MXPA01013242A - Inhibidores del crecimiento de celulas epiteliales. - Google Patents

Inhibidores del crecimiento de celulas epiteliales.

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Abstract

La presente invencion se refiere a inhibidores del la crecimiento de las celulas epiteliales diferencialmente expresadas en celulas epiteliales cancerosas y normales. Las proteinas ICCE y la secuencia de acido nucleico que las codifican son empleadas en la diagnosis y tratamiento de canceres de celulas epiteliales, por ejemplo, prostata, ovario, cancer de colon y similares.

Description

INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS EPITELIALES Campo de la Invención Esta invención se refiere a una familia de inhibidores del crecimiento de las células epiteliales empleados en la diagnosis y tratamiento de los cánceres de células epiteliales.
Antecedentes de la Invención Los cánceres de células epiteliales, por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de los bazos, cáncer testicular, cáncer del timo, etc., son padecimientos caracterizados por el crecimiento acelerado, anormal de las células epiteliales. Este crecimiento acelerado micialmente causa que se forme un tumor. Eventualmente, también puede ocurrir la metástasis a diferentes sitios de órganos. Aunque el progreso se ha hecho en la diagnosis y tratamiento de varios cánceres, estos padecimientos todavía resultan en mortalidad significante. El tratamiento del cáncer es mayormente mejorado por la detección temprana. Sin embargo, hay dificultades en la detección del padecimiento en sus etapas tempranas. Por REF.: 135242 ejemplo, los órganos que contienen tejido epitelial tales como la próstata, ovario y otros, no son fácilmente palpados. La detección del crecimiento anormal del tumor en tales <^ órganos es difícil sin selección y marcadores apropiados 5 frecuentes. Una desventaja substancial de los ensayos de diagnostico del cáncer disponibles, es una alta relación de resultados positivos y negativos falsos, haciendo a las pruebas disponibles menos confiables que las deseadas. Por esta razón, hay una gran necesidad para identificar nuevos 10 diagnósticos, así como también nuevos agentes terapéuticos *w para mejorar la diagnosis y tratamiento del cáncer, por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de los bazos, cáncer testicular, cáncer del timo, etc. 15 Un nuevo inhibidor del crecimiento de las células mamarias, específicas, Ma astatina, ha sido recientemente identificado y caracterizado. La mamastatina se ha expresado a partir de varios clones, MammA (PCT/US97/18026, ATCC # 97451, depositado el 22 de Febrero de 1996); MammB 20 (PCT/US97/27147, ATCC # , depositado el 15 de Junio de 2000) ; y MammC, descrito en la solicitud PCT copendiente No. PCT/US00/ , presentada en fecha aún junto con esta (ATCC # , depositada el 15 de Junio de 2000) .
LáAA^.j. | ^«in^-j—H La mamastatina es producida y secretada por las células mamarias normales, y se detecta en muestras sanguíneas de individuos normales. Las concentraciones de A sangre del inhibidor del crecimiento de las células mamarias, 5 y particularmente de la forma fosforilada, activa de Mamastatina, se reducen o son ausentes en pacientes con cáncer de mama. La administración de la proteína comprende Mamastatina activa (secretada de las células de cáncer de mama humano normal) , es efectiva para reducir el tamaño y ?^ 10 número del tumor, y para prevenir el crecimiento del tumor en pacientes con cáncer en etapa tardía. Los inhibidores del crecimiento de las células epiteliales que tienen similitud a la Mamastatina, ahora se han descubierto, aislado y caracterizado. Estos inhibidores 15 portan la identidad de secuencia parcial a la Mamastatina al extremo 5' de la secuencia, y tiene poca o ninguna identidad ^ al extremo 3' de la molécula. Como la mamastatina, la familia recientemente descubierta de los inhibidores del crecimiento de las células epiteliales (ICCE) son diferencialmente 20 expresadas en tejidos normales de células epiteliales, pero no en tejidos cancerosos de células epiteliales. También, como la Mamastatina, la familia recientemente descubierta de inhibidores del crecimiento de las células epiteliales, son detectadas en las muestras de sangre tomadas de individuos normales, pero no en la sangre de pacientes con cánceres de células epiteliales, como se muestra en los Ejemplos abajo. • 5 Sumario de la Invención Una familia de inhibidores del crecimiento de las células epiteliales (ICCE) , han sido ahora identificados en un número de diferentes células epiteliales. Estos ICCE son diferencialmente expresados en células epiteliales normales, 10 peor no en las células cancerígenas epiteliales. Como se • muestra en los Ejemplos abajo, las proteínas de ICCE como la Mamastatina, se han descubierto en una variedad de tejidos de células epiteliales, incluyendo próstata, colon, ovario, pulmón, bazo, testículos, timo y otros. 15 Los ICCE de la invención, se han expresado en células epiteliales normales, peor no en células epiteliales cancerígenas. Las proteínas de ICCE como la Mamastatina, son codificadas por secuencias de ácido nucleico que hibridizan a las secuencias de ácido nucleico que codifican a la 20 Maraastatina. Las proteínas de ICCE también se enlazan a los anticuerpos anti-Mamastatina. Una secuencia de ácido nucleico que codifica a los ICCE en células de próstata (PRT-6, SEC ID NO: ) se ha aislado y caracterizado (PRT-6, ATCC# , «gtf¡ depositada el 15 de Junio de 2000), como se describe en los Ejemplos abajo. Debido a que los ICCE de la invención son diferentemente expresados por las células epiteliales normales y no por células epiteliales cancerosas, la presencia o cantidad de los ICCE puede ser analizada para diagnosticar cáncer y/o para monitorear el tratamiento. Las proteínas de los ICCE inventivos y los ácidos nucleicos que los codifican, también proporcionan agentes terapéuticos útiles para inhibir del crecimiento de las células epiteliales, prevenir la formación del tumor, y tratar el cáncer.
Breve Descripción de las Figuras La Figura ÍA es un diagrama esquemático de un panel de prueba de ARNm que muestra las ubicaciones de ARNms de tejido específico para análisis. La Figura IB es una imagen explorada por computadora de un manchado Northern que muestra la hibridación de la secuencia de ácido nucleico de Mamastatina a ARNm a partir de una variedad de tejidos de conformidad con el plano mostrado en la Figura ÍA. La Figura 2 es una imagen explorada por computadora de un ensayo de manchado dot que presenta las muestras de suero, proteína estándar de Mamastatina, de control, de pacientes con cáncer de mama, y medio acondicionado a partir de células de próstata humana cancerosa sometidas a sondas con anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6. La Figura 3 es una imagen explorada por computadora de un ensayo de Manchado Western, que muestra el lisado de células mamarias humanas normales (A) , lisado de células LnCap de cáncer de próstata humana (B) , lisado de células de cáncer de mama MCF7 (C) , y lisado de células de próstata humana normales (D) sometidas a sondas con anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6. La Figura 4 es una imagen explorada por computadora de un ensayo de Manchado Western, que muestra usados celulares a partir de células normales de próstata (A) , células de cáncer de próstata LnCap (B) , células normales de colon (C) , y células de cáncer de colon (D) sometidas a sondas con anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6. La Figura 5 es una imagen explorada por computadora de un ensayo de manchado Western, que muestra los usados celulares a partir de células cancerígenas de ovario humano (B) , células normales de ovario humano (C) , y células normales mamarias de humanos (D) sometidas a sondas con anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6. La línea A contiene pesos moleculares estándares. La Figura 6 es una imagen explorada por computadora jflfc de un ensayo de manchado dot que muestra muestras de suero a 5 partir de adultos machos saludables (A, C,D), y de un paciente con cáncer de próstata (B) , sometidas a sondas con anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6. La Figura 7 es una imagen explorada por computadora de un gel de ADN que contiene clones putativos de ADN de FCCE 10 de próstata. La Figura 8 es una representación diagramática del ICCE de Próstata y su relación estructural con otras secuencias . 15 Descripción Detallada de la Invención Proteínas de la Invención: Las * Proteínas inhibidoras del crecimiento de las células epiteliales (ICCE)" de la invención, están definidas 20 aquí por significar proteínas como la Mamastatina producidas por y activas para inhibir el crecimiento de células epiteliales normales. Las proteínas ICCE inhibitorias, activas de la invención, están reducidas o ausentes en las *.A..*l*tí~*l ,,k.-t.t,M^lkák^^^^^Z,ti^í^ ^k.^^^^^ AAA-Í . i i ! células epiteliales cancerosas. La familia de proteínas del ICCE descritos aquí, parecen incluir inhibidores que son específicos a cada tejido epitelial, con poca o ninguna actividad inhibitoria a través de los tipos de tejidos. Como se discute más completamente abajo, se postula que cada proteína del ICCE contiene un dominio inhibitorio del crecimiento y un dominio de especificidad del tejido. Las proteínas ICCE de la invención, presentan homología significante a la Mamastatina, un inhibidor del crecimiento de las células mamarias producidos por células mamarias humanas normales, y previamente demuestran ser útiles en la diagnosis y tratamiento del cáncer de mama (PCT/US97/18026) . Las proteínas ICCE enlazan uno o más anticuerpos anti-Mamastatina tales como 7G6 (Neomarcadores, Freemont, CA) , y son codificados por secuencias de ácido nucleico que portan homología significante con las secuencias de ácido nucleico que codifican a la Mamastatina. Estudios reportados en los Ejemplos abajo demuestran la expresión diferencial de las proteínas ICCE en tejidos de células epiteliales normales, pero no en tejidos de células epiteliales cancerosas, incluyendo mama, próstata, ovario y colon. Como la mastatina, las proteínas ICCE de la invención aparecen por ejemplo, en manchados Western, como bandas dobles o triples, con una banda mayor y una o dos bandas más pequeñas menos prominentes. Este patrón de expresión se demostró por la Mamastatina por ser debido a la fosforilación de la proteína. La mamastatina tiene un peso molecular aproximado de 53 kilodatons, cuando se fosforilan a dos sitios. La mamastatina de tamaño más pequeño, 49 y 44 kilodaltons, corresponde a uno o ninguno de los sitios que son fosforilados. La fosforilación de la proteína Mamastatina está correlacionada con su actividad inhibitoria. Los manchados Western de ICCE sometidos a sondas con el anticuerpo anti-Mamastatina 7G6, demuestran el tamaño aproximado de ICCE producido por varios tejidos de células epiteliales. Como se muestra más completamente en los Ejemplos abajo (véase, por ejemplo, Figura 4-5), el ICCE a partir de células de próstata, migra en un manchado Western a aproximadamente 55 kilodaltons, con bandas más pequeñas, menos prominentes a 51 y 46 kilodaltons sugestivos de las formas fosforiladas similares a los patrones vistos para la Mamastatina. Los ICCE a partir de las células de colon migran a aproximadamente 50 kD, con bandas menos prominentes a aproximadamente 47 y 43 kilodaltons. Los ICCE a partir de células de ovario migran a aproximadamente 60 kilodaltons.
Secuencias de Ácido Nucleico que Codifican al ICCE Las secuencias de ácido nucleico de la invención están definidas aquí como aquellas secuencias de ácido nucleico que codifican a proteínas ICCE, como se definen anteriormente. Las secuencias de ácido nucleico que codifican a las proteínas ICCE portan homología de secuencia significante a las secuencias de ácido nucleico que codifican a la Mamastatina, e hibridizan a las secuencias de ácido nucleico que codifican a la Mamastatina bajo condiciones de alta rigurosidad. Los inhibidores del crecimiento de las células epiteliales como la Mamastatina, preferiblemente tienen identidad substancial (al menos 90%, y preferiblemente al menos 95% de identidad) sobre aproximadamente 1000 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácido nucleico que codifica a la Mamastatina. Los ácidos nucleicos que codifican a la Mamastatina incluyen aquellos insertos de ADN de MammA (PCT/US97/18026, ATCC#97451, depositado el 22 de Febrero de 1996); MammB (PCT/US97/27147, ATCC # , depositado el 15 de Junio de 2000) ; y MammC, descrito aquí (ATCC # , depositado el 15 de Junio de 2000) . Las secuencias consenso determinadas para clones de Mamastatina conocidos, se muestran en la Tabla 5 de Secuencia Comparativa abajo, y como SEC ID N0:1 (MammA) ; SEC ID N0:2 (MammB) ; SEC ID N0:3 (MairtmC) . La secuencia de ácido nucleico ICCE de próstata (SEC ID NO: 4) está mostrada en las Tablas 1, 2 y 5. Los ICCE pueden ser amplificados a partir de una biblioteca de ácido nucleico de células epiteliales específicas, por ejemplo, usando cebadores internos de Mamastatina y/o hibridación a la Mamastatina bajo condiciones de estricta rigurosidad. Como se muestra más completamente en los Ejemplos abajo, las secuencias de ácido nucleico que hibridizan a la Mamastatina han sido demostradas en numerosos tejidos epiteliales, incluyendo sistema nervioso central, corazón, intestino delgado, intestino grueso, apéndice, recto, células linfáticas, células de la médula ósea, pulmón y vías respiratorias, vejiga, útero, próstata, testículos, ovario, hígado, páncreas, glándula adrenal, glándula salival y glándula mamaria (Véase Figura 1) . La secuencia de ácido nucleico de un ICCE aislado a partir de células de próstata, por ejemplo, porta más del 95% de identidad a la Mamastatina a la mitad 5' de la molécula, con poca o ninguna identidad de secuencia sin embargo, a la mitad 3'. Se postula que el extremo 5', que porta identidad con la Mamastatma, incluye dominio inhibitorio del crecimiento de la molécula, mientras el extremo 3' que tiene H|j^j >||*| i t sásráJSá ? ?.. poca identidad a la Mamastatina, incluye un dominio de especificidad de tejido.
Métodos de Diagnóstico 5 La invención además proporciona un ensayo in vi tro para detectar ICCE inhibitorios, activos, en muestras de pacientes que incluyen tejidos, células y fluidos. El cáncer de células epiteliales y avance de la enfermedad metastática es diagnosticado por correlación de la presencia y tipo de 10 proteína ICCE en una muestra de paciente con aquella de • células epiteliales humanas cancerosas o normales. Una muestra de tejido o sangre del paciente es analizada por la proteína ICCE, por ejemplo, por la abundancia de la proteína ICCE y/o por sus formas de pesos moleculares. Como se discute 15 abajo, la ausencia o pérdida de la proteína ICCE, particularmente del peso molecular superior, formas ^ fosforiladas, están correlacionadas con una célula epitelial específica indicativa del avance del padecimiento metastático. 20 El análisis del ICCE puede realizarse usando una variedad de herramientas analíticas conocidas y métodos, que incluyen inmunoensayos, hibridación, técnicas de PCR, y similares. Los métodos de inmunoensayos preferidos son, latíameÍA^^^ incluyendo ELISA, Manchado Western, y análisis de manchado dot de una muestra de paciente, usando anticuerpos anti-ICCE. Preferiblemente, los estándares de ICCE recombinantes, son usados para proporcionar una curva estándar para cuantificación confiable de los niveles inhibidores. Tales inmunoensayos son ejemplificados por los ensayos de manchado dot y ensayos de manchado Western mostrados en los ejemplos abajo. En una modalidad preferida alternativa de la invención, las muestras de tejido, tales como biopsias del tumor, son analizadas por inmunohistoquímica, o por cultivación de las células de tumor del paciente y examinación de los cultivos por la expresión del ICCE. En una modalidad particularmente preferida, un ensayo para la diagnosis de un cáncer de células epiteliales incluye, al menos dos anticuerpos específicos: un anticuerpo para identificar el tejido sometido a muestra como tejido epitelial, tal como un anticuerpo anti-citoqueratina, y un anticuerpo anti-ICCE específico. Por ejemplo, usando un formato de inmunomanchado, el tejido de próstata sospechoso de contener células cancerígenas en la próstata, es homogenizado, separado en un gel SDS/PAGE, transferido a la membrana y sometido a sonda con tanto anticuerpos ICCE anti-queratina como anti-próstata. Los segundos anticuerpos A4 específicos del isotipo, que son conjugados a un sistema marcador adecuado tal como peroxidasa o fosfatasa alcalina, son usados para detectar anticuerpos de enlace. Las membranas ? que contienen anticuerpos de enlace primero y segundo, son 5 entonces desarrolladas usando técnicas colormétricas o fluorométricas conocidas y cuantificadas por métodos conocidos . En la modalidad más preferida, la muestra es analizada por el tamaño y/o formas fosforiladas del ICCE, tal L10 como por Manchado Western, usando anticuerpos anti-ICCE. Una • disminución o ausencia de la forma de proteína ICCE de peso molecular alto se correlaciona con el avance del cáncer. Los equipos de Diagnóstico de la invención incluyen proteína ICCE o secuencias de ácido nucleico que codifican al 15 ICCE por ejemplo, como controles. Opcionalmente, los equipos de diagnóstico contienen uno o más anticuerpos que enlazan el ICCE de las células epiteliales para ser detectados o cuantificados . Los anticuerpos pueden enlazarse a un dominio como la Mamastatina (por ejemplo, 7G6) o pueden ser 20 anticuerpos ICCE específicos del tejido. Alternativamente, los equipos de diagnóstico incluyen una o más sondas de hibridación o cebador de amplificación para la amplificación y/o detección de las secuencias de ácido nucleico que [l-iiÉMnhi Ü""" -«"^*^ codifican un ICCE de las células epiteliales, por ejemplo, los cebadores usados en los Ejemplos abajo.
Uso Terapéutico 5 La proteína ICCE para uso terapéutico es producida de los cultivos de células epiteliales bajo condiciones libre de suero o por medios recombinantes. Preferiblemente, la proteína ICCE es producida en levadura o células eucarióticas superiores para alcanzar la fosforilación de la proteína. La 10 proteína recombinante es producida en las células hospederas o por medios sintéticos. El ICCE funcional es administrado a pacientes por métodos conocidos para la administración de la fosfoproteína, preferiblemente por inyección, para incrementar los niveles 15 inhibitorios en la corriente sanguínea e incrementar las interacciones del inhibidor con el epitelial deseado. flp La proteína puede ser suministrada al paciente por métodos conocidos en el campo para suministro de los agentes de la proteína fosforilada. En general, el inhibidor es 20 mezclado con el vehículo suministrado y administrado por inyección. La dosificación del inhibidor a ser administrada puede ser determinada por un experto en la técnica, y variará *» con el tipo de modalidad del tratamiento y extensión del padecimiento. Puesto que la Mamastatina inhibe aproximadamente 50% del crecimiento de las células M cancerígenas mamarias a una concentración de 10 ng/ml y 5 detiene el crecimiento a aproximadamente 20-25 ng/ml in vi tro, un rango de dosificación terapéutico empleado de ICCE es una dosis de aproximadamente 2.5 µg hasta aproximadamente 250 µm administrada diariamente. Es preferida una dosis de aproximadamente 125 µg administrada diariamente. El objetivo ^ ' 10 de la administración es el resultado en una dosis de corporal final que es la fisiológica (por ejemplo, 15-50 ng/ml) o ligeramente de rango superior (por ejemplo, 25-75 ng/ml) . Para uso clínico, el rango de dosificación preferido es de aproximadamente 500 ng/ml para tratamiento inicial del 15 padecimiento metastático, seguido por una dosificación de mantenimiento de aproximadamente 50 ng/ml. En estudios clínicos que usan Mamastatina, una dosis administrada diariamente de aproximadamente 50 ng/ml hasta aproximadamente 750 ng/ml fue suficiente para inducir remisión en pacientes 20 con cáncer de mama en Etapa IV. Puesto que el ICCE activo es una proteína fosforilada, se anticipa que las dosis múltiples del inhibidor se requerirán para mantener los niveles que inhiben eí* crecimiento de ICCE en la sangre del paciente. También, puesto que el ICCE de manera general actúa como un agente citostático preferentemente que un agente citocidal, se ?(?l espera que un efecto máximo del inhibidor requerirá regular 5 el mantenimiento de los niveles del inhibidor en pacientes con cáncer de células epiteliales. En uso preferido, el ICCE es administrado en dosificaciones altas (>50 ng/ml, preferiblemente alrededor de 50-500 ng/ml) para inducir la regresión del tumor. Las dosis 10 de mantenimiento inferiores (<50 ng/ml, preferiblemente 20-50 • ng/ml) , son usadas para prevenir el crecimiento de las células cancerígenas. La experiencia clínica con Mamastatina administrada en pacientes con cáncer de mama en Etapa IV, indica que una 15 dosis empleada es la cual mantiene los niveles fisiológicos de la Mamastatina en la sangre. La administración es preferiblemente diaria, pero puede ser por ejemplo, por infusión continua, por depósito de liberación lenta, o por inyección una vez cada 2-3 días. La evidencia anecdotal 20 sugiere que la administración continua puede inducir inhibición de retroalimentación así, un esquema de administración preferido es administrar una dosis diariamente de Mamastatina por aproximadamente 25-28 días, seguida por 2- 5 días sin administración.
Ensayo de Diagnóstico jB Los ensayos de la presente invención para detectar 5 la presencia del inhibidor funcional en el tejido humano y el suero, son empleados en la selección de pacientes para el cáncer de células epiteliales, para seleccionar la población para aquellos con alto riesgo de desarrollar cáncer de células epiteliales, para detectar el comienzo temprano del 10 cáncer epitelial, y para monitorear en el paciente los niveles del inhibidor durante el tratamiento. Por ejemplo, el análisis de un ICCE en la sangre del paciente, por ejemplo, puede indicar una cantidad reducida de peso molecular alto, ICCE de próstata fosforilado, comparado con un control normal 15 o con el perfil ICCE de próstata previo del paciente. Tal cambio está correlacionado con el riesgo incrementado de cáncer de próstata, con comienzo temprano de cáncer de próstata, y con avances metastáticos de cáncer de próstata. Los ensayos de diagnóstico para el ICCE de próstata de 55 kD, 20 activo, fosforilado, preferiblemente son por inmunoensayos del manchado Western, o ELISA usando anticuerpos anti-ICCE específicos. Seleccionados por ejemplo, en suero, son preferiblemente por inmunoensayos, por ejemplo, ELISA, manchado Western, o ensayo de manchado dot. Para mejores resultados, las muestras de pacientes deberán someterse a ensayos dentro de un corto tiempo de muestreo (dentro de una semana), almacenarse a 4°C (menos de un año) o congelarse por almacenamiento de largo término. Más preferiblemente, las muestras son congeladas hasta el tiempo del ensayo.
EJEMPLOS La invención puede ser mejor entendida por referencia a los siguientes Ejemplos, los cuales no están propuestos para limitar la invención en forma alguna.
EJEMPLO 1 Expresión del Tejido Múltiple del ICCE El análisis del manchado Northern se realizó en un arreglo de expresión de tejido múltiple (Clontech, Inc. #7775-1) para demostrar la expresión del ICCE en una variedad de tejidos de células epiteliales. Un fragmento EcoRI etiquetado con digoxina de Mamastatina, que contiene aproximadamente 1800 pares base de la región 3' de pMammC, SEC ID NO: 3 (aproximadamente extremo de 359 nucleótidos), se usó como una sonda. El ADNc de Mamastatina etiquetado con DIG y í^^ ¡ se hibridizó al arreglo en 10 ml de solución HYB fácil (Roche) por 16 horas a 65°C, con lavados de 65°C, hibridación anticuerpo anti-DIG y el desarrollo de CSPD se realizó de conformidad con las instrucciones del fabricante. El manchado • entonces se expuso a película X-OMAT de Kodak por 30 minutos a temperatura ambiente. El plano del tejido del arreglo de expresión del tejido múltiple se muestra en la Figura ÍA. La hibridación del ADNc de Mamastatina al ARNm del arreglo se muestra en la 10 Figura IB, y demuestra la variedad de tejidos de células ^ epiteliales que expresan una secuencia ICCE como la Mamastatina. Los tejidos específicos que hibridizan al ANDc de mamastatina incluyen: sistema nervioso central, corazón, intestino delgado, intestino grueso, apéndice, recto, células 15 linfáticas, células de la médula ósea, pulmón y vías respiratorias, vejiga, uretra, próstata, testículos, ovario, ßm hígado, páncreas, glándula adrenal, glándula salival y glándula mamaria. EJEMPLO 2 20 Células de Próstata Normal Contra Células de Próstata Cancerosa Las células normales de próstata obtenidas de muestras quirúrgicas y células de próstata cancerosa, LnCap, obtenidas de la Colección de Cultivos Tipo .Americano (ATCC), se incubaron y analizaron para la producción de un ICCE de próstata. Las células se cultivaron en un medio DMEM/F12 con 40 µm de calcio, suplementadas con suero de caballo tratado con Chelex al 5%, 10 ng/mL de EGF, 10 µg/mL de insulina, 100 ng/mL de toxina del Cólera y 1 µg/mL de hidrocortisona por cuatro días. Las muestras del medio acondicionado entonces se colectaron y analizaron. Las células normales mamarias de humano, obtenidas de muestras de pacientes, se incubaron en el mismo medio y la Mamastatina secretada en el medio de cultivo se usó como un control. El suero obtenido de pacientes con cáncer de mama también se analizó y usó como un control. Los fluidos de muestra se colectaron y cargaron por succión en una membrana de nitrocelulosa en un aparato de manchado dot. Las membranas entonces se sometieron a prueba con el anticuerpo anti-Mamastatina 7G6, y el enlace anticuerpo se detectó con anticuerpo de cabra-anti-ratón etiquetado con fosfatasas alcalinas. El color se desarrolló con el sistema de substrato NBT/BCIP (Life Technologies) . Los resultados se muestran en la Figura 2. El anticuerpo anti-Mamastatina reconoce una proteína producida por células de próstata normal pero no za células de próstata cancerosa. Esto es análogo al reconocimiento del anticuerpo del inhibidor del crecimiento de las células mamarias, Mamastatina, producidos por células mamarias normales, pero no por células de cáncer de mama. Estos datos, en combinación con los datos del Ejemplo 1, demuestran la producción del ICCE como Mamastatina en otros tejidos de células epiteliales, y particularmente en células de próstata.
EJEMPLO 3 Expresión Diferencial de ICCE en Próstata, Colon y Ovario Próstata Células normales de próstata (Clontech, Inc.), células de cáncer de próstata LnCap (A.T.C.C), células de cáncer de mama MCF7 (A.T.C.C.), y células normales mamarias humanas (obtenidas del tejido de hospital), se incubaron como se describe anteriormente para el Ejemplo 2. Después de al menos 48 horas de incubación, las células se sometieron a lisis en amortiguador cargado de muestra y se analizaron por la presencia de ICCE por manchado Western, usando el anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6 como una sonda. El lisado de la proteína de células mamarias humanas normales (NHMC) (1 mg/ml) , se usó como un control de Mamastatina (A) . Los datos se muestran en la Figura 3. El lisado de células de próstata normales (D) contiene una proteína que se reconoció por el anticuerpo anti-Mamastatina, mientras las células cancerígenas de próstata (LnCap) (B) y células de cáncer de mama (MCF7) (C) no. La proteína reconocida en el lisado de células de próstata (D) fue de un tamaño similar a aquél de la Mamastatina (A) .
Colon y Prósta ta Células de próstata normales (Clontech, Inc.), células de cáncer de próstata LnCap (A.T.C.C.), células de cáncer de colon Sw 948 (A.T.C.C), y células epiteliales de colon normal (obtenidas de un tejido de cirugía de un paciente) , se incubaron como se describe anteriormente para el Ejemplo 2. Los usados celulares se prepararon en amortiguador cargado de muestra y se analizaron para la expresión de ICCE por manchado Western, usando el anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6 como una sonda. Como se muestra en la Figura 4, las células epiteliales de próstata normal (A) y colon normal (C) , expresaron una proteína que se reconoció por el anticuerpo t, uy .jfr^«> ^ ani-Mamastatina, mientras las células cancerígenas a partir de estos tejidos no (B,D). La expresión diferencial de la proteína es similar a aquella demostrada por la Mamastatina ^fl en el tejido de mama. Además, el patrón de las bandas 5 mostrado en el manchado Western para tejidos normales de próstata y colon, es similar al patrón de Fosforilación demostrado por la Mamastatina producida en células mamarias humanas normales. Una banda prominente más grande se muestra junto con dos bandas más tenues, más pequeñas. Este patrón se 10 ha correlacionado con la Fosforilación de la Mamastatina. El ICCE de próstata se muestra en el análisis de manchado Western (Figura 4), teniendo un peso molecular aproximado de 51 kilodaltons; el ICCE de colon se muestra por tener un peso molecular aproximado de 50 kilodaltons. 15 Ovar i o ( Las células cancerígenas de ovario OvCar (A.T.C.C.), células de ovario humano normal (tejido de cirugía de paciente) , y células mamarias humanas normales 20 (tejido de cirugía de paciente), se incubaron como se describe anteriormente para el Ejemplo 2. Después de un periodo de incubación de al menos 48 horas, los usados directos se prepararon por remoción del medio de crecimiento y enjuague de las células con salina y el amortiguador cargado de la muestra SDS-PAGE hasta viscosidad. Los usados se colectaron y separaron en SDS-PAGE al 10%, se ^m transfirieron electroforéticamente en nitrocelulosa, y se 5 sometieron a sondas con el anticuerpo anti-Mamastatina 7G6. Los datos se muestran en la Figura 5, en donde la línea A contiene pesos moleculares estándares; B, lisado de células de cáncer de ovario OvCar; C, Usados de células de ovario humano normales; y D, lisados de células mamarias de humano 10 normales. • La Figura 5 demuestra que una proteína ICCE como la Mamastatina es producida en tejidos de ovario humano normales y se reconoce por el anticuerpo anti-Mamastatina. La proteína no está expresada en las células de cáncer de ovario 15 analizadas. El ICCE de ovario tiene un peso molecular aproximado de 60 kilodaltons.
Ejemplo 4 Detección Diferencial del ICCE de Próstata en la Sangre 20 Las muestras de suero de tres voluntarios machos saludables se analizaron por la presencia del ICCE de próstata, y se compararon con aquélla del suero a partir de un paciente con cáncer de próstata. Las muestras de suero se |*|J^^j|AÜ|^ ^^ j| cargaron a muestras de 400 microlitros y 200 microlitros por duplicado. Las muestras se retiraron en nitrocelulosa por vacío en un aparato de manchado dot de 96 pocilios. Los filtros se sometieron entonces a prueba con el anticuerpo anti-Mamastatina, 7G6, y se desarrollaron con substrato NBT/BCIP. Los datos se muestran en la Figura 6. Los cultivos de células mamarias de humano normales (CMHN) , producen medio acondicionado estándar por comparación. Los estándares por duplicado, contienen 400, 200, 100, 50, 25, 12 y 6 microlitros de medio CMHN. Las muestras de suero de machos adultos saludables (A, C, D) , y de un paciente adulto con cáncer de próstata (B) , se sometieron a ensayo usando 400 y 200 microlitros de muestra de suero. Una señal prominente del suero normal (A, C, D) , demostró la presencia del ICCE de próstata, mientras el suero del paciente con cáncer de próstata mostró solamente una señal débil.
Ejemplo 5 Actividad Inhibitoria del ICCE de Próstata Células normales de próstata (Clontech, Inc.), y células de cáncer de próstata LnCap y PC3 (A.T.C.C), se plaquearon a una densidad de 5.0 x 104 células por mililitro ^? -"^ ?.tíl IÉÜ1 itl i II i ií en placas de 12 pocilios en un medio RMPI que contiene suero bovino fetal al 10%. Después de 24 horas, los cultivos se complementaron con medio acondicionado al 10%. Cada muestra se corrió por triplicado. Las placas se dejaron incubar por seis días a 37°C y C02 al 5%, y al final del periodo de incubación, las células se sometieron a lisis con Cetrimida y se contaron usando un Contador Colter. El porcentaje de inhibición se calculó comparando los pocilios tratados contra los no tratados, y los datos se muestran en la tabla abajo. 10 Las células PCR insensibles al andrógeno no se inhibieron por • el medio de células normales de próstata o por el medio acondicionado obtenido de células normales de próstata. En contraste, las células LnCap se inhibieron por la adición del medio de crecimiento, con la inhibición algunas veces mayor 15 por el medio derivado del medio de próstata normal contra el medio derivado de las células cancerígenas. • 20 Ejemplo 6 Aislamiento y Caracterización del ADN de ICCE de Próstata Las bibliotecas de ácido nucleico se produjeron a as ' partir del ARNm de las células normales de próstata (tejido 5 de cirugía de paciente) y de LnCap, células de tumores de próstata (A.T.C.C.). Las secuencias de ácido nucleico en las bibliotecas de células de próstata normales y cancerosas se incorporaron en vectores y se usaron para transformar la bacterias. Las ^^ 10 colonias de bacterias que expresan las secuencias de ácido nucleico de células de próstata normales y cancerosas, se seleccionaron por hibridación con una sonda de ácido nucleico de Mamastatina etiquetadas con digoxina, bajo condiciones rigurosas, como se describe anteriormente. 15 Las colonias positivas se seleccionaron y se hicieron crecer en caldo LB. Los plásmidos obtenidos de las iflft colonias positivas se purificaron y digirieron con ECO Rl y Xhol para liberar los insertos de ADNC. El ADN digerido entonces se separó en gel de agarosa al 1% (véase Figura 7A) 20 y el ADN separado se sometió a análisis de manchado Southern usando el fragmento de Mamastatina etiquetado con digoxina como una sonda. Como se muestra en la Figura 7 abajo, se aislaron dos clones ICCE de próstata, cada uno tiene un abiíÍ.AA,A ^ kfc?¡ ^fc tamaño de aproximadamente 2 Kb: Un clon se aisló a partir de la biblioteca de tejido de próstata normal (PRN2.1) y una vez de la biblioteca de células de tumor de próstata LnCap (PRT- 6). El PRT-6 además se caracterizó, y se determinó su secuencia de ácido nucleico. Como se muestra abajo en la Tabla 1, la secuencia de ácido nucleico que codifica al ICCE de Próstata, tiene identidad substancial a la Mamastatina (mayor del 90%) al extremo 5' de la molécula (aproximadamente 15-1032 nucleótidos de MammC), con poca o ninguna identidad al extremo 3' de la molécula. Estas regiones de similitud y distinción se muestran diagramáticamente en la Figura 8.
Ejemplo 7 Aislamiento y Caracterización del ADN del ICCE de Próstata Bibliotecas de ácido nucleico se construyeron a partir del ARNm o células de próstata normales (obtenidas de tejido de cirugía de paciente) y de células de tumor de próstata LnCap (A.T.C.C) . La biblioteca de ADNc se usó para transferir E. coli y se plaqueó para la hibridación de colonias. Las colonias se seleccionaron con un fragmento de Mamastatina C etiquetado con digoxina generado por PCR, usando los cebadores externos M200 y M2200. *«sw . [Secuencia ID NO: 5] M200: GCGCCGGCCGGGCGCGACCCG [Secuencia ID NO: 6] .M2200: GCAATCTCAGCGCACTGCTGC Las colonias bacterianas que expresan clones de ICCE de próstata, se hibridizaron a la sonda de Mamastatina etiquetada bajo condiciones de hibridación estrictas, como se describe abajo.
Ejemplo 8 10 Homología del ICCE de Próstata La secuencia del ICCE de Próstata se analizó contra las secuencias de ácido nucleico presentes en el GenBank.
Porciones de dos moléculas mostraron alguna similitud a los dominios dentro de la secuencia de ICCE de próstata: 28SARNm 15 e H?p55. La homología 28SARNm se ha identificado en muchas secuencias de gen con importancia en la regulación del crecimiento (Hu et al., 1999, PNAS 96:1339-1344; Mauro et al., PNAS 94:422-427). El Hip55 es una proteína que se enlaza 20 al progenitor hematopoyético de tipo 1 cinasa, una proteína involucrada en la trayectoria de transducción de la señal src (Ensena et al., 1999, JBC 274:33945-50). Usando la estructura lectora abierta conocida para ^ít ' * - ^t> Hip55, se dedujo una secuencia de aminoácido putativa para el clon de próstata. Como se muestra abajo en la Tabla 3, la traducción incluye varios codones de detención internos. También usando la Hip ORF, se dedujo una secuencia de aminoácido putativo para las secuencias MammB y MammC, mostradas en las Tablas 4 y 5.
Tabla 1 ICCE de pMammC y Préstate 50 pMarcun C (1) Próstata GIP (i) GCACGA^TTCCCACGGGTCCCTACCTACTATCC?GCGAAACCACAGCCAA Consenso (11 51 100 pMapup C (1) CA Próstata GIP (51) GCGAACGGGCTTGGCGGAATCAGCGGGGAAAGAAGACCCTCTTGAGCTTG Consenso (51) 101 ^_ -.-J..l -I,-L..- -J. . -?. p amm C (3) Psróstata GIP (101) Consenso (1011 pMaipxn C (53) Próstata GIP (151) Consenso (151) pMamm C (103) Próstata GIP (201) Consenso (201) • pMamm C (153) Próstata GIP (2511 Consenso (251) pManun C (203) Próstata GIP 1301) Consenso (301) pMamiti C (253) Próstata GIP (3515 Consenso (351) pManun C (303) Próstata GIP (401) Consenso (401) pManpn C (353) Próstata GIP (451) Consenso (151) • pMamrp C (403) Próstata GIP (501) Consenso (501) pMamm C (453) Próstata GIP (5511 Consenso (551) pMamip C (503) Próstata GIP (601) Consenso (601) pMaoun C (553) ^^¿ft^t?i^^tífaítd ft^J^^iÉIUtótoÍ_i_ Consenso (1401) TCTAC GA C C A GGT CAG CAAG T C 1451 1S00 pMamiti C (1350) PrósUU GIP 11406) Consenso (1451) T CA ATTGA A A TTC G AG GCC CAG A pMamn. C (1399) PrósUU GIP (14541 Consenso (1501) pMaiam C (1445) PrósUU GIP (1502) Consenso (1551) pMamm C (1495) PrósUU GIP (1548) Consenso (1601) pMamm C (1544) PrósUU GIP (1598) Consenso (1651) pMaropi C (1594) PrósUU GIP 11648) Consenso (1701) oMamro C (1643) PrósUU GIP (1698) Consenso (1751) pMamn C (1692! PrósUU GIP (1741) Consenso (1B01) pMamrn C (17421 PrósUU GIP (1789) Consenso (1851) pMamm C (1789) PrósUU GIP (1839) Consenso (1901) pMamra C (1839) ProsUU GIP (1888) Consenso (1951) pMaitun C (1887) PrósUU GIP (1938) Consenso 2001) pMamm C (1937) PrósUU GIP (1988) Concenso (2051) pKamm c (1987) PrósUU GIP ;2018) Consenso (2101) pMajn C (2037) PrósUU GIP (2068) Consenso (2151) • i ¿ i U itjlíí 4 * ñ m Tabla 2 Homología del ICCE de la PrósUU 1 50 28S RNA (1 ) CTTTGGGAGGCCGAGGCCGTAGGATCCCTCGAGGAATCGCCTAACCCTGG pKajwnB (1) PrósUU (1) HipdS ( 1 ) 51 100 28SmRNA (51) GGAGGTTGAGGTTGCAGTGAGTGAGCCATAGTTGTGTCACTGTGCTCCAG pMamjnB (i) PrósUU ( •_ , HipS5 (1) 101 150 28SraRNA (101) TCTGGGCGAAAGACAGAATGAtMCCCTGCCACAGGCAGGCAGGCAGGCffl p ammB (1) PrósUU (1) - CACGQS H?.p55 (1) 151 200 8Sp?KMA (151) GC G @^ _ SA ^ CTGT T _>TG T B gggGC; GQg gGl pMaxpxnB (1) PrósUU ( 8 ) AT CA®C G CCgT^TACTA CC^CGAA C_^»?a^CAjS_EGB^G HipSS ( i j 201 250 28S?rJWA (201) . B A_^^^AB9g^CTTg^ B^ TTBrS^TTBc^CGGACl Ma?mB (1) PrósUU (58) GGCTflGi^B^^-B^Gr^^^ QS CCC^gg^?Gg BG f Hip55 (1) H?p55 (1) — |CAGI 1951 2000 8SmRNA (2 06) pMammB (17461 ProsUU (1778) H?pSS (1332) 2451 2500 28SmRNA (2404) fflflllT»-WT -Wtf. WWAfi¡SltAB^ • PrósUU (2161) HipSS (13325 2551 2900 28StnR«A (2 94) AAAGAAAAAAGAAAAAAAO-\CAAAAC^GAACAACCCCA(;CGTGACATAC pMam B (2327) -'- PrósUU (2384) Hi?55 (1332) 290: 2950 Tabla 3 Secuencia de aminoácido PuUtiva del ICCE de PrósUU H E I P T V P T Y V P A K P Q 1 GCACGAGATT CCCACTGTCC CTACCTACTA TCCAGCGAAA CCACAGCCAA CGTGCTCTAA GGGTGACAGG GATGGATGAT AGGTCGCTTT GGTGTCGGTT • E R A W R N Q R G K K T L L S 51 GGG ACGGGC TTGGCGGAAT CAGCGGGGAA AGAAGACCCT GTTGAGCTTG CCCTTGCCCG AACCGCCTTA GTCGCCCCTT TCTTCTGGGA CAACTCGAAC T L V K G E £ T * E V * N K W 101 ACTCT-AGTCT GGCACGGTGA AGAGACATGA GAGGTGTAGA ATAAGTGGGA TGAGATCAGA CCGTGCCACT TCTCTGTACT CTCCACATCT TATTCACCCT • A P G A P P V S P R G A R G G 151 GGCCCCCGGC GCCCCCCCGG TGTCCCCGCG AGGGGCCCGG GGCGGGGTCC CCGGGGGCCG CGGGGGGGCC ACAGGGGCC-C TCCCCGGGCC CCGCCCCAGG • R P C S P P V K ? H ? S D R F 201 GCCGGCCCTG CGGGCCGCCG GTGAAATACC ACTACTCTGA TCGTTTTTTC CGGCCGGGAC GCCCGGGGGC CACTTTATGG TGAT6AGACT AGCAAAAAAG T D P V R R G G E P R G A L A S 251 ACTGACCCGG TGACGCGGGG GGGCGAGCCC CGAGGGGCTC TCGCTTCTGG TGACTGGGCC ACTCCGCCCC CCCGCTCGGG GCTCCCCGAG AGCGAAGACC • A K R P A A R R P G A T F S G 301 CGCCAAGCGC CCGGCCGCGC GCCGGCCGGG CSCGACCCGC TCCGGGGACA GCGGTTCGCG GSCCGGCGCG CGGCCGGCCC GCGCTGGGCG AGGCCCCTGT - A R 3 V • L G R Y T C Q. T V 351 GTGCCAGGTG GGGAGTTTGA CTGGGGCGGT ACACCTGTCA AACGGTAACG CACGGTCCAC CCCTCAAACT 5ACCCCGCCA TGTGGACAGT TTGCCATTGC Q V S * G E L R E D R N L P W _? 401 CAGGTGTCCT AAG6CGAGCT CAGGGAGGAC AGAAACCTCC CGTGGAGCAG GTCCACAGGA TTCCGCTCGA GTCCCTCCTG TCTTTGGAGG GCACCTCGTC • R A K A R L I L I F S T N T D 451 AAGGGCAAAA GCTCGCTTGA TCTTGATT7T CAGTACGAAT ACAGACCGTG TTCCCGTTTT CGAGCGAACT AGAACTAAAA GTCATGCTTA TGTCTGGCAC • S G A S R S F - F F G F * A G 501 AAAGCGGGGC CTCACCATCC TTCTGACCTT TTGGGTTTTA AGCAGG?GGT TTTCGCCCCC GAGTGCTAGG AAGACTGGAA AACCCAAAAT TCGTCCTCCA V R K V T T G I T G L W R P S V 551 GTCAGAAAAG TTACCACAGG GATAACTGCC TTGTGGCGGC CAAGCGTTCA CAGTCTTTTC AATCGTGTCC CTATTGACCG AACACCGCCG GTTCGCAAGT • S D V ? F * S F D V G S S Y H 601 TAGCGACGTC GCTTTTTGAT CCTTCGATGT CGGCTCTTCC TATCATTGTG ATCGCTGCAG C6AAAAACTA GGAAGCTACA GCCGAGAAGG ATAGTAACAC • A E F T K R I V H P L I G H 651 AAGCAGAATT CACCAAGCGT TGGATTGTTC ACCCACTAAT AGGGAACGTG TTCGTCTTAA GTGGTTCGCA ACCTAACAAG TGGGTGATTA TCCCTT3CAC S W O * T V R Q V S F T L L M 701 AGCTGGGATT AGACCGTCGT GAGACAGGTT AGTTTTACCC TACTGATGAT TCGACCCTAA TCTGGCAGCA CTCTGTCCAA TCAAAATGGG ATGACTACTA • C C C H G U P A Q Y E R N R R 751 GTGTTGTTGC CATGGTAATC CTGCTCAGTA CGAGAGGAAC CGCAGCTTCA CACAACAACG GTACCATTAG GACGAGTCAT GCTCTCCTTG GCGTCCAAGT • H L V Y V L G * G A M G A K ?. 801 GACATTTGGT GTATGTGCTT GGCTGAGGAG CCAATGGGGC GAAGCTACCA tá á). ^| |Í UÍ CTGTAAACCA CATAC?CGAA CCGACTCC7C GGTTACCCCG TTCCA7GGT S V G L * L N A S K S E S R P C 851 -CTGTGGGAT TATGACTGAA CGCCTCTAAG TCAGAATCCC GCCCAGCCGG AGACACCCTA ATACTGACTT «CGGAGATTC AGTCTTAGGG CGGGTC CCC - T I R O R R C A S G L G * P 901 SACGATACC3 CAGCGCCGCG GAGCCTCGGT TGGCCTCGGA TAGCCGCTCC TTGCTATGCC GTC6C3GCGC CTCSGAGCCA ACCGGAGCCT ATCGGCCAGG • R L S P P A C R P L H A P • 951 CCCGCCTGTC CCCGCCGGCG GCCCGCCCCC CCCTCCACGC GCCCCGCGCG GGGCG3RCAG GGGCGGCC6C CCGGCGGGGG GGGAGGTGCG CGGGGCCCGC R G R A R A P P R A G T G V C 1001 CGCGGGAGGG CGCGTGCCCC GCCGCGCGCC GGGACCGGGG TCCGGTGCGG GCGCCCTCCC GCGCACGGGG CGGCGCGCGG CCCTGGCCCC AGGCCACGCC • V P F V _ G N G A R P E R R P 1051 AGTGCCCTTC GTCCTGGGAA ACGGGGCGCG GCCGGAAAGG CGGCCG<;CCC tCACGGGAAC CAGGACCCTT TCCCCCGCGC CGGCCTTTCC GCCGGCGGGG • R p S T A R S W W R T no:. 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V Q A E E E A v Y e E P 1301 CCTCCATGTC TSGTGCAGGC AGAAGAGGAG GCTGTGTATG AGGAACCTCC GGAGGTACAG ACCACGTCCG TCTTCTCCTC CGACACATAC TCCTTG3AGG • E Q E T F V E Q P P L V Q O Q 1351 AGAGCAGGAG ACCTTCTACG AGCAGCCCCC ACTGGTGCAG CAGCAAGGTG TCTCGTCCTC TGGAAGATGC TCGTCGGGGG TGACCACGTC GTCGTTCCAC • G S E H I D H H I G C G L S 1401 CTGGCTCTGA GCACATTGAC CACCACATTC AGGGCCAGGG GCTCA3TGGG GACCGAGACT CGTGTAACTG GTGGTGTAAG TCCCGGTCCC CGAGTCACCC Q G L C A R A L Y D ? Q A A D 3 1451 CA.AGGGCTCT GTGCCCGTGC CCTGTACGAC TACCAGGCAG CCGACGACAC GTTCCCGAGA CACGGGCACG GGACATGCTG ATGGTCCGTC GGCTGCTGTG • e i S F D P E N L l T G I E V 1501 AGAGATCTCC TTTGACCCCG AGAACCTCAT CACGGGCATC GAGGTCATCG TCTCTAGAGG AAACTGGGGC TCTTGGAGTA GTGCCCGTAG "CTCCACTAGC E G M W R G Y G P D C H F G M 1551 ACGAAGGCTG GTGGCGTGGC TATGGGCCGG ATGGCCATTT TGGCATGTTC TGCTTCCGAC CACCGCACCG ATACCCGGCC TACCGGTAAA ACCGTACAAG ? A N Y V E L I E * G * G H I L 1601 CCTGCCAACT ACGTGGAGCT CATTGAGTGA GGCTGAGGGC ACATCT7GCC CGACGGTTGA TGCACCTCGA GTAACTCACT CCGACTCCCG TGTAGFvACGG • F P S Q T L P Y C W K R R P 1651 CTTCCCCTCT CAGACATGGC TTCCTTATTC CTGGAAGAGG AGGCC7GGGA GAAGGGGAGA GTC?GTACCG AAGGAATAAC GACCTTCTCC TCCGG?CCCT • H S A L F Q E - D ? Q " G - poi GTTGACATTC AGCACTCT7C CAGGAATAGG ACCCCCAGTG AGGATCAGGC CAACTGTAAG TCGTGAGAAG GTCCTTATCC TGGGGGTCAC TCCTAC'TCCG L R A P S G . A D S A C H P K C 1751 CTCAGGGCTC CCTCCGGCTT GCCAGACTCA GCCTGTCACC CCAAATGCAG GAGTCCCGAG GGAGGCCGAA CCGTCTGAGT CGGACAGTGG GGTTTKCGTC • N G L V I P T H P S C I P R P 1801 CAATGGCCTG GTGATTCCCA CACATCCTTC C7GCATCCCC CGACCCTCCC GTTACCGGAC CACTAAGGGT GTGTAGGAAG CACGTAGGGG GCTGG13AGGG T A W L L P L T G Y • A P C 1851 AGACAGCTTG GCTCTTGCCC CTGACAGGAT ACTGAGCCAA GCCCTGCCTG TCTGTCGAAC CGAGAACGGG GACTGTCCTA TGACTCGGTT CGGGACCGAC P S P E P P S C G E G S * 19C1 TGGCCAAGCC CTGAGTGGCC AC7GCCAAGC TGCGGGGAAG GGTCCTCÍAGC ACCGGTTCGG GACTCACCGG TGACGGTTCG ACGCCCCTTC CCAGGA TCG • G A S G R L W L P S A F I C L 1951 AGGGGCATCT GGGAGGCTCT GGCTGCCTTC TGCATTTATT TGCCTTTTTT tCCCCGTAGA CCCTCCSAGA CCGACGGAAG ACGTAAATAA ACGGAA?AAA • F S L A S K G W W P P L F R M 2001 CTTTTTCTCT TGCTTCTAAG GGGTGGTGGC CACCACTGTT TAGAATGACC GAAAAAGAGA ACGAAGATTC CCCACCACCG GTGGTGACAA ATCTTACTGG L G N S E R R E L F L A E F T 2051 CTTGGGAACA GTGAACGTAG AGAATTGTTT TTAGCAGAGT TTGTGACCAA GAACCCTTGT CACTTGCATC TCTTAACAAA AATCGTCTCA AACACTGGTT • V R V D H G G L A A G N L S C 2101 AGTCAGAGTG GATCATGGTG GTTTSGCAGC AGGGAATTTG TCTTGTTGGA TCAGTCTCAC CTAGTACCAC CAAACCGTCG TCCCTTAAAC AGAACAACCT • L L C A P H S I S L S L C L G 2151 GCCTGCTCTG TGC7CCCCAC TCCATTTCTC TGTCCCTCTG CCTGGG TAT CGGACGAGAC ACGAGGGGTG AGGTAAAGAG ACAGGGAGAC GGACCC3ATA G K W G C R W P S S H K 2201 GGGAAGTGGG GATGCAGATG GCCAAGCTCC CACCCTGGGT ATTCAAAAAC CCCTTCACCC CTACGTCTAC CGGTTCGAGG GTGGGACCCA TAAGTTTTTG • A D T T C S S T R L R C L Q 2251 GGCAGACACA ACATCTTCCT CCACGCGGC CACTCGATGC CTGCAGSCCC CCGTCTGTGT TGTACAAGGA GGTGCGCCGA GTGAGCTACG GACGTCCGGG • V C A S T D S D F R K S K K K 2301 CAGTGTGTGC CTCAACTGAT TCTGACTTCA GGAAAAGTAA AAAAAAAAAA GTCACACACG C-A6TTGACTA AGACTGAAGT CCTTTTCATT TTTTTTTTTT K K L E K L W T S S 2351 AAAAAACTCG AGAAGCTTTG C-ACTTCTTCG CCA TTTTTTGAGC TCTTCGAAAC CTGAAGAAGC GGT Tabla 4 Secuencia de aminoácido MammC PuUtivo • I R H E H G E E T * E V * N K GAATTCGGCA CGAGCACGGT GAAGAGACAT GAGAGGTGTA GAATAAGTGG CTTAAGCCGT GCTCGTGCCA CTTCTCTGTA CTCTCCACAT CTTATTCACC E A P G A P P V S P R G A R G G 51 GAGGCCCCCG GCGCCCCCCC GGTGTCCCCG CGAGGGGCCC GGGGCGGGGT CTCCGGGGGC CGCGGGGGGG CCACAGGGGC GCTCCCCGGG CCCCGCCCCA K 101 CCGCCGGCCC TGCGGGCCGC CGGTGAAATA CCACTACTCT GATCGTTTTT GGCGGCCGGG ACGCCCGGCG GCCACTTTAT GGTGATGAGA CTAGCAAAAA • T D ? V R R G G E P R G A L A 151 TCACTGACCC GGTGAGGCGG GGGGGCGAGC CCCGAGGGGC TCTCGCTTCT AGTGACTGGG CCACTCCGCC CCCCCGCTCG GGGCTCCCCG AGAGCGAAGA G A K R P A A R R P G A T R S G 201 GGCGCCAAGC GCCCGGCCGC GCGCCGGCCG GGCGCGACCC GCTCCGGGGA CCGCGGTTCG CGGGCCGGCG CGCGGCCGGC CCGCGCTGGG CGAGGCCCCT • S A R W G V * L G R Y T C Q T 251 CAGTGCCAGG TGGGGAGTTT GACTGGGGCG GTACACCTGT CAAACGGTAA GTCACGGTCC ACCCCTCAAA CTGACCCCGC CATGTGGACA GTTTGCCATT • Q V S * G E L R E D R N L P W 301 CGCAGGTGTC CTAAGGCGAG CTCAGGGAGG ACAGAAACCT CCCGTGGAGC GCGTCCACAG GATTCCGCTC GAGTCCCTCC TGTCTTTGGA GGGCACCTCG R R A K A R L I L I F S T N T D 351 AGAAGGGCAA AAGCTCGCTT GATCTTGATT TTCAGTACGA ATACAGACCG TCTTCCCGTT TTCGAGCGAA CTAGAACTAA AAGTCATGCT TATGTCTGGC • E S G A S R S F * P F G F * A 401 TGAAAGCGGG GCCTCACGAT CCTTCTGACC TTTTGGGTTT TAAGCAGGAG ACTTTCGCCC CGGAGTGCTA GGA?GACTGG AAAACCCAAA ATTCGTCCTC V R K V T G I T G L W R P S 451 GTGTCAGAAA AGTTACCACA GGGATAACTG GCTTGTGGCG GCCAAGCGTT CACAGTCTTT TCAATGGTGT CCCTATTGAC CGAACACCGC CGGTTCGCAA H S D V A F * S F D V G S S Y H 501 CATAGCGACG TCGCTTTTTG ATCCTTCGAT GTCGGCTCTT CCTATCATTG GTATCGCTGC AGCGAAAAAC TAGGAAGCTA CAGCCGAGAA GGATAGTAAC • E A E F T K R W I V H P L I G 551 TGAAGCAGAA TTCACCAAGC GTTGGATTGT TCACCCACTA ATAGGGAACG ACTTCGTCTT AAGTGGTTCG CAACCTAACA AGTGGGTGAT TATCCCTTGC S W V « T V V R Q V S F T L L 601 TGAGCTGGGT TTAGACCGTC GTGAGACAGG TTAGTTTTAC CCTACTGATG ACTCGACCCA AATCTGGCAG CACTCTGTCC AATCAAA?TG GGATGACTAC M C C C H G N P A Q Y E R N R R 651 ATGTGTTGTT GCCATGGTAA TCCTGCTCAG TACGAGAGGA ACCGCAGGTT TACACAACAA CGGTACCATT AGGACGAGTC ATGCTCTCCT TGGCGTCCAA • R H L V Y V L G * G A N G A K 701 CAGACATTTC GTGTATGTGC TTGGCTGAGG AGCCAATGGG GCGAAGCTAC GTCTGTAAAC CACATACACG AACCGACTCC TCGCTTACCC CGCTTCGATG • S V G' L - L Ñ A S K S E S R P 751 CATCTGTGGG ATTATGACTG AACGCCTCTA AGTCAGAATC CCGCCCAGGC GTAGACACCC TAATACTGAC TTGCGGAGAT TCAGTCTTAG GGCGGGTCCG G T I R Q R R G A S V G L G * P 801 GGAACGATAC GGCAGCGCCG CGGAGCCTCG GTTGGCCTCG GATAGCCGGT CCTTGCTATG CCGTCGCGGC GCCTCGGAGC CAACCGGAGC CTATCGGCCA F R L S P P A G R P P P S T R 851 CCCCCGCCTG TCCCCGCCGG CGGGCCGCCC CCCCCCCTCC ACGCGC CCG GGGGGCGGAC AGGGGCGGCC GCCCGGCGßG GGGGGGGAGG TGCGCG GGC • R A G G R V P R R A ? G ? G S 901 CGCGCGCGGS AGSGCGCGTG CCCCGCCGCG CGCCGGGACC GGGGTCCGGT GCGCGCGCCC TCCCGC-CAC GGGGCGGCGC GCSGCCCTGG CCCCAGGCCA R G R 951 GCGGAGTGCC CTTCGTCCTG GGAAACGGGG CGCGGCCGGA AAGGCGGCCG CGCCTCACGG GAAGCAGGAC CCTTTGCCCC 3CGCCGGCCT TTCCCCCGGC P L A R H A P H V R A R A E F 1001 CCCCCTCGCC CGTCACGCAC CGCACGTTCG TGCTCGTGCC GAATTCGGCA GGGGGAGCGG GCAGTGCGTG GCG7GCAAGC ACGAGCACGG CTTAAGCCGT - S S T I K N R H T S A C I F M 1051 CGAGTAGCAC CATTCACAAT AGACATACAA GTGCATGTAT CTTTATGATA GCTCATCGTG GTAAGTGTTA TCTGTATGTT CACGTACATA GAAATACTAT * - l L F L V D I Q * W D C * 1101 TAATGAATTC TTTTCCTTTG GGTAGATATC CAGTAGTGGG ATTGCTAGAT ATTACTTAAG AAAAGGAAAC CCATCTATAG GTCATCACCC TAACGATCTA • T W - F Y F r i e K S S Y -1151 CACCTGGTAG TTCTATTTCT GGTTTATTGA GAAATCTTCA TACTGATTTC GTGGACCATC AAGATAAAGA CCAAATAACT CTTTAGAAGT ATGACTAAAG • * R L Y K F T S L P S D F F K 1201 CATAGAGGTT CTACAAATTT ACATCCCTAC CAAGTGATTT TTTTAAA?AT GTATCTCCAA CATGTTTAAA TGTAGGGATG GTTCACTAAA AAAATTT?TA E R M V W R N A P H * Y P P F T 1251 GAAAGAATGG TCTGGAGAAA TGCCCCTCAT TAGTATCCCC CTTTTACCTC CTTTCTTACC AGACCTCTTT ACGGGCAGTA ATCATAGGGG GAAAATGGAG • L L Q N D F K G Y R Y L Q V S 1301 TCTACTGCAG AATGACTTCA AGGGGTACAG GTATTTACAA GTTTCATTAT AGATGACGTC TTACTGAAGT TCCCCATGTC CATAAATGTT CAAAGTAATA • R Q l E Y * N F C 1 R G T D F 1351 ACAGACAAAT TGAATATTGA AATTTCTGCA TAAGAGGCAC AGATTTTAG TGTCTGTTTA ACTTATAAC? TTAAAGACGT ATTCTCCGTG TCTAAAATCC I Q S C M N K D K C S R D Q S 1401 ATTCAAAGT? GTATGAACAA GGACAAGTGC TCTAGGGACT TGCAAAGCTG TAAGTTTCAA CATACTTGTT CCTGTTCACG AGATCCCTGA ACGTTTCGAC • N W K S Q M K Y I S S S T T S 1451 GAATTGGAAA TCTCAGA?GA AATACATTTC TAGTAGTACC ACCAGCATAT CTTAACCTTT AGAGTCTACT TTATGTAAAG ATCATCATGG TGGTCGTATA • S T E A * S S L I ? T Y * 1501 ATTCTACTGA ATTGGCTTTG TGATCATCAT TAATACCTAC TTATTAAAAC TAA5ATGACT TAACCGAAAC ACTAGTAGTA ATTATGGATG AATAATTTrG * * K G F I S N I L * G I K X K 1551 TAATGAAAAG GGTTTATATC AAATATACTT TAAGCTATAA AAATCAñATT ATTACTTTTC CCAAATATAiG TTTATATGAA ATTCCATATT TTTAGTTTAA • " V K L F S A F ' F Q N I K 1601 ATAGGTAAAG CTGTTTTCTT TAGCATTTTA ATTTCAAAAC ATAAAATAt?C TATCCATTTC GACAAAAGAA ATCGTAAAAT TAAAGTTTTC TATTTTATOG • P S I G H L Y C T R H C V C H 1651 TACCGTCTAT TGGGCATTTA TACTGTACCA GACACTGTGT TTGTCACATT ATGGCAGATA ACCCGTAAA? ATGACATGGT CTGTGACACA AACAGTGTAA S K M F S W * C S Q « F C P V R 1701 TCAAAAATGT TCTCATGGTA ATGTTCACAA TAATTCTG7A GGGTGAGAAA AGTTTTTACA AGAGTACCAT TACAAGTGTT ATTAAGACAT CCCACTCTlT • S L T V V R L F S K R N L - T 1751 TAGTCTTACC GTAGTAAGAC TATTCAGTAA ACGAAACCTC TGAACCTTC3 ATCAGAATGG CATCATTCTG ATAAGTCATT GCTTTGGAG ACTTGGAACC - F N L R K V S N R 7 R T " T -1801 AGTTCAACTT GCGCAAAGTT AGTAACAGGA CTAGGACTTG AACCTGAACC TCAAGTTGAA CGCGTTTCAA TCATTGTCCT GATCCTGAAC TTGGACTTGG I T L Q I S P Y H T A = T C A C kktj m.Mxne'-'** ******* -t<*&k»k.tk> É:tfZ 1851 ATCACACTCC AGATCTCTCC ATACCACACT GCTACCACAT GTGCCTGTCA TAGTGTGAGG TCTAGAGAGG TATGCTGTGA CGATCGTCTA CACGGACAGT - L I P G S C Y F ? F Y F L S L 1901 TCTTATTCCT GGCTCCTGTT ATTTCCCTTT TTATTTCCTT CCCTTCCTC AGAATAAGGA CCGAGGACAA TAAAGGGAAA AATAAAGGAA AGGGAAG'SAG • T T ? F S ? H F F S F F L I V 1951 CCACAACCCC TTTTTCCCCC CATTTCTTTT CTTTCTTTTT AATTGTT?AT GGTGTTGGGG AAAAAGGGGG GTAAAGAAAA GAAAGAAAAA TTAACAATTA N C L S E Q L 1 K K 2001 TACATAACTA ATACATGCTT ATCAGAACñA TTGATATAGC ACAAAAGC.AT ATGTATTGAT TATGTACGAA TAGTCTTGTT AACTATATCG TGTTTTCCTA • - S T G E " * L I P V I L A L 2051 ATAAAGTACG GGTGAGTGAT AGCTCATCCC TGTAATCCTA GCACTTTCGA TATTTCATGC CCACTCACTA TCGAGTAGGG ACATTACGAT CGTGAAACCT • A K A G R S L E S R V R I) Q P 2101 AGGCCAAGGC AGGCAGATCA CTTGAGTCCA GACTTCGAGA CCAGCCTCGG TCCGGTTCCG TCCGTCTAGT GAACTCAGGT CTCAAGCTCT GGTCGGACCC Q H G E T L S L Q K N T K ? • P 2151 CAACATGGTG AAACCCTGTC TCTACAAAAA AATACAAAAA TTTAGCCGGG GTTGTACCAC TTTGGGACAG AGATGTTTTT TTATGTTTTT AAATCGGCCC • V L A H T C S L S Y S E G « G 2201 CGTGCTGGCA CACACCTGTA GTCTCAGCTA CTCTGAGGGC TGAGGTG6GA GCACGACCGT GTGTGGACAT CAGAGTCGAT GAGACTCCCG ACTCCACCCT • I D * A Q E V E A A A V R * D 2251 AGATTGATTG AGCCCAGGAG GTGGAAGCTG CAGCAGTGCG CTGAGATTGC TCTAACTAAC TCGGGTCCTC CACCTTCGAC GTCGTCACGC GACTCTAACG A ? A L Q P G * E R E T L S Q K 2301 GCCATTGCAC TCCAGCCTGG GTGAGAGA6A GAGACCCTGT CTCAAAAAAA CGGTAACGTG AGGTCGGACC CACTCTCTCT CTCTGSGACA GAGTTTTTTT - K 2351 AAAAA Tabla 5 Comparación MammA. MammB. MammC de PrósUU pMaram A ( 1 ) pMara B ( 1 ) pMa?ttm C o pPros ( 1 ) GCACGAGATTCCCACTGTCCCTACCTACTATCCAGCGAAACCACABegAA 51 100 pMamm. A ¡9) C.ACCC^^GGC^gcfCTCtfi_^CTAG G^CC^g(*fiGC GCAGB_ pMam» E , j ) jaMapun C ( i j Bg pPras ( 51 ) GGGA __^C T^^(^ TC^GGGG A.Q IU>^_3FTG GC TG pPros pManm, A (359) pMapp» E (29C) pKanun C (303) pPros (401) pMajnm A (409) pMapsn B (339) pMarßm C (353) pPxos (451) 501 550 pMatíun A (459) pKamtn & (382) pMapnri C (403) "~3h~a Pros • • 1401 1450 r tt,t*t-¿,tot-">t*fi 4, «»__ <^-_-_M(_____ -^- *-*^ ? t^j¡i^.^_.-_M_-.4 AjAAA.j.atfe.Ji,.»^^.,, pKaríBsi C (2267) pPros (2255) pMapßn A (2370) pMapur. B (2280) pMapipv C (2317) pPros (2303) 2501 2532 pXaram A (2419) pMaipm B (2327) pMapun C (2356) ppjos (2352) AAAAACTCGAGAAGCTTTGGACTTCTTCGCCA LISTADO DE SECUENCIA <110> BIOTHEFAPieS, INC. <120> INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS EPITELIALES <130> 4273. 3WOU1 <l* l > 2000-06-19 <150> 60/139, 995 <1S 1> 1999-06-lß <16Cf> 10 <170> Patent?n Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2-1B <212> ADN <213> Homo s piens <400> 1 tggrggctcca ceccggtvgc ggeegeXcta gaactagtgg cggg ctgcaggaat, 60 tcggeacgag caeggtgaag agaeatgaga ggtgtag-ati cegtgggagg cecftcggcgc 120 cccccggxg tcccegcga? ggeeegggg cgggg.eegc cggccctgc-i ggccgccggt 180 gaaataccac cactcxtatc gtttt.tt.cac tgacecggtc gagogggggg gcgagccccg 240 aggggctctc gcttccggcg ecaagcgccc ggcegcgcgc cggccgggeo. cgacccgctc 300 cggggacagt gccaggtggg gagtttgact ggggeggcac acctgf-caau cggtaacgca 360 ggtgtcetaa ggcgagctca gggaggacag aaacetcecg tggagcagaa gggeaaaagc 420 tegottgatc ttgattttca gr.aegaat.ac agaccgtgta agcgg?gCCt cacgatcctt 480 etgaccettt gggccccaag caggaggtgt cagaaaagtt aeeaeaggga taactggctt S40 geggeggcca agcg tcatc a gecgtcgc ttcetgaccc ctcgatgtcq gctctcecta 600 tcattgtg ß gcagaattea eeaagcgttg gattgttcac ccactaataq ggaacgtgag 660 cCgggtetag accgtcgtga gaeaggttat ttctacccta etgat?atcg tctg tgcca 720 tggttat.cct gc*cagt.acg a?aggaaccg caggttcaga cacttggtgr, atgT.gct.tgg 780 ctgaggagce aatggggcga ageaecate tgtgggat a tgaccgßcgc tetaagtcat 840 gaatcccgce ca?gcggaac gata ggcag cgccgcggag cccggtcgcj cctcggatta 900 gccggteecc cgcccgtccc egccggcggg ccgccCGCCC ccctccacgc gccccgcgcg 960 egcgggaggg cgegtqcecc gccgcgcgcc gggaeegggg tccggtgcg agtgcccttc 1020 gtcctgggaa «cggggegcg gecggaaagg cggccgcccc eccgcccgtc acgcaccgca 1080 cgt.tcgcgct cgtgeegaat tcggcacgag tgeaceeatt cacaatatac acacaagtgc 1140 atg-.a*-ctte atgatataat. gaattcttet cctttgggta gatatecagv agtgqgattg 1200 ctagateaec tggtagttert acccctggtt catttagaaa tcctcatact gatteccata 1260 gßggttgtac t ac c ccctaccaaa gtgatttctt taaatatgaa agaatggtct 1320 ggagaaatgc cecteattag catccccctt ttacetctet actgcagaat gacttcaagg 1380 ggtacaggta tttacaagtt tcatt eaca gaca attga atattgaaat tttctgoita 1440 *_____. agaggeacag attttaggat tcaaagetgt atgaaeaagg acaßgtgcte tagggaettg 1500 caaagctgga attggaaatc tcagaxgaaa tacatttcta gtagtacca cagcatatat 1560 tctactgaat tggctttcgt gatcatcatt aatacctact tatcaaaacx aatgaaaagg 1620 gtttatatca «atatacttt aaggeatßaß aatcaaatta taggtaaagc tgttttcttt 1680 aßcattwaa tttcaaaaca taaaatagct accgtctatt gggcatctat aet?taegag 1740 aeaetgtgtt tgtcaeattt caaaaat-jtr. cr.catgot.aa tgttcacaat aattetgteg 1800 ggtgagaaaa tagtcttacc gtagtaagac tattcagtaa aacgaaacct ctgaacottg 1860 • gagtteaact. tgcg aaagt tagtaacagg actaggactt gaacctgaac catcacactc 1920 gagatctctc cacaccaeac tgctagcaca tgtgcctgtc atcttattcc tggctccctt 1980 ttttatttcc ttteccttcc tcccaeaacc cctttttccc cccßtttctt tctttßtttt 2040 tatttgttaa ttacataaet aatacatgtt tttgagaaca attgatatag cacaaaagga 2100 tataaagtac gggggagtga tagctcatcc ctgtaatcct agcactttgg aaggcoaagg 2160 caggeagatc actttgagtc cagagttcga gaccagcctg ggcaacatgg tgaaaccctg 2220 tctctacaaa aaaatacaaa aaatetagcc gggcgtgctg gcacagacct gtagtctcag 2280 ctact tgag ggctgaggtg ggaagactga ttgagcccag gaggtggaag ctgcagcagt 2340 gcgctgagat tgcgccattg cactccagcc tgggtgagag agagagacec tgtctccaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2418 <210> 2 <211> 2326 10 <212> ADN <213> Hoo sa iens • <:400> 2 cggcacgagc acggtgaaga gacatgagag gtgtagaata agtgggaggc ccccggcgcc 60 cecccggcgt ccccgcgagg ggeeegcggg tccgecggce cgcgggcgcc gg gaaatac 12o eacca-rtctq atcgtttttt eaetgacceg g*¿gaggcggg qggcgagcoc egaggggcte 180 tcgcttc-_gg cgccaagcgc ecggcegcgc gccggccggg cgcgacccgc tccggggaca 240 gtgecagtgg ggagtttgae tggggcggta cacctgtcaa acggtaacgc ag_jtstccta 300 aggcgagctc agggaggaca aaacctcccg tggagcagaa gggcaaaatg tcttgattt 360 tcagtacgaa tacagacegt gaaagcgggg ccccagatcc tctgaccttt tgggttttaa 420 gcaggaggtg tcagaaaagt taccacaggg ataact?gct tgtggcggcc aagccttcaa 480 agcgacg cg ctttttgacc cttcgatgtc ggctcttcct atcattggga agcagaattc 540 15 accaagcgtt ggattgttca cccactaata gggaacgtga g tgggttta gaccgtcgtg 600 agacaggttt gtttacccta ctgatgat?t g tgttgcca tggtaatcct gctcagtacg 660 agaggaaccg caggttcaga eatttggtgt atgtgcttgg ct?gggagec aatggggcga 720 agctaccatc tgtgggatta ttactgaacg cctctaagtc agaatcccgc ccaggcggaa 780 cgatacggca gcgccgcgga «.ectcggt g gcctcggatg gecggtccc cgcctgtccc 840 cgccggcggg cocecececc cctccacgcg ccecgcgcgc gcgggagggc gcgtgeeccg 900 ccgegegccg ggaccggggt ccggegcgga gtgcccttcg tcctgggaj.-. cggggcgcgg 9€0 ccggaaaggc ggccgcccce tcgcc gtca cgcacßgcac gttcgtgcto gtgccgaatt 1020 cggcacgagt agcaccattc acaatagaca tacaagtgca tgtatcttta ttatataatg 1080 aattcttttc ctttggggag atatccagta gtgggattgc tagatca cr, ggcagttcta 1140" cttcr-ggttt attgagaaat cttcatactg atttccatag a?gttgtae. aatttacatc 1200 cctaccaagt gattttttta aatatgaaag ßatggtctgg agaaatgccc ctcattagta 1260 2Q teeecetttt acetetctac tg agaatga «ttcaagggg tacaggtatt tacaagtttc 1320 attßtacßgß caaattgaat attgaaattt ctgeattaga ggeacagatt ttaggatt a 1380 aagttgtaag aacaaggaca agtgctctag ggaectocaa agctggaatt ggaaatctca 1440 gaagaaatac ßtttctagta gtaccaccag catatattet aetgaattgg ctttgtgatc 1500 acca ttata cctactcatt aaaactaatg aaaagggttt atatcaaata tacttcaagg 1560 caaaaaaace aaattatagg aaaagctget ttctcttgca ttttaattt aaaacaaaaa 1620 atagccaccg tctattgggc atttatactg taccagacac tgtgtt gtc acatttcaaa 1680 aatgttccca tggtaacgtt cacaataatt ctgtagggtg gagaaatagt cttaccgcag 1740 taagactatt eagaaac?aa acctccgaac cttggagttc aacttgegca aagttagtaa 1800 caggactagg acttgaacct gaaccatcac actccagatc tctccatacc acactgctag 1860 caeatgtgcc tgtcatctta ttcctggetc ctkyttatt tcetttccct tcetcccaca 1920 accccttttt ccccccattt cttttatttc tttctatttg ttaattacac aactaataca 1980 tgtctatcag aacaattgat atageacaaa aggatataaa gtacgggtga gtgatagctc 2040 atccctgtaa tetageaett tggaaggcca aggcaggeag acca ttgat ccagagttcg 2100 agaccagcct gggcaaeatg gtgaaaccct ?tetetacaa aaaaatacaa aaatttagcc 2160 gggcgtgctg gcaeacacct ?tagtctcag ctaetetgag ggctgaggcg ggaagattga 2220 ttgagcccag gaggtggaag cegeageagt g gctgagat tg gccattg cascccagcc 2280 tgggtgagag agagagaece tgtcttcaaa aaaaaaaaaa aaßaaa 2326 <2iO> 3 211> 2355 <2XZ> ADN <213-» BOBVO sapiens <400l> 3 gaattcggca cgagcacggt gaagagacat gagaggtgta gaataagtgq gaggcccccg 60 gcgccccccc ggtgtccccg cgaggggeec ggggcggggt ccgccggccc tgcgggccgc 120 cggtgaaata eeaeeactet gat gttttt tcaccgaccc ggtgaggcgg gggggcgagc xßo ccegagggge ectcgettct ggcgccaagc gccoagcege gcgccggccg ggeg gacce 240 gotccgggga oagtgccagg tggggagttt gactggggeg gtacacctgt caaacggcaa 300 cgeaggtgtc ctaaggcgag ctcagggagg aeagaaacct cccgtggagc agaagggcaa 360 aagetcgctt gat ttgatt ttcag acga atacagaecg cgaaagcggg gcctcacgat 420 ecttetgacc ttttgggttt raageaggag gtgtc&gaaa agetaccaen gggataaetg 480 gcttgtggcg gccaagcgtc catagegacg tcgctttttg ateett gar. gtcggctctt 540 c t tca g tgaagcagaa ttcaccaagc gttggattgt tcacccacta atagggaacg 600 cgagctgggt ttagacegtc gtgagacagg ttagttttac cctactgatcj acgtgttgtt 660 g cßcggtaa ccc ctcag tacgagagga accgcaggtt cagacattty 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Leu Cys Ala Pxo His Ser He Sor Leu Ser Leu Cys Leu Gly Gly Lys 690 69S 700 trp Sly Cys Arg Tsrp Pro Ser Ser Hiß Pxo Gly Tyr Ser Lyß Xaa Ala 705 710 715 720 Asp Thr Thr Cys Ser Ser Thr Arg Leu Thx Arg Cys eu ein Xaa val 725 730 735 5 Cys Ala Ser Thx Asp Ser Asp Phe Arg Lys Ser Lys Lys Lys Lys Lys 740 745 750 Leu Glu Lys Leu Trp Thr Ser Ser 7S5 760 <2l0> 10 <211> 753 <212> PRT <213> Mono sapiens 10 <220> • <221> INSEGURO <222> 110) <220> <221> INSEGURO <222> ( 13) <220> <221> INSEGURO <222> (32) _5 <220> <221> INSEGURO <222> ( 48 ) <220> <22l INSEGURO • <222> (80) <220> <22 i INSEGURO <222> ( 87 ; 20 <220> <221> INSEGURO <222> <?6) <220> <221 INSEGURO <222> (100) <220> <221> INSEGURO <222> (127) <220> <221> INSEGURO <222> (137) <220> <221> INSEGURO <222> (142) <220> <221> INSEGURO <222> (144) <220> <221> INSEGURO <222> (166) <220> <221> INSEGURO <222> {176) <220> <221> INSEGURO <222> (192) <220> <221> INSEGURO <222> .196) <220> <221> INSEGURO <222> (224¡ <220> <221> INSEGURO <222? 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Gly Phe Xaa Ala Xaa 130 135 140 Val Arg Lys Val Thr Thr Gly He Thr Cly Leu Trp Arg Pro Ser His 145 15.0 155 160 Ser Asp Val Ala Phe Xa* Ser Phe Asp Val Giy Ser Ser Tyr His Xaa 165 170 175 Glu Ala Glu Ph* Thr Lys Arg Trp He Val His Prc Leu He ßly Xaa 180 185 190 Ser Trp v&l Xaa Thr Vai Vai Arg Gln val Ser Phe Thr Leu Leu Met 195 200 20S Cys Cys Cys His Gly Asn Pro Ala Gln Tyr Glu Arg Asn Axg Ag xaa 210 215 220 Axg His Leu Val Tyr Val Leu Gly XAH Gly -Ala Asn Gly Ala Lys Xaa 225 230 235 240 Ser Val Gly L-? Xaa Leu Asn Ala Ser Lyß Ser Glu Ser Arg Pro Gly 245 250 7S5 Thr lie Arg Gln Ar? Arg Gly Ala Ser Val Gly Leu Gly X?? pro Xa. 260 265 270 Pro Arg Leu Ser Pro Pro Ala Gly Arg Pro Pro Pro Ser Thr Arg xaa 275 2ß0 _235 Axg Ala Gly Gly Arg Val Pro Arg Aro Ala Pro Gly Pro Gly Ser Ala 290 295 300 Glu Cys Pro Ser Ser Trp Clu Thr Gly Arg Gly Arg Lys Glv Glv Xaa 305 315 320 Pro Leu Ala Arg Has Ala Pro His Val Arg Ala Arg Ala Glu Phe Xaa 32S 330 33s Ser Ser Thr He His A*rt Arg H1S Thr Ser Ala Cys He Phe Met Xaa 340 345 350 xaa He Leu Phß Leu Trp Val Asp jA Gln Xaa Trp Asp Cys Xaa .Xaa 355 360 ; 365 Thr Trp Xaa Fhe Tyr Phe T¿rp Phe He Glu Lys Ser Ser Tyx Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Asg Leu Tyr Lys Phe Thr Ser Leu Pro Se* Asp Phß Phe Lys Glu 385 390 BSS 400 Arg Mee val Trp Arg Asn Ala Pro His Xaa Tyr Pro Pro M» Thr Xaa 405 410 415 Leu Leu Gln As Aap Phe Lys Gly Tyr Arg Tyr Leu Gin Val Ser Xaa 420 425 430 Arg Gln He Giu Tyr Xaa Asn Phe Cys He Arg Gly Thr Aßp Phe He 435 440 445. Gln Ser Cys Mee Asp Lys Asp Lys Cys Str Arg ?sp Leu Gin Ser Xaa 450 455 460 10 Asn Trp Lys Ser Gln Met Lys Tyr He Ser Ser Ser Thr Thr Ser Xaa 465 470 475 480 Ser Thr Glu Leu Ala Leu Xaa Ser Ser Leu He Pro Thr Tyr Xaa Xaa 485 490 495 Xas Lys Gly Phe He Ser Asn He Leu Xaa Gly He Lys He Lys Xaa 500 505 510 aa Val Lys Leu Phe Ser Leu Ala Phe Xaa Phe Gln Asn He Lys x*« 515 520 525 -^c, P o Ser He Giy His Leu Tyr Cys Thr Arg Bis Cys Val Cys His Ser 530 535 540 Lys Met Phe Ser Trp X?? Cys Ser Glp Xaa Phe Cys Ar? Val Arg Xaa 545 550 555 560 Ser Leu Thr V?X V?I Arg Leu Phß Ser Lys Arg Asn Leu Xaa Thr Xaa 5€5 570 575 Phe Asn Leu Arg Lys al Ser Asn Arg Thr Arg Thr Xaa Thr ?aa ?_e 580 595 590 Thr Leu Gln He Ser Pro Tyr HAß Thr Ala Ser Thr Cys Ala Cys Xaa 0 595 600 605 Leu He Pro Gly Ser Cys Tyr P «s Prß Phe Tyr Phe Leu Ser Leu Xaa 610 615 620 Thr Thr Pro Phe Ser Pro Bis Phe Phe Ser Phe Phe Leu He Val Tyr 625 630 635 640 He Thr Asn Thr Cy* Leu Ser Glu Gln Leu He Xaa Hl-s Lyo Arg Xaa 645 6S0 .6SS Xaa Ser Thr ßly Glu Xaa Xaa Leu He Pro val He Leu Ala Leu Xaa 660 665 670 Ala Lys Ala Gly Arg Ser Leu Glu Ser Aro Val Arg -Asp Gln Pro Glr. 675 680 685 H?S Gly Glu Thr Leu Ser Leu Gln Lys Asn thr Lys He Xa*. Pro Xaa 690 695 700 Val Leu Ala His Thr Cys Ser Leu Sur Tyr Ser Glu Gly Xaa Gly Xaa 705 710 715 720 He Asp Xaa Aia Gln Glu Val Glu Ala Ala Ala Val Arg Xaa Asp Ala 725 730 735 He Ala Leu Gln Pro Gly Xaa Glu Arg Glu Thr Leu Ser Gln Lys Xaa 740 7í5 750 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por" la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. g^É

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Una proteina producida por una célula epitelial y que tiene propiedades inhibitorias del crecimiento de las células epiteliales, caracterizada porque la proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 50-60 kilodaltons.
2. La proteina de la reivindicación 1, caracterizada porque las células epiteliales son del sistema nervioso central, corazón, intestino delgado, intestino grueso, apéndice, recto, células linfáticas, células de la médula ósea, pulmón y vias respiratorias, vejigas, útero, próstata, testículos, ovario, higado, páncreas, glándula adrenal, glándula salival, y glándula mamaria.
3. La proteina de la reivindicación 1, caracterizada porque las células epiteliales son células de colon, ovario, próstata, bazos, testículos o timo. . La proteina de la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina está codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad substancial sobre al menos un tercio de una secuencia de .*_Í.-UJ_. í-^^^^i?ik1?^^? sm^É ?m? ácido nucleico seleccionada a partir de las Sec. Id. Nos: 1, 2, 3 y
4. 5. La proteina de la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina es específicamente
5 reconocida por el anticuerpo anti-mamastatina, 7G6.
6. Una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque comprende las SEC ID NOs: 1, 2, 3, 4, o una secuencia de ácido nucleico que tiene identidad substancial sobre al menos un tercio de la secuencia con las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 10 o 4. •
7. Un método para detectar cáncer de células epiteliales, caracterizado porque comprende: analizar fluido corporal por la presencia o cantidad de la proteina de la reivindicación 1 o una 15 secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6; y correlacionar una reducción o ausencia de dicha • proteina o dicha secuencia de ácido nucleico con células de cáncer epiteliales.
8. Un método para tratar el cáncer de células 20 epiteliales en un paciente, caracterizado porque comprende: administrar al paciente, la proteina de la reivindicación 1 o una secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 6.
9. Un equipo de diagnóstico, caracterizado porque comprende : la proteina de la reivindicación 1 o la secuencia • de ácido nucleico de la reivindicación 6; y opcionalmente el anticuerpo que específicamente enlaza la proteina de la reivindicación 1.
10. El equipo de diagnóstico de la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo es 7G6.
11. Uso de la proteína de la reivindicación 1 para 10 la manufactura de un medicamento para el tratamiento del # cáncer de células epiteliales. 15 20 -"5*9**,** RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a inhibidores del crecimiento de las células epiteliales diferencialmente expresadas en células epiteliales cancerosas y normales. Las proteínas ICCE y la secuencia de ácido nucleico que las codifican son empleadas en la diagnosis y tratamiento de cánceres de células epiteliales, por ejemplo, próstata, ovario, cáncer de colon y similares. 10 • 15 • 20
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