MXPA02003434A

MXPA02003434A - Factor de crecimiento endotelial vascular 2.

Info

Publication number: MXPA02003434A
Application number: MXPA02003434A
Authority: MX
Inventors: Timothy A Coleman
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 2000-08-04
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2002-09-02
Also published as: AU8473401A; US20030215921A1; JP2004505619A; US20060057117A1; US7273751B2; CN1416354A; WO2002011769A1; CN1211126C; EP1313512A1; CA2386103A1; NZ518077A; KR20020059609A; EP1313512A4

Abstract

Se describen polipeptidos de VEGF-2 de humano, fragmentos, analogos o derivados de los mismos, biologicamente activos o utiles en diagnostico o terapia, y ADN (ARN) que codifican para tales polipeptidos de VEGF-2. Tambien se proveen procedimientos para producir tales polipeptidos mediante tecnicas recombinantes y anticuerpos y antagonistas contra tales polipeptidos. Tales polipeptidos y polinucleotidos se pueden utilizar en forma terapeutica para estimular la curacion de heridas y para reparacion del tejido vascular. Tambien se proveen metodos para utilizar los anticuerpos y antagonistas para inhibir angiogenesis de tumor y por lo tanto el crecimiento de tumores, inflamacion, retinopatia diabetica, artritis reumatoide y psoriasis.

Description

FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR 2 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polinucleótidos recién identificados, polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. Los polipéptidos de la presente invención se han identificado como miembros de la familia del factor de crecimiento del endotelio vascular. De manera más particular, los polipéptidos de la presente invención son el factor de crecimiento del endotelio vascular 2 (VEGF-2) . La invención también se refiere a la inhibición de la acción de tales polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La -formación de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis es esencial para el desarrollo embrionario, el crecimiento posterior y la reparación de tejidos. La angiogénesis también es una parte esencial de ciertas condiciones patológicas, tales como neoplasia (es decir, ji ^^#^^^áí^^»*ft¿^S|s?^$<?^ tumores y gliomas) . La angiogénesis anormal está asociada con otras enfermedades tales como inflamación, artritis reumatoide, psoriasis y retinopatía diabética (Folkman, J. , y Klagsbrum, M., Science 235:442-447 (1987)). Las moléculas del factor de crecimiento de fibroblastos tanto acidas como básicas son mitógenos para las células endoteliales y otros tipos de células. La angiotropina y la angiogenina pueden inducir angiogénesis, aunque sus funciones no son claras (Folkman, J. , Cáncer Medicine, Lea y Febiger Press, pp . 153-170 (1993)). Un mitógeno altamente selectivo para las células del endotelio vascular es el factor de crecimiento de endotelio vascular o VEGF (Ferrara, N. et al . , Endocr . Rev. 13:19-32 (1992)), el cual se conoce también como factor de permeabilidad vascular (VPF) . El factor de crecimiento endotelial es un mitógeno angiogénico secretado cuya especificidad hacia las células blanco parece estar restringida a las células del endotelio vascular. El gen para VEGF de ratón ha sido caracterizado y se ha analizado su patrón de expresión en la embriogénesis. Se observó una expresión persistente de VEGF en células epiteliales adyacentes al endotelio fenestrado, por ejemplo, en el plexo coroidal y en los glomérulos renales. Los datos son consistentes con un papel de VEGF como un regulador multifuncional del crecimiento y diferenciación de las células endoteliales (Breier, G. et al . , Development 114:521-532 (1992) ) . VEGF comparte homología de secuencia con los factores de crecimiento derivados de plaquetas humanas, PDGFa y PDGFb (Leung, D. . et al . , Science 246: 1306-1309, (1989) ) . El grado de homología es de aproximadamente 21% y 23%, respectivamente. Ocho residuos de cisteína que contribuyen a la formación de puentes disulfuro se conservan estrictamente en estas proteínas. Aunque estas son similares, existen diferencias específicas entre VEGF y PDGF. Mientras que PDGF es un factor de crecimiento principal para el tejido conectivo, VEGF es altamente específico para las células endoteliales. En forma alternativa, se han identificado moléculas de ARNm empalmadas tanto para VEGF, PLGF y PDGF y estos productos de empalmamiento diferentes difieren en actividad biológica y en su carácter específico de unión a receptor. VEGF y PDGF funcionan como homodímeros o heterodímeros y se unen a los receptores que presenten una actividad intrínseca de tirosina cinasa después de la dimerización del receptor. VEGF tiene cuatro formas diferentes de 121, 165, ÍA.I.Í t :t_.t t. íA . i.A 189 y 206 aminoácidos debido al empalmamiento alternativo. VEGF121 y VEGF165 son solubles y pueden promover la angiogénesis, mientras que VEGF189 y VEGF206 se unen a proteoglicanos que contienen heparina en la superficie celular. La expresión temporal y espacial de VEGF se ha correlacionado con la proliferación fisiológica de los vasos sanguíneos (Gajdusek, C.M., y Carbón, S.J., Cell Physiol . 139:570-579 (1989); McNeil, P.L., et al . , J. Cell . Biol . 109:811-822 (1989)). Sus sitios de unión de alta afinidad se localizan únicamente sobre las células endoteliales en secciones de tejido (Jakeman, L.B., et al . , Clin Invest . 89:244-253 (1989)). El factor se puede aislar de células pituitarias y de diversas líneas de células de tumor, y se ha implicado en algunos gliomas de humano (Píate, K.H., Nature 359:845-848 (1992)). Como un aspecto interesante, la expresión de VEGF121 o VEGF165 confiere a las células de ovario de hámster chino la capacidad de formar tumores en ratones desnudos (Ferrara, N. et al . , J. Clin . Invest . 91:160-170 (1993)). Se demostró que la inhibición de la función de VEGF mediada por anticuerpos monoclonales anti-VEGF inhibe el crecimiento de tumor en ratones con sistema inmune deficiente (Kim, K.J., Na ture 362:841-844 (1993)). Además, se ha demostrado que un mutante dominante-negativo del receptor de VEGF inhibe el crecimiento de glioblastomas en ratones. También se descubrió que el factor de permeabilidad vascular (VPF) es responsable de la hiperpermeabilidad microvascular persistente hacia las proteínas plasmáticas incluso después del cese del daño, lo cual es una característica común de la cicatrización normal de heridas. Esto sugiere que VPF en un factor importante en la curación de heridas. Brown, L.F. et al . , J. Exp . Med. 176:1375-1379 (1992) . La expresión de VEGF es elevada en tejidos vascularizados (por ejemplo, pulmón, corazón, placenta y tumores sólidos) y se correlaciona con la angiogénesis en forma tanto temporal como espacial . También se ha demostrado que VEGF induce la angiogénesis in vivo . Debido a que la angiogénesis es esencial para la reparación de tejidos normales, en especial tejidos vasculares, se ha propuesto el uso de VEGF para promover la reparación de tejido vascular (por ejemplo en aterosclerosis) . La patente E.U.A. No. 5,073,492, expedida el 17 de diciembre de 1991 para Chen et al., describe un método para mejorar en forma sinergista el crecimiento de células del endotelio en un entorno apropiado que comprende agregar al i.Ji.M AíÁ'íl - i . entorno, VEGF, efectores y factor derivado de suero. Además, se ha preparado el ADN de la subunidad C del factor de crecimiento de células del endotelio vascular mediante técnicas de reacción de polimerasa en cadena. El ADN codifica para una proteína que podría existir ya sea como un heterodímero o como un homodímero. La proteína es un mitógeno de células del endotelio vascular de mamífero, y, como tal, es útil para promover el desarrollo y reparación vascular, como se describe en la solicitud de patente europea No. 92302750.2, publicada el 30 de septiembre de 1992.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Los polipéptidos de la presente invención se han identificado en forma putativa como un factor de crecimiento del endotelio vascular novedoso tomando como base la homología de secuencia de aminoácidos con VEGF de humano. De conformidad con un aspecto de la presente invención, se proveen polipéptidos maduros novedosos, así como fragmentos, análogos y derivados de los mismos biológicamente activos y útiles en diagnóstico o terapia. Los polipéptidos de la presente invención son de origen humano . De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proveen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de VEGF-2 de longitud completa o truncados que tienen las secuencias de aminoácido mostradas en las SEQ ID NOS: 2 ó 4, respectivamente, o las secuencias de aminoácidos codificadas por los clones de ADNc depositados en hospederos de origen bacteriano como el Depósito ATCC número 97149 efectuado el 12 de mayo de 1995 o como el Depósito ATCC número 75698 efectuado el 4 de marzo de 1994. La presente invención se refiere también a fragmentos, análogos y derivados de VEGF-2 biológicamente activos y útiles para diagnóstico o terapia. De conformidad incluso con otro aspecto de la presente invención, se proveen procedimientos para producir tales polipéptidos mediante técnicas recombinantes que comprenden cultivar células de hospedero procarionte y/o eucarionte recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención, bajo condiciones que promuevan la expresión de dichas proteínas y la recuperación posterior de dichas proteínas. í ?&i A ¿AÍ ?.Í¿S ?¡AÍ¡U£, De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, se proveen procedimientos para utilizar tales polipéptidos, o los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos para propósitos terapéuticos, por ejemplo, para estimular la angiogénesis, la curación de heridas, el crecimiento de huesos y tejidos dañados, y para promover la reparación de tejido vascular. En particular, se proveen procedimientos para utilizar tales polipéptidos, o los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, para el tratamiento de enfermedad arterial periférica, tal como la isquemia de extremidad crítica y las cardiopatías coronarias . De conformidad incluso con otro aspecto de la presente invención, se proveen anticuerpos contra tales polipéptidos y procedimientos para producir tales polipéptidos . De conformidad incluso con otro aspecto de la presente invención, se proveen antagonistas para tales polipéptidos, los cuales se podrían utilizar para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, para evitar la angiogénesis de tumores y de esta manera inhibir el crecimiento de los mismos, para tratar retinopatía diabética, inflamación, artritis reumatoide y psoriasis.

De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proveen sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico con longitud suficiente para hibridarse en forma especifica a las secuencias de ácido nucleico de la presente invención. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para diagnosticar enfermedades o la susceptibilidad a enfermedades relacionadas con mutaciones en las secuencias de ácido nucleico de la presente invención y las proteínas codificadas por dichas secuencias de ácido nucleico. De conformidad incluso con un aspecto adicional de la presente invención, se provee un procedimiento para utilizar tales polipéptidos, o los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, para propósitos in vi tro relacionados con la investigación científica, la síntesis de ADN y la fabricación de vectores de ADN. Estos y otros aspectos de la presente invención deberán ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las siguientes figuras son ilustraciones de modalidades de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención tal como queda abarcado por las reivindicaciones . Las figuras 1A-1E muestran el nucleótido de longitud completa (SEQ ID NO:l) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:2) de VEGF2. El polipéptido comprende aproximadamente 419 residuos de aminoácido de los cuales aproximadamente 23 representan la secuencia guía. Se utiliza la abreviación estándar de una letra para los aminoácidos. La determinación de secuencia se realizó utilizando el analizador de secuencias de ADN automatizado modelo 373 (Applied Biosystems, Inc.). Se pronostica que la exactitud de la determinación de secuencia es mayor del 97%. Las figuras 2A-2D muestran la secuencia del nucleótido (SEQ ID NO : 3 ) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 4) de una forma biológicamente activa truncada, de VEGF2. El polipéptido comprende aproximadamente 350 residuos de aminoácido de los cuales aproximadamente los primeros 24 aminoácidos representan la secuencia guía. Las figuras 3A-3B son una ilustración de la í¡á ?? á.?e:i ,ÉíÍ ?^S?A.,' ¡1?MA. . . . ?& . , ± . ? . ^.4, ., ± ^*^aAt. ?^. *~^^ JrtM* ^ . y *tM. ¿j e. .t?l jÁÁ? II homología de secuencia de aminoácidos entre PDGFa (SEQ ID N0:5), PDGFb (SEQ ID N0:6), VEGF (SEQ ID NO:7) y VEGF-2 (SEQ ID NO: 4). Las áreas enmarcadas indican las secuencias conservadas y la ubicación de los ocho residuos de cisteína conservados . La figura 4 muestra, a manera de cuadro, el por ciento de homología entre PDGFa, PDGFb, VEGF y VEGF-2. La figura 5 muestra la presencia de ARNm de VEGF-2 en líneas celulares de tumor de mama de humano. La figura 6 muestra los resultados del análisis Northern blot de VEGF-2 en tejidos adultos de humano. La figura 7 muestra una fotografía de un gel de SDS-PAGE después de la transcripción, traducción y electroforesis in vi tro del polipéptido de la presente invención. Carril 1: marcador de 14C y M.W. en arco iris; Carril 2: control de FGF; Carril 3: VEGF-2 producido por los iniciadores M13 inverso y directo; Carril 4: VEGF-2 producido por los iniciadores M13 inverso y VEGF-F4; Carril 5: VEGF-2 producido por los iniciadores M13 inverso y VEGF-F5. Las figuras 8A y 8B muestran fotografías de geles de SDS-PAGE. El polipéptido de VEGF-2 se expresó en un sistema de baculovirus que consiste de células Sf9. Se analizó la proteína proveniente del medio y el citoplasma de las células mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (figura 8A) y reductoras (figura 8B) . La figura 9 muestra una fotografía de un gel de SDS-PAGE. Se precipitó el medio proveniente de células Sf9 infectadas con una secuencia de ácido nucleico de la presente invención. El precipitado resuspendido se analizó mediante SDS-PAGE y se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. La figura 10 muestra una fotografía de un gel de SDS-PAGE. Se purificó VEGF-2 a partir del sobrenadante del medio y se analizó mediante SDS-PAGE en presencia o en ausencia del agente reductor b-mercaptoetanol y se tiñó con Azul Brillante de Coomassie. La figura 11 muestra el análisis de HPLC de fase inversa de VEGF-2 purificado utilizando una columna RP-300 (0.21 x 3 cm, Applied Biosystems, Inc.) . La columna se equilibra con ácido trifluoroacético al 0.1% (Solvente A) y las proteínas se eluyen con un gradiente de 0 a 60%, durante 7.5 minutos, de Solvente B, constituido por acetonitrilo que contiene 0.07% de TFA. La elución de la proteína se monitorea mediante absorbancia a 215 nm (línea "roja") y 280 nm (línea "azul") . El porcentaje de Solvente B se muestra con la línea "verde" .

La figura 12 es una gráfica de barras que ilustra el efecto de la proteína de VEGF-2 parcialmente purificada sobre el crecimiento de células del endotelio vascular en comparación con el factor de crecimiento de fibroblastos básico. La figura 13 es una gráfica de barras que ilustra el efecto de la proteína de VEGF-2 purificada sobre el crecimiento de células del endotelio vascular. Las figuras 14A y 14B muestran la expresión de ARNm de VEGF-2 en tejidos de feto y de adulto humanos. La figura 15 muestra la expresión de ARNm de VEGF-2 en células de cultivo primario de humano. Las figura 16A y 16B muestran la expresión transitoria de la proteína de VEGF-2 en células COS-7. La figura 17 muestra la proliferación estimulada de VEGF-2 de células del endotelio de la vena umbilical de humano (HUVEC) . La figura 18 muestra la proliferación estimulada de VEGF-2 de células del endotelio microvascular dérmico. La figura 19 muestra el efecto estimulador de VEGF-2 sobre la proliferación de células del endotelio microvascular, del cordón umbilical, del endometrio y de la aorta de bovino. Í? ?-.Á ¿,?ít? .í.?*áí? . s.^ 44^ÁÍ.Í Las figuras 20A y 20B muestran la inhibición de proliferación de células de músculo liso (de aorta de humano) vascular inducida por PDGF. Las figuras 21A y 21B muestra la simulación de migración de células HUVEC y de endotelio microvascular de bovino (BMEC) por VEGF-2. La figura 22 muestra la estimulación de la liberación de óxido nítrico de las células HUVEC por VEGF-2 y VEGF-1. La figura 23 muestra la inhibición de formación de cuerda de las células del endotelio microvascular (CADMEC) por VEGF-2. La figura 24 muestra la estimulación de angiogénesis por VEGF, VEGF-2 y bFGF en la prueba de CAM. Las figuras 25 A-0 muestra el restablecimiento de ciertos parámetros en la extremidad isquémica ocasionada por la proteína de VEGF-2 (figura 25, paneles superiores) y por plásmido de expresión desnudo (figura 25, paneles intermedios) : relación BP (Figura 25a) ; Flujo Sanguíneo y Flujo de Reserva (figura 25b); Puntuación .Angiográfica (figura 25c); densidad capilar (figura 25d) . Las figuras 26 A-G muestran la capacidad de VEGF-2 para afectar la presión sanguínea diastólica en ratas con hipertensión espontánea (SHR) . Las figuras 26a y b muestran la disminución dependiente de la dosis en la presión sanguínea diastólica que se obtiene con VEGF-2. Las figuras 26c y d muestran la presión arterial promedio (MAP por sus siglas en inglés) reducida que se observa con VEGF-2. El panel E muestra el efecto de incrementar las dosis de VEGF-2 en la presión arterial promedio (MAP) de ratas SHR. El panel F muestra el efecto de VEGF-2 sobre la presión diastólica de ratas SHR. El panel G muestra el efecto de VEGF-2 sobre la presión sanguínea diastólica de ratas SHR. La figura 27 muestra la inhibición de proliferación inducida por VEGF-2N= y VEGF-2. La figura 28 muestra una representación esquemática del vector de expresión pHE4a (SEQ ID NO: 16) . Se indican los sitios del gen marcador de resistencia a kanamicina, de la región enlazadora de sitio de clonación múltiple, de la secuencia oriC, y de la secuencia que codifica para laclq. La figura 29 muestra la secuencia de nucleótido de los elementos reguladores del promotor pHE4a (SEQ ID NO:17). Las dos secuencias de operador lac, la secuencia Shine-Delgarno (S/D) y los sitios de restricción terminales Hindl l l y Ndel (en cursivas) .

La figura 30 muestra una representación en esquema de la construcción de vector de expresión pVGI .1 que contiene un polinucleótido que codifica para VEGF-2. La figura 31 A-G muestra la secuencia de nucleótido de la construcción del vector pVGI .1 que contiene el inserto para VEGF-2 (SEQ ID NO: 36) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS De conformidad con un aspecto de la presente invención, se proveen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica para un polipéptido de VEGF-2 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1 (SEQ ID NO : 2 ) , la cual se determinó mediante determinación de secuencia de una molécula de .ADNc clonada. La secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID NO : 1 se obtuvo mediante determinación de secuencia de un clon de ADNc, el cual se depositó el 12 de mayo de 1995 en el Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y se le dio el número de depósito ATCC 97149. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proveen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que codifica para un polipéptido de VEGF-2 truncado que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 2 (SEQ ID NO: 4) , la cual se determinó mediante determinación de secuencia de una molécula de ADNc clonada. La secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID NO : 3 se obtuvo mediante determinación de secuencia de un clon de ADNc, el cual se depositó el 4 de marzo de 1994 en el Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, y se le dio el número de depósito ATCC 75698. A menos que se indique de otra manera, todas las secuencias de nucleótido determinadas mediante determinación de secuencia de una molécula de ADN en la presente invención se determinaron utilizando un determinador de secuencia automatizado de ADN (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por moléculas de ADN que se determinan en la presente invención se pronosticaron mediante traducción de una secuencia de ADN que se determina como se indicó anteriormente. Por lo tanto, como es sabido en la técnica para cualquier secuencia de ADN que se determina mediante este método automatizado, cualquiera de las secuencias de nucleótido que se determinan en la presente invención podría contener algunos errores. Las secuencias de nucleótido que se determinan mediante métodos automatizados típicamente tienen por lo menos 90% aproximadamente de identidad, de manera más típica por lo menos desde el 95% aproximadamente hasta 99.9% aproximadamente de identidad con la secuencia de nucleótido real de la molécula de .ADN a la que se determina la secuencia. Se puede determinar la secuencia actual en forma más precisa mediante otros métodos incluyendo métodos de determinación de secuencia de ADN manuales, los cuales son bastante conocidos en la técnica. También es sabido en la técnica, que una sola inserción o deleción en una secuencia de nucleótido determinada en comparación con la secuencia actual ocasionan un desplazamiento del marco en la traducción de la secuencia de nucleótido de tal manera que la secuencia de aminoácido pronosticada, codificada por una secuencia de nucleótido determinada, será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN a la que se determina la secuencia, empezando en el punto de tal inserción o deleción. Se puede obtener un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la presente invención a partir de . «¡*A??mM3~*j¿?J?tS)± osteoclastomas de embrión de humano de etapa inicial (semana 8 a 9) , de corazón adulto o de varias líneas de células de cáncer de tejido mamario. El polinucleótido de esta invención se descubrió en una genoteca de ADNc derivada de embrión de humano en etapa inicial de 9 semanas. Este está estructuralmente relacionado con la familia de VEGF/PDGF. Este contiene un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de aproximadamente 419 residuos de aminoácido, de la cual aproximadamente los primeros 23 residuos de aminoácido son la secuencia líder putativa de tal manera que la proteína madura comprende 396 aminoácidos, y cuya proteína exhibe la homología de secuencia de aminoácido más elevada con el factor de crecimiento de endotelio vascular de humano (30% de identidad) , seguido por PDGFa (24%) y PDGFb (22%) , (véase figura 4) . Es particularmente importante que todas las ocho cisteínas se conserven dentro de todos los cuatro miembros de las familia (véase las áreas enmarcadas de la figura 3) . Además la rúbrica para las familias PDGF/VEGF, PXCVXXXRCXGCCN, (SEQ ID NO: 8), se conserva en VEGF2 (véase figura 3) . La homología entre VEGF2, VEGF y los dos PDGF está a nivel de secuencia de proteína. No se puede detectar homología de secuencia de nucleótido, y por lo tanto, podría ser difícil aislar al VEGF2 mediante métodos simples tales como hibridación con baja astringencia. El polipéptido de VEGF2 de la presente invención incluye al polipéptido de longitud completa y a la secuencia de polinucleótido que codifique para cualquiera de las secuencias líder y para fragmentos activos del polipéptido de longitud completa. Se pretende que los fragmentos activos incluyan cualquiera de las porciones de la secuencia de aminoácido de longitud completa que tengan menos de los 419 aminoácidos totales de la secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, pero que sigan conservando los ocho residuos de cisteína mostrados en la figura 3 y que aún tengan actividad de VEGF2. Existen por lo menos dos secuencias ARNm para VEGF-2 empalmadas en forma alternada presentes en los tejidos normales. Las dos bandas en la figura 7, carril 5 indican la presencia de ARNm empalmadas en forma alternada que codifica para el polipéptido de VEGF2 de la presente invención. El polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, cuyo ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble cadena o de cadena sencilla, y si es de una sola cadena puede ser la cadena codificadora o la cadena no codificadora (anti-sentido) . La secuencia codificadora que codifica para el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificadora mostrada en la figura 1 o en la figura 2, o a la de los clones depositados, o podría ser una secuencia codificadora diferente la cual, como resultado de la redundancia o de la degeneración del código genético, codifica para el mismo polipéptido maduro que el ADN de la figura 1, la figura 2, o las moléculas de ADNc depositadas. El polinucleótido que codifica para el polipéptido maduro de la figura 1 o de la figura 2 o para los polipéptidos maduros codificados por las moléculas de ADNc depositadas podría incluir: únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido maduro; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro y secuencias codificadoras adicionales tales como una secuencia líder o secretora o una secuencia para pro-proteína; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro (y opcionalmente las secuencias codificadoras adicionales) y secuencias no codificadoras, tales como intrones o la secuencia 5' y/o 3' no codificadora de la secuencia que codifica para el polipéptido maduro.

Por lo tanto, el término "polinucleótido que codifica para un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye únicamente las secuencias codificadoras para el polipéptido así como un polinucleótido que incluye secuencias codificadoras y/o no codificadoras adicionales. La presente invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en la presente invención los cuales codifican para fragmentos, análogos y derivados de polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 1 ó 2, o el polipéptido codificado por la molécula de ADNc de los clones depositados. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica del polinucleótido que se presente en forma natural o una variante del polinucleótido que no se presente en forma natural . Por lo tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican para el mismo polipéptido maduro, como se muestra en las figuras 1 ó 2 o el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de los clones depositados así como las variantes de tales polinucleótidos cuyas variantes codifican para un fragmento, derivado o análogo de los polipéptidos de las figuras 1 ó 2, o el polipéptido codificado por el ADNc de los clones depositados. Tales variantes de nucleótido incluyen variantes de supresión, variantes de sustitución, y variantes de adición o inserción. Como se indicó anteriormente en la presente invención, el polinucleótido puede tener una secuencia codificadora que sea una variante alélica que se presenta en forma natural de la secuencia codificadora mostrada en las figuras 1 ó 2, o de la secuencia codificadora de los clones depositados. Como se sabe en la técnica una variante alélica es una forma alterna de una secuencia de polinucleótido que tiene una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, la cual no altera en forma sustancial la función del polipéptido codificado. La presente invención también incluye polinucleótidos, en los cuales la secuencia codificadora para el polipéptido maduro se podría fusionar en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayude en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula hospedera, por ejemplo, una secuencia líder que funcione como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una pre-proteína y la célula hospedera podría cortar la secuencia líder para itiJLát ? j . .,.&km l?«h:? ¡^^a^^$ ¡h^jl Jj¡t¿¡egj¿^¿*¡*¡^^< formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también podrían codificar para una pro-proteína la cual es la proteína madura más los residuos de aminoácido del extremo 5' adicionales. Una proteína madura que tenga una pro-secuencia es una pro-proteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la pro-secuencia se corta permanece una proteína madura activa Por lo tanto, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención podría codificar para una proteína madura, o para una proteína que tenga una pro- secuencia o para una proteína que tenga tanto una pro- secuencia como una pre-secuencia (secuencia líder) . Los polinucleótidos de la presente invención también podrían tener la secuencia codificadora fusionada en el marco a una secuencia marcadora que permita la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora podría ser una marca hexa-histidina suministrada por un vector pQE-9 para asegurar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un hospedero bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora podría ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se utiliza un hospedero mamífero, por ejemplo células COS- 7. La marca HA corresponde a un epítope derivado l'ji-t.-u .* .*, . ~ r . 44-. . ^ ».A... *, .- ***.. ~At~AÍ*.M*~~~??-*~ de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson, I. et al. , Cell 37:767 (1984) ) . Las modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótido por lo menos con 95% de identidad, y más preferido por lo menos con 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con (a) una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido en SEQ ID No. 2; (b) una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido que tenga la secuencia de aminoácido en SEQ ID No . 2, pero que carezca de la metionina del extremo N-terminal; (c) una secuencia de nucleótido que codifique para el polipéptido que tenga la secuencia de aminoácido en las posiciones 1 a 396 aproximadamente en SEQ ID No. 2; (d) una secuencia de nucleótido que codifique para el polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 97149; (e) una secuencia de nucleótido que codifique para el polipéptido de VEGF-2 maduro que tenga la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 97149; o (f) que sea complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótido en (a) , (b) , (c) , (d) ó (e) .

Las modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótido por lo menos con 95% de identidad, y más preferido por lo menos con 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con (a) una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido en SEQ ID No. 4; (b) una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido que tenga la secuencia de aminoácido en SEQ ID No. 4, pero que carezca de la metionina del extremo N-terminal; (c) una secuencia de nucleótido que codifique para el polipéptido que tenga la secuencia de aminoácido en las posiciones 1 a 326 aproximadamente en SEQ ID No. 4; (d) una secuencia de nucleótido que codifique para el polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698; (e) una secuencia de nucleótido que codifique para el polipéptido de VEGF-2 maduro que tenga la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADNc contenido en el Depósito ATCC No. 75698; o (f) que sea complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótido en (a) , (b) , (c) , (d) ó (e) . Con la frase un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos con por lo menos, por ejemplo, 95% "de identidad" con una secuencia de nucleótido de referencia que codifica para un polipéptido de VEGF-2 se quiere decir que la secuencia de nucleótido del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótido podría incluir hasta 5 mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótido de referencia que codifica para el polipéptido de VEGF-2. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótido por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótido de referencia, se podrían suprimir o sustituir hasta un 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia con otro nucleótido, o se podría insertar en la secuencia de referencia un número de nucleótidos hasta un 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se podrían presentar en las posiciones 5N o 3N terminales de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, esparcidas ya sea en forma individual entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como algo práctico, el que una molécula de ácido nucleico particular sea por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 4íi ' ?á-*-» t-*- ~í'- -I&?t? riu 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NOS: 1 ó 3, o a la secuencia de nucleótidos del clon o clones del ADNc depositado se puede determinar en forma convencional utilizando programas para computadora conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711) . El programa Bestfit utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza el programa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia en particular es o no, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de conformidad con la presente invención, se establecen los parámetros, desde luego, de tal manera que el porcentaje de identidad se calcule a través de la longitud completa de la secuencia de nucleótido de referencia y que se permitan espacios en la homología de hasta un 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Como se describe con mayor detalle posteriormente, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar t?.? A.<L3LlJ>Ai* L.I*l.¡Z?*' -~-"--- -•-«»*-.*..«-.-*- *-*"•- -»*«** .. ^^^im^ ,*«*»I?J ¿H? *A?i-para crear anticuerpos policlonales y monoclonales, los cuales son útiles en pruebas de diagnóstico para detectar la expresión de la proteína de VEGF-2 como se describe posteriormente o como agonistas y antagonistas que puedan incrementar o inhibir la función de la proteína VEGF-2. Además, tales polipéptidos se pueden utilizar en el sistema de dos híbridos de levadura para "capturar" las proteínas que se unen a la proteína de VEGF-2 las cuales también son agonistas y antagonistas candidatos de conformidad con la presente invención. El sistema de dos híbridos de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989). En otro aspecto, la invención provee un péptido o polipéptido que comprende una porción portadora de epítope de un polipéptido de la invención. Respecto a la selección de péptidos o polipéptidos que portan un epítope antigénico (es decir, que contengan una región de una molécula de proteína a la cual se pueda unir un anticuerpo) , es bien sabido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia de proteína pueden en forma rutinaria inducir un antisuero que reaccione con la proteína parcialmente imitada. Véase, por ejemplo, Sutcliffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N. y Learner, R.A. (1983) Antibodies that react with §, predetermined sites on proteins. Science 219:660-666. Los péptidos que pueden inducir suero reactivo a proteína con frecuencia están representados en la secuencia primaria de una proteína, se pueden caracterizar mediante un conjunto 5 simple de reglas químicas y no están confinados ni a las regiones inmunodominantes de las proteínas intactas (es decir, epítopes inmunogénicos) ni a los extremos amino o carboxilo terminales. Los péptidos que son extremadamente hidrofóbicos y aquellos que tienen seis o menos residuos por 10 lo general no son efectivos para inducir anticuerpos que se unan a la proteína imitada; por lo general son efectivos los péptidos más largos, solubles, especialmente aquellos que contienen residuos de prolina. Sutcliffe et al., supra, en la página 661. Por ejemplo, 18 de 20 péptidos diseñados de 15 conformidad con estos lineamientos, contienen 8-39 residuos que cubren el 75% de la secuencia de la cadena de polipéptido de hemaglutinina HA1 del virus de influenza, inducen anticuerpos que reaccionan con la proteína HA1 o con el virus intacto; y 12/12 péptidos provenientes de la 20 polimerasa MuLV y 18/18 de la glicoproteína de rabia inducen anticuerpos que precipiten con las proteínas respectivas. Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos portadores de epítopes antigénicos de la invención son -a ^^ ^t^És í^^^^^'* .*-S -^ ií Ít útiles para crear anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unan en forma específica a un polipéptido de la invención. De esta manera, una proporción alta de hibridomas obtenidos mediante fusión de esplenocitos provenientes de donadores inmunizados con un péptido portador de epítope por lo general secretan anticuerpos que reacción con la proteína original. Sutcliffe et al., supra en la página 663. Los anticuerpos creados con péptidos o polipéptidos portadores de epítopes son útiles para detectar la proteína imitada, y se podrían utilizar anticuerpos para péptidos diferentes para rastrear el destino de varias regiones de un precursor de proteína que se somete a procesamiento posterior a la traducción. Se pueden utilizar los péptidos y los anticuerpos anti -péptido en una variedad de pruebas cualitativas o cuantitativas para la proteína imitada, por ejemplo, en pruebas de competencia debido a que se ha demostrado que aun los péptidos cortos (por ejemplo, de 9 aminoácidos aproximadamente) se pueden unir y desplazar a los péptidos más grandes en pruebas de inmunoprecipitación. Véase por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984) en la página 777. Los anticuerpos anti-péptido de la invención también son útiles para la purificación de la proteína imitada, por ejemplo, mediante 'lJá?&. zMMbé^tAÍ¡*?áÍ?M*?i cromatografía de adsorción utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los péptidos y polipéptidos portadores de epítope antigénico de la invención diseñados de conformidad con los lineamientos anteriores de preferencia contienen una secuencia de por lo menos siete, más preferido por lo menos nueve y más preferido aún entre aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácido de un polipéptido de la invención. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más larga de una secuencia de aminoácido de un polipéptido de la invención, que contienen aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o 150 aminoácidos, o cualquier longitud de hasta y que incluya la secuencia de aminoácido completa de un polipéptido de la invención, también se consideran péptidos o polipéptidos portadores de epítope de la invención y también son útiles para inducir anticuerpos que reaccionen con la proteína imitada. De preferencia, la secuencia de aminoácido del péptido portador de epítope se selecciona para proveer solubilidad sustancial en solventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos y de preferencia se evitan las secuencias altamente hidrofóbicas) ; y son particularmente preferidas las secuencias que contienen residuos de prolina. Los ejemplos no limitativos de polipéptidos o péptidos antigénicos que se pueden utilizar para generar anticuerpos específicos para VEGF-2 incluyen los siguientes: un polipéptido que comprende residuos de aminoácido desde aproximadamente leu-37 hasta aproximadamente glu-45 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Tyr- 58 hasta aproximadamente Gly- 66 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Gln-73 hasta aproximadamente Glu- 81 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Asp-100 hasta aproximadamente Cys-108 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Gly-140 hasta aproximadamente Leu-148 en SEQ ID N0:2, desde aproximadamente Pro-168 hasta aproximadamente Val-176 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente H?s-183 hasta aproximadamente Lys- 191 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Ile-201 hasta aproximadamente Thr-209 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Ala-216 hasta aproximadamente Tyr-224 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Asp-244 hasta aproximadamente His-254 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Gly-258 hasta aproximadamente Glu-266 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Cys-272 hasta aproximadamente Ser-280 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Pro-283 hasta aproximadamente Ser-291 en SEQ ID NO : 2 , desde <uU¡UtJL.*i .¿» . l ' M. a»»t?t ?>í^MÍ^» ?^£^^mé S=Í^^É^í¿ i¿^tS£SÍ aproximadamente Cys-296 hasta aproximadamente Gln-304 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Ala-307 hasta aproximadamente Cys-316 en SEQ ID NO : 2 , desde aproximadamente Val-319 hasta aproximadamente Cys-335 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Cys-339 hasta aproximadamente Leu-347 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Cys-360 hasta aproximadamente Glu-373 en SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente Tyr-378 hasta aproximadamente Val -386 en SEQ ID NO : 2 , y desde aproximadamente Ser-388 hasta aproximadamente Ser-396 en SEQ ID NO: 2. Se ha determinado que estos fragmentos de polipéptido portan epítopes antigénicos de la proteína de VEGF-2 mediante el análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf . Los péptidos y polipéptidos portadores de epítope de la invención se pueden producir mediante cualquiera de los medios convencionales para preparar péptidos o polipéptidos incluyendo medios recombinantes utilizando las moléculas de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia de aminoácido corta portadora de epítope a un polipéptido más largo que actúe como un vehículo durante la producción recombmante y purificación, así como durante la inmunización para producir anticuerpos anti-péptido. También se pueden sintetizar péptidos portadores de epítope utilizando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para la síntesis de números grandes de péptidos, tales como 10-20 mg de 248 péptidos diferentes de 13 residuos que representan variantes de aminoácido individuales de un segmento del polipéptido de HA1 los cuales se prepararon y caracterizaron (mediante estudios de unión tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R. A. (1985) General method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acids. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5131-5135. Este procedimiento de "Síntesis Simultánea de Péptidos Múltiples (SMPS por sus siglas en inglés)" también se describe en la patente E.U.A. No. 4,631,211 para Houghten et al. (1986). En este procedimiento las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de los diversos péptidos están contenidas en paquetes separados permeables a solventes, lo que permite el uso óptimo de los muchos pasos repetitivos idénticos implicados en los métodos en fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite que se puedan efectuar 500-1000 o más síntesis en forma simultánea. Houghten et al., supra, en la página 5134.

Aüii - Los péptidos y polipéptidos portadores de epítope de la invención se utilizan para inducir anticuerpos de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985) . Por lo general, los animales se pueden inmunizar con péptido libre; sin embargo, el título de anticuerpo anti -péptido podría ser reforzado acoplando el péptido a un portador macromolecular, tal como la hemocianina de lapa (KLH) o el toxoide del tétanos. Por ejemplo, los péptidos que contiene residuos de cisteína se pueden acoplar a un portador utilizando un enlazador tal como el éster de maleilimidobenzoil-N-hidrosuccinimida (MBS) , mientras que otros péptidos se podrían acoplar a los portadores utilizando un agente enlazante más general tal como glutaraldeído . Los animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan ya sea con el péptido libre o con péptidos acoplados a portador, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 mg de péptido o proteína portadora y adyuvante de Freund. Se podrían necesitar varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas, para proveer un título útil de anticuerpo antipéptido el cual puede ser detectado, por ejemplo, mediante pruebas ELISA utilizando péptido libre adsorbido a una superficie sólida. Se podría incrementar el título de cualquiera de los anticuerpos antipéptido en suero provenientes de un animal inmunizado seleccionando anticuerpos antipéptido, por ejemplo, mediante adsorción al péptido en un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Los péptidos portadores de epítope inmunogénicos de la invención, es decir, aquellas partes de una proteína que inducen una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el inmunógeno, se identifican de conformidad con métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Geysen et al., supra, describe un procedimiento para la síntesis concurrente rápida sobre soportes sólidos de cientos de péptidos con pureza suficiente para reaccionar en una prueba inmunosorbente ligada a enzima. Después se detecta fácilmente la interacción de los péptidos sintetizados con los anticuerpos sin retirarlos del soporte. De esta manera, el experto en la técnica puede identificar en forma rutinaria un péptido que tenga un epítope inmunogénico de una proteína deseada. Por ejemplo, Geysen et al. localizaron el epítope de importancia inmunológica en la proteína de la cubierta del virus de la enfermedad de pies y boca con una resolución de siete aminoácidos mediante síntesis de un conjunto traslapante de todos los 208 posibles hexapéptidos que cubren la secuencia completa de 213 aminoácidos de la proteína. Después se sintetiza un conjunto completo de reemplazo de péptidos en los cuales a su vez se sustituyen todos los 20 aminoácidos en cada posición dentro del epítope, y se determinan los aminoácidos particulares que confieren carácter específico para la reacción con el anticuerpo. Por lo tanto, utilizando este método se pueden preparar en forma rutinaria los análogos peptídicos de los péptidos portadores de epítope de la invención. La patente E.U.A. No. 4,708,781 para Geysen (1987) también describe estge método de identificación de un péptido que porte un epítope inmunogénico de una proteína deseada. También, la patente E.U.A. No. 5,194,392 para Geysen (1990) describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) que sean un equivalente topológico del epítope (es decir, un amimotope) el cual es complementario a un paratope particular (sitio de unión a antígeno) de un anticuerpo de interés. De manera más general, la patente E.U.A. No. 4,433,092 para Geysen (1989) describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros que sea un equivalente topográfico de un ligando que sea complementario al sitio de unión al ligando de un receptor de interés particular. De igual manera, la patente E.U.A. No. 5,480,971 para Houghten, R. A. et al. (1996) sobre mezclas de oligopéptido peralquilado describe oligopéptidos lineales peralquilados de alquilo de C?-C7 y conjuntos y genotecas de tales péptidos, así como métodos para utilizar tales conjuntos y genotecas de oligopéptido para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se unan en forma preferente a una molécula aceptora de interés. Por lo tanto, utilizando estos métodos también se pueden preparar en forma rutinaria análogos no peptídicos de los péptidos portadores de epítope de la invención. Como el experto en la técnica apreciará, se pueden combinar los polipéptidos de VEGF-2 de la presente invención y los fragmentos de los mismos portadores de epítope antes descritos con partes del dominio constante de las inmunoglobulmas (IgG) , dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y presentan una vida media incrementada in #• '*.*i-'-.^v lÚAiMA?i A LJ ^^- ' -' 1-*-*^****--'**-"- *- - í A*4.^..,,*-..»=a*i^...,^ áá? i vivo. Esto se ha demostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 de humano y de diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de mamífero (EP 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1998)). De conformidad con la presente invención, también se describen variantes novedosas de VEGF-2. Estas se pueden producir mediante deleción o sustitución de uno o más aminoácidos de VEGF-2. Las mutaciones naturales son llamadas variaciones alélicas. Las variaciones alélicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden tener secuencia de aminoácido alterada. Con el fin de intentar mejorar o alterar las características de VEGF-2 original, se puede utilizar la manipulación genética de proteínas. Se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante conocida por los expertos en la técnica para crear polipéptidos novedosos. Las muteínas y las deleciones pueden presentar, por ejemplo, actividad mejorada o estabilidad incrementada. Además, estos se podrían purificar con rendimientos más elevados y mostrar una mejor solubilidad por lo menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento. Más adelante se indican íLA i?t*?*j»A*??-**¿¡Í* ~ * .«.M-?* A??üt. ,... t ejemplos de las mutaciones que se pueden construir.

Deleciones en los extremos amino terminal y carboxi terminal Además, parece ser que VEGF-2 se corta en forma proteolítica después de la expresión lo que da como resultado fragmentos de polipéptido de los siguientes tamaños cuando se corren en un gel de SDS-PAGE (los tamaños son aproximados) (Véase las figuras 6-8, por ejemplo) : 80, 59, 45, 43, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 31, 29, 21, y 15 kDa. Estos fragmentos de polipéptido son el resultado de corte proteolítico en ambas porciones N-terminal y C-terminal de la proteína. Estos fragmentos generados por corte proteolítico parecen tener actividad, en particular el fragmento de 21 kDa. Además, se puede utilizar la manipulación genética de proteínas para mejorar o alterar una o más características de VEGF-2 original. La deleción de los aminoácidos del extremo carboxi terminal puede mejorar la actividad de las proteínas. Un ejemplo es el interferón gamma que muestra una actividad hasta diez veces más elevada cuando se suprimen diez residuos de aminoácido del extremo carboxi terminal de la proteína (Dóbeli et al., J. of Biotechnology, 7:199-216 (1988)). Por lo tanto, un aspecto de la invención es proveer análogos de polipéptido de VEGF-2 y las secuencias de nucleótido que codifican para tales análogos que presenten estabilidad mejorada (por ejemplo, cuando se exponen a condiciones de pH y térmicas típicas o a otras condiciones de almacenamiento) con relación al polipéptido de VEGF-2 original. A continuación se muestran los polipéptidos de VEGF-2 particularmente preferidos (la numeración empieza con el primer aminoácido en la proteína (Met) (Figura 1 (SEQ ID NO: 18)): Ala (residuo 24) a Ser (residuo 419); Pro (25) a Ser (419) ; Ala (26) a Ser (419) ; Ala (27) a Ser (419) ; Ala (28) a Ser (419); Ala (29) a Ser (419); Ala (30) a Ser (419) ; Phe (31) a Ser (419) ; Glu (32) a Ser (419) ; Ser (33) a Ser (419); Gly (34) a Ser (419); Leu (35) a Ser (419); Asp (36) a Ser (419) , Leu (37) a (Ser (419) ; Ser (38) a Ser (419); Asp (39)a Ser (419); Ala (40) a Ser (419); Glu (41) a Ser (419); Pro (42) a Ser (419); Asp (43) a Ser (419); Ala (44) a Ser (419) ; Gly (45) a Ser (419) ; Glu (46) a Ser (419) ; Ala (47) a Ser (419) ; Thr (48) a Ser (419) ; Ala (49) a Ser (419); Tyr (50) a Ser (419); Ser (52) a Ser (419); Asp (54) a Ser (419); Val (62) a Ser (419); Val (65) a Ser (419); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Met (418); Met (1), Glu (23), o Ala (24) a Gln (417); Met (1), Glu (23), o Ala (24) a Pro (416); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Arg (415); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Gln (414); Met (1) , Glu (23), o Ala (24) a Trp (413); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Tyr 5 (412); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Ser (411); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Pro (410); Met (1), Glu (23), o Ala(24) a Val (409); Met (1), Glu (23), o Ala (24) a Cys (408); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Arg (407); Met (1) , Glu (23), o Ala (24) a Cys (406); Met (1), Glu (23), o Ala (24) a Val 10 (405); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Glu (404); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Glu (403); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Ser (402); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Gly (398); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Pro (397); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Lys (393); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Met (263); 15 Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Asp(311); Met(l), Glu (23), o Ala (24) a Pro (367); Met(l) a Ser (419); Met(l) a Ser (228); Glu(47) a Ser(419); Ala(lll) a Lys(214); Ala(112) a Lys(214); H?s(113) a Lys(214); Tyr(114) a Lys(214); Asn(115) a Lys(214); Thr(116) Lys(214); Thr(103) a Leu(215); 20 Glu(104) a Leu(215); Glu(105) a Leu(215); Thr(106) a Leu(215); Ile(107) a Leu(215); Lys(108) a Leu(215); Phe(109) a Leu(215); Ala(llO) a Leu(215); Ala(lll) a Leu(215); Ala(112) a Leu(215); His(113) a Leu(215); Tyr (114) a ?? "^mfi-^ : IA ?.&ÍÍL?..Á. k?ní. , me -. .. ...?.-..A.^t*.l^^^ .'.. ,^.--*AAJL.í'íí&?iÍ? Leu(215); Asn(115) a Leu(215); Thr(116) a Leu(215); Thr(103) a Ser(228); Glu(104) a Ser(228); Glu(105) a Ser(228); Thr(106) a Ser(228); Ile(107) a Ser(228); Lys(108) a Ser(228); Phe(109) a Ser(228); Ala(llO) a Ser(228); Ala(lll) a Ser(228); Ala(112) a Ser(228); His(113) a Ser(228); Tyr (114) a Ser(228); Asn(115) a Ser(228); Thr(116) a Ser(228); Thr(103) a Leu(229); Glu(104) a Leu(229); Thr(103) a Arg(227); Glu(104) a Arg(227); Glu(105) a Arg (227); Thr(106) a Arg (227); Ile(107) a Arg (227); Lys(108) a Arg (227); Phe(109) a Arg (227); Ala(llO) a Arg (227); Ala(lll) a Arg (227); Ala (112) a Arg (227); His (113) a Arg (227); Tyr (114) a Arg (227); Asn(115) a Arg (227); Thr(116) a Arg (227); Thr(103) a Ser(213); Glu(104) a Ser(213); Glu(105) a Ser(213); Thr(106) a Ser(213); Ile(107) a Ser(213); Lys(108) a Ser(213); Phe(109) a Ser(213); Ala(llO) a Ser(213); Ala(lll) a Ser(213); Ala(112) a Ser(213); His(113) a Ser(213); Tyr(114) a Ser(213); Asn(115) a Ser(213); Thr(116) a Ser(213); Thr(103) a Lys(214); Glu(104) a Lys(214); Glu(105) a Lys(214); Thr(106) a Lys(214); Ile(107) a Lys (214); Lys (108) a Lys (214); Phe (109) a Lys (214); Ala (110) a Lys(214); Glu(105) a Leu(229); Thr(106) a Leu(229); Ile(107) a Leu(229); Lys(108) a Leu(229); Phe(109) a Leu(229); Ala(llO) a Leu(229); Ala(lll) a Leu(229); Ala(112) Í.ja*.aAa¿&.b?iÉ a,4A¡¡fc a Leu(229); His(113) a Leu(229); Tyr(114) a Leu(229); Asn(115) a Leu(229); Thr(llß) a Leu(229). Las modalidades preferidas incluyen los siguientes mutantes por deleción: Thr(103) --Arg(227); Glu(104) Arg(227); Ala(112) -- Arg (227); Thr(103) -- Ser(213); Glu(104) -- Ser(213); Thr(103) -- Leu(215); Glu(47) --Ser (419); Met(l), Glu (23), o Ala (24) -- Met (263); Met(l), Glu (23), o Ala (24) -- Asp(311); Met(l), Glu (23), o Ala (24) -- Pro (367); Met(l) -- Ser (419); y Met(l) -- Ser (228) of (Figure 1 (SEQ ID NO: 18)). La presente invención también incluye los mutantes por deleción a los que se suprimen aminoácidos tanto del, extremo NB terminal como del extremo C-terminal. Tales mutantes incluyen todas las combinaciones de los mutantes por deleción del extremo N-terminal y de los mutantes por deleción del extremo C-terminal antes descritos. Se pueden hacer esas combinaciones utilizando técnicas recombinantes conocidas por el experto en la técnica. En particular, las deleciones en el extremo N-terminal del polipéptido de VEGF-2 se pueden describir mediante la fórmula general m-396, en la cual m es un número entero de -23 a 388, y en la cual m corresponde a la posición del residuo de aminoácido identificado en SEQ ID Í? jJtXiXí *A»-* 4,ijÁÉéJj.&*& l¡? L¿ NO: 2. De preferencia, las deleciones en el extremo N- terminal retienen el área conservada en recuadro de la figura 3 (PXCVXXXRCXGCCN) (SEQ ID NO: 8), e incluyen los polipéptidos que comprenden la secuencia de residuos de aminoácidos: las deleciones en el extremo N-terminal del polipéptido de la invención mostrado como SEQ ID NO: 1 incluyen polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácido de los residuos: : E-l a S-396; A-2 a S-396; P-3 a S-396; A-4 a S-396; A-5 a S-396; A-6 a S-396; A-7 a S-396; A-8 a S-396; F-9 a S-396; E-10 a S-396; S-ll a S-396; G-12 a S-396; L-13 a S-396; D-14 a S-396; L-15 a S-396; S-16 a S- 396; D-17 a S-396; A-18 a S-396; E-19 a S-396; P-20 a S-396; D-21 a S-396; A-22 a S-396; G-23 a S-396; E-24 a S-396; A-25 a S-396; T-26 a S-396; A-27 a S-396; Y-28 a S-396; A-29 a S- 396; S-30 a S-396; K-31 a S-396; D-32 a S-396; L-33 a S-396; E-34 a S-396; E-35 a S-396; Q-36 a S-396; L-37 a S-396; R-38 a S-396; S-39 a S-396; V-40 a S-396; S-41 a S-396; S-42 a S- 396; V-43 a S-396; D-44 a S-396; E-45 a S-396; L-46 a S-396; M-47 a S-396; T-48 a S-396; V-49 a S-396; L-50 a S-396; Y-51 a S-396; P-52 a S-396; ?-53 a S-396; Y-54 a S-396; W-55 a S- 396; K-56 a S-396; M-57 a S-396; Y-58 a S-396; K-59 a S-396; C-60 a S-396; Q-61 a S-396; L-62 a S-396; R-63 a S-396; K-64 a S-396; G-65 a S-396; G-66 a S-396; W-67 a S-396; Q-68 a S- 396; H-69 a S-396; N-70 a S-396; R-71 a S-396; E-72 a S-396; Q-73 a S-396; A-74 a S-396; N-75 a S-396; L-76 a S-396; N-77 a S-396; S-78 a S-396; R-79 a S-396; T-80 a S-396; E-81 a S- 396; E-82 a S-396; T-83 a S-396; 1-84 a S-396; K-85 a S-396; F-86 a S-396; A-87 a S-396; A-88 a S-396; A-89 a S-396; H-90 a S-396; Y-91 a S-396; N-92 a S-396; T-93 a S-396; E-94 a S- 396; 1-95 a S-396; L-96 a S-396; K-97 a S-396; S-98 a S-396 1-99 a S-396; D-100 a S-396; N-101 a S-396; E-102 a S-396 W-103 a S-396; R-104 a S-396; K-105 a S-396; T-106 a S-396 Q-107 a S-396; C-108 a S-396; M-109 a S-396; P-110 a S-396 R-lll a S-396; E-112 a S-396; V-113 a S-396; C-114 a S-396 1-115 a S-396; D-116 a S-396; V-117 a S-396; G-118 a S-396 K-119 a S-396; E-120 a S-396; F-121 a S-396; G-122 a S-396 V-123 a S-396; A-124 a S-396; T-125 a S-396; N-126 a S-396 T-127 a S-396; F-128 a S-396; F-129 a S-396; K-130 a S-396 P-131 a S-396; P-132 a S-396; C-133 a S-396; V-134 a S-396 S-135 a S-396; V-136 a S-396; Y-137 a S-396; R-138 a S-396 C-139 a S-396; G-140 a S-396; G-141 a S-396; C-142 a S-396 C-143 a S-396; N-144 a S-396; S-145 a S-396; E-146 a S-396 G-147 a S-396; L-148 a S-396; Q-149 a S-396; C-150 a S-396 M-151 a S-396; N-152 a S-396; T-153 a S-396; S-154 a S-396 T-155 a S-396; S-156 a S-396; Y-157 a S-396; L-158 a S-396 S-159 a S-396; K-160 a S-396; T-161 a S-396; L-162 a S-396 F-163 a S-396; E-164 a S-396; 1-165 a S-396; T-166 a S-396, V-167 a S-396; P-168 a S-396 L-169 a S-396; S-170 a S-396; Q-171 a S-396; G-172 a S-396 P-173 a S-396; K-174 a S-396; P-175 a S-396; V-176 a S-396 T-177 a S-396; 1-178 a S-396; S-179 a S-396; F-180 a S-396 A-181 a S-396; N-182 a S-396; H-183 a S-396; T-184 a S-396 S-185 a S-396; C-186 a S-396; R-187 a S-396; C-188 a S-396 M-189 a S-396; S-190 a S-396; K-191 a S-396; L-192 a S-396 D-193 a S-396; V-194 a S-396; Y-195 a S-396; R-196 a S-396 Q-197 a S-396; V-198 a S-396; H-199 a S-396; S-200 a S-396 1-201 a 5-396; 1-202 a S-396; R-203 a S-396; R-204 a S-396 S-205 a S-396; L-206 a S-396; P-207 a S-396; A-208 a S-396 T-209 a S-396; L-210 a S-396; P-211 a S-396; Q-212 a S-396 C-213 a S-396; Q-214 a S-396; A-215 a S-396; A-216 a S-396 N-217 a S-396; K-218 a S-396; T-219 a S-396; C-220 a S-396 P-221 a S-396; T-222 a S-396; N-223 a S-396; Y-224 a S-396 M-225 a S-396; W-226 a S-396; N-227 a S-396; N-228 a S-396 H-229 a S-396; 1-230 a S-396; C-231 a S-396; R-232 a S-396 C-233 a S-396; L-234 a S-396; A-235 a S-396; Q-236 a S-396 E-237 a S-396; D-238 a S-396; F-239 a S-396; M-240 a S-396 F-241 a S-396; S-242 a S-396; S-243 a S-396; D-244 a S-396 A-245 a S-396; G-246 a S-396; D-247 a S-396; D-248 a S-396 S-249 a S-396; T-250 a S-396; D-251 a S-396; G-252 a S-396 F-253 a S-396; H-254 a S-396; H^| j^^^^^^^g -" *- -^ — ~* -«*"«-»- -»"* iátHÉabiawiÉ^iHüiá^ D-255 a S-396; 1-256 a S-396; C-257 a S-396; G-258 a S-396; P-259 a S-396; N-260 a S-396; K-261 a S-396; E-262 a S-396; L-263 a S-396; D-264 a S-396; E-265 a S-396; E-266 a S-396; T-267 a S-396; C-268 a S-396; Q-269 a S-396; C-270 a S-396, V-271 a S-396; C-272 a S-396; R-273 a S-396; A-274 a S-396; G-275 a S-396; L-276 a S-396; R-277 a S-396; P-278 a S-396; A-279 a S-396; S-280 a S-396; C-281 a S-396; G-282 a S-396; P-283 a S-396; H-284 a S-396; K-285 a S-396; E-286 a S-396; L-287 a S-396; D-288 a S-396; R-289 a S-396; N-290 a S-396; S-291 a S-396; C-292 a S-396; Q-293 a S-396; C-294 a S-396; V-295 a S-396; C-296 a S-396; K-297 a S-396; N-298 a S-396; K-299 a S-396; L-300 a S-396; F-301 a S-396; P-302 a S-396; S-303 a S-396; Q-304 a S-396; C-305 a S-396; G-306 a S-396; A-307 a S-396; N-308 a S-396; R-309 a S-396; E-310 a S-396; F-311 a S-396; D-312 a S-396; E-313 a S-396; N-314 a S-396; T-315 a S-396; C-316 a S-396; Q-317 a S-396; C-318 a S-396; V-319 a S-396; C-320 a S-396; K-321 a S-396; R-322 a S-396; T-323 a S-396; C-324 a S-396; P-325 a S-396; R-326 a S-396; N-327 a S-396; Q-328 a S 396; P-329 a S-396; L-330 a S-396; N-331 a S-396; P-332 a S-396; G-333 a S-396; K-334 a S-396; C-335 a S-396; A-336 a S-396; C-337 a S-396; E-338 a S-396; C-339 a S-396; T-340 a S-396; E-341 a S-396; S-342 a S-396; P-343 a S-396; Q-344 a S-396; K-345 a S-396; C-346 a S-396; l»...l ..,. A.i..i„ *&»&-« <«***» L-347 a S-396; L-348 a S-396; K-349 a S-396; G-350 a S-396, K-351 a S-396; K-352 a S-396 F-353 a S-396; H-354 a S-396 H-355 a S-396; Q-356 a S-396 T-357 a S-396; C-358 a S-396, S-359 a S-396; C-360 a S-396 Y-361 a S-396; R-362 a S-396; R-363 a S-396; P-364 a S-396 C-365 a S-396; T-366 a S-396; N-367 a S-396; R-368 a S-396 Q-369 a S-396; K-370 a S-396 A-371 a S-396; C-372 a S-396 E-373 a S-396; P-374 a S-396; G-375 a S-396; F-376 a S-396 S-377 a S-396; Y-378 a S-396 S-379 a S-396; E-380 a S-396 E-381 a S-396; V-382 a S-396; C-383 a S-396; R-384 a S-396 C-385 a S-396; V-386 a S-396; P-387 a S-396; S-388 a S-396 Y-389 a S-396; W-390 a S-396; Q-391 a S-396 de SEQ ED NO : 2. Una modalidad preferida comprende los aminoácidos S-205 a S-396 de SEQ ID NO : 2. También se prefieren los polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos. Además, también se pueden describir las deleciones en el extremo C-terminal del polipéptido de VEGF-2 mediante la fórmula general -23 -n, en la cual n es un número entero de -15 a 395 y en la cual n corresponde a la posición del residuo de aminoácido identificado en SEQ ID NO : 2. De preferencia, las deleciones en el extremo C-terminal retienen el área conservada en recuadro de la figura 3 (PXCVXXXRCXGCCN) (SEQ ID NO: 8), e incluyen los polipéptidos I??JA*-*-fr-aifrf -r-que comprenden la secuencia de residuos de aminoácido: De igual manera, las deleciones en el extremo C-terminal del polipéptido de la invención mostrado como SEQ ID NO: 2 incluyen los polipéptidos que comprenden la secuencia de residuos de aminoácido: E-l a M-395; E-l a Q-394; E-l a P-393; E-l a R-392; E-l a Q-391; E-l a W-390; E-l a Y-389; E-l a S-388; E-l a P-387; E-l a V- 386; E-l a C-385; E-l a R-384; E-l a C-383; E-l a V-382; E-l a E-381; E-l a E-380; E-l a S-379; E-l a Y-378; E-l a S-377; E-l a F-376; E-l a G-375; E-l a P-374; E-l a E-373; E-l a C-372; E-l a A-371; E-l a K-370; E-l a Q-369; E-l a R-368; E-l a N-367; E-l a T-366; E-l a C-365; E-l a P-364; E-l a R-363; E-l a R-362; E-l a Y-361; E-l a C-360; E-l a S-359; E-l a C-358; E-l a T-357; E-l a Q-356; E-l a H-355; E-l a H-354; E-l a F-353; E-l a K-352; E-l a K-351; E-l a G-350; E-l a K-349; E-l a L-348; E-l a L-347; E-l a C-346; E-l a K-345; E-l a Q-344; E-l a P-343; E-l a S-342; E-l a E-341; E-l a T-340; E-l a C-339; E-l a E-338; E-l a C-337; E-l a A-336; E-l a C-335; E-l a K-334; E-l a G-333; E-l a P-332; E-l a N-331; E-l a L-330; E-l a P-329; E-l a Q-328; E-l a N-327; E-l a R-326; E-l a P-325; E-l a C-324; E-l a T-323; E-l a R-322; E-l a K-321; E-l a C-320; E-l a V-319; E-l a C-318; E-l a Q-317; E-l a C-316; E-l a T-315; E-l a N-314; E-l a E-313; E-l a D-312; E-l a F-311; E-l a E-310; E-l sM ^mámíiÉíáU?t? i ?i itt??u I lil ll llllíllÉ lllll I I lili -inHM ÉÉtiÉÜ a R-309; E-l a N-308; E-l a A-307; E-l a G-306; E-l a C-305; E-l a Q-304; E-l a S-303; E-l a P-302; E-l a F-301; E-l a L-300; E-l a K-299; E-l a N-298; E-l a K-297; E-l a C-296; E-l a V-295; E-l a C-294; E-l a Q-293; E-l a C-292; E-l a S-291; E-l a N-290; E-l a R-289; E-l a D-288; E-l a L-287; E-l a E-286; E-l a K-285; E-l a H-284; E-l a P-283; E-l a G-282; E-l a C-281; E-l a S-280; E-l a A-279; E-l a P-278; E-l a R-277; E-l a L-276; E-l a G-275; E-l a A-274; E-l a R-273; E-l a C-272; E-l a V-271; E-l a C-270; E-l a Q-269; E-l a C-268; E-l a T-267; E-l a E-266; E-l a E-265; E-l a D-264; E-l a L-263; E-l a E-262; E-l a K-261; E-l a N-260; E-l a P-259; E-l a G-258; E-l a C-257; E-l a 1-256; E-l a D-255; E-l a H-254; E-l a F-253; E-l a G-252; E-l a D-251; E-l a T-250; E-l a S-249; E-l a D-248; E-l a D-247; E-l a G-246; E-l a A-245; E-l a D-244; E-l a S-243; E-l a S-242; E-l a F-241; E-l a M-240; E-l a F-239; E-l a D-238; E-l a E-237; E-l a Q-236; E-l a A-235; E-l a L-234; E-l a C-233; E-l a R-232; E-l a C-231; E-l a I-230; E-l a H-229; E-l a N-228; E-l a N-227; E-l a W-226; E-l a M-225; E-l a Y-224; E-l a N-223; E-l a T-222; E-l a P-221; E-l a C-220; E-l a T-219; E-l a K-218; E-l a N-217; E-l a A-216; E-l a A-215; E-l a Q-214; E-l a C-213; E-l a Q-212; E-l a P-211; E-l a L-210; E-l a T-209; E-l a A-208; E-l a P-207; E-l a L-206; E-l a S-205; E-l a R-204; E-l a R-203; E-l a I- 'i.?.a. .^í*.-... í...„.,. ,^A -.+-*-.* .» ¡ ^^*A . *~ -. ??Í?*?t&.?A mA»i*J?. 202; E-l a 1-201; E-l a S-200; E-l a H-199; E-l a V-198; E-l a Q-197; E-l a R-196; E-l a Y-195; E-l a V-194; E-l a D-193; E-l a L-192; E-l a K-191; E-l a S-190; E-l a M-189; E-l a C- 188; E-l a R-187; E-l a C-186; E-l a S-185; E-l a T-184; E-l a H-183; E-l a N-182; E-l a A-181; E-l a F-180; E-l a S-179; E-l a 1-178; E-l a T-177; E-l a V-176; E-l a P-175; E-l a K- 174; E-l a P-173; E-l a G-172; E-l a Q-171; E-l a S-170; E-l a L-169; E-l a P-168; E-l a V-167; E-l a T-166; E-l a 1-165; E-l a E-164; E-l a F-163; E-l a L-162; E-l a T-161; E-l a IC160; E-l a S-159; E-l a L-158; E-l a Y-157; E-l a S-156; E-l a T-155; E-l a S-154; E-l a T-153; E-l a N-152; E-l a M-151; E-l a C-150; E-l a Q-149; E-l a L-148. E-l a G-147; E-l a E- 146; E-l a S-145; E-l a N-144; E-l a C-143; E-l a C-142, E-l a G-141; E-l a G-140; E-l a C-139; E-l a R-138; E-l a Y-137; E-l a V-136; E-l a S-135; E-l a V-134; E-l a C-133, E-l a P- 132; E-l a P-131; E-l a K-130; E-l a F-129; E-l a F-128; E-l a T-127; E-l a N-126; E-l a T-125, E-l a A-124; E-l a V-123; E-l a G-122; E-l a F-121; E-l a E-120; E-l a K-119; E-l a G- 118; E-l a V-117; E-l a D-116; E-l a 1-115; E-l a C-114; E-l a V-113; E-l a E-112; E-l a R-lll; E-l a P-110; E-l a M-109; E-l a C-108; E-l a Q-107; E-l a T-106; E-l a K-105; E-l a R- 104; E-l a W-103; E-l a E-102; E-l a N-101; E-l a D-100; E-l a 1-99; E-l a S-98; E-l a K-97; E-l a L-96; E-l a 1-95; E-l a E-94; E-l a T-93; E-l a N-92; E-l a Y-91; E-l a H-90; E-l a A-89; E-l a A-88; E-l a A-87; E-l a F-86; E-l a K-85 E-l a 1-84; E-l a T-83; E-l a E-82; E-l a E-81; E-l a T-80 E-l a R-79; E-l a S-78; E-l a N-77; E-l a L-76; E-l a N-75 E-l a A-74; E-l a Q-73; E-l a E-72; E-l a R-71; E-l a N-70 E-l a H-69; E-l a Q-68; E-l a W-67; E-l a G-66; E-l a G-65 E-l a K-64; E-l a R-63; E-l a L-62; E-l a Q-61; E-l a C-60 E-l a K-59; E-l a Y-58; E-l a M-57; E-l a K-56; E-l a W-55 E-l a Y-54; E-l a E-53; E-l a P-52; E-l a Y-51; E-l a L-50 E-l a V-49; E-l a T-48; E-l a M-47; E-l a L-46, E-l a E-45 E-l a D-44; E-l a V-43; E-l a S-42; E-l a S-41; E-l a V-40 E-l a S-39; E-l a R-38; E-l a L-37; E-l a Q-36, E-l a E-35 E-l a E-34; E-l a L-33; E-l a D-32; E-l a K-31; E-l a S-30 E-l a A-29; E-l a Y-28; E-l a A-27; E-l a T-26; E-l a A-25 E-l a E-24; E-l a G-23; E-l a A-22; E-l a D-21; E-l a P-20 E-l a E-19; E-l a A-18; E-l a D-17; E-l a S-16; E-l a L-15 E-l a D-14; E-l a L-13; E-l a G-12; E-l a S-ll; E-l a E-10; E-l a F-9; E-l a A-8; E-l a A-7 de SEQ ID NO: 2. También se prefieren los polmucleótidos que codifican para estos polipéptidos. Además, la invención también provee polipéptidos a los que se les ha quitado uno o más aminoácidos tanto del extremo amino terminal como del extremo carboxi terminal, de los cuales se puede describir en general que tienen residuos m-n de SEQ ID NO : 2 , en la cual n y m son números enteros como los descritos anteriormente. De igual manera, también se prefieren las deleciones en el extremo C-terminal del polipéptido de VEGF-2 de la invención mostrado como SEQ ID NO : 2 las cuales incluyen polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácido de los residuos: F-9 a M-395; F-9 a Q-394; F-9 a P-393; F-9 a R-392; F-9 a Q-391; F-9 a W-390; F-9 a Y-389; F-9 a S-388; F-9 a P-387; F-9 a V-386; F-9 a C-385; F-9 a R-384; F-9 a C-383; F-9 a V-382; F-9 a E-381; F-9 a E-380; F-9 a S-379; F-9 a Y-378; F-9 a S-377; F-9 a F-376; F-9 a G-375; F-9 a P-374; F-9 a E-373; F-9 a C-372; F-9 a A-371; F-9 a K-370; F-9 a Q-369; F-9 a R-368; F-9 a N-367; F-9 a T-366; F-9 a C-365; F-9 a P-364; F-9 a R-363; F-9 a R-362; F-9 a Y-361; F-9 a C-360; F-9 a S-359; F-9 a C-358; F-9 a T-357; F-9 a Q-356; F-9 a H-355; F-9 a H-354; F-9 a F-353; F-9 a K-352; F-9 a K-351 ; F-9 a G-350; F-9 a K-349; F-9 a L-348; F-9 a L-347; F-9 a C-346; F-9 a K-345; F-9 a Q-344; F-9 a P-343; F-9 a S-342; F-9 a E-341; F-9 a T-340; F-9 a C-339; F-9 a E-338; F-9 a C-337; F-9 a A-336; F-9 a C-335; F-9 a K-334; F-9 a G-333; F-9 a P-332; F-9 a N-331; F-9 a L-330; F-9 a P-329; F-9 a Q-328; F-9 a N-327; F-9 a R-326; F-9 a P-325; F-9 a C-324; t. A ?..a- .jt*-* i«Mi» ?lr,tJ*-->M ?±I? U F-9 a T-323; F-9 a R-322; F-9 a K-321; F-9 a C-320; F-9 a V-319; F-9 a C-318; F-9 a Q-317; F-9 a C-316; F-9 a T-315; F-9 a N-314. F-9 a E-313; F-9 a D-312; F-9 a F-311; F-9 a E-310; F-9 a R-309; F-9 a N-308; F-9 a A-307; F-9 a G-306; F-9 a C-305; F-9 a Q-304; F-9 a S-303; F-9 a P-302; F-9 a F-301; F-9 a L-300; F-9 a K-299; F-9 a N-298; F-9 a K-297; F-9 a C-296; F-9 a V-295; F-9 a C-294; F-9 a Q-293; F-9 a C-292; F-9 a S-291; F-9 a N-290; F-9 a R-289; F-9 a D-288; F-9 a L-287; F-9 a E-286; F-9 a K-285; F-9 a H-284; F-9 a P-283; F-9 a G-282; F-9 a C-281; F-9 a S-280; F-9 a A-279; F-9 a P-278; F-9 a R-277; F-9 a L-276; F-9 a G-275; F-9 a A-274; F-9 a R-273; F-9 a C-272; F-9 a V-271; F-9 a C-270; F-9 a Q-269; F-9 a C-268; F-9 a T-267; F-9 a E-266; F-9 a E-265; F-9 a D-264, F-9 a L-263; F-9 a E-262; F-9 a K-261; F-9 a N-260; F-9 a P-259; F-9 a G-258; F-9 a C-257; F-9 a 1-256; F-9 a D-255; F-9 a H-254; F-9 a F-253; F-9 a G-252; F-9 a D-251; F-9 a T-250; F-9 a S-249; F-9 a D-248; F-9 a D-247; F-9 a G-246; F-9 a A-245; F-9 a D-244; F-9 a S-243; F-9 a S-242; F-9 a F-241; F-9 a M-240; F-9 a F-239; F-9 a D-238; F-9 a E-237; F-9 a Q-236; F-9 a A-235; F-9 a L-234; F-9 a C-233; F-9 a R-232; F-9 a C-231; F-9 a 1-230; F-9 a H-229; F-9 a N-228; F-9 a N-227; F-9 a W-226; F-9 a M-225; F-9 a Y-224; F-9 a N-223; F-9 a T-222; F-9 a P-221; F-9 a C-220; F-9 a T-219; F-9 a K-218; F-9 a N-217; F-9 tá.**AA? *t*. 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Se prefiere en forma específica el fragmento de polipéptido que comprende los residuos de aminoácido F-9 a R-203 de SEQ ID NO : 2 , así como los polinucleótidos que codifican para este polipéptido. Este rtilfiliit-*'*^-8^-"^*^'^'-"^"' - - -"<""» *"f IIIII mi -¡inri lirtiir f íiß?ktir-'- •*-*• polipéptido de F-9 a R-203 de SEQ ID N0:2 de preferencia está asociado con un polipéptido de S-205 a S-396 de SEQ ID NO: 2. La asociación se puede efectuar a través de interacciones de puente de disulfuro, covalentes o no covalentes, mediante enlace con un enlazadores (por ejemplo, enlaces con serina, glicina, prolina) , o mediante un anticuerpo . Muchas de las secuencias de polinucleótido, tales como las secuencias EST, están públicamente disponibles y se puede tener acceso a ellas a través de las bases de datos de secuencia. Algunas de esta secuencias están relacionadas con SEQ ID NO:l y podrían haber estado disponibles al público antes de la concepción de esta invención. De preferencia, tales polinucleótidos relacionados se excluyen en forma específica del campo de la presente invención. Listar cada una de las secuencias relacionadas ocasionaría problemas. Por consiguiente, los polinucleótidos que se excluyen en forma preferente de la presente invención son uno o más polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos descrita por la fórmula general de a-b, en la cual a es cualquier número entero entre 1 a 1660 de SEQ ID NO : 1 , b es un número entero de 15 a 1674, en la cual tanto a como b corresponden a las posiciones de los residuos de nucleótido «a,. ,^ . t»...„^ ^.-. .^AM*áA.-.~lat>á¡* A~ mostrados en SEQ ID NO:l, y en la cual b es mayor que o igual a "a + 14" . Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención provee mutantes por deleción en el extremo N terminal. Tales mutantes incluyen aquellos que comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 18) excepto por una deleción de por lo menos los primeros 24 residuos de aminoácido del extremo N-terminal (es decir, una deleción de por lo menos Met(l) - Glu(24)) pero no más de los primeros 115 residuos de aminoácido del extremo N-terminal de la figura 1 (SEQ ID NO: 18). En forma alternativa, los primeros 24 residuos de aminoácido del extremo N-termínal (es decir, una deleción de por lo menos Met(l) - Glu(24)) pero no más de los primeros 103 residuos de aminoácido del extremo N- terminal de la figura 1 (SEQ ID NO:18), etc. En otro aspecto, la presente invención provee mutantes por deleción en el extremo C-terminal. Tales mutantes incluyen aquellos que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 18) excepto por una delecíón de por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal (Ser (419)) pero no más de los últimos 220 residuos de aminoácido del extremo C- terminal (es decir, una deleción de los residuos de aminoácido (Val (199) - Ser (419)) de la figura 1 (SEQ ID N0:18). En forma alternativa, la deleción incluirá por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal pero no más de los últimos 216 residuos de aminoácido del extremo C-terminal de la figura 1 (SEQ ID N0:18). En forma alternativa, la deleción incluirá por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal pero no más de los últimos 204 residuos de aminoácido del extremo C- terminal de la figura 1 (SEQ ID NO:18). En forma alternativa, la deleción incluirá por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal pero no más de los últimos 192 residuos de aminoácido del extremo C- terminal de la figura 1 (SEQ ID NO:18). En forma alternativa, la deleción incluirá por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal pero no más de los últimos 156 residuos de aminoácido del extremo C- terminal de la figura 1 (SEQ ID NO:18). En forma alternativa, la deleción incluirá por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal pero no más de los últimos 108 residuos de aminoácido del extremo C- terminal de la figura 1 (SEQ ID NO:18). En forma alternativa, la deleción incluirá por lo menos el último residuo de aminoácido del extremo C-terminal pero no más de los últimos 52 residuos de aminoácido del extremo C-terminal de la figura 1 (SEQ ID NO: 18) . Incluso en otro aspecto, la presente invención también incluye los mutantes por deleción a los que se han suprimido aminoácidos de los extremos tanto N-terminal como C-terminal. Tales mutantes incluyen todas las combinaciones de los mutantes por deleción en el extremo N-terminal y de los mutantes por deleción en el extremo C-terminal antes descritos . El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; éste incluye regiones anteriores y posteriores a la región de codificación (líder y de arrastre) así como secuencias intercaladas (intrones) entre los segmentos codificadores individuales (exones) . La presente invención también está dirigida a fragmentos de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente invención. Con la frase un fragmento de una molécula de ácido nucleico aislada que tenga la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: l o en SEQ ID NO: 3 se quiere decir fragmentos de por lo menos aproximadamente 15 nt , y más preferido por lo menos 20 nt aproximadamente, incluso más preferido por lo menos 30 nt aproximadamente y todavía más preferido por lo menos 40 nt aproximadamente de longitud que son útiles como sondas de diagnóstico e iniciadores como los discutidos en la presente invención. Desde luego, los fragmentos más largos de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650 ó 1654 nt de longitud también son útiles de conformidad con la presente invención, al igual que lo son los fragmentos correspondientes a la mayoría, sino a todas, las secuencias de nucleótido de la molécula o moléculas de .ADNc depositada (s) o como las que se muestran en SEQ ID NO: l o en SEQ ID NO: 3. Con la frase un fragmento de por lo menos 20 nt de longitud, por ejemplo, se quiere decir fragmentos que incluyan 20 o más bases contiguas provenientes de la secuencia de nucleótidos de , la molécula o moléculas de ADNc depositada (s) o como las que se muestran en SEQ ID NO: 1 o en SEQ ID NO : 3. Además, los ejemplos representativos de fragmentos de polinucleótido de VEGF-2 incluyen, por ejemplo, los fragmentos que tienen una secuencia aproximadamente desde s,.«¿. *a"""l?ftTf"' ' •*A-""S'-;J *«<~3''* >.< los nucleótidos 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 651-700, 701-750, 751-800, 800-850, 851-900, 901-950 ó 951 hasta el final de SEQ ID NO : 1 o del ADNc contenido en el clon depositado. En este contexto "aproximadamente" incluye los intervalos indicados en forma particular, más grandes o más pequeños por varios (5, 4, 3, 2 ó 1) nucleótidos, en cualquiera de los extremos o en ambos extremos terminales. De preferencia, estos fragmentos codifican para un polipéptido que tiene actividad biológica. Se podrían utilizar los fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención como una sonda de hibridación para una genoteca de ADNc para aislar el ADNc de longitud completa y para aislar otras moléculas de ADNc que tengan una similitud de secuencia elevada con el gen o una actividad biológica similar. De preferencia, las sondas de este tipo tienen por lo menos 30 bases y podrían contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda también se podría utilizar para identificar un clon de ADNc correspondiente a un transcrito de longitud completa y a un clon o clones genómicos que contengan el gen completo incluyendo las regiones reguladoras y de promotor, exones e intrones. Un ejemplo de una selección comprende aislar la región codificadora del gen utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tengan una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se utilizan para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN genómico o ARNm de humano para determinar a cuales de los elementos de la genoteca se hibrida la sonda. Un "polinucleótido" de VEGF-2 también incluye aquellos polinucleótidos que se puedan hibridar, bajo condiciones de hibridación astringentes, a las secuencias contenidas en SEQ ID NO: 1, o por ejemplo, el clon o clones de ADNc contenidos en los Depósitos ATCC números 97149 ó 75698, o los complementos del mismo. "Condiciones de hibridación astringentes" se refiere a una incubación durante toda la noche a 42 °C en una solución que comprende formamida al 50%, 5x SSC (750 mM de NaCl , 75 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (7.6), 5x de solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a corte tangencial, seguido por el lavado de los filtros en 0.1 x SSC a 65 °C aproximadamente. También se contemplan las moléculas de ácido nucleico que se hibridan a los polinucleótidos de VEGF-2 en Ítji &.? Ljk íárt-*.???* J ^..*..~*Aimé..*A. condiciones de hibridación con astringencia menor. Los cambios en la astringencia de hibridación y de detección de señal se logran principalmente mediante la manipulación de la concentración de formamida (porcentajes menores de formamida dan como resultado una astringencia reducida) ; condiciones salinas o temperatura. Por ejemplo, las condiciones de astringencia menores incluyen una incubación durante toda la noche a 37°C en una solución que comprende 6X SSPE (20X SSPE = 3M de NaCl ; 0.2 M de NaH2P04; 0.02M de EDTA, pH 7.4), 0.5% de SDS, 30% de formamida, 100 µg/ml de ADN para bloqueo de esperma de salmón; seguido por lavados a 50 °C con 1XSSPE, 0.1% de SDS. Además, para lograr una astringencia incluso menor, los lavados realizados después de la hibridación astringente se pueden efectuar a concentraciones más altas de sal (por ejemplo 5X SSC) . Advierta que las variaciones en las condiciones anteriores se pueden lograr mediante la inclusión y/o sustitución de reactivos bloqueadores alternos utilizados para suprimir el fondo en los experimentos de hibridación. Los reactivos para bloqueo típicos incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y formulaciones registradas disponibles comercialmente. La inclusión de reactivos específicos para bloqueo podría requerir la modificación de las condiciones de hibridación antes descritas, debido a problemas con la compatibilidad. Desde luego, un polinucleótido que se hibride únicamente a las secuencias poliA + (tales como cualquier región poliA+ del extremo 3' terminal de un ADNc mostrado en el listado de secuencias) , o a un tramo complementario de residuos T (o U) , podría no quedar incluido en la definición de "polinucleótido" , debido a que tal polinucleótido se hibridará a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc de cadena doble) . Con la frase un polinucleótido que se híbrida a una "porción" de un polinucleótido se quiere decir un polinucleótido (ya sea ADN o ARN) que se hibride a por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt) y de manera más preferida por lo menos aproximadamente 20 nt , incluso más preferido por lo menos aproximadamente 30 nt, y todavía más preferido aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia. Estos son útiles como sondas de diagnóstico e iniciadores como los discutidos anteriormente y en mayor detalle posteriormente.

Con la frase una porción de un polinucleótido de "por lo menos 20 nt de longitud" por ejemplo, se quiere decir 20 o más nucleótidos contiguos provenientes de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el ADNc depositado o la secuencia de nucleótidos como la que se muestra en SEQ ID NO:l) . Desde luego, un polinucleótido que se hibride únicamente a una secuencia poliA (tal como el tramo poli (A) del extremo 3N terminal del ADNc de VEGF-2 mostrado en las SEQ ID NO : 1 ó 3) , o un tramo complementario de residuos de T (o U) no quedará incluido en un polinucleótido de la invención utilizado para que se hibride a una porción de un ácido nucleico de la invención, debido a que tal polinucleótido se hibridará a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo poli (A) o al complemento del mismo (por ejemplo prácticamente cualquier clon de ADNc de cadena doble) . La presente solicitud se dirige a moléculas de por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEQ ID NOS: 1 o 3 o la secuencia de ácido nucleico de las moléculas de ADNc depositadas, sin tomar en cuenta si estas codifican o no para un polipéptido que tenga actividad de proteína de VEGF- 2. Esto se debe a que incluso en caso que una molécula de ácido nucleico particular no codifique para un. un polipéptido que tiene actividad de VEGF-2, un experto en la técnica sabrá cómo utilizar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como una sonda de hibridación o como un iniciador para la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que no codifican para un polipéptido que tenga actividad de VEGF-2 incluyen, entre otros, (1) aislar el gen de VEGF-2 o las variantes alélicas del mismo en una genoteca de ADNc; (2) hibridación in situ (por ejemplo "FISH") a frotis cromosómicos en metafase para proveer la ubicación cromosómica precisa del gen de VEGF-2, tal como se describe en Verma et al . , Human Chro osomes : a Manual of Basi c Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); y análisis Northern Blot para detectar la expresión de ARNm de VEGF-2 en tejidos específicos. Sin embargo, se prefieren las moléculas de ácidos nucleicos que tienen secuencias con por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia de ácido nucleico mostrado en SEQ ID NOS: 1 ó 3 o con una secuencia de ácido nucleico de las moléculas de ADNc depositadas, las cuales de hecho, codifican para un polipéptido que tenga actividad de proteína de VEGF-2. Con la frase "un polipéptido que tenga actividad de VEGF-2" se quiere decir polipéptidos que presentan actividad de VEGF-2 en una prueba biológica particular. Por ejemplo, se puede medir la actividad de proteína de VEGF-2 utilizando, por ejemplo pruebas mitogénicas y pruebas de migración de células del endotelio. Véase, por ejemplo, Olofsson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:2576-2581 (1996) y Joukov et al., EMBO J. 5:290-298 (1996) . Desde luego, debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que un número grande de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico de las moléculas de ADNc depositadas o de las secuencias de ácido nucleico mostradas en SEQ ID NO: l o SEQ ID NO : 3 codificarán para un polipéptido "que tenga actividad de proteína de VEGF-2 " . De hecho, debido a las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótido, todas codifican para el mismo polipéptido, esto se hace claro al experto en la técnica incluso sin realizar la prueba de comparación antes descrita. Se reconocerá también en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no sean variantes degeneradas, un número razonable de estas también codificarán para un polipéptido que tenga actividad de proteína de VEGF-2. Esto es debido a que el experto en la técnica está completamente consciente de las sustituciones de aminoácido que en forma menos probable o que probablemente no afectan en forma significativa la función de la proteína (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) . Por ejemplo, los lineamientos concernientes a cómo hacer sustituciones de aminoácido fenotípicamente silenciosas se provee en Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions" Science 247:1306-1310 (1990), en la cual los autores indican que las proteínas son sorpresivamente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tengan por lo menos un 70% de identidad, de preferencia por lo menos 90% y más preferido por lo menos un 95%, 96%, 97% o 98% de identidad con un polmucleótido que codifique para los polipéptidos de SEQ ID NOS: 2 ó 4, así como a fragmentos de las mismas, cuyos fragmentos tienen por lo menos 30 bases y de preferencia por lo menos 50 bases y a los polipéptidos codificados por tales i?Í?iíí<ri?iHfaiAii,"a"ft,aa*>Mlt*feJ --*-»*-'"->~- »~- - - •*"* - < «*»*** polinucleótidos . "Identidad" por sí misma tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando técnicas publicadas. (Véase, por ejemplo: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, (1988) ; BIOCOMPUTING: INFORMATICS Y GENOME PROJECTS, Smith, D. W. ed. , Academic Press, New York, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G. eds., Humana Press, New Jersey, (1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, (1987) ; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. y Devereux, J. , eds., M. Stockton Press, New York, (1991) . Aunque existe un número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótido o de polipéptido, el término "identidad" es bien conocido por los expertos en la técnica. (Carrillo, H., y Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988)). Los métodos comúnmente utilizados para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en "Guide to Huge Computers," Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, (1994), y Carrillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988). Los métodos para alinear polinucleótidos o polipéptidos están Iánliiiil gt|Hf>" -,-J"*'-«""" "-**-*»------ --- - ~*^—* — codificados en programas de computadora, incluyendo el paquete de programas GCG (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12(1) :387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990), el programa Bestfit (paquete de análisis de secuencia Wisconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711 (utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Appli ed Ma thematics 2 : 482-489 (1981)). Con la frase un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos con por lo menos, por ejemplo, 95% "de identidad" con una secuencia de nucleótido de referencia de la presente invención, se quiere decir que la secuencia de nucleótido del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótido podría incluir hasta 5 mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótido de referencia que codifica para el polipéptido de VEGF-2. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótido por lo menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótido de referencia, se podrían suprimir o sustituir hasta un 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia con otro ' nucleótido, o se podría insertar en la secuencia de SEJE í ll' it-..-l-81-t-?-iMM?-fa?^^t.^iirt^^t...a ,¿«aiAi>, ..Ai f**.»*..* referencia un número de nucleótidos de hasta un 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia. La secuencia por analizar podría ser una secuencia entera de la secuencia SEQ ID NO: 1, el ORF (marco de lectura abierta) , o cualquier fragmento especificado como se describe en la presente invención. Como algo práctico, se puede determinar si una molécula de ácido nucleico o polipéptido particular es o no idéntica en por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a una secuencia de nucleótidos de la presente invención, en forma convencional utilizando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor comparación global entre una secuencia por analizar (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de referencia, también conocido como alineamiento de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). En una alineación de secuencias las secuencias por analizar y de referencia son ambas secuencias de ADN. Se puede comparar una secuencia de ARN convirtiendo los U en T (uracilos en tiouracilos) . El resultado de dicha alineación de secuencia global está en por ciento de identidad. Los parámetros preferidos utilizado en la alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el por ciento de identidad son: Matriz=unitaria, k-tuplo=4, castigo por no apareamiento=l , castigo por unión=30, longitud de grupo de aleatorización=0 , puntuación por corte=l, castigo por espacio=5, castigo por tamaño de espacio=0.05 , tamaño de ventana=500 o la longitud de secuencia de nucleótidos de referencia, lo que sea más corto. Si la secuencia de referencia es más corta que la secuencia por analizar debido a las deleciones 5' o 3' y no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en consideración los truncamientos en los extremos 3' y 5' de la secuencia de referencia cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para las secuencias de referencia truncadas en los extremos 5' o 3', con relación a la secuencia por analizar, el por ciento de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia por analizar que están en los extremos 5' y 3' de la secuencia de referencia. El que un nucleótido esté o no apareado/alineado se determina con los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje se resta después del por ciento de identidad, calculado mediante el programa de FASTDB anterior, utilizando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de por ciento de identidad final. Esta puntuación corregida es la que se utiliza para los propósitos de la presente invención. Únicamente se calculan las bases fuera de las bases del extremo 5' y 3' de la secuencia de referencia, tal como se muestra por la alineación FASTDB, las cuales no están apareadas/alineadas con la secuencia por analizar, con el propósito de ajustar en forma manual la puntuación de por ciento de identidad. Por ejemplo, una secuencia de referencia de 90 bases se alinea con una secuencia por analizar de 100 bases para determinar el por ciento de identidad. Las deleciones se presentan en el extremo 5' de la secuencia de referencia y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5' . Las 10 bases no apareadas representan el 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no apareadas/número total de bases en la secuencia por analizar) de modo que se sustrae o se resta el 10% de la puntuación de por ciento de identidad calculada por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes se aparean perfectamente, el por ciento de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia de referencia de 90 bases con una secuencia por analizar de 100 bases. En esta ocasión las deleciones son deleciones internas de modo tal que no hay bases en los extremos 5' o 3' de la secuencia de referencia que no estén apareadas/alineadas con la secuencia por analizar. En este caso el por ciento de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, únicamente se corrigen manualmente las bases en los extremos 5' y 3' de la secuencia de referencia que no están apareadas/alineadas con la secuencia por analizar. No se hacen otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención. Con la frase un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos por analizar de la presente invención, se quiere decir que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia es idéntica a la secuencia por analizar excepto que la secuencia de polipéptidos de referencia podría incluir hasta 5 alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos por analizar. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos por analizar, se podrían insertar, suprimir (deleciones internas) , o sustituir hasta un 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se podrían presentar en las posiciones amino o carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, esparcidas ya sea en forma individual entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como algo práctico, se puede determinar si un polipéptido particular es o no por lo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, las secuencias de aminoácido mostradas en el cuadro 1 o a la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADN depositado, en forma convencional utilizando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor comparación global entre una secuencia por analizar (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de referencia, también conocido como alineamiento de secuencia global, se puede determinar utilizando el programa de computadora FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencias las secuencias por analizar y de referencia son ambas secuencias de nucleótido o ambas son secuencias de aminoácido. El resultado de dicha alineación de secuencia global está en por ciento de identidad. Los parámetros preferidos utilizados en la alineación de aminoácidos por FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuplo=2, castigo por no apareamiento=l , castigo por unión=20, longitud de grupo de aleatorízación=0, puntuación por corte=l, tamaño de ventana=longitud de secuencia, castigo por espacio=5, castigo por tamaño de espacio=0.05 , tamaño de ventana=500 o la longitud de secuencia de aminoácidos de referencia, lo que sea más corto. Si la secuencia de referencia es más corta que la secuencia por analizar debido a las deleciones en los extremos N- o C- terminales , no debido a deleciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no toma en consideración los truncamientos en los extremos N- o C-terminales de la secuencia de referencia cuando calcula el porcentaje de identidad global. Para las secuencias de referencia truncadas en los extremos N- y C-terminales , con relación a la secuencia por analizar, el por ciento de identidad se corrige calculando en número de residuos de la secuencia por analizar que están en los extremos N- y C-terminales de la .Ada secuencia de referencia, los cuales no están apareados/alineados, con un residuo de referencia correspondiente, como un por ciento de las bases totales de la secuencia por analizar. El que un residuo esté o no apareado/alineado se determina con los resultados de la alineación de secuencia FASTDB. Este porcentaje se resta después del por ciento de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior, utilizando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de por ciento de identidad final. Esta puntuación de por ciento de identidad final es la que se utiliza para los propósitos de la presente invención. Únicamente los residuos de los extremos N- y C-terminales de la secuencia de referencia, los cuales no están apareados/alineados con la secuencia por analizar, se consideran con el propósito de ajustar en forma manual la puntuación de por ciento de identidad. Es decir, únicamente las posiciones de los residuos por analizar fuera de los residuos de los extremos N- y C- terminales más lejanos de la secuencia de referencia. Por ejemplo, una secuencia de referencia de 90 residuos de aminoácido se alinea con una secuencia por analizar de 100 residuos para determinar el por ciento de identidad. Las deleciones se presentan en el extremo N- MJjL'1 'ÍÍÍItífl-tÍíltlÍÍ f^-^^- ^- -'"^^.-- -.^ . -.. -4-.-^-.. ?*~* ¿^ **?¡?¡>*«i terminal de la secuencia de referencia y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de los primeros 10 residuos en el extremo N- terminal. Los 10 residuos no apareados representan el 10% de la secuencia (número de residuos en los extremos N- y C- terminales no apareados/número total de residuos en la secuencia por analizar) de modo que se resta el 10% a la puntuación de por ciento de identidad calculada por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes se aparearan perfectamente, el por ciento de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia de referencia de 90 residuos con una secuencia por analizar de 100 residuos. En esta ocasión las deleciones son delciones internas de modo tal que no hay residuos en los extremos N- y C- terminales de la secuencia de referencia que no estén apareados/alineados con la secuencia por analizar. En este caso el por ciento de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. De nuevo, únicamente las posiciones de los residuos fuera de los extremos N- o C- terminales de la secuencia de referencia, según se muestra en la alineación FASTDB, que no están apareados/alineados con la secuencia por analizar se corrigen manualmente. No se hacen otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención.

Polipéptidos de VEGF-2 La presente invención también se refiere a polipéptidos que tienen las secuencias deducidas de aminoácidos de las figuras 1 ó 2, o que tienen las secuencia de aminoácidos codificadas por las moléculas de ADNc depositadas, así como fragmentos, análogos, y derivados de tales polipéptidos. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de las figuras 1 ó 2 o aquellas codificadas por la molécula de ADNc depositada, significan un polipéptido que retiene el motivo conservado de las proteínas de VEGF-2 como se muestra en la figura 3 y esencialmente la misma función o actividad biológica. En la presente invención un "fragmento de polipéptidos" se refiere a una secuencia de aminoácidos corta contenida en SEQ ID NO: 2 o codificado por el ADNc contenido en el clon depositado. Los fragmentos de proteína pueden ser "independientes", o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual el fragmento forma una parte o región, más preferido como una región continua individual. Los ejemplos representativos de los fragmentos de polipéptido de la invención, incluyen por ejemplo, fragmentos desde aproximadamente el aminoácido No. 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 102-120, 121-140, 141-160, 161-180, 181-200, 201-220, 221-240, 241-260, 261-280 ó 281 hasta el final de la región codificadora. Además, los fragmentos de polipéptido pueden ser de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 aminoácidos aproximadamente de longitud. En este contexto "aproximadamente" incluye los intervalos indicados en forma particular, más grandes o más pequeños por varios aminoácidos (5, 4, 3, 2 ó 1) , en cualquier extremo o en ambos extremos. Los fragmentos de polipéptido preferidos incluyen la proteína de VEGF-2 secretada así como la forma madura. Los fragmentos de polipéptido más preferidos incluyen la proteína de VEGF-2 secretada o la forma madura que tenga una serie continua de residuos suprimidos del extremo amino-o carboxi terminal, o de ambos. Por ejemplo se puede suprimir cualquier número de aminoácidos en un intervalo de 1-60 del extremo amino terminal de cualquiera del polipéptido de VEGF-2 secretado o de la forma madura. Del mismo modo, se puede suprimir cualquier número de aminoácidos, en un intervalo de 1-30 del extremo carboxi terminal de la proteína de VEGF-2 secretada o de la forma t.?.j¿?natf&A.- ?. madura. Además se prefiere cualquiera de las combinaciones de las supresiones anteriores en los extremos amino- y carboxi terminal. De igual manera, también se prefieren los fragmentos de polinucleótido que codifiquen para estos fragmentos de polipéptido de VEGF-2. También se prefiere el polipéptido de VEGF-2 y los fragmentos de polinucleótido caracterizados por dominios estructurales o funcionales, tales como los fragmentos que comprenden las regiones de la hélice alfa y las que forman la hélice alfa, las regiones que forman la hoja beta y la región de la hoja beta, las regiones de vuelta y las regiones que forman las vueltas, la región de la espiral y la región que forma la espiral, las regiones hidrofílicas, las regiones hidrofóbicas, las regiones anfipátícas alfa, las regiones anfipáticas beta, regiones flexibles, las regiones formadoras de superficie, la región de unión a substrato y las regiones de índice antigénico elevado. Los fragmentos de polipéptido de la SEQ ID NO: 2 que caen dentro de los dominios conservados quedan contemplados en forma específica por la presente invención. (Véase la figura 2) . Además, también se contemplan los fragmentos de polinucleótido que codifican para estos dominios. Otros fragmentos preferidos son los fragmentos de proteína de VEGF-2 biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son aquellos que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido de VEGF-2 descrito. La actividad biológica de los fragmentos podría incluir una actividad mejorada deseada o una actividad indeseable reducida. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos, de preferencia polipéptidos recombínantes . Se reconocerá en la técnica que se pueden variar algunas secuencias de aminoácido del polipéptido de VEGF-2 sin afectar en forma significativa la estructura o función de la proteína. Si tales diferencias en la secuencia se contemplan, se debe recordar que habrá áreas críticas en la proteína que determinen la actividad. Por lo tanto, la invención incluye también variaciones del polipéptido de VEGF-2 que muestren una actividad de polipéptido de VEGF-2 sustancial o que incluyan regiones de la proteína de VEGF-2 tales como las porciones de proteína discutidas posteriormente. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y substituciones de tipo. Como se indicó anteriormente, Se pueden encontrar los lineamientos referentes a cuales de los cambios de aminoácido tienen la probabilidad de ser fenotípicamente silenciosos en Bowie, J.U. et al . , "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990). Por lo tanto, los fragmentos, derivados o análogos de los polipéptidos de las figuras 1 o 2, o que son codificados por las moléculas de ADNc depositadas podrían ser: (I) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácido estén sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (de preferencia un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido podría ser codificado o no por el código genético; o (ii) uno en el cual uno de los residuos de aminoácido incluya un grupo sustituyente; o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro esté fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto que incremente el tiempo de vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) ; o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales estén fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se utilice para purificar al polipéptido maduro o una secuencia de proproteína; o (v) uno que comprenda pocos residuos de aminoácido mostrado en SEQ ID NOS: 2 ó 4, y que retenga el motivo conservado y siga reteniendo las características de actividad de la familia de polipéptidos de VEGF. Se considera que tales fragmentos, derivados, y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Son de interés particular las sustituciones de aminoácidos con carga con otro aminoácido cargado y con aminoácidos con carga neutra o negativa. Estos últimos dan como resultado proteínas que tienen carga positiva reducida para mejorar las características de la proteína de VEGF-2. Es bastante deseable evitar la agregación. La agregación de proteínas no sólo da como resultado la pérdida de actividad sino que también puede ocasionar problemas cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, debido a que estas pueden ocasionar una respuesta inmune (Pinckard et al . , Clin . Exp . Immunol . 2:331-340 (1967); Robbinson et al . , Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al . , Cri t . Rev. Therapeu tic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)). El reemplazo de aminoácidos también puede cambiar la selectividad de unión a los receptores de la superficie de la célula. Ostade et al . , Na ture 361:266-268 (1993) describen ciertas mutaciones que dan como resultado la unión iJliíl lililí ÉÉltli I i ' i i ....... .^ ~~iA-~. £,-¿.»?A selectiva de TNF-alfa a solamente uno de los dos tipos conocidos de receptores de TNF. Por lo tanto, la proteína de VEGF-2 de la presente invención podría incluir una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido provenientes ya sea de mutaciones naturales o provocadas por el hombre. Como se indicó, los cambios de preferencia son de una naturaleza menor, tal como las substituciones conservadoras de aminoácido que no afectan en forma significativa la configuración o actividad de la proteína (véase cuadro 1) .

CUADRO 1 Sustituciones de aminoácido conservadoras ^^¿¿i^t^+^íiimfWiwiÉto Pequeño Alanina Serina Treonina Metionina Gl icina Desde luego, el número de sustituciones de aminoácido que un experto en la técnica podría hacer depende de muchos factores, incluyendo los antes descritos. En términos generales, el número de sustituciones para cualquier polipéptido de VEGF-2 determinado no será mayor de 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 ó 3. Los aminoácidos en la proteína de VEGF-2 de la presente invención que son esenciales para su funcionamiento se pueden identificar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesís dirigida a sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este último procedimiento introduce mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se evalúan después respecto a la actividad biológica, tal como actividad de unión a receptor o actividad proliferativa in vi tro . También se pueden determinar los sitios que son críticos para la unión ligando-receptor mediante análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética .^^^¡¡ ¿^^¿ "—-"-*"-"'•*- M ¡Í!& A!£ .*J*¿At k?? nuclear o marcado de fotoafinidad (Smith et al . , J. Mol . Biol . 224:899-904 (1992) y de Vos et al . , Science 255:306- 312 (1992) ) . Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención de preferencia se proveen en forma aislada, y también se prefiere que estén purificados hasta homogeneidad . El término "aislado" significa que el material se retira de su entorno original (del entorno natural si es que se presenta en la naturaleza) . Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presenta en forma natural y que está presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de alguna parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tal polinucleótido podría ser parte de un vector y/o tal polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición y estar no obstante aislado en el sentido que tal vector o composición no es parte de su ambiente natural. En las modalidades específicas, los polinucleótido de la invención tienen una longitud menor de 300 kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb o 7.5 kb. En una modalidad adicional, los polinucleótidos de la invención comprenden por lo menos 15 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora de una proteína de VEGF-2 descrita, pero no comprenden todo o una porción de cualquier intrón de la proteína de VEGF-2. En otra modalidad, la secuencia codificadora para una proteína de VEGF-2 que comprende ácido nucleico no contiene secuencias codificadoras de un gen de flanqueo genómico (es decir, 5' o 3' hacia el gen de la proteína de VEGF-2 en el genoma) . Los polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos de SEQ ID NOS: 2 y 4 (en particular el polipéptido maduro) , así como los polipéptidos que tengan por lo menos 70% de similitud (de preferencia por lo menos 70% de identidad) con los polipéptidos de SEQ ID NOS: 2 y 4 y más preferido por lo menos 90% de similitud (más preferido por lo menos 95% de identidad) con los polipéptidos de SEQ ID NOS: 2 y 4, e incluso más preferido a por lo menos 95% de similitud (incluso más preferido por lo menos 90% de identidad con los polipéptidos de SEQ ID NOS: 2 y 4 y también incluye porciones de tales polipéptidos, comprendiendo tales porciones del polipéptido por lo general, por lo menos 30 aminoácidos y más preferido por lo menos 50 aminoácidos. Como ya se sabe en la técnica "la similitud" entre gJUjte í^^4gk±^^ | dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos conservados sustitutos de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención se podrían utilizar para producir al polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos se podrían utilizar como intermediarios para producir polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención se podrían utilizar para sintetizar los polínucleótídos de longitud completa de la presente invención. Los polipéptidos de la presente invención incluyen al polipéptido codificado por el ADNc depositado incluyendo la secuencia líder; al polipéptido maduro codificado por el ADNc menos la secuencia líder (es decir, la proteína madura) ; un polipéptido que comprende los aminoácidos desde -23 aproximadamente hasta 396 aproximadamente en SEQ ID NO:2; un polipéptido que comprende los aminoácidos desde -22 aproximadamente hasta 396 aproximadamente en SEQ ID NO : 2 ; un polipéptido que comprende los aminoácidos desde 1 aproximadamente hasta 396 aproximadamente en SEQ ID NO: 2; así como los polipéptidos que son por lo menos 95% idénticos, y más preferido por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a los polipéptidos antes descritos y que además incluyen porciones de tales polipéptidos por lo menos con 30 aminoácidos y más preferido por los menos 50 aminoácidos.

Proteínas de fusión Se puede utilizar cualquier polipéptido de VEGF-2 para generar proteínas de fusión. Por ejemplo, se puede utilizar el polipéptido de VEGF-2, cuando está fusionado a una segunda proteína como una marca antigénica. Los anticuerpos creados contra el polipéptido de VEGF-2 se pueden utilizar para detectar en forma indirecta la segunda proteína mediante unión al polipéptido de VEGF-2. Además, debido a que las proteínas secretadas eligen como blanco sitios celulares basándose en las señales de tráfico, se podrían utilizar los polipéptidos de VEGF-2 como una molécula para seleccionar blancos una vez que se fusionan a otras proteínas. Los ejemplos de dominios que se pueden fusionar a los polipéptidos de VEGF-2 incluyen no sólo secuencias de señal heterólogas, sino también otras regiones funcionales heterólogas. La fusión no necesariamente debe ser directa, sino que se puede presentar a través de secuencias i?¿?i??ipÉfteH)f- 1"***-*'-' -<*"-""- -f- .--»—-..^ .A~**.a*A* >*** enlazadoras . Además, también se podrían manipular genéticamente las proteínas de fusión para mejorar las características del polipéptido de VEGF-2. Por ejemplo, se puede agregar una región de aminoácidos adicionales, en particular aminoácidos cargados, al extremo N-terminal del polipéptido de VEGF-2 para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación a partir de la célula hospedera o el manejo y almacenamiento subsiguiente. Además se pueden agregar porciones peptídicas al polipéptido de VEGF-2 para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden eliminar antes de la preparación final del polipéptido de VEGF-2. La adición de porciones peptídicas para facilitar el manejo de los polipéptidos son técnicas familiares y rutinarias en el campo. Además, se pueden combinar polipéptidos de VEGF-2, incluyendo fragmentos, y de manera específica epítopes con partes del dominio constante de las inmunoglobulinas (IgG), lo que da como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y presentan un tiempo de vida media incrementada in vivo . Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 - de humano y Él11ftf-**-**•*-—-——-Éff- *- —**'""*•"-««-'-•*»<*— **********# diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero (EP A 394,827; Traunecker et al . , Na ture 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tengan estructuras diméricas unidas por puentes disulfuro (debido a la IgG) también podrían ser más eficientes para unir y neutralizar otras moléculas, que la proteína monomérica secretada o un fragmento de proteína solo (Fountoulakis et al . , J. Biochem . 270:3958-3964 (1995) ) . Del mismo modo, el documento EP-A-0 464 553 (contraparte canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de la región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína de humano o una parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es benéfica en la terapia y diagnosis, y por lo tanto puede dar como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0232 262) . En forma alternativa, sería deseable la supresión de la parte Fc después que la proteína de fusión ha sido expresada, detectada y purificada. Por ejemplo, la porción Fc podría obstaculizar la terapia y diagnosis si la proteína de fusión se utiliza como un antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas, tales como hIL-5, con porciones Fc con el propósito de pruebas de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. (Véase, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995). Además, el polipéptido de VEGF-2 se puede fusionar a secuencias marcadoras, tales como un péptido que facilite la purificación de un polipéptido de VEGF-2. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácido marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA 91311), entre otros, muchos de los cuales se pueden conseguir comerclalmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina asegura la purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra marca peptídíca útil para la purificación, el marcador "HA", corresponde a un epítope obtenido de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)). Por lo tanto, se puede manipular genéticamente cualquiera de estas fusiones anteriores utilizando los polinucleótidos o los polipéptidos de VEGF-2. jjliMliiill liiil ?t Élirl *" -««*— --*- — -- - B^--^-^»M^* ^*»»^ .-**•**** Actividades biológicas de VEGF-2 Se pueden utilizar los polinucleótidos y polipéptidos de VEGF-2 en pruebas para evaluar respecto a una o más actividades biológicas. Si los polinucleótidos y polipéptidos de VEGF-2 presentan actividad en una prueba particular, es probable que VEGF-2 pueda estar implicado en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por lo tanto se podría utilizar a VEGF-2 para tratar la enfermedad asociada.

Actividad inmune Los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 podrían ser útiles para tratar deficiencias o trastornos del sistema inmune, activando o inhibiendo la proliferación, diferenciación, o movilización (quimiotaxis) de las células inmunes. Las células inmunes se desarrollan a través de un proceso llamado hematopoyesis, que produce células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos, y macrófagos) y células linfoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotenciales. La etiología de estas deficiencias o trastornos inmunes puede ser genética, somática, tales como cáncer o algunos trastornos autoinmunes, adquirida (por ejemplo mediante quimioterapia o toxinas), o infecciosa. actividad hemostática (la detención del sangrado) o la actividad trombolítica (formación de coágulos) . Por ejemplo, incrementando la actividad hemostática o trombolítica, se podrían utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF- 2 para tratar trastornos de coagulación de sangre (por ejemplo afibrinogenemia, deficiencias de factor) , trastornos de plaquetas de la sangre (por ejemplo trombocitopenia) , o heridas que resulten de trauma, cirugía u otras causas. En forma alternativa, se podrían utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, que puedan reducir la actividad hemostática o trombolítica para inhibir o disolver los coágulos, importante en el tratamiento de ataques al corazón (infarto), embolia o formación de cicatrices. Los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 también se podrían ser útiles para tratar o detectar trastornos autoinmunes . Muchos trastornos autoinmunes resultan del reconocimiento inapropiado del ser propio como un material extraño por las células inmunes. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido del hospedero. Por lo tanto, la administración de polmucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 que puedan inhibir una respuesta inmune, en particular la proliferación, tililiíll li ITIÜIÍ— -- A *i?í?* >***—>-** -diferenciación, o quimiotaxis de las células T, podría ser una terapia efectiva para prevenir trastornos autoinmunes. Los ejemplos de trastornos autoinmunes que se pueden tratar o detectar incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de Addison, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípido, artritis reumatoide, dermatitis, encefalomielitis alérgica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Grave, esclerosis múltiple, miastenia gravis, neuritis, oftalmía, Pemfigoide ulceroso, pémfigo, poliendocrinopatías, púrpura, enfermedad de Reiter, síndrome de Stiff-Man, tiroiditis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina, y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune. De igual manera, también se podrían tratar reacciones y condiciones alérgicas, tales como asma (en particular asma alérgica) u otros problemas respiratorios, con los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2. Además, se puede utilizar a VEGF-2 para tratar anafilaxia, hipersensibilidad a una molécula antigénica, o incompatibilidad de grupo sanguíneo. También se podrían utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, para tratar y/o prevenir el rechazo de órganos o la enfermedad de injerto contra hospedero (GVHD por sus siglas en inglés) . El rechazo de órganos se presenta porque las células inmunes del hospedero destruyen el tejido transplantado a través de una respuesta inmune. De igual manera, también está implicada una respuesta inmune en GVHD, pero en este caso, las células inmunes extrañas trasplantadas destruyen los tejidos del hospedero. La administración de polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, que inhiban una respuesta inmune, en particular la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de las células T, podría ser una terapia efectiva para prevenir el rechazo de órganos o la GVHD. De igual manera, también se podrían utilizar los polmucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, para modular la inflamación. Por ejemplo, los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, podrían inhibir la proliferación y diferenciación de las células implicadas en una respuesta inflamatoria. Estas moléculas se pueden utilizar para tratar condiciones inflamatorias, tanto crónicas como agudas, incluyendo la inflamación asociada con la infección (por ejemplo, choque séptico, sepsis, o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS por sus siglas en inglés) ) , daño por isquemia-reperfusión, letalidad por endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, t¿^&J^ i l>t'*Xl^-^^-*^*~a-^¿ i^. x ^,j,M*?t^A a?l^*A?A*i* m* ?&*a*? nefritis, daño pulmonar inducido por citoquinas o quimiocina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, o las que resultan de la sobreproducción de citoquinas (por ejemplo TNF o IL-1) .

Trastornos hiperproliferativos Se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos , incluyendo neoplasmas. Los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 antagonistas podrían inhibir la proliferación del trastorno mediante interacciones directas o indirectas. En forma alternativa, los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 antagonistas podrían hacer proliferar otras células las cuales pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo . Por ejemplo, se pueden tratar los trastornos hiperproliferativos incrementando una respuesta inmune, en particular incrementando las cualidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o haciendo que las células T proliferen, se diferencien o se movilicen. Esta respuesta inmune se puede incrementar ya sea incrementando una respuesta inmune ya existente, o iniciando una nueva respuesta inmune. En forma alternativa, la reducción de una respuesta inmune también podría ser un método para tratar trastornos hiperproliferativos , tales como con un agente quimioterapéutico . Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar mediante los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 antagonistas incluyen, pero no se limitan a neoplasmas localizados en el: abdomen, tejido óseo, tejido mamario, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenales, paratiroideas, pituitaria, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico) , sistema linfático, pelvis, piel, tejido suave, bazo, tórax, y en el tracto urogenital . De igual manera, también se pueden tratar o detectar otros trastornos hiperproliferativos mediante los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 antagonistas. Ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias , púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezari, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis , y cualquier otra enfermedad hiperproliferativos, además de neoplasia, localizada en un sistema u órgano listado anteriormente.

Enfermedades infecciosas Se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, se pueden tratar enfermedades infecciosas incrementando la respuesta inmune, en particular incrementando la proliferación y diferenciación de células B y/o T. La respuesta inmune se puede incrementar ya sea aumentando una respuesta inmune ya existente, o iniciando una nueva respuesta inmune. En forma alternativa, los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, también podrían inhibir directamente al agente infeccioso, sin la necesidad de evocar una respuesta inmune. Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede ocasionar enfermedad o síntomas que se pueden tratar o detectar mediante los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias virales de ADN y ARN: arbovirus, adenovíridos, arenavíridos , arterivirus, Birnavíridos, buniavíridos, calicivíridos, circovíridos , coronavíridos, falvivíridos, hepadnavíridos (Hepatitis) , herpesvíridos (tales como, citomegalovirus, herpes simplex, herpes Zoster) , mononegavirus (por ejemplo, paramixovíridos, morbilivirus, rabdovíridos) , ortomixavíridos (por ejemplo, influenza), papovavíridos, parvovíridos, picornavíridos , poxvíridos (tales como viruela o vaccinia) , reovíridos (por ejemplo, rotavirus) , retrovíridos (HTLV-I, HTLV-II, lentivirus) , y togavíridos (por ejemplo, rubivirus) . Los virus que caen dentro de estas familias pueden ocasionar una variedad de enfermedades o síntomas, incluyendo, pero no limitándose a: artritis, bronquiolitis, encefalitis, infecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis, queratitis) , síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, Activa Crónica, Delta), meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, viruela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabias, resfriado común, polio, leucemia, rubéola, enfermedades transmitidas sexualmente, enfermedades de la piel (por ejemplo, sarcoma de Kaposi, verrugas) y viremia. Se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. De igual manera, con los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 se pueden tratar o detectar agentes bacterianos o fúngicos que pueden ocasionar enfermedades o síntomas, incluyendo, pero no limitándose a, las siguientes familias de hongos y bacterias Gram-negativas y Grampositivas: actinomicetos (por ejemplo Corinebacterium, Mycobacterium, Norcardia) , aspergilosis, Bacillaceae (por ejemplo, ántrax, Clostridium) , Bacetoidaceae, Blastomicosis, Bordetella, Borrelia, brucelosis, candidiasis, Campylobacter, coccidiomicosis, criptococosis, dermatocicosis, Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella, Serratia, Yersinia) , Erysipelothrix, Helicobacter, legionelosis, leptospirosis, Listeria, Micoplásmidos (Mycoplasmatales) , Neisseriaceae (por ejemplo, Acinetobacter, Gonorrea, Meningococos) , infecciones por Pasteurellacea (por ejemplo, Actinobacilus , Heamophilus, Pasteurella) , Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae, sífilis y Staphylococcus . Estas familias de bacterias o de hongos pueden ocasionar las siguientes enfermedades o síntomas, incluyendo, pero no limitándose a: bacteremia, endocarditis, infecciones oculares (conjuntivitis, tuberculosis, uveitis), gingivitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, infecciones relacionadas con SIDA) , paroniquia (paronychia) , infecciones relacionadas con prótesis, enfermedad de Reiter, infecciones del tracto respiratorio, tales como tos ferina o empiema, sepsis, enfermedad de Lyme, enfermedad de rasguño de gato (Cat Scratch Disease) , i^i . t ii.it -A*Á .-a.?AÁ¿l a á disentería, fiebre paratifoidea, envenenamiento por alimento, tifoide, neumonía, gonorrea, meningitis, clamidia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculosis , tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumática, fiebre escarlata, enfermedades transmitidas sexualmente, enfermedades de la piel (por ejemplo celulitis, dermatocicosis) , toxemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas. Se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. Además, con los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 se pueden tratar o detectar los agentes parásitos que causan enfermedades o síntomas incluyendo, pero no limitándose a, las siguientes familias: amibiasis, babesiosis, coccidiosis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, sífilis equina, ectoparásitos, giardiasis, helmintiasis, leishmaniasis, teileriasis, toxoplasmosis, tripanosomiasis y tricomonas. Estos parásitos ocasionan una variedad de enfermedades o síntomas, incluyendo, pero no limitándose a: sarna, trombiculiasis, infecciones oculares, enfermedades intestinales (por ejemplo, disentería, giardiasis) , enfermedades hepáticas, enfermedad de pulmón, infecciones oportunistas (por ejemplo las relacionadas con SIDA) , íaj? A.J jÍAUÍiA*tj?.M??* **.*¿- -*--- ---»t" -malaria, complicaciones del embarazo y toxoplasmosis . Se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades . De preferencia, el tratamiento utilizando los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 puede ser ya sea administrando una cantidad efectiva de polipéptido de VEGF-2 al paciente, o retirando células del paciente, suministrar a las células con polinucleótido de VEGF-2, y regresar las células manipuladas al paciente (terapia ex vi vo) . Además, se puede utilizar el polipéptido o polinucleótido de VEGF-2 como un antígeno en una vacuna para crear una respuesta inmune contra la enfermedad infecciosa.

Regeneración Se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para diferenciar, hacer proliferar y para atraer células, lo cual conduce a la regeneración de tejidos. (Véase, Science 276:59-87 (1997)). La regeneración de tejidos se puede utilizar para reparar, reemplazar o proteger tejido dañado por defectos congénitos, trauma (heridas, quemaduras, incisiones, o úlceras) , la edad, enfermedad (por ejemplo osteoporosis, osteoartritis, Í??? ? A.2.it?rÍí,t 4, ?.áú ?-.ií . &&&.. enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, daño por reperfusión o daño sistémico por citoquinas. Los tejidos que se podrían regenerar utilizando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardíaco) , vasculatura (incluyendo vascular y hepática), tejido nervioso, hematopoyético y esquelético (hueso, cartílago, tendón y ligamento) . De preferencia, la regeneración se presenta sin cicatrización o con cicatrización reducida. La regeneración también puede incluir angiogénesis. Además, los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 podrían incrementar la regeneración de tejidos que son difíciles de curar. Por ejemplo, la regeneración incrementada de tendón/ligamento podría apresurar el tiempo de recuperación después del daño. También se pueden utilizar los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 de la presente invención en forma profiláctica en un esfuerzo para evitar el daño. Las enfermedades específicas que podrían tratarse incluyen tendinitis, síndrome de túnel del carpió, y otros defectos de tendones o ligamentos. Un ejemplo adicional de regeneración de tejido de cicatrices que no sanan incluye las úlceras por presión, las úlceras asociadas con insuficiencia vascular, y las heridas quirúrgicas y traumáticas . De igual manera, también se podrían regenerar tejidos de cerebro y nervioso utilizando los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para hacer proliferar y diferenciar las células nerviosas. Las enfermedades que se podrían tratar utilizando este método incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatías, o trastornos mecánicos y traumáticos (por ejemplo trastornos de la médula espinal, traumas en la cabeza, enfermedad cerebrovascular y embolia). De manera específica, se podrían tratar enfermedades asociadas con daños a nervios periféricos, neuropatías periféricas (por ejemplo, las que resultan de quimioterapia o de otras terapias médicas) , neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Hungtington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager) utilizando los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2. t..j ..». il ¿, A . ? i ..

Quimiotaxis Los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, podrían tener actividad de quimiotaxis. Una molécula quimiotáctica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, células madre, eosinófilos, células epiteliales y/o del endotelio) hacia un sitio particular en el cuerpo, tal como un sitio de inflamación, de infección o de hiperproliferación. Las células movilizadas pueden entonces combatir y/o curar el trauma o anormalidad particular. Los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, podrían incrementar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas moléculas quimiotácticas se pueden utilizar después para tratar inflamación, infección, trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema inmune incrementando el número de células escogidas como blanco en un sitio particular del cuerpo. Por ejemplo, se pueden utilizar moléculas quimiotácticae para tratar heridas y otros traumas a los tejidos atrayendo células del sistema inmune hacia el sitio dañado. Al igual que una molécula quimiotáctica, los polipéptidos de VEGF-2 también pueden atraer fibroblastos, los cuales se pueden utilizar para tratar heridas .

También se contempla que los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 puedan inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas también se pueden utilizar para tratar trastornos. Por lo tanto, los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, se podrían utilizar como un inhibidor de quimiotaxis.

Actividad de unión Se pueden utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para seleccionar respecto a moléculas que se unan a los polipéptidos de VEGF-2 o respecto a moléculas a las cuales se unan los polipéptidos de VEGF-2. La unión de un polipéptido de VEGF-2 y la molécula pueden activar (agonista) , incrementar, inhibir (antagonista) , o disminuir la actividad del polipéptido de VEGF-2 o la molécula unida.

Los ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo, receptores) , o moléculas pequeñas. De preferencia, la molécula está cercanamente relacionada con el ligando natural de VEGF-2, por ejemplo, un fragmento el ligando, o un substrato natural, un ligando, un imitador estructural o funcional. (Véase Coligan, et al., Current Protocols in Immun. , 1(2), cap. 5, (1991)). De igual manera, la molécula puede estar cercanamente relacionada al receptor natural al cual se une VEGF-2 (es decir, Flt-4) , o por lo menos, un fragmento del receptor que pueda unirse a VEGF-2 (por ejemplo, un sitio activo) . En cualquier caso, la molécula se puede diseñar en forma racional utilizando técnicas conocidas. DE preferencia, la selección de estas moléculas implica producir células apropiadas que expresen al polipéptido de VEGF-2, ya sea como una proteína secretada o sobre la membrana celular. Las células preferidas incluyen células provenientes de mamíferos, levaduras, Drosophila, o E. coli. Las células que expresan a VEGF-2 (o la membrana celular que contiene al polipéptido expresado) de preferencia se ponen en contacto después con un compuesto de prueba que contiene potencialmente la molécula para observar la unión, estimulación o inhibición de la actividad de cualquiera del polipéptido de VEGF-2 o de la molécula. La prueba podría simplemente evaluar la unión de un compuesto candidato a VEGF-2, en la cual la unión se detecta mediante un marcador, o en una prueba que implique competencia con un competidor marcado. Además, la prueba también podría evaluar si el compuesto candidato da como resultado o no, una señal generada por la unión a VEGF-2. En forma alternativa, la prueba se puede realizar utilizando preparaciones libres de células, de polipéptido/molécula fijas a un soporte sólido, conjuntos de compuestos químicos, o mezclas de productos naturales. La prueba también podría simplemente comprender los pasos de mezclar un compuesto candidato con una solución que contenga a VEGF-2, medir la actividad o unión polipéptido de VEGF- 2/molécula, y comparar la actividad o unión polipéptido de VEGF-2/molécula con un patrón de referencia. De preferencia, una prueba ELISA puede medir el nivel o actividad de VEGF-2 en una muestra (por ejemplo muestra biológica) utilizando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir el nivel o actividad de VEGF-2 ya sea mediante unión, en forma directa o indirecta, a VEGF-2 o mediante competencia con VEGF-2 por un substrato. Todas estas pruebas anteriores se pueden utilizar como marcadores para diagnóstico o prognosis. Las moléculas descubiertas utilizando estas pruebas se pueden utilizar para tratar la enfermedad o para obtener un resultado particular en un paciente (por ejemplo crecimiento de vasos sanguíneos) activando o inhibiendo la unión polipéptido de VEGF-2/molécula. Además, las pruebas pueden descubrir agentes que puedan inhibir o intensificar la producción de VEGF-2 a partir de células o tejidos manipulados en forma apropiada . Por lo tanto, la invención incluye un método para identificar compuestos que se unen a VEGF-2 que comprende los pasos de: (a) incubar un compuesto para unión candidato con VEGF-2; y (b) determinar si se ha presentado la unión. Además, la invención incluye un método para identificar agonistas/antagonistas que comprende los pasos de: (a) incubar un compuesto candidato con VEGF-2; (b) evaluar mediante pruebas una actividad biológica, y (c) determinar si se ha alterado una actividad biológica de VEGF-2.

Otras actividades Los polipéptidos o polinucleótidos de VEGF-2 también podrían incrementar o reducir la diferenciación o proliferación de células madre embrionarias, además del linaje hematopoyético, como se discutió anteriormente. También se podrían utilizar los polipéptidos o polinucleótidos de VEGF-2 para modular características de los mamíferos, tales como peso corporal, altura, color del cabello, color de los ojos, pigmentación, tamaño y forma, porcentaje de tejido adiposo de la piel (por ejemplo, cirugía cosmética) . De igual manera, se pueden utilizar los polipéptidos o polinucleótidos de VEGF-2, para modular el metabolismo de los mamíferos que afecta el catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización y almacenamiento de energía . Los polipéptidos o polinucleótidos de VEGF-2 se podrían utilizar para cambiar el estado mental o el estado físico de un mamífero, influyendo en los ritmos biológicos, ritmos cardiacos, depresión (incluyendo trastornos depresivos) , tendencia a la violencia, tolerancia al dolor, capacidades de reproducción (de preferencia mediante actividad de tipo activina o inhibina) , niveles hormonales o endocrinos, apetito, libido, memoria, tensión u otras cualidades cognitivas. También se podrían utilizar los polipéptidos o poiinucleótidos de VEGF-2 como aditivo o conservadores para alimentos, tal como para incrementar o reducir las capacidades de almacenamiento, contenido de grasa, lípidos, proteínas, carbohidratos, vitaminas, minerales, cofactores u otros componentes nutricionales .

Vectores, células hospederas y producción de proteína La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, los cuales incluyen las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, y a células hospederas que contienen a los vectores recombinantes, así como a métodos para elaborar a dichos vectores y células hospederas y para utilizarlos en la producción de producción de los polipéptidos o péptidos de VEGF-2 mediante técnicas recombinantes. Las células hospederas se manipulan genéticamente (se transducen, se transforman o se transfectan) con los vectores de esta invención, los cuales podrían ser, por ejemplo, un vector para clonación o un vector de expresión. El vector podría estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células hospederas manipuladas genéticamente se pueden cultivar en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes, o para amplificar los genes de VEGF-2 de la invención. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas utilizadas previamente con la célula hospedera seleccionada para la ..8AáA*r-J**J*-A- —»----.<-wt-A "i*M b¡±. :¡ .¿...i ?.i , expresión, y serán evidentes para el experto en la técnica. Se pueden utilizar los polinucleótidos de la presente invención para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. De esta manera, por ejemplo, se puede incluir la secuencia de polinucleótido en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; plásmidos de levadura; vectores derivados a partir de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de viruela de aves de corral y seudo-rabias . Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro plásmido o vector, en tanto que este se pueda replicar y sea viable en el hospedero. La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos . En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiado mediante procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros se consideran dentro del campo de habilidad el experto en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está LA. jjufea¿ .¿X, ........ aulit. . ligada en forma operable a una secuencia o secuencias de control de expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores se podrían mencionar: promotor LTR o SV40, los promotores lac o trp de E. coli, el promotor PL del fago lambda y otros promotores que se sabe controlan la expresión de genes en células procariontes o eucariontes o en sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión de preferencia contienen por lo menos un gen marcador que pueda ser seleccionado para proveer un rastro fenotípico para la selección de células hospederas transformadas. Tales marcadores incluyen los genes para dihidrofolato reductasa (DHFR) o para resistencia a neomicina para cultivo celular de eucariontes y los genes de resistencia para tetraciclina, o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Se podría utilizar el vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como la descrita anteriormente en la presente invención, así como una secuencia de promotor o de control apropiada, para transformar un hospedero tat i&Aík?? jr---A«_--*.. ?A *&¿tJU*? ... —A* ??-apropiado que permita que el hospedero exprese la proteína. Los ejemplos representativos de hospederos apropiados incluyen pero no se limitan a, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto tales como las células S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera; células de animales tales como las células CHO, COS, y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. Se considera que la selección de un hospedero apropiado está dentro de la habilidad del experto en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. De manera más particular, la presente invención incluye también construcciones recombinantes que comprenden una o más secuencias como las antes descritas ampliamente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector plásmido o viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o invertido. En un aspecto preferido de esta modalidad, la construcción comprende también secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, ligado en forma operable a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen un número grande de vectores y promotores apropiados, y se puede conseguir en forma comercial. Se proveen los siguientes vectores a manera de ejemplo - bacterianos: pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de QIAGEN, Inc.; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucariontes preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene, y pSVK3 , pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores apropiados serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. Además de utilizar vectores de expresión en la práctica de la presente invención, la presente invención incluye también vectores de expresión novedosos que comprenden un operador y elementos de promotor ligados en forma operativa a las secuencias de nucleótido que codifican para una proteína de interés. Un ejemplo de tal vector es pHE4a el cual se describe a continuación con mayor detalle. Como se presenta en forma resumida en las figuras 28 y 29, los componentes del vector pHE4a (SEQ ID NO: 16) incluyen: 1) un gen para neomicinfosfotransferasa como un marcador de selección, 2) un origen de replicación de E. coli , 3) una secuencia de promotor de fago T5 , 4) dos secuencias de operador lac, 5) una secuencia Shine-Delgarno, 6) el gen represor del operón de lactosa (laclq) y 7) una región enlazadora para sitio de clonación múltiple. El origen de replicación (oriC) se obtiene a partir de pUC19 5 (LTI, Gaithersburg, MD) . La secuencia de promotor y las secuencias de operador se elaboran en forma sintética. La producción sintética de secuencias de ácido nucleico es bien conocida en la técnica. Catálogo 95/96 de CLONTECH, páginas 215-216, CLONTECH, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 10 94303. El vector pHE4a se depositó en el ATCC el 25 de febrero de 1998, y se le dio el número de acceso 209645. Se puede ligar en forma operable una secuencia de ácido nucleico que codifica para VEGF-2 (SEQ ID NO:l) al promotor y operador de pHE4a restringiendo el vector con 15 Ndel y con cualquiera de Xbal, BamHl, Xhol, o Asp718, y aislando el fragmento más grande (la región de sitio de clonación múltiple es de 310 nucleótidos aproximadamente) sobre un gel . Se genera la secuencia de ácido nucleico que codifica para VEGF-2 (SEQ ID NO:l) con los sitios de 20 restricción apropiados, por ejemplo, de conformidad con el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 1, utilizando iniciadores para PCR que tengan sitios de restricción para Ndel (como el iniciador 5') y cualquiera de Xbal, BamHl, Xhol, o Asp718 (como el iniciador 3'). El inserto de PCR se purifica en gel y se restringe con enzimas compatibles. El inserto y el vector se ligan de conformidad con protocolos estándar. Como se indicó anteriormente, el vector pHE4a contiene un gen laclq. Laclq es un alelo del gen lacl el cual confiere una regulación fuerte del operador lac . Amann, E. et al., Gene 69:301-315 (1988); Stark, M., Gene 551:255-267 (1987). El gen laclq codifica para una proteína represora que se une a las secuencias del operador lac y bloquea la transcripción de las secuencias hacia el extremo 3'. Sin embargo, el producto del gen laclq se disocia del operador lac en presencia de lactosa o de ciertos análogos de lactosa, por ejemplo, "isopropil-B-D-tiogalactopiranósido (IPTG) . Por lo tanto no se produce VEGF-2 en cantidades apreciables en células hospederas no inducidas que contienen al vector pHE4a. Sin embargo, la inducción de estas células hospederas por la adición de un agente tal como IPTG, da como resultado la expresión de la secuencia que codifica para VEGF- 2. Las secuencias de promotor/operador del vector pHE4a (SEQ ID NO: 17) comprende un promotor de fago T5 y dos secuencias de operador lac. Un operador está localizado en el extremo 5' con respecto al sitio de inicio de transcripción y el otro está localizado en el extremo 3' con respecto al mismo sitio. Estos operadores, cuando están presentes en combinación con el producto del gen laclq, confieren una represión fuerte a las secuencias hacia el extremo 3 ' en ausencia de un inductor del operón lac, por ejemplo IPTG. Se puede inducir la expresión de secuencias ligadas en forma operable localizadas hacia el extremo 3' desde los operadores de lac mediante la adición de un inductor de lac, tal como IPTG. La unión de un inductor de lac a las proteínas de laclq da como resultado que estas se liberen de las secuencias del operador de lac y que se inicie la transcripción de secuencias ligadas en forma operable. La regulación de expresión de gen del operón lac se revisa en Devlin, T., TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WHIT CLINICAL CORRELATIONS , 4a edición (1997) páginas 802-807. Las series de vectores de pHE4 contienen todos los componentes del vector pHE4a excepto por la secuencia que codifica para VEGF-2. Las características de los vectores pHE4a incluyen promotor sintético de fago t5 optimizado, operador lac y secuencias Shine-Delagarno . Además, estas secuencias también están separadas en forma óptima de modo que la expresión de un gen insertado puede ser regulada fuertemente y se presenta un nivel elevado de expresión después de la inducción. Entre los promotores bacterianos conocidos apropiados para ser utilizados en la producción de las proteínas de la presente invención se incluyen los promotores lacl y lacZ de E. coli , lo promotores T3 y T7 , el promotor gpt, los promotores PR y PL del fago lambda y el promotor trp. Los promotores eucariontes apropiados incluyen el promotor inicial inmediato de CMV, el promotor de timidina cinasa de HSV, los promotores inicial y tardío de SV40, los promotores de las LTR virales, tales como aquellas del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) , y los promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína-I de ratón. El vector pHE4a también contiene una secuencia de Shine-Delgarno en el extremo 5' hacia el codón de iniciación AUG. Las secuencias de Shine-Delgarno son secuencias cortas ubicadas por lo general alrededor de 10 nucleótidos hacia el extremo 5' desde el codón de iniciación AUG. Estas secuencias dirigen esencialmente los ribosomas de procariontes hacia el codón de iniciación AUG. Por lo tanto, la presente invención también está dirigida al vector de expresión útil para la producción de las proteínas de la presente invención. Este aspecto de la -aü.^.. invención se ejemplifica por el vector pHE4a (SEQ ID NO: 16) . Las regiones de promotor se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado utilizando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores que puedan seleccionarse. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos nombrados de manera particular incluyen lacl, lacZ , T3 , T7 gpt PR, PL y trp de lambda. Los promotores eucariontes incluyen inicial inmediato de CMV, timidina cinasa de HSV, inicial y tardío de SV40, las LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado está dentro del nivel de habilidad común del experto en la técnica. En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a células hospederas que contiene la construcción antes descrita. La célula hospedera puede ser una célula de eucarionte superior, tal como una célula de mamífero, o una célula de eucarionte inferior, tal como una célula de levadura, o la célula puede ser una célula de procarionte, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula hospedera se puede efectuar mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación, transducción, infección, u otros métodos. (Davis et al., Basic Methods In ^¿^^•^^^^^¿^¿¿fe^*,- . A^e*A?&&Aim¿*4 Molecular Biology (1986) . Se pueden utilizar las construcciones en las células hospederas en una forma convencional para producir el producto de gen codificado por la secuencia recombinante. En forma alternativa, los polipéptidos de la invención se pueden producir mediante síntesis utilizando sintetizadores de péptido convencionales. Las proteínas maduras se pueden expresar en células de mamífero, de levadura, de bacterias o en otras células bajo el control de los promotores apropiados. También se pueden utilizar sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas utilizando las moléculas de ARN derivadas a partir de las construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores para clonación y expresión apropiados para ser utilizados con hospederos procariontes y eucariontes se describen en Sambrook et al . , (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. (1989), cuya descripción se incorpora en la presente invención para referencia. La transcripción de un ADN que codifica para los polipéptidos de la presente invención utilizando eucariontes superiores se incrementa insertando una secuencia í *ái ..í.^ lr. „»«-.*. iS . * ^ i^?A-&tillílt~J&*Jbá mcrementadora en el vector. Las secuencias incrementadoras son elementos de ADN en la configuración cis, por lo general de 10 a 300 pares de bases aproximadamente, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el incrementador de SV40 sobre el lado tardío del origen de replicación (pares de bases 100 a 270), un incrementador de promotor inicial de citomegalovirus, un incrementador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, e incrementadores de adenovirus. Por lo general, los vectores de expresión recombmantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula hospedera, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S . cerevi siae, y un promotor derivado a partir expresado a niveles altos para dirigir la transcripción de una secuencia estructural ubicada hacia el extremo 3 ' . Tales promotores se pueden obtener a parir de operones que codifican para enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor alfa, fosfatasa acida, o proteínas para choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de la traducción, y de preferencia, una secuencia líder que pueda dirigir la l ^„A.,A.A d-. A.Íui.AÁ..Í 4 A,a,.-^,.^.-. secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplasmático o hacia el medio extracelular. En forma opcional, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación N-terminal que imparta las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso en bacterias se construyen insertando un una secuencia de ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con las señales de inicio y terminación de traducción apropiadas en fase de lectura operable con un promotor funcional . El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proveer amplificación dentro del hospedero. Los hospederos procariontes apropiados para transformación incluyen E. coli , Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus , aunque también se podrían utilizar otros como una cuestión de elección. Como un ejemplo representativo, pero no limitativo, los vectores de expresión útiles para uso en bacterias pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano obtenido a partir de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación conocido pBR322 (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEMÍ (Promega Biotec, Madison, Wl , EUA). Estas secciones "de estructura base de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y con la secuencia estructural que será expresada. Después de la transformación de una cepa del hospedero apropiado y del crecimiento de la cepa hospedera hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se des-reprime mediante medios apropiados (por ejemplo cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se cosechan típicamente mediante centrifugación, se desintegran mediante medios físicos o químicos, y se conserva el extracto crudo resultante para purificación adicional. Las células microbianas utilizadas en la expresión de proteínas se pueden desintegrar utilizando cualquier método conveniente, bien conocido por los expertos en la técnica, incluyendo ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes para lisis celular. También se pueden utilizar diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluzman, Cell 23:175 (1981), y otras líneas celulares que puedan expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3 , CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor apropiado y un incrementador, y también cualquiera de los sitios de unión a ribosoma necesarios, sitio de poliadenilación, sitios donadores y receptores de empalme, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo en el extremo 5'. Se podrían utilizar, por ejemplo las secuencias de ADN obtenidas a partir del genoma viral de SV40, el origen de SV40, el promotor inicial, el mcrementador, los sitios de empalme y de poliadenilación, para proveer los elementos genéticos no transcritos requeridos . Además de abarcar células hospederas que contienen .j^- a.» las construcciones de vector discutidas en la presente invención, la invención también abarca células de hospedero primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, en particular de origen mamífero, que han sido manipuladas genéticamente para suprimir o reemplazar el material genético endógeno (por ejemplo la secuencia de VEGF-2) , y/o para que incluyan material genético (por ejemplo promotores heterólogos) que esté asociado en forma operable con la secuencia de VEGF-2 de la invención, y las cuales activan, alteran y/o amplifican los polmucleótidos exógenos de VEGF-2. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas conocidas en el campo para asociar en forma operable las regiones de control heterólogas y las secuencias de polinucleótido endógenas (por ejemplo, que codifican para VEGF-2) mediante recombinación homologa (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,641,670, expedida el 24 de junio de 1997; publicación internacional No. WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; publicación internacional No. WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989), cuyas descripciones se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad.

La célula hospedera puede ser una célula eucarionte superior, tal como una célula de mamífero (por ejemplo, una célula derivada de humano), o una célula eucarionte inferior, tal como una célula de levadura, o la célula hospedera puede ser una célula procarionte, tal como una célula de bacteria. Se puede escoger la cepa hospedera para que module la expresión de las secuencias de gen insertadas, o para que modifique y procese el producto del gen en el modo específico deseado. Se puede elevar la expresión de ciertos promotores en presencia de ciertos inductores; por lo tanto se puede controlar la expresión del polipéptido manipulado genéticamente. Además, las células de hospedero diferentes tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación de la traducción y posterior a la traducción (por ejemplo, glucosilación, fosforilación, corte) de proteínas. Se pueden elegir las líneas celulares apropiadas para asegurar las modificaciones y procesamiento deseado de la proteína expresada . Los polipéptidos se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía con lectina. Se prefiere tener concentraciones bajas de ion calcio presente (0.1 - 5 mM aproximadamente) durante la purificación (Price ete al., J. Biol. Chem. 244:917 (1969)). Se pueden utilizar pasos de reconfiguración de proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Por último se puede utilizar cromatografía liquida de alto rendimiento ("HPLC") para los pasos finales de purificación. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado en forma natural, o un producto de procedimientos de síntesis química o producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedero procarionte o eucarionte (por ejemplo, células de bacteria, levadura, planta superior, insecto y mamífero en cultivo) . Dependiendo del hospedero utilizado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glucosilados con carbohidratos de mamífero o con otros carbohidratos de eucarionte o pueden estar no glucosilados. Los polipéptidos de la presente invención también podrían incluir un residuo „M» - ^^ÜAguAJtAi-- inicial de metionina. Además, los polipéptidos de la invención se pueden sintetizar químicamente utilizando técnicas conocidas en el campo (por ejemplo, véase Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W. H. Freeman & Co . , N.Y., y Hunkapiller, M. , et al., 1984, Nature 310:105-111). Por ejemplo, se puede sintetizar un péptido correspondiente a un fragmento de un polipéptido de VEGF-2 de la invención utilizando un sintetizador de péptidos. Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos de tipo no clásico o análogos químicos de aminoácido como una sustitución o adición en la secuencia de polinucleótidos que codifican para la proteína de VEGF-2. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los D-isómeros de los aminoácidos comunes ácido 2 , 4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, flúoro-aminoácidos, aminoácidos de diseñador tales como b-metil aminoácidos, Ca-metilaminoácidos , Na-metilaminoácidos - "y,. ^¿si^ . ítMíi$ -íto&? ,jáfcfe*¿?& Í .lá y análogos de ácido en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorrotatorio) o L (levorrotatorio) . La invención abarca polipéptidos de VEGF-2 que están modificados en forma diferencial durante o después de la traducción, por ejemplo mediante glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, o formación de derivados mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, corte proteolítico, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. se puede efectuar cualquiera de un número de modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo pero no limitándose a corte químico específico con bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8 , NaBH4 ; acetilación, formilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tumicamicina. En forma adicional las modificaciones posteriores a la traducción abarcadas por la invención incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidrato N-unidas u O-unidas, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal, unión de porciones químicas a la estructura base de aminoácido, modificaciones químicas de las cadenas de carbohidrato N-unidas u 0-unidas y la adición o supresión un residuo de metionina N-terminal como resultado de la expresión en ¡j células de hospedero procarionte. Los polipéptidos también se pueden modificar con un marcador que se pueda detectar, tal como un marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad para permitir la detección y aislamiento de la proteína. La invención también provee derivados químicamente modificados de la proteína de VEGF-2 los cuales podrían brindar ventajas adicionales tales como solubilidad, estabilidad y tiempo de circulación mejorados del polipéptido, o carácter inmunogénico reducido (véase patente de E.U.A. No. 4,179,337). Las porciones químicas para la formación de derivados se pueden seleccionar a partir de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol , carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Los polipéptidos podrían modificarse en posiciones al azar dentro de la molécula, o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y podrían incluir 1, 2, 3 o más porciones químicas unidas. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y podría estar ramificado o no ramificado. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre 1 kDA aproximadamente y 100 kDa aproximadamente (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilitar el manejo y fabricación. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada los efectos, si los hubieran sobre la actividad biológica, la facilidad en el manejo, el grado o carencia de carácter antigénico y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína terapéutica o análogo) . Las moléculas de polietilenglicol (u otras porciones químicas) se deben unir a la proteína considerando los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existe un número de métodos unión disponible para los expertos en la técnica, por ejemplo EP 0 401 384, incorporada en la presente invención para referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol . 20:1028-1035 (1992) que reporta el tratamiento con PEG de GM-CSF utilizando cloruro de trecilo) . Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir en forma covalente mediante residuos de aminoácido a través de un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales se puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácido que tienen un grupo amino libre podría incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácido del extremo N-terminal; los que tienen un grupo carboxilo libre podrían incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico, y los residuos de aminoácido del extremo C-terminal . También se podrían utilizar grupos sulfhidrilo como un grupo reactivo para unir las moléculas de polietilenglicol. Para los propósitos terapéuticos se prefiere la unión en un grupo amino, tal como la unión en el extremo N-terminal o en el grupo lisina. Se podrían desear en forma específica proteínas químicamente modificadas en el extremo N-terminal. Utilizando polietilenglicol como una ilustración de la presente composición, se puede seleccionar a partir de una variedad de moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.) la proporción de moléculas de polietilenglicol a molécula de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción con polietilenglicol que se van a realizar, y el método para obtener la proteína tratada con PEG en el extremo N-terminal seleccionada. El método para obtener la preparación tratada con PEG en el extremo N-terminal (es decir la separación de esta porción ..&&. de las otras porciones con una sola molécula de PEG, si fuera necesario) podría ser mediante purificación del material tratado con PEG en el extremo N-terminal a partir de una población moléculas tratadas con PEG. Se pueden 5 lograra proteínas selectivas químicamente modificadas en la modificación del extremo N-terminal mediante alquilación reductiva la cual aprovecha la reactividad diferencial de los tipos diferentes de grupos amino primarios (lisina contra N-terminal) disponible para la formación de derivados 10 en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas se logra la formación de derivados sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N- terminal con un polímero que contiene grupos carbonilo. Los polipéptidos de VEGF-2 de la invención pueden 15 estar en monómeros o multímeros (es decir dímeros, trímeros, tetrámeros o multímeros superiores) . Por consiguiente, la presente invención se refiere a monómeros y multímeros del polipéptido de VEGF-2 de la invención, su preparación y composiciones (de preferencia, composiciones farmacéuticas) 20 que los contienen. En modalidades específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En modalidades adicionales, los multímeros de la invención son por lo menos dímeros, por lo imwiti menos trímeros o por lo menos tetrámeros . Los multímeros abarcados por la invención pueden ser homómeros o heterómeros . Tal como se utiliza en la presente invención, el término homómero, se refiere a un multímero que contiene solamente polipéptidos de VEGF-2 de la invención (incluyendo fragmentos, variantes, variantes de empalme y proteínas de fusión de la proteína de VEGF-2 como se describe en la presente invención) . Estos homómeros pueden contener polipéptidos de VEGF-2 que tengan secuencias de aminoácido iguales o diferentes. En una modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene únicamente polipéptidos que tengan una secuencia de aminoácido a una de la proteína de VEGF-2 descritas. En otra modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene polipéptidos de VEGF-2 que tengan secuencias de aminoácido diferentes. En las modalidades específicas, el multímero de la invención es un homodímero (por ejemplo contienen polipéptidos de VEGF-2 que tienen secuencias de aminoácido idénticas o diferentes) o un homotrímero por ejemplo, (por ejemplo contienen polipéptidos de VEGF-2 que tienen secuencias de aminoácido idénticas y/o diferentes) . En las modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es por lo menos un homodímero, por lo menos un homotrímero o por lo menos un homotetrámero. Tal como se utiliza en la presente invención, el término heterómero se refiere a un multímero que contiene uno o más polipéptídos heterólogos (es decir polipéptidos de proteínas diferentes) además del polipéptido de VEGF-2 de la invención. En una modalidad específica, el multímero de la invención es un heterodímero, un heterotrímero o un heterotetrámero. _ En las modalidades adicionales, el multímero de la invención es por lo menos un homodímero, por lo menos un homotrímero o por lo menos un homotetrámero. Los multímeros de la invención podrían ser el resultado de asociaciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iones y/o covalentes y/o podrían estar ligados en forma indirecta, por ejemplo, mediante formación de liposomas. De esta manera, en una modalidad, los multímeros de la invención, tales como, por ejemplo, homodímero y homotrímeros , se forman cuando los polipéptidos de la invención entran en contacto uno con el otro en solución. En otra modalidad, los heteromultímeros de la invención, tales como, por ejemplo, heterotrímeros o heterotetrámeros , se forman cuando los polipéptidos de la invención entran en contacto con los anticuerpos para los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos para la secuencia de polipéptido A?f?.rttttui. ?áte? heteróloga en una proteína de fusión de la invención) en solución. En otras modalidades, los multímeros de la invención se forman mediante asociaciones covalentes con y/o entre los polipéptidos de VEGF-2 de la invención. Tales asociaciones covalentes podrían implicar uno o más residuos de aminoácido contenidos en las secuencias de polipéptido (por ejemplo, las indicadas en SEQ ID NOS: 2 o contenida en el polipéptido codificado por el clon depositado) . En un ejemplo, las asociaciones covalentes se entrelazan entre los residuos de cisteína ubicados dentro de las secuencias de polipéptido que interactúan en el polipéptido original (es decir, que se presentan en forma natural) . En otro caso, las asociaciones covalentes son la consecuencia de manipulación química o recombinante. En forma alternativa, tales asociaciones covalentes podrían implicar uno o más residuos de aminoácido contenidos en la secuencia del polipéptido heteróloga en una proteína de fusión de VEGF-2. En un ejemplo, las asociaciones covalentes están entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión de la invención (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925). En un ejemplo específico, las asociaciones covalentes están entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión VEGF-2-Fc (como se describe en la it - a- t- . ¿. , ..:;;k-., presente invención) . En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de la proteínas de fusión de la invención están entre la secuencia de polipéptido heteróloga proveniente de otro miembro ligando/receptor de la familia TNF que puede formar multímeros asociados en forma covalente, tales como por ejemplo, osteoprotegerina (véase, por ejemplo, publicación internacional No. WO 98/49305, cuyos contenidos se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad) . Los multímeros de la invención se pueden generar utilizando técnicas químicas conocidas en el campo. Por ejemplo, los polipéptidos que se desea estén contenidos en los multímeros de la invención se pueden entrelazar químicamente utilizando moléculas enlazadoras y técnicas de optimización de longitud de molécula de enlazador conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925, la cual se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad) . En forma adicional los multímeros de la invención se pueden generar utilizando técnicas conocidas en el campo para formar uno o más entrelazamientos intermoleculares entre los residuos de cisteína localizados dentro de la secuencia de los polípéptidos que se desea estén contenidos en el multímero Í.¡Í¡?.? A.Í,.*.?*Í -.?.-1 mMtA .aS,.-^,^ - «.AjáAáA (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No.5 , 478 , 925 , la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . Además, los polipéptidos de la invención se pueden modificar en forma rutinaria mediante la adición de cisteína o biotina al extremo C-terminal o N-terminal del polipéptido y se pueden aplicar técnicas conocidas en el campo para generar multímeros que contengan uno o más de estos polipéptidos modificados (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925, la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . En forma adicional, se pueden aplicar técnicas conocidas en el campo para generar liposomas que contengan los componentes de polipéptido que se desea estén contenidos en el multímero de la invención (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925, la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . En forma alternativa, se podrían generar multímeros de la invención utilizando técnicas de manipulación genética conocidas en el campo. En una modalidad, se producen los polipéptidos contenidos en multímeros de la invención en forma recombinante utilizando tecnología de proteína de fusión descrita en la presente invención o conocida de alguna otra manera en el campo i = .^&S£tf&£¡ß£É£ÍH (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925, la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . En una modalidad específica, se generan polinucleótidos que codifican para un homodímero de la invención ligando una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de la invención a una secuencia que codifica para un polipéptido enlzador y después también a un polinucleótido sintético que codifica el producto traducido del polipéptido en la orientación invertida desde el extremo C-terminal original hacia el extremo N-terminal (que carece de la secuencia líder) (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925, la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . En otra modalidad, se aplican técnicas recombinantes descritas en la presente invención o de alguna otra manera conocida en la técnica para generar los polipéptidos recombinantes de la invención los cuales contienen un dominio de transmembrana (o un péptido hidrofóbico o de señal) y los cuales se pueden incorporar mediante técnicas de reconstitución de membrana en liposomas (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,478,925, la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) I. ¿444& . 4¿ 14 b 'í k S ?^.Í.2 Usos terapéuticos El polipéptido de VEGF-2 de la presente invención es un mitógeno potente para las células del endotelio vascular y linfático. Como se muestra en las figuras 12 y 13 5 el polipéptido de VEGF-2 de SEQ ID NO : 2 , menos los 46 aminoácidos iniciales, es un mitógeno potente para las células del endotelio vascular y estimula su crecimiento y proliferación. Los resultados del análisis Northern Blot efectuados para la secuencia de ácido nucleico que codifica 10 para este polipéptido en el cual se sondearon 20 mg de ARN proveniente de varios tejidos de humano con 32P-VEGF-2, ilustra que esta proteína se expresa activamente en el corazón y pulmón lo cual es evidencia adicional de actividad mitogénica . 15 Por consiguiente, se podría utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para tratar el trauma vascular promoviendo la angiogénesis. Por ejemplo, para estimular el crecimiento de tejido transplantado en los casos en los cuales se efectúa cirugía de marca pasos 20 coronario. También se podrían utilizar los polipéptidos de VEGF-2, o las porciones biológicamente activas de los mismos, para promover el sanado de heridas, en particular, para formar tejido vascular nuevo en tejidos dañados o para estimular el flujo sanguíneo colateral durante la isquemia y en casos en los cuales se desea una nueva angiogénesis capilar. Los polipéptidos de VEGF-2, o las porciones biológicamente activas de los mismos, se pueden utilizar para tratar heridas de espesor completo tales como las úlceras dérmicas, incluyendo ampollas por presión, úlceras venosas, y úlceras diabéticas. Además, los polipéptidos de VEGF-2, o las porciones biológicamente activas de los mismos, se pueden utilizar para tratar quemaduras y lesiones de espesor completo en los casos en los cuales se utiliza un injerto o colgajo de piel para reparar tales quemaduras y lesiones. Los polipéptidos de VEGF-2, o las porciones biológicamente activas de los mismos, también se pueden emplear para utilizarlos en cirugía plástica, por ejemplo, para la reparación de laceraciones, quemaduras u otro trauma. Además, los polipéptidos de VEGF-2, o las porciones biológicamente activas de los mismos, se pueden utilizar para promover el sanado de heridas y lesiones de los ojos así como para tratar enfermedades oculares. En el mismo contexto, también se puede utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas de los mismos, para inducir el crecimiento de tejido óseo dañado, tejido periodontal o tejido de ligamentos. También se podría Ü. ..i» ti. A ?l. utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para regenerar los tejidos de soporte de los dientes, incluyendo el ligamento de cemento y periodontal, que han sido dañados, por ejemplo, por enfermedad o trauma periodontal . Debido a que la angiogénesis es importante para mantener las heridas limpias y sin infección, se podría utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, en asociación con cirugía y después de la reparación de incisiones y cortes. También se podría utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para el tratamiento de heridas abdominales en las cuales existe un riesgo elevado de infección. VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, se podrían utilizar para promover la formación de endotelio en cirugía de injerto vascular. En el caso de injertos vasculares que utilizan material sintético o transplantado, se puede aplicar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, a la superficie del injerto o en la unión para promover el crecimiento de células del endotelio vascular. También se puede utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para reparar el daño al tejido del miocardio que resulta del kJL . A.A A. í :.isA*Á.^. .. M.AA?. .í?-i, - . infarto al miocardio. También se podría utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para reparar el sistema vascular cardíaco después de la isquemia. VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, también se podrían utilizar para tratar tejido vascular dañado como resultado de cardiopatía coronaria y de enfermedad vascular del sistema nervioso central y periférico. También se puede utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para cubrir las prótesis artificiales o los órganos naturales que son transplantados en el cuerpo para reducir al máximo el rechazo del material transplantado y para estimular la vascularización de los materiales transplantados. VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, también se podrían utilizar para reparar tejido vascular de las lesiones que resultan de trauma, por ejemplo, los que aparecen durante la arteriesclerosis y y que son requeridos después de angioplastia de globo en los casos en los cuales se dañan los tejidos vasculares. VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, también se podrían utilizar para tratar enfermedad arterial periférica. Por consiguiente, en un aspecto . A. ~^*JéAaA a*^*1l¡?® '^a*0A¡i&SA&.* Se. adicional, se provee un procedimiento para utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para tratar la enfermedad arterial periférica. De preferencia, se administra a un individuo un polipéptido de VEGF-2 con el propósito de aliviar o tratar la enfermedad arterial periférica. Las dosis, formulaciones y vías de administración apropiadas se describen posteriormente . También se puede utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para promover la función endotelial de los tejidos y vasos linfáticos, tal como en el caso del tratamiento de la pérdida de vasos linfáticos, oclusiones de los vasos linfáticos, y linfoangiomas . También se podría utilizar VEGF-2 para estimular la producción de lmfocitos . VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, también se podría utilizar para tratar hemangioma en los recién nacidos. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se provee un procedimiento para utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para tratar hemangioma en los recién nacidos. De preferencia, se administra a un individuo un polipéptido de VEGF-2 con el propósito de aliviar o tratar hemangioma en los recién nacidos. Las dosis, formulaciones y vías de administración apropiadas se describen posteriormente . También se podría utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para prevenir o tratar el desarrollo anormal de la retina en recién nacidos prematuros. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se provee un procedimiento para utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para tratar el desarrollo anormal de la retina en recién nacidos prematuros. De preferencia, se administra a un individuo un polipéptido de VEGF-2 con el propósito de aliviar o tratar el desarrollo anormal de la retina en recién nacidos prematuros. Las dosis, formulaciones y vías de administración apropiadas se describen posteriormente. VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, se pueden utilizar para tratar linfademas primarios (idiopáticos) , incluyendo enfermedad de Milroy y linfadema praecox. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se provee un procedimiento para utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para tratar linfademas primarios (idiopáticos) , incluyendo enfermedad de Milroy y linfadema praecox. De preferencia, se administra a un individuo un polipéptido de VEGF-2 con el propósito de aliviar o tratar linfademas primarios (idiopáticos) , incluyendo enfermedad de Milroy y linfadema praecox. Los polipéptidos de VEGF-2 o las JS ^i a-S.ifc,4- ~to?ÁlAÍAA~A..tiL AA?A*¿éi.ii *i .. . A¿.~?. . .^ . . ^ . .4, . s.AA¿**J..AA .Í.a*As e¿í. f pn fij?fe- é0*X &!í.<«&4&í*¡ie< i ? porciones biológicamente activas del mismo se podrían utilizar también para tratar edema así como para afectar la presión sanguínea en un animal. Las dosis, formulaciones y vías de administración apropiadas se describen posteriormente. VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, también se podrían utilizar para tratar tiempos de vida secundarios (obstructivos) incluyendo aquellos que resultan de (I) la eliminación de los nodulos y vasos linfáticos, (ií) radioterapia y cirugía en el tratamiento de cáncer, y (iii) trauma e infección. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se provee un procedimiento para utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para tratar tiempos de vida secundarios (obstructivos) incluyendo aquellos que resultan de (I) la eliminación de los nodulos y vasos linfáticos, (ii) radioterapia y cirugía en el tratamiento de cáncer, y (iii) trauma e infección. De preferencia, se administra a un individuo un polipéptido de VEGF-2 con el propósito de tratar tiempos de vida secundarios (obstructivos) incluyendo aquellos que resultan de (I) la eliminación de los nodulos y vasos linfáticos, (ii) radioterapia y cirugía en el tratamiento de cáncer, y (iii) trauma e infección. Las dosis, formulaciones y vías de administración apropiadas se describen posteriormente. También se podría utilizar VEGF-2, o las porciones biológicamente activas del mismo, para tratar el sarcoma de Kaposi. Por consiguiente, en un aspecto adicional, se provee un procedimiento para utilizar los polipéptidos de VEGF-2 para tratar el sarcoma de Kaposi. De preferencia, se administra a un individuo un polipéptido de VEGF-2 con el propósito de aliviar o tratar el sarcoma de Kaposi. Las dosis, formulaciones y vías de administración apropiadas se describen posteriormente. Los antagonistas del polipéptido de VEGF-2 se pueden utilizar para tratar cáncer inhibiendo la angiogénesis necesaria para soportar el crecimiento de cáncer y tumores.

Trastornos cardiovasculares Los inventores de la presente han demostrado que VEGF-2 estimula el crecimiento de células del endotelio vascular, estimula la migración de células del endotelio, estimula la angiogénesis en la prueba de CAM, reduce la presión sanguínea en ratas con hipertensión espontánea, e incrementa el flujo sanguíneo a las extremidades isquémicas en conejos. Por consiguiente, se pueden utilizar los ¿e taeu?* polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2 para tratar trastornos cardiovasculares, incluyendo enfermedad arterial periférica, tal como isquemia de las extremidades. Los trastornos cardiovasculares incluyen anormalidades cardiovasculares, tales como fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, malformaciones arteriovenosas del cerebro, defectos cardiacos congénitos, atresia, y síndrome de cimitarra. Los defectos cardiacos congénitos incluyen constricción de la aorta, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón en cruz, dextrocardia, ductus arteriosus patente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome de corazón izquierdo hipoplásico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de vasos grandes, ventrículo derecho con salida doble, atresia de tricúspide, truncus arteriosus persistente y defectos del septo (septal) cardiaco, tales como defecto del septo aortopulmonar , defectos de amortiguamiento del endocardio, Síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos del septo cardiaco ventricular. Los trastornos cardiovasculares también incluyen cardiopatías tales como arritmias, cardiopatía carcinoide, rendimiento cardiaco elevado, rendimiento cardiaco bajo, taponamiento cardiaco, endocarditis (incluyendo bacteriana) , aneurisma cardiaco, paro cardiaco, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía congestiva, disnea paroxísmica, edema cardiaco, hipertrofia cardiaca, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, ruptura cardiaca posterior al infarto, ruptura del septo ventricular, enfermedades de la válvula cardiaca, enfermedades del miocardio, isquemia del miocardio, efusión pericárdica, pericarditis (incluyendo obstructiva y tuberculosa) , neumopericardio, síndrome posterior a la pericardiotomía, cardiopatía pulmonar, cardiopatía reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares del embarazo, síndrome de cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovasculares . Las arritmias incluyen arritmias del seno, fibrilación atrial, atrial flutter, bradicardia, extrasístole, Síndrome de Adams-Strokes, bloque de bundle- branch, bloque sinoatrial, Síndrome de QT largo, parasístole, Síndrome de Lown-Ganong-Levine, Síndrome de pre-excitación de tipo Mahaim, Síndrome de Wolf-Parkinson- White, Síndrome de seno enfermo, taquicardias, y fibrilación ventricular. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxismal, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia re-entrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia de junta ectópica, taquicardia de re-entrada nodal sinoatrial, taquicardia del seno, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular. La enfermedad de válvula cardiaca incluye insuficiencia de válvula aórtica, estenosis de la válvula aórtica, murmuro cardiaco, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, atresia de la tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide . Las enfermedades del miocardio incluyen cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatia congestiva, cardiomiopatia hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatia restrictiva, cardiomiopatia de Chagas, fibroelastosis del endocardio, Síndrome de Kearns, daño por reperfusión del miocardio y miocarditis . Las isquemias del miocardio incluyen cardiopatía coronaria, tal como angina pectoris, aneurismo de la '"*-'-»" coronaria, arteriosclerosis de la coronaria, trombosis de la coronaria, vasoespasmo de la coronaria, infarto al miocardio y parálisis del miocardio (stunning) . Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis por bacilos, Enfermedad de Hippel-Lindau, Síndrome de Klippel-Trenaunay- Weber, Síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades de la aorta, arteritis de Takayasu, aortitis, Síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas de las arterias, arteritis, enarteritis, poliarteritis nudosa, trastornos cerebrovaasculares, angiopatías diabéticas, retmopatía diabética, embolias, trombosis, eritromelalgia, hemorroides, enfermedad veno-oclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, Síndrome de CREST, oclusión de la vena de la retina, Síndrome de Cimitarra, Síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, atacia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis, e insuficiencia venosa . Los aneurismas incluyen aneurismas disectantes, aneurismas falsos, aneurismas infectados, aneurismas rotos, aneurismas aórticos, aneurismas del cerebro, aneurismos de la coronaria, aneurismas del corazón y aneurismas ileacos. Las enfermedades oclusivas de las arterias incluyen arteriosclerosis, claudicación intermitente, estenosis de la carótida, displasias fibromusculares, oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción arterial renal, oclusión de la arteria de la retina, y tromboanginitis obliterans. Los trastornos cerebrovasculares incluyen enfermedades de la arteria carótida, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de la arteria cerebral, embolia y trombosis cerebral, trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, Síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural , hemorragia subaracnoide, infarto al cerebro, isquemia cerebral (incluyendo transitoria) , Síndrome de la subclava, leucomalacia periventricular, dolor de cabeza vascular, dolor de cabeza en racimo, migraña e insuficiencia vertebrobasilar . Las embolias incluyen embolias por aire, embolias de fluido amniótico, embolias por colesterol, Síndrome de dedo del pie azul, embolias por grasa, embolias pulmonares y tromboembolias . La trombosis incluye trombosis coronaria, trombosis de vena hepática, oclusión de la vena de la retina, trombosis de arteria carótida, trombosis del seno, Síndrome de Wallenberg y tromboflebitis. La isquemia incluye isquemia cerebral, colitis isquémica, Síndromes de compartimiento, Síndrome de compartimiento anterior, isquemia del miocardio, daños por reperfusión e isquemia de extremidad periférica. La vasculitis incluye aortitis, arteritis, Síndrome de Behcet, Síndrome de Churg-Strauss, Síndrome de nodulo linfático mucocutáneo, tromboanginitis obliterans, vasculitis de hipersensibilidad, púrpura de Schoenlein-Henoch, vasculitis cutánea alérgica y granulomatosis de Wegener. Los polinucleótidos o polipéptidos de VEGF-2, son especialmente efectivos para el tratamiento de isquemia de extremidad crítica y enfermedades de la coronaria. Como se muestra en el ejemplo 18, la administración de polinucleótidos y polipéptidos de VEGF-2 a una extremidad delantera de conejo con isquemia inducida en forma experimental puede restablecer la tasa de presión sanguínea, el flujo sanguíneo, el marcador angiográfico y la densidad hléiné.iiA ák.&.&. biák iá.í.. ...¿¿.. .*É. . - ... i 3A d..*. eÁ?.J^?^?i*m8ÍS^ capilar. Los polipéptidos de VEGF-2 se pueden administrar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, inyección directa con aguja en el sitio de suministro, inyección intravenosa, administración tópica, infusión con catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja con gel de espuma, otros materiales de depósitos disponibles comercialmente, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas orales o en supositorio, decantación o aplicaciones tópicas durante la cirugía, suministro en aerosol. Tales métodos son conocidos en la técnica. Los polipéptidos de VEGF-2 se pueden administrar como parte de una composición farmacéutica, descrita posteriormente con mayor detalle. Los métodos para suministrar polinucleótidos de VEGF-2 se describen con mayor detalle en la presente invención.

Métodos de terapia con genes Otro aspecto de la presente invención son los métodos de terapia con genes para tratar trastornos, enfermedades y condiciones. Los métodos de terapia con genes se refieren a la introducción de secuencias de ácido .-.ai-A.' nucleico (.ADN, ARN y ADN o ARN antisentido) en un animal para obtener la expresión del polipéptido de VEGF-2 de la presente invención. Este método requiere un polinucleótido que codifique para un polipéptido de VEGF-2 ligado en forma operativa a un promotor y a cualquiera de los otros elementos genéticos necesarios para la expresión del polipéptido por el tejido blanco. Tales técnicas de terapia y suministro de genes son conocidas en el campo, véase, por ejemplo el documento WO 90/11092, el cual se incorpora en la presente invención para referencia. De esta manera, por ejemplo, se pueden diseñar genéticamente las células provenientes de un paciente con un polinucleótido (ADN o ARN) que comprenda un promotor ligado en forma operable a un polinucleótido de VEGF-2 ex vivo, suministrando después las células diseñadas genéticamente a un paciente para que sea tratado con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Belldegrun, A., et al . , J. Na ti . Cáncer Inst . 85:207-216 (1993); Ferrantini, M. et al . , Cáncer Research 53:1107-1112 (1993); Ferrantini, M. et al . , J. Immunology 153:4604-4615 (1994); Kaido, T., et al . , Int . J. Cáncer 60:221-229 (1995); Ogura, H., et al . , Cáncer Research 50:5102-5106 (1990); Santodonato, L., et al . , Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, L., et al . , Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); y Zhang, J.-F. et al . , Cáncer Gene Therapy 3:31-38 (1996)), las cuales se incorporan en la presente invención para referencia. En una modalidad, las células manipuladas genéticamente son células arteriales. Las células arteriales se pueden volver a introducir en el paciente a través de inyección directa a la arteria, los tejidos que rodea a la arteria, o mediante inyección con catéter . Como se discute con mayor detalle posteriormente, las construcciones de polinucleótido de VEGF-2 se pueden suministrar mediante cualquier método que suministre materiales inyectables a las células de un animal, tales como, inyección en el espacio intersticial de los tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado y similares). Las construcciones de polinucleótido de VEGF-2 se pueden suministrar en un líquido o vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el polinucleótido de VEGF-2 se suministra como un polinucleótido desnudo. El término polinucleótido "desnudo", ADN o ARN se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de suministro que actúe para ayudar, promover o facilitar la entrada en las células, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectma o agentes precipitantes y similares. Sin embargo, los polmucleótidos de VEGF-2 también se pueden suministrar en formulaciones de liposomas y en formulaciones de lipofectina y similares que se pueden preparar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos se describen, por ejemplo, en las patentes E.U.A. Nos. 5,593,972, 5,589,466 y 5,580,859, los cuales se incorporan en la presente invención para referencia. Las construcciones de vector de polinucleótido de VEGF-2 utilizadas en el método de terapia con genes de preferencia son construcciones que no se integrarán en el genoma del hospedero ni tampoco contendrán secuencias que permitan la replicación. Los vectores apropiados incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; pSVK3 , pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia; y pEFl/V5, pcDNA3.1 y pRc/CMV2 disponibles de Invitrogen y el vector que contiene al polmucleótido de VEGF-2, pVGLl, depositado como depósito ATCC no. PTA-2185. Otros vectores apropiados serán evidentes para el experto en la técnica. Se puede utilizar cualquier promotor fuerte ?,Í.-Í:iÍ,?A..i,.fo,t»¿.4 » ,.4. conocido por los expertos en la técnica para activar la expresión de ADN de VEGF-2. Los promotores apropiados incluyen promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal de adenovirus; o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV) ; el promotor de virus del sincitio respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de metalotionema; los promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAI ; los promotores de globina humana; los promotores de timidina quinasa viral, tales como el promotor de timidina quinasa de Herpes Simplex; LTRs retrovirales; el promotor de b-actina; y los promotores de la hormona de crecimiento humana. El promotor también puede ser un promotor original para VEGF-2. A diferencia de otras técnicas de terapia con genes, una ventaja principal de introducir secuencias de ácido nucleico desnudas en las células blanco es la naturaleza transitoria de la síntesis del polinucleótido en las células. Los estudios han demostrado que se pueden introducir secuencias de ADN no replicante en las células para proveer la producción del polipéptido deseado durante periodos de hasta seis meses. La construcción de polinucleótido de VEGF-2 se puede suministrar en el espacio intersticial de los tejidos dentro de un animal, incluyendo el de músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, tejido óseo, cartílago, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovarios, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende la matriz de mucopolisacárido, fluida, intercelular entre las fibras reticulares de los tejidos de los órganos, las fibras elásticas en las paredes de los vasos sanguíneos o cámaras, las fibras de colágeno de los tejidos fibrosos, o esa misma matriz dentro del tejido conectivo que envuelve las células musculares o en la laguna del tejido óseo. De igual manera es el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los canales linfáticos. Por las razones discutidas anteriormente se prefiere el suministro al espacio intersticial del tejido muscular. Estos se pueden suministrar en forma conveniente mediante inyección en los tejidos que comprenden estas células. De preferencia, estos se suministran y se expresan en células persistentes que no se dividan las cuales están diferenciadas, aunque se puede obtener el suministro y expresión en células no diferenciadas o en células menos diferenciadas totalmente, tales como, por ejemplo, células madre de la sangre o fibroblastos de la piel. Las células musculares in vivo son particularmente competentes respecto a su habilidad para absorber y expresar los polinucleótidos. Para la inyección de secuencias de ácido desnudo, la cantidad de dosis efectiva de ..ADN o de ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. De preferencia, la dosis será de aproximadamente 0.005 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg y de manera más preferida, desde aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg. Desde luego, como apreciará el experto en la técnica, esta dosis variará de conformidad con el sitio de inyección en el tejido. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis apropiada y efectiva de la secuencia de ácido nucleico y esta dependerá de la condición que se está tratando y de la vía de administración. Para el suministro al miocardio, se pueden administrar dosis múltiples de pVGI .1 (VEGF-2) a un paciente, a diversos niveles de dosis tales como, por ejemplo, 200, 800 y 2000 µg . Una manera de suministrar una dosis podría ser a través de inyección directa en el miocardio utilizando, por ejemplo, toracotomía con invasión mínima. Si fuera necesario, se pueden seleccionar sitios de inyección múltiples de conformidad con las áreas de isquemia identificadas por un estudio de profusión de miocardio de línea basal tal como SPECT (tomografía computarizada por emisión de fotón individual) . Para la administración en extremidad, se pueden administrar dosis múltiples de pVGI .1 (VEGF-2) a la extremidad de un paciente, a diversos niveles de dosis tales como, por ejemplo, 2, 4 y 8 mg. Una manera de suministrar la dosis podría ser a través de inyección intramuscular. La vía de administración preferida es mediante la vía de administración parenteral de inyección en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, también se pueden utilizar otras vías de administración parenteral, tales como, inhalación de una formulación en aerosol en particular para el suministro al tejido de los pulmones o de los bronquios, garganta o las membranas mucosas de la nariz. Además, las construcciones de ADN de VEGF-2 desnudo se pueden suministrar a las arterias durante la angioplastía a través del catéter utilizado en el procedimiento. Los polinucleótidos desnudos se suministran mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, inyección directa con ÍJ ^k $J sá?Á á &2i&Ak^.3&fc¿!.aAx.i.? aguja en el sitio de suministro, inyección intravenosa, administración por vía tópica, infusión con catéter, y las denominadas "pistolas de genes". Estos métodos de suministro son conocidos en la técnica. Como se demuestra en el ejemplo 18, las secuencias de ácido nucleico de VEGF-2 desnudo se pueden administrar in vivo, lo cual da como resultado la expresión exitosa del polipéptido para VEGF-2 en las arterias femorales de conejos . Las construcciones también se pueden suministrar con vehículos de suministro tales como las secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina, agentes precipitantes, etc. Tales métodos de suministro son conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, las construcciones de polinucleótido de VEGF-2 se complejan en un preparado de liposomas. Los preparados liposómicos que se utilizan en la presente invención incluyen preparados catiónicos (con carga positiva), aniónicos (con carga negativa) y neutros. Sin embargo, los liposomas catiónicos son particularmente preferidos debido a que pueden formar un complejo con carga fuerte entre el liposoma catiónico y el ácido nucleico polianiónico. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos tt A?^L?*Í?~ilÍl?lA .M*lk?»l.í^r . —--"-..-*..,, , *. .. *. ~ xtm, - .Í.?-±l~..A¿,*~¿it?á *jÍ son mediadores del suministro intracelular de ADN plásmido (Felgner et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . EUA (1987) 84:7413-7416, la cual se incorpora en la presente invención para referencia); ARNm (Malone et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . EUA (1989) 86:6077-6081, la cual se incorpora en la presente invención para referencia) ; y factores de transcripción purificados (Debs et al . , J. Biol . Chem . (1990) 265:10189-10192, la cual se incorpora en la presente invención para referencia) en forma funcional. Los liposomas catiónicos se pueden conseguir fácilmente. Por ejemplo, los liposomas de N[l-(2,3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trietilamonio (DOTMA) son particularmente útiles y se pueden conseguir bajo la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, N.Y. (Véase también Felgner et al., Proc . Nati . Acad . Sci . EUA (1987) 84:7413-7416 , la cual se incorpora en la presente invención para referencia) . Otros liposomas disponibles comercialmente incluyen transfectace (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (de Boehringer) . Otros liposomas catiónicos se pueden preparar a partir de materiales que se pueden conseguir fácilmente utilizando técnicas conocidas en el campo. Véase, por ejemplo la Publicación No. WO 90/11092 del PCT (la cual se . A tl. incorpora en la presente invención para referencia) para una descripción de la síntesis de los liposomas DOTAP (1,2-bis (oleiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) . La preparación de los liposomas DOT.MA se explica en la literatura, véase por ejemplo, P. Felgner et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . EUA (1987) 84:7413-7417, la cual se incorpora en la presente invención para referencia. Se pueden utilizar métodos similares para preparar liposomas a partir de otros materiales lípidos de tipo catiónico. De igual manera, se pueden conseguir fácilmente los liposomas aniónicos y neutros, como por ejemplo a partir de Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.), o se pueden preparar fácilmente utilizando materiales que se pueden conseguir fácilmente. Tales materiales incluyen entre otros fosfatidilo, colina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleilfosfatidilcolina (DOPC) , dioleilfosfatidilglicerol (DOPG) , dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) . Estos materiales también se pueden mezclar con los materiales de partida de DOTMA y DOTAP en relaciones apropiadas. Los métodos para elaborar liposomas utilizando estos materiales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar dioleilfosfatidilcolina (DOPC) , dioleilfosfatidilglicerol L4 i..i ,.| ¿?.

(DOPG) y dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) disponibles comercialmente en varias combinaciones para elaborar liposomas convencionales, con o sin la adición de colesterol. De esta manera, por ejemplo, se pueden preparar vesículas de DOPG/DOPC secando 50 mg de cada uno de DOPG y de DOPC bajo una corriente de gas nitrógeno en un frasco para sonicación. La muestra se coloca bajo una bomba de vacío durante toda la noche y se hidrata al día siguiente con agua desionizada. Después la muestra se sónica durante 2 horas en un frasco tapado, utilizando un sonicador modelo 350 de Heat Systems equipado con una sonda con copa invertida (tipo baño) al valor máximo mientras el baño se hace circular a 15 EC . Como alternativa, se pueden preparar vesículas con carga negativa sin someterlas a sonicación para producir vesículas de láminas múltiples o mediante extrusión a través de membranas nucleopore para producir vesículas unilaminares de tamaño discreto. Se conocen otros métodos y estos están disponibles para los expertos en la técnica . Los liposomas pueden comprender vesículas de láminas múltiples (MLV por sus siglas en inglés) , vesículas unilaminares pequeñas (SUV por sus siglas en inglés) o vesículas unilaminares grandes (LUV por sus siglas en inglés) , siendo preferidas las SUV. Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se prepara utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger et al . , Methods of Immunology (1983), 101:512-527, la cual se incorpora en la presente invención para referencia. Por ejemplo, se pueden preparar MLV que contengan ácido nucleico depositando una película delgada de fosfolípido sobre las paredes de un tubo de vidrio e hidratando posteriormente con una solución del material que se va a encapsular. Las SUV se preparan mediante sonicación prolongada de las MLV para producir una población homogénea de liposomas unilaminares. El material que se va a atrapar se agrega a una suspensión de MLV preformadas y después se sónica. Cuando se utilizan liposomas que contienen lípidos catiónicos, la película de lípido seca se vuelve a suspender en una solución apropiada tal como agua estéril o una solución reguladora isotónica tal como Tris/NaCl 10 mM, se sónica, y después se mezclan los liposomas preformados directamente con el ADN. El liposoma y el ADN forman un complejo muy estable debido a la unión de los liposomas con carga positiva al ADN catiónico. Las SUV encuentran utilidad con fragmentos pequeños de ácido nucleico. Las LUV se preparan mediante un número de métodos, conocidos en la técnica. Los métodos utilizados comúnmente incluyen quelación de Ca2+-EDTA (Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta (1975) 394:483; Wilson et al., Cell (1979) 17:77); inyección de éter (Deamer, D y Bangham, A., Biochem. Biophys. Acta (1976) 443:629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commum. (1977) 76:836; Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979) 76:3348); diálisis con detergente (Enoch, H., y Strittmatter, P., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1979) 76:145); y evaporación en fase invertida (REV por sus siglas en inglés) (Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka, F. y Papahadjopoulos, D., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1978) 75:145; Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215:166), las cuales se incorporan en la presente invención para referencia. En general, la relación de ADN a liposomas será de 10:1 aproximadamente hasta 1:10 aproximadamente. De preferencia, la relación será desde 5:1 aproximadamente hasta 1:5 aproximadamente. Más preferido, la relación será desde 3:1 aproximadamente hasta 1:3 aproximadamente. Incluso más preferido, la relación será de 1:1 aproximadamente. La patente E.U.A. No. 5,676,954 (la cual se incorpora en la presente invención para referencia) reporta sobre la inyección de material genético, complejado con portadores liposómicos catiónicos, en ratones. Las patentes i¡A¡£Á¡t,d.A..feÁ¿AtAÍxL,ÍA >*X>x?.. . -I..4» -, .. » , — . — I .. - —. *.^A*^nexA^¿Aim E.U.A. Nos. 4,897,355, 4,946,787, 5,049,386, 5,459,127, 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055, y la publicación internacional no. WO 94/9469 (las cuales se incorporan en la presente invención para referencia) proveen lípidos catiónicos para ser utilizados en la transfección de ADN en células y mamíferos. Las patentes E.U.A. Nos. 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055, y la publicación internacional No. WO 94/9469 (las cuales se incorporan en la presente invención para referencia) proveen métodos para suministrar complejos de ADN-lípido catiónico a los mamíferos . En ciertas modalidades, las células se manipulan genéticamente, ex vivo o in vivo, utilizando una partícula retroviral que contenga ARN el cual comprende una secuencia que codifica para una proteína de VEGF-2 . Los retrovirus a partir de los cuales se pueden derivar los vectores plásmidos retrovirales incluyen, pero no se limitan a, el virus de leucemia de mundo de Moloney, virus de necrosis de bazo, virus de sarcoma de Rous, virus de sarcoma de Harvey, virus de leucosis de aves, virus de leucemia de gibón, virus de inmunodeficiencia humana, virus de sarcoma mieloproliferativo, y virus de tumor de tejido mamario. El vector de plásmido retroviral se utiliza para ÍS ? A J^*** transducir líneas celulares de empacamiento para formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células de empaque que se pueden transfectar incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT- 19-17-H2 , RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAml2 y D.AN como se describen en Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990) , la cual se incorpora para referencia en la presente invención en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaque mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaP04. En una alternativa, el vector de plásmido retroviral se puede encapsular en un liposoma, o se puede acoplar a un lípido, y después se administra a un hospedero. La línea de células productoras genera partículas de vector retroviral infecciosas las cuales incluyen al polinucleótido que codifica para una proteína de VEGF-2 . Tales partículas de vector retroviral se pueden utilizar después, para transducir células de eucarionte, ya sea in vi tro o in vivo . Las células de eucarionte transducidas expresarán a la proteína de VEGF-2 . En algunas otras modalidades, las células se manipulan genéticamente, ex vivo o in vivo, con el polinucleótido de VEGF-2 contenido en un vector de adenovirus . El adenovirus se puede manipular en forma tal que éste codifique y exprese la proteína de VEGF-2 , y al mismo tiempo se inactive en términos de su capacidad para replicar en un ciclo de vida viral lítico normal. La expresión del adenovirus se logra sin integración del ADN viral en el cromosoma de las células del hospedero, con lo cual se alivian las preocupaciones acerca de la mutagénesis por inserción. Además, durante muchos años se han utilizado adenovirus como vacunas entéricas vivas con un perfil de seguridad excelente (Schwartz, A. R. et al . , (1974) Am . Rev. Respir. Dis . 109 : 233 - 238 ) . Por último, se ha demostrado la transferencia de genes mediada por adenovirus en un número de casos incluyendo la transferencia de alfa-1-antitr?psma y CFTR a los pulmones de ratas del algodón (Rosenfeld, M. , et al . , (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al . , (1992) Cell 68:143-155). Además, los estudios intensivos para intentar establecer al adenovirus como un agente causante en el cáncer de humano fueron negativos en forma uniforme (Grenn, M., et al. (1979) Proc . Nati . Acad . Sci . EUA 76:6606) . Los vectores adenovirales apropiados útiles en la presente invención se describen, por ejemplo, en Kozarsky y Wilson, Curr. Opin . Genet . Devel . 3:499-503(1993); Rosenfeld et al . , Cell 68:143-155 (1992); Engelhardt et al . , Human Genet . Ther. 4 : 759-769 (1993) ; Yang et al . , Nature Genet . 7:362-369(1994); Wilson et al . , Nature 365:691-692(1993); y la patente E.U.A. No. 5,652,224, los cuales se incorporan en la presente invención para referencia. Por ejemplo, el vector de adenovirus Ad2 es útil y se puede desarrollar en células 293 de humano. Estas células contienen la región El del adenovírus y expresan en forma constitutiva a Ela y Elb, los cuales complementan al adenovirus defectuoso suministrando los productos de los genes suprimidos del vector. Además de Ad2 , también son útiles otras variedades de adenovirus (por ejemplo, Ad3 , Ad5 y Ad7) en la presente invención. De preferencia, los adenovirus utilizados en la presente invención son de replicación deficiente. Los adenovirus de replicación deficiente requieren de la ayuda de un virus auxiliar y/o de una línea de células de empaque para formar partículas infecciosas. El virus resultante es capaz de infectar las células y puede expresar un polinucleótido de interés el cual está ligado en forma operable a un promotor, por ejemplo, el promotor HARP de la presente invención, pero no se puede replicar en la mayoría de las células. Los adenovirus de replicación deficiente pueden tener supresiones en uno o más de un total o de una porción de los siguientes genes: Ela, Alb, E3 , E4 , E2a o Ll hasta L5. En algunas otras modalidades, las células se diseñan genéticamente, ex vivo o in vivo, utilizando un virus adeno-asociado (AAV por sus siglas en inglés) . Los AAV son virus defectuosos que se presentan naturalmente los cuales requiere de virus auxiliares para producir partículas infecciosas (Muzyczka, N. , Curr. Topics in Mi crobiol . I munol . 158:97(1992)) . Este también es uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no se dividen. Los vectores se contienen una cantidad tan ba a como 300 pares de bases de AAV se pueden empacar y se pueden integrar, pero el espacio para el ADN exógeno está limitado hasta 4.5 kb aproximadamente. Los métodos para producir y utilizar tales AAV son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes E.U.A. Nos. 5,139,941, 5,173,414, 5,354,678, 5,436,146, 5,474,935, 5,478,745 y 5,589,377. Por ejemplo, un vector de AAV apropiado para ser utilizado en la presente invención incluirá todas las secuencias necesarias para la replicación, formación de la cápside e integración en la célula hospedera del ADN. La construcción de polinucleótido de VEGF-2 se inserta en el vector de AAV utilizando métodos de clonación estándar, tales como aquellos encontrados en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press (1989) . El vector de .AAV recombinante se transfecta después en las células de empaque las cuales se infectan con un virus auxiliar, utilizando cualquier técnica estándar, incluyendo lipofección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, etc. los virus auxiliares apropiados incluyen adenovirus, citomegalovirus, virus vaccinia o herpesvirus. Una vez que las células de empaque se transfectan e infectan, éstas producirán partículas virales de .AAV infecciosas las cuales contienen la construcción de polmucleótido de VEGF-2. Estas partículas virales se utilizan después para transducir células de eucarionte, ya sea ex vivo o in vivo . Las células transducidas contendrán la construcción de polinucleótido de VEGF-2 integrada en su genoma, y expresarán la proteína de VEGF-2 . Otro método de terapia con genes implica asociar en forma operable las regiones de control heterólogas y las secuencias de polmucleótido endógenas (por ejemplo, que codifican para una proteína de VEGF-2) mediante recombmación homologa (véase por ejemplo la patente E.U.A. No. 5,641,670, expedida el 24 de junio de 1997; la publicación internacional No. WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; la publicación internacional No. WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . EUA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al . , Na ture 342:435-438 (1989). Este método implica la activación de un gen el cual está presente en las células objetivo, pero que normalmente no se expresa en las células, o se expresa a un nivel más bajo que el que se desea. Las construcciones de polinucleótido se elaboran, utilizando técnicas estándar conocidas en el campo, en forma tal que contengan al promotor con las secuencias para selección de objetivo flanqueando al promotor. Los promotores apropiados se describen en la presente invención. La secuencia para selección de objetivo tiene una complementariedad suficiente a una secuencia endógena para permitir la recombmación homologa de la secuencia para seleccionar como blanco al promotor con la secuencia endógena. La secuencia para selección de blanco estará lo suficientemente cerca del extremo 5' de la secuencia de polmucleótido endógena deseada de la proteína de VEGF-2 de modo tal que el promotor estará enlazado en forma operable a la secuencia endógena después de la recombinación homologa. El promotor y las secuencias para selección de blanco se pueden amplificar utilizando PCR. De preferencia, el promotor amplificado contiene sitios de enzima de restricción distintos sobre los extremos 5' y 3'. De preferencia, el extremo 3' de la primer secuencia para selección de objetivos contiene el mismo sitio de enzima de restricción que el extremo 5' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia para selección de objetivo contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3' del promotor amplificado. El promotor y las secuencias para selección de objetivos amplificadas se digieren y ligan juntos. La construcción promotor-secuencia para seleccionar objetivos se suministra a las células, ya sea como un polinucleótido desnudo, o junto con agentes que faciliten la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, virus enteros, lipofección, agentes de precipitación, etc., descritos en detalle anteriormente. El promotor P-secuencia para seleccionar objetivos se pueden suministrar mediante cualquier método, incluyendo inyección directa con aguja, inyección intravenosa, administración por vía tópica, infusión con 'rWfl r catéter, aceleradores de partículas, etc. Los métodos se describen con mayor detalle posteriormente. Las células absorben la construcción promotor-secuencia para seleccionar objetivos. Se presenta la recombmación homologa entre la construcción y la secuencia endógena, de modo tal que una secuencia endógena que codifica para VEGF-2 queda bajo el control del promotor. El promotor activa después la expresión de la secuencia angiogénica endógena de VEGF-2. Los polmucleótidos que codifican para la proteína de VEGF-2 se pueden administrar junto con otros polinucleótidos que codifiquen para otras proteínas de VEGF-2. Los polinucleótidos que codifican para VEGF-2 se pueden administrar junto con otros polinucleótidos que codifiquen para otras proteínas angiogénicas . Las proteínas angiogénicas incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento de fibroblastos ácido y básico, VEGF-1, factor de crecimiento epidérmico alfa y beta, factor de crecimiento de células del endotelio derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor alfa de necrosis tumoral, factor de crecimiento de hepatocito, factor de crecimiento tipo insulina, factor estimulante de colonia, factor estimulante de colonia de macrófago, factor estimulante de colonia de granulocito/macrófago y óxido nítrico sintetasa. De preferencia, el polinucleótido que codifica 5 para la proteína de VEGF-2 contiene una secuencia de señal secretora que facilita la secreción de la proteína. Típicamente, la secuencia de señal está colocada en la región codificadora del polinucleótido para que se exprese hacia o en el extremo 5' de la región codificadora. La 10 secuencia de señal puede ser homologa o heteróloga al polinucleótido de interés y puede ser homologa o heteróloga para las células que se van a transfectar. En forma adicional, la secuencia de señal se puede sintetizar químicamente utilizando métodos conocidos en la técnica. 15 Se puede utilizar cualquier modo de administración de cualquiera de las construcciones de polinucleótidos antes descritas en tanto que el modo dé como resultado la expresión de una o más moléculas en una cantidad suficiente para proveer un efecto terapéutico. Esto incluye la 20 inyección directa con aguja, inyección sistémica, infusión con catéter, inyectores biolísticos, aceleradores de partículas (es decir, "pistolas de genes"), depósitos de esponja gelfoam, otros materiales de depósito disponibles comercialmente, bombas osmóticas (por ejemplo, mini bombas Alza) , formulaciones farmacéuticas orales o en supositorio sólidas (tabletas o pildoras) y decantación o aplicaciones tópicas durante la cirugía. Por ejemplo, la inyección directa de plásmido desnudo precipitado con fosfato de calcio en hígado de rata y en bazo de rata o de un plásmido revestido con proteína en la vena portal ha dado como resultado la expresión génica del gen extraño en hígados de rata (Kaneda et al . , Science 243:375(1989)). Un método preferido de administración local es mediante inyección directa. De preferencia, se administra una molécula recombinante de la presente invención complejada con un vehículo de suministro mediante inyección directa en, o en forma local, dentro del área de las arterias. La administración en forma local de una composición dentro del área de las arterias se refiere a inyectar la composición a centímetros y de preferencia, a milímetros dentro de las arterias. Otro método de administración local es poner en contacto una construcción de polinucleótido de la presente invención tienen o alrededor de una herida quirúrgica. Por ejemplo, un paciente puede someterse a cirugía y se puede recubrir la construcción de polinucleótido sobre la superficie del tejido dentro de la herida o la construcción se pueden inyectar en áreas de tejido dentro de la herida. Las composiciones terapéuticas útiles en la administración sistémica, incluyen moléculas recombinantes de la presente invención complejadas a un vehículo de suministro dirigido de la presente invención. Los vehículos de suministro apropiados para ser utilizados con la administración sistémica comprenden liposomas que contengan ligandos para dirigir el vehículo a un sitio particular. Los métodos preferidos de administración sistémica, incluyen inyección intravenosa, aerosol, suministro oral y percutáneo (tópico) . Las inyecciones intravenosas se pueden realizar utilizando métodos estándar en la técnica. El suministro de aerosol también se puede efectuar utilizando métodos estándar en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling et al . , Proc . Na ti . Acad . Sci . EUA 189:11277-11281, 1992, el cual se incorpora en la presente invención para referencia) . El suministro oral se puede efectuar complejando una construcción de polinucleótido de la presente invención a un vehículo que pueda soportar la degradación por enzimas digestivas en las visceras de un animal. Los ejemplos de tales vehículos, incluyen cápsulas o tabletas de material plástico, tales como aquellas conocidas í .-í -.i Á A. en la técnica. El suministro por vía tópica se puede efectuar mezclando una construcción de polinucleótido de la presente invención un reactivo lipofílico (por ejemplo, DMSO) que pueda pasar en la piel. La determinación de una cantidad efectiva de sustancia que se va a suministrar depende de un número de factores incluyendo, por ejemplo, la estructura química y la actividad biológica de la sustancia, la edad y peso del animal, la condición precisa que requiere el tratamiento y su gravedad, y la vía de administración. La secuencia de tratamientos depende de un número de factores, tales como la cantidad de construcciones de polinucleótido que se administran por dosis, así como la salud e historia del individuo. La cantidad precisa, el número de dosis, y los momentos en que se administran las dosis serán determinados por el médico o veterinario encargado. Las composiciones terapéuticas de la presente invención se pueden administrar a cualquier animal, de preferencia a mamíferos y aves. Los mamíferos preferidos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas, conejos, ovejas, vacas, caballos y cerdos, siendo los humanos los preferidos particularmente. lAti.áAi---i---ii-i-, »--.i--t-... ^ -n^. i 4, «. .. ., <^ *^v~^* .-> £?. . ?¿A?i?í ? í? ??ií*aiJ Utilidades de ácido nucleico También se podrían utilizar las secuencias de ácido nucleico de VEGF-2 y los polipéptidos de VEGF-2 para propósitos in vitro relacionados con la investigación científica, síntesis de ADN y la fabricación de vectores de ADN, y para la producción de compuestos de diagnóstico y terapéuticos para tratar la enfermedad humana. Por ejemplo, se puede utilizar VEGF-2 para el cultivo in vitro de células del endotelio vascular, en el cual éste se agrega al medio condicional en una concentración de 10 pg/ml hasta 10 ng/ml. Se podrían utilizar los fragmentos del gen de VEGF-2 de longitud completa como una sonda de hibridación para una genoteca de ADNc para aislar otros genes que tengan una similitud de secuencia elevada con el gen o una actividad biológica similar. Por lo general las sondas de este tipo tienen por lo menos 50 pares de bases, aunque podrían contener un número mayor de bases. La sonda también se podría utilizar para identificar un clon de ADNc correspondiente a un transcrito de longitud completa y a un clon o clones genómicos que contengan el gen completo de VEGF-2 incluyendo las regiones reguladoras y de promotor, exones e intrones. Un ejemplo de una selección comprende aislar la región codificadora del gen de VEGF-2 utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Los oligonucleótidos marcados que tengan una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se utilizan para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN genómico o ARNm de humano para determinar a cuales de los elementos de la genoteca se hibrida la sonda. La presente invención provee métodos para identificar los receptores de VEGF-2. Se puede identificar al gen que codifica para el receptor mediante métodos numerosos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, inspección visual de ligando y clasificación FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), cap. 5, (1991)). De preferencia, se utiliza la clonación de expresión en los casos en los cuales se prepara ARN poliadenilado a partir de una'célula que responda a VEGF-2, y una genoteca de ADNc creada a partir de ARN se divide en mezclas y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no respondan a VEGF-2. Las células transfectadas las cuales se cultivan en portaobjetos de vidrio se exponen al VEGF-2 marcado. VEGF-2 se puede marcar mediante una variedad de medios incluyendo yoduración o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio. Después de la fijación e incubación, los i »á.?.¿f éAih**k* portaobjetos se someten a análisis auto-radiográfico. Se identifican las mezclas positivas y se preparan sub-mezclas y se vuelven a transfectar utilizando un procedimiento iterativo de sub-mezclado y de re-selección, el cual brinda en un momento determinado un clon individual que codifica para el receptor putativo. Como un método alternativo para la identificación de receptor, VEGF-2 marcado se puede enlazar mediante fotoafinidad con la membrana celular o con preparados de extractos que expresen la molécula de receptor. El material entrelazado se resuelve mediante análisis PAGE y se expone a película de rayos X. El VEGF-2 que contiene complejo marcado se puede extirpar, resolver en fragmentos de péptido, y someter a microdeterminación de secuencia de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microdeterminación de secuencia se utilizará para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótido degeneradas para seleccionar una genoteca de ADNc para identificar los genes que codifican para el receptor putativo.

Agonistas y antagonistas de VEGF-2 La presente invención se refiere a un método para seleccionar compuestos para identificar compuestos que sean ^^^^^^^^^^ -^ ^,,.0^^, ^ i t.4. j.« . ^i.. *~??*A? a?iA*e A*t*?^*a?Í **A<i agonistas o antagonistas de VEGF-2. Un ejemplo de tal método toma ventaja de la capacidad de VEGF-2 para estimular en forma significativa la proliferación de células del endotelio humano en presencia del comitógeno Con A. Se obtienen células endoteliales y se cultivan en placas de cultivo de 96 cavidades con fondo plano (Costar, Cambridge, MA) en una mezcla de reacción complementada con Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA) . Se agregan el compuesto Con-A, polípéptidos de la presente invención y el compuesto que se va a seleccionar. Después de incubar a 37°C, los cultivos se pulsan con 1 FCi de 3 [H] timidina (5 Ci/mmoles; Ci=37 BGq; NEN) durante un tiempo suficiente para incorporar al 3 [H] y cosechar sobre filtros de fibra de vidrio (Cambridge Technology, Watertown, MA) . Se determina la incorporación de 3 [H] -timidina promedio (cpm) de cultivos por triplicado utilizando un contador de destello liquido (Beckman Instruments, Irvine, CA) . La incorporación significativa de 3 [H] timidina, según se compara con una prueba de control en la cual se excluye el compuesto, indica la estimulación de proliferación de células del endotelio. Para hacer la prueba a agonistas, se realiza la prueba antes descrita y la capacidad del compuesto para promover la incorporación de 3 [H] timidina en presencia de y fca una proteína angiogénica indica que el compuesto es un agonista para la proteína angiogénica. Por el contrario, para evaluar respecto a antagonistas, se realiza la prueba antes descrita y la capacidad del compuesto para inhibir la incorporación de 3 [H] timidina en presencia de una proteína angiogénica indica que el compuesto es un antagonista para la proteína angiogénica. En forma alternativa, los antagonistas para la proteína angiogénica se pueden detectar combinando una proteína angiogénica y un antagonista potencial bajo condiciones apropiadas para una prueba de inhibición competitiva. La proteína angiogénica se puede marcar, tal como mediante radioactividad, como es el caso del número de moléculas de proteína angiogénica unidas al receptor se puede determinar la efectividad del antagonista potencial . En forma alternativa, se puede medir la respuesta de un sistema de segundos mensajeros conocido después de la interacción con la proteína angiogénica y el receptor y se podría comparar en presencia o ausencia del compuesto. Tales sistemas de segundo incluyen pero no se limitan a cAMP guanilato ciclasa, canales de ion o hidrólisis de fosfoinositido. En otro método, se cultiva y se incuba una célula de mamífero o una preparación de membrana que exprese Í?áií¡l ^kfáfe^^j^Í^ gí^^^M¡Í ^^? al receptor de la proteína angiogénica con proteína angiogénica marcada en presencia del compuesto. La capacidad del compuesto para aumentar o inhibir esta interacción puede entonces medirse. Los antagonistas potenciales de VEGF-2 incluyen un anticuerpo, o en algunos casos, un oligonucleótido, el cual se une al polipéptido y en forma efectiva elimina la actividad de la VEGF-2. Como alternativa, un antagonista potencial podría ser una proteína cercanamente relacionada que se una a los receptores de VEGF-2, sin embargo, éstas son formas inactivas del polipéptido y por lo tanto evitan la acción de VEGF-2. Los ejemplos de estos antagonistas incluyen un mutante negativo dominante de un polipéptido de VEGF-2, por ejemplo, una cadena de una forma heterodimérica de una VEGF-2 puede ser dominante y podría mutarse de tal manera que la actividad biológica no se conserve. Un ejemplo de un mutante dominante negativo incluye versiones truncadas de una VEGF-2 dímérica que pueda interactuar con otro dímero para formar la VEGF-2 de tipo silvestre, sin embargo, el homodímero es inactivo y no puede presentar las características de actividad deseada. Otro antagonista potencial de VEGF-2 es una construcción de antisentido preparada utilizando tecnología l*?.*.?? ?ÉmUt~* t*+. a^aa de antisentido. Se puede utilizar la tecnología de antisentidos para controlar la expresión de genes a través de una formación de hélice triple o ADN o ARN de antisentido, de los cuales ambos métodos se basan en la unión de un polinucleótido al ADN o al ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia de polinucleótido, la cual codifica para los polipéptidos maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN de antisentido desde aproximadamente 10 hasta 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice-véase Lee et al., Nucí. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), con lo cual se evita la transcripción y la producción de una VEGF-2. El oligonucleótido de ARN de antisentido se hibrida con el ARNm ín vivo y bloquea la producción de la molécula de ARNm en el polipéptido de VEGF-2 (Antisense-Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991): Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) ) . Los oligonucleótidos antes descritos también se pueden suministrar a células de tal manera que el ARN o ADN J^^^^^^ i ... ?í M,&?*. Ü^- ^. M .:.J-^i? ¿¿?,!Íiá antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción de VEGF-2. Los antagonistas potenciales de VEGF-2 también incluyen moléculas pequeñas que se unen a y ocupan el sitio activo del polipéptido con lo cual hacen al sitio catalítico inaccesible al substrato de tal que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero no se limitan a péptidos o moléculas tipo péptido pequeñas. Los antagonistas se podrían utilizar para limitar la angiogénesis necesaria para la metástasis de tumores sólidos. Se puede utilizar la identificación de VEGF-2 para generar ciertos inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular. Debido a que la angiogénesis y la neovascularización son el paso esencial en el crecimiento de tumores sólidos, la inhibición de actividad angiogénica de la VEGF-2 es muy útil parar evitar el crecimiento adicional, retardar o incluso revertir los tumores sólidos. Aunque el nivel de expresión de VEGF-2 es extremadamente bajo en tejidos normales incluyendo el tejido mamario, este se puede encontrar expresado a niveles moderados en por los menos dos líneas de células de tumor de mama que se derivan de tumores malignos. Por lo tanto, es posible que VEGF-2 esté implicado en la angiogénesis y crecimiento de tumores. Los gliomas son también un tipo de neoplasia que puede ser tratada con los antagonistas de la presente invención. También se pueden utilizar los antagonistas para tratar la inflamación crónica ocasionada por una permeabilidad vascular incrementada. Además de estos trastornos, también se pueden utilizar los antagonistas para tratar la retinopatía asociada con diabetes, artritis reumatoide y psoriasis. Los antagonistas se pueden utilizar en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como el que se describe posteriormente en la presente invención.

Composiciones farmacéuticas Los polipéptidos, polinucleótidos y agonistas y antagonistas de VEGF-2 se pueden emplear en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o agonista o antagonista, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo incluye pero no se limita a solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. Las formulaciones se deben ajustar al modo de administración . La invención también provee un empaque o estuche farmacéutico que comprende uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Junto con el contenedor o contenedores puede estar una nota en una forma prescrita por la agencia del gobierno que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, cuya nota refleja la aprobación, por la agencia, para la fabricación, uso o venta para administración en humanos. Además, las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar junto con otros compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una forma conveniente tal como mediante las vías de administración tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra tumor, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que sea efectiva para el tratamiento y/o profilaxis de la indicación específica. En general, las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad de por lo menos 10 mg/kg aproximadamente de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad no mayor de 8 mg/kg aproximadamente de peso corporal por día. En la mayoría de los casos, las dosis es desde 10 mg/kg aproximadamente hasta 1 mg/kg aproximadamente de peso corporal diariamente, tomando en consideración las vías de administración, síntomas, etc. Los polipéptidos de VEGF-2, y los agonistas o antagonistas los cuales son polipéptidos también se podrían utilizar de conformidad con la presente invención mediante la expresión de tal polipéptido in vivo, lo cual con frecuencia se conoce como "terapia con genes", descrita anteriormente . De esta manera, por ejemplo, células tales como las células de médula ósea se pueden manipular genéticamente con un polinucleótido (.ADN o ARN) que codifica para el polipéptido ex vivo, después se proveen las células manipuladas genéticamente a un paciente que se va a tratar con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden diseñar genéticamente células mediante procedimientos conocidos en la técnica utilizando una partícula retroviral que contenga ARN que codifique para el polipéptido de la presente invención. De igual manera, se pueden diseñar genéticamente células in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo, por ejemplo, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Como es sabido en la técnica, se puede administrar una célula productora para producir una partícula retroviral que contenga ARN que codifique para un polipéptido de la presente invención a un paciente para diseñar genéticamente células in vivo y para expresar el polipéptido in vivo . Éstos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención mediante tales métodos deberán ser evidentes a los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para diseñar genéticamente las células podría ser otro diferente a una partícula retroviral, por ejemplo, un adenovirus, el cual se puede utilizar para diseñar genéticamente células in vivo después de combinarlo con un vehículo de suministro apropiado. Los retrovirus a partir de los cuales se pueden obtener los vectores de plásmido retroviral mencionados anteriormente en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, virus de leucemia de múrido de Moloney, virus de necrosis del bazo, retrovirus tales como el virus de sarcoma de Rous, el virus de sarcoma de Harvey, el virus de leucosis de aves, el virus de leucemia de gibón, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus de sarcoma mieloproliferativo y virus de tumor de tejido mamario. En una modalidad, el vector de plásmido retroviral se deriva del virus de leucemia de múrido de Moloney. El vector incluye uno o más promotores. Los promotores apropiados que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a, LTR retroviral; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus de humano (CMV) descrito en Miller et al . , Biotechniques 7:980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como los promotores celulares eucariontes incluyendo, pero no limitándose a, los promotores de histona, pol III y b-actina) . Otros promotores virales que se podrían utilizar incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK por sus siglas en inglés) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor apropiado será evidente a los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en la presente invención. La secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor apropiado. Los promotores apropiados que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; o promotores heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV) ; el promotor de virus de sincitio respiratorio (RSV) ; los promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de metalotioneina; los promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor ApoAl ; los promotores de globina de humano; los promotores de timidina quinasa viral, tales como el promotor de timidina quinasa de Herpes simplex; LTR retroviral (incluyendo los LTR retrovirales modificados descritos anteriormente en la presente invención) ; el promotor de b-actina; y los promotores de la hormona de crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor original del cual controla al gen que codifica al polipéptido. El vector de plásmido retroviral se utiliza para transducir las líneas de células de empaque para formar líneas de célula productora. Los ejemplos de células de empaque que se pueden transfectar incluyen, pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, PA317, y-2, y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, yCRE, yCRIP, GP+E-86, GP+envAml2 y DAN como se describen en Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990) , la cual se incorpora para referencia en la presente invención en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaque mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaP04. En una alternativa, el vector de plásmído retroviral se puede encapsular en un liposoma, o se puede acoplar a un lípido, y después se administra a un hospedero . La línea de células productoras genera partículas de vector retroviral infecciosas las cuales incluyen a la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifica para los polipéptidos . Tales partículas de vector retroviral se pueden utilizar después, para transducir células de eucarionte, ya sea ín vi tro o in vi vo . Las células de eucarionte transducidas expresarán a la secuencia o secuencias de ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Las células eucariontes que se pueden transducir incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células del endotelio y células del epitelio bronquial. tri?fft,iMW,r'"'--"*^''~,-""t* --* -""•- ""--* ..^«M--MJ-.^^-4-»--^-» Pruebas de diagnóstico Esta invención también se refiere al uso de los genes que codifican para la proteína de VEGF-2 como parte de una prueba de diagnóstico para detectar enfermedades o la susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la presencia de mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican para la proteína de VEGF-2. Los individuos que llevan mutaciones en el gen que codifica para VEGF-2 se pueden detectar a nivel de ADN mediante una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnóstico se pueden obtener a partir de las células del paciente, tales como sangre, orina, saliva, biopsia de tejido y material de autopsia. El ADN genómico se puede utilizar directamente para la detección o se puede amplificar mediante enzimas utilizando PCR (Saiki et al . , Na ture 324:163-166 (1986)) antes del análisis. También se puede utilizar ARN o ADNc con el mismo propósito. Como ejemplo, se pueden utilizar iniciadores de PCR complementarios al ácido nucleico que codifica para una proteína de VEGF-2 para identificar y analizar las mutaciones del mismo. Por ejemplo, se pueden detectar supresiones e inserciones mediante un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal . Se pueden identificar mutaciones de punto hibridando ADN amplificado a ARN radiomarcado de VEGF-2, o en forma alternativa, secuencias de ADN antisentido radiomarcadas específicas para el ARN de VEGF-2 . Mediante digestión con ARNasa A o mediante las diferencias en las temperaturas de fusión se pueden distinguir las secuencias perfectamente apareadas de los dúplex no apareados. Las pruebas genéticas basadas en las diferencias en la secuencia de ADN se pueden obtener detectando la alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las supresiones e inserciones pequeñas en la secuencia se pueden visualizar mediante electroforesis en gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de secuencias diferentes se pueden distinguir en geles de gradiente de formamida desnaturalizantes en los cuales las movilidades de los fragmentos de ADN diferente se retardan en el gel en posiciones diferentes de conformidad con sus temperaturas de fusión específicas o parciales (véase por ejemplo, Myers et al . , Science 230:1242 (1985)). Los cambios de secuencia en sitios específicos también se pueden revelar mediante pruebas de protección de nucleasa tales como la protección de ARNasa y de SI o el método de disociación química (por ejemplo, Cotton et al . , PNAS, EUA 85:4397-4401 (1985)). Por lo tanto, la detección de una secuencia de ADN se puede lograr mediante métodos tales como hibridación, protección de ARNasa, disociación química, determinación directa de la secuencia de ADN o la utilización de enzimas de restricción, (por ejemplo, Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP por sus siglas en inglés) ) y Southern blotting de ADN genómico. Las mutaciones también se pueden detectar mediante análisis in situ, además de la electroforesis en gel y la determinación de secuencia de ADN más convencionales. La presente invención también se refiere a una prueba de diagnóstico para detectar niveles alterados de proteína de VEGF-2 en diversos tejidos debido a que una sobre expresión de la proteínas en comparación con muestras de tejido normal de control puede detectar la presencia de una enfermedad o la susceptibilidad a la enfermedad, por ejemplo, la diferenciación celular anormal. Las pruebas utilizadas para detectar los niveles de proteína de VEGF-2 en una muestra obtenida de un hospedero son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen pruebas radioinmunológicas, pruebas de unión competitiva análisis Ai-¿,; 1 it--l,,i?l i i, »-aa-.-Ji.». - .. ,.¿M-.....,., .......... ..... „ «. J.*^^ ..^ ..>.i^.&i ¿?á ~^*Ár4* M?íu?A?lájM Western blot, pruebas ELISA y la prueba "de emparedado". Una prueba ELISA (Coligan et al . , Current Protocols in Immunology 1(2), capítulo 6, (1991)) comprende preparar inicialmente un anticuerpo específico para el antígeno de la proteína de VEGF-2 , de preferencia un anticuerpo monoclonal . Además se prepara un anticuerpo reportero contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo reportero se une un reactivo detectable tal como radioactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano. Se retira una muestra de un hospedero y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, una caja de poliestireno, que se una a la proteínas en la muestra. Después se cubre cualquiera de los sitios de unión a proteína en la caja incubando con una proteína no específica, tal como seroalbúmina de bovino. Enseguida, el anticuerpo monoclonal se incuba en la caja durante un tiempo en el cual los anticuerpos se unen a cualquiera de la proteína de VEGF-2 unidas a la caja de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal sin unir se lava con solución reguladora. El anticuerpo reportero ligado a la peroxidasa de rábano se coloca en la caja lo que da como resultado la unión del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal unido a la proteína de VEGF-2 . El anticuerpo reportero no unido se lava después. Después se agregan los substratos para la peroxidasa a la caja y la cantidad de color desarrollada en un periodo determinado es una medida de la cantidad de proteína de VEGF-2 presente en un volumen determinado de muestra del paciente cuando se compara contra una curva estándar . También se puede utilizar una prueba competitiva en los casos en los cuales los anticuerpos específicos para una proteína de VEGF-2 están unidos a un soporte sólido. Después se marcan los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, mediante radioactividad, y se hace pasar una muestra obtenida del hospedero a través de un soporte sólido y se detecta la cantidad del marcador, por ejemplo mediante cromatografía de destello de líquido, la cual se puede correlacionar con una cantidad de proteína de VEGF-2 en la muestra . Una prueba de "emparedado" es similar a una prueba ELISA. En una prueba de "emparedado" la proteína de VEGF-2 se hace pasar a través de un soporte sólido y se unen al anticuerpo unido a un soporte sólido. Después se liga un segundo anticuerpo a la proteína de VEGF-2 . Después se hace pasar un tercer anticuerpo el cual está marcado y es específico para el segundo anticuerpo, a través del soporte sólido y se une al segundo anticuerpo y entonces se puede cuantificar una cantidad.

Identificación de cromosoma Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia dirige específicamente a, y se pueden hibridar con un sitio particular un cromosoma individual de humano. Además, existe la necesidad actual de identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Hoy en día se dispone de unos cuantos reactivos marcadores de cromosoma basados en datos de secuencias reales (de polimorfismo de repetición) para marcar sitios cromosómicos . El mapeo de las moléculas de ADN hasta los cromosomas de conformidad con la presente invención es un primer paso importante para correlacionar aquellas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. En forma breve, se pueden mapear las secuencias hasta los cromosomas preparando iniciadores de PCR (de preferencia de 15-25 pares de bases) a partir de ADNc. Se utiliza el análisis por computadora de ADNc para seleccionar rápidamente iniciadores que no abarquen más de un exón en el ADN genómico, complicando de esta manera el procedimiento de amplificación. Estos iniciadores se utilizan después para seleccionar mediante PCR los híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Únicamente aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente al iniciador darán un fragmento amplificado. El mapeo mediante PCR de los híbridos de célula somática es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Utilizando la presente invención con los mismos iniciadores de oligonucleótido, se puede lograr la sub-localización con paneles de fragmentos provenientes de cromosomas específicos o de mezclas de clones genómicos grandes en una forma análoga. Otras estrategias de mapeo que se pueden utilizar en forma similar para mapear hasta su cromosoma incluyen hibridación m situ, preselección con cromosomas clasificados por flujo marcados y preselección mediante hibridación para construir genotecas de ADNc específico del cromosoma. Se puede utilizar la hibridación in situ con fluorescencia (FISH por sus siglas en inglés) de un clon de ADNc para una expansión cromosómica en metafase para proveer una ubicación cromosómica precisa en un solo paso. Esta técnica se puede utilizar con sondas provenientes de ADNc tan cortas como 50 o 60 pares de bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al . , Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988) . Una vez que se ha mapeado una secuencia hasta una ubicación cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con datos de mapas genéticos. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de la Biblioteca Medica Welch de la Universidad John Hopkins) . La relación entre los genes y las enfermedades que se han mapeado a la misma región cromosómica se identifican después mediante análisis de vínculo (co-herencia de genes físicamente adyacentes) . Después es necesario determinar las diferencias en la secuencia de ADNc o genómica entre los individuos afectados y los no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados pero no en ninguno de los individuos normales, entonces es probable que la mutación sea agente causante de la enfermedad. Con la resolución actual de las técnicas de mapeo físico y de mapeo genético, una molécula de ADNc ubicada en forma precisa a una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Esto supone una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por cada 20 kb) . La comparación de individuos afectados y no afectados generalmente implica buscar primero las alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como supresiones o translocaciones que son visibles en frotis de cromosomas o que se pueden detectar utilizando PCR basada en esa secuencia de ADNc. Por último, la determinación de la secuencia completa de los genes provenientes de varios individuos es necesaria para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir las mutaciones de los polimorfismos .

Antisentido La presente invención está dirigida también a la inhibición de VEGF-2 in vivo utilizando tecnología antisentido. Se puede utilizar la tecnología de antisentido para controlar la expresión de genes a través de una formación de hélice triple o ADN o ARN de antisentido, de los cuales ambos métodos se basan en la unión de un polinucleótido al ADN o al ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia de polinucleótido, la cual codifica para el polipéptido de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN de antisentido desde aproximadamente 10 hasta 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice-véase Lee et al., Nucí. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)), con lo cual se evita la transcripción y la producción de VEGF-2. El oligonucleótido de ARN de antisentido se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la producción de la molécula de ARNm en VEGF-2 (Antisense-Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991): Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988)). De manera alternativa, los oligonucleótidos antes descritos también se pueden suministrar a células de tal manera que el ARN o ADN antisentido pueda ser expresado in vi vo para inhibir la producción de VEGF-2 en la forma antes descrita. Por lo tanto, las construcciones de antisentido para VEGF-2 podrían inhibir la actividad angiogénica del VEGF-2 y evitar el crecimiento adicional o incluso revertir los tumores sólidos, debido a que la angiogénesis y la neovascularización son el paso esencial en el crecimiento de tumores sólidos. Estas construcciones de antisentido también r¡ftír,fa^á -AArA.-**.* f~ ^-¿—-i-*^* se podrían utilizar para tratar artritis reumatoide, psoriasis, retinopatía diabética y sarcoma de Kaposi, los cuales se caracterizan por angiogénesis anormal.

Porciones portadoras de epítope En otro aspecto, la invención provee péptidos y polipéptidos que comprenden porciones que portan epítopes de los polipéptidos de la presente invención. Estos epítopes son epítopes inmunogénicos o antigénicos de los polipéptidos de la presente invención. Un "epítope inmunogénico" se define como una parte de una proteína que induce una respuesta de anticuerpo ín vivo cuando el polipéptido completo de la presente invención, o un fragmento del mismo, es el inmunógeno. Por otro lado, una región de un polipéptido a la cual se puede unir un anticuerpo se define como un "determinante antigénico" o "epítope antigénico" . El número de epítopes inmunogénicos in vivo de una proteína por lo general es menor que el número de epítopes antigénicos. Véase por ejemplo, Geysen, et al., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002. Sin embargo, se pueden preparar anticuerpos para cualquier epítope antigénico, sin considerar si es o no un epítope inmunogénico, utilizando métodos tales como despliegue de fago. Véase por ejemplo, *&¡m Petersen G, et al., (1995) Mol. Gen. Genet. 249:425-431. Por lo tanto, en la presente invención se incluyen tanto los epítopes inmunogénicos como los epítopes antigénicos. En particular se señala que los epítopes inmunogénicos comprenden residuos de aminoácidos críticos pronosticados que se determinan utilizando el análisis de Jameson-Wolf. Por lo tanto, se pueden agregar residuos de flanqueo adicionales en cualquiera de los extremos N- terminal, C-terminal o en ambos, a estas secuencias para generar un polipéptido que porte epítope de la presente invención. Por lo tanto, los epítopes inmunogénicos podrían incluir residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N- terminal o en el extremo C-terminal. Los residuos de aminoácidos adicionales de flanqueo pueden estar contiguos a las secuencias de flanqueo de los extremos N-terminal o C- terminal provenientes de los polipéptidos de la presente invención, de secuencias de polipéptido heterólogas, o podrían incluir tanto secuencias de flanqueo contiguas provenientes de los polipéptidos de la presente invención como secuencias de polipéptido heterólogas. Los polipéptidos de la presente invención que comprenden epítopes inmunogénicos o antigénicos son de por lo menos 7 aminoácidos de longitud. "Por lo menos" significa que un polipéptido de la presente invención que comprende a un epítope inmunogénico o antigénico podría ser de 7 residuos de aminoácido de longitud o un número entero entre 7 aminoácidos y el número de residuos de aminoácido de los polipéptidos de longitud completa de la invención. Los polipéptidos preferidos que comprenden epítopes inmunogénicos o antigénicos son de por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 residuos de aminoácidos en longitud. Sin embargo, se señala que todos y cada uno de los números enteros entre 7 y el número de residuos de aminoácido del polipéptido de longitud completa quedan incluidos en la presente invención. Los fragmentos portadores de epítopes inmuno y antigénicos se pueden especificar ya sea por el número de residuos de aminoácido contiguos, como se describió anteriormente, o además se especifican mediante las posiciones N-termmales o C-terminales de estos fragmentos sobre la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 2. En la invención se incluye cada combinación de una posición N-terminal y C-terminal que un fragmento de, por ejemplo, por lo menos 7 o por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos de longitud pudiera ocupar en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. De nuevo, "por lo menos 7 A?x&.Íb lj¡ Mj*'*—HÍ*1Aá?—ktl¡~?aiibti--J~ *.~t*~« —JL«... -^...«..-^-a,"-'^-'^-?-J-A residuos de aminoácido contiguos de longitud" significa 7 residuos de aminoácido de longitud o un número entero entre 7 aminoácidos y el número de residuos de aminoácido de los polipéptidos de longitud completa de la invención. En forma específica, todos y cada uno de los números enteros entre 7 y el número de residuos de aminoácido del polipéptido de longitud completa quedan incluidos en la presente invención. Los polipéptidos portadores de epítope inmunogénico y antigénico son útiles, por ejemplo, para preparar anticuerpos que se unan en forma específica a los polipéptidos de la invención, y en pruebas inmunológicas para detectar los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, en la purificación por afinidad de los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos también se pueden utilizar en forma rutinaria en una variedad de pruebas inmunológicas cuantitativas y cualitativas, en específico para los polipéptidos de la presente invención utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998) . Los péptidos y polipéptidos portadores de epítope de la invención se pueden producir mediante cualquiera de los medios convencionales para preparar péptidos o polipéptidos incluyendo medios sintéticos y recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, los péptidos portadores de epítope se pueden sintetizar utilizando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple para la síntesis de números grandes de péptidos, tales como 10-20 mg de 248 péptidos diferentes de 13 residuos que representan variantes de aminoácido individuales de un segmento del polipéptido de HAl los cuales se prepararon y caracterizaron (mediante estudios de unión tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R. A. (1985) . Este procedimiento de "Síntesis Simultánea de Péptidos Múltiples (SMPS por sus siglas en inglés) " también se describe en la patente E.U.A. No. 4,631,211 para Houghten et al. (1986). En este procedimiento las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de los diversos péptidos están contenidas en paquetes separados permeables a solventes, lo que permite el uso óptimo de los muchos pasos repetitivos idénticos implicados en los métodos en fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite que se puedan efectuar 500-1000 o más síntesis en forma simultánea. (Houghten et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. 82:5131-5135, en la página 5134.

, . A. * . ...i?iAa Los polipéptidos portadores de epítope de la invención se utilizan para inducir anticuerpos de conformidad con los métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, inmunización in vivo, inmunización in vitro y métodos de despliegue de fago. Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985) . Si se utiliza la inmunización in vivo, los animales se pueden inmunizar con péptido libre; sin embargo, el título de anticuerpo anti-péptido podría ser reforzado acoplando el péptido a un portador macromolecular, tal como la hemocianina de lapa (KLH) o el toxoide del tétanos. Por ejemplo, los péptídos que contiene residuos de cisteína se pueden acoplar a un portador utilizando un enlazador tal como el éster de maleilimidobenzoil-N-hidrosuccinimida (MBS) , mientras que otros péptidos se podrían acoplar a los portadores utilizando un agente enlazante más general tal como glutaraldeído. Los animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan ya sea con el péptido libre o con péptidos acoplados a portador, por ejemplo, mediante inyección mtraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 µg de péptido o proteína |,AJ .-L,-ttf» -faJ-'*' " -- * portadora y adyuvante de Freund. Se podrían necesitar varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas, para proveer un título útil de anticuerpo antipéptido el cual puede ser detectado, por ejemplo, mediante pruebas ELISA utilizando péptido libre adsorbido a una superficie sólida. Se podría incrementar el título de cualquiera de los anticuerpos antipéptido en suero provenientes de un animal inmunizado seleccionando anticuerpos antipéptido, por ejemplo, mediante adsorción al péptido en un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de conformidad con métodos conocidos en la técnica . Como un experto en la técnica apreciará, y como se discutió anteriormente, los polipéptidos de la presente invención que comprenden un epítope inmunogénico o antigénico se pueden fusionar a secuencias de polipéptido heterólogas. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden fusionar con el dominio constante de las inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) o con porciones de las mismas (CH1, CH2 , CH3 , cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas) dando como resultado polipéptidos quiméricos. Tales proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una vida media incrementada ín vivo .

Esto se ha demostrado para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 de humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de 5 mamífero. Véase, por ejemplo el documento EPA 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1998). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica ligada con disulfuro debido a los enlaces disulfuro de la porción de IgG son más eficientes para unirse y neutralizar otras 0 moléculas que los polipéptidos o fragmentos de la misma como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo (Ab) incluye anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos enteros de una sola cadena, y fragmentos de los mismos que se unen al antígeno. De manera mas preferida, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno de humano de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de una sola cadena (scFv) , anticuerpos de una sola cadena, Fvs enlazados con disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden a cualquiera de los dominios VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen incluyendo aves y mamíferos, De preferencia, los anticuerpos son de humano, de múrido, de conejo, de cabra, de cobayo, de camello, caballo o pollo. Los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno incluyendo los anticuerpos de cadena individual, pueden comprender a la región o regiones variables solas o en combinación con la totalidad o con una porción de lo siguiente: regiones de gozne, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención los fragmentos de unión a antígeno que también comprenden una combinación de la región o regiones variables con una región de gozne, y dominios CH1, CH2 y CH3. La presente invención incluye también anticuerpos policlonales y monoclonales anticuerpos quiméricos, humanizados o de humano los cuales se unen en forma específica al polipéptido de la presente invención. La presente invención incluye también anticuerpos que son anti-idiotípicos para los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos , triespecíficos o tener una multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para epítopes diferentes de un polipéptido de la presente invención o podrían ser específicos tanto para un polipéptido de la presente invención así como para una composición heteróloga, tal como un polipéptido heterólogo o un material con soporte sólido. Véanse por ejemplo, las publicaciones WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; del PCT; Tutt, et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991); patente de E.U.A. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al. (1992), J. Immunol . 148-1547-1553. Los anticuerpos de la presente invención se pueden describir o especificar en términos del epítope o epítopes o porción o porciones de un polipéptido de la presente invención los cuales son reconocidos o ligados específicamente por el anticuerpo. El epítope o epítopes o porción o porciones de polipéptido se pueden especificar ÍA Á&?£.iá*.Á- &t¡ k^Jb&AA A*záÉá.»*. .Z AZ*, .l A. ^^... ' » A *S* A ^. i^. .iAm,&IAA?¿A&.?áAA&á¡álaAA. como se describe en la presente invención, por ejemplo mediante las posiciones N-terminal y C-terminal, mediante tamaño en los residuos de aminoácido contiguos, o como se lista en los cuadros y figuras. Los anticuerpos que se unen específicamente a cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también se pueden excluir. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen en forma especifica a los polipéptidos de la presente invención, y permite la exclusión de los mismos. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su reacción cruzada. Los anticuerpos que no se unen a ningún otro análogo, ortólogo o u homologo de un polipéptido de la presente invención se incluyen. Los anticuerpos que se unen a polipéptidos a con por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos70%, por lo menos 65%, por lo menos 60%, por lo menos 55%, y por lo menos 50% de identidad (tal como se calcula utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente invención) a un polipéptido de la presente invención también se incluyen en la misma. También se incluyen en la presente invención los anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por los polinucleótidos que se hibridan a un polinucleótido de la presente invención bajo condiciones de hibridación astringentes (tal como se describe en la presente invención) . Los anticuerpos de la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión hacia un polipéptido de la invención. Las afinidades de unión preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación Kd menor de 5X10" 2M, 10"2M, 5X10"3M, 10'3M, 5X10"4M, 10~M, 5X10"5M, 10"5M, 5X10" 6M, 10"6M, 5X10"7M, 107M, 5X10"8M, 10"8M, 5X10"9M, 10"9M, 5X10" 10M, 10"10M, 5X10_11M, 10_11M, 5X10"12M, 10"10"12M, 5X10"13M, 10" 13M, 5X10"14M, 10"14M, 5X10"15M o 10"15M. Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, pero sin limitarse a, para purificar, detectar y seleccionar como objetivo los polipéptidos de la presente invención, incluyendo métodos de diagnóstico y terapéuticos tanto in vivo como in vi tro. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en pruebas inmunológicas para medir en forma cuantitativa y cualitativa los niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998) (incorporado en la presente invención para referencia en su totalidad) .

Los anticuerpos de la presente invención se podrían utilizar ya sea solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos se pueden también fusionar en forma recombinante a un polipéptido heterólogo en el extremo N- o C- terminal o se pueden conjugar químicamente (incluyendo conjugaciones en forma covalente y no covalente) a polipéptidos o a otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden fusionar en forma recombinante o se pueden conjugar a moléculas útiles como marcadores en pruebas de detección y a moléculas efectoras tales como los polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos, o toxinas. Véase por ejemplo las publicaciones del PCT WO 92/08495; WO 92/14438; WO 91/14438; WO 89/12624; patente de E.U.A. No. 5,314,995; y EP 396,387. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el campo. Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico del mismo a un animal para inducir la producción de suero que contenga anticuerpos monoclonales. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en el campo incluyendo el uso de tecnología de Jí?. Á.?.&tJMéimYA A. ÍA?AA hibridoma y recombinante. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981) (dichas referencias se incorporan para referencia en su totalidad) . Se pueden producir fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención mediante corte proteolítico, utilizando enzimas tales como papaina (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab' ) 2) . En forma alternativa, se pueden producir los anticuerpos de la presente invención mediante aplicación de tecnología de ADN recombinante o mediante química de síntesis utilizando métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también se pueden generar utilizando diversos métodos de despliegue de fago conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fago, se despliegan los dominios de anticuerpo funcionales sobre la superficie de las partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En una modalidad particular, se puede utilizar tal fago para desplegar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, de humano o de múrido) . El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se una al antígeno de interés se puede seleccionar o identificar con antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una superficie sólida o esfera. El fago utilizado en estos métodos por lo general son fagos filamentosos que incluyen los dominios de unión fd y M13 expresados a partir del fago con los dominios de anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro, fusionado en forma recombinante ya sea a la proteína del gen III del fago o del gen VIII. Los ejemplos de métodos de despliegue de fago que se pueden utilizar para elaborar los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Bnnkman et al., J. Immunol . Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol . Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol . 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances m Immunology 57:191-280 (1994); solicitud del PCT No. PCT/GB91/01134; solicitudes del PCT No. WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de E.U.A. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,568,727 y 5,733,743 (cada una de las cuales se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . Como se describe en las referencias anteriores, después de seleccionar el fago, se pueden aislar las regiones que codifican para el anticuerpo del fago y utilizar para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos de humano, o cualquier otro fragmento que se una al antígeno deseado, y expresarlo en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo como se describe con mayor detalle posteriormente. Por ejemplo, se pueden también utilizar técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab' y fragmentos F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la solicitud del PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240: 1041-1043 (1998) (incorporándose dichas referencias para referencia en su totalidad) . Los ejemplos de técnicas que se pueden utilizar para producir Fvs de cadena individual y anticuerpos incluyen aquellos descritos en las patentes E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 F.i *"»i ,f'títl?r (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1998). Para algunos usos, incluyendo el uso de anticuerpos in vi vo y para pruebas de detección in vi tro, podría ser preferible utilizar anticuerpos quiméricos, humanizados o de humano. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual las porciones diferentes del anticuerpo se obtienen de especies animales diferentes, tales como anticuerpos que tengan una región variable obtenida de un anticuerpo monoclonal de múrido y una región constante de inmunoglobulina de humano. Los métodos para producir anticuerpo quiméricos se conocen en la técnica. Véase por ejemplo Morrison., Science 229:1202 (1985); Oí et al., Biotechmques 4:214 (1986); Gilíes et al., (1989) J. Immunol. Methods 125: 191-202; patente E.U.A. Nos. 5,807,715. Los anticuerpos se pueden humanizar utilizando una variedad de técnicas conocidas en el campo incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; publicación del PCT WO 91/09967; patentes de E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101; y 5,585,089), formación de estrías o formación de superficie nueva (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)) e intercambio de cadena (patente de E.U.A. No. 5,565,332). Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de despliegue de fago descritos anteriormente. Véanse también patentes de E.U.A. Nos. 4,444,887 y 4,716,111, 5,545,806 y 5,814,318; y WO 98/46645 (cada una de las cuales se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad) . La presente invención abarca anticuerpos fusionados en forma recombinante o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones tanto covalente como no covalentes) a un polipéptido de la presente. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes a los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo se pueden utilizar anticuerpos para dirigir los polipéptidos de la presente invención hacia tipos particulares de células, ya sea in vi tro o in vi vo, fusionando o conjugando los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para los receptores de la superficie celular particular. Los anticuerpos fusionados o conjugados a los polipéptidos de la presente invención también se pueden utilizar en pruebas inmunológicas in vi tro y en métodos de purificación utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Harbor et al., supra, y publicación del PCT WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol . Lett. 39:91-99 (1994); patente de E.U.A. No. 5,474,981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol . 146:2446-2452 (1991)), las cuales se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. La presente invención incluye también composiciones que comprenden a los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados a los dominios de anticuerpo diferentes a las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se podrían fusionar o conjugar a una región Fc de anticuerpo, o una fracción de la misma. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención podría comprender la región constante, la región de gozne, el dominio CH1 , el dominio CH2 y el dominio CH3 o cualquier combinación de dominios completos o porciones de los mismos. Los polipéptidos también se podrían fusionar o conjugar a las porciones de anticuerpo anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros mediante puentes disulfuro entre las porciones Fc . Se pueden elaborar formas multiméricas superiores fusionando los polipéptidos a porciones de IgA e IgM. Los métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpo se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 5,336,606; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; publicaciones del PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et a., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); y Vil et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:11337-11341 (1992) (las cuales se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad) . La invención se refiere también a anticuerpos que actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que desintegran las interacciones receptor/ligando con los polipéptidos de la invención ya sea en forma parcial o completa. Se incluyen tanto los anticuerpos específicos de receptor como los anticuerpos específicos de ligando. Se incluyen los anticuerpos específicos de receptor que no evitan la unión al ligando pero que previenen la activación del receptor. Se puede determinar la activación del receptor (es decir, señalización) mediante técnicas descritas en la presente invención o conocidas de alguna otra manera en la técnica.

También se incluyen anticuerpos específicos de receptor que tanto evitan la unión al ligando y la activación de receptor. De igual manera, se incluyen anticuerpos neutralizantes que se unen al ligando y evitan la unión del ligando al receptor, así como anticuerpos que se unen al ligando, con lo cual evitan la activación de receptor, pero no previenen al ligando de que se una al receptor. También se incluyen en la invención anticuerpos que activan al receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas para todas o no para todas las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor mediada por el ligando. Los anticuerpos pueden ser especificados como agonistas, antagonistas para las actividades biológicas que comprenden las actividades biológicas descritas en la presente invención. Se pueden elaborar agonistas de anticuerpo utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo publicación del PCT WO 96/40281; patente de E.U.A. No. 5,811,097; Deng et al., Blood 92 (6) : 1981-1988 (1998); Chen et al., Cáncer Res. 58 (16) : 3668-3678 (1998); Harrop et al., J. Immunol . 161 (4 ): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Cáncer Res. 58 (15) : 3209-3214 (1998); Yoon et al., J. Immunol. 160 (7) : 3170-3179 (1998); Prat M. et al., J. Cell. Sci . 111 (Pt2) :237-247 (1998); Pitard et al., J. Immunol .

Methods 205 (2) :177-190 (1997); Liautard et al., Cytokine 9(4):233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272 (17) : 11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14 (4) -.755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20 (1996) (de las cuales todas se incorporan para referencia en la presente invención en su totalidad) . Los anticuerpos también se pueden utilizar en una prueba inmunológica para detectar la presencia de tumores en ciertos individuos. La prueba inmunológica con enzima se puede realizar a partir de la muestra de sangre de un individuo. Los niveles elevados de VEGF-2 se pueden considerar como un diagnóstico de cáncer. También se pueden producir versiones truncadas de VEGF-2 que puedan interactuar con VEGF-2 de tipo silvestre para formar dímeros que no puedan activar el crecimiento de células endoteliales, con lo cual mactivan al VEGF-2 endógeno. O, las formas mutantes de VEGF-2 forman dímeros por si solas y ocupan el dominio de unión a ligando de los receptores de tirosina cinasa apropiados sobre la superficie de la célula objetivo, pero no pueden activar el crecimiento celular. En forma alternativa, se podrían utilizar - „^ ^?^^^J^ ?í?i ?**-»*»* ** antagonistas para los polipéptidos de la presente invención que se unan a los receptores a los cuales se une normalmente un polipéptido de la presente invención. Los antagonistas pueden ser proteínas cercanamente relacionadas tal que estas reconozcan y se unan a los sitios de receptor de la proteína natural, sin embargo, estas son formas inactivas de la proteína natural y por esto evitan la acción de VEGF-2 debido a que están ocupados los sitios de receptor. De esta manera, se evita la acción de VEGF-2 y los antagonistas/inhibidores se pueden utilizar en forma terapéutica como un fármaco contra tumores ocupando los sitios de receptor de los tumores los cuales son reconocidos por VEGF-2 o inactivando al mismo VEGF-2. También se podrían utilizar los antagonistas/inhibidores para prevenir la inflamación debido a la acción de permeabilidad vascular incrementada de VEGF-2. También se podrían utilizar los antagonistas/inhibidores para tratar el crecimiento de tumores sólidos, retinopatía diabética, psoriasis y artritis reumatoide . Los antagonistas/inhibidores se pueden emplear en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo como los que se describieron anteriormente en la presente invención. -j--^-».^-- - ^.^¿»- ^.M^A^?B??á?O?? A continuación se describe la invención con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos; sein embargo, se debe entender que la presente invención no queda limitada por tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, están en peso, amenos que se especifique de otra manera. Para facilitar el entendimiento de los siguientes ejemplos, se describen ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia. "Plásmidos" se designan con una letra p minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de la presente invención se pueden conseguir comercialmente, están disponibles al público sin restricción, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de conformidad con los procedimientos publicados. Además, en la técnica se conocen plásmidos equivalentes a aquellos descritos y serán evidentes para el experto en la técnica. "Digestión" de ADN se refiere al corte catalítico del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción utilizadas en la presente invención se pueden conseguir comercialmente y se utilizaron sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos como es sabido por el experto en la técnica. Para propósitos analíticos, se utiliza típicamente 1 mg de plásmido o de fragmento de ADN con 2 unidades de enzima aproximadamente en aproximadamente 20 Fl de solución reguladora. Para el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, típicamente se digieren de 5 a 50 mg de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. El fabricante especifica las soluciones reguladoras apropiadas y las cantidades de substrato para las enzimas de restricción particulares. Por lo general se utilizan tiempos de incubación de 1 hora aproximadamente a 37EC, pero podrían variar de conformidad con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión, la reacción se somete electroforesis directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado. La separación de tamaños de los fragmentos cortados se efectúa utilizando un gel de poliacrilamida al 8% descrito por Goeddel, D et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) . "Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas complementarias de polidesoxinucleótido, las cuales se pueden sintetizar químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato en la posición 5' y por lo tanto no se unen a otro oligonucleótido sin la adición de un fosfato con una molécula de ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se unirá a un fragmento que noi haya sido desfosforilado . "Ligación" se refiere al procedimiento de formar enlaces de tipo fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de cadena doble (Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) , pág. 146) . A menos que se provea de otra manera, la ligación se puede lograr utilizando soluciones reguladoras y condiciones con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por cada 0.5 mg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se van a ligar. A menos que se indique de otra manera, la transformación se efectúa como lo describe el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology 52:456-457 (1973).

EJEMPLOS EJEMPLO1 Patrón de expresión de VEGF-2 en tejidos humanos y en líeas celulares de cáncer de mama Se efectúa el análisis Northern blot para examinar los niveles de expresión de VEGF-2 en tejidos humanos y en líneas celulares de cáncer de mama en tejidos humanos. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol™ B (Biotecx Laboratories, Inc.). Se separan 10 mg aproximadamente of ARN total aislado a partir de cada tejido de mama y de cada línea de células especificado sobre un gel de agarosa al 1% y se somete a blotting en a filtro de nylon, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). La reacción de marcado se efectúa de conformidad con el estuche Prime-It de Stratagene con un fragmento de 50 ng de ADN. El ADN marcado se purifica con una columna Select G-50 de 5 Prime - 3 Prime, Ine (Boulder, CO) . El filtro se hibrida después con gen de VEGF- 2 de longitud completa marcado con radiactividad a 1,000,000 cpm/ml en NaP04 0.5 M y SDS al 7 % durante toda la noche a i . . A . 65°C. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60°C con 0.5 X SSC, 0.1 de SDS, El filtro se expone después a -70°C durante toda la noche con una pantalla de intensificación. Se observa un mensaje de 1.6 Kd en 2 líneas celulares de cáncer de mama. La figura 5, carril #4 representa una línea de células muy tumorigénica que no depende de estrógeno para crecer. Además, se separan 10 mg de ARN total a partir de 10 tejidos adultos de humano en un gel de agarosa y se somete a blotting en un filtro de nylon. El filtro se hibrida después con una sonda de VEGF-2 marcado con radiactividad en SDS al 7%, NaP04 0.5 M, pH 7.2; 1% de BSA durante toda la noche a 65 °C. Después de lavar en 0.2 X SSC a 65°C, el filtro se expone a la película durante 24 días a -70°C con una pantalla de intensificación. Véase la figura 6.

EJEMPLO 2 Expresión de la forma truncada de VEGF-2 (SEQ ID NO; 4) mediante transcripción y traducción in vitro Se transcribe y se traduce el ADNc de ADNc de VEGF-2 in vitro para determinar el tamaño del polipéptido í .? ¿Í..Í á-. i. :Í.?lL^ . Í.^. i . ...»»a»...,¿]i4MJJM<ttfr_--tA traducible codificado por la forma truncada de VEGF-2 y un ADNc parcial de VEGF-2. Se amplifican los dos insertos de VEGF-2 en el vector pBluescript SK mediante PCR con tres pares de iniciadores, 1) iniciadores M13 inverso y directo; 2) iniciador M13 inverso e iniciador F4 para VEGF; and 3) iniciador M13 inverso e iniciador F5 para VEGF. Las secuencias de estos iniciadores son las siguientes. Iniciador inverso M13-2: 5 ' -ATGCTTCCGGCTCGTATG-3 ' (SEQ ID NO: 9) . Esta secuencia está localizada corriente arriba del extremo 5' del inserto de ADNc de VEGF-2 en el vector pBluescript y está en una orientación anti-sentido como el ADNc. Una secuencia de promotor T3 se localiza entre este iniciador y el ADNc de VEGF-2. Iniciador directo M13-2: 5 ' GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ' (SEQ ID NO: 10) Esta secuencia está localizada corriente abajo del extremo 3' del inserto de ADNc de VEGF-2 en el vector pBluescript y está en una orientación anti-sentido al igual que el inserto de ADNc. Iniciador F4 para VEGF: 5 ' -CCACATGGTTCAGGAAAGACA- 3' (SEQ ID NO: 11) t J?? ? A. A ssé&s. . ..«.l-s, ,.,».»<* -jafcaA. , Esta secuencia está localizada dentro del ADNc de VEGF-2 en una orientación anti-sentido desde los pares de bases 1259-1239, la cual está a 169 pares de bases aproximadamente del extremo 3' del codón de detención y aproximadamente a 266 pb antes del último nucleótido del ADNc. La reacción de PCR con todos los tres pares de iniciadores produce productos amplificados con la secuencia promotora T3 en frente del inserto de ADNc. El primer y el tercer par de iniciadores produce productos de PCR que codifican para el polipéptido de VEGF-2 mostrado en SEQ ID NO : 4. El segundo par de iniciadores produce un producto de PCR al que le faltan 36 aminoácidos de la secuencia codificadora en el extremo C-terminal del polipéptido de VEGF-2. Se utilizan aproximadamente 0.5 mg de producto de PCR proveniente del primer par de iniciadores, 1 mg proveniente del segundo par de iniciadores, 1 mg proveniente del tercer par de iniciadores para la transcripción/traducción in vitro. La reacción de transcripción/traducción in vitro se efectúa en un volumen de 25 Fl , utilizando los Sistemas de material Lisado de Reticulocito Acoplado con TNTa (TNTj Coupled Reticulocyte Lysate Systems) (Promega, CAT# L4950) . De manera específica, c i.J...^aÁM^ la reacción contiene 12.5 Fl de lisado de reticulocito de conejo TNT, 2 Fl de solución reguladora TNT, 1 Fl de polimerasa T3 , 1 Fl de mezcla de aminoácidos 1 mM (menos metionina), 4 Fl de 35S-metionina (>1000 Ci/mmol, 10 mCi/ml) , 1 Fl de 40 U/µl; inhibidor de RNasin ribonucleasa, 0.5 o 1 mg de productos de PCR. Se agrega H20 libre de Nucleasa para llevar el volumen a 25 Fl . La reacción se incuba a 30°C durante 2 horas. Se analizan cinco microlitros del producto de reacción en un gel SDS-PAGE con gradiente de 4-20%. Después de fijar en isopropanol al 25% y ácido acético al 10%, se seca el gel y se expone a una película para rayos X durante toda la noche a 70 °C. Como se muestra en la figura 7, los productos de PCR que contienen el ADNc de VEGF-2 truncado (es decir, como se muestra en SEQ ID NO: 3) y el ADNc al que le faltan 266 pb en la región 3' no traducida (3' -UTR) producen la misma longitud de productos traducidos, cuyos pesos moleculares se estiman que son de 38-40 kd (carriles 1 y 3) . El ADNc al que le faltan todas las 3 ' UTR y la secuencia que codifica para los 36 aminoácidos del extremo C-terminal se traduce en un polipéptido con un peso molecular estimado de 36-38 kd (carril 2) . ?.i- .? , .i Á,.A Á.;Í., .-¡..íi . .a >H.*.~ i,..í EJEMPLO 3 Clonación y expresión de VEGF-2 utilizando el sistema de expresión de Baculovirus Se amplificó la secuencia de ADN que codifica para la proteína de VEGF-2 sin 46 aminoácidos en el extremo N-terminal, véase ATCC No. 97149, utilizando iniciadores de oligonucleótido para PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen: El iniciador 5' tiene la secuencia TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCC GCC ATG GAG GCC ACG GCT TAT GC (SEQ ID NO: 12) y contiene un sitio para enzima de restricción BamHl (en negritas) y una secuencia de 17 nucleótidos complementaria a la secuencia 5' de VEGF-2 (nt . 150-166). El iniciador 3' tiene la secuencia GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGG TCT (SEQ ID NO: 13) y contiene el sitio de corte para la enzima de restricción Xbal y 18 nucleótidos complementarios a la secuencia 3' de VEGF-2, incluyendo el codon de detención y una secuencia de 15 nt antes del codon de detención. Se aislaron las secuencias amplificadas a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un estuche disponible comercialmente ( "Geneclean, " BIO 101, Inc., La Jolla, CA) .

J^¿^¿ ¿^ El fragmento se digiere después con the endonucleasa BamHl y Xbal y después se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se liga al vector de transferencia pAcGP67A de baculovirus (Pharmingen) en los sitios BamHl y Xbal. Mediante esta ligación, se clona el ADNc de VEGF-2 en el marco con la secuencia de señal del gen gp67 de baculovirus y se localiza en el extremo 3' de la secuencia de señal en el vector. Este se designa pAcGP67A-VEGF-2. Para clonar VEGF-2 con la secuencia de señal del gen gp67 al vector pRGI para expresión, se cortan VEGF-2 con la secuencia de señal y alguna secuencia hacia el extremo 5', del plásmido pAcGP67A-VEGF-2 en el sitio Xho de endonucleasa de restricción localizada hacia el extremo 5' del ADNc de VEGF-2 y en el sitio sitio Xbal de endonucleasa de restricción con las enzimas de restricción Xhol y Xbal. Este fragmento se separa del resto del vector en un gel de agarosa al 1% y se purifica utilizando el estuche "Geneclean" . Este se denomina F2. El vector PRGI (modificación del vector pVL941) se utiliza para la expresión de la proteína de VEGF-2 utilizando el sistema de expresión de baculovirus (para una revisión véase: Summers, M.D. y Smith, G.E., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture ia.t.-¡...i.

Procedures, " Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555, (1987)). Este vector de expresión contiene al promotor fuerte de polihedrina dei virus de polihedrosis nuclear de Autógrafa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHl, Smal, Xbal, Bglll y Asp718. Un sitio para la endonucleasa de restricción Xhol se localiza hacia el extremo 5' del sitio BamHl. La secuencia entre Xhol y BamHl es la misma que la del vector PAcGp67A (estática en la cinta) r. Se utiliza el sitio de poliadenilación del virus de simio (SV)40 para la poliadenilación eficiente. Para una selección fácil del virus recombinante se inserta el gen de beta-galactosidasa de E. coli en la misma orientación que la del promotor de polihedrina seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por célula de ADN viral de tipo silvestre cotransfectado . Se pueden utilizar muchos otros vectores de baculovirus en lugar de pRGI tales como pAc373, pVL941 y pAcIMl (Luckow, V.A. y Summers, M.D., Virology 170:31-39 (1989). El plásmido se digiere con las enzimas de restricción Xbol y Xbal y después se desfosforilan utilizando fosfatasa intestinal de bovino mediante procedimientos conocidos enn la técnica. Después se aisla el ADN a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando estuche disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) . Este AND de vector se denomina V2. El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 se ligan con ADN ligasa T4. Después se transforman células HB101 de E. coli y se identifican las bacterias que contienen al plásmido (pBac gp67-VEGF-2) con el gen de VEGF-2 utilizando las enzimas BamHl y Xbal. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante determinación de secuencia de ADN. Se cotransfectan 5 mg del plásmido pBac gp67-VEGF-2 con 1.0 mg de un baculovirus linealizado disponible comercialmente ( "BaculoGoldJ baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA.) utilizando el método con lipofectina (Feigner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987) ) . Se mezclan 1 mg de AND de virus BaculoGoldJ y 5 mg del plásmido pBac gp67-VEGF-2 en una cavidad estéril de una placa para microtitulación que contiene 50 ml de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, I ?AA AA LsidmM? «A *.A&¡¡-~~*. — ..... --.?a--?— .....- . . . .-»,...- .. .~ ~~ . ~*-»^*AAA~-A?c?*a*iátimíL?*Éi*? á^ áka?mm MD) . Después de esto se agregan 10 ml de Lipofectina más 90 ml de medio de Grace, se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se agrega la mezcla de cotransfección, gota a gota, a las células Sf9 de insecto 5 (ATCC CRL 1711) se siembra en una placa para cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se mece hacia atrás y hacia adelante para mezclar la solución recién agregada. La placa se incuba después durante 5 horas a 27°C. Después de 5 horas se retira la solución 10 para cotransfección de la placa y se agrega 1 ml de medio Grace para insecto complementado con suero fetal bovino al 10%. La placa se regresa a la incubadora y se continua el cultivo a 27°C durante cuatro días. Después de cuatro días se recolecta el 15 sobrenadante y se efectúa una prueba en placa similar al descrito por Summers y Smith, supra. Como una modificación se utiliza un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) el cual permite el aislamiento fácil de las placas teñidas de azul. (También se 20 puede encontrar una descripción detallada de una "prueba en placa" en el manual del usuario para cultivo de células de insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, se agrega el virus a las células, las placas teñidas de azul se levantan con la punta de una pipeta de Eppendorf. Después se vuelve a suspender el agar que contiene a los virus recombinantes en un tubo de Eppendorf que contiene 200 ml de medio de Grace. El agar se retira mediante una centrifugación breve y se utiliza el sobrenadante que contiene al baculovirus recombinante para infectar células Sf9 sembradas en cajas de 35 mm. Cuatro días después se cosechan los sobrenadantes de estas cajas de cultivo y después se almacenan a 4°C. Se cultivan células Sf9 en medio de Grace complementado con FBS al 10% inactivado con calor. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V-gp67-VEGF-2 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1. Seis horas después se retira el medio y se remplaza con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg) . 42 horas más tarde se agregan 5 mCi de 35S-metionina y 5 mCi de 35S-cisteína (Amersham) . Las células se incuban durante otras 16 horas antes que se cosechen mediante centrifugación y las proteínas marcadas se visualizan mediante SDS-PAGE y autoradiografía. Se analiza la proteína proveniente del medio y el citoplasma de las células Sf9 mediante SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras y reductoras. Véanse las figuras 8A y 8B, respectivamente. El medio se dializa contra MES 50 mM, pH 5.8. Se obtienen precipitados después de la diálisis y se vuelven a suspender en solución de citrato de sodio 100 mM, pH 5.0. El precipitado resuspendido se analiza de nuevo mediante SDS-PAGE y se tiñe con Azul Brillante de Coomassie. Ver figura 9. También se diluye el sobrenadante del medio 1:10 en MES 50 mM, pH 5.8 y se aplica a una columna SP-650M (1.0 x 6.6 cm, Toyopearl) a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La proteína se eluye con gradientes por pasos a 200, 300 y 500 mM de NaCl. El VEGF-2 se obtiene utilizando la elución a 500 mM. Se analiza el eluato mediante SDS-PAGE en presencia o en ausencia del agente reductor, b-mercaptoetanol y se tiñe con Azul Brillante de Coomassie. Ver figura 10.

EJEMPLO 4 Expresión de proteína de VEGF-2 recombinante en células COS La expresión del plásmido, VEGF-2-HA se obtiene a partir de un vector pcDNAl/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) el origen de replicación SV40, 2) gen de resistencia a ampicilina, 3) origen de replicación de E. coli , 4) promotor de CMV seguido por una región de polienlazador, un intrón SV40 y el sitio de poliadenilación. Se clona un fragmento de ADN que codifica para el precursor completo de VEGF-2 y una marca HA fusionada en el marco hacia el extremo 3', en la región de polienlazador del vector, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante queda dirigida bajo el promotor CMV. La marca HA corresponde a un epítope obtenido de la proteína de hemaglutinina de influenza como se describió previamente (Wilson, et al., Cell 37:767, (1984)). La infusión de la marca HA a la proteína objetivo permite detectar fácilmente la proteína recombinante con un anticuerpo que reconozca al epítope de HA. A continuación se describe la estrategia de construcción del plásmido: Se construye la secuencia de ADN que codifica para VEGF-2, ATCC No. 97149, mediante PCR utilizando 2 iniciadores: un iniciador 5' (CGC GGA TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA) (SEQ ID NO: 14) que contiene un sitio BamHl seguido por 18 nucleótidos de la secuencia codificadora DE VEGF-2 iniciando desde el codón de iniciación; la secuencia 3' (CGC TCT AGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT TTG TGG TCT3') (SEQ ID NO:15) contiene las secuencias JiÍAÍi ? ? ?. i?ÍAA>:~ AMÍ^.^.A. ^^-.^A^^^ta^-^^^ complementarias para un sitio Xbal, la marca HA, un sitio Xhol, y los últimos 15 nucleótidos de la secuencia que codifica para VEGF-2 (sin incluir el codón de detención) . Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio BamHl, la secuencia codificadora seguida por un sitio Xhol para endonucleasa de restricción y la marca HA fusionada en el marco, un codón de detención para terminar la traducción adyacente a la marca HA y el sitio Xbal. El fragmento de ADN amplificado mediante PCR y el vector pcDNAI/Amp, se digieren con las enzimas de restricción BamHl y Xbal y se ligan. La mezcla para ligar se transforma en la cepa SURE de E. coli (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037) el cultivo transformado se siembra en placa sobre placas de medio con ampicilma y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN de plásmido se aisla de los transformantes y se examina mediante análisis de restricción respecto a la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de VEGF-2 recombinante, se transfeccan células COS con el vector de expresión mediante el método DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína VEGF-2-HA se detecta mediante el método de radiomarcado e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcan durante 8 horas con 35S-cisteína dos días después de la transfección. El medio de cultivos se recolecta después y las células se lisan con detergente (solución reguladora RIPA (150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0.1% de SDS, 1% de NP-40, 0.5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7.5) (Wilson, et al., Cell 37:767 (1984)). Tanto el material celular lisado como el medio de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizan en geles SDS-PAGE al 15%.

EJEMPLO 5 Efecto de la proteína VEGF-2 parcialmente purificada sobre el crecimiento de células del endotelio vascular En el día 1, se siembran células del endotelio de la vena umbilical de humano (HUVEC por sus siglas en inglés) a una densidad de 2-5xl04 células/caja de 35 mm en medio M199 que contiene 4% de suero fetal de bovino (FBS) , 16 unidades/ml de heparina, y 50 unidades/ml de complementos para crecimiento de célula del endotelio (ECGS, Biotechnique, Inc.) . En el día 2, el medio se remplaza con l«laá.- Á ?..i ..naam M199 que contiene 10% de FBS, 8 unidades/ml de heparina, proteína VEGF-2 de SEQ ID NO: 2 menos los 45 residuos de aminoácido iniciales, y se agregan (VEGF) y FGF básico (bFGF) a las concentraciones mostradas. En los días 4 y 6, el medio se remplaza. En el día 8, se determina número de células con un contador Coulter Counter (ver figura 12) .

EJEMPLO 6 Efecto de la proteína VEGF-2 purificada sobre el crecimiento de células del endotelio vascular En el día 1, se siembran células del endotelio de la vena umbilical de humano (HUVEC por sus siglas en inglés) a una densidad de 2-5xl04 células/caja de 35 mm en medio M199 que contiene 4% de suero fetal de bovino (FBS) , 16 unidades/ml de heparina, 50 unidades/ml de complementos para crecimiento de célula del endotelio (ECGS, Biotechnique, Inc.) . En el día 2, el medio se remplaza con M199 que contiene 10% de FBS, 8 unidades/ml de heparina. En este punto se agrega al medio proteína VEGF-2 purificada de SEQ ID NO : 2 menos los 45 residuos de aminoácido iniciales. En los días 4 y 6, el medio se remplaza con medio nuevo y con complementos. En el día 8, se determina número de células . iii. ,. A I .J-fe. . ita-kji con un contador Coulter Counter (ver figura 13) .

EJEMPLO 7 Expresión mediante terapia con genes Los fibroblastos se obtienen a partir de un sujeto mediante biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en medio para cultivo de tejidos y se separa en piezas pequeñas. Se colocan trozos pequeños del tejido sobre una superficie húmeda de un matraz para cultivo de tejidos, se colocan 10 piezas aproximadamente en cada matraz. El matraz se voltea hacia abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante toda la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los pedazos de tejido permanecen fijos en el fondo del matraz y se agrega medio nuevo (por ejemplo, medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y streptomicina) . El matraz se incuba después a 37°C durante una semana aproximadamente. En este momento, se agrega medio nuevo y se cambia posteriormente cada varios días. Después de otras dos semanas en cultivo, aparece una monocapa de fibroblastos. La monocapa se somete a tratamiento con tripsina y se lleva a matraces más grandes .

* -— «* Se digiere pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones de terminal larga del virus del sarcoma de múrido de Moloney, con EcoRI y HindIII y se trata posteriormente con fosfatasa de intestino de bovino. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, utilizando perlas de vidrio. El ADNc que codifica para un polipéptido de la presente invención se amplifica utilizando iniciadores para PCR que correspondan a las secuencias de extremo 5' y 3', respectivamente. El iniciador 5' contiene un sitio EcoRI y el iniciador 3' incluye además un sitio HindIII. Se agregan juntas cantidades iguales de la estructura base lineal del virus del sarcoma múrido de Moloney y de los fragmentos amplificados EcoRI y HindIII en presencia de ADN ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligar los dos fragmentos. La mezcla para ligar se utiliza después para transformar bacterias HB 101, las cuales se siembran después en placa sobre agar que contiene kanamicina con el propósito de confirmar que el vector contiene insertado en forma apropiada el gen de interés . Se cultivan las células de empacamiento anfotrópicas pA317 o GP+aml2 en cultivo de tejidos hasta una densidad confluente en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de bovino (CS) , penicilina y streptomicina . El vector MSV que contiene al gen se agrega después al medio y las células de empacamiento se transducen con el vector. Las células de empacamiento ahora producen partículas virales infecciosas que contienen al gen (las células de empacamiento ahora se conocen como células productoras) . Se agrega medio nuevo a las células productoras transducidas, y el medio se cosecha después a partir de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro millipore para eliminar las células productoras desprendidas y este medio se utiliza después para infectar las células de fibroblasto. Se retira el medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y se reemplaza rápidamente con el medio proveniente de las células productoras. Este medio se elimina y se reemplaza con medio nuevo. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador que se pueda seleccionar, tales como los marcadores i -S ii 4I, A neo o his . Los fibroblastos manipulados genéticamente se inyectan en el hospedero, ya sea solos o después de haberse desarrollado hasta confluencia en microesferas de vehículo cytodex 3. Ahora los fibroblastos producen el producto de la proteína .

EJEMPLO 8 Expresión de ARNm de VEGF-2 en tejidos de feto y de adulto humano Diseño experimental Se efectúa análisis Northern Blot para examinar los niveles de expresión de ARNm de VEGF-2 en tejidos fetales y adultos de humano. Se marca una sonda de ADNc que contiene la secuencia de nucleótido completa de la proteína VEGF-2 con P32 utilizando el sistema de marcación de ADN rediprime™ (Amersham Life Science) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. Después de marcar, la sonda se purifica utilizando una columna CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), de conformidad con el protocolo No. PT1200-1 del fabricante. La sonda marcada purificada se utiliza después para examinar diversos tejidos de humano respecto a la expresión de ARNm de VEGF-2. Se obtiene de Clontech un un Northern blot de Tejidos Múltiples (MTN por sus siglas en inglés) que contiene diversos tejidos de humano (riñon fetal, pulmón fetal, hígado fetal, cerebro, riñon, pulmón, hígado, bazo, timo, médula ósea, testículos, placenta y músculo esquelético) . El blot de MTN se examina con la sonda marcada utilizando la solución para hibridación ExpressHyb™ (Clontech) de conformidad con el protocolo No. PT1190-1 del fabricante. Después de la hibridación y el lavado, el blot se expone a una película a -70°C durante toda la noche, con una pantalla intensificadora y se revela de conformidad con procedimientos estándar.

Resultados La expresión de ARNm de VEGF-2 es abundante en músculo liso vascular y en varios tejidos altamente vascularizados . VEGF-2 se expresa en niveles significativamente más altos en los tejidos asociados con las actividades hematopoyética o angiogénica, es decir riñon fetal, pulmón fetal, médula ósea, placenta bazo y tejido pulmonar. El nivel de expresión de VEGF-2 es bajo en riñon de adulto, hígado fetal, hígado adulto, testículos; y casi lA.it, , no se detecta en cerebro fetal y en cerebro adulto (ver figura 14) . En células cultivadas primarias, la expresión de ARNm de VEGF-2 es abundante en células de músculo liso vascular y en células de fibroblasto dérmicas, pero es mucho menor en las células del endotelio de la vena umbilical de humano (ver figura 15) . Este patrón de distribución de ARNm es muy similar al de VEGF.

EJEMPLO 9 Construcción de mutantes por deleción en los extremos amino terminal y carboxi terminal Para identificar y analizar los polipéptidos de VEGF-2 biológicamente activos, se construye un panel de mutantes por deleción utilizando el vector de expresión pHE4a. 1. Construcción de VEGF-2 T103-L215 en pHE4a Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF- 2 T103-L215 (aminoácidos 103 a 215 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) en el vector de expresión de proteína de E. coli, pHE4a, se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF-2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' (Nde I/START y 18 nt de la secuencia codificadora) : 5' -GCA GCA CAT ATG ACÁ GAA GAG ACT ATA AAA-3' (SEQ ID NO: 19) . Iniciador 3' (Asp718, STOP, y 15 nt de la secuencia codificadora) : 5'- GCA GCA GGT ACC TCA CAG TTT AGA CAT GCA- 3' (SEQ ID NO: 20) . El iniciador 5' antes descrito (SEQ ID NO:19), incorpora un sitio de restricción Ndel y el iniciador 3' antes descrito (SEQ ID NO: 20) incorpora un sitio de restricción Asp718. El iniciador 5' (SEQ ID NO:19) también contiene una secuencia ATG adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, mientras que el iniciador 3' (SEQ ID NO: 20) contiene un codón de detención (utilizado en forma preferente en E. coli) adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 el cual asegura la terminación correcta de la traducción en E. coli. Se realiza la reacción en cadena de polimerasa j ,- A¡:A.Á. A..ÍS ÍAA..Í^.. íá&t?á - .4. **.~ ._ -~- ..A¡AA¿Aí^^&aAilm^^^ ^^A?? ,i utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419 en SEQ ID NO: 18) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con Ndel y Asp718 y se subclona en el vector de expresión pHE4a digerido con Ndel/Asp718. 2. Construcción de VEGF-2 T103-R227 en pHE4a Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF-2 T103-R227 (aminoácidos 103 a 227 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) en el vector de expresión de proteína de E. coli, pHE4a, se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF-2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' (Nde I/START y 18 nt de la secuencia codificadora) : 5' -GCA GCA CAT ATG ACÁ GAA GAG ACT ATA AAA-3' (SEQ ID NO: 19) . Iniciador 3' (Asp718, STOP, y 15 nt de la secuencia codificadora) : 5' -GCA GCA GGT ACC TCA ACG TCT AAT AAT GGA-3' (SEQ i£¿ «jk s a*¡LJÍ*?. t,4ÍiaÍMlatt« ID NO: 21) . En el caso de los iniciadores antes descritos, se incorpora un sitio de restricción Ndel o Asp718 en los iniciadores 5' y 3 ', respectivamente . El iniciador 5' (SEQ ID NO: 19) también contiene una secuencia ATG adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, mientras que el iniciador 3' (SEQ ID NO: 21) contiene un codón de detención (utilizado en forma preferente en E. coli) adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 el cual asegura la terminación correcta de la traducción en E. coli. Se realiza la reacción en cadena de polimerasa utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419 en SEQ ID NO: 18) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con Ndel y Asp718 y se subclona en el vector de expresión pHE4a digerido con Ndel/Asp718. xS^^ ^^^ á& te i?**,. * 44.-4^,.-. *.aii . t „ u ., ¿ ¿ ..^,¿ ¿££¿^¿^,-^4-^^^ í j -frtt¿ ¡ 3. Construcción de VEGF-2 T103-L215 en pA2GP En este ejemplo ilustrativo, se utiliza el vector de lanzadera pA2 Gp de plásmido para insertar el ADN clonado que codifica para la proteína VEGF-2 con deleción en los extremos N-terminal y C-terminal (aminoácidos 103-215 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18), en un baculovirus para expresar la proteína VEGF-2 con deleción en los extremos N-terminal y C-terminal, utilizando un líder de baculovirus y métodos estándar como los descritos en Summers, et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, " Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555, (1987)). Este vector de expresión contiene al promotor fuerte de polihedrina del virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por el péptido de señal secretora (líder) de la proteína gp67 de baculovirus y los sitios de restricción convenientes tales como BamHl, Xbal, y Asp718. Se utiliza el sitio de poliadenilación del virus de simio 40 ("SV40") para la poliadenilación eficiente. Para una selección fácil del virus recombinante, el plásmido contiene el gen de beta-galactosidasa de E. coli bajo control de un promotor de Drosophila débil en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes l*tA. * -L ~ *t.~. **-*-~- ~..... A ».,¿.,- .4-,-.4i4 i»L,A, - w^-»«-^-*-<^'-«*?-«-Jto-a-«M insertados están flanqueados en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por célula de ADN viral de tipo silvestre para generar virus viables que expresen al polipéptido clonado. Se pueden utilizar muchos otros vectores de baculovirus en lugar del vector anterior, tales como pAc373, pVL941 y pAcIMl, como apreciará un experto en la técnica, en tanto que la construcción provea señales localizadas en forma apropiada para la transcripción, traducción, secreción y similares, incluyendo una señal de péptido y un AUG en marco según se requiera. Tales vectores se describen, por ejemplo, en Luckow, et al., Virology 170:31-39 (1989). Se amplifica la secuencia de ADN que codifica para la proteína VEGF-2 sin 102 aminoácidos en el extremo N- terminal y sin 204 aminoácidos en el extremo C-terminal en la figura 1, utilizando iniciadores de ollgonucleótido para PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. El iniciador 5' tiene la secuencia 5' -GCA GCA GGA TCC CAC AGA AGA GAC TAT AAA- 3' (SEQ ID NO: 22) que contiene el sitio BamHl para enzima de restricción (en negritas) seguido por 1 nt espaciador para permanecer en marco con el péptido de señal provisto por el vector, y 17 nt de las bases de la secuencia que codifica para la proteína VEGF-2.

El iniciador 3' tiene la secuencia 5N-GCA GCA TCT AGA TCA CAG TTT AGA CAT GCA-3' (SEQ ID NO: 23) que contiene al sitio de restricción Xbal (en negritas) seguido por un codón de detención y 17 nucleótidos complementarios a la secuencia codificadora 3' de VEGF-2. Las secuencias amplificadas se aislan a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un estuche disponible comercialmente ( "Geneclean" , BIO 101, Inc., La Jolla, CA) . El fragmento se digiere después con la endonucleasa BamHl y Xbal y después se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se liga al vector de transferencia pA2 GP de baculovirus (Proveedor) en los sitios BamHl y Xbal. Mediante esta ligación, se clona el .ADNc de VEGF-2 que representa la proteína VEGF-2 con deleción en los extremos N-terminal y C-terminal (aminoácidos 103-215 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) en marco con la secuencia de señal del gen GP de baculovirus y se localiza en el extremo 3' de la secuencia de señal en el vector. Este se designa pA2GPVEGF-2.T103-L215. 4. Construcción de VEGF-2 T103-R227 en pA2GP Se amplifica la secuencia de ADNc que codifica para la proteína VEGF-2 sin 102 aminoácidos en el extremo N- terminal y sin 192 aminoácidos en el extremo C-terminal en la figura 1 (es decir, aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO: 18), utilizando iniciadores de oligonucleótido para PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. El iniciador 5' -GCA GCA GGA TCC CAC AGA AGA GAC TAT AAA ATT TGC TGC-3' tiene la secuencia (SEQ ID NO: 24) que contiene el sitio BamHl para enzima de restricción (en negritas) seguido por 1 nt espaciador para permanecer en marco con el péptido de señal provisto por el vector, y 26 nt de las bases de la secuencia que codifica para la proteína VEGF-2. El iniciador 3' tiene la secuencia 5N-GCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATG AAC- 3' (SEQ ID NO: 25) que contiene al sitio de restricción Xbal (en negritas) seguido por un codón de detención y 21 nucleótidos complementarios a la secuencia codificadora 3' de VEGF-2. Las secuencias amplificadas se aislan a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un estuche disponible comerclalmente ( "Geneclean" , BIO 101, Inc., La Jolla, CA) . El fragmento se digiere después con la endonucleasa BamHl y Xbal y después se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se liga al vector de transferencia pA2 GP de baculovirus (Proveedor) en los sitios BamHl y Xbal. Mediante esta ligación, se clona el ADNc de VEGF-2 que representa la proteína VEGF-2 con deleción en los extremos N-terminal y C-terminal (aminoácidos 103-227 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) en marco con la secuencia de señal del gen GP de baculovirus y se localiza en el extremo 3' de la secuencia de señal en el vector. Este se designa pA2GPVEGF-2.T103-R227. 5. Construcción de VEGF-2 en pCl Los vectores de expresión pCl y pC4 contienen al promotor fuerte (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo, 1985) ) además de un fragmento del intensificador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los sitios de clonación múltiple, por ejemplo con los sitios de corte enzimático de restricción BamHl, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además del intrón 3N, la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata. El vector pCl se utiliza para la expresión de la proteína VEGF-2. El plásmido pCl es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (No. de Acceso del ATCC 37146) . Ambos plásmidos contienen al gen para DHFR de ratón bajo el control del promotor inicial de SV40. ?m .?, A ¿AÍ»££> Z tí k.

Se pueden seleccionar células de ovario de hámster chino, u otras células que carezcan de actividad de dihidrofolato que se transfecten con estos plásmidos haciendo crecer las células en un medio selectivo (medio alfa menos MEM, Life Technologies) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes de DHFR en células resistentes a metotrexato (MTX) ha sido bien documentada (Véase por ejemplo, Alt, F. W., et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamiin, J. L. y Ma, C, Biochem et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990); Page, M.J. y Sydenham, M.A. Biotechnology 9:64-68(1991)). Las células que se hacen crecer en concentraciones cada vez mayores de MTX desarrollan resistencia al fármaco produciendo en exceso la enzima objetivo, DHFR, como resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si se liga un segundo gen al gen de DHFR, este por lo general se coamplifica y se expresa en exceso. Es la técnica más avanzada el desarrollo de líneas celulares que porten más de 1,000 copias de los genes. Posteriormente, cuando se retira el metotrexato, las líneas celulares contienen al gen amplificado integrado en su cromosoma (s) . El plásmido pCl contiene para la expresión del gen de interés un promotor fuerte de la repetición de terminal . A,.A>¿¿,A ? kÍ tß.?¡? larga (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-4470 (Marzo, 1985) ) además de un fragmento del intensificador de citomegalovirus (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Hacia el extremo 3' del promotor se encuentran los siguientes sitios de corte para enzima de restricción individual que permiten la integración de los genes: BamHl, Pvull y Nrul . Detrás de estos sitios de clonación, el plásmido contiene codones de terminación de la traducción en todos los tres marcos de lectura abiertos seguidos por el intrón 3N y el sitio de poliadenilación del gen de preproinsulina de rata. También se pueden utilizar otros promotores con eficiencia alta para la expresión, por ejemplo, el promotor de b-actina de humano, los promotores inicial o tardío de SV40 o las repeticiones de terminal larga provenientes de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI . Para la poliadenilación del ARNm también se pueden utilizar otras señales, por ejemplo, provenientes de los genes para la hormona de crecimiento de humano o para globina. También se pueden seleccionar líneas celulares estables que porten un gen de interés integrado en los cromosomas después de la cotransfección con un marcador que se pueda seleccionar tales como gpt , G418 o higromicina. Es conveniente utilizar más de un marcador que se pueda seleccionar en el inicio, por ejemplo, G418 más metotrexato. El plásmido pCl se digiere conla enzima de restricción BamHl y después se desfosforila utilizando fosfatasa intestinal de bovino mediante procedmientos conocidos en la técnica Después e aisla el vector a partir de un gel de agarosa al 1%. La secuencia de ADN que codifica para VEGF-2, No. de acceso del ATCC 97149, se construye mediante PCR utilizando dos iniciadores correspondientes a los extremos 5' y 3' del gen de VEGF-2 : el iniciador 5' (5' -GAT CGA TCC ATC ATG CAC TCG CTG GGC TTC TTC TCT GTG GCG TGT TCT CTG CTC G-3' (SEQ ID NO:26)) contiene un sitio BamHl lleno de Klenow y 40 nt de la secuencia que codifica para VEGF-2 empezando desde el codón de inicio; el iniciador 3' (5' -GCA GGG TAC GGA TCC TAG ATT AGC TCA TTT GTG GTC TTT-3' (SEQ ID NO: 27) contiene un sitio BamHl y 16 nt de la secuencia que codifica para VEGF-2 que no incluye al codón de terminación. El fragmento de ADN amplificado por PCR se aisla a partir de un gel de agarosa al 1% como se describió anteriormente y después se digiere con la endonucleasa BamHl y después se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. E fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan i?u? ia.^A??^i^A^M?^^it.^^>?iA.t. ..- ..¿..^....«....¿.- ^-..»,,*-.^^ después con .ADN ligasa de T4. Después se transforman células HB101 de E. coli y se identifica las bacterias que contienen al plásmido pCl . La secuencia y orientación del gen insertado se confirma mediante análisis de secuencia de ADN. Esta construcción se denomina pClVEF-2 6. - Construcción de pC4SigVEGF-2 -T103-L215 El plásmido pC4S?g es el plásmido pC4 (No. de acceso 209646) que contiene una porción Fc de IgG de humano así como una secuencia de señal de proteína. Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF-2 T103-L215 (aminoácidos 103 a 215 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) en pC4Sig, se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF-2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' (BamHl y 26 nt de la secuencia codificadora) : 5' -GCA GCA GGA TCC ACÁ GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GC-3' (SEQ ID NO:34) . Iniciador 3' (Xbal, STOP, y 15 nt de la secuencia codificadora) : 5 ' -CGT CGT TCT AGA TCA CAG TTT AGA CAT GCA TCG GCA i afMM G-3' (SEQ ID NO:35) . Se realiza la reacción en cadena de polimerasa utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con BamHl y Xbal y se subclona en el vector de expresión pC4Sig digerido con BamHI/Xbal. 7. Construcción de pC4SigVEGF-2-T103-R227 Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF- 2 T103-L215 (aminoácidos 103 a 215 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) en pC4Sig, se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF- 2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' (BamHl y 26 nt de la secuencia codificadora) : 5' -GCA GCA GGA TCC ACÁ GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GC-3' (SEQ ID NO:34) . Iniciador 3' (Xbal, STOP, y 15 nt de la secuencia codificadora) : 5' -GCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATG AAC-3' (SEQ ID NO: 25) Se realiza la reacción en cadena de polimerasa utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con BamHl y Xbal y se subclona en el vector de expresión pC4Sig digerido con BamHl/Xbal. 8. Construcción de pC4VEGF-2 M1-M263 El vector de expresión pC4 contiene al promotor fuerte (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo, 1985) ) además de un fragmento del mtensificador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los sitios de clonación múltiple, por ejemplo con los sitios de corte enzimático de restricción BamHl, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además del intrón 3N, la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulína de rata. En este ejemplo ilustrativo, el ADNc clonado que codifica para la proteína VEGF-2 M1-M263 (aminoácidos 1-263 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) con deleción en el extremo C-terminal, se inserta en el vector de plásmido pC4 para expresar la proteína VEGF-2 con deleción en el extremo C-terminal . Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF- 2 M1-M263 en el vector pC4 , se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF-2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' 5' -GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCT GGG CTT CTT CTC-3' (SEQ ID NO:28) . Iniciador 3' 5' -GAC TGG TAC CTT ATC ACÁ TAA AAT CTT CCT GAG CC-3' (SEQ ID NO: 29) En el caso del iniciador 5' antes descrito, se incorpora un sitio de restricción BamHl, mientras que en el caso del iniciador 3' se incorpora un sitio de restricción Asp718. El iniciador 5' también contiene 6 nt , 20 nt de la secuencia que codifica para VEGF-2, y una secuencia ATG adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, mientras que el iniciador 3' contiene 2nt, 20 nt de una secuencia que codifica para VEGF-2, y un codón de detención (utilizado en forma preferente en E. coli) adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 el cual asegura la terminación correcta de la traducción en E. coli. Se realiza la reacción en cadena de polimerasa utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con BamHl y Asp718 y se subclona en el vector de expresión de la proteína pC4 digerido con BamHl/Asp718. Esta construcción se denomina pC4VEGF-2 Ml- M263. 9. Construcción de pC4VEGF-2 M1-D311 En este ejemplo ilustrativo, el ADNc clonado que codifica para la proteína VEGF-2 M1-D311 (aminoácidos 1-311 en la figura 1 o en SEQ ID NO: 18) con deleción en el extremo C-terminal, se inserta en el vector de plásmido pC4 para expresar la proteína VEGF-2 con deleción en el extremo C- terminal . Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF- 2 M1-D311 en el vector de expresión pC4 , se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF-2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' 5' -GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCT GGG CTT CTT CTC-3' (SEQ ID NO: 30) . Iniciador 3' 5' -GAC TGG TAC CTT ATC AGT CTA GTT CTT TGT GGG- 3' (SEQ ID NO: 31) En el caso del iniciador 5' antes descrito, se incorpora un sitio de restricción BamHl, mientras que en el caso del iniciador 3' se incorpora un sitio de restricción Asp718. El iniciador 5' también contiene 6 nt , 20 nt de la secuencia que codifica para VEGF-2, y una secuencia ATG adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, mientras que el iniciador 3' contiene 2nt, 20 nt de una secuencia que codifica para VEGF-2, y un codón de detención (utilizado en forma preferente en E. coli) adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 el cual asegura la terminación correcta de la traducción en E. coli. Se realiza la reacción en cadena de polimerasa utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con BamHl y Asp718 y se subclona en el vector de expresión de la proteína pC4 digerido con BamHl/Asp718. 10. Construcción DE pC4VEGF-2 M1-Q367 En este ejemplo ilustrativo, el ADNc clonado que codifica para la proteína VEGF-2 M1-D311 (aminoácidos 1-311 en SEQ ID NO: 18) con deleción en el extremo C-terminal, se inserta en el vector de plásmido pC4 para expresar la proteína VEGF-2 con deleción en el extremo C-terminal. Para permitir la amplificación dirigida con reacción en cadena de polimerasa y la sub-clonación de VEGF- 2 M1-D311 en el vector pC4 , se sintetizaron dos iniciadores de oligonucleótido complementarios a la región deseada de VEGF-2 con la siguiente secuencia de bases: Iniciador 5' 5' -GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCT GGG CTT CTT CTC- 3' (SEQ ID NO: 32) . Iniciador 3' 5' -GAC TGG TAC CTC ATT ACT GTG GAC TTT CTG TAC ATT C-3' (SEQ ID NO: 33) En el caso del iniciador 5' antes descrito, se incorpora un sitio de restricción BamHl, mientras que en el caso del iniciador 3' se incorpora un sitio de restricción Asp718. El iniciador 5' también contiene 6 nt , 20 nt de la ^ . JESü secuencia que codifica para VEGF-2, y una secuencia ATG adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 para permitir la traducción del fragmento clonado en E. coli, mientras que el iniciador 3' contiene 2nt, 20 nt de una secuencia que codifica para VEGF-2, y un codón de detención (utilizado en forma preferente en E. coli) adyacente y en marco con la región que codifica para VEGF-2 el cual asegura la terminación correcta de la traducción en E. coli. Se realiza la reacción en cadena de polimerasa utilizando condiciones estándar bien conocidas por los expertos en la técnica y la secuencia de nucleótido para VEGF-2 maduro (aminoácidos 24-419) como la construida, por ejemplo, en el ejemplo 3 como una plantilla. El amplicón resultante se digiere con BamHl y Asp718 y se subclona en el vector de expresión de la proteína pC4 digerido con BamHl/Asp718. Esta construcción se denomina pC4VEGF-2 Ml- Q367.

EJEMPLO 10 Expresión transitoria de la proteína VEGF-2 en células COS-7 Diseño experimental La expresión de la proteína VEGF-2-HA proveniente de la construcción preparada en el ejemplo 4, se detecta mediante el método de radiomarcado e inmunoprecipitación, utilizando los métodos descritos en Harlow y colaboradores (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcan durante 8 horas con 35S-cisteína dos días después de la transfección con incubación. El medio y las células se recolectan después y las células se lavan y después se con solución reguladora RIPA con dertegente (150 mM de NaCl , 1% de NP-40, 0.1% de SDS, 1% de NP-40, 0.5% de DOC, Tris 50 mM, pH 7.5) (Wilson, et al., supra). Las proteínas se precipitan del lisado celular y del medio de cultivo con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizan mediante SDS-PAGE y autoradiografia .

Resultados Como se muestra en la figura 16, las células transfectadas con pcADNl VEGF-2HA secretan una proteína de 56 kd y una de 30 kd. La proteína de 56 kd, pero no la de 30 kd, también se detecto en los lisados celulares, pero no se detectó en los controles. Esto sugiere que la probablemente la proteína de 30 kd resulta del corte de la proteína de 56 kd. Debido a que la marca HA está en el extremo C-terminal de VEGF-2, la proteína de 30 kd debe representar la porción C-terminal de la proteína cortada, mientras que la porción N-terminal de la proteína cortada no se pudo detectar por mmunoprecipitación. Estos datos indican que la proteína VEGF-2 expresada en células de mamífero se secreta y se procesa EJEMPLO 11 Efecto estimulador del polipéptido de VEGF-2 sobre la proliferación de las células del endotelio vascular Diseño experimental La expresión de VEGF-2 es abundante en tejidos altamente vasculapzados . Por lo tanto, se examina el papel de VEGF-2 en la regulación de la proliferación de varios tipos de células del endotelio. bl^AA-f-***»*-***-..*-»1"" « JAÁ Prueba de proliferación de célula del endotelio Para evaluar la actividad mitógena de los factores de crecimiento, se efectuó la prueba colorimétrica MTS (3~ (4 , 5 -dimetiltiazol -2 -il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4- sulfofenil) 2H-tetrazolio) con el reactivo para acoplamiento de electrones PMS (metosulfato de fenazina) (CellTiter 96 AQ, Promega) . Las células se siembran en una placa de 96 cavidades (5,000 células/cavidad) en 0.1 mL de medio complementado con suero y se dejan adherir durante toda la noche. Después de debilitamiento con suero durante 12 horas en 0.5% de FBS, condiciones (bFGF, VEGF?65 o el polipéptido de VEGF-2 en 0.5% de FBS) con o sin heparina (8 U/ml) se agregan a las cavidades durante 48 horas. Se agregan 20 mg de mezcla MTS/PMS (1:0.05) por cavidad y se dejan incubando durante 1 hora a 37°C antes de medir la absorbancia a 490 nm un una lectora de placas para pruebas ELISA. Se resta la absorbancia de fondo proveniente de las cavidades de control (algo de medio, sin células) , y se efectúan siete cavidades en paralelo para cada condición. Véase, Leak et al . In Vi tro Cell . Dev. Biol . 30A:512-518 (1994) .

Resultados VEGF-2 estimula la proliferación de células del kíA, ,Á,.?,A á,í*Af£ ..- .-- t i-iJ,"-, . endotelio de la vena umbilical de humano (HUVEC) y de las células del endotelio microvascular de la dermis ligeramente (figuras 17 y 18) . El efecto estimulador de VEGF-2 es más pronunciado sobre la proliferación de células endoteliales microvasculares y del endometrio (figura 19) . Las células endoteliales del endometrio (HEEC) demuestran la respuesta más grande a VEGF-2 (96% del efecto de VEGF-2 sobre las células endoteliales microvasculares) . La respuesta de las células endoteliales microvasculares (HMEC) a VEGF-2 es de 73% en comparación con VEGF. La respuesta de HUVEC y BAEC (células endoteliales de aorta de bovino) a VEGF-2 fue sustancialmente menor a 10% y a 7%, respectivamente. La actividad de VEGF-2 varia entre las diferentes corridas de purificación diferentes, siendo el efecto estimulador sobre HUVEC de algunos de los lotes significativamente mayor que el de los otros lotes.

EJEMPLO 12 Inhibición de la proliferación de célula de músculo liso vascular inducida por PDGF La expresión de VEGF-2 es alta en células de músculo liso vascular. El músculo liso es un objetivo terapéutico importante para enfermedades vasculares, tales como la restenosis. Para evaluar los efectos potenciales de VEGF-2 sobre las células de músculo liso, se examina el efecto de VEGF-2 sobre la proliferación de célula de músculo liso de aorta de humano (HAoSMC) .

Diseño experimental Se puede medir la proliferación de HAoSMC, por ejemplo, por incorporación de BrdUrd. En breve, se transfectan células subconfluentes, inactivas cultivadas en portaobjetos de 4 cámaras con AT2-3LP marcado con CRP o FITC. Después, las células se pulsan con 10% de suero de bovino y 6 mg/ml de BrdUrd. Después de 24 horas, se efectúan los análisis de mmunocitoquímica utilizando el estuche para tinción con BrdUrd (Zymed Laboratories) . En breve, las células se incubaron con el anti -anticuerpo para BrdUrd de ratón tratado con biotina a 4 °C durante 2 horas después de exponerlas a la solución desnaturalizante y después se incubaron con el conjugado estreptavidma-peroxidasa y diammobencidina . Después de contrateñir con hematoxilina, las células se montan para examen microscópico, y se cuentan las células BrdUrd-positivas. El índice BrdUrd se calcula como L, íüí , í¡A^. un por ciento de las células BrdUrd-positivas con respecto al número total de células. Además, se realiza la detección simultánea de la tinción con BrdUrd (núcleo) y se efectúa la absorción de FITC (citoplasma) para células individuales mediante el uso concomitante de iluminación de campo brillante e iluminación de campo oscuro-fluorescente UV. Véase, Hayashida et al., J. Biol. Chem. 6 : 271 (36) : 21985- 21992 (1996) .

Resultados VEGF-2 tiene un efecto inhibidor sobre la proliferación de células de músculo liso vascular inducida por PDGF, pero por Suero fetal de bovino (FBS) (figura 20) .

EJEMPLO 13 Estimulación de la migración endotelial La migración de célula del endotelio es un paso importante implicado en la angiogénesis.

Diseño experimental Este ejemplo se utilizará para explorar la posibilidad que el polipéptido de VEGF-2 podría estimular la migración de célula del endotelio linfático. Actualmente no existen reportes publicados de tal modelo. Sin embargo, se adapta un modelo de migración de célula del endotelio vascular para utilizarlo con células del endotelio linfático de la siguiente manera: Se efectúan pruebas de migración de célula endotelial utilizando una microcámara para quimiotaxis de 48 cavidades (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD; Falk, W. , et al., J. Immunological Methods 1980;33:239-247). Se recubren filtros de policarbonato libre de polivinilpirrolidona con un tamaño de poro de 8 um (Nucleopore Corp. Cambridge, MA) con gelatina al 0.1% durante por lo menos seis horas a temperatura ambiente y se secan con aire estéril . Las sustancias de prueba se diluyen a las concentraciones apropiadas en M199 complementado con 0.25% de seroalbúmina de bovino (BSA) , y se colocan 25 ul de la dilución final se colocan en la cámara inferior del aparato de Boyden modificado. Se lavan cultivos subconfluentes , de pasaje temprano (2-6) de células HUVEC o BMEC y y se tratan con tripsina durante el tiempo mínimo requerido para lograr el desprendimiento de las células. Después de colocar el filtro entre la cámara superior e inferior, se siembran, en el compartimiento superior, 2.5 x 105 células suspendidas en 50 . *-' -•-^•-*'*fc-*'^-6--^j----- ----tt-i-4 —»n«»«»afc-s- aum ? ÍÚ étÚÁAk.k ^-- l -- »*-jM-,^J«-.i»?a«"- -A- --ul de M199 que contiene 1% de FBS. El aparato se incuba después durante cinco horas a 37°C en una cámara humedecida con 5% C02 para permitir la migración celular. Después del periodo de incubación, el filtro se retira y se raspa el lado superior del filtro con las células que no migraron con un gendarme de hule. Los filtros se fijan con metanol y se tiñen con una solución de Giemsa (Duff-Quick, Baxter, McGraw Park, IL) . La migración se cuantifica contando las células de tres campos de alta resolución aleatorios (40x) en cada cavidad y todos los grupos se efectúan por cuadruplicado.

Resultados En una prueba para examinar la migración de HUVEC utilizando una cámara para microquimiotaxis, VEGF-2 pudo estimular la migración de HUVEC (Figura 21) .

EJEMPLO 14 Estimulación de la producción de óxido nítrico por parte de las células del endotelio Se cree que el óxido nítrico liberado por el endotelio vascular es un mediador de la relajación del endotelio vascular. Por lo tanto, se puede evaluar la actividad del polipéptido de VEGF-2 determinando la producción de óxido nítrico por parte de las células endoteliales en respuesta al polipéptido de VEGF-2.

Diseño experimental El óxido nítrico se mide en placas de 96 cavidades de células del endotelio microvascular confluentes después de 24 horas de debilitamiento y de 4 horas de exposición posterior a diversos niveles de un control positivo y del polipéptido de VEGF-2. La cantidad de óxido nítrico en el medio se determina utilizando el reactivo de Griess para medir la cantidad de nitrito total después de reducir el nitrato derivado del óxido nítrico mediante la nitrato reductasa. El efecto del polipéptido de VEGF-2 sobre la liberación de óxido nítrico se examina en células HUVEC. En breve, la liberación de NO a partir de la monocapa de células HUVEC cultivada se mide con un electrodo polarigráfico específico para NO conectado a un medidor de NO (Iso-NO, World Precission Instruments Inc.) (1049). La calibración de los elementos para NO se efectúa de conformidad con la siguiente ecuación: 2KN02 +2KI +2H2S0462NO + I2 + 2H20 + 2K2S04 ¡ljtfJÉÍÍi-Í**°iÍB-*j ^ '^^--- '- -->^-i--- — - —"•- ....... «.r^..-;^.4-^.^,W.,»•,.4-^-M*^^^,4-,^,^-^- -^aA La curva de calibración estándar se obtiene agregando concentraciones graduadas de KN02 (0, 5, 10, 25, 50, 100, 250, y 500 nmol/l) en la solución para calibración que contiene KI y H2S04. El carácter específico del electrodo Iso-NO para NO se determina previamente midiendo el NO proveniente de gas NO auténtico (1050) . El medio de cultivo se retira y las células HUVEC se lavan dos veces con solución salina regulada con fosfatos de Dulbecco. Las células se bañan después en 5 ml de solución filtrada de Krebs-Henseleit en placas de 6 cavidades, y las placas con células se mantienen en un horno para portaobjetos (Lab Line Instruments Inc.) para mantener la temperatura a 37°C. La sonda del detector de NO se inserta verticalmente en las cavidades, manteniendo la punta del electrodo 2 mm por debajo de la superficie de la solución, antes de agregar las condiciones diferentes. Se utiliza S-nitroso acetil penicilamina (SNAP) como un control positivo. La cantidad de NO liberado se expresa como picomoles por cada lx 106 células del endotelio. Todos los valores reportados son promedios de cuatro a seis mediciones en cada grupo (número de cavidades de cultivo celular). Véase, Leak et al. Biochem. and Biophys . Res . Comm . 217:96-105 (1995). ,á*?A?¡** t?iá»k¿. *át¿~~..

Resultados VEGF-2 puede estimular la liberación de óxido nítrico sobre HUVEC (figura 22) hasta un nivel más alto que VEGF. Esto sugiere que VEGF-2 podría modificar la permeabilidad vascular y la dilatación de los vasos.

EJEMPLO 15 Efecto de VEGF-2 en la formación de cordón en la angiogénesis Otro paso en la angiogénesis es la formación de Cordón, marcada por la diferenciación de las células del endotelio. Esta prueba biológica mide la capacidad de las células del endotelio microvascular para formar estructuras tipo capilar (estructuras huecas) cuando se cultivan in vi tro .

Diseño experimental Se adquirieron células CADMEC (células del endotelio microvascular) en Cell Applications, Inc. como células proliferantes (pasaje 2) y se cultivaron en medio para crecimiento CADMEC de Cell Applications y se utilizaron en el pasaje 5. Para la prueba de angiogénesis in vi tro, se iÚ?A-tJ,l HHlt'"*- -"-*•—•-- ~»-*»>*»~ ->-—- 1 - ir w-rr - -?^tonl<*i *tPt( t* recubrieron las cavidades de una placa para cultivo celular de 48 cavidades con medio de factor de adhesión de Cell Applications (200 ml/cavidad) durante 30 minutos a 37°C. Las células CADMEC se sembraron en las cavidades recubiertas a una densidad de 7,500 células/cavidad y se cultivaron durante toda la noche en medio de crecimiento. El medio de crecimiento después se remplaza con solución reguladora para control que contiene 300 mg de medio de formación de cordón de Cell Applications o el polipéptido de VEGF-2 (0.1 a 100 ng/ml) y las células se cultivaron durante otras 48 hr. El número y longitudes de las cuerdas tipo capilar se cuantifican utilizando el analizador de imágenes de video Boeckeler VIA-170. Todas las pruebas se hacen por triplicado . Se utiliza VEGF (50 ng/ml) de Commercial (R&D) como un control positivo. Se utiliza b-esteradiol (1 ng/ml) como un control negativo. La solución reguladora apropiada (sin proteína) también se utiliza como un control.

Resultados Se ha observado que VEGF-2 inhibe la formación de cuerda en una forma similar a la de IFNa, el cual también estimula la proliferación de células del endotelio (figura 23) . Este efecto inhibidor podría ser un efecto secundario de una proliferación endotelial la cual es mutuamente exclusiva con el procedimiento de formación de cuerda.

EJEMPLO 16 Efecto angiogénico sobre la membrana corioalantóica de pollo La membrana corioalantóica de pollo (CAM por sus siglas en inglés) es un sistema bien establecido para examinar la angiogénesis. La formación de vasos sanguíneos en CAM se puede observar y cuantificar fácilmente. Se examina la capacidad de VEGF-2 para estimular la angiogénesis en CAM.

Diseño experimental Embriones Se utilizaron huevos fertilizados del pollo White Leghorn (Gallus gallus) y de codorniz japonesa (Coturnix coturnix) y se incubaron a 37.8°C y 80% de humedad. Se estudio la CAM diferenciada de embriones de pollo de 16 días de edad y de codorniz de 13 días de edad con los siguientes métodos .

Prueba de CAM En el día 4 de desarrollo, se hace una ventana en el cascarón de los huevos de pollo. Los embriones se inspeccionan respecto al desarrollo normal y los huevos se sellan con cellotape. Estos se siguen incubando hasta el día 13. Se cortan cubiertas Thermanox (Nunc, Naperville, IL) en discos de aproximadamente 5 mm de diámetro. Los factores de crecimiento estériles libres de sal se disuelven en agua destilada y se pipetean aproximadamente 3.3 mg/5 ml sobre los discos. Después de secar al aire, se aplican los discos invertidos sobre la CAM. Después de 3 días, los especímenes se fijan en glutaraldeído al 3% y en formaldehído al 2% y se enjuagan en solución reguladora de cacodilato de sodio 0.12 M. Estos se fotografían con a estéreomicroscopio [Wild M8] y se incrustan para cortar secciones semidelgadas y ultradelgadas como se describió anteriormente. Los controles se efectúan con discos con vehículo solos.

Resultados Estos datos demuestran que VEGF-2 puede estimular la angiogénesis en la prueba de CAM nueve veces más en comparación con el control sin tratar. Sin embargo, esta estimulación es solo del 45% del nivel de estimulación de HfHtf***-*-*"—* "»— ~-te*>-•" - - » • "-•-•«- --*•• "-*»»"- «*«*»»~ --*" t íí¿?í m..Jü ííi VEGF-2 (figura 24) .

EJEMPLO 17 Prueba de angiogénesis utilizando un implante de matrigel en ratón Diseño experimental Para establecer un modelo in vivo para angiogénesis para evaluar las actividades de las proteínas, se implantan a ratas y ratones, por vía subcutánea, discos de metilcelulosa que contienen ya sea 20 mg de BSA (control negativo) y 1 mg de bFGF y 0.5 mg de VEGF-1 (control positivo) . Aunque no parezca factible, lo discos de BSA contienen poca vascularización, mientras que los discos de control positivo presentan signos de formación de vasos. En el día 9, un ratón presentó una clara respuesta a bFGF.

Resultados Parece ser que ambas proteínas incrementan la celularidad de Matrigel por un factor de aproximadamente 2 mediante estimación visual. Se someten otros 30 ratones al mismo tratamiento y se les implanta discos que contienen BSA, bFGF y cantidades variables de VEGF-1, VEGF-2-B8 y VEGF-2-C4. Cada ratón recibe dos discos idénticos, en vez de un solo disco de control y de un solo disco experimental . Las muestras de todos los discos recuperados se someten a inmunotinción con el factor de Von Willbrand para detectar la presencia de células endoteliales en los discos, y con flk-1 y flt-4 para distinguir entre células endoteliales vasculares y linfáticas. Sin embargo, no se pudo determinar un análisis histoquímico definitivo de neovascularización y de linfoangiogénesis .

EJEMPLO 18 Rescate de isquemia en modelo de extremidad inferior de conejo Diseño experimental Para estudiar los efectos in vivo de VEGF-2 sobre la isquemia, se crea un modelo de isquemia en la extremidad posterior de un conejo mediante la eliminación quirúrgica de una de las arterias femorales como se describió previamente (Takeshita, S. et al . , Am J. Pathol 147 :1649-1660 (1995) ) . La extirpación de la arteria femoral da como resultado una propagación retrógrada de trombos y la oclusión de la arteria ilíaca externa. Por consiguiente, la sangre que fluye hacia la extremidad isquémica depende de los vasos sanguíneos colaterales que se originan de la arteria ilíaca interna (Takeshita, S. et al. J. Pathol 147:1649-1660 (1995) ) . Se deja pasar un intervalo de 10 días para la recuperación post-operatoria de los conejos y el desarrollo de vasos sanguíneos colaterales endógenos. A los 10 días después de la operación (día 0) , y después de realizar un angiograma de línea basal, la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica se transfecta con 500 mg de plásmido de expresión desnudo que codifica para el polipéptido de VEGF-2 mediante tecnología de transferencia de genes arterial utilizando un catéter de globo recubierto con hidrogel como se describe (Riessen, R. et al . Hum Gene Ther. 4:749-758 (1993); Leclerc, G. et al . J. Clin . Invest . 90 : 936 - 944(1992)). Cuando se utiliza el ADN que codifica para el polipéptido de VEGF-2 en el tratamiento, se suministra a la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica un bolo individual de 500 mg de la proteína de VEGF-2 o del control en un periodo de 1 minuto a través de un catéter de infusión. En el día 30, se miden varios parámetros en estos conejos .

Resultados Tanto la proteína VEGF-2 (figura 25, paneles superiores) como el plásmido de expresión desnudo (figura 25, paneles centrales) pueden restablecer los siguientes parámetros en la extremidad isquémica. El restablecimiento de flujo sanguíneo, puntuación angiográfica parece ser un poco más alto por la administración de 500 mg de plásmido en comparación con 500 mg de proteína (figura 25, paneles inferiores) . El grado de restablecimiento se puede comparar con el de VEGF en experimentos separados (datos no mostrados) . Un vasodilatador no pudo obtener el mismo efecto, lo que sugiere que el restablecimiento del flujo sanguíneo no es simplemente debido a un efecto de vasodilatación. (a) relación BP (figura 25a) La relación de la presión sanguínea de la presión sistólica de la extremidad isquémica con respecto a la extremidad normal; 2. Flujo Sanguíneo y Reserva de Flujo (figura 25b) FL en Reposo: flujo sanguíneo durante una condición no dilatada FL Max: flujo sanguíneo durante una condición completamente dilatada (también es una medida indirecta de ^u ¿¿¿g í*!; i .í.iA. . UU «totetüMlt-, b&¡á*¡ la cantidad de vasos sanguíneos) Reserva de Flujo se refleja por la relación de Flmax:FL en Reposo; 3. Puntuación Angiográfica (figura 25c) Esta se mide utilizando el angiograma de los vasos sanguíneos colaterales. El porcentaje de círculos en una rejilla sobrepuesta, que es dividida por las arterias opacas que la atraviesan dividido por el número total m de la extremidad de conejo, determina una puntuación; 4. Densidad capilar (figura 25d) El número de capilares colaterales determinado en secciones analizadas con microscopio de luz tomadas de las extremidades traseras. Como se discutió, VEGF-2 se procesa hasta un fragmento N-terminal y un C-termínal los cuales se copurifican. El fragmento N-terminal contiene el dominio funcional putativo intacto y podría ser el responsable de la actividad biológica.

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EJEMPLO 19 Efecto de VEGF-2 sobre la vasodilatación Como se describió anteriormente, VEGF-2 puede estimular la liberación de NO, un mediador de la dilatación del endotelio. Debido a que la dilatación del endotelio vascular es importante para reducir la presión sanguínea, se examinó la capacidad de VEGF-2 para afectar la presión sanguínea en ratas espontáneamente hipertensivas (SHR por sus siglas en inglés) . VEGF-2 ocasiona una reducción dependiente de la dosis en la presión sanguínea diastólica (figuras 26a y b) . Se presenta un declive constante en la presión sanguínea diastólica con dosis cada vez mayores de VEGF-2 lo cual consigue una significación estadística cuando se administra una dosis de 300 mg/kg. Los cambios que se observan a esta dosis no son diferentes de aquellos observados con acetilcolina (0.5 mg/kg). También se observa un descenso en la presión arterial promedio (MAP) (figuras 26c y d) . VEGF-2 (300 mg/kg) y acetilcolina reducen la MAP de estos animales SHR hasta niveles normales. Además, se administran dosis cada vez mayores (0, 10, 30, 100, 300, y 900 mg/kg) de las preparaciones B8, C5 y C4 de VEGF-2 a ratas espontáneamente hipertensivas de 13-14 .. ' Á^?^M?^ ^.^ .^^A^.,. -4.^.. ...*.,¿>. ^^^*?^^*» 8*tfr¡t~~¿**i* semanas de edad (SHR) . Los datos se expresan como el promedio +/- SEM. Los análisis estadísticos se efectúan con una prueba t por pares y la significación estadística se define como p<0.05 vs . la respuesta a la solución reguladora sola. Los estudios con VEGF-2 (preparación C5) revelan que aunque este reduce en forma significativa la presión sanguínea, la magnitud de la respuesta no es tan grande como la que se observa con VEGF-2 (preparación B8) incluso cuando se utiliza a una dosis de 900 mg/kg. Los estudios con VEGF-2 (preparación C4 ) revelan que esta preparación de proteína expresada en CHO da resultados similares a los que se observan con C5 (es decir, estadísticamente significativo pero de una magnitud mucho menor que la observada con la preparación B8) (Véase figuras 26A-D) . Como un control y debido a que los lotes C4 y C5 de VEGF-2 producen cambios menores, pero estadísticamente significativos, en la presión sanguínea, se efectúan experimentos con otra proteína expresada en CHO, M-CIF. La administración de M-CIF a dosis en el intervalo de 10-900 mg/kg no producen cambios significativos en la presión sanguínea diastólica. Se observa una reducción menor estadísticamente significativa en la presión sanguínea arterial promedio a dosis de 100 y 900 mg/kg, pero no se observa una respuesta a la dosis. Estos resultados sugieren que las reducciones en la presión sanguínea observadas con los lotes C4 y C5 de VEGF-2 fueron específicos, es decir se relacionan con VEGF-2.

EJEMPLO 20 Modelo de colgajo de piel isquémico de rata Diseño experimental Los parámetros de evaluación incluyen flujo sanguíneo de la piel, temperatura de la piel e mmunohistoquimica del factor VIII o reacción de fosfatasa alcalina del endotelio. Se estudió la expresión de la proteína de VEGF-2 , durante la isquemia de la piel utilizando hibridación in situ. El estudio en este modelo se divide en tres partes como sigue: a) piel isquémica b) heridas en piel isquémica c) heridas normales El protocolo del experimento incluye: ÍÉÉJÍIífnj, "*«*t-^ rfk,-W^,-d--¿----.w-4»--l-*«S& *i~ A?. Au?Ut?-UtAi*. A: Aaa a) levantar un colgajo de piel aleatorio con espesor completo de un solo pedículo de 3x4 cm, (colgajo miocutáneo en el lomo inferior del animal) . b) una lesión por corte (4-6 mm de diámetro) en la piel isquémica (colgajo de piel) . c) tratamiento tópico de las heridas por corte con el polipéptido de VEGF-2 (día 0, 1, 2, 3, 4 después de la lesión) en los siguientes intervalos de dosificación: lmg a lOOmg. d) recolectar los tejidos lesionados en los días 3, 5, 7, 10, 14 y 21 posteriores a la lesión para los estudios histológicos, inmunohistoquímicos, e in situ.

EJEMPLO 21 Modelo de enfermedad arterial periférica La terapia angiogénica utilizando el polipéptido de VEGF-2 es una estrategia terapéutica novedosa para obtener el restablecimiento del flujo sanguíneo alrededor de la isquemia en casos de enfermedades arteriales periféricas. jft [¿AAAaJUI-- 4.-»?. ***"»—»-* - í¿& Diseño experimental El protocolo experimental incluye : a) se liga un lado de la arteria femoral para crear músculo isquémico en la extremidad trasera, el otro lado de la extremidad trasera sirve como control . b) se suministra proteína de VEGF-2 por vía intravenosa y/o intramuscular en un intervalo de dosis de 20 mg - 500 mg, 3 veces (quizá más) por semana durante 2-3 semanas . c) se recolecta el tejido muscular isquémico después de ligar la arteria femoral a l, 2, y 3 semanas para el análisis de la expresión de la proteína de VEGF-2 e histología. También se efectúan biopsias en el otro lado de músculo normal de la extremidad trasera contralateral .

EJEMPLO 22 Modelo de enfermedad isquémica del miocardio El polipéptido de VEGF-2 se evaluó como un mitógeno potente capaz estimular el desarrollo de vasos colaterales, y de reestructurar vasos sanguíneos nuevos después de la oclusión de la arteria coronaria. Se investigó la alteración de la expresión de la proteína de VEGF-2 in SltU.

Diseño experimental El protocolo experimental incluye: a) se expone el corazón a través de una toracotomía en el lado izquierdo en la rata. Inmediatamente se obstruye la arteria coronaria izquierda con una sutura delgada (6-0) y se cierra el tórax. b) la proteína de VEGF-2 se suministra por vía intravenosa y/o intramuscular en un intervalo de dosis de 20 mg - 500 mg, 3 veces (quizá más) por semana durante 2-4 semanas . c) 30 días después de la cirugía, se retira el corazón y se corta en secciones para los análisis morfométricos e in situ. EJEMPLO 23 Modelo de curación de herida de cornea de rata Este modelo animal demuestra el efecto del polipéptido de VEGF-2 sobre la neovascularización.

Diseño experimental El protocolo experimental incluye : = . ,i...íi..4j¿ftí|M¡.r.. ,^.,t,. ,?A j?m. w A*. ?.»t?mi?~?.*Í?~l>mJÍII*- a) hacer una incisión de 1-1.5 mm de largo desde el centro de la cornea hacia la capa del estroma. b) insertar una espátula por debajo del labio de la incisión que mire hacia la esquina exterior del ojo. c) elaborar una bolsa (su base es de 1-1.5 mm desde el borde del ojo) . d) colocar un comprimido, que contiene 50 mg-5mg de VEGF-2, dentro de la bolsa. e) el tratamiento con VEGF-2 también se puede aplicar por vía tópica a las heridas de la cornea en un intervalo de dosis de 20 mg - 500mg (tratamiento diario durante cinco días) .

EJEMPLO 24 Modelos de curación de heridas en ratones diabéticos y con dificultades para los glucocorticoides Diseño experimental 1. Modelo de ratón db+/db+ diabético Para demostrar que el polipéptido de VEGF-2 puede acelerar el proceso de curación, se utilizó el modelo de curación de herida de ratones genéticamente diabéticos. El modelo de curación de heridas de espesor completo en el ratón db+/db+ es un modelo de curación de heridas impedido que está bien caracterizado, y que es clínicamente relevante y reproducible. La curación de la herida diabética depende de la formación de tejido de granulación y de la formación de epitelio nuevo en vez de la contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am.J. Pathol. 136:1235 (1990)). Los animales diabéticos tienen muchas de las situaciones características presentadas en la diabetes mellitus tipo II. Los ratones homocigotos (db+/db+) son obesos en comparación con sus equivalentes heterocigotos normales (db+/+m) . Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen una sola mutación recesiva autosómica en el cromosoma 4 (db+) (Coleman et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:283-293 (1982)). Los animales presentan polifagia, polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen niveles elevados de glucosa en sangre, niveles normales o incrementados de insulina y respuesta inmune mediada por células suprimida (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs , M. et al., Gun. Exp. Lmmunol. 51(1): 1-7 (1983); Leiter et al., Am. J. de Pathol. 114:46-55 (1985)). En estos animales se han descrito neuropatías periféricas, complicaciones del miocardio y Í?.áá*i,., ?£&£«*^ g£ ^^^^^¿¡¡^ ^^^¿¿¿^ lesiones microvasculares, engrosamiento de la membrana base y anormalidades en la filtración glomerular (Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83 (2) : 221-232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29(1): 60-67 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40 (4) :460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl): 1-6 (1982)). Estos ratones diabéticos homocigotos desarrollan hiperglucemia que es resistente a la insulina análoga a la diabetes tipo II de humano (Mandel et al.,J. Immunol . 120:1375-1377 (1978) ) . Las características observadas en estos animales sugieren que la curación en este modelo podría ser similar a la curación observada en diabetes de humano (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136:1235-1246(1990)).

Animales En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/KsJ (db+/db+) genéticamente diabéticos y sus equivalentes heterocigotos (db+/+m) no diabéticos (Jackson Laboratories) . Los animales se compraron a las 6 semanas de edad y el estudio se inicia cuando tienen 8 semanas de edad. Los animales se alojaron en forma individual y recibieron comida y agua sin restricción. Todas las manipulaciones se efectuaron utilizando técnicas asépticas. Los experimentos ¡^¿^£^^^**^*^¿^j se conducen de conformidad con las reglas y lineamientos de las siguientes instituciones: Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee y los lineamientos para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Heridas quirúrgicas El protocolo para crear las heridas se realiza de conformidad con los métodos previamente reportados (Tsuboi, R. y Rifkin, D.B.,J. Exp. Med. 172:245-25 1 (1990)). En breve, el día en el que se hacen las lesiones, los animales se anestesian con una inyección intraperitoneal de Avertina (0.01 mg/ml), 2 , 2 , 2-tribromoetanol y 2 -metil-2 -butanol disueltos en agua desionizada. Se rasura la región dorsal de los animales y la piel se lava con una solución de yodo y etanol al 70%. El área quirúrgica se seca con gaza estéril antes de ocasionar la lesión . Después se crea una herida de 8 mm de espesor completo utilizando una perforadora para tejidos Keyes. Inmediatamente después de hacer la herida la piel circundante se estira suavemente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejan abiertas durante el tiempo que dura el experimento. El tratamiento se aplican por vía tópica durante cinco días consecutivos empezando el día en que se hace la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y con esponjas de gaza. Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la cirugía y a intervalos de dos días después de ésta. El cierre de la herida se determina por medio de mediciones diarias en los días 1-5 y en el día 8. Las heridas se miden horizontalmente y verticalmente utilizando a calibrador Jameson calibrado. Se considera que las heridas están curadas si ya no se observa más el tejido de granulación y la herida está cubierta con un epitelio continuo. El polipéptido de VEGF-2 se administra utilizando un intervalo de dosis diferentes del polipéptido de VEGF-2, de 4 mg a 500 mg por herida por día durante 8 días en vehículo. Los grupos de control con vehículo recibieron 50 ml de la solución de vehículo. Los animales se sacrificaron en el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300mg/kg) . Las heridas y la piel circundante se recolectan después para los estudios de histología e inmunohistoquímica. Se colocan especímenes de la muestra en formalina al 10% neutra regulada en cassettes para tejido entre esponjas para biopsia para su procesamiento posterior.

Diseño experimental Se evaluaron tres grupos de 10 animales cada uno (5 diabéticos y 5 controles no diabéticos) : 1) control con placebo de vehículo 2) El polipéptido de VEGF-2 Medición del área lesionada y cierre El cierre de las heridas se analiza midiendo el área en los ejes vertical y horizontal y obteniendo el área cuadrada total de la herida. Se hace un estimado de la contracción estableciendo las diferencias entre el área de la herida inicial (día 0) y la que se mide después del tratamiento (día 8) . El área de la herida en el día 1 es 64mm , el tamaño correspondiente a la perforación de la piel. Los cálculos se hacen utilizando la siguiente fórmula: [área abierta el día 8] - [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1] .

Histología Los especímenes se fijan en formalina el 10% regulada y se incrustan en bloques de parafina los cuales se cortan en secciones perpendiculares a la superficie de la herida (5mm) utilizando un microtomo Reichert-Jung. Se efectúa la tinción rutinaria con hematoxilina-eosina (H&E) en las secciones transversales de las heridas disectadas. Se utiliza el examen histológico de las heridas para evaluar si el proceso de curación y la apariencia morfológica de la piel reparada se ve alterada o no por el tratamiento con el polipéptido de VEGF-2. Esta evaluación incluye la verificación de la presencia de acumulación celular, células inflamatorias, capilares, fibroblastos, formación de epitelio nuevo y madurez epidérmica (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). Un observador "ciego" utiliza un micrómetro con lente calibrada.

Inmunohistoquímica Formación de tejido epitelial nuevo Se tiñen secciones de tejido con inmunohistoquímica utilizando anti -anticuerpo para queratina de humano policlonal de conejo utilizando el sistema de detección ABC Élite. La piel de humano se utiliza como un control de tejido positivo mientras que la IgG no inmune se utiliza como un control negativo. El crecimiento de queratinocitos se determina evaluando el grado de formación de epitelio nuevo de la herida utilizando un micrómetro con lente calibrada.

Marcador de proliferación celular La célula proliferante nuclear antígeno/ciclina (PCNA) en especímenes de piel se demuestra utilizando anti- anticuerpo de PCNA (1:50) con un sistema de detección ABC Élite. El cáncer de colon de humano sirvió como un control de tejido positivo y se utiliza tejido de cerebro de humano como un control negativo. Cada espécimen incluyó una sección con omisión del anticuerpo primario y sustitución con IgG no inmune de ratón. La clasificación de estas secciones se basa en el grado de proliferación en una escala de 0-8, reflejando el lado inferior de la escala una proliferación ligera con respecto al lado superior que refleja una proliferación intensa.

Análisis estadístico Los datos experimentales se analizan utilizando una prueba t no apareada. Un valor p<0.05 se considera significativo .

B. Modelo de rata con dificultad para los esteroides La inhibición de la curación de las heridas ocasionada por los esteroides ha sido bien documentada en varios sistemas in vi tro e in vivo (Wahl, S.M. Glucocorticoides and Wound healing. en: Anti -Inflammatory Steroid Action: Basic y Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl, S.M.et al., J. Immunol . 115: 476481 (1975); Werb, Z. et al., J. Exp. Med. 147:1684-1694(1978)). Los glucocorticoides retardan la curación de heridas inhibiendo la angiogénesis, reduciendo la permeabilidad vascular (Ebert, R.H., et al. An. Intern. Med. 37:701-705 (1952)), la proliferación de fibroblastos, y la síntesis de colágeno (Beck, L.S. et al., Growth Factors. 5: 295-304(1991); Haynes, B.F. et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978)) y produciendo una reducción transitoria de los monocitos en circulación (Haynes, B.F., et al., J. Clin. Invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, S. M., "Glucocorticoids and wound healing", en: Antiinflammatory Steroid Action: Basic y Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp . 280-302 (1989) ) . La administración sistémica de esteroides para obstaculizar la curación de heridas es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck, L.S. et al., Growth Factors. ¡tiiti á ?t? fc-*-*-*-* 5:295-304 (1991); Haynes, B.F., et al., J. Clin, invest. 61: 703-797 (1978); Wahl, S. M., "Glucocorticoids and wound healing", en: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp . 280-302 (1989); Pierce, G.F. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2229-2233 (1989) ) . Para demostrar que el polipéptido de VEGF-2 puede acelerar el proceso de curación, se evaluaron los efectos de aplicaciones múltiples tópicas del polipéptido de VEGF-2 en heridas de espesor completo ocasionadas por corte en piel en ratas en las cuales se ha obstaculizado la curación por la administración sistémica de metilprednisolona.

Animales En este ejemplo se utilizaron ratas macho adultas jóvenes Sprague Dawley con un peso entre 250-300 g (Charles River Laboratories) . Los animales se compraron a las 8 semanas de edad y el estudio se inicia cuando tienen 9 semanas de edad. Los animales se alojaron en forma individual y recibieron comida y agua sin restricción. Todas las manipulaciones se efectuaron utilizando técnicas asépticas. Este estudio se efectuó de conformidad con las reglas y lineamientos de las siguientes instituciones: Human ??A?. ú.AAá ,£*á¡?, t, •"- *-***'** - - I- >^?L..1 .

Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care and Use Committee y los lineamientos para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Heridas quirúrgicas El protocolo para crear las heridas se realiza de conformidad con la sección A, anterior. El día en que se hacen las heridas, los animales se anestesian con una inyección intramuscular de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) . Se rasura la región dorsal de los animales y la piel se lava con una solución de yodo y etanol al 70%. El área quirúrgica se seca con gaza estéril antes de ocasionar la lesión. Después se crea una herida de 8 mm de espesor completo utilizando una perforadora para tejidos Keyes. Las heridas se dejan abiertas durante el tiempo que dura el experimento. Las aplicaciones de los materiales de prueba se administran por vía tópica una vez al día durante 7 días consecutivos empezando el día en que se hace la herida y posterior a la administración de metilprednisolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y con esponjas de gaza. Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la cirugía y a |^^4¿j^-j-***»^*^»Ía^4te8------»4--»-l*"-. -?iít?AA. ¡A a-fe»- **" *.&M á~>*~?a &m?a*¿b& ' intervalos de dos días después de ésta. El cierre de la herida se determina por medio de mediciones diarias en los días 1-5 y en el día 8. Las heridas se miden horizontalmente y verticalmente utilizando un calibrador Jameson calibrado. Se considera que las heridas están curadas si ya no se observa más el tejido de granulación y la herida está cubierta con un epitelio continuo. El polipéptido de VEGF-2 se administra utilizando un intervalo de dosis diferentes del polipéptido de VEGF-2, de 4 mg a 500 mg por herida por día durante 8 días en vehículo. Los grupos de control con vehículo recibieron 50 ml de la solución de vehículo. Los animales se sacrificaron en el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300mg/kg) . Las heridas y la piel circundante se recolectan después para los estudios de histología e inmunohistoquímica. Se colocan especímenes de la muestra en formalina al 10% neutra regulada en cassettes para tejido entre esponjas para biopsia para su procesamiento posterior.

Diseño experimental Se evaluaron 4 grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 sin glucocorticoide) : 1) grupo sin tratamiento 2) control con placebo de vehículo 3) grupos tratados con el polipéptido de VEGF-2 Medición del área de la herida y cierre El cierre de las heridas se analiza midiendo el área en los ejes vertical y horizontal y obteniendo el área cuadrada total de la herida. Se hace un estimado de la contracción estableciendo las diferencias entre el área de la herida inicial (día 0) y la que se mide después del tratamiento (día 8) . El área de la herida en el día 1 es 64mm2, el tamaño correspondiente a la perforación de la piel. Los cálculos se hacen utilizando la siguiente fórmula: [área abierta el día 8] - [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1] .

Histología Los especímenes se fijan en formalina al 10% regulada y se incrustan en bloques de parafina los cuales se cortan en secciones perpendiculares a la superficie de la herida (5mm) utilizando un microtomo Olympus. Se efectúa la tinción rutinaria con hematoxilina-eosina (H&E) en las secciones transversales de las heridas disectadas. Se utiliza el examen histológico de las heridas para evaluar si el proceso de curación y la apariencia morfológica de la piel reparada se ve alterada o no por el tratamiento con el polipéptido de VEGF-2. Un observador "ciego" utiliza un micrómetro con lente calibrada para determinar la distancia del espacio de la herida.

EJEMPLO 25 Fragmentos de péptido específicos para generar anticuerpos monoclonales para VEGF-2 Se generan cuatro péptidos específicos (denominados SP-40, SP-41, SP-42 y SP-43) . Estos se utilizan para generar anticuerpos monoclonales para analizar el procesamiento de VEGF-2. Los péptidos se muestran a continuación : 1. "SP-40": MTVLYPEYWKMY (aminoácidos 70-81 en SEQ ID N0 : 18 ) 2 . "SP-41 " : KSIDNEWRKTQSMPREV ( aminoácidos 120 - 136 (note la mutación C?S en la posición 131) en SEQ ID NO: 18) 3. "SP-43": MSKLDVYRQVHSIIRR (aminoácidos 212-227 en SEQ ID NO: 18) 4. "SP-43": MFSSDAGDDSTDGFHDI (aminoácidos 263-279 en SEQ ID NO: 18) .

EJEMPLO 26 Modelo de linfadema animal El propósito de este método experimental es crear un modelo de linfadema apropiado y consistente para evaluar los efectos terapéuticos del polipéptido de VEGF-2 en la linfoangiogénesis y el restablecimiento del sistema circulatorio linfático en la extremidad trasera de la rata. La efectividad se mide mediante el volumen de hinchazón de la extremidad afectada, cuantificación de la red de vasos linfáticos, proteína plasmática en sangre total e histopatología. Se observa linfaedema agudo durante 7-10 días. Quizás lo más importante, el avance crónico del edema continúa hasta por 3-4 semanas.

Procedimiento experimental Antes de iniciar la cirugía, se retira una muestra de sangre para el análisis de concentración de proteína. Se administra a ratas macho con un peso aproximado de 350 g una dosis de pentobarbital. Posteriormente, se rasuran las patas derechas desde la rodilla hasta la cadera. El área rasurada se limpia con una gaza remojada en EtOH al 70%. Se retira sangre para realizar la determinación de proteína total en suero. Las mediciones de circunferencia y volumétricas se efectúan antes de inyectar colorante en las patas después de marcar 2 niveles de medición (0.5 cm por encima del talón en un punto intermedio de la pata dorsal) . El dorso intradérmico de ambas patas izquierda y derecha se inyectan con 0.05 ml de Azul de Evan al 1%. Las mediciones de circunferencia y volumétricas se hacen después de inyectar el colorante en las patas. Utilizando la articulación de la rodilla como punto de referencia, se hace una incisión circunferencial que permite que se puedan localizar los vasos femorales. Se utilizan fórceps y hemostátos para disectar y separar los colgajos de piel. Después de localizar los vasos femorales, se localiza el vaso linfático que corre a lo largo a un lado y por debajo de los vasos. Los vasos linfáticos principales en esta área se coagulan después eléctricamente o se ligan con sutura . Utilizando un microscopio, los músculos en la parte posterior de la pierna (cerca de la semitendinosis y de los aductores) se disectan por despunte. El nodulo linfático poplíteo se ubica después. Los 2 vasos linfáticos proximales y 2 los vasos linfáticos distales que suministran sangre al nodulo poplíteo se ligan después mediante sutura. Después se retira el nodulo linfático poplíteo, junto con cualquier tejido adiposo que lo acompañe, cortando los tejidos conectivos. Se toman las precauciones necesarias para controlar cualquier sangrado ligero que resulte de este procedimiento. Después que los vasos linfáticos se obstruyen, se sellan los colgajos de piel utilizando piel líquida (Vetbond) (AJ Buck) . Las orillas de la piel separada se sellan al tejido muscular subyacente mientras que al mismo tiempo se deja un espacio de aproximadamente 0.5 cm alrededor de la pierna. La piel también se puede asegurar suturando al músculo subyacente cuando sea necesario. Para evitar la infección, los animales se alojan individualmente con malla (sin lecho) . Los animales en recuperación se inspeccionan diariamente hasta la aparición ||jj jÍaA-fcJ.-iatÉÍ*t - s^*~i>* .. del pico edematoso óptimo, el cual típicamente aparece entre los días 5-7. La meseta del pico edematoso se observa después. Para evaluar la intensidad del linfadema, se miden la circunferencia y los volúmenes de 2 2 lugares designados en cada pata antes de la operación y diariamente durante 7 días. Se determina el efecto de la proteínas plasmáticas sobre el linfadema y también se investigó si el análisis de proteína es un parámetro de prueba útil o no . Se evaluaron los pesos de ambas extremidades, las de control y las edematosas en 2 sitios. El análisis se realiza en una forma ciega . Mediciones de la Circunferencia: Bajo una cantidad breve de gas anestésico para evitar el movimiento de la extremidad, se utiliza una cinta para medir la circunferencia de la extremidad. 2 personas diferentes hacen las mediciones en el hueso del tobillo y en el dorso de la pata y después esas 2 lecturas se promedian. Se toman lecturas tanto de las extremidades de control como de las edematosas . Mediciones volumétricas: En el día de la operación, los animales se anestesian con Pentobarbital y se evalúan antes de la cirugía. Los animales se anestesian ligeramente con halotano anestésico (inmovilización rápida y rápida recuperación) para hacer las mediciones volumétricas diarias) , se rasuran ambas piernas y se marcan de la misma manera utilizando marcadores a prueba de agua en las piernas. Primero se sumergen las piernas en agua, después se sumergen en el instrumento hasta cada nivel marcado y después se miden utilizando el software para edema de Buxco (Chen/Victor) . Una persona registra los datos, mientras que la otra persona sumerge la pierna hasta el área marcada. Mediciones de proteína en plasma- sangre : Se retira sangre, se centrifuga, y se separa el suero antes de la cirugía y después al finalizar para realizar las comparaciones de proteína total y Ca2+. Comparación del peso de la extremidad: Después de extraer la sangre, se prepara el animal para la recolección de tejido. Se amputan las piernas utilizando una guillotina, después ambas piernas la del experimento y la de control se cortan en la ligadura y se pesan. Se hace una segunda pesada a medida que se desarticula la articulación tibio-calcañar y se pesa la pata. Preparaciones histológicas: Se extirpa el músculo transversal localizado por detrás del área de la rodilla (poplíteo) y se acomoda en un molde de metal, lleno con freezeGel, se sumerge en metilbutano frío, se coloca en ^^.^**M»l??¿~ae^* *u?tk,t? toiA*. I bolsas para muestra marcadas a - 80°C hasta que se corte en secciones. Después de cortar en secciones, se observa el músculo con microscopía fluorescente con respecto a los vasos linfáticos. Actualmente se están evaluando otros métodos inmuno/histológicos.

EJEMPLO 27 Método de tratamiento utilizando terapia con genes para la producción del polipéptido de VEGF-2- in vivo Otro aspecto de la presente invención es utilizar métodos de terapia con genes in vivo para tratar trastornos, enfermedades y condiciones. El método de terapia con genes se refiere a la introducción de secuencias de ácido nucleico desnudo (ADN, ARN, y ADN o ARN antisentido ) que comprenden VEGF-2 ligado en forma operable a un promotor en un animal para incrementar la expresión de VEGF-2. Tal terapia con genes y técnicas y métodos de suministro se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, WO90/11092, W098/11779; patente E.U.A. No. 5693622, 5705151, 5580859; Tabata H. et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35 (3 ): 470-479 , Chao J et al. (1997) Pharmacol. Res. 35 (6) : 517-522 , Wolff J.A. (1997) Neuromuscul . Disord. 7 (5) : 314-318, Schwartz B. et al. (1996) t&? ,£.? . * & l?í lk i ÍAk. l,, ,^Má*t^^ A..,. A «.r^...*^--.*.^-^»*^ Gene Ther. 3 (5) : 405-411 , Tsurumi Y. et al. (1996) Circulation 94 (12 ): 3281-3290 (incorporados en la presente invención para referencia) . Las construcciones de polinucleótido de VEGF-2 se 5 pueden suministrar mediante cualquier método que suministre materiales inyectables a las células de un animal, tales como, inyección en el espacio intersticial de tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado, intestinos y similares). Además, las construcciones de polinucleótido se 10 pueden suministrar en un líquido o vehículo acuoso farmacéuticamente aceptable. El término polinucleótido "desnudo" , ADN o ARN, se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de suministro que actúe para ayudar, promover, o facilitar 15 la entrada en la célula, incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposoma, lipofectina o agentes precipitantes y similares. Sin embargo, el polinucleótido de VEGF-2 también se puede suministrar en formulaciones de liposoma (tales como aquellas enseñadas en 20 Felgner P.L. et al. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139 y Abdallah B. et al. (1995) Biol. Cell 85(1) :l-7) las cuales se pueden preparar mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las construcciones de vector de VEGF-2 utilizadas en el método de terapia con genes de preferencia son construcciones que no se integraran en el genoma del hospedero ni contienen tampoco secuencias que permitan la replicación. Se puede utilizar cualquier promotor fuerte conocido por los expertos en la técnica para activar la expresión de ADN. A diferencia de otras técnicas de terapias con genes, una de las ventajas principales de introducir secuencias de ácido nucleico desnudo en las células objetivo es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótido en las células. Los estudios han demostrado que se pueden introducir secuencias de ADN o replicante en las células para proveer la producción del polipéptido deseado durante periodos de hasta seis meses. De preferencia, la construcción de VEGF-2 comprenderá un polinucleótido de VEGF-2 insertado en forma operable en el plásmido pVGI.l, como se ilustra en la figura 30. La construcción de plásmido pVGI .1 , cuya secuencia se muestra en la figura 31A-G, se depositó el 3 de julio de 2000 en el Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC) , 10801 Umversity Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y tiene el número de depósito ATCC PTA-2185. Esta construcción de vector de polinucleótido de VEGF-2 se puede suministrar a ,:4...» t^Ai.SL??.z^í los tejidos, utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos anteriormente, de preferencia mediante inyección directa utilizando polinucleótido desnudo, para aplicaciones terapéuticas, Tales usos incluyen la promoción de angiogénesis en el tratamiento de un número de enfermedades y condiciones, como se describe en la sección de "Usos Terapéuticos" anterior, y en cualquier otra parte en la presente invención. Los usos preferidos de esta construcción incluyen el tratamiento de isquemia de extremidad crítica y cardiopatías coronarias. La construcción de VEGF-2 se puede suministrar al espacio intersticial de los tejidos dentro de un animal, incluyendo los tejidos de músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestinos, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende el fluido intercelular, la matriz de mucopolisacárido entre las fibras reticulares de los tejidos de los órganos, las fibras elásticas en las paredes de los vasos o de las cámaras, las fibras de colágeno de los tejidos fibrosos, o esa misma matriz dentro del tejido conectivo que envuelve las células _ 44 ,~? ... ^Al.e ? iS*<kit^& &?jál. ¡U~4t*Ml¡Ít¿*m i del músculo o en la laguna del hueso. Del mismo modo es el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los canales linfáticos. Estos se pueden suministrar en forma conveniente mediante inyección en los tejidos que comprenden estas células. Estos de preferencia se suministran a y se expresan en células persistentes que no presentan división las cuales están diferenciadas, aunque el suministro y expresión se puede lograr en células no diferenciadas o en células diferenciadas en una forma menos completa, tales como, por ejemplo, células madre de la sangre o fibroblastos de la piel . De preferencia se suministran mediante inyección directa en la arteria. Para la inyección de polinucleótido desnudo, una cantidad de dosis efectiva de ADN o ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 g/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. De preferencia la dosis será de aproximadamente 0.005 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg y más preferido de aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg. Desde luego, como el experto en la técnica apreciará, esta dosis puede variar de conformidad con el sitio de inyección en el tejido. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis apropiada y efectiva de la secuencia de ácido nucleico y podría depender de la condición que está siendo tratada y de la vía de administración. La vía de administración preferida es mediante la vía de administración parenteral de inyección en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, también se pueden utilizar otras vías de administración parenteral, tales como, inhalación de una formulación en aerosol en particular para el suministro al tejido de los pulmones o de los bronquios, garganta o las membranas mucosas de la nariz. Además, las construcciones de ADN de VEGF-2 desnudo se pueden suministrar a las arterias durante la angioplastía a través del catéter utilizado en el procedimiento. Se determinan los efectos dosis-respuesta de la construcción de polinucleótido de VEGF-2 inyectado en las arterias in vivo como sigue. Se preparan plantillas apropiadas de ADN que codifica para el polipéptido de VEGF-2 para producir ARNm que codifica para el polipéptido de VEGF- 2 se prepara de conformidad con una metodología de ADN recombinanrte. El ADN de la plantilla, el cual puede ser ya sea circular o lineal, se utiliza ya sea como ADN desnudo o Como ADN complejado con liposomas. Después se inyectan los músculos del cuadríceps con diversas cantidades del ADN de la plantilla.

Se induce quirúrgicamente la isquemia de extremidad posterior en conejos, como se describe en el ejemplo 18. Inmediatamente después de esto, se inyectan cinco sitios diferentes en el aductor (2 sitios) , largo medio (2 sitios) y en músculo semimembranoso (1 sitio) en forma directa con ADN de plásmido que codifica para VEGF-2 utilizando una jeringa de 3 ml y una aguja de calibre 2 que se hace avanzar a través de una pequeña incisión en la piel. Después se cierra la piel utilizando nylon 4.0. Se determina la capacidad de rescatar la extremidad trasera de la isquemia midiendo el número de capilares en secciones para microscopio de luz tomadas de las extremidades tratadas, se comparan con extremidades isquémicas de conejos no tratados, se mide la presión sanguínea de la pantorrilla y se hace la medición íntra-arteríal con alambre guiado de Doppler de la velocidad de flujo (Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93:662-670 (1994). Se pueden utilizar los resultados de los experimentos anteriores en conejos para extrapolar regímenes de dosis adecuados y otros parámetros de tratamiento en humanos y en otros animales utilizando ADN desnudo para el polinucleótido de VEGF-2. klL?.*á ? .?AJt*ÍAÍ.i*?< ??*?»?a?. ???Í.^ „ *.. _., ,> -. --. -.. „...^,iu,.»^.,-a___^ u^fcc»^^ EJEMPLO 28 Método de tratamiento utilizando terapia con genes - ex vivo Un método de terapia con genes transplanta fibroblastos, los cuales pueden expresar los polipéptidos de VEGF-2, en un paciente. En general, los fibroblastos se obtienen a partir de un sujeto mediante biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en medio para cultivo de tejidos y se separa en piezas pequeñas. Se colocan trozos pequeños del tejido sobre una superficie húmeda de un matraz para cultivo de tejidos, se colocan 10 piezas aproximadamente en cada matraz. El matraz se voltea hacia abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante toda la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se invierte y los pedazos de tejido permanecen fijos en el fondo del matraz y se agrega medio nuevo (por ejemplo, medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina) . Los matraces se incuban después a 37°C durante una semana aproximadamente. En este momento, se agrega medio nuevo y se cambia posteriormente cada varios días. Después de otras dos semanas en cultivo, aparece una monocapa de fibroblastos. La monocapa se somete a tratamiento con tripsina y se lleva a matraces más grandes. Se digiere pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones de terminal larga del virus del sarcoma de múrido de Moloney, con EcoRI y HindIII y se trata posteriormente con fosfatasa de intestino de bovino. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, utilizando perlas de vidrio. El ADNc que codifica para los polipéptidos de VEGF-2 se puede amplificar utilizando iniciadores para PCR que correspondan a las secuencias de extremo 5' y 3', respectivamente como se indica en el Ejemplo 1. De preferencia, el iniciador 5' contiene un sitio EcoRI y el iniciador 3' incluye un sitio HindlII. Se agregan juntas cantidades iguales de la estructura base lineal del virus del sarcoma múrido de Moloney y de los fragmentos amplificados EcoRI y HindIII en presencia de ADN ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligar los dos fragmentos. La mezcla para ligar se utiliza después para transformar la bacteria HB 101, las cuales se siembran después en placa sobre agar que contiene kanamicina con el propósito de confirmar que el vector contiene insertado en forma apropiada a VEGF-2. Se cultivan las células de empacamiento Í???A?i f* " ' -t**-**^^' ¡jüfei anfotrópicas pA317 o GP+aml2 F en cultivo de tejidos hasta una densidad confluente en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de bovino (CS) , penicilina y streptomicina. El vector MSV que contiene al gen que codifica para el polipéptido de VEGF-2 se agrega después al medio y las células de empacamiento se traducen con el vector. Las células de empacamiento ahora producen partículas virales infecciosas que contienen al gen que codifica para el polipéptido de VEGF-2 (las células de empacamiento ahora se conocen como células productoras) . Se agrega medio nuevo a las células productoras transducidas, y el medio se cosecha después a partir de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio agotado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a través de un filtro millipore para eliminar las células productoras desprendidas y este medio se utiliza después para infectar las células de fibroblasto. Se retira el medio de una placa sub-confluente de fibroblastos y se reemplaza rápidamente con el medio proveniente de las células productoras. Este medio se elimina y se reemplaza con medio nuevo. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces es i É necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador que se pueda seleccionar, tales como los marcadores neo o his. Una vez que los fibroblastos han sido infectados en forma eficiente, estos se analizan para determinar si se produce o no la proteína de VEGF-2. Después, los fibroblastos manipulados genéticamente se transplantan en el hospedero, ya sea solos o después de haberse desarrollado hasta confluencia en microesferas de vehículo cytodex 3.

EJEMPLO 29 Método de tratamiento utiliando Recombinación homologa con terapia de genes Otro método de terapia con genes de conformidad con la presente invención implica asociar en forma operable la secuencia endógena de VEGF-2 con un promotor mediante recombinación homologa como se describe, por ejemplo, en la patente E.U.A. No. 5,641,670, expedida el 24 de junio de 1997; Publicación Internacional No. WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre de 1996; Publicación Internacional No. WO 94/12650, publicada el 4 de agosto de 1994; Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:8932-8935 (1989); y -«- A ?.Á ásÁ*Msh?*¡-' -"- «ja-3fcJfc*<- ** ??A*- m?~A>. -^^^^Mii-^'Ba*-aA»M'' Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). Este método implica la activación de un gen que está presente en las células objetivo, pero que no se expresa en las células, o se expresa a un nivel menor que el deseado. Se elaboran construcciones de polinucleótido las cuales contienen una secuencia de promotor y una secuencia para seleccionar objetivos, las cuales son homologas con la secuencia 5' no codificadora de VEGF-2 endógeno, flanqueando al promotor. La secuencia para seleccionar objetivos estará lo suficientemente cerca al extremo 5' del VEGF-2 de modo que el promotor estará ligado en forma operable a la secuencia endógena después de la recombinación homologa. Las secuencias de promotor y para seleccionar objetivos se pueden amplificar utilizando PCR. De preferencia, el promotor amplificado contiene sitios para la enzima de restricción distintos en los extremos 5' y 3'. De preferencia, el extremo 3' de la primera secuencia para seleccionar objetivos contiene el mismo sitio para enzima restricción que el extremo 5' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia para seleccionar objetivos contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3' del promotor amplificado. La secuencia de promotor amplificado y la secuencia para seleccionar l? .J.*i .Í-??iá?kk objetivos amplificada se digieren con las enzimas de restricción apropiadas y se tratan posteriormente con fosfatasa de intestino de bovino. La secuencia de promotor digerida y la secuencia para seleccionar objetivos digerida se agregan juntas en presencia de ADN ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para ligar los dos fragmentos. La construcción se fracciona por tamaños en un gel de agarosa y después se purifica mediante extracción con fenol y precipitación con etanol. En este ejemplo, las construcciones de polinucleótido se administran como polinucleótidos desnudos mediante electroporación. Sin embargo, las construcciones de polinucleótido también se pueden administrar con agentes que faciliten la transfección, tales como liposomas, secuencias virales, partículas virales, agentes precipitantes, etc. Tales métodos de suministro son conocidos en la técnica. Una vez que las células se transfectan, se lleva a cabo la recombinación homologa lo que da como resultado que el promotor quede ligado en forma operable a la secuencia de VEGF-2 endógena. Esto da como resultado la expresión de VEGF-2 en la célula. La expresión se puede detectar mediante tinción inmunológica, o cualquier otro método conocido en la técnica . l? ?éA ??á»i?Á?i»A?,?^<^^'"-«í- -* *~*<-¡~~*-~>-- ,-.-.».J..-..-T rtt^,tftí^f' rHlPFft-' Se obtienen fibroblastos a partir de un sujeto mediante biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en DMEM + 10% de suero fetal de bovino. Los fibroblastos que se encuentran en la fase exponencial de crecimiento o en los inicios de la fase estacionaria se tratan con tripsina y se enjuagan de la superficie de plástico con medio nutritivo. Se retira una alícuota de la suspensión celular durante el conteo, y las células remanentes se someten a centrifugación. Se aspira el sobrenadante y el comprimido se vuelve a suspender en 5 ml de solución reguladora para electroporación (HEPES 20 mM pH 7.3, 137 mM de NaCl , 5 mM de KCl, 0.7 mM de Na2HP04 , 6 mM de dextrosa) . Las células se vuelven a centrifugar, el sobrenadante se aspira, y las células vuelven a suspender en solución reguladora para electroporación que contiene 1 mg/ml de seroalbúmina de bovino acetilada. La suspensión celular final contiene aproximadamente 3X106 células/ml. La electroporación se debe efectuar inmediatamente después de volver a suspender. Se prepara ADN de plásmido de conformidad con técnicas estándar. Por ejemplo, para construir un plásmido para dirigirlo al locus en el cual se localiza el gen que codifica para la proteína de VEGF-2, se digiere el plásmido pUC18 (MBI Fermentas, Amherst, NY) con HindIII. Se amplifica el promotor de CMV mediante PCR con un sitio Xbal en el extremo 5' y un sitio BamHl en el extremo 3' . Se amplifican dos secuencias que no codifican para la proteína de VEGF-2 mediante PCR: una secuencia que no codifica para la proteína de VEGF-2 (fragmento 1 de proteína de VEGF-2 ) se amplifica con un sitio HindIII en el extremo 5' y un sitio Xba en el extremo 3'; la otra secuencia que no codifica para la proteína de VEGF-2 (fragmento 2 de proteína de VEGF-2 ) se amplifica con un sitio BamHl en el extremo 5' y un sitio HindIII en el extremo 3'. El promotor de CMV y los fragmentos de proteína de VEGF-2 se digieren con las enzimas apropiadas (promotor de CMV-Xbal y BamHl; fragmento 1 de proteína de VEGF-2 - Xbal; fragmento 2 de proteína de VEGF-2 -BamHl) y se ligan juntos. El producto ligado resultante se digiere con HindIII, y se liga con el plásmido pUC18 digerido con HindIII. Se agrega ADN de plásmido a una celda estéril con un espacio de electrodo de 0.4 cm (Bio-Rad). La concentración final de ADN es por lo general de por lo menos 120 µg/ml. Después se agregan 0.5 ml de la suspensión celular (que contiene aproximadamente 1.5 X 106 células) a la celda, y la suspensión celular y las soluciones de ADN se mezclan suavemente. La electroporación se realiza con un .. í?-i¡¡AmAi.^,.. Máta^mA aparato Gene-Pulser (Bio-Rad) . La capacitancia y el voltaje se ajustan a 960 µF y 250-300 voltios, respectivamente. A medida que el voltaje se incrementa, disminuye la supervivencia celular, pero el porcentaje de células sobrevivientes que incorporan en forma estable el ADN introducido en su genoma se incrementa en forma dramática. Dados estos parámetros, se debe observar un tiempo de pulsación de aproximadamente 14-20 mseg. Las células sometidas a electroporación se mantienen a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos, y el contenido de la celda se retira después suavemente con una pipeta de transferencia estéril . Las células se agregan directamente a 10 ml de medio nutritivo precalentado (DMEM con 15% de suero de bovino) en una caja de 10 cm y se incuban a 37°C. Al día siguiente, el medio se aspira y se reemplaza con 10 ml de medio nuevo y se incuba durante 16-24 horas adicionales. Los fibroblastos manipulados genéticamente se inyectan después en el hospedero, ya sea solos o después de haberse cultivado hasta confluencia en microesferas de vehículo cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto proteínico.

EJEMPLO 30 VEGF-2 en animales transgénicos Los polipéptidos de VEGF-2 también se pueden expresar en animales transgénicos. Se pueden utilizar animales de cualquiera de las especies, incluyendo, pero no limitándose a, ratones, ratas, conejos, hámsters, cobayos, cerdos, micro-cerdos, cabras, ovejas, vacas y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos, y chimpancés para generar animales transgénicos. En una modalidad específica, se utilizan técnicas descritas en la presente invención o conocidos de alguna otra manera en la técnica, para expresar los polipéptidos de la invención en humanos, como parte de un protocolo de terapia con genes. Se puede utilizar cualquier técnica conocida en el campo para introducir el transgen (es decir, los polinucleótidos de la invención) en animales para producir las líneas fundadoras de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen, pero no se limita a, microinyección pronuclear (Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-698 (1994); Carver et al., Biotechnology (NY) 11:1263-1270 (1993); Wright et al., Biotechnology (NY) 9:830-834 (1991); y Hoppe et al., Patente E.U.A. No. 4,873,191 (1989)); transferencia de genes mediada por retrovirus en líneas germinales (Van der Putten et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 82:6 148-6152 (1985)), blastocistos o embriones; selección de genes como objetivo en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell 56:313-321 (1989)); electroporación de células o embriones (Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-18 14 (1983)); introducción del polinucleótido de la invención utilizando una pistola de genes (véase, por ejemplo, Ulmer et al., Science 259: 1745 (1993); introducción de construcciones de ácido nucleico en células madre pluripotenciales embrionarias y transferencia de las células madre de regreso al blastocisto; y transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell 57:717-723 (1989); etc. Para una revisión de tales técnicas, véase Gordon, "Transgenic Animáis," Intl. Rev. Cytol. 115:171-229(1989), la cual se incorpora para referencia en la presente invención en su totalidad. Se puede utilizar cualquier técnica conocida en el campo para producir clones transgénicos que contiene polinucleótidos de la invención, por ejemplo, transferencia nuclear a ovocitos sin núcleo de núcleos provenientes de células embrionarias, fetales, o de adulto cultivadas inducidas a reposo (Campell et al., Nature 380:64-66 (1996); .*.. ....-^.^ t * i rnipifitmt tr iMiüi i -ríTüftWf ^- — ^^^M --Wilmut et al., Nature 385:810-813 (1997)). La presente invención provee animales transgénicos que llevan el transgen en todas sus células, así como animales que llevan el transgen an algunas, pero mo em todas sus células, es decir, animales tipo mosaio o quiméricos. El transgen puede estar integrado como un transgen individual o como copias múltiples tales como en los concatámeros, por ejemplo, tándems cabeza a cabeza o o cabeza a cola. El transgen también se puede introducir selectivamente en y activar en un tipo particular de célula siguiendo, por ejemplo, las enseñanzas de Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992)). Las secuencias reguladoras requeridas para tal activación específica de tipo celular dependerá del tipo de célula particular de interés, y será evidente para los expertos en la técnica. Cuando se desea que el transgene para el polinucleótido esté integrado en el sitio cromosómico del gen endógeno, se prefiere seleccionar los genes como objetivo. En breve, cuando se va a utilizar tal técnica, se diseñan los vectores que contiene algunas secuencias de nucleótido homologas con el gen endógeno con el propósito de integrar, mediante recombinación homologa con las secuencias cromosómicas, en y perturbar la función de la secuencia de Í ?AÁ *•*-* '»*<-» a¡gM . - .^ .«_a..q. ». 4-4- . t-tt<-----?-t*M^-«--t*-*fc nucleótido del gen endógeno. El transgen también se puede introducir en forma selectiva en un tipo particular de célula, inactivando de esta manera el gen endógeno solamente en ese tipo de células, siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Gu et al. (Gu et al., Science 265:103-106 (1994)). Las secuencias reguladoras requeridas para tal tipo de inactivación específica de célula dependerán del tipo particular de célula de interés, y será evidente para los expertos en la técnica. Una vez que se han generado los animales transgénicos, la expresión del gen recombinante se puede evaluar utilizando técnicas estándar. Se puede lograr la selección inicial mediante técnicas de análisis Southern blot o PCR para analizar tejidos animales para confirmar que se ha efectuado la integración del transgen. El nivel de expresión de ARNm del transgen en los tejidos de los animales transgénicos también se puede evaluar utilizando técnicas que incluyen, pero no se limita a, análisis Northern blot de muestras de tejido obtenidas del animal, análisis de hibridación in situ, y transcriptasa inversa-PCR (rt-PCR) . También se pueden evaluar muestras de tejido que exprese al gen transgénico mediante inmunocitoquímica o inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos para . 4», -^.».E— . m» .,4¡»^ u * ^¡AhmíJi^?itmtéis&ts ; el producto del transgen. Una vez que se producen los animales fundadores, estos se pueden reproducir sexualmente, en forma endogámica, en forma exogámica, o por entrecruzamiento para producir colonias del animal particular. Ejemplos de tales estrategias de reproducción incluyen, pero no están limitados a: cruzar externamente los animales fundadores con más de un sitio de integración con el fin de establecer líneas separadas; cruzar en forma endogámica las líneas separadas con el fin de producir compuestos transgénicos que expresen al transgen a niveles mayores debido a los efectos de la expresión aditiva de cada transgen; cruzamiento de animales heterocigotos transgénicos para producir animales homocigotos para un sitio de integración determinado con el fin de aumentar la expresión y eliminar la necesidad de seleccionar los animales mediante análisis de ADN; cruzamiento de líneas homocigotas separadas para producir líneas heterocigotas u homocigotas mezcladas; y reproducción normal para colocar al transgen en un fondo distinto que sea apropiado para un modelo experimental de interés. Los animales transgénicos de la invención tienen usos que incluyen, pero no se limitan a, sistemas de modelos animales útiles para elaborar la función biológica del polipéptido de VEGF-2, para estudiar las condiciones y/o trastornos asociados con la expresión aberrante del polipéptido de VEGF-2, y en la selección de compuestos efectivos para aliviar tales condiciones y/o trastornos.

EJEMPLO 31 Animales con VEGF-2 "fulminada" La expresión endógena del gen de VEGF-2 también se puede reducir inactivando o "fulminando (knocking out)" el gen que codifica para la proteína de VEGF-2 y/o su promotor utilizando recombinación homologa dirigida. (Por ejemplo, véase Smithies et al., Nature 3 17:230-234 (1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-5 12 (1987); Thompson et al., Cell 5:313-321(1989); cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente invención en su totalidad) . Por ejemplo, se puede utilizar un polinucleótido mutante, no funcional de la invención (o una secuencia de ADN completamente no relacionada) flanqueada por ADN homólogo con la secuencia endógena de polinucleótido (ya sea las regiones codificadoras o las regiones reguladoras del gen) , con o sin un marcador que se pueda seleccionar y/o un marcador que se pueda seleccionar negativo, para transfectar las células que expresan los polipéptidos de la invención in vivo . En otra modalidad, se utilizan técnicas conocidas en el campo para generar fulminaciones en las células que contienen, pero que no expresan al gen de interés.' La inserción de la construcción de ADN, mediante recombmación homologa dirigida, da como resultado la inactivación del gen seleccionado como objetivo. Tales métodos son particularmente apropiados en los campos agrícolas y de investigación en los cuales se pueden utilizar las modificaciones a las células madre embrionarias para generar descendencia animal con un gen inactivo seleccionado como objetivo (por ejemplo, véase Thomas & Capecchi 1987 y Thompson 1989, supra) . Sin embargo, este método se puede adaptar en forma rutinaria para ser utilizado ín humanos con la condición de que las construcciones de ADN recombinante se administren o se dirijan al sitio requerido in vivo utilizando vectores virales apropiados que serán evidentes para los expertos en la técnica. En modalidades adicionales de la invención, se administran células que están diseñadas genéticamente para expresar los polipéptidos de la invención, o en forma alternativa, que están diseñadas genéticamente para no expresar los polipéptidos de la invención (por ejemplo, ^A..Í ?.A A.A. ^AÍ... * ^ .. ^.,^....,,. ...*. ***.. ---^^.-~^*~*t>*«*t»**.**?**' knockouts)a un paciente in vivo . Tales células se pueden obtener del paciente (es decir, animal, incluyendo humano) o un donador MHC compatible y pueden incluir, pero no se limitan a, fibroblastos, células médula ósea, células de la sangre (por ejemplo, linfocitos) , adipocitos, células del músculo, células del endotelio etc. Las células se diseñan genéticamente in vi tro utilizando técnicas de ADN recombinante para introducir la secuencia que codifica para el polipéptido de la invención en las células, o en forma alternativa, para romper la secuencia codificadora y/o la secuencia reguladora endógena asociadas con los polipéptidos de la invención, por ejemplo, mediante transducción (utilizando vectores virales, y de preferencia vectores que integran el transgen en el genoma de la célula) o procedimientos de transfección, incluyendo, pero no limitándose a, el uso de plásmidos, cósmidos, YACs, ADN desnudo, electroporación, liposomas, etc. La secuencia que codifica para los polipéptidos de la invención se puede colocar bajo control de un promotor, o promotor/intensificador fuerte constitutivo o que se pueda inducir para lograr la expresión, y de preferencia secreción, del polipéptido de VEGF-2. Las células diseñadas genéticamente que expresan y de preferencia secretan los &j^ ^gg^^^HÍ& Í??Á.Á A OAÍ?ÁÍ - **~*M. polipéptidos de la invención se pueden introducir en el paciente en forma sistémica, por ejemplo, en la circulación, o por vía intraperitoneal . En forma alternativa, las células se pueden incorporar en una matriz e implantar en el cuerpo, por ejemplo, se pueden implantar fibroblastos manipulados genéticamente como parte de un injerto de piel; se pueden implantar células del endotelio diseñadas genéticamente como parte de un injerto linfático o vascular. (Véase, por ejemplo, Anderson et al. Patente E.U.A. No. 5,399,349; y Mulligan & Wilson, Patente E.U.A. No. 5,460,959 cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente invención en su totalidad) . Cuando las células que se van a administrar no son autólogas o no compatibles con MHC, estas se pueden administrar utilizando técnicas bien conocidas que eviten el desarrollo de una respuesta inmune por parte del hospedero contra las células introducidas. Por ejemplo, las células se pueden introducir en forma encapsulada la cual, aunque permite un intercambio de componentes con el entorno extracelular inmediato, no permite que las células introducidas sean reconocidas por el sistema inmune del hospedero .

Los animales "knock out" de la invención tienen usos que incluyen, pero no se limitan a, sistemas de modelos animales útiles para elaborar la función biológica del polipéptido de VEGF-2, para estudiar las condiciones y/o trastornos asociados con la expresión aberrante de la proteína de VEGF-2, y en la selección de compuestos efectivos para aliviar tales condiciones y/o trastornos. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en vista de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, dentro del campo de las reivindicaciones anexas, la invención se puede practicar en alguna otra manera de la que se describió en forma particular. La descripción completa de todas las publicaciones (incluyendo patentes, solicitudes de patente, artículos científicos, manuales de laboratorio, libros u otros documentos) citados en la presente invención quedan incorporados en la misma para referencia. Además, el Listado de Secuencias, enviado en la Solicitud Provisional No. de Serie 60/223,276, presentada el 4 de agosto de 2000, ya sea para computadora, microficha, CD-R y/o en formas de papel, queda incorporado en su totalidad en la presente invención para referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Human Genome Sciences, Inc. <120> Factor de Crecimiento Endotelial Vascular-2 <130> PF112P6PCT <150> 60/223,276 <151> 200G-0S-04 <160> 36 <170> Pate tIr. versión 3.0 <210> 1 <211> 1674 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 1 gtccttccac catgcactcg ctgggcttct tcectgtggc gtgttctctg ctcgccgcts 60 cgctgctccc gggtcctcgc gaggcgcccg ccgccgccgc cgccttcgag tccggacccg 120 acctctcgga cgcggagccc gacgcgggcg aggccacggc ttatgcaagc aaagatccgc 180 aggagcagtt acggtctgtg tccagtgtag atgaac cat gactgtactc tacccagaat 240 attggaaaat gtacaagtgt cagctaagga aaggaggctg gcaacataac agagaacagg 300 ccaacctcaa ctcaaggaca gaagagacta taaaatttgc tgcagcacat tataatacag 360 agatcttgaa aagtattgat aatgagtgga gaaagactca atgcatgcca cgggaggtgt 420 gtatagatgt ggggaaggag tttggagtcg cgacaaacac cttctttaaa cctccatgtg 480 tgtccgtcta cagatgtggg ggttgctgca atagtgaggg gctgcagtgc atgaacacca 540 gcacgagcta cctcagcaag acgttatttg aaattacagt gcctctctct caaggcccca 600 aaccagtaac aatcagtttt gccaatcaca cttcctgccg atgcatgtct aaactggatg 660 tttacagaca agttcattcc attattagac gttccctgcc agcaacacta ccacagtgtc 720 aggcagcgaa caagacctgc cccaccaatt acatgtggaa taatcacatc tgcagatgcc 780 tggctcagga agattttatg ttttcctcgg atgctggaga tgactcaaca gatggattcc 840 atgacatctg tggaccaaac aaggagctgg atgaagagac ctgtcagtgt gtctgcagag 900 cggggcttcg gcctgc — — tgtggacccc acaaagaact agacagaaac tcatgccagt 960 gtgtctgtaa aaacaaactc ttccccagcc aatgtggggc caaccgagaa tttgatgaaa 1020 acacatgcca gtgtgtatgt aaaagaacct gccccagaaa tcaaccccta aatcctggaa 1080 aatgtgcctg tgaatgtaca gaaagtccac agaaatgctt gttaaaagga aagaagttcc 1140 accaccaaac atgcagctgt tacagacggc catgtacgaa ccgccagaag gcttgtgagc 1200 caggattttc atatagtgaa gaagtgtgtc gttgtgtccc ttcatattgg caaagaccac 1260 aaatgagcta agattgtact gttttccagt tcatcgattt tctattatgg aaaactgtgt 1320 tgccacagta gaactgtctg tgaacagaga gacccttgtg ggtccatgct aacaaagaca 1380 aaagtctgtc tttcctgaac catgtggata actttacaga aatggactgg agctcatctg 1440 caaaaggcct cttgtaaaga ctggttttct gccaatgacc aaacagccaa gat- tccctc 150 C ztgtgatttc tttaaaagaa tgactatata atttatt tcc ac aaaaatc "gr ctccgc 156 C attca tttt atagcaacaa caattggtaa aactcactst ga:caa:a: ; tcataccac 152 C gcaaaa atg tttaaaataa aatgaaaatt gtat cataa aaaaaaaaa :a; c.a.c& <210> 2 <211> 419 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met His Ser Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu a Pro Ala Ala Ala A.la Ala Phe 20 " 25 30 Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala 35 40 45 Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser 50 55 60 Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met 65 70 75 80 Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln 85 90 95 Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr He Lys Phe Ala Ala Ala 100 105 110 His Tyr .Asn Thr Glu He Leu Lys Ser He Asp Asn Glu Trp Arg Lys 115 120 125 Thr Gln Cys Met Pro .Arg Glu Val Cys He Asp Val Gly Lys Glu Phe 130 135 140 Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr 165 170 175 Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu He Thr Val Pro Leu 180 185 190 Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr He Ser Phe Ala Asn His Thr Ser 195 200 205 Cys Arg Cys Met Ser Lye Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser He 210 215 220 He Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn 225 230 235 240 Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asp His He Cys Arg Cys 245 250 255 Leu Aia Gln Glu Asp ?ne Met Pne Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser 260 265 270 Tnr Asp Gly Phe His Asp He Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu 275 280 285 Giu Thr Cys Gin Cys Val Cys Are Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys 290 295 300 Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys 305 310 315 320 Asr. Lys Leu Phe Pro Ser Gin Cys Gly Ala Asn Arg Giu Phe Asp Giu 325 330 335 Asn Thr Cys Gin Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro .Arg Asn Gln Pro 340 345 350 Leu Asn Pro Gly Lys Cys A-la Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys 355 360 365 Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr 370 375 380 Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Ser Glu Glu Val Cys .Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Gln Arg Pro 405 410 415 Gln Met Ser <210> 3 <211> 1526 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 3 cgaggccacg gcttatgcaa gcaaagatct ggaggagcag ttacggtctg tgtccagtgt 60 agatgaactc atgactgtac tctacccaga atattggaaa atgtacaagt gtcagctaag 120 gaaaggaggc tggcaacata acagagaaca ggccaacctc aactcaagga cagaagagac 180 tataaaattt gctgcagcac attataatac agagatettg aaaagtattg ataatgagtg 240 gagaaagact caatgcatgc cacgggaggt gtgtatagat gtggggaagg agtttggagt 300 cgcgacaaac accttcttta aacctccatg tgtgtccgtc tacagatgtg ggggttgctg 360 ••^^•""^r ir ifrlfJÉiáif caatagtgag gggctgcagt gcatgaacac cagcacgagc tacctcagca agacg att 420 tgaaattaca gtgcctctct ctcaaggccc caaaccagta acaatcagtt ttgccaatca 480 cacttcctgc cgatgcatgt ctaaactgga tgtttacaga caagttcatt ccattattag 540 acgttccctg ccagcaacac taccacagtg tcaggcagcg aacaagacct gccccaccaa 60C tzacangzgg aataatcaca tctgcaga g cctggctcag gaaga zra tgttt cctc S6C ggatgccgga ga gactcaa caga ggatt ccetgacacc tgtggaccaa acaeggag" 72C ggatgaagag acctgtcagt gtgtccgcag agcggggc cggcctccca gcz ggacc 780 ccacaaagaa ctagacagaa actcatgcca gtgtgtctgt aaaaacaaac tcctccccag 840 ccaatgtggg gccaaccgag aatttgatga aaacacatgc cagtgtgtat gtaaaagaac 90C ctgccccaga aatcaacccc taaatcctgg aaaatgtgcc tgtgaatg a cagaaagtcc 960 acagaaatsc ttgttaaaag gaaagaagtt ccaccaccaa acatgcagct gttacagacg 1020 gccatgtacg aaccgccaga aggcttgtga gccaggattt tcatatagrg aagaagtgtg 1080 tcgttgtgtc ccttcatatt ggcaaagacc acaaatgagc taagattgra ctgttttcca 1140 gt catcgat tttctattat ggaaaactgt gttgccacag tagaactgtc tgtgaacaga 1200 gagacccttg tgggtccatg ctaacaaaga caaaagtctg tctttcctga accatgtgga 1260 taactttaca gaaatggact ggagctcatc tgcaaaaggc ctcttgtaaa gactggtttt 1320 ctgccaatga ccaaacagcc aagattttcc tcttgtgatt tctttaaaag aatgactata 1380 taatttattt ccactaaaaa tattgtttct gcattcattt ttatagcaac aacaattggt 1440 aaaactcact gtgatcaata tttttatatc atgcaaaata tgtttaaaat aaaatgaaaa 1500 ttgtatttat aaaaaaaaaa aaaaaa 1526 <210> 4 <211> 350 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met Tyr Lys Cys Gln Leu 1 5 10 15 Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln Ala Asn Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Glu Glu Thr He Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu 35 40 45 • He Leu Lys Ser He Asp Asn Glu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro 50 55 60 JUA*^ ». yfmrt-T .^^..^A.,^,^--,. . *.**? 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Pne Leu Val Trp Pro Prc Cys Val Glu Val Gl~ 115 120 125 Arg Cys Ser Giy Cys Cys A.sn Asn Arg Asn Val Gin Cys Arg Pro Tnr 130 135 140 Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gin Val Arg Lys He Giu lie Val Arg 145 150 155 160 Lys Lys Pro He Phe Lye Lys -Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp Hie Leu 165 170 175 Ala Cys Lys Cys Giu Thr Val Ais Ala Aia Ary Pro Val Thr Arg Se¿ 180 1S5 190 Pro Gly Gly Ser Gin Giu Glp Arg Aia Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val 195 200 205 Tnr He Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lye His Arg 210 215 220 Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly 225 230 235 240 Ala <210> 7 <211> 190 <212> PRT <213> homo sapiens <400> Met Asn Phe Leu Leu Sei Trp Val His Trp Thr Leu .Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Lys Ala His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro He Glu Thr Leu Val Asp He Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu He Glu Tyr He Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu .Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Ser Glu Ser Asn Val Thr Met Gln He Met Arg He Lys Pro His Glr. 100 105 110 Ser Gln His He Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu 115 120 125 -v-* Cys Arg Pro Lye Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn His Cye Glu Pro 130 " 135 140 C/s Ser Glu A.rg Arg Lys His Leu Pne Val Gln ?sp Pro Glr Thr Cye 145 150 155 160 Lvs Cvs Ser Cys Lvs Asn Thr Asp Ser A e Cvs Lys .Ala .Are G_r Leu 165 " 1-C l-*5 Giu Leu As. Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Prc Arg A.rg 180 1S5 190 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213-- ho c sapiens <220> <221> SITIO <222> (2) .. (2) 10 <223> Xaa ee íQ ai a caalquiei ar noac-ec <220> <221> SITIO <222> (5).. (5) <223> ?aa es igual a cualquiei ammoáciao <220> <221> SITIO <222> (6) .. (6) <223> xaa es igual a cualquier aminoácido 15 <220> <221> SITIO <222> (7).. (7) <223> xaa es igual a cualquier aminoácido <220> •<221> SITIO <222> ( 10 ) . . ( 10 ) <223> aa es igual a cualquier aminoácido 20 <400> 8 Pro Xaa Cys Val Xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys Cys .Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 18 <212> ADN ' l??á:ÚÁJ..? ti-átáíl,,} - -A *¿..?..*.. , .... . A,A^- *,,*.*.,4i A. "i TG ?' ipipirfliliiiMiiiiti^^ r^yt^flit^ ifáil' iiAl <213> secuencia artificial" <220> <221> ?mciddor_un?ón <222> (1) .. (18) <223> iniciador inverso l3-2 <400> 9 atgcttccgg ct .ccrta c <210> 1C <21i> 19 <212> ADK <213> secuencia artificial <220> <221> ?mc?ado?_un?ón <222> (1) (19, <223> xniciadoi directo M13 <400> 10 gggttttccc agtcacgac 19 <210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> ?n?c?ado?_un?on <222> (1) .. (21) <223> ímciadoi F de VECr <400> 11 ccacatggtt caggaaagac a 21 <210> 12 <211> 50 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> ?n?c?ador_umón <222> (1) .. (50) <223> iniciador de ollgonucleótido paia PCR 5 <400> 12 tgtaatacga ctcactatag ggatcccgcc atggaggcca cggcttatgc 50 <210> 13 < ;221111»»^^*2288 <212> ADN <213> secuencia artificial L¡¿,ií..á?Á,.MAA-t- ^ **mH* ?ü^^. ^¿?tA?Á^.. ,A .~.. ....l..?.~Í.táiÁAÍ,A....<..íí¿.¡Íl¿ <220> <221> ?n?c?ador_un?ón <222> (1)..(28) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 3' <400> 13 gatctc aga ttagctcatt tgtggtct 28 , <210> 14 <211 > 27 <212 > AD <213 > secuencia art i f icial <220> <221> m?c?ador_un?on <222> íl) (27) <223> Inlc?ador de ollgonucleótido para PCR 5' que contiene un sitio BamHl <400> 14 cgcggatcca tgactgtact ctaccca 27 <210> 15 <2il> 6C <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> ?n?c?ador_un?ón <222> (1) .. (60) <223> iniciador de oligonucleótido para PCR 3' que contiene la secuencia complementaria para un sitio Xbal, una marca HA y un sitio Xhol <400> 15 cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtac tcgaggctca tttgtggtct 60 <210> 16 <211> 3974 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 16 ggtacctaag tgagtagggc gtccgatcga cggacgcctt ttttttgaat tcgtaatcat 60 ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 120 rr^ag t aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 180 cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 240 tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 300 ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 360 taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 420 ti„l É Í<r,í ,ti?'? l S - •"*- a-tÜA- agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 480 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 540 tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 600 tgccgcttac cggatacctg tccgcccttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaca 660 ectcacgctg tage atctc ag tcggtgt aggtcgttcg ctccaagcte ggctgt t c 72C acgaacccce cgt caeccc gaccgcrgcg ccttatccgg taacta cgt c tgag-cca 78C acccggtaac acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaaca?c attagcagac 84C cgagg a g aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 900 gaagaacagt arttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagtte 950 gcagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaa r 1020 agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacgggg 1030 ctgacgctca stggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcgtcga 1140 caattcgcgc gcgaaggcga agcggcatgc atttacgttg acaccatcea atggtgcaaa 1200 acctttcgcg gcatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 1260 aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 1320 cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 1380 atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 1440 ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 1500 gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 1560 agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 1620 ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 1680 aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 1740 tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 1800 atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 1860 cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 1920 gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 1980 atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 2040 ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 2100 tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 2160 gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 2220 tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 2280 ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 2340 gcgcaacgca attaatgtaa gttagcgcga attgtcgacc aaagcggcca tcgtgcctcc 2400 ccactcctgc agttcggggg catggatgcg cggatagccg ctgctggttt cctggatgcc 2460 gacggatttg cactgccggt agaacrccgc gaggtcgtcc agcctcaggc agcagctgaa 252C ccaactcgcg aggggatcga gcccggggtc ggcgaagaac tccagcatga ga ccccgcg 25S0 ctggaggatc atccagccgg cgtcccggaa aacgatrtccg aagcccaacc ttcatagaa 264C 5 ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggtrgggc gtcgcttggt cgg catttc 2700 gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 2760 gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc sccgccaaec 2S2C tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccas; 2SSC cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgapatt cggcaagcag 2940 gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 300C 10 aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 3060 ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaa ggg 3120 caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 3180 tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 3240 cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 3300 gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 3360 gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 3420 15 cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 3480 gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga 3540 tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact 3600 ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct 3660 gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt 3720 ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt 3780 20 cagcaccg'__ ; gcggact ggctttctac gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc 3840 cctgagtgct tgcggcagcg tgaagcttaa aaaactgcaa aaaatagttt gacttgtgag 3900 cggataacaa ttaagatgta cccaattgtg agcggataac aatttcacac attaaagagg 3960 r agaaattaca tatg 3974 iitAtA? ?sA *?t¿i*i-* **M~ <210> 17 <211> 112 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> Promotor <222> (1) .. (112) <223> Promotor de pHE4a <400> 17 aagcttaaaa aactgcaaaa aatagtttga c tgtgagcg gataagaat aagargtacc 60 caattgtgag cgga aacaa tttcacacat taaagaggag aaattacata te <210> 18 <2il> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Glu Glu Thr He Lys Phe Ala Ala Ala His Tyr Asn Thr Glu He 1 5 10 15 Leu Lys Ser He Asp Asn Giu Trp Arg Lys Thr Gln Cys Met Pro Arg 20 25 30 Glu Val Cys He Asp Val Gly Lys Glu Phe Gly Val Ala Thr .Asn Thr 35 40 45 Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr Arg Cys Gly Gly Cys Cye 50 55 60 Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr Leu Ser 65 70 75 80 Lys Thr Leu Phe Glu He Thr Val Pro Leu Ser Gln Gly Pro Lys Pro 85 90 95 Val Thr He Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys 100 105 110 Leu <210> 19 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> iniciador_un?ón <222> (1)..(30) <223> Iniciador de oligonucleótido para PCR 5' que contiene un sitio Nde I <400> 19 gcagcacata tgacagaaga gactataaaa 30 <210> 20 <211> 30 <212> SDN. <213> secuencia artificial <220> <22I> m?c?ador_unj.ór <222> (1) .. (30) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 3' que contiene un sitio Asp718 <400> 20 gcagcaggta cctcacagtt :asa:acc a <210> 21 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia aitificial <220> <221> ?n?c?ado?_un?ón <222> (1)..(30) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 5' que contiene un sitio Asp718I <400> 21 gcagcaggta cctcaacgtc taataatgga 30 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia art if icial <220> <221> ?n?c?ador_un?ón <222> (1)..(30) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 5' que contiene un sitio BamHl <400> 22 gcagcaggat cccacagaag agactataaa 30 <210> 23 <211> 30 <212> ADN <213> secuencia artificial v220> <221> m?c?ador_un?ón <222> (1)..(30) <223> Iniciador de ollgonucleótido para PCR 3' que contiene un sitio Xbal <400> 23 gcagcatcta gatcacagtt tagacatgca 30 t*i?Á?á LAtAJAA¡ÍA.t,iA» Í *to. i.. <210> 24 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> pro e ína_un? ón <222> '1) (39) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 5 que contiene un sitio BamHl <400> 24 gcagcagga cccacagaag agac ataaa atttgctgc 3F <210> 25 <211> 36 <212> ADN <213> secuencia a?t?f-c±=l <220> <221> ?n?c?aao _ n?o? <222> (1) (36) <223> Iniciador de ollgonucleótido para PCR 3' que contiene un sitio Xbal <400> 25 gcagcatcta gatcaacgtc taataatgga atgaac 36 <210> 26 <211> 55 <212> ADN <213> secuencia aitificial <220> <221> ?n?c?ador_umon <222> (1) .. (55) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 5' que contiene un sitio BamHl lleno de Klenow <400> 26 gatcgatcca tcatgcactc gctgggcttc ttctctgtgg cgtgttctct gctcg 55 <210> 27 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia art i f icial <220> <221> m?c?ador_un?on <222> (1)..(39) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 3' gue contiene un sitio BamHl <400> 27 gcagggtacg gatcctagat tagctcattt gtggtcttt 39 <210> 28 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> '?n?c?ador_un?on <222> (1) . (39) <223> ímciadoi de oligonucleotido pa?< <400> 28 gactggatcc gccaccatgc actcgctggg ct :ct <210> 29 <21i> 35 <212> ADN <213> secuencia aitificial <220> <221> m?c?ador_un?ón 222> (1) (35) <223> iniciador de oligonucleotido para =CD 3 <400> 29 gactggtacc ttatcacata aaatcttcct gagcc 35 <210> 30 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> ?n?c?ador_un?on <222> (1)..(39) <223> iniciador de ollgonucleótido paia FCR 5' <400> 30 gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc 39 <210> 31 <211> 34 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> ?n?c?ador_um ón <222> (1)..(34) <223> iniciador de ollgonucleótido para PCR 3' <400> 31 gactggtacc ttatcagtct agttctttgt gggg 34 J --1-4.*k? L.. j.» ««alfa,...,.ii^?fa)¡ t*>*i4^i--M<8i-.?afaa4*^ <210> 32 <211> 39 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> r.?c ac.c?_up?or <222> (1 . ,39' <2Z3> . c-í ~ -' ae cligonuc.eótido paia PCP 5' <400> 22 gactggaccc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc <210> 33 <211> 37 <212> ADN <2l3> secuenc.= artificial <220> <221> n.c?ac-,-_?.!r?ón <222> (1) .. (37> <223> ?-?c?acc? ae ollgonucleótido para PCR 3' <400> 33 gactggtacc tcattactgt ggactttctg tacattc 37 <210> 34 <211> 3S <212> ADN " secue.pc.a artificial <220> <221> ?n?ciador_un?ón <222> (1)..(38) . _ „_ <223> Iniciador de oligonucleótido para PCR 5' que contiene un sitio BamHl <400> 34 gcagcaggat ccacagaaga gactataaaa tttgctgc 38 <210 35 <211> 36 <212> ADN <213> secuencia artificial <220> <221> in?ciador_unión <222> (1)..(36) <.23> iniciador de oligonucleótido para PCR 3' que contiene un sitio Xbal <400> 35 cgtcgttcta gatcacagtt tagacatgca tcggca 36 <210> 36 <211> 5283 67 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 36 aagcttgacc ttatgcgact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 60 taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgac cacc 12 C gggat tcca agtctccacc ccactgacgt caacgggagt ttgttttggc atcaaaatca I SC acgagactt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtagggc 24C aacatgctta tgtaacggtg agttagcaac atgccttata aggagagaaa aagca ccr e 30 C catgccgatt ggtgggagta aggtggtatg atcgtggtat gatcgtgcct tgttaggaac 36C gcaacagacg ggtctaacac ggattggacg aaccactgaa ttccgcattg cagagatat t 420 gtatt taagt gcccagctcg atacaataaa cgccat ttga ccattcacca cat tggttgte 4 S 0 cacctgggtt gggatcgatc catcatgcac tcgctgggct tcttctctgt ggcgtgttct 54 C ctgctcgccg ctgcgctgct cccgggtcct cgcgaggcgc ccgccgccgc cgccgcc t t c 600 gagtccggac tcgacctctc ggacgcggag cccgacgcgg gtgaggccac ggcttatgca 660 agcaaagatc tggaggagca gttacggtct gtgtccagtg tagatgaact catgactgta 720 ctctacccag aatattggaa aatgtacaag tgtcagctaa ggaaaggagg ctggcaacat 780 aacagagaac aggccaacct caactcaagg acagaagaga ctataaaatt tgctgcagca 840 cattataata cagagatctt gaaaagtatt gataatgagt ggagaaagac tcaatgcatg 900 ccacgggagg tgtgtataga tgtggggaag gagtttggag tcgcgacaaa caccttcttt 960 aaacctccat gtgtgtccgt ctacagatgt gggggttgct gcaatagtga ggggctgcag 1020 tgcatgaaca ccagcacgag ctacctcagc aagacgttat ttgaaattac agtgcctctc 1080 tctcaaggcc ccaaaccagt aacaatcagt tttgccaatc acacttcctg ccgatgcatg 1140 tctaaactgg atgtttacag acaagttcat tccattatta gacgttccct gccagcaaca 1200 ctaccacagt gtcaggcagc gaacaagacc tgccccacca attacatgtg gaataatcac 1260 atctgcagat gcctggctca ggaagatttt atgttttcct cggatgctgg agatgactca 1320 acagatggat tccatgacat ctgtggacca aacaaggagc tggatgaaga gacctgtcag 1380 tgtgtctgca gagcggggct tcggcctgcc agctgtggac cccacaaaga actagacaga 1440 aactcatgcc agtgtgtctg taaaaacaaa ctcttcccca gccaatgtgg ggccaaccga 1500 gaatttgatg aaaacacatg ccagtgtgta tgtaaaagaa cctgccccag aaatcaaccc 1560 ctaaatcctg gaaaatgtgc ctgtgaatgt acagaaagtc cacagaaatg cttgttaaaa 1620 ggaaagaagt tc^accacca aacatgcagc tgttacagac ggccatgtac gaaccgccag 1680 ttáa-.iat. - •*- *- -* i.i A..AuAA^ aaggcttgtg agccaggatt ttcatatagt gaagaagtgt gtcgttgtgt cccttcatat 1740 tggaaaagac cacaaatgag ctaatctagg atccgtaccc tgcccaggct tttgtcaaac 1800 agcacctttg tggttctcac ttggtggaag ctctctacct ggtgtgtggg gagcgtggat 1860 tcttctacac acccatgtcc cgccgcgaac tggaggaccc acaaggtaag ctctgctcct 1920 gaattctatc ccaagrgcra actaccctgt ttgtctttca cccttgagac cttgtaaatt 19SC gtgccctagg gtggaeegt: czcagcczza. c agtggggg gcacatttct gtgggcacct 204C agacata gt aaacatgetza grrgcra ra aggagtgaga atccttcctt aagtctccta 210C ggrggtgace ggtggctagg ccccaccata gg acctatt tggggacccc atagagcacc 2160 gcactgactg agggatggta acagga gtc taggttttgg aggcccatat gtccattcat 2220 gaccagtgac ttgtctcaca gccatgcaac c tgcctcc tgtgctgact tagcaggega 2280 taaagtgaga gaaagcctgg gctaatcagg gggtcgctca gctcctccta actggattct 2340 cctatgtgtc tttgcttcte tectec ea gctctgccct gtgctgacat gacctcccte 2400 gcagtggcac aactggagct. ggguggaggc ccgggggcag gtgaccttca gaccttggca 2460 ctggaggtgg cccggcagaa gcgcggca c gtggatcagt gctgcaccag catctgctc 2520 ctctaccaac tggagaac a ctgcaactag gcccaccact accctgtcca cccctctgca 2580 atgaataaaa cctttgaaag agcactacaa gttgtgtgta catgcgtgca tgtgcatatg 2640 tggtgcgggg ggaacatgag tggggctggc tggagtggtc gcggcttaat ctatctggca 2700 gctgtctaga cgtaatcatg gtcatagc g tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 2760 attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 2820 agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 2880 tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 2940 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 3000 tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 3060 aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 3120 tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 3180 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 3240 cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 3300 agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 3360 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 3420 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagcc?ct 3480 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 3540 cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 3600 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 3660 ggtt ttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 372C ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcac tta agggatttt» g catgagar tatceccgac caaagcggcc atcgtgcctc eccactc te cagttcggg 3S4C cca ga g- gcggatagcc gctgc egtt: tccrgsatgc cgacggatt e ac accgc 390C agaacttccg cgaggtcgtc cagcc cagg cagcagctga ac:aac;:gc gaggggatcc agcccggggt gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc gctggaggat catcca?ccg scg cccgga aaacgattcc gaagcccaac c t cataga aggcggcggt ggae cgaaa 40SC tctcgtgatg gcag tggg cgtcgctcgg ccgg cattt csaaccccag agtcccgctt 1 0 agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cga gcgctg cgaatcggga gcggcgatac 420C cgtaaagcac gaggaagcgg tcaccccatt cgccgccaag ctcttcasca atat acgg 4250 tagccaacgc tatgtcctga tagccgtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc 432C cagaaaagcg gccat ttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga 43S0 cgagatcctc gccgücgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagt cg gctggcgcga 4440 gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac 4500 gtgctcgctc gatgcgatgt tccgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg 4560 tatgcagccg ccgcaptgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag 4620 atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag 4680 tgacaacgtc gagcacagc gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg 4740 ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg 4800 ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg 4860 cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat 4920 cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt gatcccctgc 4980 gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc ttcccaacct 5040 taccagaggg cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt 5100 ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt 5160 cccttgtcca gatagcccag tagctgacat tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac 5220 tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc 5280 gtg 5283 Se hace constar que con relación a esta fecha, el me^or método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende la construcción de vector de expresión pVGI .1 mostrada en la figura 31. 2.- Una composición caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1. 3.- Un método para producir una célula hospedera caracterizado porque comprende transducir, transformar o transfectar una célula hospedera con la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 4.- La célula hospedera caracterizada porque se produce mediante el método de conformidad con la reivindicación
3. 5.- Una célula hospedera caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 6.- Un método para tratar a un paciente caracterizado porque comprende administrar al paciente la
4. molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho paciente tiene isquemia de extremidad crónica. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho paciente tiene isquemia del miocardio. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho paciente tiene la enfermedad o trastorno que se selecciona del grupo que consiste de: a. trastornos autoinmunes; b. reacciones o condiciones alérgicas; c. rechazo de órganos; d. condiciones inflamatorias; e. trastornos hiperproliferativos; f. enfermedad debido a infección viral; g. enfermedad debido a infección bacteriana; h. enfermedad debido a infección fúngica; i. enfermedad debido a infección por parásitos; j . trastornos cardiovasculares; k. arritmias; I?dL ?^IMjA? ****- 1. enfermedades de la válvula cardiaca; m. enfermedades del miocardio; n. isquemias del miocardio; o. aneurismas; p. trastornos oclusivos de la arteria; q. trastornos cerebrovasculares; r. embolias; e s. isquemia. 10.- Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende la construcción del vector de expresión pVGI .1 que está contenida en el depósito ATCC No. PTA-218
5. 11.- Una composición caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 10. 12.- Un método para producir una célula hospedera caracterizado porque comprende transducir, transformar o transfectar una célula hospedera con la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 13.- La célula hospedera caracterizada que se produce utilizando el método de la reivindicación 12. 14.- Una célula hospedera caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 15.- Un método para tratar a un paciente caracterizado porque comprende administrar al paciente la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 10. 1
6.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho paciente tiene isquemia de extremidad crónica. 1
7.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho paciente tiene isquemia del miocardio. 1
8.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho paciente tiene la enfermedad o trastorno que se selecciona del grupo que consiste de: a. trastornos autoinmunes; b. reacciones o condiciones alérgicas; c. rechazo de órganos; d. condiciones inflamatorias; e. trastornos hiperproliferativos; f . enfermedad debido a infección viral; g. enfermedad debido a infección bacteriana; h. enfermedad debido a infección fúngica; ÍAÍ ¿Á,i -**•& *» AA. ??lA. i. enfermedad debido a infección por parásitos; j. trastornos cardiovasculares; k. arritmias; 1. enfermedades de la válvula cardiaca; m. enfermedades del miocardio; n. isquemias del miocardio; o. aneurismas; p. trastornos oclusivos de la arteria; q. trastornos cerebrovasculares; r. embolias; e s. isquemia.