MXPA03006430A - Virus que causa enfermedad del tracto respiratorio en mamiferos susceptibles. - Google Patents

Virus que causa enfermedad del tracto respiratorio en mamiferos susceptibles.

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Abstract

La presente invencion se refiera al campo de la virologia. La invencion ofrece un virus aislado de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamifero (MPV) dentro de la subfamia Pneumovirae de la familia Paramyxoviridae e identificable como filogeneticamente correspondiente al genero Metapneumovirus y componentes del mismo.

Description

VIRUS QUE CAUSA ENFERMEDAD DEL TRACTO RESPIRATORIO EN MAMÍFEROS SUSCEPTIBLES La invención se refiere al campo de la virología. En las últimas décadas se han identificados varios agentes etiológicos de enfermedad de mamífero, en particular de enfermedades del tracto respiratorio (RTI) , especialmente de seres humanos (Evans, A.S. en: Viral Infections of Humans . Epidemiology and control [Infecciones virales de Seres Humanos. Epidemiología y control]. 3a ed. (ed. Evans, A.S) 22-28 (Plenum Publishing Corporation, Nueva York, 1989) ) . Agentes etiológicos clásicos de enfermedades del tracto respiratorio de mamíferos son virus sincitiales respiratorios que pertenecen al género Pneumovirus encontrados en seres humanos (hRSV) y rumiantes tales como ganado u ovejas (bRSV y/o oRSV) . En RSV de seres humanos diferencias en ensayos de neutralización cruzada recíproca, reactividad de las proteínas G en ensayos inmunológicos y secuencia de nucleótidos del gen G se utilizan para definir dos subgrupos antigénicos de hRSV. Dentro de los subgrupos las secuencias de aminoácidos muestran una identidad del 94% (subgrupo A) o 98% (subgrupo B) , mientras que solamente una identidad de secuencia de aminoácidos del 53% es encontrada entre los subgrupos. Se observa una variación adicional dentro de subgrupos con base en anticuerpos monoclonales, ensayos RT-PCR y ensayos de protección ARNasa. Virus de ambos grupos tienen una distribución mundial y pueden ocurrir durante una misma temporada. La infección puede ocurrir en presencia de inmunidad pre-existente y la variación antigénica no se requiere estrictamente para permitir una re-infección. Véase por ejemplo, Sullender, W.M., Respiratory Sincitial Virus Genetic and Antigenic Diversity [Virus Sincitial Respiratorio y Diversidad Genética y Antigénica] . Clinical Microbiology Reviews, 2000. 13(1): p. 1-15; Collins, P.L. Mclntosch, K. y Chanock, R.M., Respiratory syncytial virus [Virus sincitial respiratorio] . Field virology, ed. B.N. Knipe, Howley, P.M. 1996, Filadelfia: lippencott.raven. 1313-1351; Johnson, P.R. y colaboradores, The G glycoprotein of human respiratory syncytial viruses of subgroups A and B: extensive sequence divergence between antigenically related proteins [La glicoproteina G de virus sincitial respiratorio humano de subgrupos A y B: divergencia de secuencia extensa entre proteínas antigénicamente relacionadas] . Proc. Nati Acad Sci U S , 1987. 84(16): p. 5625-9; Collins, P.L., The molecular Biology of Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) of the Genus Pneu ovirus [La biología molecular de Virus Sincitial Respiratorio Humano (RSV) del Género Pneumovirus] , en The Paramyxoviruses, D.W. ingsbury, Editor. 1991, Plenum Press: Nueva York, p. 103-153. Otro Pneumovirus clásico es el virus de la neumonía de ratón (PVM) , encontrado en general solamente en ratones de laboratorio. Sin embargo, una proporción de las enfermedades observadas entre mamíferos todavía no puede ser atribuida a patógenos conocidos . La invención proporciona un virus de KNA de una sola cadena de sentido negativo esencialmente mamífero (MPV) aislado que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae e identificable como filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus. Dicho virus es identificable como filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus mediante la determinación de la secuencia de ácidos nucleicos de dicho virus y probándolo en análisis filogenéticos, por ejemplo, en donde se generan árboles de máxima probabilidad utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) y encontrando que tiene una mayor cercanía filogenética correspondiente a un aislado de virus depositado 1-2614 ante CNCM, Paris que su correspondencia con un aislado de virus de las aves esencialmente de pneumovirus de las aves (APV) conocido también como virus de la rinotraqueitis de pavo (TRTV) , el agente etiológico de la rinotraqueitis de las aves . Para tales análisis filogenéticos, es especialmente útil obtener la secuencia de ácido nucleico de un no-MPV como grupo externo para comparación, un aislado externo muy útil puede obtenerse a partir de serotipo de pneumovirus de las aves C (APV-C) como se muestra por ejemplo en al figura 5 aquí.
Aún cuando análisis filogenéticos proporcionan un método cómodo para identificar un virus como un MPV, varios otros métodos más directos para identificar dicho virus o dichas proteínas virales o ácidos nucleicos a partir de dicho virus se proporcionan aguí. En términos generales, un MPV puede ser identificado por los porcentajes de una homología del virus, proteínas o ácidos nucleicos a identificar en comparación con aislados, proteínas virales, o ácidos nucleicos identificados aquí por secuencia o depósito. Se sabe generalmente que especies de virus, especialmente especies de virus de KNA, constituyen frecuentemente casi una especie en donde un grupo de dichos virus presenta heterogeneidad entre sus miembros . Así, se espera que cada aislado pueda tener una relación porcentuada relativamente diferente con uno de los varios aislados según lo proporcionado aquí. Cuando se desea comparar con el virus 1-2614 depositado, la invención proporciona un virus de AR de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero (MPV) aislado que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae e identificable como filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus mediante la determinación de una secuencia de aminoácidos a dicho virus y determinando que dicha secuencia de aminoácidos tiene una homología porcentual de aminoácidos con un aislado de virus depositado como 1-2614 ante CNCM, Paris que es esencialmente mayor que la homología porcentual proporcionada aquí para la L-proteína, la M-proteína, la N-proteína, la P-proteína o la F-proteína, en comparación con APV-C o bien, de manera similar, un virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero (MPV) aislado que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae se proporciona como identificable como filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus mediante determinación de una secuencia de ácidos nucleicos de dicho virus y determinando que dicha secuencia de ácido nucleico tiene una identidad porcentual de ácido nucleico con un aislado de virus depositado como 1-2614 ante CNCM, París que es esencialmente mayor que el porcentaje identificado aquí para los ácidos nucleicos que codifican la L-proteína, la M-proteína, la N-proteína, la P-proteína, o la F-proteína según lo identificado aquí abajo en comparación con APV-C. Otra vez, en términos generales, se puede considerar un MPV como perteneciente a uno de los dos grupos serologicos de MPV según lo identificad aquí cuando los aislados de las proteínas virales o ácido nucleares de los aislados que deben ser identificados tienen porcentajes de homología que se encuentran dentro de los límites de los porcentajes de homología identificados aquí para ambos grupos separados, tomando los aislados 00-1 ó 99-1 como los aislados respectivos de comparación. Sin embargo, cuando los porcentajes de homología son menores o no hay necesidad de distinguir los aislados virales entre por ejemplo APV-C es aconsejable recurrir a los análisis filogenéticos de conformidad con lo identificado aquí. Otra vez se debe tomar en cuenta que dichos porcentajes pueden variar de alguna manera cuando se seleccionan otros aislados en la determinación del porcentaje de homología. Dentro del marco de este MPV, la invención proporciona medios de diagnóstico y métodos y medios terapéuticos y métodos a emplear en el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedad, en particular enfermedades respiratorias, especialmente de mamíferos, más particularmente de seres humanos. Sin embargo, debido a la relación genética, aún cuando distante, del MPV esencialmente de mamífero con el ¾PV esencialmente de aves, en particular con APV-C, la invención ofrece también medios y métodos a emplear en el diagnóstico de tratamiento de enfermedad de las aves. En virología, es aconsejable que el diagnóstico y/o tratamiento de una infección viral específica sea efectuado con relativos que son más específicos para dichos virus específicos que causa dicha infección. En este caso esto significa que es preferible que dicho diagnóstico y/o tratamiento de una infección MPV sea efectuado con reactivos que son más específicos para MPV. Esto no significa sin embargo la exclusión de la posibilidad que reactivos menos específicos pero suficientemente reactivos sean utilizados como por ejemplo, puesto que son más fácilmente disponibles o son suficientes para la tarea en curso. Aquí se proporciona por ejemplo la realización de diagnóstico virológico y/o serológico de infecciones por MPV en mamíferos con reactivos derivados de APV, especialmente con reactivos derivados de APV-C, en la descripción detallada se dan ejemplos que muestran que un diagnóstico serológico suficientemente confiable de infecciones por MPV en mamíferos puede lograrse mediante la utilización de un ELISA específicamente diseñado para detectar anticuerpos para APV en aves . Una prueba particularmente útil para este propósito es una prueba ELISA diseñada para la detección de anticuerpos para APV (por ejemplo, en suero o yema de huevo), una versión comercialmente disponible de esta prueba se conoce como APV-Ab SVANOVIR ® fabricada por SVANOVA Biotech AB, üppsal Science Park Gluten SE-751 83 "üppsala Suecia. La situación inversa es también factible, por ejemplo se efectúa un diagnóstico virológico y/o serológico de infecciones por APV en mamíferos con reactivos derivados de MPV-C, en la descripción detallada se muestra por ejemplo que un diagnóstico serológico suficientemente confiable de infecciones APV en aves puede lograrse mediante la obtención de un ELISA diseñado para detectar anticuerpos para MPV. Considerando que antígenos y anticuerpos tienen la relación correspondiente, la detección de los varios antígenos puede lograrse mediante la selección del anticuerpo apropiado que tiene una reactividad cruzada suficiente. Evidentemente, basándose en dicha reactividad cruzada, es mejor seleccionar los reactivos (por ejemplo antigenos o anticuerpos) bajo la guia de las homologías de aminoácidos que existen entre las varias (glico) proteínas de los varios virus, por lo que reactivos que se relacionan con las proteínas más homologas serán más útiles para su utilización en pruebas que se basan en dicha reactividad cruzada. Para la detección de ácido nucleico, es todavía más directo, en lugar de diseñar cebadores o sondas basados en secuencias de ácido nucleico heterólogas de los varios virus y por consiguiente detectar diferencias entre los Metapneumoviruses, esencialmente mamífero o aves, es suficiente diseñar o seleccionar cebadores o sondas basados en los segmentos de secuencias de ácido nucleico específicas para virus que muestran la alta homología. En general, en el caso de secuencias de ácido nucleico, porcentaje de homología del 90% o más garantizan una reactividad cruzada suficiente para pruebas de diagnóstico utilizando condiciones estrictas de hibridación. La invención ofrece por ejemplo un método para el diagnóstico virológico de una infección con MPV de un animal, especialmente de mamífero, más particularmente de un ser humano, que comprende la determinación de una muestra de dicho animal de la presencia de un aislado viral o componentes del mismo mediante la reacción de dicha muestra con un ácido nucleico especifico para MPV o un anticuerpo de conformidad con la invención, y un método para el diagnóstico serológico de una infección por MPV de mamífero, que comprende la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un anticuerpo específicamente dirigido contra un MPV o componentes del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinácea específicamente para MPV y/o fragmento de la misma o un antígeno de conformidad con la presente invención. La invención proporciona también un kit de diagnóstico para diagnosticar una infección por MPV que comprende un MPV, un ácido nucleico específico para MPV, molécula proteinácea o fragmento de la misma, antígeno y/o anticuerpo de conformidad con la presente invención, y de preferencia un medio para detectar dicho MPV con, ácido nucleico específico para MPV, molécula proteinácea o fragmento de la misma, antígeno y/o un anticuerpo, dicho medio comprende por ejemplo un grupo excitable como por ejemplo fluoróforo o un sistema de detección de enzimático utilizado en la técnica (ejemplos formato de kit de diagnóstico adecuados comprenden IF, ELISA, ensayo de neutralización, ensayo RT-PCR) . Para determinar si un componente de virus todavía no identificado o análogo sintético del mismo como por ejemplo ácido nucleico, molécula proteinácea o fragmento de la misma puede ser identificado como especifico para MPV, es suficiente analizar la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de dicho componente como por ejemplo para un segmento de dicho ácido nucleico o aminoácido, de preferencia de por lo menos 10, con mayor preferencia de por lo menos 25, con preferencia aún mayor por lo menos 40 nucleótidos o aminoácidos (respectivamente) , por comparación de homología de secuencias con secuencias de MPV conocidas y con secuencias no-MPV conocidas, (utilizándose de preferencia APV-C) empleando, por ejemplo, análisis filogenéticos como se proporciona aquí. Según el grado de relación con dichas secuencias de MPV o no-MPV, el componente o análogo sintético puede ser identificado. La invención ofrece también un método para diagnosticar virológicamente una infección por MPV de un mamífero que comprende la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un aislado viral o componente del mismo por reacción de dicha muestra con un ácido nucleico de reacción cruzada derivado de APV (de preferencia serotipo C) o un anticuerpo que reacciona de manera cruzada con dicho APV y un método para diagnosticar serológicamente una infección por MPV de un mamífero, que comprende la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un anticuerpo que reacciona de manera cruzada también dirigido contra un APV o un componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinacea o fragmento de la misma o un antigeno derivado de APV. Además, la invención ofrece el uso de un kit de diagnóstico inicialmente diseñado para la detección de AVP o anticuerpo para AVP para diagnosticar una infección por MPV, en particular para detectar dicha infección por MPV en seres humanos. La invención ofrece también un método para diagnosticar virológicamente una infección con APV en un ave que comprende la determinación en una muestra de dicha ave de la presencia de un aislado viral o componente del mismo por reacción a dicha muestra con un ácido nucleico que reacciona de manera cruzada derivada de MPV o un anticuerpo que reacciona de manera cruzada reactivo con dicho MPV, y un método para diagnosticar serológicamente una infección con APV de un ave que comprende la determinación de una muestra de dicha ave de la presencia de un anticuerpo de reacción cruzada también dirigido contra un MPV o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinácea o fragmento de la misma o un antigeno derivado de MPV. Además, la invención proporciona el uso de un kit de diagnóstico inicialmente diseñado para la infección de MPV o anticuerpo para MPV para diagnosticar una infección por APV, especialmente para detectar dicha infección por APV en aves tales como pollos, patos o pavos. Como se mencionó, con tratamiento, se puede efectuar un uso similar de la reactividad cruzada encontrada, especialmente cuando las circunstancias hacen que el uso del enfoque más homólogo sea menos directo. Vacunas que no pueden esperar como por ejemplo vacunas de emergencia contra infecciones por MPV pueden efectuarse, por ejemplo, con preparaciones de vacunas derivadas de aislados APV (de preferencia tipo C) cuando una vacuna contra MPV más homologa no está disponible, y, a la inversa, vacunas contra infecciones APV pueden contemplarse con preparaciones de vacuna derivadas de MPV. Asimismo, técnicas genéticas reversas hacen posible generar constructos quiméricos de virus APV-MPV que son útiles como vacuna, siendo suficientemente diferentes de los aislados de campo de cada una de las cepas respectivas a atenuar a un nivel deseable. Técnicas genéticas reversas similares hacen también posible generar constructos de paramyxovirus-metapneumovirus quiméricos como por ejemplo constructos RSV-MPV o P13-MPV para su uso en la preparación de vacuna. Dichos constructos pueden ser especialmente útiles como una vacuna de combinación para combatir enfermedades del tracto respiratorio. La invención ofrece por consiguiente un agente etiológico novedoso, un virus de AR de una sola cadena de sentido negativo esencialmente mamífero aislado (se conoce aquí como MPV) que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae pero no identificable como un pneumovirus clásico, y que pertenece al género Metapneumovirus, y componentes específicos de MPV o análogos sintéticos del mismo. Virus de mamífero que se parecen a metapneumovirus, es decir, metapneumovirus que pueden ser aislados de mamíferos que funcionan esencialmente como huéspedes natural para dicho virus y causan enfermedades en dichos mamífero no han sido encontrados a la fecha. Los metapneumovirus, que se consideran en general como esencialmente restringidos a las aves como huésped natural o agente etiológico de enfermedad, son también conocidos como pneumovirus de las aves. Recientemente, un aislado de APV de pato fue descrito (FR 2 801 607), lo que demuestra • adicionalmente que infecciones con APV son esencialmente restringidas a aves como huéspedes naturales. La invención ofrece un pneumovirus de mamífero aislado (se conoce también aquí como MPV) que comprende un orden de genes y una secuencia de aminoácidos distintos de lo que se encuentra en el género Pneumovirus y estrechamente relacionado y considerando su relación filogenética pertenece probablemente al genero Metapneumovirus dentro de la subfamilia de Pneumovirinae de la familia Paramyxovirídae. Aún cuando hasta ahora los metapneumovirus solamente han sido aislados a partir de aves, se ha mostrado que virus relacionados pero materialmente distintos pueden ser identificados en otras especies animales tales como mamíferos . Aquí mostramos un aislamiento repetido de MPV a partir de seres humanos, mientras que no existen reportes de este tipo para APV. Además, a diferencia de APV, MPV esencialmente no se replica o bien se replica solamente poco en pollos y pavos mientras que se replica fácilmente en macacos cynomolgus. Ningún reporte se ha encontrado de la replicación de APV en mamíferos. Además, mientras que los antisueros específicos preparados contra MPV neutraliza MPV, los antisueros preparados con APV A, B o C no neutraliza MPV en la misma magnitud, y esta falta de reactividad cruzada proporciona otra prueba que MPV es un metapneumovirus diferente. Además, mientras APV y MPV comparten un orden de gen similar, y proteínas G y SH de MPV son en gran medida diferentes de las proteínas conocidas APV en la medida en que no presentan unas homologías de secuencias significativas tanto a nivel de aminoácido como a nivel de ácido nucleico. Ensayos y diagnóstico para discriminar entre aislado de APV y MPV o anticuerpos dirigidos contra estos virus diferentes pueden ser desarrollados de manera provechosa con base en una o ambas de estas proteínas (ejemplos son IF, ELISA, ensayo de neutralización, ensayo de RT-PCT) . Sin embargo, una información de secuencia y/o antigénica obtenida a partir de las proteínas N, P, M, F y L más relacionadas de MPV y análisis de homología de secuencia con las proteínas respectivas de APV pueden también utilizarse para discriminar entre APV y MPV. Por ejemplo, análisis fllogenéticos de información de secuencias obtenida a partir de MPV revelaron que APV y MPV son dos virus diferentes. En particular, los árboles fllogenéticos muestran que APV y MPV son dos linajes diferentes de virus. Hemos mostrado también que MPV está circulando en la población humana durante por lo menos 50 años, y por consiguiente una transmisión entre especies ha probablemente ocurrido por lo menos hace 50 años y no es un evento cotidiano. Puesto que CPE de MPV es virtualmente indistinguible de la provocada por hRSV o hPIV-1 en tM u otros cultivos de células, el MPV puede haber pasado desapercibido hasta ahora. tMK (células de riñon de mono terciarias, es decir, células tMK en un tercer pasaje en un cultivo celular) se utilizan de preferencia debido a sus costos más bajos en comparación con cultivos primarios o secundarios. El CPE, asi como algunos de los Paramyxoviridae clásicos, se caracterizan por una formación de sincitio después de lo cual las células muestran un trastorno interno rápido, seguido por desprendimiento de las células de la monocapa. Las células despegaron abitualmente (pero no siempre) CPE después de tres pasajes de virus a partir del material original, los días 10 a 14 después de la inoculación, un poco más tarde que la CPE causado por otros virus como por ejemplo hRSV o hPIV-1. Clásicamente, como agentes devastadores de enfermedad, los paramixovirus representan muchas muertes de animales y seres humanos a escala mundial cada año. Los Paramyxoviridae forman • una familia dentro del orden de los Monomegavxrales (virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo), que consisten de las subfamilias Paxamyxovírinae y Pneumovírínae. Taxonómicamente hablando, esta segunda subfamilia está dividida en los géneros Pneumovírus y Metapneumovirus (Pringle, C. R. Virus taxonomy at the Xith international congress of virology [Taxonomia viral en el décimo congreso internacional de virología] Sydney, Australia 1999. Aren. Virol. 144/2, 2065-2070 (1999)). El virus sincitial respiratorio humano (hRSV) , la especie tipo del género Pneumovirus, es la causa individual más importante de infecciones del tracto respiratorio inferior durante la infancia y niñez a escala mundial (Domachowske, J.B. & Rosenberg, H.F. Respiratory syncytial virus infection: immune response, immunopathogénesis, and treatment [Infección por virus sincitial respiratorio: respuesta inmune, inmunopatogénesis, y tratamiento] . Clin. Microbio. Rev. 12(2), 298-309 (1999). Reseña). Otros miembros del género Pneumovirus incluyen los virus sincitiales respiratorios bovinos y ovinos y el virus de neumonía de ratón (PVM) . Un pneumovirus de aves (APV) también conocido como virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) , el agente etiológico de la rinotraqueitis de las aves, una infección del tracto respiratorio superior de los pavos (Giraud, P., Bermejean, G. Guittet, M. & Toquin, D. Turkey rhinotracheitis in France: preliminary investigations on a ciliostatic virus [Rinotraqueitis de pavo en Francia: Investigaciones preliminares sobre un virus ciliostático] . Vet. Rec. 119, 606-607 (1986) ) , es el único miembro del género Metapneumovirus, recientemente asignado que, como dijimos, no estaba asociado hasta recientemente con infecciones, o bien además, con enfermedades de mamíferos. Subgrupos serológicos de APV pueden ser diferenciadas con base en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la glicoprotexna G y pruebas de neutralización utilizando anticuerpos monoclónales que reconocen también la glicoprotexna G. Dentro de subgrupos, la proteína A, B y D de G muestra una identidad de secuencia de aminoácidos de 98.5 a 99.7% dentro subgrupos mientras que entre los subgrupos se observa solamente una identidad de de aminoácidos de 21.3- 38%. Véase, por ejemplo, Collins, M.S., Gough, R.E. Y Alexander, D. J., Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates Using polyclonal antisera and mouse monoclonal antihodies [Diferenciación antigénica de aislado de pneumovirus de aves utilizando antisueros policlonales y anticuerpos monoclonales para ratón] . Avian Pathology, 1993. 22: p. 469-479; Cook, J.K.A., Jones B.V., Ellis, M.M., Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies [Diferenciación. antigénica de cepas de virus de rinotraqueitis de pavo utilizando anticuerpos monoclonales] . Avian Pathology, 1993, 22: p. 257-273; Bayon-Auboyer, M.H. y colaboradores, Nucleotide sequences of the F, L, and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup [Secuencias de nucleótidos de los genes de proteina F, L y G de dos pneumovirus no-A/no-B de las aves (APV) revelan un subgrupo de APV novedoso] . J. Gen Virol, 2000. 81(Pt 11): p. 2723-33; Seal, B.S., Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demónstrate that the first US avian pneumovirus isolate is distinct from European strains [Nucleótido de gen de proteina de matriz y secuencia predicha de aminoácidos demuestran que el primer aislado de pneumovirus de las aves US es distinto de las cepas Europeas] Virus Res, 1998, 58 (1-2) : p. 45-52; Bayon-Auboyer, M.H. y colaboradores Comparison of ?-, G- and N-based RT-PCR protocola wíth conventíonal virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus [Comparación de protocolos de RT-PCR basados en F, G y N con procedimientos virológicos convencionales para la detección y el tipificado de virus de rinotraqueitis de pavo]. Aren Virol, 1999. 144 (&) : p. 1091-109; Juhasz, . y A.J. Easton, Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups [Variación extensa de secuencias en el gen de proteina de (G) de pneumovirus de las aves: evidencia de dos subgrupos distintos]. J Gen Virol, 1994. 75 (Pt 11): p. 2873-80. Un serotipo adicional de APV es proporcionado en el documento O 00/20600, que describe el aislado de Colorado de APV y se compara con cepas de APV o TRT conocidas con pruebas de neutralización de suero in vitro. Primero, »el aislado Colorado fue probado contra antisueros policlonales monoespecificos para reconocer aislados TRT. El aislado Colorado no fue neutralizado por antisueros monoespecificos para cualquiera de las cepas de TRT. Sin embargo fue neutralizado por un antisuero hiper-inmune preparado contra una cepa de subgrupo A. Este antisuero neutralizó el virus homólogo en un titulo de 1:400 y el aislado Colorado en un titulo de 1:80. Utilizando el método antes mencionado, el aislado Colorado fue después probado contra anticuerpos monoclonales de TRT. En cada caso, el titulo de neutralización reciproca fue inferior a 10. Un antisuero monoespecifico preparado para el aislado de colorado fue también probado contra las cepas de TRT de ambos subgrupos. Ninguna de las cepas de TRT probadas fue neutralizada por el antisuero para el aislado Colorado. La cepa Colorado de APV no protege los polluelos SPF contra reto con cepa de subgrupo A o cepa de subgrupo B de virus TRT. Estos resultados sugieren que el aislado Colorado puede ser el primer ejemplo de un serotipo adicional de pneumovirus de aves, como se sugiere también en Bayon-Auboyer y colaboradores (J. Gen. Vir. 81:2723-2733 (2000). En una modalidad preferida, la invención proporciona un MPV aislado que corresponde taxonómicamente a un metapneumovirus (de mamífero hasta la fecha desconocido) que comprende un orden de genes distinto del orden de los pneumovirus dentro de la subfamilia Pneumovirínae y la familia Paramyxoviridae. La clasificación de los dos géneros se basa primariamente en su constelación de genes; los metapneumovirus generalmente no presentan proteínas estructurales tales como NS1 o NS2 (véase también Randhawa y colaboradores, J. Vir. 71:9849-9854 (1997) y el orden de genes es diferente del orden de pneumovirus (RSV: ' 3-NSl-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5r , APV: ' 3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5') (Ling, R., Easton, A. J. & Pringle, C. R. Sequence analysis of the 22K, SH and G genes of turkey rhinotracheitis virus and their intergenic regions reveáis a gene order different from that of other pneumoviruses [Análisis de secuencia de los genes 22K, SH y G de virus de rinotraqueitis de pavo y sus regiones intergénicas revela un orden de genes diferente del orden de otros neumovirus] . J. Gen. Virol. 73, 1709-1715 (1992), Yu, Q. , Davis, P.J., Li, J. & Cavanagh, D. Cloning and sequencing of the matrix protein (M) gene of turkey rhinotracheitis virus reveal a gene order different from that of respiratory syncytial virus [Clonación y secuenciamiento de gen de proteína de matriz (M) de virus de rinotraqueitis de pavo revela un orden de gen diferente del orden de gen de virus sincitial respiratorio] . Virology 186, 426-434 (1992), Randha a, J.S., Marriott, A.C., Pringle, C.R. & Easton, A.J. Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus [Rescate de minireplicones sintéticos establece la ausencia de genes NS1 y NS2 a partir de pneumovirus de aves] . J. Virol. 71, 9849-9854 (1997)). MPV de conformidad con lo proporcionado por la invención o un aislado de virus que corresponde taxonómicamente es revelado a través de un análisis de EM por partículas de tipo paramixovirus . De manera consistente con la clasificación, el aislado de MPV o virus que corresponde filogenéticamente o que corresponde taxonómicamente son sensibles a tratamiento con cloroformo; se cultivan óptimamente en células tMK o células funcionalmente equivalentes y son esencialmente dependiente de la tripsina en la mayoría de los cultivos celulares . Además, el CPE típico y la falta de actividad hemaglutinante con células sanguíneas rojas más clásicamente utilizadas sugieren que un virus de conformidad con lo indicado aquí se encuentra relacionado con pneumovirus clásicos, como por ejemplo RSV, aún cuando de manera distante. Si bien la mayoría de los paramixovirus tienen una actividad hemaglutinante, la mayoría de los pneumovirus no presentan dicha actividad (Pringle, C.R. En: The Paramyxoviruses . Ia ed. (ed. D.W. ingsbury) 1-39 (Plenum Press, Nueva York, 1991) ) . Un MPV de conformidad con la presente invención contiene también un segundo ORF de empalme (M2-2) en el fragmento de ácido nucleico que codifica la proteína M3, como es en general una mayoría de los demás pneumovirus como por ejemplo se demostró en Ahmadian y colaboradores, J. Gen. Vir. 80:2011-2016 (1999). Para encontrar aislados virales adicionales de conformidad con lo proporcionado por la invención, es suficiente probar una muestra, opcionalmente obtenida a partir de un animal enfermo o un ser humano enfermo, para determinar la presencia de un virus de la subfamilia Pneumovirinae, y una prueba de un virus obtenido de esta forma para la presencia de genes que codifican NS1 o NS2 (funcionales) o demuestran esencialmente un orden de genes que es diferente del orden de los pneumovirus tales como RSV según lo comentado arriba. Además, un aislado de virus que corresponde filogenéticamente y que corresponde taxonómicamente a MPV puede encontrarse por experimentos de hibridación cruzada empleando ácido nucleico a partir de un aislado de MPV proporcionado aquí, o bien en experimentos de serología cruzada clásica utilizando anticuerpos monoclonales específicamente dirigidos contra y/o antígenos y/o inmunógenos específicamente derivados de un aislado MPV.
Virus recién aislados corresponden filogenétreamente y por consiguiente corresponden taxonómicamente a MPV cuando comprenden un orden de genes y/o secuencia de aminoácidos suficientemente similares a nuestro (s) aislado (s) de MPV prototipico (s) o bien corresponden estructuralmente con los mismos, y muestran una relación estrecha con el genero Metapneumovirus dentro de la subfamilia Pneumovdrinae. La homologia de secuencias amino más altas y la definición de la correspondencia estructural a nivel de proteínas individuales entre MPV y cualquiera de los demás virus conocidos de la misma familia hasta la fecha (APV subtipo c) es para matriz del 87%, para nucleoproteína del 88%, para fosfoproteína del 68%, para proteína de fusión del 81% y para partes de la proteína de polimerasa de 56 a 64%, según se puede deducir cuando se comparan las secuencias dadas en la Figura 6 con secuencias de otros virus, en particular de AVP-C. Proteínas individuales o aislados de virus enteros respectivamente con una homología más alta que los valores máximos mencionados se consideran filogenéticamente correspondientes y por consiguiente taxonómicamente correspondientes a MPV, y comprenden una secuencia de ácido nucleico que corresponde estructuralmente a una secuencia como se muestra en la Figura 6. De esta forma la invención proporciona un virus que corresponde filogenéticamente al virus depositado. Se observará que, de manera similar a otros virus, se encuentra un cierto grado de variación entre aislados de virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero aislados diferentes según lo proporcionado aquí. En árboles filogenéticos, hemos identificado por lo menos 2 grupos genéticos de aislados de virus con base en análisis comparativos de secuencias de partes de los genes L, M, N y F. Con base en diferencias de nucleótidos y aminoácidos en las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos virales (las secuencias virales) , y de manera análoga a otros pneumovirus tales como RSV, estos genotipos de MPV representan subtipos de MPV. Dentro de cada uno de los grupos genéticos de aislado de MPV, la identidad porcentual a nivel de nucleótidos se encontraba dentro de un rango de 94 a 100 en el' caso de L, de 912 a 100 en el caso de M, de 90 a 100 para N y de 93 a 100 para F y a nivel de aminoácidos, el porcentaje de identidad fue encontrado como ubicándose dentro de un rango de 91 a 100 en el caso de L, de 98 a 100 en el caso de M, de 96 a 100 en el caso de N y de 98 a 100 en el caso de F. Una comparación adicional puede encontrarse en las figuras 18 a 28. La identidad porcentual mínima a nivel de nucleótidos para todo el grupo de virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero aislado de conformidad con lo proporcionado aquí (aislados de MPV) identificados hasta la fecha fue de 81 en el caso de L y M, 83 en el caso de N y 82 en el caso de F. A nivel de aminoácidos, este porcentaje fue de 91 para L y N, 94 para M, y 95 para F. La secuencia viral de un aislado de MPV o un gen MPV F aislado como se proporciona aquí, por ejemplo muestra menos que 81% de identidad de secuencia de nucleótidos o menos que 82% de identidad de secuencias de aminoácidos con la secuencia respectiva de nucleótidos o aminoácidos de un gen de fusión (F) de APV-C como se proporciona por ejemplo en Seal y colaboradores, Vir. Res. 66:139147 (2000). Asimismo, la secuencia viral de un aislado de MPV o de un gen de MPV L aislado como se proporciona aquí, muestra por ejemplo menos que 61% de identidad de secuencias de nucleótidos o menos que 63% de identidad de secuencias de aminoácidos con la secuencia de nucleótido o aminoácidos respectiva de un gen de APV-A polimerasa como se proporciona por ejemplo en Randhawa y colaboradores, J. Gen. Vir. 77:3047-3051 (1996). La divergencia de secuencias de cepas de MPV en el mundo podría ser relativamente mayor, de manera análoga a otros virus. Por consiguiente, dos grupos genéticos potenciales son identificados por análisis de secuencias de nucleótidos parciales en los ORFs de N, M, F y L de 9 aislados de virus . Se observó una identidad de nucleótidos de 90-100% dentro de un grupo, y una identidad de 81-88% se observó entre los grupos. Una información de secuencia obtenida en más aislados de virus confirmó la existencia de dos genotipos. El aislado de virus ned/00/01 como prototipo de grupo A, y el aislado de virus ned/99/01 como prototipo de grupo B han sido utilizados en ensayos de neutralización cruzada para probar si los genotipos están relacionados con serotipos diferentes o subgrupos diferentes. A partir de estos datos llegamos a la conclusión que los aislados de virus esencialmente de mamífero que presentan una homología de aminoácidos porcentual mayor que 64 en el caso de L, 87 en el caso M, 88 en el caso de N, 68 en el caso de P, 81 en el caso de F, 84 en el caso de M2-1 o bien 58 en el caso de M2-2 con relación a un aislado 1-2614 pueden clasificarse como virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero aislado de conformidad con lo proporcionado aquí . En particular, los aislados de virus en general que tienen una identidad porcentual mínima a nivel de secuencia de nucleótidos con un aislado de MPV prototipo según lo proporcionado aquí de 81 para L'y M, 83 para N y/u 82 para F son miembros del grupo de aislado de MPV de conformidad con lo proporcionado aquí. A nivel de aminoácido, estos porcentajes son 91 en el caso de L y N, 94 en el caso de M, y/o 95 en el caso de F. Cuando la homología de secuencias de aminoácido porcentual para un aislado de virus dado es mayor que 90 en el caso de L y N, 93 en el caso de M, o 94 en el caso de F, el aislado de virus es similar al grupo de aislados de MPV presentado en la figura 5. Cuando la homología porcentual de secuencia de aminoácido para un aislado de virus dado es mayor que 94 para L, 95 para N o 97 para M y F, el aislado de virus puede ser identificado como perteneciente a uno de los grupos de genotipo representados en la figura 5. Se observará que estos porcentajes de homología a través de los cuales se definen grupos genéticos son similares al grado de homología encontrado entre grupos genéticos en los genes correspondientes de RSV. En resumen, la invención ofrece un virus de ??? de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero aislado (MPV) que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxovixidae e identificable como filogenéticamente correspondientes al género Metapneumovirus mediante la determinación de una secuencia de ácidos nucleicos de un fragmento adecuado del genoma de dicho virus y probándola en análisis de árboles filogenéticos en donde los árboles de máxima probabilidad son generados empleando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) y encontrando que corresponden filogenéticamente de manera más estrecha a un aislado de virus depositado con I-2614 ante CNCM, Paris que su correspondencia con un aislado de virus de pneumovirus de las aves (APV) también conocido como virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) , el agente etiológico de la rinotraqueitis de las aves. Los fragmentos en genoma de ácido nucleico adecuados útiles para tales análisis de árboles filogenéticos son por ejemplo cualquier fragmento RAP-PCR 1 a 10 según lo divulgado aqui en la descripción detallada, lo que lleva a los varios análisis de árboles filogenéticos según lo divulgado aqui en las figuras 4 ó 5. Análisis de árboles filogenéticos de los genes de nucleoproteina (N) , fosfoproteina (P) , proteina de matriz (M) y proteina de fusión (F) de MPV revelaron el mayor grado de homología de secuencias con el serotipo C de APV, el pneumovirus de las aves encontrado primariamente en aves en los Estados Unidos de América. En una modalidad preferida, la invención ofrece un virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero aislado (MPV) que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae e identificable como filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus mediante la determinación de la secuencia de ácido nucleico de un fragmento adecuado del genoma de dicho virus y probándolo en análisis de árboles filogenéticos en donde árboles de máxima probabilidad son generados utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) y encontrando que corresponde de manera filogenéticamente más cercana a un aislado de virus depositado como 1-2614 para CNCM, Paris que su correspondencia con un aislado de virus de pneumovirus de las aves (APV) conocida también como virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) , en agente etiológico de la rinotraqueitis de las aves, en donde dicho fragmento adecuado comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteina viral de dicho virus . Un marco de lectura abierto (ORF) adecuado comprende en ORF codifica la proteina N. Cuando una identidad global de aminoácidos de por lo menos 91%, de preferencia de por lo menos 95% de la proteina de N analizada con la proteina de N de aislado 1-2614 se encuentra, el aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la invención. Como se muestra, el primer gen en el mapa genómico de MPV codifica para una proteina de 394 aminoácidos (aa) y muestra una homología extensa con la proteina N de otros pneumovirus . La longitud del ORF de N idéntica a la longitud de ORF de N de APV-C (Tabla 5) y es menor que la longitud de otros paramixovirus (Barr y colaboradores, 1991) . El análisis de la secuencia de aminoácidos reveló la mayor homología con APV-C (88%) y solamente de 7 a 11% con otros paramixovirus (Tabla 6) . Barr y colaboradores (1991) identificaron 3 regiones de similaridad entre virus que pertenecen al orden Mono egavirales: A, B y C (Figura 8) . Aún cuando las similaridades son mayores dentro de una familia de virus, estas regiones son altamente conservadas entre familias de virus. En todas estas tres regiones MPV presentó una identidad de secuencia de aminoácidos de 97% con APV-C, 89% con APV-B, 92 con APV-A, y 66-73% con RSV y PVM. La región entre los residuos de aminoácidos 160 y 340 parece ser altamente conservada entre los metapneumovirus y en magnitud relativamente menor los Pneumovirinae (Miyahara y colaboradores, 1992; Li y colaboradores, 1996; Barr y colaboradores, 1991) . Esto corresponde al hecho que MPV es un metapneumovirus, esta región particular mostrando una similaridad del 99% con APV C. Otro marco de lectura abierto adecuado (ORF) es útil en análisis filogenéticos comprende el ORF que codifica la proteina P. Cuando una identidad de aminoácidos global de por lo menos 70%, de preferencia de por lo menos el 85% de la proteina P analizada con la proteina P de aislado 1-2614 se encuentra, el aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la invención. El segundo ORF en el mapa de genoma codifica para una proteina de 294 aminoácidos que comparte una homología de secuencia de aminoácidos del 68% con la proteína P de APV-C, y solamente de 22-26% con la proteína P de RSV (Tabla 6) . El gen P de MPV contiene un ORF sustancial y en este aspecto es similar a P en comparación con otros paramixovirus (Reseñado en Lamb y Kolako sky, 1996; Sedlmeier y colaboradores, 1998) . En contraste con APV A y B y PVM y de manera similar a RSV y A, el ORF de P de MPV no presenta residuos de cisterna. Ling (1995) sugirió que una región de alta similaridad entre todos los pneumovirus (aminoácidos 185-241) desempeña una función ya sea en el proceso de síntesis de AR o bien en el mantenimiento de la integridad estructural del complejo de nucleocápside. Esta región de alta similaridad se encuentra también en MPV (Figura 9) específicamente cuando sustituciones conservadoras son tomadas en cuenta, mostrando una similaridad del 100% con APV-C, 93% con APV-A y B, y aproximadamente 81% con RSV. La terminal C de la proteina P de MPV es rica en residuos glutamato y ha sido descrito para APVs (Ling y colaboradores 1995) . Otro marco de lectura abierto adecuado (ORF) útil en análisis filogenéticos comprende el ORF que codifica la proteina M. Cuando una identidad de aminoácido global de por lo menos 94%, de preferencia de por lo menos 97% de la proteina M analizada con la proteina M de aislado 1-2614 se encuentra, el aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la invención. El tercer ORF del genoma de MPV codifica una proteina de 254 aminoácidos que se parece a los ORFs de M de otros pneumovirus. El ORF de M de MPV tiene exactamente el mismo tamaño que los ORFs de M de otros metapneumovirus (Tabla 5) y muestra una alta homología de secuencia de aminoácidos con las proteínas de matriz de APV (76-87%), una homología menor con las RSV y PMV (37-39} 8%) y una homología de 10% o menos con las de otros paramixovirus (Tabla 6) . Easton (1997) comparó las secuencias de proteínas de matriz de todos los pneumovirus y encontró un hexapéptido conservado en el residuo 14 a 19 que es también conservado en MPV (Figura 10) . En el caso de RSV, PVM y APV, pequeños ORFs secundarios dentro y empalmándose con el ORF mayor de M han sido identificados (52 aminoácidos y 51 aminoácidos en bRSV, 75 aminoácidos en RSV, 46 aminoácidos en PVM y 51 aminoácidos en APV) (Yu y colaboradores, 1992; Easton y colaboradores 1997; Samal y colaboradores 1991; Satake y colaboradores, 1984) . Observamos dos pequeñas ORFs en el ORF de M de MPV. Un pequeño ORF de 54 residuos de aminoácidos fue encontrado dentro del ORF de M mayor, empezando en el nucleótido 2281 y un ORF pequeño de 33 residuos de aminoácidos fue encontrado empalmándose con el ORF mayor de M empezando en el nucleótido 2893 (datos no mostrados) . De manea similar a los ORFs secundarios de RSV y APV, no hubo ninguna homología significativa entre estos ORFs secundarios y ORFs secundarios de los demás pneumovirus, y faltan señales aparentes de inicio o terminación. Además, no se ha reportado evidencia de la síntesis de proteínas que corresponden a estos ORFs secundarios de APV y RSV. Otro marco de lectura abierto adecuado (ORF) útil en análisis filogenéticos comprende el ORF que codifica la proteína F. Cuando se encuentra una identidad de aminoácidos global de por lo menos 95%, de preferencia de por lo menos 97% de la proteína F analizada con la proteína F del aislado 1-2614, es aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la invención. El ORF de F de MPV se localiza adyacente al ORF de M, lo que es característico para miembros del genero Metapneumovirus. El gen F de MPV codifica una proteína de 539 aminoácidos, que tiene dos residuos de aminoácidos más que F de APV-C (Tabla 5) . El análisis de la secuencia de aminoácidos reveló una homología del 81% con APV-C, 67% con APV-A y B, 33-39% con las proteínas F de pneumovirus y solamente 10-18% con otros paramixovirus (Tabla 6) . Una de las características conservadas entre proteínas F de paramixovirus, y que se observa también en MPV es la distribución de residuos de cisterna (Morrison, 1988; Yu y colaboradores, 1991) . Los metapneumovirus comparten 12 residuos de cisterna en Fl (7 se conservan entre todos los paramixovirus) , y dos en F2 (1 se conserva entre todos los paramixovirus) . De los 3 sitios de glicosilación enlazados a N potenciales presentes en el ORF de F de MPV, ninguno es compartido con RSV y dos (posición 66 y 389) están compartidos con APV. El tercer sitio de glicosilación enlazado a N potencial único para MPV se localiza en la posición 206 (Figura 11) . A pesar de la baja homología de secuencias con otros paramixovirus, la proteína F de MPV reveló una características de proteínas de fusión típicas consistentes con las escritas en el caso de las proteínas de F de otros miembros de familia de Paramyxoviridae (Morrison, 1988) . Proteínas F de miembros de Paramyxoviridae son sintetizadas como precursores inactivas (FO) que son disociados por proteasa de células huéspedes que generan las subunidades F2 de terminal amino y grandes subunidades Fl de terminal carboxi. El sitio de disociación propuesto (Collins y colaboradores, 1996) es conservada entre todos los miembros de la familia de Paramyxoviridae. El sitio de disociación de MPV contiene los residuos RQSR. Ambos residuos de arginina ® están compartidos con APV y RSV, pero los residuos de glutamina (Q) y serina (S) son compartidos con otros paramixovirus tales como el virus de parainfluenza humana de tipo 1, el virus de tipo Sendai, y los morbillivirus (datos no ilustrados) . La región hidrofóbica en el extremo amino de Fl funciona, según se considera, como el dominio de fusión de membrana y muestra una alta similaridad de secuencias entre paramixovirus y morbillivirus y en menor medida los pneumovirus (Morrison, 1988) . Estos 26 residuos (posición 137-163, Figura 11) son conservados entre MPV y APV-C, lo que corresponde con el hecho que esta región es altamente conservada entre los metapneumovirus (Naylor y colaboradores, 1998; Seal y colaboradores, 2000) . Como se puede observar en el caso de las sub-unidades F2 de APV y otros paramixovirus, MPV mostró una deleción de 22 residuos de aminoácidos en comparación con RSV (posición 107-128, Figura 11) . Además, para RSV y APV, el péptido de señal y el dominio de ancla fueron conservados dentro de sub-tipos y presentaron una alta variación entre los sub-tipos (Plows y colaboradores, 1995; Naylor y colaboradores, 1998) . El péptido de señal de MPV (aminoácidos 10-35, Figura 11) en el extremo amino de F2 presenta cierta similaridad de secuencia con APV-C (18 de 26 residuos de aminoácidos son similares) y menos conservación con otros APVs o RSV. Se observa mucho más variación .en el dominio de ancla de membrana en la terminal carboxi de Fl, aún cuando cierta homología sigue viéndose con APV-C . Otro marco de lectura abierto (ORF) útil para análisis filogenéticos comprende el marco de lectura abierto que codifica la proteína M2. Cuando se encuentra una identidad de aminoácidos global de por lo menos el 85%, de preferencia por lo menos el 90% de la proteína M2 analizada con la proteína M2 del aislado 1-2614, el aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la presente invención. El gen de M2 es único para los Pnevmovirinae y dos ORFs que se empalman han sido observados en todos los pneumovirus . El primer marco de lectura abierto principal representa la proteína M2-1 que incrementa la capacidad de procesamiento de la polimerasa viral (Collins y colaboradores, 1995; Collins, 1996) y su ultralectura de regiones intergénicas (Hardy y colaboradores, 1998; Fearns y colaboradores, 1999) . El gen de M2-1 para MPV, localizado adyacente al gen F, codifica una proteina de 187 aminoácidos (Tabla 5) , y presenta la mayor homología (84%) con M2-1 de APV-C (Tabla 6) . La comparación de todas las proteínas M2-1 de pneumovirus reveló la alta conservación de la mitad de terminal amino de proteina (Collins, y colaboradores, 1990; Zamora y colaboradores, 1992; Ahmadian y colaboradores, 1999) , lo que corresponde a la observación en el sentido que MPV presenta una similaridad del 100% con APV-C en los primeros 80 residuos de aminoácidos de la proteína (Figura 12A) . La proteína M2-1 de MPV contiene tres residuos de cisteína localizados dentro de los primeros 30 residuos de aminoácidos conservados entre todos los pneumovirus, dicha concentración de cisteínas se encuentra frecuentemente en proteínas de enlace con zinc (Ahmadian y colaboradores, 1991; Cuesta y colaboradores, 2000) . Los marcos de lectura abiertos secundarios (M2-2) que se empalman con los marcos de lectura abiertos de M2-1 de pneumovirus están conservados en cuanto a ubicación pero no en secuencia y se cree que participan en el control del conmutador entre replicación de ARN viral y transcripción (Collins y colaboradores, 1985; Elango y colaboradores, 1985; Baybutt y colaboradores, 1987; Collins y colaboradores, 1990; Ling y colaboradores, 1992; Zamora y colaboradores, 1992; Alansari y colaboradores, 1994; Almadian y colaboradores, 1999; Bermingham y colaboradores, 1999) . En el caso de MPV, el ORF de M2-2 empieza en el nucleótido 512 en el ORF de M2-1 (Figura 7), lo que es exactamente la misma posición inicial que en el caso de APV-C. La longitud de los ORFs de M2-2 son iguales APV-C y MPV, 71 residuos de aminoácidos (Tabla 5) . Una comparación de secuencias de ORF de M2-2 (Figura 12B) , reveló una homología de secuencia de aminoácidos de 56% entre MPV y APV-C y una homología de secuencias de aminoácidos de solamente 26-27% entre MPV y APV-A y B (Tabla 6) . Otro marco de lectura abierto adecuado (ORF) útil en análisis filogenéticos comprende el marco de lectura abierto que codifica la proteína L. Cuando se encuentra una identidad de aminoácidos global de por lo menos el 91%, de preferencia por lo menos el 95% de la protexna L analizada con la proteína L de aislado de 1-2614, el aislado de virus analizado comprende una aislado de MPV preferido de conformidad con la invención. De manera análoga a los demás virus de cadena negativa, el último marco de lectura abierto del gs oma de MPV es el componente de ARN polimerasa dependiente de ARN de los complejos de replicación y transcripción. El gen L de MPV codifica una proteína de 2005 aminoácidos que es 1 residuo más larga que la proteína de APV-A (Tabla 5) . La proteína L de MPV comparte una homología del 64% con APV-A, una homología de 42-44% con RSV, y una homología de aproximadamente 13% con otros paramixovirus (Tabla 6) . Poch y colaboradores (1989; 1990) identificaron seis dominios conservados dentro de las proteínas L de virus de AR de cadena negativa no segmentados aparte de los cuales el dominio II contenia los cuatro motivos de polimerasa centrales que se consideran esenciales para la función polimerasa. Estos motivos (A, B, C y D) son bien conservados en la proteina L de MPV; en los motivos A, B y C: MPV comparte una similaridad del 100% con todos los pneumovirus y en cuando al motivo D, MPV comparte una similaridad del 100% con APV y una similaridad del 92% con RSV's. En el caso del dominio III entero (aminoácidos 625-8 7 en el ORF de L) ¡ MPV comparte una identidad del 83% con APV, una identidad del 67-68% con RSV y una identidad del 26-30% con otros paramixovirus (Figura 15) . Además de los motivos de polimerasa, las proteínas L de pneumovirus contienen una secuencia que se adecúa a un motivo de enlace de ATP de consenso K (X) 21GEGAGN (X) 20K (Stec, 199). El ORF de L de MPV contiene un motivo similar a APV, en el cual el espaciado de los residuos intermedios es desplazado por uno: K (x) 22GEGAGN (X) ig . Un marco de lectura abierto adecuado preferido (ORF) útil en los análisis filogenéticos comprende el marco de lectura abierto que codifica la proteina SH. Cuando se encuentra una identidad global de aminoácidos de por lo menos el 30%, de preferencia por lo menos el 50%, de preferencia por lo menos el 75% de la proteina de SH analizada con la proteina SH aislada 1-2614, el aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la presente invención. El gen se localiza adyacente a M2 de MPV codifica una proteina de 183 aminoácidos (Figura 7) . El análisis de la secuencia de nucleótido y su secuencia de aminoácidos deducida no reveló una homología discernible con otros genes de virus de ARN o productos génicos. El ORF de SH de MPV es el ORF de SH más largo conocido a la fecha (Tabla 5) . La composición de los residuos de aminoácidos del ORF del SH es relativamente similar a la composición de los residuos de aminoácidos de APV, RSV y PVM, con un alto porcentaje de treonina y serina (22%, 18%, 19%, 20.0%, 21% y 28% de contenido de serina/treonina para MPV, APV, RSV A, RSV B, bRSV y PVM, respectivamente) . El ORF de SH de MPV contiene 10 residuos de cisteina, mientras que el ORF de SH de APV contiene 16 residuos de cisterna. Todos los pneumovirus tienen números similares de sitios de N-glicosilación potenciales (MPV 2, APV 1, RSV 2, bRSV 3, PVM 4) . Los perfiles de hidrofobicidad para la proteina SH de MPV y SH de APV y RSV revelaron características estructurales similares (Figura 13B) . Los ORFs de SH de APV y MPV tienen un extremo N hidrofilico (aminoácidos 1-30), un dominio hidrofóbico central (aminoácidos 30-53) que puede servir como un dominio potencial que abarca la membrana, un segundo dominio hidrofóbico alrededor del residuo 160 y un extremo C hidrofilico. En contraste, SH de RSV parece no tener la mitad de terminal C de los ORFs de AFV y MPV. En todas las proteínas SH de pneumovirus, el dominio hidrofóbico se encuentra flanqueado por aminoácidos básicos que se encuentran también en el ORF de SH para MPV (aminoácidos 29 y 54) . Otros marco de lectura abierto (ORF) adecuado preferido útil en los análisis filogenéticos comprende el ORF que codifica la proteína G. Cuando se encuentra una identidad global de aminoácidos de por lo menos el 30% de preferencia por lo menos el 50%, con mayor preferencia por lo menos el 75% de la proteína G analizada con la proteína G de aislado de 1-2614, el aislado de virus analizado comprende un aislado de MPV preferido de conformidad con la presente invención. El ORF de G de MPV se localiza adyacente al gen SH y codifica una proteína de 236 aminoácidos. Un ORF pequeño secundario se encuentra inmediatamente después de este ORF, codificando potencialmente residuos de 68 aminoácidos (pos. 6973-7179), pero no tiene un codón inicial. Un tercer ORF mayor, en un marco de lectura diferente, de 194 residuos de aminoácidos (fragmento 4, Figura 7) , está empalmando ambos ORFs, pero tampoco tiene un codón de inicio (nucleótidos 6416-7000) . Este ORF mayor es seguido por un cuarto ORF en el mismo marco de lectura (nt 7001-7198), codificando posiblemente para 65 residuos de aminoácidos pero tampoco tiene un codón de inicio. Finalmente, un ORF potencial de 97 residuos de aminoácidos (pero sin codón de inicio) se encuentra en el tercer marco de lectura (nt 6444-6737, Figura 1) · A diferencia del primer ORF, los demás ORF no tienen unas secuencias aparentes de inicio de gen o terminación de gen (véase abajo) . Aún cuando el ORF de G de 236 residuos de aminoácidos presenta probablemente por lo menos parte de la proteina de fijación de MPV, no puede excluirse que las secuencias codificadoras adicionales sean expresadas como proteínas separadas o bien como parte de la proteína de fijación a través de algún evento de edición de ARN. Se observará que para APV y RSV, ningún ORFs secundario después del ORF de G primario ha sido identificado pero que tanto APV como RSV tienen ORFs secundarios dentro del ORF mayor de G. Sin embargo, la evidencia de la expresión de estos ORFs falta y no existe homología entre las secuencias de aminoácidos predichas para virus diferentes (Ling y colaboradores, 1992) . Los ORFs secundarios en G de MPV no revelan características de otras proteínas G y para determinar si los ORFs adicionales son expresados se requiere de investigación adicional- Análisis BLAST con los cuatro ORFs no revelaron una homología discernible a nivel de secuencias de nucleótidos o aminoácidos con otros genes de virus conocidos o productos génicos. Esto corresponde con las bajas homologías de secuencia encontradas para otras proteínas G tales como hRSV A y B (53%) (Johnson y colaboradores, 1987) y A y B de APV (38%) (Juhasz y colaboradores, 1994) . Mientras que la mayoría de los ORFs de MPV se parecen a los de APV tanto en longitud como en secuencia, el ORF de G de MPV es considerablemente más corto que el ORF de G de APV (Tabla 5) . La secuencia de aminoácidos reveló un contenido de serina y treonina del 34%, lo que es hasta mayor que el 32% para RSV y el 24% para APV. El ORF de G contiene también 8.5% de residuos de prolina, lo que es mayor que el 8% en el caso de RSV y el 7% en el caso de APV. La abundancia no habitual de residuos de prolina en las proteínas G de APV, RSV y MPV se observó también en glicoproteínas de origen mucinoso que es un determinante mayor de las proteínas de estructura tridimensional (Collins y colaboradores, 1983; Wertz y colaboradores, 1985; Jentoft, 1990) . El número de sitios de glicosilación N-enlazados potenciales en G de MPV es similar a los demás pneumovirus: MPV tiene 5, mientras que hRSV tiene 7, bRSV tiene 5 y APV tiene de 3 a 5. El perfil de hidrofobicidad predicho de G de MPV reveló características similares a los demás pneumovirus. La terminal amino contiene una región hidrofílica seguida por un área hidrofóbica corta (aminoácidos 33-53) y una terminal carboxi principalmente hidrofílica (Figura 14B) . Esta organización global es consistente con la organización de una proteina de transmembrana de tipo II anclada y corresponde bien a estas regiones en la proteina G de APV de RSV. El ORF de G de MPV contiene solamente un residuo de cisteina en contraste con RSV y APV (5 y 20, respectivamente) . De conformidad con análisis serológicos clásicos como se muestra por ejemplo en Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., y Brown, F., Classification and nomenclature of viruses. Fífth report of the international Commitee on Taxonomy of Viruses [Clasificación y nomenclatura de virus. Quinto reporte del Comité internacional en materia de taxonomía de virus]. Aren Virol, 1991, Suplemento 2: p. 140-144, un aislado de MPV es también identificable, perteneciente a un serotipo según lo proporcionado aqui, definiéndose con base en su claridad inmunológica, según lo determinado por neutralización cuantitativa con anti-sueros de animales (obtenidos por ejemplo a partir de hurones o conejillos de la India según lo proporcionado en la descripción detallada) . Dicho serotipo o bien no tiene ninguna reacción con otros o bien muestra una proporción de título homólogo a heterólogo mayor que 16 en ambas direcciones . Si la neutralización muestra un cierto grado de reacción cruzada entre los virus en cualquier dirección o en ambas direcciones (proporción entre grupos homólogos y heterólogos de ocho a 16) , se asume el carácter distinto del serotipo si existen diferencias bio-fisicas/bio-fisicas sustanciales de ADN. Si la neutralización muestra un alto grado de reacción cruzada entre dos virus en cualquier dirección o en ambas direcciones (proporción entre grupos homólogos y heterólogos menor que ocho) , se asumen la identidad de serotipo de los aislados en estudio. Como se dijo, aislados de prototipos útiles, como por ejemplo el aislado 1-2614, que se conoce aquí también como aislado de MPV 00-1, se proporcionan aquí. Una clasificación adicional de un virus como un virus de ARN de cadena única de sentido negativo especialmente de mamífero aislado según lo proporcionado aquí puede efectuarse con base en homología con las proteínas G y/o SH. Cuando en general, la identidad de secuencia de aminoácidos global ORFs de N, P, M, F, M2 y L de APV (aislado de aves) y MPV (aislado de seres humanos) fue de 64 a 88 por ciento, y cuando se encontró homología de secuencias de nucleótidos también entre las regiones no codificadoras de los genomas APV y MPV, esencialmente no se encontró homología de secuencia de aminoácidos discernible entre los dos de los ORFs del aislado humano (MPV) y ninguno de los ORFs de los demás paramixovirus . El contenido de aminoácidos,- los perfiles de hidrofobicidad y la ubicación de estos ORFs en el genoma viral muestran que representan análogos de proteína G y SH. La homología de secuencia entre APV y MPV, su organización genómica similar (3f -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5' ) asi como análisis filogenéticos proporcionan evidencia adicional para la clasificación propuesta de MPV como el primer metapneumovirus de mamífero. Nuevos aislados de MPV son identificados, por ejemplo, como tales por aislamiento de virus y caracterización en tMK u otras células, por RT-PCR y/o análisis de secuencia seguido por análisis de árbol filogenético, y por técnicas serológicas tales como ensayos de neutralización de virus, ensayos de inmunofluorescencia indirecta, ensayos de inmunofluorescencia directa, análisis de FACs u otras técnicas inmunológicas . De preferencia estas técnicas son dirigidas hacia los análogos de proteina SH y/o G. Por ejemplo, la invención proporciona aguí un método para proporcionar aislados adicionales de MPV de conformidad con lo proporcionado aguí, el método comprende la inoculación de un conejillo de la India o hurón, esencialmente no infectado con MPV o bien libre de patógeno específico (en la descripción detallada, el animal es inoculado de manera intranasal pero otras formas de inoculación, como por ejemplo inoculación intramuscular o intradérmica, y utilizando otro animal experimental, son también factible, con el aislado prototípico 1-2614 o aislados relacionados. Se recogen sueros del animal el día cero, dos semanas y tres semanas después de la inoculación. El animal específicamente sero-convertido de conformidad con lo medido en el ensayo de neutralización de virus (VN) e IFA indirecto contra el aislado respectivo I-2614 y los sueros del animal sero-convertido se utilizan en la detección inmunológica de dichos aislados adicionales. ? titulo de ejemplo, la invención ofrece la caracterización de un nuevo miembro de la familia de Para yxoviridae, un metapneumovirus humano o un virus de tipo metapneumovirus (puesto que su taxonomía final está a la espera de comentarios por un comité de taxonomía viral, el MPV se describe aqui por ejemplo como taxonómicamente correspondiente a AFV) (MPV) que puede provocar RTI severa en seres humanos. Los signos clínicos de la enfermedad causada por MPV son esencialmente similares a los causados por hRSV, como por ejemplo tos, mialgia, vómito, fiebre, bronqueolitis o neumonía, posible conjuntivitis o combinaciones de los mismos . Como se puede observar en niños infectados con hRSV, específicamente niños muy jóvenes, se puede requerir de hospitalización. A título de ejemplo, un MPV depositado el día 19 de Enero de 2001 como 1-2614 ante CNCM, Instituto Pasteur, París, o un aislado de virus filogenéticamente correspondiente se proporciona aquí. La invención ofrece un virus que comprende un ácido nucleico o un fragmento funcional filogenéticamente correspondiente a una secuencia de ácido nucleico mostrada en las Figuras 6a, 6b, 6c o bien estructuralmente correspondiente. En particular, la invención proporciona un virus caracterizado porque después de su prueba en análisis de árbol filogenético en donde se generan árboles de máxima probabilidad utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas {jumbles) , se encuentra que es más filogenéticamente correspondiente a un aislado de virus depositado por 1-2614 ante CNCM, París, que su relación con un aislado de virus de pneumovirus de las aves (APV) también conocido como virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) , el agente etiológico de la rinotraqueitis de las aves. Es particularmente útil enfriar un aislado de virus de AVP-C como grupo externo en dichos análisis de árboles filogenéticos, siendo el pariente más cercano, aún cuando se trata de un virus esencialmente no mamífero. Proponemos que el nuevo virus humano sea nombrado metapneumovirus humano o virus de tipo metapneumovirus (MPV) con base en varias observaciones. Un análisis EM reveló partículas de tipo paramixovirus . De manera consistente con la clasificación, MPV pareció ser sensible al tratamiento con cloroformo. MPV es cultivado de manera óptima en células tMK y depende de tripsina. Los síntomas clínicos causados por MPV así como el CPE típico y la falta de actividad de hemaglutinación sugieren que este virus se encuentra estrechamente relacionado con hRSV. Aún cuando la mayoría de los paramixovirus tienen una actividad hemaglutinante, la mayoría de los pneumovirus no presentan dicha actividad (Pringle, C.R. En: The Paramyxoviruses . Ia ed. (ed. D.W.
Kingsbury) 1-39 (Pleaum Press, Nueva York, 1991)). Como ejemplo, la invención ofrece un paramixovirus no previamente identificado a partir de muestras de aspirados nasofaríngeos tomados de 28 niños que padecen de RTI severo. Los síntomas clínicos de estos niños fueron muy similares a los causados por hRSV. 27 de los pacientes eran niños menores de 5 años y la mitad de ellos tenían entre 1 y 12 meses de edad. El otro paciente tenía 18 años. Todos los individuos padecían de RTI superior con síntomas dentro de un rango de tos, mialgia, vómito y fiebre hasta bronqueolitis y neumonía severa. La mayoría de estos pacientes estuvieron hospitalizados de una a dos semanas. Los aislados de virus de estos pacientes presentaron la morfología de paramixovirus en microscopía electrónica de contraste negativa pero no reaccionaron con antisueros específicos contra paramixovirus humanos y animales conocidos. Todos estuvieron estrechamente relacionados entre ellos de conformidad con lo determinado por ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IEA) con sueros preparados contra dos de los aislados. Análisis de secuencias de nueve de estos aislados revelaron que el virus es relativamente relacionado con APV. Con base en datos virológicos, proponemos una homología de secuencias así como la organización genómica en el sentido que el virus es miembro del genero Metapneumovirus. Investigaciones serológicas mostraron que este virus es un patógeno relativamente común, puesto que la sero-prevalencia en los Países Bajos se acerca al 100% de los seres humanos para la edad de 5 años. Además, la sero-prevalencia fue también elevada en sueros recogidos de seres humanos en 1958, lo que indica que el virus ha estado circulando en la población humana durante más de 40 años. La identificación de este nuevo miembro propuesto del genero Metapneumovirus proporciona también ahora el desarrollo de medios y métodos para ensayos de diagnóstico o kits de prueba y vacunas o composiciones de anticuerpos o suero para infecciones virales del tracto respiratorio, y métodos para probar o tamizar agentes antivirales útiles en el tratamiento de infecciones con MPV. En esta medida, la invención proporciona entre otras cosas un ácido nucleico aislado o recombinante o fragmento funcional específico para virus del mismo que puede obtenerse a partir de un virus de conformidad con la invención. En particular, la invención presente invención ofrece cebadores y/o sondas adecuados para identificar un ácido nucleico de MPV. Además, la invención ofrece un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la invención. Para empezar, vectores tales como vectores de plásmido que contienen (partes) del genoma de MPV, vectores de virus que contienen (partes) del genoma de MPV. (Por ejemplo, pero sin limitarse a estos ejemplos, otros paramixovirus, virus de vaccinia, retrovirus, baculovirus) , o bien MPV que contienen (partes) del genoma de otros virus u otros patógenos se proporcionan. Además, numerosas técnicas genéticas reversas han sido descritas para la generación de virus de cadena negativa recombinantes con base en dos parámetros críticos. Primero, la producción de tales virus se basa en la replicación de una copia de longitud completa o parcial del genoma de ARN viral de sentido negativo (vARN) o una copia complementaria del mismo (cARN) . Este vARN o cARN puede ser aislado de virus infeccioso producido al efectuarse una transcripción in vitro, o bien puede producirse en células al efectuarse una transección de ácidos nucleicos. Segundo, la producción de un virus de cadena negativa recombinante se basa en un complejo de polimerasa funcional. Típicamente, el complejo de polimerasa de pneumovirus consiste de proteínas N, P, Y y posiblemente M2, pero sin limitarse necesariamente a estos ejemplos. Complejos de polimerasa o componentes de los mismos pueden ser aislados a partir de partículas virales, aislarse a partir de células que expresan uno o varios de los componentes, o bien producirse al efectuarse una transección de vectores de expresión específicos. Copias infecciosas de MPV pueden obtenerse cuando los vAKN, cARN antes mencionados o bien vectores que expresan estos ARNs son replicados a través del complejo de polimerasa mencionado arriba (Lennette, D.A. y colaboradores. En: Diagnostic procedures for viral, rlckettsial , and chlamydial infectlons. 7tn ed. (eds. Lennette, E.H., Lennette, D.A. & Lennette, (E.T.) 3-25; 37-138; 431-463; 481-494; 539-563 (Asociación de salud pública American, Washington, 1995) , Collins, P.L., Hill, M.G., Camargo, E . , Grosfeld, H. , Chanock, R.M. & Murphy, Br. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5r proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development [Producción de virus sincitial respiratorio humano infeccioso a partir de ADNc clonado confirma una función esencial para el factor de elongación de transcripción a partir del marco de lectura abierto próximo a 5' del ARNm de M2 en la expresión génica y proporciona la capacidad de desarrollo de vacuna], PNAS 92, 11567 (1995), Hoffmann, E., Neumann, G., Kawakao, Y., Hobom, G. & Webster, R.G. A DNA trasfection system for generation of influenza virus from eight plasmids [Un sistema de transfección ADN para la generación de virus de influenza a partir de ocho plásmidos] . PNAS 97, 6108-6113 (2000), Bridgen, A., Elliot, R.M. Rescue of a segmented negative-strand virus entirely from cloned complementary DNAs [Rescate de un virus de cadena negativa segmentado totalmente a partir de ADNs complementarios clonados] . PNAS 93, 15400-15404 (1996), Palese, P., Zheng, ?. , Engelhardt, O.G., Pleschka, S. & Garcia-Sastre, A. Negative-strand R A viruses : genetic engineering and applications [Virus de AR de cadena negativa: manipulación genética y aplicaciones] . PNAS 93, 11354-11358 (1996), Peeters, B.P., de Leeuw, O.S., Koch, G. & Gielkens, A.L. Rescue of Ne castle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusión protein is a major determinant for virulence [Rescate de virus de enfermedad de Newcastle a partir de ADNc clonado: evidencia que la capacidad de disociación de la proteina de fusión es un determinante principal de la virulencia] . J. Virol. 73, 5001-5009 (1999), Durbin, A.P., Hall. S.L., Siew, J.W., Whitehead, S.S., Collins, P.L. & Murphy, B.R. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA [Recuperación de virus de parainfluenza humana infecciosa de tipo 3 a partir de ADNc] . Virology 235, 323-332 (1997)). Para la generación de mini-replicones o bien un sistema genético reverso para la generación de una copia de longitud entera que comprende la mayoría o la totalidad del genoma de MPV, es suficiente utilizar las secuencias de ácido nucleico de extremo 3' y/o extremo 5' que pueden obtenerse a partir de APV, por ejemplo (Randhawa y colaboradores, 1997) o bien MPV mismo . Asimismo, la invención proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico o un vector de conformidad con la invención. Vectores de plásmido o virales que contienen los componentes de polimerasa de MPV (probablemente N, P, L y M2, pero sin limitarse necesariamente a estos ejemplos) son generados en células procarióticas para la expresión de los componentes en tipos de células relevantes (bacterias, células de insecto, células eucarióticas) . Vectores de plásmidos o virales que contienen copias parciales o de longitud completa de genoma de MPV serán generados en células procarióticas para la expresión de ácidos nucleicos virales in vitro o in vivo. Estos últimos vectores pueden contener otras secuencias virales para la generación de virus quiméricos o proteínas de virus quiméricos, pueden presentar una falta del genoma viral para la generación de virus defectuoso en cuanto a replicación, y pueden contener mutaciones, deleciones o inserciones para la generación de virus atenuados . Copias infecciosas de MPV (de tipo silvestre, atenuadas, defectuadas para replicación o quiméricas) pueden producirse al efectuarse una co-expresión de los componentes de polimerasa de conformidad con las tecnologías de punta descritas arriba. Además, células eucarióticas, que expresan de manera transiente o estable una o varias proteínas de MPV parciales o de longitud completa pueden utilizarse. Tales células pueden elaborarse mediante la transfección (proteínas o vectores de ácido nucleico), infección (-vectores virales), o transducción (vectores virales) y pueden ser útiles para complementar los virus de tipo silvestre, atenuados, defectuosos para replicación o quiméricos mencionados. Un virus quimérico puede ser especialmente útil para la generación de vacunas recombinantes que protegen contra dos o más virus (Tao, T . , Durbin, A.P., Whitehead, S.S., Davoodi, F. , Collins, P.L. & Murphy, B.R. Recovery of a fully viable chimeric human parainfluenza virus (PIV) type 3 in which the hemagglutinin-neuraminidase and fusión glycoproteins nave been replaced by those of PIV type 1 [Recuperación de un virus de parainfluenza humana quimérico totalmente viable (PIV) tipo 3 en donde la hemaglutinina-neuraminidasa y glicoproteínas de fusión han sido reemplazadas por las PIV tipo 1]. J. Virol. 72, 2955-2961 (1998), Durbin, A.P., Skiadopoulos, M.H. McAuliffe, J.M, Riggs, J.M., Surman, S.R., Collins, P.L. & Murphe,B. R. Human parainfluenza virus type 3 (PIV3) expressing the hemagglutinin protein of measles virus provides a potential method for immunization against measles virus and PIV3 in early infancy [Virus de parainfluenza humana tipo 3 (PIV3) que expresa la proteína de hemaglutinina de virus de sarampión proporciona un método potencial para inmunización contra el virus de sarampión y PIV3 en infancia temprana]. J. Virol. 74, 6821-6831 (2000), Teng, N. , Whitehead, S.S., Bermingham, A., St. Claire, M. , Elkins, .R., Murphy, B.R. & Collins, P.L. J. Virol. 74, 9317-9321 (2000) ) . Por ejemplo, se puede contemplar que un vector de virus de MPV que expresa uno o varias proteínas de RSV o un vector de RSV que expresa una o varias proteínas de MPV protegerá a los individuos vacunados con dicho vector contra ambas infecciones virales. Un enfoque similar puede ser contemplado para PI3 u otros paramixovirus. Virus atenuados y defectuosos para replicación pueden ser útiles para propósitos de vacunación con vacunas vivas como se ha sugerido para otros virus (Skiadopoulos, M.H., Durbin, A.P., Tatem, J.M., Wu, S.L., Paschalis, M., Tao, T . , Collins, P.L. & Murphy, B.R. Three amino acid substitutions in the L protein of the human parainfluenza virus type 3 cp 5 live attenuated vaccine candidate contribute to its temperature-sensitive and attenuation phenotypes [Tres sustituciones de aminoácidos en la proteína L del virus de parainfluenza humana tipo 3 cp45 de candidato a vacuna atenuada viva contribuyen a sus fenotipos sensibles a la temperatura y atenuación]. J. Virol. 72, 1762-1768 (1998), Teng, N. , Whitehead, S.S., Bermingham, A., St. Claire, M. , Elkins, W.R., Murphy, B.R. & Collins, P.L. J. Virol. 74, 9317-9321 (2000) ) . En una modalidad preferida, la invención ofrece una molécula proteinácea o una proteína viral específica para metapneumovirus o fragmento funcional de la misma codificado por un ácido nucleico de conformidad con la presente invención. Moléculas proteináceas útiles se derivan, por ejemplo, de cualquiera de los genes o fragmentos genómicos derivables de un virus de conformidad con la invención. Tales moléculas o fragmentos antigénicos de las mismas, como se proporcionan aquí, son útiles, por ejemplo, en métodos de diagnóstico o kits o en composiciones farmacéuticas como por ejemplo vacunas de sub-unidades . Son particularmente útiles las proteínas F, SH y/o G o fragmentos antigénicos de las mismas para su inclusión como antígeno o inmunógeno de sub-unidad, pero se pueden utilizar también virus enteros desactivados. Son particularmente útiles las sustancias proteináceas codificadas por fragmentos de ácido nucleico recombinantes que son identificados por análisis filogenéticos, prefiriéndose evidentemente los que se encuentran dentro de los límites preferidos de los ORFs útiles en análisis filogenéticos, en particular para causar anticuerpos específicos para MPV, ya sea in vivo (por ejemplo para propósitos de protección o bien para proporcionar anticuerpos de diagnóstico) o bien in vitro (por ejemplo, por tecnología de despliegue de fagos u otra técnica útil para generar anticuerpos sintéticos) . Se proporciona también aquí anticuerpos, policlonales o monoclonales naturales, o bien anticuerpos sintéticos (por ejemplo moléculas de enlace derivadas de biblioteca (de fagos) ) que reaccionan específicamente con un antígeno que comprende una molécula proteinácea o un fragmento funcional específico de MPV del mismo de conformidad con la presente invención. Tales anticuerpos son útiles en un método para identificar un aislado viral como un MPV que comprende la reacción de dicho aislado viral o un componente del mismo con un anticuerpo de conformidad con lo proporcionado aquí. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la utilización de MPV purificado o no purificado o partes del mismo (proteínas, péptidos) empleando ELISA, RIA, FACS, o formatos similares de ensayos de detección de antígenos (Current Protocols in Immunology [Protocolos Actuales en Inmunología] ) . Alternativamente, células infectadas o cultivos de células pueden ser utilizados para identificar antígenos virales utilizando técnicas clásicas de inmunofluorescencia o inmunohistoquímicas . Otros métodos para identificar un aislado viral como un MPV comprenden la reacción de dicho aislado viral o un componente del mismo con un ácido nucleico específico para virus de conformidad con la presente invención, en particular en donde dicho virus de mamífero comprende un virus humano. De esta forma, la invención ofrece un aislado viral identificable con un método de conformidad con la presente invención como un virus taxonómicamente correspondiente a un virus de AKN de una sola cadena de sentido negativo identificable como perteneciente probablemente al genero Metapneumovirus dentro de la sub-familia Pneumovirinae de la familia Paramyxovirídae. El método es útil en un método para diagnosticar virológicamente una infección con MPV de un mamífero, dicho método comprende por ejemplo la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un aislado viral o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra por un ácido nucleico o un anticuerpo de conformidad con la invención. Ejemplos se proporcionan adicionalmente en la descripción detallada como por ejemplo el uso de reacción en cadena de polimerasa (o bien otras técnicas de amplificación o hibridación bien conocidas en la técnica) o bien el uso de detección de inmunofluorescencia (o bien otras técnicas inmunológicas conocidas) . La invención ofrece también un método para diagnosticar serológicamente una infección por MPV de mamífero, que comprende la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un anticuerpo dirigido específicamente contra un MPV o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinácea o fragmento de la misma o un antxgeno de conformidad con la presente invención. Métodos y medios proporcionados aquí son especialmente útiles en un kit de diagnóstico para diagnosticar una infección por MPV, ya sea diagnóstico virológico o serológico. Tales kits o ensayos pueden comprender, por ejemplo, un virus, un ácido nucleico, una molécula proteinácea o un fragmento de la misma, un antigeno y/o un anticuerpo de conformidad con la presente invención. El uso de un virus, un ácido nucleico, una molécula proteinácea o fragmento de la misma, un antigeno y/o un anticuerpo de conformidad con la presente invención se proporciona también para la producción de una composición farmacéutica (por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de infecciones por MPV y/o para el tratamiento o prevención de enfermedades del tracto respiratorio, especialmente en seres humanos. La atenuación del virus puede lograrse a través de métodos establecidos desarrollados para este propósito, incluyendo sin limitarse a estos ejemplo, mediante el uso de virus relacionados de otras especies, pasajes en serie a través de animales de laboratorio y/o cultivos en tejido/células, mutagénesis dirigidas a sitio de clones moleculares e intercambio de genes o fragmentos de genes entre virus relacionados . Una composición farmacéutica que comprende un virus, un ácido nucleico, una molécula proteinácea o fragmento de la misma, un antigeno y/o un anticuerpo de conformidad con la presente invención puede emplearse, por ejemplo, en un método para el tratamiento o la prevención de una infección por MPV y/o una enfermedad respiratoria que comprende el suministro a un individuo de una composición farmacéutica de conformidad con la presente invención. Esto es especialmente útil cuando dicho individuo es un ser humano, específicamente, cuando dicho ser humano es menor a cinco años, puesto que tales infantes y niños jóvenes presentan una mayor probabilidad a ser infectados por un MPV humano según lo proporcionado aquí. En general, los pacientes en fase aguda padecerán de síntomas respiratorios superiores que los predisponen a otras enfermedades respiratorias y de otros tipos. Asimismo, pueden ocurrir enfermedades respiratorias inferiores, predisponiendo para condiciones adicionales y más severas. La invención ofrece también método para obtener un agente antiviral útil en el tratamiento de enfermedad del tracto respiratorio, que comprende el establecimiento de un cultivo celular o un animal experimental que comprende un virus de conformidad con la presente invención, el tratamiento de dicho cultivo o animal con un agente antiviral candidato y la determinación del efecto de dicho agente sobre dicho virus o su infección de dicho cultivo o animal. Un ejemplo de dicho agente antiviral comprende un anticuerpo neutralizante para MPV o un componente funcional del mismo, de conformidad con lo proporcionado aquí, pero agentes antivirales de otra naturaleza se obtienen también. La invención ofrece asimismo el uso de un agente antiviral de conformidad con la invención para la preparación de una composición farmacéutica, en particular para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad del tracto respiratorio, especifreamente, cuando dicha enfermedad es causada por una infección por MPV, y proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente antiviral de conformidad con la invención, útil en método para el tratamiento o la prevención de una infección por MPV o una enfermedad respiratoria, dicho método comprende el suministro a un individuo de dicha composición farmacéutica. La invención se explica más a fondo en la siguiente descripción detallada sin limitarse a dicha descripción. Leyendas de las figuras La figura 1A comprende la tabla 1: Porcentaje de homología encontrado secuencia de aminoácidos de aislar 00-1 y otros miembros de Pneumovirlnae. Porcentaje (xlOO) se proporciona para la secuencia de aminoácidos de N, P, M F y dos fragmentos de RAP-PCR en L (8 y 9/10) . Los números de acceso utilizados para los análisis son descritos en la sección de materiales netos. La figura IB comprende la tabla 2: Sero-prevalencia de MPV en seres humanos por categoría según un grupo de edad utilizando ensayos de neutralización de virus e inmunofluorescencia. Figura 2: Representación esquemática de los genomas APV con la ubicación y tamaño de los fragmentos obtenidos con RAP-PCR y RT-PCR en aislado de virus 00-1. Los fragmentos 1 a 10 fueron obtenidos utilizando RAP-PCR. El fragmento A fue obtenido con un cebador en fragmento 1 y 2 de RAP-PCR y un cebador diseñado designado para formarse en alineación de secuencias líder y posterior de APV y RSV (Randhawa, J.S., Marriott, A.C., Pringle, C.R. & Easton, A.J. Rescue of synt etic minireplicons establishes t e absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus [Rescate de minireplicones sintéticos establece la ausencia de genes NS1 y NS2 a partir de pneumovirus de aves]. J.Virol. 71, 9849-9854 (1997) ) . El fragmento B fue obtenido empleando cebadores designados en fragmentos 1 y 2 de RAP-PCR y fragmentos 3 de RAP-PCR. El fragmento C fue obtenido con cebadores diseñados en fragmento 3 de RAP-PCR y fragmentos 4,5,6 y 7 de RAP-PCR. Para todos los árboles filogenéticos (figuras 3-5) la secuencia de ADN fue alineada utilizando el paquete de programática ClistalW y se generaron árboles de máxima probabilidad utilizando el paquete de programática de DNA-ML del programa Phylip 3.5 utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) (Brandenburg, A.H. Groen, J., van Steensel-Moll, H.A., Claas, E.J.C., Rothbarth, P.H., Neijens, H.J. & Osterhaus, A.D.M.E. Respiratory syncytial virus specific serum antibodies in infants under six months of age: limited serological response upon infection [Anticuerpos séricos específicos para virus sincitial respiratorio en infantes de menos de seis meses de edad: repuesta serológica limitada al ocurrir una infección] . J. Mee. Virol. 52, 97-104 (1997)). Secuencias previamente publicadas que fueron utilizados para la generación de árboles filogenéticos están disponibles Genbank bajo los números de acceso: Para todos- los ORFs: hRSV: NC001781; bRSV: NC001989; para el ORF de F: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152;. para el ORF de N: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; PAV-C, AF176590; para el ORF de M: PMV, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; para el ORF de P: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. Análisis filogenéticos para los nueve aislados de virus diferentes de MPV fueron efectuados con la cepa C de APV como grupo externo. Abreviaturas utilizadas en las figuras: hRSV: humano; bRSV: bovino; PVM: virus de neumonía de ratón; APV-A, B y C: pneumovirus de las aves de tipo A, B y C. Figura 3. Comparación de los ORFs de N, P, M y F de miembros de la subfamilia de Pneumovirinae y aislado de virus 00-1. La alineación muestra la secuencia de las proteínas N, P, M y F completas y las proteínas L parciales de aislado de virus 001. Aminoácidos que difieren entre el aislado 00-1 y los demás virus se muestran, aminoácidos idénticos son representados por períodos, espacios son representados por guiones. Los números corresponden a las posiciones de aminoácidos en las proteínas. Los números de acceso utilizados para los análisis son descritos en la sección de materiales y métodos. APV-A, B ó C: Pneumovirus de tipo A, B o C, b-o hRSV: virus sincitial respiratorio bovino o humano, PVM: virus de neumonía de ratón. L8 : fragmento 8 obtenido con RAP-PCR ubicado en L, 9/10: consenso de fragmento 9 o 10 obtenidos con RAP-PCR ubicado en L. Para la alineación de P, ninguna secuencia de APV-B estaba disponible de Genbank. Para la alineación L, estaban disponibles solamente las secuencias bRSV, nRSV y APV-A. Figura 4: Análisis filogenético de los ORFs de N, P, M y F de miembros del genero Pneumovirinae y aislado de virus 00.1. Se efectúo un análisis filogenético en secuencias virales a partir de los genes siguientes: F (panel A), N (panel B) , M (panel C) y P (panel D) . Los árboles filogenéticos se basan en análisis de probabilidad máxima utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) . La escala que representa el número de cambios de nucleótidos se muestra para cada árbol. Figura 5: relación filogenética para partes de los ORFs de F (panel A) , N (panel B) , M (panel C) y L (panel D) de los aislados de MPV primarios con APV-C, su pariente genéticamente más cercano. Los árboles filogenéticos se basan en análisis de máxima probabilidad. La escala representa el número de cambio de nucleótidos se muestra para cada árbol.
Números de acceso para APV-C: panel A: D00850; panel B: U39295; panel C: X58639; y panel D: U65312. Figura 6A: Información sobre secuencias de nucleótidos y aminoácidos a partir del extremo 3' del genoma de aislado de MPV 00-1. Se proporcionan los ORFs. N: ORF para nucleoproteína; P: ORF para fosfoproteína; M: ORF para proteína de matriz; F: ORF para proteína de fusión; GE: extremo de gen; GS: inicio de gen. Figuras 6B y C: Información sobre secuencias de nucleótidos y aminoácidos a partir de fragmentos obtenidos en el gen de polimerasa (L) de aislados de MPV 00.1. El posicionamiento de los fragmentos en L se basa en homologías de proteína con APV-C (número de acceso TJ65312) . El fragmento traducido 8 (figura 6) se localiza en los aminoácidos número 8 a 243, y el consenso de fragmento 9 y 10 (figura 6C) se localiza en los aminoácidos números 1464 del ORF de L de APV-C. Figura 7 Mapa genómico de aislado de MPV 001. Las posiciones de nucleótidos de los codones de inicio y terminación son indicadas bajo cada ORF. Las líneas dobles que cruzan el ORF de L indican la representación acortada del gen L. Los tres marcos de lectura debajo del mapa indican el ORF de G primaria (nt 6262-6972) y los ORFs secundarios potenciales de empalme . Figura 8: Alineación de la secuencia de aminoácidos predicha de la nucleoproteina de MPV con las secuencias de otros pneumovirus . La regiones conservas identificadas por Barr (1991) están representadas por cuadros y marcadas A, B, y C. La región conservada entre el pneumovirus (Li, 1996) se muestra sombreada con gris. Los espacios son representados por guiones, los puntos indican las posiciones de residuos de aminoácidos idénticos en comparación con MPV. Figura 9 : Comparación de secuencias de aminoácidos de la fosfoproteina de MPV con las de otros pneumovirus. La región de alta similaridad (Ling, 1995) se encuentra en un cuadro, y la región rica en glutamato esta sombreada con gris. Los espacios son representados por guiones y puntos indican la posición de residuos de aminoácidos idénticos en comparación con MPV. Figura 10: Comparación de la secuencia de aminoácidos deducidos de la proteína de matriz de MPV con las otros pneumovirus. La secuencia de hexapéptidos conservada (Easton, 1997) se presenta sombreada con gris. Los espacios están representados por guiones y los puntos indican la posición de residuos de aminoácidos idénticos con relación a MPV. Figura 11: Alineación de la secuencia de aminoácidos predicha de la proteína de fusión de MPV con las otros pneumovirus. Los residuos de cisteina conservados están en cuadro, los sitios de glicosilación N-enlatados están subrayados, el sitio de disociación de FIO es subrayado de manera doble, el péptido de fusión, el péptido de señal y el dominio de ancho de membrana se muestran sombreados con gris . Los espacios son representados por guiones y los puntos indican la posición de aminoácidos idénticos con relación a MPV. Figura 12 Comparación de la secuencia de aminoácidos de ORF de M2 de MPV con las otros pneumovirus. La alineación de ORFs de M2-1 se muestra en el panel A, con el extremo amino conservado (Collins, 1990; Zamora, 1999) mostrado sombreado de gris. Los tres residuos de cisteina conservados son impresos en negritas e indicados por #. La alineación de los ORFs de M2-2 se muestra en el panel B. Los espacios son representados por guiones y los puntos indican la posición de aminoácidos idénticos con relación a MPV. Figura 13 Análisis de secuencias de aminoácidos del ORF de SH de MPV. (A) secuencias de aminoácidos de ORF de SH de MPV, con los residuos de serina y treonina sombreados de gris, los residuos de cisteina en negritas y la región hidrofóbica doblemente subrayada. Los sitios de glicosilación enlazado con N potenciales son subrayados una sola vez. Los números indican las posiciones de los aminoácidos básicos que flanquean el dominio hidrofóbico. (B) Alineación de las áreas de hidrofobicidad de las proteínas de SH de MPV, APV-A y hRSV-B. Se utilizó el procedimiento de Kyte and Doolxttle (1982) con una ventada de 17 aminoácidos. Las flechas indican un dominio hidrofóbico fuerte. Las posiciones dentro del ORF se proporcionan en el eje X. Figura 14 Análisis de secuencias de aminoácidos del ORF de G de MPV. (A) Secuencias de aminoácidos de ORF de G de MPV, con residuos de serina, treonina y prolina sombreados de gris, el residuo e cisteína en negritas y la región hidrofóbica doblemente subrayada. Los sitios de glicosilación enlazados con N potenciales son subrayados una sola vez. (B)Alineación de las áreas de hidrofobicidad de las proteínas G de MPV, APV-A y hRSV-B. El procedimiento de Kyte and Doolxttle (1982) fue utilizado con una ventana de 17 aminoácidos. Las flechas indican la región hidrofóbica y las posiciones dentro del ORF se proporcionan en el eje X. Figura 15 Comparación de las secuencias de aminoácidos del dominio conservado del gen de polimerasa de MPV y otros paramixovirus . El dominio III se muestra con los motivos de polimerasa conservados (A, B, C, D) en el dominio III (Poch 1998, 1999) en cuadro. Los espacio son representados por guiones y los puntos indican al posición de los residuos de aminoácidos idénticos con relación a MPV. HPIV3: virus de parainfluenza humana de tipo 3; SV: virus de Sendai; h.PIV-2 : virus de parainfluenza humana de tipo 2; NDV: virus de enfermedad de New castle MV: virus de sarampión; nipah: virus de Ñipan. Figura 16: .Análisis filogenéticos de los ORFs de M2-1 y L de MPV y paramixovirus seleccionados. El ORF de M2-1 fue alineado con los ORFs de M2-1 de otros miembros de género Pneumovirlnae (A) y el ORF de L fue alineado con los ORFs de L miembros del género de pneumovirinae y seleccionados otros paramixovirus de conformidad con lo descrito en las leyendas de la figura 15 (B) . Árboles filogenéticos fueron generados por análisis de máxima probabilidad utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps ) y 3 mezclas (jumóles) . La escala que representa el número de cambios de nucleótidos se muestra para cada árbol. Los números en los árboles representan valores de bootstrap con base en los árboles de consenso. Figura 17: Secuencias no codificadoras de aislado de hMPV 00.1. (A) Las secuencias no codificadoras entre los ORFs en los extremos genómicos se muestran en el sentido positivo. De izquierda a derecha, codones de detención de ORFs indicados se muestran, seguido por las secuencias no codificadoras, las señales de inicio de gen y codones de terminación de los ORFs subsecuentes indicados. Los números indican la primera posición de los codones de inicio y terminación en el mapa de hMPV. Secuencias que presentan similaridad con las señales de fin publicadas son subrayadas y secuencias que presentan similaridad con UAAAAAU/A/C son representadas con una linea arriba de la secuencia. (B) Secuencia de nucleótidos de los extremos genómicos de hMPV. Las terminales genómicas de hMPV están alineadas entre ellas y con las de APV. Las regiones subrayadas representan las secuencias de cebador que se utilizan en ensayos de RAP-PCR que se basan en las secuencias de extremo 3' y 5' de APV y RSV (Randhawa y colaboradores, 1997, Mink y colaboradores, 1991) . Los nucleótidos en cursivas en negritas forman parte de la señal de inicio de gen del gen N. Le: Líder, Tr: siguiente. Figura 18: Comparación de dos aislados de hMPV prototípicos con APV-A y APV-C; matrices de similaridad de ADN para ácidos nucleicos que codifican las varias proteínas virales. Figura 19: Comparación de dos aislados de hMPV prototípicos con APV-A y APV-C; matrices de similaridad de proteínas para las varias proteínas virales . Figura 20: Alineación de aminoácidos de la nucleoproteína de dos aislados de hMPV prototipos.
Figura 21: Alineación de aminoácidos de la fosfoproteina de dos aislados de hMPV prototipo . Figura 22: Alineación de aminoácidos de la proteina de matriz de dos aislados de hMPV prototipos. Figura 23: Alineación de aminoácidos de la proteina de fusión de dos aislados de hMPV prototipo. Figura 24: Alineación de aminoácidos de la proteina M2-1 de dos aislados de hMPV prototipos . Figura 25: Alineación de aminoácidos de la proteina de M2-2 de dos aislados de hMPV prototipos. Figura 26: Alineación de aminoácidos de la proteina hidrofóbica corta de dos aislados de hMPV prototipos. Figura 27: Alineación de aminoácidos de la glicoproteina de fijación de dos aislados de hMPV prototipos . Figura 28: Alineación aminoácidos del extremo N de la proteina de polimerasa de dos aislados- hMPV prototipos. Figura 29: Resultados del ensayo de RAP-PCR en estirados de garganta y nariz de 12 conejillos de la India inoculados con ned/00/01 y/o ned/99/01. Figura 30A: Respuesta de IgG contra ned/00/01 y ned/99/01 para conejillos de la India infectados con ned/00/01 y re-infectados con ned/00/01 (GP 4, 5 y 6) o ned/99/01 (GP 1 y 3) . Figura 30B: Respuesta de IgG contra ned/00/01 y ned/99/01 para conejillos de la India infectados con ned/99/01 y re-infectados ya sea con ned/00/01 (GP 8 y 9) o bien con ned/99/01 (GP 10, 11, 12) . Figura 31: Especificidad de ELISA de ned/00/01 y ned/99/01 en sueros tomados de conejillos de la India infectados ya sea con ned/00/01 y ned/99/01. Figura 32: Respuestas de IgG medida contra ELISA de ned/00/01 y ned/99/01 de 3 conejillos de la India infectados homólogos (00-1/00-1), 2 conejillos de la India infectados homólogos (99-1/99-1), 2 conejillos de la India infectados heterólogos (99-1/00-1) y 2 conejillos de la India infectados heterólogos (00-1/99-1) . Figura 33: Porcentaje medio de inhibición de APV de conejillos de India infectados con hMPV. Figura 34: Títulos de neutralización de virus de conejillos de la India infectados con ned/00/01 y ned/99/01 contra ned/00/01, ned/99/01 y APV-C. Figura 35: Resultados de ensayo de RT-PCR en exudado de garganta de macacos cynomolgus inoculados (dos veces) con ned/00/01. Figura 36 ? (dos paneles superiores) : Respuesta de IgA, igM e IgG contra ned/00/01 de 2 macacos cynomolgus (re) infectados con ned/00/01. Figura 36B (paneles inferiores) Respuesta de IgG contra APV de 2 macacos cynomolgus infectados con ned/00/01. Figura 37: Comparación del uso de ELISA de KMPV y ELISA de inhibición de APV para la detección de anticuerpo IgG en seres humanos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aislamiento y caracterización de virus De 1980 a 2000 encontramos 28 aislados de virus no identificados provenientes de pacientes con enfermedad respiratoria severa. Estos 28 aislados de virus no identificados crecieron lentamente en células tMK, poco en células VERO y células A549 y no pudieron ser propagados o bien su propagación fue limitada en células de fibroblastos embrionados de pollo o MDCK. La mayoría de estos aislados de virus indujeron CPE después de tres pasajes tMK, entre el día 10 y el día 14. El CPE fue virtualmente indistinguible del causado por hRSV o hPIV en tMK u otros cultivos celulares, caracterizándose por formación de sincitio después del cual las células presentaron un trastorno interno rápido seguido por desprendimiento de las células de la capa. Las células presentaron habitualmente CPE después de tres pasajes de virus a partir del material original (a veces después), los días 10 a 14 después de la inoculación, un poco más tarde que CPE causado por otros virus como por ejemplo hRSV o hPIV. Empleamos los sobrenadantes de células tMK infectadas para análisis de EM que reveló la presencia de particulares virales de tipo paramixovirus dentro de un rango de 150 a 600 nanómetros, con proyecciones de envoltura cortas dentro de un rango de 13 a 17 nanómetros. De manera consistente con las propiedades bioquímicas de los virus envueltos como por ejemplo Paramyxovirídae, el tratamiento estándar con cloroformo o éter (Osterhaus, A.D.M.E., Yang, H., Spijkers, H.E.M., Groen, J. , Teppema, J.S. &van Steenis, G. The isolation and partial characterization of a highly pathogenic herpesvirus from the Harbor Seal (Phoca vitulina) [El aislamiento y caracterización parcial de un herpesvirus altamente patogénico a partir de la foca de puerto (Phoca vitulina)]. Arch. of Virol. 86, 239-251 (1985)) resultó en la reducción >104TCID50 de la infectividad para las células tMK. Sobrenadantes de cultivo celulares de tMK infectadas con virus no presentaron una actividad hemaglutinante con eritrocitos de pavo, pollo y conejillos de la India. Durante el cultivo, la replicación viral pareció depender de la tripsina en las células probadas. Estos datos virológicos combinados permitieron que el virus recién identificado fuera clasificado taxonómicamente como miembro de la familia Paramyxoviridae. Analizamos el AR de células tMK infectadas con 15 de los aislados virales no identificados para análisis de transcripción reversa y reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) empleando conjuntos de cebadores específicos para Paramyxoviridae (K.B. Chua y colaboradores. Ñipan virus: a recently emergent deadly paramyxovirus [Virus Nipah: un paramixovirus mortal recientemente emergente] . Science 288, 1432-2435 (2000)), hPIV 1-4, virus de sendai, virus de simio de tipo 5, virus de enfermedad de New Castle, hRSV, morbilli, paperas, virus de Nipah, Hendra, Tupai y Mapuera. Ensayos de RT-PCR fueron efectuados con bajo nivel de estrictez con objeto de detectar virus potencialmente relacionados y ARN aislado de virus homólogos fueron utilizados como controles. Mientras que los controles disponibles reaccionaron positivamente con los cebadores específicos para virus respectivos, los aislados de virus recién identificados no reaccionaron con ningún conjunto de cebadores, lo que indica que el virus no presentaba una relación estrecha con los virus probados.
Empleamos dos de los sobrenadantes de cultivo de células tMK infectados con virus para inocular conejillos de la India y hurones de manera intranasal. Se recogieron sueros de estos animales el día cero, dos semanas y tres semanas después de la inoculación. Los animales no presentaron síntomas clínicos pero todos fueron sero-convertidos de conformidad con lo medido en ensayos de neutralización de virus (VN) e IFA indirecto contra los virus homólogos . Los sueros no reaccionaron en IFA indirecto con ninguno de los paramixovirus conocidos descritos arriba y con PVM. Después, tamizamos los aislados virales no identificados a la fecha utilizando los sueros de pre-infección y post-infección de conejillos de la India y hurones de los cuales 28 fueron claramente positivos por IFA indirecto con los sueros post-infección lo que sugiere que presentaban una relación serológica estrecha o eran idénticos. RAP PCR Para obtener una información sobre secuencias de los aislados virales desconocidos, utilizamos una estrategia de amplificación por reacción en cadena de polimerasa aleatoria que se conoce como RAP-PCR (Welsh, J. , Chada, K. Dalal, S.S., Cheng, R., Ralph, D. & McClelland, M. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA [Determinación de huellas digitales de ARN por Reacción en Cadena de Polimerasa cebada arbitrariamente]. NAR. 20, 4965-4970 (1992)). Para este propósito células tMK fueron infectadas con uno de los aislados virales (aislado 00-1) asi como con hPIV-1 que sirvió como control. Una vez que ambos cultivos desplegaran niveles similares de CPE, se purificó virus en sobrenadantes de cultivo en gradientes de sucrosa continuos 20-60%. Las fracciones de gradientes fueron revisadas para determinar la presencia de tipo virus por EM, y el ARN fue aislado de la fracción que contenia aproximadamente 50% de sucrosa, en donde se observaron nucleocápsides . Cantidades equivalentes de ARN aislado a partir de ambas fracciones virales fueron utilizadas para RAP-PCR, después de lo cual muestras fueron colocadas lado a lado en un gel de agarosa NuSieve al 3%. Veinte bandas desplegadas de manera diferencial especificas para el virus no identificado fueron subsecuentemente purificadas a partir del gel, clonadas en plásmido pCDR2.1 (Invitrogen) y secuenciados con cebadores específicos para vectores. Cuando empleamos estas secuencias para investigar homologías contra secuencias en la base de datos Genbank utilizando la programática BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), 10 de los 20 fragmentos presentaron parecido con las secuencias APV/TRTV. Estos 10 fragmentos fueron localizados en los genes que codifican para la nucleoproteína (N; fragmento 1 y 2), la proteína de matriz (M; fragmento 3) , la proteína de fusión (F; fragmento 4, 5, 6, 7) y la proteína de polimerasa (L; fragmento 8, 9, 10) (Figura 2) . Después diseñamos cebadores para reacción en cadena de polimerasa para completar la información de secuencia para el extremo 3f del genoma viral con base en nuestros fragmentos de RAP PCR así como secuencias líder y siguientes publicadas para Paramyxoviridae (Randha a, J.S., Marriott, A.C., Pringle, C.R. & Easton, A.J. Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NSl and NS2 genes from avian pneumovirus [Rescate de minireplicones sintéticos establece la ausencia de genes NSl y NS2 a partir de pneumovirus de aves]. J.Virol. 71, 9849-9854 (1997) ) . Tres fragmentos fueron amplificados, de los cuales el fragmento A abarcó el fin del extremo 3' del marco de lectura abierto N (ORF) , el fragmento B abarcó el ORF de fosfoproteína (P) y el fragmento C cerró el espacio entre los ORFs de M y F (Figura 2) . Análisis de secuencias de estos tres fragmentos revelaron la ausencia de ORFs de NSl y NS2 en el fin del extremo 3' del genoma viral y la ubicación del ORF de F inmediatamente adyacente ORF de M. Esta organización genómica se parece a la organización genómica de APV de metapneumovirus, lo que es también consistente con la homología de secuencia. Generalmente, las secuencias traducidas para los ORFs de N, P, M y F presentaron en promedio una homología de 30-33% con miembros del género Pneumovirus y 66-68% con miembros del género Metapneumovirus. En el caso de los ORFs de SH y G no se observó ninguna homología discernible con miembros de cualquiera de estos géneros . Las homologías de aminoácidos encontradas para N mostraron una homología de aproximadamente 40% con hRSV y 88% con APV-C, su pariente genéticamente más cercano, como se puede deducir por ejemplo mediante la comparación de la secuencia de aminoácido de la Figura 3 con la secuencia de aminoácidos de las proteínas N respectivas de otros virus. La secuencia de aminoácidos para P mostró una homología de aproximadamente el 25% con hRSV y de aproximadamente 66-68% con APV-C, M mostró una homología de aproximadamente 36-39% con hRSV y aproximadamente 87-89% con APV-C, F mostró una homología de aproximadamente 40% con hRSV y aproximadamente 81% con APV-C, M2-1 mostró una homología de aproximadamente 34-36 % con pneumovirus y 84-86% con APV-C, M2-2 mostró una homología de 15-17% con pneumovirus y 56% con APV-C y los fragmentos obtenidos en L mostraron un promedio de 44% con pneumovirus y 64% con APV-C. Filogenia Aún cuando investigación BLAST utilizan las secuencias de nucleótidos obtenidos a partir de aislado de virus no identificado revelaron homologías primariamente con miembros de los Pneu ovirinae, homologías basadas en secuencia de proteína revelaron un cierto parecido con otros paramixovirus también (datos no mostrados) . Como indicación de la relación entre el aislado viral recién identificado y miembros de los Pneumovirinae, se construyeron árboles filogenéticos con base en los ORFs de N, P, M y F de estos virus. En todos los cuatro árboles filogenéticos, el aislado viral recién identificado presentó una relación más estrecha con APV (Figura 4) . A partir de los cuatro serotipos de APV que han sido descritos (Bayon- Auboyer, M. , Arnauld, C, Toquin, D. & Eterradossi, N. Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of t o non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup [Secuencias de nucleótidos de los genes de proteina F, L y G de dos neumovirus de las aves no-A/ no-B (APV) revelan un sub-grupo novedoso de APV] . J. of Gen. Víxol. 81, 2723-2733 (2000)), el serotipo C de APV, el metapneumo irus encontrado primariamente en aves en los Estados Unidos de América, presentó el parecido más cercano con el virus recién identificado. Se observará sin embargo que solamente se cuenta con la información de secuencia parcial para el serotipo D de APV. Para determinar la relación de nuestros varios aislados virales recién identificados, construimos árboles filogenéticos con base en la información de secuencia obtenida a partir de ocho a nueve aislados (8 para F, 9 para N, M y L) . Para este propósito, empleamos RT-PCR con cebadores diseñados para amplificar fragmentos cortos en los ORFs de N, M, F y L, que fueron subsecuentemente secuenciados directamente. Los nueve aislados virales que fueron previamente encontrados como relacionándose en términos serológicos (véase arriba) fueron también encontrados como genéticamente estrechamente relacionados. De hecho, los cuatro aislados virales presentaron una mayor relación entre ellos que con APV. Aún cuando la información de secuencia utilizada para estos árboles filogenéticos fue limitada, parece que los nueve aislados pueden ser divididos en dos grupos, con los aislados 94-1, 99-1 y 99-2 agrupándose en un grupo y los otros seis aislados (94-2; 93-1; 93-2; 93-3; 93-4; 00-1) en el otro (Figura 5) . Sero-prevalencia Para estudiar la sero-prevalencia de este virus en la población humana, probamos sueros de seres humanos en diferentes categorías de edad por IFA indirecto utilizando células tMK infectadas con uno de los aislados virales no identificados. Este análisis reveló que el 25% de los niños entre seis y doce meses de edad tenían anticuerpos para el virus, y para la edad de cinco años casi el 100% de los niños eran seropositivos . En total, se probaron 56 muestras de suero mediante IFA indirecto por ensayo de V . Para 51 de las muestras (91%) , los resultados del ensayo de VN (titulo >8) coincidieron con los resultados obtenidos con IFA indirecto (titulo >32) . Cuatro muestras que fueron encontradas positivas en IFA por prueba de VN (título <32) mientras que un suero reaccionó de manera negativa en IFA (título <32) Y y positivo en la prueba de W (titulo 16) (Tabla 2) . Un IFA efectuado con 72 sueros tomado de seres humanos en 1958 (edades dentro de un rango de 8 a 99 años) (Mulder, J. & Masurel, N. Pre-epidemic antibody against 1957 strain of asiatic influenza in serum of older people living in The Netherlands [Anticuerpo pre-epidémico contra la cepa de 1957 de la influenza asiática en suero de personas ancianas con domicilio en los Países Bajos] . The Lancet, 19 de Abril, 810-814 (1958), Masurel, N. Relation between Hong Kong virus and former human A2 isolates and the A/Equl2 virus in human sera collected before 1957 [Relación entre el virus de Hong Kong y aislados anteriores de A2 de ser humano y el virus A/Equl2 en sueros humanos recogidos antes de 1957] . The Lancet 3 de Mayo, 907-910 (1969) ) reveló una sero-prevalencia del 100%, lo que indica que el virus ha estado en circulación en la población humana durante más de 40 años. Además, varios de estos sueros fueron utilizados en ensayos de VN para confirmar los datos de IFA (Tabla 2) . Los análisis genéticos de los genes N, M, P y F revelaron que MPV presenta una homología de secuencia mayor con el género recién propuesto Metapneumovdrinae (promedio de 63%) en comparación con el género Pneumovirinae (promedio de 30%) y por consiguiente demuestra una organización genómica similar y parecida a la de APV/TRTV. En contraste con la organización genómica de los RSVs ( ,3-NSl-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'' ) , metapneumovirus no tienen los genes NSl y NS2 y tienen una ubicación diferente de los genes M y L ( X3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5' ) . La falta de ORFs entre los genes M y F en nuestros aislados virales y la falta de NSl y NS2 adyacentes a N, y la alta homología de secuencia de aminoácidos encontrada con APV son razones para proponer la clasificación de MPV aislado de seres humanos como un primer miembro del género Metapneumovirus de mamífero, en particular de origen humano. Análisis filogenéticos revelaron que nueve aislados de MPV a partir de los cuales se obtuvo información de secuencia están estrechamente relacionados . Aún cuando la información de secuencia fue limitada, estuvieron de hecho más estrechamente relacionados entre ellos que con cualquiera de los metapneumovirus de las aves. Entre los cuatro serotipos de APV descritos, el serotipo C presentó una relación más estrecha con MPV con base en los genes N, P, M y F. Se observará sin embargo que para el serotipo D solamente secuencias parciales para el g en F estuvieron disponibles den Genbank y para el serotipo B, solamente las secuencias M, N y F estuvieron disponibles. Nuestros aislados de MPV formaron dos grupos en los árboles filogenéticos . Tanto para hRSV como para APV subtipos genéticos y serológicos diferentes han sido descritos. Si los dos grupos genéticos de aislados de MPV representan subgrupos serológicos que son también funcionalmente diferentes sigue sin conocerse actualmente. Nuestros estudios serológicos mostraron que MPV es un patógeno humano común. El aislamiento repetido de este virus a partir de muestras químicas de niños con RTI severo indica que el impacto clínico y económico de MPV puede ser elevado. Nuevos ensayos de diagnóstico basados en detección de virus y serología permitirán un análisis más detallado de la incidencia y del impacto clínico y económico de este patógeno viral . Las ligeras diferencias entre los resultados de IFA y VN (5 muestras) pueden deberse al hecho que en el IFA, se detectaron solamente anticuerpos de suero de IgG mientras que el ensayo VN detecta tanto clases como subclases de anticuerpos o la diferencias pueden deberse a las diferencias de sensibilidad entre ambos ensayos. En el caso de IFA un valor de 16 se emplea mientras que en el caso de VN se emplea un valor de corte de 8. Por otra parte, diferencias entre IFA versus VN pueden también indicar posibles diferencias entre serotipos diferentes de este virus recién identificado. Puesto que MPV parece presentar una relación más estrecha con APV, planteamos de manera hipotética que el virus humano puede haberse originado en aves. El análisis de muestras de suero tomadas de seres humanos en 1958 reveló que MPV ha estado generalizado en la población humana durante más de 40 años lo que indica que un evento de zoonosis tentativo debe haber tenido lugar mucho antes que 1958. MATERIALES Y MÉTODOS Colección de muestra Durante las últimas décadas, nuestro laboratorio ha recogido aspirados nasofaríngeos provenientes de niños que padecen de RTI, rutinariamente probados para la presencia de virus. Todos los aspirados nasofaríngeos fueron probados mediante ensayos de inmunofluorescencia directa (DIF) empleando anticuerpos marcados por fluorescencia contra los tipos A y B de virus de influenza, hRSV y tipos 1 a 3 de virus para influenza humano (hPIV) . Los aspirado nasofaríngeos fueron procesados también para aislamiento viral utilizando técnicas (Rothbarth, P-H., Groen, J., Bohnen, A.M., Groot, de R., & Osterhaus, A.D.M.E. Influenza virus serology-a comparative study [Serología de virus de influenza - un estudio comparativo]. J. of Virol. Methods 78, 163-169 (1999)) de envoltura rápida en varias líneas de células incluyendo células VERO, células de riñon de mono cynomolgus terciario (tMK) , células de pulmón endotelial humanas (HEL) así como células de riñon de perro (MDCK) . Muestran que presentan los efectos citofáticos (COE) después de dos o tres pasajes, y que fueron negativas en DIF, fueron probadas por ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA) utilizando anticuerpos específicos para yirus contra los tipos A, B y C de influenza y tipos A y B de hRSV, virus de sarampión, virus de paperas, tipos 1 a 4 (hPTV) , virus de sendai, tipo 5 de virus de simio, y virus de enfermedad de New Castle. Aún cuando para muchos casos el agente etiológico puede ser identificado, ciertas muestras fueron negativas para todos los virus probados . Ensayo de Inmunofluorescencia Directa (DIF) Muestras de aspirados nasofaríngeos provenientes de pacientes que padecen de RTI fueron utilizados para DIF y aislamiento de virus de conformidad con lo descrito. Muestras fueron almacenadas a una temperatura de -70°C. En resumen, aspirados nasofaríngeos fueron diluidos con 5 mi de MEM de Dulbecco (BioWhittaker, alkersville, MD) y mezclados completamente en una mezcladora de vórtice durante un minuto. La suspensión fue después centrifugada durante diez minutos a 840 x g. El sedimento fue extendido en una platina de puntos múltiples (Nutacon, Leimuiden, Los Países Bajos) , el sobrenadante fue utilizado para aislamiento viral. Después del secado, las células fueron fijadas en acetona durante 1 minuto a temperatura ambiente. Después del lavado, las platinas fueron incubadas durante 15 minutos a 37°C con antisueros específicos para virus marcados con FITC disponibles en el comercio como por ejemplo influenza A y B, hRSV y hPIV 1 a 3 (Dako, Glostrup, Dinamarca) . Después de tres lavados en PBS y uno en agua del grifo, las platinas fueron incubadas en una solución de glicerol/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, Reino Unido) y cubiertas. Las platinas fueron analizadas utilizando un microscopio de fluorescencia Axioscop (Cari Zeiss B.V, Weesp, Los Paises Bajos) . Aislamiento de virus Para aislamiento de virus, células tMK (RIVM, Bilthoven, Los Paises Bajos) fueron cultivadas en placas de 24 pozos que contenían platinas de vidrio (Costar, Cambridge, Reino Unido) , con el medio descrito abajo complementado con suero bovino fetal al 10% (BioWhittaker, Vervier, Bélgica) . Antes de la inoculación, las placas fueron lavadas con PBS y suministradas con MEM de Eagle con sal de Hanks (ICN, Costa mesa, CA) medio litro complementándose con 0.26 gramos de HaHC03, Hepes 0.025 (BioWhittaker), 2 mM de L-glutamina (BioWhittaker) , 100 unidades de penicilina, 100 µg de estreptomicina (BioWhittaker), 0.5 gramos de lactalbumina (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Los Países Bajos), 1.0 gramo de D-glucosa (Merck, Ámsterdam, Los Países Bajos), 5.0 gramos de peptona (Oxoid, Haarlem, Los Países Bajos) y 0.02% de tripsina (Life Technologies, Bethesda, MD) . Las placas fueron inoculadas con sobrenadante de las muestras de aspirados nasofaríngeos, 0.2 mi por pozo por triplicado, seguido por centrifugación a 8 0x g durante una hora. Después de la inoculación, las placas fueron incubadas a 37°C durante un máximo de 14 días cambiando el medio una vez por semana y el cultivo fue revisado diariamente para CPE. Después de 14 días, las células fueron raspadas del segundo pasaje e incubadas durante 14 días. Este paso fue repetido para el tercer pasaje. Las platinas de vidrio fueron utilizadas para demostrar la presencia del virus mediante IFA indirecto de conformidad con lo descrito abajo. Inmunización de animales Antisueros específicos para hurones y conejillos de la India para el virus recién descubierto fueron generados por infección intranasal experimental de dos hurones libres de patógenos específicos y dos conejillos de la India alojados en cajas de guante bajo presión separadas. Dos a tres semanas después todos los animales fueron sangrados por punción cardiaca, y sus sueros fueron utilizados como sueros de referencia. Los sueros fueron probados para todos los virus previamente descritos con IFA indirecto de conformidad con lo descrito abajo. Detección de antígeno por IFA indirecto Efectuamos IFA indirecto en platinas que contenían células tMK infectadas. Después de lavar con PBS, las platinas fueron incubadas durante 30 minutos a una temperatura de 37 °C con antisueros específicos para virus. Empleamos anticuerpos monoclonales en DIF contra influenza A, B y C, tipo 1 a 3 de hPIV y hRSV de conformidad con lo descrito arriba. Para el tipo 4 de hPIV, virus de paperas, virus de sarampión, virus de Sendai, tipo 5 de virus del simio, virus de enfermedad de New Castle, anticuerpos policlonales (RIVM) y sueros de referencia para hurones y conejillos de la India fueron utilizados. Después de tres lavados con PBS y un lavado con agua del grifo, las platinas fueron teñidas con un anticuerpo secundario dirigido contra los sueros utilizados en la primera incubación. Anticuerpos secundarios para los antisueros policlonales fueron anti-hurón de cabra (KPL, Guilford, Reino Unido, diluido 40 veces) , anti-conejo de ratón (Dako, Glostrup, Dinamarca, diluido 20 veces) , anti-pollo de conejo (KPL, diluido 20 veces) y anti-conej illo de la India de ratón (Dako, dilución 20 veces) . Las platinas fueron procesadas de conformidad con lo descrito para DIF. Detección de anticuerpos en seres humanos por IFA indirecto. Para la detección de anticuerpos específicos para virus, células tMK infectadas fueron fijadas con acetona fría en láminas, lavadas con PBS y teñidas con muestras de suero en una dilución de 1 a 16. Subsecuentemente, muestras obtenidas con anticuerpos antihumanos de conejo marcados con FITC diluidos 80 veces en PBS (Dako) . Platinas fueron procesadas de conformidad con lo descrito arriba. Cultivo viral de MPV Mono-capas sub-confluentes de células tMK en medio de conformidad con lo descrito arriba fueron inoculadas con sobrenadantes de muestras que presentaron CPE después de dos a tres pasajes ene las placas de 24 pozos. Cultivos fueron revisados para determinar CPE diariamente y el medio fue cambiado una vez por semana. Puesto que CPE presentó diferencias para cada aislado, todos los cultivos fueron probados el dia 12 a 14 con IFA indirecto utilizando anticuerpos de hurón contra el nuevo aislado viral. Cultivos positivos fueron congelados-descongelados tres veces después de lo cual los sobrenadantes fueron aclarados por centrifugación a baja velocidad, divididos en alícuotas y almacenados congelados a -70°C. Las dosis infecciosas de cultivo tisular al 50% (TCID50) de virus en los sobrenadantes de cultivo fueron determinadas de conformidad con lo descrito (Lennette, D.A. y colaboradores. En: Diagnostic procedures for viral, rlckettsial, and chlamydial infections. 7th ed. (eds. Lennette, E.H., Lennette, D.A. & Lennette, (E.T.) 3-25; 37-138; 431-463; 481-494; 539-563 (Asociación de salud pública American, Washington, 1995) ) . Ensayo de neutralización de virus Ensayos de VN fueron efectuados con diluciones dobles en serie de sueros humanos y animales empezando con una dilución óctuple. Sueros diluidos fueron incubados durante una hora con 100 TCID50 antes de la inoculación de células tMK cultivadas en placas de 96 pozos, después de lo cual las placas fueron centrifugadas a 840 x g. El medio fue cambiado después de tres y seis días y se llevó a cabo un IFA con anticuerpos de hurón contra MPV 8 días después de la inoculación. El titulo de VN fue definido como la dilución más baja de la muestra de suero que resulta en IFA negativo e inhibición de CPE en cultivos de células. Caracterización de virus Ensayos de hemaglutinación y pruebas de sensibilidad al cloroformo fueron efectuados de conformidad con lo descrito (Osterhaus, A.D.M.E., Yang, H. , Spijkers, H.E.M., Groen, J., Teppema, J.S. &van Steenis, G. The isolation and partial characterization of a highly pathogenic herpesvirus from the Harbor Seal (Phoca vitulina) [El aislamiento y caracterización parcial de un herpesvirus altamente patogénico a partir de la foca de puerto (Phoca vitulina) ] . Arch. of Virol. 86, 239-251 (1985), othbarth, P-H., Groen, J., Bohnen, A.M., Groot, de R., & Osterhaus, A.D.M.E. Influenza virus serology-a comparative study [Serologia de virus de influenza - un estudio comparativo]. J. of Virol. Methods 78, 163-169 (1999) ) . Para análisis de EM, el virus fue concentrado a partir de sobrenadantes de cultivo de células infectados en una micro-centrifugadora a una temperatura de 4°C a 17000 x g, después de lo cual la pella fue resuspendida en PBS y revisada por EM de contraste negativo. Para RAP-PCR, el virus fue concentrado a partir de sobrenadante de células tMK infectados por ultra-centrifugación en un cojín de sucrosa al 60% (durante 2 horas a 150000 x g, a 4°C) . La interfaz de sucrosa al 60% fue subsecuentemente diluida con PBS y formada en capas sobre un gradiente de sucrosa continuo de 20-60% que fue centrifugado durante 16 horas a 275000 x g a 4°C. Las fracciones de gradiente de sucrosa fueron revisadas para determinar la presencia de partículas de tipo virus por EM y electroforesis en gel de poliacrilamida por tinción con plata. Las aproximadamente 50% de fracciones de sucrosa que parecían contener nucleocápsides fueron utilizadas para aislamiento de ARN y RAP-PCR. Aislamiento de ARN El ARN fue aislado a partir del sobrenadante de cultivos de células infectadas o fracciones de gradientes de sucrosa utilizando un kit de Aislamiento de ARN altamente puro de conformidad con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Almere, Los Países Bajos) . RT-PCR Secuencias de oligonucleótidos específicas para virus para ensayos de RT-PCR paramixovirus conocidos se describen en el anexo 1. Se efectuó un análisis RT-PCR de un paso en reacciones de 50 µ? que contenían Tris.HCl 50 niM, pH 8.5, NaCl 50 mM, MgCl2 4 mM, ditiotreitol 2 mM, 200 uM cada uno de dNTP, 10 unidades de ARNsin recombinante (Promega, Leiden, Los Países Bajos), 10 unidades de AMV RT (Promega, Leiden, Los Países Bajos) , 5 unidades de Amplitaq Gold DNA polimerasa (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, Los Países Bajos) y 5 µ? ARN. Las condiciones de ciclo fueron: 45 minutos a 42°C y 7 minutos a 95°C una vez, 1 minutos 95°C, 2 minutos a 42°C y 3 minutos a 72°C repetido 40 veces y 10 minutos a 72°C una vez . RAP-PCR Se llevó a cabo un análisis RAP-PCR esencialmente de conformidad con lo descrito (Welsh, J., Chada, K. Dalal, S.S., Cheng, R., Ralph, D. & McClelland, M. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA [Determinación de huellas digitales de AR por Reacción en Cadena de Polimerasa cebada arbitrariamente]. NAR. 20, 4965-4970 (1992)). Las secuencias de oligonucleótidos se describen en el anexo 2. Para la reacción a RT, se utilizó 2 µ? de ARN en una reacción de 10 ul que contenia 10 ng/µ de oligonucleótido, ditiotreitol 10 M, 500 um cada uno de d TP, Tris-HCl 25 mM, pH 8.3, C1 75 mM y MgCl2 3 mM. La mezcla de al reacción fue incubada durante 5 minutos a una temperatura 70°C y 5 minutos a 37°C, después de lo cual 200 unidades de enzima Superscript RT (LifeTechnologies) se agregaron. La incubación a 37 °C prosiguió durante 55 minutos y la reacción terminó mediante incubación durante 5 minutos a 72 °C. La mezcla de RT fue diluida para proporcionar 50 µ? de reacción en cadena de polimerasa que contenia 8 ng/µ? de oligonucleótido, 300 um cada uno de dNTP, Tris-HCL 15 M, pH 8.3, KC1 65 mM, MgCl2 3.0 mM y 5 unidades de Taq DNA polimerasa (PE Biosystems) .
Las condiciones de ciclo fueron: 5 minutos a 94 °C, 5 minutos a 40°C y 1 minuto a 72°C una vez, seguido por 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 56°C y 1 minuto a 72°C repetido 40 veces y 5 minutos a 72 °C una vez. Después de RAP-PRC, 15 µ? de los productos RT-PCR fueron colocados lado a lado en un gel de agarosa NuSieve al 3% (FMC BioProducts, Heerhugowaard, Los Países Bajos) . Los fragmentos desplegados diferencialmente específicos para MPV fueron purificados a partir del gel con el kit de Extracción de Gel Qiaquick (Qiagen, Leusden, Los Países Bajos) y clonados en vector pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Los Países Bajos) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Análisis de secuencias Los productos de RAP-PCR clonados en el vector pCR2.1 (Invitrogen) fueron secuenciados con oligonucleótidos específicos para M13. Fragmentos de M obtenidos por RT-PCR fueron purificados a partir de geles de agarosa empleando el kit de Extracción de Gel Qiaquick (Qiagen, Leusden, Los Países Bajos), y secuenciados directamente con los mismos oligonucleótidos utilizados para reacción en cadena de polimerasa. 7Análisis de secuencias fueron efectuados utilizando un kit de secuenciamiento de terminador ET Dyenamic (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Los Países Bajos) y un secuenciador de ADN automático 7ABI 373 (PE Biosystem) . Todas las técnicas fueron efectuadas de conformidad con las instrucciones del fabricante. Generación de fragmentos genómicos de MPV por RT-PCR Para generar fragmentos por reacción en cadena de polimerasa que abarcan los espacios A, B y C entre los fragmentos RAP-PCR (figura 2) emplea ensayos de RT-PCR de conformidad con lo descrito arriba en AR aislado a partir del aislado de virus 00-1. Se utilizaron los cebadores siguientes: Para el fragmento A: TR1 diseñado en el líder: (5 ' -AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3 ' ) y NI diseñado en el extremo 5' de los fragmentos de RAP-PCR obtenidas en N (5-CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3 ' ) Para el fragmento B: N2 es diseñado en el extremo 5' de los fragmentos de RAP-PCR obtenidos en N: (5 '-CATGCAAGCTTATGGGGC-3') y MI diseñado en el extremo 3' de los fragmentos de RAP-PCR obtenidos en M: (5 ' -CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3 ' ) . Para el fragmento C:M2 diseñado en el extremos 5' de fragmentos de RAP-PCR obtenido en M: (5 ' -GTAGAACTAGGAGCATATG-3') y Fl diseñado en el extremo 3' de los fragmentos RAP-PCR obtenidos en F: (5 '-TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3 ' ) . Los fragmentos fueron purificados a partir del gel, clonados y secuenciados de conformidad con lo descrito antes. RT-PCR para diagnosticar MPV. Para la amplificación y secuenciamiento de partes de los ORFs N, M, F y L de nueve de los aislados de MPV, empleamos los cebadores N3 (5' -GCACTCAAGAGATACCCTAG-3' ) y N4 (5r -AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3' ) , amplificando un fragmento de 151 nucleótidos, M3 (5f -CCCTGACAATAACCACTCTG-3' ) y M4 (5f -GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3'' ) amplificando un fragmento de 252 nucleótidos, F7 (5' -TGCACTATCTCCTCTTGGGGCTTTG-3' ) y F8 (5f -TCAAAGCTGCTTGACACTGGCC-3' ) amplificando un fragmento de 221 nucleótidos y L6 (5' -CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3' ) y L7 (5' -CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3' ) amplificando un fragmento de 173 nucleótidos, respectivamente. Se efectuaron RT-PCR, purificación en gel y secuenciamiento directo de conformidad con lo descrito arriba. Además, las sondas utilizadas fueron: Sonda utilizada en M: 5'-TGC TTG TAC TTC CCA AAG-3' Sonda utilizada en N: 5'-TAT TTG AAC AAA AAG TGT-3' Sonda utilizada en L: 5' -TGGTGTGGGATATTAACAG-3' Análisis filogenéticos Para todos los árboles filogenéticos, secuencias de ADN fueron alineadas empleando el paquete de programática ClustalW y se generaron árboles de máxima probabilidad utilizando el paquete de programática DNA-ML del programa Phylip 3.5 utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) (Brandenburg, A.H. Groen, J., van Steensel-Moll, H.A., Claas, E.J.C., Rothbarth, P.H., Neijens, H.J. & Osterhaus, A.D.M.E. Respiratory syncytial virus specific serum antibodies in infants under six months of age: limited serological response upon infection [Anticuerpos séricos específicos para virus sincitial respiratorio en infantes de menos de seis meses de edad: repuesta serológica limitada al ocurrir una infección] . J. Mee. Virol. 52, 97-104 (1997)). Secuencias previamente publicadas que fueron utilizadas para la generación de árboles filogenéticos están disponibles en Genbank bajo los números de acceso: Para todos los ORFs: RSV: NC001781; hRSV:NC001989; Para el ORF F: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; Para el ORF N; PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B U39296; APV-C, AF176590; Para el ORF M; PMV, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; Para el ORF P: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. Análisis filogenéticos para los nueve aislados de virus diferentes de MPV fueron efectuados con la cepa C de APV como grupo externo . Abreviaturas utilizadas en las figuras: hRSV: RSV humano; bRSV; RSV bovino; PVM: virus de neumonía de ratón; APV-A, B y C: tipo A, B y C de neumovirus de las aves. Ejemplos de métodos para identificar MPV Recolección de Muestras Con el objeto de encontrar aislados de virus, aspirados nasofaríngeos, torundas tomadas de garganta y nasales, lavados bronquio-alveolares de preferencia de mamíferos, por ejemplo seres humanos, carnívoros (perros, gatos, mustélidos, focas, etc.), caballos, rumiantes (ganado, ovejas, cabras, etc.), cerdos, conejos, aves (pollos, avestruces, etc.) deben examinarse- Se puede examinar también a partir de torundas tomadas de cloaca de aves y excrementos . Sueros deben ser recogidos para ensayos i munológicos, como por ejemplo ELISA y ensayos de neutralización de virus. Muestra de virus recogidas fueron diluidas con 5 mi de medio MEM de Dulbecco (BioWhittaker, Walkersville, MD) y mezclado totalmente en una mezcladora de vórtice durante 1 minuto. La suspensión fue asi centrifugada durante 10 minutos a 840 x g. El sedimento fue extendido en una platina de puntos múltiples (Nutacon, Leimuiden, Los Países Bajos) para técnicas de inmunofluorescencia, y el sobrenadante fue utilizado para aislamiento de virus. Aislamiento de virus Para aislamiento de virus, células tMK (RIVM, Bilthoven, Los Países Bajos) fueron cultivadas en placas de 24 pozos que contenían platinas de vidrio (Costar, Cambridge, Reino Unido) , con el medio descrito abajo complementado con suero bovino fetal (BioWhittaker, Vervier, Bélgica) . Antes de la inoculación, las placas fueron lavadas con PBS y suministradas con MEM de Eagle con sal de Hanks (ICN, Costa mesa, CA) complementada con 0.52/litro gramo de NaHCC>3, 0.025 M de Hepes (Biowhittaker) , 2 mM L-glutamina (Biowhittaker) , 200 unidades/litro de penicilina, 200 pg/litro de estreptomicina (Biowhittaker) , 1 gramo/litro de lactalbumina (Sigma-Aldrich, Swijndrecht, Los Países Bajos), 2.0 gramos/litro de D-glucosa (Merck, Ámsterdam, Los Países Bajos), 10 gramos/litro de peptona (Oxoid, Haarlem, Los Países Bajos) y 0.02% de tripsina (Life Technologies, Bethesda, MD) . Las placas fueron inoculadas con sobrenadante de las muestras de aspirado nasofaríngeo, 0.2 mi por pozo por triplicado, seguido por centrifugación a 840 xg durante 1 hora. Después de la inoculación, las placas fueron incubadas a una temperatura de 37°C durante un máximo de 14 días cambiando el medio una vez por semana y los cultivos fueron revisados diariamente para CPE. Después de 14 días, las células fueron raspadas del segundo pasaje e incubadas durante 14 días adicionales. Este paso fue repetido para el tercer pasaje. Las platinas de vidrio fueron utilizadas para demostrar la presencia de virus por IFA indirecto de conformidad con lo descrito abajo. Se observó generalmente CPE después del tercer pasaje, el día 8 al 14 según el aislado. El CPE fue virtualmente indistinguible del causado por hRSV o hPIV en cultivos de células tMK u otros cultivos de células. Sin embargo, hRSV induce el inicio de CPE alrededor del día 4. CPE fue caracterizado por la formación de sincitio después de lo cual las células presentaron un trastorno interno rápido, seguido por desprendimiento de células de la monocapa. En el caso de algunos aislados, fue difícil observar CPE, y se utilizó IFA para confirmar la presencia del virus en estos cultivos .
Cultivo de virus de MPV Monocapas sub-confluentes de células tMK en medios de conformidad con lo descrito arriba fueron inoculadas con sobrenadantes de muestras que presentaron CPE después de dos o tres pasajes en placas de 24 pozos. Los cultivos fueron revisados para CPE diariamente y el medio fue cambiado una vez por semana. Puesto que CPE presenta diferencia para cada aislado, todos los cultivos fueron probados el día 12 a 14 con IFA indirecto utilizando anticuerpos de hurón contra el nuevo aislado de virus. Cultivos positivos fueron congelados-descongelados tres veces después de lo cual los sobrenadantes fueron aclarados por centrifugación a baja velocidad, formados en alícuotas y almacenados congelados a una temperatura de -70°C. Las dosis infecciosas de cultivo tisular a 50% de (TCID50) de virus en los sobrenadantes de cultivo fueron determinadas siguiendo técnicas establecidas empleadas en este campo (Lennette, D.A. y colaboradores. En: Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections. 7h ed. (eds. Lennette, E.H., Lennette, D.A. & Lennette, (E.T.) 3-25; 37-138; 431-463; 481-494; 539-563 (Asociación de salud pública American, Washington, 1995) ) . Caracterización de Virus Ensayos de hemaglutinación y pruebas de sensibilidad al cloroformo fueron efectuados siguiendo técnicas bien establecidas y descritas utilizadas en el ámbito (Rothbarth, P-H., Groen,. J. , Bohnen, A.M., Groot, de R., & Osterhaus, A.D.M.E. Influenza virus serology-a comparative study [Serologia de virus de influenza - un estudio comparativo] . J. of Virol. Methods 78, 163-169 (1999)). En el caso de análisis de EM, el virus fue concentrado a partir de sobrenadantes de cultivo de células transíectadas en una microcentrifugadora a una temperatura de 4°C a 17000 x g, después de lo cual la pella fue resuspendida en PBS e inspeccionada por EM de contraste negativo. Detección de antlgeno por IFA indirecto Muestras recogidas fueron procesadas de conformidad con lo descrito y el sedimento de las muestras fue extendido en una platina de puntos múltiples. Después del secado, las células fueron fijadas en acetona durante 1 minuto a temperatura ambiente. Alternativamente, el virus fue cultivado en células tMK en platinas de 24 pozos que contenían platinas de vidrio. Estas platinas de vidrio fueron lavadas con PBS y fijadas en acetona durante 1 minuto a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, las platinas fueron incubadas durante 30 minutos a una temperatura de 37°C con anticuerpos policlonales en una dilución de 1:50 a 1:100 en PBS. Empleamos hurones inmunizados y conejillos de la India para obtener anticuerpos policlonales, pero estos anticuerpos pueden ser preparados en varios animales, y la dilución de trabajo de anticuerpo policlonal puede variar para cada inmunización. Después de tres lavados con PBS y un lavado con agua del grifo, las platinas fueron incubadas a una temperatura de 37 °C durante 30 minutos con anticuerpos de cabra anti-hurón marcados con FITC (KPL, Guilford, Reino Unido, diluido 40 veces) . Después de tres lavados en PBS y una vez en agua del grifo, las platinas fueron incubadas en una solución de glicerol/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, Reino Unido) y cubiertas. Las platinas fueron analizadas utilizando un microscopio de fluorescencia i¾xiscop (Cari Zeiss B.V., Weesp, Los Países Bajos). Detección de anticuerpos en seres humanos, mamíferos, rumiantes y otros animales por IFA indirecto Para la detección de anticuerpos específicos para virus, células tMK infectadas con MPV fueron fijadas con acetona en láminas (de conformidad con lo descrito arriba) , lavadas con PBS e incubadas durante 30 minutos a una temperatura de 37°C con muestras de suero en una dilución de 1 a 16. Después de dos lavados con PBS y un lavado con agua del grifo, las platinas fueron incubadas durante 30 minutos a una temperatura de 37°C con anticuerpos secundarios marcados con FITC para la especie utilizada (Dako) . Las platinas fueron procesadas de conformidad con lo descrito arriba. Anticuerpos pueden ser marcados directamente con colorante fluorescente, lo que resulta en un ensayo de inmunofluorescencia directa. FITC puede estar reemplazado por cualquier colorante fluorescente. Inmunización de animales Antisueros específicos para hurones y conejillos de la India para el virus recién descubierto fueron generados por infección intranasal experimental de dos hurones libres de patógenos especificós y dos conejillos de la India, alojados en cajas de guante bajo presión separadas. De dos a tres semanas después los animales fueron sangrados por punción cardiaca y sus sueros fueron utilizados como sueros de referencia. Los sueros fueron probados para todos los virus previamente descritos con IFA indirecto de conformidad con lo descrito abajo. Otras especies de animales son también adecuadas para la generación de preparaciones de anticuerpos específicos y otras preparaciones de antígenos pueden emplearse . Ensayo de neutralización de virus (ensayo de VN) Ensayos de VN fueron efectuados . con diluciones dobles de sueros humanos y animales empezando en una dilución de ocho veces. Sueros diluidos fueron incubados durante 1 hora con 100 TCID50 de virus antes de inoculación de células tM cultivadas en placas de 96 pozos, después de lo cual las placas fueron centrifugadas a 840 x g. Se utilizó el mismo medio de cultivo que lo descrito arriba. El medio fue cambiado después de tres a seis días y después de 8 días se efectuó IFA (véase arriba) . El titulo de VN fue definido como la dilución más baja de la muestra de suero que resulta en un IFA negativo y una inhibición de CPE en cultivos de células. Aislamiento de ARN El ARN fue aislado a partir del sobrenadante de cultivos de células infectadas o bien fracciones de gradiente de sucrosa utilizando un kit de Aislamiento de High Puré ARN de conformidad con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Almere, Los Países Bajos) . El ARN puede también ser aislado siguiendo otros procedimientos conocidos en la técnica (Current Protocols in Molecular Biology) . RT-PCR Se llevó a cabo una RT-PCR de un paso en reacciones de 50 µ? que contenían 50 mM de Tris.HCl pH 8.5, 50 mM de NaC, 4 inM de MgCl2, 2 mM de ditiotreitol, 200 uM de dNTP, 10 unidades de RNAsin recombinante (Promega, Leiden, Los Países Bajos), 10 unidades de AMV RT (Promega, Leiden, Los Países Bajos), 5 unidades de Amplitaq Gold DNA polimerasa (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijseel, Los Países Bajos) y 5 µ? de ARN. La condiciones de los ciclos fueron 45 minutos a 42°C y 7 minutos a 95°C una vez, 1 minuto a 95°C, 2 minutos a 42°C y 3 minutos a 72°C repitiéndose 40 veces y 10 minutos a 72°C una vez . Cebadores utilizados para reacción en cadena de polimerasa de diagnóstico: En la nucleoproteína: N3 (5' -GCACTCAAGAGATACCCTAG-3' ) y N4 (5' -AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3' ) , que amplifica un fragmento de 151 nucleótidos. En la proteina de matriz: M3 (5' -CCCTGACAATAACCACTCTG-3' ) y M4 (5' -GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3' ) que amplifica un fragmento de 252 nucleótidos. En la proteina de polimerasa: L6 (5' -CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3r ) y L7 (5' -CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3' ) que amplifica un fragmento de 173 nucleótidos. Otros cebadores pueden ser diseñados con base en las secuencias MPV y diferentes amortiguadores y condiciones de ensayo pueden utilizarse para propósitos específicos. Análisis de secuencia Se efectuaron análisis de secuencia utilizando un kit de secuenciamiento de terminador Dyenamic ET (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Los Países Bajos) y un secuenciador de ADN automático ABI 373 (PE Biosystem) . Todas las técnicas fueron efectuadas de conformidad con las instrucciones del fabricante. Fragmentos de reacción en cadena de polimerasa fueron secuenciados directamente con los mismos oligonucleótidos utilizados para PCR, o bien los fragmentos fueron purificados a partir del gel con Quiaquick Gel Extraction kit (Quiagen, Leusden, Los Países Bajos) y clonados en vector pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Los Países Bajos) de conformidad con las instrucciones del fabricante y subsecuentemente secuenciados con oligonucleótidos específicos para M13. Oligonucleótidos utilizados para analizar el extremo 3 ' del genoma (ausencia de NS1/NS2) . El cebador TRi (5'AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3' ) fue diseñado con base en las secuencias trasera y líder para hRSV y APV, publicadas por Randhawa (1997) y el cebador NI (CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3 ' ) fue diseñado con base en las secuencias obtenidas en la proteína n. El ensayo RT-PCR y el secuenciamiento fueron efectuados de conformidad con lo descrito arriba. La reacción RT-PCR proporcionó un producto de aproximadamente 500 pares de bases que es demasiado pequeña para contener la información para dos ORFS, y la traducción de estas secuencias no reveló un ORF. Detección de anticuerpos en seres humanos, mamíferos/ rumiantes u otros animales por ELISA En Paramyxovirídae, la proteína N es la proteína más abundante y la respuesta inmune a esta proteína ocurre temprano en la infección. Por estas razones, una fuente recombinantes de las proteínas N se utiliza de preferencia para desarrollar un ensayo de ELISA para detección de anticuerpos para MPV. Antígenos adecuados para la detección de anticuerpos incluyen cualquier proteína de MPV que se combina con cualquier anticuerpo específico para MPV de un paciente expuesto a virus MPV o infectado por un virus de MPV. Antígenos preferidos de la invención incluyen los antígenos que engendran predominantes la respuesta inmune en pacientes expuestos a MPV, que son por consiguiente tipicamente reconocidos más fácilmente por los anticuerpos de un paciente. Antigenos particularmente preferidos incluyen las proteínas N, F y G de MPV. Antígenos utilizados para técnicas inmunológicas pueden ser antígenos nativos o bien pueden ser versiones modificadas de los mismos. Técnicas bien conocidas de biología molecular pueden ser utilizadas para alterar la secuencia de aminoácidos de un antígeno para MPV para producir versiones modificadas de antígeno que pueden utilizarse en técnicas inmunológicas. Métodos para la clonación de genes, para manipular los genes hacia vectores de expresión y a partir de vectores de expresión y para expresar la proteína codificada por el gen e un huésped heterólogo son bien conocidas, y estas técnicas pueden ser utilizadas para proporcionar los vectores de expresión, células huéspedes y para expresar genes clonados que codifican antígenos en un huésped para producir antígenos recombinantes para su uso en ensayos de diagnóstico. Véase, por ejemplo: Molecular Cloning, A labozatory Manual [Clonación Molecular, un manual de laboratorio] y Current protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular] . Varios sistemas de expresión pueden ser utilizados para producir antígenos para MPV. Por ejemplo, varios vectores de expresión adecuados para producir proteínas en E. colir B. subtilis, levadura, células de insecto y células de mamífero han sido descritos, cualquiera de ellos puede ser utilizado para producir un antígeno para MPV adecuado para detectar anticuerpos anti-MPV en pacientes expuestos. El sistema de expresión de baculovirus tiene la ventaja de proporcionar un procesamiento necesario de proteínas y por consiguiente es preferido. El sistema utiliza el promotor de polihedrina para la expresión directa de antígenos de MPV. (Matsuura y colaboradores, 1987, J. Gen. Virol. 68:1233-1250) . Antígenos producidos por baculovirus recombinantes pueden emplearse en varios ensayos inmunológicos para detectar anticuerpos anti-MPV en un paciente. Se sabe que antígenos recombinantes pueden ser utilizados en lugar de virus natural en prácticamente cualquier ensayo inmunológico para detectar anticuerpos específicos para virus. Los ensayos incluyen ensayos directos e indirectos, ensayos emparedados, ensayos en fase sólida tales como los que utilizan placas o perlas entres otros, y ensayos en fase líquida. Ensayos adecuados incluyen los ensayos que utilizan anticuerpos primarios y secundarios, y los que utilizan reactivos de unión con anticuerpos tales como proteína A. Además, varios métodos de detección pueden ser utilizados en la invención, incluyendo métodos calorimétricos fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes, luminiscentes y radioactivos. Ejemplo 1 de EIA indirecto anti IgG de MPV utilizando proteina N recombinante Un EIA indirecto IgG utilizando una proteina N recombinante (producida con baculovirus recombinante en células de insecto (Sf9) como antigeno puede efectuarse. Para la preparación de antígenos, células Sf9 son infectadas con el baculovirus recombinante y cosechadas de 3 a 7 días después de la infección. La suspensión de células es lavada dos veces en PBS, pH 7.2, ajustada a una densidad de células de 5.0 X 10° células/ml, y congelada-descongelada tres veces. Residuos celulares grandes son formadas en pellas por centrifugación a baja velocidad (500 x g durante 15 minutos) y el sobrenadante es recogido y almacenado a una temperatura de -70° C hasta su uso. Células no infectadas son procesadas de manera similar para antigeno de control negativo. Se utilizan 100 µ? de un lisado de congelación-descongelación para recubrir placas de microtitulación, en divisiones dentro de un rango de 1:50 a 1:1000. Se trata un lisado de células no infectadas en pozos por duplicado el cuál sirve como control negativo. Después de la incubación durante la noche, las placas son lavadas dos veces con PBS/Tween al 0.05%. Sueros de prueba son divididos 1:50 a 1:2:00 en amortiguador de ELISA (PBS, suplementado al 2% con sueros de cabra normales y con albúmina sérica bovina al 0.55 y leche al 0.1%, seguido por incubación en pozos durante 1 hora a 37° C. Placas son lavadas dos veces con PBS/Tween 0.05%. Peroxidasa de rábano agrio son marcadas con IgG antihumana de cabra (o bien contra otras especies), diluida 1:3000 a 1:5000 en amortiguador de ELISA, agregada a pozos e incubadas durante 1 hora a 37° C. Las placas son después lavadas dos veces con PBS/Tween al 0.05% y una vez con agua del grifo, incubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con el sustrato de enzima TMB, 3, 3 ',5, 5' tetrametilbencidina, como lo obtenido de Sigma, y la reacción es detenida con 100 µ? de ácido fosfórico 2 M. Lecturas calorimétricas son medidas a 450 nm utilizando un lector de placas de microtitulación automatizado . Ejemplo 2: EIA de captura de IgM anti-MPV utilizando una nucleoproteina recombinantes . Un EIA de captura de IgM utilizando la nucleoproteina recombinante o cualquier otra proteina recombinante como antigeno puede efectuarse mediante la modificación de ensayos previamente descritos por Erdman y colaboradores (190) J. Clin. Microb. 29:1466-1471. Un anticuerpo de captura de IgM anti-humano purificado por afinidad (o bien contra otras especies), por ejemplo lo obtenida en Dako, se agrega a pozos de una placa de microtitulación en una concentración de 250 ng por pozo en amortiguador de carbonato 0.1 , pH 9.6. Después de incubación durante una noche a temperatura ambiente, las placas son lavadas con veces con PBS/Tween al 0.05%. Se agrega 100 µ? de suero de prueba diluido 1:200 a 1:1000 en amortiguador de ELISA a pozos por triplicado y se incuban durante 1 hora a una temperatura de 37° C. Las placas son después lavadas dos veces con PBS/Tween al 0.05%. El lisado de células Sf21 congelado/descongelado (infectado con virus recombinante) es diluido 1:100 a 1:500 en amortiguador de ELISA y se agrega a los pozos se incuba durante 2 horas a una temperatura de 37° C. El lisado de células no infectadas sirve como control negativo y es efectuado en pozos por duplicado. Las placas son después lavadas tres veces en PBS/Tween al 0.05% e incubadas durante 1 hora a una temperatura de 37° C con 100 µ? de anticuerpo adicional contra MPV en una dilución óptima en amortiguador de ELISA. Después de 2 lavados con PBS/Tween al 0.05%, las placas son incubadas con anticuerpo secundario marcado con peróxido de rábano agrio (por ejemplo anti-hurón de cone o) , y las placas son incubadas durante 20 minutos a una temperatura de 37° C. Las placas son después lavadas cinco veces en PBS/Tween al 0.05%, incubadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con el sustrato de enzima (TMB, 3, 3 ',5 ',5' tetrametilbencidina, como se puede obtener por ejemplo en "Sigma", y la reacción es detenida con 100 µ? de ácido fosfórico 2 M. Lecturas colorimétricas son medidas a 450 nía utilizando un vector de placa de microtitulación automatizado. Las sensibilidades del EIAs de captura de IgM utilizando la nucleoproteína recombinantes (o bien otra proteína recombinante) y virus MPV entero se comparan utilizando pares de sueros de fase aguda y fase de convalecencia provenientes de personas con infección clínica por virus de MPV. La especificidad de la EIA de captura de nucleoproteína recombinantes es determinada por prueba de muestra de suero de personas sanas y personas con otras infecciones de paramixovirus . Potencial para EIAs para utilizar proteínas de fusión de MPV recombinantes y glicoproteínas producidas por la expresión de baculovirus . Las glicoproteínas G y F son dos glicoproteínas de envoltura de transmembrana del virion MPV y representan los antígenos mayores de neutralización y protección. La expresión de estas glicoproteínas en un sistema de virus de vector, por ejemplo un sistema de baculovirus proporciona una fuente de antígenos recombinantes para su uso ensayos para detectar anticuerpos específicos para MPV. Además, su uso en combinación con la nucleoproteína, por ejemplo, incrementa adicionalmente la sensibilidad de los inmunoensayos de enzima en la detección de anticuerpos contra MPV. Varios otros ensayos inmunológicos (Current Protocols in Immunology [Protocolos actuales en Inmunología] ) pueden utilizarse como métodos alternativos a los descritos aquí. Con el objeto de encontrar aislados virales, aspirados nasofaríngeos, torundas tomadas de garganta y nariz, lavados bronqueo alveolares y torundas tomadas de garganta de preferencia de seres humanos, carnívoros (perros, gatos, focas, etc.), caballos, rumiantes (ganado, ovejas, cabras, etc.), cerdos, conejos, aves, (polvos, avestruces, etc.) pueden examinarse, sin limitarse a estos ejemplos. A partir de aves se pueden examinar también torundas tomadas de cloaca e intestinales así como excrementos. Para todas las muestras, se puede efectuar técnicas de serología (detección de anticuerpos y antígenos, etc.), aislamiento viral y técnicas de detección de ácido nucleico para detectar un virus. Anticuerpos monoclonales pueden ser generados mediante la inmunización de ratones (o bien otros animales) con MPV purificado o parte del mismo (proteínas, péptidos) y utilizando subsecuentemente tecnología de hibridoma establecida (Current Protocols in Immunology [Protocolos Actuales en Inmunología] ) . Alternativamente se puede utilizar una tecnología de despliegue de fagos para este propósito (Current Protocols in Immunology [Protocolos Actuales en Inmunología] ) . De manera similar, anticuerpos policlonales pueden ser obtenidos a partir de seres humanos a animales infectados, o bien a partir de seres humanos o animales inmunizados ( (Current Protocols in Immunology [Protocolos Actuales en Inmunología] ) . La detección de la presencia o ausencia de proteínas de NSl y NS2 puede también efectuarse utilizando análisis wester-blot, IFA; técnicas de inmuno precipitación utilizando varias preparaciones de anticuerpo. La detección de la presencia o ausencia de genes NSl y NS2 u homólogos de los mismos en aislados virales puede efectuarse utilizando reacción en cadena de polimerasa con un primer conjunto diseñado con base en genes NSl y/o NS2 conocidos asi como con varias técnicas de hibridación de ácido nucleico.
Para determinar si genes NSl y NS2 están presentes en el extremo 3' del genoma viral, se puede efectuar una reacción en cadena de polimerasa con cebadores específicos para este extremo 3' del genoma. En nuestro caso, utilizamos un cebador específicos para la región no traducida 3' del genoma viral un cebador en el ORF de N. Otros cebadores pueden ser diseñados para el mismo propósito. La ausencia de genes NS1/NS2 es revelada por la longitud y/o la secuencia ce nucleótidos del producto de reacción en cadena de polimerasa. Cebadores específicos para genes NSl y/o NS2 pueden ser utilizados en combinación con cebadores específicos para las demás partes del extremo 3' del genoma viral (por ejemplo la región no traducida o ORFs de N, M o F) para permitir una identificación positiva de la presencia de genes NS1 o NS2. Además de reacción en cadena de polimerasa, varias técnicas, por ejemplo clonación molecular, hibridación de ácido nucleico, puede emplearse para el mismo propósito. Ejemplo 3: Serotipos/subgrupos de MPV.
Dos grupos genéticos potenciales son identificados por análisis de secuencias parciales de nucleótidos en los ORFs de N, M y F de 9 aislados virales. Se observó una identidad de nucleótidos de 90-100% dentro de un grupo, y una identidad de 81-88% se observó entre los grupos. La información de secuencias obtenida en más aislados virales confirmó la existencia de dos genotipos. El aislado viral ned/00/01 como prototipo de grupo A, y el aislado viral ned/99/01 como prototipo del grupo B han sido utilizados ensayos de neutralización cruzada para probar si los genotipos están relacionados con serotipos o subgrupos diferentes. Resultados Utilizando ensayos RT-PCR con cebadores ubicados en el gen de polimerasa, identificamos 30 aislados virales adicionales a partir de muestras de aspirado' nasofaringes . La información de secuencia de partes de los genes de matriz de polimerasa de estos nuevos aislados junto con las de los nueve aislados previos fueron utilizados para construir árboles filogenéticos (Figura 16) . El análisis de estos árboles confirmo la presencia de dos grupos genéticos, con el aislado de virus ned/00/00-1 como el virus prototipo en el grupo A y el aislado viral ned/99/01 como el virus prototipo en el grupo B. La identidad de secuencias de nucleótidos dentro de un grupo fue de más del 92%, mientras que entre los grupos la identidad fue de 81-85%.
Los aislados virales ned/00/01 y ned/99/01 han sido utilizados para inocular hurones para preparar antisueros específicos para virus. Estos antisueros fueron utilizados en ensayos de neutralización de virus con ambos virus. Tabla 3: Titulo de neutralización de virus Aislado 00-1 Aislado 99-1 Presuero de 2 2 Hurón A (00-1) hurón A 64 2 22 dpi (00-1) presuero de 2 2 hurón B (99-1) hurón B 4 64 22 dpi (99-1) Para el aislado 00-1, el titulo difiere 32 veces (64/2) Para el aislado 99-1, el titulo difiere 16 veces (64/4) Además, 6 conejillos de la India han sido inoculados con cualquiera de los virus (ned/00/01 y ned/99/01) . Ensayos de RT-PCR sobre muestras de aspirado nasofaríngeos mostraron una replicación viral desde el día 2 hasta el día 10 después de la infección. Para el día 70 después de la infección, los conejillos de la India han sido retados ya sea con el virus homólogo o bien con el virus heterologo y en todos los cuatro casos se observó una replicación viral. Tabla 4 Infección replicación Infección Primaria de virus secundaria Conejillos de la 00-1 2 de 3 99-1 India 1-3 Conejillos de la 00-1 3 de 3 00-1 India 4-6 Conejillos de la 99-1 3 de 3 00-1 India 7-9 Conejillos de la 99-1 3 de 3 99-1 India (10-12) (continuación de la tabla 4) Replicación de Virus Conejillos de la 1 de 2 India 1-3 Conejillos de la 1 de 3 India 4-6 Conejillos de la 2 de 2 India 7-9 Conejillos de la 1 de 3 India (10-12) nota: para la infección secundaria, los conejillos de la India 2 y 9 ya no estaban ahí. Ensayos de neutralización de virus con anti sueros después del primer reto presentaron esencialmente los mismos resultados que en los ensayos de YN efectuados con los hurones (diferencia mayor de 16 veces en cuanto a titulo de VN) . Los resultados presentados en este ejemplo confirman la existencia de dos genotipos que corresponden a dos serotipos de MPV y muestran la posibilidad de infección repetida con virus heterologo y homólogo. Ejemplo 4: Determinación de secuencias adicionales Este ejemplo describe el análisis adicional de las secuencias de marcos de lectura -abiertos (ORFs) de MPV y secuencias intergénicas así como secuencias parciales de los extremos genómicos . Análisis de secuencias del gen (N) de nucleoproteína, (0) de fosfoproteína, (M) de proteína de matriz y (F) proteína de fusión de MPV revelaron el grado más alto de homología de secuencias con el serotipo C de APV, el pneumovirus de las aves encontrado primariamente en aves en los Estados Unidos de América. Estos análisis mostraron también la ausencia de proteínas NS1 y NS2 no estructurales en el extremo 3' del genoma viral y la colocación de la proteína de fusión inmediatamente adyacente a la proteína de matriz. Aquí presentamos las secuencias de genes de proteína 22K (M2) , pequeña proteína hidrofóbica (SH) , proteína de fijación (G) y proteína de polimerasa (L) , las regiones intergénicas y la secuencia trasera. En combinación con las secuencias descritas previamente, las secuencias presentadas aquí completan la secuencia genómica de MPV a excepción de los nucleótidos de extremo 12-15 de los extremos genómicos y establecen la organización genómica de MPV. Comparaciones lado a lado de las secuencias del genoma de MPV con las secuencias de los subtipos , B y C de APV, subtipos A y B de RSV, PVM y otros paramixovirus proporcionan evidencia fuerte para la clasificación de MPV en el género Metapneumovirus. Referencias adicionales utilizadas con el Ejemplo 4 AHMADIAN, G., CHAMBERS, P., and EASTON, A.J. (1999). Detection and characterisation of proteins encoded by the second ORF of the M2 gene of pneumoviruses [Detección y caracterización de proteínas codificadas por el segundo ORF del gen M2 de pneumovirus] . J. Gen Virol 80, 2011-6.
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Resultados Estrategia de secuencias El aislado 00-1 de MPV (van den Hoogen y colaboradores 2001) fue propagado en células terciarias de riñon de mono (tMK) y ARN aisladas a partir del sobrenadante 3 semanas después de la inoculación fue utilizado como templado para análisis RT-PCR. Cebadores fueron diseñados con base en la información de secuencia parcial disponible para MPV 00-1 (van den Hoogen y colaboradores) asi como las secuencias líder y trasera de APV y RSV (Randhawa y colaboradores, 1997; Mink y colaboradores, 1991) . Inioralmente, fragmentos entre los productos previamente obtenidos, con un tamaño dentro de un rango de 500 pares de bases a 4 kilobases de longitud, fueron generados por amplificación por RT-PCR y secuenciados directamente. La secuencia genómica es subsecuentemente confirmada mediante la generación de la serie de fragmentos de RT-PCR que se empalman ubicándose dentro de un rango de tamaño de 500 a 800 pares de bases que representaron todo el genoma de MPV. Para todos los fragmentos de reacción en cadena de polimerasa, ambas cadenas fueron secuenciadas directamente para minimizar los errores de amplificación y secuenciamiento . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos fueron utilizadas para buscar homologías con secuencias en la base de datos Genbank utilizando al programática BLAST (www.ncbi .nlm.nih. gov/BLAST) . Los nombres de las proteínas fueron asignados a marcos de lectura abiertos (ORFs) con base en homología con genes virales conocidos así como su ubicación en el genoma. Con base en esta información, se construyó un mapa genómico para MPV (Figura 7) . El genoma de MPV es de 13378 nucleótidos de longitud y su organización es similar a la organización genómica de APV. A continuación presentamos la comparación entre los ORFs y las secuencias no codificadores de MPV y las de otros paramixovirus y comentamos las importantes similitudes y diferencias. El gen de nucleoproteína (N) Como se muestra, el primer gen del mapa genómico de MPV codifica para una proteína de 394 aminoácidos (aa) y muestra una homología extensa con la proteína N de otros pneumovirus. La longitud del ORF de N es idéntica a la longitud de ORF de N de APV-C (Tabla 5) y es menor que las longitudes de ORF de N de otros paramixovirus (Barr y colaboradores, 1991) . Un análisis de la secuencia de aminoácidos reveló la mayor homología con APV-C (88%) , y una homología de solamente 7-11% con otros paramixovirus (Tabla 6) . Barr y colaboradores (1991) identificaron 3 regiones de similitud entre virus que pertenecen al orden Monomegavirales : A, B y C (Figura 8) . Aún cuando las similaridades son mayores dentro de una familia de virus, estas regiones son altamente conservadas entre familias de virus . En todas las tres regiones MPV reveló una identidad de secuencia de aminoácidos del 97% con APV-C, una identidad de secuencias de aminoácidos del 89% con APV-B, una identidad de secuencias de aminoácidos del 92% con APV-A, y una identidad de secuencias de aminoácidos de 66-73% con RSV y PVM. La región entre los residuos de aminoácidos 160 y 340 parece altamente conservada entre metapneumovirus y un poco menos conservada con relación a los Pneumovirinae (Miyahara y colaboradores, 1992; Li y colaboradores, 1996; Barr y colaboradores 1991) . Esto corresponde a MPV siendo un metapneumovirus, mostrando una similitud del 100% con APV-C. El gen de fosfoproteína (P) El segundo ORF en el mapa del genoma codifica para una proteína de 294 aminoácidos que comparte una homología de secuencias de aminoácidos del 68% con la proteína P de APV-C y solamente una homología de secuencias de aminoácidos de 22-26% con la proteína P de RSV (Tabla 6) . El gen P de MPV contiene un ORF sustancial y en cuanto a este aspecto es similar a P de muchos otros paramixovirus (Reseñado en Lamb y Kolakofsky, 1996; Sedlmeier y colaboradores, 1998) . En contraste con A y B de APV y PVM y de manera similar a RSV y APV-C el ORF de P de MPV no presenta residuos de cisteína. Ling (1995) sugirió que una región de alta similitud entre todos los pneumovirus (aminoácidos 185-241) desempeña una función ya sea en el proceso de síntesis de ARN o bien en el mantenimiento de la integridad estructural del complejo de nucleocápside. Esta reglón de alta similitud se encuentra también en MPV (Figura 9) , específicamente cuando se toman en cuenta sustituciones conservadoras, mostrando una similitud del 100% con APV-C, una similitud del 93% con APV-A y B, y una similitud de aproximadamente 81% con RSV. El extremo C de la proteina MPV es rico en residuos de glutamato como se ha descrito para APVs (Ling y colaboradores, 1995) . El gen de proteína de matriz (M) El tercer ORF del genoma de MPV codifica una proteína de 254 aminoácidos que se parece a los ORFs de M de otros pneumo irus . El ORF de M de MPV tiene exactamente el mismo tamaño que los ORFs de M de otros metapneumovirus (Tabla 5) y muestra una alta homología de secuencias de aminoácidos con las proteínas de matriz de APV (78-87%) , una homología menor con las proteínas de RSV y PVM (237-38%) y una homología del 10% o menos con las proteínas de otros paramixovirus (Tabla 6) . Easton (1997) comparó las secuencias de proteínas de matriz de todos los pneumovirus y encontró un heptapéptido conservado en los residuos 14 a 19 que es también conservado en MPV (Figura 10) . Para RSV, PVM y APV pequeños ORFs secundarios dentro del ORF mayor o M empalmándose con el ORF mayor M han sido identificados (52 aminoácidos y 51 aminoácidos en bRSV, 75 aminoácidos en RSV, 46 aminoácidos en PVM y 51 aminoácidos en APV) (Yu y colaboradores, 1992) ; Easton y colaboradores, 1997; Samal y colaboradores, 1991; Satake y colaboradores, 1984) .Observamos dos pequeñas ORFs en el ORF de M de MPV. Un pequeño ORF de 54 residuos de aminoácidos fue encontrado dentro del ORF de M mayor (fragmento 1, Figura 7) , empezando en el nucleótido 2281 y un pequeño ORF de 33 residuos de aminoácidos fue encontrado empalmando el ORF mayor de M empezando en el nucleótido 2893 (fragmento 2, Figura 7} . De manera similar a los ORFs secundarios de RSV y APV, no se observa ninguna homología significativa entre estos ORFs secundarios y ORFs secundarios de los demás pneumovirus, y faltan señales aparentes del inicio o terminación. Además, no se ha reportado evidencia de la síntesis de proteína que corresponden a estos ORFs secundarios de APV y RSV. El gen de proteína de fusión (F) El ORF de F de MPV se localiza adyacente al ORF de M, que es característico para miembros del género Metapneumovirus. El gen F de MPV codifica una proteína de 539 aminoácidos que es dos residuos de aminoácidos más larga que F de APV-C (Tabla 5) . Un análisis de la secuencia de aminoácidos reveló una homología del 81% con APV-C, una homología del 67% con APV-A y B, una homología del 33-39% con proteínas F de pneumovirus y solamente una homología de 10-18% con otros paramixovirus (Tabla 6) . Una de las características conservadas entre proteínas F de paramixovirus, y que se observa también en MPV es la distribución de residuos de cisterna (Morrison, 1988; Yu y colaboradores, 1991) . Los metapneumovirus comparten 12 residuos de cisterna en Fl (7 se conservan en todos los paramixovirus) , y dos en F2 (1 se conserva entre todos los paramixovirus) . Entre los tres sitios potenciales de glicosilación enlazado con N presentes en el ORF de F de MPV, ninguno es compartido con RSV y dos (posición 74 y 389) son compartidos con APV. El tercer sitio de glicosilación unido a N potencial, único, para MPV se localiza en la posición 206 (Figura 11) . A pesar de la baja homología de secuencias con otros paramixovirus, la proteína F de MPV reveló características de proteínas de fusión típicas consistentes con las descritas para las proteínas F de otros miembros de la familia de Paramyxoviridae (Morrison, 1988).. Las proteínas F de miembros de Paramyxoviridae son sintetizados como precursores inactivos (F0) que son disociados por proteasas de células huéspedes que generan subunidades F2 en terminal amino y grandes subunidades Fl en terminal carboxi. El sitio de disociación propuesto (Collins y colaboradores, 1996) es conservado entre todos los miembros de la familia de Paramyxoviridae. El sitio de disociación de MPV contiene los residuos RQSR. Ambos residuos de arginina ® son compartidos con APV y RSV, pero los residuos de glutamina (Q) y serina (S) son compartidos con otros paramixovirus tales como el tipo 1 de virus de parainfluenza humano, virus de Sendai y morbillivirus (datos no mostrados) . La región hidrofóbica en el extremo amino de Fl es considerada como funcionando como el dominio de función de membrana y muestra una alta similitud de secuencias entre paramixovirus y morbillivirus y en menor medida con los pneumovirus (Morrison 1988) . Estos 26 residuos (posición 137-163, Figura 11) son conservados entre MPV y APV-C, lo que corresponde con el hecho que esta región es altamente conservada entre los metapneumovirus (Naylor y colaboradores, 1998; Seal y colaboradores 2000) . Como se puede observar en el caso de las subunidades F2 y APV y otros paramixovirus, MPV mostró una deleción de 22 residuos de aminoácidos en comparación con RSV (posición 107-128, Figura 11) . Además, para RSV y APV, se encontró que el péptido de señal y el dominio de ancla eran altamente conservados dentro de subtipos y desplegaron una alta variación entre los sub-tipos (Plows y colaboradores, 1995; Naylor y colaboradores, 1998) . El péptido de señal de MPV (aminoácidos 10-35, Figura 11) en el extremo amina de F2 presenta cierta similitud de secuencia con APV-C (18 de 26 residuos de aminoácidos son similares) y menos conservación con otros APVs o RSV. Se observa una variación mucho en el dominio de ancla de membrana en el extremo carboxi de Fl, aún cuando una cierta homología sigue observándose con APV-C.
La proteína 22K (M2) El gen M2 es único para los Pneumovirinae y dos ORFs que se empalman han sido observados en todos los pneumovirus . El primer ORF principal representa la proteína M2-1 que incrementa la capacidad de procesamiento de la polimerasa viral (Collins y colaboradores, 1995; Collins, 1996) y su ultralectura de regiones intergénicas (Hardy y colaboradores, 1998; Fearns y colaboradores, 1999) . El gen M2-1 para MPV, ubicado adyacente al gen F, codifica una proteína de 187 aminoácidos (Tabla 5) , y presenta la mayor homología (84%) con M2-1 de APV-C (Tabla 6) . La comparación de todas las proteínas M2-1 de pneumovirus reveló la mayor conservación en la mitad de terminal amino de la proteína (Collins y colaboradores, 1990; Zamora y colaboradores, 1992; Ahmadian y colaboradores, 1999) , lo que corresponde a la observación en el sentido que MPV presenta una similitud del 100% con APV-C en los primeros 80 residuos de aminoácidos de la proteína (Figure 12a) . La protelna M2-1 de MPV contiene 3 residuos de cisteína ubicados dentro de los primeros 30 residuos de aminoácidos que son conservados entre todos los pneumovirus. Dicha concentración de cisternas se encuentra frecuentemente en proteínas de unión con zinc (Ahmadian y colaboradores, 1991; Cuesta y colaboradores, 2000) . Los ORFs secundarios (M2-2) que se empalman con los ORFs de M2-1 de pneumovirus son conservados en ubicación pero no en secuencia y se cree que participan en el control de la conmutación entre la replicación y transcripción de ARN viral (Collins, y colaboradores, 1985, Elango, y colaboradores, 1985; Baybutt y colaboradores, 1987; Collins y colaboradores, 1990; Ling y colaboradores, 1992; Zamora y colaboradores, 1992; Alansari y colaboradores, 1994; Ahmadian y colaboradores, 1999; Bermingham y colaboradores, 1999) . Para MPV, el ORF de M2-2 empieza en el nucleótido 512 en el ORF de M2-1 (Figura 7) , lo que representa exactamente la misma posición de inicio que en el caso de APV-C. Las longitudes de los ORFs de M2-2 son iguales para APV-C y para MPV, 71 residuos de aminoácidos (Tabla 5) . La comparación de secuencias de ORF M2-2 (Figura 12B) reveló una homología de secuencia de aminoácidos del 64% entre MPV y APV-C, y una homología de secuencias de aminoácidos de solamente 44-48% entre MPV y APV-A y B (Tabla 6) . El ORF de pequeña proteína hidrofóbica (SH) El gen ubicado adyacente a M2 de hMPV codifica probablemente una proteína SH de 183 aminoácidos (Figuras 1 y 7) . No hay ninguna identidad de secuencia discernible entre este ORF y otros genes de virus de ARN o productos génicos. Esto no es sorprendente puesto que la similitud de secuencia entre proteínas SH de pneumovirus es generalmente baja. El ORF de SH putativo de hMPV es el ORF de SH mayor conocido a la fecha (Tabla 1) . La composición de aminoácidos del ORF de SH es relativamente similar a la composición de APVf RSV y PVM, con un alto porcentaje de residuos de treonina y serina (22%, 18%, 19%, 20.0%, 21% y 28% para hMPV, APV, RSV A, RSV B, bRSV y PVM, respectivamente) . El ORF de SH de hMPV contiene 10 residuos de cisteina mientras que SH de APV contiene 16 residuos de cisteina. El ORF de SH de hMPV contiene dos sitios de glicosilación unidos con N potenciales (aminoácidos 76 y 121), mientras que APV tiene un sitio, RSV tiene dos o tres sitios y PVM tiene cuatro sitios. Los perfiles de hidrofobicidad para la proteina SH de hMPV putativa y SH de APV y RSV presentaron características similares (Figura 7B) . Los ORFs de SH de APV y hMPV tienen un extremo N hidrofílico, un dominio hidrofóbico central que puede servir como dominio que abarca membrana potencial (aminoácidos 30-53 para hMPV) , un segundo dominio hidrofóbico (aminoácidos 155-170), y un extremo C hidrofílico . En contraste, SH de RSV parece no presentar la parte C-terminal de los ORFs de APV y hMPV. En todas las proteínas SH de pneumovirus, el dominio hidrofóbico está flanqueado por residuos de aminoácidos básicos que son también encontrados en el ORF de SH para hMPV (aminoácidos 29 y 54) . El ORF de glicoproteína de fijación (G) El ORF de G putativo de hMPV se localiza adyacente al gen SH putativo y codifica una proteína de 236 aminoácidos (nt 6262-6972, Figura 1) . Un pequeño ORF secundario se encuentra inmediatamente después de este ORF, codificando potencialmente para residuos de 68 aminoácidos (nt 6973-7179) pero sin presentar un codón de inicio. Un tercer ORF potencial en el segundo marco de lectura de 194 residuos de aminoácidos empalma ambos estos ORFs pero tampoco presenta un codón de inicio (nt 6416-7000) . Este OF es seguido por un cuarto ORF potencial de 65 residuos de aminoácidos en el mismo marco de lectura (nt 7001-7198), y otra vez no presenta un codón de inicio. Finalmente, un ORF potencial de 97 residuos de aminoácidos (pero sin codón de inicio) se encuentra en el tercer marco de lectura (nt 6444-6737, Figura 1) . A diferencia del primer ORF, los demás ORFs no tienen secuencias aparentes de inicio de gen o terminación de gen (véase abajo) . Aún cuando el ORF de G de 236 aminoácidos representa probablemente por lo menos una parte de la proteina de fijación de MPV, no se puede excluir que las secuencias codificadoras adicionales sean expresadas como proteínas separadas o bien como parte de la proteína de sujeción a través de algún evento de edición de ARN. SE observará que para APV y RSV, no se ha identificado ningún ORFs secundario después del ORF de G, pero que tanto APV como RSV tienen ORFs secundarios dentro del ORF mayor de G. Sin embargo, la evidencia para la expresión de estos ORF no está disponible y no existe identidad de secuencias entre las secuencias de aminoácidos predichas para diferentes virus (Ling y colaboradores, 1992) . Los ORFs secundarios en G de hMPV no revelan caracterizan de otras proteínas G y la determinación de si lo ORFs adicionales son expresados requiere de investigación adicional. Análisis BLAST con todos los ORFs no revelaron identidad de secuencia discernible a nivel de secuencias de nucleótidos o aminoácidos con otros genes de virus conocidos o productos génicos conocidos- Esto corresponde a la baja identidad porcentual entre secuencias que se encuentra para otras proteínas G tales como ? y B de hRSV (53%) (Johnson y colaboradores, 1987) y A y B de APV (38%) (Juhasz y Easton, 1994) . Mientras que la mayor parte de los ORFs de hMPV se parecen a los de APV tanto en cuanto a longitud como en cuanto a secuencia, el ORF de G putativo de 236 residuos de aminoácidos de hMPV es considerablemente menor en cuando a longitud que el ORF de G de APV (Tabla 1) . La secuencia de aminoácidos reveló un contenido de serina y treonina del 34% lo que es aún mayor que el 32% para RSV y el 24% para APV. El ORF de G putativo contiene también 8.5% de residuos de prolina, lo que es mayor que el 8% en el caso de RSV y 7% en el caso de APV. La abundancia no habitual de residuos de prolina en las proteínas G de APV, RSV y hMPV ha sido también observada en glicoproteínas de origen mucinoso en donde es un determinante principal de las proteínas de estructura tridimensional (Collins y Wertz, 1983; Wertz y colaboradores, 1985; Jentoft, 1990) . El ORF de G de hMPV contiene cinco sitios potenciales de glicosilación unida a N, mientras que RSV tiene siete sitios, bRSV cinco, y APV tiene entre tres y cinco sitios de este tipo. El perfil predic o de hidrofilicidad de G de hMPV reveló características similares a los demás pneumovirus. El extremo de N contiene una región hidrofílica seguida por un área hidrofóbica corta (aminoácidos 33-53. para hMPV) y un extremo C principalmente hidrofílico (Figura 8B) . Esta organización global es consistente con la organización de una proteína de transmembrana de tipo II anclada y corresponde bien a estas regiones en la proteína G de APV y RSV. El ORF de G putativo de hMPV contiene solamente un residuo de cisteína en contraste con RSV y APV (5 y 20, respectivamente) . Es importante observar que solamente dos de los ORFs secundarios en el gen G contenían un residuo de cisteína adicional y estos cuatro ORFs potenciales presentaron 12-20% de residuos de serina y treonina y 6-11% de residuos de prolina. El gen de polimerasa (L) De manea análoga a otros virus de cadena negativa, el último ORF del genoma de MPV es el componentes de ARN polimerasa dependiente de ARN de los complejos de replicación y transcripción. El gen L de MPV codifica una proteína de 2005 aminoácidos que es un residuo más largo que la proteína de APV-A (Tabla 5) . La proteína 1 de MPV comparte una homología de 64% con APV-A, una homología de 42-44% con RSV, y una homología de aproximadamente 13% con otros paramixovirus (tabla 6) . Poch y colaboradores (1989; 1990) identificaron 6 dominios conservados dentro de la proteína L de virus de ARN de cadena negativa no segmentada, entre los cuales el dominio III contenía los cuatro motivos de polimerasa centrales que se consideran esenciales para función polimerasa. Estos motivos (A, B, C y D) son bien conservados en la proteína L de MPV: en los motivos A, B y C, MPV comparte una similitud del 100% con todos los pneumovirus y en el motivo D, MPV comparte una similitud del 1005 con APV y del 92% con RSV. En el caso del dominio III entero (aminoácidos 627-903 en el ORF de L) , MPV comparte una identidad del 77% con APV, una identidad de 61-62% con RSV y una identidad de 23-27% con otros paramixovirus (Figura 15) . Además de los motivos de polimerasa, las proteínas L pneumovirus contienen una secuencia que forma un motivo de unión de ATP de consenso K(X)2iGEGAGN(X)20K (Stec, 1991). El ORF L MPV contiene un motivo similar a APV, en donde el espaciados de los residuos intermedios es desplazado por uno: K (x) 22GEGAGN (X) i9K. Análisis filogenético Como indicador para la relación entre MPV y miembros de Pneumovlrínae, árboles filogenéticos basados en ORFs de N, P, M y F han sido construidos previamente (van den Hoogen y colaboradores, 2001) y mostraron una relación estrecha entre MPV y APV-C. Debido a la baja homología de los genes SH y G de MPV con los otros paramixovirus, árboles filogenéticos confiables para estos genes no pueden construirse- Además, la organización genómica distinta entre miembros de los géneros Pneumovirus y Metapneumovirus hacen imposible generar árboles filogenéticos basados en toda la secuencia genómica. Por consiguiente construimos solamente árboles filogenéticos para los genes M2 y L además de los previamente publicados . Ambos árboles confirmaron la relación estrecha entre APV y MPV dentro de la subfamilia Pneumovirinae (Figura 16) . Secuencias no codificadoras de MPV Las uniones de genes de los genomas de paramixovirus contienen secuencias de nucleótidos cortas y altamente conservadas al principio y al final de cada gen (señales de inicio de gen y terminación de gen) que desempeñan posiblemente una función en el inicio y en la terminación de la transcripción (Curran y colaboradores, 1999) . La comparación de las secuencias intergénicas entre todos genes de MPV reveló una secuencia de consenso para la señal de inicio de gen de N, P, M, F, M2 y G; GGGACAAGU (Figura 17A) , que es idéntica a la señal de inicio de gen de consenso de los metapneumovirus (Ling y colaboradores, 1992, Yu y colaboradores, 1992; Li y colaboradores, 1996; Bayon-Auboyer y colaboradores, 2000) . Las señales de inicio de gen para los genes SH L de MPV fueron encontradas ligeramente diferentes de este consenso (SH: GGGAUAAAU, L: GAGACAAAU) ) . En el caso de APV, la señal de inicio de gen L fue también encontrada diferente del consenso: AGGACCAAT (APV-A) (Randhawa y colaboradores, 1996) y GGGACCAGT (APV-D) (Bayon-Auboyer y colaboradores, 2000) . En contraste con las secuencias similares de inicio de gen de MPV y APV, la secuencia de terminación de gen de consenso de APV, UAGUUAAUU (Randhawa y colaboradores, 1996), no pudo ser encontrada en las secuencias intergénicas de MPV. La secuencia repetida encontrada en la mayoría de los genes, excepto la región intergénica G-L, fue U AAAAA U/A/C, que pudo posiblemente actuar como señal de extremo de gen. Sin embargo, puesto que secuenciamos AR viral en vez ce ARm señales de terminación de gen definitivas no pudieron ser asignadas y por consiguiente se requiere de investigación adicional . Las regiones intergénicas de pneumovirus varían en cuanto a tamaño y secuencia (Curran y colaboradores, 1999; Blumberg y colaboradores, 1991; Collins y colaboradores, 1983) . Las regiones intergénicas de MPV no revelaron homología con las regiones intergénicas de APV y RSV y presentan un rango de tamaño de 10 a 228 nucleótidos (Figuras 17B) . La región intergénica entre los ORFs de F y M de MPV contiene parte de un ORF secundario que empieza en el ORF de M primario (véase arriba) . La región intergénica entre SH y G contiene 192 nucleótidos y no parece tener potencial codificador con base en la presencia de numerosos codones de terminación en los tres marcos de lectura. La región intergénica entre G y L contiene 241 nucleótidos, que pueden incluir ORFs adicionales (véase arriba) . Es interesante observar que el inicio del ORF de L se localiza en estos ORFs secundarios. Mientras que el gen L de APV no empieza en el ORF de G precedente, el ORF de L de RSV empieza también en el gen M2 precedente. En los extremos 3' y 5' del genoma de paramixovirus, regiones extragénicas cortas se conocen como secuencias líder y trasera, y aproximadamente los primeros 12 nucleótidos de la secuencia líder y los últimos 12 nucleótidos de la secuencia trasera son complementarios, probablemente puesto que cada uno contiene elementos básicos de promotores virales (Curran y colaboradores, 1999; Blumberg y colaboradores, 1991; Mink y colaboradores, 1986) . Los líderes 3' de MPV y APV presentan ambos 41 nucleótidos de longitud y se observa cierta homología en la región entre el núcleo 16 y el núcleo 41 de ambos virus (18 de 26 nucleótidos) (figura 17B) . Como se mencionó arriba, los primeros 15 nucleótidos del mapa genómico de MPV se basan en una secuencia de cebadores elaborada en el genoma de APV. La longitud de la secuencia trasera 5' de MPV (188 nucleótidos) se parece al tamaño de la secuencia trasera 5' de RSV (155 nucleótidos) , lo que es considerablemente más largo que en el caso de APV (40 nucleótidos) . Alineaciones de los 40 nucleótidos extremos de la secuencia trasera de MPV y de la secuencia trasera de APV revelaron 21 homología de nucleótidos entre 32, aparte de los dos nucleótidos de extremo que representan secuencias de cebadores con base en las secuencias genómicas de APV. Nuestros análisis de secuencias revelaron la ausencia de genes NSl y NS2 en el extremo 3' del genoma y una organización genómica que se parece a la organización de metapneumovirus (3 ' -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5"). La alta homología de secuencias encontrada entre genes MPV y APV enfatiza adicionalmente la relación estrecha entre estos dos virus. En el caso de genes N, P, M, F, M2-1 y M2-2 de MPV, se encuentra una homología de aminoácidos global de 79% con APV-C. De hecho, para estos genes, APV-C y MPV presentaron homología de secuencias que se encuentran dentro del mismo rango que las homologías de secuencias encontradas entre subgrupos y otros géneros, por ejemplo RSV-A y B o APV-A y B. Esta relación estrecha entre APV-C y MPV se muestra también en los análisis filogenéticos que revelaron MPV y APV-C siempre en la misma ramificación, separados de la ramificación que contenía APV-A y B. La organización genómica idéntica, las homologías de secuencias y los análisis filogenéticos fueron todos a favor de la clasificación de MPV como el primer miembro del género metapneumovirus que puede ser aislado de mamíferos. Se observará que la variación de secuencias encontrada entre diferentes aislados de virus de MPV en los genes n, M, F y L reveló la existencia posible de genotipos diferentes (van den Hoogen y colaboradores, 2001) . La relación estrecha entre MPV y APV-C no es reflejada en el rango de huéspedes puesto que APV infecta aves en contraste con MPV (van den Hoogen y colaboradores, 2001) . Esta diferencia en cuanto al rango de huéspedes puede ser determinada por las diferencias entre las proteínas SH y G de ambos virus que son altamente divergentes . Las proteínas SH y G de MPV no revelaron ninguna homología de secuencia de aminoácidos significativa con proteínas SH y G de otros virus. Aún cuando el contenido de aminoácidos y las representaciones de hidrofobicidad son a favor de definir estos ORFs como SH y G, datos experimentales se requieren para evaluar su función. Tales análisis pueden también aclarar la función de los ORFs de empalme adicionales en estos genes SH y G. Además, análisis de secuencias en los géneros SH y G de APV-C pueden proporcionar más comprensión de la función de las proteínas de SH y G de MPV y su relación con las de APV-C. Las regiones no codificadoras de MPV fueron encontradas relativamente similares a las de APV. Las secuencias líder 3' y trasera 5' de APV y MPV presentaron un alto grado de homología. Aún cuando las longitudes de las regiones intergénicas no fueron siempre iguales para APV y MPV, las señales de inicio de gen de consenso de la mayoría de los ORFs fueron encontradas idénticas. En contraste, las señales de extremo de gen de APV no fueron encontradas en el genoma de MPV. Aún cuando encontramos una secuencia repetitiva (U AAAAA U/A/C) en la mayoría de las regiones intergénicas, un análisis de secuencia de AR m virales se requiere para delinear formalmente estas secuencias de extremos de genes . Se observará que la información de secuencias para 15 nucleótidos en el extremo de terminal 3' y 12 nucleótidos en el extremo de terminal 5' se obtiene mediante la utilización de procedimientos modificados de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) . Otros han comprobado que esta técnica es exitosa para virus relacionados (Randhawa, J. S. y colaboradores, Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 y NS2 genes from avian pneumovirus [El rescate de minireplicones sintéticos establecen la ausencia de genes NS1 y NS2 a partir de pneumovirus de las aves], J. Virol, 71, 9849-9854 (1997); Mink M.A. y colaboradores, Nucleotide sequences of the 3' and 5' trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic R A [Secuencias de nucleótidos de las regiones líder 3' y trasera 5' de ARN genómico de virus sincitial respiratorio humano] , Virology 185, 615-24 (1991). Para determinar la secuencia del líder 3' vARN, una cola de homopolímero A es agregada para purificar vARN utilizando poli-A-polimerasa y la secuencia líder es subsecuentemente amplificada por reacción en cadena de polimerasa empleando un cebador poli-T y un cebador en el gen N. Para determinar la secuencia trasera 5' vARN, una copia de ADNc de la secuencia trasera es elaborada utilizando transcriptasa reversa y un cebador en el gen L, seguido por formación de cola de homopolimero dG del ADNc con transferasa terminal. Subsecuentemente, la región trasera es amplificada utilizando un cebador poli-C y un cebador en el gen L. Como estrategia alternativa, ARNv es ligado sobre si mismo o enlazadores sintéticos después de lo cuál las regiones líder y trasera son amplificadas empleando cebadores en los genes L y N y cebadores específicos para enlazadores. Para la secuencia trasera 5', es también posible efectuar un secuenciamiento de didesoxinucleótidos directo de ARNv purificado (Rand awa, 1997) . Empleando estos enfoques, podemos analizar la secuencia exacta de los extremos del genoma de MPV. La información de secuencia proporcionada aquí es importante para la generación de pruebas de diagnóstico, vacunas y antivirales para MPV e infecciones por MPV. Materiales y Métodos Análisis de Secuencia El aislado de virus 00-1 fue propagado hasta altos títulos (aproximadamente 10,000 TCID 50/mi) en células de riñon de mono terciarias de conformidad con lo descrito previamente (van den Hoogen y colaboradores, 2001) . El ARN viral fue aislado a partir de sobrenadantes de células infectadas empleando un ki de ARN High Puré de conformidad con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Almere, Los Países Bajos) . Cebadores son diseñados con base en secuencias publicadas previamente (van den Hoogen y colaboradores, 2001) además de secuencias publicadas para las regiones líder y trasera de APV/RSV (Randhawa y colaboradores, 1997; Mink y colaboradores, 1991) y están disponibles a petición. Ensayos de RT-PCR fueron efectuados con AR viral, empleando un ensayo de un tubo en un volumen total de 50 µ? con Tris 50 mM pH 8.5, NaCl 50 mM, MgCl2 4.5 mM, DTT 2 mM, cebador directo 1 uM, cebador reverso 1 uM, dNTP' s 0.6 mM, 20 unidades de RAsin (Promega, Leiden, Los Países Bajos) , 10 U de AMV transcriptasa reversa (Promega, Leiden, Los Países Bajos), y 5 unidades de Taq Polimerase (PE Applied Biosystems, Nieu erkerk aan de IJseel, Los Países Bajos) . La transcripción reversa fue efectuada a una temperatura de 42°C durante 30 minutos, seguido por 8 minutos de desactivación a 95°C. El ADNc fue amplificado durante 40 ciclos de 95°C, 1 minutos; 42°C, 2 minutos; 72°C, 3 minutos, con una extensión final a 72°C durante 10 minutos. Después de examen en un gel de agarosa al 1%, los productos de RT-PCR fueron purificados a partir del gel utilizando un kit de Extracción de Gel Quiaquick (Qiagen, Leusden, Los Países Bajos) y secuenciados directamente empleando un kit de secuenciamiento de terminador Dyenamic ET (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, Los Países Bajos) y un secuenciador de ADN automático ABI 373 (PE Applied Biosystem, Nieuwerkerk aan den IJseel, Los Países Bajos), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se efectuaron alineaciones de secuencias utilizando el paquete de programática Clustal disponible en el paquete de programática de BioEdit versión 5.0.6 (http://jwbrown.mbio.ncsu.edU/Bioedit//bioedit.html; Hall, 1999) . Análisis Filogenético Para construir árboles filogenéticos, secuencias de ADN fueron alineadas empleando el paquete de programática ClustalW y se generaron árboles de máxima probabilidad utilizando el paquete de programática DNA-ML de programa Phylip 3.5 utilizando 100 secuencias de arranque (booststraps) y 3 mezclas (jumbles) . Los valores de Bootstrap fueron calculados para árboles de consenso creados con el paquete de consenso (Felsenstein, 1989) . La secuencia genómica de MPV está disponible en Genbank bajo el número de acceso AF371337. Todas las demás secuencias utilizadas aquí están disponibles en Genbank bajo los números de acceso AB046218 (virus de sarampión, todos los ORFs), NC-001796 (virus de parainfluenza humana de tipo 3, todos los ORFs), NC-001552 (virus Sendai, todos los ORFs), X57559 (virus de parainfluenza de tipo 2, todos los ORFs) , NC-002617 (virus de enfermedad de New Castle, todos los ORFs), NC-002728 (virus de Ñipan, todos los ORFs), NC-001989 (bRSV, todos los ORFs), M11486 (hRSV A, todos los ORFs excepto L) , NC-001803 (hRSV, L ORF) , NC-001781 (hRSV B, todos los ORFs), D10331 (PVM, N ORF) , U09649 (PVM, P ORF) , U66893 (PVM, M ORF), U66893 (PVM, SH ORF), D11130 (PVM, G ORF), D11128 (F ORF) . El ORF de M2 de PVM fue tomado de Ahmadian (1999) , AF176590 (APV-C, N ORF), U 39295 (APV-A, N ORF), U 39296 (APV-B, N ORF), AF262571 (APV-C, M ORF), U37586 (APV-B, M ORF), X58639 (APV-A, M ORF), AF176591 (APV-C, P ORF), AF325443 (APV-B, P ORF), U22110 (APV-A, P ORF), AF187152 (APV-C, F ORF) , Y14292 (APV-B, F ORF) , D00850 (APV-A, F ORF) , AF176592 (APV-C, M2 ORF), AF35650 (APV-B, M2 ORF), X63408 (APV-A, M2 ORF), U65312 (APV-A, L ORF), S40185 (APV-A, SH ORF) . Tabla 5: Longitudes de los ORFs de MPV y otros paramixovirus. NI P M F M2-1 M2-2 SH G L MPV 394 294 254 539 187 71 183 236 2005 APV A 391 278 254 538 186 73 174 391 2004 APV B 391 279 254 538 186 73 _2 414 _2 APV C 394 294 254 537 184 71 2 _2 2 APV D _2 _2 _2 _2 _2 _2 _2 389 _2 hRSV A 391 241 256 574 194 90 64 298 2165 hRSV B 391 241 249 574 195 93 65 299 2166 bRSV 391 241 256 569 186 93 81 257 2162 PVM 393 295 257 537 176 77 92 396 _2 otrosJ 418- 225- 335- 539- 4 _4 _4 4 2183- 542 709 393 565 2262 Notas : 1. Longitud de residuos de aminoácidos. 2. Secuencias no disponibles 3. otros: virus de parainfluenza humana de tipo 2 y 3, virus de Sendai, virus de sarampión, virus de ñipan, virus del moquillo tocino y enfermedad por virus de New Castle 4. ORF no presente en el genoma viral Tabla 6: Identidad de secuencia de aminoácidos entre ORFs de MPV y los de otros paramixovirusi . N P M F M2-1 M2-2 L APV A 69 55 78 67 72 26 64 APV B 69 51 76 67 71 27 _2 APV C 88 68 87 81 84 56 -2 hRSV A 42 24 38 34 36 18 42 hRSV B 41 23 37 33 35 19 44 hRSV 42 22 38 34 35 13 44 PVM 45 26 37 39 33 12 _2 otros"3 7- 4- 7- 10- _4 4 13· 11 9 10 18 14 Notas : 1. No se encontró homología de secuencia con proteínas G y SH conocidas y por consiguiente fueron excluidos . 2. Secuencias no disponibles. 3. Véase lista en la tabla 5, nota 3. 4. ORF ausente en el genoma viral. Cebadores utilizados para detección por RT-PCR de paramixovirus conocidos. Cebadores para h.PIV-1 a 4, paperas, sarampión, Tupaia, Mapuera y Hendra son desarrollados en casa y basados en alineamientos de secuencias disponibles. Cebadores para el virus de enfermedad de New Castle son tomados de Seal, J., J. y colaboradores, Clin. Microb., 2624-2630, 1995. Cebadores para Nipah y reacción en cadena de polimerasa de paramixovirus en general se toman de: Chua, K.B., y colaboradores, Science, 288 26 Mayo de 2000. Virus Cebadores localizados en proteína HPIV-1 directo 5' -TGTTGTCGAGACTATTCCAA~3' HN reverso 5' -TGTTG (T/A)ACCAGTTGCAGTCT-3' HPIV-2 directo 5' -TGCTGCTTCTATTGAGAAACGCC-3' N reverso 5' -GGTGAC/T TC ( /C) AATAGGGCCA-3' HPIV-3 directo 5' -CTCGAGGTTGTCAGGATATAG-3' HN reverso 5' -CTTTGGGAGTTGAACACAGTT-3' HPIV-4 directo 5' -TTC (A/G) GTTTTAGCTGCTTACG-3' N reverso 5' -AGGCAAATCTCTGGATAATGC-3' Paperas directo 5' -TCGTAACGTCTCGTGACC-3' SH reverso 5' -GGAGATCTTTCTAGAGTGAG-3' NDV directo 5' -CCTTGGTGAiTCTATCCGIAG-3' F reverso 5' -CTGCCACTGCTAGTTGiGATAATCC-3'' Tupaia directo 5' ~GGGCTTCTAAGCGACCCAGATCTTG-3' N reverso 5' -GAATTTCCTTATGGACAAGCTCTGTGC-3' Mapuera directo 5' -GGAGCAGGAACTCCAAGACCTGGAG-3' N reverso 5' -GCTCAACCTCATCACATACTAACCC-3' Hendra directo 5' -GAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAG-3' N reverso 5' -GCCTTTGCAATCAGGATCCAAATTTGGG-3' Nipah directo 5' -CTGCTGCAGTTCAGGAAACATCAG-3' N reverso 5' -ACCGGATGTGCTCACAGAACTG-3' HRSV directo 5' -TTTGTTATAGGCATATCATTG-3' F reverso 5' -TTAACCAGCAAñ.GTGTTA-3' Sarampión directo 5' - TAGGGCAAGAGATGGTAAGG-3' N reverso 5' -T ATAACAA GATGGAGGG-3' Paramyxoviridae General : directo 5' -CATTAAAAAGGGCACAGACGC-3' P reverso 5' -TGGACATTCTCCGCAGT-3' Cebadores para RAP-PCR: ZFl : 5' -CCCACCACCAGAGAGAAA-3' ZF4 : 5' -ACCACCAGAGAGAAACCC-3' ZF7 : 5' -ACCAGAGAGAAACCCACC-3' ZFl0 : 5' -AGAGAGAAACCCACCACC-3' ZF13 : 5' -GAGAAACCCACCACCAGA-3' ZF16: 5' -AAACCCACCACCAGAGAG-3' CS1: 5' -GGAGGCAAGCGAACGCAA-3' CS4: 5' -GGCAAGCGAACGCAAGGA-3' CS7 : 5' -AAGCGAACGCAAGGAGGC-3' CS10: 5' -CGAACGCAAGGAGGCAAG-3' CS13: 5' -ACGCAAGGAGGCAAGCGA-3' CS16: 5' -CAAGGAGGCAAGCGAACG-3' 20 Fragmentos fueron purificados y secuenciados exitosament 10 Fragmentos encontrados con homología de secuencia en APV Fragmento 1 ZF7, 335 pares de bases gen N Fragmento 2 ZF10, 235 pares de bases gen N Fragmento 3 ZF10, 800 pares de bases gen M Fragmento 4 CS 1, 1250 pares de bases gen F Fragmento 5 CS 10, 400 pares de bases gen F Fragmento 6 CS 13, 1450 pares de bases gen F Fragmento 7 CS 13, 750 pares de bases gen F Fragmento 8 ZF 4, 780 pares de bases gen L (a nivel de proteína) Fragmento 9 ZF 10, 330 pares de bases gen L (a nivel de proteína) Fragmento 10 ZF 10, 250 pares de bases gen L (a nivel de proteína) Cebadores utilizados para la amplificación por RAP-PCR de ácidos nucleicos a partir del aislado prototipo.
Ej emplo 5 Exploración adicional de los sub-tipos de hMPV Con base en análisis filogenéticos de los diferentes aislados de hMPV obtenidos a la fecha, se identificaron dos genotipos con aislado viral 00-1 siendo el prototipo del genotipo A y el aislado 99-1 siendo el prototipo del genotipo B. Planteamos de manera hipotética que los genotipos están relacionados con sub-tipos y que una re-infección con virus de ambos sub-grupos ocurre en presencia de inmunidad pre-existente y la variación antigénica puede no ser estrictamente requerida para permitir una re-infección. Además, hMPV parece presentar una relación estrecha con el pneumovirus de las aves, un virus encontrado primariamente en pollos . Las secuencias de nucleótidos de ambos virus muestran altos porcentajes de homología, a excepción de las proteínas SH y G. Aquí encontramos que los virus reaccionan de manera cruzada en pruebas, que se basan primariamente en la nucleoproteína y proteína de matriz, pero responden de manera diferente en pruebas que se basan en las proteínas de fijación. Las diferencias en cuanto a títulos de neutralización de virus proporcionaron la prueba adicional que los dos genotipos de hMPV son dos serotipos diferentes de un virus, en donde APV es un virus diferente. La reacción cruzada entre los dos serotipos y la reacción cruzada entre APV y hMPV.
Métodos Protocolo para la detección de anticuerpos IgG, IgA e IgM para MPV: El EIA indirecto de IgG para hMPV fue efectuado en placas de microtitulación esencialmente de conformidad con lo descrito previamente (Rothbarth, P.H. y colaboradores, 1999; Influenza virus serology-a comparative study [Serologia de virus de influenza - Un estudio comparativo] . J. of Vir. Methods 78. (1999) 163-169. En resumen hMPV concentrado fue solubilizado con tratamiento con 1% Tritón X-100 y revestido durante 16 horas a temperatura ambiente en placas de microtitulación en PBS después de la determinación de la dilución de trabajo óptima por titulación en tablero. Subsecuentemente, se agregaron volúmenes de 100 ul de muestras de suero humano diluido 1:100 en amortiguador de EIA a los pozos y se incubó durante 1 hora a una temperatura de 37°C. la unión de IgG de ser humano fue detectada por adición de un conjugado de peroxidasa de IgG anti-humana de cabra (Biosource, EUA) . La adición de TMB como substrato reveló las placas y se midió la OD a 450 nm. Los resultados fueron expresados como la proporción en S (eñal) /N (egativa) de la OD. Un suero fue considerado positivo para IgG, si la proporción S/N estaba más allá del control negativo más tres veces el estándar. Anticuerpos para hMPV de las clases IgM e IgA fueron detectados en sueros por EIA de captura esencialmente de conformidad con lo descrito previamente (Rothbarth, P. H. y colaboradores, 1999; Influenza virus serology-a comparative study [Serologia de virus de Influenza - Un estudio comparativo], J. Vir. Methods 78 (1999) 163-169. Para la detección de IgA e IgM placas de microtitulación comercialmente disponibles revestidas con anticuerpos monoclonales específicos IgM o IgA antihumanos fueron utilizados. Sueros fueron diluidos 1:100 y después de incubación durante 1 hora a 37°C, se agregó una dilución de trabajo óptima de hMPV a cada pozo (100 ul) . Se incubó durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Después de lavado, se agregó anti hMPV policlonal marcado con peroxidasa, la placa fue incubada durante 1 hora a una temperatura de 37°C. La adición de TMB como sustrato reveló placas y se midió OD a 450 nm. Los resultados fueron expresados como la relación S (eñal) /N (egativa) de la OD. Un suero fue considerado positivo para IgG si la proporción S/N estaba más allá del control negativo más veces el estándar. Anticuerpos para AVP fueron detectados en un ensayo de inhibición de AVP. Protocolo para prueba de inhibición APV se incluye en el inmunoensayo de enzima APV-Ab SVANOVIR® fabricad por SVANOVA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Suecia. Los resultados fueron expresados como la proporción S (eñal) /N (egativa) de la OD. Un suero fue considerado positivo para IgG si la proporción S/N se encontraba más allá del control negativo más tres veces el estándar. 1. Conejillos de la India A. (re) infección de conejillos de la India con ambos subtipos de hMPV Aislados de virus ned/00/01 (subtipo A) y ned/99/01 (subtipo B) han sido utilizados para inocular 6 conejillos de la India por subtipo (intratraqueal, nariz y ojos) . 6 GPs infectados con hMPV 00-1 (10e6,5 TCID50) 6 GPs infectados con hMPV 99-1 (10e4,l TCID50) 54 dias después de la infección primaria, los conejillos de la India fueron inoculados con los subtipos homólogos y heterólogos (10e4 TCID 50/ml) : 2 conejillos de la India: Ia infección 00-1; 2a infección 99-1 (heterólogo) 3 conejillos de la India: Ia infección 00-1; 2a infección 00-1 (homólogo) 2 conejillos de la India: Ia infección 99-1; 2a infección 00-1 (heterólogo) 3 conejillos de la India: Ia infección 99-1; 2a infección 99-1 (homólogo) Torundas tomadas de garganta y nariz han sido recogidas durante 12 dias (Ia infección) u 8 dias (2a infección) después de la infección y han sido probados para determinar la presencia de virus por ensayos de RT-PCR. Resultados de ensayo de RT-PCR: Figura 29 Resumen de los resultados: conejillos de la India inoculados con el aislado de virus ned/00/01 presentan infección del tracto respiratorio superior del dia 1 al 10 después de la infección. Conejillos de la India inoculados con ned/99/01 presentan infección del tracto respiratorio superior del dia 1 a 5 después de la infección. La infección con ned/99/01 parece ser menos severa que la infección con ned/00/01. Una segunda inoculación de los conejillos de la India con el virus heterólogo resulta en una re-infección en 3 de 4 conejillos de la India y con el virus homólogo en 2 de 6 conejillos de la India. Ningún síntoma clínico o muy pocos síntomas clínicos fueron observados en los animales que fueron re-infectados, y no se observaron síntomas clínicos en los animales protegidos contra las re-infecciones, lo que demuestra que aún con virus de tipo silvestre, es evidente un efecto protector de la primera infección, lo que muestra el uso posible de aislados heterólogos (y evidentemente homólogos) como vacuna, aún en una forma no atenuada. Ambos subtipos de hMPV pueden infectar conejillos de la India, aún cuando una infección con el subtipo B (ned/99/01) parece menos severa (período más corto de presencia del virus en nariz y garganta) que la infección con el subtipo A (ned/00/01) . Esto puede deberse a la dosis más alta proporcionada para el subtipo A o a la virulencia menor del subtipo B. Aún cuando la presencia de inmunidad pre-existente no protege totalmente contra re-infección con el virus homólogo y con el virus heterólogo, la infección parece ser menos prominente en la medida en que se observó un periodo de presencia de virus más corto y no todos los animales se volvieron positivos para el virus. B. Serologia de conejillos de la India de conejillos de la India infectados con ambos subtipos de hMPV Los días 0, 52, 70, 80, 90, 110, 126 y 160 se recogieron sueros de los conejillos de la India y se llevaron a cabo pruebas a una dilución 1:100 en ELISA de virus entero contra antigeno de ned/00/01 y ned/99/01. Figura 30A y B: respuestas de IgG contra ned/00/01 y ned/99/01 para cada conejillo de la India individual Figura 31; Especificidad de ELISA contra ned/00/01 y ned/99/01. Se utilizaron solamente datos de conejillos de la India reinfectados homólogos. Figura 32; Respuesta de IgG media contra ELISA contra ned/00/01 y ned/99/01 de 3 conejillos de la India infectados homólogos (00-1/00-1), 2 conejillos de la India infectados homólogos (99-1/99-1), 2 conejillos de la India infectados heterólogos (99-1/00-1) y 2 conejillos de la India infectados heterólogos (00-1/99-1) .
Resumen de los resultados : Solamente una diferencia menor en respuesta a los dos ELISA diferente se observa. ELISA de virus entero contra 00-1 o 99-1 no puede ser utilizado para discriminar entre los dos subtipos. C . Reactividad de sueros preparados contra hMPV en conejillos de la India con antigeno para APV Sueros recogidos de conejillos de la India infectados han sido probados con un ELISA de inhibición de APV. Figura 33: Porcentaje promedio de inhibición de APV de conejillos de la India infectados con hMPV. Resumen de los resultados : Sueros preparados contra hMPV en conejillos de la India reaccionan en prueba de inhibición de APV de la misma manera que reaccionan en ELISAs de IgG de hMPV. Sueros preparados contra ned/99/01 muestran un porcentaje menor de inhibición en el ELISA e inhibición de APV que sueros preparados contra ned/00/01. Conejillos de la India infectados con ned/99/01 pueden tener un titulo más bajo (como se observa en ELISAs de hMPV) o bien la reacción cruzada de ned/99/01 con APV es menor que la reacción cruzada de ned/00/01. Sin embargo, ELISA de inhibición de APV-Ab puede ser utilizado para detectar anticuerpos para hMPV en conejillos de la India. D. Ensayos de neutralización de virus con sueros preparados contra hMPV en conejillos de la India Sueros recogidos el dia 0, el día 52, el día 70 y el día 80 después de la infección fueron utilizados en un ensayo de neutralización de virus (cruzado) con ned/00/01, ned/99/01 y APV-C. La dilución de inicio fue de 1 a 10 y se utilizaron 100 virus TCID50 por pozo. Después de neutralización, el virus fue llevado en células tMK, centrifugado durante 15 minutos a 3500 rpm después de lo cual el medio fue refrescado . Las pruebas de APV fueron cultivadas durante 4 días las pruebas de hMPV fueron cultivadas durante 7 días. Células fueron fijadas con 80% de acetona y se llevaron a cabo IFAs con hMPV de anti-mono marcado con FITC. Pozos que resultaron negativos en la tinción fueron considerados como el título neutralizante. Para cada virus, se incluyó una titulación 10-log de la solución madre de virus y una titulación doble de la solución de trabajo. Figura 34: Títulos de neutralización de virus de conejillos de la India infectados con ned/00/01 y ned/99/01 contra ned/00/01, ned/99/01 y APV-C. 2. Macacos Cynomolgus A. (re) infección de macacos cynomolgus con ambos subtipos de hMPV Aislados de virus ned/00/01 (subtipo A) y ned/99/01 (subtipo B) (le5 TCID50) han sido utilizados para inocular dos macados cynomolgus por subtipo (intratraqueal, nariz y ojos) . Seis meses después de la infección primaria, el macaco fue inoculado por segunda vez por ned/00/01. Se tomaron exudados de garganta 14 días (Ia infección) u 8 dias (2a infección) después de la infección, y se llevaron a cabo pruebas para determinar la presencia del virus por ensayos RT-PCR. Figura 35: Resultados de ensayos RT-PCR en torundas tomadas de garganta de macacos cynomolgus inoculados (dos veces) con ned/00/01. Resumen de los resultados: Macacos cynomolgus inoculados con el aislado viral ned/00/01 muestran infección en el tracto respiratorio superior del dia 1 al 10 después de la infección. Síntomas clínicos incluyen una rinitis supurativa. Una segunda inoculación de los macacos con el virus homólogo resulta en una re-infección, de conformidad con lo demostrado por reacción en cadena de polimerasa, sin embargo no se observaron síntomas clínicos. B . Serologia en sueros recogidos de macacos cynomolgus de hMPV. ? partir de los macacos que recibieron ned/00/01 se recogieron sueros durante 6 meses después de la infección primaria (la re-infección ocurrió el día 240 para el mono 3 y el día 239 para el mono 6) . Sueros fueron utilizados para probar la presencia de anticuerpos IgG contra ya sea ned/00/01 o bien APV y para determinar la presencia contra anticuerpos IgA e IgM contra ned/00/01. Resultados: Figura 36A Respuesta IgA, IgM e IgG contra ned/00/01 de 2 macacos cynomolgus (re) infectados con ned/00/01. Figura 36B Respuesta de IgG contra APV de 2 macacos cynomolgus infectados con ned/00/01. Resumen de los resultados : Dos macacos han sido exitosamente infectados con ned/00/01 y en presencia de anticuerpos contra ned/00/01 han sido reinfectados con el virus homólogo. La respuesta a anticuerpos IgA e IgM muestra la elevación en cuanto a anticuerpos IgM después de la primera infección, y su ausencia después de la re-infección. Anticuerpos IgA son detectados solamente después de la re-infección, lo que demuestra el carácter inmediato de la respuesta inmune después de una primera infección. Sueros preparados contra hMPV en macacos que fueron probados en un ensayo de ELISA de inhibición de APV muestran una respuesta similar a ELISA de IgG de hMPV. Comentarios/Conclusiones Anticuerpos contra hMPV en macacos cynomolgus son detectados con ELISA de inhibición de APV con una sensibilidad similar al caso de un análisis ELISA de hMPV, y por consiguiente el EIA de inhibición de APV es adecuado para probar muestras humanas para determinar la presencia de anticuerpos contra hMPV. C. Ensayos de neutralización de virus (neutralización cruzada) con sueros recogidos de macacos cynomolgus infectados con hMPV Resumen de resultados: Los sueros tomados del día 0 al día 229 después de la infección primaria muestran solamente títulos de neutralización de virus bajos contra ned/00/01 (0-80) , los sueros tomados después de la infección secundaria muestran títulos de neutralización altos contra ned/00/01: >1280. Solamente los sueros tomados después de la infección secundaria muestran títulos de neutralización contra ned/99/01 (80-640) y ninguno de los sueros neutraliza el virus C de APV. No hay ninguna reacción cruzada entre APV-C y hMPV en ensayos de neutralización (cruzada) de virus en donde existe una reacción cruzada entre ned/00/01 y ned/99/01 después de un refuerzo de la respuesta de anticuerpo. 3. Seres Humanos Sueros de pacientes dentro de un rango de edad de 6 meses a 20 años han sido previamente probados en IFA y ensayos de neutralización de virus contra ned/00/01. (Véase Tabla 1 de la patente) . Aquí hemos probado varios de estos sueros para detener la presencia de anticuerpos IgG, IgM e IgA en un estudio en ELISA contra ned/00/01 y probamos las muestras en el estudio ELISA de inhibición de APV. Resultados: Figura 37 Comparación del uso de ELISA hMPV y ELISA de inhibición de APV para la detección de anticuerpos IgG en sueros humanos. Existe una fuerte correlación entre la prueba hMPV para IgG y la prueba APV-Ab, por consiguiente la prueba para APV-Ab es esencialmente capaz de detectar anticuerpos IgG para hMPV en seres húmanos4. Aves de corral 96 pollos han sido probados tanto en ELISA de inhibición de APV como en ELISA para ned/00/01 para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra APV. Resumen de los resultados: Tanto ELISA para hMPV como ELISA de inhibición de APV detectan anticuerpos contra APV (datos no mostrados) . Resumen de resultados Encontramos dos genotipos de hMPV con ned/00/01 siendo el prototipo del subgrupo A y ned/99/01 siendo el prototipo del subgrupo B. De conformidad con análisis serológicos clásicos (como por ejemplo Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L., y Brown, F., Classification and nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses [Clasificación y nomenclatura de virus. Quinto reporte del Comité Internacional sobre Taxonomía de Virus] . Arch Virol, 1991. Suplemento 2: p. 140-144), dos subtipos pueden ser definidos con base en su distinción inmunológica de conformidad con lo determinado por ensayos de neutralización cuantitativa con antisueros de animales. Dos serotipos distintos o bien no tienen reacción cruzada entre ellos o bien muestran una proporción entre título homólogo y heterólogo mayor que 16 en ambas direcciones. Si la neutralización muestra un cierto grado de reacción cruzada entre dos virus en cualquier dirección en ambas direcciones (proporción entre título homólogo y heterólogo de ocho o 16), se asume una distinción de serotipo si existen diferencias biofísicas/bioquímicas sustanciales de ADNs. Si la neutralización muestra un grado distinto de reacción cruzada entre dos virus en cualquier dirección o en ambas direcciones (proporción entre título homólogo y heterólogo inferior a ocho) , se asume la identidad de serotipo de los aislados en estudio . Para RSV, se muestra que ocurre una re-infección en presencia de inmunidad pre-existente (tanto homologa como heteróloga) . La infección de conejillos de la India y macacos cynomolgus con serotipos de homólogos y heterólogos de MPV mostró que es también cierto en el caso de hMPV. Además, ELISAs de IgA e IgM contra hMPV mostraron que la reacción de anticuerpos IgA ocurre solamente después de re-infección. Sueros preparados contra hMPV o APV responden en forma igual en ELISAs para APV y hMPV. A partir de las comparaciones de secuencias de nucleótido, se sabe que los virus presentan una homología de aminoácidos aproximadamente 80% para los genes N, P, M y F. En ELISAs, las proteínas N y M son los antígenos principales para la reacción. Ensayos de neutralización de virus (conocidos por reaccionar contra las glicoproteínas de superficie G, SH y F) presenta una diferencia entre los dos sueros diferentes . Aún cuando APV y hMPV reacciona de manera cruzada en ELISAs, análisis filogenéticos de las secuencias de nucleótidos de hMPV y APV, las diferencias en cuanto a títulos de neutralización de virus de sueros preparados contra los dos virus diferentes y las diferencias en uso de huésped revelan otra vez que APV-C y hMPV son dos virus diferentes. Con base en los resultados especulamos que una infección por hMPV en mamíferos es posible como resultado de un evento zoonótico de aves a mamíferos. Pero el virus se ha adaptado de tal manera (es decir, las proteínas G y SH) que un evento zoonótico de retorno (de mamíferos a aves) parece improbable, tomando en cuenta la presencia de APV en aves. SUPLEMENTO Antecedentes sobre Pneumovirinae La familia de Parmyxoviridae contiene dos subfamilias; los Paramyxovirinae y los Pneumovirinae. La subfamilia Pneumovirinae consiste de dos géneros: Pneumovirus y Metapneumovirus. El género Pneumovirus contiene los virus sincitiales respiratorios humanos, bovinos, ovinos y caprinos y el virus de la neumonía de ratones de (PVM) . El género Metapneumovirus contiene los pneumovirus de aves (APV, que se conoce también como TRTV) . La clasificación de los géneros en la subfamilia Pneumovirinae se basa en características virales clásicas, orden de genes y constelación de genes . Virus del género Pneumovirus son únicos en la familia de Paramyxoviridae en tener dos proteínas no estructurales en el extremo 3' del genoma (3' -NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5' ) . En contraste, virus en el género Metapneumovirus no tienen los genes NSl y NS2 y la organización de genes entre las regiones codificadoras M y L es diferente: 3' -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5' . Todos los miembros de la subfamilia Paramyxovirinae tienen una actividad hemaglutinante, pero esta función no es una característica que define la subfamilia Pneumovirinae, puesto que es ausente en RSV y APV pero presente en PMV. La actividad neuraminidasa está presente en miembros de los géneros Paramyxovirus y Rubulavirus (subfamilia de Paramyxovirinae) pero es ausente en el género Morbillivirus (subfamilia Paramyxovirinae) y los géneros Pneumovirus y Metapneumovirus (subfamilia Pneumovirinae) . Una segunda característica distintiva de la subfamilia Pneumovirinae es la utilización aparente limitada de ORFs alternativo dentro de ARNm por RSV. En contraste, varios miembros de la subfamilia Paramyxovirinae, como por ejemplo el virus de Sendai y de sarampión accesan ORFs alternativo dentro del ARNm que codifica la fosfoproteina (P) para dirigir asi la síntesis de una proteina novedosa. La proteina G de los Pneumovirinae no tiene relación de secuencias ni similaridad estructural con las proteínas HN o H de Paramyxovirinae y presenta solamente aproximadamente la mitad del tamaño de su longitud de cadena. Además, las proteínas Además, las proteínas N y P son más pequeñas que sus contrapartes en los Paramyxovirinae y no tienen una homología de secuencia no ambigua. La mayoría de los virus ARN de cadena negativa no segmentados tienen una sola proteína de matriz (M) . Miembros de la subfamilia de Pneumovirinae son una excepción por tener dos proteínas de ese tipo M y M2. La proteína M es más pequeña que sus contrapartes en Paramyxovirinae y no presenta relación de secuencia con Paramyxovirinae. Cuando se cultivan en cultivos celulares, miembros de la subfamilia Pneumovirinae muestran efectos citopáticos típicos; inducen a la formación de sincitios característicos de células (Collins, 1996) . La subfamilia Pneumovirinae, género Pneumovirus hRSV es la especie tipo del género Pneumovirus y es una causa principal y generalizada de enfermedades del tracto respiratorio inferior durante la infancia y principios de la niñez (Selwyn, 1990) . Además, hRSV es reconocido cada vez más como un patógeno importante en otros grupos de pacientes, incluyendo individuos inmuno comprometidos y ancianos . RSV es también una causa importante de neumonía adquirida en la comunidad entre adultos hospitalizados de todas las edades (Englund, 1991; Falsey, 2000; Do ell, 1996). Dos tipos antigénicos principales para RSV (A y B) han sido identificados con base en diferencias en cuanto a su reactividad con anticuerpos monoclonales y policlonales y por análisis de secuencias de ácidos nucleicos (Anderson, 1985; Johnson, 1987; Sullender, 2000). En particular, la proteína G es utilizada para distinguir los dos subtipos. RSV-A y B comparten solamente 53% de homología de secuencias de aminoácidos en G, mientras que las demás proteínas presentan homologías mayores entre los subtipos (Tabla 1) (Collins, 1996) . La detección de infecciones de RSV ha sido descrita utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales en técnicas de inmunofluorescencia (DIF, IFA) , ensayos de neutralización de virus y ELISA o RT-PCR (Rothbarth, 1988; Van Milán, 1994; Coggins, 1998). Los hRSV bovino (bRSV) , ovino (oRSV) y caprino (oRSV) están estrechamente relacionados con hRSV, entre los cuales bRSV ha sido estudiado de manera más amplia. Con base en homología de secuencias con hRSV, los RSVs de rumiantes se clasifican dentro del género Pneumovírus, subfamilia Pneumovirinae (Collins, 1996) . El diagnóstico de infección por RSV de rumiante y la sub-tipificación se basa en el uso combinado de ensayos de serología detección de antígenos, aislamiento de virus y RT-PCR (Uttenthal, 1996; Valarcher, 1999; Oberst, 1999; Vilcek, 1994) . Varios análisis de la organización molecular de bRSV han sido efectuados utilizando antisueros humanos y bovinos, anticuerpos monoclonales y sondas de ADNc. Estos análisis revelaron que las composiciones de proteína de hRSV y bRSV son muy similares y la organización genómica de bRSV se parece a la organización genómica de hRSV. Tanto para bRSV como para hRSV, las proteínas G y F representan los antígenos de protección y neutralización principales. La proteína G es altamente variable dentro de los subtipos hRSV y entre hRSV y bRSV (53 y 28%, respectivamente) (Prozzi, 1997; Lerch, 1990) . Las proteínas F de hRSV y bRSV presentan características estructurales comparables y relación antigénica. La proteína F de bRSV muestra una homología de 80-81% con hRSV, mientras los dos subtipos de hRSV comparten una homología de 90% en F (Walravens, K. 1990) . Estudios basados en el uso de anticuerpos monoclonales específicos para hRSV y bRSV han sugerido la existencia de subtipos antigénicos diferentes de bRSV. Los subtipos A, B y AB se distinguen con base en patrones de reacción de anticuerpos monoclonales específicos para la proteína G (Furze, 1994; Prozzi, 1997; Elvander, 1998) . La epidemiología de bRSV es muy similar a la epidemiología de hRSV. Una infección espontánea en ganado joven es frecuentemente relacionada con signos respiratorios severos, mientras que una infección experimental resulta generalmente en una enfermedad más leve con ligeros cambios patológicos (Elvander, 1996) . RSV ha sido también aislada de ovejas infectadas naturalmente (oRSV) (LeaMaster, 1983) y cabras (cRSV) (Lehmkuhl, 1980) . Ambas cepas comparten una homología de secuencia de nucleótidos de 96% con el RSV bovino y reaccionan de manera cruzada antigénicamente. Por consiguiente, estos virus se clasifican también dentro del género Pneumovirus. Un miembro distinto de la subfamilia Pneumovirinae, género Pneumovirus es el virus de la neumonía de ratones (PVM) . PVM es un patógeno común en colonias de animales de laboratorio, especialmente los que contienen ratones atímicos. La infección naturalmente adquirida se considera asintomática, aún cuando el pasaje de virus en pulmones de ratones resultó en signos abiertos de enfermedad dentro de un rango de infección del tracto respiratorio superior hasta neumonía fatal (Richter, 1988; Weir, 1988) . Una reactividad cruzada serológica restringida entre la proteina de nucleocápside (N) y la fosfoproteina (P) de PVM y hRSV ha sido descrita pero ninguna de las proteínas externas muestra reactividad cruzada, y los virus pueden ser distinguidos entre ellos en ensayos de neutralización de virus (Chambers, 1990a; Giménez, 1984; Ling, 1989a) . Las glicoproteínas de PVM parecen diferir de las glicoproteínas de otros paramixovirus y se parecen a las glicoproteínas de RSV en términos de su patrón de glicosilación. Sin embargo difieren en términos de procesamiento. A diferencia de RSV, pero de manera similar a los demás paramixovirus, PVM tiene una actividad hemaglutinante con eritrocitos de murino, de lo cual la proteína G parece ser responsable puesto que un anticuerpo monoclonal para esta proteína inhibe la hemaglutinación (Ling, 1989b) . El genoma de PVM se parece al genoma de hRSV, incluyendo dos proteínas no estructurales en su extremo 3' y una organización genómica similar (Chambers, 1990a; Chambers, 1990b) . Las secuencias de nucleótidos de los genes NS1/NS2 de PVM no son detectablemente homólogos con los genes de hRSV (Chambers, 1991) . Algunas proteínas de PVM muestran una fuerte homología con hRSV (N: 60%, y F: de 38 a 40%) mientras que G es claramente diferente (la secuencia de aminoácidos es 31% más larga) (Barr, 1991; Barr, 1994; Chambers, 1992) . El gen P de PVM, pero no el gen de RSV de APV, ha sido reportado como codificando el segundo ORF lo que representa una proteína de PVM única (Collins, 1996) . Nuevos aislados de PVM son identificados por aislamiento de virus, ensayos de hemaglutinación, ensayo de neutralización de virus y varias técnicas de inmunofluorescencia. Tabla con suplemento : Homología de aminoácidos entre los diferentes virus dentro del género Pneumovirus de la subfamilia Pneumovirinae.
Gen hRSV s bRSV s oRSV v. bRSV v. bRSV v. PVM ¦ hRSV hRSV oRSV hRSV NS1 87 68-69 89 * NS2 92 83-84 87 N 96 93 60 P - 81 M - 89 F 89 80-81 38-4' G 53 88-100 21-29 38-41 60-62 * M2 92 94 41 SH 76 45-50 56 L _ * Ninguna homología de secuencia detectable El género Metapneumovirus Pneumovirus de las aves (APV) ha sido identificado como el agente etiológico de la rinotraqueitis de pavo (McDougall, 1986; Collins, 1988) y por consiguiente se conoce frecuentemente como virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) . La enfermedad es una infección del tracto respiratorio superior de pavos, que resulta en una alta morbidez y una mortalidad variable, pero frecuentemente alta. En pavas, el virus puede también inducir una reducción sustancial de la producción de huevo. El mismo virus puede también infectar pollos, pero en esta especie, la función del virus como patógeno primario es menos definida, aún cuando se relaciona comúnmente con un síndrome de cabeza hinchada (SHS) en pollos de cría (Cook, 2000) . Los viriones son pleyomórficos, aún cuando principalmente esféricos, con tamaños dentro de un rango de 70 a 600 nm y la nucleocápside, que contiene el genoma de ARN de sentido negativo, no segmentado, lineal, presenta una simetría helicoidal (Collins, 1986; Giraud, 1986) . Esta morfología se parece a la de miembros de la familia Paramyxoviridae. Análisis de proteínas codificadas con APV y ARNs sugieren que entre las dos subfamilias de esta familia (Paramyxovirinae e Pneumovirinae) , APV se parece de manera más estrecha a Pneumovirinae (Collins, 1988; Ling, 1988; Cavanagh, 1988) . APV no tiene proteínas estructurales (NS1 y NS2) y el orden de genes (3' -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5' ) es diferente del orden de genes de los pneumovirus de mamífero como por ejemplo RSV. Por consiguiente APV ha sido clasificado recientemente como la especie tipo para el nuevo género de Metapneumovirus (Pringle, 1999) . Diferencias en patrones de neutralización, ELISA y reactividad con anticuerpos monoclonales han revelado la existencia de diferentes tipos antigénicos de APV. El secuenciamiento de nucleótidos del gen G llegó a la definición de dos subtipos de virus (A y B) , que comparten solamente una homología del 38% a nivel de aminoácidos (Collins, 1993; Juhasz, 1994) . Un APV aislado de Colorado, Estados Unidos de América (Cook, 1999) , presenta una neutralización cruzada limitada con los subtipos A y B de virus basados en información de secuencia y fue designado como subtipo novedoso C (Seal, 1998; Seal 2000) . APVs no/A/B fueron aislados en Francia, y se mostró que eran antigénicamente distintos de los subtipos A, B y C. Con base en secuencias de aminoácidos de los genes F, L y G, estos virus fueron clasificados otra vez como un subtipo novedoso D (Bayon-Auboyer, 2000) . El diagnóstico de infección con APV puede obtenerse por aislamiento de virus en cultivos de órganos de tráquea de pollo o pavo (TOCs) o en cultivo de células Vero. Un efecto citopático (CPE) se observa generalmente después de uno o dos pasajes adicionales. Este CPE se caracteriza por áreas focales dispersas de redondeo celular provocando la formación de sincitios (Buys, 1989) . Numerosos ensayos serológicos, incluyen IF y ensayos de neutralización de virus han sido. La detección de anticuerpos para APV por ELISA es el método más comúnmente utilizado (O'Loan, 1989; Gulati, 2000). Recientemente, la reacción en cadena de polimerasa ha sido utilizada para diagnosticar infecciones con APV. Torundas tomadas de esófagos pueden ser utilizadas como material inicial (Bayon-Auboyer, 1999; Shin, 2000) . Alansari, H. and Potgieter, L.N.D. 1994. 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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo esencialmente de mamífero aislado (MPV) que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae e identificable como filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus. Un virus de ARN de una sola cadena de sentido negativo aislado (MPV) que pertenece a la subfamilia Pneumovirinae de la familia Paramyxoviridae e identificable cómo filogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus mediante la determinación de una secuencia de ácido nucleico de dicho virus y probándolo en análisis de árboles filogenéticos en donde se generan árboles de máxima probabilidad empleando 100 secuencias de arranque (bootstraps) y 3 mezclas (jumbles) y encontrando que presenta más cercanía filogenética con un aislado viral depositado como I-2614 ante el CNCM, Paris que con un aislado viral de Pneumovirus de las aves (APV) que se conoce también como virus de rinotraqueitis de pavo (TRTV) , el agente etiológico de la rinotraqueitis de las aves. Un virus de conformidad con la reivindicación 2, en donde dicho pneumovirus de las aves comprende APV de tipo C (APV-C) . Un virus de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3 en donde dicha secuencia de ácido nucleico comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica la proteina viral de dicho virus . ün virus de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicho marco de lectura abierto se selecciona dentro del grupo que consiste de ORFs que codifica las proteínas N, P, M y F. Un virus de conformidad con la reivindicación 5, en donde dicho marco de lectura abierto se selecciona dentro del grupo que consiste de ORFs que codifica la proteína SH o G. Un virus de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende un ácido nucleico o fragmento funcional filogenéticamente correspondiente a una secuencia mostrada en la figura 6. Un virus de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende un aislado de MPV depositado como 1-2614 ante el CNCM, Instituto Pasteur, Paris o un aislado viral filogenéticamente correspondiente a él. Un virus de conformidad con la reivindicación 8 aislable a partir de un ser humano afectado por una enfermedad del tracto respiratorio. Un ácido nucleico aislado o recombinante o fragmento funcional específico de MPV del mismo que puede obtenerse a partir de un virus de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 11. Un vector que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 12. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10 o un vector de conformidad con la reivindicación 11. 13. Una molécula proteinácea aislada o recombinante o fragmento funcional especifico de MPV de la misma codificado por un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 14. Un antigeno que comprende una molécula proteinácea o fragmento funcional especifico de MPV de la misma de conformidad con la reivindicación 13. 15. Un anticuerpo específicamente dirigido contra un antígeno de conformidad con la reivindicación 14. 16. Un método para identificar un aislado viral como un MPV, que comprende la reacción de dicho aislado viral o un componente del mismo con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15. 17. Un método para identificar un aislado viral como un MPV, que comprende la reacción de dicho aislado viral o un componente del mismo con un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 16 o 17, en donde dicho MPV comprende un MPV de ser humano. Un aislado viral identificable con un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 18 como un virus de APJST de una sola cadena de sentido negativo de mamífero dentro de la subfamilia Pneumov-írinae de la familia Paramyxoviridae e identificable como fílogenéticamente correspondiente al género Metapneumovirus. Un método para diagnosticar virológicamente una infección por MPV de un mamífero, que comprende la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un aislado viral o componentes del mismo por reacción de dicha muestra con un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15. Un método para diagnosticar serológicamente una infección por MPV de un mamífero, que comprende la determinación en una muestra de dicho mamífero de la presencia de un anticuerpo específicamente dirigido contra un MPV o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinácea o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 13 o un antígeno de conformidad con la reivindicación 14. Un kit de diagnóstico para diagnosticar una infección por MPV, que comprende un virus de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, una molécula proteinácea o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 13, un antigeno de conformidad con la reivindicación 14 y/o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15. El uso de un virus de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, un vector de conformidad con la reivindicación 11, una célula huésped de conformidad con la reivindicación 12, una molécula proteinácea o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 13, un antigeno de conformidad con la reivindicación 14, o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15 para la producción de una composición farmacéutica. El uso de conformidad con la reivindicación 23, para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de una infección con MPV. El uso de conformidad con la reivindicación 23 o 24 para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de enfermedades del tracto respiratorio . Una composición farmacéutica que comprende un virus de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 1 a 9, un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10, un vector de conformidad con la reivindicación 11, una célula huésped conformidad con la reivindicación 12, una molécula proteinácea o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 13, un antígeno de conformidad con la reivindicación 14, o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15. 27. Un método para el tratamiento o la prevención de una infección por MPV, que comprende el suministro de un individuo de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26. 28. Un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria que comprende el suministro a un individuo de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26. 29. Un método de conformidad con la reivindicación 27 o 28, en donde dicho individuo comprende un ser humano. 30. Un método para obtener un agente antiviral útil en el tratamiento de enfermedades del tracto respiratorio, que comprende el establecimiento de un cultivo celular o animal experimental que comprende un virus de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el tratamiento de dicho cultivo o animal con un agente antiviral candidato, la determinación del efecto de dicho agente sobre dicho virus o su infección de dicho cultivo o animal, y la selección de un agente antiviral con efecto deseado. 31. Un agente antiviral que puede obtenerse de conformidad con el método de la reivindicación 30. 32. El uso de un agente antiviral de conformidad con la reivindicación 31 para la preparación de una composición farmacéutica. 33. El uso de conformidad con la reivindicación 32 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades del tracto respiratorio. 34. El uso de conformidad con la reivindicación 32 o 33 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección por MPV. 35. Una composición farmacéutica que comprende un agente antiviral de conformidad con la reivindicación 31. 36. Un método para el tratamiento o prevención de una infección por MPV que comprende el suministro a un individuo de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35. 37. Un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria que comprende el suministro a un individuo de una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35. ün método de conformidad con la reivindicación 36 o 37 en donde dicho individuo comprende un ser humano. Un método para diagnosticar virológicamente una infección por MPV de un animal, que comprende la determinación en una muestra de dicho animal de la presencia de un aislado viral o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con un ácido nucleico o un anticuerpo que reacciona específicamente con un componente de un pneumovirus de las aves (APV) , dicho ácido nucleico o anticuerpo reacciona de manera cruzada con un componente de MPV. Un método para diagnosticar serológicamente una infección por MPV de un animal que comprende la determinación en una muestra de dicho animal de la presencia de un anticuerpo dirigido contra un MPV o un componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinácéa o fragmento de la misma o anticuerpo derivado de una aislado de APV o componente del mismo, dicha molécula, fragmento o antígeno se selecciona para que sea esencialmente homólogo con un componente de MPV. Un método para diagnosticar virológicamente una infección por APV de un ave, que comprende la determinación en una muestra de dicha ave de la presencia de un aislado viral o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 15, dicho ácido nucleico o anticuerpo reacciona de manera cruzada con un componente de APV. Un método para diagnosticar serológicamente una infección por APV de un ave, que comprende la determinación en una muestra de dicha ave de la presencia de un anticuerpo específicamente dirigido contra un APV o componente del mismo mediante la reacción de dicha muestra con una molécula proteinácea o fragmento de la misma de conformidad con la reivindicación 13 o un antígeno de conformidad con la reivindicación 14, dicha molécula, fragmento o antígeno seleccionándose por ser esencialmente homólogo con un componente de APV. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 39 a 42, en donde dicho APV comprende APV-C. El uso de una prueba de diagnóstico para detectar anticuerpos específicos para APV para la detección " de un anticuerpo dirigido contra MPV. El uso de conformidad con la reivindicación 44, en donde dicha prueba comprende un ensayo inmunoenzimático (EIA) . Un método para la detección de un anticuerpo dirigido contra MPV en una muestra, que comprende el estudio de dicha muestra en una prueba de diagnóstico diseñada para detectar anticuerpos específicos para APV. Un método de conformidad con la reivindicación 46, en donde dicha prueba comprende un ensayo inmunoenzimático (EIA) .
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