MXPA02001349A - Inhibidores de la polimerizacion de proteinas y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al descubrimiento de peptidos que modulan las interacciones proteina-proteina necesarias para la polimerizacion de proteinas y la concentracion de complejos proteinicos supramoleculares. Mas especificamente, se describen herramientas biotecnologicas y medicamentos que comprenden varios peptidos menores que tienen una terminacion carboxilo modificada, para utilizarse en el estudio y tratamiento o prevencion de la enfermedad humana.

Description

INHIBIDORES DE LA POLIMERIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al descubrimiento de péptidos que modulan las interacciones proteína-proteína necesarias para la polimerización de proteínas y la concentración de complejos de proteína supramoleculares . Más específicamente, se describen herramientas y medicamentos biotecnológicos que comprenden varios péptidos menores que tienen un término carboxilo modificado para su uso en el estudio y tratamiento o prevención de enfermedades humanas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las estructuras supramoleculares tales como complejos de transcripción, toxinas bacteriales, filamentos y haces de proteína, y recubrimientos de proteína viral se forman mediante la concentración no-covalente de muchas moléculas, llamadas "subunidades". Las interacciones proteína-proteína entre subunidades estabilizan estos complejos y proporcionan integridad estructural. Este proceso se favorece de manera evolutiva debido a que la formación de una gran estructura a partir de subunidades menores proporciona una población altamente diversa de complejos a partir de la mínima cantidad de información genética, la concentración y desconcentración de tales estructuras puede controlarse fácilmente (dado que las subunidades se asocian a través de enlaces múltiples de relativamente baja energía), y pueden evitarse fácilmente los errores en la síntesis de la estructura debido a que los mecanismos de corrección pueden operar durante el curso de la concentración para excluir las subunidades malformadas. (Ver, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Tercera Edición, Garland Publishing, Inc., New York y Londres, pag. 123 (1994) . Muchas proteínas y complejos proteínicos que regulan la expresión del gen (e.g., activadores y represores transcripcionales) logran una fuerte interacción con un ácido nucleico y a través de interacciones proteína-proteína y la polimerización de proteínas. En un caso simple, una subunidad se asocia con otra subunidad para formar un dímero. Las interacciones proteína-proteína entre los dos monómeros estabilizan al dímero. Las proteínas de hélice-giro-hélice, por ejemplo, son una familia de proteínas que comprende cientos de proteínas de unión de DNA que se unen como dímeros simétricos a las secuencias DNA que se componen de dos "semi-sitios" muy similares, que están dispuestos también simétricamente. Esta disposición permite que cada monómero de proteína forme un conjunto de contactos casi idénticos y aumenta enormemente la afinidad de unión. Un segundo grupo importante de motivos de unión de DNA utiliza una o más moléculas de cinc como un componente estructural. Tales motivos de unión de DNA cinc-coordinados, llamados ramificaciones de cinc, forman también dímeros que permiten que una de las dos hélices a de cada subunidad interactúe con el canal mayor de DNA. Además, un tercer motivo de proteína, llamado el motivo de cierre de leucina, reconoce al DNA como un dímero. En los dominios de cierre de leucina, dos hélices a, una de cada monómero, se unen entre sí para formar una bobina de bobinado corto. Las proteínas reguladoras del gen que contienen un motivo de cierre de leucina pueden formar ya sea homodímeros, en los cuales los dos monómeros son idénticos, o heterodímeros en los cuales los monómeros son diferentes. Un cuarto grupo de proteínas reguladoras que unen DNA como un dímero comprenden un motivo de hélice-enlace-hélice. Como con las proteínas de cierre de leucina, las proteínas de hélice-enlace-hélice pueden formar homodímeros o heterodímeros. (Ver, Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Tercera Edición, Garland Publishing, Inc., New York y Londres, pag. 124 (1994)). Muchas proteínas reguladoras del gen, en particular los factores de transcripción, dependen de las interacciones proteína-proteína y de la polimerización de proteínas para funcionar apropiadamente . De manera similar, la función de varias toxinas bacteriales depende de las interacciones proteína-proteína y de la polimerización de subunidades. Por ejemplo, la toxina de la tos ferina, la toxina de la difteria, la toxina del cólera, la exotoxina A de Pseudomonas, la toxina lábil al calor de E. coli , las verotoxinas, y la toxina shiga tienen estructuras similares que se caracterizan por una subunidad A enzimáticamente activa que se polimeriza a un oligómero de subunidades B que son necesarias para la formación de la holotoxina. (Stein et al., Nature, 355:748 (1992); Read et al., Pat. de los E.U. ?o. 5,856,122; Lingwood, Trends in Microbiology 4:147 (1996)). Muchos creen que las subunidades B divergen de una proteína ancestral común (e.g., una proteína pentamérica que reconoce a los carbohidratos de superficie celular) y se asocian con diferentes componentes enzimáticos. (Stein et al., Nature, 355:748 (1992)). Adicionalmente a las pequeñas estructuras supramoleculares, los grandes complejos supramoleculares compuestos de múltiples subunidades se encuentran también presentes en la naturaleza. Cuando la fuerza mecánica es de la mayor importancia en una célula, las concentraciones moleculares se hacen comúnmente a partir de subunidades fibrosas en vez de globulares. Mientras que las bobinas de bobinado corto sirven como dominios de dimerización en varias familias de proteínas reguladoras del gen, más comúnmente se extenderá una bobina bobinada por más de 100 nm y sirve como un bloque de formación para una gran estructura fibrosa, tal como los gruesos filamentos de actina o los haces de tubulina. (Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Tercera Edición, Garland Publishing, Inc., New York y Londres, pag. 124-125 (1994)). Sin embargo, la acumulación de grandes estructuras fibrosas puede ser perjudicial en algunas circunstancias y la deposición no-regulada de las proteínas polimerizadas se ha asociado con varias formas de cáncer y enfermedades neurodegenerativas amiloidosis-relacionadas, tales como la enfermedad de Alzheimer y scrapie (enfermedad prion-relacionada) . Algunas subunidades de proteína se montan también dentro de hojas planas en las cuales se disponen las subunidades en arreglos hexagonales. Las proteínas de membrana especializada se disponen frecuentemente de esta manera en capas dobles de lípidos. Con un ligero cambio en la geometría de las subunidades individuales, una hoja hexagonal puede convertirse en un tubo o, con más cambios, en una esfera hueca. Estos principios se ilustran dramáticamente en la concentración de la cápside de proteína de muchos virus. Estos recubrimientos se forman a menudo de cientos de subunidades de proteína idénticas que encierran y protegen al ácido nucleico viral . La proteína en tal cápside tiene una estructura particularmente adaptable, debido a que hace varios tipos diferentes de contacto y también cambia su disposición para dejar salir al ácido nucleico para iniciar la replicación viral una vez que el virus ha entrado en una célula. La información para formar muchas de las concentraciones de complejos de macromoléculas y células está contenida en las subunidades en sí, dado que bajo condiciones apropiadas, las subunidades aisladas se montan de manera espontánea en una estructura final . Muchas interacciones proteína-proteína que están presentes en la naturaleza son esenciales para mediar la función de la proteína, la polimerización de proteínas, y la concentración del complejo supramolecular. La asociación de los factores de transcripción, los complejos de transcripción, las toxinas bacteriales, las concentraciones fibrosas, y las cápsides virales depende de las interacciones proteína-proteína y de la polimerización de proteínas. El descubrimiento de agentes que inhiben selectivamente estas interacciones proteína-proteína y los eventos de polimerización de proteínas permite el desarrollo de nuevas herramientas biotecnológicas, terapéuticas y profilácticas para el estudio, tratamiento y prevención de numerosas enfermedades . SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención incluyen péptidos menores modificados (de dos a diez aminoácidos de longitud) que inhiben las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas y la concentración de los complejos supramoleculares. La selección, diseño, fabricación, caracterización y uso de tales agentes péptidos llamados inhibidores de polimerización de proteínas, se refieren colectivamente como "Tecnología PPI" . El uso de la tecnología PPI puede extenderse a muchas áreas que incluyen pero no se limitan a la investigación y desarrollo biotecnológico, así como, a la medicina terapéutica y profiláctica . Muchos eventos bioquímicos (e.g., la formación de dímeros de factor de transcripción, complejos de transcripción, toxinas bacteriales, y estructuras fibrosas o en haz, y la concentración de cápsides virales) dependen de las interacciones proteína-proteína que ensamblan subunidades de proteína dentro de polímeros y complejos proteínicos. Una manera de romper la concentración de tales estructuras supramoleculares, que para su función particular dependen de la di-, tri-, tetra-, o poli-merización, es construir pequeñas moléculas que afectan tales interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, y las concentraciones de complejos. Se descubrió que los péptidos menores con su grupo hidroxilo de término carboxilo reemplazado con un grupo amida tienen tal efecto inhibidor. De este modo, las modalidades de la presente invención incluyen a los péptidos menores modificados que efectúan las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas y la concentración de complejos proteínicos. En las modalidades deseables, los péptidos cortos modificados se unen a una proteína en una región involucrada en una interacción proteína-proteína y/o una concentración de subunidades y en consecuencia inhiben o previenen la polimerización de proteínas o la formación de un complejo proteínico. En algunas modalidades, los péptidos menores, que tienen una secuencia que corresponde a una secuencia de un factor de transcripción, interactúan con los monómeros del factor de transcripción y previenen la dimerización. En otras modalidades, los péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a un activador o represor transcripcional interactúan con la proteína y modulan la concentración de un complejo activador o represor de transcripción. El complejo NF-?B/l?B, por ejemplo, es incapaz de activar la transcripción, sin embargo, los péptidos menores que interactúan con el NF-?B o l?B, en regiones involucradas en las interacciones proteína-proteína que estabilizan al complejo, pueden modular la formación del complejo (e.g., inhibir o prevenir o aumentar) a fin de aumentar la expresión del gen o prevenir o retardar la expresión del gen. Se proporcionan métodos para modular la concentración del complejo NF-KB y l?B administrando péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a las regiones de interacción proteína-proteína involucradas en la concentración o estabilización del complejo. Además se proporcionan métodos para identificar péptidos menores que modulan la concentración del complejo NF-KB y l?B. Los péptidos menores identificados por su habilidad para modular la concentración del complejo NF-?B y l?B pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir enfermedades con una regulación aberrante del complejo NF-?B y l?B . En otras modalidades, los péptidos menores modificados que corresponden a la secuencia en una subunidad de una toxina bacterial, tal como la toxina de la tos ferina, la toxina de la difteria, la toxina del cólera, la exotoxina A de Pseudomonas, la toxina lábil al calor de E. coli , y la verotoxina, se utilizan para prevenir o inhibir la concentración de una holotoxina bacterial . Se proporcionan métodos, por ejemplo, para inhibir o prevenir el concentración y la función de la toxina de la tos ferina administrando péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a las regiones de interacción proteína-proteína involucradas en la concentración o estabilización de las subunidades que forman la holotoxina. Además, se proporcionan métodos para identificar otros péptidos menores que inhiben o previenen la concentración de la holotoxina bacterial. Los péptidos menores identificados por su habilidad para inhibir la formación de una holotoxina bacterial pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir los efectos tóxicos de una holotoxina bacterial . Las modalidades adicionales incluyen la fabricación e identificación de péptidos menores que inhiben la polimerización de proteínas fibrosas, tales como actina, péptidos ß-amiloide, y proteínas prion-relacionadas. Se proporcionan los métodos para inhibir o prevenir la polimerización de actina, péptido ß-amiloide, y proteínas prion-relacionadas administrando péptidos menores modificados que tienen una secuencia que corresponde a las regiones de interacción proteína-proteína involucradas en la polimerización de proteínas. Además, se proporcionan métodos para identificar péptidos menores que inhiben o previenen la polimerización de proteínas. Los péptidos menores identificados por su habilidad para inhibir actina, péptido ß-amiloide, y la polimerización de proteínas prion-relacionadas pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir enfermedades asociadas con una actina aberrante, un péptido ß-amiloide, o la polimerización de proteínas prion-relacionadas incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y scrapie. Otros aspectos de la invención incluyen la fabricación e identificación de péptidos menores que inhiben la polimerización de tubulina. Los inhibidores de polimerización de tubulina se han administrado para el tratamiento de varias formas de cáncer durante varios años pero permanece la necesidad de inhibidores de polimerización de tubulina menos tóxicos. Los péptidos menores que corresponden a las secuencias de tubulina involucradas en la polimerización de tubulina pueden administrarse oralmente con poco o ningún efecto lateral . Se proporcionan métodos para inhibir o prevenir la polimerización de tubulina administrando péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a las regiones de interacción proteína-proteína involucradas en la polimerización de tubulina. Además, se proporcionan métodos para identificar péptidos menores que modulan (e.g., inhiben, previenen, o aumentan) la polimerización de tubulina. Los péptidos menores identificados por su habilidad para efectuar la polimerización de tubulina pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir enfermedades asociadas con una polimerización de tubulina aberrante. En las modalidades preferidas, los péptidos menores modificados que corresponden a secuencias involucradas en la concentración de la cápside viral se utilizan para romper las interacciones proteína-proteína y, en consecuencia, inhibir o prevenir la concentración de la cápside viral. Por ejemplo, los péptidos menores Gly-Pro-Gly-NH2 (GPG-NH2) , Gly-Lys-Gly-NH2 (GKG-NH2) , Cys-Gln-Gly-NH2 (CQG-NH2) , Arg-Gln-Gly-NH2 (RQG-NH2) , Lys-Gln-Gly-NH2 (KQG-NH2) , Ala-Leu-Gly-NH2 (ALG-NH2) , Gly-Val-Gly-NH2 (GVG-NH2) , Val-Gly-Gly-NH2 (VGG-NH2) , Ala-Ser-Gly-NH2 (ASG-NH2) , Ser-Leu-Gly-NH2 (SLG-NH2) , y Ser-Pro-Thr-NH2 (SPT-NH2) son las especies preferidas. Se proporcionan métodos para inhibir o prevenir una concentración de la cápside viral administrando péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a las regiones de interacción proteína-proteína involucradas en la concentración o estabilización de la cápside viral. Además, se proporcionan métodos para identificar péptidos menores que inhiben o previenen la concentración de la cápside viral. Los péptidos menores identificados por su habilidad para inhibir o prevenir la concentración de la cápside viral pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir infecciones virales, tales como la infección de VIH. Se describen los fármacos que comprenden los péptidos menores modificados de la invención y se proporcionan los métodos para preparar tales fármacos, profilácticos, y terapéuticos para el tratamiento y prevención de enfermedades asociadas con interacciones proteína-proteína, polimerización de proteínas, y la concentración de complejos supramoleculares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 es un fotomontaje de electromicrografías de partículas de VIH no-tratadas. La FIGURA 2 es un fotomontaje de electromicrografías de partículas de VIH que se han puesto en contacto con el inhibidor de proteasa Ritonavir. La FIGURA 3 es un fotomontaje de electromicrografías de partículas de VIH que se han puesto en contacto con GPG-NH2. La FIGURA 4 es un gráfico que representa los resultados de un estudio de infectividad de VIH conducido en células HUT78. La FIGURA 5 ilustra una alineación de la secuencia de proteína que corresponde al término carboxilo de la proteína VIH-1 p24 (residuos 146-231) y a las secuencias de proteína de VIH-2, SIV, virus del Sarcoma de Rous (RSV), célula T humana del tipo 1 del virus de leucemia (HTLV-1) , virus de tumor mamario de ratón (MMTV) , virus de mono Mason-Pfizer (MPMV) , y virus de leucemia murina Moloney (MMLV) . La barra representa la región mayor de homología (MHR) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA Se ha descubierto que los péptidos menores modificados que tienen secuencias que corresponden a las regiones de interacción proteína-proteína previenen y/o inhiben la polimerización de proteínas y la concentración de 4 complejos supramoleculares. En muchas estructuras supramoleculares, las subunidades de proteína (e.g., los monómeros de proteína) experimentan un proceso de concentración o polimerización, que involucra interacciones proteína-proteína no-covalentes, para generar un polímero de moléculas de proteína. Los péptidos menores que tienen una amida en vez de un grupo hidroxilo en el término carboxilo interrumpen este proceso de polimerización inhibiendo las interacciones proteína-proteína necesarias para la generación del polímero. Tales péptidos menores, referidos como inhibidores de polimerización de proteínas son útiles en la fabricación de herramientas biotecnológicas y fármacos para el estudio y la prevención y tratamiento de enfermedades humanas. Además, se proporcionan abajo los procedimientos para elaborar herramientas biotecnológicas y composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos menores modificados y/o peptidomiméticos que se asemejan a estos péptidos menores (referidos colectivamente como "agentes péptidos") que corresponden a las secuencias de factores de transmisión, toxinas bacteriales, proteínas fibrosas o en haces, proteínas de la cápside viral, y otras proteínas involucradas en la polimerización de proteínas y la concentración supramolecular . En algunas modalidades, los péptidos menores, que tienen una secuencia que corresponde a una secuencia de un activador transcripcional, interactúan con los monómeros del factor de transcripción y previenen la dimerización. Al inhibir la dimerización de un activador transcripcional (e.g., NF-?B) , la expresión de los genes activados mediante el factor de transcripción puede reducirse o inhibirse efectivamente. El NF-KB consiste de dos proteínas que tienen pesos moleculares de 50 y 65 kD. Se piensa que el NF-KB es un regulador transcripcional de la expresión del gen para varios genes de citocina. (Haskill et al., Pat. de los E.U. No. 5,846,714). Los péptidos menores que corresponden a la secuencia del NF-KB involucrada en las interacciones proteína-proteína que estabilizan al activador, interrumpen el complejo y, en consecuencia, inhiben la expresión de los genes de citocina. Tales inhibidores tienen uso como herramientas biotecnológicas y como fármacos (e.g., para el tratamiento de enfermedades inflamatorias caracterizadas por una sobreexpresión de los genes de citocina) . En otras modalidades, los péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a un activador o a un represor transcripcional interactúan con el factor de transcripción, modulan la concentración de un complejo represor de transcripción, y, en consecuencia, regulan la expresión del gen. Como se describió anteriormente, el NFKB es un activador transcripcional que se une a las regiones reguladoras de DNA de ciertos genes de citocina. (Haskill et al., Pat. de los E.U. No. 5,846,714). El NF-?B se regula mediante su asociación con una proteína represora de 36 kD llamada I?B. El complejo NF-?B e I?B ( "NF?B/I?B" ) es incapaz de activar la transcripción, sin embargo, cuando el NFKB es fosforilado, el I?B se disocia y puede tener lugar la activación transcripcional. Los péptidos menores que interactúan con NF-?B o I?B, de preferencia en las regiones involucradas en las interacciones proteína-proteína que estabilizan al complejo NF-?B/l?B, inhiben o previenen la formación del complejo a fin de mejorar la expresión del gen, o alternativamente, pueden estabilizar al complejo y de este modo, prevenir o retardar la expresión del gen. Muchos péptidos menores que modulan la asociación de NFKB a I?B pueden identificarse utilizando los métodos abajo descritos. Como en lo anterior, los péptidos menores identificados por su habilidad para modular la concentración del complejo NF-?B/l?B pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir enfermedades asociadas con una regulación aberrante del complejo NF-?B/l?B. En otras modalidades, se proporcionan los métodos de fabricación, identificación y uso de los péptidos menores para la inhibición de la polimerización de proteínas, necesarios para la concentración de las toxinas bacteriales. Para que sea efectivo, las toxinas bacteriales deben suministrar la subunidad catalítica de la holotoxina a un sitio de interacción apropiado. Varias toxinas bacteriales se han adaptado a este problema formando una estructura supramolecular que comprende dos componentes funcionales, un componente catalítico y un componente de reconocimiento celular o de unión. En la toxina de la tos ferina y la vetrotoxina, por ejemplo, una subunidad catalítica "A" se une a una concentración de pentámeros comprendida de cinco subunidades "B" que están implicadas en la unión de toxina. Los péptidos menores modificados que corresponden a la secuencia en una subunidad de una toxina bacterial, tal como la toxina de la tos ferina, la toxina de la difteria, la exotoxina A Pseudomonas, la toxina lábil al calor de E. coli , y la verotoxina, pueden utilizarse para prevenir o inhibir la concentración de una holotoxina bacterial y, en consecuencia, reducir o inhibir la toxicidad de la toxina bacterial . Se proporcionan también enseguida los métodos para identificar otros péptidos menores que inhiben la concentración de la holotoxina bacterial. Los péptidos menores identificados por su habilidad para inhibir la formación de una holotoxina bacterial pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir los efectos tóxicos de una holotoxina bacterial . Adicionalmente, los métodos de fabricación e identificación de los péptidos menores que inhiben la polimerización de la actina y los péptidos ß-amiloide se encuentran dentro del alcance de los aspectos de la presente invención. Se ha demostrado que la deposición de ß-amiloide y la agregación o polimerización en una membrana celular ocasiona un influjo de calcio, que causa el daño a células nerviosas. Este daño neuronal se ha asociado con varias enfermedades neurodegenerativas que incluyen, pero no se limitan a, el infarto de Alzheimer y la enfermedad de Huntington. Los compuestos que ocasionan la despolimerización de la actina, tales como las citocalcinas, son útiles para mantener la homeostasis del calcio a pesar de la presencia de péptidos ß-amiloide polimerizados. Se describen abajo los métodos para identificar péptidos menores que inhiben o previenen la polimerización de actina y la agregación del péptido ß-amiloide. Los péptidos menores que inhiben o previenen la polimerización de actina pueden administrarse en conjunción con péptidos menores que inhiben o previenen la agregación de péptidos ß-amiloide a fin de restaurar la homeostasis del calcio y proporcionar un tratamiento terapéuticamente benéfico para individuos afectados con ciertas enfermedades neurodegenerativas. Otras modalidades de la invención incluyen la fabricación e identificación de péptidos menores que inhiben la polimerización de tubulina. Los inhibidores de polimerización de tubulina, tales como la viniblastina y la vinicristina, se han administrado para el tratamiento de varias formas de cáncer durante varios años pero los inhibidores de polimerización de tubulina actuales están asociados con muchos efectos laterales y no son bien recibidos por el cuerpo. En contraste, los péptidos menores que corresponden a secuencias de tubulina involucradas en la polimerización pueden administrarse oralmente con poco o ningún efecto lateral son bien tolerados por el cuerpo. Los métodos para identificar péptidos menores que inhiben la polimerización de tubulina se proporcionan en la siguiente descripción. Los péptidos menores, identificados por su habilidad para inhibir la polimerización de tubulina, pueden utilizarse como herramientas biotecnológicas o pueden administrarse para tratar o prevenir el cáncer. En algunas modalidades, se proporcionan métodos de fabricación, identificación, y uso de péptidos menores modificados que corresponden a secuencias en las proteínas de la cápside viral para el tratamiento y prevención de enfermedades virales. Estos péptidos menores que se unen a la cápside de la proteína viral, inhiben la polimerización de la cápside de la proteína viral y, en consecuencia, inhiben la infectividad viral. Se utilizan, por ejemplo, ensayo de unión in vi tro para demostrar que los péptidos menores que tienen una secuencia que corresponde a la proteína viral p24, se unen a la cápside mayor de la proteína (p24) del VIH-1. 2 Además, utilizando la microscopía electrónica, se demuestra que los péptidos menores interrumpen de manera eficiente la polimerización de la cápside de la proteína y la concentración de la cápside. Se proporciona también evidencia de que los péptidos menores, tales como GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2, inhiben la replicación del VIH-1, VIH-2 y SIV. Debido a que se conocen las secuencias de las regiones de varias proteínas involucradas en las interacciones proteína-proteína que median la polimerización de proteínas y la concentración supramolecular, varios péptidos modificados que corresponden a estas secuencias pueden seleccionarse, diseñarse, elaborarse, y filtrarse rápidamente para identificar aquellos que inhiben y/o previenen efectivamente la unión de proteína o la polimerización de proteínas utilizando las técnicas aquí descritas, o las modificaciones de estos ensayo como será aparente para los expertos en la técnica dada la presente descripción. Aunque los agentes péptido preferidos son tripéptidos que tienen un grupo amida en su término carboxi, tales como GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2, se proporcionan composiciones y métodos para inhibir las interacciones proteína-proteína y la polimerización de proteínas, que comprenden un péptido en forma de amida que tiene la fórmula Xi, X2, X3-NH2 o la fórmula X4, X5, Xi, X2, X3-NH2, en donde Xx, X2, X3í X y Xs/ son cualquier aminoácido y en donde cualquiera de uno o dos aminoácidos puede estar ausente. Las modalidades deseables tienen un residuo glicina como X3. En algunas modalidades, se proporcionan los agentes péptido en forma monomérica; en otras, los agentes péptido se proporcionan en forma multimérica o en forma multimerizada. Los agentes péptido de soporte combinado se utilizan también en varias modalidades. Las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes péptido se administran como terapéuticos o profilácticos o ambos para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden agentes péptido se administran en combinación con otros tratamientos convencionales para la enfermedad particular. El agente péptido se selecciona y se diseña primeramente mediante un procedimiento racional. Esto es, el agente péptido se selecciona y se diseña en base al entendimiento de que la secuencia del agente péptido se involucra en una interacción proteína-proteína que modula la polimerización de proteínas o la concentración de un complejo proteínico. Varias piezas de información pueden ayudar en este proceso de selección incluyendo, pero sin limitarse a, el ensayo mutacional, el ensayo de homología de proteína (e.g., el ensayo de otras secuencias que tienen dominios relacionados) , el diseño de proteína, y otros procedimientos en el diseño racional de drogas. Los agentes péptido pueden también, por supuesto, seleccionarse al azar. Los agentes péptido se fabrican entonces utilizando métodos sintéticos convencionales péptidos o químicos. Muchos agentes péptido se encuentran también comercialmente disponibles. Enseguida, se llevan a cabo los ensayo que evalúan la habilidad del agente péptido para unirse a la proteína de interés, interfieren con las interacciones proteína-proteína que permiten la polimerización de proteína y/o la concentración de un complejo supramolecular, y previenen la enfermedad. Los ensayo aquí descritos, que evalúan la habilidad de un agente péptido para unirse a una proteína de interés, modulan la polimerización de proteínas o la concentración del complejo proteínico, y previenen la enfermedad, se refieren colectivamente como "ensayo de caracterización del agente péptido" . Deberá entenderse que cualquier número, orden o modificación de los ensayo de caracterización del agente péptido aquí descrito puede emplearse para identificar un agente péptido que modula una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico. En lo siguiente, se proporcionan varias modalidades de equipo lógico y de máquina de la invención, así como métodos computacionales que pueden utilizarse para ayudar en la selección y el diseño de los agentes péptido de la invención. Modalidades de Equipo Lógico y de Máquina La secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia proteínica de un polipéptido de interés o sus fragmentos (e.g., una proteína involucrada en una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico) puede introducirse en un medio legible de computadora para su registro y manejo. Se apreciará por los expertos en la técnica que un medio legible de computadora que tiene la secuencia de ácido nucleico y la secuencia proteínica de una proteína de interés o sus fragmentos es útil para determinar las secuencias homologas, los dominios estructurales y funcionales, y la construcción de modelos proteínicos. La utilidad de un medio legible de computadora que tiene la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia proteínica de la proteína de interés o sus fragmentos incluye la habilidad para comparar la secuencia, utilizando programas de computadora conocidos en la técnica, a fin de llevar a cabo búsquedas de homología, averiguar dominios estructurales y funcionales y desarrollar modelos proteínicos con el fin de seleccionar los agentes péptido que modulan las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, y la concentración de complejos proteínicos . La secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia proteínica o sus fragmentos, de una proteína involucrada en una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico puede almacenarse, registrarse, y manejarse en cualquier medio que pueda leerse y accesarse mediante un ordenador. Como aquí se utilizan, las palabras "registrado" y "almacenado" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio legible de computadora. Un artesano experto puede adoptar fácilmente cualquiera de los métodos conocidos en el presente para registrar información en un medio legible de computadora para generar manufacturas que comprenden la información de la secuencia de nucleótido o polipéptido de esta modalidad. Para un artesano experto se encuentra disponible una variedad de estructuras de almacenaje de datos para crear un medio legible de computadora que tiene la secuencia de nucleótido o polipéptido registrada en el mismo. La elección de la estructura de almacenaje de datos se basa generalmente en el componente seleccionado para accesar la información almacenada. El medio legible de computadora incluye un medio magnéticamente legible, un medio ópticamente legible, o un medio electrónicamente legible. Por ejemplo, el medio legible de computadora puede ser un disco duro, un disquete, una cinta magnética, un disco cerrado, CD-ROM, DVD-ROM, RAM, o ROM así como otros tipos de medio conocidos por los expertos en la técnica. El medio legible de computadora en el cual se almacena la información de secuencia puede estar en una computadora personal, una red, un servidor u otros sistemas de computadora conocidos por los expertos en la técnica. Las modalidades de la invención incluyen sistemas, particularmente sistemas en base a computadora que utilizan la información de secuencia y el modelo proteínico aquí descritos, para el diseño y selección de los agentes péptido para la modulación de una interacción proteína-proteína, un evento de polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico. El término "sistema en base a computadora" se refiere a la máquina, equipo lógico, y cualquier base de datos utilizados para analizar un polipéptido o su secuencia para tal propósito. El sistema en base a computadora incluye de preferencia el medio de almacenaje arriba descrito, y un procesador para accesar y manejar los datos de secuencia. La máquina de los sistemas en base a computadora de esta modalidad comprende una unidad central de procesamiento (CPU) y datos de base de datos. Un artesano experto puede apreciar que cualquier sistema en base a computadora actualmente disponible es adecuado. En una modalidad particular, el sistema de computadora incluye un procesador conectado a un enlace común que está conectado a una memoria principal (de preferencia implementada como RAM) y una variedad de dispositivos secundarios de almacenaje, tales como una unidad de disco y un dispositivo de almacenaje de medio removible. El dispositivo de almacenaje de medio removible puede representar, por ejemplo, una unidad de disquete, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, etc. Un medio de almacenaje removible, tal como un disquete, un disco compacto, una cinta magnética, etc., que contiene un circuito lógico de control y/o datos registrados en el mismo (e.g., la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia proteínica o sus fragmentos, de una proteína involucrada en una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico) puede insertarse dentro del dispositivo de almacenaje removible. El sistema de computadora incluye el equipo lógico apropiado para leer el circuito lógico de control y/o los datos del dispositivo de almacenaje de medio removible una vez insertado en el dispositivo de almacenaje de medio removible. La secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia proteínica o sus fragmentos, de una proteína de interés puede almacenarse de una manera bien conocida en la memoria principal, en cualquiera de los dispositivos secundarios de almacenaje, y/o en un medio de almacenaje removible. El equipo lógico para accesar y procesar la secuencia de ácido 7 nucleico y/o la secuencia proteínica o sus fragmentos (tal como herramientas de búsqueda, herramientas de comparación, y herramientas de diseño etc.) reside en la memoria principal durante la ejecución. Como aquí se utiliza, "una base de datos" se refiere a la memoria que puede almacenar información de secuencia de nucleótido o polipéptido, información de modelo proteínico, e información de otros péptidos, químicos, peptidomiméticos, y otros agentes que modulan una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico. Adicionalmente, una "base de datos" se refiere a un componente de acceso a la memoria que puede accesar a manufacturas que se han registrado en la misma información de secuencia de nucleótido o polipéptido, en la información de modelo proteínico, y en la información obtenida a partir de los varios ensayo de caracterización del péptido aquí proporcionados. En algunas modalidades, una base de datos almacena la información antes descrita para numerosos agentes péptido y productos de modo que puede hacerse una comparación de los datos. Esto es, las bases de datos pueden almacenar esta información como un "perfil" para cada agente péptido probado y pueden compararse perfiles a partir de diferentes agentes péptido a fin de identificar las características funcionales y estructurales necesarias en un agente péptido derivado para producir una respuesta deseada. Entonces, estas moléculas derivadas pueden producirse mediante técnicas convencionales en la biología molecular y en la ingeniería proteínica y probarse en rondas posteriores de ensayo funcionales. Adicionalmente, los perfiles en los numerosos agentes péptido son útiles cuando se desarrollan estrategias que emplean múltiples agentes péptido. El uso de múltiples agentes péptido (e.g., en un fármaco para el tratamiento o prevención de enfermedades) pueden modular la asociación de la proteína de interés con otra proteína o concentración de proteínas más efectivamente que la administración de un agente péptido que modula las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la formación de un complejo proteínico en un sitio. Los datos de secuencia de una proteína de interés o de un agente péptido o ambos pueden almacenarse y manipularse en una variedad de programas de procesador de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, los datos de secuencia pueden almacenarse como texto en un archivo de procesamiento de palabras, tal como Microsoft WORD o WORDPERFECT, un archivo ASCII, un archivo html, o un archivo pdf, en una variedad de programas de base de datos familiar para los expertos en la técnica, tal como DB2, SYBASE, u ORACLE. Un "programa de búsqueda" se refiere a uno o más programas implementados en el sistema en base a computadora para comparar una secuencia de nucleótido o polipéptido de una proteína de interés con otras secuencias de nucleótido o polipéptido y los perfiles moleculares creados como se describió en lo anterior. Un programa de búsqueda se refiere también a uno o más programas que comparan uno o más modelos proteínicos con varios modelos proteínicos que existen en una base de datos y uno o más modelos proteínicos con varios agentes péptido, existentes en una base de datos. Un programa de búsqueda se utiliza, por ejemplo, para comparar las regiones de la secuencia proteínica de una proteína de interés o sus fragmentos que igualan secuencias en una base de datos que tiene las secuencias de los agentes péptido a fin de identificar las secuencias correspondientes u homologas . Un "programa de recuperación" se refiere a uno o más programas implementados en el sistema en base a computadora para identificar una secuencia homologa de ácido nucleico, una secuencia homologa de proteína, un modelo homólogo de proteína, o una secuencia homologa de agente péptido. Un programa de recuperación se utiliza también para identificar péptidos, peptidomiméticos y químicos que interactúan con una secuencia proteínica, o un modelo de proteína almacenado en una base de datos. Además un programa de recuperación se utiliza para identificar un perfil a partir de la base de datos que iguala una interacción proteína-proteína deseada en un complejo proteínico de interés . En lo que se trata a continuación, se describen varios métodos de modelado molecular, química combinatorial, y diseño racional de drogas para el diseño y selección de agentes péptido que interactúan con una proteína de interés que se cree que está involucrada en una interacción proteína-proteína, polimerización de proteínas o la concentración de un complejo proteínico. Métodos para el Diseño Racional de Drogas En algunas modalidades, se emplean programas de búsqueda para comparar las regiones de una proteína de interés con otras proteínas a fin de poder seleccionar y diseñar más eficientemente los agentes péptido que modulan las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico. En otras modalidades, los programas de búsqueda se emplean para comparar las regiones de una proteína de interés con los agentes péptido y los perfiles de agentes péptido de modo que pueden predecirse las interacciones del agente péptido con la proteína de interés (e.g., la modulación de interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, y la concentración de un complejo proteínico) . Este proceso se refiere como "diseño racional de drogas" . El diseño racional de drogas se ha utilizado para desarrollar los inhibidores de proteasa VIH y los agonistas para cinco diferentes subtipos de receptor de somatostatina . (Erickson et al., Science 249:527-533 (1990) y Berk et al., Science 282:737 (1998)). En un caso, por ejemplo, no se conoce la región de interacción proteína-proteína necesaria para la polimerización de proteínas o la concentración del complejo proteínico de una proteína de interés pero se conoce tal región para una proteína relacionada. Comenzando con la secuencia o un modelo proteínico de la proteína de interés o sus fragmentos, pueden identificarse rápidamente los polipéptidos relacionados u homólogos que tienen regiones conocidas de la interacción proteína-proteína necesaria para la polimerización de proteínas o la concentración de subunidades. Comparando las regiones conocidas de la interacción proteína-proteína en proteínas homologas recientemente encontradas con la proteína de interés, los dominios de la proteína de interés que se encuentran involucrados de manera similar en la interacción proteína-proteína pueden identificarse y los agentes péptido que corresponden a estas regiones pueden seleccionarse y diseñarse . De acuerdo a esto, mediante un procedimiento bidimensional, puede determinarse una identidad de secuencia porcentual mediante métodos estándar que se utilizan comúnmente para comparar la similaridad y la posición del aminoácido de dos polipéptidos. Utilizando un programa de computadora tal como BLAST o FASTA, se alinean dos polipéptidos para igualar de manera óptima sus respectivos aminoácidos (ya sea a lo largo de la longitud total de ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias) . Tales programas proporcionan una sanción de apertura por "omisión" y una sanción de espacio por "omisión", y puede utilizarse una matriz de puntaje tal como PAM 250 (una matriz de puntaje estándar: ver Dayhoff et al., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Supp. 3 (1978)) en conjunción con el programa de computadora. La identidad porcentual puede calcularse entonces como: número total de equivalencias idénticas X 100 [longitud de la secuencia más larga dentro del tramo igualado + número de espacios introducidos dentro de la secuencia más larga a fin de alinear las dos secuencias] La secuencia de proteína de la proteína de interés se compara con las secuencias conocidas sobre una base de proteína. La secuencia de proteína de la proteína de interés se compara, por ejemplo, con secuencias aminoácido conocidas encontradas en las bases públicas de datos de liberación Swissprot 35, liberación PIR 53 y liberación Genpet 108 utilizando BLASTP con el parámetro W=8 y permitiendo un máximo de 10 equivalencias. En adición, la secuencia de proteína que codifica a la proteína de interés se compara con secuencias aminoácido públicamente conocidas de Swissprot utilizando BLASTX con el parámetro E=0.001. Una vez que se identifica un grupo de polipéptidos relacionados, se revisa la literatura disponible sobre las secuencias de proteína relacionadas a fin de identificar una o más proteínas relacionadas, en las cuales las interacciones proteína-proteína que permiten la polimerización de proteínas y la concentración de complejos proteínicos se han determinado. Mientras se perciben las regiones de una proteína relacionada involucradas en una interacción proteína-proteína, polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico, estas secuencias se comparan con la proteína de interés para homología, teniendo en cuenta los reemplazos de aminoácido conservativos. De esta manera, pueden determinarse las regiones previamente desconocidas de una proteína de interés involucradas en las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, y la concentración del complejo proteínico y esta información puede utilizarse para seleccionar y diseñar los agentes péptido. Adicionalmente, cuando no se conocen las regiones de interacción proteína-proteína necesarias para la polimerización de proteínas y la concentración del complejo proteínico, pueden emplearse varias técnicas en ensayo mutacional para determinar los dominios de la proteína necesarios para la asociación de subunidad. Una técnica es la exploración de alanina (Wells, Methods in Enzymol, 202:390-411 (1991)). Mediante este procedimiento, cada residuo aminoácido en una proteína de interés se reemplaza por alanina, un mutante a la vez, y se calcula el efecto de cada mutación sobre la habilidad de la proteína para recibir una interacción proteína-proteína, un evento de polimerización de proteínas, o para participar en la concentración de un complejo proteínico. Cada uno de los residuos aminoácido de la proteína de interés se analiza de esta manera y se identifican las regiones que son necesarias para la asociación o polimerización de subunidad. También es posible aislar un anticuerpo objetivo-específico, seleccionado por su habilidad para modular una interacción proteína-proteína necesaria para la polimerización de proteínas o para la concentración del complejo proteínico, y desdoblar su estructura cristalina a fin de identificar una región de la proteína de interés dócil para la modulación mediante un agente péptido. Principalmente, este procedimiento produce un fármaco bajo el cual puede basarse el diseño subsecuente. Mediante este procedimiento, la cristalografía de proteína de la proteína de interés se deriva por completo generando anticuerpos anti-idio-típicos (anti-ids) en un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen de espejo de una imagen de espejo, se espera que el sitio de unión de los anti-ids sea un análogo de una región de la proteína de interés. El anti-id puede utilizarse entonces para diseñar y seleccionar los agentes péptido. Adicionalmente, puede utilizarse una estructura tridimensional de una proteína de interés para identificar las regiones de la proteína involucradas en una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico. En el pasado, las estructuras tridimensionales de proteínas se han determinado en un número de formas. Tal vez la mejor forma conocida para determinar una estructura de proteína implica el uso de la cristalografía de rayos-X. Una revisión general de esta técnica puede encontrarse en Van Holde, K.E. Physical Biochemistry, Prentice-Hall, N.J. pag. 221-239 (1971) . Al utilizar esta técnica, es posible dilucidar una estructura tridimensional con buena precisión. Adicionalmente, la estructura de proteína puede determinarse a través del uso de técnicas de difracción de neutrón, o mediante resonancia magnética nuclear (NMR). (Ver, e.g., Moore, W.J. Physical Chemistry, 4a edición, Prentice-Hall, N.J. (1972)). Alternativamente, los modelos de proteína pueden construirse utilizando técnicas de diseño de proteínas en base a computadora. Mediante un procedimiento, se resuelve el problema del plegado de proteína encontrando secuencias objetivo que son mayormente compatibles con los perfiles que representan los ambientes estructurales de los residuos en estructuras de proteína tridimensionales conocidas. (Ver, e.g., Eisenberg et al., Patente de los E.U. No. 5,436,850 expedida en Julio 25, 1995) . En otra técnica, las estructuras tridimensionales conocidas de proteínas en una familia dada se encuentran superimpuestas para definir las regiones estructuralmente conservadas en esa familia. Esta técnica de diseño de proteína utiliza también la estructura tridimensional conocida de una proteína homologa para aproximarse a la estructura de un polipéptido de interés. (Ver, e.g., Srinivasan et al., Patente de los E.U. 5,557,535 expedida en Septiembre 17, 1996) . Las técnicas de diseño de homología convencionales se han utilizado rutinariamente para la formación de modelos de proteasas y anticuerpos.

(Sowdhamini et al., Protein Engineering 10:207,215 (1997)).

Los procedimientos comparativos pueden utilizarse también para desarrollar modelos de proteína tridimensionales cuando la proteína de interés tiene una pobre identidad de secuencia para templar proteínas. En algunos casos las proteínas se pliegan en estructuras tridimensionales similares a pesar de tener identidades de secuencia muy débiles. Por ejemplo, las estructuras tridimensionales de un número de citocinas hélicas se pliegan en una topología tridimensional similar a pesar de la débil homología de secuencia. El desarrollo reciente de métodos de roscado y procedimientos "difusos" permite ahora la identificación de patrones probables de plegado y dominios funcionales de proteína en un número de situaciones en donde la relatividad estructural entre el objetivo y el (los) templado(s) no es detectable en el nivel de secuencia. Mediante un método, el reconocimiento de pliegue se lleva a cabo utilizando Roscado Múltiple de Secuencia (MST) y se deducen las equivalencias estructurales a partir de la salida del roscado utilizando el programa de distancia geométrica DRAGÓN que construye un modelo de baja resolución. Se construye entonces una representación de átomo completo utilizando un paquete de modelado molecular tal como QUANTA. De acuerdo con este procedimiento de 3 -etapas, los templados candidato se identifican primero utilizando el novedoso algoritmo de reconocimiento de pliegue MST, que es capaz de llevar a cabo el roscado simultáneo de múltiples secuencias alineadas en una o más estructuras 3-D. En una segunda etapa, las equivalencias estructurales obtenidas a partir de la salida MST se convierten en restricciones de distancia inter-residuales y se alimentan dentro del programa de distancia geométrica DRAGÓN, junto con la información auxiliar obtenida a partir de las predicciones secundarias de estructura. El programa combina las restricciones de una manera no-derivada y genera rápidamente un gran número de confirmaciones de modelo de baja resolución. En una tercera etapa, estas confirmaciones de modelo de baja resolución se convierten en modelos de átomo completo y se sujetan a minimización de energía utilizando el paquete de modelado molecular QUANTA . (Ver e.g., Aszódi et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics, Supplement 1:38-42 (1997) ) . En un procedimiento, una estructura tridimensional de una proteína o un complejo proteínico de interés se determina mediante cristalografía de rayos-X, ?MR, o difracción de neutrón y modelado por computadora, como se describió anteriormente. Los modelos útiles de la proteína o del complejo proteínico pueden lograrse también solo mediante el modelado por computadora. Las regiones de la(s) proteína (s) involucradas en interacciones proteína-proteína, polimerización de proteínas y la concentración del complejo proteínico se identifican y los agentes péptido que corresponden a estas regiones se seleccionan y se diseñan. Los agentes péptido candidato se fabrican entonces y se prueban en los ensayo de caracterización de agente péptido aquí descritos. Los archivos de los agentes péptido relacionados pueden sintetizarse y estas moléculas se filtran entonces en los ensayo de caracterización de agente péptido.

Los compuestos que producen las respuestas deseables se identifican, se registran en un medio legible de computadora, (e.g., se hace un perfil) y se repite el proceso para seleccionar los agentes péptido óptimos. Cada agente péptido recientemente identificado y su desempeño en el ensayo de caracterización de agente péptido se registra en un medio legible de computadora y se genera una base de datos o un archivo de perfiles sobre varios agentes péptido. Los investigadores utilizan estos perfiles para identificar importantes diferencias de propiedades entre moléculas activas e inactivas de modo que los archivos de agentes péptido (e.g., para el uso en estrategias que emplean múltiples agentes péptido) se enriquecen con las moléculas que tienen características favorables. Además, un modelo tridimensional de una proteína o de un complejo proteínico de interés puede almacenarse en una primera base de datos, un archivo de agentes péptido que corresponde a la proteína o complejo proteínico y sus perfiles puede almacenarse en una segunda base de datos, y puede utilizarse el programa de búsqueda para comparar el modelo de la primera base de datos con los agentes péptido de la segunda base de datos dados los parámetros definidos por los perfiles de los agentes péptido. Puede emplearse entonces un programa de recuperación para obtener un agente péptido o una pluralidad de agentes péptido que modulan de manera predecible una interacción proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración de un complejo proteínico. Subsecuentemente, los agentes péptido pueden filtrarse en los ensayo de caracterización de agente péptido. Esta técnica puede ser extremadamente útil para la rápida selección y diseño de los agentes péptido y puede utilizarse par elaborar protocolos de tratamiento para enfermedades humanas . Muchos programas de computadora y bases de datos pueden utilizarse con las modalidades de la invención para seleccionar y diseñar agentes péptido. La siguiente lista no pretende limitar la invención sino proporcionar una guía para los programas y bases de datos que son útiles con los procedimientos arriba tratados . Los programas y bases de datos que pueden ser útiles incluyen, pero sin limitarse a: MacPattern (EMBL) , DiscoveryBase (Molecular Applications Group) , GeneMine (Molecular Applications Group) , Look (Molecular Applications Group) , MacLook (Molecular Applications Group) , BLAST y BLAST2 (NCBI) , BLASTN y BLASTX (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403 (1990)), FASTA (Pearson and Lipman, Proc . Nati . Acad. Sci . EUA, 85:2444 (1988)), Catalyst (Molecular Simulations Inc.) Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Félix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), Modeller 4 (Sali and Blundell J". Mol . Biol . 234:217- 241 (1997)), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), la base de datos EMBL/Swissprotein, la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report, la base de datos Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos Derwents's World Drug Index, y la base de datos BioByteMasterFile. Muchos otros programas y bases de datos serán aparentes para el experto en la técnica dadas las técnicas en la presente. Una vez que se ha seleccionado y diseñado un péptido puede elaborarse mediante muchos procedimientos conocidos en la técnica. Además, muchas empresas comerciales se especializan en la fabricación de péptidos, peptidomiméticos y químicos hechos a pedido. Lo que se trata a continuación proporciona un procedimiento general para la fabricación de los péptidos menores modificados. Obtención de los Agentes Péptido Los procedimientos utilizados para obtener los péptidos menores aquí descritos se describen en esta sección. Varios de los tripéptidos utilizados para los experimentos aquí descritos se sintetizaron químicamente con un sintetizador de péptido automatizado (Syro, Multisyntech, Tubingen, Alemania) . La síntesis se llevó a cabo utilizando aminoácidos protegidos 9-fluorenilmetoxicarbonilo (fmoc) (Milligen, Bedford, MA) de acuerdo a protocolos estándar. Todos los péptidos se liofilizaron y después se disolvieron en la concentración apropiada en salina fosfato-amortiguada (PBS) . Los péptidos se analizaron mediante cromatografía líquida de fase de reversa de alto desempeño (RP-HPLC) utilizando una columna PepS-15 C18 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . En muchas modalidades, se utilizaron los péptidos que tienen un grupo de modulación unido a la terminación carboxi del péptido ("péptidos modificados"). En algunos casos, se crearon los péptidos modificados sustituyendo un grupo amino por el residuo hidroxilo normalmente presente en el grupo terminal carboxilo de un péptido. Esto es, que en lugar de un COOH terminal, los péptidos se sintetizaron para tener C0-NH . Por ejemplo, los péptidos menores preferidos incluyen amida glicil-lisil-glicina (GKG-NH ) , amida cistil-glutamil-glicina (CQG-NH2) , amida glicil-prolil-glicina (GPG-NH2) , amida arginil -glutamil -glicina (RQG-NH2) , amida lisil-glutamil-glicina (KQG-NH2). amida alanil-leucil-glicina /ALG-NH2) , amida glicil-valil-glicina (GVG-NH2) , amida valil-glicil-glicina (VGG-NH2) , amida alanil-seril-glicina (ASG-NH2) , amida seril-leucil-glicina (SLG-NH2) , y amida seril-prolil-treonina (SPT-NH2) . En adición a los sintetizados, se adquirieron muchos tripéptidos de Bachem AG, Suiza, incluyendo, pero sin limitarse a, GKG-NH2, CQG-NH2 y GPG-NH2. Existen muchas formas para sintetizar péptidos menores, y se proporciona la descripción anterior como una manera posible de obtener las modalidades de péptidos menores modificados aquí descritas. Varios procedimientos para formar peptidomiméticos que se asemejan a los péptidos menores aquí descritos se conocen en la técnica. Un vasto número de métodos, por ejemplo, pueden encontrarse en las Pats. de los E.U. Nos. 5,288,707; 5,552,534; 5,811,515; 5,817,626; 5,817,879; 5,821,231; y 5,874,529, incorporadas aquí como referencia en su totalidad. Después de haber seleccionado, diseñado y fabricado el agente péptido, éste se prueba en uno o más ensayo de caracterización de péptido para determinar la habilidad del agente péptido para modular una interacción proteína-proteína y/o la polimerización de proteínas y/o la concentración del complejo proteínico. Los ensayo de caracterización de péptido pueden, por ejemplo, evaluar la habilidad de un agente péptido para unirse a una proteína de interés, modular ... .....¿i?¿i£n: la polimerización de proteína o la concentración del complejo proteínico, y prevenir la enfermedad. El uso de los ensayo de caracterización de péptido para identificar agentes péptido para su incorporación dentro de las herramientas biotecnológicas y los farmacéuticos se describe abajo con referencia a los ejemplos y aplicaciones particulares. Estos ejemplos y aplicaciones no limitan el alcance de la invención a las modalidades particulares tratadas debido a que la tecnología aquí descrita puede emplearse para modular otras varias interacciones proteína-proteína, eventos de polimerización de proteína, y concentraciones del complejo proteínico. En lo siguiente, se proporciona una descripción para el uso de la tecnología PPI para inhibir la dimerización de un activador transcripcional NFKB . Inhibición de la dimerización de un activador transcripcional Los miembros de la familia rel/NFkB de los factores de transcripción juegan un papel vital en la regulación de rápidas respuestas celulares, tales como las requeridas para combatir la infección o reaccionar a la tensión celular. Los miembros de esta familia de proteínas forman homo y heterodímeros con afinidades diferentes para la dimerización. Estos comparten un motivo estructural conocido como la región reí de homología (RHR) , cuyo un tercio de la C-terminal media la dimerización de proteína. (Huang et al., Structure 5:1427-1436 (1997)). Las estructuras cristalinas de los miembros de la familia rel/NFkB p50 y p65 en su forma homodimérica de enlace DNA se han resuelto. Estas estructuras mostraron que los residuos de los dominios de dimerización de ambos p50 y p65 participan en la unión de DNA y que la proteína DNA y las superficies de dimerización de proteína forman una interfase superpuesta continua. (Huang et al., Structure 5:1427-1436 (1997)). Además, las estructuras cristalinas de los dominios de dimerización de la murina p50 y p65 en la resolución 2.2 A y 2.0 A se han resuelto y una comparación de estas dos estructuras revela que los cambios conservativos de aminoácido en tres posiciones son responsables de las diferencias en sus interfases dímero. Los aminoácidos en las posiciones que corresponden a 254, 267 y 307 de la murina p50, funcionan como determinantes principales para las diferencias observadas en la afinidad de dimerización. Huang et al., Structure 5:1427-1436 (1997)) . Los hallazgos anteriores pueden utilizarse para seleccionar y diseñar agentes péptido que modulan la dimerización de NFkB. La estructura cristalina de la murina p50 se utilizó para determinar que los residuos aminoácido 254, 267 y 307 de p50 están involucrados en la dimerización de NFkB. Los agentes péptido que corresponden a secuencias superpuestas que abarcan estos residuos aminoácido pueden diseñarse, elaborarse y filtrarse en los ensayo de caracterización de agente péptido. Adicionalmente, el modelo murina de p50 puede compararse con el modelo humano p50 para discernir la región de la proteína que corresponde a los residuos aminoácido 254, 267 y 307. Debido al alto grado de homología de las proteínas NFkB p50 de ratón y humanas, es probable que los residuos aminoácido 254, 267 y 307 o los aminoácidos cercanos a estos sitios sean necesarios para la dimerización del NFkB humano. Además, los agentes péptido pueden seleccionarse y diseñarse para otras regiones de p50 y p65 y los agentes péptido preferidos corresponden a las secuencias encontradas en el extremo C-terminal de la región reí de homología (RHR) , que media la dimerización de proteína. (Huang et al., Structure 5:1427-1436 (1997)). Una vez que los agentes péptido que corresponden a las regiones de p50 y p65 se seleccionan, se diseñan y se fabrican, se filtran en ensayo de caracterización de agente péptido. Inicialmente, se conducen los ensayo de unión. Mediante un procedimiento, el dímero p50, p65 o pl05 se coloca en una membrana de diálisis con una dilución de 10,000 mw (e.g., un Slide-A-lyzer, Pierce). Alternativamente, la proteína de interés se inmoviliza sobre un soporte (e.g., una resina de cromatografía de afinidad o un depósito de una placa de micro valoración) . Los agentes péptido etiquetados se agregan en un amortiguador adecuado y se permite que tenga lugar la reacción de unión durante la noche a 4°C. Los agentes péptido pueden radio-etiquetarse con 125I o 14C, de acuerdo a las técnicas estándar o pueden etiquetarse con otras señales detectables. Después de que la reacción de unión tuvo lugar, el agente péptido que contiene amortiguador se remueve, y el soporte de enlace de proteína se lava en un amortiguador sin agentes péptido radioactivos o la membrana de diálisis que tiene la proteína de interés se dializa durante dos horas a 4°C en un amortiguador que carece de agentes péptido radioactivos. Subsecuentemente, la radiactividad ligada a la proteína sobre el soporte o la radiactividad presente en la proteína dializada se calcula por centelleo. Los agentes péptido que se unen a p50, p65 o pl05 pueden identificarse rápidamente de esta manera. Las modificaciones de estos ensayo de unión que pueden emplearse, como será aparente a los expertos en la técnica, en ensayo de unión particulares, tal como se describió en lo anterior son fácilmente adaptables al ensayo de alto rendimiento, por ejemplo, uniendo la proteína de interés a una placa de micro valoración y filtrando para la unión de agentes péptido etiquetados de manera fluorescente. Después de determinar la unión de uno o más agentes péptido, se emplea un ensayo que evalúa la habilidad del agente péptido para modular la dimerización del NFkB. Tal ensayo es un ensayo de desplazamiento de gel. (Ver e.g., Haskill et al., Patente de los E.U. No. 5,846,714). Los dímeros NFkB se unen a un amplificador regulador de DNA específico que tiene la secuencia TGGGGATTCCCCA (SEC. ID. NO. 1) y los oligonucleótidos etiquetados de manera radioactiva (e.g., 32P) que tienen esta secuencia pueden utilizarse para desdoblar complejos de NFkB y el oligonucleótido en un gel de poliacrilamida no desnaturalizado de bajo porcentaje. De acuerdo a esto, el ensayo de desplazamiento de gel que evalúa la habilidad de un agente péptido para inhibir la dimerización del NFkB se completa como sigue. Los oligonucleótidos que tienen la secuencia de amplificador de NFkB se etiquetan radioactivamente mediante procedimientos convencionales. Estos oligonucleótidos se incuban en presencia de concentraciones variables de los agentes péptido candidatos y un extracto nuclear que tiene un NFkB a 23 °C durante 15 minutos. Las condiciones típicas de unión pueden incluir 10 µg de extracto nuclear, 10,000 cpm de prueba de oligonucleótidos, lOmM de Tris, un pH de 7.7, 50 mM de NaCl , 0.5 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 2 ug de poli dl-dC y 10% de glicerol en un volumen final de 20 µl . El NFkB que contiene extractos nucleares puede obtenerse a partir de varios tipos de célula pero se obtiene de preferencia a partir de células T Jurkat mitógenas y forbales inducidas con éster. Después de la unión, los compuestos se desdoblan sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizado al 5% formado en amortiguador Tris/glicina/EDTA como lo describe Baldwin, DNA & Protein Eng. Tech . 2:73-76. La electroforesis se conduce durante 2 horas a 20 mA, después el gel se autoradiografía durante la noche a -70 °C. Debido a que el complejo del dímero de NFkB unido al oligonucleótido etiquetado puede desdoblarse a partir de cualquier monómero (p50 p p65) que permanece asociado con el complejo después de la electroforesis, la habilidad del agente péptido para inhibir la dimerización del NFkB puede determinarse rápidamente. De preferencia, la concentración de los diferentes agentes péptido se valora sobre el curso de varios experimentos para encontrar una cantidad que inhibe satisfactoriamente la formación de dímeros de NFkB. Adicionalmente, la habilidad de los agentes péptido candidatos para inhibir la activación transcripcional del NFkB en las células puede determinarse tratando las células que se han transfectado con una estructura informadora de NFkB, con una concentración variable de los agentes péptido. Una estructura informadora de NFkB puede comprender, por ejemplo, tres o más secuencias amplificadoras (e.g., TGGGGATTCCCCA (SEC. ID. NO. 1) unidas a un promotor mínimo y a una molécula informadora (e.g., luciferasa, transferasa de acetil cloranfenicol, o proteína verde fluorescente). Tal estructura informadora puede hacerse utilizando técnicas en biología molecular. De preferencia, la estructura informadora se transfecta dentro de una línea celular que puede producir una copiosa cantidad de NFkB bajo estimulación con un éster forbal, tal como las células Jurkat. Los agentes péptido candidatos pueden filtrarse transfectando la estructura informadora en células que se han cultivado en presencia de concentraciones variables de los agentes péptido. Comparando los niveles de la señal informadora detectada en células de control no tratadas con las células tratadas con el agente péptido, puede determinarse la habilidad del agente péptido para inhibir la activación transcripcional mediada del NFkB. De preferencia, los agentes péptido que comprenden aminoácidos en las posiciones correspondientes a 254, 267 y 307 de la murina p50 y otros aminoácidos de la porción C-terminal de la región reí de homología se seleccionan, se diseñan, se fabrican y se analizan utilizando las técnicas arriba descritas. De esta manera, los agentes péptido que inhiben la activación de NFkB pueden identificarse para su incorporación en un fármaco para el tratamiento y/o prevención de enfermedades relacionadas con el NFkB. En lo siguiente, se proporciona una descripción del uso de la tecnología PPI para inhibir la asociación del NFkB con el represor IkB. Inhibición de un complejo represor transcripcional La inhibición de un complejo represor transcripcional puede completarse también utilizando la tecnología PPI . Por ejemplo, los agentes péptido correspondientes a las secuencias de NFkB involucradas en interacciones proteína-proteína que estabilizan al complejo NFkB/IkB pueden seleccionarse, diseñarse, elaborarse y filtrarse en ensayo de caracterización de péptido para identificar agentes péptido que modulan de manera eficiente la concentración del complejo NFkB/lkB. De acuerdo a esto, los agentes péptido se seleccionan y se diseñan para corresponder a secuencias que han demostrado estar involucradas en la estabilización del complejo NFkB/lkB. El dominio que contiene repetición de anquirina y la secuencia carboxilo-terminal de extensión acídica/PEST son regiones de IkB que se encontraron involucradas al heterodímero de NFkB de 105 kDa. (Latimer et al., Mol . Cell Biol . 18:2640 (1998) y Malek et al., J. Biol . Chem. 273:25427 (1998)). Adicionalmente, la secuencia nuclear de localización, el dominio de dimerización y el dominio de unión de DNA amino-terminal del NFkB interactúan con el IkB a fin de estabilizar el complejo NFkB/lkB. (Malek et al., J. Biol . Chem. 273:25427 (1998)). Los agentes péptido que corresponden a estas regiones se seleccionan, se diseñan y se fabrican. Enseguida, los agentes péptido candidato se filtran en ensayo de caracterización de péptido que evalúan su habilidad para unirse a NFkB o IkB, inhiben la formación del complejo NFkB/lkB, e inhiben la represión transcripcional IkB-mediada. Para evaluar la habilidad de un agente péptido para unirse ya sea a NFkB o a IkB, se lleva a cabo un ensayo de unión in vi tro. Como se describió anteriormente, existen varios tipos de ensayo de unión in vi tro que son conocidos en la técnica y los procedimientos deseables implican la unión de agentes péptido radio-etiquetados para las proteínas NFkB o IkB dispuestas en un soporte o en una membrana de diálisis. Mediante un procedimiento, las proteínas NFkB o IkB se encuentran dispuestas en una membrana de diálisis que tiene una dilución de 10,000 mw (e.g., una Slide-A-Lyzer, Pierce) o la proteína de interés se inmoviliza en un soporte (e.g., una resina de cromatografía de afinidad o un depósito de una placa de micro valoración) . Después, los agentes péptido radiactivamente etiquetados se agregan en un amortiguador adecuado y se permite que tenga lugar la reacción de unión durante la noche a 4°C. Los agentes péptido pueden radio-etiquetarse con 125I o 14C, de acuerdo a las técnicas estándar o pueden etiquetarse con otras señales detectables. Después de que la reacción de unión tuvo lugar, el agente péptido que contiene amortiguador se remueve, y el soporte de enlace de proteína se lava en un amortiguador sin agentes péptido radioactivos o la membrana de diálisis que tiene la proteína de interés se dializa durante dos horas a 4°C en un amortiguador que carece de agentes péptido radioactivos. Subsecuentemente, la radiactividad ligada a la proteína sobre el soporte o la radiactividad presente en la proteína dializada se calcula por centelleo. Los agentes péptido que se unen a NFkB o a IkB pueden identificarse rápidamente de esta manera. Las modificaciones de estos ensayo de unión que pueden emplearse, como será aparente a los expertos en la técnica, en ensayo de unión particulares, tal como se describió en lo anterior son fácilmente adaptables al ensayo de alto rendimiento, por ejemplo, uniendo la proteína de interés a una placa de micro valoración y filtrando para la unión de agentes péptido etiquetados de manera fluorescente. Después de determinar la unión de uno o más agentes péptido, se emplea un ensayo que evalúa la habilidad del agente péptido para inhibir la formación del complejo NFkB/lkB. Tal ensayo es un ensayo de desplazamiento de gel. (Ver e.g., Haskill et al., Patente de los E.U. No. 5,846,714) . Los dímeros NFkB se unen a un amplificador regulador de DNA específico que tiene la secuencia TGGGGATTCCCCA y los oligonucleótidos etiquetados de manera radioactiva (e.g., 32P) que tienen esta secuencia pueden utilizarse para desdoblar complejos de NFkB y el oligonucleótido en un gel de poliacrilamida no desnaturalizado de bajo porcentaje. ^,?Í«?t-!,»-!?, De acuerdo a esto, el ensayo de desplazamiento de gel que evalúa la habilidad de un agente péptido para inhibir la concentración del complejo NFkB/lkB se completa como sigue. Los oligonucleótidos que tienen la secuencia de amplificador de NFkB se etiquetan radioactivamente mediante procedimientos convencionales. Estos oligonucleótidos se incuban en presencia de concentraciones variables de los agentes péptido candidatos y un extracto nuclear que tiene un NFkB y un IkB a 23 °C durante 15 minutos. Las condiciones típicas de unión pueden incluir 10 ug de extracto nuclear, 10,000 cpm de sonda oligonucleótida, lOmM de Tris, un pH de 7.7, 50 mM de NaCl , 0.5 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 2 ug de poli dl-dC y 10% de glicerol en un volumen final de 20 µl . El NFkB e IkB que contienen extractos nucleares pueden obtenerse a partir de varios tipos de célula pero se obtiene de preferencia a partir de células T Jurkat mitógenas y forbales inducidas con éster. Después de la unión, los complejos se desdoblan sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizado al 5% formado en amortiguador Tris/glicina/EDTA como lo describe Baldwin, NA & Protein Eng. Tech . 2:73-76 (1990). La electroforesis se conduce durante 2 horas a 20 mA, después el gel se autoradiografía durante la noche a -70 °C. Debido a que el complejo del dímero de ?FkB unido al oligonucleótido etiquetado puede desdoblarse sobre el gel después de la electroforesis y los complejos ?FkB/IkB son incapaces de unirse al amplificador, la habilidad del agente péptido para romper o prevenir la formación de los complejos NFkB/lkB puede determinarse rápidamente. De preferencia, la concentración de los diferentes agentes péptido se valora sobre el curso de varios experimentos para encontrar una cantidad que inhibe satisfactoriamente el ensamblaje del NFkB/lkb. Los agentes péptido que corresponden a las regiones de NFkB o IkB que previenen la asociación del complejo NFkB/lkB se detectarán como un producto gel-retardado que comprende el oligonucleótido radio-etiquetado unido al NFkB, mientras que los agentes péptido que fallan al romper el complejo NFkB/lkB no se desdoblarán mediante el ensayo de retraso de gel . Adicionalmente, la habilidad de los agentes péptido candidatos para inhibir la represión transcripcional IkB-mediada en las células puede determinarse tratando las células que se han transfectado con una estructura informadora de NFkB, con una concentración variable de los agentes péptido. Una estructura informadora de NFkB puede comprender, por ejemplo, tres o más secuencias amplificadoras (e.g., TGGGGATTCCCCA) unidas a un promotor mínimo y a una molécula informadora (e.g., luciferasa, transferasa de acetil cloranfenicol, o proteína verde fluorescente). Tal estructura informadora puede hacerse utilizando técnicas convencionales en biología molecular. De preferencia, la estructura informadora se transfecta dentro de una línea celular que tiene IkB y puede producir una copiosa cantidad de NFkB bajo estimulación con un mitógeno y un éster forbal , tal como las células Jurkat. Los agentes péptido candidatos pueden filtrarse transfectando la estructura informadora en células que se han cultivado en presencia de concentraciones variables de los agentes péptido. Comparando los niveles de la señal informadora detectada en células de control no tratadas con las células tratadas con el agente péptido, puede determinarse la habilidad de un agente péptido particular para inhibir la represión transcripcional IkB-mediada. Los agentes péptido que corresponden a las regiones de NFkB o de IkB que previenen la asociación del complejo NFkB/lkB exhibirán un incremento en la transcripción en este ensayo, mientras que los agentes péptido que fallan al romper el complejo NFkB/lkB tendrán si acaso poca transcripción. De esta manera, los agentes péptido que interrumpen al complejo NFkB/lkB pueden identificarse para su incorporación en un fármaco para el tratamiento y/o prevención de enfermedades relacionadas con el NFkB. En la siguiente descripción, el inventor trata la fabricación, identificación y uso de péptidos menores modificados para la inhibición de la polimerización de proteínas de toxina bacterial , que es necesaria para la concentración de holotoxinas bacteriales.

La inhibición de toxicidad de toxinas bacteriales Varias toxinas bacteriales tienen estructuras supramoleculares compuestas de proteínas polimerizadas. Por ejemplo, Bordetella Pertussis tiene una exotoxina de 105 kDa, llamada toxina de la tos ferina, que ocasiona la tos ferina, una enfermedad respiratoria altamente contagiosa en infantes y niños jóvenes. La toxina de la tos ferina consiste de 5 subunidades polipéptido (SI a S5) dispuestas en una estructura A-B típica de varias toxinas bacteriales. (Ver, Read et al., Patente de los E.U. No. 5,856,122). Las subunidades S2, S3 , S4 (dos copias) y S5 forman un pentámero (el oligómero B) que cuando se combina con la subunidad SI forma la holotoxina. La SI es una enzima con transferasa ADP-ribosil y actividades NAD-glicohidrolasa. La actividad de SI es la causa principal de la toxicidad de la toxina de la tos ferina (PT) . El oligómero B media la unión de la holotoxina a las células objetivo y facilita la entrada del protómero A. La función de esta estructura base es unirse a los receptores de la célula base y permitir que la subunidad SI penetre la membrana citoplásmica. (Armstrong y Peppler, Infection & Immun. 55:1294 (1987)) . La toxina de la tos ferina se ha destoxificado mediante la modificación de sus propiedades celulares de unión, por ejemplo, por supresión de Asn-105 en la subunidad S2 y de Lys- 105 en la subunidad S3, y mediante cualquier sustitución del residuo Tyr-82 en S3. (Lobet et al., J. Exp . Med. 177 : 79-87 • (1993) y Loosmore et al., Infect . Immun . 61:2316-2324 (1993)). La estructura tridimensional de la toxina de la tos ferina, así como de muchas otras toxinas bacteriales, comparte semejanza funcional y/o estructural a la PT, incluyendo la toxina de la difteria, la toxina del cólera, la exotoxina A de Pseudomonas, la toxina lábil al calor de E. coli , y la verotoxina-1. (Read et al., Patente de los E.U. No. 5,856,122, Choe et al., Nature 357:216-222 (1992). Allured et al., Proc . Nati . Acad . Sci . EUA 83:1320-1324 (1986), Brandhuber et al., Proteins 3:146-154 (1988), Sixma et al., J. Mol . Biol . 230:8990-9180 (1993), Sixma et al., Biochemistry 32:191-198 (1993), y Stein et al., Nature 355:748-750 (1992)). Esta información tridimensional y la secuencia aminoácido que codifica a los polipéptidos de estas toxinas bacteriales pueden utilizarse para diseñar y elaborar agentes péptido que inhiben la polimerización de la subunidad de la toxina bacterial y, de este modo, la formación de las holotoxinas de la toxina bacterial . Mediante un procedimiento, el modelo tridimensional de la toxina de la tos ferina se utiliza para seleccionar las regiones de interacción proteína-proteína que son susceptibles a la inhibición de péptidos menores. Una región tal involucra la interacción entre el C-terminal de SI (228 a 235) y el poro B-oligómero que cuenta para el 28% de la superficie subterránea entre SI y el B-oligómero. De este modo, una modalidad abarca los agentes péptido que tienen una secuencia que corresponde a las regiones de SI que interactúan con el B-oligómero (e.g., los péptidos menores que corresponden a secuencias superpuestas de SI (228-235) . De manera similar, las regiones de S2 , S3 , S4 y S5 que componen el 28% de la superficie subterránea entre SI y el B-oligómero se utilizan para seleccionar y diseñar agentes péptido que inhiben la formación de la holotoxina. Debido a que la dimerización de PT es de importancia funcional en la unión a las células objetivo, la interrupción de este proceso de dimerización utilizando agentes péptido que corresponden a las regiones de interacciones proteína-proteína necesarias para la polimerización de proteínas puede proporcionar un método para inactivar la holotoxina. Varios residuos en S2 contienen determinantes aminoácidos únicos que promueven la dimerización. (Read et al., Patente de los E.U. No. 5,856,122). Los residuos de S2 Glu-66, Asp-81, Leu-82, y Lys-83, que no se conservan en S3, se predicen responsables por la dimerización de PT. Además, los residuos aminoácido 82 y 83 son también importantes en la unión glicoconjugada. Se piensa que otras regiones de las subunidades S2 y S4 , tales como Trp-52 de S2 y los residuos Asp-1, Tyr-4, Thr-88 y Pro-93 de S4 están involucradas en las interacciones proteína-proteína que median la polimerización de las subunidades S2 y S4. Los agentes péptido que corresponden a las regiones de las subunidades de toxina involucradas en la concentración de la holotoxina se seleccionan, se diseñan, y se fabrican. De manera similar puede completarse la selección, diseño y fabricación de los agentes péptidos que inhiben la polimerización de otras holoenzimas de toxina bacterial, tales como la toxina de la difteria, la exotoxina A de Pseudomonas, la toxina lábil al calor de E. coli , y la verotoxina-1. Enseguida, los agentes péptido candidatos se filtran en ensayo de caracterización de péptido que evalúan su habilidad para unirse a proteínas de subunidad de toxina, inhibir la formación de la holotoxina, e inhibir los efectos tóxicos de la holotoxina. Para evaluar la habilidad de un agente péptido para unirse a la holotoxina PT o a las proteínas individuales que componen la holotoxina, se lleva a cabo un ensayo in vi tro . Como se describió anteriormente, existen varios tipos de ensayo de unión in vitro que son conocidos en la técnica y un procedimiento preferida involucra la unión de agentes péptido radio-etiquetados para las proteínas PT o la holotoxina dispuesta en una membrana de diálisis. Mediante un procedimiento, las proteínas PT o la holotoxina se disponen en una membrana de diálisis que tiene una dilución de 10,000 mw (e.g., un Slide-A-lyzer, Pierce).

Entonces, los agentes péptido etiquetados se agregan en un amortiguador adecuado y se permite que tenga lugar la reacción de unión durante la noche a 4°C. Los agentes péptido pueden radio-etiquetarse con 125I o 14C, de acuerdo a las técnicas estándar o pueden etiquetarse con otras señales detectables. Después de que la reacción de unión tuvo lugar, el agente péptido que contiene amortiguador se remueve, y la membrana de diálisis que tiene la proteína de interés se dializa durante dos horas a 4°C en un amortiguador que carece de agentes péptido radioactivos. Subsecuentemente, la radiactividad presente en la proteína dializada se calcula por centelleo. Los agentes péptido que se unen a las proteínas PT u holotoxina pueden identificarse rápidamente de esta manera. Las modificaciones de estos ensayo de unión que pueden emplearse, como será aparente a los expertos en la técnica, en ensayo de unión particulares, tal como se describió en lo anterior son fácilmente adaptables al ensayo de alto rendimiento, por ejemplo, uniendo la proteína PT u holotoxina a una placa de micro valoración y filtrando para la unión de agentes péptido etiquetados de manera fluorescente . Después de identificar los agentes péptido que se unen a las proteínas PT u holotoxinas, se llevan a cabo ensayo que evalúan la habilidad de los agentes péptido para romper la holotoxina. Varios de tales ensayo son conocidos en la técnica. Head et al., proporciona un procedimiento que puede adaptarse fácilmente para determinar la habilidad de los agentes péptido para romper la holotoxina PT en subunidades PT. (Head et al., J. Biol . Chem. 266:3617 (1991) ) . De acuerdo a esto, en algunos experimentos, la PT purificada (obtenible de List Biological Laboratories, Inc.) se incuba con los agentes péptido durante 2 horas a 4°C. En otros experimentos, la PT purificada se disocia primero en un amortiguador de disociación y entonces se regresa a un amortiguador fisiológico en presencia de un agente péptido, después de lo cual se permite que ocurra la unión durante 2 horas a 4°C. Para llevar a la holotoxina a condiciones de disociación, se agrega por goteo un amortiguador de disociación (6 M de urea, C.l M de NaCl, 0.1 M de ácido propiónico, pH 4) , y la toxina se incuba sin agitación a 4°C durante 1 hora. (Ito et al., Microb. Pathog. 5, 189-195 (1988) ) . Si la disociación se lleva a cabo en un volumen pequeño (e.g., 25 µl) y las unidades disociadas se resuspenden en un gran volumen de amortiguador fisiológico que contiene una concentración deseada de agentes péptido (e.g., 975 µl) , las condiciones que promueven la formación de holotoxina y la unión del agente péptido pueden restaurarse rápidamente. Un amortiguador fisiológico adecuado es 50 mM de salina Tris-amortiguada (TBS), pH 7.4. Después de la reacción de unión, la holotoxina se resuelve de complejos disociados mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) . Las reacciones de unión que contienen aproximadamente 1 mg de subunidades u holotoxina (en 1 ml) se inyectan en una columna de filtración de gel TSK-G2000SW HPLC previamente equilibrada con 50 mM de salina Tris-amortiguada (TBS), pH 7.4, proporción de flujo de 1.0 ml/min. Los picos se calculan entonces por absorbencia a ? = 280 mn, y las fracciones se colectan. La PT purificada migrará como un solo pico con un tiempo de retención de aproximadamente 12-15 min. Las subunidades disociadas presentarán un perfil que tiene dos picos, que representan la subunidad A y las subunidades B. Los agentes péptido que rompen la holotoxina PT o que previenen la concentración de la holotoxina se identificarán por la apariencia de dos picos en el ensayo arriba descrito. De preferencia, la concentración de los diferentes agentes péptido se valora sobre el curso de varios experimentos para encontrar una cantidad que rompa o prevenga satisfactoriamente la concentración de la holotoxina PT. Una vez que se han identificado los agentes péptido que rompen o previenen la concentración de la holotoxina PT, se evalúa la habilidad de tales moléculas para inhibir los efectos tóxicos de PT en un sistema de base celular o de base animal. Un ensayo de base celular analiza los efectos de PT en células de ovario de hámster Chino (CHO) en cultivo. El ensayo celular de CHO se lleva a cabo esencialmente como se describe en Hewlett et al. (Hewlett et al., Infect . Immun . 40:1198 (1983)). Las células CHO se cultivan y se mantienen en un medio Ham F-12 (GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.) que contiene 10% de suero fetal de ternera y concentraciones variables de los agentes péptido en una atmósfera de 5% de C02. Las diluciones seriales de doble pliegue de PT se preparan en un medio Ham F-12. Se agrega la toxina en un volumen de 10 µl a las células CHO, 20 horas después de colocarlas en los depósitos de micro valoración. Después de 24 horas de incubación adicional, las células CHO se observan para el patrón de características de crecimiento asociado con el envenenamiento por toxinas. Esto es, células planas redondeadas que crecen en grupos estrechos. En contraste, las células tratadas con agente péptido (como células de control, a las que no se administra toxina) exhibirán una mono-capa de células alargadas. Mediante otro procedimiento, se lleva a cabo un estudio de base animal para evaluar la habilidad de los agentes péptido para interferir con la toxicidad de PT. Un reto de base animal para identificar la eficacia de los péptidos menores que corresponden a la secuencia de las subunidades de la toxina de la tos ferina puede emplearse como sigue. Se inyectan ratones tacónicos (15 a 17g) en el día cero con 0.5 ml de un péptido menor modificado intraperitonealmente en tres dosis a fin de llevar la concentración del péptido menor a la sangre a 100µM-300µM. Cada dosis se inyecta a 10 ratones. En el día 2, se reta a los ratones con una inyección intracerebral de una dosis estándar de B . pertussis . Los ratones de control se inyectan también al mismo tiempo para averiguar la efectividad del reto. Tres días después del reto, el número de muertes animales se registra cada día hasta un día 28 adicional. En el día 28, los ratones paralizados y los ratones con edema cerebral se registran también como muertes. Los resultados se registran como LD50, que es la dosis con la cual murieron la mitad de los ratones. El resultado de este experimento mostrará que el LD50 de los ratones tratados con péptido menor es mayor que el de los ratones no tratados, y, de este modo, el tratamiento con péptidos menores modificados fue protector contra la enfermedad. Los agentes péptido identificados de esta manera pueden incorporarse en los fármacos para el tratamiento y prevención de los efectos tóxicos de PT. Además, utilizando los procedimientos arriba detallados, los agentes péptido que rompen o previenen la concentración de otras toxinas bacteriales, tales como la toxina de la difteria, la exotoxina A Pseudomonas, la toxina lábil al calor de E. coli , la toxina del cólera, y la verotoxina-1 y 2 pueden seleccionarse, diseñarse, elaborarse y filtrarse de acuerdo con los ensayo de caracterización de péptido.

En otras modalidades, descritas a continuación, se fabrican, identifican y utilizan péptidos menores modificados para inhibir la polimerización de proteínas (e.g., el péptido actina y ß-amiloide) involucradas en la formación de estructuras supramoleculares asociadas con la irrupción de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad prion. La inhibición de la polimerización del péptido actina y ß-amiloide Los agentes péptido pueden utilizarse también para inhibir o prevenir la polimerización de proteínas involucradas en la irrupción de enfermedades asociadas con la concentración aberrante de proteínas fibrosas, tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad prion. Como la AD, las enfermedades prion humanas, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y la enfermedad de Gertsmann-Straussler-Scheinker, se caracterizan por la lenta irrupción de la neurodegeneración. La patología cerebral en estas enfermedades se asemeja a la de AD y se caracteriza también por la agregación de una proteína cerebral normal, la proteína prion (PrP) (en lugar de el péptido ß-amiloide asociado con AD) . (Baker y Ridley, Neurodegeneration, 1:3-16 (1992), (Prusiner, N. Engl . J. Med. 310:661-663 (1984), y (Prusiner, Science 252 : 1515-1522 (1991)). Se cree que el agente infeccioso del scrapie opera acelerando la etapa en la formación amiloide que es determinante en una proporción normal. (Griffith, Nature 215:1043-1044 (1967) y (Prusiner, Science 252:1515-1522 (1991) ) . Muchos creen que esta etapa - la formación de un núcleo ordenado, que es la característica que define una polimerización nucleación-dependiente - es mecánicamente relevante a la formación amiloide en la enfermedad prion humana y en AD. (Jarret y Lansbry, Cell , 73:1055-1058 (1993) ) . De este modo, el rompimiento de la semilla de la formación amiloide puede ser un acercamiento para tratar o prevenir la transmisión de scrapie y el inicio de la AD. La polimerización de proteína nucleación-dependiente describe muchos procesos bien caracterizados, incluyendo la cristalización de proteínas, la concentración de microtúbulos, la concentración de flagelos, la formación fibril de la célula-sickle de hemoglobina, la concentración de procápside de bacteriófago, y la polimerización de actina. Mediante una interpretación, la formación del núcleo requiere una serie de etapas de asociación termodinámicamente desfavorables (Kn<<l) debido a que las interacciones intramoleculares resultantes no compensan el costo entrópico de asociación. (Chothia y Janin, Nature 256:705 (1975)). Una vez que el núcleo se ha formado, la adición posterior de monómeros se vuelve termodinamicamente favorable (Kg>>l) debido a que los monómeros hacen contacto con el polímero en crecimiento en sitios múltiples, resultando en una rápida polimerización/crecimiento. Esto es, la nucleación determina la proporción a niveles de baja saturación. En consecuencia, la agregación de una semilla o núcleo desarrollado a una solución supersaturada cinéticamente soluble resulta en la polimerización inmediata. Sin embargo, al determinar las regiones de la semilla necesarias para las interacciones proteína-proteína que permiten la polimerización, los agentes péptido pueden seleccionarse y diseñarse para estas regiones e identificarse de acuerdo a su habilidad para inhibir o prevenir la "siembra" de la polimerización. Tales agentes péptido pueden incorporarse en fármacos y pueden administrarse para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas como la AD y la enfermedad prion. Se ha reportado que el uso de péptidos ß-amiloide que tienen 6-60 residuos aminoácido unidos al grupo de modulación tal como biotina y otros compuestos cíclicos y heterocíclicos y otros compuestos que tienen un "volumen" estérico similar inhibe la agregación de péptidos ß-amiloide naturales. (Patente de los E.U. No. 5,817,626). Patológicamente, la enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por la presencia de lesiones distintivas en el cerebro de la víctima. Estas lesiones cerebrales incluyen filamentos intracelulares anormales llamados madejas neurofibrilares (NFTs) y depósitos extracelulares de proteínas amiloidógenas en placas seniles o amiloides. El constituyente mayor de la proteína de las placas amiloide se ha identificado como un péptido de 4 kilodaltons (40-42 aminoácidos) llamado péptido ß-amiloide. (Glenner et al., Biochem . Biophys . Res . Commun . 120:885-890 (1984) y Masters et al., Proc . Nati . Acad . Sci . EUA 82:4245-4249 (1985)). Se observan frecuentemente depósitos difusos del péptido ß-amiloide en cerebros adultos normales, mientras que el tejido cerebral en AD se caracteriza por placas ß-amiloide más compactas de núcleo denso. (Ver, e.g., Davies et al., Neurology 38:1688-1693 (1988)). La neurotoxicidad del péptido ß-amiloide depende de su habilidad para "sembrar" agregados o polímeros que se acumulan en las membranas de plasma y rompen la homeostasis celular de calcio. El influjo de calcio a través de los receptores glutamato y los canales dependientes del voltaje media una disposición de la función y las respuestas estructurales en las neuronas. El influjo irrestricto de calcio, sin embargo, puede dañar y matar células neuronales. La agregación o polimerización de los péptidos ß-amiloide puede ocasionar un drástico influjo de calcio, lo cual daña o mata a las células nerviosas. Los microfilamentos de actina son un principal elemento citoesqueletal cuyo estado de polimerización es altamente sensitivo al calcio. Los compuestos de citocalasina ocasionan la despolimerización de actina, reducen el influjo de calcio inducido por el glutamato y la despolarización de la membrana, y anulan el influjo de calcio mediado por la polimerización de ß-amiloide en las membranas de plasma. (Mattson, Patente de los E.U. No. 5,830,910). De este modo, los medicamentos de actina que componen el citoesqueleto juegan un activo papel en la modulación de la homeostasis del calcio y los compuestos que afectan la polimerización de actina pueden aliviar el daño neuronal en una variedad de condiciones neurodegenerativas. Así en otras modalidades, los agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina involucradas en la polimerización de actina se seleccionan, diseñan, fabrican e identifican de acuerdo a su habilidad para inhibir la polimerización de actina y, en consecuencia, contrarrestan el influjo de calcio inducido por la agregación del péptido ß-amiloide. De manera similar, los agentes péptido que corresponden a las secuencias de ß-amiloide pueden utilizarse para prevenir la agregación del péptido ß-amiloide en las membranas de plasma y, en consecuencia, contrarrestan el influjo de calcio inducido por la agregación del péptido ß-amiloide. Además, las terapias que combinan agentes péptido que corresponden a las regiones de actina y proteína ß-amiloide se encuentran dentro del alcance de algunas modalidades de la invención. Los agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina y péptido ß-amiloide involucradas en la polimerización pueden diseñarse, elaborarse e identificarse empleando la estrategia antes descrita. De nuevo, en general, el ensayo de mutación, el modelado de proteína y el ensayo de interacción de drogas en la literatura se revisa o tales determinaciones se hacen mediante procedimientos convencionales para diseñar y seleccionar los agentes péptido apropiados que corresponden a las secuencias involucradas en la polimerización de proteína. Por supuesto, los péptidos menores pueden seleccionarse al azar. Los agentes péptido se fabrican entonces (e.g., utilizando el procedimiento antes detallado) . Enseguida, los péptidos menores seleccionados se identifican conduciendo ensayo de caracterización de péptido que evalúan la habilidad del agente péptido para unirse a una proteína de interés, inhibir o prevenir la polimerización o unión de la proteína, y reducir un estado de enfermedad asociado con la proteína polimerizada o la concentración supramolecular. Puede emplearse cualquier número u orden de ensayo de caracterización de péptido para identificar a un péptido menor que inhibe la polimerización de proteínas o la concentración del complejo supramolecular. Dado que las citocalasinas se unen al extremo de rápido crecimiento (punzante) de la actina y, bloquean todas las reacciones de asociación y disociación, los péptidos menores que corresponden a las secuencias de actina en el extremo punzante interferirán con la polimerización de actina. De este modo, los agentes péptido que corresponden a esta región de actina se seleccionan, diseñan, y fabrican. Se ha mostrado que la mutación y la sustitución de dos aminoácidos hidrófobos del péptido ß-amiloide reducen la amiloidogenicidad. (Hilbich et al., J. Mol . Biol . 228:460-473 (1992)). Se encontró que un núcleo hidrófobo bien preservado alrededor de los residuos 17 a 20 del péptido ß-amiloide es importante para la formación de estructuras de hoja-ß y otras propiedades amiloide. Se cree que esta región juega un papel importante en la concentración y la estabilización de las placas amiloide. Así, los agentes péptido que corresponden a esta región del péptido ß-amiloide se seleccionan, diseñan y fabrican. Una vez formados, los péptidos se filtran en ensayo de caracterización de péptido. Para evaluar la habilidad de un agente péptido para unirse a actina o péptido ß-amiloide (las formas purificadas se obtienen de Sigma) , se lleva a cabo un ensayo de unión in vitro con agentes péptido radio-etiquetados. Como se describió previamente, un procedimiento preferido involucra disponer la proteína de interés en una membrana de diálisis y unir la proteína con agentes péptido radio-etiquetados. De acuerdo a esto, la proteína de interés se coloca en una membrana de diálisis que tiene una dilución a 10,000 mw (e.g., un Slide-A-lyzer, Pierce). Después, los agentes péptido radiactivamente etiquetados se agregan en un amortiguador adecuado y se permite que la reacción de unión tenga lugar durante la noche a 4°C. Los agentes péptido pueden radio-etiquetarse con 125I o 14C, de acuerdo a las técnicas estándar o pueden etiquetarse con otras señales detectables. Después de que tuvo lugar la reacción de unión, se remueve el amortiguador que contiene agente péptido, y la membrana de diálisis que tiene la proteína de interés se dializa durante dos horas a 4°C en un amortiguador que carece de agentes péptido radiactivos. Subsecuentemente, la radiactividad presente en la proteína dializada se calcula mediante centelleo. Los agentes péptido que se unen a actina o péptido ß-amiloide pueden identificarse rápidamente de esta manera. Pueden emplearse las modificaciones de estos ensayo de unión, como será aparente a los expertos en la técnica, particularmente en los ensayo de unión tales como los descritos anteriormente que son fácilmente adaptables para el ensayo de alto rendimiento, por ejemplo, uniendo la actina o péptido ß-amiloide a una placa de micro valoración y filtrando para la unión de los agentes péptido etiquetados de manera fluorescente. Después que se han identificado los agentes péptido que se unen a actina o péptido ß-amiloide, se llevan a cabo los ensayo que evalúan la habilidad de los agentes péptido para romper la polimerización de actina o péptido ß-amiloide. Mientras que concierna a la inhibición de la polimerización de actina, pueden utilizarse técnicas en inmunohistoquímica. De acuerdo a esto, se conducen estudios de inmunofluorescencia en células que se han tratado con agentes péptidos y se determina la presencia de actina polimerizada con anticuerpos que son específicos para la actina (e.g., anti-actina-FITC monoclonal conjugado (Clon No. AC-40) Sigma F3046) ) . Las células neuroblastoma de ratón transformadas y las células de fibroblasto normales son adecuadas para estos experimentos y tales células se contactan con cantidades variables de agentes péptido, se unen, se manchan con el anticuerpo de actina, y se analizan de acuerdo a técnicas estándar de inmunofluorescencia. Mediante un procedimiento, las células del clon N1E-115 de neuroblastoma de ratón transformadas se cultivan en un medio de Dulbecco Eagles modificado (DMEM) suplementado con 5% de suero fetal de ternera a 37°C en una atmósfera de 10% de C02. Los fibroblastos de ratón normales (Swiss/373) se cultivan en DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera. Las células se contactan con lOOµM - 300µM de agentes péptido durante la noche o sin agentes péptido (control) y se re-emplacan subsecuentemente sobre recipientes de cultivo de tejido plástico de 35 mm que contienen porta objetos de cubierta de vidrio. Las células neuroblastoma diferenciadas se obtienen agregando 2% de sulfóxido dimetilo (DMSO) al medio de cultivo.

Las células en el porta objetos de la cubierta se enfrían entonces sobre hielo, el medio de cultivo se retira, y las células se lavan en salina fosfato-amortiguada fría (PBS) . Después del lavado, las células se unen durante 30 minutos en paraformaldehído al 2% (PFA), una dilución 1:1 con PBS de 4% PFA, y .1% de Tritón X-100 sobre hielo, o 15 minutos en metanol al 100% a -10 °C. Después de la unión, el unidor se retira y las células se lavan dos veces en PBS a 4°C (5 minutos/lavado). El anticuerpo de anti-actina etiquetado FITC se agrega a una dilución de 1:75 y se permite que tenga lugar la unión durante 1 hora a 4°C. Subsecuentemente, las células se lavan cuatro veces en PBS a 4°C (5 minutos/lavado) . El examen microscópico de las células revelará que las células no tratadas tienen extensos microfilamentos de actina etiquetados con el anticuerpo anti-actina FITC. Las células no tratadas mostrarán actina organizada caracterizada por largos haces de actina. Las células neuroblastoma, en particular, mostrarán un contorno suave, tipificado por micro-puntas. En contraste, las células tratadas con los agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina involucradas en la polimerización de actina, mostrarán células redondeadas, una pérdida de las micro-puntas y conos de crecimiento alterados. Adicionalmente, los largos haces de actina encontrados en células normales no serán ya visibles y se encontrará un intenso etiquetamiento de actina en el citoplasma o en las membranas plegadas. Utilizando las técnicas antes descritas, los agentes péptido que corresponden a la secuencia de proteína de actina pueden diseñarse, elaborarse y filtrarse para la habilidad para unirse a la actina y prevenir la polimerización de actina. Como un control positivo adicional, las células pueden tratarse con un compuesto de citocalasina y la inmunofluorescencia mostrará una despolimerización de actina caracterizada por la carencia de largos haces de actina. Con respecto a la determinación de agentes que inhiben la agregación/polimerización del péptido ß-amiloide, se conocen varios métodos. Mediante un procedimiento, la proteína(i-40) ß-amiloide se disuelve en isopropinol hexaflúor (HFIP; Aldrich Chemical Co.) en 2 mg/ml. Los alícuotas de la solución de HFIP se transfieren a tubos de ensayo y se pasa una corriente de gas argón a través de cada tubo para evaporar el HFIP. La delgada película resultante del péptido ß-amiloide se disuelve en DMSO y se agrega una barra de agitación magnética recubierta con teflón a cada tubo. Se agrega un amortiguador adecuado (e.g., 100 mM de NaCl , 10 mM de fosfato de sodio pH 7.4) a la solución de DMSO con agitación. La mezcla resultante se agita continuamente y se monitorea la densidad óptica a 400 nm para observar la formación de agregados péptido insolubles. En muestras de control, los agregados péptido serán rápidamente discernibles como lo determina el incremento en la densidad óptica a 400 nm. En presencia de los agentes péptido, sin embargo, la agregación del péptido ß-amiloide se inhibirá como se detecta mediante una densidad óptica menor a 400 nm que la muestra de control . En un segundo ensayo, la agregación de la proteína ß-amiloide se calcula utilizando un ensayo fluorométrico . (Levine, Protein Science 2:404-410 (1993)). En este ensayo, la tioflavina T teñida (ThT) se contacta con la solución de proteína ß-amiloide. La ThT teñida se asocia con la proteína ß-amiloide agregada pero no con la proteína ß-amiloide monomérica o libremente asociada. Cuando se asocia con la proteína ß-amiloide, la ThT da lugar a un máximo de excitación a 450 nm y a una emisión aumentada a 482 nm comparado con los 385 nm y 455 nm de una teñida libremente. De acuerdo a esto, los alícuotas de la proteína ß-amiloide en presencia y ausencia de los agentes péptido que corresponden a las secuencias de la proteína ß-amiloide, se agregan a los envases de reacción y se conducen a 50 mM de amortiguador de fosfato potasio pH 7.0 que contiene tioflavina T (10 mM; obtenida de Aldrich Chemical Co.) . La excitación se sitúa en 450 nm y la emisión se calcula en 482 nm. Como en el ensayo de agregación anterior, las muestras que tienen agentes péptido que inhiben la agregación del péptido ß-amiloide mostrarán escasa emisión en 482 nm comparado con los 444 nm, mientras que la emisión para las muestras de control de teñido libre mostrará una emisión considerable en 482 nm y escasa emisión en 444 nm. En un tercer ensayo, la habilidad de los agentes péptido de la invención para romper la agregación ß-amiloide se determina mezclando los péptidos amiloide con agentes péptido e iniciando la mezcla con rojo Congo. Todos los tipos de amiloide muestran un verde birregringente bajo luz polarizada si se manchan con el tinte rojo Congo. Sin embargo, los péptidos ß-amiloide que son incapaces de agregarse en virtud de la presencia de los agentes péptido no exhibirán un verde birrefringente bajo luz polarizada. De acuerdo a esto, próximamente 0.5 a 1 mg de péptidos ß-amiloide secados por congelación se suspenden en 100 µl de PBS, pH 7-4 que contiene de 100 a 300 µM de agente péptido. Después de la adición de los péptidos ß-amiloide, se agrega una solución de 5 µl de rojo Congo (1% en agua) . Después se colocan 20 µl de la suspensión sobre un porta objetos de microscopio y se inspecciona inmediatamente bajo luz polarizada y no-polarizada en un microscopio. Pueden tomarse fotografías en una magnificación primaria de 200X. En las muestras de control, e.g., sin agentes péptido, se observarán los péptidos ß-amiloide agregados y un verde birrefringente verde, sin embargo, las muestras que tienen agentes péptido mostrarán una agregación ß-amiloide reducida y un verde birrefringente . Adicionalmente, la agregación de ß-amiloide en presencia y ausencia de agentes péptido puede lograrse utilizando la microscopía electrónica. Para la formación de filamentos, se dializan soluciones de péptidos ß-amiloide en HCOOH al 70% (1 mg de péptido ß-amiloide/200 µl) contra una mezcla de PBS y HCOOH con y sin agentes péptido a temperatura ambiente durante 5 días. Durante este tiempo la cantidad de PBS en el amortiguador de diálisis se incrementa de 20 a 100%. Se aplican suspensiones frescas de péptidos ß-amiloide en PBS con y sin agentes péptido (después de la diálisis) a rejillas de cobre desionizadas recubiertas con carbono, secas, manchadas negativamente con acetato de uranilo al 2% (w/v) y se visualizan en un microscopio electrónico. Una característica de los péptidos ß-amiloide es su tendencia a agregarse dentro de filamentos solubles de la gran masa molecular. Tales agregados se detectan rápidamente mediante microscopía electrónica y pueden tener un diámetro de aproximadamente 5 nm con una longitud que se acerca a 200 nm. Las muestras que contienen los péptidos ß-amiloide que se contactaron con los agentes péptido, sin embargo, mostrarán si acaso pocos filamentos. Para conocer la habilidad de los agentes péptido que corresponden a la secuencia de actina y a la secuencia de ß-amiloide para romper el influjo de calcio inducido por la agregación del péptido ß-amiloide, se llevan a cabo ensayo funcionales utilizando cultivos de células hipocampales . Se establecen cultivos de célula embriónica hipocampal de rata y se mantienen en un sustrato recubierto con polietilenimina en recipientes plásticos de 35 mm, placas de depósito 96, o recipientes de fondo de vidrio de 35 mm. La densidad celular se mantiene aproximadamente a 70-100 células/mm2. Las células se mantienen en un medio Eagles mínimo esencial suplementado con 10% de suero fetal bovino que contiene 20 mM de piruvato de sodio. Los experimentos se llevan a cabo en cultivos de 6-10 días, un tiempo en el cual las neuronas exhiben respuestas de calcio al glutamato mediadas por ambos receptores NMDA y ácido a-amino-3-hidroxi-5-metilisoxasolo-4-propiónico (AMPA) /cainato, y son vulnerables a la exotoxicidad y a la toxicidad de ß-amiloide. Los péptidos ß-amiloide 25-35 y 1-40 (Sigma A1075,A4559, respectivamente) se preparan inmediatamente antes de usarse disolviendo el péptido en una concentración de 1 mM en agua estéril destilada. Estos péptidos se agregan rápidamente al colocarse en un medio de cultivo y progresivamente matarán neuronas sobre un período de 48 horas al agregarse a cultivos en forma soluble. (Mattson, Patente de los E.U. No. 5,830,910, incorporada aquí como referencia) . La supervivencia neuronal se cuantifica contando las neuronas viables en el mismo campo microscópico (10X objetivo) inmediatamente antes del tratamiento y en puntos de tiempo después del tratamiento. Adicionalmente, las células cultivadas en placas de depósito 96 en presencia de fluorescencia azul Alamar (Alamar Laboratorios) se cuantifica utilizando un lector de placa de fluorescencia. El azul Alamar es un sustrato no-fluorescente que después de la reducción mediante metabolitos celulares, se vuelve fluorescente. La viabilidad de las neuronas se averigua mediante un criterio morfológico. Las neuronas que admiten neuritas de diámetro uniforme y somas con una apariencia redonda, suave se consideran viables, mientras que las neuronas con neuritas fragmentadas y un soma vacío o crecido se consideran no-viables. Los valores de supervivencia pueden expresarse como porcentajes del número inicial de neuronas presente antes del tratamiento experimental . En presencia de los agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina o las secuencias ß-amiloide necesarias para la polimerización de proteínas, se observará una supervivencia neuronal mayor que el 50%. De manera deseable, la supervivencia neuronal inducida mediante el contacto de las células con un agente péptido que corresponde a una secuencia de actina o ß-amiloide o ambas secuencias, se encontrará entre 50-100%. De preferencia, la supervivencia neuronal será de 60-100% y la supervivencia neuronal puede ser 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y 100%. En contraste, las células incubadas con 100 mM de glutamato mostrarán tan poco como el 25% de supervivencia neuronal y las células cultivadas en presencia de péptidos ß-amiloide mostrarán una supervivencia neuronal menor que el 50%. Además, en células pre-tratadas durante 1 hora con los agentes péptido que corresponden a secuencias de actina o péptidos ß-amiloide, se reducirá la neurotoxicidad del glutamato. En estudios posteriores, puede determinarse una medición del influjo de calcio en presencia y ausencia de agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina y/o del péptido ß-amiloide utilizando el tinte indicador de calcio Fura-2. Mediante un procedimiento, la representación promedio de fluorescencia del tinte indicador de Ca2+ Fura-2 se utiliza para cuantificar el Ca2+ en soma neuronal que se ha tratado ya sea con glutamato o péptido ß-amiloide en presencia y ausencia de agentes péptidos que corresponden ya sea a la secuencias de actina o péptido ß-amiloide o ambas. Las células se incuban durante 30-40 minutos en presencia de 2 mM de la forma éster acetoximetilo del tinte indicador de Ca2+ Fura-2 y se lavan después dos veces (2 ml/lavado) con un medio fresco y se dejan incubar cuando menos 40 minutos antes de la representación. Inmediatamente antes de la representación, el medio de cultivo normal se reemplaza con una solución salina blanceada Hanks (Gibco) que contiene 10 mM de amortiguador HEPES y 10 mM de glucosa. Las células se representan utilizando un sistema Zeiss Attofluor con un objetivo aceitoso o el sistema Quantex con un objetivo de aceite a 40X. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que pueden emplearse otros sistemas microscópicos. La proporción de la emisión de fluorescencia utilizando dos diferentes longitudes de onda de exitación (334 y 380 nm) se utiliza para determinar el influjo de calcio. El sistema se calibra utilizando soluciones que contienen ya sea ningún Ca2+ o un saturado de Ca2+ (1 mM) . La representación del calcio Fura-2 revelará que los agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina o péptido ß-amiloide o ambas atenuarán las respuestas [Ca2+] i al glutamato y a la despolarización de membrana inducida por el péptido ß-amiloide. En cultivos de control, por ejemplo, 50 mM de glutamato inducirán a un rápido aumento en el [Ca2+] i neuronal . En contraste la respuesta [Ca2+] i al glutamato es reducida en neuronas pre-tratadas con 300 µM de agentes péptido durante una hora. Adicionalmente, la respuesta [Ca2+] i neuronal al glutamato aumenta grandemente en los cultivos pre-tratados con péptidos ß-amiloide durante 3 horas. Sin embargo, en presencia de agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina o péptido ß-amiloide, la potenciación de la respuesta [Ca2+] ± al glutamato en el cultivo pre-tratado con ß-amiloide se suprime. Estos experimentos demostrarán que la despolimerización de actina y/o la despolimerización del péptido ß-amiloide ocasionadas por la presencia de los agentes péptido que corresponden a las secuencias de actina y péptido ß-amiloide reducirán el influjo de [Ca2+] i inducido por el glutamato y la despolarización mediada de membrana de ß-amiloide. Como se mencionó en la sección anterior, una terapia de combinación que emplea ambos agentes que corresponden a la secuencia de actina y a la secuencia del péptido ß-amiloide son modalidades de la invención. Utilizando los ensayo descritos anteriormente, los agentes péptido que se unen a la actina y al péptido ß-amiloide pueden seleccionarse, diseñarse, elaborarse y caracterizarse. Puede obtenerse una mejor respuesta (e.g., menor influjo de Ca2+) administrando agentes péptido que corresponden a las secuencias de ambos, actina y péptido ß-amiloide. Adicionalmente, utilizando los procedimientos similares a las antes descritas, los agentes péptido que inhiben la formación de placas de proteína prion-relacionadas pueden seleccionrse, diseñarse, elaborarse y caracterizarse. Los agentes péptido seleccionados, diseñados, fabricados y caracterizados como se describió en lo anterior pueden incorporarse en fármacos para su uso como agentes terapéuticos y profilácticos para el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad prion. Los métodos de tratamiento de los sujetos afectados con enfermedades neurodegenerativas tal como la enfermedad de Alzheimer se llevan a cabo administrando tales fármacos. (Ver Findeis et al., Patente de los E.U. No. 5,817,626 para moduladores de agregación del péptido ß-amiloide) . Además, la eficacia de tales péptidos puede probarse en ratones transgénicos que exhiben una neuropatología tipo Alzheimer. (Gains et al., Nature 373-523-527 (1995)). Estos ratones transgénicos expresan altos niveles de proteína precursora amiloide mutante humana y desarrollan progresivamente muchas de las condiciones patológicas asociadas con la enfermedad de Alzheimer. En lo que se trata a continuación, se describe el uso de la tecnología PPI para interrumpir la polimerización de tubulina para el tratamiento y prevención del cáncer. Inhibición de la polimerización de tubulina En otro aspecto, se describe la fabricación y uso de los agentes péptido para la inhibición de la polimerización de tubulina. Los agentes péptido que inhiben la polimerización de tubulina se utilizan como herramientas biotecnológicas y como terapéuticos para el tratamiento de varias formas de cáncer. Los agentes péptido que corresponden a las secuencias de tubulina a o subunidades ß o ambas, por ejemplo, pueden prevenir la polimerización de tubulina y pueden utilizarse como agentes anti-tumor. Los inhibidores de polimerización de tubulina de péptido menor pueden incorporarse en fármacos para tratar leucemias, melanomas y cánceres de colon, pulmón, ováricos, CNS y renales así como otros cánceres. De preferencia, los agentes péptido se utilizan para tratar los cánceres de colon. Se sabe que una variedad de compuestos clínicamente promisorios que demuestran una potente actividad citotóxica y anti-tumor efectúan su primer modo de acción a través de una eficiente inhibición de la polimerización de tubulina. (Gerwick et al., J. Org . Chem . 59:1243 (1994)). Esta clase de compuestos anti-tumor se une a la tubulina y a su vez detiene la habilidad de la tubulina a la polimerización en micro-túbulos que son compuestos esenciales para el mantenimiento celular y la división celular. (Owellen et al., Cáncer Res . 36:1499 (1976)). Actualmente, los inhibidores de polimerización de tubulina más reconocidos y clínicamente útiles para el tratamiento del cáncer incluyen vinblastina, vincristina, rizoxina, combretastina A-4 y A-2, y taxol. (Pinney, Patente de los E.U. No. 5,886,025). La tubulina es un heterodímero de subunidades de tubulina globular a y ß. Utilizando reactivos de etiquetado de foto-afinidad para tubulina, los investigadores han identificado tres sitios distintos de unión de la molécula menor en la tubulina: el sitio colcinina, el sitio vinblastina, y el sitio rizoxina. Adicionalmente, los reactivos de etiquetado de foto-afinidad han revelado que la rizoxina se une al sitio Met-363-Lys-379 en la ß-tubulina.

(Sawada et al., Biochem. Pharmacol . 45:1387 (1993)). Además, se ha encontrado que un reactivo en base a taxol etiqueta los residuos aminoácido N-terminal 31 de la ß-tubulina.

(Swindell et al., J. Med . Chem. 37:1446 (1994) y Rao et al., J". Biol . Chem. 269:3132 (1994)). De preferencia, los agentes péptido de estas modalidades se seleccionan y diseñan para corresponder a las secuencias en estas regiones. Una vez seleccionados, diseñados y fabricados, los agentes péptido se filtran para su habilidad para unirse a la tubulina. Utilizando un procedimiento similar a la antes descrita, la tubulina (Sigma T 4925) se coloca en una membrana de diálisis, (e.g., un Slide-A-lyzer, Pierce) . Después se agregan agentes péptido radio-etiquetados en un amortiguador adecuado y se permite que la reacción de unión tenga lugar durante la noche a 4°C. Los agentes péptido pueden radio-etiquetarse con 125I o 14C, de acuerdo a las técnicas estándar o pueden etiquetarse con otras señales detectables . Después de que la reacción de unión ha tenido lugar, el amortiguador que contiene agente péptido se retira, y la membrana de diálisis que tiene la proteína de interés se dializa durante dos horas a 4°C en un amortiguador que carece de agentes péptido radiactivos. Subsecuentemente, la radiactividad presente en la proteína dializada se calcula mediante centelleo. Los péptidos que se unen a la tubulina se identifican rápidamente mediante la detección de radiactividad en el fluido de centelleo. Pueden utilizarse las modificaciones de estos ensayo de unión, como será aparente para los expertos en la técnica, en ensayo de unión particulares, tales como los descritos anteriormente que son fácilmente adaptables para el ensayo de alto rendimiento, por ejemplo, uniendo la tubulina a una placa de micro-valoración y filtrando para la unión de agentes péptido fluorescentemente etiquetados. Después que se han identificado los agentes péptido que se unen a la tubulina, se llevan a cabo ensayo que evalúan la habilidad del péptido para romper la polimerización de tubulina. Un sistema de ensayo adecuado es el descrito por Bai et al., Cáncer Res . 56:4398-4406 (1996). La inhibición de la concentración glutamato-inducido de tubulina purificada en presencia y ausencia de los agentes péptido puede evaluarse en mezclas de reacción de 0.25 ml seguidas de la pre-incubación durante 15 min a 37 °C sin GTP. Las concentraciones finales para una mezcla típica de reacción pueden ser de 1.0 mg/ml (10 µM) de tubulina, 300 µM de agente péptido, 1.0 M de glutamato monosódico, 1.0 mM de MgCl2, 0.4 mM de GTP y 4% (v/v) de DMSO. La concentración se inicia mediante un 75-s-salto desde 0 a 37°C y puede monitorearse en un espectrofotómetro Gilford a 350 nm. La extensión de la reacción se evalúa después de 20 min. En presencia de los agentes péptido, se detectará muy poca absorbencia a 350 nm. En contraste, en ausencia de los agentes péptido, se detectará una absorbencia significativa a 350 nm. La agregación de tubulina en presencia y ausencia de los agentes péptido puede seguirse también por HPLC sobre una columna de permeación de gel de 7.5 x 300 -mm TSK G3000SW con un sistema LKB en línea con un detector de flujo Ramona 5-LS. La columna se equilibra con una solución que contiene 0.1 M MES (pH 6.9) y 0.5 mM de MgCl2. Los datos de absorbencia pueden evaluarse con un equipo lógico Raytest en una computadora IBM-compatible . En presencia de los agentes péptido, se detectará muy poca absorbencia a 350 nm. En contraste, en ausencia de los agentes péptido, se detectará una absorbencia significativa a 350 nm. Además, puede utilizarse la microscopía electrónica para evaluar la agregación de tubulina en presencia y ausencia de los agentes péptido. De acuerdo a esto, se colocan 5 µl de la reacción sobre una rejilla de cobre tratada con Formavar de malla-200, recubierta con carbono, y después de 5-10 seg., la muestra no ligada se lava con 5-10 gotas de acetato de uranilo al 0.5%. El exceso de mancha se remueve por absorbencia en papel filtro y los especímenes manchados negativamente se examinan en un microscopio electrónico. En presencia de los agentes péptido, se verán muy pocos haces de tubulina. En contraste, en ausencia de los agentes péptido, se observará un número significativo de haces de tubulina. Los agentes péptido pueden también probarse para su habilidad para inhibir el crecimiento de células tumorales. La citotoxicidad de los agentes péptido que corresponden a las secuencias de tubulina se evalúa en términos de la actividad inhibidora del crecimiento contra varias líneas celulares de cáncer humano, incluyendo líneas ováricas CNS, renales, de pulmón, de colon y melanoma. El ensayo utilizado se describe en Monks et al., (Ver, e.g., Monks et al., J. Nt . Cáncer Inst . 83:757-766 (1991), que se incorpora aquí como referencia) . Brevemente, las suspensiones celulares, diluidas de acuerdo al tipo particular de célula y a la densidad celular esperada del objetivo (aproximadamente 5,000-40,000 células por depósito en base a las características de crecimiento celular) , se agregan con pipeta (100 µl) a placas de micro-valoración de depósito 96. Se permite a los inoculados un tiempo de pre-incubación de 24-28 horas a 37°C para su estabilización. Se permite que ocurra la incubación con los agentes péptido durante 48 horas en una atmósfera de C02 al 5% y 100% de humedad. La determinación del crecimiento celular se completa mediante la unión in si tu de las células, seguida por el manchado con un tinte de unión de proteína, sulforodamina B (SRB) , que se une a los aminoácidos básicos de las macromoléculas celulares. La mancha solubilizada se mide estectrofotométricamente. Los agentes péptido que corresponden a las secuencias de tubulina se evalúan de preferencia para su actividad citotóxica contra las células P388 de leucemia. El valor ED50, definido como la dosis efectiva requerida para inhibir el 50% del crecimiento celular, puede determinarse para cada uno de los agentes péptido probados. Las células cancerosas incubadas en presencia de agentes péptido exhibirán muy poca proliferación y crecimiento celular, mientras que, en ausencia de agentes péptidos, las células cancerosas proliferarán. Los agentes péptido seleccionados, diseñados, fabricados y caracterizados como se describió en lo anterior pueden incorporarse en fármacos para el uso como agentes terapéuticos y profilácticos para el tratamiento y prevención de varias formas de cáncer. Lo descrito a continuación trata el uso de la tecnología PPI para romper la concentración de la cápside viral para el tratamiento y prevención de infección viral . Inhibición de la concentración de la cápside viral Otro aspecto incluye la fabricación y el uso de agentes péptido para la inhibición de infección viral . Los agentes péptido que inhiben la infección viral se utilizan como herramientas biotecnológicas y como terapéuticos para el tratamiento de varias formas de enfermedad viral . Los agentes péptido que corresponden a las secuencias de la cápside de la proteína viral, por ejemplo, pueden prevenir la polimerización de la cápside y pueden utilizarse como agente anti-viral. Estos agentes anti-virales pueden incorporarse en fármacos para tratar VIH-1, VIH-2, y SIV, así como, tipos de infecciones virales. Inicialmente, los agentes péptido que corresponden a la cápside de la proteína viral del VIH-1, VIH-2, y SIV ("p24") se seleccionaron, se diseñaron, y se elaboraron. La proteína p24 se polimeriza para formar el cápside viral y es un componente integral para la formación del nucleocápside de lentivirus. La forma amida de los péptidos menores listada en la Tabla 1, que corresponde a las secuencias de p24 que se cree están involucradas en las interacciones proteína-proteína que permiten la polimerización de la cápside, se fabricó, y se filtró en ensayo de caracterización. Estos agentes péptido se sintetizaron de acuerdo al método antes descrito, pero podrían por supuesto sintetizarse mediante cualquier método conocido en la técnica. TABLA 1 Leu-Lys-Ala (LKA) Arg-Gln-Gly (RQG) Iso-Leu-Lys (ILK) Lys-Gln-Gly (KQG) Gly-Pro-Gln (GPQ) Ala-Leu-Gly (ALG) Gly-His-Lys (GHK) Gly-Val-Gly (GVG) Gly-Lys-Gly (GKG) Val-Gly-Gly (VGG) Ala-Cys-Gln (ACQ) Ala-Ser-Gly (ASG) Cys-Gln-Gly (CQG) Ser-Leu-Gly (SLG) Ala-Arg-Val (ARV) Ser-Pro-Thr (SPT) Lys-Ala-Arg (KAR) Gly-Ala-Thr (GAT) His-Lys-Ala (HKA) Lys-Ala-Leu (KAL) Gly-Pro-Gly (GPG) cont . TABLA 1 Abreviaturas utilizadas Leu-Leucina Lys-Lisina Gln-Glutamina Ala-Alaniña His-Histidina Ileu-Isoleucina Cys-Cisteína Gly-Glicina Pro-Prolina Arg-Arginina Val-Valina Thr-Treonina Ser-Serina Para determinar si los agentes péptido listados en la Tabla 1 se ligan a la proteína de cápside viral p24, se llevó a cabo un ensayo de unión in vi tro . Como se describió previamente, se condujo un ensayo de unión en base a diálisis utilizando una membrana de diálisis con un tamaño de poro menor que 10 kD. (Slide-A-lyzer, Pierce) . Se introdujeron cincuenta microlitros de un almacenaje de 10 µM de las proteínas recombinantes p24, gp 120 (donaciones del programa AIDS, NCIB) y BSA (Sigma) en membranas de diálisis separadas y las proteínas se dializaron a 4°C durante 2 días contra una solución de 500 ml compuesta de 150 mM de NaCl , y 50 mM de Tris-HCl, amortiguador de pH 7.4, y 27.5 M de 14C-GPG-NH2 (Amersham Ltd. UK) . Subsecuentemente, se retiraron diez o cinco microlitros de alícuotas de la p24 dializada, gp 120, y BSA y se mezclaron con 3 ml de ReadySafe (Beckman) en un frasco de centelleo. El C14 se detectó entonces mediante conteo de centelleo. En la Tabla 2, se proporcionan los resultados de un ensayo de unión en base a diálisis representativo. Notablemente, se observó una asociación de p24 con GPG-NH2 al equilibrar la diálisis. La cantidad de GPG-NH2 radiactivo asociado con p24 fue 7.5 veces mayor que la presente en el amortiguador. En contraste, ninguna cantidad apreciable de GPG-NH2 radiactivo sobre la cantidad presente en el amortiguador de la diálisis se asoció con gp 120 o BSA. Estos resultados prueban que los péptidos menores, tales como el GPG-NH2 se unen a p24. TABLA 2 Muestra: amortiguador de diálisis p24 gpl20 BSA UCi/ml 1.816 13.712 1.745 1.674 Períodos de Amortiguador 1.000 7.551 0.961 0.922 La evidencia de que los agentes péptido inhiben o previenen la polimerización de proteína de cápside viral y, así, la propia concentración de nucleocápside, se obtuvo llevando a cabo la microscopía electrónica en partículas VIH-1 que se pusieron en contacto con un péptido menor modificado. En este grupo de experimentos, las células HUT78 se infectaron con virus de VIH-1 SF-2 a 300TCID50 durante 1 hora a 37 °C. Subsecuentemente, las células infectadas se lavaron y se granularon 3 veces. Enseguida, las células se re-suspendieron en un medio de cultivo RPMI suplementado con FBS al 10%, antibióticos (100 u/ml) y polibreno (3.2 ug/ml). Se agregó entonces el GPG-NH2 dentro de los cultivos celulares 3, 5 o 7 días después de la infección a una concentración de 1 µM o 10 µM. A una muestra de control se administró 0.5 µM de Ritonavir (un inhibidor de proteasa). Las células se cultivaron hasta el día 14, en cuyo punto, las células se unieron en glutaraldehído al 2.5% mediante medios convencionales. Las células unidas se post-uniron en Os04 al 1% y se deshidrataron, se cubrieron con resinas epoxi, y los bloques se dejaron polimerizar. Las secciones epon de las células infectadas con el virus se formaron de aproximadamente 60-80 nm de espesor a fin de acomodar la anchura de la nucleocápside. Las secciones se montaron en rejillas manchadas con acetato uranilo al 1.0% y se analizaron en un microscopio Zeiss CEM 902 a un voltaje de aceleración de 80 kV. El microscopio se equipó con un espectrómetro para aumentar la calidad de imagen y se utilizó una trampa de enfriamiento de nitrógeno líquido para reducir el daño por emisión. Las rejillas que tienen secciones de control y células incubadas con GPG-NH2 se examinaron en varios estudios blindados. La microscopía electrónica de las partículas de VIH no tratadas reveló la característica en forma de cono del nucleocápside y del RNA cercado manchado de manera uniforme que ensanchó la longitud del nucleocápside. (Ver Figura 1). En contraste, la Figura 2 presenta dos micrografías electrónicas que muestran varias partículas de VIH-1 que se han puesto en contacto con el inhibidor de proteasa viral Ritonavir. Las células infectadas que habían sido tratadas con Ritonvir exhibieron estructuras malformadas que no tienen un nucleocápside discernible, como se esperaba. La Figura 3 presenta micrografías electrónicas que muestran partículas virales que se han contactado con GPG-NH2. Las células que tienen partículas de VIH-1 que se pusieron en contacto con el GPG-NH2 exhibieron partículas de VIH-1 con estructuras de cápside discernibles que son distintas de las partículas tratadas con Ritonavir. Más específicamente, en algunas partículas virales tratadas con tripéptido, la estructura en forma de cono de la cápside pareció estar parcialmente intacta pero el RNA se amasó en una configuración semejante a una pelota ya sea fuera de la cápside o en la parte superior (extremo amplio) de la cápside. Aún adicionalmente, se observó que algunas cápsides tuvieron estructuras deformes con poca o ninguna morfología que semejara un nucleocápside normal y se observó que el RNA estaba ya sea fuera de la estructura o dentro de la estructura en un extremo. A partir de estos estudios se aclaró que los péptidos menores interfieren con la polimerización de proteína de cápside viral y en la propia formación del nucleocápside. Enseguida se evaluó la habilidad de los agentes péptido para inhibir la infección viral. De acuerdo a esto, los agentes péptido listados en la Tabla 1 se utilizaron en varios ensayo de infección viral (e.g., VIH-1, VIH-2 y SIV) . La eficiencia de la infección de VIH-1, VIH-2 y SIV se monitoreó mediante la actividad transcriptasa de reversa, la concentración de proteína p24 en el sobrenadante celular, y mediante la evaluación microscópica de la formación sincitia del VIH-1. En experimentos iniciales, se filtraron varios tripéptidos modificados para la habilidad para inhibir la infección por VIH-1, VIH-2 y SIV en células H9. Una vez identificados los tripéptidos inhibidores, se condujeron ensayo más específicos para determinar el efecto de concentraciones variables de los tripéptidos seleccionados y los tratamientos de combinación (e.g., el uso de más de un tripéptido modificado en combinación) . En los experimentos 1 y 2, aproximadamente 200,000 células H9 se infectaron con VIH-1, VIH-2 y SIV a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de los siguientes tripéptidos sintetizados LKA-NH2, ILK-NH2/ GPQ-NH2, GHK-NH2, GKG-NH2, ACQ-NH2, CQG-NH2 ARV-NH2, KAR-NH2, HKA-NH2, GAT-NH2, KAL-NH2, y GPG-NH2. De acuerdo a esto, las células H9 se re-suspendieron con o sin los diferentes péptidos (aproximadamente 100 µM) en 1 ml del medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado con calor (FBS) , penicilina (100 u/ml) , y estreptomicina (100 u/ml) , todos disponibles a través de GIBCO, y Polibreno (g/ml), disponible a través de Sigma. Enseguida, los virus se agregaron en 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con el virus a 37 °C durante 1 hora después se granularon a 170 xg durante 7 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces en un medio RPMI sin péptidos a temperatura ambiente y se granularon a 170 xg durante 7 minutos como en lo anterior. Después del lavado final, las células se re-suspendieron en un medio de cultivo RPMI en una placa de depósito 24 (Costar Corporation) y se conservaron a 37°C en 5% de C02 con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron y se analizaron cuando cambió el medio a 4, 7, 10, y 14 días postinfección. Para monitorear la replicación del virus, se analizó la actividad transcriptasa de reversa (RT) en los sobrenadantes utilizando un equipo de actividad comercialmente disponible Lenti-RT. (Cavidi Tech. Uppsala, Suecia) . La cantidad de RT se determinó con la ayuda de una línea de regresión de estándares. Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteína y mayor infección viral. La formación de centelleo se monitoreó también mediante examen microscópico. Las Tablas 3 y 4 muestran los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular de los Experimentos 1 y 2 respectivamente. En el experimento 3, (Tabla 5) se infectaron aproximadamente 200,000 células H9 con VIH-1, VIH-2 y SIV a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de los péptidos GPG-NH2 GKG-NH2 y CQG-NH2, y las combinaciones de estos péptidos (la concentración indicada corresponde a la concentración de cada tripéptido) . Como en lo anterior, las células H9 se re-suspendieron con o sin los diferentes péptidos a concentraciones variables en 1 ml del medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado con calor (FBS) , penicilina (100 u/ml) y estreptomicina (100 u/ml) , y Polibreno (g/ml) . Enseguida, los virus se agregaron en 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con el virus indicado a 37 °C durante 1 hora después se granularon a 170 xg durante 7 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces en un medio RPMI sin péptidos a temperatura ambiente y se granularon a 170 xg durante 7 minutos, como en lo anterior.

Después del lavado final, las células se re-suspendieron en el medio de cultivo RPMI en una placa de depósito 24 (Costar corporation) y se conservaron a 37 °C en 5% de C02 con humedad . Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron cuando cambió el medio a 4, 7 y 11 días post-infección. Como en lo anterior, la replicación de cada virus se monitoreó detectando la actividad transcriptasa de reversa (RT) en los sobrenadantes utilizando el equipo de actividad Lenti-RT. (Cavidi Tech.) . La cantidad de RT se determinó con la ayuda de una línea de regresión de estándares. Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteína y mayor infección viral . La Tabla 4 muestra los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular del Experimento 3. En el experimento 4, (Tabla 6) se infectaron aproximadamente 200,000 células H9 con VIH-1, VIH-2 y SIV a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de los péptidos GPG-NH2 GKG-NH2 y CQG-NH2, y las combinaciones de estos péptidos (la concentración indicada corresponde a la concentración de cada tripéptido) . Como en lo anterior, las células H9 se re-suspendieron con o sin los diferentes péptidos a concentraciones variables en 1 ml del medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado con calor (FBS) , penicilina (100 u/ml) y estreptomicina (100 u/ml) , y Polibreno (g/ml) . Enseguida, los virus se agregaron en 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con el virus indicado 5 a 37 °C durante 1 hora después se granularon a 170 xg durante 7 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces en un medio RPMI sin péptidos a temperatura ambiente y se granularon a 170 xg durante 7 minutos, como en lo anterior. Después del lavado final, las células se re-suspendieron en el medio de cultivo RPMI en una placa de depósito 24 (Costar Corporation) y se conservaron a 37°C en 5% de C02 con humedad . Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron cuando cambió el medio a 4, 7 y 11 días post-infección. Como en lo anterior, la replicación de cada virus se monitoreó detectando la actividad transcriptasa de reversa (RT) en los sobrenadantes utilizando el equipo de actividad Lenti-RT. (Cavidi Tech.) . La cantidad de RT se determinó con la ayuda de una línea de regresión de estándares. Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteína y mayor infección viral . La Tabla 5 muestra los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular del Experimento 4. El sobrenadante analizado en el día Use diluyó en 5 pliegues de modo que pudo determinarse la iM>i^*t¿... detección más verazmente. En el experimento 5, (Tabla 7) se infectaron aproximadamente 200,000 células H9 con VIH-1, VIH-2 y SIV a 25 TCTD5o para probar el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de los péptidos GPG-NH2 GKG-NH2 y CQG-NH2, y las combinaciones de estos péptidos. Como en lo anterior, las células H9 se re-suspendieron con o sin los diferentes péptidos a concentraciones variables en 1 ml del medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado con calor (FBS) , penicilina (100 u/ml) y estreptomicina (100 u/ml) , y Polibreno (g/ml) . Enseguida, los virus se agregaron en 25 TCID50 en un volumen de 20-30 µl . Las células se incubaron con el virus indicado a 37 °C durante 1 hora después se granularon a 170 xg durante 7 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces en un medio RPMI sin péptidos a temperatura ambiente y se granularon a 170 xg durante 7 minutos, como en lo anterior. Después del lavado final, las células se re-suspendieron en el medio de cultivo RPMI en una placa de depósito 24 (Costar Corporation) y se conservaron a 37°C en 5% de C02 con humedad . Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron cuando cambió el medio a 4, 7 y 14 días post-infección. La replicación de cada virus se monitoreó detectando la presencia de p24 en los sobrenadantes. El antígeno de p24 VIH se determinó utilizando un equipo de detección de antígeno p24 VIH comercialmente disponible (Abbott) . Los resultados se presentan como valores de absorbencia (OD) y la absorbencia mayor indica una mayor concentración de proteína y mayor infección viral. En algunos casos, las diluciones seriales de los sobrenadantes se hicieron a fin de detectar más verazmente la concentración de p24. La Tabla 6 muestra los valores de absorbencia de los sobrenadantes del cultivo celular del Experimento 5. Como se trata abajo en mayor detalle, se descubrió que los tripéptidos GPG-NH2, GKG-NH2, y CQG-NH2 y las combinaciones de estos péptidos inhiben efectivamente la infección por VIH-1, VIH-2 y SIV. En el experimento 6, (Tabla 8 y Figura 5) se infectaron aproximadamente 200,000 células HUT78 con VIH-1 a 25 TCID50 para probar el efecto inhibidor de GPG-NH2 RQG-NH2 KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2 VGG-NH2 ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2. Las células HUT se re-suspendieron en 1 ml del medio RPMI 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado con calor (FBS, GIBCO) , penicilina (100 u/ml) estreptomicina (100 u/ml) , y Polibreno (Sigma 2ug/ml) con o sin la presencia de los diferentes péptidos menores (100 µM) antes mencionados. Enseguida, el virus VIH-1 se agregó en 25 TCID50 en un volumen de 20 µl . Las células se incubaron con el virus a 37 °C durante 1 hora y subsecuentemente las células se granularon a 170 xg durante 7 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces en un medio RPMI sin péptidos a temperatura ambiente mediante sedimentación celular a 170 xg durante 7 minutos, como en lo anterior. Después del lavado final, las células se re-suspendieron en el medio de cultivo RPMI en una placa de depósito 24 (Costar corporation) y se conservaron a 37 °C en 5% de C02 con humedad. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron cuando cambió el medio en el día 4, 7 y 11 post-infección y se monitoreó la producción de p24 viral utilizando un equipo ELISA p24 VIH-1 (Abbott Laboratories, North Chicago, EUA) . Como se trata a continuación, se descubrió que los péptidos menores RQG-NH2 KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2 VGG-NH2 ASG-NH2, SLG-NH2 y SPT-NH2 inhiben efectivamente la infección de VIH-1.

TABLA 3 Experimento 1 - (péptidos formados in si tu) Día 7 RT Día 10 RT *Valores que representan la densidad óptica (OD) TABLA 4 Experimento 2 - (péptidos formados in si tu) Día 7 RT Día 10 RT *Valores que representan la densidad óptica (OD) TABLA 5 Experimento 3 - (péptidos obtenidos de Bachem) Día 7 RT Día 10 RT *Valores que representan la densidad óptica (OD) TABLA 6 Experimento 4 - (péptidos obtenidos de Bachem) Día 7 RT Día 10 RT *Valores que representan la densidad óptica (OD) ~?¿*ÍU?lS?Í* TABLA 7 Experimento 5 - (péptidos formados in si tu) * 100µM GPG-NH2 + GKG-NH2 + CQG-NH2 *Valores que representan la densidad óptica (OD) TABLA 8 Experimento 6 - (péptidos formados in si tu) De los péptidos menores listados en la Tabla 1, GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2; KQG-NH2, ALG-NH2/ GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2/ y SPT-NH2 inhibieron y/o previnieron la infección por VIH-1 y GKG-NH2/ CQG-NH2, y GPG-NH2, mostraron también inhibir o prevenir la infección por VIH-2 y SIV. Debe entenderse que los péptidos menores RQG-NH2> KQG-NH2/ ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2/ y SPT-NH2 no se analizaron por su habilidad para prevenir o inhibir la infección por VIH-2 o SIV pero, dado el hecho de que el VIH-2 y el SIV comparten una homología similar en la estructura de proteína cápside en la región a la cual corresponden los péptidos menores GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2, se espera una inhibición o prevención de la infección por VIH-2 o SIV o ambos . Los resultados para los Experimentos 1-6 (mostrados en las Tablas 3-8 y la Figura 4) , demuestran que los péptidos menores en forma de amida que corresponden a la secuencia de proteína de cápside viral que tiene glicina como el aminoácido carboxiterminal , GPG-NH2/ GKG-NH2/ COG-NH2, RQG-NH2/ KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, y SLG-NH2, inhibieron o previnieron la infección por VIH. Los péptidos que contienen un residuo alanina carboxiterminal, Leu-Lys-Ala (LKA) e His-Lys-Ala (HKA) o un residuo glutamina carboxiterminal, Gly-Pro-Gln (GPQ) y Ala-Cys-Gln (ACQ) no previnieron la infección por VIH. La glicina en el término amino no fue un factor de inhibición, sin embargo, debido a que los péptidos con un residuo glicina de terminal amino, Gly-Pro-Gln (GPQ) , Gly-His-Lys (GHK) , y Gly-Ala-Thr (GAT) fallaron en la prevención de la infección y la formación sincitia. Además, los péptidos con otras cadenas laterales polares no cargadas tales como Gly-Pro-Gln (GPQ) , Ala-Cys-Gln (ACQ) , y Gly-Ala-Thr (GAT) o cadenas laterales no polares en el término carboxi tales como Ala-Arg-Val (ARV) , His-Lys-Ala (HKA) , y Lys-Ala-Leu (KAL) , y Leu-Lys-Ala (LKA) fallaron en la prevención de la infección. Aunque el residuo glicina en el témino carboxi parece estar asociado con la inhibición de la infección por VIH y SIV, otros residuos aminoácido o residuos aminoácidos modificados en el término carboxi de los péptidos menores pueden inhibir también la infección por VIH y SIV. Por ejemplo, se mostró que Ser-Pro-Thr (SPT) inhibió o previno la infección por VIH-1. En algunos experimentos, el efecto de los péptidos menores en la infección por VIH-1, VIH-2, y SIV dependió de la concentración y del tiempo. Las concentraciones de GKG-NH2/ CQG-NH2? GPG-NH2, y sus combinaciones, tan bajas como 5µM y 20µM fueron efectivas para reducir la infección por VIH-1, VIH-2 y SIV. A lOOµM o mayor, sin embargo, los tripéptidos GKG-NH2, CQG-NH2/ GPG-NH2 y sus combinaciones inhibieron de manera más eficiente la infección por VIH-1, VIH-2 y SIV. Como se muestra en la Tabla 7, 300µM de GKG-NH2 y CQG-NH2 redujeron la infectividad del VIH-1 por casi 100%, como se detectó mediante la presencia del antígeno p24 en los sobrenadantes celulares. La reducción porcentual tabulada en la Tabla 7 se calculó dividiendo la cantidad de antígeno p24 detectada en la muestra tratada con péptido entre la cantidad de antígeno p24 detectada en la muestra de control, mutltiplicando este dividendo por 100 para obtener un porcentaje, y sustrayendo el porcentaje dividendo por 100%.

Por ejemplo, la reducción porcentual exhibida por GPG-NH2 es: .6 x 102 x 100 = 3% Y 100%-3% = 97% 2.0 x 10 En los primeros experimentos (Tablas 3-7) se mostró que los tripéptidos GKG-NH2, CQG-NH2, GPG-NH2 y sus combinaciones, inhiben la infección por VIH-1, VIH-2 y SIV en concentraciones iguales o mayores que 5µM. En el sexto experimento (Tabla 8 y Figura 4) , se mostró que los péptidos menores RQG-NH2, KQG-NH, ALG-NH2, GVG-NH2; VGG-NH2/ ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2 inhiben efectivamente y/o previenen la infección por VIH-1 a lOOµM. Como se muestra en la Tabla 7, se logró una reducción cercana al 100% del virus, calculada mediante la cantidad de proteína de cápside p24 en el sobrenadante, con los péptidos menores RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, y SLG-NH2. La reducción porcentual de p24 mostrada en la Tabla 8 se calculó como se describe para la Tabla 7 anterior. Aunque GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, y SPT-NH2 fueron menos efectivos para inhibir o prevenir la infección por VIH-1 a lOOµM, se cree que los tripéptidos son más efectivos a concentraciones más altas. Los datos presentados en los experimentos 1-6, mostrados en las Tablas 3-8 y la Figura 4, demuestran que los péptidos menores que corresponden a las secuencias de una proteína de cápside viral son efectivos agentes antivirales sobre un amplio rango de concentraciones. En los experimentos anteriores, se ha demostrado que los péptidos menores modificados que tienen una secuencia que corresponde a las proteínas de cápside viral inhiben la infección viral (e.g., infección por VIH-1, VIH-2 y SIV) mediante la unión a la proteína de cápside viral, la prevención o inhibición de la polimerización de proteínas y, en consecuencia la interrupción de la concentración apropiada de la cápside y la infección viral . Los muchos ensayo antes detallados pueden utilizarse para identificar la habilidad de cualquier péptido menor, péptido menor modificado, oligopéptido, o peptidomimético para prevenir o inhibir la infección por VIH o SIV. Pueden utilizarse también técnicas similares para identificar la habilidad de cualquier péptido menor, péptido menor modificado, oligopéptido, o peptidomimético para prevenir o inhibir otras infecciones virales. Además, este grupo de experimentos proporciona otro ejemplo de agentes péptido que son inhibidores efectivos de las interacciones proteína-proteína necesarias para la polimerización de proteínas. Debido a que se conoce la secuencia de varias proteínas de cápside viral, el diseño, fabricación e identificación de los péptidos menores en la forma amida que previenen la polimerización apropiada de diferentes proteínas de cápside viral es directa. Por ejemplo, varias proteínas de cápside viral contienen una región 20 aminoácida de larga homología llamada la región de homología mayor (MHR) , que existe dentro del dominio carboxilo-terminal de muchos onco-y lentivirus. (Ver Figura 5). La Figura 5 muestra el dominio carboxilo-terminal de VIH-1 (residuos 146-231) y compara esta secuencia con las secuencias de proteína de cápside viral de otros virus, algunos de los cuales infectan aves, ratones y monos. Notablemente, se encuentra una homología considerable en las secuencias de estas proteínas de cápside viral. Los investigadores han observado que el dominio carboxilo-terminal se requiere para la dimerización de la cápside y la concentración viral en VIH-1. (Gamble et al., Science 278:849 (1997), incorporada aquí como referencia). Mientras que los péptidos menores que exhibieron actividad antiviral en los ensayo descritos en esta descripción corresponden total o parcialmente a las regiones del dominio carboxilo-terminal de VIH-1, CIH-2 y SIV, las regiones del dominio N-terminal de los virus importantes para la polimerización de la cápside y el diseño y la síntesis de los péptidos menores que corresponden total o parcialmente a los aminoácidos de la región N-terminal de las proteínas de cápside viral son modalidades deseables de la presente invención. El uso de los péptidos menores que corresponden total o parcialmente a los aminoácidos dentro de la región MHR y el dominio * A -d. , carboxilo-terminal de las proteínas de cápside viral, sin embargo, son modalidades preferidas de la presente invención. Al diseñar y elaborar péptidos menores, oligopéptidos, y/o peptidomiméticos que corresponden a las regiones de las secuencias descritas en la Figura 5, pueden identificarse rápidamente nuevas moléculas que inhiben la infección por VIH, SIV, RSV, HTLV-1, MMTV, MPMV y MMLV utilizando las técnicas de filtración arriba tratadas o las modificaciones de estos ensayo, como será aparente para el experto en la técnica. Además, se conocen muchas de las secuencias de otras proteínas de cápside viral, tales como los miembros de las familias arenavirus, rotavirus, orbivirus, retrovirus, papillomavirus, adenovirus, herpesvirus, paramixovirus, mixovirus, y hepadnavirus . Pueden seleccionarse varios péptidos menores, oligopéptidos, y/o peptidomiméticos que corresponden total o parcialmente a estas secuencias y filtrarse rápidamente para identificar aquellos que inhiben y/o previenen efectivamente la infección viral utilizando los ensayo de infectividad viral, el ensayo de unión de proteína de cápside viral, y las técnicas de microscopía electrónica aquí descritas, o las modificaciones de estos ensayo como será aparente para los expertos en la técnica dada la presente descripción. Las modalidades deseables son los agentes péptidos, que incluyen péptidos menores (de más de un aminoácido y ^M a^B^^ - - ' ' líifüi menos que o, iguales a 10 aminoácidos de longitud) que tienen un término carboxi modificado utilizados para interrumpir las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, y la concentración de complejos supramoleculares. De preferencia, se utilizan los dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos y los peptidomiméticos que tienen una secuencia que corresponde a una región de una proteína involucrada en una interacción proteína-proteína, el evento de polimerización de proteínas, o la concentración de complejos supramoleculares. Por ejemplo, un oligopéptido de la presente invención puede tener cuatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis aminoácidos, siete aminoácidos, ocho, o nueve o diez aminoácidos y los peptidomiméticos de la presente invención pueden tener estructuras semejantes a cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos. Los oligopéptidos deseables pueden incluir las secuencias totales o parciales encontradas en los tripéptidos GPG-NH2. GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2/ SLG-NH2, y SPT-NH2. Los peptidomiméticos que se asemejan a los dipéptidos, tripéptidos y también a los oligopéptidos, pueden corresponder a una secuencia que se encuentra en GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2/ KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2; SLG-NH2, y SPT-NH2. Se prefiere que los péptidos menores posean un grupo de modulación (e.g., un grupo amida) en su término carboxi (CO-NH2) en vez de un grupo carboxilo (COOH) . Los péptidos menores que tienen otros grupos de modulación en el término carboxi pueden utilizarse también pero deseablemente, los grupos de modulación incluidos tienen la misma carga y se comportan estéricamente de la misma manera que un grupo amida. (Ver, Patente de los E.U. No. 5,627,035 para Vahlne et al., para el ensayo para comparar péptidos que tienen sustituyentes que difieren en el término carboxilo) . Inesperadamente, el inventor ha descubierto que un grupo de modulación (e.g., un grupo amida o un sustituyente que se comporta química y estéricamente como un grupo amida) , permite que el agente péptido interactúe con la proteína de interés y, en consecuencia interrumpa las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, y la concentración de complejos supramoleculares. En la siguiente descripción, se proporcionan varios procedimientos para elaborar herramientas biotecnológicas y composiciones farmacéuticas que comprenden dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos de menos que, o iguales a 10 aminoácidos, y peptidomiméticos que se asemejan a los tripéptidos y oligopéptidos de menos que, o iguales a 10 aminoácidos (referidos colectivamente como "agente (s) péptido") . Debe notarse que el término "agentes péptido" incluye dipéptidos, tripéptidos y oligopéptidos de menos que o iguales a 10 aminoácidos. Los "agentes péptido" son, por ejemplo, péptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos y peptidomiméticos que se asemejan a los péptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos. Además los "agentes péptido" son péptidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos o peptidomiméticos que se asemejan a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez aminoácidos que se proporcionan como agentes multiméricos o multimerizados, como se describe a continuación. Las herramientas biotecnológicas o componentes deseables para los agentes profilácticos o terapéuticos, proporcionan el agente péptido de tal manera que se obtiene una afinidad o inhibición suficiente de una interacción proteína-proteína, un evento de polimerización de proteínas o la concentración de un complejo supramolecular. Mientras que un agente péptido monomérico natural (e.g., que aparece como unidades discretas del agente péptido que llevan cada una solo un epítope de unión) puede ser suficiente, los ligandos sintéticos o ligandos multiméricos (e.g., que aparecen como unidades múltiples del agente péptido con varios epítopes de unión) pueden tener una mayor capacidad para inhibir las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas y la concentración de complejos supramoleculares. Debe notarse que el término "multimérico" se refiere a la presencia de más de una unidad de un ligando, por ejemplo, varias moléculas individuales de un tripéptido, oligopéptido o un peptidomimético, distinguidos a partir del término "multimerizado" que se refiere a la presencia de más de un ligando unido como una sola unidad discreta, por ejemplo, varios tripéptidos, oligopéptidos o peptidomiméticos unidos en serie. Un agente multimérico (sintético o natural) puede obtenerse acoplando un agente péptido a un soporte macromolecular. Un "soporte" puede llamarse también a un portador, una resina o cualquier estructura macromolecular utilizada para atacar, inmovilizar, o estabilizar a un agente péptido. Los soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, las paredes de los depósitos de una bandeja de reacción, los tubos de ensayo, las cuentas de poliestireno, las cuentas magnéticas, las cintas de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como las partículas de látex, células sanguíneas rojas de oveja (u otro animal) , células artificiales y otros. Los soportes son también portadores como se entiende para la preparación de fármacos. El soporte macromolecular puede tener una superficie hidrófoba que interactúa con una porción del agente péptido mediante la interacción hidrófoba no-covalente. La superficie hidrófoba del soporte puede ser también un polímero tal como el plástico o cualquier otro polímero en el cual se hayan enlazado grupos hidrófobos tales como el poliestireno, polietileno o polivinilo. Alternativamente, el agente péptido puede estar enlazado de manera covalente a portadores incluyendo proteínas y oligopolisacaridas (e.g., celulosa, harina, glicógeno, citosano, o sefarosa aminada) . En estas últimas modalidades, puede utilizarse un grupo reactivo sobre el agente péptido, tal como un grupo hidroxi o amino, para unirse a un grupo reactivo sobre el portador a fin de crear el enlace covalente. El soporte puede tener también una superficie cargada que interacúa con el agente péptido. Adicionalmente, el soporte puede tener otros grupos reactivos que pueden activarse químicamente a fin de atacar a un agente péptido. Por ejemplo, las matrices activadas de bromuro cianógeno, las matrices activadas de epoxia, los geles de tio y tiopropilo, el cloroformato de nitrofenilo y los ligandos N-hidroxi de cloroformato de succinimida y los soportes acrílicos de oxirano son comunes en la técnica. El soporte puede comprender también un portador inorgánico tal como el material de óxido de silicona (e.g., gel de sílice, zeolita, tierra diatomácea o vidrio aminado) al cual se enlaza el agente péptido de manera covalente a través de un grupo hidroxi, carboxi o amino y un grupo reactivo sobre el portador. Además, en algunas modalidades, se contempla como soporte una capa doble de lípido (natural o sintético) y los agentes péptidos se unen a la superficie de la membrana o se incorporan dentro de la membrana mediante técnicas en ingeniería de liposomas. Mediante un procedimiento, los soportes multiméricos de liposomas comprenden un agente péptido que está expuesto a la capa doble y un segundo dominio que ancla al agente péptido a la capa doble de lípido. El anclado puede construirse de residuos hidrófobos de aminoácido que se asemejan a dominios transmembrana conocidos, o puede comprender ceramidas que se unen al primer dominio mediante técnicas convencionales. Los soportes o portadores para uso en el cuerpo, (i.e., para aplicaciones profilácticas o terapéuticas) son deseablemente fisiológicos, no-tóxicos y de preferencia no-inmunoresponsivos . Los portadores contemplados para el uso en el cuerpo incluyen poli-L-lisina, poli-D, L-alanina, liposomas, y Chromosorb* (Johns-Manvilie Products, Denver Co.). El Chromosorb* (Synsorb-Pk) ligando-conjugado se ha probado en humanos para la prevención del síndrome hemolítico-urémico y se reportó que no presenta reacciones adversas. (Armstrong et al., J. Infectious Disseases, 171:1042-1045 (1995)). Para algunas modalidades, el presente inventor contempla la administración de un portador "vacío" (i.e., que carece de un agente péptido unido) que tiene la capacidad de atacar a un agente péptido en el cuerpo de un sujeto. Mediante este procedimiento, se contempla una terapia "tipo-prodroga" en la cual el portador vacío se administra por separado del agente péptido y, una vez que ambos se encuentran en el cuerpo, el portador y el agente péptido se ensamblan en un complejo multimérico. La inserción de enlaces, tales como los enlaces ?, de una longitud apropiada entre el agente péptido y el soporte se contempla también a fin de promover una mayor flexibilidad del agente péptido y en consecuencia superar cualquier obstáculo estérico que pueda presentar el soporte. La determinación de una longitud apropiada del enlace puede determinarse filtrando los agentes péptido con enlaces variables en los ensayo detallados en la presente descripción. Un soporte compuesto que comprende más de un tipo de agente péptido es también una modalidad. Un "soporte compuesto" puede ser un portador, una resina, o cualquier estructura macromolecular utilizada para atacar o inmovilizar a dos o más diferentes agentes péptido que se unen a una proteína capsómera, tal como p24, y/o interfieren con una concentración de la cápside y/o inhiben la infección viral, tal como la infección por VIH o SIV. En algunas modalidades, se contempla un liposoma o capa doble de lípido (natural o sintética) para el uso en la construcción de un soporte compuesto y los agentes péptido se unen a la superficie de la membrana o se incorporan dentro de la membrana utilizando técnicas en ingeniería de liposomas. Como en lo anterior, la inserción de enlaces, tales como los enlaces ?, de una longitud apropiada entre el agente péptido y el soporte se contempla también a fin de promover una mayor flexibilidad en la molécula y en consecuencia superar cualquier obstáculo estérico que pueda ocurrir. La determinación de una longitud apropiada del enlace puede determinarse filtrando los ligandos con enlaces variables en los ensayo detallados en la presente descripción. En otras modalidades de la presente invención, los soportes multiméricos y compuestos antes tratados pueden tener ligandos multiméricos unidos a fin de crear un "soporte multimerizado-multimérico" y un "soporte muítimerizado-compuesto", respectivamente. Un ligando multimerizado puede obtenerse, por ejemplo, acoplando dos o más agentes péptido en serie utilizando las técnicas convencionales en biología molecular. La forma multimerizada del ligando puede ser ventajosa para muchas aplicaciones debido a la habilidad para obtener un agente con una mejor habilidad para unirse en una proteína capsómera, tal como la p24, y/o interferir con la concentración de la cápside y/o inhibir la infección viral, tal como la infección por VIH y SIV. Además, es una modalidad ventajosa la incorporación de enlaces como espaciadores, tales como los enlaces flexibles ?, entre los dominios individuales que conforman al agente multimerizado.

La inserción de enlaces ? de una longitud apropiada entre los dominios de unión de la proteína, por ejemplo, puede promover una mayor flexibilidad en la molécula y puede superar el obstáculo estérico. De manera similar, la inserción de enlaces entre el ligando multimerizado y el soporte puede promover una mayor flexibilidad y limitar el obstáculo estérico presentado por el soporte. La determinación de una longitud apropiada del enlace puede determinarse filtrando los ligandos con enlaces variables en los ensayo detallados en la presente descripción. En modalidades preferidas, los varios tipos de soportes arriba tratados se crean utilizando los tripéptidos modificados GPG-NH2/ GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2/ SLG-NH2, y SPT-NH2. Los soportes multiméricos, los soportes compuestos, los soportes multimerizados-multiméricos o los soportes multimerizados-compuestos referidos colectivamente como "agentes ligados por soporte", se construyen también de preferencia utilizando los tripéptidos GPG-NH2, GKG-NH2, CQG-NH2, RQG-NH2, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH2, ASG-NH2, SLG-NH2, y SPT-NH2. Son también modalidades varios métodos para elaborar y utilizar las composiciones aquí descritas. Mediante un procedimiento, los agentes péptido obtenidos mediante la tecnología PPI se incorporan en fármacos. Esto es, que los agentes péptido que se seleccionan, diseñan, fabrican e identifican por su habilidad para prevenir o inhibir las interacciones proteína-proteína, los eventos de polimerización de proteínas o la enfermedad (e.g., los agentes péptido identificados por su desempeño en los ensayo de caracterización de péptido) se incorporan en fármacos para su uso en el tratamiento de enfermedad humana. En algunos aspectos, la selección y el diseño se logran con la ayuda de un sistema de computadora. Los programas de búsqueda y los programas de recuperación, por ejemplo, se utilizan para accesar a una o más bases de datos para seleccionar y diseñar agentes péptido que inhiben las interacciones proteína-proteína, la polimerización de proteínas, o la concentración del complejo supramolecular. Adicionalmente, los procedimientos en el diseño racional de drogas, como se describió anteriormente, se utilizan para seleccionar y diseñar los agentes péptido. Una vez seleccionado y diseñado, el agente péptido se "obtiene" (e.g., fabricado o adquirido de una entidad comercial) . Enseguida, el agente péptido se filtra en ensayo de caracterización de péptido que miden la habilidad del agente péptido para unirse a una proteína de interés, interrumpir la polimerización de proteínas, y prevenir o tratar la enfermedad. Los agentes péptido se seleccionan entonces en base a su desempeño en tales ensayo de caracterización. Pueden crearse perfiles que tienen un símbolo que representa al agente péptido y uno o más símbolos que representan un desempeño sobre un ensayo de caracterización del péptido y estos perfiles pueden compararse para seleccionar un agente péptido apropiado para su incorporación en un fármaco o para la selección y diseño posterior de nuevos agentes péptido. Una vez caracterizados, los agentes péptido se incorporan en un fármaco de acuerdo a las técnicas convencionales. Los compuestos farmacológicamente activos pueden procesarse de acuerdo con los métodos convencionales de farmacia galénica para producir agentes medicinales para la administración a pacientes, e.g., mamíferos incluyendo humanos. Los agentes péptido pueden incorporarse en un producto farmacéutico con y sin modificación. Además, es una modalidad la fabricación de fármacos o agentes terapéuticos que suministran el agente péptido o una secuencia de ácido nucleico que codifica a un péptido menor mediante varias rutas. Por ejemplo, y no como limitación, los vectores de DNA, RNA y virales que tienen una secuencia que codifica a un péptido menor que interrumpe una interacción proteína-proteína, un evento de polimerización de proteínas, o la concentración del complejo supramolecular se encuentran dentro del alcance de los aspectos de la presente invención. Los ácidos nucleicos que codifican un agente péptido deseado pueden administrarse solos o en combinación con los agentes péptido.

Los agentes péptido pueden emplearse mezclados con excipientes convencionales, i.e., sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuados para la aplicación parenteral, enteral (e.g., oral) o tópica que no reaccionen de manera dañina con los agentes péptido. Los portadores adecuados farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes de bencilo, glicoles de polietileno, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o harina, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite perfumado, monoglicéridos de ácido graso y diglicéridos, esteres de ácido graso de pentaeritritol, metilcelulosa hidroxi, pirrolidona de polivinilo, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse y si se desea mezclarse con agentes auxiliares, e.g., lubricantes, preservativos, estabilizadores, agentes humidificantes, emulsificantes, sales para influenciar la presión osmótica, amortiguadores, sustancias colorantes, saborizantes y/o aromáticas y similares que no reaccionen de manera dañina con los compuestos activos. Pueden también combinarse si se desea con otros agentes activos, e.g., vitaminas. La dosis efectiva y el método de administración de una formulación particular del agente péptido puede variar en base al paciente individual y a la etapa de la enfermedad, —....aa?sfe«¿ferf así como a otros factores conocidos por los expertos en la técnica. La eficacia terapéutica y la toxicidad de tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, e.g., ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) . La proporción de la dosis de los efectos, tóxico a terapéutico se encuentra en el índice terapéutico, y puede expresarse como la proporción LD50/ED50. Las composiciones farmacéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos se prefieren. Los datos obtenidos a partir de los ensayo de cultivo celular y estudios animales se utilizan para formular un rango de dosis para el uso humano. La dosis de tales compuestos se encuentran de preferencia dentro de un rango de concentraciones circulatorias que incluyen al ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis varía dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración. La dosis exacta es elegida por el médico individualmente en vista al paciente a ser tratado. La dosis y la administración se ajustan para proporcionar los niveles suficientes del residuo activo o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que deben tenerse en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, la edad, el peso y género del paciente, la dieta, el tiempo y frecuencia de la administración, la(s) combinación (es) de droga, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción corta se administran diariamente mientras que las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se administran cada 2, 3 a 4 días, semanalmente, o una vez cada dos semanas. Dependiendo de la vida media y la proporción de liberación de la formulación particular, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más veces al día. Las cantidades normales de dosificación pueden variar desde aproximadamente 1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 10 gramos, dependiendo de la vía de administración. Las dosis deseables incluyen 250ug, 500ug, lmg, 50mg, lOOmg, 150mg, 200mg, 250mg, 300mg, 350mg, 400mg, 450mg, 500mg, 550mg, 600mg, 650mg, 700mg, 750mg, 800mg, 850mg, 900mg, lg, l.lg, 1.2g, 1.3g, 1.4g, 1.5g, 1.6g, 1.7g, 1.8g, 1.9g, 2g, 3g, 4g, 5g, 6g, 7g, 8g, 9g, y lOg. Adicionalmente, las concentraciones de los agentes péptido de la presente invención pueden ser bastante altas en modalidades que administran los agentes en forma tópica. Las concentraciones molares de agentes péptido pueden utilizarse con algunas modalidades. Las concentraciones deseables para la administración tópica y/o para recubrir equipo médico ...AUW fluctúan desde lOOµM hasta 800mM. Las concentraciones preferidas para estas modalidades fluctúan entre 500µM hasta 500mM. Por ejemplo, las concentraciones preferidas para el uso en aplicaciones tópicas y/o para recubrir equipo médico incluyen 500µM, 550µM, 600µM, 650µM, 700µM, 750µM, 800µM, 850µM, 900µM, lmM, 5mM, lOmM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 60mM, 70mM, 80mM, 90mM, lOOmM, 120mM, 130mM, 140mM, 150mM, 160mM, 170mM, 180mM, 190mM, 200mM, 300mM, 325mM, 350mM, 375mM, 400mM, 425mM, 450mM, 475mM, y 500mM. La guía en cuanto a la dosificación particular y los métodos de suministro se proporcionan en la literatura, (ver e.g., la Patentes de los E.U. Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212) y a continuación. Más específicamente, la dosificación de los agentes péptido de la presente invención es la que proporciona el agente péptido suficiente para lograr el efecto deseado. De acuerdo a esto, la dosis de las modalidades de la presente invención puede producir una concentración en tejido o sangre o en ambas desde aproximadamente 0. lµM hasta 500mM. La dosis deseable produce una concentración en tejido o sangre o en ambas de aproximadamente 1 a 800µM. La dosis preferida produce una concentración en tejido o sangre mayor que aproximadamente lOµM hasta aproximadamente 500µM. Las dosis preferidas son, por ejemplo, la cantidad de péptido menor requerida para lograr una concentración en tejido o sangre o en ambas de lOµM, 15µM, 20µM, 25µM, 30µM, 35µM, 40µM, 45µM, 50µM, 55µM, 60µM, 65µM, 70µM, 75µM, 80µM, 85µM, 90µM, 95µM, lOOµM, HOµM, 120µM, 130µM, 140µM, 145µM, 150µM, 160µM, 170µM, 180µM, 190µM, 200µM, 220µM, 240µM, 250µM, 260µM, 280µM, 300µM, 320µM, 340µM, 360µM, 380µM, 400µM, 420µM, 440µM, 460µM, 480µM, y 500µM. Aunque las dosis que producen una concentración en tejido de más de 800µM no son preferidas, pueden utilizarse con algunas modalidades de la presente invención. Puede proporcionarse también una infusión constante del péptido a fin de mantener una concentración estable en los tejidos calculada mediante los niveles en sangre. Las vías de administración de los agentes péptido incluyen pero sin limitarse a, tópica, transdérmica, parenteral, gastrointestinal, transbronquial, y transalveolar. La administración tópica se logra mediante una crema, gel, enjuague, etc. aplicado tópicamente que contiene un péptido. La administración transdérmica se logra mediante la aplicación de una crema, enjuague, gel, etc., capaz de permitir que el agente péptido penetre la piel y entre a la corriente sanguínea. Las vías de administración parenterales incluyen, pero sin limitarse a, inyección eléctrica o directa tal como la inyección directa dentro de una línea venosa central, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, o inyección subcutánea. Las vías de administración gastrointestinal incluyen, pero sin limitarse a, ingestión y rectal. Las vías de administración transbronquiales y transalveolares incluyen, pero sin limitarse a, inhalación, ya sea vía bucal o intranasal. Las composiciones de los compuestos que contienen agente péptido adecuadas para la aplicación tópica incluyen, pero sin limitarse a, implantes fisiológicamente aceptables, ungüentos, cremas, enjuagues y geles. Cualquier base líquida, en gel o sólida farmacéuticamente aceptable en la cual los péptidos sean cuando menos mínimamente solubles es adecuada para el uso tópico en la presente invención. Las composiciones para aplicación tópica son particularmente útiles durante el contacto sexual para prevenir la transmisión del VIH. Las composiciones adecuadas para tal uso incluyen, pero sin limitarse a supositorios vaginales o anales, cremas, y duchas. Las composiciones de los agentes péptido adecuados para la administración transdérmica incluyen, pero sin limitarse a, suspensiones farmacéuticamente aceptables, aceites, cremas y ungüentos aplicados directamente a la piel o incorporados en un portador protector tal como un dispositivo transdérmico ("parche transdérmico"). Los ejemplos adecuados de cremas, ungüentos, etc., pueden encontrarse, por ejemplo, en el Physician's Desk Reference. Los ejemplos adecuados de dispositivos transdérmicos se describen por ejemplo, en la Patente de los E.U. No. 4,818,540 expedida en Abril 4, 1989 para Chinen et al., incorporada aquí como referencia. Las composiciones de los agentes péptido adecuadas para la administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables. Tales soluciones incluyen, pero sin limitarse a, salina y salina de fosfato amortiguada para la inyección en una línea venosa central, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o inyección subcutánea de los agentes péptido. Las composiciones de los agentes péptido adecuadas para la administración transbronquial y transalveolar incluyen, pero sin limitarse a, varios tipos de aerosoles para inhalación. Por ejemplo, la pentamidina se administra de manera intranasal vía aerosol a los pacientes de SIDA para prevenir la pneumonía causada por pneumocystis carinii . Los dispositivos adecuados para la administración transbronquial y transalveolar de los péptidos son también modalidades. Tales dispositivos incluyen, pero sin limitarse a. atomizadores y vaporizadores. Muchas formas de atomizadores y vaporizadores actualmente disponibles pueden adaptarse fácilmente para suministrar agentes péptido. Las composiciones de los agentes péptido adecuadas para la administración gastrointestinal incluyen, pero sin limitarse a, polvos farmacéuticamente aceptables, pildoras o .~.-waa^....~ líquidos para ingestión y supositorios para administración rectal . Debido a las vías más comunes de la infección por VIH y a la facilidad de uso, la administración gastrointestinal, particularmente oral, es la modalidad preferida de la presente invención. Se han preparado cápsulas de quinientos miligramos que tienen un tripéptido (GPG-NH2) y se encontró que son estables durante un mínimo de 12 meses cuando se almacenan a 4°C. Como se mostró previamente en otros sistemas de virus-base, la actividad antiviral específica de los péptidos menores puede detectarse en el suero después de la administración oral. (Miller et al., Appl . Microbiol . 16:1489 (1968)). Los agentes péptido son también adecuados para su uso en situaciones en las que la prevención de la infección por VIH es importante. Por ejemplo, el personal médico está expuesto constantemente a pacientes que pueden ser VIH positivo y cuyas secreciones y fluidos corporales contienen el virus de VIH. Además, los agentes péptido pueden formularse en composiciones antivirales para su uso durante el contacto sexual a fin de prevenir la transmisión del VIH. Tales composiciones se conocen en la técnica y también se describen en la solicitud nacional publicada bajo el número de publicación PCT W090/04390 en Mayo 3, 1990 para Modak et al., que se incorpora aquí como referencia. Los aspectos de la invención incluyen también un ^^^0 . ._..___^aa? recubrimiento para el equipo médico tal como guantes, sábanas y superficies de trabajo que protege contra la transmisión de VIH. Alternativamente, los agentes péptido pueden impregnarse en un dispositivo médico polimérico. Son particularmente preferidos los recubrimientos para guantes y condones médicos. Los recubrimientos adecuados para el uso en dispositivos médicos pueden proporcionarse mediante un polvo que contiene los péptidos o mediante el recubrimiento polimérico dentro del cual se suspenden los agentes péptido. Los materiales poliméricos adecuados para recubrimientos son aquellos que son fisiológicamente aceptables y a través de los cuales puede difundirse una cantidad terapéuticamente efectiva del agente péptido. Los polímeros adecuados incluyen, pero sin limitarse a, poliuretano, polimetacrilato, poliamida, poliéster, polietileno, polipropileno, poliestireno, politetrafluoroetileno, cloruro de polivinilo, acetato de celulosa, elastómeros de silicona, colágeno, seda, etc. Tales recubrimientos se describen, por ejemplo, en la Patente de los E.U. No. 4,612,337, expedida en Septiembre 16, 1986 para Fox et al., que se incorpora aquí como referencia. Los agentes péptido monoméricos y multiméricos son adecuados para el tratamiento de sujetos ya sea como una medida preventiva o como un terapéutico para tratar sujetos ya afectados con la enfermedad. De este modo, los métodos de tratamiento de la enfermedad humana son modalidades de la ^fa ^^ g^jg& invención. Aunque cualquiera podría ser tratado con los péptidos como un profiláctico, los sujetos más adecuados son personas en riesgo para contraer una enfermedad en particular. En muchos métodos de la invención, por ejemplo, se identifica primero a un individuo en riesgo. Los individuos que sufren de una enfermedad relacionada al NFkB (e.g., enfermedad inflamatoria o desorden inmune) pueden identificarse en base a los niveles de expresión de un producto de gen asociado con este activador transcripcional . Los individuos que tienen una sobreexpresión de citocina, por ejemplo, pueden identificarse mediante un diagnóstico en base a proteína o en base a RNA. Una vez identificado, se administra al individuo una dosis terapéuticamente efectiva de un agente péptido que inhibe la dimerización del NFkB. De manera similar, los individuos que sobreexpresan el IkB pueden tratarse. De acuerdo a esto, los individuos se identifican mediante un diagnóstico en base a proteína o en base a RNA y una vez identificado, se administra al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente péptido que rompe la formación del complejo NFkB/lkB. Además, los individuos que sufren de los efectos tóxicos de una toxina bacterial pueden tratarse. Aunque los agentes péptido pueden administrarse a cualquiera, como preventivos, para aminorar los efectos tóxicos de una toxina bacterial, de preferencia se identifica a individuos o personas en riesgo de infección bacterial. Se conocen en la técnica muchas pruebas diagnósticas que pueden hacer esta determinación. Una vez identificado, se administra al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente péptido que interrumpe la formación de una holotoxina bacterial . Las modalidades adicionales incluyen métodos de tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer y scrapie. Aunque muchas personas pueden estar en riesgo de contraer estas enfermedades y pueden identificarse en esta base, los individuos que tienen una historia familiar o una marca genética asociada con la enfermedad de Alzheimer o que han probado positivo por la presencia de la proteína prion-relacionada se identifican de preferencia como pacientes en riesgo. Se han reportado varios procedimientos diagnósticos para identificar personas en riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. (Ver, e.g., las Pats. de los E.U. Nos. 5,744,368; 5,837,853; y 5,571,671). Estos procedimientos pueden utilizarse para identificar a un paciente en riesgo de desarrollar Alzheimer o pueden emplearse otras conocidas por los expertos en la técnica. Una vez identificado, se administra al individuo afectado con la enfermedad de Alzheimer o a un paciente en riesgo de tener la enfermedad de Alzheimer una cantidad terapéuticamente segura y efectiva de un agente péptido que se selecciona, diseña, fabrica y caracteriza mediante los procedimientos antes detallados (referidas colectivamente como "tecnología PPI"). De manera similar, cuando se ha identificado a una persona que tiene la evidencia de una proteína prion-relacionada, se utiliza la tecnología PPI para generar un fármaco que se administra al sujeto que lo necesita a fin de tratar la condición. Una modalidad adicional de la invención es un método de tratamiento o prevención del cáncer en el cual se identifica a un paciente afectado con cáncer o a un paciente en riesgo de tener cáncer y entonces se le administra una cantidad terapéuticamente segura y efectiva de un agente péptido obtenido mediante la tecnología PPI . Este método puede utilizarse para tratar o prevenir muchas formas de cáncer asociadas con la polimerización de tubulina incluyendo, pero sin limitarse a, leucemia, cáncer de próstata, y cáncer de colon. Aunque, en algunos contextos, todos se encuentran en riesgo de desarrollar cáncer y en consecuencia se identifican como individuos que necesitan el tratamiento, los individuos deseables con una historia médica o una historia familiar se identifican para el tratamiento. Se encuentran disponibles varios procedimientos diagnósticos para determinar si una persona está en riesgo de desarrollar las diferentes formas de cáncer. Por ejemplo, la Pat. de los E.U. No. 5,891,857 proporciona procedimientos para diagnosticar cáncer mamario, ovárico, del colon y pulmonar en base a la detección de BRCA1, la Pat de los E.U. No. 5,888,751 proporciona un procedimiento general para detectar la transformación celular detectando el marcador SCP-1, la Pat. de los E.U. No. 5,891,651 proporciona procedimientos para detectar la neoplasia colorrectal recuperando las células colorrectales epiteliales o sus fragmentos a partir de brotes, la Pat de los E.U. No. 5,902,725 proporciona procedimientos para detectar el cáncer de próstata analizando la presencia de un antígeno de próstata específico que se ha ligado a una oligosacarida que es triantenaria, y la Pat de los E.U. No. 5,916,751 proporciona procedimientos para diagnosticar el adenocarcinoma mucoso del colon o los ovarios, o un adenocarcinoma del testis detectando la presencia del gen TGFB-4. Se conocen muchas más filtraciones de base genética y de base sanguínea. Además, se proporcionan los métodos de tratamiento de enfermedad viral. De acuerdo a esto, se identifica a un individuo afectado y después se le administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente péptido que interrumpe la concentración de la cápside viral y, de este modo, la infección viral. Los individuos que tienen infección viral o aquellos en riesgo de infección viral se identifican de preferencia como sujetos que lo necesitan.

Adicionalmente, en algunas modalidades, los agentes péptido se administran en conjunción con otras terapias convencionales para el tratamiento de la enfermedad humana. Mediante un procedimiento, los agentes péptido se administran en conjunción con una terapia citorreductiva (e.g., resecamiento quirúrgico del tumor) a fin de lograr una mejor respuesta tumoral en el paciente que la que se presentaría mediante solo el resecamiento quirúrgico. En otra modalidad, los agentes péptido se administran en conjunción con terapia de radiación a fin de lograr una mejor respuesta tumoral en el paciente que la que se presentaría mediante solo la radiación. Además, los agentes péptido pueden administrarse en conjunción con agentes quimioterapéuticos. Adicionalmente, los agentes péptido pueden administrarse en conjunción con radioinmunoterapia a fin de tratar el cáncer más efectivamente de lo que ocurriría solo mediante el tratamiento con radioinmunoterapia. Aún adicionalmente, los agentes péptido de la invención pueden administrarse en conjunción con agentes antivirales, o agentes utilizados para tratar la enfermedad de Alzheimer. En algunas modalidades preferidas, los agentes terapéuticos que comprenden los agentes péptido se administran en conjunción con otros agentes terapéuticos que tratan infecciones virales, tales como la infección por VIH, a fin de lograr una mejor respuesta viral. En el presente, se encuentran en uso cuatro diferentes clases de drogas en el tratamiento antiviral de la infección por VIH-1 en humanos. Estas son (i) inhibidores nucleósidos análogos de transcriptasa de reversa (NRTIs) , tales como zidovidina, lamivudina, stavudina, didanosina, abacavir y zalcitabina; (ii) inhibidores nucleótidos análogos de transcriptasa de reversa, tales como adetovir, y pivaxir; (iii) inhibidores no-nucleósidos de transcriptasa de reversa (NNNRTIs) , tales como efavirenz, nevirapina y delavirdina; y (iv) inhibidores de proteasa, tales como indinavir, naltinavir, ritonavir, saquinavir, y amprenavir. Utilizando simultáneamente dos, tres o cuatro clases diferentes de drogas en conjunción con la administración de los agentes péptido de la presente invención, es menos probable que el VIH-1 desarrolle resistencia, debido a que es menos probable que las múltiples mutaciones superen las diferentes clases de drogas y los agentes péptido aparecerán en la misma partícula del virus. Es entonces una modalidad preferida de la presente invención que los agentes péptido se proporcionen en combinación con inhibidores nucleósidos análogos de transcriptasa de reversa, inhibidores nucleótidos análogos de transcriptasa de reversa, inhibidores no-nucleósidos de transcriptasa de reversa e inhibidores de proteasa en dosis y mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los medicamentos que comprenden los agentes péptido de la presente invención y los inhibidores nucleósidos análogos de transcriptasa de reversa, inhibidores nucleótidos análogos de transcriptasa de reversa, inhibidores no-nucleósidos de transcriptasa de reversa e inhibidores de proteasa son también modalidades de la presente invención. Aunque la invención se ha descrito con referencia a modalidades y ejemplos, deberá entenderse que pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. De acuerdo a esto, la invención se limita solo mediante las siguientes reivindicaciones. Todas las referencias aquí citadas se incorporan aquí expresamente como referencia.

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición para inhibir la activación transcripcional, que comprende una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 y en donde dicha composición inhibe la activación transcripcional interrumpiendo la dimerización de un activador transcripcional.
2. 2. Una composición para inhibir la represión transcripcional, que comprende una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2, X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 y en donde dicha composición inhibe la represión transcripcional interrumpiendo la asociación de un represor transcripcional con un activador transcripcional.
3. 3. Una composición para inhibir la concentración de una holotoxina bacterial, que comprende una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 y en donde dicha composición inhibe la concentración de una holotoxina bacterial evitando la asociación de una subunidad de proteína de toxina en un complejo proteínico.
4. 4. Una composición para inhibir la polimerización de actina, que comprende una cantidad efectiva de un péptido . . ...-.•aa&=aA& en forma de amida que tiene la fórmula X;L,X2,X3-NH2, en donde Xi X2/ y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 y en donde dicha composición inhibe la polimerización de actina evitando la asociación de una subunidad de actina en un complejo proteínico.
5. 5. Una composición para inhibir la agregación de un péptido ß-amiloide, que comprende una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 y en donde dicha composición inhibe la agregación de un péptido ß-amiloide evitando la asociación de una subunidad ß-amiloide en un complejo proteínico .
6. 6. Una composición para inhibir la concentración de un complejo de tubulina, que comprende una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 y en donde dicha composición inhibe la concentración de un complejo de tubulina evitando la asociación de una subunidad de tubulina en un complejo proteínico.
7. 7. Un método para inhibir la activación transcripcional, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
8. 8. Un método para inhibir la represión transcripcional, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula XX,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
9. 9. Un método para inhibir la concentración de una holotoxina bacterial, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde XX,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
10. 10. Un método para inhibir la polimerización de actina, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
11. 11. Un método para inhibir la agregación del péptido ß-amiloide, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
12. 12. Un método para inhibir la polimerización de tubulina, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula XX,X2,X3- AA^^^a^ NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
13. 13. Un método para tratar y prevenir una enfermedad inflamatoria, que comprende: identificar a un individuo que sobreexpresa NFKB O se encuentra en riesgo de sobreexpresar NFKB; y administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
14. 14. Un método para tratar y prevenir una enfermedad humana, que comprende: identificar a un individuo que sobreexpresa NFKB o se encuentra en riesgo de sobreexpresar NFKB; y administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
15. 15. Un método para tratar y prevenir una enfermedad humana, que comprende: identificar a un individuo que sobreexpresa I?B o se encuentra en riesgo de sobreexpresar I?B; y administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
16. 16. Un método para tratar y prevenir la enfermedad de Alzheimer, que comprende: identificar a un individuo que tiene la enfermedad de Alzheimer o se encuentra en riesgo de contraer la enfermedad de Alzheimer; y administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X , y X3 son cualquier aminoácido.
17. 17. Un método para tratar y prevenir un cáncer, que comprende : identificar a un individuo que tiene un cáncer o se encuentra en riesgo de contraer cáncer; y administrar a dicho individuo una cantidad efectiva de un péptido en forma de amida que tiene la fórmula X?,X2,X3-NH2, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido.
18. 18. Un método para elaborar un fármaco que comprende : (a) seleccionar una amida tripéptido que corresponde a una región de una proteína involucrada en una interacción proteína-proteína; (b) obtener la amida tripéptido seleccionada en la etapa (a) ,- (c) determinar si la amida tripéptido obtenida en la etapa (b) se une a dicha proteína; e (d) incorporar la amida tripéptido de la etapa (c) que se une a dicha proteína en un fármaco.
19. 19. El método de la reivindicación 18, en donde la amida tripéptido consiste de la fórmula X?,X ,X3-NH2, en donde Xi/X2 y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2.
20. 20. El método de la reivindicación 19, en donde la etapa de determinación comprende un ensayo de caracterización de péptido.
21. 21. Una composición para inhibir la activación transcripcional, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula XX,X2,X3-R, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene una carga y volumen estérico similar y en donde dicha composición inhibe la activación transcripcional interrumpiendo la dimerización de un activador transcripcional.
22. 22. Una composición para inhibir la represión transcripcional, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X?,X2,X3-R, en donde X ,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene una carga y volumen estérico similar y en donde dicha composición inhibe la represión transcripcional interrumpiendo la asociación de un represor transcripcional con un activador transcripcional.
23. 23. Una composición para inhibir la concentración de una holotoxina bacterial, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X?,X2,X3-R, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene una carga y volumen estérico similar y en donde dicha composición inhibe la concentración de una holotoxina bacterial evitando la asociación de una subunidad de proteína de toxina en un complejo proteínico.
24. 24. Una composición para inhibir la polimerización de actina, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X1,X2,X3-R, en donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene una carga y volumen estérico similar y en donde dicha composición inhibe la polimerización de actina evitando la asociación de una subunidad de actina en un complejo proteínico.
25. 25. Una composición para inhibir la agregación de un péptido ß-amiloide, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X!,X2,X3-R, en donde XX,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly- NH2 en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene una carga y volumen estérico similar y en donde dicha composición inhibe la agregación de 5 un péptido ß-amiloide evitando la asociación de una subunidad ß-amiloide en un complejo proteínico.
26. 26. Una composición para inhibir la concentración de un complejo de tubulina, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X?,X2,X3-R, en 10 donde X?,X2, y X3 son cualquier aminoácido y dicho péptido no es Gly-Pro-Gly-NH2 en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene una carga y volumen estérico similar y en donde dicha composición inhibe la 15 concentración de un complejo de tubulina evitando la asociación de una subunidad de tubulina en un complejo proteínico .
27. 27. La composición de la reivindicación 21, 22, 23, 24, 25, o 26 en donde el péptido tiene la fórmula X4,X5,X6 20 X7,X8,X9X10,X?,X2 X3-R en donde X4,X5,X6,X7,X8,X9 y Xio son cualquier aminoácido y en donde cualquiera de los uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos está ausente, en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida o otro 25 residuo que tiene carga y volumen estérico similar.
28. 28. Un método para inhibir la activación transcripcional, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido de la reivindicación 21 o 27.
29. 29. Un método para inhibir la represión transcripcional, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido de la reivindicación 22 o 27.
30. 30. Un método para inhibir la concentración de una holotoxina bacterial, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido de la reivindicación 23 o 27.
31. 31. Un método para inhibir la polimerización de actina, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido de la reivindicación 24 o 27.
32. 32. Un método para inhibir la agregación del péptido ß-amiloide, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido de la reivindicación 25 o 27.
33. 33. Un método para inhibir la polimerización de tubulina, que comprende: proporcionar una célula con una cantidad efectiva de un péptido de la reivindicación 26 o 27.
34. 34. Un fármaco que comprende una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de la composición de la reivindicación 27.
35. 35. Un método para tratar una enfermedad humana que comprende : identificar a un individuo que necesita un agente que inhiba una interacción proteína-proteína; y administrar a dicho individuo un fármaco que comprenda una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 27.
36. 36. Un fármaco que comprende una cantidad efectiva de un péptido que tiene la fórmula X4,X5,X6 X7, X8,X9X?o,Xi/ X2 X3- R donde X4,X5,X6 X7,X8,X9 y Xio son cualquier aminoácido y en donde cualquiera de los uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos está ausente, en donde R es un grupo de modulación unido a la terminación carboxi de dicho péptido y R comprende un grupo amida u otro residuo que tiene carga y volumen estérico similar. -» t i a 4