MXPA04007585A

MXPA04007585A - Metodo para la produccion de proteinas recombinantes en microorganismos.

Info

Publication number: MXPA04007585A
Application number: MXPA04007585A
Authority: MX
Inventors: Pasternack Ralf
Original assignee: N Zyme Biotec Gmbh
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2005-09-20
Also published as: WO2003066842A3; EP1472346A2; CA2475277A1; WO2003066842A2; JP2005525798A; AU2003210137A8; AU2003210137A1; CN1768138A

Abstract

La invencion se refiere a un metodo para producir un plasminogeno funcional recombinante en microorganismos, y a un metodo para identificar los activadores de plasminogeno. La secuencia de acidos nucleicos que codifica la parte funcional del plasminogeno se fusiona con una molecula de acidos nucleicos que codifica para al menos un peptido de senal. La molecula de acidos nucleicos que codifica para el plasminogeno y la molecula de acidos nucleicos que codifica para el peptido de senal se combinan con los codones para las interfases de proteasa que aseguran la separacion del peptido de senal. El plasminogeno recombinante o la plasmina correspondiente son adecuadas para tratar heridas que son lentas de sanar o no sanan, mediante la aplicacion de la enzima en una formulacion apropiada.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN MICROORGANISMOS Campo Técnico El sistema fibrinolítico humano incluye como elemento central la plasmina proteasa (Pm) . Por una parte la plasmina es capaz de degradar la fibrina y por otra parte de activar la matriz de metaloproteinasas (MMPs) y los factores de crecimiento, que a su vez son responsables conjuntamente de la degradación de la matriz extracelular y del saneamiento de heridas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La plasmina se origina mediante esto de su molécula precursora, el plasminógeno . Hasta ahora, se conocen dos activadores fisiológicos del plasminógeno (también referidos como activadores de plasminógeno, PA) . Estos son el activador de plasminógeno del tipo de tejido (PA de tipo de tejido; t-PA) y el activador de plasminógeno del tipo de urocinasa (PA de tipo de urocinasa; u-PA) . Además el sistema se regula a través de un conjunto de inhibidores de proteasa, e.g., a2-antiplasmina . Las dos propiedades biológicas más importantes del plasminógeno y la plasmina respectivamente se relacionan directamente a los dos diferentes activadores. La forma mediada por el así llamado t-PA es responsable de la homeostasis de la fibrina, mientras la forma mediada por la u-PA es la más destacada en la migración celular y el remodelado de tejido. Puede mostrarse en particular que en el caso crónico de ratones deficientes en u-PA, no ocurre el saneamiento de heridas. Lo mismo se aplica a ratones, los genes de los cuales se desactivaron para el plasminógeno y el t-PA y u-PA respectivamente. Además, el tiempo de vida de los animales se acortó claramente, lo cual se debe ínter alia, a trombosis y colapso de órgano. Una revisión acerca del sistema plasminógeno/ plasmina se publicó por Desire Collen (Thrombosis and Haemostasis, 82, 1999 (1)). El uso terapéutico de la plasmina es adecuado para el tratamiento de pacientes con ataque o choque cardiaco, en el caso del cual una disolución rápida del coagulo de fibrina es esencial para la sobrevivencia y así representa un tratamiento alternativo para alguien con activadores de plasminógeno, el cual logra la hidrólisis del coagulo de fibrina sólo indirectamente. Los modelos de ratón anteriormente mencionados muestran que la plasmina es además un terapéutico potencial, que puede utilizarse en el tratamiento de no saneamiento de heridas o únicamente lento. Normalmente, la activación del plasminógeno mediante t-PA tiene lugar solo en la presencia de fibrina, tal como después de la terminación de la cascada de coagulación sanguínea. En ausencia de un sustrato la plasmina se inhibe casi inmediatamente mediante a2-antiplasmina . Esta interacción se admite claramente lenta a través de la unión de plasmina a la fibrina y la degradación del coagulo de fibrina se activa mediante esto. Se utilizan diferentes estrategias de la activación del plasminogeno para terapia, ya que en el caso de un ataque o choque cardiaco, la disolución del coagulo sanguíneo es frecuentemente inevitable para la sobrevivencia de los pacientes. Por ejemplo, la infusión de estreptocinasas conduce a una rápida recanalización de los lúmenes de vasos. La terapia de activación del plasminogeno con estreptocinasa, una proteína bacterial, no se basa en una activación proteolítica sino en un complejo. Después este complejo puede activar otras moléculas de plasminogeno a plasmina. Además una urocinasa se utiliza terapéuticamente, cuya admisión como la estreptocinasa no puede distinguir el plasminogeno de unión a la fibrina a partir del plasminogeno libre sobre un nivel molecular. Por lo tanto se desarrolló el t-PA humano recombinante , el cual se probó por sí mismo como superior a la estreptocinasa en los estudios clínicos. Pero estos diagnósticos encontrados no se confirmaron por otros estudios. Precisamente los activadores del plasminogeno producido recombinantemente tales como rt-PA (más diferentes derivados) , urocinasa-PA de cadena sencilla recombinante y estafilocinasa recombinante que acentúa la importancia de los sistemas de producción producidos con los métodos genéticamente moleculares para la producción de proteínas recombinantes para el uso en la terapia moderna. El plasminógeno es la molécula precursora de la plasmina de la enzima fibrinolítica . El ADNc (Malinowski et al., Biochemistry, 23, 1984 (12); Forsgren et al., FEBS Lett. 213, 1987 (2)) así como el gen inclusivo de los intrones no codificados (Petersen et al., J. Biol . Chem. , 265, 1990 (3)) para el plasminógeno humano ya se publicaron en la literatura científica . El plasminógeno humano (hPg) , la proenzima de la plasmina de la proteasa de serina, es una glicoproteína que consiste de una cadena de polipéptidos de 791 aminoácidos con un peso molecular de 92.000 y un punto isoeléctrico teórico de 7.1. La tasa de carbohidrato está al 2% (Collen, 1999, (1) ) . El plasminógeno se produce en el hígado, la concentración de plasma es de aproximadamente 200 mg/1 (1.5-2 µ?) . La molécula se divide en 7 dominios de estructura,-asentado con esto se encuentra el péptido de preactivación N-terminal (Glu-1 - Lys-77) , cinco dominios Kringle parcialmente homólogos y el dominio de proteinaza catalíticamente activo (Val-562 - Asn-791; Collen, 1999 (1) ) . El motivo de la estructura de la terna catalítica común hacia todas las proteasas de serina consiste de los aminoácidos His-603, Asp-646 y Ser-741. El dominio 1 Kringle sirve como una secuencia de reconocimiento para unir el plasminogeno a la fibrina (Petersen et al., 1990 (3)) y diferentes receptores de superficie celular. Entre las modificaciones post-translacionales los dos sitios de glicosilación esenciales Asn-289 y Thr-346, que ambos se localizan en el dominio 3 Kringle se acentúan especialmente para la función del plasminogeno (capacidad de activación a través de las diversas proteinasas y estreptocinasa respectivamente, propiedades de unión al receptor) . Considerando estas dos formas de modificaciones principales del plasminogeno se distinguen: plasminogeno I representa el patrón de glicosilación descrito anteriormente plasminogeno II carece de la modificación en Asn- 289 Otro sitio de glicosilación es el aminoácido Ser-248. El aminoácido Ser-248 puede existir en la forma fosforilada. La activación tiene lugar en el organismo a través del desdoblamiento proteolítico entre los aminoácidos Arg-561 y Val-562. Subsecuentemente otra activación proteolítica tiene lugar entre Lys-77 y Lys-78 hacia Lys-78-hPg. De manera alternativa esta unión puede hidrolizarse inicialmente también directamente en Glu-Pg. La plasmina activa Lys-78-hPm se une a través de los puentes de disulfuro en cada caso. Por lo tanto la cadena pesada del hPm (1/78-561) es responsable de la interacción con los sustratos, e.g., fibrinógeno y fibrina. La cadena ligera (562-791) que resulta a partir de la C-terminal representa la sub-unidad catalíticamente activa. Ya conocido en la literatura se encuentra un método, que se utilizó para la producción recombinante del dominio de unión a la fibrina del plasminógeno en Pichia pastoris con un rendimiento de 17 mg/1 (Duman et al., Biotechnol Appl . Biochem. 28; 39-45 1998 (4)) . La glicosilación de este dominio ( ringle 1-4) pudiera probarse por los autores. Otra cita describe la producción de los dos dominios Kringle 4 y 5 del plasminógeno humano (Guan et al., Sheng u Gong Cheng Xue Bao, 17, 2001 (5)). El objetivo fue identificar el dominio, que puede inhibir el crecimiento de células endotélicas. Sin embargo, los dominios de plasminógeno producidos recombinantemente por los dos grupos de trabajo en Pichia pastoris no poseen el dominio catalítico decisivo para la funcionalidad fisiológica. Gonzalez-Gronow et al., (Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6)) comparó una con otra la expresión del plasminógeno humano recombinante en Escherichia coli y células COS, una línea celular de riñon de simio. La producción microbial falló en E. coli, que se atribuye por los autores a la gicosilación inadecuada. Fue exitosa la producción de la cadena de polipéptido, pero en una forma no capaz de activación, i.e., el tratamiento con activadores (urocinasa y t-PA) no resultó en la plasmina activa. La glicosilación ausente da como resultado una proteína, que carece de funciones fisiológicas importantes con respecto a la capacidad de activación (actividad de enzima no detectable) así como con respecto al reconocimiento celular endotélico (González -Gronow et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6)). Además la modificación post- ranslacional con los carbohidratos influye significativamente la vida media en la sangre de los mamíferos. Se considera que los autores pueden producir el plasminógeno funcional en células COS. Otros autores describen la expresión funcional en células de insecto (Whitefleet-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys., 271, 1989 (7) ) . Sin embargo, en el uso de células de mamífero e insecto las condiciones de cultivo son lentas y de alto costo así como lo realizable, son desventajosas las bajas cantidades de proteína. Además en células de mamífero no son adecuadas para producir grandes cantidades de una proenzima debido a la expresión intracelular y a las proteasas en el citoplasma (Nilsen y Castellino, Protein Expression and Purification, 16, 1999 (8) y Busby et al., J. Biol . Chem. , 266, 1991 (9)). Típicamente en el sistema de baculovirus/lepidoptera (células de insecto) los rendimientos de expresión son solamente en el rango de 3-10 mg/ml . En la WO0250290 se describió la producción recombinante del mini- y micro-plasminógeno funcional en levadura. Para esto, los autores expresaron los genes para el dominio catalítico del plasminógeno humano con (mini-plasminógeno) o sin un dominio Kringle (micro-plasminógeno) en el organismo huésped Pichia pastoris . El mini- y micro-plasminógeno producido así recombinantemente respectivamente se purificó subsecuentemente, procesado a mini- y micro-plasmina respectivamente y su actividad se demostró en el experimento animal. La producción reivindicada de las proteínas recombinantes se encuentra a 100 mg/1 por mini-plasminógeno y a 3 mg/1 por micro-plasminógeno. Sin embargo entre mayor sea una proteína es más difícil su producción recombinante, que se confirma en la descripción de la O0250290 por la clara disminución en la producción de micro a mini -plasminógeno en el orden de dos exponentes decimales. No se presenta un ejemplo de una modalidad para la expresión de las variantes del plasminógeno más grande tal como el plasminógeno Lys- o Glu- . La producción recombinante del plasminógeno funcional en microorganismos no se ha descrito aún, de manera que un experto en la técnica puede ejecutarlo. Por lo tanto es el objetivo de la presente invención producir un método de plasminógeno humano funcional a bajo costo y procesarlo en la plasmina catalíticamente activa . Este objetivo se resuelve por un método de producción recombinante para la producción del plasminógeno con un microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1. Se mencionan soluciones adicionales en las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes reflejan las modalidades preferidas. Sorprendentemente se encontró que es posible en microorganismos la producción microbial recombinante del plasminógeno Glu-o Lys- funcional. Además de esto se encontró que la producción recombinante del plasminógeno micro- mini- de Lys y Glu es posible en grandes cantidades no esperadas . La materia de la invención es la clonación del gen del plasminógeno en los vectores de expresión, preferidos del gen de plasminógeno micro- y mini- y más preferidos del gen de plasminógeno Glu o Lys o en cada caso de una variante funcional del mismo y la producción recombinante del plasminógeno funcional, preferentemente plasminógeno funcional humano utilizando métodos genéticos moleculares.

Además, la invención describe la identificación de proteasas, que catalizan la activación del plasminogeno hacia la plasmina. El plasminogeno y las plasmina respectivamente, lo cual se produce a través de esta invención, se encuentra libre de contaminantes tal como las proteínas de animales o virus, que ocurren de manera natural al aislarse a partir de humanos, ganado y otros mamíferos y los cuales pueden dejar efectos colaterales en los pacientes. La invención se caracteriza por un método de la producción recombinante que comprende al menos la siguiente etapa: a.) la fusión de la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para al menos la parte funcional del péptido de plasminogeno acoplándose con una secuencia de ácidos nucleicos que codifican para al menos un péptido de señal, la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para el péptido de plasminogeno funcional y la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para al menos el péptido de señal con los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas suministradas para el desdoblamiento del péptido de señal. La producción de las proteínas terapéuticas se lleva a cabo de manera incrementada con los sistemas de producción recombinantes . Debido a los factores de costo se lucha por llevar a cabo la producción recombinante en microbios, especialmente en organismos bacteriales. Estos sistemas implican la ventaja de que junto con una producción de precio comparativamente bajo, las producciones de la proteína pueden llevarse a cabo en el rango g/1 y las proteínas recombinantes no se contaminan con los virus o proteínas tales como priones, que pueden ser peligrosos para los pacientes. Como los sistemas de producción bacterial son con frecuencia no capaces de producir correctamente la proteína varias veces, la producción frecuentemente se lleva a cabo en los sistemas eucarióticos tales como levaduras, células de insecto o células de mamífero además del plegamiento inverso in vitro de las proteínas no plegadas. Las cepas de producción eucariótica y las líneas de producción celular ofrecen la ventaja, de que pueden producirse las proteínas glicosiladas con ellas. Se aplica especialmente para células de insecto o células de mamífero, en donde la producción de la proteína recombinante es de costo muy alto y los rendimiento con frecuencia son muy bajos. Además tienen la desventaja de que pueden también contaminarse con los virus y proteínas que son dañinos para los humanos. Este no es el caso al utilizar los microorganismos eucarióticos. El equipo de instrumental para el cultivo de los microorganismos eucarióticos es comparable con el de los microorganismos bacteriales, las contaminaciones con los virus de mamífero y las proteínas no se encuentran presentes y también son posibles las producciones de la proteína en el rango g/1. Se prefiere especialmente un organismo huésped eucariótico que se cuenta para la sección de levaduras, preferentemente para la Ascomycota. También se prefiere que se cuente para la Saccharomycotina , especialmente para la clase de la Saccharomycetes, especialmente aquí para el orden de los Saccharomycetales . De acuerdo con las modalidades especialmente preferidas, el organismo huésped también se cuenta para la familia Saccharomycetaceae, aquí especialmente para el género Pichia. Los microorganismos eucarióticos preferidos utilizados de acuerdo con la invención son ej emplificativamente la levadura Saccharomyces cerevisiae para horneado, otros ejemplos son Candida, las levaduras metanotrópicas Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula plymorpha o filamentos de hongo del género Aspergillus, tales como Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Aspergillus nidulans. Se prefiere especialmente Pichia pastoris . El método para la producción recombinante también se caracteriza en que una codificación de la molécula de ácido nucleico para al menos la parte funcional del plasminógeno se incorpora en un vector de expresión para este microorganismo, la codificación de la molécula de ácido nucleico preferentemente para el plasminógeno humano se fusiona con la codificación de la molécula de ácido nucleico para al menos un péptido de señal, preferentemente un prepropéptido, preferentemente para el transporte hacia el retículo endoplásmico, los codones para sitios de desdoblamiento de las proteasas que suministran el desdoblamiento de la secuencia de señal o del prepropéptido en el organismo huésped se insertan entre las dos moléculas de ácido nucleico. Preferentemente se utiliza una molécula de ácido nucleico que codifica para el plasminogeno humano. Además puede utilizarse una molécula de ácido nucleico que codifica para las moléculas de ácido nucleico del plasminogeno humano que codifica para el plasminogeno a partir de otros mamíferos. Esto permite la producción del plasminogeno de los mamíferos respectivos. Además en el plasminogeno humano recombinante se forma de acuerdo al presente método mediante la sobreexpresión y puede, si se desea, secretarse en el medio de cultivo a partir del cual puede separarse de las células huésped a través de centrifugación, filtración o sedimentación y puede someterse a la purificación de proteína sin los complejos procesos de disrupción celular, que pueden llevarse a cabo a través de métodos conocidos por el experto en la técnica. La activación del plasminogeno en la plasmina se resuelve por las proteasas, que son capaces de procesar el plasminogeno en la plasmina catalíticamente activa. En los siguientes términos utilizados en el contexto de la presente invención se definen: "Método para la producción recombinante" se refiere, que el péptido o una proteína se expresa a partir de una secuencia de ácidos nucleicos, preferentemente una secuencia de ADN a través de un organismo huésped adecuado, la secuencia de ácidos nucleicos se formó a partir de una clonación y una fusión de las secciones individuales de ácido nucleico . "Clonación" debe comprender en la presente todos los métodos de clonación conocidos de acuerdo con el estado de la técnica, sin embargo, los cuales no se describirán en detalle, debido a que pertenecen para herramientas auto-evidentes del experto en la técnica. "Expresión, en un sistema de expresión adecuado" comprenderá en la presente todos los métodos de expresión conocidos de acuerdo con el estado en la técnica, especialmente aquellos, los cuales se mencionan en las reivindicaciones . Bajo la "parte funcional de plasminógeno-péptido" , la parte del plasminogeno o plasminógeno-péptido se entenderá que puede llevar a cabo las funciones biológicamente relevantes del plasminogeno. Estas funciones biológicamente relevantes son al menos la capacidad de activación hacia la plasmina mediante los activadores del plasminogeno tales como por ejemplo el activador de plasminogeno de tejido, urocinasa, el activador de plasminogeno de vampiro-murciélago, estreptocinasa, estafilocinasa, proteína Pía a partir de Yersinia pestis, etc., y la actividad proteolítica, que se caracteriza por la hidrólisis de fibrina. El término "activador (es) de plasminógeno" utilizado en la descripción y los ejemplos se referirá a los activadores de plasminógeno proteolítico así como no proteolítico . Adicionalmente en el caso del plasminógeno Glu se entiende la capacidad de procesamiento en el plasminógeno Lys a través del desdoblamiento catalizado por plasmina del péptido de preactivación . La capacidad de activación incrementada del plasminógeno por arriba del factor de 1000 después de la unión a la fibrina, laminina, fibronectina, vitronectina, proteoglicano de heperansulfato, colágeno tipo 4 y otros sustratos de igual modo se cuentan para las funciones biológicas. Entre las funciones biológicamente relevantes de la plasmina, que tienen que garantizarse después del procesamiento del plasminógeno, se entiende la degradación de laminina, la degradación de fibronectina, de vitronectina, de proteoglicano de heperansulfato, la activación de procolagenasa , la activación de metaloproteasas de promatriz, la activación de elastasa latente de macrófago, las pro hormonas y factores del crecimiento tales como TGFP-l (factor del crecimiento de transformación latente) , VEGF (factor del crecimiento endotelial vascular) o bFGF (factor del crecimiento de fibroblasto básico) . Otra función biológica es la capacidad de inhibición por los inhibidores de plasmina tales como a2-antiplasmina y a2-macroglobulina . Se considera a las funciones biológicamente relevantes además de la unión a la fibrina, laminina, fibronectina, vitronectina, proteoglicano de heperansulfato y colágeno tipo 4, la unión hacia los receptores tales como el a-enolasa, anexina II o amfoterina. El primero de todos los plasminógenos se forma como un plasminógeno Glu inactivo. Este plasminógeno Glu puede convertirse en plasminógeno Lys mediante la plasmina a través del desdoblamiento del así llamado péptido de preactivación . Ambos se convierten mediante el tejido de los activadores de plasminógeno (solo en este caso a través de los activadores proteolíticos anteriormente mencionados) a través del desdoblamiento proteolítico en la plasmina, que consiste de subunidades conectadas a través de los puentes de sulfuro. La subunidad más pequeña incluye el dominio proteolítico y el sitio de fosforilación, la subunidad más grande lleva las tres glicosilaciones y es responsable para unión a la fibrina. Además de que las glicosilaciones son importantes para la estabilidad en el plasma. A través de la formación de un complejo 1:1 con la estreptocinasa y la estafilocinasa, el plasminógeno puede convertirse adicionalmente en una enzima proteolíticamente activa, que es capaz de procesar el plasminógeno en la plasmina. De acuerdo con esto, el plasminógeno funcional es el plasminógeno que puede procesarse mediante los activadores de plasminógeno en la plasmina proteolíticamente activa. Además el plasminógeno funcional incluye preferentemente el dominio de unión a la fibrina y puede incluir preferentemente al menos una de las tres glicosilaciones . Las formas más pequeñas del plasminógeno funcional son las micro- y mini -plasminógeno, una forma más grande del plasminógeno Lys . El plasminógeno Glu, que todavía incluye el péptido de preactivación, es también plasminógeno funcional. Sin embargo, es imaginable, que las regiones pueden omitirse especialmente dentro de la cadena más grande sin interferir significativamente las funcionalidades anteriormente mencionadas (Inter alia proteólisis, unión a la fibrina) . Es auto-evidente para un experto en la técnica el producir diferentes formas de plasminógeno (referidos como derivados de plasminógeno en lo siguiente) , que incluyen un dominio catalítico funcional. Bajo funcional debe entenderse como ya se describió, que el plasminógeno varía las características de la actividad proteolítica después de la activación con los activadores de plasminógeno tales como estreptocinasa y urocinasa. el dominio catalítico puede comprender cancelaciones e intercambios de aminoácidos o pueden fusionarse con otros aminoácidos o péptidos o proteínas el dominio grande puede comprender todos los intermediarios a partir de Glu20 hasta Arg580 (en base a la secuencia del pre-plasminógeno) , que puede activarse con los activadores de plasminogeno en la plasmina activa Como en el ejemplo preciso se mencionarán tres formas del plasminogeno Lys : Variante 1: aminoácido N-terminal: Met88 Variante 2 : aminoácido N-terminal : Lys97 Variante 3: aminoácido N-terminal: Val98 Los derivados de plasminogeno son aproximadamente de manera preferente un número de 1 a 50 aminoácidos más cortos o más grandes que el plasminogeno micro-, mini- Lys o Glu correspondiente o preferentemente representa un intercambio de 1 a 10 aminoácidos, estos derivados además exhiben la propiedad de activarse por los activadores de plasminogeno. Entre el plasminogeno micro-, mini- Lys o Glu y los derivados de plasminogeno correspondientes existe una homología de secuencia (igualación de secuencia) sobre 80%, de preferencia sobre 85%, más preferentemente sobre 90%, mucho más preferida sobre 95%, se prefiere especialmente sobre 98% y se prefiere más especialmente sobre 99%. Preferentemente los derivados de plasminógeno representan las siguientes características: el dominio catalítico puede comprender al menos una cancelación y/o al menos un intercambio de aminoácido y/o fusionarse con al menos otro aminoácido o al menos otro péptido o al menos otra proteína . el dominio grande puede comprender todos los intermediarios a partir de Glu20 hasta Arg580 (en base a la secuencia del pre-plasminógeno) que se activan con los activadores de plasminógeno en la plasmina activa un derivado de plasminógeno representa una homología de secuencia de aminoácidos (iguala) preferida sobre 80%, más preferida sobre 85%, aún más preferida sobre 90%, especialmente preferida sobre 95%, y más especialmente preferida sobre 99%. Con "microorganismo" se encuentran comprendidos todas las formas de vida, las cuales se caracterizan únicamente por dimensiones menores. Por lo tanto comprenderán los microorganismos eucarióticos así como procarióticos . Especialmente se mencionan bacterias, levaduras, hongos y virus. "Ácido nucleico" comprenderá ADN así con ARN, ambos en todas las configuraciones imaginables, e.g., en la forma de ácido nucleico bicatenario, en la forma de ácido nucleico monocatenario, combinaciones de los mismos, así como ácidos nucleicos lineales o circulares. Bajo "secuencia de señal" se entiende una secuencia de péptidos que es capaz de garantizar el transporte de otra secuencia de péptidos en o a través de una membrana, e.g., en el retículo endoplásmico . Por lo tanto puede concebirse ej emplificativamente un prepropéptido, un prepéptido o un propéptido. Con "sitio de desdoblamiento" tales puntos se indican en una secuencia de péptidos, que se suministran para el desdoblamiento de una secuencia de señal, un prepropéptido o propéptido a partir de otra secuencia de péptidos o generalmente el desdoblamiento de una secuencia de péptidos en dos partes en un organismo huésped. Un "ácido nucleico que codificación para al menos un péptido o un prepropéptido de señal", es una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica para una estructura de péptido o de proteína, el cual proporciona al otro polipéptido una transfección en las membranas, e.g., en el retículo endoplásmico . Con "iniciador" se indica un oligonucleótido iniciador. En la presente significa oligorribo- o desoxirribonucleótidos monocatenarios , de cadena corta, los cuales son complementarios a una región en una molécula de ácido nucleico monocatenaria y puede hibridizarse con una bicatenaria. Los extremos libres 3-hidroxi en esta bicatenaria sirven como sustrato para las polimerasas de ADN y como punto de inicio para la reacción de polimerización de toda la monocatenaria en la bicatenaria. Los iniciadores se utilizan especialmente en el PCR, i.e., la reacción en cadena de la polimerasa conocida por el experto en la técnica. Con "plásmido" se indican moléculas de ácido nucleico, las cuales no se integran en el cromosoma y ocurren en muchos microorganismos procarióticos y algunos eucarióticos con una longitud de aproximadamente 2 kb hasta más de 200 kb. "Ligación" es el término para la conexión de los extremos de dos moléculas de ácido nucleico por medio de una ligasa o en línea con una auto-ligación, i.e., a través de una reacción de cierre de anillo intramolecular, en la cual los dos extremos monocatenarios de una molécula de ADN lineal dimerizan siempre que sus extremos puedan formar pares de bases unos con otros. "Endonucleasa de restricción" es el término para una clase de enzimas bacteriales, las cuales desdoblan las uniones de fosfodiéster con las secuencias de base específicas en ambas cepas de una molécula de ADN. "Electroporación" es un método para introducir ácidos nucleicos en células. Por lo tanto las membranas celulares de las células receptoras, las cuales se localizan en suspensión y crecen exponencialmente, se hacen permeables para las moléculas moleculares altas mediante breves impulsos eléctricos de alta resistencia de campo mientras se exponen a la solución de ácido nucleico. Bajo "sobreexpresión" se entiende una producción aumentada del plasminógeno funcional mediante una célula en comparación con una producción por el tipo silvestre de esta célula. Normalmente una sobreexpresión trata de, cuando el gen externo expresado asciende a aproximadamente 1 - 40% del total de la proteína celular de la célula huésped en caso de la producción intracelular . Bajo "vector de expresión" debe entenderse tales vectores, que permiten la transcripción del gen extremo clonado en el vector y la traducción subsecuente del ARNm formado (ARN mensajero) después de incorporarse dentro de una célula huésped adecuada. Los vectores de expresión normalmente contienen las señales de control, las cuales son necesarias para la expresión de los genes en células de procariontes y eucariontes. En los promotores de la presente invención que son preferentemente inducibles por metanol tales como el promotor AOX1 o especialmente se prefieren los promotores constitutivos tales como el promotor YPT-1 o el promotor GAP se utilizan para el control de la expresión del gen en levaduras tales como Pichia pastoris . Especialmente preferido es el promotor GAP constitutivo. "A0X1" es un gen de la alcohol oxidasa 1 proveniente de P. pastoris ; "GAP" es un gen de la gliceraldehído-3- fosfato dehidrogenasa proveniente de P. Pastoris y "YPT1" es un gen de una proteína de unión a GTP proveniente de P. pastoris. Los péptidos de señal de las proteínas codificadas por los genes PHO-1, SUC-2, PHA-E o alfa- F se utilizan frecuentemente para la producción secretora en levaduras. "PHOl" es un gen de la fosfatasa ácida proveniente de P. pastoris; "SUC-2" es un gen de la invertasa secretora proveniente de S. cerevisiae; "PHA-E" es un gen de la fosfatasa ácida proveniente de Phaseolus vulgaris Agglutinis; y "alfa-MF" es un gen de los factores de apareamiento alfa proveniente de S. cerevisiae . Especialmente preferidos son los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas y codones para los sitios de desdoblamiento para el desdoblamiento del propéptido para la proteasa Kex2 o la proteasa Stel3. Se prefiere especialmente que la conexión tome lugar en la etapa a) por arriba de los codones, que codifican para un sitio de desdoblamiento Kex2 y adicionalmente dos sitios de desdoblamiento Stel3. En una modalidad preferida de la presente invención la molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal o el prepropeptido viene de la levadura, especialmente de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Una modalidad más preferida se dirige a una molécula de ácido nucleico que codifica para el péptido de señal o el prepropéptido, el cual codifica para el péptido de señal o prepropéptido del factor a de la levadura Saccharomyces cerevisiae. El producto de fusión formado descrito anteriormente en la etapa a) se amplifica preferentemente a través de PCR y después adicionalmente en el purificado preferentemente. En la WO02/50290 la producción recombinante del mini- y micro-plasminógeno se describe con el vector de expresión pPICZocA adecuado para la levadura que contiene el promotor AOXl inducible y el prepropéptido de la levadura del factor alfa. Estas variantes más pequeñas del plasminógeno tienen ya sea (tal como el micro-plasminógeno) absolutamente o no o solo un dominio Kringle (tal como mini -plasminógeno) . El vector de expresión pPICZaA contiene los sitios de desdoblamiento para las proteasas Kex2 y Stel3. Sin embargo los sitios de desdoblamiento Stel3 se cancelaron en la clonación de los vectores de expresión correspondientes del mini- y micro-plasminógeno . Se conoce un conjunto de promotores para los sistemas de expresión inducibles en levadura. Aquí se cuentan inter alia, el promotor A0X1 , A0X2 , CUP1 (Koller A, Valesco J, Subramani S., Yeast 2000: 16(7), 651-6), PHOl (EP0495208) , HIS4 (US 4885242), FLD1 (Shen et al., Gene 1998: 216 (1), 93-10) y el promotor XYL1 (Den Haan y Van Zyl , Ap l . Microbiol. Biotechnol. 2001: 57(4), 521-7). Mediante el promotor A0X1 inducible de metanol la producción de la proteína heteróloga puede dirigirse selectivamente y puede obtenerse una biomasa homogénea. Antes de que se induzca la expresión de la proteína ajena los organismos huésped pueden llevar a cabo una alta densidad de crecimiento sin las desventajas de selección, las cuales pueden ocurrir en la expresión de una proteína ajena. Contrario a sus variantes más pequeñas, las cuales se expresan en la WO02/50290 bajo el control del promotor A0X1 , el plasminógeno Glu y Lys producido recombinantemente en la presente invención incluye todos los cinco dominios Kringle, que complica su producción recombinante debido a las siguientes razones: posible pérdida del cásete de expresión debido a las desventajas del crecimiento para los organismos huésped en la expresión de las proteínas ajenas; - degradación proteolítica de las proteínas expresadas y bajo rendimiento La producción del plasminógeno Glu- o Lys no se describe en la WO02/50290 debido a las desventajas descritas. Estas dificultades se resolvieron en la presente invención ínter alia en la forma que la proteína recombinante incluye un péptido de señal, un ex2 y al menos un Stel3, preferentemente dos sitios de desdoblamiento de proteasa Stel3. Además en una modalidad preferida se llevó a cabo una alimentación con glicerol como otra fuente de carbono entre 0.1 y 10 ml/h, preferentemente entre 0.5 y 5 ml/h, más preferentemente entre 0.8 y 1.5 ml/h y el medio de cultivo se amortiguó a un pH neutral de 7.0. Se pagó la atención para suficiente alimentación de oxígeno. En una modalidad preferida se pagó la atención para integrar el ácido nucleico recombinante sin la conexión con el sitio 5' del gen AOX1 , pero en relación con el sitio 5' del gen de gliceraldehído fosfato deshidrogenasa proveniente de P. pastoris . En esto, se utilizó un no inducible pero un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos que se activan en levadura y que pueden utilizarse son el promotor GAP, el promotor YPT1 (Sears et al., Yeast 1998: 14(8), 783-90), el promotor TKL (Den Haan y Van Zyl , Appl . Microbiol . Biotechnol. 2001:57(4), 521-7), el promotor ACT (Kang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 55(6), 734-41) y el promotor PMA1 (Yeast 2000: 16(13), 1191-203). Los promotores preferidos son el promotor GAP y el promotor YPT1. Un promotor especialmente preferido es el promotor GAP. Contrario a un promotor inducible, un promotor constitutivo tiene la desventaja, de que la proteína ajena a expresarse se produce constitutivamente, durante toda la fase de crecimiento. A través de esto, las desventajas ocurren para la célula huésped, la cual se demostró ínter alia en un crecimiento lento. Debido a que prevalece la presión de selección, las células huésped que han perdido el cásete de expresión recombinante tienen una ventaja y pueden crecer por encima de las células huésped recombinantes . A través de esto, puede surgir una población mezclada heterogénea, la cual debe evitarse. Sin embargo, se encontró sorprendentemente que el promotor GAP constitutivo habilita un alto rendimiento de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención. Aunque se utilizan el plasminógeno Lys del promotor AOX1 los rendimiento se obtuvieron después de 120 horas de la inducción de al menos 17 U/1 (= 1.5 mg/1) , más preferidas 120 U/1 (= 11 mg/1) , más preferidas 180 U/1 (= 16 mg/1) , aún más preferidas 200 U/1 (= 18 mg/1) , más preferidas 220 U/1 (= 20 mg/1) , aún más preferidas 240 U/1 (= 22 mg/1) , especialmente preferidas 260 U/1 (= 24 mg/1) y más especialmente preferidas 280 U/1 (= 25.5 mg/1), , los rendimientos fueron significativamente mayores al utilizar un promotor constitutivo, especialmente el promotor GAP. En una modalidad preferida un promotor constitutivo, e.g., el promotor GAP se acopla operativamente a un ácido nucleico, que codifica para al menos la parte funcional de la secuencia de plasminógeno y que se fusiona con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos un péptido de señal, la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para el plasminógeno funcional y la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para al menos el péptido de señal que se acopla con los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas, las cuales se proporcionan para el desdoblamiento del péptido de señal. En una modalidad especialmente preferida un promotor constitutivo, e.g., el promotor GAP, se acopla operablemente a la secuencia de ácidos nucleicos del plasminógeno micro-, mini- Lys o Glu, que se fusiona con la secuencia de ácidos nucleicos de un péptido de señal a partir de la levadura. A este respecto, se encontró sorprendentemente, que el promotor GAP constitutivo de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención habilita un rendimiento, que es de aproximadamente 10 veces mayor (ver el ejemplo 7c, producción del plasminógeno Lys, 1375 U/1, que convierte los resultados en 125 mg/1) . En otra modalidad preferida, se lleva a cabo una alimentación de glicerol como otra fuente de carbono entre 0.1 y 10 ml/h, preferentemente entre 0.5 y 5 ml/h, más preferentemente entre 0.8 y 1.5 ml/h y el medio de cultivo se amortiguó a un pH neutro de 7.0. Por lo tanto la tasa de crecimiento µ [l/h] alcanza los valores entre 0.002 y 0.10, preferentemente entre 0.004 y 0.020, más preferentemente entre 0.008 y 0.010. Al utilizar el plasminógeno Lys del promotor GAP los rendimientos se obtuvieron después de un periodo de tiempo de fermentación de 250 horas de al menos 660 U/1 (60 mg/1) , de preferencia 1000 U/1 (= 91 mg/1) , de preferencia 1500 U/1 {= 136 mg/1) , de mayor preferencia 2000 U/1 (= 182 mg/1) , se prefiere especialmente 2500 U/1 (= 227 mg/1) y se prefiere más especialmente 2750 U/1 (= 250 mg/1) . Se obtuvieron en la producción recombinante de acuerdo con el plasminógeno mini- y micro- rendimientos mayores. Los rendimientos en el caso del mini -plasminógeno se encuentran entre 100 mg a 2 g por litro, de preferencia de 300 mg/1 - 1.5 g/1, más preferentemente desde 400 mg/1 - 1 g/1, adicionalmente más preferentemente de 500 mg/1 - 800 mg/1 y se prefiere más especialmente de 600 - 700 mg/1. Los rendimientos del micro-plasminógeno son además de al menos 10% por arriba de los del mini -plasminógeno . Los rendimientos insignificantemente inferiores se obtuvieron en la producción recombinante del plasminógeno Glu en comparación con el plasminógeno Lys . El método de acuerdo con la presente invención es adecuado para la producción de los plasminógenos mini-, micro- Lys- y Glu. Las modalidades preferidas en la presente se centran en la producción recombinante del plasminógeno Mini-, micro-, Lys- y Glu-, que se acoplan cada uno a una señal o prepro secuencia, en un vector de expresión, que contiene un promotor constitutivo, e.g., el promotor GAP. En una modalidad adicional preferida la secuencia de señal consiste del péptido o prepropéptido de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae . En una modalidad especialmente preferida un promotor constitutivo, e.g., el promotor GAP, se acopla operablemente a un ácido nucleico de las secuencias Sec . ID. No. 7 o 9 o una de las secuencias Sec. ID. No. 13 o 15 o una de las secuencias Sec. ID. No. 50 a 59 y se expresa en un vector de expresión adecuado. En una modalidad adicional preferida un promotor constitutivo, e.g. el promotor GAP, se acopla operablemente a un ácido nucleico, que codifica al menos para la parte funcional de la secuencia de plasminógeno. En una modalidad especialmente preferida un promotor constitutivo, e.g., el promotor GAP se acopla operablemente a un ácido nucleico de las secuencias Sec. ID. No. 13, 15, 7 y 9 o una de las secuencias Sec. ID. No. 50 a 59 o de la secuencia Sec. ID. No. 11 y se expresa en un vector de expresión adecuado.

Plasminógeno Glu (datos calculados con el programa EditSeq™ (DNASTAR) ) Peso molecular: 88431.67 Daltones 791 aminoácidos punto isoeléctrico: 7.121 carga a pH 7.0: 1.351 Sitios de glicosilación: 0-268, N-308, 0-365 (los numerales se refieren al pre-plasminógeno que consisten de 810 aminoácidos) Plasminógeno Lys (datos calculados con el programa EditSeq™ (DNASTAR) Peso molecular: 79655.71 Daltones 741 aminoácidos punto isoeléctrico: 7.492 carga a pH 7.0: 5.287 Sitios de glicosilación: 0-268, N-308, 0-365 (los numerales se refieren al pre-plasminógeno que consiste de 810 aminoácidos) Mini-Plasminógeno (datos calculados con el programa EditSeq™ (DNASTAR) Peso molecular: 38169.63 Daltones 348 aminoácidos punto isoeléctrico: 7.203 carga a pH 7.0 : 0.893 Sitios de glicosilación: ninguno Micro-Plasminógeno (datos calculados con el programa EditSeq™ (DNASTAR) Peso molecular: 27230.41 Daltones 249 aminoácidos punto isoeléctrico 7.934 a pH 7.0: 3.733 Sitios de glicosilación : ninguno A continuación se describe en detalle el método de acuerdo con la invención. El producto de fusión generado en la etapa a) de la presente invención puede implementarse además en un vector de expresión adecuado para los microorganismos. Este vector de expresión se escoge preferentemente a partir del grupo que comprende pPICZaA, B y C y pPICZA, B y C y pGAPZaA, B y C y pGAPZA, B y C y pPIC6aA, B y C y pPIC6A, B y C así como pA0815, pPIC3.5K y pPIC9K. La introducción en el vector de expresión se lleva a cabo de nuevo preferentemente mediante ligación. El producto PCR así como el vector de expresión, se cortan preferentemente con las endonucleasas de restricción Kspl y Xhol, antes de que se liguen con una ligasa ADN T4. El ácido nucleico ligado puede transformarse a través de la electroporación en un microorganismo, preferentemente E. coli y el ADN puede aislarse a partir de las cepas transformadas obtenidas en esa forma y separarse a través del desdoblamiento endonucleolítico preferentemente con Xhol o Sful y Kspl. El ácido nucleico obtenido en esa forma puede ser un plásmido preferentemente escogido a partir del grupo pMHS476.1, pSM54.2, pSM49.8, pS 82.1, y pSM58.1, pAC37.1, pJW9.1, pPLGl.l, pPLG2.1 , pPLG3.2 , pPLG4.2 , pPLG5.3 , pPLG6.1, pPLG7.1, pPLG8.3 , pPLG9.1, pPLGIO.l, pPLG11.2, pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18.1, pPLG19.2 y pPLG20.1. Como iniciador para la amplificación antes mencionada se utilizan dos iniciadores de oligonucleótido preferentemente escogidos a partir del grupo que comprende N034 (secuencia ID-No. 1), N036 (secuencia ID- No. 2) , N036a (secuencia ID-No • 19) , N036b (secuencia ID -No ) , N036c (secuencia ID-No. 21) , N036d (secuencia ID -No 22) , N036e (secuencia ID-No. 23) , N036f (secuencia ID -No 24) , N036g (secuencia ID-No. 25) , N036h (secuencia ID -No 26) , N036Í (secuencia ID-No. 27) , N036j (secuencia ID -No 28) , N057 (secuencia ID-No. 3) , N037 (secuencia ID-No. 4) N035 (secuencia ID-No. 5) y N056 (secuencia ID-No. 6) . De acuerdo con la presente invención las siguientes modalidades son las especialmente preferidas: Los codones que codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y el gen de fusión al plasminógeno, que representan la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la secuencia ID No. 7 o 13. Los codones que codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y la proteína de fusión al plasminógeno, que representan la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la secuencia ID No. 8 o 14. Los codones que codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y el Stel3 de proteasa y el gen de fusión al plasminógeno, que representan la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la secuencia ID No. 9 o 15. Los codones que codifican para la proteasa Kex2 y la proteasa Stel3 y la proteína de fusión al plasminógeno, que representan la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la secuencia ID No. 10 o 16. Pre erentemente el plásmido anteriormente mencionado, que se escoge preferentemente a partir del grupo anterior mencionado, se transforma en un huésped microbial. La transformación puede llevarse a cabo por ejemplo mediante electroporación . El microorganismo utilizado es preferentemente un microorganismo eucariótico que se cuenta para la sección del hongo. Los microorganismos preferidos se cuentan para la Ascomycota, se prefiere la Saccharomycotina y de ahí la preferida es la clase de las Saccharomycetes, se prefiere adicionalmente el orden de Saccharomycetales , más preferentemente la familia de Saccharomycetaceae y de ahí se prefiere especialmente el género Pichia, Saccharomyces, Hansenula. y Aspergillus . De acuerdo con una modalidad especialmente preferida de la presente invención la secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos para la parte funcional del plasminógeno se sobreexpresa a partir de un organismo huésped microbial transformado con el producto de fusión generado en la etapa a) anteriormente descrita y al menos la parte funcional del plasminógeno se secreta, preferentemente se secreta en el medio de cultivo. De acuerdo con otra modalidad preferida la parte funcional de la secuencia de ácidos nucleicos del plasminógeno es una de las secuencias ID-No. 60, 61, 62, 63, 64, 65 o 66. De acuerdo con otra modalidad preferida la parte funcional de la secuencia de ácidos nucleicos del plasminógeno corresponde a la secuencia de plasminógeno completa. Preferentemente se produce un plasminógeno funcional humano con el método de la producción recombinante de acuerdo con la presente invención. Este plasminógeno, que puede obtenerse por el método de la producción recombinante de acuerdo con la presente invención o de la plasmina que resulta por la influencia de las proteasas de este, puede utilizarse para la producción de un farmacéutico para el tratamiento de heridas, especialmente en el tratamiento de heridas que sanan pobremente o lento, para el tratamiento de eventos trombóticos o para la prevención de eventos trombóticos.

Además se detectó, que el plasminógeno producido de acuerdo con la presente invención así como la plasmina obtenida del mismo representa las propiedades anticoagulantes. Estas ventajosas propiedades permiten la adición del uso de plasminógeno y/o plasmina como agente activo anti-trombótico así como anti -coagulante para la profilaxis y/o el tratamiento del ataque cardiaco, trombosis, restenosis, hipoxia, isquemia, necrosis por coagulación, inflamaciones de los vasos sanguíneos, así como para el tratamiento subsecuente a un ataque cardiaco, subsecuente a la revascularización quirúrgica, subsecuente a una angioplastía así como a una distensión de cavidad. El plasminógeno puede utilizarse también para la terapia trombótica en el caso de ataque cardiaco agudo, para la recanalización de derivaciones arteriovenosas así como para la reperfusión de las arterias coronarias ocluidas en el caso de un ataque cardiaco agudo. Los usos adicionales del plasminógeno producido de acuerdo con la invención comprenden la profilaxis y tratamiento de embolia pulmonar aguda, de coagulaciones recientes o pasadas de trombosis venosas, trombosis arterial aguda o subaguda, trombosis venosa, oclusiones arteriales agudas de las extremidades, arteriopatías oclusivas crónicas, trombosis de derivaciones arteriovenosas, trombosis venosa profunda de la cadera y las extremidades, trombosis temprana en el área de los vasos desobliterados, oclusión aguda de vaso central en el ojo, conjuntivitis en el caso de deficiencia tipo 1 de plasminógeno, lesiones por quemaduras y congelaciones, quemaduras por ácidos o álcalis así como coagulación intravasal diseminada durante el ataque. En el caso de estas indicaciones el plasminógeno y/o plasmina se utilizan juntas preferentemente con un anticoagulante. Como anticoagulantes son adecuados la heparina, derivados de heparina o ácido acetilsalicílico . La presente invención también se centra por lo tanto en composiciones farmacéuticas que comprenden un plasminógeno, el cual se ha producido de acuerdo al método de la producción recombinante de la presente invención, o la plasmina obtenida del mismo, en combinación con un sustrato, aditivo y/o solvente farmacéuticamente aceptable cuando se requiera. Además las composiciones farmacéuticas pueden contener preferentemente un agente activo anticoagulante, especialmente heparina, derivados de heparina o ácido acetilsalicílico . El plasminógeno producido de acuerdo con la invención y/o la plasmina obtenible del mismo se utilizan en el tratamiento externo de heridas preferentemente en composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la aplicación tópica. Mediante esto el plasminógeno y/o la plasmina se utilizan en una concentración de 0.01 - 500 U por gramo de composición farmacéutica, se prefiere 0.1 - 500 U, se prefiere además 0.1 - 250 U, se prefiere más 0.5 - 250 U por gramo de composición farmacéutica y se prefiere especialmente en una concentración de 1 - 150 U de plasminógeno y/o plasmina por gramo de composición farmacéutica. Si los emplastos u otros materiales para restauración se utilizan en lugar de formulaciones semisólidas en la forma de por ejemplo ungüentos, pastas, geles, etc. , se consideran las regiones de concentración anteriormente dadas por 2 cm2 de la superficie de emplasto y superficie de los materiales para restaurar respectivamente. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se producen con los sustratos o diluyentes sólidos o fluidos comunes y los agentes auxiliares farmacéuticos comúnmente utilizados de acuerdo con el tipo deseado de aplicación en una dosis adecuada en una forma conocida. Las formulaciones o composiciones farmacéuticas preferidas se encuentran presentes en una forma farmacéutica, que es adecuada para la aplicación externa local. Tales formas farmacéuticas son por ejemplo ungüentos, pastas, geles, recubrimientos, dispersiones, emulsiones, suspensiones o formulaciones especiales, tales como sistemas nanodispersos en forma de liposomas, nanoemulsiones o nanopartículas de lípidos, así como formulaciones libres tenside, emulsiones de polímeros estabilizados o emulsiones estabilizadas partículas . Los métodos para la producción de diversas formulaciones así como los diferentes métodos de aplicación se conocen por el experto en la técnica y se describen en detalle por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA" . Las composiciones producidas por la aplicación parenteral son adecuadas en el caso de utilizar las composiciones farmacéuticas para la profilaxis y/o tratamiento del ataque cardiaco, trombosis, restenosis, hipoxia, isquemia, necrosis por coagulación, inflamaciones de los vasos sanguíneos, ataque cardiaco agudo así como para el tratamiento subsecuente del ataque cardiaco, subsecuente a una revascularización por cirugía, subsecuente a una angioplastía así como subsecuente a una distensión de cavidad . Además las composiciones farmacéuticas son adecuadas en caso de diversas aplicaciones sistémicas que comprenden el uso en el caso de embolia aguda de pulmón, terapia trombótica en el caso de ataque cardiaco agudo, coagulaciones recientes o pasadas de trombosis venosas, trombosis arterial aguda o subaguda, recanalización de derivaciones arteriovenosas , trombosis venosa, reperfusión de arterias coronarias ocluidas en el caso de ataque cardiaco agudo, oclusiones arteriales agudas de las extremidades, arteriopatías oclusivas crónicas, trombosis de derivaciones arteriovenosas , trombosis venosa profunda de la cadera y las extremidades, trombosis temprana en el área de los vasos desobliterados, oclusión aguda de vaso central en el ojo, conjuntivitis en el caso de deficiencia tipo 1 de plasminogeno, lesiones por quemaduras, quemaduras alcalinas o ácidas y congelaciones, coagulación intravasal diseminada durante el ataque . Otra posibilidad para la aplicación surge en el caso de deficiencias de plasminogeno, tal como la deficiencia de plasminogeno hereditaria o congénita (deficiencia de plasminogeno tipo 1 de homocigoto) , que puede dar como resultado e.g., en conjuntivitis lignosa o trombofilia. Existe la posibilidad en la presente de tratar la enfermedad a través de por ejemplo la administración intravenosa del plasminogeno recombinante, inclusive en las formas Glu-, Lys-, mini- y micro-plasminógeno así como las variantes derivadas de los mismos (Heinz efc al., Klin. Monatsblatt Augenheilkunde 2002 , 219 (3) : 156-8) . En otra posibilidad para la aplicación, puede lograrse la resolución de las pseudomembranas y la normalización de los pasajes respiratorios así como la cicatrización mejorada de heridas en el caso de la administración del plasminogeno. Esta aplicación se describió para un niño recién nacido (The New England Journal of Medicine 1998, 339, 23, 1679-1686) . Así, el plasminógeno recombinantemente producido se utiliza potencialmente junto con la plasmina obtenida del mismo o también solo la plasmina en composiciones farmacéuticas, lo cual es adecuado para la profilaxis y/o el tratamiento de la embolia aguda de pulmón, terapia trombótica en el caso de ataque cardiaco agudo, coagulaciones recientes o pasadas de trombosis venosas, trombosis arterial aguda y subaguda, recanalización de derivaciones arteriovenosas , trombosis venosa, reperfusión de arterias coronarias ocluidas en el caso de ataque cardiaco agudo, oclusiones arteriales agudas de las extremidades, arteriopatías oclusivas crónicas, trombosis de derivaciones arteriovenosas, trombosis venosa profunda de la cadera y las extremidades, trombosis temprana en el área de los vasos desobliterados, oclusión aguda de vaso central en el ojo, conjuntivitis en el caso de deficiencia tipo 1 de plasminógeno, lesiones por quemaduras, quemaduras alcalinas o ácidas y congelaciones, coagulación intravasal diseminada durante el ataque. El plasminógeno recombinantemente producido de acuerdo con la invención se utiliza preferentemente en composiciones farmacéuticas, que son adecuadas para el tratamiento tópico de lesiones por quemaduras, congelaciones, quemaduras alcalinas o ácidas, lesiones y/o heridas especialmente heridas deficientemente sanadas. De aquí que el plasminógeno recombinante se utiliza preferentemente junto con al menos un activador (activadores de plasminógeno tal como por ejemplo urocinasa o estreptocinasa) . Otra posibilidad preferida es convertir el plasminógeno producido de acuerdo con la invención total o parcialmente antes de su uso a través de un activador en plasmina y utilizarlo en las indicaciones y formulaciones aquí descritas en la forma de plasmina o plasmina con plasminógeno. Se consideran aplicaciones parenterales especialmente la aplicación intravenosa, intravasal, intraperitoneal , subcutánea así como intramuscular. En el caso de las formulaciones parenterales especialmente en forma de soluciones para inyección o infusión se utiliza la proteína en una concentración de 0.1-100 millones de unidades, preferentemente de 1 a 10 millones de unidades por 10 mi de solución y especialmente de preferencia de 3 a 5 millones de unidades por 10 mi de solución. En el caso de formulaciones adecuadas para la aplicación oral se utiliza la proteína en una concentración de 0.1 a 100,000 unidades por gramo de la formulación y especialmente de preferencia de 1.000 a 50.000 unidades por gramo de la formulación. Las formulaciones ventajosas adicionales se representan por ejemplo por medio de vendas, apositos u otros materiales para apositos que contienen proteasa. Estas formulaciones son especialmente adecuadas para la aplicación tópica en caso de cicatrización de heridas, o para el tratamiento de lesiones por quemaduras, congelación superficial, quemaduras y/o lesiones álcali o ácidas. El plasminogeno producido de forma recombinante de acuerdo con la invención se utiliza preferentemente en composiciones farmacéuticas, especialmente en los agentes para cicatrización de heridas, en vendas así como en materiales para apositos junto con al menos un activador (activadores de plasminogeno tales como por ejemplo urocinasa o estreptocinasa) o se convierte con anticipación en plasmina a través de los activadores anteriormente descritos y se utiliza como plasmina potencialmente junto con el plasminogeno y potencialmente con al menos un activador y/o en las composiciones y formulaciones farmacéuticas. Se prefiere especialmente el uso del plasminogeno, de preferencia el plasminogeno con un activador, o plasmina, o plasmina junto con plasminogeno y un activador en y/o sobre vendas y materiales para apositos, que son adecuados para la cicatrización de heridas, especialmente para el tratamiento de heridas de cicatrización deficiente, así como para el tratamiento de lesiones por quemaduras, congelación superficial, quemaduras u otras lesiones álcali o ácidas. Los materiales para apositos, apositos para cicatrización de heridas o vendas contienen el plasminogeno producido de acuerdo con la invención y/o la plasmina obtenida del mismo en una concentración de 0.01-500 unidades de plasminogeno y/o plasmina por cm.2 de la formulación farmacéutica, preferentemente de 0.1 a 500 unidades de plasminogeno y/o plasmina por cm.2 del material para apositos y vendas respectivamente. Preferentemente el plasminogeno o la plasmina se encuentra contenido en una concentración de 0.1-250 unidades, aún más preferentemente de 0.5-250 unidades y especialmente de preferencia de 1-150 unidades del plasminogeno y/o una plasmina que resulta del mismo por cm.2 de la formulación farmacéutica en la venda o material para apositos . Para la activación de 1 µg del plasminogeno se utilizan entre 100 ^g y 1 ng de urocinasa, preferentemente se utilizan entre 10 µg y 10 ng de urocinasa. Para la activación de 1 µg de plasminogeno se utiliza entre 1 mg y 1 ^g de estreptocinasa, preferentemente se utilizan entre 300 /ig y 3 fig de estreptocinasa. Para la activación de 1 mg de plasminogeno proteasa de S. griseus se utilizan entre 100 µg y 10 ng, preferentemente se utilizan entre 10 g y 100 ng de proteasa de S. griseus. Para la activación de 1 mg del plasminogeno se utiliza entre 100 g y 10 ng de proteasa VIII, preferentemente se utiliza entre 10 g y 100 ng de proteasa VIII. Preferentemente la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la parte funcional del plasminogeno es una secuencia de ADN. La presente invención se refiere además a los siguientes plásmidos: Plásmido pPLGl .1 Plásmido pPLG2.1 Plásmido pPLG3.2 Plásmido pPLG .2 Plásmido pPLG5.3 Plásmido pPLG6.1 Plásmido pPLG7.1 Plásmido pPLG8.3 Plásmido pPLG9.1 Plásmido pPLGIO.l Plásmido pPLG11.2 Plásmido pPLG12.1 Plásmido pPLG13.1 Plásmido pPLG14.2 Plásmido pPLG15.1 Plásmido pPLG16.3 Plásmido pPLG17.2 Plásmido pPLG18.1 Plásmido pPLG19.2 Plásmido pPLG20.1 Plásmido pMHS476.1 (depósito No.: DSM 14678) Plásmido pSM54.2 (depósito No. : DSM 14682) Plásmido pSM49.8 (depósito No.: DSM 14681) Plásmido pSM82.1 (depósito No.: DSM 14679) Plásmido pSM58.1 (depósito No.: DSM 14680) Plásmido pAC37.1 (depósito No.: DSM 15369) Plásmido pJ 9.1 (depósito No.: DSM 15368). (Los números de depósito se refieren al depósito en la Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures Ltd., Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig) . Además, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN adecuada para la expresión, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos para la parte funcional del plasminógeno, obtenible mediante el método recombinante de producción de acuerdo con la presente invención. Además se refiere al organismo microbiano huésped, que comprende el producto de fusión contenido en la etapa a) anteriormente descrita y una secuencia de ácidos nucleicos derivada del mismo. Adicionalmente la presente invención se refiere a un vector, una molécula de ADN o una molécula de ARN, que comprende el producto de fusión contenido en la etapa a) anteriormente descrita o una secuencia de ácidos nucleicos derivada del mismo. Finalmente la presente invención se refiere también a un método de detección para la identificación de activadores de plasminógeno, especialmente proteasas de activación de plasminógeno, mientras que se utiliza el plasminogeno funcional, producido de acuerdo al método recombinante de producción anteriormente descrito. Para este propósito preferentemente después de la preincubacion de las proteasas la actividad de la plasmina resultante se mide con el plasminogeno funcional producido de acuerdo con la presente invención. La actividad de la plasmina resultante puede medirse con un sustrato sintético del péptido. Especialmente de preferencia la actividad de la plasmina resultante se mide con N-tosil -Gly-Pro-Lys-pNA. La invención se explica en más detalle mediante los dibujos, que ilustran lo siguiente: Figura 1: Mapa físico del plásmido pMHS476.1 (5682 bp) . El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 con el gen plasminogeno Lys humano y se encuentra bajo el control del promotor A0X1. Figura 2: Mapa físico del plásmido pSM54.2 (5694 bp.) . El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 con el gen plasminogeno Lys humano y se encuentra bajo el control del promotor A0X1. Figura 3: Mapa físico del plásmido pSM49.8 (5715 bp) . El gen preplasminógeno humano se encuentra bajo el control, del promotor AOX1.

Figura 4: Mapa físico del plásmido pSM82.1 (5913 bp . ) . El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 con el gen plasminógeno Lys humano y se encuentra bajo el control del promotor A0X1. Figura 5: Mapa físico del plásmido pSM58.1 (5925 bp . ) . El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 con el gen plasminógeno Glu humano y se encuentra bajo el control del promotor A0X1. Figura 6: Mapa físico del plásmido pAC37.1 (11400 bp . ) . El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 con el gen plasminógeno Lys humano y se encuentra bajo el control del promotor A0X1. Figura 7: Mapa físico del plásmido pJW9.1 (5925 bp . ) . El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 con el gen plasminógeno Lys humano y se encuentra bajo el control del promotor GAP. Figura 8: Mapa físico del plásmido pPLGl .1. El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 con el gen mini-plasminógeno humano y se encuentra bajo el control del promotor A0X1. Figura 9; Mapa físico del plásmido pPLG11.2. El gen del prepropéptido del factor alfa se encuentra conectado por medio de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 con el gen mini-plasminógeno humano y se encuentra bajo el control del promotor GAP. Figura 10 : Detección de la actividad de fibrinolisis en el ensayo Klárhof (zona despejada). De acuerdo con la invención todos los microorganismos pueden considerarse como organismos huésped, que son capaces de llevar a cabo la glicosilación y, si se desea, la secreción de las proteínas. Se mencionarán en la presente los ej emplificativos : S. cerevisiae, P.pastoris, . P metha.no!ica y H. polymorpha o el hongo filamentoso Aspergíllus sp. Especialmente se considera el uso del plasminógeno funcional y la plasmina respectivamente producidos de acuerdo con el presente método de producción en una composición farmacéutica. En tal formulación el plasminógeno funcional puede mezclarse con un sustrato o agente auxiliar farmacéuticamente aceptable así como con otros agentes auxiliares o aditivos adecuados de una forma conocida para el experto en la técnica. El sitio de desdoblamiento Kex2 proporciona el desdoblamiento del propéptido por medio de la proteasa Kex2 localizada en el aparato de Golgi . Esta proteasa también referida como proteasa YscF o como Kexin es una serina proteasa de procesamiento de proproteína, que se corta de manera C-terminal a partir de pares básicos de aminoácido (e . g . : Lys-Arg) . El sitio de desdoblamiento Stel3 proporciona el desdoblamiento del propéptido por medio de la proteasa Stel3 localizada en el aparato de Golgi. La Stel3 (también referida como proteasa YscVI o como dipeptidil aminopeptidasa A) se localiza en el último Golgi y retira etapa por etapa los dipéptidos Xaa-Ala N-terminal, e.g., del factor-a inmaduro de la levadura S. cerevisiae. En adición a los sitios de desdoblamiento para las proteasas Kex2 y Stel3 pueden insertarse otros sitios de desdoblamiento, que son reconocidos como sustratos por las proteasas localizadas en el retículo endoplásmico o en el aparato de Golgi . También es posible fusionar con el gen plasminógeno exclusivamente una secuencia de señal (prepéptido) responsable del transporte en el retículo endoplásmico, i.e., el propéptido e.g., del factor de emparejamiento de la levadura S. cerevisiae no se requiere necesariamente. Los métodos microbiológico, molecular biológico y químico de proteínas mencionados en los ejemplos son bien conocidos para el experto en la técnica. Los siguientes libros de referencia se mencionarán como referencia: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, 1989 (10) ; Gassen & Schrimpf , Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1999 (11); EasySelect™ Pichia Expression Kit Instruction Manual, Invitrogen, Groningen, Países Bajos, catálogo No. K1740-01. Las especies de Pichia pastoris y los sistemas de expresión también provienen de Invitrogen y se describen en el Manual de Instrucciones antes mencionado. En el caso de pPICZA, B y C en Pichia pastoris cortos de 3.3 kb se involucran los vectores de expresión. Los vectores tienen un gen de resistencia a la zeocina para la selección directa de los transformantes de Pichia. Además, los vectores tienen una secuencia de marcador C-terminal, que proporciona una rápida purificación y la detección de las proteínas de fusión. En el caso de pPICZalpha A, B y C se involucran los vectores de expresión de Pichia pastoris de 3.6 kb, que también tienen el gen de resistencia a la zeocina así como la secuencia de marcador C-terminal antes mencionada. En adición, contienen la señal de secreción del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae para un transporte eficiente de las proteínas en el medio. Además el plasminógeno puede activarse. Además el plasminógeno puede incubarse ejemplarmente con una proteasa, que se identificó con el método de detección de acuerdo con la invención. Preferentemente el plasminógeno se incuba además con proteasa de S. griseus, con proteasa VIII o proteasa XVIII, con ficina, metaloendopeptidasa, clostripaina, con endoproteinasa Glu-C, proteasa XIII, proteinaza A, tripsina, endoproteinasa Asp-N o elastasa. Además es imaginable activar el plasminógeno por medio de la incubación del plasminógeno con una de las proteasas t-PA, u-PA o vb-PA (PA de murciélago vampiro) . En otra modalidad preferida el plasminógeno se activa por medio de incubación con estafilocinasa o con estreptocinasa . La estreptocinasa o estafilocinasa forman con plasminógeno un complejo 1:1. Mediante esta formación de complejo, el plasminógeno enlazado en el complejo recibe un cambio en la conformación, de modo que se vuelve proteolíticamente activo y es capaz de activar el plasminógeno en plasmina. El plasminógeno funcional o el plasminógeno funcional activado producido de acuerdo con el presente método de producción recombinante es capaz de hidrolizar fibrina. Además es capaz de activar metaloproteasas promatriz y factores de crecimiento. La invención se explicará en más detalle mediante los ejemplos como sigue. Ejemplo la: Amplificación del gen plasminógeno Lys con la inserción de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 en el extremo 5' El plásmido pPLGKG (Forsgren et al., FEBS Lett . 1987 Mar 23 ; 213 (2 ) : 254 - 60 (2)), que contiene el gen para el pre-plasminógeno Glu, se aisló a partir de la especie E. coli HB101 (pPLGKG) utilizando el equipo midi de plásmidos QIAGEN (QIAGEN, Hilden) . 150 ng de pPLGKG-ADN se linearizaron con 10 U de la endonucleasa de restricción EcoRI (Roche, Mannheim) y enseguida se purificaron con el equipo de purificación PCR Qiaquick (QIAGEN, Hilden) . Para la amplificación del gen de plasminógeno se utilizó el par de iniciadores de oligonucleotido N034 (Seq ID No. 1) y N036 (Seq ID No. 2) . El iniciador de oligonucleotido N036 tiene además de las bases complementarias al gen de plasminógeno los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2. Para la PCR se utilizaron 0.5 U de Pwo-ADN-polimerasa (Hybaid, Heidelberg) , cada una con 400 nM del iniciador de oligonucleotido, cada una con 200 µ? de dNTP, 3 ng de pPLGKG-ADN linearizado y el amortiguador de reacción respectivo en un volumen final de 50 µ? . La temperatura de enlace del iniciador fue de 50°C.

El producto resultante de PCR se probó para el tamaño esperado mediante electroforesis de gel de agarosa y se purificó con el equipo de purificación PCR QIAquick. Ejemplo Ib: Clonación del gen de plasminógeno en el vector pPICZaA 400 ng del producto de la PCR se cortaron con cada 10 U de las endonucleasas de restricción Kspl y Xhol (Roche, Mannheim) . 300 ng de ADN del plásmido pPICZaA (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) , que contiene la secuencia de prepropéptido de factor a de S. cerevisiae, se cortaron también con 10 U de las endonucleasas de restricción ífspl y Xhol. El ADN así tratado se separó electroforéticamente en un gel de agarosa al 0.9% y los fragmentos obtenidos se extrajeron del gel con el equipo de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Hildeb) . El ADN de vector se combinó con el ADN de inserto y se ligaron a 4°C durante la noche con 1 U de T4-ADN-ligasa (Roche, Mannheim) . El ADN del lote de ligación se purificó después de esto con el equipo de purificación PCR QIAquick y se utilizó para la transformación del E. coli JM109 por electroporación . Las células electroporadas de E. coli JM109 se incubaron durante lh a 37°C en 1 mi de medio SOC, después de esto se colocaron en placas en un medio sólido de agar LB con 20 ^g/µ? de zeocina (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y se incubaron a 37°C durante la noche.

De una de las especies de E. coli así obtenidas se aisló el ADN con el mini equipo de plásmidos QIAGEN (QIAGEN, Hilden) y después del desdoblamiento endonucleolítico con las enzimas Xhol y Kspl se separaron 300 ng mediante electroforesis en gel de agarosa . El plásmido aislado contenía un fragmento del tamaño esperado y se refirió como pMHS476.1 (Figura 1) . La secuencia correcta del gen de fusión a partir del gen de prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae y el gen Lys-plasminógeno así como los codones para la secuencia del sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 se confirmaron mediante análisis de secuencia (Seq. ID No. 7) . Ejemplo le: Transformación de Pichia pastoris con el plásmido pMHS476.1 Con el midi equipo de ADN plásmido QIAGEN del plasminógeno se aisló el ADN plásmido del vector de expresión pMHS476.1 a partir de la especie de E. coli JM109 (pMHS476.1). 10 µg de pMHS476.1-ADN se linearizaron con 100 U de Pmel (New England Biolabs., Frankfurt) y se utilizaron para la electroporación de Pichia pastoris KM71H his 4:: HIS 4 arg 4 aoxl : : genotipo ARG 4 de Pichia pastoris Y-11430 (Northern Regional Research Laboratories, Peoría, EUA) de acuerdo con el protocolo mostrado en el Manual de Instrucciones del Equipo de Expresión de Pichia EasySelect™. Las colonias cultivadas con 100 /ig/ml de zeocina después de tres o cuatro días en medio sólido YPDS (Manual de Instrucciones del Equipo de Expresión de Pichia EasySelect™) se colocaron en placas con 100 µ?/??? de zeocinas sobre medio sólido YPDS y se utilizaron para la inoculación de cultivos líquidos. Las colonias se refirieron como Pichia pastoris KM71H/pMHS476.1-1/a, mientras que "a" representa la numeración consecutiva de las colonias que inician en 1. Ejemplo Id: Crecimiento de Pichia pastoris KM71H/pMHS476.1-1/1 a -1/3 e inducción de la expresión del gen plasminógeno Para la producción de los precultivos se incubaron 100 mi del medio BMGY (Manual de Instrucciones del Equipo de Expresión de Pichia EasySelect™) en envases deflectores de 1 1 a 28°C y a 250 rpm hasta un OD60o=20-30. Después de esto los precultivos se centrifugaron durante 10 min a 4645 g y a 4°C. Las células así recolectadas se resuspendieron en un medio BMMY (metanol al 0.5%), a fin de obtener una concentración de masa bio-humedecida de 80 g/1. 60 mi de estos cultivos principales se incubaron durante 118 h en envases deflectores de 300 mi a 28°C y a 250 rpm. Después de 24 y 72 horas se agregó metanol al 2%. Los envases deflectores y las altas revoluciones por minuto de 250 rpm se utilizaron para proporcionar la suficiente alimentación de oxígeno, necesaria para el uso del promotor AOX. Ejemplo le: Medición de la actividad del plasminógeno en el sobrenadante de los cultivos principales después de la activación con estreptocinasa Las muestras de los cultivos principales se centrifugaron durante 10 min a 16 000 g. 300 µ? del sobrenadante se incubaron durante 20 min a 37 °C con 1 µ? de estreptocinasa (S8026) (Sigma, Deisenhofen) . A 750 µ? 100 mM de amortiguador de fosfato de sodio, pH 8, 0.36 mM de CaCl2, NaCl al 0.9% se pipetaron 100 µ? de solución de N-tosil-Gly-Pro-Lys-pNA (9.5 mg disueltos en 75 mg de glicina/10 mi, Tween® 20 al 2%) y se incubaron durante 10 min a 37°C. Para iniciar la reacción se agregaron 250 µ? del sobrenadante pretratado con estreptocinasa y se incubaron adicionalmente a 37 °C. El aumento en la extinción se midió fotométricamente a 405 nm. Para la determinación de los valores de control se utilizaron sobrenadantes de un cultivo paralelamente cultivado de P. pastoris KM71H así como los sobrenadantes sin activación de estreptocinasa. Para las muestras tomadas después de 72 h de inducción se determinaron los siguientes valores de actividad (1 U/1 = 1 µt??? N-tosil-Gly-Pro-Lys-pNA conversión por minuto por litro del sobrenadante del cultivo): KM71H/pMHS476.1-1/1 : 2 U/1; KM71H/pMHS476.1-1/2 : 2 U/1; KM71H/pMHS476.1-1/3 : 1 U/1. Después de 118 h de inducción pudieron determinarse los siguientes valores de actividad: KM71H/pMHS476.1-1/1 : 7 U/1; KM71H/pMHS476.1- 1/2 : 9 U/1; KM71H/pMHS476.1-1/3 : 8 U/1.

Ejemplo 2a: Amplificación del gen del plasminogeno Lys con inserción de los codones de un sitio de desdoblamiento Kex2 y de dos sitios de desdoblamiento Stel3 en el extremo 5' La amplificación del gen del plasminogeno Lys para la clonación dentro del vector pPICZ A con la inserción de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 se llevó a cabo con los dos iniciadores de oligonucleótido N034 y N057 (Seq ID No. 3) utilizando las condiciones mencionadas en el ejemplo la. El iniciador de oligonucleótido ??57 tiene además de las bases complementarias al gen de plasminogeno los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3. Ejemplo 2b: Clonación del gen del plasminogeno Lys amplificado como se describió en el ejemplo 2a dentro del vector pPICZaA La clonación del gen del plasminogeno Lys dentro del vector pPICZaA para la producción de un gen de fusión del gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura de S. cerevisiae y el gen del plasminogeno con la inserción de los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas Kex2 y Stel3 se llevó a cabo análoga a la clonación descrita en el ejemplo Ib. El plásmido obtenido se refirió como pSM54.2 (Figura 2) . La secuencia correcta (Seq ID No. 9) se confirmó mediante análisis de secuencia.

Ejemplo 2c: Transformación de Pichia pastoris con el plásmido pSM54.2 Como se describió para pMHS476.1 en el ejemplo le, Pichia pastoris KM71H se transformó con el plásmido pSM54.2. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris KM71H/pSM54.2-1/a, mientras que "a" representa de nuevo la numeración consecutiva de las colonias que comienzan en 1. Ejemplo 2d: Cultivo de Pichia pastoris KM71H/pSM54.2-1/1 a -1/3 e inducción del gen del plasminogeno La producción de los precultivos y de los cultivos principales así como la inducción con metanol se llevaron a cabo análogas a las condiciones descritas en el ejemplo Id. Ejemplo 2e: Medición de la actividad del plasminogeno en las muestras de los cultivos principales después de la activación con estreptocinasa La actividad del plasminogeno después de la activación con estreptocinasa se determinó como se describió para K 71H/pMHS476.1-1/1 a -1/3 en el ejemplo le. Para las muestras tomadas después de 72 h de inducción se obtuvieron los siguientes valores actividad: KM71H/pSM54.2 - l/l : 2 U/1; KM71H/pSM54.2-1/2 : 8 U/1; K 71H/pSM54.2 - 1/3 : 6 U/1. Después de 118 h de inducción se determinaron los siguientes valores de actividad: KM71H/pSM5 .2 - l/l : 8 U/1; KM71H/pSM54.2 -1/2 : 17 U/1; K 71H/pSM54.2-1/3 : 13 U/1. Ejemplo 3a: Amplificación del gen del plasminogeno con secuencia de señal propia y clonación en el vector pPICZA; transformación de Pichia pastoris La amplificación del gen del plasminogeno inclusiva de la codificación de secuencia para el péptido de señal propia (pre-plasminógeno) para la clonación en el vector pPICZA se llevó a cabo con los dos iniciadores de oligonucleótido N034 y N037 (Seq ID No. 4) utilizando las condiciones descritas en el ejemplo la. La clonación del gen de preplasminógeno en el vector pPICZA se llevó a cabo análoga a la clonación descrita en el ejemplo Ib, mientras que el vector así como el producto de PC se cortaron con las endonucleasas de restricción Sful y Kspl. El plásmido obtenido se refirió como pSM49.8 (Figura 3) . La secuencia correcta (Seq ID No. 11) se confirmó mediante análisis de secuencia. Como se describió para pMHS476.1 en el ejemplo le Pichia pastoris K 71H se transformó con el plásmido pSM49.8. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris KM71H/pSM49.8-l/a, mientras que "a" de nuevo representa la numeración consecutiva de las colonias que comienzan con 1.

Ejemplo 4a: Amplificación del gen del plasminogeno Glu con inserción de los codones de un sitio de desdoblamiento ex2 y clonación en el vector de expresión pPICZct(alfa) A; transformación de Pichia pastoris La amplificación del gen del plasminogeno Glu para la clonación en el vector pPICZoíA con inserción de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 se llevó a cabo con los dos iniciadores de oligonucleótido N034 y N035 (Seq ID No. 5) utilizando las condiciones descritas en el ejemplo la. El iniciador de oligonucleótido N035 tiene además de las bases complementarias al gen del plasminogeno Glu los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2. La clonación del gen del plasminogeno Glu en el vector pPICZaA para la producción de un gen de fusión a partir del gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura S. cerevisiae y el gen del plasminogeno Glu con la inserción de los codones para los sitios de desdoblamiento de la proteasa Kex2 se llevó a cabo análoga a la clonación descrita en el ejemplo Ib. El plásmido obtenido se refirió como pSM82.1 (Figura 4) . La secuencia correcta (Seq ID No. 13) se confirmó mediante análisis de secuencia. Como se describió para pMHS476.1 en el ejemplo le Pichia pastoris KM71H se transformó con el plásmido pSM82.1. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris KM71H/pSM82. l/a , mientras que "a" representa de nuevo la numeración consecutiva de las colonias que comienzan en 1. Ejemplo 5a: Amplificación del gen del plasminogeno Glu con inserción de los codones de un sitio de desdoblamiento Kex2 y de dos sitios de desdoblamiento Stel3 en el extremo 5' y clonación en el vector de expresión pPICZotA; transformación de Pichia pastoris La amplificación del gen del plasminogeno Glu para la clonación en el vector pPICZotA con inserción de los codones para un sitio de desdoblamiento Kex2 y de dos sitios de desdoblamiento Stel3 se llevó a cabo con los dos iniciadores de oligonucleótido N034 y N056 (Seq ID No. 6) utilizando las condiciones descritas en el ejemplo la. El iniciador de oligonucleótido N056 tiene además de las bases complementarias al gen del plasminogeno Glu los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3. La clonación del gen del plasminogeno Glu en el vector pPlCZaA para la producción de un gen de fusión a partir del gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura S. cerevisiae y el gen del plasminogeno Glu con la inserción de los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas Kex2 y Stel3 se llevó a cabo análoga a la clonación descrita en el ejemplo Ib. El plásmido obtenido se refirió como pSM58.1 (Figura 5) . La secuencia correcta (Seq ID No. 15) se confirmó mediante análisis de secuencia. Como se describió para pMHS476.1 en el ejemplo le Pichia pastoris KM71H se transformó con el plásmido pSM58.1. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris K 7lH/pSM58. l/a, mientras que "a" representa de nuevo la numeración consecutiva de las colonias que comienzan en 1. Ejemplo 6a: Inserción del gen del plasminogeno Lys a partir de pSM54.2 en el vector pPIC9K 150 mg del vector pPIC9K (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) se cortaron con cada 10 U de las endonucleasas de restricción Sacl y Notl (ambas de Roche Diagnostics, Mannheim) . 300 ng del plásmido de expresión del plasminogeno pSM54.2 (ver ejemplo 2b) también se cortaron con las enzimas Sacl y Notl. El ADN así tratado se separó mediante electroforesis en gel con un gel de agarosa al 0.9%. En cada caso el fragmento más grande se extrajo del gel por medio del equipo de extracción del gel QIAgen (Qiagen, Hilden) . Los dos fragmentos se combinaron y se ligaron a 4°C durante la noche con 1 U de T -ADN-ligasa . La transformación del E. coli DH5a, el aislamiento y la caracterización del plásmido resultante se llevaron a cabo análogos a la descripción en el ejemplo Ib, mientras que en lugar del antibiótico zeocina se utilizó el antibiótico ampicilina para la selección de transformantes. El plásmido así construido se refirió como pAC37.1 (Figura 6) . Ejemplo 6b: Transformación de Pichia pastoris con el plásmido pAC37.1 Como se describió para la transformación de Pichia pastoris KM71H con pMHS476.1 en el ejemplo le, Pichia pastoris KM71 se transformó con el plásmido pAC37.1 linearizado con la endonucleasa de restricción Salí. Las células transformadas se colocaron en placas sobre el medio libre de histidina MD-agar (manual de instrucciones del Multi-Copy Pichia Expresión Kit) y se incubaron. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris KM71/pAC37.1 , mientras que "a" de nuevo representa la numeración consecutiva de las colonias que comienzan en 1. Ejemplo 6c: Cultivo de Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/1 e inducción del gen del plasminogeno La producción de los precultivos y los cultivos principales así como la inducción con metanol se llevaron a cabo análogas a las condiciones descritas en el ejemplo Id. La inducción se llevó a cabo sobre 216 h. Comenzó con una concentración de metanol de 0.5%, después de 24 h y después en períodos de 48 h se re-alimentó metanol al 2%. Ejemplo 6d: Medición de la actividad del plasminogeno en las muestras de los cultivos principales después de la activación con estreptocinasa La actividad del plasminogeno después de la activación con estreptocinasa se determinó como se describió para KM71H/pMHS476. l-l/l a -1/3 en el ejemplo le. Para las muestras tomadas después de 120 h de inducción se obtuvo una actividad de 120 U/1. Después de 216 h de inducción pudo medirse una actividad de 190 U/1. Ejemplo 6e: Inducción de Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/1 en medio mínimo (BSM) y medición de la actividad del plasminógeno en las muestras de los cultivos principales después de la activación con estreptocinasa Después del cultivo de Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/1 en medio BMGY-complejo (ver ejemplo Id) 80 g de células centrifugadas se resuspendieron en 100 mi de medio mínimo BSM para la fase de inducción. La composición del medio mínimo BSM (Medio de Sales Básales) es como sigue: H3PO4, 85%: 26.0 ml/1; CaCl2-2H20: 0.6 g/1; K2S04 : 18.0 g/1; MgS04-7H20: 14.0 g/1; KOH: 4.0 g/1; glicerina: 20 ml/1; antiespumante : 1.0 ml/1; solución de rastreo: 8.0 ml/1; solución de biotina (0.2 g/1) : 8.0 ml/1. Composición de la solución de rastreo: H2S04 : 5.0 ml/1; CuS04-5H20: 6.0 g/1; Kl : 0.08 g/1; MnS04-H20: 3.0 g/1; Ma2Mo04 : 0.2 g/1; H3BO3: 0.02 g/1; CoCl2 : 0.5 g/1; ZnCl2 : 20.0 g/1; FeS04-7H20: 65.0 g/1. Para la inducción se agregó metanol al 2% diariamente. La actividad del plasminógeno después de la activación con estreptocinasa se determinó como se describe para KM71H/pMHS476.1 - l/l a -1/3 en el ejemplo le. Después de 120 h de la inducción se determinó una actividad de plasminógeno de 193 U/1, después de 168 h pudieron medirse 289 U/1. Ejemplo 6f: Detección de la actividad del plasminógeno en las muestras de los cultivos principales después de la activación con estreptocinasa en la prueba Klárhof de fibrinolisis (zona despejada) Para la preparación de la prueba Klárhof de fibrinolisis (zona despejada) (Stack, M.S., Pizzo, S.V., y Gonzalez-Gronow, M. (1992) : Efecto de desialilación en las propiedades biológicas del plasminógeno humano. Biochem. J. 284, 81-86) (13), 1.5 g de agarosa GTG de baja fusión se fusionaron calentando en 75 mi de 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.4. 35 mi de solución de fibrinógeno (225 mg/37.5 mi 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.4) se mezclaron libres de burbujas con 350 µ? de solución de trombina (10 U/ml en 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.4), se agitaron en la solución de agarosa y se vaciaron en una caja de petri . Después de solidificarse del agar de fibrina se perforaron orificios de un tamaño de 1 mm en el agar. Para detectar la actividad de fibrinolisis del plasminógeno producido de manera recombinante después de la activación de la estreptocinasa en cada caso 20 µ? de las siguientes soluciones se pipetaron dentro de los orificios y se incubaron durante 2Oh a 37°C: 1: 0.5 mg/ml de plasminógeno (Roche, Mannheim) 2: sobrenadante del cultivo KM7l/pAC37.1 -3/1 del ejemplo 6e 3: 0.5 mg/ml de plasminógeno, activado por estreptocinasa 4: sobrenadante del cultivo KM71/pAC37.1-3/1 del ejemplo 6e, activado por la estreptocinasa 5: 0.25 mg/ml de plasminógeno , activado por la estreptocinasa 6: sobrenadante del cultivo KM7l/pAC37.1-3/1 del ejemplo 6e, diluido 1:2, activado por la estreptocinasa 7: 0.125 mg/ml de plasminógeno, activado por la estreptocinasa 8 : sobrenadante del cultivo KM71H, producido como se describió en el ejemplo 6e para KM7l/pAC37.1-3/1, activado por la estreptocinasa Para la activación con estreptocinasa 2µ1 de estreptocinasa (100 U/µ?, Sigma, Dreisenhofen) se pipetaron a 40µ1 de las soluciones respectivas y se incubaron durante 60 min a 37 °C. Los puntos obtenidos por la actividad fibrinolítica se muestran en la Figura 10. Ejemplo 6g: Purificación del plasminógeno producido recombinantemente en Pichia pastoris KM71/pAC37.1-3/1 mediante cromatografía de afinidad 50 mi del sobrenadante del cultivo de Pichia pastoris K 7l/pAC37. l-3/l del ejemplo 6c/6d se dializaron a 4°C contra 4 1 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.5. Después de 24 h el amortiguador de diálisis se intercambió y se dializó durante otras 24 h. El dializado se presionó después de esto a través de un filtro de 0.02 µ?t? y después se vació en una columna de lisina-sefarosa TM 4B (diámetro: 16 mm, altura: 95 mm) (Amersham Biosciences) equilibrada con 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.5. Las proteínas no específicamente enlazadas se lavaron de la columna con 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.5, 0.5 M de NaCl . El plasminógeno enlazado se eluyó con 50 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7.5, 0.01 M e-ácido aminocaproico . Se analizaron muestras individuales por medio de SDS-PAGE al 7.5% con el manchado de plata subsiguiente (Figura 11) . El plasminógeno recombinante contenido en las fracciones se localiza en el gel en la altura del plasminógeno humano agregado como referencia. La Figura 11 muestra un SDS-PAGE al 7.5% de las fracciones de purificación del ejemplo 6g. En la Figura 11 las abreviaturas utilizadas tienen significados como sigue: M: tamaño estándar (de arriba a abajo: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa) , D: dialisato, N: fracción no enlazada, : fracción de lavado, F1-F5 fracciones de elusión que contienen plasminógeno, Plg: plasminógeno (American Diagnostica, Pfungstadt) Ejemplo 6h: Fermentación de Pichia pastoris K 71/pAC37.1-3/1 para la evaluación del valor pH y la influencia del sustrato 50 mi de medio YEP-G (10 g/1 de extracto de levadura, 20 g/1 caseína peptona, 20 g/1 de glicerol) en un matraz de cuello amplio de 1 1 sin baffles se inocularon con 2 mi de crio-cultivo de glicerol Pichia pastoris KM71/pAC37-3/1 y se incubaron durante 9 a 30°C y a 300 rpm. 5 mi de este cultivo se utilizaron para inocular 50 mi de medio MG (5 g/1 de base de levadura de nitrógeno con/sin aminoácidos, 30 g/1 de glicerol, 2.5 ml/1 de solución de biotina (0.2 g/1) en un matraz de agitación de cuello amplio de 1 1 sin baffles. Este segundo precultivo se incubó durante 16 h a 30°C y a 300 rpm. El cultivo principal se fermentó en el aparato de multi fermentación "stirrer-pro" (DASGIP, JüLICH) , que permite la fermentación paralela de cuatro cultivos en diferentes condiciones. En consecuencia en cada caso se inocularon 150 mi de medio BSM (ver ejemplo 6e) se inocularon con 15 mi del segundo precultivo. Las fermentaciones comenzaron a un pH de 6, el valor pH objetivo se detuvo después de iniciar la dosificación del sustrato. Las diferentes condiciones y resultados de las fermentaciones paralelas se muestran en la tab. 1. Tab . 1 : Exp. pH sustrato tasa de alimentación OD600 conc. del plasminógeno I S metanol perfil 187 1.4 mg/1 II 7 metanol perfil 160 6.1 mg/1 III 6 metanol/glicerol 1 ml/h 270 10.1 mg/1 IV 6 metanol perfil 130 3.4 mg/1 En el experimento IV se agregó al medio 30 g/1 de peptona. Antes del inicio de la dosificación de metanol se agregó el medio de alimentación de glicerol (500 g/1 de glicerol libre de agua, 10 ml/1 de solución de rastreo, 10 ml/1 de solución de biotina [ver ejemplo 6e] ) durante 4 h con una tasa constante de 24 ml/h. Para el perfil en los experimentos I, II y IV se proporcionó el siguiente término como una función de dosificación f (x) =P1+ (P2/l+exp (-P3 (t-P4) ) ) ) + (P5/ (l+exp(-P6 (t-P7) ) ) ) con P1=0; P2=0.7; P3 =0.2; P4=15; P5=P6=P7=0. Puede verse a partir de la tab.l, que las concentraciones del plasminogeno a un valor neutral de pH y las dosificaciones mezcladas de glicerol/metanol son las más altas . Ejemplo 7a: Inserción del gen del plasminogeno Lys de pAC37.1 en el vector pGAPZotA 150 ng del vector pGAPZaA (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) se cortaron con cada 10 U de las endonucleasas de restricción Xhol y Notl (ambas de Roche Diagnostics, annheim) . 300 ng del plásmido de expresión del plasminogeno pAC37.1 (ver ejemplo 6a) , se cortaron también con las enzimas Xhol y Notl. El ADN así tratado se separó mediante electroforesis de gel con un gel de agarosa al 0.9%. El fragmento de 2715 bp del gen de plasminogeno a partir de pAC37.1 así como el fragmento de 3073 bp del vector a partir de pGAPZ A se extrajeron del gel por medio del equipo de extracción de gel QIAgen (Qiagen, Hilden) . Los dos fragmentos se combinaron y se ligaron a 4°C durante la noche con 1 U de T4 -ADN-ligasa . La transformación de E. coli DH5a , el aislamiento y la caracterización del plásmido resultante se llevaron a cabo análogos a la descripción en el ejemplo Ib, aunque en lugar del antibiótico zeocina se utilizó el antibiótico ampicilina para la selección de los transformantes. El plásmido así construido se refirió como pJ 9.1 (Figura 7).

Ejemplo 7b: Transformación de Pichia pastoris con el plásmido pJW9.1 Como se describió para la transformación de Pichia pastoris K 71H con pMHS476.1 en el ejemplo le, Pichia pastoris K 71H se transformó con el plásmido pJW9.1 linearizado con la endonucleasa de restricción Blnl . Las células transformadas se colocaron en placas sobre el agar YPDS con 100 µg/ml de zeocina (manual de instrucciones del EasySelect™ Pichia Expresión Kit) y se incubaron. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris K 71H/pJW9.1-a , mientras que "a" representa la numeración consecutiva de las colonias que comienzan en 1. Ejemplo 7c: Fermentación de Pichia pastoris KM7IH/pJW9.1-3 para la evaluación del valor pH a la tasa de alimentación de glicerol Los precultivos y la fermentación en el "stirrer-pro" se llevaron a cabo como se describió en el ej emplo 6 i .

Los resultados se muestran en la tab. 2. Tab. 2 : Exp. pH sustrato tasa de alimentación OD600 conc. del plasminógeno I 6.5 glicerol 1 ml/h 220 18.6 mg/l II 7.0 glicerol 1 ml/h 203 22.2 mg/l III 6.5 glicerol 0.5 ml/h 142 10.1 mg/l IV 7.0 glicerol 0.5 ml/h 99 3.8 mg/l También en el caso de la alimentación de glicerol los mejores rendimientos se obtuvieron mediante fermentación a un valor pH neutral, aunque la influencia de la dosificación del sustrato (tasa de alimentación) en la formación del producto puede verse claramente. Ejemplo 7d: Fermentación de Pichia pastoris K 71H/pJW9.1-3 50 mi de medio YEP-G (10 g/1 de extracto de levadura, 20 g/1 de caseína peptona, 20 g/1 de glicerol) en un matraz de cuello amplio de 1 1 sin baffles, se inocularon con Pichia pastoris K 71H/pJW9.1-3 y se incubaron durante 9 h a 30°C y a 300 rpm. 10 mi de este cultivo se utilizaron para inocular 40 mi de medio MG (5 g/1 de base de levadura de nitrógeno con/sin aminoácidos, 30 g glicerol, 2.5 ml/1 de solución de biotina (0.2 g/1)) en un matraz agitado de cuello amplio de 1 1 sin baffles. Este cultivo se incubó durante 16 h a 30°C y a 300 rpm. 3 1 de medio BSM (ver ejemplo 6e) se inocularon con 30 mi de este cultivo en un termentador de laboratorio de 7.5 1 (tipo Labfors, Infors AG, CU) . La fermentación se llevó a cabo a 25°C y una tasa de alimentación de gas constante de 3.2 1/min. Después de 24 h se agregó solución de glicerol (500 g/1 de glicerol, 10 ml/1 de solución de rastreo, 10 ml/1 de solución de biotina [ver ejemplo 6e] ) . La tasa de dosificación se incrementó paso a paso desde 10 ml/h hasta 45 ml/h durante la fermentación. Después de 250 h pudo medirse una actividad del plas inógeno de 1375 U/1 después de la activación con estreptocinasa . Ejemplo 8: Identificación de los activadores del plasminógeno 24 proteasas comercialmente adquiribles se probaron en su elegibilidad para la activación del plasminógeno. Los experimentos para la misma se llevaron a cabo en 100 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 8 , 0.36 mM de CaCl2, 0.9% de NaCl . Las proteasas suministradas en forma de polvos se disolvieron en amortiguador, las proteasas suministradas en solución se utilizaron directamente y se diluyeron respectivamente con amortiguador según fue necesario. 25 µ? de las soluciones de proteasa se mezclaron con 25 µ? de plasminógeno de acuerdo con la presente invención (20 mg/ml) y se incubaron durante 10 min a 37 °C. Después de esto la actividad de plasmina se midió con respecto al sustrato N-tosil-Gly-Pro-Lys-pNA. Para esto, 200 µ? de solución de sustrato (9.5 mg de N-tosil-Gly-Pro-Lys-pNA, disuelto en 75 mg de glicina/10 mi, Tween® 20 al 2%) se pipetaron a 850 µ? de amortiguador, se fusionaron con los 50 µ? de la mezcla de proteasa de plasminógeno preincubada y se incubaron adicionalmente a 37°C. El aumento de la extinción se midió fotométricamente a 405 nm. Para la medición del aumento de la extinción debida a las proteasas se llevaron a cabo pruebas, en las cuales en lugar de la mezcla de proteasa de plasminógeno preincubada se utilizó de manera similar una mezcla de proteasa de amortiguador preincubada. La proteasa de S. griseus, proteasa VIII, proteasa XXIII, proteasa XIX, proteasa XVIII, ficina, metaloendopeptidasa , clostripaina, Glu-C, proteasa XIII, cimopapaina, cimotripsina , proteasa X, bromelaína, calicreína y proteinaza A se adquirieron de Sigma, Deisenhofen; tripsina, papaína, Asp-N, dispasa 1, Lys-C, trombina y elastasa provinieron de Roche, annheim; la proteinasa K se suministró por QIAGEN, Hilden. Las soluciones de almacenamiento de proteasa producidas tuvieron las concentraciones de proteína dadas en la Tabla 3. El factor F de dilución indica a qué proporción se diluyen las soluciones de almacenamiento para las mediciones. Enseguida las actividades de plasmina pudieron determinarse después de la activación (1 U/mg = 1 µt??? N-tosil-Gly-Pro-Lys-pNA conversión por minuto por mg de proteína) : Tabla 3 : Proteasa actividad de plasmina conc , de proteína F después de la activación [mg/ml] Proteasa de S. griseus 613.3 U/mg 0.77 1000 Proteasa VIII 9 U/mg 3.58 1000 Proteasa XXIII 17.8 50000 Proteasa XIX 2.78 100 Proteasa XVIII 0.7 U/mg 1.79 100 Ficina 0.01 U/mg 0.81 1 Metaloendopeptidasa 8.9 U/mg 0.01 1 Clostripaina 1.7 U/mg 0.25 1 Endoproteinasa Glu-C 0.6 U/mg 0.81 1 Proteasa XIII 0.01 U/mg 0.43 1 Ciraopapaina 2.02 1 Cimotripsina 0.14 1 Proteasa X 2.01 1 Brome1aína 0.81 1 Calicreína 0.56 1 Proteinaza A 0.02 U/mg 0.36 1 Tripsina 11 kU/mg 3.40 100000 Papaína * 0.64 10 Endoproteinasa Asp-N 4.3 U/mg 0.004 1 Dispasa 1 * 0.2 1 Endoproteinasa Lys-C * 0.01 1 Trombina 83.0 U/mg 0.59 500 Elastasa 0.63 U/mg 0.36 5 Proteinaza K * 3.60 100 *Para las proteasas, proteasa XXIII, proteasa XIX, cimopapaina, endoproteinasa Lys-C, cimotripsina, papaína, dispasa 1, proteasa X, bromelaína, calicreína y proteinaza K no pudo detectarse ninguna activación del plasrainogeno. Ejemplo 9: Formulaciones farmacéuticas El plasminogeno funcional recombinante utilizado en los siguientes ejemplos se obtuvo por medio del método de producción inventivo. A este respecto el término "plasminogeno" se refiere al micro-, mini-, Lys- o plasminogeno Glu recombinante y el término "plasmina" a la plasmina que se obtuvo mediante el desdoblamiento proteolítica del micro-, mini-, Lys- o plasminogeno Glu recombinante. La activación del micro, mini-, Lys- o plasminogeno Glu puede obtenerse mediante el uso de los mismos activadores del plasminogeno, especialmente de las proteasas que activan el plasminogeno como se describió anteriormente, pero no se limita a estos ejemplos, aunque la proporción de unidades de activador a unidades de plasminogeno (micro-, mini-, Lys-, o plasminogeno Glu) es de aproximadamente 1:1000.

El plasminógeno puede activarse proteolíticamente, i.e., mediante el activador de plasminógeno del tejido de proteasas, urocinasa o las proteasas proteasa VII o la proteasa de S. griseus descrita en la patente así como mediante la formación de complejo con estreptocinasa o estafilocinasa . Ejemplo 9a: Formulaciones farmacéuticas Hidrogeles Formulación base para hidrogeles (lOOg) Plasminógeno 100 U Activador (es) de plasminógeno 0.1 U Hidroxietil celulosa 10 000 3.5 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.4%, PHB-éster 0.1%) agua purificada ad 100.0 Puede utilizarse la resp. de hipromelosa de metil celulosa en lugar de la resp. de hidroxietil celulosa en una cantidad de 0.5-15.0 g. Gel Plasminógeno 1000 U Activador (es) del plasminógeno 1 U Glicerol (85%) 150.0 g Hidroxietil celulosa 10 000 32.5 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.4%, PHB-éster 0.1%) Solución de Ringer sin lactato ad 1000.0 g alternativamente : 100 g contienen: Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Hidroxietil celulosa 10 000 2.5 g Glicerol 85% 10.0 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%) agua purificada ad 100.0 alternativamente : 100 g de gel contienen: Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Ácidos poliacrílicos 1 g Propilen glicol 8 g Triglicérido mid-catenado 8 g Dietilamina (para ajustar el pH) q.s. conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%) 2 -Propanol 0-1 g Agua ad 100 g Ungüento hidrófilo (ungüento de Macrogol) 50g contienen Plasminógeno 50 U Activador (es) del plasminógeno 0.05 U Macrogol 400 30.0 g Macrogol 4000 10.0 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%) Agua purificada ad 50.0 g alternativamente : Ungüento de Macrogol Libre de Agua 100 g contienen: Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Macrogol 300 50 g Macrogol 1500 ad 100 g alternativamente : Ungüento reabsorbente de agua Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Alcohol Cetilestearílico 29 g Parafina, viscosa 34 g Vaselina, blanca 100 g Ungüento Hidrófobo Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Vaselina 80.0 g Fluido delgado de parafina ad 100 g Pasta hidrofóbica Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Hipromelosa 400 20 g Vaselina, blanca ad 100 g alternativamente : Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Carbómero {e.g., carbopol 974p) 15 g Parafina, viscosa 40 g Vaselina blanca ad 199 g Crema Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Triglicéridos Mid-catenados 20 g alcohol cetilestearílico emulgente 10 g Lanolina 10 g Sorbitol 10 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%) agua purificada ad 100 g Crema hidrofílica no iónica Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Alcohol Cetílico 20 g 2 -Etilauromiristato 10 g Glicerol 85% 6 g Sorbato de potasio 0.14 g Ácido cítrico 0.07 g Agua ad 100 g Crema no iónica Plasminógeno 100 U Activador (es) del plasminógeno 0.1 U Polysorbat 60 5 g Alcohol cetilestearílico 10 g Glicerol 85% 10 g Vaselina, blanca 25 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%) Agua ad 100 g Formulación Liposomal Plasminógeno 100 U Activado (es) del plasminógeno 0.1 U Lecitina de soja, lecitina de pollo 15 g conservación opcional (ácido sorbínico/sorbato de potasio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%, resp . diazodinil urea 1-2 g) Agua ad 100.0 g Cápsula Una cápsula con 0.25g de polvo/granulado contiene: Plasminógeno 5 U Activador (es) del plasminógeno 0.005 U Almidón 0.1 g Dióxido de Silicio 0.02 g Estearato de Magnesio 0.002 g Copolimerisatos de polimetacrilato/ácido polimetacrílico 0.015 g Trietilcitrato 0.0005 g Talco 0.001 g Celulosa, microcristalina ad 0.25 g alternativamente: Una cápsula con 0.25 g de polvo/granulado contiene: Plasminógeno 5 U Activador (es) del plasminógeno 0.005 U Dióxido de silicio 0.01 g Estearato de magnesio 0.002 g Copolimerisatos de polimetacrilato/ácido polimetacrílico 0.015 g Trietilcitrato 0.0001 g Talco 0.001 mg Manitol ad 0.25 g Pildoras 100 mg de granulado de pildora contienen: Plasminógeno 5 U Activador (es) del plasminógeno 0.005 U Almidón 30 mg Dióxido de Silicio 2 mg Estearato de Magnesio 4 mg Copolimerisatos de polimetacrilato/ácido polimetacrílico 5 mg Trietilcitrato 0-1 mg Talco 0.0001 mg Celulosa, microcristalina ad 100 mg Pastillas pastillas de 100 g contienen: Plasminógeno 2000 U Activador (es) del plasminógeno 2 U Almidón 20 g Estearato de sucrosa 20 g Dióxido de Silicio 2 g Estearato de Magnesio 3 g Polivinilpirrolidona 0-1 g Copolimerisatos de polimetacrilato/ácido polimetacrílico 5 g Talco 0.2 g Trietilcitrato 0.1 g Celulosa, microcristalina ad 100 g Solución inyectable Plasminógeno 500 U Activador (es) del plasminógeno 0.5 U Etanol 0-1 g Propilenglicol 10 g Polietilenglicol 0-1 g Cloruro de sodio q.s conservación opcional (fosfato de hidrógeno de sodio/fosfato de dihidrógeno de sodio 0.1-0.2%, PHB-éster 0.1%) Agua purificada ad 100 mi En lugar de micro-, mini-, Lys- o plasminógeno Glu en caso de las formulaciones enumeradas también puede utilizarse la misma cantidad en base a la actividad de plasmina. Si la plasmina se utiliza directamente no tiene que contenerse ningún activador del plasminógeno en la formulación farmacéutica. Ejemplo 9b: Formulaciones farmacéuticas a) Hidrogeles Formulación básica para hidrogeles (100 g) Plasmina 100 U Hidroxietilcelulosa 400 2.5-5.0 g agua purificada ad 100.0 g El tiempo para dilatación toma de 1 a 3 horas. Es posible el uso de 1-1000 U de plasmina por gramo de hidrogel . b) Ungüento hidrófilo Formulación básica de un ungüento hidrófilo (1000 g) : Plasmina 1000 U Glicerol, libre de agua 85.0 g Hidroxietilcelulosa 10.000 32.5 g Opcionalmente polihexanida 0.2 % por peso Solución de Ringer sin lactato ad 1000.0 g Puede . agregarse opcionalmente polihexanida como agente anti microbiano activo en una concentración hasta de 0.2 % por peso. En lugar de hidroxietilcelulosa 10.000 (Natrosol 250® HX PHAR ) también puede agregarse hidroxietilcelulosa 400 [e.g., Tylose® H 300 o Natrosol 250® HX PHARM) . Es posible el uso de 1-10000 U de plasmina por gramo de ungüento, (c) Ungüento Formulación Básica para ungüento (50 g) Plasmina 50 U Macrogol 400 30.0-32.5 g Macrogol 4000 12.5-7.5 g agua purificada ad 50.0 g Preparació : 12.5 g de macrogol 4000 y 30.0 g de macrogol 400 (en el caso de ungüentos suple 7.5 g de macrogol 4000 y 32.5 g de macrogol 400) se calientan en el baño de agua en un depósito para ungüento hasta oler el macrogol. Después de enfriar la cantidad apropiada de la plasmina, que se produjo por medio del método inventivo, se agrega disuelta en 7.5 g de agua purificada y después de esto se homogeniza. d) Cápsula Formulación básica para 0.5 g Plasmina 5 U Lactosa 0.42 g Almidón 0.06 g Estearato de magnesio 0.02 g Es posible el uso de 0.1-100 U de plasmina por cápsula . e) Solución inyectable/solución en infusión Formulación básica para 100 mi Plasmina 500 U Etanol 0.01 g Polipropilenglicol 30 mi agua purificada ad 100 mi Es posible el uso de 1-500 U de plasmina por mi de solución. En lugar de plasmina también puede utilizarse micro-, mini- Lys- o plasminógeno Glu en las cantidades mencionadas para la plasmina en base a la actividad en unidades, si al mismo tiempo se agrega al menos un plasminógeno en una cantidad de 1:10000 a 1:100, de preferencia en una cantidad de 1:1000 en base a la actividad del plasminógeno. Ejemplo 10a: Amplificación y clonación de diferentes formas del gen del mini- y el micro-plasminógeno y clonación en el vector pPICZaA; transformación de Pichia pastoris El mini- y micro-plasminógeno representan derivados de plasminogeno acortados, que carecen de los dominios de N-terminal , pero que pueden aún activarse dentro de la plasmina activa. La amplificación de los genes de mini- y micro-plasminógeno para la clonación en el vector pPICZaA se llevó a cabo con el iniciador de oligonucleótido N034 para el extremo 3' y en cada caso con uno de los iniciadores N036a-j (Seq ID No. 19 a 28) para el extremo 5' particular utilizando las condiciones descritas en el ejemplo la. Los iniciadores de oligonucleótido N036a, c, e, g, i tienen además de las bases complementarias al gen de plasminogeno los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2, los iniciadores N036b, d, f, h, j tienen además subsiguientes a los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 los codones para dos sitios de desdoblamiento Stel3. El iniciador N034 tiene además en un sitio de desdoblamiento Kspl , los iniciadores N036 a-j tienen un sitio de desdoblamiento X ol . La clonación de los genes de mini-y micro-plasminogeno en el vector pPICZaA se llevó a cabo análoga a la clonación descrita en el ejemplo Ib, aunque el vector así como el producto de PCR particular se cortaron con las endonucleasas de restricción Xhol y Kspl . Los iniciadores utilizados, los nombres del derivado de plasminogeno, los sitios de desdoblamiento de proteasa codificados, el marcado de los plásmidos obtenidos y el aminoácido de N- terminal del derivado de plasminogeno secretado se resumen en la siguiente tabla . iniciador iniciador nombre punto de nombre Aminoácido * 5' 3' segmentación del plásmido N-terminal de proteasa N03Sa N034 mini- lasminogeno Kex2 pPLGl . 1 A463 N036b N034 mini-plasminogeno Kex2,2xStel3 pPLG2. 1 A463 N03Sc N034 micro-plasminógeno Kex2 pPLG3. 2 K550 N03Sd N034 micro-plasminogeno Kex2,2xStel3 pPLG4. 2 K550 ?036T N034 micro-plasminógeno ex2 pPLG5. 3 L551 N036f N034 micro-plasminógeno Kex2, 2xStel3 pPLG6. 1 L551 N036g N034 micro-plasminógeno Kex2 pPLG7. 1 A562 N036h N034 micro-plasminógeno Kex2, 2xStel3 pPLG8. 3 A562 N036j N034 micro-plasminógeno ex2 pPLG9. 1 S564 N036j N034 micro-plasminógeno ex2, 2xStel3 pPLGIO. 1S564 *La numeración se refiere al preplasminógeno de 810 aminoácidos de longitud (Seq ID No. 12) La Figura 8 muestra de manera ejemplar el plásmido pPLGl .1. Como se describió para pMHS476.1 en el ejemplo le Pichia pastoris se transformó con el plásmido pPLGl .1. Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia pastoris KM71H/pPLGl .1-l/a, mientras que "a" representa la numeración consecutiva de las colonias que comienzan en 1.

La generación de cepas en base a los plásmidos pPLG2.1 , pPLG3.2 , pPLG .2 , pPLG5.3 , pPLG6.1 , pPLG7.1 , pPLG8.3, pPLG9.1, y pPLGIO .1 se llevó a cabo de acuerdo con la producción de la cepa K 71H/pPLGl .1-l/a . Iniciador de Oligonucleótido N36a-j N036a AAAAACTCGAGAAAAGACCACCTCCGCCTGTTG N036b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG N036C AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG N036d AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG N036e AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG N036f AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG N036g AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG N036h AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG N036Í AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC N036j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC Ejemplo 10b: Amplificación y clonación de diferentes formas del gen del mini-y el micro-plasminógeno y clonación dentro del vector pGAPZaA transformación de Pichia pastoris La amplificación de los genes de mini- y micro-plasminógeno para la clonación en el vector pGAPZaA se llevó a cabo con el iniciador de oligonucleótido N034 para el extremo 3' y en cada caso con uno de los iniciadores N036a-j (Seq ID No. 19 a 28) para el extremo 5' particular utilizando las condiciones descritas en el ejemplo la. Los iniciadores de oligonucleótido N036a, c, e, g, i tienen además de las bases complementarias al gen de plasminógeno los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2, los iniciadores N036b, d, f, h, j tienen además subsiguientes a los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 los codones para dos sitios de desdoblamiento Stel3. El iniciador N034 tiene además en un sitio de desdoblamiento Kspl, los iniciadores N036 a-j tienen un sitio de desdoblamiento Xhol . La clonación de los genes de mini-y micro-plasminógeno en el vector pGAPZaA se llevó a cabo análoga a la clonación descrita en el ejemplo Ib, aunque el vector así como el producto de PCR particular se cortaron con las endonucleasas de restricción Xhol y Kspl . Resumiendo los iniciadores, los nombres del derivado de plasminógeno, los sitios de desdoblamiento de proteasa codificados, el marcado de los plásmidos obtenidos y el aminoácido de N-terminal del derivado de plasminógeno secretado pueden tomarse de la siguiente tabla. iniciador iniciador nombre punto de nombre Aminoácido 5' 3' segmentación del plásmido N-terminal de proteasa N036a N034 mini- lasminógeno Kex2 pPLGll. .1 A463 NO36b N034 mini -plasminógeno Kex2, 2xStel3 pPLG12. .1 A463 N036C N034 micro-plasminógeno Kex2 pPLG13. .2 K550 N03Sd N034 micro-plasminógeno ex2, 2xStel3 pPLG14. .2 K550 N036e N034 miero-plasminógeno Kex2 pPLG15 , .3 L551 N03Sf N034 micro-plasminógeno Kex2, 2xStel3 pPLG16. .1 L551 N036g N034 micro--plasminógeno ex2 pPLG17..1 A562 N036h N034 micro--plasminógeno Kex2,2xStel3 pPLG18. .3 A562 N036j N034 micro--plasminógeno Kex2 pPLG19. .1 S564 N036j N034 micro--plasminógeno ex2,2xStel3 pPLG20. .1 S564 *La numeración se refiere al preplasminogeno de 810 aminoácidos de longitud (Seq ID No. 12) La Figura 9 muestra de manera ejemplar el plásmido pPLGll .2. Como se describió para pJW9.1 en el ejemplo 7a Pichia pastoris K 71H se transformó con el plásmido pPLGll.l se linearizó mediante la endonucleasa de restricción Blnl . Las colonias obtenidas se refirieron como Pichia Pastoris KM71H/pPLGll .2-l/a, mientras que "a" de nuevo representa la numeración consecutiva de las colonias que empiezan en 1. La generación de cepas en base a los plásmidos pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18.1, pPLG19.2, y pPLG20.1 se llevó a cabo de acuerdo con la producción de la cepa KM71H/pPLGl .1-l/a.

Protocolo de Secuencias Secuencia 1: Iniciador de oligonucleótido N034 AAAAACCGCGGTCAATTATTTCTCATCACTCCC Secuencia 2: Iniciador de oligonucleótido N036 AAAAACTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTG Secuencia 3: Iniciador de oligonucleótido N057 AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTG Secuencia 4: Iniciador de oligonucleótido N037 AAAAATTCGAAAAATGGAACATAAGGAAGTGG Secuencia 5: Iniciador de oligonucleótido N035 AAAAACTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTAT Secuencia 6: Iniciador de oligonucleótido N056 AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTAT Secuencia 7: gen de fusión del plasminógeno Lys humano con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y el gen de la secuencia de señal del factor alfa de la levadura £3aecharomyees cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTAC AGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCT CCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTAC TGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAG AGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAA AACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCT CAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAG AATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAAC AAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCC ACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTT TCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCA GAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGG GCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCC TGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACC CCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACC ACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAG ACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCC GATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTG AAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCA GATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGC AAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCAT AGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGC CGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTT TACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAA GTGGAGCCGAAGAAATOTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCC TGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTG ATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCA TCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAA ATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTA AGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTAT GTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTT GGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGC TATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGA GGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAA TACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGT GTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 8 : plasminógeno Lys humano con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el péptido de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKVYLSECKTGNGK Y RGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQG PWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDS QSPHAHGYIPSKFPN NLKK YCR PDRELRPWCFTTDPN RWELCDIPR CTTPPPSSGPTYQCLKGTGE YRG VAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTP ENFPCK LDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQ LAPTAPPELTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQK TPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASV VAPPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPH RHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCA APSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTL ISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEV LEPHVQEIEVSRLFLEP TRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTF GAGLL EAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSG GPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR N* Secuencia 9 : gen de fusión del plasminógeno Lys humano con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen para la secuencia de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAAT GGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGG AGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTG GAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACT GATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCAT TGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAG GCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAG AACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACC ACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCA TCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTG GCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACAT AACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCT GACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGT AAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCA CCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGC ACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACAC CGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGG AATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAG TACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTT GTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAA GGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCC CAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAA AAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAAT CCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGT GGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCC CACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGT GGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCC CCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCG CATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCA TCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACC CAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAA GTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGG CATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTC GAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCC AATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATG AGAAATAATTGA Secuencia 10 : plasminógeno Lys humano con los sitios de desdoblamiento Stel3 y Kex2 y el péptido de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPV TTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTN GLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKVYLSECKTGN G NYRGTMSKTK GITCQKWSSTSPH PRFSPATHPSEGLEE YC NPDN DPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKT SGLECQ A DSQSPHAHGYIPSKFPN LKKNYCR PDRELRPWCFTTDPNKRWELC DIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTH RTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPV STEQLAPTAPPELTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTG KCQSWSSMTPH RHQKTPENYPNAGLTM YCR PDADKGP CFTTDPSVRWEYC LKKCSGT EASWAPPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAA QEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPR LYDYCDV PQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFC GGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSY VILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRL FLEPTR DIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGET QGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCMRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQ GDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVM RN * Secuencia 11: gen de pre lasminógeno humano ATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAGAG CCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAG CTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACC TGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGG AAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTC TCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAAT GGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCT ACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAG GGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAG TGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACC ATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAG CTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAA TCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGT GGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGG GGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTT ACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 12 : preplasminógeno humano MEHKEWLLLLLFLKSGQGEPLDDYV TQGASLFSVTKKQLGAGSIEECA AKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIII MRD LFEK VYL SECKTGNGKNYRGT SKTK GITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEEN YCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKT SGLECQAWDSQSPHAHGYIPS FPNK LKK YCRNPDRELRPWCFTTDP NKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGE YRGNVAVTVSGHTCQHWS AQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIP SCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQS WSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTM YCRNPDADKGP CFTTDPSVRWEYCN LKKCSGTEASWAPPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGT PCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEK YCR PDGDVGGPWCYTTNPRK LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRT RFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSY VILGAHQEV LEPHVQ EIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECF ITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLA GGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV TWIEGVMR N* Secuencia 13 : gen de fusión del plasminógeno Glu humano con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y el gen para la secuencia de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTC AGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAG GAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTG ATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTT GAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACG ATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGA CCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAAT CCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGAC TACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGAC GGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCA CACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGT CGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGG GAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAG TGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCAC ACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTC CCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGG TGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCC TCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTC CAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACA GGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAA AACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGC CCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGC TCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAG ACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCG ACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGC ATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCT GATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTAC TGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCG AAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGG CAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCA GAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAG GTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTG TCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCT GCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCT GACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGC CTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTT CTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGAC AGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTA CAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTT CGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 14: plasminógeno Glu humano con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el péptido de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae FPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNST NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREPLDDYVNTQGASLF SVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSI IIRMRDWLFEKKVYLSECKTGNGK YRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHR PRFSPATHPSEGLEE YCRNPDNDPQGP CYTTDPEKRYDYCDILECEEE CMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNK LKK YC RNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYR G VAVTVSGHTCQH SAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPW CHTTNSQVR EYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPWQDCYHGDGQS YRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKG PWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASWAPPPWLLPDVETPSEEDCMFG NGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEK YCR P DGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGG CVAHPHSWP QVSLRTRFGMHFCGGTLISPE VLTAAHCLEKSPRPSSYK VILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPA CLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEF LNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGC ARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN* Secuencia 15: gen de fusión del plasminógeno Glu humano con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen para la secuencia de señal del factor alfa de la levadura Saccharomycea cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGG GCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCA GCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAG CAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGAT GTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAAC TACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACT TCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAAC TACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAA AAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGA GAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGAC TCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAG AAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCC AACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGT CCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACC GTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACA CCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAA AGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCG TCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTA ACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCC ACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAG AAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGAT GCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAAC CTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTT CCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGA GGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCC CATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTAC TGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAA CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCT CAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACAT TCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACC TTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCT TCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAG GAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAG CTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAAT TATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACT TTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAAT CGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCC GGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGAC AAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCT GGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAAT TGA ecuencia 16 : plasminógeno Glu humano con los sitios de desdoblamiento Stel3 y Kex2 y el péptido de señal del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPV TTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNST NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEPLDDYVNTQG ASLFSVTKKQLGAGSIEECAA CEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENR KSS11IRMRDWLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSST SPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILE CEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNK LK K YCRNPDRELRPWCFTTDPNKR ELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTG ENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTH RTPENFPCKNLDE YCRNPDGK RAPWCHTTNSQVR EYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPWQDCYHG DGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTM YCR PD ADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASWAPPPWLLPDVETPSEED CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNY CR PDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGR WGGCVAHPHS PWQVSLRTRFG HFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRP SSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDK VIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCN RYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSW GLGCARPNKPGVYVRVSRF TWIEGVMR N* !cuencia 17: Secuencia del plasminógeno Glu (pSM49.8, pSM58.1 y pSM82.1) secretado en el medio EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSK EQQCVIMAENRKSSII IRMRDWLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTK NGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPD DPQGP CYTTDP EKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQA DSQSPHAHGY IPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSS GPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQH SAQTPHTHNRTPENFPCKNL DENYCR PDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPE LTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNA GLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVR EYCNLKKCSGTEASWAPPPWL LPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPE TNPRAGLEKNYCR PDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGK PQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPE VLT AAHCLE SPRPSSYKVILGAHQEV LEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALL LSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAGLLKEA QLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEK DKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR N* cuencia 18: Secuencia del plasminógeno Lys (p HS476.1, pSM54.2, pAC37.1 y pJW9.1) secretado en el medio KVYLSECKTGNGK YRGTMSKTK GITCQK SSTSPHRPRFSPATHPSEG LEENYCR PD DPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGE YDGK ISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNK LKKMYCRNPDRELRPWCF TTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTC QHWSAQTPHTH RTPENFPCKNLDE YCR PDGKRAPWCHTTNSQVR EY CKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPWQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGK KCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCR PDADKGPWCFTTDPSVRW EYCNLKKCSGTEASWAPPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATT VTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCR PDGDVGGPWCYTT NPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQV SLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEV LE PHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADR TECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCA GHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRV SRFVTWIEGVMRNN* cuencia 19: Iniciador de oligonucleótido N036a AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG cuencia 20: Iniciador de oligonucleótido N036b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG Secuencia 21: Iniciador de oligonucleótido N036c AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG Secuencia 22: Iniciador de oligonucleótido N036d AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG Secuencia 23 : Iniciador de oligonucleótido N036e AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG Secuencia 24: Iniciador de oligonucleótido N036f AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG Secuencia 25: Iniciador de oligonucleótido N036g AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG Secuencia 26: Iniciador de oligonucleótido N036h AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG Secuencia 27: Iniciador de oligonucleótido N036i AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC Secuencia 28: Iniciador de oligonucleótido N036j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC Secuencia 29: Mini-plasminógeno (pPLGl .1 y pPLG2.1) APPPWLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHR HSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCAA PSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFG HFCGGTLI SPE VLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPT RKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFG AGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGG PLVCFEKDKYILQGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR N* Secuencia 30: Micro-plasminógeno (pPLG3.2 y pPLG4.2) KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLR TRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHV QEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTEC FITG GETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHL AGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRF VTWIEGVMR N* Secuencia 31: Micro-plasminógeno (pPLG5.3 y pPLG6.1) LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRT RFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEV LEPHVQ EIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSP YWADRTECF ITG GETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLA GGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV TWIEGVMRNN* Secuencia 32: Micro-plasminógeno (pPLG7.1 y pPLG8.3) APSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFGMHFCGGTL ISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEV LEPHVQEIEVSRLFLEP TRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFI GWGETQGTF GAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSG GPLVCFEKDKYILQGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR N* Secuencia 33: Micro-plasminógeno (pPLG9.1 y pPLGIO.l) SFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFGMHFCGGTLIS PEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTR KDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGA GLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGP LVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN* Secuencia 34: secuencia de ADN del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae en pPICZaA hasta el sitio de desdoblamiento Kex2.

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG CTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCAT CGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGC ACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAG Secuencia 35: secuencia de aminoácidos del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae en pPICZaA hasta el sitio de desdoblamiento Kex2.

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDF DVAVLPFSNST NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLE Secuencia 36: Secuencia de ADN del sitio de desdoblamiento Kex2 AAAAGA Secuencia 37: Secuencia de ADN del sitio de desdoblamiento Stel3 GAGGCTGAAGCT Secuencia 38: secuencia de aminoácidos del sitio de desdoblamiento Kex2 KR Secuencia 39: secuencia de aminoácidos del sitio de desdoblamiento Stel3 EAEA Secuencia 40: secuencias de aminoácidos del mini- plasminógeno humano como en pPLGl.l con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPPPWLLPDVETPS EEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLE KNYCRNPDGDVGGP CYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKC PGRWGGCVAHPHSWP QVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKS PRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVI TDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIEN VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGV TSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRNN* Secuencia 41: secuencia de aminoácidos del mini- plasminógeno humano como en pPLG2.1 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAA EEGVSLEKREAEAAPPPWLLPDV ETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPR AGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPR LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVE PKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFG HFCGGTLISPEWVLTAAHC LEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSS PAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPV IEN VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI LQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN* Secuencia 42: secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG3.2 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYS DLEGDFDVAVLPFSNST GLLFINTTIASIAAKEEGVSLEK RKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPH SWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSS YKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSP AVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAGLL KEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQG DSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV TWIEGVMRNN* Secuencia 43: secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG4.2 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPV TTTEDETAQIPAEAVIGYSDL EGDFDVAVLPFSNST NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAE AKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS P QVSLRTRFG HFCGGTLISPE VLTAAHCLEKSPRPSSYKVI LGAHQEV LEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDK VIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVI ENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFE KDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN* Secuencia 44: secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG5.3 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPS IFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDF DVAVLPFSNST NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRLYDYCDVPQCA APSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFG HFCGG TLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRL FLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG G ETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGT DSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRNN* Secuencia 45: secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG6.1 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPV TTTEDETAQIPAEAVIGYSDL EGDFDVAVLPFSNST NGLLFINTTIASI AKEEGVSLEKREAE ALYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHSWP WQVSLRTRFGMHFCGGTLISPE VLTAAHCLEKSPRPSSYKVIL GAHQEV LEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKV IPACLPSP YWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIE NKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEK DKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVT IEGVMRNN* Secuencia 46: Secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG7.1 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDF DVAVLPFSNSTN GLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPSFDCGKPQV EPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTA AHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIAL LKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITG GETQGTFGAGLL KEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPL VCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN* Secuencia 47 : Secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG8.3 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDF DVAVLPFSNST NGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPSFDCG KPQVEPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEW VLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRK DIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFG AGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDS GGPLVCFEKDKYILQGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR N * Secuencia 48: Secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLG9.1 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQI AEAVIGYSDLEGDF DVAVLPFSNST GLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRSFDCGKPQVEP KKCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPE VLTAAH CLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLK LSSPAVITDKVIPACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKE AQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVC FEKDKYILQGVTS GLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMR N* Secuencia 49: Secuencia de aminoácidos del micro- plasminógeno humano como en pPLGIO .1 con el sitio de desdoblamiento Kex2 y dos sitios de desdoblamiento Stel3 y el prepropéptido del factor alfa de la levadura Saecharomyees cerevisiae MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDF DVAVLPFSNST GLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEASFDCGKP QVEPKKCPGRWGGCVAHPHS PWQVSLRTRFG HFCGGTLISPE VL TAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDI ALLKLSSPAVITDKVI PACLPSPNYWADRTECFITGWGETQGTFGAG LLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGG PLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRN Secuencia 50: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de mini-plasminógeno humano como en pPLGl .1 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saecha omyees cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG CTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCAT CGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGC ACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGA GACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGG GCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGAC ACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCG TAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTT TACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTC AAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACA TTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGC ACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAA GGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCA TGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGC CATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGA AACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAG AATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCT GTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCT GGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGC TGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGA TTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 51: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de mini-plasminógeno humano como en pPLG2.1 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG CTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCAT CGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGC ACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCT TCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATAC CGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGG AGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAA AAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAAT CCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATT GTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGT GGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCAC TTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGG AGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAA TCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGA AAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCC CAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCAC TGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTC CCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAAT CCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAG TGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGT TTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 52 : Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG3.2 con los codones para el sitio de desdoblamiento ex2 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGT GCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAA TGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGG CCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGA GGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTG GAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACAC CAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGG CTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGC AGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCC CCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGG GGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAG CTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAAT GGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGC ACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAG AAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGT GCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTT ACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 53 : Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG4.2 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGTGAT GTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTG GAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCAC CCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATG CACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCT GCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATC CTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATA GAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTG CTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCT TGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTC ATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTC AAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTAT GAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCAT TTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTG GTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGG GGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTT TCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 54: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG5.3 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCG GCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGT CCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCC TGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGC ACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAG AAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAA GAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTG TTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGT CCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCA AATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGA GAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTC CCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGA AGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACT GACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAG GACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCA CGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACT TGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 55: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG6.1 con los codones para el sitio de desdoblamiento ex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG CTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCAT CGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGC ACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGATGTCCC TCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGT CCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCA GTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTG GGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTC ATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGT CTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCC TGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTC GCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAG CTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTA TGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGA GGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACA AATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCC TGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAAT AATTGA Secuencia 56: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG7.1 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTG GAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCAC CCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATG CACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCT GCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATC CTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATA GAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTG CTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCT TGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTC ATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTC AAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTAT GAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCAT TTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTG GTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGG GGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTT TCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 57 : Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG8.3 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGGG AAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGG TGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACA AGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGG GTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCC TACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCAT GTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAA GATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAA GTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGG ACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGA GCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTG TGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTC TGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGT GGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGA GTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTC TATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGA AATAATTGA Secuencia 58: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG9.1 con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCG AAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACAT TCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTC TGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCAC TGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGT GCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTG TCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAG CTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTG CCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACT GGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAA GCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTT CTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCC GGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGC TTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTT GGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGG TTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 59: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLGIO.l con los codones para el sitio de desdoblamiento Kex2 y los sitios de desdoblamiento Stel3 y el gen del prepropéptido del factor alfa de la levadura Saccharomyces cerevisiae ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAA ATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTC GATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTG TTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCT CAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTG GCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTT GGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTG ACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAG GTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAG GAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATT GCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATC CCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAA TGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGC CTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAAT CGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCT GGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGT CCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACT TCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTT CGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAAT TGA Secuencia 60: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de mini-plasminógeno humano como en pPLGl .1 y pPLG2.1 GCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATG TTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGC CAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCA CGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGG TGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCC CCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTG GGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTT GGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCAC TGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAA GTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACA CGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATC CCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACT GGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCT GTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACC GAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGT CCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTT GGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGG ATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 61: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG3.2 y pPLG4.2 AAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTT GATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTT GTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGT CTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCC CCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGG CCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTC GAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCC ACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATC ACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTC GCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGT ACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAG AATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCC ACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAG GGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATT TTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAG CCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGA GTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 62: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG5.3 y pPLG6.1 CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGAT TGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTG GGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTT AGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCA GAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCT TCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAA CCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACA CGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACT GACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCT GACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACT TTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAAT AAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACC GAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGT GACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTA CAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCT GGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTG ATGAGAAATAATTGA Secuencia 63: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG7.1 y pPLG8.3 GCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGT CCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCC TGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGC ACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAG AAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAA GAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTG TTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGT CCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCA AATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGA GAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTC CCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGA AGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACT GACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAG GACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCA CGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACT TGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 64: Secuencia de ácidos nucleicos del gen de micro-plasminógeno humano como en pPLG9.1 y pPLGIO.l TCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGA AGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAA GTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTG ATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCC CCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTG AATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTG GAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCC GTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTAT GTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACC CAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTG ATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTC CAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGT TGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAA TACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCC AATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATT GAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 65: Secuencia de ácidos nucleicos del gen del plasminogeno Glu humano GAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAG CAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTC ACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAAC AGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTAT CTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAA AATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCT GCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCG CAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTT GAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAG ACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATAC ATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGG GAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATC CCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACA GGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGG AGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTG GATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAAC AGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACG GAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCAT GGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAG TCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCT GGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACC ACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCG AGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAA GACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGG ACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAG ACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGT GGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAG TGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGA AGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGA ACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACT GCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCA CACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTG GAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGAC AAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGT TTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCC CAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTC CAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGAC AGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTT GTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Secuencia 66: Secuencia de ácidos nucleicos del gen del plasminógeno Lys h mnao AAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCC AAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGA TTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGAC AACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGC GACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAA ATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCT CATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAAC CCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTT TGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTG AAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGT CAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGC AAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCAT ACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCA GTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGAC TGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAG AAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTAC CCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGG TGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGA ACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCT TCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACT GTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTC ACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGT GATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGAT GTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAA TGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTC AGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGG GTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATC CTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGG CTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTC ATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGG ACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTC AAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAAT GGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGC CAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGA GTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTT TCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA Bibliografía (1) = Desire Collen, Thrombosis and Haemostasis , 82, 1999 (2) = Forsgren et al., FEBS Lett . 213, 1987 (3) = Petersen et al., J. Biol . Chem. , 265, 1990 (4) = Duman et al., Biotechnol . Ap l . Biochem. 28; 39-45, 1998 (5) = Guan et al., Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 17, 2001 (6) = González-Gronow et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (7) = Whitefleet-Smith et al., Arch. Biochem. Biophys., 271, 1989 (8) = Nilsen und Castellino, Protein Expression and Purification, 16, 1999 (9) = Busby et al., J. Biol. Chem., 266, 1991 (10) = Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, 1989 (11) = Gassen & Schrimpf, Gentechnische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1999 (12) = Malinowski et al., Biochemistry, 23, 1984 (13) = Stack et al., Biochem. J. 284, 1992

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para la producción recombinante de un plasminogeno funcional en microorganismos que comprende al menos la etapa: a) fusión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos la parte funcional del plasminogeno con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos un péptido de señal, estando acoplada la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el plasminogeno funcional y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos el péptido de señal con los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas que se proporcionan para el desdoblamiento del péptido de señal .
2. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos la parte funcional del plasminogeno comprende el dominio proteolítico del plasminogeno o un mutante o un fragmento del mismo.
3. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos una parte funcional del plasminogeno codifica para el plasminogeno Glu o Lys.
4. El método para la producción recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos un péptido de señal codifica para un prepropéptido, un prepéptido o un propéptido y/o en donde los codones codifican para sitios de desdoblamiento de proteasas para la proteasa Kex2 y/o Stel3.
5. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado en que la molécula de ácido nucleico que codifica para al menos un péptido de señal codifica para el péptido de señal del factor alfa o de SUC2 , PHA-E o PH01 de la levadura Saccharo yces cerevisiae .
6. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que se producen al menos 20 mg/1 de plasminógeno Glu o Lys funcional.
7. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que después de un procesamiento de 120 horas se producen al menos 120 U/1 del plasminógeno Lys funcional.
8. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, en donde como iniciadores para la amplificación se utilizan dos iniciadores de oligonucleótido seleccionados del grupo que consiste de N036a (Seq ID No. 19), N036b (Seq ID No. 20), N036c (Seq ID No. 21), N036d (Seq ID No. 22), N036e (Seq ID No. 23), N036f (Seq ID No. 24), N036g (Seq ID No. 25), N036h (Seq ID No. 26), N036Í (Seq ID No. 27), y N036j (Seq ID No. 28) .
9. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, en donde como iniciadores para la amplificación se utilizan dos iniciadores de oligonucleótido seleccionados del grupo que consiste de N034A (Seq ID No. 1), N036 (Seq ID No. 2), N057 (Seq ID No. 3), N037 (Seq ID No. 4), N035 (Seq ID No. 5), N056 (Seq ID No. 6), así como del grupo que consiste de N036a (Seq ID No. 19), N036b (Seq ID No. 20), N036c (Seq ID No. 21), N036d (Seq ID No. 22), N036e (Seq ID No. 23), N036f (Seq ID No. 24), N036g (Seq ID No. 25), N036h (Seq ID No. 26), N036Í (Seq ID No. 27), y N036j (Seq ID No. 28).
10. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas en donde el producto de fusión que resulta en la etapa a) se incorpora al vector de expresión adecuado para microorganismos .
11. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el vector de expresión es adecuado para hongos.
12. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el vector de expresión comprende un promotor inducible y constitutivo.
13. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el vector de expresión comprende el promotor GAP constitutivo de P. pastoris .
14. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado en que el ácido nucleico así obtenido es un plásmido preferentemente seleccionado del grupo pPLG11.2 pPLG12.1, pPLG13.1, pPLG14.2, pPLG15.1, pPLG16.3, pPLG17.2, pPLG18.1, pPLG19.2, y pPLG20.1, pAC37.1, pJW9.1, pMHS476.1, pSM54.2 , pSM49.8, pSM82.1 y pSM58.1.
15. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que los codones codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y el gen de fusión del plasminógeno tiene la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Seq. ID No. 7, 13, 50, 52, 54, 56 o 58.
16. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que los codones codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y la proteína de fusión del plasminógeno tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Seq. ID No. 8, 14, 40, 42, 44, 46 o 48.
17. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que los codones codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y la proteasa Stel3 y el gen de fusión del plasminógeno tiene la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Seq. ID No. 9, 15, 51, 53, 55 o 57.
18. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que los codones codifican para el sitio de desdoblamiento de la proteasa Kex2 y la proteasa Stel3 y la proteína de fusión del plasminógeno tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Seq. ID No. 10, 16, 41, 43, 45, 47, o 49.
19. Método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, en donde un huésped considerado en los microorganismos se transforma con el plásmido incluido en la reivindicación 14.
20. El método para la producción recombinante de acuerdo con un o más de las reivindicaciones previas en donde el organismo huésped utilizado es un microorganismo eucariótico .
21. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado en que el organismo huésped utilizado se considera en el género de hongo .
22. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado en que el organismo huésped utilizado se considera en el género de Pichia, Saccharmyces, Hasenula, Candida o Aspergillus.
23. El método para la producción recombinante de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado en que el organismo huésped utilizado se considera en las especies Pichia pastoris, Pichia Methanólica, Hansenula polymorpha, Aspergillus Níger, Aspergillus oryzae o Aspergillus nidulans.
24. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, en donde la secuencia de ácidos nucleicos que se encuentra sobre expresada codifica para al menos la parte funcional del plasminógeno y al menos la parte funcional del plasminógeno que se secreta para un organismo huésped microbial se transforma con el producto de fusión generado de acuerdo con la etapa a)
25. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, en donde la parte funcional de la secuencia de ácidos nucleicos del plasminógeno es una de las secuencias Seq ID, No, 60, 61, 62, 63, 64, 65 o 66.
26. El método para la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que se produce un plasminógeno humano funcional .
27. Método para la reproducción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones previas, caracterizado en que se produce un plasminógeno homólogo al humano funcional .
28. Plásmido pPLG11.2, plásmido pPLG12.1, plásmido pPLG13.1, plásmido pPLG14.2, plásmido pPLG15.1, plásmido pPLG16.3, plásmido pPLG17.2, plásmido pPLG18.1, plásmido pPLG19.2, o plásmido pPLG20.1.
29. Plásmido pMHS476.1, plásmido pSM54.2, plásmido pSM49.8, plásmido pSM82.1.
30. Plásmido pSM58.1, plásmido pAC37.1, plásmido pJW9.1.
31. La secuencia de ácidos nucleicos obtenible mediante el método de la producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizada en que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos la parte funcional del plasminógeno se encuentra operativamente acoplada a un promotor que se activa en la levadura y adicionalmente se acopla a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos un péptido de señal, estando acoplada la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el plasminógeno funcional y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para al menos el péptido de señal con los codones para los sitios de desdoblamiento de las proteasas Kex2 y Stel3.
32. El plasminógeno obtenible a través del método de producción recombinante de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 27.
33. El plasminógeno de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado en que se refiere a un microplasminógeno , miniplasminógeno, plasminógeno Lys, plasminógeno Glu o un derivado de plasminógeno.
34. El derivado de plasminógeno de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado en que contiene el dominio funcional proteolítico del plasminógeno y comprende al menos una supresión y/o al menos un intercambio de aminoácido y/o se encuentra fusionado con al menos un aminoácido o al menos un péptido o al menos una proteína.
35. El derivado de plasminógeno de acuerdo con la reivindicación 33 o 34, caracterizado en que es activable a través de al menos un activador de plasminógeno para activar la plasmina.
36. El derivado de plasminógeno de acuerdo con una de las reivindicaciones 33 a 35, caracterizado en que contiene al menos el dominio funcional proteolítico del plasminógeno y caracteriza una homología de secuencia a micro-, mini-, Lys- o Glu-plasminógeno de aproximadamente 80%, de preferencia aproximadamente 90% y especialmente preferida de aproximadamente 95%.
37. La plasmina obtenible a través de la activación del plasminógeno o derivados del plasminógeno de acuerdo con una de las reivindicaciones 32-36 utilizando al menos un activador de plasminógeno.
38. El organismo huésped microbial que comprende el producto de fusión de una secuencia de ácidos nucleicos derivados del mismo obtenido en la etapa a) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27.
39. El organismo huésped microbial de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizado en que se selecciona del grupo Pichia pastoris, Pichia ethanolica, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Aspergillus Níger, Aspergillus oryzae y Aspergillus nidulans .
40. El uso de un plasminógeno funcional y/o la plasmina que se origina del mismo producido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27 para la preparación de un farmacéutico .
41. El uso de un plasminógeno funcional y/o la plasmina que se origina del mismo producido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27 para el tratamiento de heridas, eventos trombóticos o la prevención de eventos trombóticos .
42. El uso de un plasminógeno funcional y/o la plasmina que se origina del mismo producido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27 como agente anti-trombótico así como anticuagulante activo
43. El uso más particularmente de acuerdo con la reivindicación 42 para la profilaxis y/o tratamiento del ataque cardiaco, apoplejía, trombosis, trombosis venosa, restenosis, hipoxia, isquemia, necrosis por coagulación, inflamaciones de los vasos sanguíneos, embolia pulmonar aguda, trombosis arterial aguda y subaguda, coagulaciones recientes o pasadas de trombosis venosas, trombosis venosa profunda de la cadera y las extremidades, trombosis temprana en el área de vasos desobliterados, oclusión aguda de vaso central en el ojo, conjuntivitis en el caso de deficiencia tipo I de plasminógeno, lesiones por quemadura, quemaduras alcalinas o ácidas y congelaciones, choque durante la coagulación intravasal diseminada, oclusiones arteriales agudas de las extremidades, arteriopatías oclusivas crónicas, trombosis de derivaciones arteriovenosas así como para el tratamiento subsecuente al ataque cardiaco, subsecuente a una revascularización por cirugía, subsecuente a una angioplastía así como subsecuente a una distensión de cavidad, para la terapia trombótica en el caso de ataque cardiaco agudo, para la recanalización de derivaciones arteriovenosas, así como para la reperfusión de arterias coronarias ocluidas en el caso de ataque cardiaco agudo.
44. El uso de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 40 a 43 en combinación con un anticoagulante .
45. El uso de acuerdo con la reivindicación 44, caracterizado en que el anticoagulante se refiere a heparina, derivados de heparina, o ácido acetilsalisílico .
46. El uso de un plasminógeno funcional y/o la plasmina que se origina de este, producido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27 para incorporarse en materiales de restauración, emplastos o para el uso en combinación con drogas cicatrizales.
47. Los materiales de restauración vendajes y emplastos cicatrizales que comprenden plasminógeno funcional y/o la plasmina que se origina de este producido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 27.
48. Los materiales de restauración, vendajes y emplastos cicatrizales de acuerdo con la reivindicación 47, que comprende 0.01 - 500 U de plasminógeno y/o la plasmina que se origina de este por cm2 de la formulación farmacéutica, de preferencia 0.1 - 250 Unidades y se prefiere especialmente de 1 - 150 Unidades de plasminógeno y/o una plasmina que se origina de este por cm2 de la formulación farmacéutica .
49. El uso de materiales de restauración, vendajes y emplastos cicatrizales de acuerdo con la reivindicación 47 o 48 para el tratamiento de lesiones por quemaduras, congelamientos, quemaduras alcalinas o ácidas, lesiones y/o heridas .
50. La composición farmacéutica que comprende un plasminógeno y/o una plasmina que se origina de este, producido de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 27, y un vehículo, aditivo y/o solvente farmacéuticamente aceptable, así como en caso o necesidad de agentes activos de anticoagulación .
51. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 50 adecuada para aplicación oral, tópica, o parenteral, intravasal, especialmente intravenosa, intraperitoneal , subcutánea o intramuscular.
52. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 51 adecuada para la aplicación tópica conteniendo de 0.01 - 500 U de plasminógeno y/o una plasmina que se origina de este, por gramo de la composición farmacéutica, de preferencia de 0.1 - 250 Unidades y se prefiere especialmente de 1 - 150 Unidades de plasminógeno y/o una plasmina que se origina de este por gramo de la composición farmacéutica.
53. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 51 adecuada para la aplicación oral conteniendo de 0.01 - 100,000 U de plasminógeno y/o una plasmina que se origina de este por gramo de la composición farmacéutica, de preferencia de 100 - 80,000 Unidades y se prefiere especialmente de 1,000 - 50,000 Unidades de plasminogeno y/o una plasmina que se origina de este por gramo de la composición farmacéutica.
54. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 51 adecuada para la inyección o infusión conteniendo de 0.1 - 100 millones de U de plasminogeno y/o una plasmina que se origina de este por 10 mi de solución, de preferencia 1 - 10 millones de Unidades y se prefiere especialmente de 3 - 5 millones de Unidades de plasminogeno y/o una plasmina que se origina de este por 10 mi de la solución de inyección o infusión.
55. El uso de la composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 50 a 54 para la profilaxis y/o tratamiento del ataque cardiaco, apoplejía, trombosis, trombosis venosa, restenosis, hipoxia, isquemia, necrosis por coagulación, inflamaciones de los vasos sanguíneos, embolia pulmonar aguda, trombosis arterial aguda y subaguda, coagulaciones recientes o pasadas de trombosis venosas, trombosis venosa profunda de la cadera y las extremidades, trombosis temprana en el área de vasos desobliterados, oclusión aguda de vaso central en el ojo, conjuntivitis en el caso de deficiencia tipo I de plasminogeno, lesiones por quemadura, quemaduras alcalinas o ácidas y congelaciones, choque durante la coagulación intravasal diseminada, oclusiones arteriales agudas de las extremidades, arteriopatías oclusivas crónicas, trombosis de derivaciones arteriovenosas así como para el tratamiento subsecuente al ataque cardiaco, subsecuente a una revascularización por cirugía, subsecuente a una angioplastía así como subsecuente a una distensión de cavidad, para la terapia trombótica en el caso de ataque cardiaco agudo, para la recanalización de derivaciones arteriovenosas, así como para la reperfusión de arterias coronarias ocluidas en el caso de ataque cardiaco agudo
56. El vector que comprende el producto de fusión o una secuencia de ácidos nucleicos derivada del mismo obtenida en la etapa a) de acuerdo con la reivindicación 1.
57. La molécula de ADN que comprende el producto de fusión o una secuencia de ácidos nucléicos derivada del mismo obtenida en la etapa a) de acuerdo con la reivindicación 1.
58. La molécula de ARN que comprende el producto de fusión o una secuencia de ácidos nucléicos derivada del mismo obtenida en la etapa a) de acuerdo con la reivindicación 1
59. El método de selección para identificación de activadores de plasminógeno a través del uso del plasminógeno funcional de acuerdo con la reivindicación 36 o 37.
60. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 59 caracterizado en que la actividad de la plasmina resultante se mide después de la preincubación de las proteasas con el plasminógeno funcional de acuerdo con la reivindicación 35 o 36.
61. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 59 o 60 caracterizado en que la actividad de la plasmina resultante se mide con un sustrato sintético de péptido .
62. El método de selección de acuerdo con la reivindicación 61, caracterizado en que la actividad de la plasmina resultante se mide con N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA.