MXPA04009411A - Pancreas quimerico. - Google Patents

Abstract

Metodos, tejidos y composiciones novedosos para incrementar la masa pancreatica de un recipiente mamifero que incluye cosechar tejido pancreatico inmaduro a partir de un donante mamifero y trasplantar dicho tejido dentro de la cavidad peritoneal de recipiente mamifero bajo condiciones que permiten que el tejido pancreatico se vascularice y madure, por lo tanto desarrollando un pancreas endocrino quimerico funcional que produce al menos insulina en el recipiente; la invencion tambien incluye tejido pancreatico inmaduro de mamifero, adaptado para transplante dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamifero para incrementar la masa pancreatica del recipiente mamifero asi como metodos y composiciones para tratamiento del tejido pancreatico, inmunosupresion del recipiente y bloqueo de coestimulacion del recipiente.

Description

PANCREAS QUIMERICO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de los E.U.A. número de serie 60/367,181 , presentada el 25 de marzo del 2002 e incorporada en la presente invención como si se re-formulara en la presente invención por completo.

DERECHOS GUBERNAMENTALES EN LA INVENCION Esta invención se realizó con el apoyo de la subvención económica gubernamental R01 DK53497 a partir de los National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos de América tiene ciertos derechos en esta invención.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiera el campo de la biotecnología, en particular, a métodos, tejidos y composiciones para incrementar la masa pancreática de un recipiente mamífero.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diabetes mellitus idiopática o primaria es un trastorno crónico del metabolismo de carbohidratos, grasas, y proteínas caracterizado en su forma completamente expresada por una deficiencia absoluta o relativa de insulina, hiperglucemia por ayuno, glucosuria, y una impresionante tendencia hacia el desarrollo de aterosclerosis, microangiopatía, nefropatía, y neuropatía. La subutilización de la glucosa es característica de todos los pacientes diabéticos, pero solamente algunos tienen una deficiencia severa de insulina claramente definida que se produce por la pérdida de las células beta. La gran mayoría de los pacientes diabéticos padecen de algún deterioro de la respuesta de secreción de insulina asociada con una marcada resistencia a la insulina en los tejidos periféricos. La frase "diabetes mellitus idiopática" abarca un grupo heterogéneo de trastornos que tienen en común las características anteriormente mencionadas. Se han identificado al menos dos variantes principales comunes así como diversas variantes menos severas de la enfermedad. Una de las variantes principales, la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) (tipo I), se considera para aproximadamente 10% de los diabéticos. Una segunda variante, la diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) (tipo II) representa el remanente 90% de todos los pacientes diabéticos. Mediante la terapia de reemplazo de insulina regular ausente utilizando insulina producida exógenamente y/o el monitoreo cuidadoso de la dieta de los pacientes diabéticos, dichos pacientes experimentan un amplio intervalo de síntomas debilitantes, algunos de los cuales pueden progresar hacia un coma y finalmente a la muerte. En los mamíferos, el páncreas es el órgano principal responsable para el mantenimiento de la normoglucemia. Generalmente, el páncreas de mamífero maduro se desarrolla a partir de 2 yemas pancreáticas (o primordios) denominados el páncreas dorsal y el páncreas ventral. Estos primordios se fusionarán durante el desarrollo para formar el páncreas aunque el primordio dorsal se genera primero y produce la mayoría del páncreas. El primordio ventral se genera junto al conducto biliar y forma parte del proceso de la cabeza y del proceso uncinado del páncreas. El páncreas maduro tiene tanto funciones exócrinas (digestión) como endocrinas (hormonal). La función exócrina incluye la secreción de enzimas para ayudar en la digestión. La función hormonal pancreática incluye la secreción de al menos insulina y glucagon, dos hormonal las cuales juntas ayudan a regular los niveles de glucosa en sangre. Dentro del páncreas endocrino, se encuentran las células beta, las cuales están organizadas en áreas denominadas islotes de Langerhans, que crean y excretan la insulina. El glucagon se secreta por las células alfa dentro de los islotes de Langerhans. Se han realizado muchos intentos para reemplazar la masa y/o la función pancreática en recipientes diabéticos a través de métodos quirúrgicos. Por ejemplo, el trasplante de islotes de Langerhans digeridos y aislados derivados a partir de páncreas de cadáveres de humano a humanos diabéticos inmunosuprimidos es una forma establecida pero experimental de tratar la diabetes mellitus. Dada la tecnología existente, la mayor limitación de esta técnica es el abastecimiento insuficiente de tejido pancreático de humano disponible para el transplante. Además, el tejido de la isleta se puede perder o degradar durante los procedimientos de digestión y de aislamiento así como después del transplante puesto que solamente una fracción de los islotes transplantados se injerta en el hospedero. El incremento de masa de las células beta dentro de los islotes también puede ser sub-óptimo puesto que muchos transplantes exhiben un potencial imitado para la expansión de la masa de las células beta. Además, la inmunosupresión y problemas relacionados implicados en cualquier transplante de tejido de cadáveres pueden ser bastante significativos. El isotransplante de todo el páncreas inmaduro de rata fetal a un espacio renal subcapsular de rata, cámara anterior del ojo, testículos, cavidad subcutánea, tercer ventrículo, y cavidad de la mejilla, también se conocen en la técnica. Dicho trabajo también incluye el efecto del tratamiento de insulina sobre el crecimiento y diferenciación del tejido transplantado. También se conoce el trasplante de islotes maduros de rata y de hámster digeridos con colagenasa y aislados dentro de pliegues de la piel de hámster y tejido muscular estriado en donde los islotes aislados se revascularizan. Se sabe que al menos dos regímenes inmunosupresores, ciclosporina A (CsA) y 15-deoxiespergualina (DOS), son útiles para dichos xenoinjertos. De manera similar, se conoce la inyección de páncreas de rata disperso en desarrollo (fragmentado, disociado y digerido con colagenasa) dentro de la cavidad peritoneal o dentro del sitio subcapsular de los ríñones de ratas diabéticas con aloxano, para revertir, al menos temporalmente, su diabetes. Los agrupamientos de islotes aislados de páncreas porcino fetal también han sido utilizados como un transplante xenogenéico para pacientes diabéticos humanos. Por lo tanto, se sabe aislar islotes pancreáticos a partir de fetos de cerdo e inyectar los islotes dentro de una vena de un paciente diabético humano. Un problema notable con dichos procedimientos es la necesidad para mantener la inmunosupresión con ciclosporina, prednisolona y azatioprina. Un problema adicional es que dichos injertos no ayudan al recipiente a alcanzar el control para los niveles de glucosa circulante. Las desventajas de los métodos anteriores son significativas. Los métodos con células dispersas o en agrupamiento requieren grandes cantidades de tejido del donante y usualmente múltiples donantes por recipiente. También se necesita una fuerte inmunosupresión para ayudar a evitar el rechazo agudo de las células transplantadas. Además, dada la forma dispersa de los transplantes celulares y en agrupamiento, el implante actual puede ser difícil de controlar y nunca se ha creado un órgano quimérico particular, en desarrollo. Entre otras diferencias, los transplantes tempranos de tejido pancreático total adulto o inmaduro han utilizado tejido substancialmente más desarrollado que el de la presente invención y no se han enfocado en el peritoneo como el sitio de transplante. Como un resultado, las técnicas anteriores exhiben un riesgo incrementado de rechazos hiperagudos y/o vasculares agudos así como el potencial de desarrollo de la función pancreática exócrina no deseada e innecesaria. Solamente la presente invención provee el desarrollo de un órgano pancreático quimérico recientemente vascularizado, con función endócrina, pero no exócrina, a la vez que evita o reduce sustancialmente al menos el rechazo hiperagudo y el rechazo vascular agudo. El páncreas quimérico de la presente invención incrementa substancialmente o al menos es capaz de incrementar la masa funcional dentro del hospedero para establecer al menos niveles casi normales de glucemia dentro del hospedero. Esto se refleja por al menos: 1 ) la ausencia de insulina en transplantes de tejido pancreático inmaduro al momento del implante y la presencia de dicha insulina secretada en los islotes en desarrollo dos semanas después del transplante; y 2) el retraso de aproximadamente 30 días entre el transplante del tejido pancreático inmaduro en ratas diabéticas con estreptozotocina y la euglucemia resultante del hospedero conforme el tejido se desarrolla y madura. Por consiguiente, y a la luz del fracaso de cualesquiera de los métodos anteriores para llevar a un tratamiento efectivo de la diabetes mellitus en humanos, existe una necesidad de desarrollar métodos novedosos, tejidos, y composiciones para transplantar tejido pancreático inmaduro dentro de recipientes mamíferos para incrementar la masa pancreática del recipiente.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Una modalidad de la presente invención se dirige a un método novedoso para incrementar la masa pancreática de un recipiente mamífero que comprende cosechar tejido pancreático inmaduro a partir de un donante mamífero y transplantar dicho tejido dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero bajo condiciones que permiten que el tejido pancreático se vascularice y madure, por lo tanto desarrollando un páncreas quimérico funcional endocrino que produce al menos insulina en el recipiente. Otra modalidad de la presente invención es tejido pancreático inmaduro de mamífero adaptado para transplante dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero para incrementar la masa pancreática del recipiente mamífero. Otra modalidad de la presente invención es composiciones para inmunosupresión del recipiente y métodos para inmunosuprimir al recipiente de un transplante de tejido pancreático inmaduro dentro de la cavidad peritoneal del recipiente mamífero para disminuir la posibilidad de rechazo del tejido transplantado. Otra modalidad de la presente invención son composiciones que bloquean la co-estimulación del recipiente y métodos para bloquear la coestimulación de la respuesta inmune del recipiente de un transplante de tejido pancreático inmaduro dentro de la cavidad peritoneal del recipiente mamífero para disminuir la posibilidad de rechazo del tejido transplantado.

Otra modalidad de la presente invención incluye composiciones y métodos para el tratamiento del tejido cosechado para mejorar el crecimiento y desarrollo post-implante del tejido. Esta modalidad puede comprender incubar el tejido pancreático inmaduro aislado de mamífero, adaptado para transplante dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero, con factores de crecimiento antes del implante para mejorar el crecimiento y desarrollo post- transplante del tejido transplantado en el recipiente mamífero. En cada modalidad en la presente invención, el tejido pancreático inmaduro puede comprender tejido pancreático de mamífero fetal el cual, al momento de la cosecha, no está sustancialmente vascularizado por el donante y está sustancialmente libre de células presentadoras del antígeno. Un objetivo de la presente invención es proveer métodos, tejidos y composiciones para transplantar tejido pancreático inmaduro de mamífero dentro de recipientes mamíferos para incrementar la masa pancreática del recipiente. Otros aspectos y características serán en parte evidentes y en parte serán señalados a continuación.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1A es un metanefros de cerdo (pm) en el día embrionario (E) 28,14 días post-implante en el omentum de ratón; Las figuras 1 B y 1 C muestran secciones teñidas con hematoxilina y eosina ("H & E") de los metanefros de cerdo embebidos en parafina 14 días post-implante en el omentum de ratón. Los glomérulos están marcados (g); La figura 1 D ilustra una sección embebida en parafina de un metanefros de cerdo en desarrollo 14 días post-implante dentro del omentum de ratón teñida con marcador anti-CD31 de célula endotelial específica de ratón. La tinción positiva (positiva a CD31 ) de las estructuras vasculares de origen de ratón (flecha y cabeza de flecha) está delineando el metanefros de cerdo; se muestran amplificaciones para A & B (A) y para C y D. La figura 2A es un metanefros (m) de cerdo 14 días post-implante dentro de un omentum de ratón; Las figuras 2B-2E muestran secciones teñidas con H & E de los metanefros implantados. Los glomérulos están marcados (g), se muestran amplificaciones para A & B (B), C, D y E; La figura 3A es una fotografía de una sección del duodeno (dúo) a partir de un embrión de rata Lewis en E12.5. El primordio del páncreas dorsal (dp) y el primordio del páncreas ventral (vp) están marcados; La figura 3B es una sección teñida con H & E del dp y del vp con el duodeno removido; La figura 3C es una vista a mayor aumento del páncreas dorsal que se muestra en las figuras 3B y 3C que ilustra un cordón condensado de células túbulo-acinares (flechas); La figura 4A muestra una sección H & E de un primordio pancreático obtenido a partir de un embrión de rata Lewis en E12. 5; La figura 4B muestra una sección adyacente de un primordio teñido con anticuerpo anti-insulina indicando que no existe tinción positiva en la sección del tejido; Las figuras 4C a 4F muestran el primordio pancreático dos semanas post-transplante con 4C y 4E mostrando las secciones control teñidas y 4D y 4F mostrando la tinción con anticuerpos anti-insulina. Las flechas delinean los islotes de Langerhans como estructuras positivas a la tinción; La figura 5A es una sección control teñida con el anticuerpo que se origina a partir de un primordio pancreático ventral, 6 semanas post-implante en el peritoneo de una rata Lewis adulta. El tejido con tinción negativa está delineado por flechas; La figura 5B es una sección adyacente teñida con anticuerpo anti-insulina. Las fechas delinean el tejido de la isleta. El tejido ha llevado a cabo crecimiento, están presentes más islotes que a las 2 semanas post-transplante; Las figuras 5C y 5D son vistas a mayor aumento de otra sección control teñida con el anticuerpo y otra sección teñida con anti-insulina, respectivamente. Las figuras 5E y 5F son secciones de tejido teñidas con anticuerpos anti-insulina en las cuales los islotes ductales en desarrollo que permanecen conectadas al epitelio del ducto están delineados por flechas; La figura 6 ¡lustra un primordio del páncreas aproximadamente quince semanas post-transplante mostrando la estructura de los islotes del tejido del órgano quimérico, con estroma rodeado por grasa peritoneal, con flechas delineando a los islotes; La figura 6A es una sección teñida con H & E; La figura 6B es una sección control teñida; Las figuras 6C y 6D son secciones teñidas con anti-insulina; La figura 7 A muestra secciones de tejido pancreático recuperado quince semanas post-transplante, los islotes se muestran señalados por las flechas; La figura 7B muestra, para comparación, secciones del primordio pancreático dorsal a partir de una rata recién nacida, se muestran células acinares señaladas por cabezas de flecha mientras que los islotes se muestran señalados por las fechas; La figura 8A muestra una imagen de microscopía electrónica de una célula dentro de una isleta, en donde la célula está llena de gránulos neurosecretores que contienen núcleos densos excéntricos los cuales representan insulina cristalizada (flechas); La figura 8B muestra una mayor amplificación de los gránulos; La figura 9 muestran los niveles comparativos de glucosa de ratas isotransplantadas, controles que no se sometieron a cirugía, y ratas a las que se les indujo diabetes durante un periodo de treinta y cinco días; La figura 10 muestran los niveles comparativos de glucosa de ratas isotransplantadas, controles que no se sometieron a cirugía, y ratas a las que se les indujo diabetes durante un periodo de cuatro meses; La figura 11A es un portaobjetos que muestra una sección transversal de un tejido pancreático inmaduro xeno-transplantado (rata a ratón tratado con vehículo), cuatro semanas post-transplante; La figura 1 1B es un portaobjetos que muestra una sección transversal de un tejido pancreático inmaduro xeno-transplantado (rata a ratón tratado con bloqueo de co-estimulacíón), cuatro semanas post-transplante; y La figura 12 muestra secciones transversales de un páncreas de rata xeno-transplantado que exhiben diferentes protocolos de tinción: La figura 12A muestra un control con suero; La figura 12B muestra el uso de un anticuerpo anti-insulina el cual resalta a las células productoras de insulina; y La figura 12C muestra una tinción de Gomori combinada la cual resalta a los islotes pancreáticos (identificados por flechas en cada marco).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La siguiente descripción detallada se provee para ayudar a aquellos expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. No debe considerarse que la descripción limite indebidamente a la presente invención puesto que se pueden realizar modificaciones y variaciones de las modalidades discutidas en la presente invención por aquéllos expertos en la técnica sin apartarse del espíritu o alcance del presente descubrimiento de invención. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, bases de datos y otras referencias citadas en esta solicitud, todas las solicitudes relacionadas referidas en la presente invención, y todas las referencias citadas en la presente invención, se incorporan como referencias en su totalidad como si se establecieran en la presente invención y por completo y como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente, base de datos u otras referencias se indicaran específicamente e individualmente para ser incorporadas como referencias. Una modalidad de la presente invención se dirige a un método novedoso para incrementar la masa pancreática de un recipiente mamífero que comprende cosechar tejido pancreático inmaduro a partir de un donante mamífero y trasplantar dicho tejido dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero bajo condiciones que permiten que el tejido pancreático se vascularice medíante vasos sanguíneos que se originan a partir del hospedero y madure, por lo tanto desarrollando un páncreas quimérico funcional endocrino que produce al menos insulina en el recipiente. El tejido pancreático inmaduro puede comprender tejido pancreático inmaduro de mamífero el cual, en el momento de la cosecha, no está al menos sustancialmente vascularizado por el donante y está al menos sustancialmente libre de células presentadoras del antígeno. Una modalidad preferida comprende cosechar tejido pancreático inmaduro a partir de al menos un donante mamífero embrionario, preferiblemente un donante porcino, dicho tejido comprendiendo al menos un primordio pancreático dorsal, ventral o combinado dorsal y ventral sustancialmente no vascularizado y primordio pancreático ventral sustancialmente libre de células presentadoras del antígeno. Dicho tejido se transplanta dentro de la cavidad peritoneal de un paciente humano diabético en un sitio adyacente a las ramificaciones de la arteria mesentérica superior. Después del transplante, dicho tejido se vasculariza y madura, por lo tanto desarrollando un páncreas quimérico funcional endocrino que produce al menos insulina en el recipiente. Dicho método preferido también puede comprender la administración de inmunosupresión o un bloqueo de coestimulación al sistema inmune del recipiente para ayudar en la prevención del rechazo del tejido transplantado. Dicho método preferido también puede comprender métodos y composiciones para tratar el tejido para mejorar el crecimiento y desarrollo post-implante del tejido.

Los donantes mamíferos adecuados se pueden seleccionar para compatibilidad con un hospedero basándose en protocolos de transplante conocidos, así como en diversos factores incluyendo fisiología similar, tamaño del órgano, perfiles antígénicos, disponibilidad del donante y similitud de la función endocrina del páncreas. Un donante mamífero preferido para un recipiente humano puede ser cerdo criado para estar libre de patógenos y posiblemente transgénico para algunas proteínas de humano tal como el factor acelerador de la degeneración y CD59, o cerdo deficiente en alfa-gal transferasa. Los cerdos son los donantes xenogenéicos preferidos para recipientes humanos debido a, entre otros factores, su tamaño comparable de órgano y su disponibilidad general como donantes. Además, los procedimientos de homeostasis de la glucosa y regulación de la secreción de insulina son muy similares en cerdos y en humanos. Además, el tejido pancreático inmaduro de humano se puede preferir para el transplante alogenéico en recipientes humanos. En una modalidad preferida, el tejido pancreático inmaduro puede comprender al menos un primordio embrionario dorsal o pancreático que no está sustancialmente vascularizado en el donante en el momento de la cosecha. Dicho tejido puede comprender adicionalmente tanto el primordio dorsal como el primordio ventral, uno o más de dichos primordios, los páncreas totales (tanto el primordio dorsal como el primordio ventral o primordios fusionados), o dicho tejido a partir de uno o más donantes. Aunque se prefiere utilizar todo el primordio, también está dentro del alcance del tejido pancreático inmaduro de la presente invención el incluir porciones no digeridas, no disociadas de dicho tejido. El tejido pancreático inmaduro se puede cosechar a partir de al menos un donante en una etapa adecuada de desarrollo, es decir, inmediatamente antes o pocos días después de que los primordios dorsal y ventral se fusionen, y antes de la vascularización y la creación y distribución en el tejido de células presentadoras del antígeno por el donante. Preferiblemente, el tejido pancreático inmaduro se cosecha poco después de que el páncreas inmaduro empieza su formación y se pueda disecar libre de tejidos del donante y antes de la presencia de vasos sanguíneos que se originan ya sea dentro del páncreas o fuera del páncreas. La cosecha antes de la vascularización se prefiere particularmente puesto que las células maduras presentadoras del antígeno aún no se habrán formado en los embriones en desarrollo a partir de los cuales se obtienen los primordios pancreáticos o si se han formado, aún no habrán migrado hacia el primordio pancreático avascular. En este momento, el tejido pancreático inmaduro puede ser considerado libre o al menos sustancialmente libre de células presentadoras del antígeno. El tejido cosechado demasiado tarde en el desarrollo del páncreas, por ejemplo, tejido que tiene vasos sanguíneos visibles, puede contener más células presentadoras del antígeno y antígeno de superficie celular y por lo tanto representa más de una amenaza de rechazo por el recipiente. El tejido cosechado en el tiempo preferido de desarrollo y vascularización estará substancialmente libre de células presentadoras del antígeno lo cual significa que la posibilidad de al menos rechazo vascular hiperagudo y rechazo vascular agudo en transplantes no-isoinjerto se reduce en gran medida cuando se compara con los transplantes de injertos vascularizados o aquéllos que contienen células presentadoras del antígeno. La etapa de desarrollo específico para cosechar el tejido pancreático variará dependiendo de la especie del donante. En las ratas, el páncreas se forma en el día 1 1-12 de un periodo de 22 días de gestación con el tiempo preferido para cosecha del tejido pancreático inmaduro siendo entre aproximadamente el día 12 a aproximadamente el día 13. En ratones, la formación del páncreas es alrededor del día 10-1 1 de un periodo de gestación de 19 días y la cosecha preferida es de aproximadamente el día 11 a aproximadamente el día 12. En los cerdos, el páncreas se forma en los días 16-18 de un periodo de gestación de 115 días con la cosecha preferida siendo entre aproximadamente el día 20 a aproximadamente el día 38 con un periodo más preferido para cosecha siendo entre aproximadamente el día 25 a aproximadamente el día 35 y la fecha más preferida para cosecha siendo aproximadamente el día 29. En humanos, el páncreas se forma días 31-40 de un periodo de gestación de 270 días con la cosecha preferida siendo entre aproximadamente el día 40 a aproximadamente el día 50 o antes en el primer trimestre de preñez.

En un aspecto de la presente invención, el recipiente es un mamífero y puede ser de cualquier edad. Un recipiente preferido es un humano, y más preferiblemente es un paciente humano con diabetes tipo II o tipo I. En otra modalidad preferida, dicho recipiente exhibe masa pancreática funcional reducida como un resultado de padecer una de las enfermedades anteriormente mencionadas. Un método preferido comprende implantar tejido pancreático inmaduro que comprende al menos un primordio pancreático total de un donante mamífero embrionario dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero bajo condiciones que permiten que el tejido pancreático inmaduro se vascularice y madure, por lo tanto desarrollando un páncreas quimérico funcional endocrino que produce al menos insulina en el recipiente. El tejido pancreático se implanta dentro de la cavidad peritoneal del recipiente utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad, el tejido pancreático se implanta cerca del omentum del recipiente adyacente a una ramificación de la arteria mesentérica superior, y preferiblemente se implanta dentro de una cavidad del omentum. El tejido pancreático inmaduro transplantado utilizando las técnicas descritas en la presente invención inicialmente no está vascularizado y, por lo tanto, crece y se vasculariza al menos en parte por los vasos sanguíneos del recipiente, desarrollando al menos un páncreas quimérico endocrino. Los páncreas quiméricos se caracterizan por la formación de islotes de Langerhans maduros y funcionales, las cuales pueden producir y externalízar al menos insulina y posiblemente, glucagon y somatostatina. La vascularización por el recipiente puede facilitar la aceptación del tejido xenogenéico transplantado. Más específicamente, la ausencia de vascularización existente en el trasplante y la ausencia de anastomosis vascular entre el tejido transplantado y el recipiente en el momento del transplante, ayuda a evitar al menos el rechazo hiperagudo y el rechazo vascular agudo de los tejidos. Por lo tanto, los transplantes xenogenéicos de la presente invención son capaces de evitar dos de los tipos más severos de rechazo de órganos y se vascularizan y se desarrollan hacia órganos quiméricos funcionales dentro de los hospederos. Para el transplante alogenéico del tejido pancreático inmaduro, cualquier primordio(s) embrionario se puede transplantar dentro de un recipiente de la misma especie el cual necesita de dicho transplante. Si se desea, se puede llevar a cabo una coincidencia de haplotipo MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) entre un donante y un recipiente utilizando cualquier método conocido en la técnica, tal como la reacción de linfocito mezclado. Las condiciones adecuadas para vascularización y madurez del páncreas endocrino quimérico de la presente invención también pueden incluir el uso de métodos pre o post-operativos y composiciones para facilitar el desarrollo y funcionamiento del tejido transplantado y prevenir el rechazo del transplante. En el trasplante isogenéico y en algunos casos de transplante alogenéico, puede no haber rechazo por parte del hospedero del tejido pancreático transplantado, por lo tanto, se pueden evitar los métodos y composiciones de inmunosupresion y/o co-estimulación. Además, el tejido pancreático inmaduro de la invención se puede adaptar para uso en la presente invención mediante tratamiento con factores de crecimiento y otros compuestos y composiciones para mejorar su crecimiento y desarrollo dentro del hospedero, su desarrollo de células beta productora de insulina dentro del hospedero, y para reducir la probabilidad de rechazo del transplante. Otra modalidad de la presente invención son composiciones y métodos que bloquean la co-estimulación del recipiente (véase el ejemplo régimen 1 y régimen 2) por el transplante de tejido pancreático inmaduro dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero para incrementar la masa pancreática del recipiente mamífero. Como se sabe, las células T CD4+ desempeñan un papel principal en el rechazo agudo, mediado por células T de aloinjertos y xenoinjertos no vascularizados. Por lo tanto, el combate de dicho rechazo mediante el direccionamiento de la activación y/o función de las células T CD4+ mediante el bloqueo de la co-estimulación de la respuesta de las células T del recipiente ha probado ser efectivo en la presente invención. Los agentes inmunomoduladores adecuados y los métodos que dirigen y sub-modulan la respuesta de células T del hospedero al tejido transplantado se pueden utilizar y se contemplan en la presente invención. El primero de dichos métodos comprende las composiciones de CTLA4lg (Genetics Institute, Cambridge MA) y anti-CD2 (Pharmingen, San Diego CA) los cuales se pueden administrar al recipiente antes, durante y después del transplante. Un segundo método del bloqueo de co-estimulac¡ón comprende composiciones de anti-CD 1 la (Pharmingen, San Diego CA), anti-CD45RB (Clone 23G2, Pharmingen, San Diego CA) y anti-CD154 (CloneMRI , Pharmingen, San Diego CA) las cuales también se pueden administrar antes, durante y después del transplante. En al menos el caso del transplante xenogenéico, la invención puede incluir métodos y composiciones de inmunosupresión para el recipiente. Esto se realiza usualmente mediante la inmunosupresión del recipiente después del implante. El tratamiento con ciclosporina A (CSA) puede proveer suficiente inmunosupresión para prevenir el rechazo del tejido del donante. Los métodos de tratamiento con CSA para prevenir el rechazo del transplante se conocen en el campo médico. Las técnicas locales de inmunosupresión se describen por Gruber (1992), Transplantation 54: 1-1 1 . En la Patente de E.U.A. No 5,560,91 1 , se describen los anticuerpos dirigidos en contra de idiotipos sobre anticuerpos anti-animales de humano que se presentan naturalmente para uso en la inhibición del rechazo por xenoinjerto. También se conocen las globulinas anti-linfocitos para la prevención de rechazo del transplante (Lacy et al. (1981 ), Diabetes 30: 285-291 ). Como una alternativa a la inmunosupresión, el páncreas implantado se puede tratar antes del implante para reducir su antigenicidad. Los métodos ejemplares para la reducción de la inmunogenicidad de transplantes mediante modificación de superficie se describen por Faustman WO 92/04033 (1992).

En un aspecto preferido de la invención, la composición para inmunosupresión dada al recipiente que recibe el tejido pancreático inmaduro se basará en el uso de aquellos agentes inmunosupresores que han probado ser menos diabetogénicos. Por ejemplo, el uso de corticosteroides, ciclosporina A, o tacrolimus se puede limitar para los propósitos de transplante descritos en la presente invención. Un ejemplo de un tratamiento inmunosupresor exitoso se puede basar en uno utilizado en el método de Edmonton (Shapiro et al, 2000), el cual requiere una dosis elevada de Sirolimus (no-diabetogénico) a largo plazo, una dosis baja de Tacrolimus (diabetogénico) a largo plazo y Daclizumab a corto plazo. El tejido pancreático inmaduro se puede adaptar para transplante mediante su preparación para o manteniéndolo en frío (aproximadamente a 4°Celsius) antes de transplante pero después de cosechar. La invención puede comprender adicionalmente adaptar el tejido pancreático para transplante mediante el contacto del tejido pancreático inmaduro aislado de mamífero con factores de crecimiento, medio para crecimiento, y otros compuestos y composiciones para mejorar el crecimiento y el desarrollo post-implante del tejido. Una de dichas composiciones puede comprender el factor de crecimiento de hepatocito (preferiblemente 10-9 M) y VEGF (preferiblemente 5 ug/ml) en medio de Ham F12:de Eagle modificado por Dulbecco (preferiblemente 50 a 100 ul de una mezcla 50: 50) post-cosecha y antes del implante. En una modalidad preferida, el tejido se incuba con dicha composición por 3/4-3 horas a 4° Centígrados.

El tejido cosechado se puede tratar con diversos factores de crecimiento y agentes promotores de crecimiento, o combinaciones de los mismos, para mejorar el desarrollo del transplante. Por ejemplo, poniendo en contacto el tejido cosechado con el factor de crecimiento de hepatocito (HGF) se puede mejorar la proliferación de la célula beta e incrementar la masa de los islotes in vivo. De manera similar, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se puede utilizar para incrementar la vascularización de los islotes pancreáticos. Otros factores de crecimiento que se pueden emplear para diseñar e implementar protocolos para mejoramiento del desarrollo y maduración incluyen, entre otros: ligandos de la familia del factor de crecimiento epidémico (EGF), los cuales pueden regular la determinación del linaje de células endocrinas dentro del primordio pancreático mantenido en cultivo de órganos; la betacelulina (BTC), la cual favorece la diferenciación de la célula beta; y la Neuregulina (NRG-4), la cual afecta el desarrollo de las células delta productoras de somatostatina; antagonistas de retinoide, los cuales inhiben la diferenciación acinar in vitro; miembros de la familia del factor de crecimiento transformante (TGFs), factores de crecimiento (IGFs), gastrina, activina A, y miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). El desarrollo mejorado del transplante, específicamente de las células beta, se puede mejorar mediante la administración post-quirúrgica de insulina, particularmente insulina exógena, al recipiente. En una modalidad preferida, la invención incluye el paso de administrar insulina exógena al paciente post-transplante para mejorar el desarrollo del tejido transplantado. Después de un período de desarrollo suficiente, es evidente que el tejido transplantado de la invención es capaz de excretar insulina. En virtud del transplante de tejido dentro de la cavidad peritoneal, la insulina excretada se libera directamente dentro del sistema portal del recipiente. Por lo tanto, el transplante del tejido pancreático inmaduro utilizando los métodos y composiciones de la invención contribuye a incrementar la masa endocrina funcional del recipiente. También, después de un período de desarrollo suficiente, es evidente que el tejido pancreático exócrino está ausente del páncreas quimérico. En lugar de eso, éste consiste de islotes de Langerhans y tejido estromal como se muestra en la figura 7. Por lo tanto, no existe necesidad de inventar metodología para separar secreciones pancreáticas exócrinas a partir del páncreas quimérico.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen modalidades de la invención. Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones en la presente invención serán evidentes a un experto en la técnica a partir de la consideración de la especificación o de la práctica de la invención como se describe en la presente invención. Se pretende que la especificación, junto con los ejemplos, se consideren solamente ejemplares, con el alcance y espíritu de la invención siendo indicado por las reivindicaciones que se encuentran a continuación del ejemplo.

Regímenes de bloqueo de co-estimulación para transplante porcino a ratón Régimen 1 : En este ejemplo, el tejido de metanefros porcino en desarrollo (primordio renal en desarrollo) se transplante a partir de un cerdo donante dentro de un ratón recipiente. El método de tratamiento implicó la administración a los ratones recipientes C57B1/6J, de una composición de CTLA4lg, 0.5 mg/día a los días 2 y 1 antes del implante, el día del implante y al día 5 post-implante; y una composición de anti CD2, 0.5 mg al día del implante y a los días 3,7 y 10 post-implante. Se muestra en la figura 1A un metanefros de cerdo (m) 14 días post-implante dentro del omentum de ratón. Las secciones teñidas con H & E de metanefros embebidos en parafina se muestran en las figuras 1 B y 1 C. Los glomérulos están marcados (g). La figura 1 D ilustra una sección embebida en parafina teñida con anti-CD31 específico de ratón (6). Un vaso sanguíneo (flecha) y asas capilares glomerulares (cabezas de flecha) están delineados en el metanefros de cerdo. Estos vasos sanguíneos y asas son de origen de ratón (tinción + para anti-CD31 específico de ratón). Los glomérulos (g) están marcados. Por lo tanto, es evidente que el tejido porcino transplantado no se rechazó en el ratón recipiente y, de hecho, se desarrolló y se vascularizó por el recipiente durante su desarrollo.

Régimen 2: Este método y composiciones también se ejemplifican por un transplante de metanefros de porcino a ratón. Los ratones recipientes fueron tratados con antiCDI 1a, 0.2 mg iv al día del implante y a los días 0,1 , 7, y 14 post-implante; anti CD45RB, 0.2 mg iv a los días 3 y 2 antes 5 del implante, 0.3 mg al día 1 antes del implante y 0.1 mg al día del implante y a los días 1 -10 post implante; y ant¡CD154, 0.25 mg iv el día antes del implante, el día del implante y a los días 2 y 4 post-implante. En la figura 2A se muestra el metanefros de cerdo (m) 14 días post-implante dentro del omentum de ratón. Las secciones teñidas con H & E se muestran en las í o figuras 2B-2E. Un uréter (u) está marcado en la figura 2B. la zona nefrogénica (nefronas en desarrollo) está delineada (flechas figuras 2C y D). Un glomérulo (g) está marcado en las figuras 2D y 2E. De nuevo, las figuras post-implante establecen que el metanefros se vascularizó y desarrolló dentro del hospedero sin rechazo. 15 El transplante del primordio pancreático embrionario produce la formación de islotes de Lanqerhans Un primordio pancreático que consiste tanto del páncreas dorsal como ventral se cosechó quirúrgicamente bajo un alcance de disección a 0 partir de un embrión de rata Lewis en E12. 5, y se suspendió en solución salina en hielo bajo condiciones estériles (véase la figura 3A). Dentro de las 2 horas después de la remoción, el primordio pancreático se implantó dentro del omentum de una rata Lewis adulta. Dos semanas después del implante, la rata Lewis adulta se sacrificó, y el transplante pancreático se removió para análisis histológico. El examen histológico de las secciones de masa del tejido fijado, embebido en parafina, y colocado sobre un portaobjetos que se tiñeron con hematoxilina y eosina reveló que el primordio pancreático transplantado creció y se desarrolló hacia tejido que contenía islotes de Langerhans. En la figura 3A se muestra una fotografía de una sección del duodeno (dúo) a partir de un embrión de rata Lewis en E12.5. El páncreas dorsal (dp) y el páncreas ventral (vp) están marcados. En la figura 3B se muestra una sección teñida con H & E de los primordios pancreáticos dorsal y ventral con el duodeno removido. La figura 3C es una vista con mayor amplificación de los primordios pancreáticos dorsal y ventral que se muestra en 3B. Para determinar si la inmunorreactividad para insulina está presente en el primordio pancreático en E12.5, los inventores llevaron a cabo tinciones adicionales. La figura 4A muestra una sección teñida con H & E de un primordio pancreático obtenido partir de un embrión de rata Lewis en E12.5. La figura 4B muestra una sección adyacente teñida con un anticuerpo anti-insulina. No se detectó tinción positiva para insulina en E12.5. A las dos semanas de post-transplante del primordio pancreático total dentro del omentum de una rata Lewis, el tejido ha llevado a cabo diferenciación. En la figura 4C se muestra una sección control teñida con el anticuerpo y en la figura 4D, una sección adyacente teñida con insulina. Los tejidos correspondientes negativos (4C) y positivos (4D) están delineados (cabezas de flecha). En la figura 4E se muestra una sección control teñida de otro páncreas transplantado 2 semanas después del implante y en la figura 4F se muestra una sección adyacente teñida con insulina. Un islote de Langerhans está delineado (flechas). Se muestran amplificaciones para A & B (A), para C & D (C) y para E & F (E). Para caracterizar el crecimiento y desarrollo del primordio pancreático más allá de las 2 semanas y el patrón de inmunorreactividad a la insulina, los inventores examinaron las estructuras que estaban presentes en el peritoneo del hospedero 6 ó 15 semanas después del transplante del primordio pancreático de E12.5. En la figura 5A se muestra una sección control teñida con el anticuerpo que se origina a partir de un primordio pancreático, 6 semanas post-implante dentro del peritoneo de una rata Lewis adulta. En la figura 5B se muestra una sección adyacente teñida con anticuerpo anti-insulina. El tejido del islote está delineado (flechas). En las figuras 5C y 5D se muestran vistas con mayor amplificación de otras secciones control teñidas con el anticuerpo (figura 5C) y una sección adyacente teñida con anticuerpo anti-insulina (figura 5D). Las figuras 5E-5F son secciones teñidas con anticuerpos anti-insulina en las cuales los islotes con ductos en desarrollo que permanecen conectados al epitelio del ducto (d) están delineados (flechas). Se muestran las amplificaciones para A & B (A), para C & D (C), y para E y F. La figura 6 ilustra un primordio pancreático de 15 semanas post-transplante. La figura 6A muestra una sección teñida con H & E y en la figura 6B, una sección control con suero teñida. La sección correspondiente teñida con el anticuerpo anti-insulina se muestra en la figura 6C. La figura 6D muestra un islote de Langerhans agrandado, teñido con anticuerpos antiinsulina. Las flechas delinean a los islotes. Se muestran amplificaciones en A para A hasta C y en D. El "órgano" es un órgano novedoso, que consiste de tejido de islote dentro de estroma rodeado por grasa peritoneal. No existe reacción inflamatoria en el peritoneo que podría sugerir actividad secretoria exócrina activa. El método combinado de Gomori tiñe a las células beta de color púrpura y a las células acinares de color rosa brillante. En la figura 7A se muestra una sección a partir de un primordio pancreático desarrollado de 15 semanas post-transplante. En la figura 7B se muestra una sección del páncreas dorsal a partir de una rata recién nacida. Los islotes (flechas) y las células acinares (cabezas de flecha) están delineados. Como se podría esperar, la tinción positiva combinada de Gomori (rosa brillante) del tejido acinar está presente en la figura 7B. En contraste, en la figura 7A solamente está presente el tejido del islote rodeado por estroma que no está teñido. Se muestran amplificaciones (B). Se llevó a cabo la microscopía electrónica para describir si las células beta contenían gránulos de insulina. La figura 8A muestra una célula dentro de un islote. Su citoplasma está lleno de gránulos neurosecretores que contienen núcleos densos excéntricos los cuales representan insulina cristalizada (flechas). Una amplificación mayor de los gránulos se muestra en la figura 8B.

Tratamiento de diabetes mellitus por estreptozotocina mediante transplante de primordio pancreático Después de la medición de los niveles básales de glucosa sanguínea (día 0), se indujo la diabetes por estreptozotocina en ratas Lewis. Un grupo control (control, n=8) recibió el vehículo en lugar de la estreptozotocina. Al día 5 post-estreptozotocina o vehículo, se midieron los niveles de glucosa en sangre. En algunas ratas diabéticas con estreptozotocina, se transplantaron 10 primordios pancreáticos dentro del peritoneo (n=3 transplantes). Otras ratas fueron sometidas a cirugía sin procedimiento adicional (N=7 diabéticas). Los niveles de glucosa se midieron de nuevo a las 8 AM los días 14, 28 y 35 post administración del vehículo o de la estreptozotocina. Como se muestra en la figura 9, los niveles de glucosa se elevaron en las ratas diabéticas en comparación con los controles a los días 5, 14, 28, y 35. En contraste, al día 35, los niveles de glucosa no fueron diferentes entre las ratas control y transplantadas (previamente hiperglucémicas).** p < 0.01 vs Control para ese día; * P < 0.05 vs Control para ese día, procedimiento de comparación múltiple de Dunnett. Se llevaron a cabo las pruebas de tolerancia a la glucosa en un segundo grupo de ratas control (n=6), ratas diabéticas (n=4) y ratas transplantadas (previamente hiperglucémicas) (n=6) a las 18 semanas post-transplante de 10 primordios pancreáticos dentro del grupo transplantado, utilizando la metodología descrita en Brown et al, Diabetes 30: 9-13 (1981 ). A las ratas se les hizo ayunar durante toda la noche, se contuvieron envolviéndolas en una toalla, y se les dio D-glucosa a una dosis de 0.5 g/kg de peso corporal mediante inyección rápida dentro de la vena de la cola. Subsecuentemente se recolectaron muestras de sangre a partir de la vena de la cola. El valor k para la velocidad de desaparición de glucosa (%/min) se determinó utilizando valores de 10, 20 y 30 min. Los valores K (%/min) para desaparición de glucosa en ratas control y en ratas dialécticas fueron de 2.92 ± 0.44 y 0.48 ± 0.26 respectivamente, comparables a los valores reportados por Brown et al (control > diabética, p < 0.01 ). Los valores K para las ratas transpiantadas fueron de 2.82 ± 0.46, no significativamente diferentes a partir de los controles y se incrementaron significativamente en comparación con los animales diabéticos. El nivel de glucosa se midió semanalmente en las ratas utilizadas para generar los datos mostrados en la figura 9. La normoglucemia se presentó por 4 meses (16 semanas) (figura 10).

Xenotransplante del primordio pancreático embrionario Los primordios pancreáticos de ratas Lewis en E12.5 se transplantaron dentro del omentum de ratones C57B1/6J. Algunos ratones hospederos fueron tratados con agentes para bloqueo de la co-estimulación exactamente como se mencionó anteriormente [hCTLA4-lg: 0.2 mg i.p. al día del transplante (día 0); y a los días 2 y 4 post-transplante; anti-CD45RB (Clona 23G2):, 0.1 mg i. v. al día 3 antes del transplante (día -3) hasta el día 0, y 0.1 mg i. p. a los días 1-10 post-transplante; y anti-CD154: 0.25 mg i. p. a los días 0, 2 y 4 post-transplante.] Otros ratones se trataron con inyecciones del vehículo. La figura 1 1 A muestra un primordio pancreático de ratas Lewis 4 semanas post transplante dentro del omentum de un ratón C57B1/6J tratado con el vehículo. La figura 1 1 B muestra un primordio pancreático de ratas Lewis 4 semanas post transplante dentro del omentum de un ratón C57B1/6J que se trató con agentes bloqueadores de la co-estimulación. En contraste con el tejido no diferenciado que se muestra en la figura 1 1 A, los islotes (flechas) se pueden discernir en la figura 1 1 B. La figura 12 muestra un segundo primordio pancreático de rata Lewis en E12.5, 4 semanas post-transplante dentro del omentum de un ratón adulto C57B1/6J que recibió el bloqueo de la co-estimulación. Figura 12A, control con suero; figura 12B, anticuerpo anti-insulina; figura 12C, tinción combinada de Gomori. Los islotes están delineados (flechas).

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1. - El uso de tejido pancreático de mamífero a partir de un donante mamífero en la elaboración de un medicamento para incrementar la masa pancreática de un recipiente mamífero, dicho tejido comprende tejido pancréatico inmaduro sustancialmente no vascularizado, adaptado para desarrollar un páncreas endocrino quimérico funcional bajo condiciones que permiten que dicho tejido pancreático inmaduro sustancialmente no vascularizado se vascularice y madure, de modo que dicho tehido produzca al menos insulina en el recipiente.

2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el recipiente mamífero es un humano.

3. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el donante mamífero es un cerdo.

4. - El uso como se reclama en la reivindicación 3, en donde dicho tejido se obtiene a partir de aproximadamente el día 20 a aproximadamente el día 35 del periodo gestacional del donante.

5. - El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde dicho tejido se adapta para introducción adyacente a una ramificación de la arteria mesentérica superior del recipiente.

6. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho tejido se adapta para introducción dentro de una cavidad del omentum del recipiente.

7. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho tejido pancreático inmaduro sustancialmente no vascularizado comprende al menos una porción no digerida, no disociada de al menos un primordio pancreático sustancialmente no vascularizado al menos sustancialmente libre de células presentadoras del antígeno.

8. - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde dicho primordio comprende al menos un primordio pancreático ventral. 9.- El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde dicho primordio comprende al menos un primordio pancreático dorsal. 10. - El uso como se reclama en la reivindicación 7, en donde dicho tejido comprende al menos un páncreas total. 1 1 . - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho medicamento adicionalmente se adapta para co-administración con al menos una composición para inmunosupresión al recipiente para reducir la posibilidad de rechazo de dicho tejido por dicho recipiente. 12. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho medicamento adicionalmente se adapta para co-administración con al menos una composición del bloqueo de co-estimulación a dicho recipiente para reducir la posibilidad de rechazo de dicho tejido por dicho recipiente. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , que comprende adicionalmente tratar dicho tejido para mejorar el crecimiento post- administración y el desarrollo del tejido. 14. - Un tejido pancreático inmaduro de mamífero, adaptado para transplante dentro de la cavidad peritoneal de un recipiente mamífero para incrementar la masa pancreática del recipiente mamífero, dicho tejido comprendiendo al menos una porción no digerida, no disociada de al menos un primordio pancreático sustancialmente no vascularizado al menos sustancialmente libre de células presentadoras del antígeno. 15. - El tejido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho tejido está adaptado para transplante mediante su preparación para o manteniéndolo en frío antes del transplante y después de la cosecha. 16. - El tejido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho tejido está adaptado para transplante mediante el contacto de dicho tejido con factores de crecimiento. 17.- El tejido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho tejido comprende al menos un primordio pancreático ventral. 18. - El tejido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho tejido comprende al menos un primordio pancreático dorsal. 1

9. - El tejido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho tejido comprende al menos un páncreas total. 20.- El uso de tejido pancreático de mamífero a partir de un donante mamífero en la elaboración de un medicamento para tratar diabetes en un recipiente mamífero, dicho tejido comprendiendo tejido pancreático inmaduro sustancialmente no vascularizado, adaptado para desarrollar un páncreas endocrino quimérico funcional, bajo condiciones que permiten que dicho tejido pancreático inmaduro sustancialmente no vascularizado se vascularice y madure de modo que dicho tejido produzca al menos insulina en el recipiente.