MXPA02002684A

MXPA02002684A - Citocinas de mamifero; reactivos y metodos relacionados.

Info

Publication number: MXPA02002684A
Application number: MXPA02002684A
Authority: MX
Inventors: De Waal Malefyt Rene
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2002-07-30
Also published as: KR100894359B1; HUP0301102A2; AU2008240348A1; JP2007045830A; AU780163B2; JP2009268467A; EP1210434A2; ES2300276T5; JP4505166B2; JP2013128489A; CN1387571A; AU7360800A; WO2001018051A3; DE60038304D1; IL148300A0; AR035560A1; JP2015051005A; HUP0301102A3; JP2003510038A; CN100529076C

Abstract

Se proveen genes purificados que codifican citocina de un mamifero, reactivos relacionados con los mismos incluyendo proteinas purificadas, anticuerpos especificos y acidos nucleicos que codifican esta molecula; tambien se proveen metodos para usar dichos reactivos y equipos de diagnostico.

Description

C1TOCINAS DE MAMÍFERO: REACTIVOS Y MÉTODOS RELACIONADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos relacionados con proteínas, que funcionan para controlar la biología y fisiología de células de mamífero, por ejemplo células de un sistema inmunitario de mamífero. En particular, provee genes purificados, proteínas, anticuerpos, reactivos relacionados, y métodos que son útiles, por ejemplo para regular la activación, el desarrollo, la diferenciación y la función de varios tipos de células, incluyendo células hematopoyéticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La tecnología de ADN recombinante se refiere en general a las técnicas de integrar información genética de una fuente donadora en vectores para el procesamiento subsiguiente, tal como a través de la introducción en un huésped, mediante lo cual se copia la información genética transferida y/o se "expresa en el nuevo ambiente. Comúnmente, la información genética existe en forma de ADN complementario (ADNc) derivado de ARN mensajero (ARNm) que codifica un producto de proteína deseado. El portador frecuentemente consiste en un plásmido que tiene la capacidad de incorporar ADNc para su réplica posterior en un huésped, y, en algunos casos, para controlar realmente la expresión del ADNc y dirigir de esta manera la síntesis del producto codificado en un huésped. Desde hace algún tiempo, es conocido el hecho de que la respuesta inmune de un mamífero se basa en una serie de complejas interacciones celulares, denominadas "red inmune". Ver por ejemplo, Paul (1998) Fundamental Immunoloqy (4a. ed.) Raven Press, NY. Recientes investigaciones han proporcionado nuevos puntos de vista en cuanto al trabajo interno de esa red. Aunque es claro que en gran de la respuesta gira en realidad alrededor de las interacciones de tipo reticular de los linfocitos, macrófagos, granulocitos, y otras células, los inmunólogos sostienen actualmente la opinión de que las proteínas solubles, conocidas como linfocinas, citocinas, o monocinas, juegan un rol crítico en el control de estas interacciones celulares. Por lo tanto, existe considerable interés en aislar, caracterizar, y en los mecanismos de acción de los factores moduladores celulares, la comprensión de los cuales conducirá a obtener significativos avances en el diagnóstico y terapia de numerosas anormalidades médicas, por ejemplo, los desórdenes del sistema inmunitario. Algunos de estos factores son factores de desarrollo hematopoyético, por ejemplo, el factor de estimulación de la colonia de granulocitos (G-CSF). Ver, por ejemplo, Thomson (ed. 1998) The Cvtokine Handbook (3a. ed.) Academic Press, San Diego; Mire-Sluis and Thorpe (ed 1998) Cvtokines Academic Press, San Diego; Metcalf and Nicola (1995) The Hematopoietic Colonv Stimulating Factors Cambridge University Press; and Aggarwal and Gutterman (1991) Human Cvtokines Blackwell Pub. La expresión de citocinas mediante las células del sistema inmunitario juega un importante rol en la regulación de la respuesta inmune. La mayor parte de la citocinas son pleiotrópicas y tienen múltiples actividades biológicas incluyendo la presentación de antígenos; activación; proliferación y diferenciación de los subgrupos de células CD4+ T; la respuesta de los anticuerpos mediante las células 8; y las manifestaciones de hipersensibilidad. Además las citocinas pueden usarse para diagnosticar y en la terapia de un amplio rango de condiciones degenerativas o anormales que involucran directa o indirectamente el sistema inmunitario y/o las células hematopoyéticas. Las linfocinas son aparentemente los intermediarios de las actividades celulares en una variedad de formas. Han demostrado que soportan la proliferación, desarrollo y/o diferenciación de las células de estirpe hematopoyéticas pluripotenciales en vastos números de progenitores que comprenden diversos linajes celulares que constituyen un complejo sistema inmunitario. Son necesarias interacciones adecuadas y equilibradas entre los componentes celulares para obtener una respuesta inmune saludable. Los diferentes linajes celulares a menudo responden de manera diferente cuando se administran linfocinas conjuntamente con otros agentes. Los linajes de células especialmente importantes para la respuesta inmune incluyen dos clases de linfocitos: células B, que pueden producir y secretar ¡nmunoglobulinas (proteínas con capacidad de reconocer y adherirse a materia extraña para efectuar su remoción), y células T de varios subgrupos que secretan linfocinas y que inducen o suprimen las células B y varias otras células (incluyendo otras células T) que constituyen la red inmunitaria. Estos linfocitos interactúan con muchos otros tipos de células. De lo que antecede, resulta evidente que el descubrimiento y desarrollo de nuevas linfocinas, por ejemplo, las relacionadas con G-CSF y/o 1L6, podrían contribuir a nuevas terapias para un amplio rango de condiciones degenerativas o anormales que involucran directa o indirectamente el sistema inmunitario y/o las células hematopoyéticas. En particular, el descubrimiento y desarrollo de las linfocinas que mejoran o que potencian las actividades beneficiosas de las linfocinas conocidas sería sumamente ventajoso. Originalmente el nuevo gen IL-B30 fue identificado como una potencial citocina en base a su estructura pronosticada, y se clasificó como una citocina de cadena larga de tipo 1L6 y GCSF (International Patent Application PCT/US 98/15423 (WO 99105280). Las citocinas IL-6 y las relacionadas tales como Oncostatina M, factor inhibidor de leucemia (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) y la cardíotroflna-1 tienen actividades biológicas sobre la hematopoyesis, trombopoyesis, inducción de una respuesta de fase aguda, formación de osteoclastos, diferenciación de neuronas y supervivencia, e hipertrofia cardíaca. La expresión transgénica de IL-B30 en ratones indujo un fenotipo similar al que se observó después de la sobreexpresión de IL-6 en ratones, que comprende enanismo, inflamación sistémica, infertilidad y muerte. La IL-830 parece ser una nueva citocina involucrada en la inflamación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento del rol fisiológico de IL-B30 denominado aquí también como proteína IL-B30, y su rol en la respuesta inmune. En particular, el rol de IL-B30 ha sido elucidado en vías que están involucradas en la inflamación, enfermedades infecciosas, desarrollo hematopoyético e infección viral. La invención está específicamente dirigida a composiciones que comprenden combinaciones de la subunidad p40 de IL-12, con interleuquina-830 (IL-B30) y sus actividades biológicas. Incluye ácidos nucleicos que codifican ambos polipéptidos o proteínas de fusión, y métodos para su producción y uso. Los ácidos nucleicos de la invención se caracterizan, en parte, por su homología con las secuencias de ADN complementarias (ADNc) aquí descritas y/o ensayos funcionales. Asimismo se proveen polipéptidos, anticuerpos y métodos para usarlos, que incluyen usar métodos de expresión de ácido nucleico. Se proveen métodos para modular o para intervenir en el control de una fisiología que depende del factor de crecimiento o una respuesta inmune. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la subunidad p40 de IL-12 está también asociada con la citocina IL-B30 descrita previamente, por ejemplo, en USSN 08/900.905 y 09/122.443, en forma natural, Por lo tanto, la coexpresión de los dos polipéptidos conjuntamente da como resultado señalización y adhesión del receptor funcional.

La presente invención provee composiciones que comprenden: a) tanto un polipéptido substancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 como un polipéptido substancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-B30; b) tanto un polipéptido substancialmente puro que comprende por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 como un polipéptido substancialmente puro que comprende por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30; c) un polipéptido substancialmente puro que comprende a ambos, una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 y una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de ILB30; o d) un polipéptido substancialmente puro que comprende tanto un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 como un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30. Varias modalidades incluyen las composiciones: a) una en la cual la pluralidad descrita de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos comprende un segmento de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; b) una en la cual la pluralidad descrita de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos, son ambas de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; c) una en la cual el segmento descrito de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; d) una en la cual el segmento descrito de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; e) que comprende además un portador seleccionado de un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o buffer; f) formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; o g) que es una composición estéril. Otras modalidades incluyen aquellas en las cuales: a) donde por lo menos uno de los polipéptidos descritos es: i) detectablemente rotulado; ii) recombinantemente producido; ¡ii) no glicosilado; iv) desnaturalizado; v) adherido a un substrato sólido; o vi) conjugado con otra porción química; b) que comprende tanto un polipéptido substancialmente puro IL-12 p40 como un polipéptido substancialmente puro IL-B30; c) que comprende un polipéptido substancialmente puro que comprende IL-12 p40 fusionado con ILB30; o d) combinado con IL-18, IL-12, radiación o quimioterapia, un coadyuvante inmunitario o un anti-viral. Las modalidades de equipo incluyen las que comprenden dicha composición descrita y: a) un compartimento que comprende el polipéptido descrito; o b) instrucciones para el uso o descarte de reactivos en el equipo descrito. Las composiciones de ácido nucleico de la ¡nvención incluyen, por ejemplo, un ácido nucleico recombinante o aislado que codifica: a) tanto un polipéptido substancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 como un polipéptido substancialmente puro que comprende una pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-B30; b) tanto un polipéptido substancialmente puro que comprende por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 como un polipéptido substancialmente puro que comprende por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30; c) un polipéptido substancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-12 p40, y una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-B30; o d) un polipéptido substancialmente puro que comprende un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 y un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30. Ambas modalidades incluyen un ácido nucleico de: a) uno en el cual la pluralidad descrita de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos comprende un segmento de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; b) uno en el cual la pluralidad descrita de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos consiste, ambos, de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; c) uno en el cual el segmento descrito de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 consiste en que por lo menos 15 aminoácidos contiguos; d) uno en el cual el segmento descrito de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de ILB30 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; e) uno en el cual la IL-12 p40 descrita es de un primate; f) uno en el cual el IL-B30 descrito es de un primate; g) que es un vector de expresión; h) que comprende además un origen de réplica; i) que comprende un rótulo detectable; j) que comprende una secuencia nucleotídica sintética; k) que es de por lo menos 6 kb, preferiblemente de menos de 3 kb; o I) que es de un primate. Asimismo se provee una célula que comprende el ácido nucleico recombinante descrito, incluyendo aquel en el cual la célula descrita es: una célula procariótica, eucariótica, bacteriana, de levadura, de insecto, de mamífero, de ratón, de primate, o de seres humanos. Las modalidades del equipo incluyen aquellas modalidades que comprenden un ácido nucleico descrito y: a) un compartimento que comprende el ácido nucleico descrito; b) un compartimento que comprende además un polipéptido IL-12 p40 de primate; c) un compartimento que comprende además un polipéptido IL-B30 de primate; o d) instrucciones para uso o descarte de reactivos en el equipo descrito. Alternativamente, la invención provee un ácido nucleico que se híbrida: a) bajo condiciones de lavado de 30 minutos a 50°C y menos de una sal 1 M para la porción codificadora madura natural de primate IL-12 p40; y b) bajo condiciones de lavado de 30 minutos a 50°C y menos de una sal 1 para ¡a porción codificadora madura natural del primate IL-B30. Varias modalidades incluyen dicho ácido nucleico descrito en el cual: a) las condiciones de lavado descritas para IL-12 p40 son de 60°C y de menos de 400 mM de sal; b) las condiciones de lavado descritas para IL-B30 son a 60°C y menos de 400 mM de sal; c) el ácido nucleico descrito exhibe identidad sobre una extensión de por lo menos 50 nucleótidos para secuenciar la codificación de IL-12 p40 de primate; y/o d) el ácido nucleico descrito exhibe identidad en una extensión de por lo menos 50 nucleótidos para la secuencia que codifica IL-B30 de primate. Las modalidades preferidas incluyen dicho ácido nucleico en el cual: a) las condiciones de lavado descritas para IL-12 p40 son a 65°C y menos de 150 mM de sal; b) las condiciones de lavado descritas para IL-B30 son a 65°C y menos de 150 mM de sal; c) el ácido nucleico descrito exhibe identidad en una extensión de por lo menos 90 nucleótidos para la secuencia que codifica IL-12 p40 de primate; y/o d) el ácido nucleico descrito exhibe identidad en una extensión de por lo menos 90 nucleótidos para la secuencia que codifica IL-B30 de primate. Se proveen antagonistas de las composiciones IL-12 p40/IL-B30 combinadas con, por ejemplo un antagonista aTNF, un antagonista IL-12, IL-10, o esteroides. La invención provee también un compuesto de adhesión, por ejemplo el que comprende un sitio de adhesión de antígeno de un anticuerpo, cuyo anticuerpo se adhiere específicamente a una composición IL-12 p40/IL-B30 tal como se ha descrito, a) que comprende un polipéptido substancialmente puro que comprende tanto al polipéptido IL-12 p40 substancialmente puro como el polipéptido IL-B30 substancialmente puro; o b) que comprende un polipéptido substancialmente puro que comprende IL-12 p40 fusionado con IL-B30; pero no a cualquiera del polipéptido IL-12 p40 o IL-B30. Otros compuestos de adhesión incluyen aquellos en los cuales: a) el compuesto de adhesión descrito es un contenedor; b) el compuesto de adhesión descrito es un fragmento Fv, Fab, o Fab2; c) el compuesto de adhesión descrito está conjugado con otra porción química; o d) el anticuerpo descrito; i) se crea contra una composición IL-12 p40/IL-B30; u) está inmunoseleccionado; ¡ii) es un anticuerpo policlonal; iv) exhibe un Kd para el antígeno de por lo menos 30 mM; v) está unido a un substrato sólido, incluyendo una membrana de plástico o granulos; vi) es una composición estéril; o vii) está detectablemente rotulada, incluyendo un rótulo radioactivo o fluorescente. Algunas formas preferidas incluyen composiciones que comprende: a) un compuesto de adhesión estéril, tal como el descrito; o b) el compuesto de adhesión descrito y un portador, donde el portador descrito es: i) un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o solución reguladora de pH; y/o ii) está formulado para administración oral, rectal, nasal, "tópica, o parenteral. Adicionalmente, se proveen modalidades de equipos que comprenden el compuesto de adhesión descrito y: a) un compartimento que comprende el compuesto de adhesión descrito; o b) instrucciones para el uso o descarte de reactivos en el equipo descrito. Además, la invención provee métodos para producir un complejo de antígeno:anticuerpo, que comprende poner en contacto, bajo condiciones apropiadas, una composición de IL-12 p40/IL-B30 de primate con un compuesto de adhesión descrito, permitiendo de esta manera que se forme el complejo descrito. Varios métodos incluyen aquellos en los cuales: a) el complejo descrito se purifica a partir de otras citocinas; b) el complejo descrito se purifica a partir de otros anticuerpos; c) el contacto descrito se efectúa con una muestra que comprende una citocina; d) el contacto descrito permite la detección cuantitativa del antígeno descrito; e) el contacto descrito se efectúa con una muestra que comprende el anticuerpo descrito; o f) el contacto descrito permite la detección cuantitativa del anticuerpo descrito. La ¡nvención provee también métodos para modular la fisiología , o el desarrollo de una célula o tejido que comprende poner en contacto la célula descrita con una composición IL-12 p40/IL-B30 o un antagonista de la misma. Un método preferido consiste en modular la fisiología o desarrollo de una célula que comprende poner en contacto la célula descrita con una composición IL-12 p40/IL-B30, y el contacto descrito da como resultado un aumento de la producción de IFN?. Típicamente, la célula descrita está en un organismo huésped, y el organismo descrito exhibe una respuesta Thl mejorada, por ejemplo, una seleccionada entre: un efecto antitumoral; un efecto coadyuvante; un efecto anti-viral; o un efecto alérgico antagonizado. A menudo, el contacto se da en combinación con: IL-18; IL-12; terapia o quimioterapia de radiación; un coadyuvante ¡nmune; o un agente terapéutico anti-viral. En otra modalidad, el antagonista descrito consiste en un anticuerpo contra la subunidad ß1 del receptor IL-12. Por lo tanto, la invención abarca también un método tal como se ha descrito en el cual el contacto descrito se efectúa con un antagonista, y el contacto descrito da como resultado una relativa disminución de la producción de IFN? Por lo tanto, la invención provee métodos para modular la fisiología o desarrollo de una célula en un organismo huésped, que comprende administrar el antagonista descrito al organismo descrito, donde el contacto descrito da como resultado una mejora de: una condición autoinmune o una condición inflamatoria crónica. La identificación de la asociación de las dos subunidades provee métodos para incrementar la secreción de: a) IL-B30 de primate, comprendiendo dicho método expresar el polipéptido descrito con IL-12 p40; o b) un IL-12 p40 de primate, comprendiendo dicho método expresar el IL-12 p40 descrito con IL-B30. Preferiblemente: a) el incremento descrito es de por lo menos 3 veces; o bien b) la expresión descrita es la de un ácido nucleico recombinante que codifica IL-B30 y IL-12 p40. Se proveen métodos para rastrear un receptor que adhiere la composición IL-12 p40/IL-830 descrita, por ejemplo, que comprende poner en contacto el complejo descrito con una célula que expresa el receptor descrito bajo condiciones que permiten que el complejo descrito se adhiera al receptor descrito, formando de este modo una interacción detectable. Preferiblemente, la interacción descrita da como resultado una respuesta fisiológica en la célula descrita. La presente invención provee también métodos para modular el tráfico o la activación de un leucocito en un animal, comprendiendo dichos métodos poner en contacto células de linaje de monocito/macrófago en el animal con una cantidad terapéutica de un agonista de una proteína IL-B30 de mamífero; o una antagonista de una proteína IL-B30 de mamífero. Las modalidades preferidas incluyen aquellas en las cuales: la proteína IL-B30 de mamífero es una proteína de primate; y/o el antagonista es un anticuerpo que se adhiere a IL-B30 de mamífero. Algunas modalidades incluyen aquellas en las cuales las células de linaje de monocito/macrófago incluyen una célula microglial o una célula dendrítica, o aquella en la cual el animal exhibe signos o síntomas de una condición inflamatoria, leucoproliferativa, neurodegenerativa, o post-traumática. Las modalidades preferidas incluyen aquellas en las cuales el signo o síntoma está en el tejido pulmonar; tejido hepático; tejido neural; tejido linfoide; tejido mieloide; páncreas; tejido gastrointestinal; tejido de tiroides; tejido muscular; o piel o tejido colagenoso. Otros métodos incluyen aquellos en los cuales la modulación es una función inhibidora de la célula leucocítica; y/o en la cual el administrador es el agonista. Preferiblemente, el agonista es IL-B30 de mamífero. Algunas modalidades incluyen aquellas en las cuales el animal experimenta signos o síntomas de autoinmunidad; una condición inflamatoria; autoinmunidad específica de tejido; autoinmunidad degenerativa; artritis reumatoide; osteoartritis; aterosclerosis; esclerosis múltiple; vasculitis; hipersensibilidades demoradas; injerto de piel; transplantes; lesiones espinales; apoplejía; neurodegeneración; una enfermedad infecciosa; isquemia; cáncer; tumores; mieloma múltiple; enfermedad de Castleman; osteoporosis post- menopáusica o enfermedades asociadas con ILS. El administración puede estar en combinación con: un agonista o antagonista de citocina anti-infiamatoria; un analgésico; un agente anti-inflamatorio; o un esferoide. Se proveen varios otros métodos en los cuales la modulación es una función mejorada de la célula leucocítica y/o el administrador es el antagonista. Preferiblemente, el antagonista es: un anticuerpo que se adhiere a IL-B30 de mamífero; o una muteina de 1L-B30 de mamífero que compite con 1L-B30 de mamífero en la adhesión al receptor IL-B30, pero que no tiene una señal substancial. En varias modalidades, se aplica un método en el cual el animal experimenta signos o síntomas de curación de heridas o formación de coágulos. El administrador estará muy a menudo en combinación con: un factor angiogénico; un factor de desarrollo, que incluye FGF o PDGF; un antibiótico; o un factor de aglutinante. Finalmente la presente invención proporciona un método para inducir la proliferación de células T - de memoria por la administración de Li 3-30 o un agonista del mismo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Todas las referencias citadas aquí se incorporan aquí como referencia en el mismo grado que si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.

Descripción i. General II. Complejo IL-12 p40/IL-B30 purificado A. Propiedades físicas B. Propiedades biológicas III. Variantes Físicas A. Variantes de secuencia, fragmentos B. Variantes post-translacionales Glicosilación Otros IV. Variantes Funcionales A. Análogos, fragmentos 1. Agonistas 2. Antagonistas B. Miméticos 1. Proteína 2. Productos Químicos 10 C. Variantes de Especies V. Anticuerpos A. Policlonal B. Monoclonal C. Fragmentos, composiciones de adhesión 15 VI. Ácidos Nucleicos A. Aislados naturales; métodos 8. Genes sintéticos C. Métodos para aislamiento Vil. Preparación del complejo p40/IL-B30, miméticos 20 A. Métodos recombinantes 8. Métodos de síntesis C. Purificación natural VIH. Usos A. Diagnósticos B. Terapéuticos IX.. Equipos A. Reactivos de ácido nucleico B. Reactivos de proteína C. Reactivos de anticuerpos X. Receptores aislantes para los complejos p40/IL-B30 I. General La presente invención provee la descripción y las enseñanzas de apareamiento de proteínas de mamíferos para preparar citocinas solubles, por ejemplo, una molécula secretada que puede ser intermediaria de una señal entre la inmunidad u otras células. Ver, por ejemplo, Paul (1998) Fundamental Immunoloqv (4th ed.) Raven Press, N.Y. Algunos factores solubles están constituidos por polipéptidos heterodiméricos, por ejemplo IL-6 y IL-12. Las formas diméricas que son probablemente las formas fisiológicas, y los fragmentos, o antagonistas serán útiles, por ejemplo, en la modulación fisiológica de células que expresan un receptor. Es probable que la citocina funcional que comprende el complejo p40/lL-B30 tenga efectos estimuladores o inhibidores sobre las células hematopoyéticas, incluyendo por ejemplo, células linfoides, tales como células T, células 8, células asesinas naturales (NK), macrófagos, células dendríticas, progenitores hematopoyéticos, etc. Las proteínas serán también útiles como antígenos, por ejemplo, como ínmunógenos, para crear anticuerpos para varios epitopos en la proteína, tanto epitopos lineales como conformacionales. La subunidad IL-12 p40 ha sido descrita. Ver, por ejemplo, Seiler, et al. US Pat. 5.547.852; Scott y Trinchien, US Pat. 5.571.515; Gately, et al. US Pat. 5.650.492; Liesehke y Mulligan, US Pat. 5.891.680; Warne, et al. US Pat. 5.744.132; y números de acceso gbM86671 , gbAF133197, gbU16674, gbU83184, embY07762, embYi 1129.1 , gbM65272, gbAFOO7S76, gbUI 9841 , gbUI 1815, gbU57752, gbAFOO4O24, gbU49iOO, gbU19834, y embX97OI9. Se identificó una secuencia que codifica IL-B30 a partir de una secuencia genómica humana. La molécula fue designada hulL-B30. También se describió una secuencia de roedor, por ejemplo, de ratón. Ver, por ejemplo, USSN 08/900.905 y 09/122.443. La presente invención abarca composiciones que comprenden combinaciones de estos dos polipéptidos, por ejemplo, p40 e IL-B30, y construcciones de ácido nucleico que codifican ambas secuencias. También se proveen anticuerpos que reconocen las combinaciones, y los métodos para producir los dos mensajes o polipéptidos, por ejemplo, en forma coordinada. El gen IL-B30 humano codifica una pequeña proteína soluble de tipo citocina, de aproximadamente 198 aminoácidos. La secuencia de señal pronosticada psort es probablemente de aproximadamente 17 residuos, y correría desde Met hasta aproximadamente Ala. Ver el Cuadro 1 y la SEC. ID. NO: 1 y 2. El IL-B30 exhibe motivos estructurales que son característicos de un miembro de las citocinas de cadena larga. Comparar, por ejemplo, IL-B30, G-CSF, e IL-6, secuencias obtenibles de GenBank. Ver también USSN 08/900.905 y 09/122.443.

CUADRO 1 Acido nucleico (SEC ID NO: 1 ) que codifica IL-B30 de un primate, por ejemplo, un ser humano. La secuencia de aminoácido traducida es SEC ID NO: 2. ATG CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACÁ 48 Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr -21 -20 -15 -10 GCT' CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG 96 Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln -5 1 5 10 TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC AC CTG GCC TGG AGT GCA CAT 144 Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His 15 20 25 CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT 192 Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr 30 35 40 AC AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAÁ 240 Thr Asn Asp Val Pro His He Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln 45 50 55 GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAÁ AGG ATC CAC CAG GGT 288 Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg He His Gln Gly 60 65 70 75 CTG ATT TT TAT GAG AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC ACÁ GGG GAG 336 Leu He Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp He Phe Thr Gly Glu 80 85 90 CCT TCT CTG CTC CCT GAT AGC CCT GTG GCG CAG CTT CAT GCC TCC CTA 384 Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu 95 100 105 CTG GGC CTC AGC CA CTC CTG CAG CCT GAG GGT CAC CAC TGG GAG ACT 432 Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr 110 115 120 CAG CAG ATT CCA AGC CTC AGT CCC AGC CAG CCA TGG CAG CGT CTC CTT 480 Gln Gln He Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu 125 130 135 CTC CGC TTC AAA ATC CTT CGC AGC CTC CAG GCC TTT GTG GCT GTA GCC 528 Leu Arg Phe Lys He Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala 140 145 150 155 GCC CGG GTC TTT GCC CAT GGA GCA GCA ACC CTG AGT CCC TAA 570 Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro 160 165 MLGSRAVMLLLLLP TAQGRAVPGGSSPA QCQQLSQKLCTLA S2WÍPLVGH DLREEGDEE TTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEK LGSDIFTGEPSLLPDSPVAQLHA SLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQP QR LLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP Secuencia de codificación: ATGCTGGGGA GCAGAGCTGT AATGCTGCTG TTGCTGCTGC CCTGGACAGC TCAGGGCAGA GCTGTGCCTG GGGGCAGCAG CCCTGCCTGG ACTCAGTGCC AGCAGCTTTC ACAGAAGCTC TGCACACTGG CCTGGAGTGC ACATCCACTA GTGGGACACA TGGATC AG AGAAGAGGGA GATGAAGAGA CTAC AA GA TGTTCCCCAT ATCCAGTGTG GAGATGGCTG TGACCCCCAA GGACTCAGGG ACAACAGTCA GTTCTGCTTG CAAAGGATCC ACCAGGGTCT GATTTTTTAT GAGAAGCTGC TAGGATCGGA TATTTTCACA GGGGAGCCTT CTCTGCTCCC TGATAGCCCT GTGGCGCAGC TTCATGCCTC CCTACTGGGC CTCAGCCAAC TCCTGCAGCC TGAGGG CAC C C GGGAG CTCAGCAGAT TCCAAGCCTC AGTCCCAGCC AGCCATGGCA GCGTCTCCTT CTCCGCTTCA AAATCCTTCG CAGCCTCCAG GCCTTTGTGG CTGTAGCCGC CCGGGTCTTT GCCCATGGAG CAGCAACCCT GAGTCCCTAA Roedor, v.gr., ratón, IL-B30 (SEC ID NO: 3 y 4): CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA 60 CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG 115 Met -21 CTG GAT TGC AGA GCA GTA ATA ATG CTA TGG CTG TTG CCC TGG GTC ACT 163 Leu Asp Cys Arg Ala Val He Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr -20 -15 -10 -5 CAG GGC CTG GCT GTG CCT AGG AGT AGC AGT CCT GAC TGG GCT CAG TGC 211 Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys 1 5 10 CAG CAG CTC TCT CGG AAT CTC TGC ATG CTA GCC TGG AAC GCA CAT GCA 259 Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala 15 20 25 CCA GCG GGA CAT ATG AAT CTA CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG ACT 307 Pro Ala Gly Hxs Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr 30 35 40 AAA AAT AAT GTG CCC CGT ATC CAG TGT GAA GAT GGT TGT GAC CCA CAÁ 355 Lys Asn Asn Val Pro Arg He Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln 45 50 55 60 GGA CTC AAG GAC AAC AGC CAG TTC TGC TTG CAÁ AGG ATC CGC CAÁ GGT 403 Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg He Arg Gln Gly 65 70 75 CTG GCT TTT TAT AAG CAC CTG CTT GAC TCT GAC ATC TTC AAA GGG GAG 451 Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp He Phe Lys Gly Glu 80 85 90 CCT GCT CTA CTC CCT GAT AGC CCC ATG GAG CAÁ CTT CAC ACC TCC CTA 499 Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu 95 100 105 CTA GGA CTC AGC CAÁ CTC CTC CAG CCA GAG GAT CAC CCC CGG GAG ACC 547 Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr 110 115 120 CA CAG ATG CCC AGC CTG AGT TCT AGT CAG CAG TGG CAG CGC CCC CTT 595 Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu 125 130 135 140 CTC CGT TCC AAG ATC CTT CGA AGC CTC CAG GCC TTT TTG GCC ATA GCT 643 Leu Arg Ser Lys He Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala He Ala 145 150 155 GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG 691 Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val 160 165 170 CCA ACÁ GCT TAAGGAÍGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA 740 Pro Thr Ala 175 ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTTAAT TAACCCATTA GGACTTGTGC TGTTCTTGTT 800 TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GCAAGGACAC CATTATTAAA GAGAAAAGAA ACAAACCCCA 860 GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG AAAGGAGCTG GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC GAGCCCTTGG 920 CCTTGGAAGC GGGCAAGCAG CTGCGTGGCC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG CATCGAGAAA 980 CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA TCAGAAAAAG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT TATCTGTAAG 1040 AAAAACAAGA AAAGGGGAAC AT ATACTTT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT GTGCAGATGC 1100 ACAGTACTCC AGACAGCAGC TCTGTACCTG CCTGCTCTGT CCCTCAGTTC TAACAGAATC 1160 TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAAT ACGAACTGAC AAA 1203 MLDCRAVI L LLPWVTQGLAVPRSSSPDWAQCQQLSRNLCMLAWNAHAPAGHMNLLREEED EETKNNVPRIQCEDGCDPQGLKDNSQFCLQRIRQG AFYKHLLDSDIFKGEPALLPDSPMEQ LHTSLLGLSQLLQPEDHPRETQQMPSLSSSQQ QRPLLRSKILRSLQAFLAIAARVFAHGAA TLTEPLVPTA La homología estructural de IL-B30 con las proteínas de citocina sugiere una función relacionada de esta molécula. Sin embargo, el reconocimiento de la asociación del polipéptido IL-12 p40 con el polipéptido IL-B30 permite un ensayo biológico de los dímeros de p40/IL-B30 activos, Las composiciones IL-12 p40/IL- B30 pueden estar constituidas ya sea por polipéptidos distintos que representan cada uno de los polipéptidos individuales, o las construcciones de fusión de IL-12 p40 con IL-B30. Las observaciones indican que el dímero es capaz de inducir la producción de interferon-? (IFN?) mediante varias células, por ejemplo, PBMC, que sugiere funciones biológicas para las cuales debe ser usarse el dímero. Además, los experimentos indican que la subunidad ß1 del receptor IL-12 es un componente del receptor para el dímero p40/IL-B30. IFN? activa los macrófagos, estimula las actividades tumoricidas y microbiocidas. También modula la expresión de ia molécula MHC de clase 1 y II incluyendo la sobre-regulación de las moléculas de clase II sobre los monocitos/macrófagos y las células dendríticas, e induce la expresión en las células epiteliales, endoteliaies, y otras células, convirtiéndolas en capaces de presentación de antígeno. La citocina es una citocina de tipo Thl que promueve el desarrollo de células CDA+ T de tipo Thl, pero inhibe que de las células T de tipo Th2. Es un inhibidor poderoso y relativamente específico de la síntesis de lgG4 e IgE inducido por IL-4 mediante los linfocitos B, aunque en concentraciones más elevadas no inhibe específicamente la producción de los isotipos de anticuerpo. IFN? aumenta la respuesta inmune citotóxica contra los organismos y tumores intracelulares intermediados por las células NK y CTLs. Tal como IL-12, IFN? tiene propensión a promover la respuesta citotóxica intermediada por células, mientras que inhibe la inflamación alérgica y la síntesis de IgE. Ver, por ejemplo, Karupiah (ed. 1997) Gamma lnterferon in Antiviral Defense Ohapman & Hall; Jaife (ed. 1992) Anti-lnfective Aplications of Interferon-Gamma Marcel Dekker (ISBN: 0824786882); Sutterwala, et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 65:543-551 ; Billiau, et al. (1998) Ann. NY Acad. Sci. 856:22-32; y Gessani, et al. (1998) Cvtokine Growth Factor Rev. 9:117-123. Los agonistas o antagonistas IL-B30 pueden actuar también como antagonistas funcionales o receptores, por ejemplo, los que bloquean la adhesión de IL-4 o IL-12 a sus respectivos receptores, o que actúan como intermediarios de las acciones opuestas. Por lo tanto, IL-B30, o sus antagonistas, pueden ser útiles para el tratamiento de condiciones médicas anormales, incluyendo desórdenes inmunitarios, por ejemplo deficiencias inmunes de la célula T, inflamación crónica, o rechazo a los tejidos, o para condiciones cardiovasculares o neurofisiológicas. Los agonistas se usarían probablemente en un contexto terapéutico para mejorar la inmunidad intermediada por células, por ejemplo en situaciones anti-tumorales, coadyuvantes, y anti-virales, o para antagonizar las respuestas alérgicas. Los antagonistas se usarían probablemente en el contexto de bloqueo de dicha inmunidad mejorada, por ejemplo, en contribuciones celulares para enfermedades autoinmunes o para condiciones inflamatorias crónicas. Los antígenos naturales son capaces de intermediar en varias respuestas bioquímicas que conducen a respuestas biológicas o fisiológicas en células objetivo. Las modalidades preferidas serían de humanos, pero también existen otras contrapartes de especies de primates u otras especies en la naturaleza. Las secuencias adicionales para las proteínas en otras especies de mamíferos, por ejemplo, primates, caninos, felinos, y roedores, también estarían disponibles. En particular, la asociación de la subunidad IL-12 p40 con IL-B30 ha sido confirmada. Las moléculas IL-12 p40 e IL-B30 deberían haber evolucionado conjuntamente. Si se asocian dos funcionalmente, podrían actuar conjuntamente de la misma manera que IL-12. Ver, por ejemplo, Trinchieri (1998) Adv. Immunol. 70:83-243; Gately, et al. (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:495:521 ; y Trinchieri (1998) Int. Rev. Immunol. 16:365-396. En forma de complejo, sin embargo, se esperaría que el complejo ¡nteractuara con dos receptores de señales altos en la familia del receptor de citocina. Esto ha sido confirmado en el caso de la subunidad ß-1 del receptor 1L-12. Pueden ensayarse otros receptores relacionados para la adhesión con el complejo soluble. Se ha construido una serie de células, por ejemplo BAF/3, que expresa en forma estable varios de estos receptores altos capaces de señalar la transducción. Los sobrenadantes de los transfectantes de los dos IL-12 p40 e IL-B30 (o una construcción de combinación única) en la misma célula, se usaron para ensayar estas varias células para verificar si esta es una respuesta proliferativa o de señalización. En realidad la mayoría de los efectos fisiológicos de la citocina pueden deberse al complejo de las proteínas. De este modo, muchas de las descripciones siguientes de biología resultantes de la citocina pueden ser realmente fisiológicamente afectadas por el complejo que comprende la combinación de las subunidades Las siguientes descripciones pueden aplicarse también al complejo IL-12 p40/IL-B30. Se construyó una fusión de la subunidad IL-12 p40 con IL-B30, tal como por ejemplo, hiper IL-6. Ver, por ejemplo, Fischer, et al (1997) Nature Biotechnol. 15:42-145; Rakemann, et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:1257-1266; y Peters, et al. (1998) J. Immunol. 161 :3575-3581 ; los cuales se incorporan aquí como referencia. Además, el apareamiento del complejo de citocina con un receptor que comprende la subunidad ß1 del receptor IL-12 permite la identificación de los anticuerpos con esta subunidad como antagonista receptor del complejo de citocina. ll. Complejo p4011 L-B3Q. Purificado La secuencia de aminoácido IL-B30 humana se muestra como una modalidad dentro de la SEC ID NO: 2. Otros ácidos nucleicos naturales que codifican la proteína pueden aislarse mediante procedimientos convencionales usando la secuencia provista, por ejemplo técnicas de PCR, o por hibridación. Estas secuencias de aminoácidos, proporcionaron amino a carboxi, y son importantes para proveer la información de secuencia para la subunidad de citoclna que permite distinguir el antígeno de proteína de otras proteínas y ejemplificar numerosas variantes. Además, las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para que reconozcan los segmentos, y secuencias nucleotídicas que permitan la preparación de sondas oligonucíeotídicas, siendo ambas estrategias para la detección o aislamiento, por ejemplo, donación, de genes que codifican dichas secuencias. Tal como se usa aquí, el término "IL-B30 soluble en humano" abarca, cuando se usa en un contexto de proteína, una proteína que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a un polipéptido soluble de SEC ID NO: 2. Los fragmentos significativos del mismo a menudo retendrán funciones similares, por ejemplo antigenicidad. Las modalidades preferidas comprenden una pluralidad de segmentos distintos, por ejemplo, no superpuestos de la longitud especificada. Típicamente, la pluralidad será de por lo menos dos, más usualmente de por lo menos tres, y preferiblemente 5, 7, o incluso más. Aunque puede indicarse la longitud mínima, pueden ser apropiadas longitudes más largas de varios tamaños, por ejemplo, una de longitud 7, y dos de longitud 12. Pueden aplicarse características similares al polipéptido IL-12 p40 y a los polinucleótidos de cualquiera o ambos. Los componentes de adhesión, por ejemplo, los anticuerpos, se adhieren típicamente a un complejo IL-12 p40/IL-B30 con alta afinidad, por ejemplo, de por lo menos aproximadamente 100 nM, usualmente superiores a aproximadamente 30 nM, preferiblemente superiores a aproximadamente 10 nM, y aún más preferiblemente superiores a aproximadamente 3 nM. Se encontrarán complejos de proteínas contrapartes en especies de mamíferos distintas de las humanas, por ejemplo, en otros primates, ungulados, o roedores. Las especies que no son mamíferos también deberían Poseer genes y proteínas estructural o funcionalmente relacionados, por ejemplo, pájaros o anfibios. El término "polipéptido" tal como se usa aquí incluye un fragmento o segmento significativo y abarca una extensión de residuos aminoácidos de por lo menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente de por lo menos aproximadamente 12 aminoácidos, típicamente de por lo menos 16 aproximada- mente 16 aminoácidos, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 20 aminoácidos, y, en modalidades particularmente preferidas de por lo menos aproximadamente 30 o más aminoácidos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50 etc. Dichos fragmentos pueden tener extremos que comienzan y/o terminan en virtualmente todas las posiciones, por ejemplo, que comienzan en los residuos 1 , 2, 3, etc., y finalizan en por ejemplo 175, 174, 173, etc., en todas las combinaciones prácticas para la subunidad IL-S30 o para la subunidad IL-12 p40. Péptidos particularmente interesantes tienen extremos que corresponden a los límites de dominio estructural, por ejemplo hélices A, C, C y/o de los dominios D IL-B30 o los dominios Ig de IL-12 p40 Ver a continuación. El término "composición de adhesión" se refiere a moléculas que se adhieren con especificidad al complejo IL-12 p40/IL-B30, por ejemplo, en una interacción de anticuerpo-antígeno, pero no a los componentes individuales solos La especificidad puede ser más o menos inclusive, por ejemplo, específica para una modalidad particular, o para grupos de modalidades relacionadas, por ejemplo primates, roedores, etc. El vaciamiento o las absorciones pueden proporcionar selectividades deseadas, por ejemplo, vaciar anticuerpo que se adhieren a cualquier componente polipeptídico sólo. Asimismo, se proveen compuestos por ejemplo proteínas que se asocian específicamente con el complejo IL-12 p4011 L-B30, incluyendo una interacción de proteína-proteína relevante fisiológicamente natural, ya sea en forma covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula que tiene una configuración molecular que interactúa con los determinantes de adhesión apropiados. Los compuestos pueden servir como agonistas o antagonistas de una interacción de adhesión de receptor, ver, por ejemplo, Goodman, et al. (eds.) Goodman & Gilman's: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics (current ed.) Pergamon Press. Substancialmente puro, por ejemplo, en un contexto de proteínas, significa típicamente que la proteína está libre de cualquier otra proteína contaminante, de ácidos nucleicos, o de otros productos biológicos derivados del organismo de fuente original. La pureza puede ensayarse por métodos convencionales, típicamente por el peso, y comúnmente será aproximadamente 40% pura, generalmente por lo menos aproximadamente 50% pura, a menudo por lo menos aproximadamente 60% pura, típicamente por lo menos aproximadamente 80% pura, preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% pura, y en la mayoría de las modalidades preferidas, por lo menos aproximadamente 95% pura. A menudo pueden agregarse portadores o excipientes. Una composición que comprende una IL-12 p40 y 1L-B30 substancialmente pura no tendrá grandes cantidades de polipéptidos extraños que no estarán naturalmente asociados con el complejo de los dos polipéptidos. La solubilidad de un polipéptido o un fragmento depende del ambiente y del polipéptido. Muchos parámetros afectan la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, el ambiente electrolítico, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del solvente. Típicamente, la temperatura a la cual se usa el Polipéptido está en un rango de aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 65°C. Usualmente la temperatura de uso es superior a aproximadamente 18°C. Con propósitos de diagnóstico, la temperatura será usualmente de temperatura ambiente o más caliente, pero de menos de la temperatura de desnaturalización de los componentes en el ensayo. Con propósitos terapéuticos, la temperatura usualmente será la temperatura del cuerpo, típicamente aproximadamente 37°C para seres humanos y ratones, aunque bajo ciertas condiciones la temperatura puede elevarse o disminuirse in situ o in vitro. El tamaño y la estructura de los polipéptidos generalmente debería estar en un estado substancialmente estable, y usualmente no debería estar en estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, para conferirle por ejemplo solubilidad, o por estar asociado con lípidos o detergentes. En particular, un complejo constituido por la asociación de los dos polipéptidos se prefiere en una composición de fusión. El solvente y los electrolitos usualmente serán una solución reguladora de pH biológicamente compatible de un tipo usado para la preservación de actividades biológicas, y usualmente se aproximará a un solvente fisiológico acuoso. Usualmente el solvente tendrá un pH neutro, típicamente de entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente de aproximadamente 7.5. En algunas ocasiones, se agregarán uno o más detergentes, típicamente suave no desnaturalizante, por ejemplo CHS (hemisuccinato de colesterilo) o CHAPS (3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1 - propansulfonato), o una concentración suficientemente baja para evitar una interrupción significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína. En otros casos, puede usarse un detergente áspero para efectuar una significativa desnaturalización. Un polipéptido IL-B30 que se adhiere específicamente o que es específicamente inmunorreactivo con un anticuerpo, por ejemplo, tal como un anticuerpo policlonal, generado contra un inmunógeno definido, por ejemplo, tal como un ¡nmunógeno que consiste en una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2 o fragmentos de la misma o un polipéptido generado a partir de un ácido nucleico de SEC ID NO: 1 se determina típicamente en un inmunoensayo. Se incluyen dentro de los límites y delimitaciones de la presente ¡nvención aquellas secuencias de ácido nucleico aquí descritas que incluyen variantes funcionales que codifican polipéptidos que se adhieren selectivamente a los anticuerpos policlonales generados contra el polipéptido prototípico IL-B30 tal como se define estructural y funcionalmente aquí. El inmunoensayo usa típicamente un antisuero policlonal que fue creado por ejemplo para un complejo que comprende una proteína de la SEC ID NO: 2. Este antisuero está seleccionado, o vaciado, para tener baja reactividad cruzada contra otros miembros de familias apropiadas estrechamente relacionadas, preferiblemente de la misma especie, y se elimina cualquier otra reactividad cruzada por inmunoabsorción o por vaciamiento antes de usarlo en el inmunoensayo. En particular, los anticuerpos que se adhieren a los polipéptidos IL-12 p40 o el IL-B30 solos son objetivos para el inmuno-vaciamiento. Pueden aislarse y caracterizarse preparaciones de suero selectivo apropiadas. Para producir antisueros para ser usados en un inmunoensayo, los complementos que comprenden la proteína, por ejemplo de la SEC ID NO: 2, se aislan tal como se describe aquí. Por ejemplo, la proteína recombinante puede producirse en una línea de célula de mamífero. Un huésped apropiado, por ejemplo, una cepa endógama de ratones tales como Balb/c, es inmunizada con el complejo que comprende una proteína de la SEC ID NO: 2 usando un coadyuvante convencional, tal como un coadyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratón convencional (ver Harlow y Lañe). Alternativamente, una construcción de péptido sintético substancialmente de longitud total derivada de las secuencias aquí descritas puede ser usada como ¡nmunógeno. Los sueros policlonales se recogen y se titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo en un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido junto con selecciones o vaciamientos apropiados. Los antisueros policlonales con un título de 104 o superior se seleccionan y se ensayan por su reactividad cruzada contra otros miembros de familias estrechamente relacionadas, por ejemplo, LIF, CT-1 , CNTF, u otros miembros de la familia IL-6, usando un ¡nmunoensayo de adhesión competitivo tal como el descrito en Harlow y Lañe, supra, en las páginas 570- 573. Preferiblemente, se usan por los menos dos miembros individuales de la familia IL-6/IL-12 en esta determinación conjuntamente con el objetivo. Estos miembros de la familia de citocinas de cadena larga pueden producirse como proteínas recombinantes y pueden aislarse usando biología molecular convencional y técnicas de química de proteínas tal como se describen aquí. Por lo tanto, pueden identificarse o producirse preparaciones de anticuerpos que tengan la selectividad o especificidad deseadas para miembros de los subgrupos de la familia de IL-12 p40/IL-B30. Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos que se adhieren a las formas de polipéptidos de fusión del complejo que comprende IL-12 p40 e IL-B30. Pueden usarse inmunoensayos en el formato de adhesión competitivo para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de fusión puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Las proteínas agregadas al ensayo compiten con la adhesión de los antisueros selectivos para el antígeno inmovilizado. La capacidad de las precedentes proteínas para competir con la adhesión de los antisueros selectivos para la proteína inmovilizada se compara con la proteína de fusión. La reactividad cruzada porcentual para las precedentes proteínas se calcula usando cálculos convencionales. Se seleccionan y reúnen aquellos antisueros con una reactividad cruzada inferior al 10% con cada una de las proteínas enumeradas más arriba. Los anticuerpos selectivos de reacción cruzada son luego extraídos de los antisueros reunidos mediante inmuno-absorción con las proteínas previamente enumeradas. Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se usan luego en un inmunoensayo de adhesión competitivo tal como se describió más arriba para comparar una segunda proteína con la proteína de fusión inmunogéníca. A fin de efectuar esta comparación, se ensayó cada una de las dos proteínas en un amplio rango de concentraciones, y se determinó la cantidad de cada proteína necesaria para inhibir el 50% de la adhesión del antisuero selectivo para la proteína de fusión inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es inferior al doble de la cantidad de la proteína de fusión necesaria, entonces se dice que la segunda proteína se adhiere específicamente a un anticuerpo selectivo generado para el ¡nmunógeno. lll. Variantes Físicas Esta invención abarca complejos que comprende proteínas o péptidos que tienen una identidad de secuencia de aminoácido substancial con las secuencias de aminoácidos del antígeno IL-12 p40/IL-B30. Las variantes incluyen especies, o variantes polimórficas o alélicas. La homología de la secuencia de aminoácido, o de la identidad de secuencia, se determina optimizando los apareamientos del residuo, si es necesario, mediante la introducción de brechas según se requiera. Ver también, Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443453; Sankoff, et al. (1983) Chapter One in Time Warps, Strinq Edits. And Macromolecules: The Theorv and Practice of Seguence Comparíson, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA; and the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, Wl. La identidad de secuencia cambia cuando se consideran las substituciones conservadoras como apareamientos. Las substituciones conservadoras incluyen típicamente substituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. La conservación puede aplicarse para críticas biológicas, características funcionales, o características estructurales. Las secuencias de aminoácidos homólogos están típicamente destinadas a incluir variaciones naturales polimórficas o alélicas e interespecies, de una secuencia de proteína. Los péptidos o proteínas homólogos típicos tendrán una identidad de 25-100% (si pueden introducirse brechas), hasta una identidad de 50-100% (si se incluyen substituciones conservadoras), con la secuencia de aminoácido de IL-B30. Las mediciones de identidad serán de por lo menos aproximadamente 35%, generalmente de por lo menos aproximadamente 40%, a menudo de por lo menos aproximadamente 50%, típicamente de por lo menos aproximadamente 60%, usualmente de por lo menos aproximadamente 70%, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 80% y aún más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 90%. El ADN IL-12 p40 o IL-B30 aislado puede ser rápidamente modificado mediante substituciones nucleotídicas, deleciones nucleotídicas, inserciones nucleotídicas, e inversiones de tramos nucleotídicos cortos. Estas modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de ADN, que codifican estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tiene actividad funcional u otra actividad similar fisiológica, inmunogénica o antigénica. Estas secuencias modificadas pueden usarse para producirse antígenos mutantes o para mejorar la expresión. La expresión mejorada puede involucrar amplificación génica, transcripción incrementada, traducción incrementada y otros mecanismos. "Mutante IL-B30" abarca un polípéptido que por otra parte entra dentro de la definición de entidad de secuencia de ¡L-B30 tal como se estableció precedentemente, pero que tiene una secuencia de aminoácido que difiere de la de IL-B30 tal como se encuentra normalmente en la naturaleza, ya sea a modo de deleción, substitución, o inserción. Esto incluye generalmente proteínas que tienen identidad significativa con una proteína que tiene la secuencia de SEC ID NO: 2, y que comparte varias actividades biológicas, por ejemplo antigénicas o inmunogénicas, con aquellas secuencias, y en las modalidades preferidas contiene la mayor parte de las secuencias naturales de longitud total descritas. Se prefieren típicamente secuencias de longitud total, aunque también son útiles versiones truncadas, y asimismo genes o proteínas que se encuentran en fuentes naturales que típicamente son las más deseables. Pueden aplicarse conceptos similares a diferentes proteínas IL-B30, particularmente aquellas que se encuentran en varios animales de sangre caliente, por ejemplo mamíferos y aves. Estas descripciones abarcan generalmente varias proteínas IL-B30, y no se limitan a las modalidades particulares para primates específicamente discutidas. La mutagénesis de IL-12 p40 o IL-B30 también puede llevarse a cabo preparando inserciones o deleciones de aminoácido. Pueden generarse substituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación para llegar hasta una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi-terminales. La mutagénesis al azar puede llevarse a cabo en un codón objetivo y los mutantes expresados pueden ser rastreados para la actividad deseada. Los métodos para preparar mutaciones de substitución en sitios predeterminados en ADN que tienen una secuencia conocida son bien conocidos en el arte, por ejemplo mediante mutagénesis de cebador M13 o técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Ver, por ejemplo, Sambrook, et al. (1989); Ausubel et al. (1987 and Supplements); y Kunkel, et al. (1987) Methods in Enzvmol. 154:367-382. Las modalidades preferidas incluyen por ejemplo 1 vez, 2 veces, 3 veces, 5 veces, 7 veces, etc., preferiblemente substituciones conservadoras a los niveles de nucleótido o aminoácido. Preferiblemente, las substituciones estarán alejadas de las cisteinas conservadas, y a menudo estarán en las regiones alejadas de los dominios estructurales helicoidales. Dichas variantes pueden ser útiles para producir anticuerpos específicos, a menudo compartirán muchas o la totalidad de las propiedades biológicas. El reconocimiento de la estructura de citocina provee importante información para discernir la estructura y las posiciones de los residuos que pueden modificarse para efectuar los cambios deseados en la interacción del receptor. Asimismo, la interacción de IL-12 p40 con la proteína IL-B30 requiere características estructurales complementarias en la superficie ¡nteractuante. Los análisis estructurales permitirán efectuar una predicción adicional de los residuos superficiales críticos en ambas cosas, la formación de complejos y el complejo para la interacción del receptor. La presente invención provee también proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas usando segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no están normalmente fusionadas de la misma manera. Puede aplicarse un concepto similar a las secuencias heterólogas de ácido nucleico. Además, pueden prepararse nuevas construcciones combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, pueden intercambiarse adhesiones al objetivo u otros segmentos entre diferentes polipéptidos de fusión o fragmentos. Ver, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336, y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992.

El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981 ) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintéticos apropiados. A menudo podrá obtenerse un fragmento de doble filamento ya sea mediante síntesis del filamento complementario y acoplamiento del filamento conjuntamente bajo condiciones apropiadas o agregando el filamento complementario usando polimerasa de ADN con una secuencia cebadora apropiada, por ejemplo, mediante técnicas de PCR. Puede aplicarse un análisis estructural a este gen, en comparación con la familia IL-6 de citocinas. La familia incluye, por ejemplo IL-6, IL-II, IL-12, G-CSF, LIF, OSM, CNTF y Ob. La alineación de las secuencias IL-B30 humanas y , de ratón con otros miembros de la familia ILB debería permitir la definición de las características estructurales. En particular, pueden determinarse los residuos de lámina ß y de hélice a usando por ejemplo un programa PASMOL, ver Bazan, et al. (1996) Nature 379:591 ; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991) Protein EnQineering 4:263-269 Ver, también, Wilkins, et al. (eds. 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY. Los residuos preferidos para las substituciones incluyen los residuos expuestos a la superficie que podrían predecir la interacción con el receptor. Otros residuos que deberían conservar la función serán substituciones conservadoras, particularmente en una posición alejada de los residuos expuestos en la superficie.

IV. Variantes Funcionales El bloqueo de la respuesta fisiológica para los complejos IL-12 p40/IL-B30 puede ser el resultado de la ¡nhibición competitiva de la adhesión del ligando a su receptor. La identificación de una subunidad del receptor permite la caracterización adicional tal como se ha descrito, y el uso de anticuerpos para esta subunidad para bloquear la adhesión y/o la señalización con el complejo. En los ensayos in vitro de la presente invención a menudo se usan complejos aislados, proteínas, fragmentos solubles que comprenden segmentos de adhesión al receptor de estas proteínas, o fragmentos adheridos a substratos de fase sólida. Estos ensayos permitirán también la determinación diagnóstica de los efectos de adhesión de mutaciones y modificaciones de segmento, o bien de mutaciones y modificaciones de citocina, por ejemplo, análogos de complejo IL-12 p4OIIL-B30. Esta invención contempla también el uso de ensayos competitivos de rastreo de drogas, por ejemplo, aquellos en los cuales los anticuerpos neutralizadores para el complejo de citocina o los fragmentos de adhesión al receptor compiten con un compuesto de ensayo. "Derivados" de antígenos IL-12 p40/IL-B30 incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos a partir de formas naturales, variantes de glicosílación, y conjugados covalentes o agregados con otras porciones químicas. Pueden prepararse derivados covalentes mediante enlaces de funcionalidades con grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácido del complejo IL-12 p40/IL-B30 o en los términos N- o C-, por ejemplo, mediante medios convencionales. Ver, por ejemplo, Lundblad y Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, vols. 1-2, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, Hugli (ed. 1989) Techniques in Protein Chemistrv. Academic Press, San Diego, CA; y Wong (1991) Chemistrv of Protein Coniugation and Cross Linking. CRC Press, Boca Ratón. FL. En particular, se incluyen alteraciones de glicosilación, preparadas por ejemplo mediante modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas de procesamiento adicionales. Ver, por ejemplo, Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497-534. Asimismo, están también abarcadas versiones de ios péptidos con la misma secuencia de aminoácido primaria que tienen otras modificaciones menores, incluyendo residuos de aminoácido fosforilados, por ejemplo fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina. También se proveen polipéptidos de fusión entre IL-12 p40/ILB30. Muchos receptores de citocina u otras proteínas de superficie son multiméricos, por ejemplo, son entidades homodiméricas, y una construcción de repetición puede tener varias ventajas incluyendo menor susceptibilidad a la disociación proteolítica. Ejemplos típicos están constituidos por fusiones de un polipéptido informante, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de adhesión a un receptor, de modo que la presencia o ubicación del ligando fusionado pueda ser fácilmente determinada. Ver, por ejemplo, Dull, et al., Patente Norteamericana No. 4.859.609. Otros pares de fusión génicos incluyen ß-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, ß-iactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa, factor de apareamiento alfa de la levadura, y detección o purificación de marcadores tales como la secuencia FLAG de la secuencia Hís6. Ver, por ejemplo, Godowski, et al. (1988) Science 241 :812-816. También se proveen construcciones de fusión con otras entidades terapéuticas, por ejemplo, aquellas que pueden ser coadministradas, pero proteolíticamente disociadas. Los péptidos de fusión típicamente estarán constituidos por métodos de ácidos nucleicos recombinantes o bien por métodos de polipéptidos sintéticos. Las técnicas para la manipulación y expresión de ácido nucleico han sido descritas en forma general, por ejemplo, en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (2d ed.) vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory y Ausubel et al. (eds. 1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene y Wiiey, NY. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos han sido descritas por ejemplo en Merrifleld (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Svnthesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford; y Grant (1992) Svnthetic Peptides: A Uset^s Guide. W. H. Freeman, NY. Los métodos de replegado pueden ser aplicables a las proteínas sintéticas. Esta invención contempla también el uso de derivados de proteínas IL-12 p40 o IL-B30 distintas de las variaciones en la secuencia de aminoácido o glicosilación. Dichos derivados pueden involucrar asociación covalente o agregativa con porciones químicas o portadores de proteína. Los derivados covalentes o agregativos serán útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación tales como para purificación por afinidad de pares de adhesión, por ejemplo otros antígenos. Una IL-12 p40 o IL-B30 puede inmovilizarse mediante adhesión covalente a un soporte sólido tal como SEPHAROSE activada por bromuro de cianógeno, mediante métodos que son bien conocidos en el arte, o puede ser adsorbida sobre superficies de poliolefina, con o sin entrecruzamiento de glutaraldehído, para ser usado en el ensayo o purificación de anticuerpos anti-IL-12 p40 o IL-B30 o como una composición de adhesión alternativa. Las IL-12 p40, IL-B30 o proteínas de fusión pueden estar también rotuladas con un grupo detectable, para ser usadas por ejemplo en ensayos de diagnóstico. La purificación del complejo IL-12 p40/IL-B30 puede efectuarse mediante un anticuerpo inmovilizado a un polipéptido o bien a una secuencia componente o a un par de adhesión complementario, por ejemplo, porción de adhesión de un receptor. Un polipéptido IL-12 p4OIIL-B30 solubilizado o un fragmento de acuerdo con esta invención pueden usarse como inmunógeno para la producción de antisuero o anticuerpos específicos para la adhesión. Puede usarse antígeno purificado para rastrear anticuerpos monoclonales o fragmentos de adhesión al antígeno, que comprende fragmentos de adhesión al antígeno de anticuerpos naturales, por ejemplo, Fab, Fab\ F(ab)2, etc. Los antígenos IL-12 p40/IL-B30 purificados pueden usarse también como reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados del complejo citosina, que puede ser un diagnóstico de una condición anormal o una condición fisiológica específica o enfermedad. Esta invención contempla anticuerpos creados contra secuencias de aminoácidos codificados por la secuencia nucleotídica que se muestra en la SEC ID NO: 1 , o fragmentos de proteínas que la contienen. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de adhesión con o que están creados contra dominios específicos, por ejemplo, hélices A, B, C, o D del IL-B30 o los dominios Ig de IL-12 p40. La presente ¡nvención contempla la aislamiento de variantes especies adicionales estrechamente relacionadas. El análisis de borrón Southern y Northern establecerá que existen entidades genéticas similares en otros mamíferos. Es probable que IL-B30 esté ampliamente dispersado en variantes especies, por ejemplo roedores, lagomorfos, carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos, y primates. La ¡nvención provee también medios para aislar un grupo de antígenos relacionados que exhiben ambas cosas, diversidad y similaridad en la estructura expresión, y función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de las moléculas se acelerará enormemente mediante la aislamiento y caracterización de especies distintas adicionales o variantes polimórficas de las mismas. En particular, la presente invención provee sondas útiles para identificar entidades genéticas homologas adicionales en diferentes especies.

Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de un IL-B30, por ejemplo, cualquier tipo de especie o células que carecen de las proteínas correspondientes y que exhiben actividad de base negativa. Esto debería permitir el análisis de la función de IL-B30 en comparación con células de control no transformadas. La disección de elementos estructurales críticos que efectúan las varias funciones fisiológicas intermediadas a través de estos antígenos es posible usando técnicas convencionales de biología molecular moderna, particularmente en miembros comparativos de la clase relacionada. Ver, por ejemplo, la técnica de mutagénesis de escaneo de homólogos descrita en Cunningham, et al. (1989) Science 243:1339-1336, y el método usado en O'Dowd, et al. (1988) J. Biol Chem. 263:15985-15992; y Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9:43814390. Las funciones intracelulares involucrarían probablemente señalización del receptor. Sin embargo, puede ocurrir internalización de la proteína bajo ciertas circunstancias y puede ocurrir la interacción entre componentes intracelulares y citocinas. Los segmentos específicos de interacción de IL-B30 con componentes interactuantes pueden identificarse por mutagénesis o por medios bioquímicos directos por ejemplo entrecruzamiento o métodos de afinidad. El análisis estructural mediante métodos físicos o cristalográficos también será aplicable. Una investigación adicional del mecanismo de la transducción de señales incluirá el estudio de componentes asociados que pueden ser aislables por métodos de afinidad o por medios genéticos, por ejemplo por complementación del análisis de mutantes. Se proseguirá un estudio adicional de la expresión y control de 1L-B30. Los elementos controladores asociados con los antígenos deberían exhibir patrones fisiológicos diferenciales, de desarrollo, específicos de tejido, u otros patrones de expresión. Las regiones genéticas cadena arriba o cadena abajo, por ejemplo, los elementos de control, son muy interesantes. Los estudios estructurales de los antígenos IL-B30 conducirán al diseño de nuevos antígenos, particularmente análogos que exhiben propiedades agonistas o antagonistas en la molécula. Esto puede combinarse con los métodos de rastreo previamente descritos para aislar antígenos que exhiben los espectros de actividades deseadas.

V. Anticuerpos Pueden crearse anticuerpos para varios epitopos de las proteínas p40/IL- B30, incluyendo especies, variantes polimórficas o alélicas y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas naturales como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, pueden crearse anticuerpos para IL-B30 en sus formas activas o en sus formas inactivas, incluyendo versiones naturales o desnaturalizadas. También se contemplan anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de adhesión y las versiones de cadena única, contra fragmentos predeterminados de los antígenos pueden crearse mediante inmunización de los animales con conjugados de los fragmentos con proteínas ¡nmunogénicas. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser rastreados para adherirse a IL-B30 normales o defectuosos, o pueden rastrearse para determinar la actividad agonística o antagonística, por ejemplo intermediados a través de un receptor. Los anticuerpos pueden ser agonísticos o antagonísticos, por ejemplo, mediante bloqueo estérico de la adhesión a un receptor. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se adherirán con por lo menos un KD de aproximadamente 1 mM, más usualmente de por lo menos aproximadamente 300 µM, típicamente por lo menos aproximadamente 100 µM, más típicamente de por lo menos aproximadamente 30 µM, preferiblemente de por lo menos 10 µM, y más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 3 µM o más. Los anticuerpos de esta invención pueden ser también útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o anticuerpos no neutralizadores, dichos anticuerpos pueden ser rastreados para la capacidad de adherirse a los antígenos sin inhibir la adhesión a un receptor. Como anticuerpos neutralizadores, pueden ser útiles en ensayos de adhesión competitiva. Asimismo serán útiles para detectar o cuantificar la proteína IL-B30 o sus receptores. Ver, por ejemplo, Chan (ed. 1987) Immunology A Practical Guide; Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds. 1991 ) Principies and Practlce of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; y Ngo (ed. 1988) Nonisotopic Immunoassav Plenum Press, N.Y. Las absorciones cruzadas u otros ensayos identificarán anticuerpos que exhiben varios espectros de especificidades, por ejemplo, especificidades únicas o de especies compartidas. Además, los anticuerpos, incluyendo fragmentos de adhesión de antígeno de esta invención pueden ser potentes antagonistas que se adhieren al antígeno y que inhiben la adhesión funcional, por ejemplo, a un receptor que puede producir una respuesta biológica. También ser útiles como anticuerpos no neutralizadores, y pueden ser acoplados a toxinas o radionúclidos de manera que cuando el anticuerpo se adhiere a un antígeno, una célula que le expresa, por ejemplo en su superficie, es muerta. Además, estos anticuerpos pueden conjugarse con drogas o con otros agentes terapéuticos, ya sea en forma directa o en forma indirecta mediante un ligador y pueden efectuar el envío de la droga al objetivo. Los fragmentos de antígeno pueden unirse a otros materiales particularmente polipéptidos, en forma fusionada o pueden unirse covalentemente polipéptidos para usarlos como inmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos pueden estar fusionados o ligados covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de la lapa "Fissurella", albúmina de suero bovino, toxoide del tétanos, etc. Ver Microbioloqv; Hoeber Medical División, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificitv of Seroloqial Reactions. Dover Publications, New York; Williams, et al. (1967) Methods in Immunoloqv and Immunochemistrv, vol. 1 , Academic Press, New York; y Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual. CSH Press, NY, para las descripciones de los métodos para preparar antisueros policlonales. En algunos casos, es conveniente preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios huéspedes de mamífero de tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de las técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales puede encontrarse en, por ejemplo, Sutes, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4a. ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias aquí citadas; Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2a. ed.), Academic Press, New York; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que describe un método para generar anticuerpos monoclonales. Otras técnicas apropiadas involucran la exposición in vitro de linfocitos para los polipéptidos antigénicos o alternativamente para la selección de genotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Ver, Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire ¡n Phage Lambda", Science 246:1275-1281 ; y Ward, et al. (1989) Nature 341 :544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificaciones, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos estarán rotulados mediante unión, ya sea en forma covalente o no covalente, de una sustancia que provee una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de rótulos y técnicas de conjugación de las cuales se informa extensamente tanto en la literatura científica como de patentes. Entre los rótulos apropiados se incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes, donde se explica el uso de dichos rótulos incluyen las patentes norteamericanas Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Asimismo, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, ver Cabilly, patente norteamericana No. 4.816.567; Moore, et al., patente norteamericana No. 4.642.334; y Queen, et al. (1989) Proc. Nati Acad. Sci. USA 86:10029-10033. Los anticuerpos de esta invención pueden usarse también para cromatografía de afinidad a fin de aislar la proteína. Pueden prepararse columnas en las que los anticuerpos están ligados a un soporte sólido. Ver, por ejemplo, Wilchek et al. (1984) Meth. Enzvmol. 104:3-55. A la inversa, pueden usarse proteínas para el vaciamiento o absorciones cruzadas a fin de preparar composiciones adherentes selectivamente específicas. Los anticuerpos creados contra cada IL-B30 serán útiles para elevar los anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles para detectar o para diagnosticar varias condiciones inmunológicas relacionadas con la expresión de los antígenos respectivos.

VI. Ácidos Nucleicos Las secuencias peptídicas y los reactivos relacionados son útiles para detectar, aislar o identificar un clon de ADN que codifica IL-12 p40 y IL-B30, por ejemplo, provenientes de una fuente natural. Típicamente, serán útiles para aislar genes de un mamífero, y podrán aplicarse procedimientos similares a genes aislados de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá la aislamiento de IL-12 p40 o IL-B30 a partir de los mismos, por ejemplo variantes polimórficas y otras especies. Estará disponible una variedad de diferentes modalidades para aislar en forma exitosa un clon de ácido nucleico apropiado. Tales genes permiten la construcción de construcciones de coexpresión o construcciones de fusión. La proteína o polipéptidos purificados son útiles para generar anticuerpos por métodos convencionales, tal como se describió más arriba. • Pueden presentarse proteínas purificadas o péptidos sintéticos para un sistema inmunitario con el fin de generar anticuerpos monoclonales o policlonales Ver. por ejemplo, Coligan (1991 ) Current Protocols in Immunoloqv Wiley/Greene; y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Press. Por ejemplo, podría usarse una composición de adhesión específica para rastrear una genoteca de expresión preparada a partir de una línea de células que expresan IL-12 p40 y también IL-B30. El rastreo de la expresión intracelular puede llevarse a cabo mediante varios procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Podrían usarse composiciones de adhesión para purificar la afinidad o para seleccionar células que expresen una proteína de fusión de superficie. También pueden usarse segmentos peptídicos para seleccionar o para identificar oligonucleótidos apropiados a fin de rastrear una genoteca. Puede usarse un código genético para seleccionar oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para el rastreo. Ver, por ejemplo, GenBank y SEC ID NO: 1. En combinación con las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar clones correctos de una genoteca. También se usarán como sondas, cebadores o filamentos antisentido secuencias complementarias. Serían particularmente útiles varios fragmentos, por ejemplo, acoplados con vectores anclados o técnicas de PCR complementarias de poli-A o con ADN complementario de otros péptidos. Esta invención contempla el uso de ADN aislado o de fragmentos que codifican un complejo biológicamente activo del correspondiente polipéptido IL-12 p40 e IL-B30, que carece particularmente de la porción que codifica las porciones no traducidas de las secuencias descritas. Además, esta ¡nvención cubre ADN recombinante o aislado que codifica una proteína de fusión biológicamente activa o un polipéptido y que es capaz de hibridarse bajo condiciones apropiadas con las secuencias de ADN aquí descritas. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede consistir en un antígeno intacto, o un fragmento, y puede tener una secuencia de aminoácido descrita en por ejemplo, SEC ID NO: 2, particularmente un polipéptido maduro secretado. Además, esta invención cubre el uso de ADN recombinante o aislado o de fragmentos del mismo, que codifican proteínas que exhiben una alta identidad con un complejo IL-12 p49/IL-B30 secretado. El ADN aislado puede tener las respectivas secuencias reguladoras en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, mejoradores, señales de adición de poli-A, y otros. Alternativamente, la expresión puede efectuarse ligando operativamente un segmento codificador con un promotor heterólogo, por ejemplo insertando un promotor cadena arriba desde un gen endógeno. Ver, por ejemplo, Treco, et al. WO 96129411 o USSN 08/406.030. Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN, o un polímero mixto, que está substancialmente separado de otros componentes extraños que acompañan naturalmente una secuencia natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, y/o secuencias genómicas flanqueadoras de la especie originante. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido removida de su ambiente natural, e ¡ncluye aislados de ADN donados o recombinantes y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados mediante sistemas heterólogos. Una molécula substancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula, por ejemplo, distintas de un cromosoma aislado. En general, el ácido nucleico estará en un vector o fragmento de menos de aproximadamente 50 kb, usualmente de menos de aproximadamente 30 kb, típicamente de menos de aproximadamente 10 kb, y preferiblemente de menos de aproximadamente 6 kb.

Un ácido nucleico aislado generalmente será una composición homogénea de moléculas, pero en algunas modalidades contendrá menor heterogeneidad. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos o porciones poliméricas no críticos para una actividad o función biológica deseada. Un ácido nucleico "recombinante" se define o bien por su método de producción o por su estructura. Con referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto preparado mediante un procedimiento, el procedimiento es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, que involucran por ejemplo la intervención humana en la secuencia nucleotídica, típicamente la selección o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico preparado por generación de una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos entre sí, pero que significa que excluirán productos naturales, por ejemplo, los mutantes que ocurren en forma natural. Por lo tanto, por ejemplo, los productos preparados por transformación de células con cualquier vector que no ocurre en forma natural están abarcados así como lo están también los ácidos nucleicos que comprenden secuencias derivadas mediante el uso de cualquier proceso oligonucleotídico de síntesis. Esto se efectúa a menudo para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo o un aminoácido conservador, y que introduce al mismo tiempo o que elimina un sitio de reconocimiento de secuencia.

Alternativamente, se efectúa para unir conjuntamente segmentos de ácido nucleico de las funciones deseadas a fin de generar una única entidad genética que comprende una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales comúnmente disponibles. A menudo el objetivo de dichas manipulaciones artificiales son los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción pero pueden incorporarse por diseño otros objetivos específicos de sitio, por ejemplo promotores, sitios de réplica de ADN, secuencias reguladoras, secuencias de control, u otras características útiles. Se propone un concepto similar para un polipéptido recombinante, por ejemplo de fusión. Específicamente, incluidos están los ácidos nucleicos sintéticos que, por redundancia de código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de varias especies o variantes polimórficas diferentes. Un "fragmento" significativo en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de por lo menos aproximadamente 22 nucleótidos, comúnmente de por lo menos aproximadamente 29 nucleótidos, muy a menudo de por lo menos aproximadamente 35 nucleótidos, típicamente de por lo menos aproximadamente 41 nucleótidos, usualmente de por lo menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 55 nucleótidos, y son modalidades particularmente preferidas las que son de por lo menos aproximadamente 60 o más nucieótidos, por ejemplo, 67, 73, 81 , 89, 95, etc., incluyendo cientos y/o miles.

Un ADN que codifica para una proteína IL-B30 resultará particularmente útil para identificar genes, especies de ARNm, y ADNc que codifican proteínas relacionadas o similares, así como también ADN que codifican proteínas homologas de diferentes especies. Habrá homólogos en otras especies incluyendo primates, roedores, caninos, felinos, y aves. Varias proteínas IL-B30 deberían ser homologas y están abarcadas aquí. Sin embargo, incluso proteínas que tienen una relación de evolución más distante con el antígeno, pueden ser fácilmente aisladas bajo condiciones apropiadas empleando estas secuencias sí las mismas son suficientemente homologas. Las proteínas de primate IL-B30 son particularmente interesantes. También lo son las IL-12 p40, que son proteínas que constituyen objetivos principales para las construcciones de fusión o para composiciones de combinación. Los clones recombinantes derivados de secuencias genómicas por ejemplo los que contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos incluyendo, por ejemplo, células transgénicas y organismos, y terapia génica. Ver por ejemplo Goodnow (1992) "Transgenic Animáis" in Roitt (ed.) Encvclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, PP. 1502-1504; Travis (1992) Science 256: 1392-1394; Kuhn, et al. (1991 ) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas y Embrvonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Rosenberg (1992) J. Clinical Oncoloqy 10:180-199. Homología sustancial, por ejemplo identidad, en el contexto de comparación de secuencias de ácido nucleico, significa que cualquiera de los segmentos, o sus filamentos complementarios, cuando se comparan, son idénticos cuando están alineados óptimamente con inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas en por lo menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, generalmente por lo menos aproximadamente 58%, comúnmente por lo menos aproximadamente 65%, a menudo por lo menos aproximadamente 71 %, típicamente por lo menos aproximadamente 77%, usualmente por lo menos aproximadamente 85%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 95 ó 98% o más, y en modalidades particulares, tan alta como 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectiva, a un filamento, o a su complemento, usando típicamente una secuencia de IL-12p40 y/o IL-B30, por ejemplo en SEC ID NO: 1. Típicamente, ocurrirá una hibridación selectiva cuando existe por lo menos una identidad de aproximadamente 55% en una extensión de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 75% en una extensión de aproximadamente 25 nucleótidos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% en aproximadamente 20 nucleótidos. Ver, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203- 213. La longitud de la comparación de la identidad tal como se describe puede ser de extensiones más prolongadas y en algunas modalidades será en una extensión de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente, por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, y preferiblemente por lo menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos. Condiciones rigurosas, cuando nos referimos a la homología en el contexto de hibridación, consisten en condiciones combinadas rigurosas de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros parámetros típicamente aquellos controlados en las reacciones de hibridación. Las condiciones de temperatura rigurosas usualmente incluirán temperaturas en exceso de aproximadamente 30°C, usualmente en exceso de aproximadamente 37°C, típicamente en exceso de aproximadamente 55°C y más típicamente en exceso de aproximadamente 60 o 65°C y preferiblemente en exceso de aproximadamente 70°C. Condiciones salinas rigurosas serán comúnmente las de aproximadamente 1000 mM, usualmente de menos de aproximadamente 400 mM, típicamente menos de aproximadamente 250 mM, preferiblemente menos de aproximadamente 150 mM incluyendo aproximadamente 100, 50 o incluso 20 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medición de cualquier parámetro. Ver, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J.Mol. Biol. 31 :349-370. La hibridación bajo condiciones rigurosas debería dar una base de por lo menos dos veces con respecto a la base, preferiblemente por lo menos 3-5 o mas. Para la comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se ingresan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia calcula luego el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo en relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros de programa designados. Una alineación óptica de secuencias para comparación puede llevarse a cabo por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48:443, mediante la investigación del método de similaridad de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444. mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o por inspección visual (ver en general Ausubel et al., supra). Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. El PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples desde un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas, en pares para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También gráfica un árbol o dendrograma que muestra las relaciones de cúmulos usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresivo de Feng y Doolíttle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación en pares de las dos secuencias más similares, que producen un cúmulo de dos secuencias alineadas. Este cúmulo se almea luego con las siguiente secuencia más próxima o cúmulo de secuencias alineadas. Dos cúmulos de secuencias están alineados mediante una simple extensión de la alineación en pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas, en pares. El programa se lleva a cabo designando secuencias específicas y sus coordenadas nucleotídicas o de aminoácido para regiones de comparación de secuencia y mediante designación de los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias de ensayo para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia usando los parámetros siguientes: peso de la brecha por omisión (3.00), peso de la longitud de la brecha por omisión (0,10), y i brechas finales ponderadas. Otro ejemplo de algoritmo que es apropiado para determinar el i porcentaje de identidad de secuencia y la similaridad de secuencia es el algoritmo BLAST que ha sido descrito por Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. I 215:403-410. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está disponible para el público en National Center for Biotechnology Information (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencia de alto resultado (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de interrogación, que o bien se aparea o satisface algunos T de resultado en el umbral de valor positivo cuando se almea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se define como el umbral de resultado de palabra vecina (Altschul, et al., supra). Esta palabra vecina inicial cercana actúa como siembra para las investigaciones de iniciación hasta llegar a una HSP más larga que las contiene. Las palabras iniciales se extienden luego en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta llegar tan lejos como pueda incrementarse el resultado de la alineación acumulativa. La extensión de las palabras iniciales en cada dirección se detiene cuando: el resultado de alineación acumulativa cae por la cantidad X desde su valor máximo logrado; el resultado acumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de resultado negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa como por omisión una longitud de palabra (W) de 11 , la matriz de resultado BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambos filamentos. Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST efectúa también un análisis estadístico de la similaridad entre las dos secuencias (ver por ejemplo Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de ia similaridad provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad mediante la cual ocurriría por casualidad un apareamiento entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácido. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0.1 , más preferiblemente inferior a aproximadamente 0.01 , y aún más preferiblemente menos de aproximadamente 0.001. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico de polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente de reacción cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico tal como se describe a continuación. Por lo tanto un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico al segundo polipéptido, por ejemplo cuando los dos péptidos difieren únicamente por las sustituciones conservadoras. Otra indicación de que las dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas tal como se describe a continuación. IL-B30 de otras especies de mamíferos puede ser donado y aislado mediante hibridación de especies cruzadas entre especies estrechamente relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies distantemente relacionadas, y por lo tanto la hibridación de las especies relacionadas en forma relativamente íntima es aconsejable.

Alternativamente la preparación de una preparación de anticuerpos que exhiba menos especificidad de especies puede ser útil en modalidades de donación de expresión.

Vil. Efectuando combinaciones de P4O/IL-B30; Miméticos El ADN que codifica el IL-12p40 o IL-B30 o fragmentos de las mismas puede obtenerse mediante síntesis química, rastreo de genotecas de ADNc, o rastreos de colecciones genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de muestras de tejidos o líneas de células. Ver por ejemplo Okayama y Berg (1982) Mo. Qell.Biol. 2:161-170; Gubler y Hoffman (1983) Gene 25:263-269; y Glover (ed. 1984) DNA Cloninq: A Practical Approach. IRL Press, Oxford. Alternativamente, las secuencias provistas aquí proporcionan cebadores de PCR útiles o permiten una preparación de síntesis u otra preparación de genes apropiados que codifican una IL-12 o IL-B30; incluyendo las modalidades que ocurren en forma natural. Este ADN puede expresarse en una amplia variedad de células huésped para las síntesis de un IL-12 p40 y IL-B30 de longitud total o fragmentos que a su vez pueden usarse por ejemplo para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de adhesión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de la estructura/función. Vectores tal como se emplea aquí comprende plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del huésped. Ver por ejemplo Pouwels, et al. (1985 y Supplements) Cloninq Vectors: A Laboratory Manual Elsevier. N.Y.; y Rodríguez, et al. (eds. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloninq Vectors y Their Uses, Buttersworth, Boston, MA. Para los propósitos de esta invención, las secuencias de ADN están ligadas operativamente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, ADN para una pre-secuencia o líder secretora está ligado operativamente a un polipéptido si se expresa como pre-proteina o si participa en la dirección del polipéptído hasta la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificadora, si el mismo controla la transcripción del polipéptido; un sitio de adhesión de ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificadora si está situado para permitir la traducción. Usualmente, ligado operativamente significa contiguo y en marco de lectura, pero sin embargo algunos elementos genéticos tales como los genes represores no están ligados contiguamente sino que están todavía adheridos a secuencias operativas que controlan a su vez la expresión. Ver por ejemplo Rodríguez et al., Chapter 10, PP. 205-236; Balbas y Bolívar (1990) Methods in Enzvmoloqy 185:14-37; y Ausubel, et al. (1993) Current Protocols in Molecular BioloQy. Greene y Wiley, NY. La coexpresión de las dos secuencias codificadoras es particularmente interesante aquí. Ejemplos representativos de vectores de expresión apropiados incluyen pCDNAl ; pCD, ver Okayama, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1136- 1 142; pMCI neo Poly-A, ver Thomas, et al. (1987) Cell. 51 :503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC373 o pAC61O. Ver, por ejemplo, Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177-199. A menudo será deseable expresar un polipéptido IL-12 p40 y/o IL-B30, en un sistema que provee un patrón de glicocilación específico o definido. Ver por ejemplo, Luckow y Summers (1988) Bio/Technoloqy 6:47-55; y Kaufman (1999) Meth. Enzvmol. 185:487-511. El IL-12 p40 y/o IL-B30 o un fragmento del mismo puede manipularse por ingeniería genética para que sea fosfatidil inositol (Pl) ligado a una membrana celular, pero puede removerse de las membranas mediante tratamiento con una enzima disociadora del fosfatidil inositol por ejemplo fosfatidil inosol fosfolipasa C Esta libera al antígeno en una forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos convencionales de la química de proteínas. Ver por ejemplo Low (1989) Biochim. Biophvs Acta 988:427454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner. et al. (1991 ) J.Cell Biol. 114:1275-1283. Ahora que han sido caracterizados el IL-12 p40 y/o IL-B30, los fragmentos o derivados de los mismos pueden prepararse por procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los descritos en Stewart y Young (1984) Solid Phase PeDtide Svnthesis. Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bódanszky (1984) The Practice of Peptide Svnthesis. Springer-Verlag, New York; Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Svnthesis, Springer-Verlag, New York; y Villafranca (ed. 1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, Ca.

VIH. Usos La presente invención provee reactivos que son útiles para aplicaciones de diagnóstico tal como se describe en otra parte aquí, por ejemplo en las condiciones intermediadas por el complejo IL-12p40/IL-B30 o en lo que sigue más adelante en la descripción de los equipos para diagnóstico. El gen puede ser útil en ciencias forenses, por ejemplo, para distinguir roedores de humanos, o como marcadores para distinguir entre diferentes células que exhiben patrones de modificación o expresión diferenciales. Las composiciones provistas son reactivos útiles para, por ejemplo, ensayos in vitro, investigación científica, y para la síntesis o manufactura de ácidos nucleicos polipéptidos, o anticuerpos. Esta invención provee también reactivos con significativo potencial comercial y/o terapéutico. El complejo IL-12 p40/IL-B30 (natural o recombinante), los fragmentos del mismo, y los anticuerpos del mismo junto con compuestos identificados por su afinidad de adhesión al complejo o los componentes individuales del mismo serían útiles como reactivos para las técnicas de enseñanza de biología molecular inmunología o fisiología. Pueden prepararse equipos apropiados con los reactivos, por ejemplo, en ejercicios prácticos de laboratorio en la producción o uso de proteínas, anticuerpos, métodos de donación, histología, etc.

Los reactivos serán también útiles en el tratamiento de condiciones asociadas con desarrollo o fisiología anormal incluyendo condiciones inflamatorias. Pueden ser útiles en ensayos in vitro para determinar la presencia o ausencia de componentes interactuantes, que pueden estar correlacionados con éxitos de estrategias de tratamiento particulares. En particular, la modulación de la fisiología de varias células, por ejemplo hematopoyéticas o linfoides, se logrará mediante métodos apropiados para el tratamiento usando las composiciones aquí provistas Ver por ejemplo Thomson (1994; ed.) The Cvtokine Hsndbook (2d ed.) Academic Press., San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colonv Stimulatinq Factors Cambridge University Press; y Aggarwall y Gutterman (1991 ) Human Cytokines Balckwell Pub. Las observaciones de que el complejo de citocina puede inducir niveles de IFN provee un útil discernimiento del potencial terapéutico. En particular, la producción de IFN? da como resultado mejor inmunidad intermediada por células. Ver, por ejemplo, Paul (1998) Fundamental Immunoloqy (4a. ed.) Raven Press, NY; y Delves y Roitt (eds. 1998) The Encvclopedia of Immunoloqy Academic Press (ISBN: 0122267656). Por lo tanto, el incremento de las respuestas celulares será útil en el contexto de mejorar la actividad antitumoral, mejorar las respuestas a la vacuna (tanto de inmunidad humoral como celular), mejorar los efectos anti-virales, y antagonizar las respuestas alérgicas en algunas ventanas de desarrollo. Ver, por ejemplo, Rose y Mackay (eds. 1998) The Autoimmune Diseases (3d ed.) Acedemic Press, San Diego; y Kay (ed. 1997) AllerQy y Allerqic Diseases Blackwell Science, Malden MA. A la inversa, los antagonistas se usarían para bloquear o para evitar dicho incremento de IFN?, reduciendo de esta manera la resistencia o intensidad dei incremento celular. Esto sería útil por ejemplo en situaciones de autoinmunidad (tal como esclerosis múltiple o psoriasis) o en condiciones inflamatorias crónicas (tal como artritis reumatoide o enfermedad inflamatoria del intestino). Ver, por ejemplo, Samter, et al. (eds.) Immunoloqical Diseases vols. 1 y 2, Little, Brown y Co. Los resultados iniciales sugieren que el rol de p40/IL-B30 es más crítico para el mantenimiento de la condición inflamatoria crónica. Por lo tanto el bloqueo puede ser eficaz después del desarrollo inicial de la condición. Con tales objetivos terapéuticos, los agonistas o antagonistas se combinarán con la terapéutica existente, por ejemplo con otros moduladores de inflamación. Por lo tanto los agonistas a menudo se combinarán por ejemplo con IL-18, IL-12, tratamientos de radiación o quimioterapia, coadyuvantes de vacuna, y/o terapéutica antiviral. Alternativamente los antagonistas podrán combinarse con antagonistas TNFa, antagonistas IL-12, con IL-IO, y/o esteroides. También podrían usarse homólogos virales de las citocinas. Por ejemplo, una enfermedad o desorden asociado con expresión anormal o con señalización anormal mediante IL-12 p40/IL-B30 debería ser un objetivo probable para un agonista o antagonista. Las nuevas citocinas deberían jugar un rol en la regulación o desarrollo de las células hematopoyéticas por ejemplo células linfoides, que afectan las respuestas inmunológicas, por ejemplo inflamación y/o desórdenes de autoinmunidad. Alternativamente pueden afectar la fisiología o desarrollo vascular o los efectos neuronales. El tiempo de administración del agente terapéutico en relación al iniciador o al mantenimiento de la condición puede ser también importante. En particular, el complejo de citocina debería intermediar, en varios contextos, la síntesis de citocina por parte de las células, la proliferación, etc. Los antagonistas de IL-12 p40/IL-B30 tal como las variantes de muteina de una forma natural o de anticuerpos bloqueadores, podría proporcionar una vía selectiva y poderosa para bloquear las respuestas inmunes por ejemplo en situaciones tales como respuestas inflamatorias o autoinmunes. Ver también Samter, et al. (eds.) Immunological Diseases vols. 1 y 2, Little, Brown y Co. Los objetivos particulares para aplicación terapéutica incluyen por ejemplo condiciones pulmonares, tanto asma como fibrosis, en modelos EAE (los cuales pueden ser modelos útiles para esclerosis múltiple), diabetes, e inflamaciones intestinales. Ver, por ejemplo, Barnes, et al. (1998) Mol. Med. Today 4:452458; Pauwels, et al. (1998) Clin. Exp. Allerqy Auq. 28 Suppl 3:1-5; Durham (1998) Ciin. Exp. Allerqy Jun. 28 Suppl 2:11-16; Leunq (1997) Pediatr. Res. 42: 559-568; Pretolaní, et al. (1997) Res Immunol. 148:33-38; Lamkhioued, et al. (1996) Ann. NY Acad. Sci. 796:203-208; Erb, et al. (1996) Immunoi. Celí. Biol. 74:206-208; y Anderson, et al. (1994) Trends Pharmacol. Sci. 15:32-332 para asma; Coker. et al. (1998) Eur. Respir. J. 11 :1218-1221 ; y Blenkowski, et al. (1995) Proc. Soc. Exp. Biol. Med 209:118-140 for lung fibrosis; Pearson y Me Devitt (1999) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 238:79-122; Miller y Shevach (1998) Res Immunol. 149:753-759; Hoffman y Karpus (1998) Res. Immunol. 149:790-794 (con discusión 846-847 y 855-60); Segal (1998) Res. Immunol. 149:811-820 (con discusión 850-851 y 855-60); Libiau, et al. (1997) Immunol. Today 18:599-604 Gold, et al. (1997) Cnt Rev. Immunol. 17:507-510; Spack (1997) Cnt. Rev. Immunol. 17:529-536; y Leonard, et al. (1997) Cnt. Rev. Immunol. 17:545-553 para EAE modelos (para esclerosis múltiple); Almawi, et al. (1999) J. Clin. Endocrinol. Metab. 84:1497-1502; Rabinovitch, et al. (1998) Biochem. Pharmacol. 55:1139-1149; y Rabinovitch (1998) Diabetes Metab. Rev. 14:129-151 para diabetes; y Leach, et al. (1999) Toxicol. Pathol. 27:123-133; Braun, et al. (1999) Curr. Opin. Rheumatol. 1 1 :68-74; Rugtveit, et al. (1997) Gastroenteroloav 112:1493-1505: Strober, et al. (1997) Immunol. Today 18:61-64; and Ford, et al. (1996) Semin. Pediatr. Surq. 5:155-159 para condiciones inflamatorias de vientre/intestino. La estimulación con p40/IL-B30 de las células activadas por la memoria da como resultado cambios fenotípicos que incluyen moléculas de adhesión. CD69L está altamente expresado después de la estimulación con p40/IL-B30, y CD54 disminuye dramáticamente. Estos cambios en la expresión de las moléculas de adhesión puede permitir que las células moduladoras de memoria entren a la región rica en células T/DC de los nodulos linfáticos primarios y secundarios, por ejemplo a través de vénulas endoteliales superiores (HEV). Las células de la memoria están también cebadas para tornarse sensibles a la estimulación de IL- 12. Por lo tanto, una rápida y elevada producción de IFN seguiría rápidamente la inducción de IL-1 2 por parte del antígeno. Por lo tanto p40/IL-30 podría acelerar una respuesta inmune por parte de las células de la memoria, ya sea incrementando los efectos diferenciales específicos para las células de la memoria, con menor o ningún efecto sobre las células no tratadas. A la inversa, en muchas condiciones inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, etc., las lesiones activas dependen de las células CD45Rbbajas. Como tales, ios antagonistas pueden bloquear efectivamente la fase crónica de dicha condición inflamatoria. Se conocen varias condiciones anormales en cada uno de los tipos de células que demostraron que producen a ambos, IL-12 y/o IL-B30 mRNA mediante análisis de borrón Northern. Ver Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn, et al. Harrison's Principies of Interna! Medicine. McGraw-Hill, N.Y.; and Weatherall, et al. (eds. Oxford Textbook of Medicine. Oxford University Press, Oxford. Muchas otras condiciones médicas y enfermedades involucran la activación por parte de macrófagos o monocitos, y muchas de estas responderán al tratamiento con un agonista o antagonista de los que se proveen aquí. Ver, por ejemplo, Stites y Terr (eds.; 1991) Basic and Clinical Immunoloqy Appleton y Lange, Norwalk, Connecticut; y Samter, et al. (eds.) Immunoloqical Diseases Little, Brown and Co. Estos problemas deberían ser susceptibles de prevención o tratamiento usando las composiciones que se proveen aquí.

El complejo de citocina IL-12 p40/IL-B30, los antagonistas, los anticuerpos, etc. pueden purificarse y ser luego administrados a un paciente, tanto veterinario o humano. Estos reactivos pueden combinarse para uso terapéutico con ingredientes adicionales activos o inertes, como por ejemplo en diluyentes o portadores convencionales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo coadyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizadores fisiológicamente inocuos excipientes, o preservadores. Estas combinaciones pueden filtrarse en forma estéril y pueden colocarse en formas de dosificación mediante liofilización en frascos para dosificación o pueden almacenarse en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o fragmentos de adhesión de los mismos incluyendo formas que no son de adhesión de complemento. El rastreo de la droga usando IL-12 p40/IL-B30, proteína de fusión o fragmentos de la misma, pueden efectuarse para identificar compuestos con los cuales tienen afinidad de adhesión o con otros efectos biológicos relevantes sobre las funciones de IL-12 p40/IL-B30, incluyendo la aislamiento de los componentes asociados. Luego pueden usarse subsiguientes ensayos biológicos para determinar si un compuesto candidato tiene una actividad estimuladora intrínseca y si por lo tanto es un bloqueador o antagonista porque bloquea la actividad del complejo de citocina. Asimismo, un compuesto que tiene actividad estimuladora intrínseca puede activar la vía de señales y es por consiguiente un agonista porque estimula la actividad del complejo de citocina Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos bloqueadores para IL-12 p40, IL-B30 o el complejo como antagonistas y de anticuerpos estimuladores como agonistas. Esta modalidad debería ser particularmente útil con otras variantes de especies IL- 12 p40 ó IL-B30. Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, que incluyen los medios de administración, el sitio que constituye el objetivo, el estado fisiológico del paciente y de otros medicamentos administrados. Por lo tanto las dosis de tratamiento deberían titularse para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente las dosis usadas in vitro pueden proveer una guía útil con relación a las cantidades que son útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo en animales de dosis efectivas para el tratamiento de desórdenes particulares proporcionará una indicación adicional predictiva de la dosis para seres humanos. Se han descrito varias consideraciones, por ejemplo en Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics. 8a. Ed., Pergamon Press; y Reminqton's Pharmaceutical Sciences. 17ava. ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para administración se discuten aquí y a continuación, por ejemplo para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otros. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, solución reguladora de pH y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el índice Merck, Merck y Co. Rahway, New Jersey. Los rangos de dosificación, se esperaría comúnmente de cantidades inferiores a concentraciones de 1 mM, típicamente concentraciones de menos de aproximadamente 10 µM, usualmente de menos de aproximadamente 100 nM, preferiblemente de menos de aproximadamente 10 pM (picomolar), y aún más preferiblemente de menos de aproximadamente 1 flv! (femtomolar), con un portador apropiado. A menudo se utilizarán formulaciones de liberación lenta o un aparato de liberación lenta para una administración continua o a largo término. Ver por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533. El complejo de citocina IL-12 p40, IL-B30, las proteínas de fusión, los fragmentos de las mismas y los anticuerpos para las mismas o sus fragmentos, los antagonistas y agonistas, pueden ser administrados directamente al huésped que es necesario tratar, o dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser conveniente conjugarlos con proteínas portadoras tales como ovalbúmína o albúmina de suero antes de su administración. Pueden administrarse formulaciones terapéuticas en muchas formulaciones de dosificación convencional. Aunque es posible administrar el ingrediente activo solo, se prefiere presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente por lo menos un ingrediente activo tal como se definió más arriba conjuntamente con uno o más portadores aceptables de los mismos. Cada portador debería ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable en el sentido de que debería ser compatible con los otros ingredientes y no ser perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las que son apropiadas para administración oral, , rectal, nasal, tópica o parenteral (incluyendo administración subcutánea intramuscular, intravenosa e ¡ntradérmica). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificación unitaria, y pueden prepararse mediante muchos métodos que son bien conocidos en el arte farmacéutico. Ver, por ejemplo Gilman, et al., (eds. 1990) Goodman y Gilman's: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics. 8a. ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a. ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn; Avis, et al. (eds 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York, Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Tablets. Dekker, New York; y Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical dosaqe Forms: Disperse Systems, Dekker, New York. La terapia de esta invención puede combinarse o puede usarse en asociación con otros agentes, por ejemplo otras citocinas incluyendo IL-6 o G-CSF, o sus respectivos antagonistas. Ambas formas, la natural y la recombinante de IL-B30 de esta invención, son particularmente útiles en equipos y en métodos de ensayo que son capaces de rastrear compuestos para determinar la actividad de adhesión a las proteínas. En años recientes se han desarrollado varios métodos de ensayos automáticos que permiten el rastreo de cientos de miles de compuestos en un corto período. Ver, por ejemplo, Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773, el cual describe los medios para el ensayo de afinidad de adhesión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos apropiados puede facilitar enormemente la disponibilidad de grandes cantidades de complejo de citocina IL-12 p40/IL-B30 soluble, tal como el provisto por esta invención. Pueden usarse otros métodos para determinar los residuos críticos en las interacciones del receptor - complejo IL-12p40/IL-B30. Puede efectuarse un análisis mutacional, por ejemplo ver, Somoza, et al., (1993) J Exptl. Med 178:549-558. para determinar los residuos específicos críticos en la interacción y/o señalización. PHD (Rost y Sander (1994) Proteins 19:55-72) y DSC (King y Stemberg (1996) Protein Sci 5:2298-2310) pueden proveer predicciones de estructura secundaria de hélice (H), -filamento (E), o espiral (L). Las hélices A y D son típicamente las más importantes en la interacción del receptor, siendo la región más importante la de la hélice D. Por ejemplo, los antagonistas pueden encontrarse normalmente una vez definido estructuralmente el antígeno y/o receptor, por ejemplo mediante datos de estructura terciaria. El ensayo de los potenciales análogos de interacción es ahora posible mediante el desarrollo de métodos de ensayo sumamente automatizados empleando un complejo purificado IL-12 p40/IL-B30. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas usando las técnicas de rastreo aquí descritas. Son particularmente importantes los compuestos que demuestran tener afinidad de adhesión combinada para un espectro de moléculas de IL-12 p40/IL-B30, por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especies del complejo de citocina.

Un método para rastrear drogas utilizan células huésped eucarióticas o procarióticas que son establemente transformadas con moléculas de ADN recombinante que expresan un IL-20p40/IL-B30. Pueden aislarse células que expresan una IL-12 p40/IL-B30 aislada a partir de otras moléculas. Dichas células, ya sea en forma viable o fija pueden usarse para ensayos de adhesión de par de adhesión convencional. Ver también Parce, et al. (1989) Science 246:243-247: y Owicki, et al (1990) Proc Nati. Acad. Sci. USA 87:4007-4011 , las cuales describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Otra técnica para el rastreo de drogas involucra una modalidad que provee un elevado resultado de rastreo para compuestos que tienen la afinidad de adhesión apropiada con una IL-12 p40/IL-B30 y que ha sido descrita en forma detallada por Geysen, en la solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. En primer lugar, se sintetizan grandes cantidades de diferentes compuestos de ensayo que consisten en pequeños péptidos sobre un sustrato sólido, por ejemplo pins de plástico o alguna otra superficie apropiada ver Fodor et al. (1991). Luego todos los pins se hacen reaccionar con p40/IL-B30 solubilizado, no purificado o solubilizado, purificado, y se lavan. La etapa siguiente involucra detectar el p40/IL-B30 adherido. Un diseño de droga racional puede basarse también en estudios estructurales de las configuraciones molares de p40/IL-B30 y de otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que son intermediarios de otras funciones en respuesta a la adhesión, u otras proteínas que interactúan normalmente con p407IL-B30, por ejemplo un receptor. Un medio para determinar cuales sitios interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensional. Estos proveerán una guía en lo que se refiere a cuales son los residuos aminoácidos que forman regiones de contacto molecular, modelado por ejemplo contra otros modelos de citocina-receptor. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas ver por ejemplo Blundell y Johnson (1976) Protein Crvstallographv, Academic Press, New York.

LX. Equipos Esta invención contempla también el uso de proteínas p40/IL-B30, fragmentos de la misma, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de equipos de diagnóstico y los métodos para detectar la presencia de otro p40/IL- B30 o par de adhesión. Típicamente, el equipo tendrá un compartimiento que contiene un péptido p40, p40/IL-B30, o IL-B30 definido o un segmento génico o un reactivo que reconoce a uno o al otro, por ejemplo anticuerpos o fragmentos de fusión p40/IL-B30. Un equipo para determinar la afinidad de adhesión de un compuesto de ensayo con un IL-12 p40/IL-B30 comprendería típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto rotulado, por ejemplo un par de adhesión a un anticuerpo que tiene afinidad de adhesión conocida para p40/IL-B30; una fuente de p40/IL- B30 (natural o recombinante); y medios para separar el compuesto adherido del compuesto rotulado libre tal como una fase sólida para inmovilizar la molécula. Una vez rastreados los compuestos, los que tienen afinidad de adhesión apropiada para el antígeno pueden evaluarse en ensayos biológicos apropiados tal como es bien conocido en el arte para determinar si actúan como agonistas o antagonistas para la vía de señalización p40/IL-B30. La biodisponibilidad de los polipéptidos de fusión IL-12 p40/IL-B30 recombinantes provee también patrones bien definidos para calibrar dichos ensayos. Un equipo preferido para determinar la concentración de por ejemplo un p40/IL-B30 en una muestra comprendería típicamente un compuesto rotulado, por ejemplo un par de adhesión a un anticuerpo que tiene afinidad de adhesión conocida para el antígeno, una fuente de citocina (natural o recombinante) y medios para separar el compuesto adherido del compuesto rotulado, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar el p40/IL-B30. Normalmente se proveerán compartimientos que contienen reactivos e instrucciones. Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de adhesión de antígeno, específicos para p40/IL-B30 o los fragmentos son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de p40, IL-B30, p40/IL- B30 y/o sus fragmentos. Dichos ensayos de diagnóstico pueden emplear usados, células vivas, células fijas, Inmuno-fluorescencia, cultivos de células, fluidos corporales, y además pueden involucrar la detección de antígenos relacionados con el antígeno en suero o similares. Los ensayos para diagnóstico pueden ser homogéneos (sin etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de antígeno-par de adhesión) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen varios ensayos comerciales tales como radioinmunoensayo (RÍA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), e inmunoensayo de enzimas (EIA) técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT), inmunoensayo fluorescente rotulado con sustrato (SLFIA), y similares. Ver por ejemplo Van Vunakis, et al. (1980) Meth. Enzymol. 70:1-525; Harlow y Lañe (1980) Antibodies: A Laboratorv Manual. CSH Press, NY; y Coligan, et al. (eds. 1993) Current Protocols in Immunologv, Greene y Wiley, NY. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra p40/IL-B30, puesto que pueden ser en diagnóstico de varios estados anormales. Por ejemplo la sobreproducción de p40/IL-B30 puede dar como resultado la producción de varias reacciones ¡nmunológicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anormales, particularmente en condiciones de ensayo proliferativas, tales como cáncer o activación o diferenciación anormal. Frecuentemente, los reactivos para los ensayos de diagnóstico se proveen en equipos para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, del protocolo, y del rótulo, se provee cualquiera de un anticuerpo rotulado o no rotulado, o un par de adhesión, o p40/IL-B30 rotulado. Esto usualmente conjuntamente con otros aditivos tales como soluciones reguladoras de pH, estabilizadores, los materiales necesarios para la producción de señales tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente el equipo contendrá también instrucciones para un uso adecuado y descarte de los contenidos después del uso. Típicamente el equipo tiene compartimientos para cada reactivo útil. Convenientemente los reactivos se proveen en forma de un polvo seco liofilizado donde dichos reactivos pueden ser reconstituidos en un medio acuoso con la condición de proveer concentraciones apropiadas de reactivos para llevar a cabo el ensayo. Muchos de los constituyentes antes mencionados del rastreo de drogas y de los ensayos para diagnóstico pueden usarse sin modificación o pueden modificarse de varias maneras. Por ejemplo la rotulación puede llevarse a cabo uniendo en forma covalente o no covalente una porción que directa o indirectamente provee una señal detectable. En muchos de estos ensayos el par de adhesión, el compuesto de ensayo, p40/IL-B30, o los anticuerpos para los mismos pueden rotularse en forma directa o indirecta. Las posibilidades para la rotulación directa incluyen grupos de rótulos: radio-rótulos tales como 1251, enzimas tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y rótulos fluorescentes (patente norteamericana No. 3.940.475) que son capaces de monitorear el cambio en la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de fluorescencia. Las posibilidades para una rotulación indirecta incluyen biotinilación de un constituyente seguida de adhesión a avidina acoplada con uno de los grupos rotuladores precedentes. Existen también numerosos métodos para separar la p40/IL-B30 adherida de la libre o alternativamente la adherida del primer compuesto libre de ensayo. El p40/IL-B30 puede inmovilizarse sobre varias matrices después de lavarlo. Entre las matrices apropiadas se incluyen las plásticas tales como una placa ELISA, filtros, y granulos. Ver por ejemplo Coligan, et al. (eds. 1993) Current Protocols in Immunoloqv, Vol. 1 , capítulo 2, Greene y Wiley, NY. Otras técnicas de separación apropiadas incluyen sin limitación el método de partículas magnetizables de anticuerpo con fluoresceína descrito en Rattie, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457- 1461 , y la doble separación de partículas magnéticas de anticuerpos descrita en la patente norteamericana No 4.659.678. Los métodos para ligar proteínas o sus fragmentos a los varios rótulos han sido extensamente informados en la literatura y no requieren aquí una discusión detallada. Muchas de las técnicas involucran el uso de grupos carboxilo activados ya sea a través del uso de carbodiimida o de esteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres por reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo o una olefina activada taJ como maleimida, para enlace, o similares. Las proteínas de fusión serán también útiles en estas aplicaciones. Otro aspecto de diagnóstico de esta invención involucra el uso de secuencias polinucleotídicas oligonucleotídicas tomadas de la secuencia de un p40/IL-B30. Estas secuencias pueden usarse como sondas para detectar los niveles de los mensajes de p40 ó IL-B30 en muestras de pacientes que se sospecha que tienen una condición anormal, por ejemplo enfermedades inflamatorias o autoinmunes. Debido a que la citocina puede ser un marcador o un mediador para la activación, puede ser útil determinar la cantidad de células activadas a fin de determinar por ejemplo cuando puede utilizarse terapia adicional por ejemplo de manera preventiva antes de que aparezcan los efectos y avancen hasta un punto significativo. La preparación de ambas secuencias nucleotídicas, la de ARN y la de ADN, la rotulación de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias, ha recibido una amplia descripción y discusión en la literatura. Ver, por Ejemplo, Langer-Safer, et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. 79:4381-385; Caskey (1987) Science 236:962-967; y Wilchek et al. (1988) Anal. Biochem 171 :1 -32. Los equipos de diagnóstico que sirven también para probar la calidad o cantidad de expresión de otras moléculas han sido también contemplados. El diagnóstico o prognosis puede depender de la combinación de múltiples indicaciones usadas como marcadores. Por lo tanto, los equipos pueden ensayar combinaciones de marcadores. Ver, por ejemplo, Viallet, et al. (1989) Proqress in Growth Factor Res. 1 :89-97. Otros equipos pueden usarse para evaluar otros subgrupos de células.

X. Aislamiento de un Receptor P40/IL-B30 Habiendo aislado un ligando de una interacción específica de ligando- receptor, existen métodos para aislar el receptor. Ver, Gearing, et al. (1989) EMBO J. 8:3667-3676. Por ejemplo, pueden determinarse medios para rotular la citocina IL-B30 sin interferir con la adhesión a su receptor. Por ejemplo, puede fusionarse un rótulo de afinidad al término amino o carboxilo del ligando. Dicho rótulo puede ser una marca de epitopo FLAG, o, por ejemplo, un dominio Ig o Fe. Puede rastrearse una genoteca de expresión para la adhesión específica de la citocina, por ejemplo, seleccionando células, u otros rastreos para detectar la subpoblaciones que expresen dicho componente de adhesión. Ver, por ejemplo, Ho, et al. (1993) Proc. Nati Acad. Sci. USA 90:11267-11271 ; y Lui, et al. (1994) J. Immunol. 152:1821-29. Alternativamente, un método de paneo que puede usarse. Ver, por ejemplo, Seed y Aruifo (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3365-3369. Las técnicas de ligadura cruzada de proteínas con rótulos pueden aplicarse para aislar los pares de adhesión del complejo de citocina p40/IL-B30. Esto permitiría la identificación de proteínas que interactúan específicamente con la citocina, por ejemplo en una manera de tipo ligando-receptor. Se efectuarán previamente experimentos para determinar si los componentes conocidos del receptor IL-6 o G-CSF están involucrados en las respuestas para p40/IL-B30. También es bastante posible que estos complejos receptores funcionales puedan compartir muchos o todos los componentes con el complejo receptor de p40/IL-B30, ya sea como subunidad receptora específica o como una subunidad receptora accesoria. Muchas modificaciones y variaciones de esta invención podrán llevarse a cabo sin apartarse de su espíritu y alcance, tal como resultará aparente para los expertos en la materia. Las modalidades específicas descritas aquí se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invención está limitado únicamente por lo términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance total de equivalentes a los cuales dichas reivindicaciones tienen derecho.

EJEMPLOS 1. Métodos Generales Muchos de los métodos convencionales que se dan a continuación han sido descritos, o citados como referencia, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloninq, A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (2a. ed.) Vol. 1-3, CSH Press NY; Ausubel, et al. Bioloqv Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; Ausubel, et al. (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Bioloqv Wiley/Greene, NY; Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY Bonifacino, et al. Current Protocols in Cell. Bioloqv Wiley, NY; y Doyle, et al. Cell and Tissue Culture: Laboratorv Protocols Wiley, NY. Los métodos para purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electrofóresis, centrifugación, cristalización, y otros. Ver, por ejemplo Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification, "Methods in Enzymoloqy vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, et al (1995 y suplementos) Current Protocols in Protein Science John Wiley y Sons, New York, NY; Matsudaira (ed. 1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. Academic Press, San Diego, CA; y en la literatura del fabricante sobre el uso de productos para purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond CA. La combinación con técnica recombinante permite la fusión para segmentos apropiados (marcas de epitopos), por ejemplo, para una secuencia de FLAG o un equivalente que puede fusionarse, por ejemplo, a través de una secuencia removible por proteasa,. Ver, por ejemplo, Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Enqineering Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crow, et al, (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purificación System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Puede efectuarse un análisis de secuencia de computadora, por ejemplo, usando programas software, disponibles que ¡ncluye los de University of Wisconsin Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wl, the NCBI en NIH, y GenBank, NCBI, EMBO, y otras fuentes de secuencias públicas. Otras fuentes de análisis incluyen, por ejemplo el programa PASMOL, ver Bazan, et al. (1996) Nature 379:591 ; Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766; Sayle and Milner-White (1995) JIBS 20:374-376; y Gronenberg, et al. (1991 ) Protein Engineerino 4:263- 269; ad DSC, Ver King y Sternberg (1996) Protein Sci. 5:2298-2310. Ver, también, Wilkins, et al (eds. 1997) Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer-Verlag, NY; Salzberg, et al. (eds. 1998) Computational Methods in Molecular Biology Elsevier, NY; y Birren, et al. (eds. 1997) Genome - Analvsis: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY Se describen técnicas inmunológicas convencionales, por ejemplo en Hertzenberg, et'al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunologv vols. 14, Blackwells Science; Coligan (1991 and updates) Current Protocols in Inmmunology Wíley/Greene, NY; and Methods in Enzvmology vols. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121 , 132, 150, 162, y 163. Ensayos de citocina se describen, por ejemplo, en Thomson (ed. 1994) The Cvtokine Handbook (2d ed.) Academic Press, San Diego; Metcalf y Nicola (1995) The Hematopoietic Colonv Stimulating Factors Cambridge University Press y Aggarwal y Gutterman (1991 ) Human Cytokines Blackwell Pub. Los ensayos para las actividades biológicas vasculares son bien conocidos en el arte. Los mismos cubren actividades angiogénicas y angiostáticas en tumores, o en otros tejidos, por ejemplo, proliferación del músculo liso arterial, (ver, por ejemplo Koyoma, et al. (1996) Cell 87:1069-1078), adhesión de monocitos al epitelio vascular (ver McEvoy, et. (1997) J,.

Exp. Med. 185:2069- 2077), etc. Ver también Ross (1993) Nature 362:801-809; Rekhter y Gordon (1995) Am. J. Pathol. 147:668-677; Thyberg, et al. (1990) Atherosclerosis 10:966-990; y Gumbiner (1996) Cel[ 84:345-357. Los ensayos para las actividades biológicas de células neurales han sido descritas, por ejemplo, en Wouterlood (ed.1995) Neuroscience Protocols módulos 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; and Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Methodology of developmental systems, por ejemplo, en Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Bioloqv CRC Press; y Chrispeels (ed.) Molecular Technigues and Approaches in Developmentai Bioloqv Interscience. Los análisis FACS se describen en Melamed, et. ai. (1990) Flow Cvtometrv and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometrv Liss, New York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cvtometrv Methods Wiley-Liss, New York, NY.

II. Clonación de p40 vio IL-B30 Humano Las secuencias IL-12 p40 están disponibles en varias bases de datos de secuencias, tal como se describió más arriba. La secuencia del gen IL-B30 se proveen en la Tabla 1. La secuencia deriva de una secuencia humana genómica. Estas secuencias permiten la preparación de los cebadores PCR, o sondas, para determinar la distribución de los genes celulares. Las secuencias permiten la aislamiento del ADN genómico que codifica los mensajes. Usando la senda o cebadores de PCR, se sondean varios tejidos o tipo de células para determinar la distribución celular. Se donan los productos de PCR usando, por ejemplo, un equipo de donación TA (Invitrogen). Los plásmidos resultantes de ADNc son secuenciados desde ambos términos en un secuenciador automático (Applied Biosystems).

III. Expresión celular de p40 y de IL-B30 Se prepara una sonda o cebadores apropiados específicos para ADNc que codifica los respectivos genes. Típicamente, la sonda rotulada, por ejemplo, mediante cebadura al azar. La expresión coordenada de ambas subunidades es la más importante cuando el complejo p40/IL-B30 es de interés.

IV. Purificación de la Proteína p40/IL-B30 Se rastrearon líneas de células transfectadas múltiples para la que expresa la citocina o el complejo a un alto nivel en comparación con otras células. Alternativamente, puede prepararse una combinación de la construcción recombinante. Se rastrearon varias líneas de células y se seleccionaron por sus propiedades favorables de manipulación. La aislamiento individual de las respectivas subunidades y la combinación posterior puede dar como resultado cierta formación de dímeros. Puede aislarse IL-B30 natural de fuentes naturales o mediante la expresión de una célula transformada usando un vector de expresión apropiado. También puede usarse construcciones de adenovirus para la producción/expresión. La purificación de las subunidades expresadas o del complejo se logra mediante procedimientos convencionales, o puede combinarse con medios de manipulación genética para una purificación eficaz con alta eficiencia a partir de sobrenadantes o usados de células. En particular, la fusión de p40 con IL-B30. con o sin ligador apropiado puede dar como resultado métodos de alta eficiencia para procesamiento o purificación. Pueden usarse segmentos FLAG o His6 para dichas características de purificación. Alternativamente, la cromatografía de afinidad puede usarse con anticuerpos específicos, ver a continuación. La proteína se produce en coli, células de insectos, o sistemas de expresión de mamíferos, según se desee.

V. Preparación de anticuerpos específicos para p40/IL-B30 Se presentan péptidos sintéticos o proteínas purificadas para un sistema inmunitario a fin de generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Ver, por ejemplo, Coligan (1991 ) Current Protocols in Immunoloqy Wiley/Green; y Harlow and Lañe (1989) Antibodies: A Laboratorv Manual Cold spring Harbor Press. La inmunoselección o los métodos de vaciamiento pueden aplicarse para tener la seguridad de que los anticuerpos resultantes son específicos para los determinantes antigénicos presentados por el complejo de polipéptidos, distintos de aquellos presentados por los componentes individuales mismos. Puede prepararse suero policlonal, o hibridomas. En situaciones apropiadas, el reactivo de adhesión está rotulado tal como se describió más arriba, por ejemplo, por fluorescencia o en otra forma, o bien está inmovilizado en un substrato mediante métodos de paneo. La inmunosección, inmunovaciamiento, y técnicas relacionadas están disponibles para preparar reactivos selectivos, según se desee, por ejemplo, para el complejo entre las dos subunidades.

VI. Coprecipitado de 1L-12 p40 y IL-B30 Se preparó una construcción de fusión IL-12 p40-lg de ratón en un vector de expresión El dominio Ig se adhiere a al Proteína A, y puede precipitar este polipéptido. También se preparó una construcción IL-B3OEtag (epitopo marcado con un motivo FLAG en el término N), cuyo polipéptido es inmunoprecipitable con el anticuerpo M2. Las construcciones de expresión fueron transfectadas en células 293 T, con la construcción IL-12 p40-lg sola, la construcción IL-B30Etag sola, o ambas conjuntamente. Las células fueron rotuladas con 3 S metionina. Con la construcción IL-12 p40 sola, no se detectó proteína soluble en el sobrenadante de la célula usando proteína A. Asimismo, con la construcción FLAG-IL-B30, no se detectó ninguna proteína soluble en el sobrenadante de la célula usando el anticuerpo M2. Sin embargo, con la cotransfección de las dos construcciones de expresión, el sobrenadante de la célula produjo un complejo soluble el cual fue precipitable con el reactivo de proteína A o con el anticuerpo M2. El análisis PAGE del complejo reveló que el complejo precipitado con proteína A estaba constituidos por polipétidos que correspondían a los dos polipétidos esperados, el IL-12 p40-lg de fusión y los polipéptidos FLAG-IL-B30. Correspondientemente, el complejo precipitado con el anticuerpo M2 estaba constituido por el polipéptido FLAG-IL-B30 y la proteína de fusión IL-12 p40-lg. Experimentos similares con una construcción de expresión IL-12 p40 humana y una construcción FLAG-IL-B30 humana proporcionaron los resultados esperados. La transfección con la construcción FLAG-IL-B30 no dio como resultado ninguna proteína soluble significativa. La co-transfección de ambos vectores de expresión en células primate dio como resultado una secreción efectiva de un complejo el cual fue inmunoprecipitable con el anticuerpo M2. El análisis PAGE del complejo resultante confirmó que el complejo estaba constituido por él polipéptido FLAG-IL-B30 y el polipéptido 11-12 p40.

Vil. Identificación del Receptor El receptor IL-1 2 está constituido por las subunidades ß1 y ß2 del receptor 11-12. Una construcción de fusión p40/IL-B30 se adhiere a células que expresa al subunidad ß1 receptora. Un homodímero de las subunidades 11-12 p40 puede bloquear la adhesión de LI-12 a la subunidad de ratón ß1 , pero no a la subunidad ß2. La subunidad p40 es un componente de complejo p40/IL-B30, de manera que se ensaya si la subunidad ß1 del receptor IL-12 podría ser un componente del receptor para una construcción de fusión de p40/IL-B30. Los anticuerpos para la subunidad 131 del receptor IL-12 bloquean la adhesión de la construcción de fusión a células que expresan la subunidad ß1 del receptor. Los anticuerpos contra el complejo p40/p70, que reconocen principalmente la subunídad p40 pueden bloquear el efecto de la composición p40/IL-B30, lo cual sugiere que el componente p40 es importante en la interacción del receptor. Estas observaciones sugieren que las subunidad ß1 del receptor se adhiere a la construcción de fusión p40/IL-B30 Experimentos similares que ensayan la invoiucración de la subunidad gp130 común compartida entre receptores relacionados sugieren que gp130 no es una subunidad relevante del receptor para p40/IL-B30. Habiendo identificado una subunidad el receptor, los esfuerzos de donación de expresión han sido iniciados. Las células que expresan esta subunidad pero que no muestran adhesión se usarán para la donación de expresión de una subunidad adicional. Otros homólogos ß2 de la subunidad receptora están siendo rastreados. Alternativamente, pueden usarse genotecas de células apropiadas en métodos de donación de expresión convencionales.

VIII. Evaluación de la Amplitud de las Funciones Biológicas Se ensayaron las actividades biológicas del complejo p40/IL-B30, basándose, por ejemplo, en la secuencia y homología estructural entre L-B30 y IL-6 y G-CSF. Inicialmente, se examinaron ensayos que habían mostrado actividades biológicas de IL-6 o G-CSF. Los ensayos se efectuaron en un complejo recombinante o en una construcción de fusión. La construcción de fusión constituida en una construcción con la secuencia de señal y IL-12- p40 ligada a un epitopo N terminal FLAG fusionado con la secuencia IL-12 p40 madura fusionada con una secuencia ligadora rica en ser/gly de la longitud apropiada fusionada con la secuencia madura de IL-B30. Esta construcción cumple ambas cosas, se expresa bien, es secretada, y el marcador de epitopo permite la purificación y la localización. Se generaron ambas formas de secuencia la de. ratón y la de ser humano. Las construcciones de expresión de adenovirus de ambos los polipéptidos separados y las proteínas de fusión también fueron asequibles. Los tipos de célula objetivo incluye tipos de células linfoides, mialoides, mastoides, pre-B, pre-T, y fibroblastos-endoteliales. Por ejemplo, las células de macrófago/monocito serán evaluados para determinar los cambios de marcador de superficie de célula, por ejemplo MHC clase II, B7, CD40, y familias relacionadas; producción de citocina y quemoquinas; y capacidad de presentación de antígenos. Las células CD4 + T, tanto células CD45Rba,t0 y naturales como las células CD45Rbbaj0 T de memoria, fueron ensayadas, por ejemplo, para los marcadores de desarrollo y activación, y para las funciones efectoras, por ejemplo para la producción de citocina y quemoquina. Las células citotóxicas CD4+, CD8+ y las células NK se evaluarán para determinar los efectos sobre la generación y función. Los efectos sobre la producción de anticuerpos se ensayarán, por ejemplo, en células B MLN y esplénicas. Se evaluarán las células dendríticas para la generación, maduración, y función, incluyendo la producción del factor. También se están desarrollando ensayos de apoptósis. Los cultivos de médula ósea a largo término, se ensayarán para determinar los efectos sobre la modulación de células de estroma y para la generación de células generadoras de estirpe y la diferenciación (cultivos Dexter), para la modulación de células estromales y para la diferenciación y generación de células progenitoras B (Cultivos Whitlock-Witte), y para la evaluación del potencial para regular las poblaciones de linfoide B y del mieloide primitivas.

A. Efectos sobre la proliferación de células El efecto sobre la proliferación de varios tipos de células se evaluó con varias concentraciones de citocinas. Se efectuó un análisis de respuesta a la dosis, en combinaciones con las citocinas relacionadas IL-6, G-CSF, etc. Puede usarse una máquina citosensora, que detecta el desarrollo y metabolismo de las células (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La proteína de fusión humana p40/IL-B30 mejora la proliferación de los blastos PHA humanos estimulados con anti-CD3 o con ambos anti-CD3 y anti-CD28. La estimulación anti-CD3 parece ser esencial. La proteína de fusión humana p40/IL-B30 comprende también la proliferación de los clones de células Thl o Th2 activados, pero no los clones de células en reposo Thl o Th2. Cualquiera de las proteínas de fusión la de ratón o humana, funcionará en las células objetivo de ratón. La proteína de fusión soportó la proliferación de células CD4+ CD4SRbbai0CD62bai0 CD44alt0 (células T activadas 1 de memoria), cuando fueron estimuladas con anti-CD3. La estimulación mediante la proteína de fusión no se incrementó por coestimulación de anti-CD28. Esto no depende en gran manera de la presencia de IL-2. Esto sugiere que p40/IL-B30 puede ser un importante factor para expandir una población de células con un fenotipo de memoria y/o generar o mantener la memoria inmunológica. Esta citocina parece soportar selectivamente las células de memoria activadas con un fenotipo Th1 , por ejemplo, células que producen IFN, pero no 114 o IL-5.

B. Efectos sobre la diferenciación de células T naturales Se recogieron células de sangre de cordón humano y se aislaron células CD4+ T naturales. Estas fueron cultivadas, por ejemplo, durante dos semanas, en presencia de anti-CD3 y de IL-2 y con fibroblastos irradiados que expresan CD32, CD58, y CD8O, activando de esta manera y proliferando las células T. El cultivo de células 1 se evaluó para determinar los efectos de varias citocinas sobre la proliferación o diferenciación. Se evaluaron las células individuales para la producción de citocinas mediante análisis FACS. La proteína de fusión p40/IL- B30 soportó la proliferación y diferenciación de células T productoras de IFN? y no de IL-4, un perfil de expresión de citocina característico de las células Th1.

C. Efectos de la expresión de las moléculas superficiales de células Los monocitos se purificaron por selección negativa de células mononucleares de sangre periférica de donadores sanos normales. Resumiendo, se incubaron 3 x 108 de células mononucleares de banda ficoll en hielo con un cóctel de anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson; Mountain View, CA) que consistían, por ejemplo en 200 µl de aCD2 (Leu-5A), 200 µl de aCD3 (Leu-4), 100 µl de aCD8 (Leu2a), 100 µl de aCD19 (Leu-12), 100 µl de aCD20 (Leu-16), 100 µl de aCD56 (Leu-19), 100 µl de aCD67; (IOM 67; Immunotech, Westbrook, ME), y anticuerpo glicoforina (10F7MN, ATCC, Rockville, MD). Las células adheridas al anticuerpo se lavaron y luego se incubaron con granulos magnéticos acoplados 'con IgG anti-ratón de oveja (Dynal, Oslo, Noruega) en una relación de granulo a célula de 20:1. Las células adheridas a los anticuerpos se separaron de los monocitos por aplicación de un campo magnético. Subsiguientemente, se cultivaron los monocitos humanos en un medio de Yssel (Gemini Bioproducts, calabazas, CA) que contenía 1% de AB humano en ausencia o en presencia de IL-B30, IL-6, G-GSF.

Los análisis de la expresión de moléculas de superficies celular pueden efectuarse por inmunofluorescencia directa. Por ejemplo, los monocitos humanos purificados 2 x 105 se incubaron en solución salina regulada con fosfato (PBS) que contenía 1 % de suero humano en hielo durante 20 minutos. Las células se granularon a 200 x g. Las células se resuspendieron en 20 ml de mAb rotulado con PE o FITC. Después de una incubación adicional de 20 minutos en hielo, las células se lavaron en PBS que contenía 1 % de suero humano seguido de dos lavados con PBS solo. Las células se fijaron en PBS que contenía 1% de paraformaldehído y se analizaron en un citómetro de flujo FACScan Dickinson, Mountain View, CA). Se usaron ejemplos mAbs, por ejemplo: CD1 1 b (anti-mac 1), CD11c (a gp 150195), CD14 (Leu-Me), CD54 (Leu 54), CD8O (anti-BBI/B7), HLADR (L243) de Becton-Dickinson y CD86 (FUN 1 ; Pharmingen), CD64 (32,2. Medarex), CD4O (mAb89; Schering-Plough France).

D. Efectos sobre la producción de citocina mediante células humanas Se aislaron monocitos humanos al como se describió y se cultivaron en un medio de Yssel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) que contenía 1 % de AB humano en ausencia a presencia de IL-B30 (material expresado en baculovirus con dilución al 1/100). Además, los monocitos se estimularon con LPS (E. coli 0127:B8 Difco) en ausencia o en presencia de IL- B30 y la concentración de las citocinas (IL-1 ß, IL-6, TNFa, GM-CSE, y IL-10) en el sobrenadante del cultivos de células determinado por ELISA. Para la tinción intracitoplásmica para citocinas, se cultivaron monocitos (1 milión/ml) en un medio de Yssel en ausencia o en presencia de IL-B30 y LPS (E.coli 0127:B8 Difco) y 10 mg/ml Brefeldin A (Epicentre Technologies Madison Wl) durante 12 horas. Se lavaran las células en PBS y se incubaron en una solución al 2% de formaldehído/PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Subsiguientemente se lavaron las células, se resuspendieron en buffer de permeabilización (0.5% de saponina (Sigma) en PBS/BSA (0.5%)/Azida (1 mM)) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células (2 x 105) se centrifugaron y resuspendieron en 20 mi de anti-citocina mAbs directamente conjugada, diluida al 1 :10 en solución reguladora de pH de permeabilización durante 20 minutos a temperatura ambiente. Pueden usarse las siguientes anticuerpos: IL-1 -PE (364-3B3-14); IL-6-PE (MQ2-13A5); TFN-PE (MAbll); GM-CSF-PE (BVD2-21C11); IL-12-PE (C11.5.14; Pharmingen San Diego, CA). Subsiguientemente, se lavaron las células dos veces en buifer de permeabilización y una vez en PBS/BSNAzida y se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (Bectan Dicton Dickinson, Mountain View, CA). Los blastos PHA humanos produjeron IFN? en respuesta al contacto can ia construcción de fusión p40/IL-B30 humana. Los efectos fueran sinérgicos con IL- 2. El producto de fusión mejoró la producción IFN? mediante células T activadas, pero no en reposo, clones de células Th1 en reposo, o clones Th2 en reposo.

E. Efectos sobre la proliferación de células monoucleares de sangre periférica humana (PBMC) Se aisló PBMC total a partir de coágulos superficiales de dadores sanos normales por centrifugación a través de ficoll-hypaque descrito por (Boym, et al.). Las PBMC se cultivaron en 200 µl de medio de Yessel (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) que contenía 1 % de AB humano en placas de 96 receptáculos (Falcon, Becton-Dickinson, NJ) en ausencia o en presencia de IL-30. Se cultivaron células en un medio solo o en combinación con 100/ml IL-2 (R&D Systems) durante 120 horas. Se agregó 3H-Timidina (0.1 mCi) durante las últimas seis horas de cultivo y se determinó la incorporación de 3H-Timidina mediante recuento por centelleo líquido. Las proteínas nativas, recombinantes y de fusión se ensayaron para determinar la actividad agonista y antagonista en mucho otros sistemas de ensayo biológicos, por ejemplo, en células T, células B, NK, macrófagos, células dendríticas, progenitores hematopoyéticos, etc. Debido a la relación estructural de IL-6 de G-CSF, los ensayos relacionados con dichas actividades deberían ser analizados. Se evaluó p40/IL-B30 para determinar la actividad agonista y antagonista sobre las células transfectadas que expresaban IL-6 o el receptor G-CSF y los controles. Ver, por ejemplo, Ho, et al. (1993) Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 90, 11267-11271 ; Ho, et al. (1995) Mol. Cell. Bol. 15:5043-5053; y Liu, et al. (1994). J. Immunol. 152.1821-1829. Se evaluó p40/IL-B30 para determinar el efecto en la determinación de células macrófagas para dendrítícas y en los ensayos de presentación de antígenos, en la producción de citocinas célula t y en la proliferación en respuesta a los estímulos antigénicos o alogénicos. Ver, por ejemplo, Waal Malefy et al. (1991 ) J. Exp. Med. 174:1209-1220; de Waal Malefyt et al. (1991 ) 1 Exp. Med. 174:915-924; Fiorentino, et al. (1991 ) J¿ Immunol 147, 3815-3822; Fiorentino, et al. (1991 ) J. Immunol 146:3444-3451 ; y Groux, et al. (1996) J. Exp. Med. 184:19-29. También se evaluó p40/IL-B30 para determinar los efectos sobre la estimulación de las células NK. Los ensayos pueden basarse, por ejemplo, en Hsu, et al. (992) Intemat. Immunol. 4:563-569; y Schwarz, et al. (1994) 1 Immunother. 16:95-104. Los efectos de diferenciación y desarrollo de la célula B se analizarán, por ejemplo, mediante la metodología descrita, por ejemplo, en Defrance, et al. (1992). J. Exp. Med. 175:671-682; Rousset, et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:1890-1893; incluyendo los ensayos del factor de cambio lgG2 e lgA2.

IX. Generación y Análisis de Animales Genéticamente Alterados Pueden generarse ratones transgénicos por métodos convencionales. Dichos animales son útiles para determinar los efectos de la sobre expresión de los genes en tejidos específicos, o completamente a través el organismo. Pueden proveer interesantes puntos de vista en el desarrollo de los tejidos particulares o de animales en varias etapas. Además, puede evaluarse el efecto sobre varias respuestas para el estrés biológico. Ver, por ejemplo, Hogan, et al. (1995) Manipulatinq the Mouse Embrvo: A Laboratorv Manual (2d ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se encuentran disponibles técnicas de adenovirus para la expresión de los genes en varias células y órganos. Ver, por ejemplo, Hitt, et al. (1997) Adv. Pharmacol. 40:137-195; y literatura de Quantum Biotechnologies, Montreal, Canadá. Los animales pueden ser útiles para determinar los efectos de los genes sobre varios sistemas de animales funcionales fisiológicamente o desarrolladamente. Un ADN de 0.5kb que codifica para IL-B30 se clonó como un fragmento de EcoRI en un vector de expresión que contiene el promotor de ß-actina mejorador de CMV y la señal de poliadenilación de ß-globina de conejo, previamente descrita por Niwa et al., (1991 ) Gene 108:193-200. La separación del transgen de la secuencia vectora se llevó a cabo mediante centrifugación zonal de gradiente de sucrosa tal como fue descrita por Mann et al., (1993) "Factor Influencing Production Frequency of Transgenic Mice", Methods in Enzimoloqy 225:771-781 Se reunieron las fracciones que contenía el transgen, se efectuó microcentrifugación a través de filtros Microcon-100 y se lavaron 5 veces con solución reguladora de pH de microinyección (SmM Tris-HCl, pH 7.4, 5mM Nací, 0.1 mM EDTA).

El transgen se resuspendió en solución reguladora de pH de microinyección (5mM Tris-HCl, pH 7,4, 5mM NaCI, 0,1 mM EDTA) hasta una concentración final de 1-5ng/ml, se microinyectaron en óvulos ([C57BL/6J x DBN2JFÍ; The Jackson Laboratory), que luego fueron transferidos a oviductos de madres sustituías ICR (Sprague-Dawley), de acuerdo con los procedimientos publicados por Hogan et al. (1994) Manipulation of the Mouse Embrvo Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. A los 10 días de vida, se tomó un trozo de la cola de los animales resultantes para análisis para ADN. La identificación de los fundadores transgénicos se llevó a cabo mediante análisis por reacción de cadena de polimerasa (PCR) tal como ha sido previamente descrito por Lira et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 87:7215-7219. La identificación de ratones transgénicos II-B30 se llevó a cabo mediante amplificación del ADN de cola de ratón. Se usaron como control interno para los cebadores de reacción de amplificación para el gen LDL endógeno. Los cebadores amplifican un segmento de 20Obp del transgen II-B30 y un segmento de 397bp del gen LDL. Las condiciones de PCR fueron: 95°C, 30 segundo, 60°C, 30 segundos; 72°C, 60 segundos para 30 ciclos. Los animales transgénicos se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos.

Análisis de ratones transgénicos IL-B30 Se extrajo ARN de tejidos usando ARN STAT-60, siguiendo las especificaciones el fabricante (TEL-TEST, Inc. Friedswood, TX). El ARN total (20 µg) se desnaturalizó y se colocó sobre una membrana Biotrans (ICN Biomedicals Costra Mesa, CA. Se verificó la expresión transgénica por hibridación con ADNc L-30 rotulado al azar (Stratagene, La Jolla, CA). La expresión del gen de hígado de fase aguda expresado se verificó mediante hibridación del ARN total con segmentos de PCR rotulados al azar del gen de hemopexina de murinos, de glicoproteina de alfa-1 -ácido de múridos y el gen de haptoglobina de murinos. Se adquirieron equipos ELISA de fuentes comerciales y se ensayaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los equipos ELISA para IL-2 de múridos (sensibilidad < 3 pg/ml), ll-lb de múridos (sensibilidad < 3 pglml), IFN-gamma de múridos (sensibilidad <2 pg/ml) y TNF-alfa de múridos (sensibilidad < 5,1 pg/ml) se adquirieron en R & D sytems (Minneapolis, MN). Los equipos IL-6 ELISA de murinos (sensibilidad < 8 pg/ml), se adquirieron en Biosource Intemation (Camarillo, CA). Los equipos de IL-1 - ELISA de Múridos (sensibilidad < 6 pg/ml) se adquirieron en Endogen (Cambridge, MA). En ensayos ELISA para determinar los niveles de inmunoglobulina del suero se llevaron a cabo usando pares de anticuerpos adquiridos en PharMingen (San Diego, CA) siguiendo las líneas de guía de los fabricantes. Se usaron como anticuerpos de captura Anti-ratón IgM (con 11/41), anti-ratón IgA (clon RS-140 anti-ratón IgGI (Clon A853), anti-ratón lgG2a (clon Rl 1-89) y anti-ratón lgG2b (clon R9-91). Se usaron IgM de ratón (clon G155-228), IgA (clon Ml 8-254), IgGI (clon 107,3), lgG2a (clon G155-178) e lgG2b (clon 49,2) para generar curvas standard. Se usaron como anti cuerpos de detección IgM anti-ratón de biotína (clon R6-0.2), IgA anti-ratón de biotina (clon R5-140), IgGI anti-ratón de biotina (clon A85-1 ), lgG2a (clon R19-15) y anti-ratón de botina lgG2b (clon Rl 2-3) como anticuerpos de detección. Los niveles de IGF-1 en suero de rata se determinaron usando un radioinmunoensayo comercialmente obtenible para IGF-1 humano que reconoce también IGF-1 de múridos después de extraer las muestras de suero con ácido-etanol de acuerdo con las instrucciones provistas con el fabricante (Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA). Después del sacrificio los tejidos fueron congelados instantáneamente con medio congelantes para criosección, o bien se fijaron por inmersión en 10% de formalina regulada con fosfato. Los tejidos fijados con formalina se procesaron rutinariamente a 5mm, y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). Para la inmunotinción, se fijaron secciones instantáneamente congeladas con acetona y se secaron al aire. Se recogieron muestras de sangre del seno infra-orbital en tubos esterilizados, evacuados con agregado de EDTA (Vacutainer Systems, Becton Dickinson, Rutherford, NJ). Los valores hematológicos se determinaron con un sistema automático (Abbot Cell-Dyn 3500, Abbot Park, IL). Se efectuaron recuentos de plaquetas manualmente cuando el instrumento fue capaz de proveer recuentos de plaquetas exactos debido a un excesivo agrupamiento o a plaquetas excesivamente grandes. Manchas de sangre se tiñeron con tintura modificado con Wright-Giemsa (Hema-Tck Stain Pack, Bayer Corp., Elkhart, IN) usando un teñido automático (Bayer Hema-Tek 2000, Elkhart, IN) y se examinaron manualmente para determinar la morfología de células inmaduras y plaquetas, células glóbulos rojos, y glóbulos blancos.

Transferencia de Médula Osea Se limpiaron el fémur y la tibia del músculo y se expelió en el gen del hueso en PBS. Se lavaron las células de médula ósea una vez, y se inyectaron i.v. en ratones receptores que habían sido letalmente irradiados (1000 RAD).

Fenotipo de ratones transgénicos IL-B30 Para analizar la función biológica de IL-30, el gen se expresó bajo el control del mejorador de CMV/promotor de actina, descrito por Niwa et al., (1991) Gen 108:193-200, en ratones transgénicos. Este cassette de mejorador /promotor dirige altos niveles de expresión transgénicas principalmente el músculo esquelético al páncreas, pero el transgen puede expresarse en virtualmente en todos los órganos y células. Ver Lira et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:7215-7219. Los ratones transgénicos IL-B30 eran minúsculos en comparación con los de la misma lechigada de control. El régimen de aumento del peso del cuerpo en los ratones transgénicos 1 L-B30 varía ampliamente pero fue claramente inferior al que se encontró en los hermanos de lechigada El análisis de borrón Northern , de ARN extraído de cualquier músculo o piel de ratones transgénicos IL-B30 y de sus hermanas de lechigada de control de hibridaron con IL-B30 ADNc, y revelaron que el IL-B30 ARNm se detectó tanto en el músculo como en la piel de todo los ratones transgénicos 11-830, mientras que no se detectó ARNm de 11-830 en su hermanos de lechigada de control. Se demuestra que el desarrollo atrofiado estaba siempre asociado con al expresión de LI-B30. Entre los ratones transgénicos 11-30 obtenidos, 25% sobrevivieron hasta la adultez y fueron afectados por ia expresión de IL-B30 ya que exhibieron un deterioro del crecimiento un abdomen hinchado, la piel arrugada, infertilidad y muerte súbita. Por lo tanto, la expresión transgénica de IL-30 causó un fenotipo que evitó la generación de progenie transgénica de IL-B30. Los resultados presentados aquí derivan del análisis preliminar de los ratones fundadores transgénicos de IL-B30.

Análisis Histológico de ratones transgénicos de IL-B30 El examen microscópico de tejidos recogidos a partir de ratones transgénicos IL-B30 reveló una inflamación que va de mínimo a moderado en múltiples sitios, incluyendo pulmones piel, esófago, intestino delgado e hígado (conductos biliares), intestina grueso, y páncreas. Los infiltrados inflamatorios consistían en neutrófilos, linfocitos, y/o macrófagos. La inflamación en la piel estaba asociada con acántosis y/o ulceración en algunos ratones. En los pulmones, los infiltrados de células mononucleares peribronquiales eran algunas veces prominentes, las paredes alveolares contenían cantidades crecientes de leucocitos, y revestimiento epitelial de las vías respiratorias eran hiperplástico. También eran comunes en el hígado infiltrado de células mononucleares periportales mínimas. La corteza de los nodulos linfáticos eran algunas veces escasamente celular y carecía de desarrollo folicular. Se observó, hematopoyesis extramedular (EMH) en el hígado, bazo, y nodulos linfáticos. El EMH estaba especialmente marcado en el bazo. Los bazos de los tres ratones transgénicos y el ratón de control fueron examinados después de tinción ¡nmunohistológica para las células T (anti-Cd3D3), células B (anti-B220), y macrófagos (anti-F4/80). En los ratones transgénicos, las células positivas CD3-, B220-, y F4/80- estaban presente 5 en sus lugares normales. Sin embargo, se separó la pulpa blanca mediante EMH en la pulpa roja y las células se tiñeron positivamente dentro de ¡a pulpa roja fueron interdispersadas con células hematopoyéticas que se tiñeron con menos intensidad, o que no se tiñeron positivamente, con los varios anticuerpos. Estas observaciones demuestran que la expresión transgénica de IL-B30 induce a una inflamación sistémica que está asociada con EMH. Para analizar el efecto de IL-B30 sobre los recuentos de plaquetas y leucocitos en la sangre periférica, se efectuó un análisis de sangre completo. La cantidad de neutrófilos en la sangre de los ratones transgénicos de IL-B30 se incrementó de 3 a 11 veces sobre el recuento más elevados de neutrófilos en los compañeros de lechigada de control. Los aumentos de neutrólifos de sangre periféricas son típicos de la inflamación y están correlacionados con la infiltración de neutrófilos observados en varios tejidos.

Por consiguiente, la relación de mieloide (granulocítica)/eritroide se incrementó en la médula ósea. Además, aumentó la cantidad de plaquetas circulantes hasta tres veces en los ratones transgénicos IL-B30 con respecto a la lechigada de control. Un incremento en la cantidad de plaquetas podría originarse a partir de cualquier incremento de la cantidad de megacariocitos o por un incremento en la producción de plaquetas por los megacariocitos. Para ensayar cualquiera de estas posibilidades, se analizaron microscópicamente la sangre periférica, la médula ósea y el bazo de ratones transgénicos IL-B30. En la sangre periférica, frecuentemente se detectaron plaquetas de morfología de bizarra, incluyendo plaquetas de forma elongada y en forma de huso. En la médula ósea y el bazo de algunos ratones los megacariocitos se ensancharon debido al incremento de cantidades de citoplasma. En contraste, la cantidad de megacarioctios, en la médula ósea y en el bazo no aumentó. Esto sugiere que IL-B30 induce un aumento en la cantidad de plaquetas al acelerar su producción con los megacariocitos. Todos los ratones transgénicos IL-B30 examinados sufrían también de anemia hipocrómica microcítica que iba desde suave a moderada, con esquistocitos y varios grados de regeneración evidente. Las valores de hematocrito fueron inferiores al promedio de control en un 36 a 70%. La presencia de anemia hipocrómica microcítica sugiere un defecto en la producción de hemoglobina.

Perfil de citocina de ratones transgénicos IL-B30 Para probar si la inflamación sistémica observada en los ratones transgénicos IL-B30 está correlacionada con la expresión correlacionada con la expresión alterada de las citocinas pro-inflamatorias, hemos determinado las concentraciones de IL-1 , TNF-a, IL-6 y IFN? en la sangre periférica. En todos los ratones transgénicos IL-B30 ensayados, se incrementaron los niveles de TNF-a y IFN-?. Además, se incrementó el nivel de IL-1 en 25% de los ratones transgénicos IL-B30 ensayados. Las concentraciones de IL-1 y TNF-a encontrados en los ratones transgénicos IL-B30 alcanzaron niveles asociados con la inducción de una respuesta inflamatoria aguda mediante LPS. Sorprendentemente, no se detectó IL-6 en la sangre periférica de ratones transgénicos IL-B30, incluso a pesar de que la expresión IL-6 está sumamente inducida bajo condiciones inflamatorias (Reinecker et al., (1993) Clin. Exp. Immunoloqy 94: 174-181 ; Stevens et al., (1992) Diq. Dis. Sci. 37: 818-826) y pueden estar directamente inducidas por TNF-a, IL-1 y IFN? (Helle et al., (1988) Eur. J. Immunol. 18: 957- 959.

Genes de fase aguda en los hígados de ratones transgénicos IL- B30 El cuerpo reacciona a la inflamación con una respuesta de fase aguda caracterizada por la expresión de proteínas de pasma definidas en el hígado Debido a que los ratones transgénicos IL-B30 exhiben un fenotipo característico de la inflamación sistémica, hemos examinado la expresión de genes de fase aguda en los hígados de ratones transgénicos IL-B30 y en las lechigadas de control. La alfa-1 -ácido glicoproteina, haptoglobina y hemopexina de los genes del hígado en fase aguda, fueron altamente expresados en todos los ratones transgénicos IL-B30 ensayados, mientras que no se detectó ninguna expresión en las lechigadas de control. Esto demostró que los genes de hígado en fase agua estaban constitutivamente expresados en los animales transgénicos IL-B30.

Inmunoqlobulinas del suero de ratones transgénicos IL-B30 Durante una respuesta inmune, algunas citocinas inducen la diferenciación de la célula B y la subsiguiente síntesis de inmunoglobulina.

Para ensayar si la síntesis de inmunoglobulina se alteraba en los ratones transgénicos IL-B30, se determinaron las concentraciones de los isotipos de inmunoglobulina en la sangre periférica. En 2 de 7 ratones transgénicos IL-B30, se incrementó la concentración de IgA de 6 a 9 veces cuando se comparó con las lechigadas de control. Además, se incrementaron las concentraciones de IgGI, lgG2a y IgGb de 2,5 a 6 veces en todos los ratones transgénicos en IL-B30 cuando se compararon con las lechigadas de control.

En contraste, no pudo detectarse ningún incremento significativo en los títulos de IgM o IgE en cualquiera de los ratones transgénicos IL-B30 ensayados. En realidad, 4 de 7 ratones IL-B30 transgénicos exhibieron niveles marcadamente disminuidos de síntesis de IgM. Resumiendo, un subgrupo de ratones transgénicos IL-B30 exhibió un aumento de 6 a 9 veces de la concentración de los isotipos IgA e IgG, de inmunoglobulina, mientras que no se detectó ningún aumento significativo en las concentraciones de los isotipos de ¡nmunoglobulina IgM e IgE.

Niveles de IGF-1 en el suero en ratones transgénicos IL-B30 Las condiciones inflamatorias crónicas (Kirschner y Sutton (1986) Gastroenterology 91.830-836; Laursen et al. (1995) Arch. Dis. Child. 72: 494497) o la sobre expresión de las citocinas en los animales transgénicos (De Benedetti et al., (1994) J. Clin. Invest. 93: 2114-2119) pueden causar un deterioro del desarrollo que está asociado con una disminución del factor-1 del crecimiento de tipo de insulina (IGF-1). Para probar si el desarrollo atrofiado del ratón transgénico IL-B30 podrá rastrearse hasta niveles reducidos de IGF-1 , se sometieron a ensayos muestras de suero de ratones transgénicos para IGF-1. En todos los ratones transgénicos IL-B30 ensayados, la cantidad de IGF-I en el suero fue de 12 a 14% del nivel que se encontró en los compañeros de lechigada de control apareados por edad. Estos sugiere que la expresión transgénica de IL-B30, así como también la subsiguiente respuesta inflamatoria producida, da como resultado la reducción de IGF-I en ratones transgénicos IL-B30, y que podría consecuentemente ser la causa de desarrollo deteriorado e infertilidad (GAy et. al, (1997) Endocrinoloqy 137(7): 2937-2947).

Expresión de IL-30 biológicamente activo en células hematopoyéticas Las citocinas son proteínas secretadas que regulan el sistema inmunitario localmente o que son intermediarios de los efectos a largo plazo. Para ensayar si IL-B30 funciona como una citocina, y puede inducir inflamación multi-orgánica distante y una respuesta en el hígado de fase aguda, transferimos IL-B30 médula ósea transgénica en ratones receptores de tipo salvaje letalmente irradiados. Los receptores de médula ósea fueron monitoreados semanalmente para determinar la inducción de una respuesta de fase aguda. Ei aumento de las concentraciones de la proteína de fase aguda SAA pudo detectarse en los receptores de médula ósea IL-B30 tan pronto como a los 35 días después de la transferencia y los niveles de SAA se incrementaron a lo largo del tiempo Concurrentemente con el aumento de las concentraciones de SAA en la sangre periférica, se deterioró la salud de los receptores de médula ósea IL-B30 a juzgar por la apariencia de la piel arrugada e inflamada del hocico y el cuello. En contraste, los receptores de médula ósea de tipo salvaje no tuvieron niveles elevados de SAA en la sangre, ni parecían enfermos. Los animales terminaron cuando parecían gravemente enfermos. Pudo detectarse la expresión de IL-B30 en la médula ósea y en el bazo de los receptores de médula ósea transgéncia IL-B30, pero no en los órganos de los receptores de médula ósea de tipo salvaje. Como en los dadores transgénicos ÍL-B30, la piel, los pulmones, el hígado, y el tracto gastrointestinal estaban inflamados en los receptores de médula ósea transgénica y IL-B30, pero no en los receptores de médula ósea de tipo salvaje. Nuevamente, los genes de hígado de fase aguda (hemopexina, AGP-1 ) estaban altamente expresados en los receptores de médula ósea transgénicos IL-B30, pero no pudo detectarse IL-6 en el suero sanguíneo. Estos resultado sugieren que IL-B30 es una verdadera citocina con propiedades de largo rango. La expresión transgénica de IL-B30 induce un sorprendente fenotipo caracterizado por arrugas, inflamación sistémica, infertilidad y muerte de los animales transgénicos. Los animales transgénicos IL-B30 tienen inflamación sistémica con infiltración de células inflamatorias de los pulmones, hígado, piel, y tracto digestivo. La sobreexpresión de IL-B30 in vivo causó un fenotipo de desarrollo deteriorado e inflamación - que fue sorprendentemente similar al de varios modelos de expresión transgénica de IL-6. De manera similar al efecto de la expresión transgénica de IL-6, o después de la administración de IL-6 recombinante a ratones, se observó infiltración neutrófila y anemia como resultado de la expresión transgénica de IL-B30. Tal como en los animales transgénicos IL-6, el desarrollo deteriorado de los fundadores transgénicos IL-B30 esta ligada a niveles disminuidos de IGF-I que podrían estar relacionados con la inflamación sistémíca observada en estos animales. Este fenotipo de los animales transgénicoas IL-B30 podría estar causado por la expresión IL-6 sobreregulada ya sea como efecto directo de la sobreexpresión de IL-B30, o bien mediante la sobreregulación intermediada por IL-B30 de IL-1 y una expresión de TNFa. IL-1 y TNFa son inductores conocidos de IL-1 y el incremento de concentración es de TNF-a y de IL-1 se encontró en la sangre periférica de ratones transgénicos IL-30. Sin embargo, no pudo detectarse IL-6 en la sangre de IL-B30 transgénicos lo cual sugiere que el fenotipo de los animales IL-B30 está ligado directamente a la sobreexpresión de esta nueva citocina y que, tal como está implícito por sus homologías de secuencia, la IL-B30 tiene actividades biológicas similares a IL-6. IL-6 es una citocina pleyotrópica que entre una amplia variedad de funciones induce trombocitosis, síntesis de proteína en fase aguda, y diferenciación de células B. En realidad, los animales transgénicos IL-B30 expresan constitutivamente genes hepáticos de fase aguda tal como ACP-I, haptoglobina, hemopexina y proteína A amiloide del suero. Se ha mostrado un fenotipo similar en ratones como efecto de la sobreexpresión transgénica de IL-6, o después de la administración de IL-6 recombinante. Además la expresión transgénica de IL-B30 dio como resultado trombocitosis que era inusual porque muchas de las plaquetas tenían morfología bizarra (apariencia alargada, tamaño grande, y/o formas de huso). Sospechamos que IL-B30 y/o otras citocinas sobrereguladas tienen un efecto sobre la producción normal de plaquetas. Esto sugiere nuevamente que IL-B30 comparte una actividad biológica con IL-6 y sus similares.

IL-6 ha sido también identificado como un factor de diferenciación de célula B. La sobreexpresión transgénica de IL-6 causa plasmocitoma y los ratones deficientes en IL-6 muestran una respuesta de IgG reducida. Aunque hemos observado incrementos en la producción de IgG e IgA en algunos ratones transgénicos IL-B30, esta observación no coincide entre diferentes fundadores. Por lo tanto un análisis adicional es necesario para caracterizar adicionalmente IL-B30 como potencial factor de diferenciación de célula B. Los ratones transgénicos IL-B30 que aumentan los neutrófilos circulantes eran consistentes con la evidente inflamación en varios tejidos, pero sin embargo, los cambios en los parámetros de coágulos rojos de la sangre no puede explicarse fácilmente. IL-1 , TNF-alfa, e IFN-gama son mediadores de un síndrome comúnmente denominado anemia de enfermedad crónica (ACD), que generalmente se presenta como una anemia normocítica, normocrónica, no-regenerativa (o mínimamente regenerativa), y que se observan una variedad de enfermedades inflamatorias crónicas. La Anemia de Enfermedad Crónica puede estar presente también en forma microcítica, hipodrómica en algunos pacientes humanos. El síndrome se debe a un metabolismo de hierro alterado y a una respuesta disminuida a la eritropoyetina. La anemia hipocrómica microcítica observada en ratones IL-B30 puede deberse a ACD, según se sugiere por los aumentos de concentraciones periféricas de citocina. Sin embargo, la causa más común de la anemia hipocrómica microcítica es la deficiencia de hierro, que es más consistente con la respuesta parcial de médula ósea (regeneración) y trombocitosis que se observa en ratones IL-B30. Una investigación adicional, incluyendo la medición de ferritina del suero, hierro, y capacidad total de adhesión del hierro que permitiría la diferenciación de ACD de la anemia con deficiencia del hierro, no se llevó a cabo debido a las dificultades para obtener sangre adecuada en los ratones afectados. Se sabe que IL-1 y TNF-alfa son inductores conocidos de la expresión de IL-6 y la expresión de IL-6 está usualmente sobreregulada durante una respuesta inflamatoria. Por lo tanto es sorprendente que IL-6 no pudiera ser detectado en la sangre periférica de animales transgénicos IL-B30. Esto sugiere que IL-B30 tiene un efecto negativo sobre la expresión IL-6 mediante un mecanismo no identificado. En realidad, la ausencia de IL-6 en animales transgénicos IL-B30 podría explicar los altos niveles de IL-1 y de TNF-alfa observados en estos animales debido al hecho de que 11-6 tiene un efecto negativo sobre las concentraciones de IL-1 y TNF-alfa circulante en los ratones. Las altas concentraciones de TNF-alfa circulantes observadas en ratones transgéncicos IL-B30 podrían ser también un resultado del incremento de las concentraciones de IFN-gama. IFN-gama se produce mediante las células T activadas por IL-2 o células B activadas por IL-4, e induce la expresión TF-alfa en monocitos y macrofagos. Sigue quedando sin determinar si la expresión de IFN-gama es directamente intermediada por IL-B30 o por otras citocinas inducidas por IL-B30. Resumiendo, nuestros resultados sugieren que IL-B30 comparte una amplia variedad de actividades biológicas con IL-6. Falta ver si estas actividades biológicas están intermediadas por un receptor común, un elemento de señal de transducción o un factor de transcripción compartido con IL-6. Esperamos que estos casos podrán clarificarse mediante los experimentos que se llevan a cabo usando modalidades genéticas y bioquímicas. Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia en el mismo grado que si se indicara específica e individualmente cada publicación o solicitud de patente individual para ser incorporada como referencia en su totalidad para cualquier propósito. Pueden efectuarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, tal como resultará aparente para los expertos en la materia. Las modalidades específicas aquí descritas se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invención queda únicamente limitada por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance total de los equivalentes a los cuales tienen derecho dichas reivindicaciones.

LISTA_DE SECUENCIAS <110> Shering Co oration <120> Citocinas de Mamíferos; Reactivos y Métodos Relacionados <130>CX01042XPCT <140> <141> <150> 09/393,090 <151> 1999-09-09 <150> 09/393,090 <151> 1999-09-09 <160> 5 <170>PatentInVe.2.1 <210> 1 <211>570 <212>ADN <213> Organismo desconocido <220> <223> Descripción de Organismo Desconocido; supuestamente Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(567) <220> <221> mat_peptido <222>(64)..(567) atg ctg ggg age aga gct gta atg ctg ctg ttg ctg ctg ecc tgg acá 48 Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr -20 -15 -10 gct cag ggc aga gct gtg ect ggg ggc age age ect gcc tgg act cag 96 Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln -5 -1 1 5 10 tgc cag cag ctt tea cag aag ctc tgc acá ctg gcc tgg agt gca cat 144 Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His 15 20 25 cea cta gtg gga cae atg 'gat cta aga gaa gag gga gat gaa gag act 192 Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr 30 35 40 acá aat gat gtt ecc cat ate cag tgt gga gat ggc tgt gac ecc caá 240 Thr Asn Asp Val Pro His lie Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln 45 50 55 gga etc agg gac aac agt cag ttc tgc ttg caá agg ate cae cag ggt 288 Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg lie His Gln Gly 60 65 70 75 ctg att ttt tat gag aag ctg cta gga teg gat att ttc acá ggg gag 336 eu lie Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp lie Phe Thr Gly Glu 80 85 90 ect tet ctg ctc ect gat age ect gtg gcg cag ctt cat gcc tec cta 384 Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu Bis Ala Ser Leu 95 100 105 ctg ggc ctc age caá ctc ctg cag ect gag ggt cae cae tgg gag act 432 Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr 1 0 115 120 cag cag att cea age ctc agt ecc age cag cea tgg cag cgt ctc ctt 480 Gln Gln lie Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu 125 130 135 ctc cgc ttc aaa ate ctt cgc age ctc cag gcc ttt gtg gct gta gcc 528 Leu Arg Phe Lys He Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala 140 145 150 155 gcc cgg gtc ttt gcc cat gga gca gca acc ctg agt ecc taa 570 Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro 160 165 <210> 2 <211> 189 <212> PRT <213> Organismo desconocido <223> Descripción de Organismo Desconocido; supuestamente Homo Sapiens <400> 2 Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr -20 -15 -10 Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln -5 -1 1 5 10 Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His 15 20 25 Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr 30 35 40 Thr Asn Asp Val Pro His He Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln 45 50 55 Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg He His Gln Gly 60 .65 70 75 Leu lie Phe Tyr Glu .Lys Leu Leu Gly Ser Asp He Phe Thr Gly Glu 80 85 90 Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu Hís Ala Ser Leu 95 100 105 Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr 110 115 120 <210> 3 <211>1203 <212>ADN <213> Organismo desconocido <220> <223> Descripción de Organismo Desconocido; supuestamente Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (113)..(700) <220> <221> mat__peptido <222> (176).. (700) <400> 3 cgcttagaag tcggactaca gagttagact cagaaccaaa ggaggtggat agggggtcca 60 caggcctggt gcagatcaca gagccagcca gatctgagaa gcagggaaca ag atg ctg 118 Met Leu -20 gat tgc aga gca gta ata atg cta tgg ctg ttg ecc tgg gtc act cag 166 Asp Cys Arg Ala Val He Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr Gln -15 -10 -5 ggc ctg gct gtg ect agg agt age agt ect gac tgg gct cag tgc cag 214 Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys Gln -1 1 5 10 cag ctc tet cgg aat ctc tgc atg cta gcc tgg aac gca cat gca cea 262 Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala Pro 15 20 25 gcg gga cat atg aat cta cta aga gaa gaa gag gat gaa gag act aaa 310 Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr Lys 30 35 40 45 aat aat gtg ecc cgt ate cag tgt gaa gat ggt tgt gac cea caá gga 358 Asn Asn Val Pro Arg lie Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln Gly 50 55 60 ctc aag gac aac age cag ttc tgc ttg caá agg ate cgc ca ggt ctg 406 Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg lie Arg Gln Gly Leu 65 70 " 75 gct ttt tat aag cae ctg ctt gac tet gac ate ttc aaa ggg gag ect 454 Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp lie Phe Lys Gly Glu Pro 80 85 90 gct cta ctc ect gat age ecc atg gag caá ctt cae acc tcc cta cta 502 Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His. Thr Ser Leu Leu 95 100 105 gga ctc age caá ctc ctc cag cea gag gat cae ecc cgg gag acc caá 550 Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr Gln 110 115 120 125 cag atg ecc age ctg agt tet agt cag cag tgg cag cgc ecc ctt ctc 59S Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu Leu 130 135 140 cgt tcc aag ate ctt cga age ctc cag gcc ttt ttg gcc ata gct gcc 646 Arg Ser Lys He Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala He Ala Ala 145 150 155 cgg gtc ttt gcc cae gga gca gca act ctg act gag ecc tta gtg cea 694 Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val Pro 160 165 170 acá gct taaggatgcc caggttccca tggctaccat gataagacta atetatcage 750 Thr Ala 175 ccagacatct accagttaat taaeccatta ggacttgtgc tgttcttgtt tcgtttgttt 810 tgcgtgaagg gcaaggacac cattattaaa gagaaaagaa acaaacccca gagcaggcag 870 ctggctagag aaaggagctg gagaagaaga ataaagtctc gagcccttgg cettggaage 930 gggcaagcag ctgcgtggcc tgaggggaag ggggcggtgg categagaaa ctgtgagaaa 990 acccagagca tcagaaaaag tgagcccagg ctttggccat tatctgtaag aaaaacaaga 1050 aaaggggaac attatacttt cctgggtggc tcagggaaat gtgcagatgc acagtactcc 1110 agacageage tctgtacctg cctgctctgt ccctcagttc taacagaatc tagtcactaa 1170 gaactaacag gactaccaat acgaactgas aaa 1203 <210> 4 <211> 196 <212> PRT <213> Organismo desconocido <223> Descripción de Organismo Desconocido; supuestamente Mus sp. <400> 4 Met Leu Asp Cys Arg Ala Val He Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val -20 -15 -10 Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln -5 -1 1 5 10 Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His 15 20 25 Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu 30 35 40 Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg He Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro 45 50 55 Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg He Arg Gln 60 65 70 75 Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp He Phe Lys Gly 80 85 90 Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser 95 100 105 Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu 110 115 120 Thr Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro 125 130 135 Leu Leu Arg Ser Lys He Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala He 140 145 150 155 Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu 160 165 170 Val Pro Thr Ala 175 <210> 5 211> 102 <^12> PRT <213> Organismo desconocido <220> <223> Descripción de Organismo Desconocido; supuestamente Sus sp. <400> 5 Ser Cys Leu Gln Arg He His Gln Gly Leu Val Phe Tyr Glu Lys Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ser Asp He Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu His Pro Asp Gly 20 25 30 Ser Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Arg Gln Leu Leu 35 40 45 Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Glu Gln Thr Pro Ser Pro Ser 50 55 60 Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Leu Lys He Leu Arg 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly 85 90 95 Ala Ala Thr Leu Ser Gln 100

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una composición, caracterizada porque comprende: a) ambos: i) un polipéptido sustancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-12 p40, y II) un polipéptido sustancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-B30; b) ambos: i) un polipéptido sustancialmente puro que comprende por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40; y ¡i) un polipéptido sustancialmente puro que comprende por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30; c) un polipéptido sustancialmente puro que comprende a alnbos: i) una pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-12 p40, y ii) una pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-B3Q, o d) un polipéptido sustancialmente puro que comprende ambos: i) un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40; y ii) un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30.

2. La composición de la reivindicación 1 , caracterizada además porque: a) dicha pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos comprende un segmento de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; b) dicha pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos son de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; c) dicho segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; d) dicho segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; e) comprende además un portador seleccionado entre un compuesto acuoso que incluye agua, solución salida y/o solución reguladora de pH; f) está formulada para administración oral, rectal, nasal, tópica, o parenteral; o g) es una composición estéril.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque: a) por lo menos uno de dichos polipéptidos está: i) detectablemente marcado; ii) recombinantemente producido; iii) no glicosilado; iv) desnaturalizado; v) unido a un substrato sólido; o vi) conjugado con otra porción química; b) comprende a ambos: i) un polipéptido IL-12 p04 sustancialmente puro; y ii) un polipéptido IL-B30 sustancialmente puro; c) comprende un polipéptido sustancialmente puro que comprende IL-12 p40 fusionado con IL-B30 o d) combinado con IL-18, IL-12, radiación o quimioterapia, un coadyuvante inmune, o un antiviral.

4. Un equipo que comprende una composición como la que se reclama en la reivindicación 1 , y: a) un compartimiento que comprende dicho polipéptido; o b) instrucciones para ser usadas o para el descarte de reactivos en dicho equipo.

5. Un ácido nucleico aislado o recombinante, caracterizado porque codifica para: a) ambos: i) un polipéptido sustancialmente puro que comprende una pluralidad de distintos segmentos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos IL-12 p40; y ii) un polipéptido sustancialmente puro que comprende una pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos de IL-B30; b) ambos: i) un polipéptido sustancialmente puro que comprende por aminoácidos contiguos de IL-12 p40; y ii) un polipéptido sustancialmente puro que comprende por aminoácidos contiguos de IL-B30; c) un polipéptido sustancialmente puro que comprende ambos: i) una pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 contiguos de IL-12 p40; y ii) una pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 contiguos de IL-B30; o d) un polipéptido sustancialmente puro que comprende ambos: i) un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-12 p40; y ii) un segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30.

6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, caracterizado además porque: a) dicha pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos contiguos comprende un segmento de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; b) dicha pluralidad de segmentos distintos de por lo menos 7 aminoácidos distintos son ambos de por lo menos 9 aminoácidos contiguos; c) dicho segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de 1L-12 p40 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; d) dicho segmento de por lo menos 11 aminoácidos contiguos de IL-B30 es de por lo menos 15 aminoácidos contiguos; e) IL12 p40 es de un primate; f) dicho IL-B30 es de un primate; g) es un vector de expresión; h) comprende además un origen de replica; i) comprende una marca detectable; j) comprende una secuencia nucleotídica sintética que es de menos de 6 kb, preferiblemente de menos de 3 kb; o I) es de un primate.

7. Una célula, caracterizada porque comprende dicho ácido nucleico recombinante de la reivindicación 6.

8. La célula de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque dicha célula es: a) una célula procariótica; b) una célula eucariótica; c) una célula bacteriana; d) una célula de levadura; e) una célula de insecto; f) una célula de mamífero; g) una célula de ratón; h) una célula de primate; o i) una célula humana.

9. Un equipo, caracterizado porque comprende dicho ácido nucleico de la reivindicación 6, y: a) un compartimiento que comprende dicho ácido nucleico; b) un compartimiento que comprende además un polipéptido IL-12 p40 de primate; o c) un compartimiento que comprende además un polipéptido IL-B30 de primate; o d) instrucciones para uso o descarte de los reactivos en dicho equipo.

10. Un ácido nucleico, caracterizado porque se híbrida: a) bajo condiciones de lavado de 30 minutos a 50°C y menos de 1M de sal para una porción codificadora madura natural de IL-12 p40 de primate; y b) bajo condiciones de lavado de 30 minutos a 50°C y menos de 1M de una sal para la porción codificadora madura natural de primate IL-B30.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 10, caracterizado además porque: a) dichas condiciones de lavado para IL-12 p40 son a 60°C y menos de 400 mM de sal; b) dichas condiciones de lavado para IL-B30 son a 60°C y menos de 400 mM de sal; c) dicho ácido nucleico exhibe identidad en una extensión de por lo menos 50 nucleótidos para una secuencia que codifica IL-12 p40 de primate; y/o d) dicho ácido nucleico exhibe identidad en una extensión de por lo menos 50 nucleótidos para secuencia que codifica IL-B30 de primate.

12. El ácido nucleico de la reivindicación 10, caracterizado además porque: a)dichas condiciones de lavado para IL-12 p40 son a 65°C y menos de 150 mM de sal; b) dichas condiciones de lavado para IL-B30 son a 65°C y menos de 150 mM de sal; c) dicho ácido nucleico exhibe identidad en una extensión de por lo menos 90 nucleótidos para una secuencia que codifica IL-12 p40 de primate; y/o d) dicho ácido nucleico exhibe identidad en una extensión de por lo menos 90 nucleótidos para una secuencia que codifica IL-B30 de primate.

13. Un antagonista de IL-12 p40/IL-B30 combinado con: a) un antagonista TNFa; b) un antagonista IL-12; c) IL-10; o d) esteroides.

14. Un compuesto de adhesión, caracterizado porque comprende un sitio de adhesión de antígeno de un anticuerpo que se adhiere específicamente a una composición como la que se describe en la reivindicación 1 : a) que comprende un polipéptido sustancialmente puro que comprende a ambos: i) un polipéptido IL-12 p40 sustancialmente puro; y ii) un polipéptido IL-B30 sustancialmente puro; o b) que comprende un polipéptido sustancialmente puro que comprende IL-12 p40 fusionado a IL-B30 pero no a cualquiera de un polipéptido IL-12 p40 o IL-B30.

15. El compuesto de adhesión de la reivindicación 14, caracterizado además porque: a) dicho compuesto adherente está en un contenedor; b) dicho compuesto adherente es un fragmento Fv Fab, o Fab2; dicho compuesto adherente está conjugado con otra porción química; o d) dicho anticuerpo: i) está creado contra una composición de la reivindicación 1 ; ii) está inmunoseleccionado; iii) es un anticuerpo policlonal; iv) exhibe un Kd para el antígeno de por lo menos 30 mM; v) está unido a un substrato sólido incluyendo una membrana plástica o de granulos; vi) está en una composición estéril; o vii) está detectablemente rotulado, incluyendo un rótulo radioactivo o fluorescente.

16. Un equipo, caracterizado porque comprende dicho compuesto de adhesión de la reivindicación 15, y: a) un compartimiento que comprende dicho compuesto de adhesión; o b) instrucciones para uso o descarte de reactivos en dicho equipo.

17. Un método para producir un complejo de antígeno: anticuerpo caracterizado porque comprende poner en contacto bajo condiciones apropiadas, una composición IL-12 p40/IL-B30 de primate con un anticuerpo de la reivindicación 14 permitiendo de este modo que se forme el complejo.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque: a) dicho complejo se purifica a partir de otras citocinas; b) dicho complejo está purificado a partir de otro anticuerpo; c) dicho contacto se efectúa con una muestra que comprende una citocina; d) dicho contacto permite una detección cuantitativa de dicho antígeno; e) dicho contacto se efectúa con una muestra que comprende dicho anticuerpo; o f) dicho contacto permite una detección cuantitativa de dicho anticuerpo.

19. Una composición, caracterizada porque comprende: a) un compuesto de adhesión estéril de la reivindicación 14 o b) dicho compuesto de adhesión de la reivindicación 14 y un vehículo, donde dicho vehículo es: i) un compuesto acuoso, que incluye agua, solución salina, y/o buffer; y/o ii) está formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

20. Un método para modular la fisiología o el desarrollo de una célula o tejido, caracterizado porque comprende poner en contacto dicha célula con una composición de la reivindicación 1 o un antagonista del mismo.

21. El uso de una composición como la que se reclama en la reivindicación 1, para preparar un medicamento para modular la fisiología o el desarrollo de una célula dando como resultado un incremento en la producción de I FN?.

22. El uso de conformidad con la reivindicación 21 , en donde dicha célula está en un organismo huésped y dicho organismo exhibe una respuesta Th1 mejorada.

23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicha respuesta Th1 está seleccionada de: a) un efecto anti-tumoral; b) un efecto coadyuvante; c) un efecto anti-viral; o d) un efecto alérgico antagonizado.

24. El uso de una composición como la que se describe en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para modular la fisiología o el desarrollo de una célula en un organismo huésped, en donde dicha modulación da como resultado: a) un efecto anti-tumoral; b) un efecto coadyuvante; c) un efecto anti-viral; o d) un efecto alérgico antagonizado.

25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde dicho medicamento está en combinación con: a) IL-18; b) IL-12; c) terapia o quimioterapia de radiación; d) un coadyuvante inmune; o e) un terapéutico anti-viral.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde dicho antagonista es un anticuerpo contra la subunidad ß1 del receptor IL-12.

27. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde dicha modulación se efectúa con dicho antagonista, y dicha modulación da como resultado una disminución relativa en la producción de I FN?.

28. El uso de un antagonista, para preparar un medicamento para modular la fisiología o desarrollo de una célula en un organismo huésped, en donde dicha modulación da como resultado una mejora de: a) una condición autoinmune; o b) una condición inflamatoria crónica.

29. Un método para incrementar la secreción de: a) un IL-B30 de primate que comprende expresar dicho polipéptido con IL-12 p40; o b) un IL-12 p40 de primate, dicho método estando caracterizado porque comprende expresar dicho IL-12 p40 con IL-830.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque: a) dicho incremento es de por lo menos 3 veces; o b) dicha expresión es de un ácido nucleico recombinante que codifica IL-B30 y lL-12 p40. 5

31. Un método para rastrear un receptor que se adhiere a dicha composición de la reivindicación 3, caracterizado porque comprende poner en contacto dicho complejo con una célula que expresa dicho receptor bajo condiciones que permiten que dicho complejo se adhiera a dicho receptor, formando de esta manera una interacción detectable. 10

32. El método de conformidad con la reivindicación 31 , I L- caracterizado además porque dicha interacción da como resultado una respuesta fisiológica en dicha célula.

33. El uso de: a) un agonista de una proteína IL-B30 de mamífero; o b) un antagonista de una proteína IL-B30 de mamífero, para 15 preparar un medicamento para modular la respuesta inflamatoria en un animal.

34. El uso de conformidad con la reivindicación 33 en donde dicho: a) proteína IL-B30 de mamífero es una proteína de primate; b) el antagonista es un anticuerpo que se adhiere a dicho IL-B30 de mamífero, o c) 20 el antagonista es un anticuerpo que bloquea la señalización mediada por IL- B30 de mamífero.

35. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en donde dicho animal exhibe signos o síntomas de una respuesta inflamatoria de fase aguda.

36. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en donde 5 dicho signo o síntoma se encuentra en el tejido de la piel; el tejido del pulmón; el tejido gastrointestinal; o el tejido del hígado.

37. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en donde dicho signo o síntoma se encuentra en el tejido de la piel; el tejido del pulmón; el tejido gastrointestinal; o el tejido del hígado. 10

38. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en donde í j, dicha modulación es una maduración acelerada de neutrofilos en plaquetas.

39. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en donde dicha modulación tiene un efecto IgA.

40. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en donde 15 dicha modulación tiene un efecto sobre IgG.

41. El uso de conformidad con la reivindicación 38, en donde dicha modulación es con dicho agonista.

42. El uso de conformidad con la reivindicación 39, en donde dicha modulación es con dicho agonista. 20

43. El uso de conformidad con la reivindicación 40, en donde dicha modulación es con dicho agonista.

44. El uso de conformidad con la reivindicación 41 , en donde, a) dicho agonista es dicha proteína IL-B30 de mamífero; o b) dicho animal experimenta signos o síntomas de una condición inflamatoria.

45. El uso de conformidad con la reivindicación 42, en donde, a) dicho agonista es dicha proteína IL-B30 de mamífero; o b) dicho animal experimenta signos o síntomas de una condición inflamatoria.

46. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en donde, a) dicho agonista es dicha proteína IL-B30 de mamífero; o b) dicho animal experimenta signos o síntomas de una condición inflamatoria.

47. El uso de conformidad con la reivindicación 44, en donde dicho medicamento está en combinación con: a) un agonista o antagonista de citocina anti-inflamatorio; b) un analgésico; c) un agente anti-inflamatorio; o d) un esferoide.

48. El uso de conformidad con la reivindicación 45, en donde dicho medicamento está en combinación con: a) un agonista o antagonista de citocina anti-inflamatorio; b) un analgésico; c) un agente anti-inflamatorio; o d) un esferoide.

49. El uso de conformidad con la reivindicación 46, en donde dicho medicamento está en combinación con: a) un agonista o antagonista de citocina anti-inflamatorio; b) un analgésico; c) un agente anti-inflamatorio; o d) un esferoide.

50. Un método para inducir la proliferación de células T de memoria por la administración de IL-B30 o un agonista del mismo.