MXPA03003191A - Genes de serina proteasa novedosos relacionados con dppiv. - Google Patents

Abstract

Se proveen novedosos polipeptidos o proteinas que tienen una homologia de secuencia significativa con DPPIV, acidos nucleicos que los codifican, celulas que han sido modificadas con tales acidos nucleicos de modo de expresar estas proteinas, metodos de analisis para el descubrimiento de nuevos agentes terapeuticos que son inhibidores de la actividad de estas proteinas o de proteinas relacionadas, y agentes terapeuticos descubiertos por tales metodos de analisis, asi como nuevos tratamientos terapeuticos.

Description

GENES DE SERINA PROTEASA NOVEDOSOS RELACIONADOS CON DPPIV Campo de la Invención La presente invención se refiere a novedosas serina proteasas relacionadas con dipeptidil peptidasa IV (DPPIV) , y a ácidos nucleicos aislados que codifican estas proteasas, todos los cuales son útiles para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos, para medir la actividad de proteasa y para determinar la actividad inhibitoria de compuestos contra estas proteasas . Antecedentes de la Invención Las proteasas y las peptidasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces amida peptidicos. Las proteasas juegan un importante papel en la regulación de procesos biológicos en casi cada forma de vida, de bacterias a virus a mamíferos. Llevan a cabo funciones criticas, por ejemplo, en la digestión, la coagulación de la sangre, la apóptosis, la activación de respuestas inmunes, la activación de cimógeno, la maduración viral, la secreción de proteínas y el tráfico de proteínas. Pueden clasificarse de acuerdo con varios criterios, tales como el sitio de acción, la preferencia del sustrato, y el mecanismo. Así, por ejemplo, las aminopeptidasas actúan de manera preferencial en los residuos N-terminales de un péptido, mientras que las carboxipeptidasas actúan preferencialmente en el término C y las endopeptidasas actúan en sitios retirados de los dos términos. Entre las carboxi y las aminopeptidasas, las peptidil peptidasas cortan un solo residuo de aminoácido del sustrato, las dipeptidil peptidasas cortan una unidad dipéptido (dos aminoácidos) del sustrato, y las tripeptidasas cortan tres aminoácidos del sustrato. La preferencia del sustrato es frecuentemente expresada en términos del residuo de aminoácido inmediatamente N-terminal al sitio de corte. Por ejemplo, las peptidasas similares a tripsina cortarán preferencialmente un péptido junto a un aminoácido básico (arginina o lisina) , es decir donde el enlace hidrolizado es el enlace Arg/Lys-Xaa. Como otro ejemplo, la familia de las peptidasas similares a quimotrip-sina hidrolizan preferencialmente péptidos adyacentes a un residuo aromático. De manera mecánica, las peptidasas son clasificadas como serina dependientes, cisteina dependientes, dependientes de ácido aspártico o dependientes de zinc. Debido a que las peptidasas y las proteasas están implicadas en la regulación de muchos procesos biológicos, son objetivos atractivos para el desarrollo de agentes terapéuticos. Los inhibidores de proteasa y peptidasa, por ejemplo, son usados en el tratamiento de hipertensión, desórdenes de la coagulación e infección viral. Las enzimas proteoliticas que explotan serina en su actividad catalítica están en todas partes, encontrándose en virus, bacterias y eucariotes . Mas de 20 familias (denotadas SI-S27) de la serina proteasa han sido identificadas; éstas son agrupadas en seis clanes (SA, SB, SC, SE, SF y SG) con base en la similaridad estructural y otra evidencia funcional. Se conocen las estructuras para cuatro de los clanes (SA, SB, SC y SE) ; parecen estar totalmente no relacionadas, sugiriendo al menos cuatro orígenes evolutivos de las serina peptidasas y posiblemente muchos mas, Rawlings y Barrett, Meth. Enzymol. 244:19-61 (1994) . La familia de las prolil oligopeptidasas consiste en varias peptidasas relacionadas evolutivamente cuya actividad catalítica parece estar provista por un sistema de relevo de carga similar al de la familia de la tripsina de las serina proteasas, pero que evolucionó mediante evolución convergente independiente. Se ha demostrado experimentalmente que un residuo de serina (en proteasa II de E. coli así como en PE de cerdo y bacteriana) es necesario para el mecanismo catalítico. Esta serina, que es parte de la triada catalítica (Ser, His, Asp) está ubicada generalmente alrededor de 150 residuos lejos del extremo C-terminal de estas enzimas (que son todas proteínas que contienen alrededor de 700 a 800 aminoácidos) . Una de las prolil oligopeptidasas mas intensamente estudiadas es la dipeptidil peptidasa IV (DPPIV, EC 3.414.5), una glicoproteína tipo II, que es la única dipeptidil aminopeptidasa bien caracterizada conocida por estar ubicada en el lado externo de membranas de plasma. Como se indicó antes, las dipeptidil aminopeptidasas están caracterizadas por su capacidad para cortar dipéptidos N-terminales de una variedad de péptidos pequeños. Las dipeptidil aminopeptidasas muestran diferentes especificidades de sustrato y localización celular, sugiriendo diferentes funciones de cada actividad en el procesamiento de péptidos. DPPIV está caracterizada por su capacidad para cortar dipéptidos N-terminales conteniendo prolina o alanina como el penúltimo residuo. El gen DPPIV abarca aproximadamente 70 kb y contiene 26 exones, variando en tamaño de 45 bp a 1.4 kb. La secuencia de nucleótidos (3,465 bp) del ADNc contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido que comprende 766 aminoácidos. Los nucleótidos que codifican la secuencia del sitio activo (G-W-S-Y-G) están divididos entre dos exones. Esto distingue claramente la organización genómica de la familia de las prolil oligopeptidasas de la familia clásica de las serina proteasas. La DPPIV está distribuida ampliamente en tejidos de mamíferos y se encuentra en gran abundancia en los ríñones, el epitelio intestinal y la placenta (Yaron, A., y Naider, F. , Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol . 1993 [1], 31). En el sistema inmunológico humano, la enzima es expresada casi exclusivamente por linfocitos T activados del tipo CD4+ donde se ha demostrado que la enzima es sinónimo del antígeno CD26 de la superficie celular. Aunque el papel exacto de DP-IV en la fisiología humana no ha sido totalmente comprendido, investigaciones recientes han demostrado que la enzima claramente tiene un papel principal en la fisiología y la patofisiología humanas. En células T humanas, la expresión de DPPIV aparece tardía en la diferenciación tímica y es preferencialmente restringida a la población de ayuda/memoria de CD4+, y CD26 puede entregar una potencia señal de activación de células T coestimulante. La DPPIV, también conocida como el antígeno CD26 de activación de células T, por consiguiente juega un importante papel en la respuesta inmune vía asociación con CD45 tirosina fosfatasa y, mediante su capacidad de ligar adenosina desaiainasa (ADA) a la superficie de las células T, protege las células T de la inhibición de proliferación mediada por adenosina. A mayor abundamiento, la regulación de la función de las quimocinas por CD26/DPPIV parece ser esencial para el tráfico de linfocitos y la infectividad de cepas de HIV. Se ha asociado DPPIV con numerosas funciones, que incluyen implicación en la activación de células T, adhesión celular, digestión de péptidos que contiene prolina en el riñon y el intestino, infección por HIV y apóptosis, y regulación de la tumorigenicidad en ciertas células de melanoma, Pethiyagoda y colaboradores, Clin. Exp. Metástasis 2000 18 (5) : 391-400. La DPPIV también está implicada en la regulación endocrina y la fisiología metabólica. De manera mas particular, la DPPIV corta el dipéptido His-Ala amino terminal de GLP-1, generando un antagonista del receptor de GLP-1, y con ello acorta la respuesta fisiológica a GLP-1. El péptido similar a glucágono 1 (GLP-1) , una incretina que induce secreción de insulina dependiente de glucosa, es rápidamente degradado por la DPPIV, y como la vida media para el corte por DPPIV es mucho menor que la vida media para el retiro de GLP-1 de la circulación, se anticipa un incremento significativo en la bioactividad de GLP-1 (5 a 10 veces) a partir de la inhibición de DPP-IV. Los inhibidores de DPPIV están siendo estudiados actualmente en clínica como agentes terapéuticos potenciales para diabetes tipo 2 y tolerancia a la glucosa afectada. Se conocieron en 1998 varios diferentes inhibidores de DPPIV. Uno de estos es una N-Ala-Pro-O- (nitrobencil) -hidroxila-mina inhibidora de suicidio. Otro es un inhibidor competitivo: e- (4-nitro) benzoxicarbonil-Lys-Pro, y otro es una inmunoglobulina de DPPIV de ratón anti-porcino de conejo, policlonal. Otros se han desarrollado desde entonces y se describen en detalle en las patentes US 5,939,560; 6,110,949; 6,011,155; y 5,462,928. En adición a pero de manera independiente a su actividad catalítica tipo serina, la DPPIV se liga estrechamente a la enzima extra-celular adenosina desaminasa (ADA) , que actúa como un receptor y se piensa que media la transducción de señal. La estructura de DPPIV está caracterizada por dos dominios extra-celulares, un dominio de hidrolasa de pliegue a/ß y un dominio de propulsor beta de siete aspas consistente en láminas beta repetidas de alrededor de 50 aminoácidos. Se ha mostrado recientemente que, además de seleccionar sustratos por tamaño, el dominio propulsor beta, que contiene 10 de los 12 residuos de cisteína altamente conservados, contribuye a la catálisis del dominio de peptidasa. En adición, el dominio rico en cisterna es responsable de ligadura por DPPIV a colágeno I y a ADA extra-celular. También se reporta que la DPPIV juega un papel en interacciones mediadas con fibronectina de células con la matriz extra-celular. Estudios recientes demuestran que la actividad de proteasa de la DPPIV no es requerida para su actividad antiinvasiva debido a que los mutantes de DPPIV que carecen la actividad de serina proteasa extra-celular conservan tal actividad. Se han reportado en la literatura diversas proteínas que comparten similitudes con DPPIV. Varias de estas proteínas han sido clonadas, incluyendo DPP-I, DPP-II, DPP-III, DPP-X, y la proteína de activación de fibroblastos (FAP) . Estas han sido identificadas y caracterizadas ya sea por clonación molecular y estudios funcionales de proteínas expresadas o como actividades bioquímicas en extractos de tejidos. DPPIV-beta y otras peptidasas novedosas con similitudes funcionales a DPPIV no han sido todavía clonadas. Son retos significativos la identifica-ción, la caracterización y/o la clasificación apropiada de miembros adicionales de la familia de las prolil oligopeptidasas, la elucidación de su papel fisiológico (y particularmente patofisiológico) , y la aplicación de ese conocimiento al desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Compendio de la Invención La presente invención provee proteínas con actividades de prolil oligopeptidasas (corte post-prolina) que constituyen tres miembros novedosos de una familia de proteínas relacionadas con DPPIV, incluyendo las proteínas de longitud completa, formas empalmadas alternativas, sub-unidades, y mutantes, así como secuencias de nucleótidos que las codifican. La presente invención también provee métodos de analizar sustratos, proteínas de interacción, agonistas, antagonistas o inhibidores de las proteínas anteriores, y a mayor abundamiento a composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas y/o los mutantes, derivados y/o análogos y/o ligandos de los anteriores. Estas novedosas proteínas que tienen una significativa homología de secuencia con DPPIV son llamadas proteínas relacionadas a dipeptidil peptidasa 1, 2 y 3 (DPRP-1, DPRP-2 y DPRP-3) . Las secuencias de aminoácidos de DPRP-1, DPRP-2 y DPRP-3 son dadas en las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, respectivamente. También se divulgan secuencias de ácido nucleico que codifican estas proteínas (SEQ ID NOS: 2, 4 y 5) . La Tabla 1 ilustra la homología (es decir, la similitud) entre las novedosas proteínas DPRP-1, DPRP-2 y DPRP-3 y otras serina proteasas conocidas.

Tabla 1 - Comparación de secuencias de estas tres novedosas proteínas con DPPIV y otros miembros de la familia S9, clan SC y de la sub-familia B Familia de Nombre de # de aminoHomología Región Triada Ser- Ubicación de pH Óptimo Proteasas Proteasa ácidos con DPPIV TM Asp-His gen Clan CA, DPPI 463 N N N llql4. l-ql4.3 - Familia Cl Clan SC, DPPII 500 N Y N - 4.5-6.0 Familia S28 QPP 492 N N N - 4.5-7.5 PCP 496 N N N - - Sin asignar DPPIII 737 N N N - - Clan SC, DPPIV 766 100 Y Y 2q24.3 7.5-8.0 Familia S9, Sub-familia DPPVI 865 52 Y Mutación 7 B FAP 760 70 Y Y 2q23 7.5-8.0 DPRP-1 882 41 N Y 15q22.1-15q22.2 7.5-8.0 DPRP-2 864 39 N Y 19pl3.3 7.5-8.0 DPRP-3 796 54 Y Mutación 2ql2.3-2ql4.1 - La mayor homología entre DPRP-1, DPRP-2 y DPPIV es vista en las secuencias C-terminales . Con base en la homología de secuencia con DPPIV (ver figura 1) , se puede predecir que estas proteínas DPRP tendrían funciones que incluyen, pero no se limitan a, papeles como enzimas. La clonación, la expresión, la caracterización bioquímica y molecular han confirmado esta hipótesis . El patrón de expresión de las proteínas DPRP y la localización en células epiteliales especializadas y células del plasma (células de Leydig, células epiteliales de la próstata, linfocitos, células B) son consistentes con un papel en diferenciación, proliferación e inflamación. La locación del gen DPRP-1 en cánceres sensibles a hormonas (de pecho, próstata, testículos) , tejidos regulados por testosterona y la expresión abundante en cánceres pobremente diferenciados demuestran que las moléculas de activación o inhibición de DPRP tendrán numerosas aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de desórdenes caracterizados por crecimiento, diferenciación y síntesis y degradación de hormonas de polipéptido y esteroides desregulados. Los datos divulgados en la presente soportan la hipótesis de que DPRP-1 y DPRP-2 están implicadas en la regulación de la proliferación de modelos in vitro de cáncer de próstata y testículos bien conocidos por los técnicos en la materia. Las actividades de DPRP-1 y DPRP-2 descritas en la presente y sus patrones de expresión son compatibles con el hecho de que tengan papeles funcionales como reguladores fisiológicos de los sistemas inmunológico y neuro-endocrino mediante la modificación enzimática de mediadores bioquimicos como péptidos y quimocinas. Las numerosas funciones previamente descritas para DPPIV con base en el uso de inhibidores pueden deberse en parte a su acción y la de proteínas similares, como las DPRPs. Por tanto, el descubrimiento de inhibidores selectivos y potentes de DPPIV, de las DPRPs y de otras proteasas relacionadas, como FAP, es considerado central para lograr el uso efectivo y farmacéuticamente seguro de estos y cualesquiera nuevos inhibidores de serina proteasas recién identificados, asi como de otros compuestos activos que modifican la o las funciones de tales proteínas . La invención de esta manera provee novedosos polipépti-dos o proteínas, los ácidos nucleicos que los codifican, células que han sido modificadas con el ácido nucleico de modo de expresas estas proteínas, anti-cuerpos a estas proteínas, un método de análisis para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos que son inhibidores de la actividad de estas proteínas (o que son inhibidores de DPPIV y no de las proteínas), y agentes terapéuticos descubiertos mediante tales métodos de análisis. Las novedosas proteínas y los ácidos nucleicos que las codifican pueden por tanto usarse para descubrir nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de ciertas enfermedades, tales como, por ejemplo, desórdenes reproductivos, inflamatorios y metabólicos, y tambié en la preparación de anti-cuerpos con valor terapéutico o de diagnóstico. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proveen novedosas proteínas biológicamente activos, maduras, principalmente de origen humano. Tales proteínas pueden ser aisladas en pequeñas cantidades a partir de tejidos animales (incluyendo humanos) adecuados o fluidos biológicos, por medio de técnicas estándar; sin embargo, cantidades mas grandes son preparadas de manera mas conveniente en cultivos de células genéticamente modificadas de modo de expresar la proteina. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proveen moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de la presente invención, incluyendo ARNm, ADNs, ADNc, ADN genómico, de las mismas. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proveen también sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de longitud suficiente para hibridar de manera específica a una secuencia de ácido nucleico de la presente invención. De acuerdo con un aspecto todavía adicional de la presente invención, se proveen procesos que utilizan técnicas recombinantes para producir tales polipéptidos útiles para investigación científica in vitro, por ejemplo síntesis de ADN y elaboración de vectores de ADN. Procesos para producir tales polipéptidos incluyen cultivar células hospederas procarióticas y/o eucarióticas, recombinantes, que han sido transíectadas con vectores de ¾DN que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica tal polipéptido y/o la proteina madura bajo condiciones que promueven la expresión de tal proteína y la recuperación subsecuente de tales proteínas o un fragmento del producto expresado . De acuerdo con todavía otro aspecto, la invención provee métodos para usar polipéptidos DPRP y polinucleótidos, incluyendo el tratamiento de infecciones, tales como infecciones bacterianas, por hongos, por protozoarios y virales, particularmente infecciones ocasionadas por HIV-1 o HIV-2, dolor, diabetes, pubertad precoz, infertilidad, obesidad, anorexia, bulimia, mal de Parkinson, falla cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto al miocardio, embolia, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna, cánceres, incluyendo cánceres sensibles a hormonas e independientes de andrógenos, migrañas, vómitos, desórdenes psicóticos y neurológicos, incluyendo ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, depresión, demencia y retardo mental severo, y disquinesias, en lo sucesivo referidos colectivamente como "las enfermedades". De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se provee un proceso para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para el descubrimiento de compuestos que inhiben la actividad biológica de sus proteínas maduras, v.gr., cortando un dipéptido N-terminal, y tales inhibidores son de esta manera también provistos . De acuerdo con un aspecto mas específico, la invención provee un ácido nucleico aislado que codifica (a) un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, o (b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 70% similar a ella y exhibe la misma función biológica, o que es una variante de empalme alternativa de una de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, o que es una sonda que comprende al menos 14 nucleótidos contiguos de dicho ácido nucleico que codifica (a) o (b) , o que es complementaria a uno de los anteriores. De acuerdo con otro aspecto específico, la invención provee un polipéptido que puede ser adicionalmente glicosilado, y que (1) tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína madura especificada en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5; (b) tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína madura que tiene al menos alrededor de 70% de similitud con una de las proteínas maduras de (a) y que exhibe la misma función biológica; (c) tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína madura que tiene al menos alrededor de 90% de identidad con una proteína madura de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5; o (d) es un fragmento inmunológicamente reactivo de (a) . De acuerdo con todavía otro aspecto específico, la invención provee un método para analizar un compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática de al menos una proteina madura de la invención, el cual método comprende incubar dicha proteina madura y un sustrato adecuado para dicha proteina madura en presencia de uno o mas compuestos de prueba o sus sales, medir la actividad enzimática de dicha proteina madura, comparar dicha actividad con actividad comparable determinada en ausencia de un compuesto de prueba, y seleccionar el compuesto de prueba o compuestos que reducen la actividad enzimática, y también provee un método para analizar un compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática de DPPIV que no inhibe la actividad enzimática de al menos una proteina madura y un sustrato adecuado en presencia de uno o mas inhibidores de DPPIV o sus sales, medir la actividad enzimática de dicha proteina madura, comparar dicha actividad con actividad comparable determinada en ausencia del inhibidor de DPPIV, y seleccionar un compuesto que no reduce la actividad enzimática de dicha proteina madura. Breve Descripción de los Dibujos Las figuras 1A y IB muestran la alineación co-lineal de DPRP-1, DPRP-2, DPRP-3, y DPPIV, suministrándose sombreado para indicar los mismos (negro) o similares (gris) residuos de aminoácidos en un lugar particular. La figura 2 es similar a la figura 1 y muestra alineación co-lineal de DPRP-2 humana y de ratón. La figura 3 es una gráfica que muestra los efectos de diversos inhibidores de tetrapéptido amida sobre la actividad enzimática de dipeptidil peptidasa. Las figuras 4A-4C muestran los efectos de tres compuestos inhibidores sobre la proliferación de lineas celulares de cáncer de próstata PC3 a diversas dosis. Descripción Detallada de las Formas de Realización Preferidas De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proveen secuencias de ácido nucleico aisladas (polinucleótidos ) que codifican los polipéptidos maduros que tienen las secuencias de aminoácidos deducidas de las tres DPRPs (SEQ ID NOS: 1, 3 y 5) . Los polinucleótidos de esta invención fueron descubiertos usando una biblioteca de ADNc de testículo humano (DPRP-1), una biblioteca de colon humano (DPRP-2) , y una biblioteca de ADNc de hipotálamo humano (DPRP-3) . Ácido nucleico aislado para DPRP-1 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de aproximadamente 882 aminoácidos de longitud que está estructu-ralmente relacionada con DPPIV humana, mostrando 26% de identidad, y 41% de similitud con toda la secuencia de la proteína DPPIV humana. Ácido nucleico aislado de DPRP-2 contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de aproximadamente 864 aminoácidos, que es 39% similar a toda la secuencia de aminoácidos de DPPIV. El análisis de la secuencia de aminoácidos primarios de DPRP-1 y DPRP-2 usando las gráficas de hidrofobici-dad predice que estas dos proteínas no tienen un dominio de trans-membrana . A pesar de este hecho, es posible que estas serina proteasas intra-celulares sean secretadas al ocurrir activación celular. La prolina dipeptidasa (QPP) de células quiescentes es una serina proteasa que es objetivada a vesículas intra-celulares que son distintas de lisosomas (Chiravuri, M., y colaboradores, J. Immunol. 2000 nov. 15: 165 (10) : 5695-702) . Esta hipótesis expande el o los sitios potenciales y el ámbito de la implicación de DPRP-1 y DPRP-2 en mecanismos para regulación post-traduccional de quimocinas, citocinas, péptidos y polipépti-dos . La secuencia de DPRP-3 de longitud completa contiene 796 aminoácidos, un péptido de señal de 1 a 48, y un dominio de trans-membrana entre 34 y 56. Se predice que la proteína madura sea una proteína de trans-membrana tipo II y pueda ser cortada para producir una forma soluble. La secuencia de aminoácidos es especificada en la SEQ ID NO: 5, la cual fue deducida de la SEQ ID NO: 6 y tiene 54% de similitud con DPPIV. Las alineaciones de secuencia de aminoácidos de estos polipéptidos con miembros de la sub-familia S9B de las enzimas prolil oligopeptidasas muestran que las tres proteínas DPRP tienen una secuencia y una homología estructural globales con DPPIV y FAP. Se predice que las DPRPs son miembros del clan SC (serina nucleófilo) de enzimas con residuos catalíticos en el orden Ser, Asp, His y la secuencia de sitios activos (G- -S-Y-G) .

Tabla 2. Homología (es decir, similitud) entre DPRP-1, DPRP-2, DPRP-3 y miembros de las enzimas de la familia S9B de prolil oligopeptidasas DPPIV 41 DPRP-1 39 74 DPRP-2 54 39 40 DPRP-3 70 41 39 52 FAP 52 40 42 68 54 DPPVI DPRP-1 , DPRP-2 y DPRP-3 no exhiben similitud de secuencia con cualquiera de los miembros de las familias clásicas de las serina proteasas, quimotripsina y subtilisina. El orden de los residuos de la triada catalítica es diferentes en las tres principales familias relacionadas del clan SC: His-Asp-Ser en quimotripsina, Asp-His-Ser en subtilisina y Ser-Asp-His en las prolil oligopeptidasas. Como se muestra en la Tabla 2, DPRP-3 tiene la mayor homología con DPPVI (68% de homología y 51% de identidad) . Wada y colaboradores aislaron clonas de ADNc para DPPVI, una proteína relacionada a DPPIV, de bibliotecas de cerebro de bovino, rata (Wada y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 89:197-201 (1992)) y ser humano (Yokotani y colaboradores, HUIR. Molec. Genet. 2:1037-1039 (1993)). Demostraron que, a diferencia de DPPIV, la triada catalítica en DPPVI no tiene el primer residuo serina. En DPRP-3, dos de los aminoácidos en la triada catalítica caracte-ristica de la familia de la serina proteasa son conservados. Sin embargo, el residuo serina mismo es reemplazado por glicina. Aunque la ausencia del residuo serina es factible que impida actividad de proteasa en este sitio, es posible que permanezcan intactas muchas otras funciones mediadas por otros dominios funcionales de la proteina. Como se describió antes brevemente, DPPIV es una molécula multi-funcional que ejerce funciones importantes, dependiendo de las células y tejidos expresados, además de su actividad catalítica como peptidasa. DPRP-3 y DPPVI también es factible que mantengan múltiples funciones a pesar de la ausencia de una triada catalítica intacta. Por ejemplo, se ha implicado a DPPVI en la regulación de las plasticidad neuronal . DPPVI es expresada altamente en el hipocampo, el tálamo, y el hipotálamo. Además, el paro de desarrollo y la fatalidad embriónica de embriones Rw/Rw de rabadilla blanca se piensa se debe a la disrupción del gen DPPIV. La mutación Rw está asociada con una inversión cromosomal que abarca 30 cM de la porción próxima del cromosoma 5 de ratón. El análisis genómico del gen DPPIV en el cromosoma Rw coloca el punto de ruptura de inversión en la región de codificación, lo que resulta en una pérdida de una fracción significativa de la región C-terminal, Hough, R.B., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 95, 13800-13805 (1998) . El gen DPRP-1 humano, predecido ser de 32, 688 bp de longitud, tiene al menos 22 exones y ocho transcripciones. Mapea al cromosoma 15 (NT_010265) en la posición 15q21.1-I5q22.1. Las longitudes de las transcripciones variantes de empalme alternativas, predecidas, varían entre 602 y 4,523 bp (ver SEQ ID NOS: 7-22) . Esto está en concordancia con las múltiples transcripciones observadas por análisis de manchado Northern (ver Ejemplo 2). ESTs que representan las transcripciones fueron encontradas en numerosos tejidos, incluyendo fibroblastos seniles, linfocitos T, células B germinales centrales, seminoma de células germinales, testículos, melanocitos, útero, ovario, pecho, lesiones de esclerosis múltiples, páncreas y placenta. La DPRP-2 humana pertenece a un gen con al menos 27 exones y nueve variantes de empalme (ver SEQ ID NOS: 23-40) . Se observó una SNP en 3' UTR (55% (37) C vs . 12% (5)T) . El gen DPRP-2 mapea a la región 19pl3.3 del cromosoma 19. Esta ubicación es anfitrión a varios marcadores de enfermedades y está asociada con diversos desórdenes, incluyendo hipercalcemia hipocalciúrica, ataxia cerebelar tipo II, distrofia muscular, convulsiones, susceptibilidad a ateroesclerosis, psoriasis, displasia ectodér-mica, y leucemia mieloide aguda. En concordancia con la distribución siempre en todas partes del ARNm observado por análisis de manchado Northern (ver Ejemplo 2), se expresó DPRP-2 en una amplia variedad de tejidos al examinarse la cobertura de EST (v.gr., mas de 64 ESTs expresados en hígado, bazo, músculo, melanocitos, corazón, pulmón, placenta, piel, páncreas, estómago, glándula paratiroides del cerebro) .

La DPRP-3 humana pertenece a un gen con al menos 23 exones y dos variantes de empalme (ver SEQ ID NOS: 41-44) . El gen mapea al cromosoma 2 (NT_005445) en la posición 2ql2.3-2ql4.1. Las transcripciones de DPRP-3 no muestran una distribución tan amplia ' como DPRP-1 y DPRP-2. Como se muestra por análisis de manchado Northern en el Ejemplo 2, la expresión de DPRP-3 es restringida al cerebro y el páncreas. ESTs que representan el ARNm de DPRP-3 eran abundantes en tejido derivado de lesiones de esclerosis múltiple, hipotálamo, cerebro completo y nervios, con unas cuantas transcripciones encontradas en el útero y el colon. Las relaciones entre proteasas de humano y roedor en el clan SC, incluyendo DPRP-1, DPRP-2 y DPRP-3 fueron analizadas usando el método de unión de vecinos (NJ) , ver Saitou y Nei, Mol . Biol. Evol. 4, 406-525 (1987) . El análisis filogenético muestra que entre las proteasas S9, DPRP-1 y DPRP-2, ambas careciendo de un dominio de trans-membrana, se distinguen de DPPIV y sus proteínas estrechamente relacionadas como FAP. Sin embargo, la similitud es mostrada entre DPPIV y FAP y entre DPRP-3 y DPPVI, que son todas proteínas de membrana tipo II. Una búsqueda en base de datos de genes adicionales relacionados con DPRP reveló la presencia de una secuencia de murino relacionado con DPRP-1. La alineación de esta secuencia de ratón con las novedosas proteasas humanas muestra que DPRP-lm despliega una considerable homología con su contraparte humana (figura 2) . Un técnico en la materia reconocerá fácilmente que el novedoso gen de proteasa de ratón puede ser aislado usando la información de secuencia divulgada en la presente y puede incorporarse fácilmente en una de las construcciones de expresión usadas rutinariamente que son bien conocidas en la materia. El uso de esta secuencia divulgada por los técnicos en la materia para generar un modelo de ratón transgénico empleará el desarrollo de vectores de objetivación de gen, por ejemplo, que dan como resultado recombinación homologa en células madre embriónicas de ratón. El uso de ratones aturdidos en el análisis adicional de la función de los genes DPRP es una valiosa herramienta. Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en la forma de ARN o en la forma de ADN; ADN debe entenderse que incluye ADNc, ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hélice o de hélice sencilla y, si es de hélice sencilla, puede ser la hélice de codificación o la hélice de no codificación (anti-sentido) . La secuencia de codificación que codifica el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia de codificación mostrada en las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, respectivamente, o puede ser una diferente secuencia de codificación que codifica el mismo polipéptido maduro, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético o un polimorfismo de un solo nucleótido . Por ejemplo, puede también ser una transcripción de ARN que incluye toda la longitud de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6.

Los polinucleótidos que codifican las proteínas maduras de las SEQ ID NOS: 1 , 3 y 5, respectivamente, pueden incluir pero no se limitan a la secuencia de codificación para la proteina madura sola; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro mas una secuencia de codificación adicional, tal como una secuencia guia o de secreción o una secuencia de pro-proteina; y la secuencia de codificación para la proteina madura (y, opcionalmente, la secuencia de codificación adicional) mas la secuencia de no codificación, tal como intrones o una secuencia de no codificación 5' y/o 3' de la secuencia de codificación de la proteina madura. De esta manera, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" o el término '""ácido nucleico que codifica un polipéptido" debe ser entendido para englobar un polinucleótido o ácido nucleico que incluye solamente la secuencia de codificación para la proteina madura asi como una que incluye una secuencia adicional de codificación y/o no codificación. Los términos "polinucleótidos" y "ácido nucleico" son usados de manera intercambiable. La presente invención también incluye polinucleótidos donde la secuencia de codificación para la proteina madura puede estar fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión y la secreción de un polipéptido a partir de una célula hospedera; por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia de secreción para controlar el transporte de un polipéptido de la célula puede fusionarse de esta manera. El polipéptido que tiene tal secuencia líder es llamado una pre-proteína o una pre-pro-proteína y puede tener la secuencia líder cortada, por la célula hospedera para formar la forma madura de la proteína. Estos polinucleótidos pueden tener una región 5' extendida de modo que codifique una pro-proteína, que es la proteína madura mas residuos de aminoácido adicionales en el término N. El producto de expresión que tiene tal pro-secuencia es llamado una pro-proteína, que es una forma inactiva de la proteína madura; sin embargo, una vez que la pro-secuencia es cortada, permanece una proteína madura activa. De esta manera, por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar proteínas maduras, o proteínas que tienen una pro-secuencia, o proteínas que tienen tanto una pro-secuencia como una pre-secuencia (secuencia líder) . Los polinucleótidos de la presente invención pueden también tener la secuencia de codificación fusionada en un marco a una secuencia marcadora que permite la purificación de los polipéptidos de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser un marbete polihistidina, un marbete hemaglutinina (HA) , un marbete c-myc o un marbete V5 cuando se usa un anfitrión mamífero, v.gr., células COS-1. El marbete HA correspondería a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson, I., y colaboradores, Cell 37:767 (1984)), y el marbete c-myc puede ser un epítope de la proteina Myc humana (Evans, G.I., y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 5:3610-3616 (1985)) . El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en producir una cadena de polipéptido incluye regiones que preceden y que siguen a la región de codificación (líder y posterior) así como secuencias que intervienen (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones) . El término "homología de secuencia significativa" está destinado a denotar que al menos 25, de preferencia al menos 40% de los residuos de aminoácidos son conservados, y que de los residuos no conservados, al menos 40% son sustituciones conservadas. Fragmentos de los genes de longitud completa de la presente invención pueden ser usados como una sonda de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar ADNc de longitud completa así como para aislar otros ADNc que tienen homología de secuencia significativa al gen y que codificarán proteínas o polipéptidos teniendo actividad o función biológica similar. Por "actividad o función biológica similar", para los fines de esta solicitud, se quiere decir la capacidad de cortar un dipéptido N-terminal que tiene Ala o Pro como el penúltimo residuo u otros aminoácidos. Tal sonda de este tipo tiene al menos 14 bases (al menos 14 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6) , de preferencia al menos 30 bases, y puede contener, por ejemplo, 50 o mas bases. Tal sonda puede también ser usada para identificar una clona de ADNc correspondiente a la transcripción de longitud completa y/o una clona o clonas genómicas conteniendo el gen completo, incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones e intrones. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención son útiles para analizar una biblioteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para localizar miembros de la biblioteca a los cuales híbrida la sonda. Como un ejemplo, una secuencia de ADN conocida puede ser usada para sintetizar una sonda de oligonu-cleótido que es entonces usada al analizar una biblioteca para aislar la región de codificación de un gen de interés. La presente invención es considerada proveer adicional-mente polinucleótidos que hibridan a las secuencias antes descritas donde hay al menos 70, de preferencia al menos 90, y con mayor preferencia al menos 95% de identidad o similitud entre las secuencias, y de esta manera codifican proteínas que tienen actividad biológica similar. Mas aún, como se conoce en la materia, hay "similitud" entre dos polipéptidos cuando las secuencias de aminoácidos que contienen sustitutos de aminoácidos iguales o conservados para cada residuo individual en la secuencia. La identidad y la similitud pueden ser medidas usando software de análisis de secuencias (v.gr., el paquete de software de análisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, Estados Unidos) . La presente invención provee particularmente tales polinucleótidos que hibridan bajo condiciones severas a los polinucleótidos anteriormente descritos. Como se usa en la presente, el término "condiciones severas" significa condiciones que permiten la hibridación entre secuencias de polinucleótidos y las secuencias de polinucleótido de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, donde hay al menos alrededor de 70% de identidad. Condiciones adecuadamente severas pueden ser definidas por, v.gr., las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de pre-hibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la materia. En particular, la severidad puede ser incrementada reduciendo la concentración de sal, incrementando la concentración de formamida, y/o elevando la temperatura de hibridación. Por ejemplo, la hibridación bajo condiciones severas puede emplear alrededor de 50% de formamida a alrededor de 37 a 42°C, mientras que la hibridación bajo condiciones severas reducidas puede emplear alrededor de 35 a 25% de formamida a alrededor de 30 a 35°C. Un conjunto particular de condiciones para hibridación bajo condiciones de alta severidad emplea 42 °C, 50% de formamida, 5x SSPE, 0.3% SDS, y 200 ug/ml de ADN de esperma de salmón sometido a esfuerzo cortante y desnaturalizado. Para hibridación bajo severidad reducida, pueden usarse condiciones similares a las antes descritas en 35% de formamida a una temperatura reducida de 35°C. El rango de temperaturas correspondiente a un nivel particular de severidad puede ser reducido adicionalmente calculando la relación de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura de manera consecuente. Variaciones de los rangos y condiciones anteriores son bien conocidas en la materia. De preferencia, la hibridación debe ocurrir solamente si hay al menos 95, y con mayor preferencia al menos 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que hibridan a los polinucleótidos antes descritos en una forma de realización preferida codifican polipéptidos que exhiben sustancialmente la misma función o actividad biológica que la proteina madura codificada por uno de los ADNc de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6. Como se mencionó, una sonda adecuada de polinucleótidos puede tener al menos 14 bases, de preferencia 30 bases, y con mayor preferencia al menos 50 bases, e hibridará a un polinucleó-tido de la presente invención que tiene identidad con ella, como se describió anteriormente, y que puede o no conservar actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden ser empleados como una sonda para hibridar a los polinucleótidos de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, respectivamente, por ejemplo, para recuperación de tal polinucleótido, o como una sonda de diagnóstico, o como un cebador de PCR. De esta manera, la presente invención incluye polinucleótidos que tienen al menos 70% de identidad, de preferencia al menos 90% de identidad, y con mayor preferencia al menos 95% de identidad a un polinucleótido que codifica los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, respectivamente, asi como sus fragmentos, los cuales fragmentos de preferencia tienen al menos 30 bases y con mayor preferencia al menos 50 bases, y a los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos . Como es bien sabido en la materia, el código genético es redundante en cuanto a que ciertos aminoácidos son codificados por mas de un triplete de nucleótidos (codón) , y la invención incluye aquellas secuencias de polinucleótidos que codifican los mismos aminoácidos usando un codón diferente del específicamente ejemplificado en las secuencias de la presente. Tal secuencia de polinucleótidos es referida en la presente como una secuencia de polinucleótidos "equivalente". La presente invención incluye además variantes de los polinucleótidos antes descritos que codifican fragmentos, tales como parte o toda una proteína madura, análogos y derivados de uno de los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, respectivamente. Las formas variantes de los polinucleótidos pueden ser un variante alélico que ocurre naturalmente del aminoácido que resulta de la degeneración del código genético, o pueden haber variantes de eliminación, variantes de sustitución, y variantes de adición o inserción. Como se conoce en la materia, un variante alélico es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos que puede tener una sustitución, eliminación o adición de uno o mas nucleótidos que no altera sustancialmente la función biológica del polipéptido codificado. La presente invención incluye además polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, asi como fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos . Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo", cuando se refieren a los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, significan polipéptidos que conservan esencialmente la misma función o actividad biológica de tales polipéptidos. Por ejemplo, un análogo puede incluir una pro-proteina que puede ser activada por corte de la porción de pro-proteina para producir una proteina madura activa. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos; sin embargo, son de preferencia polipéptidos recombinantes, glicosilados o no glicosilados . El fragmento, derivado o análogo de un polipéptido de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, respectivamente, puede ser (i) uno en el cual uno o mas residuos de aminoácidos son sustituidos con un residuo de aminoácidos conservado o no conservado (de preferencia un residuo de aminoácidos conservado) y tal residuo de aminoácidos sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o mas de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual se fusionan aminoácidos adicionales a la proteina madura, tal como una secuencia lider o de secreción o una secuencia que es empleada para purificación del polipéptido maduro o una secuencia de pro-proteina. Tales fragmentos, derivados y análogos son considerados estar dentro del ámbito de los que pueden proveer los técnicos en la materia con base en las enseñanzas de la presente . Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención deben estar en una forma aislada, y de preferencia son purificados a una homogeneidad o pureza sustanciales. Por "homogeneidad sustancial" se quiere decir una pureza de al menos alrededor de 85%. El término ? aislado" es usado para significar que el material ha sido removido de su ambiente natural (v.gr., el ambiente natural si ocurre naturalmente) . Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que ocurre naturalmente en un animal vivo no es considerado estar aislado, pero el mismo polinucleótido polipéptido, cuando se separa de sustancialmente todos los materiales co-existentes en el sistema natural, es considerado aislado. Para ADN, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que es incorporado en un vector, en un plásmido o virus que replica de manera autónoma, o en ADN genómico de un procariote o eucariote; o que existe como una molécula separada (v.gr., un ADNc o un fragmento de ADN genómico o ADNc producido por reacción de cadena de polimerasa (PCR) o digestión con endonucleasa de restricción), independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia de polipéptido adicional, v.gr., una proteína de fusión. Adicionalmente incluido está ADN recombinante que incluye una porción de los nucleótidos mostrados en una de las SEQ ID NOS: 2, 4 o 6, que codifica una variante de empalme alternativa de la DPRP. Diversas variantes de empalme alternativas son e emplificadas en las SEQ ID NOS: 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 y 46. Los polipéptidos de la presente invención incluyen cualquiera de los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5 (en particular, la proteina madura) , asi como polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (v.gr., de preferencia al menos 90% de identidad) con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, y con mayor preferencia al menos 95% de similitud (v.gr., de preferencia al menos 95% de identidad) con uno de los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5. Mas aún, de preferencia deben incluir porciones exactas de tales polipéptidos que contienen una secuencia de al menos 30 aminoácidos, y con mayor preferencia al menos 50 aminoácidos. Fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa correspondiente por síntesis de péptido. Fragmentos o porciones de los polinu-cleótidos de la presente invención pueden también ser usados para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención . La presente invención también incluye vectores que incluyen tales polinucleótidos, células hospederas que son manipuladas por ingeniería genética con tales vectores y la producción de polipéptidos mediante técnicas recombinantes usando los anteriores. Las células hospederas son manipuladas por ingeniería genética (transducidas o transformadas o transfecta-das) con tales vectores que, por ejemplo, pueden ser un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forna de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospederas manipuladas por ingeniería genética pueden ser cultivadas en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquéllas usadas comúnmente con la célula hospedera seleccionada para expresión, como es bien sabido por los técnicos en la materia. Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser empleados para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. De esta manera, por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar incluidos en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar polipéptidos. Tales vectores incluyen secuencias de ADN crornosorna1, no cromosomal y sintético, v.gr., derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fagos; baculovi-rus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de erupción de aves, y pseudo-rabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector en tanto sea capaz de replicar y viable en el anfitrión. La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector por medio de cualquiera de una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN es insertada en un sitio o sitios apropiados de endonucleasa de restricción mediante procedimientos bien conocidos en la materia, los cuales procedimientos son considerados estar dentro del ámbito de los técnicos en la materia. La secuencia de ADN en el vector de expresión está enlazada operativamente a una secuencia o secuencias de control de expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, pueden mencionarse el promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli, el promotor P.sub.L lambda de fagos, y otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión debe también contener un sitio de ligadura de ribosoma para inicio de traducción y un terminador de transcripción. El vector puede también incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. En adición, los vectores de expresión de preferencia contienen uno o mas genes marcadores seleccionables para proveer un rasgo fenotípico para selección de células hospederas transformadas, tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucarióticas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada, como se describió anteriormente, asi como un promotor o secuencia de control apropiado, puede emplearse para transformar un anfitrión apropiado para permitir que el anfitrión exprese la proteina. Como ejemplos representativos de anfitriones apropiados, pueden mencionarse : células bacterianas, tales como E. coli¡ Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngales, tales como levadura; células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales, tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. La selección de un anfitrión apropiado es considera estar dentro del ámbito de los técnicos en la materia a partir de las enseñanzas de la presente. La producción sintética de secuencias de ácido nucleico es bien conocida en la materia, como es evidente del catálogo Clontech 95/96, páginas 215-216, Clontech, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, California 94303, Estados Unidos. De esta manera, la presente invención también incluye vectores de expresión útiles para la producción de las proteínas de la presente invención. La presente invención incluye además construcciones recombinantes que comprenden una o mas de las secuencias descritas anteriormente de manera amplia. Las construcciones pueden comprender un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientació hacia adelante o inversa. En un aspecto preferido de esta forma de realización, la construcción puede además comprender secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor, enlazado operativamente a la secuencia. Son conocidos por los técnicos en la materia y están disponibles comercialmente grandes números de vectores y promotores adecuados. Los siguientes vectores son provistos a guisa de ejemplo: bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pBS, pDlO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene) , ptrc99a, p K223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia); y eucarióticos : pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector adecuado en tanto sea capaz de replicar y viable en el anfitrión. Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol acetil transfera-sa) u otros vectores con marcadores seleccionables . Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P.sub.R, P.sub.L y trp. Promotores eucarióticos incluyen CMV intermedio temprano, HSV timidina cinasa, SV temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína I de ratón. La selección del vector y el promotor apropiados está dentro del ámbito de los técnicos en la materia. Los componentes del vector de expresión generalmente incluyen: 1) un gen de neomicina fosfotransferasa (G418) o higromicina B fosfotransferasa (hyg) como un marcador de selección, 2) un origen de replicación de E. coli, 3) una secuencia de promotor de T7 y SP6, 4) secuencias de operador lac, 5) gen represor de operón de lactosa (laclq) y 6) una región de enlace de múltiples sitios de clonación. Tal origen de replicación (oriC) puede ser derivado de pUC19 (LTI, de Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) . Una secuencia de nucleótidos que codifica uno de los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, teniendo los sitios de restricción apropiados, es generada, por ejemplo, de acuerdo con el protocolo PCR descrito mas adelante en el Ejemplo 1, usando cebadores de PCR que tienen sitios de restricción para Kpnl (como cebador 5') y Notl o SacI (como cebador 3') para DPRP-1, o sitios para HindIII (como cebador 5') y Notl o BamHI (como cebador 3') para DPRP-2. Los insertos de PCR son purificados en gel y digeridos con enzimas de restricción compatibles. El inserto y el vector son ligados de acuerdo con protocolos estándar. En una forma de realización adicional, la presente invención provee células hospederas que contienen las construcciones antes descritas. La célula hospedera puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedera puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción a la célula hospedera puede ser efectuada por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofección o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battery, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986) ) . Tales construcciones en células hospederas son de preferencia usadas en una manera convencional para producir el producto de gen codificado por la secuencia recombinante . De manera alternativa, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente mediante sintetizadores de péptidos convencionales o por ligación química de fragmentos adecuados preparados de esta manera. Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamífero, levadura, bacterias, u otras células, bajo el control de promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivado de las construcciones de ARN de la presente invención. Vectores de clonación y expresión apropiados para uso con anfitriones procarióticos y eucarióticos son descritos por Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, New York (1989) . La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por medio de eucariotes superiores es incrementada insertando una secuencia mej oradora al vector. Los mejoradores incluyen elementos que actúan cis de ADN, habitual-mente de alrededor de 10 a 300 bp, que actúa sobre un promotor para incrementar su transcripción. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado tardío del origen de replicacion bp 100a 270, un mejorador de promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polinoma en el lado tardío del origen de replicacion, y mej oradores de adenovirus . Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicacion y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedera, v.gr., el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden ser derivados de operones que codifican enzimas glicolíticas, tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor alfa, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heterologa es ensamblada en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de traducción, y de preferencia, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida al espacio periplásmico o el medio extra-celular. Opcionalmente, la secuencia heterologa puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, v.gr., estabilización o purificación simplificada del producto recombi-nante expresado. Vectores de expresión útiles para uso bacteriano son construidos insertando una secuencia estructural de ADN que codifica una proteína deseada junto con señales adecuadas de inicio y terminación de traducción en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o mas marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar la conservación del vector y, si se desea, proveer amplificación dentro del anfitrión. Anfitriones procarióticos adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimuxium, y diversas especies de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque pueden emplearse otros como un asunto de selección. Como un ejemplo representativo pero no limitativo, vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, de Uppsala, Suecia) , y GEMI (Promega Biotec, de Madison, Wisconsin, Estados Unidos) . Estas selecciones de "columna vertebral" de pBR322 son combinadas con un promotor apropiado y la secuencia estructural por expresarse. Después de la transformación de una cepa hospedera adecuada y el desarrollo de la cepa hospedera a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (v.gr., desplazamiento de temperatura o inducción química) , y las células son cultivadas por un período adicional. Las células son típicamente cosechadas por centrifugación y luego perturbadas por medios físicos o químicos, el extracto crudo resultante siendo retenido para purificación adicional. Células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser perturbadas por cualquier método conveniente, incluyen ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonica-ción, disrupción mecánica y el uso de agentes de levigación de células; tales métodos son bien conocidos por los técnicos en la materia. Pueden también emplearse sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar una proteina recombinante . Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de ríñones de mono, descritas por Gluzman, Cell 23:175 (1981). Otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible incluyen, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BH . Los vectores de expresión de mamíferos generalmente comprenderán un origen de replicación, un promotor y un mejorador adecuados, y también cualesquiera sitios de ligadura de ribosomas, sitios de poliadenilación, sitios donadores y aceptantes de empalme, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas de flanco 5' que sean necesarios. También pueden usarse secuencias de ADM derivadas del empalme SV40, y sitios de poliadenilación, para proveer los requeridos elementos genéticos no transcritos. Los polipéptidos pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía por intercambio de aniones o cationes, cromatografía por fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía por hidroxilapatita, y cromatografía por lectina. La recuperación puede ser facilitada si se expresa el polipéptido en la superficie de las células, pero ello no es un pre-requisito . La recuperación puede también ser deseable para productos de la disociación o el corte que son cortados después de la expresión de una forma mas larga del polipéptido. Pueden usarse pasos de repliegue de proteína, como se conoce en la materia, como sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Puede emplearse cromatografía de líquidos de alto desempeño (HPLC) para los pasos finales de purificación. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser productos naturales purificados, o producidos por técnicas recombinantes a partir de un anfitrión procariótico o eucariótico (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos o de mamíferos en cultivo) . Dependiendo del anfitrión empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o no glicosilados . Los polipéptidos de la invención pueden también incluir un residuo del aminoácido metionina inicial. En una forma de realización preferida, las proteínas de la invención son aisladas y purificadas de modo de estar sustancialmente libres de contaminación por otras proteínas. Por ejemplo, las proteínas de la invención deben constituir al menos 80% en peso de la proteína total presente en una muestra, con mayor preferencia al menos 90%, incluso con mayor preferencia al menos 95%, y con la mayor preferencia al menos 98% en peso de la proteína total . Estas proteínas pueden estar en la forma de una solución en agua, otro solvente adecuado, tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO) o etanol, o una mezcla de solventes adecuados. Ejemplos de mezclas de solventes incluyen etanol al 10% (en peso) en agua y DMSO al 2% (en peso) en agua. Una solución puede además comprender sales, agentes amortiguadores, agentes caotrópicos, detergentes, conservadores, y similares. De manera alternativa, las proteínas pueden estar en la forma de un sólido, tal como un polvo liofilizado o un sólido cristalino, que puede también comprender un solvente residual, una sal, o similares. Como se usa en la presente, el término "anti-cuerpos" incluye anti-cuerpos policlonales, anti-cuerpos policlonales purificados por afinidad, anti-cuerpos monoclonales, y fragmentos de ligadura de antígeno, tales como fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fabf . También están incluidos anti-cuerpos o fragmen-tos manipulados por ingeniería genética, intactos, tales como anti-cuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anti-cuerpos de cadena sencilla, y similares, asi como péptidos y polipéptidos sintéticos de ligadura de antigeno. Los anti-cuerpos no humanos pueden ser humanizados por injerto de CDRs no humanos en un armazón humano y regiones constantes, o incorporando todos los dominios variables no humanos (opcionalmente, "clavándolos" con una superficie similar a humana por reemplazo de residuos expuestos, donde el resultado en un anti-cuerpo "con vetas") . En algunos casos, los anti-cuerpos humanizados pueden conservar residuos no humanos dentro de los dominios de armazón de región variable humanos para acrecentar las características de ligadura apropiadas. Mediante la humanización de anti-cuerpos, puede incrementarse la media vida biológica, y debe reducirse el potencial de reacciones inmunes adversas al administrarse a seres humanos. Técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles en la presente incluyen exposición in vitro de linfocitos a la proteína DPRP pro-hormona humana o un péptido de ella, y selección de bibliotecas de despliegue de anti-cuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de la proteína o péptido DPRP humana inmovilizada o marcada) . Los genes que codifican polipéptidos que tienen dominios potenciales de ligadura de polipéptido DPRP humano pueden obtenerse analizando bibliotecas de péptidos aleatorios desplegadas en fagos (despliegue de fago) o en bacterias, tales como E. coli.

Secuencias de nucleótidos que codifican tales polipéptidos pueden ser obtenidas en varias maneras bien conocidas en la materia. Como seria evidente a un técnico en la materia, pueden generarse anti-cuerpos policlonales a partir de inocular una variedad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones y ratas, con un polipéptido DPRP humano o un fragmento del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido DPRP pro-hormona humano puede ser incrementada mediante el uso de un coadyuvante, tal como alúmina (hidróxido de aluminio) o coadyuvante de Freund completo o incompleto, o sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, KLH o dinitrofenol . Entre los coadyuvantes usados en seres humanos, son especialmente preferibles BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Polipéptidos útiles para inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de DPRP o una porción de las mismas con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteina de ligadura de maltosa. El inmunógeno de polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción de polipéptido es "similar a hapteno", tal porción puede ser venta osamente unida o enlazada a un portador macro-molecular, tal como hemocianina de ojo de la cerradura (KLH), albúmina de suero de bovino (BSA) o el toxoide del tétano, para inmunización. Anticuerpos a DPRP pueden también ser generados usando métodos que son bien conocidos en la materia. Tales anti-cuerpos pueden incluir, pero no se limitan a anti-cuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y de cadena sencilla, fragmentos Fab, y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab. Los anti-cuerpos neutralizantes (es decir, aquéllos que bloquean o modifican interacciones en los sitios activos) son especialmente preferidos para uso terapéutico. Para la producción de anti-cuerpos, proteínas de ligadura, o péptidos que se ligan específicamente a DPRP, pueden analizarse bibliotecas de anti-cuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, otros fragmentos de anti-cuerpos, dominios de proteínas no de anti-cuerpos, o péptidos. Las bibliotecas pueden ser generadas usando despliegue de fagos, otros métodos de ADN recombinante, o síntesis de péptidos (Vaughan, T.J., y colaboradores, Nature Biotechnoloqy 14:309-314 (1966)). Tales bibliotecas serian comúnmente analizadas usando métodos que son bien conocidos en la materia para identificar secuencias que demuestren ligadura especifica a DPRP. Se prefiere que los oligopéptidos, péptidos, o fragmentos usados para inducir anti-cuerpos a DPRP tengan una secuencia de aminoácidos consistente en al menos alrededor de 5 aminoácidos y, con mayor preferencia, de al menos alrededor de 10 aminoácidos. También se prefiere que estos oligopéptidos, péptidos o fragmentos sean idénticos a una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural. También pueden fusionarse tramos cortos de aminoácidos de DPRP con aquéllos de otra proteina, tal como KLH, y pueden producirse anti-cuerpos a la molécula quimérica. Pueden prepararse anti-cuerpos monoclonales a DPRP usando cualquier técnica bien conocida que provea la producción de moléculas de anti-cuerpo por lineas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas, y la técnica de EBV-hibridoma, aunque pueden preferirse anti-cuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma. En adición, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anti-cuerpos quiméricos", tales como empalme de genes de anti-cuerpo de ratón a genes de anti-cuerpo humanos para obtener una molécula con la especificidad a antigeno y la actividad biológica apropiadas; ver Neuberger, M.S., y colaboradores, Nature 312:604-608 (1984). De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anti-cuerpos de cadena sencilla pueden ser adaptadas, usando métodos conocidos en la materia, para producir anti-cuerpos de cadena sencilla específicos a DPRP. Pueden generarse anti-cuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica, por cambio de cadenas a partir de bibliotecas de inmunoglobulina combinato-riales aleatorias (Burton, D.R., Proc. Nati. Acad. Sci. 88:11120-11123 (1991) ) . También pueden producirse anti-cuerpos induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o analizando bibliotecas o paneles de inmunoglobulina de reactivos de ligadura altamente específicos, como se divulga en la literatura (Orlandi, R., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 86:3833-3837 (1989)). También pueden generarse fragmentos de anti-cuerpos que contienen sitios de ligadura específicos para DPRP. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a fragmentos F(ab')2 producidos por digestión con pepsina de la molécula de anti-cuerpo y fragmentos Fab generados reduciendo los puentes bisulfuro de los fragmentos F(ab')2. De manera alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse, W.D., y colaboradores, Science 254:1275-1281 (1989)). Pueden usarse diversos inmuno-ensayes para identificar anti-cuerpos que tienen la especificidad deseada. Son bien conocidos en la materia numerosos protocolos para ligadura competitiva o ensayes inmuno-radiométricos usando anti-cuerpos ya sea policlonales o monoclonales con especificidades establecidas. Tales inmuno-ensayes típicamente implican la medición de la formación de complejos entre DPRP y su anti-cuerpo específico. Se prefiere un inmuno-ensaye a base de monoclonal, de dos sitios, utilizando anti-cuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes de DPRP que no interfieren, pero puede también emplearse un ensaye de ligadura competitiva.

Como se mencionó antes, las DPRPs pueden ser usadas en el tratamiento de las enfermedades . Composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en este aspecto de la invención incluyen composiciones donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito pretendido con relación a una de las enfermedades. La determinación de una dosis terapéuticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de los técnicos en la materia y puede ser estimada inicialmente ya sea en ensayes de cultivo de células, v.gr., de células neoplásticas, o en modelos animales, habitualmente ratones, ratas, conejos, perros o cerdos. Un modelo animal puede también ser usado para determinar el rango de concentración y la ruta de administración apropiados, la cual información es entonces usada de manera común para determinar dosis y rutas útiles para administración en seres humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a aquella cantidad de ingrediente activo, v.gr., una DPRP o un fragmento de ésta, anti-cuerpos de DPRP, o un agonista, antagonista o inhibidor de DPRP, que mejora síntomas o condiciones particulares de la enfermedad. Por ejemplo, la cantidad por administrarse puede ser efectiva para cortar un sustrato objetivo deseado al tener contacto con éste. Pueden similármente determinarse la eficacia terapéutica y la toxicidad por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o con animales experimentales, tales como calculando estadísticas de los valores ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) o LD50 (la dosis letal a 50% de la población) . La relación de dosis de tóxico a efectos terapéuticos es el índice terapéutico, y puede ser expresado como la relación LD50/ED50. Composiciones farmacéuticas que exhiben índices terapéuticos grandes son preferidas. Los datos obtenidos de ensayes de cultivo de células y estudios en animales son usados para formular un rango de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tales composiciones está de preferencia dentro de un rango de concentraciones de circulación que incluye ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este rango, dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente, y la ruta de administración. Una dosificación exacta será normalmente determinada por el profesionista médico a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere el tratamiento, la dosificación y la administración siendo ajustadas para proveer un suficiente nivel de la fracción activa o para mantener un efecto deseado. Los factores por tomarse en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso, y el género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades a la reacción, y la tolerancia/respuesta a la terapia. Composiciones farmacéuticas de acción larga pueden ser administradas cada 3 a 4 días, cada semana, o incluso una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la tasa de aceptación de la formulación particular. Todavía otro aspecto de la invención provee moléculas de polinucleótidos que tienen secuencias que son anti-sentido a las transcripciones de ARNm de los polinucleótidos DPRP1, DPRP2 y DPRP3. La administración de la molécula de polinucleótido anti-sentido puede bloquear la producción de la proteína codificada por DPRP-1, DPRP-2 o DPRP-3. Las técnicas para preparar moléculas de polinucleótidos anti-sentido y administrar tales moléculas son conocidas en la materia. Por ejemplo, pueden encapsularse moléculas de polinucleótidos en liposomas para fusión con células . En particular, la expresión de DPRP-1, DPRP-2 y DPRP-3 en células epiteliales especializadas, células inmunes (linfoci-tos y células B) , tumores astrocíticos, y en diversos cánceres sensibles a hormonas provee evidencia de un papel potencial en la patofisiología del cáncer, metaplasia y metástasis. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayes de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles de expresión inapropiados de DPRP. Pueden usarse anticuerpos que se ligan específicamente a DPRP para el diagnóstico de desórdenes caracterizados por la expresión de DPRP, o en ensayes para monitorear pacientes que están siendo tratados con DPRP o con agonistas o antagonistas (inhibidores) de DPRP. Anticuerpos útiles para fines de diagnóstico pueden ser preparados de la misma manera a la antes descrita para terapia. Ensayes de diagnóstico para DPRP incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un etiqueta para detectar DPRP en fluidos del cuerpo humano o en extractos de células o tejidos. Los anti-cuerpos pueden ser usados con o sin modificación, y pueden ser etiquetados por medio de unión covalente o no covalente con una molécula reportera. Se conoce en la materia una amplia variedad de moléculas reporteras. Proteínas DPRP recombinantes que han sido modificadas de modo de ser catalíticamente inactivas también pueden ser usadas como inhibidores negativos dominantes. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, mutación del sitio activo. Se conoce en la materia una variedad de protocolos para medir DPRP, incluyendo ELISA, RIA y FACS, y proveen una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de expresión de DPRP. Valores normales o estándar para expresión de DPRP son establecidos combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos mamíferos normales, de preferencia humanos, con anticuerpo a DPRP, bajo condiciones adecuadas para formación de complejos. El método para detectar DPRP en una muestra biológica comprendería los pasos de: a) proveer una muestra biológica; b) combinar la muestra biológica y un anti-cuerpo anti-DPRP bajo condiciones que sean adecuadas para formación de complejos entre DPRP y el anti-cuerpo; y c) detectar formación de complejos entre DPRP y el anti-cuerpo, con ello estableciendo la presencia de DPRP en la muestra biológica. La magnitud de la formación de complejos puede ser cuantificada por diversos métodos, de preferencia por medios fotométricos . Las cantidades de DPRP expresada en el sujeto, el control y muestras de enfermedades de tejidos sometidos a biopsia son comparadas con los valores estándar. La desviación entre valores estándar y del sujeto establece los parámetros para diagnosticar la enfermedad. En otra forma de realización de la invención, los polinucleótidos que codifican DPRP son usados para fines de diagnóstico, los cuales polinucleótidos pueden incluir secuencias de oligonucleótidos, moléculas de ARN y ADN complementarias, y y PNAs . Estos polinucleótidos pueden ser usados para detectar y cuantificar la expresión de genes en tejidos sometidos a biopsia en los cuales la expresión de DPRP puede es~ar correlacionada con una de las enfermedades. El ensaye de diagnóstico puede ser usado para distinguir entre ausencia, presencia y exceso de expresión de DPRP y para monitorear la regulación de niveles de DPRP durante intervención terapéutica. Mas aún, puede usarse análisis farmaco-genómico, de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de los genes DPRP como un método para analizar mutaciones que indican predisposición a enfermedad o respuesta modificada a fármacos . Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de DPRP, sus fragmentos, anti-cuerpos de DPRPs, y agonistas, antagonistas o inhibidores de DPRPs pueden ser usados como herramientas de descubrimiento para identificar eventos de reconocimiento molecular y por tanto proteínas, polipéptidos y péptidos que interactúan con las proteínas DPRP. Un ejemplo específico son bibliotecas de péptidos de despliegue de fagos donde pueden analizarse mas de 108 secuencias de péptidcs en una sola ronda de exploración. Tales métodos, así como otros, son conocidos en la materia y pueden ser utilizados para identificar compuestos que inhiben o mejoran la actividad de DPRP-1, DPRP-2 o DPRP-3. Los enlaces acoplados representan interacciones funcionales tales como complejos o trayectorias, y pueden identificarse proteínas que interactúan con DPRPs mediante un sistema híbrido de dos levaduras, técnicas proteómicas (análisis en gel 2D diferencial y espectrometría de masa y genómicas (expresión diferencial de genes por micro-arreglo o análisis en serie de expresión de genes SAGE) . Las proteínas identificadas como enlazadas funcionalmente a DPRPs y el proceso de interacción forman la base de métodos de analizar respecto de inhibidores, agonistas y antagonistas y moduladores de estas interacciones DPRP-proteína . El término "antagonista", como se usa en la presente, se refiere a una molécula inhibidora que, cuando se liga a DPRP, disminuye la cantidad o la duración del efecto de la actividad biológica o inmunológica de DPRP, v.gr., reduciendo la actividad enzimática de la peptidasa para cortar el dipéptido N-terminal. Los antagonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, anti-cuerpos o cualesquiera otras moléculas que reduzcan el efecto de DPRP; por ejemplo, pueden incluir moléculas pequeñas y compuestos orgánicos que se ligan a e inactivan DPRPs por un mecanismo tipo competitivo o no competitivo. Ejemplos específicos de inhibidores de actividad enzimática peptídica de tetrapéptido DPRP son descritos en los Ejemplos 6 y 7. Los inhibidores, por ejemplo, pueden ser inhibidores de la actividad de proteasa de DPRP, o alternativamente inhibidores de la actividad de ligadura de DPRP a proteínas con las que interactúa. Ejemplos específicos de tales inhibidores pueden incluir, por ejemplo, anti-cuerpos anti-DPRP, péptidos, fragmentos de proteínas, o inhibidores de peptidil proteasa pequeños, o pequeños inhibidores de moléculas orgánicas, no péptidos, que son formulados en un medio que permite introducción al tipo de célula deseado. De manera alternativa, tales inhibidores pueden ser unidos a ligandos de objetivación para introducción mediante endocistosis mediada por células y otros eventos mediados por receptores. Tales métodos son descritos adicionalmente mas adelante y pueden ser puestos en práctica por los técnicos en la materia dadas las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de DPRP descritas en la presente. Un uso adicional para las DPRPs es para el análisis de antagonistas potenciales para uso como agentes terapéuticos, por ejemplo, para inhibir ligadura a DPRP, así como para analizar respecto de agonistas. Pueden usarse DPRP, sus fragmentos inmunogénieos, o sus oligopéptidos para analizar bibliotecas de compuestos que son agonistas o antagonistas prospectivos en cualquiera de una variedad de técnicas de análisis de fármacos. El fragmento empleado en tal análisis puede estar libre en solución, fijo a un soporte sólido, llevado en una superficie celular, o ubicado intra-celularmente . La formación de complejos de ligadura entre DPRP y el agente que está siendo probado es entonces medida. Otros ensayes para descubrir antagonistas que inhiben DPRP son evidentes a partir de las divulgaciones de las patentes US 6,011,155/ 6,107,317; 6,110,949; 6,124,305; y 6,166,063, que describen inhibidores de DPPIV. Otro valioso uso de estas DPRPs es el análisis de inhibidores de DPPIV para demostrar que no tendrán efectos secundarios no deseados también inhibiendo una o mas de las DPRPs . Un método provisto para analizar una biblioteca de pequeñas moléculas para identificar una molécula que se liga a DPRP generalmente comprende: a) proveer una biblioteca de pequeñas moléculas; b) combinar la biblioteca de pequeñas moléculas con el polipéptido de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5, o con un fragmento de éstas, bajo condiciones que son adecuadas para formación de complejos; y c) detectar formación de complejos, donde la presencia de tal complejo identifica una pequeña molécula que se liga a DPRP. Un método para identificar un antagonista comprende entregar una pequeña molécula que se liga a DPRP en extractos a partir de células transformadas con un vector que expresa DPRP junto con un sustrato cromogénico (v.gr., Ala-Pro-AFC o Ala-Pro-AMC) bajo condiciones donde ocurriría normalmente corte, y luego ensayar respecto de inhibición de corte por la enzima monitorean-do cambios en fluorescencia, o absorción de luz UV, por espectro-fotometría para identificar moléculas que inhiben el corte. Una tasa reducida de reacción o una cantidad total de fluorescencia o absorción de luz UV reducida, en presencia de la molécula, establece que la pequeña molécula es un antagonista que reduce la actividad catalítica/enzimática de DPRP. Una vez que se identifican tales moléculas, pueden administrarse para reducir o inhibir corte por una DPRP. El término "agonista", como se usa en la presente, se refiere a una molécula que, cuando se liga a DPRP, incrementa o prolonga la duración del efecto de DPRP. Los agonistas pueden incluir proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualesquiera otras moléculas que se liguen a y modulen el efecto de DPRP. Aunque es menos factible que las pequeñas moléculas prueben ser agonistas de DPRP efectivos, un método para identificar tal pequeña molécula, que se liga a DPRP como un agonista, comprende entregar una forma cromogénica de una pequeña molécula que se liga a DPRP en células transformadas con un vector que expresa DPRP y ensayar respecto de cambios en fluorescencia o absorción de luz UV mediante espectrofotometría. Una magnitud incrementada de absorción UV o fluorescencia establecería que la molécula pequeña es un agonista que incrementa actividad de DPRP. Otra técnica para análisis de fármacos que puede usarse provee análisis de alto rendimiento de compuestos que tienen una afinidad de ligadura adecuada a la proteína de interés, como se describe en la solicitud PCT publicada WO 84/03564. En este método, se sintetizan grandes números de diferentes compuestos de prueba pequeños sobre un sustrato sólido, tal como pasadores plásticos o alguna otra superficie. Los compuestos de prueba son hechos reaccionar con DPRP, o con sus fragmentos, y luego lavados. Se detecta entonces DPRP ligada por métodos bien conocidos en la materia. DPRP purificada puede también ser revestida directamente sobre placas para uso en las técnicas de análisis de fármacos antes mencionadas. De manera alternativa, pueden usarse anti-cuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido. En otra forma de realización, se pueden usar ensayes de análisis de fármacos competitivos en los cuales anti-cuerpos neutralizantes capaces de ligar DPRP compiten específicamente con un compuesto de prueba para ligadura a DPRP. De esta manera, pueden usarse anti-cuerpos para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o mas determinantes antigéni-cos con DPRP. Como se indicó antes, investigando los sitios de ligadura, pueden diseñarse ligandos que, por ejemplo, tengan mas interacciones con DPRP que lo que hacen sus ligandos naturales. Tales ligandos antagonistas se ligarán a DPRP con mayor afinidad y así funcionarán como ligandos competitivos . De manera alternativa, pueden diseñarse proteínas sintéticas o recombinan-tes homologas o análogas al sitio de ligadura de ligando de DPRP nativa, como puede ser el caso de otras moléculas que tienen alta afinidad por DPRP. Tales moléculas debe también ser capaces de desplazar DPRP y proveer un efecto protector. Como se indicó antes, el conocimiento de las estructuras de DPRP permite diseñar sitios de ligadura homólogos y análogos. Tales moléculas facilitarán en gran medida el uso de las propiedades de ligadura para objetivar agentes terapéuticos potenciales, y pueden también usarse para analizar respecto de agentes terapéuticos potenciales. A mayor abundamiento, pueden usarse como inmunógenos en la producción de anti-cuerpos monoclonales, los cuales anti-cuerpos mismos pueden ser usados en diagnóstico y/o terapia, como se describió antes. Dada la expresión siempre presente de varios miembros de la familia S9B de las prolil oligopeptidasas, serán de gran valor lineas celulares en las cuales se objetiva la disrupción de genes de DPPIV, DPRP-1, DPRP-2, DPRP-3, FAP y DPPVI, para establecer el fenotipo nulo, para ayudar a analizar respecto de compuestos selectivos y potentes. En consecuencia, la invención provee tales líneas celulares manipuladas por ingeniería con el elemento de ADM de cartucho Lox-Neo IRES tk y GFP-IRES-Neo Knock-in/out para construir vectores de objetivación de genes somáticos . Ejemplo 1 Clonación ? Expresión de Genes DPRP Usando el Sistema de Expresión de Mamífero Fragmentos de ADN que codifican el polipéptido DPRP-1 de longitud completa fueron amplificados usando cebadores de oligonucleótidos PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen, es decir las SEQ ID NOS: 45 y 46. En adición, fragmentos de ADN que codifican el polipéptido DPRP-2 de longitud completa fueron amplificados usando cebadores de oligonucleótidos PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' de ese gen, es decir las SÉQ ID NOS: 50 y 51. A mayor abundamiento, fragmentos de ADN que codifican el polipéptido DPRP-3 de longitud completa fueron amplificados usando cebadores de oligonucleótidos PCR correspondientes a las secuencias 5" y 3' de ese gen, es decir las SEQ ID NOS: 55 y 56. Las tres secuencias amplificadas fueron aisladas respectivamente de un gel de agarosa al 0.7% usando un kit comercialmente disponible (kit de purificación de bandas de gel y GFX PCR DNA, Amersham Pharmacia Biotech Inc., de Piscataway, New Jersey, Estados Unidos) . Los fragmentos fueron entonces ligados al vector de clonación, pGEM-7Zf (-) (Promega Corporation, de Madison, Wisconsin, Estados Unidos) y secuenciados . Las construcciones de clonación correspondientes fueron respectivamente designadas pGEM7-DPRPl, pGEM7-DPRP2, y pGEM7-DPRP3. Las secuencias de ADN que codifican DPRP-1, DPRP-2 o DPRP-3 truncas fueron amplificadas usando pGEM7-DPRPl o pGEM7-DPRP2 o pGEM7-DPRP3 como una plantilla y cebadores de oligonucleótidos de PCR. Se usaron las SEQ ID NOS: 45 y 47 para DPRP-1; las SEQ ID NOS: 50 y 52 fueron usadas para DPRP-2; y las SEQ ID NOS: 57 y 58 para DPRP-3. Las secuencias amplificadas fueron de nuevo aisladas a partir de un gel de agarosa al 0.7% usando los mismos kits de purificación y sub-clonadas en pGEM-7Zf(-). Las construcciones resultantes fueron designadas pGEM7-DPRPlf, pGEM7-DPRP2f, y pGEM7-DPRP3f. Para hacer la construcción de expresión de mamífero DPRP-1, se digirió pGEM7-DPRPl con las enzimas de restricción Kpnl y Notl para liberar el gen DPRP-1 de longitud completa. El fragmento de ADN que lleva el gen DPRP-1 fue purificado en banda de gel usando el kit anterior y luego insertado en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen, de Carlsbad, California, Estados Unidos) para hacer la construcción de expresión de DPRP-1 nativa, que fue designada pcDNA-DPRPl . Se digirió pGEM7-DPRPlf con las enzimas de restricción Xbal y HindIII para liberar el gen DPRP-lf trunco. El fragmento de ADN que lleva el gen DPRP-lf fue purificado en banda de gel usando el kit anterior y luego insertado en el vector de expresión pcDNA3.1 (-) /myc-His A (Invitrogen, de Carlsbad, California, Estados Unidos) para hacer la construcción de expresión de DPRP-1 marcada pcDNA-MycHis-DPRP1. Para hacer la construcción de expresión de mamífero DPRP-2, se digirió pGEM7-DPRP2 con las enzimas de restricción HindlII y BamHI para liberar el gen DPRP-2 de longitud completa. El fragmento de ADN que lleva el gen DPRP-2 fue purificado en banda de gel usando el kit anterior y luego insertado en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen, de Carlsbad, California, Estados Unidos) para hacer la construcción de expresión de DPRP-2 nativa, que fue designada pcDNA-DPRP2. Se digirió pGEM7-DPRP2f con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI para liberar el gen DPRP-2f trunco. El fragmento de ADN que lleva el gen DPRP-2f fue purificado en banda de gel usando el kit anterior y luego insertado en el vector de expresión pcDNA3.1 (-) /myc-His A (Invitrogen, de Carlsbad, California, Estados Unidos) para hacer la construcción de expresión de DPRP-2 marcada pcDNA-MycHis-DPRP2. Para hacer la construcción de expresión de mamífero DPRP-3, se digirió pGEM7-DPRP3 con las enzimas de restricción EcoRI y Xhol para liberar el gen DPRP-3 de longitud completa. El fragmento de ADN que lleva el gen DPRP-3 fue purificado en banda de gel usando el kit anterior y luego insertado en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen, de Carlsbad,. California, Estados Unidos) para hacer la construcción de expresión de DPRP-3 nativa, que fue designada pcDNA-DPRP3. Se digirió pGEM7-DPRP3f con las enzimas de restricción Nhel y Apal para liberar el gen DPRP-3f trunco. El fragmento de ADN que lleva el gen DPRP-3f fue purificado en banda de gel usando el kit anterior y luego insertado en el vector de expresión pcDNA3.1 (-) /myc-His A (Invitrogen, de Carlsbad, California, Estados Unidos) para hacer :la construcción de expresión de DPRP-3 marcada pcDNA-MycHis- DPRP3. Ejemplo 2 Patrón de Expresión de Genes DPRP en Tejidos Humanos Se llevó a cabo análisis PCR cuantitativo para examinar los niveles de expresión de los ARNm para los polipéptidos de la presente invención en tejidos humanos. Se llevó a cabo también PCR RT en varias lineas celulares humanas incluyendo, pero sin limitarse a células cancerosas de próstata (LNCaP, PC3, DU145) , la linea MLTC-1 (testículo de ratón) , y células MDA-MB231 (cáncer de pecho) . Bandas de los tamaños esperados para DPRP-1, DPRP-2 y DPPIV fueron todas expresadas en las diversas líneas celulares cancerosas, FAP también siendo expresada a niveles sumamente bajos . Análisis de' Manchado Northern Se llevó a cabo análisis de manchado Northern con 2 \ig de poli (A) + ARN aislado de ocho diferentes tejidos usando sondas de DPRP. Específicamente, un manchado Northern (MTN) de tejidos múltiples humanos (Clontech, de Palo Alto, California, Estados Unidos) fue sometido a una sonda con un fragmento N-terminal de 1 kb que había sido etiquetado radioactivamente por cebado aleatorio en presencia de 32PdCTP (A.P. Feinberg y colaboradores, Anal. Biochem. 132, 6 (1983)) . La hibridación fue llevada a cabo a 68°C durante la noche en solución de hibridación ExpressHyb (Clontech, de Palo Alto, California, Estados Unidos) . Los manchados fueron primero lavados a temperatura de habitación en dos veces SSC y SDS al 0.05%, y luego lavados a 60°C (DPRP-1 y DPRP-2) y 50°C (DPRP-3) en 0.1 veces SSC y SDS al 0.1%. El análisis Northern mostró expresión de DPRP-1 en varios tejidos, la señal mas abundante estando en testículos, próstata, músculos y cerebros. Los testículos mostraron tres transcripciones de aproximadamente 7.5, 4.5 y 2.5 kb de longitud. La especie de ARNm mas corta era sumamente abundante en los testículos pero despreciable en los demás tejidos probados. La DPRP-2 fue expresada en todas partes en cada tejido, con los niveles mas altos en hígado y músculos y una transcripción predominante a 5 kb. La expresión de DPRP-3 estuvo limitada a cerebro y páncreas. Análisis adicionales fueron conducidos para las tres proteasas en regiones específicas del cerebro (cerebelo, corteza, médula, médula espinal, lóbulo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal y putamen) . Se expresó DPRP-1 en todas las regiones, con bajos niveles presentes en la médula espinal, mientras que se expresó DPRP-2 en todas las regiones del cerebro probadas . Se usaron los cebadores de oligonucleótidos de las SEQ ID NOS: 48 y 49 para PCR cuantitativa de DPRP-1, mientras que se usaron los cebadores de oligonucleótidos de las SEQ ID NOS: 53 y 54 para PCR cuantitativa de DPRP-2. Se usaron ADNc de tejidos múltiples humanos ( TC) , paneles I y II (Clontech, de Palo Alto, California, Estados Unidos) como plantillas de ADNc normalizadas. Se usaron 0.5 ng de cada ADNc en una reacción PCR de 25 µ?, con cada cebador en una concentración final de 300 nM. La reacción PCR fue llevada a cabo usando un kit de reactivos de núcleo de PCR verde SYBR (Applied Biosystems, de Foster City, California, Estados unidos) y se detectó con un sistema de detección de secuencias GeneAmp 5700 de Applied Biosystems. Se usó el parámetro de ciclo térmico recomendado por el fabricante, v.gr., 50°C por dos minutos, 95°C por 10 minutos, seguidos por 40 ciclos de 95°C por 15 segundos y 60°C por un minuto. Los datos obtenidos muestran tasas relativamente altas de expresión tanto para DPRP-1 como DPRP-2 en el páncreas, los ovarios y los testículos, y una tasa particularmente alta para DPRP-2 en el hígado . Ejemplo 3 Producción de Anti-Cuerpos Policlonales de DPRP y Manchado Western La secuencia de aminoácidos deducida del ADNc que codifica DPRP-1 fue analizada usando software DNASTAR (DNASTAR, Inc.) para determinar regiones de alta inmunogenicidad, y se sintetizó y usó un oligopéptido correspondiente para producir anti-cuerpos anti-DPRP-1. El procedimiento fue repetido para DPRP-2 y DPRP-3. La selección de las secuencias de péptidos y las técnicas apropiadas para producción de anti-cuerpos son métodos bien conocidos por los técnicos en la materia. La selección de epitopes apropiados, tales como aquéllos cercanos al término C o en regiones hidrófilas, es bien conocida en la materia. Típicamente, se sintetizaron oligopéptidos que son de alrededor de 15 a 20 residuos de longitud, v.gr., SEQ ID NO: 59 para DPRP-1, SEQ ID NO: 60 para DPRP-2, y SEQ ID NO: 61 para DPRP-3, usando un sintetizador de péptidos modelo 431 A de Applied Biosystems . Se usó química de Fmoc y los péptidos de 19 o 15 residuos fueron acoplados respectivamente a KLH (de Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos) por reacción con éster de N-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) . Se inmunizaron conejos con el complejo de oligopéptido-KLH en coadyuvante de Freund completo. Los anti-sueros resultantes fueron probados respecto de actividad anti-péptido, v.gr., por ligadura del péptido a plástico, bloqueando con BSA al 1%, reaccionando con anti-sueros de conejo, lavando y haciendo reaccionar con IgG anti-conejo, de cabra, radio-yodada. Se llevó a cabo manchado Western usando muestras de proteína humana normal (mezcla de proteínas) obtenidas de Clontech (alrededor de 36 ug de proteínas totales) . Las proteínas fueron fraccionadas a través de geles de SDS-poliacri-lamida al 10%, y transferidas a membranas de nitrocelulosa de 0.45 mm. Se bloquearon membranas en solución salina amortiguada con Tris (TBS) con Tween 20 al 0.05% y BSA al 1%. Anti-cuerpos específicos anti-DPRP-1 o DPRP-2 fueron usados como anti-cuerpos primarios y fueron diluidos en solución salina amortiguada con Tris con Tween 20 al 0.05% (TBST) e IgG anti-conejo, de cabra, conjugada con fosfatasa alcalina (AP) (Promega) fue diluida 1:5, 000 en el mismo amortiguador antes de uso. La reacción positiva fue visualizada incubando la membrana en sustrato estabilizado azul Western (Promega) para A? hasta que las bandas de interés han alcanzado la intensidad deseada. Las proteínas DPRP-1 y DPRP-2 fueron detectadas en tejidos de cerebro, músculo, riñon, próstata, testículos y ovarios. Se sintetizaron DPRP-1 y DPRP-2 como formas de aproximadamente 101 y 100 kDa, respectivamente, que están en buena concordancia con las masas moleculares estimadas a partir de su estructura primaria, como se muestra en la Tabla 3. Tabla 3 - Peso molecular predecido, número de sitios potenciales de glicosilación N-enlazados (residuos Asn) y valores pl predecidos de DPRP-1, DPRP-2 y DPRP-3, con base en análisis de secuencias usando el método desarrollado por Hopp y Woods, Proc. Nati. Acad. Sci . 78:3824-3828 (1981) Se observaron varias bandas adicionales de peso molecular similar. Se piensa que éstas se deben a la presencia de glicosilación post-traduccional de las proteínas. La Tabla 3 también muestra el número de sitios potenciales de N-glicosila-ción para las proteínas DPRP. La presencia de formas glicosila-das y no glicosiladas de las proteínas fue evaluada usando tunicamicina, un inhibidor de la síntesis de oligosacáridos . Es evidente que las formas mas pequeñas fueron formas no glicosila-das. La correlación entre ARNm (análisis Northern) y la cantidad de proteína (análisis Western) para DPRP-1 es mostrada en la Tabla 4. Tabla 4 - Correlación de ARNm y expresión de proteina de DPRP-1 en tejidos humanos Ejemplo 4 Localización Inmuno-Histoquímica de Proteínas DPRP en Tejidos Humanos Se prepararon secciones de cuatro mieras a partir de varios tejidos humanos adosados en parafina, fijados en formali-na. Las secciones de los tejidos fueron desparafinadas mediante cuatro inmersiones en xilenos por 5 minutos, seguidas por una serie de alcohol de grado a agua destilada. Se usó recuperación de epítopes inducida por calor de vapor de agua (SHIER) con varias diferentes soluciones SHIER con y sin tejido de digestión enzimática en dos diferentes concentraciones (Ladner y colaboradores, Cáncer Res . 60, p. 3493-3503, (2000)). Los tratamientos y las diluciones de anti-cuerpos empleados son bosquejados mas adelante . 1. Reactivo de bloqueo por 15 minutos (suero de cabra normal) . 2. Anti-cuerpo primario por 25, 60 minutos o incubación durante la noche. 3. Anti-cuerpo secundario por 25 minutos (IgG anti-cone o, de cabra, biotinilado) . 4. Bloqueo con peroxidasa endógena por 3 x 1.5 minutos. 5. ABC (complejo avidina-biotina) /peroxidasa de rábano por 25 minutos. 6. Cromógeno DAB por 3 x 5 minutos (producto de reacción marrón) . 7. Manchado de contador de hematoxilina en luz 1 minuto. Se corrieron controles positivos para asegurar que las químicas de detección y los pre-tratamientos de antigeno estuviesen trabajando apropiadamente. Se corrió, IgG de conejo como un control negativo. Un sistema de manchado de tejidos a base de avidina-biotina fue usado para la detección del anticuerpo de DPRP-1. Se usó peroxidasa de rábano como una enzima reportera con DAB como cromógeno. Después del manchado, se deshidrataron las diapositivas mediante una serie de alcohol a etanol absoluto, seguida por enjuagues con xileno. Las diapositivas fueron cubiertas de manera permanente con cubiertas de vidrio. Imágenes digitales del manchado representativo, donde el manchado positivo fue indicado por un cromógeno marrón oscuro (producto de reacción DAB-HRP) fueron capturadas usando una cámara de video Olympus . La contra-mancha de hematoxilina provee una mancha nuclear azul para determinar morfología celular y de tej idos . El anti-cuerpo policlonal de conejo DPRP-1 etiqueta tejidos humanos adosados en parafina, fijos en formalina, incluyendo testículos, glándulas de la próstata, glándulas endometriales, anginas y páncreas normales. También estuvo presente en células endoteliales de ovario, vejiga y riñon normales. El manchado fue localizado en el citoplasma de células epiteliales y algunas células estromales, tales como fibroblastos, células endoteliales y linfocitos. De manera interesante, en testículos normales probados con anti-cuerpos DPRP-1, hubo expresión distintiva en células de Leydig y macrófagos multi-nucleados encontrados en tejido intersticial, que es el espacio que rodea los túbulos seminíferos. Células B de anginas fueron manchadas con anti-cuerpo DPRP-1. Ejemplo 5 Expresión en Células de Mamíferos e Insectos de Proteínas DPRP y Purificación ADN de plásmido de pcDNA-DPRPl, pcDNA-MycHis-DPRPl, pcDNA-DPRP-2 o pcDNA-MycHis-DPRP2 fue transfectado en células PEA (EdgeBioSystems de Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) o COS-1 (ATCC CRL-1650) usando el método LipofectAmine (Life Technologies, de Gaithersburg, Maryland, Estados Unidos) recomendado por el fabricante. Se mantuvieron las células transfectadas en DMEM con FBS al 5% a 37 °C con 5% de C02 por 48 horas. Las células fueron entonces recolectadas y usadas para extracción de proteína recombinante . Las células fueron cosechadas 48 horas después de la transíección, homogeneizadas y luego hechas girar a 18,000 g por 40 minutos. El supernadante fue recolectado como fracciones cistosólicas . Esta fracción fue cargada en una columna de giro Talón (Clontech) , y proteínas marcadas con His fueron levigadas con 50 mM PBS, 150 iri imidazo-la, pH de 7. Las proteínas recombinantes fueron entonces detectadas por manchado Western con anti-cuerpo anti-myc y visualizadas usando un sistema ProtoBlot II ?? (Promega) . Fusiones purificadas por afinidad, recombinantes de DPRP-1 y DPRP-2 fueron detectadas por manchado Western, y se sintetizaron DPRP-1 y DPRP-2 como formas de 112 y 109 kDa, como se predijo. Proteínas DPRP que ocurren naturalmente o recombinantes fueron purificadas sustancialmente por cromatografía por inmuno-afinidad usando anti-cuerpos específicos para DPRP-1, DPRP-2, o DPRP-3. Una columna de inmuno-afinidad fue construida acoplando covalentemente anti-cuerpos DPRP a una resina cromatográfica activada, tal como Sepharose activada por CNBr (Pharmacia & Upjohn) . Después del acoplamiento, la resina fue bloqueada y lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medios o extractos celulares conteniendo las proteínas DPRP fueron pasados sobre la columna de inmuno-afinidad, y la columna fue lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de DPRPs (v.gr., amortiguadores de intensidad altamente iónica en presencia de detergente) . La columna fue levigada bajo condiciones que perturban la ligadura anti-cuerpo/ DPRP (v.gr., un amortiguador con pH 2-3 o una elevada concentración de un caótropo, tal como urea o el ion tiocinanato) , y se recolectó DPRP purificada. Ejemplo 6 Actividad Enzimática de Proteínas DPRP y Métodos de Analizar Respecto de Inhibidores Las propiedades cinéticas de DPRP-1 y DPRP-2 recombi-nantes fueron determinadas en un ensaye fluorimétrico continuo. La optimización de amortiguador, pH y dependencia de la temperatura llevó a las siguientes condiciones de ensaye: se llevaron a cabo ensayes enzimáticos en 50 mM PBS, pH 7.4, 50 µ? (50 ug/ml) de enzimas purificadas fueron mezclados con 1 µ? de concentraciones diferentes de Ala-Pro-AMC (Enzyme Systems) . Luego se incubaron placas a 37°C por 30 minutos, y se detectó fluorescencia usando un fluorímetro Wallac 1420 con Aex40355 y Aem535. Los valores Km de DPRP-1 y DPRP-2 fueron similares (208 y 161 uM, respectivamente) . Caracterización bioquímica adicional revela que DPRP-1 y DPRP-2 tienen perfiles similares a DPPIV. Las dos proteasas purificadas y DPPIV fueron pre-íncubadas con inhibidores a temperatura de habitación por 30 minutos. El sustrato, Ala-Pro-AMC (100 M) , fue entonces añadido, y la intensidad de la fluorescencia fue registrada como 60 lecturas durante un periodo de 60 minutos. El inhibidor de serina proteasa irreversible AEBSF fue el único inhibidor probado que mostró una intensa inhibición de las tres enzimas (Tabla 5) . Esto confirma la predicción de análisis estructural y de dominios que estas proteínas pertenecen a la super-familia de las serina proteasas. Tabla 5 - Inhibición de DPRP-1 y DPRP-2 por inhibidores de proteasa En adición a Ala-Pro-AMC, los sustratos adicionales probados confirmaron también que DPRP-1 y DPRP-2 son dipeptidil peptidasas. Los datos fueron derivados determinando el cambio de fluorescencia después de 30 minutos de incubación de los sustratos (125 µ?) con enzimas como un porcentaje de la fluorescencia medida en Ala-Pro-AMC y Gly-Pro-AMC como los únicos sustratos buenos entre los probados. Tabla 6 - DPRP-1 y DPRP-2 son dipeptidil peptidasas Se probaron di, tri y tetra-péptidos de aminoácidos naturales y no naturales a fin de encontrar un sustrato óptimo para las pruebas de cada una de las proteínas DPRP que también muestre actividad reducida cuando es DPPIV incubada. El método de ensaye enzimático descrito en la presente es uno de varios métodos que pueden utilizarse para analizar inhibidores de péptidos y no péptidos de las enzimas DPRP. Se probaron bibliotecas de inhibidores de tetra-péptidos para descubrir inhibidores de la actividad enzimática. Los inhibidores candidatos fueron preparados como soluciones 10-20 mM en DMSO y almacenados a -20°C. Se realizaron diluciones en amortiguador de ensaye. La inhibición fue determinada comparando los cambios en fluorescencia de la enzima inhibida con el cambio de fluorescencia de la enzima de control (vehículo) . 100 (unidades fl de la muestra/unidades fl del control x 100) da el valor de la inhibición porcentual. La inhibición porcentual y la concentración de inhibidor a la cual se inhibió la enzima 50% (IC50) fueron determinadas graficando la inhibición porcentual vs . la concentración de inhibidor en la escala logarítmica. Como se muestra en la figura 3, varias amidas de tetra-péptido inhibieron la actividad enzimática, donde los datos son expresados como el porcentaje de actividad en presencia del vehículo (DMSO al 0.02%) solo. Se añadieron compuestos a 1 mM. Lo mas interesante fue la aparente actividad diferencial de algunos tetra-péptidos para DPRP-1 y DPRP-2, en comparación con DPPIV. Aunque las tres enzimas fueron inhibidas por el péptido 1, solamente DPRP-1 y DPRP-2 fueron inhibidas significativamente por los péptidos 4 y 5. Esto demuestra que es susceptible de lograrse la inhibición selectiva de las enzimas purificadas. El ensaye descrito en este ejemplo también puede ser usado para analizar bibliotecas de compuestos sintéticos o que ocurren naturalmente adicionales, incluyendo macro-moléculas, respecto de agentes que ya sea inhiban o acrecienten la actividad de DPRP. Los polipéptidos DPRP-1 y DPRP-2 por usarse en el ensaye pueden ser obtenidos, por ejemplo, por traducción in vitro, expresión recombinante (ver Ejemplo 5) o procedimientos bioquimicos . También pueden usarse métodos distintos de los descritos en la presente para analizar e identificar compuestos que inhiban DPRP-1, DPRP-2 o DPRP-3, los cuales métodos pueden incluir, por ejemplo, ensayes de ligadura tales como ELISA y RIA. Ejemplo 7 Efecto de los Inhibidores de DPRP Sobre la Proliferación de Células Cancerosas Humanas In VItro En un intento por determinar el efecto que pueden tener diversos inhibidores de DPRP-1 y DPRP-2 sobre la proliferación de células cancerosas humanas,- LNCap, PC3 y Dul45, células de cáncer de pecho MLTC-1 y MDA-MB231 de la linea de testículos de ratón fueron puestas en placas (104 per pozo) en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos y se dejaron desarrollar y unirse por 24 horas a 37 °C en una incubadora de C02. Se añadieron entonces a los pozos compuestos a diversas diluciones (diluciones finales: 0.1 nM a 10 µ?) por diversos periodos de incubación de 24 a 96 horas, reemplazándose cada día con compuesto fresco. La adición del diluyente DMSO solo sirvió como control. Después de la incubación con estos compuestos por triplicado, se determinó la proliferación celular usando un ensaye de proliferación celular XTT (Roche 1-465-015) . Las placas fueron leídas a 490 y 650 nm cinco horas después de que se añadió la mezcla XTT. Se observó un incremento en la proliferación celular con tres de los inhibidores a concentraciones iguales a 0.1, 1, 10 y 100 x IC50, y los resultados son mostrados en las figuras 4A, 4B y 4C para células PC3. Globalmente, las DPRPs son expresadas en una amplia variedad de tejidos, como se ha demostrado mediante amplificación de ARNm, manchando Western e inmuno-histoquimica . DPRP-1 fue la mas abundante en los testículos, mediante manchado Northern y manchado Western. El gran número de marbetes de secuencia expresados (ESTs) de fuentes de ADNc de testículo que son homogéneos a DPRP-1 también confirma una abundante expresión de DPRP-1 en testículos. El Ejemplo 4 describe la localización inmuno-histoquímica de la proteína DPRP-1 en testículos humanos usando un anti-cuerpo DPRP-1 específico. La DPRP-1 es expresada intensamente en células epiteliales de Leydig, y las células de Leydig son la fuente primaria de andrógenos testiculares (hormonas esferoides de machos) en el macho mamífero. En el intersticio de los testículos, las células de Leydig y los macrófagos están en asociación estrecha con "digitación" de procesos de células- de Leydig que se extiende sobre la superficie de los macrófagos. Células multi-nucleadas en proximidad estrecha a las células de Leydig también fueron manchadas con anti-cuerpo DPRP-1, sugiriendo que la proteasa también fue expresada en macrófagos, y los macrófagos en los testículos juegan un importante papel en la regulación paracrina de células de Leydig. Las citocinas secretadas por los macrófagos testiculares son mitogénicas a células de Leydig y juegan un papel importante en la diferenciación de células progenitoras mesenqui-males en células de Leydig maduras. Una mas clara comprensión de las proteínas y las trayectorias implicadas en la maduración de los testículos es importante para el descubrimiento de nuevos tratamientos para la pubertad precoz. En adición, las células de Leydig ocasionan tumores tales como tumores estromales de los conductos sexuales vía producción de esteroides sexuales (predominantemente testosterona) . La testosterona está asociada con diversas neoplasias y enfermedades tales como carcinoma de pecho y cánceres uterinos, carcinoma de ovarios y alopecia androgénica (pérdida de cabello) . Exámenes adicionales de la localización de proteínas DPRP en otras glándulas en el cuerpo (v.gr., glándulas adrenales) que producen testosterona y otras hormonas androgénicas están actualmente bajo investigación. La posible asociación de DPRP-1 con funciones de trayectorias biosintéticas de hormonas esteroides y polipéptidas está siendo investigada, y el Ejemplo 7 es relevante a comprender el papel de las proteínas DPRP en modelos de células de próstata, testículos y pecho in vltro. 7Análisis inmuno-histoquímicos también localizaron DPRP-1 en las glándulas endometriales en el útero (ver Ejemplo 4), acinos pancreáticos, glomérulos del riñon, células de plasma en la vejiga, un sub-conjunto de células B en las anginas, células epiteliales de columna en la próstata y metaplasia escamosa de próstata pobremente diferenciada, carcinoma prostático de Gleason, grado 4, y glándulas hiperplásticas en hiperplasia prostática benigna. El manchado positivo en carcinoma de pecho, asi como en seminoma y metaplasia escamosa de próstata, sugiere una asociación general de DPRP-1 con tejidos sensibles a hormonas, particularmente en células que se tornan pobremente diferenciadas. La presencia de DPRP-1 en células epiteliales especializadas y en células de plasma inflamatorias (linfocitos) también es de interés. El carcinoma de pecho inflamatorio tiene una abundancia de linfocitos de infiltración y una mala prognosis global. DPRP-1 y otras proteínas DPRP aparecen en carcinomas medulares que típicamente tienen un componente linfoplasmacítico infiltrante, constante, en la periferia del tumor, que se piensa representa una reacción de los tejidos anfitriones al neoplasma. La mayoría de los linfocitos son células T, y la mayoría de las células de plasma son del tipo productor de IgG. Diversos antígenos son abundantes en células B, un sub-grupo de células de cáncer de pecho, y otras células epiteliales de cáncer, y estos antígenos son objetivos para una nueva clase de anti-cuerpos monoclonales terapéuticos, habiéndose logrado algún éxito notable con un anti-cuerpo monoclonal humanizado contra el antígeno CD20 específico a células B. En consecuencia, se piensa que anticuerpos monoclonales a proteínas DPRP son útiles para diagnosticar y tratar enfermedades en las que están implicadas, incluyendo cáncer . La expresión de DPRP-1 en células epiteliales especializadas de varios tejidos sugiere que DPRP-1 y otras proteínas DPRP pueden estar implicadas en su desarrollo y diferenciación. Las pruebas usando inhibidores descritos en el Ejemplo 6 en modelos in vitro de cáncer de próstata y testículos (Ejemplo 7) mostraron que los inhibidores de DPRP-l/DPRP-2 ocasionaron 50-60% de incremento en la proliferación de células PC3 a concentraciones nM, como se muestra en las figuras 4A-4C. Aunque la invención ha sido descrita de acuerdo con sus formas de realización preferidas, que constituyen el mejor modo actualmente conocido a los inventores, debe entenderse que cambios y modificaciones que serían obvios a los técnicos en la materia pueden hacerse sin apartarse de su ámbito, que se señala en las reivindicaciones anexas. Por ejemplo, aunque la divulgación se enfoca en DPRP-1 y DPRP-2 en ciertos casos, se considera que DPRP-3 y sus fragmentos son similarmente útiles, como lo son los ácidos nucleicos que los codifican. Aspectos particulares de la invención son enfatizados en las reivindicaciones siguientes.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Ácido nucleico aislado, que codifica (a) un polipéptido, que incluye la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, o (b) un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos que es al menos alrededor de 70% similar al mismo y exhibe la misma función biológica/ o que es una variante de empalme alternativa de una de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6; o que es una sonda que comprende al menos 14 nucleótidos contiguos de dicho ácido nucleico que codifica (a) o (b) ; o que es complementario a cualquiera de los anteriores. 2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que es ADN o ARN. 3. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que es una transcripción de ADN que incluye toda la longitud de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6, o que es complementaria a la región de codificación completa de una de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6. . Un oligonucleótido anti-sentido dirigido contra el ADN de la reivindicación 3. 5. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que es una transcripción de ARN que incluye toda la longitud de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6. 6. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que es una variante de empalme alternativa de una de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6. 7. Un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 6. 8. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que tiene un aminoácido que es al menos alrededor de 90% similar a una de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5. 9. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que tiene un aminoácido que es al menos alrededor de 95% similar a uno de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5. 10. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que tiene al menos alrededor de 90% de identidad con una de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5. 11. Una sonda de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos 14 nucleótidos contiguos de una de las SEQ ID NOS: 2, 4 y 6. 12. Una molécula de polinucieótido recombinante, aislada, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 mas elementos de control de expresión enlazados operativamente con dicho ácido nucleico para impulsar su expresión. 13. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos completa establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, enlazada operativamente a un promotor, dicha vector de expresión estando presente en una célula hospedera compatible. 14. Una célula hospedera de mamífero, insecto o bacteriana, que ha sido manipulada por ingeniería genética por la inserción de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 que codifica al menos la porción de proteína madura de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 1, 3 o 5. 15. Un proceso para producir un polipéptido que incluye la porción de proteína madura de una de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, el cual proceso comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 11 bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido. 16. El proceso de la reivindicación 15, donde dicho polipéptido es expresado en la superficie de dicha célula e incluye además el paso de recuperar el polipéptido o un fragmento del mismo del cultivo. 17. Un polipéptido, que puede ser opcionalmente glicosilado, y que (a) tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína madura establecida en cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5; (b) tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína madura que tiene al menos 70% de similitud con una de las proteínas maduras de (a) y que exhibe la misma función biológica; (c) tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína madura que tiene al menos alrededor de 90% de identidad con una proteína madura de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5; o (d) es un fragmento inmunológicamente reactivo de (a) . 18. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14, que es una proteína madura que tiene al menos alrededor de 95% de similitud con una proteína madura de (a) . 19. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14, que es una proteína madura que tiene al menos alrededor de 90% de similitud a una proteína madura de (a) . 20. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14, teniendo la secuencia de aminoácidos de la proteína madura de una de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5, o es un fragmento de la misma, que exhibe la misma función biológica que la proteína madura respectiva . 21. Un antagonista DPRP que inhibe la función biológica de una de dichas proteínas maduras de las reivindicaciones 17, 18 y 19. 22. Un anti-cuerpo que reconoce un polipéptido o un fragmento de acuerdo con la reivindicación 17. 23. El anti-cuerpo de la reivindicación 22, que reconoce un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 1 o 3 o 5. 24. Un método para analizar respecto de un compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática de al menos una proteína madura de la reivindicación 17, el cual método comprende incubar dicha proteína madura y un sustrato adecuado para dicha proteína madura en presencia de uno o mas compuestos de prueba o sus sales, medir la actividad enzimática de dicha proteína madura, comparar dicha actividad con actividad comparable determinada en ausencia de un compuesto de prueba, y seleccionar el compuesto o los compuestos de prueba que reducen la actividad enzimática. 25. Un método para analizar respecto de un compuesto capaz de inhibir la actividad enzimática de DPPIV que no inhibe la actividad enzimática de al menos una de las proteínas maduras de la reivindicación 20, el cual método comprende incubar dicha proteína madura y un sustrato adecuado para dicha proteína madura en presencia de uno o mas inhibidores de DPPIV o sus sales, medir la actividad enzimática de dicha proteína madura, comparar dicha actividad con actividad comparable determinada en ausencia del inhibidor de DPPIV, y seleccionar un compuesto que no reduce la actividad enzimática de dicha proteína madura. Resurnen Se proveen novedosos polipéptidos o proteínas que tienen una homología de secuencia significativa con DPPIV, ácidos nucleicos que los codifican, células que han sido modificadas con tales ácidos nucleicos de modo de expresar estas proteínas, métodos de análisis para el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos que son inhibidores de la actividad de estas proteínas o de proteínas relacionadas, y agentes terapéuticos descubiertos por tales métodos de análisis, así como nuevos tratamientos terapéuticos.