producto. Por lo tanto, si la L-aminoácido-oxidasa es utilizado, el H202 resultante puede ser eliminado o sus niveles disminuidos para disminuir el daño potencial a la célula o al producto. Las catalasas pueden ser utilizadas para reducir el nivel de H202 en la célula (FIGS. 11-13) . La célula productora puede expresar un gen o secuencia de ADNc que codifica para una catalasa (EC 1.11.1.6), que cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno a agua y oxígeno gaseoso. Por ejemplo, una catalasa puede ser expresada a partir de un vector transfectado en la célula productora. Los ejemplos de catalasas que pueden ser utilizadas incluyen, pero no están limitadas a: tr/Q9EV50 (Staphylococcus xylosus) , tr/Q9KBE8 (Bacillus halodurans) , tr/Q9URJ7 {Candida albicans) , tr/P77948 (Streptomyces coelicolor) , tr/Q9RBJ5 {Xanthomomas campestris) (SwissProt Accesos Nos.). Los reactores biocatalíticos que utilizan la L-aminoácido-oxidasa, D-aminoácido-oxidasa, o triptofano-oxidasa, pueden también contener un polipéptido de catalasa. Modulación de la Disponibilidad de PLP (piridoxal-5' -fosfato)
Como se muestra en la FIG. 1, el PLP puede ser utilizado en uno o más de los pasos biosintéticos descritos en la presente. La concentración de PLP puede ser suplementada de modo que PLP no se vuelva una limitación sobre la eficiencia total de la reacción. La vía biosintética para vitamina B6 (la precursora de PLP) ha sido completamente estudiada en E. coli y algunas de las proteínas han sido cristalizadas (Laber et al., FEBS Letter, 449:45-8, 1999) . Dos de los genes (epd o gapB y serC) son requeridos en otras vías metabólicas, mientras que tres genes {pdxA, pdxB, y pdxj) son únicos para la biosíntesis del fosfato de piridoxal . Uno de los materiales iniciales en la vía de E. coli es el l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP) . La síntesis de este precursor a partir de metabolitos central comunes de 2 y 3 átomos de carbono, es catalizada por el polipéptido l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato-sintasa (DSX) . El otro precursor es un derivado de treonina formado a partir del azúcar de 4 átomos de carbono, del D-eritrosa-4 -fosfato. Los genes requeridos para la conversión a fosfo-4-hidroxil-L- treonina (HTP) son epd, pdxB, y serC. La última reacción para la formación de PLP es una condensación intramolecular compleja y una reacción de cierre de anillo entre DXP y HTP, catalizada por los productos génicos de pdxA y pdxJ. Si PLP se vuelve un nutriente limitante durante la fermentación para producir monatina, la expresión incrementada de uno o más de los genes de la vía en una célula hospedera productora, puede ser utilizada para incrementar el rendimiento de la monatina. Un organismo hospedero puede contener múltiples copias de sus genes de la vía nativa o copias de los genes de la vía no nativa pueden ser incorporados dentro del genoma del organismo. Adicionalmente, múltiples copias de los genes de la vía salvaje pueden ser clonados dentro del organismo hospedero. Una vía salvaje que es conservada en todos los organismos, recicla los diversos derivados de la vitamina B6 a la forma PLP activa. Los polipéptidos involucrados en esta vía son la cinasa pdxK, la oxidasa pdxH, y la cinasa pdxY. La sobre-expresión de una o más de estos genes puede incrementar la disponibilidad de PLP. Los niveles de la vitamina B6 pueden ser elevados por la eliminación o represión de la regulación metabólica de los genes de la vía biosintética nativa en el organismo hospedero. PLP reprime los polipéptidos involucrados en la biosíntesis del derivado precursor de treonina en la bacteria Fla ojac e ium sp. Cepa 238-7. Esta cepa bacteriana, liberada del control metabólico, sobreproduce derivados de piridoxal y puede excretar hasta 20 mg/L de PLP. La manipulación genética del organismo hospedero que produce monatina de una manera similar permitirá la producción incrementada de PLP sin sobre-expresión de los genes de la vía biosintética. Utilización de Amonio Las reacciones de triptofanasa pueden ser impulsadas hacia la dirección sintética (producción de triptofano a partir de indol) al hacer el amoniaco más disponible o mediante eliminación del agua. Las reacciones de aminación reductiva tales como aquellas catalizadas por la glutamato-deshidrogenasa, pueden también ser impulsadas hacia delante por un exceso de amoniaco. El amoniaco puede ser hecho disponible como una sal de carbamato de amonio o fosfato de amonio en un sistema amortiguado con carbonato o con fosfato. El amoniaco puede también ser proporcionado como piruvato de amonio o formiato de amonio. Alternativamente, el amoniaco puede ser suministrado si la reacción es acoplada con una reacción que genere amoniaco, tal como la glutamato-deshidrogenasa o triptofano-deshidrogenasa. El amoniaco puede ser generado por la adición de los sustratos naturales de EC 4.1.99- (tirosina o triptofano) , que serán hidrolizados a fenol o indol, piruvato ? NH3. Esto permite también un rendimiento incrementado del producto sintético sobre la cantidad normal en equilibrio al permitir que la enzima hidrolice su sustrato preferido . Eliminación de productos y subproductos La conversión de triptofano a indol-3 -piruvato vía un triptofano-aminotransferasa puede afectar de manera adversa la velocidad de producción del indol-3 -piruvato debido a que la reacción produce glutamato y requiere el co-sustrato 2-oxoglutarato (a-cetoglutarato) . El glutamato puede provocar la inhibición de la aminotransferasa, y la reacción consumirá grandes cantidades del co-sustrato. Además, las altas concentraciones de glutamato son dañinas para los procesos de separación corriente abajo (3'). El polipéptido-glutamato-deshidrogenasa (GLDH) convierte el glutamato a 2 -oxoglutarato, con lo cual se recicla el co-sustrato en la reacción catalizada por la triptofano-aminotransferasa . GLDH también genera equivalentes reductores (NADH o NADPH) que pueden ser utilizados para generar energía para la célula (ATP) bajo condiciones aeróbicas. La utilización del glutamato por GLDH también reduce la formación de subproducto. Adicionalmente, la reacción genera amoniaco, que puede servir como una fuente de nitrógeno para la célula o como un sustrato en una aminación reductora para el paso final mostrado en la FIG. 1. Por lo tanto, una célula productora que sobre-expresa un polipéptido GLDH puede ser utilizada para incrementar el rendimiento y reducir el costo de los medios y/o los procesos de separación. En la vía del triptofano a la monatina, el donador del grupo amino del paso tres (por ejemplo, glutamato o aspartato) puede ser convertido nuevamente al aceptor de amino requerido para el paso 1 (por ejemplo, 2-oxo-glutarato u oxaloacetato) , si se utiliza una aminotransferasa proveniente de las clases de enzimas apropiadas. La utilización de dos transaminasas separadas para esta vía, en la cual el sustrato de una transaminasa no inhibe competitivamente la actividad de la otra transaminasa, puede incrementar la eficiencia de esta vía. Muchas de las reacciones en las vías descritas son reversibles y, por lo tanto, alcanzarán un equilibrio entre los sustratos y los productos. El rendimiento de la vía puede ser incrementado por la eliminación continua de los productos a partir de los polipéptidos . Por ejemplo, la secreción de monatina hacia el caldo de fermentación utilizando una permeasa u otra proteína de transporte, o la cristalización selectiva de la monatina a partir de una corriente del reactor biocatalítico con el reciclamiento concomitante de los sustratos, incrementará el rendimiento de la reacción. La eliminación de los subproductos por reacciones enzimáticas adicionales o por sustitución de los grupos donadores de amino es otra manera más para incrementar el rendimiento de la reacción. Son discutidos varios ejemplos en el Ejemplo 13 y mostrados en las FIGS.. 11-13. Idealmente, es producido un sub-producto que no es disponible para reaccionar en la dirección inversa, ya sea por cambio de fase (evaporación) o por conversión espontánea a un producto final no reactivo, tal como dióxido de carbono. Modulación de los Combinados de Sustrato El combinado de indol puede ser modulado al incrementar la producción de los precursores de triptofano y/o por alteración de las vías catabólicas que involucran el indol-3-piruvato y/o el triptofano. Por ejemplo, la producción de ácido indol -3 -acético a partir de indol -3-piruvato puede ser reducida o eliminada al suprimir funcionalmente el gen que codifica para EC 4.1.74.1 en la célula hospedera. La producción de indol a partir de triptofano puede ser reducida o eliminada al suprimir funcionalmente el gen que codifica para EC 4.1.99.1 en la célula hospedera. Alternativamente, un exceso de indol puede ser utilizado como un sustrato en un proceso in vitro o in vivo en combinación con cantidades incrementadas del gen que codifica para EC 4.1.99 (Kawasaki et al., J. Ferm. And Bioeng. , 82:604-6, 1996). Pueden ser realizadas modificaciones genéticas para incrementar el nivel de los intermediarios tales como D-eritrosa-4 -fosfato y corismato. La producción de triptofano es regulado en la mayoría de los organismos. Un mecanismo es vía la inhibición de la retroalimentación de ciertas enzimas en la vía; conforme se incrementan los niveles de triptofano, disminuye la velocidad de producción del triptofano. De este modo, cuando se utiliza una célula hospedera manipulada por ingeniería genética para producir monatina vía un intermediario de triptofano, puede ser utilizado un organismo que no es sensible a las concentraciones de triptofano. Por ejemplo, una cepa de Catharanthus roseus que es resistente a la inhibición del desarrollo por diversos análogos de triptofano, fue seleccionada por la exposición repetida a altas concentraciones de 5-metiltriptofano (Schallenberg y Berlín, Z. Naturforsch 34:541-5, 1979). La actividad resultante de la triptofano-sintasa de la cepa, fue menos afectada por la inhibición del producto, probablemente debido a mutaciones en el gen. Similarmente, una célula hospedera utilizada para la producción de monatina puede ser optimizada.
La producción de triptofano puede ser optimizada a través del uso de la evolución dirigida para evolucionar los polipéptidos que son menos sensibles a la inhibición del producto. Por ejemplo, la selección puede ser realizada sobre placas que no contienen triptofano en el medio, pero con altos niveles de análogos de triptofano no metabolizables . Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,756,345; 4,742,007; y 4,371,614 describen los métodos utilizados para incrementar la productividad de triptofano en un organismo de fermentación. El último paso de la biosíntesis del triptofano es la adición de serina a indol . Por lo tanto, la disponibilidad de la serina puede ser incrementada para incrementar la producción de triptofano. La cantidad de monatina producida por un organismo de fermentación puede ser incrementada al incrementar la cantidad de piruvato producido por el organismo hospedero. Ciertas levaduras, tales como Trichosporon cutaneu (Wang et al., Lett. Appl. icrobiol. 35:338-42, 2002) y Torulopsis glabrata (Li et al., Appl. Microbiol. Biotechnol . 57:451-9, 2001) sobre-producen piruvato y pueden ser utilizadas para practicar los métodos descritos aquí. Además, pueden ser realizadas modificaciones genéticas a los organismos para promover la producción de ácido pirúvico, tales como aquellas en la cepa W1485lip2 de E. coli (Kawasaki et al., J. Ferm. And Bioeng. 82:604-6, 1996).
Control de la Quiralidad El perfil de sabor de la monatina puede ser alterado al controlar la estereoquímica (quiralidad) de la molécula. Por ejemplo, pueden ser deseados diferentes isómeros de la monatina en diferentes mezclas de concentraciones para diferentes sistemas alimenticios. La quiralidad puede ser controlada via una combinación del pH y de los polipéptidos .
La racemización en la posición C-4 de la monatina (ver molécula numerada arriba) puede ocurrir mediante desprotonación y reprotonación por el carbono alfa, lo cual puede ocurrir por un desplazamiento en el pH o por reacción con el co-factor PLP. En un microorganismo, es improbable que el pH se desplace lo suficiente para provocar la racemización pero PLP es abundante. Los métodos para controlar la quiralidad con los polipéptidos dependen de la ruta biosintética utilizada para la producción de monatina. Cuando la monatina es formada utilizando la via mostrada en la FIG. 2, puede ser considerado lo siguiente. En una reacción biocatalitica, la quiralidad del carbono 2 es determinada por la enzima que convierte el indol -3 -piruvato a MP. Múltiples enzimas (por ejemplo de EC 4.1.2, 4.1.3-) pueden convertir el indol -3 -piruvato a MP, de este modo, se puede elegir la enzima que forme el isómero deseado. Alternativamente, la enantioespecificidad de la enzima que convierte el indol-3 -piruvato a MP puede ser modificada a través del uso de la evolución directa o los anticuerpos catalíticos pueden ser manipulados mediante ingeniería genética para catalizar la reacción deseada. Una vez que se produce MP (ya sea enzimáticamente o mediante condensación química) el grupo amino puede ser agregado estereoespecíficamente utilizando una transaminasa, tales como aquellas descritas en la presente. Puede ser generada ya sea la configuración R o la configuración S del carbono 4 dependiendo de si se utiliza la aminotransferasa del ácido D-o L-aromático. La mayoría de las aminotransferasas son específicas para el isómero L, no obstante, existen D-triptofano-aminotransferasa en ciertas plantas (Kohiba y Mito, Proceedings of t e 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japón 1990) . Además, las D-alanina-aminotransferasas (2.6.1.21), las D-metionina-piruvato-aminotransferasas (2.6.1.41) y la (R) -3 -amino-2 -metilpropanoato-aminotransferasa (2.6.1.61) y la (S)-3-amino-2 -metilpropanoato-aminotransferasa (2.6.1.22) han sido identificadas. Ciertas aminotransferasas pueden únicamente aceptar el sustrato para esta reacción con una configuración particular en el carbono C2. Por lo tanto, incluso si la conversión a MP no es estereoespecífica, la estereoquímica del producto final puede ser controlada a través de la selección apropiada de una transaminasa . Ya que las reacciones son reversibles, el MP sin reaccionar (isómero no deseado) puede ser reciclado nuevamente a sus constituyentes, y puede ser reformada una mezcla racémica de MP. Activación de los Sustratos Pueden ser utilizados sustratos fosforilados, tales como fosfoenolpiruvato (PEP) , en las reacciones descritas en la presente. Los sustratos fosforilados pueden ser más energéticamente favorables y, por lo tanto, pueden ser utilizados para incrementar las velocidades de reacción y/o los rendimientos. En las condensaciones de aldol, la adición de un grupo fosfato estabiliza el tautómero de enol del sustrato nucleofílico, haciéndolo más reactivo. En otras reacciones, un sustrato fosforilado frecuentemente proporciona un mejor grupo saliente. Similarmente, los sustratos pueden ser activados mediante conversión a derivados de CoA o derivados de pirofosfato. Ejemplo 1 Clonación y Expresión de Triptofano-Aminotransferasas Este ejemplo describe los métodos que fueron utilizados para clonar las triptofano-aminotransferasas, que pueden ser utilizadas para convertir el triptofano a indol-3- piruvato . Panorama Experimental Once genes que codifican para las aminotransferasas fueron clonados en E. coli. Estos genes fueron la D-alanina- aminotransferasa de Bacillus subtilis (dat, Genbank No. de Acceso Y14082, 1 pb 28622-29470) y Genbank No. de Acceso NP_388848.1, las secuencias de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente. La tirosina-aminotransferasa de Sinorhizobium meliloti (también denominado Rhizobium meliloti) (tatA, SEQ ID Nos. : 1 y 2, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la tirosina-aminotransferasa de la cepa 2.4.1 de i¾odojbacter sphaeroides (tatA validada por homología, SEQ ID Nos.: 3 y 4, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la tirosina-aminotransferasa de R. sphaeroides 35053 (validada por homología, SEQ ID Nos.: 5 y 6, la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la aminotransferasa de amplio sustrato de la Leishmania major (bsat, validada por homología a los fragmentos peptídicos provenientes de L. mexicana, SEQ ID Nos.: 7 y 8, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la aminotransferasa de aromáticos de Bacillus subtilis {araT, validada por homología, SEQ ID Nos.: 9 y 10, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la aminotransferasa de aromáticos de Lactobacillus amylovorus (araT validada por homología, SEQ ID Nos.: 11 y 12, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la aminotransferasa de sustratos múltiples de R. Sphaeroides 35053 (validada por homología SEQ ID Nos.: 13 y 14, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , la aminotransferasa de sustratos múltiples de Rhodobacter sphaeroides cepa 2.4.1 (msa validada por homología, Genbank No. de Acceso AAAE01000093.1 , pb 14743-16155 y Genbank No. de Acceso ZP00005082, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) , aspartato-aminotransferasa de Escherichia coli {aspC, Genbank No. de Acceso AE000195.1, pb 2755-1565 y Genbank No. de Acceso AAC74014.1, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respec ivamente) , y tirosina-aminotransferasa de E. coli (tirB, SEQ ID Nos. : 31 y 32, la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente) . Los genes fueron clonados, expresados, y probados para la actividad en la conversión de triptofano a indol-3-piruvato, junto con las enzimas comercialmente disponibles. Todos los once clones tuvieron actividad.
Identificación de Cepas Bacterianas que Pueden Contener Polipeptidos con la Actividad Deseada Ninguno de los genes en la base de datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information) fueron designados como triptofano-aminotransferasas . No obstante, los organismos que tienen esta actividad enzimática han sido identificados. La actividad de L-triptofano-aminotransferasa (TAT) ha sido medida en los extractos celulares o a partir de proteína purificada proveniente de las siguientes fuentes: aislado Rhizobacteriano de Festuca octoflora, mitocondrias y citosol de chícharo, células de agalla de corona de girasol, Rhizobium leguminosarum biovar trifoli, Er inia herbicola pv gypsophiale, Pseudomonas syringae pv. savastanoi, Agrobacterium tu efaciens, Azospirrillum lipferum & brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii , cerebro de rata, hígado de rata, Sinorhizobium meliloti , Pseudomonas fluorescens CHAO, Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, plántulas de trigo, cebada, Phaseoulus aureus (fríjol mung) , Saccharomyces uvarum (carlsbergensis) , Leish ania sp. , maíz, brotes de tomate, plantas de chícharo, tabaco, cerdo, Clostridium sporogenes y Streptomyces griseus . Aislamiento de ADN Genómico para la Clonación Se desarrolló S. meliloti (ATCC número 9930) en medio TY a 25°C, H 7.2. Las células se desarrollaron a una densidad óptica de 600 nm (OD60o) de 1.85 y se utilizó un inoculo de 2% para las preparaciones de ADN genómico. El equipo Qiagen Genomic tipo 20/G (Valencia, CA) fue utilizado para el aislamiento del ADN genómico. El Bacillus subtilis 6051 (ATCC) se desarrolló a 30°C en Caldo Nutritivo Bereto (Difco; Detroit, MI) . Se utilizó protocolo de Qiagen Genomic tipo 20/G para aislar el ADN genómico con los siguientes cambios: las concentraciones de la proteinasa K y la lisozima fueron duplicadas y los tiempos de incubación fueron incrementados de 2-3 veces. Se suministró ADN genómico de Leishmania major ATCC 50122 por IDI, Inc. (Québec, Canadá) en amortiguador TE pH 8.01, 17 ng/µ?. i¾odojbacter sphaeroides 2.4.1 (proporcionado por el Profesor Sam Kaplan de la Universidad de Texas, Houston) , i?. sphaeroides 35053 (ATCC número) , y el ADN genómico de L. amylovorus se preparó mediante extracción estándar con fenol . Las células fueron cosechadas en fase logarítmica tardía, resuspendidas en amortiguador TEN (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, cloruro de sodio 100 mM) , y se lisaron por la adición de 0.024 mL de urilsarcosina de sodio por mL de suspensión celular. Después de extraer al menos tres veces con un volumen igual de fenol saturado con el amortiguador TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM) , la solución de ADN fue extraída una vez con cloroformo : octanol 9:1 y tres veces con cloroformo. El ADN fue precipitado por la adición de 0.1 volumen de acetato de sodio 3 , pH 6.8 y 2 volúmenes de etanol . El precipitado se recolectó mediante centrifugación y se lavó una vez con etanol al 70%. Finalmente, el ADN se disolvió en 0.10 mL de agua destilada. El ADN genómico de Escherichia coli fue aislado de la cepa DH10B (Invitrogen) y preparada utilizando el equipo Qiagen Genomic-tipMR (500/G) . A partir de 30 mL de esta cepa desarrollada en LB a una D065o de 1.87, se obtuvieron 0.3 mg de ADN purificado. El ADN purificado fue disuelto en amortiguador de elusión Qiagen (EB) a una concentración de
0.37 µg/µL. Protocolo de la Reacción en Cadena de Polimerasa Se diseñaron cebadores con proyecciones compatibles para el vector Xa/LIC de pET 30 (Novagen, Madison, WI) . El vector pET tiene una proyección de una sola hebra de 12 bases sobre el lado 5' del sitio Xa/LIC y una proyección de una sola hebra de 15 bases sobre el lado 3' del sitio Xa/LIC. El plásmido es diseñado para la clonación independiente de la ligadura, con los marcadores de His y S-N-terminales y un marcador de His-S-terminal opcional. El sitio de reconocimiento de la proteasa Xa (IEGR) se asienta directamente enfrente del codón de inicio del gen de interés, tal que pueden ser removidos los marcadores de la proteína de fusión. La siguiente secuencia fue agregada a los extremos 5' de las secuencias específicas del organismo cuando se diseñan los cebadores: cebador delantero, 5 ' GGTATTGAGGGTCGC (SEQ ID No.: 73); cebador inverso, 5 'AGAGGAGAGTTAGAGCC (SEQ ID No.: 74) . Cebadores dat de Bacillus subtilis: Extremo N: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3 ' y Extremo C 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3 ' (SEQ ID Nos.: 15 y 16) . Cebadores tatA de Sinorhizobium eliloti: Extremo N: 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG y Extremo C 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC (SEQ ID Nos.: 17 y 18).
Cebadores araT de Bacillus subtilis: Extremo N: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC y Extremo C 5 ' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG (SEQ ID Nos.: 19 y 20).
Cebadores msa de Rhodobacter sphaeroides (ambos 2.4.1 y 35053): Extremo N: 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT y Extremo C 5 ' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG (SEQ ID Nos. : 21 y 22) . Cebadores bsat de Leishmania major: Extremo N: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT y Extremo C 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC (SEQ ID Nos.: 23 y 24).
Cebadores araT de Lactobacillus amylovorus: Extremo N: 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA y Extremo C 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA (SEQ ID Nos. : 25 y 26) .
Cebadores tatA de Rhodobacter sphaeroides (ambos 2.4.1 y 35053): Extremo N: 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC y Extremo C 5 ' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG (SEQ ID Nos . : 27 y 28) . Cebadores aspC de Escherichia coli: Extremo N: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3 ' y Extremo C 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3 ' (SEQ ID Nos.: 29 y 30) . Cebadores tyrB de Escherichia coli: Extremo N: 5'- GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC y Extremo C 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGAGCAAACG-3 ' (SEQ ID Nos.: 33 y 34) . El gen derivado de S. eliloti (tatA) fue amplificado utilizando el siguiente protocolo de PCR. En una reacción de 50 µ?, se utilizaron 0.1-0.5 g de plantilla, 1.5 µ? de cada cebador, 0.4 mM de cada dNTP, 3.5 U de Polimerasa de Alta Fidelidad de Expansión (Roche, Indianápolis , IN) , y IX de amortiguador Ex andí con magnesio. El programa termociclador utilizado incluyó un inicio en caliente a 96°C por 5 minutos, seguido por 29 repeticiones de los siguientes pasos: 9 °C por 30 segundos, 55°C por 2 minutos, y 72°C por 2.5 minutos. Después de las 29 repeticiones la muestra fue mantenida a 72 °C por 10 minutos y luego almacenada a 4°C. Este protocolo de PCR produjo un producto de 1199 pares de bases.
Las secuencias de los genes derivados de R. sphaeroides {msa y tatA) , araT de L. amylovorus, y araT de Bacillus fueron amplificados utilizando el siguiente protocolo de PCR. En una reacción de 50 µ?, se agregaron 0.1- 0.5 µg de plantilla, 1.5 µ? de cada cebador, 0.4 mM de dNTP, 3.5 U de Polimerasa Expand High FidelityMR y IX de amortiguador ExpandMR con magnesio. El programa termociclador utilizado incluyó un inicio en caliente a 96°C por 5 minutos, seguido por 29 repeticiones de los siguientes pasos. 94 °C por 30 segundos, 40-60°C por 1 minuto, 45 segundos (termociclador en gradiente) y 72°C por 2 minutos, 15 segundos. Después de las 29 repeticiones, la muestra fue mantenida a 72 °C por 10 minutos, y luego se almacenó a 4°C. Para cada gen msa de R. Sphaeroides, las temperaturas de recocido de 42 °C y 48 °C produjeron múltiples productos, pero una banda distinta a aproximadamente a 1464 pares de bases. Para araT de L. amiylovorus, las temperaturas de recocido de 42 °C, 48 °C y 56 °C produjeron productos simples con bandas intensas a 1173 pares de bases. Para araT de B. subtilis, las temperaturas de recocido de 40°C, 45°C, 50°C, 55°C generaron productos intensos simples (1173 pares de bases) a partir del ADN genómico y de las colonias. Para bsat de L. major, la temperatura de recocido de 55 °C dio el producto más limpio (1239 pares de bases) . Para los genes tatA de Rhodobacter, las temperaturas de recocido de 50°C, 55°C dieron productos limpios al tamaño correcto (1260 pares de bases) . Para los genes de E. coli y el gen dat de B. subtilis, se utilizó una temperatura de recocido de 55-60°C, y el tiempo de recocido fue acortado a 45 segundos. Fueron obtenidos productos limpios de los tamaños correctos (aproximadamente 1.3 kb para los genes de E. coli, 850 pares de bases para el gen dat) . Clonación Los productos de PCR fueron purificados en gel a partir de geles de TAE-agarosa a 0.8 o 1% utilizando el equipo de extracción en gel Qiagen (Valencia, CA) . Los productos de PCR fueron cuantificados mediante comparación a los estándares sobre un gel de agarosa, y luego tratados con la ADN polimerasa T4 siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante para clonación independiente de la ligadura (Novagen, adison, WI) . En resumen, aproximadamente 0.2 pmol del producto de PCR purificado fueron tratados con una u de ADN polimerasa-T4 en presencia de dGTP por 30 minutos a 22°C. La polimerasa elimina las bases sucesivas de los extremos 3' del producto de PCR. Cuando la polimerasa encuentra un residuo de guanina, la actividad de la polimerasa 5' a 3' de la enzima, contraataca la actividad de exonucleasa para prevenir efectivamente la extirpación posterior. Esto crea proyecciones de una sola hebra que son compatibles con el vector pET Xa/LIC. La polimerasa es inactivada por incubación a 75 °C por 20 minutos. El vector y el inserto tratados fueron recocidos como es recomendado por Novagen. Aproximadamente 0.02 pmol del inserto tratado y 0.01 pmol del vector se incubaron por 5 minutos a 22°C, se agregó EDTA 6.25 mM (concentración final), y la incubación a 22°C fue repetida. 1 µ? de la reacción de recocido fue agregado a las células componentes simples NovaBlueMR (Novagen, Madison, WI) y se incubó sobre hielo por 5 minutos. Después del mezclado, las células fueron transformadas mediante choque térmico por 30 segundos a 42 °C. Las células fueron colocadas sobre hielo por 2 minutos, y se dejaron recuperar en 250 µ?, de SOC a temperatura ambiente por 30 minutos a 37°C con agitación a 225 rpm. Las células fueron sembradas en placas sobre placas de LV que contenían kanamicina (25-50 µg/mL) . El ADN plasmídico fue purificado utilizando el equipo de minipreparación por centrifugación Qiagen y seleccionado para los insertos correctos mediante digestión por restricción con Xhol y Xbal. Las secuencias de los plásmidos que parecieron tener el inserto correcto fueron verificadas mediante secuenciamiento de ADN de terminación de cadena de didesoxi . Las SEQ ID Nos.: 1-14 y 31-32 muestran secuencias de nucleótidos y de los aminoácidos correspondientes de las aminotransferasa recombinantes , cualesquiera cambios a partir de las secuencias de Genbank ya sea sustituciones conservadoras silenciosas o generadas, en la secuencia de proteína. Las SEQ ID Nos.: 11 y 12 son secuencias novedosas. Expresión del Gen y Ensayos El ADN plasmídico, verificado por análisis secuencial, fue subclonado dentro de hospederos de expresión de E. coli BLR (DE3 ) ó BL21 (DE3) (Novagen, adison, WI) . Los cultivos fueron desarrollados y los plásmidos fueron aislados utilizando el equipo miniprep de Qiagen, y analizados por digestión por restricción para confirmar la identidad. La inducción fue inicialmente realizada con araT de L. amylovorus, araT de B. Subtilis, y tatA de S. meliloti en células BLR (DE3 ) y BL21(DE3). Un estudio en el curso de tiempo fue utilizado con los cultivos desarrollados en LB que contenía kanamicina (30 mg/L) a una D060o de 0.5-0.8 e inducida con IPTG 1 m (tiogalactósido de isopropilo) y muestreadas a 0, 1, 2 y 4 horas después de la inducción. Las células provenientes de 2.0 mL fueron resuspendidas en 0.10 mL de Tris-HCl 120 mM, pH 6.8, que contenía dodecilsulfato de sodio al 10%, 10% de 2 -mercaptoetanol , y 20% de glicerol, calentado a 95°C por 10 minutos, y enfriado y diluido con 0.10 mi de agua. Las alícuotas de estas muestras de proteína celular total fueron analizadas mediante SDS-PAGE, utilizando un gel en gradiente de 4 a 15%. No existieron diferencias significativas en la cantidad de proteína expresada entre la inducción a 2 horas y a 4 horas,' ni entre las células BLR (DE3 ) y BL21 (DE3 ) . Los extractos celulares fueron también preparados a partir de muestras de 4 horas al suspender los botones celulares a partir de 2 mi de cultivo en 0.25 mi de reactivo Novagen BugBusterMR que contenía 0.25 µ? de nucleasa benzonasa, incubando a temperatura ambiente por 20 minutos con agitación suave, y centrifugando a 16,000 x g para eliminar el desecho celular. Los sobrenadantes (extractos celulares) fueron cargados sobre geles en gradiente de 4 a 15% para el análisis de las proteínas solubles celulares. Los tres clones (L. amylovorus araT (SEQ ID NOS.: 11 y 12), B. Subtilis araT (SEQ ID NOS.: 9 y 10) , y S. meliloti tatA (SEQ ID NOS.: 1 y 2) mostraron proteína soluble que correspondió al tamaño correcto (aproximadamente 45 kDa) . El producto del gen araT de B. Subtilis fue sobreexpresado al más alto nivel y/o fue más soluble que los otros dos productos génicos . En métodos de expresión subsecuentes, el ADN plasmídico proveniente de los clones positivos fue subclonado en BL21(DE3) debido a las mejores características de desarrollo de este hospedero. La inducción fue repetida utilizando un IPTG 1 m con cultivos desarrollados en LB que contenían kanamicina a 50 mg/litro, induciendo cuando la OD60o alcanzó aproximadamente 0.8. Las células fueron cosechadas después de 4 horas de desarrollo a 37°C, centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos (4°C) , lavadas con amortiguador TEGGP (Tris-HCl 50 mM (pH 7.0), EDTA 0.5 mM, 100 mg/litro de glutatión, 5% de glicerol, con coctel inhibidor de proteasa completo de Roche) , y se congeló instantáneamente en etanol a -80°C. Las muestras fueron resuspendidas en 5 ml/g de peso de células húmedas del reactivo de BugbusterMR (Novagen) que contenía 5 µ?/ml del equipo #3 de coctel inhibidor de proteasa (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) y 1 µ?/ml de la nucleasa benzonasa. Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente por 20 minutos en un agitador orbital. Los desechos celulares insolubles fueron removidos mediante centrifugación a 16,000 x g por 20 minutos a 4°C. Los extractos celulares fueron analizados mediante SDS-PAGE, y evaluados para la actividad de triptofano-aminotransferasa al seguir la producción del ácido indol-pirúvico utilizando el siguiente protocolo. Se llevaron a cabo reacciones de un mi en tetraborato de sodio 50 mM (pH 8.5), EDTA 0.5 mM, arseniato de sodio 0.5 mM, fosfato de piridoxal 50 µ?, oc-cetoglutarato 5 mM, y L-triptofano 5 mM. Las reacciones fueron iniciadas por la adición de extractos libres de células o la enzima purificada, y se incubaron 30 minutos a 30 °C. Se agregaron 200 µ? de TCA al 20% para detener la reacción, y la proteína precipitada fue removida mediante centrif gación. La absorbancia a 327 nm fue medida y comparada a una curva estándar de indol -3 -piruvato recién preparado, en el amortiguador de ensayo. Las reacciones control sin el sustrato de triptofano o utilizando extractos libres de células, provenientes de clones transformados con pET30a solo, fueron también realizadas. Debido al antecedente de las aminotransferasas nativas de E. coli en los extractos celulares, se purificaron las proteínas recombinantes utilizando cartuchos His-Bind siguiendo los protocolos del fabricante (Novagen, Madison, WI) . Las fracciones eluyentes fueron desaladas sobre columnas PD-10 (Amersham Biosciences, Piscata ay, NJ) y eluidas en Tris 50 mM, pH 7.0. Las proteínas purificadas fueron analizadas mediante SDS-PAGE y evaluadas para la actividad de aminotransferasa . Los resultados provenientes de la inducción a 37°C con IPTG 1 mM (4 horas) demuestran que L. ajor bsat, S. meliloti tatA, E. coli aspC y ambos clones de tatA de R. sphaeroides tienen niveles significativos de actividad de triptofano-aminotransferasa. La proteína arar de B. subtilis fue sobre-expresada y fue soluble, pero mostró poca actividad enzimática. El producto del gen araT de L. amylovorus pareció ser soluble en el extracto celular, pero la purificación utilizando un cartucho His-Bind dio como resultado únicamente pequeñas cantidades de proteina con el peso molecular correcto. Los productos del gen msa fueron insolubles y además fueron realizados experimentos de expresión a 24 °C para reducir al mínimo la formación de cuerpos de inclusión. Se utilizaron varias concentraciones de IPTG entre 10 µ?a y 1 mM para elevar al máximo la cantidad de proteína soluble. La Tabla 1 lista las actividades específicas medidas en los microorganismos de indol-3-piruvato (I3P) formados por miligramo de proteína por minuto. En algunos casos, cantidades muy pequeñas de proteína recombinante mostraron altos niveles de actividad por arriba del intervalo lineal efectivo del ensayo. En estos casos un signo >' precede el número de actividad específica. Tabla 1 : Actividades Específicas de los Clones en Extractos Celulares (CE) y Proteínas Purificadas (P) y Enzimas Comerciales
Enzima Actividad Nota Específica (µ? l3P/mg proteína/ minuto) L major bsat CE >49.3 L. major bsat P >4280 S. meliloti tatA CE >28.6 S. meliloti tatA P >931 2.4.1 tatA CE >41.2 2.4.1 tatA P 1086 Enzima Actividad Nota Específica (µ9 l3P/mg proteína/ minuto) 35053 tatA CE >62.3 35053 tatA P >486 L amylovorus ara T CE 1.26 L. amylovorus araT P 0 poca proteína después del cartucho His-Bind B. subtilis araT CE 0 no detectable fí. subtilis araT P 1.5-4.5 2.4.1 msa CE 2.05 muy poca proteína soluble
2.4.1 msa P 0 no hay proteína después del cartucho His-Bind 35053 msa CE 3.97 muy poca proteína soluble
35053 msa P 0 no hay proteína después del cartucho His-Bind £ co//' aspC (P) 800 £. coli tyrB (P) 1 no muy soluble B. subtilis D-aminotransf. (P) 2.7 usando D-triptofano como sustrato Transaminasa de intervalo 22 Sigma Cat # T 7684 amplio Porcina tipo ll-A 1.5 Sigma G7005 Porcina tipo I 1 Sigma G2751
Un alineamiento que compara todas las proteínas recombinantes clonadas, ilustra que no existen muchas áreas altamente conservadas entre las secuencias de araT, tatA, bsat, y msa. Un alineamiento de las proteínas recombinantes de más alta actividad. Los homólogos del producto del gen tatA de Rh.odoba.cter, la aminotransferasa de sustrato amplio de L. major, y la tirosina-aminotransferasa de Sinorhizobium meliloti mostraron varias regiones conservadas, no obstante éstas son únicamente aproximadamente 30 a 46% idénticas al nivel de proteína. La disponibilidad de la aminotransferasa específica de D (D-alanina) de amplio intervalo, puede ser útil en la producción de otros estereoisomeros de monatina. Ejemplo 2 Conversión del indol-3 -lactato al indol-3 -piruvato Como se muestra en las Figuras 1 y 3, el ácido indol -3-láctico puede ser utilizado para producir el indol-3-piruvato. La conversión entre el ácido láctico y el piruvato es una reacción reversible, como lo es la conversión entre el indol-3 -piruvato y el indol -3 -lactato . La oxidación del indol-lactato fue típicamente seguida debido a la alta cantidad de antecedente a 340 nm proveniente del indol-3 -pi uvato . La mezcla de ensayo estándar contenía fosfato de potasio 100 mM, pH 8.0, NAD+ 0.3 mM, 7 unidades de lactato-deshidrogenasa (LDH) (Sigma-L2395 , Saint Louis, MO) , y sustrato 2 mM en 0.1 mi. El ensayo fue realizado por duplicado en una placa de microtitulación transparente a UV, utilizando un lector de placas Molecular Devices SpectraMax Plus. El polipéptido y el amortiguador fueron mezclados y llevados con pipeta hacia pozos que contenían el ácido indol- 3 -láctico y NAD+, y la absorbancia a 340 nm de cada pozo fue leída a intervalos de 9 segundos después de un breve mezclado. La reacción fue mantenida a 25 °C por 5 minutos. El incremento en la absorbancia a 340 nm sigue la producción de NADH a partir de NAD+. Se realizaron controles negativos separados sin NAD+ y sin sustrato. D-LDH proveniente de Leuconostoc mesenteroides (Sigma número de catálogo L2395) pareció mostrar más actividad con los sustratos derivados de indol que L-LDH proveniente de Bacillus stearothermophilus (Sigma número de catálogo L5275) . Se utilizaron métodos similares con el ácido D-láctico y NAD+ o NADH y piruvato, los sustratos naturales de los polipéptidos de D-LDH. La Vmax para la reducción de piruvato fue 100 a 1000 veces mayor que la Vmax para la oxidación del lactato. La Vmax para la reacción de oxidación del indol-3-láctico con D-LDH fue aproximadamente un quinto de aquella con el ácido láctico. La presencia del indol -3 -piruvato fue también medida siguiendo el cambio en la absorbancia a 327 nm (el derivado de enol -borato) utilizando amortiguador de borato de sodio 50 mM que contenía EDTA 0.5 mM y arseniato de sodio 0.5 mM. Se observaron cambios en absorbancia, pequeños pero repetibles, en comparación a los controles negativos para los polipéptidos L- y D-LDH. Adicionalmente, las lactato-deshidrogenasas de amplia especificidad (enzimas con actividad asociada con EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 y/o EC 1.1.2.3), pueden ser clonadas y utilizadas para elaborar el indol-3 -piruvato a partir del ácido indol-3 -láctico. Las fuentes de deshidrogenasas de amplia especificidad incluyen E. coli, Neisseria gonorrheae y Lactobacillus plantarum. Alternativamente, el indol-3 -piruvato puede ser producido al poner en contacto el indol-3 -lactato con extractos celulares de Clostridium sporogenes que contienen una deshidrogenasa del indol -lactato (EC 1.1.1.110); o extractos celulares de epimastigotes de Tripanosoma cruzi que contienen la p-hidroxifenilacetato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.222) que se sabe tiene también actividad sobre el indol-3-piruvato; o extractos celulares de Pseudo onas, acidovorans o E. coli, que contienen una deshidrogenasa del lactato de imidazol-5-ilo (EC 1.1.1.111); o Coleus blumei, que contiene una hidroxifenilpiruvato-reductasa (EC 1.1.1.222); o Candida maltosa que contiene una deshidrogenasa de lactato-D-aromático (EC 1.1.1.222). Las referencias que describen tales actividades incluyen, Nowicki et al. (FEMS Microbiol Lett 71: 119-24, 1992), Jean y DeMoos (Canadian J. Microbiol. 14 1968, Coote y Hassall (Biochem. J 111: 237-9, 1969), Córtese et al. (C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 162 390-5, 1968), Petersen y Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43 501-4, 1988), y Bhatnagar et al. (J\ Gen Microbiol 135: 353-60, 1989) . Además, una lactato-oxidasa tal como aquella proveniente de Pseudomonas sp (Gu et al. J. Mol. Catalysis B: Enzimatic : 18: 299-305, 2002), puede ser utilizada para la oxidación del indol-3 -lactato a indol-3 -piruvato. Ejemplo 3 Conversión de L-triptofano a indol-3 -piruvato utilizando la oxidasa de L-aminoácido Este ejemplo describe los métodos utilizados para convertir el triptofano a indol -3 -piruvato vía una oxidasa (EC 1.4.3.2), como una alternativa al uso de una triptofano-aminotransferasa como se describe en el Ejemplo 1. La oxidasa de L-aminoácido o L-aminoácido-oxidasa fue purificada a partir de Crotalus durissus (Sigma, Saint Louis, MO, número de catálogo A-2805) . Los números de acceso de las oxidasas de L-aminoácido para la clonación molecular incluye: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 y Z48565. Las reacciones fueron realizadas en tubos para microcentrífuga en un volumen total de 1 mi, incubados por 10 minutos mientras que se agitaba a 37°C. La mezcla de reacción contenia L-triptofano 5 ttiM, amortiguador de fosfato de sodio 100 mM pH 6.6, arseniato de sodio 5 mM, EDTA 0.5 mM, tetraborato de sodio 25 mM, catalasa 0.016 mg (83 U, Sigma C.3515), 0.008 mg de FAD (Sigma), y 0.005-0.125 Unidades de oxidasa de L-aminoácido. Los controles negativos contenían todos los componentes excepto el triptofano, y los blancos contenían todos los componentes excepto la oxidasa. Se utilizó la catalasa para remover el peróxido de hidrógeno formado durante la desaminación oxidativa. El arseniato y el tetraborato de sodio se utilizaron para estabilizar la forma de enol-borato del indol-3 -piruvato, que muestra una absorbancia máxima a 327 nm. Se prepararon estándares de indol -3 -piruvato a concentraciones de 0.1-1 mM en la mezcla de reacción. La oxidasa de L-aminoácido adquirida tuvo una actividad específica de 540 g de indol-3 -piruvato formado por minuto por mg de proteína. Este es el mismo orden de magnitud que la actividad específica de las enzimas triptofano-aminotransferasa . Ejemplo 4 Conversión de indol-3 -piruvato a ácido 2 -hidroxi-2- (indol-3 - ilmetil) -4-ceto-glutárico con una aldolasa Este ejemplo describe los métodos que pueden ser utilizados para convertir el indol-3-piruvato al precursor de monatina ( P) ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-ceto-glutárico utilizando una aldolasa (liasa) (Figura 2) . Las condensaciones de aldol son reacciones que forman enlaces carbono-carbono entre el carbono beta de un aldehido o cetona y el carbono carbonílico de otro aldehido o cetona. Se forma un carbanión sobre el carbono adyacente al grupo carbonilo de un sustrato, y sirve como un nucleófilo que ataca el carbono carbonílico del segundo sustrato (el carbono electrofílico) . Más comúnmente, el sustrato electofílico es un aldehido, de modo que la mayoría de las aldolasas caen dentro de la categoría EC 4.1.2. Muy frecuentemente, el sustrato nucleofílico es el piruvato. Es menos común que las aldolasas catalicen la condensación entre dos ceto-acidos o dos aldehidos . No obstante, las aldolasas que catalizan la condensación de dos ácidos carboxílicos han sido identificadas. Por ejemplo, la Patente Europea EP-1045-029 describe la producción del ácido L-4-hidroxi-2-cetoglutárico a partir del ácido glioxílico y piruvato utilizando un cultivo de Pseudomonas (EC 4.1.3.16). Además, la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato-aldolasa (4-hidroxi-4-metil-oxoglutarato-piruvato-liasa, EC 4.1.3.17) puede catalizar la condensación de dos cetoácidos. Por lo tanto, se utilizaron polipéptidos de aldolasa similares para catalizar la condensación del indol -3 -piruvato con piruvato. Clonación Las 4 -hidroxi -4 -metil -2 -oxoglutarato-piruvato-liasas (aldolasa ProA, EC 4.1.3.17) y la 4-hidroxi-2-oxoglutarato-glioxilato-liasa (aldolasa KHG, EC 4.1.3.16) catalizan reacciones muy similares a la reacción de la aldolasa de la Figura 2. Fueron diseñados cebadores con grupos sobresalientes compatibles para el vector pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI) . El diseño de estos cebadores es descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Los siguientes cebadores fueron diseñados para la clonación de pET30 Xa/LIC: 1. El gen proA de Pseudomonas straminea (Genbank Acceso No. 12964663 Versión: 12964663) y el gen proA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NOs: 65-66, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) de1antera 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTG -3 ' e inversa 5 ' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3 ' (SEQ ID NOS : 55 y 56) . . gen SMc00502 de Sinorhizobium eliloti 1021 (homólogo a proA, Genbank Acceso Nos. 15074579 y CAC46344, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) delantera 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3 ' e inversa 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3 ' (SEQ ID NOs : 61 y 62) . . gen fldZ de Sphingomonas sp LB126 (Genbank Acceso No. 7573247 Versión: 7573247, códigos para una acil- transferasa putativa) delantera 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3 ' e inversa 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3 ' (SEQ ID NOs : 57 y 58) . gen pcmE de Arthrobacter keyseri (Genbank Acceso No. AF331043 Versión: AF331043.1, codifica para una oxalocitramalato-aldolasa) delantera 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3 ' e inversa 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3 ' (SEQ ID NOs : 59 y 60) . gen YPO0082 de Yersinia pestis cepa C092 (Genbank Acceso No. 15978115 Versión: 15978115, codifica para una posible transferasa) delantera 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3 ' e inversa 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3 ' (SEQ ID NOs : 63 64) . gen khg de Bacillus subtilis (Genbank Acceso Nos. Z99115.1 GI:2634478, 126711-127301 y CAB14127.1, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) delantera 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3 ' e inversa 5 ' -AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3 ' (SEQ ID NOs : 35 y 36) . gen khg de E. coli (Genbank Acceso Nos. AE000279.1 1331-1972 y AAC74920.1, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) delantera 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3 ' e inversa 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3 ' (SEQ ID NOs : 37 y 38) . 8. gen khg de S. meliloti (Genbank Acceso Nos. AL591792.1 GI: 15075850, 65353-64673 y CAC47463.1, secuencia de ácidos nucleicos y secuencia de aminoácidos, respectivamente) delantera 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3 ' e inversa 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3 ' (SEQ ID NOs : 39 y 40) . . El ADN genómico proveniente de los organismos descritos en 1-2 y 6-8 anteriores, fue purificado utilizando el protocolo de punta genómica Qiagen. Utilizando técnicas similares el ADN genómico de los organismos descritos en 3-5 puede ser purificado. Las Pseudomonas straminea (ATCC 33636) fue desarrollada a 30°C en Caldo Nutritivo y en medio de hidroxibenzoato. Se desarrolló Comamonas testosteroni (ATCC 49249) a 26°C en Caldo Nutritivo y medio de hidroxibenzoato. Sphingomonas sp. LB126 (Flemish Institute for Technological Research, VITO, B-2400 Mol, Bélgica) se desarrolla de acuerdo al método descrito por Wattiau et al. (Research in Microbiol. 152: 861-72, 2001). Arthrobacter keyseri (Gulf Ecology División, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, Gulf Breeze, FL 32561, EUA) se desarrolla de acuerdo al protocolo descrito por Eaton (J\ Bacterial. 183: 3689-3703, 2001). Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC 51124) se desarrolló a 26°C en el medio TY de la ATCC y medio de hidroxibenzoato . Yersinia pestis cepa C092 (ATCC) se desarrolla a 26°C en el medio 739 de agar de sangre de Caballo de la ATCC. Bacillus subtilis 6051 (ATCC) se desarrolla a 30°C en Caldo Nutritivo Bereto (Difco; Detroit, MI) . El ADN genómico de E. coli fue aislado de la cepa DH10B (Invitrogen) como se describe en el Ejemplo 1. Los protocolos de PCR, de clonación y de selección descritos en el Ejemplo 1 fueron utilizados para clonar las secuencias proA de C. testosteroni y de S. meliloti , así como las secuencias khg de E. coli, B. Subtilis y S. meliloti. Pueden ser utilizados los mismos métodos para clonar las otras secuencias descritas anteriormente. Los clones positivos? fueron secuenciados utilizando el secuenciamiento por terminación de cadena didesoxi (Seqwright, Houston, Texas) con los cebadores S-tag y terminador T7 (Novagen) , y los cebadores internos provenientes de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) . Ensayos de Expresión y de Actividad El ADN plasmídico (verificado por análisis secuencial) fue subclonado dentro de un hospedero de expresión BL21 (DE) (Novagen) . Los cultivos fueron desarrollados en medio LB con 50 mg/litro de kanamicina, los plásmidos aislados utilizando un equipo de minipreparación de plásmido giratorio Qiagen y subsecuentemente se analizaron mediante digestión por restricción para confirmar la identidad. Se realizaron experimentos de inducción con las construcciones BL2l(DE3) desarrolladas en medio LB que contenía 50 mg/litro de kanamicina a 37°C. La expresión de la proteína fue inducida utilizando IPTG 0.1 mM después de que la OD60o alcanzó aproximadamente 0.6. Las células fueron desarrolladas por 4 horas a 30°C y cosechadas mediante centrifugación. Las células fueron luego lisadas utilizando el reactivo BugbusterMR (Novagen) y las proteínas recombinantes de marcador de His (His-tag) fueron purificadas utilizando los cartuchos His-Bind como se describió anteriormente (Ejemplo 1) . Las proteínas purificadas fueron desaladas sobre columnas desechables PD-10 y eluidas en amortiguador de Tris-HCl 50 mM, pH 7.3 con cloruro de magnesio 2 mM. Las proteínas fueron analizadas mediante SDS-PAGE sobre geles en gradiente de 4 a 15% para detectar los niveles de proteína soluble al peso molecular predicho de la proteína de fusión recombinante . Las proteínas fueron evaluadas para la actividad utilizando el indol-3-piruvato y el piruvato de sodio como sustrato. La mezcla de ensayo contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7-pH 8.9), cloruro de magnesio 0-8 mM, fosfato de potasio 3 mM ( H 8) , y 6 m de cada sustrato en 1 mi. La reacción se inició mediante la adición de diversas cantidades del polipéptido (por ejemplo de 10 a 100 , y se incubó a 25°C- 37°C por 30 minutos, se filtró y luego se congeló a -80°C. Resultados de Actividad con los Productos del Gen proA Las construcciones génicas proA de C. testosteroní y SMc00502 de S. meliloti tuvieron altos niveles de expresión cuando fueron inducidas con IPTG. Las proteínas recombinantes fueron altamente solubles, como se determinó por el análisis de SDS-PAGE de la proteína total y las muestras de extracto celular. El producto génico de C. testosteroni fue purificado a una pureza mayor de 95%. Debido a que el rendimiento del producto génico de S. meliloti fue muy bajo después de la purificación por afinidad utilizando el cartucho His-Bind, se utilizó el extracto celular para los ensayos enzimáticos. Ambas aldolasas recombinantes catalizaron la formación de MP a partir del indol-3 -piruvato y del piruvato. La presencia de fosfato de potasio y de magnesio divalente fue requerida para la actividad enzimática. Ningún producto fue aparente cuando estuvo ausente el indol-3 -piruvato, el piruvato o el fosfato de potasio. Una pequeña cantidad del producto fue también formada en ausencia de la enzima (típicamente un orden de magnitud menor que cuando la enzima estuvo presente) .
El pico de producto eluyó a partir de la columna C18 de fase inversa, ligeramente más tarde que el estándar de indol-3-piruvato, el espectro de masa de este pico mostró un ion progenitor inducido por colisión ( [M+H] +) de 292.1, el ion progenitor esperado para el producto MP. Los fragmentos hijos mayores presentes en el espectro de masa incluyeron aquellos con m/z=158 (el ion carbanión de 1H- indol -3-carbaldehído) , 168 (ion carbonio de 3 -buta- 1 , 3 -dienil - 1H-indol), 274 (292-H20), 256 (292-2 H20) , 238 (292-3 ¾0) , 228 (292-CH403) , y 204 (pérdida de piruvato) . El producto también mostró un espectro de UV característico de otros compuestos que contienen indol tales como triptofano, con la ? de 279-280 y un hombro pequeño aproximadamente a 290 nm. La cantidad de MP producida por la aldolasa de C. testosterorii se incrementó con un incremento en la temperatura de reacción a partir de la temperatura ambiente hasta 37°C, la cantidad del sustrato, y la cantidad del magnesio. La actividad sintética de la enzima disminuyó conforme se incrementaba el pH, el producto máximo observado fue a pH 7. Con base en los estándares de triptofano, la cantidad de MP producido bajo un ensayo estándar utilizando 20 µg de la proteína purificada, fue aproximadamente 10-40 µg or un mi de reacción. Debido al alto grado de homología de las secuencias que codifican para la aldolasa proA de S. meliloti y C. testosteroni con los otros genes descritos anteriormente, se espera que todos los productos génicos recombinantes puedan catalizar esta reacción. Además, se espera que las aldolasas que tienen treonina (T) en las posiciones 49 y 87, arginina (R) en 119, aspartato (D) en 120, e histidina (H) en 31 y 71, (con base en el sistema de numeración de C. testosteroni) tendrán actividad similar. Resultados de Actividad con los productos del gen khg Las construcciones del gen khg de B. Subtilis de E. coli tuvieron altos niveles de expresión de la proteína cuando se indujo con IPTG, mientras que khg de S. meliloti tuvo un nivel menor de expresión. Las proteínas recombinantes fueron altamente solubles, como se juzgó por el análisis de SDS-PAGE de las proteínas totales y de los extractos celulares. Los productos del gen khg de B. Subtilis y de E. coli fueron purificados a una pureza mayor de 95%; el rendimiento del producto del gen de S. meliloti no fue tan alto después de la purificación por afinidad después de un cartucho His-Bind. No existe evidencia de que el magnesio y el fosfato sean requeridos para la actividad para esta enzima. No obstante, la literatura reporta la realización de los ensayos en amortiguador de fosfato de sodio, y la enzima al parecer es bifuncional y tiene actividad sobre los sustratos fosforilados tales como el 2-ceto-3 -desoxi-6-fosfogluconato (KDPG) . Los ensayos enzimáticos fueron realizados como se describió anteriormente, y en algunos casos el fosfato fue omitido. Los resultados indican que las aldolasas de KHG recombinantes produjeron MP, pero no fueron tan activas como las aldolasas de ProA. En algunos casos, el nivel de MP producido por KHG fue casi idéntico a la cantidad producida por el magnesio y el fosfato solos. El fosfato no pareció incrementar las actividades de KHG. La enzima de Bacillus tuvo la más alta actividad, aproximadamen e 20-25% mayor actividad que el magnesio y el fosfato solos, como se determinó por SRM (ver Ejemplo 10) . La enzima de Sinorhizobium tuvo la menor cantidad de actividad, la cual puede estar asociada con problemas de plegamiento y de solubilidad anotados en la expresión. Estas tres enzimas tienen el glutamato en el sitio activo (posición 43 en el sistema de numeración de B. subtilis) así como la lisina requerida para la formación de la base de Shiff con piruvato (posición 130) ; no obstante, la enzima de B. Subtilis contiene una treonina en la posición 47, un residuo de sitio activo, en vez de arginina. La KHG de B. subtilis es más pequeña y parece estar en un grupo distinto de las enzimas de S. meliloti y E. coli, con otras enzimas que tienen la treonina del sitio activo. Las diferencias en el sitio activo pueden ser la razón para la actividad incrementada de la enzima de B. subtilis. Mejoramiento de la Actividad de Aldolasa Anticuerpos catalíticos pueden ser tan eficientes como las aldolasas naturales, aceptar una amplia gama de sustratos, y pueden ser utilizados para catalizar la reacción mostrada en la Figura 2. Las aldolasas pueden también ser mejoradas por la evolución . dirigida, por ejemplo como se describió previamente, para una aldolasa de KDPG (altamente homologa a KHG descrita anteriormente) evolucionada por el entremezclado de ADN y la PCR propensa a errores, para eliminar el requerimiento del fosfato y para invertir la enantioselectividad. Los polipéptidos de KDPG de aldolasa son útiles en las reacciones bioquímicas, ya que éstos son altamente específicos para el sustrato ganador (en la presente, piruvato) , pero son relativamente flexibles con respecto al sustrato aceptor (por ejemplo indol -3-piruvato) (Koeller & ong, Nature 409: 232-9, 2001). La aldolasa de KHG tiene la actividad para la condensación del piruvato con un número de ácidos carboxílicos . Versiones de mamífero de la aldolasa de KHG se piensa que tienen más amplia especificidad que las versiones bacterianas, incluyendo su actividad sobre la 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato y la aceptación de ambos estereoisómeros del 4 -hidroxi-2 -cetoglutarato . Las fuentes bacterianas parecen tener una preferencia 10 veces mayor por el isómero R. Existen casi 100 homólogos de KHG disponibles en las bases de datos genómicas, y la actividad ha sido demostrada en Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli y en tejidos de mamífero. Estas enzimas pueden ser utilizadas como un punto inicial para diseñar a la medida la enantioespecificidad que es deseada para la producción de monatina. Las aldolasas que utilizan el piruvato y otro sustrato que es ya sea un cetoácido y/o tiene un grupo hidrofóbico voluminoso como el indol , puede ser "evolucionado" para diseñar a la medida la especificidad del polipéptido, la velocidad y la selectividad del mismo. Además de las aldolasas KHG y ProA demostradas en la presente, los ejemplos de estas enzimas incluyen, pero no están limitados a: aldolasas de KDPG y polipéptidos relacionados (KDPH) / transcarboxibenzalpiruvato-hidratasa-aldolasa proveniente de Nocardioides st; 4- (2 -carboxifenil) -2-oxobut-3-enoato-aldolasa (2 ' -carboxibenzalpiruvato-aldolasa) que condensa el piruvato y el 2 -carboxibenzaldehído (un sustrato que contiene anillo aromático) ; la trans-O-hidroxibencilidenpiruvato-hidratasa-aldolasa proveniente de Pseudomonas putida y Sphingomonas aro aticivorans, que también utiliza piruvato y un aldehido que contiene aromático, como sustratos; la 3-hidroxiaspartato-aldolasa (eritro-3 -hidroxi-L-aspartato-glioxilato-liasa) , que utiliza los 2-oxoácidos como los sustratos y se piensa que está en el microorganismo Micrococcus denitrificans; benzoina-aldolasa (benzaldehído- liasa) , que utiliza los sustratos que contienen grupos bencilo; dihidroneopterina-aldolasa; L-treo-3 -fenilserina-benzaldehído-liasa ( fenilserina-aldolasa) que condensa la glicina con el benzaldehído; 4-hidroxi-2-oxovalerato-aldolasa; 1, 2 -dihidroxibencilpiruvato-aldolasa; y 2-hidroxibenzalpiruvato-aldolasa . Un polipéptido que tiene la actividad deseada puede ser seleccionado mediante la selección de los clones de interés utilizando los siguientes métodos. Auxótrofos de triptofano son transformados con vectores que poseen los vectores de interés sobre un cásete de expresión y son desarrollados sobre un medio que contiene pequeñas cantidades de monatina o P. Ya que las reacciones de aminotransferasas y de aldolasas son reversibles, las células son capaces de producir triptofano a partir de una mezcla racémica de monatina. Similarmente, pueden ser seleccionados los organismos (recombinantes y de tipo silvestre) por la habilidad para utilizar MP o la monatina como fuente de carbono y de energía. Una fuente de aldolasas objetivo es las bibliotecas de expresión de diversas Pseudomonas y cepas rhizobacterianas . Las Pseudomonas tienen muchas vías catabólicas inusuales para la degradación de las moléculas aromáticas y éstas también contienen muchas aldolasas;
mientras que las rhizobacterias contienen aldolasas, se sabe que se desarrollan en la rhizosfera vegetal, y tienen muchos de los genes descritos para la construcción de una vía biosintética para la monatina. Ejemplo 5 Síntesis Química del Precursor de Monatina El Ejemplo 4 describe un método para utilizar una aldolasa para convertir el indol-3 -piruvato al precursor de monatina (MP) ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-ceto-glutárico. Este ejemplo describe un método alternativo para sintetizar químicamente MP. El MP es formado mediante el uso de una condensación típica tipo aldol (Figura 4) . En resumen, una reacción típica tipo aldol involucra la generación de un carbanión del éster de piruvato utilizando una base fuerte, tal como LDA (diisopropilamida de litio) , hexametildisilazano de litio o butil -litio. El carbanión que se genera reacciona con el indol-piruvato para formar el producto acoplado. Los grupos protectores que pueden ser utilizados para proteger el nitrógeno del indol incluyen, pero no están limitados a: t-butiloxicarbonilo (Boc) , y benciloxicarbonilo (Cbz) . Los grupos bloqueadores para los ácidos carboxílicos incluyen, pero no están limitados a, ésteres de alquilo (por ejemplo, ésteres de metilo, etilo, bencilo) . Cuando se utilizan tales grupos protectores, no es posible controlar la estereoquímica del producto que se forma. Sin embargo, si R2 y/o R3 son grupos protectores quirales (Figura 4) , tal como el (S) -2-butanol, mentol, o una amina quiral, esto puede favorecer la formación de un enantiómero de MP sobre el otro. Ejemplo 6 Conversión del Triptofano o del Indol-3-piruvato a Monatina
Un proceso in vi tro que utiliza dos enzimas, una aminotrasferasa y una aldolasa, produjo la monatina a partir del triptofano y el piruvato. En el primer paso, el alfa-cetoglutarato fue el aceptor del grupo amino proveniente del triptofano en una reacción de transaminación que genera el indol-3 -piruvato y glutamato. Una aldolasa catalizó la segunda reacción en la cual el piruvato se hizo reaccionar con indol -3 -piruvato, en presencia de Mg2+ y fosfato, generando el derivado de alfa-ceto de la monatina (MP) , ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico . La transferencia del grupo amino a partir del glutamato formado en la primera reacción, produjo el producto deseado, monatina. La purificación y la caracterización del producto estableció que el isómero formado era S , S-monatina . Los sustratos, enzimas y condiciones alternativas se describen, así como los mejoramientos que fueron realizados a este proceso . Enzimas La aldolasa, 4-hidroxi-4-metil-2-oxoglutarato- piruvato-liasa (aldolasa de ProA, gen proA) (EC 4.1.3.17) de Comamonas testosteroni fue clonada, expresada y purificada como se describe en el Ejemplo 4) . Las 4-hidroxi-2- oxoglutarato-glioxilato-liasas (aldolasas de KHG) (EC 4.1.3.16) proveniente de B. subtilis, E. coli y S. meliloti fueron clonadas, expresadas y purificadas como se describe en el Ejemplo 4. Las aminotransferasas utilizadas en conjunto con las aldolasas para producir la monatina fueron la L-aspartato-aminotransferasa codificada por el gen aspC de E. coli, la tirosina-aminotransferasa codificada por el gen tyrS de E. coli, la enzima TatA de S. meliloti, la aminotrasferasa de sustratos amplios codificada por el gen bsat de L. major, o la transaminasa glutámica-oxaloacética de corazón de cerdo (Tipo lia) . La clonación., expresión y purificación de las proteínas no de mamífero se describen en el Ejemplo 1. La transaminasa glutámica-oxaloacética proveniente de corazón de cerdo (tipo Ha) fue obtenida de Sigma (#G7005) . Método que utiliza la aldolasa de ProA y la L-aspartato-aminotransíerasa La mezcla de reacción contenía acetato de amonio 50 mM, pH 8.0, cloruro de magnesio 4 mM, fosfato de potasio 3 rtiM, fosfato de piridoxal 0.05 mM, piruvato de amonio 100 mM, triptofano 50 mM, alfa-cetoglutarato 10 mM, 160 mg de aldolasa ProA de C. testosteroni recombinante (extracto celular no purificado, aproximadamente 30% de aldolasa) , 233 mg de L-aspartato-aminotrasferasa de E. coli recombinante (extracto celular no purificado, aproximadamente 40% de aminotransferasa) en un litro. Todos los componentes excepto las enzimas se mezclaron conjuntamente y se incubaron a 30°C hasta que el triptofano se disolvió. Las enzimas fueron luego agregadas y la solución de reacción se incubaron a 30°C con agitación suave (100 rpm) por 3.5 horas. A 0.5 y 1 hora después de la adición de las enzimas, a la reacción se agregaron alícuotas de triptofano sólido (50 mmoles cada una) . Todo el triptofano agregado no se disolvió, pero la concentración fue mantenida a 50 mM o mayor. Después de 3.5 horas, el triptofano sólido se filtró. El análisis de la mezcla de reacción por LC/MS utilizando una cantidad definida de triptofano como un estándar, mostró que la concentración de triptofano en la solución fue de 60.5 mM y la concentración de la monatina fue de 5.81 mM (1.05 g) . Se utilizaron los siguientes métodos para purificar el producto final . Noventa por ciento de la solución clara se aplicó a una columna de resina AG50W-X8 de BioRad (225 mi; capacidad de enlace de 1.7 milieq/ml) . La columna se lavó con agua, recolectando fracciones de 300 mi, hasta que la absorbancia a 280 nm fue menor de 5% del primer flujo a través de la fracción. La columna fue luego eluida con acetato de amonio 1 M, pH 8.4, recolectando 4 fracciones de 300 mi. Las 4 fracciones contenían monatina y se evaporaron hasta 105 mi utilizando un evaporador rotatorio con un baño de agua tibia. Se formó un precipitado conforme el volumen se reducía y se filtró sobre el curso del proceso de evaporación. El análisis de las fracciones de la columna por LC/MS mostró que el 99% del triptofano y de la monatina se enlazaron a la columna. El precipitado que se formó durante el proceso de evaporación contenía más de 97% de triptofano y menos de 2% de monatina. · La proporción de triptofano al producto en el sobrenadante fue de aproximadamente 2:1. Se aplicaron 7 mi de sobrenadante a una columna de 100 mi de DEAE Sepharose de Flujo Rápido (Amersham Biosciences) previamente convertida a la forma de acetato por lavado con 0.5 litros de hidróxido de sodio 1 M, 0.2 litros de agua, 1.0 litro de acetato de amonio 1.0 M, pH 8.4 y 0.5 litro de agua. El sobrenadante se cargó a menos de 2 mi/minuto y la columna se lavó con agua a 3-4 mi/minuto hasta que la absorbancia a 280 nm fue de aproximadamente 0. La monatina se eluyó con acetato de amonio 100 mM, pH 8.4, recolectando 4 fracciones de 100 mi. El análisis de las fracciones mostró que la proporción de triptofano en la monatina en el flujo a través de las fracciones fue de 85:15, y la proporción en las fracciones del eluyente fue de 7:93. Asumiendo el coeficiente de extinción a 280 nra de la monatina que es el mismo que triptofano, las fracciones del eluyente contenían 0.146 mmol del producto. La extrapolación a la reacción total de 1 litro produciría aproximadamente 2.4 mmoles (aproximadamente 710 mg) de monatina, para una recuperación de 68%. Las fracciones del eluyente provenientes de la columna de DEAE Sepharose se evaporaron a menos de 20 mi. Una alícuota del producto se purificó adicionalmente por la aplicación a una columna preparativa de fase inversa C8 utilizando las mismas condiciones cromatográficas que aquellas descritas en el Ejemplo 10 para la caracterización de la monatina a escala analítica. El software Waters FractionlynxMR fue empleado para disparar la recolección automatizada de las fracciones, de la monatina, con base en la detección del ion m/z=293. Las fracciones provenientes de la columna C8 con el ion molecular protonado, correspondiente para la monatina, fue recolectada, evaporada hasta sequedad, y luego disuelta en un pequeño volumen de agua. Esta fracción fue utilizada para la caracterización del producto. El producto resultante fue caracterizado utilizando los siguientes métodos. Espectroscopia de UV/Visible. Las mediciones espectroscópicas de UV/visible de la monatina producida enzimáticamente fueron llevadas a cabo utilizando un espectrofotómetro Cary 100 Bio de UV/visible. El producto purificado, disuelto en agua, mostró un máximo de absorción de 280 nm con un hombro a 288 nm, características típicas de los compuestos que contienen indol. Análisis de LC/MS. Los análisis de las mezclas para la monatina derivada de las reacciones bioquímicas in vitro fueron llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 10. Un análisis típico de LC/MS de la monatina en una mezcla sintética enzimática in vitro, se ilustra en la Figura 5. El panel inferior de la Figura 5 ilustra un cromatograma de iones selectos para el ion molecular protonado de la monatina a m/z=293. Esta identificación de la monatina en la mezcla fue corroborada por el espectro de masa ilustrado en la Figura 6. El análisis del producto purificado por LC/MS mostró un pico simple con un ion molecular de 293 y absorbancia a 280 nm. El espectro de masa fue idéntico a aquel mostrado en la Figura 6. Análisis de MS/MS. Los experimentos de iones hijos LC/MS/MS, como se describe en el Ejemplo 10, fueron también realizados sobre la monatina. Un espectro de masa de iones hijos de monatina se ilustra en la Figura 7. Asignaciones estructurales tentativas de todos los iones fragmentarios marcados en la Figura 7, fueron realizadas. Estas incluyen los iones fragmentarios de m/z=275 (293-H20) , 257 (293- (2 x H20) ) , 230 (275-COOH) , 212 (257-COOH) , 168 (ion indolcarbonio de 3-buta-l, 3-dienil-lH) , 158 (ion lH-indol-3-carbaldehído) , 144 (ion carbonio de 3-etil-lH-indol) , 130 (ion carbonio de 3-metilen-lH-indol) , y 118 (ion carbonio del indol) . Muchos de éstos son los mismos que aquellos obtenidos para MP (Ejemplo 4) , como se esperaba si se deriva de la porción indol de la molécula. Algunos son 1 unidad de masa mayor que aquellos observados por MP, debido a la presencia de un grupo amino en vez de una cetona. Análisis de MS de Alta Resolución. La Figura 8 ilustra el espectro de masa obtenido para la monatina purificada, empleando un espectrómetro de masa híbrido cuadrupolar/tiempo de vuelo Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star. La masa medida para la monatina protonada utilizando el triptofano como un estándar de calibración de masa interna fue de 293.1144. La masa calculada de la monatina protonada, con base en la composición elemental, Ci4H17 205 es 293.1137. Este es un error de medición de masa menor de 2 partes por millón (ppm) , proporcionando evidencia concluyente de la composición elemental de la monatina producida enzimaticamente. Espectroscopia de RMN. Los experimentos de RMN fueron realizados sobre un instrumento Varían Inova de 500 MHz . La muestra de monatina (aproximadamente ~ 3 mg) fue disuelta en 0.5 mi de D20. Inicialmente , el solvente (D20) fue utilizado como la referencia interna a 4.78 ppm. Ya que el pico para el agua fue grande, la RMN-"^ fue corrida con supresión del pico para el agua. Subsecuentemente, debido a la amplitud del pico de agua, el protón C-2 de la monatina se utilizó como el pico de referencia, y se ajustó al valor publicado de 7.192 ppm. Para RMN-13C, una corrida inicial de varios cientos de exploraciones indicó que la muestra estaba demasiado diluida para obtener un espectro de 13C adecuado en el tiempo asignado. Por lo tanto, se realizó un experimento de coherencia cuántica múltiple heteronuclear (MC) , el cual hizo posible la correlación de los hidrógenos y los carbonos a los cuales éstos están enlazados, y proporcionando también información sobre los desplazamientos químicos de los carbonos .. Un resumen de los datos de 1H y MC se muestra en las Tablas 2 y 3. Por comparación a los valores publicados, los datos de RM indicaron que la monatina enzimáticamente producida fue ya sea (S,S), (R, R) , o una mezcla de ambas. Análisis Quiral de LC/MS. Para establecer que la monatina producida in vitro era un isómero, y no una mezcla de los enantiómeros (R,R) y (S,S), se llevaron a cabo análisis quirales de LC/MS utilizando la instrumentación descrita en el Ejemplo 10. Las separaciones de LC quiral fueron realizadas utilizando una columna de cromatografía quiral Chirobiotic T (Advances Separations Technology) a temperatura ambiente. La separación y detección, basada en los protocolos publicados del vendedor, fueron optimizados para los isómeros R- (D) y S- (L) del triptofano. La fase móvil LC consistió de A) agua que contenia 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético; B) metanol que contenia 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético . La elución fue isocrática a 70% de A y 30% de B. La velocidad de flujo fue de 1.0 ml/minuto, y la absorbancia de PDA fue monitorizada desde los 200 nm hasta 400 nm. Los parámetros instrumentales utilizados para el análisis quiral de LC/MS del triptofano y la monatina son idénticos a aquellos descritos en el Ejemplo 10 para el análisis de LC/MS. Fue utilizada La recolección de espectros de masa para la región m/z 150-400. Los cromatogramas de iones seleccionados para los iones moleculares protonados ([M+H]+=205 para el R- y el S-triptofano y [M+H]+=293 para la monatina) permitieron la identificación directa de estos analitos en las mezclas. Los cromatogramas del R- y el S-triptofano y la monatina, separados por cromatografía quiral y monitorizados por S, se muestran en la Figura 9. El pico simple en el cromatograma de la monatina indica que el compuesto es un isómero, con un tiempo de retención casi idéntico al S-triptofano. Tabla 2: datos de RM XH
Cargill 2 Vleggaar et al.1 Takeshi et al
Atomo d? J(HH) Hz d? J(HH) Hz d? J(HH) Hz
2 7.192 (1 H, s) 7.192 (s) 7.18 (s) 4 7.671 (d) 7.99 7.686 (d) 7.9 7.67 (d) 8.0
5 7.104 (dd) 7.99 7.102 (dd) 8.0, 8.0 7.11 (dd) 7.5, 7.5
6 7.178 (dd) 7.176 (dd) 8.0, 8.0 7.17 (dd) 7.5, 7.5
7 7.439 (d) 7.99 7.439 (d) 8.1 7.43 (d) 8.0
10a 3.242 (d) 14.5 3.243 (d) 14.3 3.24 (d) 14.5
10b 3.033 (d) 14.5 3.051 (d) 14.3 3.05 (d) 14.5
12 2.626 (dd) 15.5, 1.5 2.651 (dd) 15.3, 1.7 2.62 (dd) 15.5, 1.8
2.015 (dd) 15.0, 12.0 2.006 (dd) 15.3, 11.7 2.01 (dd) 15.5, 12.0
13 3.571 (dd) 10.75*, 1.5 3.168 (dd) 11.6, 1.8 3.57 (dd) 12.0, 1.8
Vleggaar et al. [J.C.S. Perkin Trans
Takeshi y Shusuke ( JP2002060382, 2002 Tabla 3: datos de F N- C (del espectro de HMQC) Cargill Vleggaar et al.1 Atomo 6c 2 126.1 126.03 3 1 10.31 R 120.4 120.46 5 120.2 120.25 6 122.8 122.74 7 112.8 112.79 8 * 137.06 9 * 129.23 10a 36.4 36.56 12 39.5 39.31 13 54.9 54.89 14 * 175.30 15 181.18 1 Vleggaar et al. {J.C.S. Perkin Trnas. 1: 3095-8,
1992) . Polarimetría. La rotación óptica fue medida sobre un polarímetro Rudolph Autopol III. La monatina fue preparada como una solución de 14.6 mg/ml en agua. La rotación específica esperada ([oc]D20) para la S,S-monatina (forma salina) es de -49.6 para una solución de 1 g/ml en agua (Vleggaar et al.). La [ ]D20 observada fue de -28.1 para la monatina enzimáticamente producida, purificada, indicando que éste fue el isómero S,S. Mejoramientos Las condiciones de reacción, incluyendo las concentraciones del reactivo y la enzima, fueron optimizadas y fueron producidos rendimientos de 10 mg/ml utilizando la siguiente mezcla de reactivo: Acetato de amonio 50 mM pH 8.3, cloruro de magnesio 2 mM, piruvato 200 mM (sal de sodio o de amonio) , alfa-cetoglutarato 5 mM (sal de sodio), fosfato de piridoxal 0.05 mM, agua desaireada para alcanzar un volumen final de 1 mi después de la adición de las enzimas, fosfato de potasio 3 mM, 50 µg/ml de aldolasa ProA recombinante (extracto celular; concentración de proteína total de 167 µg/ml) , 1000 µg/ml de L-aspartato-aminotransferasa modificada por el gen aspC de E. coli (extracto celular; concentración de proteína total de 2500 µg/ml) , y triptofano sólido para proporcionar una concentración mayor de 60 mM (saturada; cierta cantidad no disuelta a todo lo largo de la reacción) . La mezcla se incubó a 30°C por 4 horas con agitación o mezclado suaves. Sustituciones La concentración del alfa-cetoglutarato puede ser reducida a 1 mM y suplementada con aspartato 9 mM con un rendimiento equivalente de monatina. Los aceptores de aminoácidos alternativos pueden ser utilizados en el primer paso, tal como el oxaloacetato . Cuando se utilizó la aminotransferasa de sustrato amplio de L. major, recombinante , en lugar de la L-aspartato-aminotransferasa de E. coli, se lograron rendimientos similares de la monatina. No obstante, un segundo producto no identificado (3-10% del producto mayor) con una masa molecular de 292, fue también detectado por el análisis de LC-MS. Las concentraciones de monatina de 0.1-0.5 mg/ml fueron producidas cuando la enzima codificada por tyrB de E. coli, la enzima codificada por tatA de S. meliloti o la transaminasa glutámica-oxaloacética proveniente de corazón de cerdo (tipo lia) se agregó como la aminotransferasa . Cuando se comienza la reacción a partir del indol -3 -piruvato, se puede realizar una aminación reductiva para el último paso con la glutamato-deshidrogenasa y NADH (como en el Ejemplo 7) . Las aldolasas de KHG de B. Subtilis, E. coli y s.
meliloti fueron también utilizadas con la L-aspartato- aminotransferasa de E. coli para producir monatina enzimáticamente . Se utilizaron las siguientes condiciones de reacción: acetato de amonio 50 mM, pH 8.3, cloruro de magnesio 2 mM, piruvato 200 mM, glutamato 5 mM, fosfato de piridoxal 0.05 mM, agua desaireada para alcanzar un volumen final de 0.5 mi después de la adición de las enzimas, fosfato de potasio 3 mM, 20 µg/ml de aldolasa de KHG de B. Subtilis recombinante (purificada) , aproximadamente 400 µg/ml de L- aspartato-aminotransferasa (AspC) de E. coli no purificada proveniente del extracto celular, e indol -3 -piruvato 12 mM. Las reacciones fueron incubadas a 30°C por 30 minutos con agitación. La cantidad de monatina producida utilizando la enzima de B . Subtilis fue de 80 ng/ml, y se incrementó conforme se incrementaron las cantidades de aldolasa. Si el indol -3 -piruvato y el glutamato fueron reemplazados por cantidades de saturación del triptofano y alfa-cetoglutarato 5 mM, la producción de la monatina fue incrementada a 360 ng/ml. Las reacciones fueron repetidas con 30 µg/ml de cada una de las tres enzimas KHG en Tris 50 mM pH 8.3, con cantidades saturantes de triptofano, y se dejaron proceder por una hora con el fin de incrementar la detección. La enzima de Bacillus tuvo la más alta actividad como en el Ejemplo 4, produciendo aproximadamente 4000 ng/ml de monatina. La KHG de E. coli produjo 3000 ng/ml de monatina, y la enzima de S. meliloti produjo 2300 ng/ml . Ejemplo 7 Inter-conversión entre MP y Monatina La aminación de MP para formar la monatina puede ser catalizada por las aminotransferasas tales como aquellas identificadas en los Ejemplos 1 y 6, o por las deshidrogenasas que requieren un cofactor tal como NADH o NADPH. Estas reacciones son reversibles y pueden ser medidas en cualquier dirección. La direccionalidad, cuando se utiliza una enzima deshidrogenasa, puede ser controlada en gran medida por la concentración de las sales de amonio. Actividad de deshidrogenasa. La desaminación oxidativa de la monatina fue monitorizada siguiendo el incremento en la absorbancia a 340 nm conforme el NAD(P)+ se convirtió al NAD(P)H cromofórico. La monatina fue enzimáticamente producida y purificada como se describe en el Ejemplo 6. Una mezcla de ensayo típica contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 a 8.90, NAD+ o NADP+ 0.33 mM, 2 a 22 unidades de glutamato-deshidrogenasa (Sigma) y sustrato 10-15 mM en 0.2 mi. El ensayo se realizó por duplicado en una placa de microtitulación transparente a UV, sobre un lector de placas Molecular Devices SpectraMax Plus. Una mezcla de la enzima, amortiguador y NAD(P)+ se vació con pipeta dentro de los pozos que contenían el sustrato y se monitorizó el incremento en la absorbancia a 340 nm a intervalos de 10 segundos después de un breve mezclado. La reacción se incubó a 25°C por 10 minutos. Los controles negativos fueron llevados a cabo sin la adición del sustrato, y el glutamato fue utilizado como un control positivo. La glutamato-deshidrogenasa del tipo III proveniente de hígado bovino (Sigma # G-7882) catalizó la conversión de la monatina al precursor de monatina a una velocidad de conversión aproximadamente un centesimo de la velocidad de la conversión del glutamato a alfa-cetoglutarato . Actividad de transaminación. Fueron conducidos ensayos de monatina-aminotransferasa con la aspartato-aminotransferasa (AspC) de E. coli, la tirosina-aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de sustrato amplio (BSAT) de L. major, y las dos glutamato-oxaloacetato-aminotransferasas porcinas comercialmente disponibles, descritas en el Ejemplo 1. El oxaloacetato y el alfa-cetoglutarato fueron probados como el aceptor de amino. La mezcla de ensayo contenía (en 0.5 mi) Tris-HCl 50 tnM, pH 8.0, PLP 0.05 m , aceptor de amino 5 mM, monatina 5 mM, y 25 µg de aminotransferasa . Los ensayos fueron incubados a 30°C por 30 minutos, y las reacciones fueron detenidas por la adición de 0.5 mi de alcohol isopropílico. La pérdida de monatina fue monitorizada por LC/MS (Ejemplo 10) . La más alta cantidad de actividad fue notada con BSAT de L. major con oxaloacetato como el aceptor de amino, seguido por la misma enzima con alfa-cetoglutarato como el aceptor de amino. La actividad relativa con el oxaloacetato fue: BSAT>AspC>porcina tipo IIa>porcina tipo I = TyrB. La actividad relativa con el alfa-cetoglutarato fue: BSAT>AspC>porcina tipo I>porcina tipo IIa>TyrB. Ejemplo 8 Producción de Monatina a partir de Triptofano y Fuentes de C3 Diferentes del Piruvato Como se describió anteriormente en el Ejemplo 6, el indol-3 -piruvato o el triptofano pueden ser convertidos a monatina utilizando piruvato como la molécula de 3 átomos de carbono. No obstante, en algunas circunstancias, el piruvato puede no ser una materia prima deseable. Por ejemplo, el piruvato puede ser más caro que otras fuentes de 3 átomos de carbono, o puede tener efectos adversos sobre las fermentaciones, si se agrega al medio. La alanina puede ser transaminada por muchas enzimas de PLP para producir el piruvato . Enzimas similares a la triptofanasa realizan las reacciones de beta-eliminación a velocidades más rápidas que otras enzimas PLP tales como las aminotransferasas . Las enzimas provenientes de esta clase (4.1.99.-) pueden producir amoniaco y piruvato a partir de aminoácidos tales como L-serina, L-ciste£na y derivados de serina y cisteína con buenos grupos salientes tales como O-metil-L-serina, O- bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina, O-bencil-L-serina, S-metilcisteína, S-bencilcisteina, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina, 3-cloro-L-alanina. Los procesos para producir monatina utilizando los polipéptidos de EC 4.1.99.- pueden ser mejorados mediante la mutación de la ß-tirosinasa (TPL) o la triptofanasa de acuerdo al método de la Mouratou et al. (J. Biol . Chem 274: 1320-5, 1999). Mouratou et al. describe la habilidad para convertir la ß-tirosinasa a una ß-liasa de aminoácido dicarboxílico, la cual no se ha reportado que ocurra en la naturaleza. El cambio en la especificidad fue logrado mediante la conversión de la valina (V) 283 a arginina (R) y la arginina (R) 100 a treonina (T) . Estos cambios de aminoácidos permiten que la liasa acepte un aminoácido dicarboxílico para la reacción de desaminación hidrolítica (tal como el aspartato) . El aspartato, por lo tanto, puede ser utilizado también como una fuente de piruvato para reacciones subsecuentes de condensación de aldol . Adicionalmente , las células o los reactores enzimáticos pueden ser suministrados con lactato y una enzima que convierte el lactato a piruvato. Los ejemplos de enzimas capaces de catalizar esta reacción incluyen la lactato-deshidrogenasa y la lactato-oxidasa.
Aislamiento del ADN Genómico Los polipéptidos de triptofanasa han sido previamente reportados en, por ejemplo, Mouratou et al. (JBC 274: 1320-5, 1999) . Para aislar los genes que codifican para los polipéptidos de triptofanasa, se utilizó el ADN genómico proveniente de E. coli DH10B como una plantilla para PCR como se describe en el Ejemplo 1. El gen para la tirosina-fenol-liasa fue aislado de C. freundii (ATCC catálogo numero 8090, Designación ATCC 13316; NCTC 9750) y desarrollado sobre agar Nutritivo (Difco 0001) y caldo nutritivo (Difco 0003) a 37°C a una densidad óptica (DO) de 2.0. El ADN genómico fue purificado utilizando un equipo Qiagen Genomic-tipMR 100/G. Amplificación por PCR de las Secuencias de Codificación Los cebadores fueron diseñados con grupos sobresalientes compatibles para el vector Xa/LIC de pET 30 (Novagen, Madison, WI) como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. tna de E. coli (SEQ ID NO: 41) . Cebador N-terminal para la clonación de Xa/LIC de pET 30: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3' (SEQ ID NO: 43). Cebador C-terminal para la clonación de Xa/LIC de pET30: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGT TTT G-3' (SEQ ID NO: 44) . tpl de C. freundii (SEQ ID NO: 42) . Cebador N-terminal para la clonación de Xa/LIC de pET30: 5' -GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3 ' (SEQ ID NO: 45) . Cebador C-terminal para la clonación de Xa/LIC de pET30: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3 ' (SEQ ID NO: 46). El Ciclador Térmico Eppendorf MastercyclerMR Gradient 5331 fue utilizado para todas las reacciones de PCR. En 50 µ? se agregaron 0.5 µg de plantilla (ADN genómico) , 1.0 µ? de cada cebador, 0.4 mM de cada dNTP, 3.5 U de Polimerasa de Alta Fidelidad de Expansión (Expand High Fidelity Polymerase (Roche) , IX de Amortiguador Expand con magnesio, y 5% de DMSO (concentración final) . El programa utilizado de PCR por termociclador fue como sigue: inicio de calentamiento a 96°C (5 minutos) , 94°C - 30 segundos, 40-60°C - 1 minuto 45 segundos, 72 °C - 2 minutos 15 segundos; 30 repeticiones. El paso de polimerización final fue por 7 minutos, y las muestras fueron luego almacenadas a 4°C. Clonación Se utilizaron procedimientos de clonación y de identificación de clones positivos, detallados anteriormente en el Ejemplo 1, para identificar los clones apropiados. Expresión del Gen y Ensayos de Actividad El ADN plasmídico (verificado por análisis secuencial) fue subclonado dentro del hospedero de expresión BL21(DE3) (Novagen) . Los cultivos fueron desarrollados en medio LB con 30 mg/litro de kanamicina, los plásmidos fueron aislados utilizando un equipo de minipreparación Qiagen, y analizados mediante digestión de restricción para confirmar la identidad. Se realizaron experimentos de inducción con el hospedero de expresión BL21(DE3), las construcciones fueron desarrolladas en medio LB que contenía 50 mg/litro de kanamicina a 37°C. La expresión de la proteína fue inducida utilizando IPTG 0.1 m después de que la DO600 del cultivo alcanzó aproximadamente 0.6. Las células fueron desarrolladas por 4 horas a 30°C y cosechadas mediante centrifugación. Las células fueron luego lisadas en 5 ml/g de peso de células húmedas del reactivo BugBusterMR (Novagen) que contenía 5 µ?/ml de equipo de coctel de inhibidor de proteasa #111 (Calbiochem) y 1 µ?/ml de benzonasa-nucleasa (Novagen) , y las proteínas recombinantes marcadas con His fueron purificadas utilizando los cartuchos His-Bind como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Las proteínas purificadas fueron desaladas sobre una columna PD-10 (G25 Sephadex, Amersham Biosciences) y eluidas en amortiguador Tris-HCl 100 mM, pH 8.0. Las proteínas fueron analizadas mediante SDS-PAGE sobre geles en gradiente de 4 a 15% para verificar los niveles de proteína soluble al peso molecular predicho de la proteína de fusión recombinante . Mutagénesis Algunos miembros del polipéptido clase 4.1.99.- (triptofanasa y ß-tirosinasa) realizarán la reacción de beta- liasa con aspartato o aminoácidos similares sin ninguna modificación. No obstante, algunos miembros de la clase pueden necesitar ser mutagenizados para permitir el uso de sustratos y/o la creación de productos. Además, en algunos casos los polipéptidos que pueden realizar la conversión pueden ser además optimizados mediante mutagénesis. La mutagénesis dirigida al sitio fue realizada con base en el análisis de la estructura tridimensional de los polipéptidos que se enlazan a PLP. Dos ejemplos para cambiar la especificidad del sustrato de los polipéptidos se muestran enseguida . Mutagénesis de Triptofanasa Ejemplo 1 El protocolo de mutagénesis proporcionado enseguida introdujo dos mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos. La primera mutación puntual cambió a arginina (R) en la posición 103 a treonina (T) y la segunda mutación puntual cambió valina (V) en la posición 299 a arginina (R) (sistema de numeración para la proteína madura de E. coli) . Fueron realizados experimentos de mutagénesis por ATG Laboratories (Edén Prairie, M ) . Las mutaciones fueron introducidas secuencialmente por PCR de los fragmentos de genes y el reensamble de los fragmentos fue logrado por PCR también. Cebadores para convertir arginina (R) 103 a treonina (T) : 5 ' -CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT- 3 ' (SEQ ID NO: 47) y 5' -TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3 ' (SEQ ID NO: 48).
Cebadores para convertir valina (V)299 a arginina (R) : 5 ' -TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3 ' (SEQ ID NO: 49) y 5'-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3 ' (SEQ ID NO : 50). Los imitantes fueron seleccionados mediante digestión de restricción con Xbal/HindIII y Sphl, y verificados por secuenciamiento . M tagéaesis de Tirosina-Fenol-Liasa (ß-tirosinasa) Ejemplo 2 Se realizaron dos mutaciones puntuales a la secuencia de aminoácidos de la tirosina-fenol-liasa . Estas mutaciones convirtieron la arginina (R) en la posición 100 a treonina (T) , y valina (V) en la posición 283 a arginina (R) (en la secuencia de la proteína madura de C. freundii) . Los cebadores para conversión de R100T fueron: 5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3 ' (SEQ ID NO: 51) y 5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3 ' (SEQ ID NO: 52) . Los cebadores para la conversión de V282R fueron: 5'-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3 ' (SEQ ID NO: 53) y 5'-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3 ' (SEQ ID NO: 54). Los métodos descritos anteriormente fueron utilizados, y los clones fueron seleccionados mediante digestión con Kpnl/SacI, y digestión con BstXI . Las secuencias fueron verificadas mediante el secuenciamiento de terminación de cadena didesoxi . La proteína recombinante fue producida como se describió anteriormente para las enzimas de tipo silvestre. La mezcla de reacción consistió de Tris-HCl 50 mM pH 8.3, cloruro de magnesio 2 mM, fuente 3 átomos de carbono 200 mM, alfa-cetoglutarato 5 mM, sal de sodio, fosfato de piridoxal 0.05 mM, agua desaireada para alcanzar un volumen final de 0.5 mi después de la adición de las enzimas, fosfato de potasio 3 mM pH 7.5, 25 g de aldolasa ProA de C. testosteroni recombinante, cruda, como se describe en el Ejemplo 4, 500 g de L-aspartato-aminotransferasa cruda (AspC) como se prepara en el Ejemplo 1, y triptofano sólido para proporcionar una concentración mayor de 60 mM (saturada; cierta cantidad no disuelta a todo lo largo de la reacción) . La mezcla de reacción fue incubada a 30 °C por 30 minutos con mezclado. La serina, la alanina y el aspartato se suministraron como fuente de 3 átomos de carbono. Los ensayos fueron realizados con y sin enzimas PLP secundarias (purificadas) capaces de realizar las reacciones de beta-eliminación y beta-liasa (triptofanasa (TNA) , triptofanasa doble mutante, ß-tirosinasa (TPL) ) . Los resultados se muestran en la Tabla 4: Tabla 4 : Producción de monatina utilizando fuentes alternativas dé 3 átomos de carbono
Fuente de 3 átomos de carbono Enzima PLP adicional Actividad Relativa ninguna ninguna 0% piruvato ninguna 100% serina ninguna 3% serina 11 g de TNA de tipo 5.1% silvestre (1 U) Fuente de 3 átomos de carbono Enzima PLP adicional Actividad Relativa serina 80 XQ de TNA doble muíante 4.6% alanina ninguna 32% alanina 11 µ? de TNA tipo silvestre 41.7% alanina 80 µg de TNA muíante 43.9% aspartato 110 µ? de TNA tipo silvestre 7.7% (10 U) aspartato 5 U de TPL tipo silvestre 5.1% (crudo) aspartato 80 9 de TNA muíante 3.3%
La monatina producida a partir de la alanina y la serina como fuentes de 3 átomos de carbono fue verificada por el análisis de exploración hija LC/MS/MS, y fue idéntica a la monatina caracterizada producida en el Ejemplo 6. La alanina fue la mejor alternativa probada, y fue transaminada por la enzima AspC. La cantidad de monatina producida fue incrementada por la adición de la triptofanasa, la cual es capaz de realizar la transaminación como una actividad secundaria. La cantidad de monatina producida con la serina como una fuente de carbono casi se duplicó con la adición de las enzimas triptofanasas, aún cuando únicamente un quinto de la cantidad de trxptofanasa fue agregado en comparación a la aminotransferasa . AspC es capaz de realizar cierta cantidad de actividad de beta-eliminación sola. Los resultados con el aspartato indican que la actividad de triptofanasa sobre el aspartato no se incrementa con las mismas mutagénesis dirigidas al sitio que las que se sugirieron previamente para la ß-tirosinasa . Se espera que la ß-tirosinasa mutante tenga mayor actividad para la producción de monatina. Ejemplo 9 Síntesis Química de Monatina La adición de la alanina al ácido indol-3 -pirúvico produce monatina, y esta reacción puede ser realizada sintéticamente con un reactivo de Grignard o de organolitio.
Por ejemplo, a la 3 -cloro- o -3 -bromo-alanina que ha sido apropiadamente bloqueada en los grupos carboxilo y amino, se agrega magnesio bajo condiciones anhidras. El indol-3-piruvato (apropiadamente bloqueado) es luego agregado para formar el producto acoplado, seguido por la eliminación de los grupos protectores para formar la monatina. Grupos protectores que son particularmente útiles incluyen THP (éter tetrahidropiranílico) que es fácilmente acoplado y eliminado. Ejemplo 10 Detección de la Monatina y MP Este ejemplo describe los métodos utilizados para detectar la presencia de monatina, o su precursor el ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico . Análisis de LC/MS Los análisis de las mezclas para la forma del alfa-cetoácido de la monatina (precursor de la monatina, MP) y la monatina derivada de las reacciones bioquímicas in vi tro o in vivo se realizaron utilizando un instrumento de espectroscopia de masa en tándem con cromatografía líquida aters/ icromass (LC/MS/MS) incluyendo un cromatógrafo de líquidos Waters 2690 con un monitor de absorbancia de Arreglo de Foto-Diodo (PDA) Waters 996, colocado en serie entre el cromatógrafo un espectrómetro de masa cuadrupolar triple Micromass Quattro Ultima. Se realizaron separaciones de LC utilizando una columna de cromatografía de fase inversa Supelco Discovery C18/ de 2.1 mm x 150 mm, o una columna de cromatografía de fase inversa Xterra MS C8, de 2.1 mm x 250 mm, a temperatura ambiente. La fase móvil de LC consistió de
A) agua que contenía 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético y
B) metanol que contenía 0.05% (v/v) de ácido trifluoroacético . La elución en gradiente fue lineal desde 5% de B a 35% de B, 0-9 minutos, lineal desde 35% de B a 90% de B, 9-16 minutos, isocrático a 90% de B, 16-20 minutos, lineal desde 90% de B hasta 5% de B, 20-22 minutos, con un periodo de reequilibrio de 10 minutos entre las corridas. La velocidad de flujo fue de 0.25 mi/minutos, y la absorbancia de PDA fue monitorizada desde 200 nm hasta 400 nm. Todos los parámetros del ESI-MS fueron optimizados y seleccionados con base en la generación de los iones moleculares protonados ( [M+H+) de los analitos de interés, y producción de los iones de los fragmentos característicos.' Los parámetros instrumentales siguientes fueron utilizados para el análisis de LC/MS de la monatina: Capilar: 3.5 kV; Cono: 40 v; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de la fuente: 100°C; temperatura de desolvatación: 350°C; gas de desolvatación : 500 litro/hora; gas del cono: 50 litro/hora; baja resolución de masa (Ql) : 15.0; alta resolución de masa (Ql) : 15.0; energía iónica: 0.2; entrada: 50 V; energía de colisión: 2; salida: 50 V; baja resolución de masa (Q2) : 15; alta resolución de masa (Q2) : 15; energía iónica (Q2) : 3.5; Multiplicador: 650. Las incer idumbres para las proporciones reportadas de masa/carga (m/z) y las masas moleculares son + 0.01%. La detección inicial de la forma de alfa-cetoácido de la monatina (MP) y la monatina en las mezclas fue lograda por monitoreo de LC/MS con recolección de espectros de masa para la región m/z 150-400. Los cromatogramas de iones seleccionados para los iones moleculares protonados ( [M+H] =292 para MP, [M+H]+=293 para monatina) permitieron la identificación directa de estos analitos en las mezclas. Análisis de MS/MS Se realizaron experimentos de iones hijos LC/MS/MS sobre la monatina, como sigue. Un análisis de iones hijos involucra la transmisión del ion progenitor (por ejemplo m/z=293) para la monatina) de interés a partir del primer analizador de masa (Ql) hacia la celda de colisión del espectrómetro de masa, donde se introduce argón y disocia químicamente el progenitor en iones fragmentarios (hijos) . Estos iones fragmentarios son luego detectados con el segundo analizador de masa (Q2) , y pueden ser utilizados para corroborar la asignación estructural del progenitor. Fueron utilizados los siguientes parámetros instrumentales para el análisis de LC/MS/MS de la monatina: Capilar: 3.5 kV; Cono: 40 V; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de la Fuente: 100°C; Temperatura de desolvatación: 350°C; Gas de desolvatación : 500 litros/hora; gas del cono: 50 litros/hora; Baja resolución de masa (Ql) : 13.0; Alta resolución de masa (Ql) : 13.0; energía iónica: 0.2; Entrada: -5 V; Energía de colisión: 14; Salida: 1 V; Baja resolución de masa (Q2) : 15; Alta resolución de masa (Q2) : 15; Energía iónica (Q2) : 3.5; Multiplicador: 650. Determinación de Alto Rendimiento de la Monatina Los análisis de alto rendimiento (<5 minutos/muestra) de las mezclas para la monatina derivada de las reacciones in vitro o in vivo, se llevaron a cabo utilizando la instrumentación descrita anteriormente, y los mismos parámetros que los que se describen para LC/MS/MS . Se realizaron separaciones de LC utilizando la cromatografía aters Xterra MS C8 (2.1 mm x 50 mm) a temperatura ambiente con elución isocrática en metanol acuoso al 15%, ácido acético al 0.25% a una velocidad de flujo de 0.3 mi/minuto. La detección de la monatina en las mezclas se logró utilizando la espectrometría de masa en tándem (SRM) monitoreando la reacción seleccionada. Esto involucró el monitoreo específico del ion progenitor inducido por colisiones ( [M+H] +=293.1) a las transiciones del ion hijo (p . ej . , el ion fragmentario a m/z = 168.1, tentativamente asignado como un ion carbonio de 3-buta-l, 3-dienil-lH-indol) para elevar al máximo la sensibilidad, la selectividad y el rendimiento para la detección de la monatina. Los datos de absorbancia de PDA fueron recolectados en paralelo para la verificación posterior de la identidad de la monatina. Ejemplo 11 Producción de Monatina en Bacterias Este ejemplo describe los métodos utilizados para producir la monatina en las células de E. coli . Una persona de experiencia en la técnica comprenderá que pueden ser utilizados métodos similares para producir la monatina en otras células bacterianas. Además, pueden ser utilizados los vectores que contienen otros genes en la vía de la síntesis de la monatina (Figura 2) . El medio de Trp-1 + glucosa, un medio mínimo que ha sido utilizado para la producción incrementada de triptofano en células de E. coli (Zeman et al. Folia Microbiol . 35: 200-4, 1990), fue preparado como sigue. A 700 mi de agua nanopura se agregaron los siguientes reactivos: 2 g de sulfato de amonio, 13.6 g de fosfato diácido de potasio, 0.2 g de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.01 g de cloruro de calcio bihidratado, y 0.5 mg de sulfato ferroso heptahidratado. El pH fue ajustado a 7.0, el volumen fue incrementado a 850 mi, y el medio fue calentado en autoclave. Se preparó una solución de glucosa al 50% separadamente, y se esterilizó por filtración. Se agregaron cuarenta mi al medio base (850 mi) para un volumen final de 1 litro. Una solución de 10g/litro de L-triptofano fue preparada en fosfato de sodio 0.1 M pH 7, y se esterilizó por filtración. Un décimo del volumen fue típicamente agregado a los cultivos como se especificó más adelante. Se preparó también una solución de piruvato de sodio al 10% y se esterilizó por filtración. Se utilizó típicamente una alícuota de 10 mi por litro de cultivo. Se prepararon reservas de ampicilina (100 mg/ml) , kanamicina (25 mg/ml) e IPTG (840 mM) , se esterilizaron por filtración, y se almacenaron a -20°C antes del uso. Se utilizó Tween 20 (polioxietileno 20-monolaurato de sorbitán) a una concentración final de 0.2% (volumen/volumen) . Se utilizó ampicilina a concentraciones no letales, típicamente una concentración final de 1-10 µg/ml . Placas frescas de BL21(DE3) de E. coli::proA de C. testosteroni/pET30 Xa/LIC (descrita en el Ejemplo 4) se prepararon sobre medio LB que contenía 50 µ9/p?1 de kanamicina. Los cultivos de toda la noche (5 mi) fueron inoculados a partir de una colonia simple y desarrollados a 30°C en medio LB con kanamicina. Típicamente, se utilizó de 1 a 50 inóculos para la inducción en el medio de trp-1 + glucosa. El antibiótico fresco fue agregado a una concentración final de 50 mg/litro. Matraces en agitación se desarrollaron a 37°C antes de la inducción. Las células fueron muestreadas cada hora hasta que se obtuvo una D06oo de 0.35-0.8. Las células fueron luego inducidas con IPTG 0.1 m , y la temperatura reducida a 34°C. Se recolectaron muestras de 1 mi antes de la inducción (punto de tiempo cero) y se centrifugaron a 5000 x g. El sobrenadante se congeló a -20°C para el análisis de LC/MS . Cuatro horas después de la inducción, se recolectó otra muestra de 1 mi, y se centrífugo para separar el caldo del botón celular. Se agregaron como se describió anteriormente, tríptofano, piruvato de sodio, ampicilina y Tween. Las células fueron desarrolladas por 48 horas después de la inducción, y se tomó otra muestra de 1 mi y se preparó como se describe anteriormente. A las 48 horas, se agregó otra alícuota más de tríptofano y de piruvato. El volumen de cultivo completo fue centrifugado después de aproximadamente 70 horas de crecimiento (post-inducción) , por 20 minutos a 4°C y 3500 rpm. El sobrenadante fue decantado y el caldo y las células fueron congeladas a -80°C. Las fracciones de caldo fueron filtradas y analizadas por LC/MS . Las alturas y las áreas de los picos de [M+H]+=293, fueron monitorizadas como se describe en el Ejemplo 10. El nivel antecedente del medio fue sustraído. Los datos fueron también normalizados para el desarrollo celular al trazar gráficamente la altura del pico [M+H]+=293 dividido entre la densidad óptica del cultivo a 600 nm. Se produjeron niveles más altos de monatina cuando se agregaron piruvato, ampicilina y Tween, 4 horas después de la inducción, en vez de en la inducción. Otros aditivos tales como PLP, fosfato adicional o cloruro de magnesio adicional no incrementaron la producción de monatina. Se obtuvieron títulos más altos de monatina cuando se utilizó triptofano en vez del indol-3 -piruvato, y cuando el triptofano fue agregado después de la inducción en vez de en la inoculación o en la inducción. Antes de la inducción, y 4 horas después de la inducción (al tiempo de la adición del sustrato) , no existió típicamente nivel detectable de la monatina en el caldo de fermentación o en los extractos celulares. Se realizaron controles negativos utilizando células con el vector pET30a únicamente, así como cultivos donde no se agregaron triptofano y piruvato. Una exploración MS progenitora demostró que el compuesto con (m+l)/z=293 no fue derivado de moléculas más grandes, y las exploraciones hijas (realizadas como en el Ejemplo 10, fueron similares a la monatina elaborada in vitro. El efecto de Tween fue estudiado mediante la utilización de concentraciones finales de 0, 0.2% (volumen/volumen) y 0.6% de Tween 20. La más alta cantidad de monatina producida por los matraces en agitación fue a 0.2% de Tween. La concentración de ampicilina fue variada entre 0 y 10 µg/ l. La cantidad de monatina en el caldo celular se incrementó rápidamente (2.5 X) entre 0 y 1 µ9/p?1, y se incrementó 1.3 X cuando la concentración de ampicilina fue incrementada de 1 a 10 µ9/t?1. Un experimento de curso de tiempo que muestra los resultados típicos, se muestra en la Figura 10. La cantidad de monatina secretada hacia el caldo celular se incrementó, aun cuando los valores son normalizados para el desarrollo celular. Mediante el uso del coeficiente de extinción molar del triptofano, se estimó que la cantidad de monatina en el caldo era menor de 10 µg/ml. Se repitió el mismo experimento con las células que contenían el vector sin el inserto proA. Muchos de los números fueron negativos, indicando que a altura máxima a m/z=293 fue menor en estos cultivos que en el medio solo (Figura 10) . Los números fueron consistentemente menores cuando estuvieron ausentes el triptofano y el piruvato, demostrando que la producción de monatina es un resultado de una reacción enzimática catalizada por la enzima aldolasa . La producción in vivo de la monatina en células bacterianas fue repetida en experimentos con matraces de agitación de 800 mi y en termentadores. Una muestra de 250 mi de monatina (en el caldo libre de células) fue purificada mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía líquida preparativa de fase inversa. Esta muestra fue evaporada, y enviada para el análisis de masa de alta resolución (descrito en el Ejemplo 6) . La MS de alta resolución indicó que el metabolito que es producido es la monatina . Los ensayos in vitro indican que la aminotransferasa necesita estar presente a niveles más altos que la aldolasa (ver Ejemplo 6) , por lo tanto, la aspartato-aminotransferasa proveniente de E. coli fue sobreexpresada en combinación con el gen de la aldolasa para incrementar la cantidad de monatina producida. Fueron diseñados cebadores para introducir proA de C. testosteroni dentro de un operón con aspC/pET30 Xa/LIC, como sigue: cebador 5' :
ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (SEQ ID NO : 67) y cebador 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (SEQ ID NO: 68) . El cebador 5' contiene un sitio BamHI , el cebador 3' contiene un sitio Salí para la clonación. Se realizó la PCR como se describe en el Ejemplo 4, y se purificó el gel . La construcción aspC/pET30 Xa/LIC fue digerida con BamHI y Salí, y fue el producto de PCR. Las digestiones fueron purificadas utilizando una columna giratoria Qiagen. El producto de PCR de proA fue ligado al vector utilizando el equipo de Ligadura de ADN Roche Rapid (Indianápolis, IN) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fueron realizadas transformaciones químicas utilizando Novablues Singles (Novagen) como se describe en el Ejemplo 1. Las colonias fueron desarrolladas en medio LB que contenía 50 mg/litro de kanamicina, y el ADN plasmídico fue purificado utilizando el equipo de minipreparacion giratoria Qiagen. Los clones fueron seleccionados mediante análisis de digestión por restricción y la secuencia se confirmó mediante Seqwright (Houston, Texas). Las construcciones se subclonaron dentro de BLR(DE3), BLR (DE3 ) pLysS , BL21(DE3) y BL21 (DE3 ) pLysS (Novagen). La construcción proA/pET30 Xa/LIC fue también transformada en BL21 (DE3 ) LysS . Las comparaciones iniciales de las muestras de BLR (DE3 ) en matraces con agitación, bajo las condiciones estándares descritas anteriormente, demostraron que la adición del segundo gen {aspC) mejoró la cantidad de monatina producida, en siete veces. Para acelerar el desarrollo, se utilizaron cepas hospederas derivadas de BL21(DE3). Los clones de proA y los dos clones del operón del gen fueron inducidos en el medio Trp-1 como se describió anteriormente, los hospederos de pLysS tuvieron también cloranfenicol (34 mg/litro) agregado al medio. Los experimentos con matraces de agitación fueron realizados con y sin la adición de Tween 20 al 0.2% y 1 mg/litro de ampicilina. La cantidad de monatina en el caldo fue calculada utilizando monatina purificada, producida in vitro como un estándar. Los análisis de SRM fueron realizados como se describe en el Ejemplo 10. Las células fueron muestreadas a cero, 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas de crecimiento. Los resultados se muestran en la Tabla 5 para las cantidades máximas producidas en los caldos de cultivo. En la mayoría de los casos, las dos construcciones génicas tuvieron valores más altos que la construcción de proA sola. Las cepas pLysS, las cuales deberían tener envolturas celulares con más fugas, tuvieron más altos niveles de monatina secretada, aun cuando estas cepas se desarrollan típicamente a una velocidad más lenta. Las adiciones de Tween y ampicilina fueron benéficas. Tabla 5 : Cantidad de Monatina Producida por Bacterias E. col!
Construcción Hospedero Tween + Amp µ?/p?? de Tiempo monatina proA BL21(DE3) - 0.41 72 horas proA BL21(DE3) + 1.58 48 horas proA BL21 (DE3)pLysS - 1.04 48 horas proA BL21 (DE3)pLysS + 1.60 48 horas aspC:proA BL21 (DE3) - 0.09 48 horas aspCiproA BL21 (DE3) + 0.58 48 horas aspCiproA BL21 (DE3)pLysS - 1.39 48 horas aspC proA BL21 (DE3)pLysS + 6.68 48 horas Ejemplo 12 Producción de Monatina en Levadura Este ejemplo describe los métodos utilizados para producir la monatina en células eucarióticas . Una persona de experiencia en la técnica comprenderá que pueden ser utilizados métodos similares para producir la monatina en cualquier célula de interés. Además, pueden ser utilizados otros genes (por ejemplo, aquellos listados en la Figura 2) además de, o alternativamente a aquellos descritos en este ej emplo . Se utilizó el Sistema de Vector de Marcación de Epitopos de Levadura pESC (Stratagene, La Jolla, Ca) para clonar y expresar los genes aspC de E. coli y proA de C. testosteroni , dentro de Saccharomyces cerevisiae. Los vectores pESC contienen los promotores GAL1 y GALIO sobre hebras opuestas, con dos sitios de clonación múltiples distintos, permitiendo la expresión de dos genes al mismo tiempo. El vector pESC-His también contiene el gen His3 para la complementación de la auxotrofía de la histidina en el hospedero (YPH500) . Los promotores de GAL1 y GALIO son reprimidos por la glucosa e inducidos por la galactosa; se utiliza una secuencia Kozak. para la expresión óptima en levadura. Los plásmidos pESC son vectores lanzadera, permitiendo que la construcción inicial sea realizada en E. coli (con el gen bla para la selección) ; no obstante, no están presentes sitios de enlace al ribosoma bacteriano, en los sitios de clonación múltiple. Los siguientes cebadores fueron diseñados para la clonación de pESC-His (los sitios de restricción están subrayados, la secuencia Kozak está en negritas) .· aspC (Ban&íl/SalI ) , GAL1 : 5 ' -CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3 ' (SEQ ID NO: 69) y 5 ' -ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3 ' (SEQ ID NO: 70). proA {EcoRI/Notl ) , GALIO: 5'- CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3 ' (SEQ ID NO: 7) y 5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3 ' (SEQ ID NO: 72). El segundo codón para ambas proteínas maduras fue cambiado de un aminoácido aromático a valina debido a la introducción de la secuencia Kozak. Los genes de interés fueron amplificados utilizando el ADN miniprep de pET30 Xa/LIC a partir de los clones descritos en el Ejemplo 1 y Ejemplo 4 como plantilla. Se realizó la PCR utilizando un termociclador de gradiente ciclador Eppendorf Master y el siguiente protocolo para una reacción de 50 µ? . 1.0 µ? de plantilla, 1.0 µ? de cada cebador, 0.4 mM de cada dNTP, 3.5 U de Polimerasa de Alta Fidelidad de Expansión (Roche, Indianápolis, IN) , y el amortiguador IX ExpandMR con magnesio. El programa termociclador utilizado consistió de un inicio en caliente a 9 °C por 5 minutos, seguido por 29 repeticiones de los siguientes pasos: 94°C por 30 segundos, 50°C por 1 minuto 45 segundos, y 72 °C por 2 minutos 15 segundos. Después de las 29 repeticiones la muestra se mantuvo a 72°C por 10 minutos y luego se almacenó a 4°C. Los productos de PCR fueron purificados mediante separación sobre un gel de TAE-agarosa al 1%, seguido por la recuperación utilizando el Equipo de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA) . 2.7 µg del ADN vector de pESC-His se digirieron con Banüíl /Sal l y se purificaron en gel como se describió anteriormente. El producto de PCR de aspC fue digerido con Baitíñl / Sal í y se purificó con una Columna de Purificación de PCR QIAquick. Las ligaduras fueron realizadas con el Equipo de Ligadura de ADN Roche Rapid siguiendo los protocolos del fabricante. Las ligaduras desaladas fueron sometidas a electoporesis dentro de 40 µ? de células competentes Electromax DH10B (Invitrogen) en una cubeta desechable Biorad de 0.2 cm, utilizando un Pulsador de Genes II Biorad con controlador de pulso plus, de acuerdo a las instrucciones del fabricante . Después de 1 hora de recuperación en 1 mi de medio SOC, los transformantes fueron sembrados en placa sobre medio LB que contenía 100 µg/ml de ampicilina. Las preparaciones de ADN plasmídico para los clones fueron realizadas utilizando los Equipos Giratorios Miniprep de QIAprep. El ADN plasmídico fue seleccionado mediante digestión por restricción, y secuenciado (Seqwright) para la verificación, utilizando los cebadores diseñados para el vector.
El clon aspC/pESC-His fue digerido con EcoRI y Noti , como lo fue el producto de PCR proA. El ADN fue purificado como se describió anteriormente, y se ligó como se describió anteriormente. La construcción de dos genes fue transformada dentro de células DH10B y seleccionada mediante digestión por restricción y secuenciamiento de ADN. La construcción fue transformada dentro de S. cerevisiae cepa YPH500 utilizando el Equipo de Transformación S.c. EasyCompMR (Invitrogen) . Las reacciones de transformación fueron sembradas en placa sobre medio mínimo SC-His (Invitrogen pYES2 manual) que contenía 2% de glucosa. Las colonias de levadura individuales fueron seleccionadas para la presencia de los genes proA y aspC mediante PCR de colonias utilizando los cebadores de PCR anteriores. Las células concentradas (2 µ?) fueron suspendidas en 20 µ? de Amortiguador de Y-Lisis (Zymo Research) que contenía 1 µ? de zimolasa y se calentó a 37°C por 10 minutos. Cuatro µ? de esta suspensión fueron luego utilizados en una reacción de PCR de 50 µ? utilizando la mezcla de reacción de PCR y el programa descrito anteriormente . Se desarrollaron cultivos de cinco mi toda la noche sobre SC-His + glucosa a 30°C y 225 rpm. Las células fueron gradualmente ajustadas para el desarrollo sobre rafinosa, con el fin de reducir al mínimo el periodo de espera antes de la inducción con galactosa. Después de aproximadamente 12 horas de crecimiento, se tomaron las mediciones de absorbancia a 600 nm, y un volumen apropiado de las células fue centrifugado y resuspendido para dar una DO de 0.4 en el medio SC-His fresco. Se utilizaron las siguientes fuentes de carbono secuencialmente : 1% de rafinosa + 1% de glucosa, 0.5% de glucosa + 1.5% de rafinosa, 2% de rafinosa y finalmente 1% de rafinosa + 2% de galactosa para la inducción. Después de aproximadamente 16 horas de crecimiento en el medio de inducción, cultivos de 50 mi se dividieron en cultivos de 25 mi duplicados, y se agregaron los siguientes únicamente a uno de los duplicados: (concentraciones finales) 1 g/litro de L-triptofano, fosfato de sodio 5 mM pH 7.1, 1 g/litro de piruvato de sodio, cloruro de magnesio 1 mM. Las muestras de los caldos y los botones celulares provenientes del medio de no inducción, y de los cultivos de 16 horas antes de la adición de los sustratos para la vía de la monatina, se guardaron como controles negativos. Además, las construcciones que contenían únicamente el gen aspC funcional (y un gen proA truncado) se utilizaron como otro control negativo. Las células se dejaron desarrollar por un total de 69 horas después de la inducción. Ocasionalmente, las células de levadura fueron inducidas a una DO menor, y únicamente se desarrollaron por 4 horas antes de la adición del triptofano y el piruvato. No obstante, estos sustratos de monatina parecen inhibir el desarrollo, y la adición a DO más alta fue más efectiva. Los botones celulares provenientes de los cultivos fueron lisados con 5 mi de YeastbusterMR + 50 µ? de THP (Novagen) por gramo (peso húmedo) de las células siguiendo los protocolos del fabricante, con la adición de inhibidores de la proteasa y benzonasa-nucleasa como se describió en los ejemplos previos. El caldo de cultivo y los extractos celulares fueron filtrados y analizados mediante SRM como se describe en el Ejemplo 10. Utilizando este método, no se detectó la monatina en las muestras de caldo, indicando que las células no pudieron secretar la monatina bajo estas condiciones. La fuerza motriz de protones puede ser suficiente bajo estas condiciones o los transportadores generales de aminoácidos pueden ser saturados con triptofano. La expresión de proteína no fue a un nivel que permitiera la detección de los cambios utilizando SDS-PAGE. La monatina fue detectable (aproximadamente 60 g/ml) transitoriamente en extractos celulares del cultivo con dos genes funcionales, cuando el triptofano y el piruvato fueron agregados al medio. La monatina no fue detectada en ninguno de los extractos de células control negativas. Los ensayos in vitro para la monatina fueron realizados por duplicado con 4.4 mg/ml de proteína total (aproximadamente el doble de lo que se utiliza típicamente para extractos celulares de E. coli) utilizando el ensayo optimizado descrito en el Ejemplo 6. Se realizaron otros ensayos con la adición ya sea de 32 µq/ml de aldolasa ProA de C. testosteroni o 400 µg ml de aminotransferasa AspC, para determinar cuál enzima era limitante en el extracto celular. Los controles negativos fueron realizados sin la adición de enzima, o la adición únicamente de la aminotransferasa AspC (la condensación de aldol puede ocurrir en cierto grado sin enzima) . Los controles positivos fueron realizados con enzimas parcialmente puras (30-40%), utilizando 16 µg/ml de aldolasa y 400 µg/ml de aminotransferasa . Los resultados ín vitro fueron analizados mediante SRM. El análisis de los extractos celulares mostró que el triptofano fue efectivamente transportado hacia las células cuando éste fue agregado al medio después de la inducción, dando como resultado niveles de triptofano dos órdenes de magnitud mayores que aquellos en los cuales no se agregó triptofano adicional. Los resultados para el análisis de monatina in vitro son mostrados en la Tabla 6 (los números indican ng/ml) . Tabla 6: Producción de monatina con extractos de células de levadura
Construcción + + aspC Construcción + +AspC de aspC aldolasa de dos genes aldolasa reprimido (medio 0 888.3 173.5 0 465.2 829 de glucosa) inducido 24 horas 0 2832.8 642.4 0 1375.6 9146.6 Construcción + + aspC Construcción + +AspC de aspC aldolasa de dos genes aldolasa inducido 69 horas 0 4937.3 340.3 71.9 1652.8 23693.5
69 horas + subs. 0 556.9 659.1 21.9 755.6 16688.2
+ control (enzimas 21853 21853 purificadas) - control (sin 0 254.3 0 254.3 enzimas)
Se obtuvieron resultados positivos con los extractos celulares de la construcción completa de dos genes, con y sin el sustrato agregado al medio de crecimiento. Estos resultados, en comparación a los controles positivos, indican que las enzimas fueron expresadas a niveles cercanos al 1 % de la proteina local en la levadura. La cantidad de monatina producida cuando el extracto celular de la construcción aspC (con proA truncada) fue evaluada con la aldolasa, fue significativamente mayor que cuando los extractos celulares fueron evaluados solos, e indica que la amxnotransferasa AspC recombinante comprende aproximadamente 1-2 % de la proteina total de levadura. Los extractos celulares de los cultivos no inducidos tuvieron una pequeña cantidad de actividad cuando se evaluaron con la aldolasa debido a la presencia de aminotransferasas nativas en las células. Cuando se evaluó con la aminotransferasa AspC, la actividad de los extractos provenientes de la células no inducidas, se incrementó a la cantidad de monatina producida por el control negativo con AspC (aproximadamente 200 ng/ml) . En contraste, la actividad observada cuando se evalúa el extracto celular de construcción de dos genes, se incrementa más cuando la aminotransferasa es suplementada que cuando la aldolasa es agregada. Ya que ambos genes deben ser expresados al mismo nivel, esto indica que la cantidad de monatina producida es elevada al máximo cuando el nivel de aminotransferasa es más alto que aquel de la aldolasa, en concordancia con los resultados mostrados en el Ejemplo 6. La adición de triptofano y piruvato no solamente inhibe el desarrollo celular, sino que aparentemente inhibe también la expresión de la proteína. La adición del plásmido pESC-Trp puede ser utilizada para corregir la auxotrofía de triptofano de las células hospederas YPH500, para proporcionar un medio de suministrar el triptofano con menos efectos sobre el desarrollo, la expresión y la secreción. Ejemplo 13 Mejoramiento de los Procesos Enzimáticos Utilizando Reacciones Acopladas En teoría, si no ocurren las reacciones colaterales o la degradación de los sustratos o los intermediarios, la cantidad máxima de producto formado a partir de la reacción enzimática ilustrada en la Figura 1, es directamente proporcional a las constantes en el equilibrio de cada reacción, en las concentraciones de triptofano y piruvato. El triptofano no es un sustrato altamente soluble, y las concentraciones de piruvato mayores de 200 mM parecen tener un efecto negativo sobre el rendimiento (ver Ejemplo 6) . Idealmente, la concentración de monatina es elevada al máximo con respecto a los sustratos, con el fin de disminuir el costo de la separación. Las separaciones físicas pueden ser realizadas tal que la monatina es removida de la mezcla de reacción, previniendo que ocurran las reacciones inversas. Las materias primas y los catalizadores pueden ser luego generados. Debido a la similitud de la monatina en tamaño, carga e hidrofobicidad a varios de los reactivos e intermediarios, las separaciones físicas serán difíciles a no ser que exista una alta cantidad de afinidad por la monatina (tal como una técnica de cromatografía de afinidad) . No obstante, las reacciones de monatina pueden ser acopladas a otras reacciones tal que el equilibrio del sistema es desplazado hacia la producción de monatina. Los siguientes son ejemplos de procesos para mejorar el rendimiento de la monatina obtenida a partir de triptofano o indol-3 -piruvato . Reacciones acopladas utilizando oxaloacetato-descarboxilasa (EC 4.1.1.3) La Figura 11 es una ilustración de la reacción. La oxidasa y la catalasa de triptofano son utilizadas para impulsar la reacción en la dirección de la producción de indol-3 -piruvato. La catalasa es utilizada en exceso, tal que el peróxido de hidrógeno no está disponible para reaccionar en la dirección inversa, o para dañar las enzimas o los intermediarios. El oxígeno es regenerado durante la reacción de catalasa. Alternativamente, el indol -3 -piruvato puede ser utilizado como el sustrato. El aspartato se utiliza como el donador de amino para la aminación de MP, y se utiliza una aspartato-aminotransferasa . Idealmente, una aminotransferasa que tiene una baja especificidad por la reacción de triptofano/indol-3-piruvato en comparación a la reacción de MP a monatina, se utiliza de modo que el aspartato no es utilizado para reaminar el indol-3 -piruvato. La oxaloacetato-descarboxilasa (de Pseudomonas sp.) puede ser agregada para convertir el oxaloacetato a piruvato y dióxido de carbono. Ya que el C02 es volátil, éste no está disponible para la reacción con las enzimas, disminuyendo o incluso previniendo las reacciones inversas . El piruvato producido en este paso puede también ser utilizado en la reacción de condensación de aldol. Pueden ser utilizadas otras enzimas descarboxilasas, y son conocidos los homólogos que existen en Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquífex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii , Bacteroides fragilis, varias especies de Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobiu tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatm, Klebsiella pneu oniae, Legionella pneumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multocida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, varias especies de Pseudomonas, varias especies de Pyrococcus, Rhodococcus, varias especies de Salmonella, varias especies de Streptococcus, Thermochromatium tepidu , Ther otoga marítima, Treponema pallidum y varias especies de Vibrio. Fueron realizados ensayos de triptofano-aminotransferasa con la aspartato-aminotransferasa (AspC) proveniente de E. coli, la tirosina-aminotransferasa (TyrB) de E. coli, la aminotransferasa de sustrato amplio (BSAT) de L. major, y las dos glutamato-oxaloacetato-aminotransferasas porcinas comercialmente disponibles como se describe en el Ejemplo 1. El oxaloacetato y el alfa-cetoglutarato fueron probados como el aceptor de amino . La proporción de la actividad utilizando monatina (Ejemplo 7) versus la actividad utilizando triptofano fue comparada, para determinar cuál enzima tuvo la mayor especificidad para la reacción de aminotransferasa de monatina. Estos resultados indicaron que la enzima con la más alta especi icidad para la reacción de la monatina versus la reacción de triptofano es la glutamato-oxaloacetato-aminotransferasa porcina tipo lia, GOAT (Sigma G7005) . Esta especificidad fue independiente de qué aceptor de amino fuera utilizado. Por lo tanto, esta enzima fue utilizada en las reacciones acopladas con oxaloacetato- descarboxilasa . Una reacción típica que comienza a partir del indol-3-piruvato incluyó (concentraciones finales) Tris-HCl 50 mM pH 7.3, indol-3-piruvato 6 mM, piruvato de sodio 6 mM, aspartato 6 mM, PLP 0.05 mM, fosfato de potasio 3 mM, cloruro de magnesio 3 mM, 25 µg/ml de aminotransferasa, 50 µg/ml de aldolasa ProA de C. testosteroni , y 3 Unidades/ml de descarboxilasa (Sigma 04878). Las reacciones se dejaron proceder por 1 hora a 26°C. En algunos casos, la descarboxilasa fue omitida o el aspartato fue sustituido con alfa-cetoglutarato (como controles negativos) . Las enzimas aminotransferasas descritas anteriormente fueron también probadas en lugar de GOAT para confirmar los experimentos de especificidad previos. Las muestras fueron filtradas y analizadas por LC/MS como se describe en el Ejemplo 10. Los resultados muestran que la enzima GOAT produjo la más alta cantidad de monatina por mg de proteína, con la menor cantidad de triptofano producido como un subproducto. Además, existió un beneficio doble a triple al haber agregado la enzima descarboxilasa. La enzima AspC de E. coli también produjo grandes cantidades de monatina en comparación a las otras aminotransferasas . La producción de monatina fue incrementada por: 1) la adición periódica de concentraciones 2 mM de indol-piruvato, piruvato y aspartato (cada media hora a una hora) y 2) realizando las reacciones en una ambiente anaeróbico o con amortiguadores desgasif cados, 3) permitiendo que las reacciones procedieran toda la noche, y 4) utilizando descarboxilasa recién preparada que no ha sido congelada-descongelada múltiples veces. La descarboxilasa fue inhibida por concentraciones de piruvato mayores de 12 mM. A concentraciones de indol-3 -piruvato mayores de 4 mM, se aceleraron las reacciones colaterales con indol-3 -piruvato. La cantidad de indol -3 -piruvato utilizada en la reacción pudo ser incrementada si la cantidad de aldolasa fue también incrementada. Se encontró que altos niveles de fosfato (50 mM) y aspartato (50 mM) son inhibitorios para la enzima descarboxilasa. La cantidad de enzima descarboxilasa agregada pudo ser reducida a 0.5 U/ml sin disminución en la producción de la monatina en una reacción de 1 hora. La cantidad de monatina producida se incrementó cuando la temperatura fue incrementada de 26°C a 30°C y de 30°C a 37°C; no obstante, a 37°C las reacciones colaterales del indol -3-piruvato fueron también aceleradas. Las cantidades de monatina producida se incrementaron conforme se incrementaba el pH de 7 a 7.3, y fue relativamente estable de pH 7.3 a 8.3. Una reacción típica que comienza con el triptofano incluyó (concentraciones finales) Tris-HCl 50 mM pH 7.3, triptofano 20 mM, aspartato 6 mM, piruvato de sodio 6 mM, PLP 0.05 mM, fosfato de potasio 3 tt??, cloruro de magnesio 3 mM, 25 µ9/p?1 de aminotransferasa, 50 µg/ l de aldolasa ProA de C. testosteroni , 4 Unidades/ml de descarboxilasa, 5-200 mU/ml de L-aminoácido-oxidasa (sigma A-2805) , 168 U/ml de catalasa (Sigma C-3515) y 0.008 mg de FAD. Las reacciones fueron llevadas a cabo por 30 minutos a 30°C. Se observó mejoramiento con la adición de descarboxilasa. La mayor cantidad de monatina fue producida cuando se utilizaron 50 mU/ml de oxidasa. Los mejoramientos fueron similares a aquellos observados cuando se utilizó la indol-3-piruvato como el sustrato. Además, la cantidad de monatina producida se incrementó cuando 1) el nivel de triptofano fue bajo (por ejemplo, por debajo de la Km de la enzima aminotransferasa, y por lo tanto incapaz de competir con MP en el sitio activo) , y 2) la proporción de oxidasa a aldolasa y aminotransferasa fue mantenida a un nivel tal que el indol-3-piruvato no pudo acumularse . Ya sea que se inicie con el indol-3 -piruvato o con el triptofano, la cantidad de monatina producida en los ensayos con tiempos de incubación de 1 a 2 horas, se incrementó cuando se utilizaron 2 a 4 veces las cantidades de todas las enzimas, mientras que se mantenía la misma proporción de enzima. Utilizando cualquier sustrato, se lograron concentraciones de aproximadamente 1 mg/ml de monatina. La cantidad de triptofano producido si se comienza a partir de indol -piruvato fue típicamente menor de 20% de la cantidad del producto, lo cual muestra el beneficio de utilizar las reacciones acopladas. Con optimización adicional y control de las concentraciones de los intermediarios y las reacciones colaterales, se puede mejorar la productividad y el rendimiento en gran medida. Reacciones acopladas utilizando lísína-epsilon-amínotransferasa (EC 2.6.1.36) La lisina-epsilon-aminotransferasa (L-Lisina-6-transaminasa) se encuentra en varios organismos, incluyendo Rhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces, Nocardia,
Flavobacterium, Candida utilis, y Streptomyces. Esta es utilizada por los organismos como el primer paso en la producción de algunos antibióticos de beta-lactama (Rius y Demain, J. Microbiol. Biotech. 7: 95-100, 1997). Esta enzima convierte la lisina a L-2-aminoadipato-6-semialdehído (alisina) , por una transaminación mediada por PLP del carbono 6 de la lisina, utilizando alfa-cetoglutarato como el aceptor del grupo amino. La alisina es inestable y espontáneamente sufre una deshidratación intramolecular para formar 6-carboxilato de 1-piperideina, una molécula cíclica. Esto inhibe efectivamente que ocurra cualquier reacción inversa. El esquema de reacción se describe en la Figura 12. Se puede utilizar también una enzima alternativa, la lisina-piruvato- 6-transaminasa (EC 2.5.1.71) . Una reacción típica contenía en 1 mi: Tris-HCl 50 mM pH 7.3, indol-3-piruvato 20 mM, PLP 0.05 mM, fosfato de potasio 6 mM pH 8, piruvato de sodio 2-50 mM, cloruro de magnesio 1.5 mM, lisina 50 mM, 100 µg de aminotransferasa (lisina-epsilon-aminotransferasa LAT-101, BioCatalytics Pasadena, California) , y 200 µ de aldolasa ProA de C. testosteroni . La actividad de monatina producida se incrementó conforme se incrementaban las concentraciones de piruvato. La cantidad máxima utilizando estas condiciones de reacción (a 50 mM de piruvato) fue 10 veces menor que la que se observó con las reacciones acopladas utilizando oxaloacetato-descarboxilasa (aproximadamente 0.1 mg/ml) . Un pico con [M+H]+=293 eluyó al tiempo esperado para la monatina, y el espectro de masa contenía varios de los mismos fragmentos observados con otros procesos enzimáticos. Un segundo pico con la proporción correcta de masa a carga (293) eluyó ligeramente más temprano que lo que se observa típicamente para la S,S-monatina producida en el Ejemplo 6 y puede indicar la presencia de otro isómero de monatina. Muy poco triptofano fue producido por esta enzima. No obstante, existe probablemente alguna actividad sobre el piruvato (produciendo alanina como un subproducto) . También, se sabe que la enzima es inestable. Pueden ser realizados mejoramientos al llevar a cabo los experimentos de evolución directa para incrementar la estabilidad, reducir la actividad con el piruvato, e incrementar la actividad con MP. Estas reacciones pueden también ser acopladas a la L-aminoácido- oxidasa/catalasa como se describió anteriormente. Otras reacciones acopladas Otra reacción de acoplamiento que puede mejorar el rendimiento de la monatina a partir del triptofano o el indol -piruvato, se muestra en la Figura 13. La formiato-deshidrogenasa (EC 1.2.1.2 ó 1.2.1.43) es una enzima común. Algunas formiato-deshidrogenasas requieren NADH mientras que otras pueden utilizar NADPH. La glutamato-deshidrogenasa catalizó la interconversión entre el precursor de monatina y la monatina en ejemplos previos, utilizando amortiguadores basados en amonio. La presencia del formiato de amonio y la formiato-deshidrogenasa es un sistema eficiente para la regeneración de cofactores, y la producción de dióxido de carbono es una manera eficiente para disminuir la velocidad de las reacciones inversas (Bommarius et al., Biocatalysis 10: 37, 1994 y Galkin et al. Appl . Environ. Microbiol. 63: 4651-6, 1997) . Además, grandes cantidades de formiato de amonio pueden ser disueltas en el amortiguador de reacción. El rendimiento de la monatina producido por las reacciones de glutamato-deshidrogenasa (o aminaciones reductivas similares) pueden ser mejoradas por la adición de la formiato- deshidrogenasa y el formiato de amonio. Pueden ser utilizados otros procesos para impulsar el equilibrio hacia la producción de monatina. Por ejemplo, si el aminopropano es utilizado como el donador de aminoácido en la conversión de MP a monatina con una omega-aminoácido-aminotransferasa (EC 2.6.1.18) tal como aquellas descritas en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,360,724 y 5,300,437, uno de los productos resultantes podría ser la acetona, un producto más volátil que el sustrato, aminopropano. La temperatura puede ser elevada periódicamente por periodos cortos para encender la acetona, con lo cual se alivia el equilibrio. La acetona tiene un punto de ebullición de 47°C, una temperatura que probablemente no degrada los intermediarios si se utiliza por periodos cortos de tiempo. La mayoría de las aminotransferasas que tienen actividad sobre la alfa-cetoglutarato tienen también actividad sobre el precursor de monatina. Similarmente , si se utiliza una aminotransferasa de glioxilato/ácido aromático (EC 2.6.1.60) con la glicina como el donador de amino, se produce glioxilato que es relativamente inestable y tiene un punto de ebullición altamente reducido en comparación a la glicina. Ejemplo 14 Expresión Recombinante Con las secuencias de ADNc y de aminoácidos de la enzima, públicamente disponibles, y las enzimas y las secuencias descritas aquí, tales como las SEQ ID NOs : 11 y 12, así como las variantes, polimorfismos, mutantes, fragmentos y fusiones de las mismas, se hace posible la expresión y purificación de cualquier proteína, tal como una enzima, mediante técnicas estándares de laboratorio. Una persona de experiencia en la técnica comprenderá que las enzimas y fragmentos de las mismas pueden ser producidas recombinantemente en cualquier célula u organismo de interés, y purificadas antes del uso, por ejemplo antes de la producción de la SEQ ID NO: 12 y derivados de la misma. Los métodos para producir proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, el alcance de esta invención incluye la expresión recombinante de cualquier proteína o fragmento de la misma, tal como una enzima. Por ejemplo, ver la Patente de los Estados Unidos No. 5,342,764 a Jonson et al.; Patente de los Estados Unidos No. 5,846,819 a Pausch et al.; Patente de los Estados Unidos No. 5,876,969 a Fleer et al. y Sambrook et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Capítulo 17) . En resumen, las secuencias de ADNc parciales, de longitud completa o variantes, que codifican para una proteína o péptido, pueden ser ligadas dentro de un vector de expresión, tal como un vector de expresión bacteriano o eucariótico. Las proteínas y/o los péptidos pueden ser producidos mediante la colocación de un promotor corriente arriba (5') de la secuencia de ADNc. Los ejemplos de promotores incluyen, pero no están limitados a lac, trp, tac, trc, operador mayor y regiones promotoras del fago lambda, la región de control de la proteína de recubrimiento fd, los promotores temprano y tardío del SV40, los promotores derivados del polioma, adenovirus, retrovirus, baculovirus y virus de simio, el promotor para la 3-fosfoglicerato-cinasa , los promotores de la fosfatasa ácida de levadura, el promotor de los factores de acoplamiento alfa de levadura y combinaciones de los mismos. Los vectores adecuados para la producción de proteínas nativas intactas incluyen pKC30 (Shimatake y Rosenberg, 1981, Nature 292: 128), pKK177-3 (Amann y Brosius, 1985, Gene 40: 183) y pET-3 (Studier y Moffatt, 1986, J. Mol. Biol . 189: 113) . Una secuencia de ADN puede ser transferida a otros vehículos de clonación, tales como otros plásmidos, bacteriófagos, cósmidos, virus animales y cromosomas artificiales de levadura (YACs) (Burke et al., 1987, Science 236: 806-12). Estos vectores pueden ser introducidos dentro de una variedad de hospederos incluyendo células somáticas, y organismos simples o complejos, tales como bacterias, hongos (Timberlake y arshall, 1989, Science 244: 1313-7), invertebrados, plantas (Gasser y Fraley, 1989, Science 244: 1293), y mamíferos (Pursel et al., 1989, Science 244: 1281- 8) , que se hacen transgénicas por la introducción del ADNc heterólogo . Para la expresión en células de mamífero, una secuencia de ADNc puede ser ligada a los promotores heterólogos, tales como el virus de simio SV40, el promotor en el vector pSV2 (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78: 2972-6), e introducidos dentro de las células, tales como las células COS-1 de mono (Gluzman, 1981, Cell 23: 175-82) , para lograr la expresión transitoria o a largo plazo. La integración estable de la construcción del gen quimérico puede ser mantenida en células de mamífero mediante selección bioquímica, tal como neomicina (Southern y Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41) y ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78: 2072-6) . La transferencia del ADN dentro de células eucarióticas , tales como células humanas o de otro mamífero, es una técnica convencional. Los vectores son introducidos dentro de las células recipientes como ADN puro (transfección) por ejemplo, mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham y Vander Eb, 1973, Virology 52: 466), fosfato de estroncio (Brash et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 2013), electroporación (Neumann et al., 1982, EMBO J. 1: 841), lipofección (Felgner et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 84: 7413), DEAE-dextrano (McCuthan et al., 1968, J". Nati. Cáncer Inst. 41: 351), microinyección (Mueller et al., 1978, Cell 15: 579), fusión de protoplastos (Schafner, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci . BUA 77: 2163-7), o pistolas de pellas (Klein et al., 1987, Nature 327: 70). Alternativamente, el ADNc puede ser introducido mediante infección con vectores virales, por ejemplo retrovirus (Bernstein et al., 1985, Gen. Engrg. 7: 235) tales como adenovirus (Ahmad et al., 1986, J. Virol. 57: 267) o Herpes (Spaete et al., 1982, Cell 30: 295). En vista de las muchas posibles modalidades a las cuales pueden ser aplicados los principios de la presente descripción, se debe reconocer que las modalidades ilustradas son únicamente ejemplos particulares de la descripción, y no deben ser tomadas como una limitación sobre el alcance de la descripción. Más bien, el alcance de la descripción está en concordancia con las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto, se reclama como invención todo aquello que entre dentro del alcance y espíritu de estas reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (1)
1.4.1.4) y una combinación de las mismas. RESUMEN DE LA INVENCION Se describen los métodos y las composiciones que pueden ser utilizados para elaborar la monatina a partir de glucosa, triptofano, ácido indol-3 -láctico, indol-3 -piruvato y ácido 2-hidroxi-2- (indol-3-ilmetil) -4 -cetoglutárico . Se describen también los métodos para producir los intermediarios del indol -3 -piruvato y el ácido 2-hidroxi-2-(indol-3-ilmetil) -4-cetoglutárico. Las composiciones proporcionadas incluyen moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, estructuras químicas y células. Los métodos incluyen los procesos in vitro e in vivo, y los métodos in vitro incluyen las reacciones químicas. 11 Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg lie Arg Thr Met Arg Arg Thr Val 325 330 335 Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Val 340 345 350 lie Asn Gln lie Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln 355 360 365 Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn lie Phe lie Thr Val Ser Gly Arg 370 375 380 Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln 385 390 395 400 Thr lie Asn Asp Ala Val Arg Asn Val Asn Arg Glu 405 410 <210> 9 <211> 1182 <212> ADN <213> Bacillus subtilis <400> 9 atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc 60 tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt 120 ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca 180 tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa 240 aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa 300 gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg 360 cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt 420 gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc 480 aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa 540 gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat 600 gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg 660 gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt 720 ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat 780 gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt 840 gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt 900
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