MXPA01010082A - Virus recombinantes de influenza para vacunas y terapia de genes. - Google Patents

Virus recombinantes de influenza para vacunas y terapia de genes.

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Abstract

La invencion proporciona una composicion util para la preparacion de virus A de la influenza, por ejemplo, en ausencia de un virus auxiliar.

Description

VIRUS RECOMBINANTES DE INFLUENZA PARA VACUNAS Y TERAPIA DE GENES. Antecedentes de la Invención. La capacidad de generar virus infecciosos de ARN a partir de cADNs clonados, ha contribuido grandemente al entendimiento biológico de estos patógenos, y asi a métodos mejorados para el control de enfermedades (Palese y colaboradores, 1996) . Sin embargo, este progreso ha estado relativamente limitado para los virus de ARN de sentido negativo en comparación con los de sentido positivo, ya que ni el ARN viral genómico (vARN) ni el ARN complementario antigenómico (cARN) de los virus de ARN de sentido negativo, pueden servir como una plantilla directa para la síntesis de proteinas. Más bien, el vARN, después de su formación en cápsidas por la nucleoproteina viral (NP) , se debe transcribir en un mARN de sentido positivo por el complejo viral de polimerasa y ARN. Asi, se forma la unidad minima de replicación por el vARN genómico que forma un complejo con la NP y las proteinas de polimerasa. A pesar de estos obstáculos, se han establecido métodos genéticos inversos para producir virus de ARN de sentido negativo no segmentados, incluyendo el virus de la rabia (Snall y colaboradores, 1994), virus de estomatitis vesicular (Lawson y colaboradores, 1995) ; helan y colaboradores, 1995) , Ref: 133313 virus del sarampión (Radec e y colaboradores, 1995) , virus sincitial respiratorio (Collins y colaboradores, 1995) , virus de Sendai (Garcin y colaboradores, 1995; Kato y colaboradores, 1996) , virus de la peste bovina (Barón y colaboradores, 1997), virus de tipo 3 de la parainfluenza humana (Hoffman y colaboradores, 1997) y SV5 (He y colaboradores, 1997) . Las familias de Orthomyxoviridae , Arenaviridae y Bunyaviridae contienen genomas segmentados de ARN de hebra negativa e incluyen diversos patógenos humanos y animales, por ejemplo los virus de la influenza tipos A, B y C ( Orthomyxoviridae) , virus linfocitico de la coriomeningitis (LCMV) (Arenaviridae) , y virus de la fiebre hemorrágica y encefalitica (Bunyaviridae, Arenaviridae) . Sus genomas consisten de dos (Arenaviridae) , tres (Bunyaviridae) , o de seis a ocho ( Orthomyxoviridae) moléculas de ARN de hebra simple de polaridad negativa (complementarias al mARN) . Los vARNs interactúan con NP y con la polimerasa de ARN dependiente del ARN viral para formar complejos de ribonucleoproteinas (RNPs) . Las RNPs están rodeadas por una bicapa de lipidos derivada de la célula huésped. Se insertan en esta envoltura las glicoproteinas virales, que son esenciales para el enlace del receptor y la entrada dentro de la célula huésped. Asi, la generación de virus de ARN segmentados de sentido negativo a partir de cADNs clonados, plantea un desafio formidable ya que se debe producir un vARN separado por cada segmento de gen. Bridget y Eliot (1996) produjeron un virus de Bunyamwera (de la familia Bunyaviridae) a partir de cADNs clonados que codifican tres segmentos de vARN antigenómico, de sentido positivo. Sin embargo, la eficiencia de recuperación del virus es baja. Ninguno de los ortomixovirus, que contienen seis (togotovirus) , siete (virus C de la influenza) u ocho (virus A y B de la influenza) segmentos de ARN de sentido negativo, se han producido completamente a partir de cADNs clonados. Este retraso en el progreso se ha sentido más agudamente en los esfuerzos para controlar las infecciones por el virus de la influenza. Palese y sus colegas (Enami y colaboradores, 1990) fueron pioneros de la genética inversa, del sistema dependiente del virus auxiliar para el virus A de la influenza (Figura ÍA) . En su enfoque, los complejos de NRP se generan por una síntesis in vitro del vARN en presencia de polimerasa purificada y proteinas NP, y después se usan para transfectar células eucarióticas. La infección posterior con el virus auxiliar de la influenza A, resulta en la generación de virus que poseen un gen derivado del cADN clonado. Un segundo método, desarrollado por Neumann y colaboradores, (1994), se basa en la síntesis in vivo de vARN por la polimerasa I de ARN (figura IB), una enzima celular que transcribe el ARN ribosomal que carece de la terminación 5' y de la cola poli A 3' . Las células infectadas con el virus de la influenza y transfectadas con un plásmido que contiene el virus clonado de influenza de cADN, flanqueado por el promotor de murina de polimerasa I de ARN y las secuencias de terminador, condujeron a la producción de los virus transfectantes . Con ambos métodos sin embargo, se deben seleccionar los transfectantes a partir de un vasto repertorio de virus auxiliares, lo que requiere un fuerte sistema de selección y complica la generación de virus defectuosos en el crecimiento. Se desarrolló un sistema para generar partículas similares al virus, incompetentes en la replicación (VLPs) por Mena y colaboradores, (1996), en el cual un vARN similar al virus de la influenza codifica un gen reportero, se transcribe in vi tro y se transfecta en células eucarióticas. Todas las diez proteinas del virus de la influenza se expresan a partir de plásmidos bajo el control de un promotor de la polimerasa ARN T7. Cuando se infectan las células transfectadas con un virus recombinante de vacuna que expresa la polimerasa ARN 11 , producen los VLPs de la influenza. Sin embargo, la eficiencia del sistema es baja: en el 25% de los experimentos, los investigadores fallaron al detectar la expresión del gen reportero. Además, el virus de vacuna expresa más de 80 proteinas, alguna de las cuales podrian afectar el ciclo de vida viral de la influenza. Entonces, lo que se necesita es un método para preparar virus segmentados de ARN de hebra negativa, por ejemplo, ortomixovirus tales como los virus A de la influenza, completamente a partir de cADNs clonados. Breve descripción de la invención. La invención proporciona al menos uno de los siguientes vectores aislados purificados: un vector que comprende a un promotor ligado operativamente a un cADN del PA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PB2 del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del HA del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un virus de la influenza cADN del NP, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NA del virus de la 5 influenza, ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del M del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de transcripción, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NS del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción. El cADN puede estar en la orientación sentido o antisentido en relación con el promotor. Asi, un vector de la invención puede codificar una proteina de ortomixovirus (sentido), o vARN (antisentido) . Se puede emplear cualquier promotor para expresar una proteina viral. Los promotores preferidos para los vectores que codifican el vARN incluyen, pero no se limitan a, un promotor de polimerasa I de ARN, un promotor de polimerasa II de ARN, un promotor de polimerasa III de ARN, un promotor P7, y un promotor T3. Se prefiere además que el promotor de la polimerasa I de ARN sea un promotor de la polimerasa I de ARN humana. Las secuencias preferidas de terminación de la transcripción para los vectores que codifican el vARN incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de terminación de la ^aa a«-transcripción de la polimerasa I de ARN, una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa II de ARN, o una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa III de ARN, o una ribozima. Preferiblemente, los vectores comprenden cADN de la influenza, por ejemplo, ADN de la influenza A (por ejemplo cualquier gen de la influenza A incluyendo cualquiera de los 15 subtipos HA o de los 9 de NA) , B o C (ver los capítulos 45 y 46 de Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996), que se incorporan específicamente aqui como referencia) , aunque se vislumbra que los genes de cualquier virus se puedan emplear en los vectores o métodos de la invención. La invención proporciona una composición que comprende una pluralidad de vectores de ortomixovirus de la invención. En una modalidad de la invención, la composición comprende: a) al menos dos vectores seleccionados de un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PA del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PB2 del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un HA del cADN del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NP del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NA del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del M del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NS del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción; y b) al menos dos vectores seleccionados de un vector que codifica el PA del virus de la influenza, un vector que codifica al PBl del virus de la influenza, un vector que codifica al PB2 del virus de la influenza, y un vector que codifica al NP del virus de la influenza. Preferiblemente, los vectores que codifican las proteinas virales comprenden además una secuencia de terminación de la transcripción. Se prefiere que un promotor para los vectores que comprenden los cADN del virus de la influenza incluyan un promotor de la polimerasa I de ARN, un promotor de la polimerasa II de ARN, un promotor de la polimerasa III de ARN, un promotor 11 , y un promotor T3. También se prefiere que cada vector que comprende el cADN del virus de la influenza, comprenda una secuencia de terminación de la transcripción tal como una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I del ARN, una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa II del ARN, o una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa III del ARN. Preferiblemente, los vectores comprenden el ADN de la influenza, por ejemplo ADN de la influenza A, B o C. Más preferiblemente, la composición comprende una pluralidad de vectores de ortomixovirus, que comprenden: a) al menos dos vectores seleccionados a partir de un vector que comprende un promotor de la polimerasa I de ARN, ligado operativamente a un cADN del PA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I de ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I de ARN, ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I de ARN, ligado operativamente a un cADN del PB2 del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del HA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del NP del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN de NA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN, ligado operativamente a un cADN del M del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, y un vector que comprende un promotor de polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del NS del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I del ARN; y b) al menos dos vectores seleccionados de un vector que codifica el PA del virus de la influenza, un vector que codifica el PBl del virus de la influenza, un vector que codifica el PB2 del virus de la influenza, un vector que codifica el NP del virus de la influenza, un vector que codifica el HA del virus de la influenza, un vector que codifica el NA del virus de la influenza, un vector que codifica el Ml del virus de la influenza, un vector que codifica el M2 del virus de la influenza y un vector que codifica el NS2 del virus de la influenza. Otra modalidad de la invención comprende una composición de la invención como se describe arriba, que comprende además un vector que comprende un promotor ligado a secuencias no codificadoras 5' del ortomixovirus ligado a una liga deseada a las secuencias no codificadoras 3' del ortomixovirus ligadas a las secuencias de terminación de la transcripción. La introducción de tal composición a una célula huésped permisiva para la replicación del ortomixovirus, resulta en un virus recombinante que comprende el vARN que corresponde a las secuencias del vector que comprende secuencias no codificadoras del ortomixovirus 5' ligadas a un cADN ligado a unas secuencias no codificadoras 3' de ortomixovirus. Preferiblemente el cADN está en una orientación antisentido. También preferiblemente, el promotor es un promotor de polimerasa I de ARN, un promotor de polimerasa II de ARN, un promotor de polimerasa III de ARN, un promotor T7, y un promotor T3. También se prefiere que la secuencia de terminación de la transcripción, sea una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I de ARN, una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa II de ARN, o una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa III de ARN o una ribozima. Por ejemplo, el cADN puede codificar un epitope inmunogénico, tal como un epitope útil en la terapia de cáncer o vacuna. Se pueden ligar físicamente una pluralidad de vectores de la invención o cada vector puede estar presente en un plásmido individual u otro vehículo de entrega, por ejemplo, ácido nucleico, lineal. La invención también proporciona un método para la preparación del virus de la influenza. El método comprende poner en contacto una célula con una pluralidad de los vectores de la invención, por ejemplo, secuencial o simultáneamente, por ejemplo, empleando una composición de la invención en una cantidad efectiva para producir un virus infeccioso de la influenza. La invención también incluye el aislamiento del virus a partir de una célula que hace contacto con la composición. Asi, la invención suministra además virus aislados, asi como una célula huésped que hace contacto con la composición o el virus aislado de la invención. Como se describe de aqui en adelante, los virus de la influenza A se preparan completamente de cADN clonados. El enfoque de genética inversa aqui descrito, es altamente eficiente y se puede usar para introducir mutaciones dentro de cualquier segmento de genes y desarrollar los sistemas de entrega de genes de base virus de la influenza. Por ejemplo, las células de riñon humano embriónico (293T) se transfectaron con ocho plásmidos, cada uno codificando un ARN viral del virus A/ SN/33 o A/PR/8/34 (HINI) , flanqueado por el promotor humano de polimerasa I de ARN y el terminador de ratón de polimerasa I de ARN, junto con los plásmidos que codifican la nucleoproteina viral y las polimerasas virales PA, PB2 y PBl. Esta estrategia resulta en > 1 x 103 unidades formadoras de placas (pfu) de virus por mililitro de sobrenadante 48 horas posteriores a la transfección. Dependiendo del virus generado, la adición de plásmidos que expresan todas las proteinas estructurales virales remanentes, conduce a un incremento substancial en la producción de virus, > 3 x 104 pfu/ml. La genética inversa también se empleó para generar un virus reclasificante que contiene el gen PBl del virus A/PR/8/34, con todos los otros genes representando A/WSN/33. Los virus adicionales producidos por este método tuvieron mutaciones en el gen PA o poseen un epitope exterior en la cabeza de la proteina de la neuraminidasa . Además, se puede emplear el mismo enfoque para otros virus para generar virus de ARN de hebra negativa no segmentados (esto es Paramyxoviridae , Rhabdoviridae y Filoviridae) u otros virus de ARN de hebra negativa segmentados por ejemplo Arenaviridae y Buniviridae, completamente a partir de cADN clonado. Además, la expresión del cARN en células en lugar de vARN puede mejorar la eficiencia de generación del virus. El método de la invención permite la fácil manipulación del virus de la influenza, por ejemplo, con la introducción de mutaciones atenuantes dentro del genoma viral. Además, ya que los virus de la influenza inducen una fuerte inmunidad humoral y celular, la invención enriquece de forma importante estos virus como vectores de vacuna, particularmente en vista de la disponibilidad de las variantes naturales de los virus, que se pueden emplear secuencialmente, permitiendo el uso repetitivo para terapia de genes. Asi, la invención proporciona vectores o plásmidos aislados y purificados, que expresan o codifican las proteinas del virus de la influenza, o expresan o codifican el vARN de la influenza, tanto vARN nativo como recombinante. Asi, un vector o plásmido de la invención, puede comprender una estructura de lectura abierta o gen de interés, por ejemplo, un gen extraño que codifica un péptido o proteina inmunogénica útil como una vacuna. Preferiblemente, el vector o plásmido que expresa el vARN de la influenza, comprende un promotor, por ejemplo, una polimerasa I de ARN, apropiado para la expresión en una célula huésped particular, por ejemplo, células huésped de aves o mamíferos tales como células caninas, felinas, equinas, bovinas, ovinas, de primates, incluyendo células humanas. También preferiblemente los vectores o plásmidos comprenden ADN útil para preparar vARN de la influenza que comprende secuencias de terminación de la transcripción de la polimerasa I y el ARN. Para los vectores o plásmidos que comprenden un gen o una estructura de lectura abierta de interés, se prefiere que el gen o la estructura de lectura abierta estén flanqueados por las secuencias no codificadoras 5' y 3' del virus de la influenza, y aun más preferiblemente, que la estructura de lectura abierta o gen se ligue operativamente a un promotor de polimerasa I de ARN y a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I de ARN.
Como se describe de aqui en adelante, se transfectaron 293T con plásmidos que codifican las proteinas estructurales del virus A de la influenza, junto con un plásmido que contenia el gen reportero de la proteina de fluorescencia verde (GFP) , flanqueada por un promotor y terminador de la polimerasa I de ARN. La transcripción intracelular del último constructo por la polimerasa I y el ARN, generó el vARN de GFP que se empacó dentro de partículas parecidas al virus de la influenza. Este sistema, que produjo más de 104 partículas infecciosas por mililitro de sobrenadante, puede ser útil en los estudios de la replicación del virus de la influenza y la formación de partículas. También puede beneficiar los esfuerzos en la producción de vacunas y en el desarrollo de vectores mejorados para terapia de genes. Por lo tanto, la invención también proporciona una célula huésped, el genoma de la cual se aumenta establemente con al menos una molécula recombinante de ADN. La molécula recombinante de ADN incluye al menos uno de los siguientes: una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado al primer sitio lox ligado a un segmento de ADN, que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora del HA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora NA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio Jox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora del Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora del NS2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio JoxP, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora PA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora PBl del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora PB2 una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada al primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de terminación o de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora NP del virus de la influenza.
Preferiblemente, la célula huésped se aumenta con una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora HA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora NA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora MI del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza. Preferiblemente, los sitios Jox son sitios JoxP. La invención también suministra un método para la preparación de virus de la influenza defectuosos en la replicación infecciosa. El método comprende hacer contacto de una célula huésped que se aumenta con al menos una molécula recombinante de ADN de la invención, por ejemplo codificando HA, NA, Ml, M2, NS2, PA, PBl, PB2 o NP, con un virus recombinante de la influenza que comprende: vARN que comprende una estructura de lectura abierta Cre, y vARNs que comprenden genes de influenza que no se expresan por las células huésped. El virus se recupera después a partir de la célula huésped con la que se hizo contacto. Preferiblemente, el virus recombinante comprende además vARN que comprende una estructura de lectura abierta deseada. Alternativamente, la célula huésped aumentada hace contacto con un vector que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica Cre, y una pluralidad de vectores cada uno que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del virus de la influenza que no está presente en la célula huésped. El virus se recupera después. La invención también proporciona una célula huésped, el genoma de la cual se aumenta con una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a una primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora de proteina de enlace en la superficie de la célula huésped; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a una primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora de una proteina de fusión; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la trascripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la trascripción, ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza. Preferiblemente, los sitios Jox son sitios loxP. Todavía otra modalidad es una célula huésped, el genoma de la cual se aumenta con una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora de la proteina de fusión y enlace en la superficie de la célula huésped; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio Jox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio Jox, ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza. Preferiblemente, los sitios Jox son sitios loxP. Las células huésped aumentadas con las moléculas recombinantes de ADN como se describieron anteriormente son útiles para preparar virus de influenza defectuosos en la replicación infecciosa. Por ejemplo, una célula huésped transformada establemente con moléculas recombinantes de ADN que codifican HA, NA, Ml, M2 y NS2, hace contacto con una pluralidad de vectores, esto es, vectores que expresan el vARN que comprende una estructura de lectura abierta Cre, de ARN que comprende PA, vARN que comprende NP, vARN que comprende PBl, vARN que comprende PB2, y opcionalmente, vARN que comprende un gen de interés; y vectores que codifican el PA, PBl, PB2 y NP. Los métodos de producción de los virus aqui descritos, que no requieren la infección con un virus auxiliar, son útiles en los estudios virales de mutagénesis y en la producción de vacunas (por ejemplo, para el SIDA, influenza, hepatitis B, hepatitis C, rinovirus, filovirus, malaria, herpes, y enfermedades de la boca y los pies) y vectores de terapia de genes (por ejemplo para el cáncer, SIDA, adenosina desaminasa, distrofia muscular, deficiencia de la ornitina transcarbamilasa, y tumores del sistema nervioso central) . Asi, se proporciona un virus para su uso en terapia médica (por ejemplo, para una vacuna o terapia de genes) . Por ejemplo, la invención proporciona un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, por ejemplo, una bacteria, virus o parásito o un tumor maligno. El método comprende administrar al individuo una cantidad de al menos un virus aislado de la invención, opcionalmente en combinación con un adyuvante, efectivo para inmunizar al individuo. El virus comprende vARN que comprende un polipéptido codificado por el patógeno o un polipéptido especifico de tumor. También se proporciona un método para aumentar o incrementar la expresión de una proteina endógena en un mamífero que tiene una indicación o enfermedad caracterizada por una cantidad disminuida o una carencia de la proteina endógena. El método comprende administrar al mamífero una cantidad de un virus aislado de la invención, efectiva para aumentar o incrementar la cantidad de la proteina endógena en el mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano. La invención también proporciona vectores y métodos para la producción recombinante de virus de hebra positiva, por ejemplo, virus de ARN en sentido positivo. Asi, la invención proporciona un vector que comprende un segmento de ADN que comprende las secuencias de iniciación de la transcripción de la polimerasa I de ARN, ligadas operativamente a un segundo segmento de ADN que comprende la secuencias a partir de un virus de ARN en sentido positivo, opcionalmente ligado operativamente a un tercer segmento de ADN que comprende las secuencias de terminación de la transcripción de la polimerasa I de ARN. También se suministra un método para el uso de vectores para preparar virus recombinantes. El método es particularmente útil ya que emplea ADN clonado y técnicas de transfección, evitando asi el manejo de ARN. Además, la transcripción de la polimerasa I del ARN es altamente eficiente y tiene alta fidelidad. Para virus de ARN en sentido positivo cuyo ARN genómico está sin cubrir (por ejemplo pestivirus, virus de la hepatitis C, y Picornaviridae, incluyendo poliovirus, rhinovirus, virus de la hepatitis A, y virus de enfermedades de la boca y los pies) , se introduce un cADN que codifica el genoma de longitud completa en la orientación en el sentido genómico entre el promotor de la polimerasa I y el ARN y las secuencias del terminador. La transfección del plásmido resultante en células huésped permisivas, produce un ARN genómico para la replicación del virus. Diversos virus de ARN en sentido positivo, contienen ARN geonómicos cubiertos (por ejemplo, flavivirus, incluyendo el virus de la fiebre del dengue y diversos virus de la encefalitis) . Aunque los transcriptos de la polimerasa I y el ARN no están cubiertos, un cADN que codifica el genoma de longitud completa de los virus del ARN que tienen ARN genómicos cubiertos, se introduce en la orientación de sentido antigenómico en un vector de transcripción de la polimerasa I y el ARN. Después de la transfección del plásmido resultante, la polimerasa I y el ARN celular transcriben un ARN antigenómico (sin cubrir) . Además, la cotransfección con plásmidos de expresión de proteinas para las proteinas requeridas para los resultados de la replicación, en la replicación del ARN antigenómico, producen asi ARN genómico y finalmente virus infecciosos. Breve descripción de los dibujos. Figura 1. Diagrama esquemático de los sistemas establecidos de genética inversa. En el método de transfección de RNP (A) , se ensamblan proteinas de polimerasa y NP purificadas dentro de NRPs con el uso de un vARN sintetizado in vitro. Las células se transfectan con RNPs, seguido de una infección con virus auxiliar. En el método de la polimerasa I y el ARN (B) , se transfectan un plásmido que contiene el promotor de la polimerasa I y ARN, un cADN que codifica el vARN a ser rescatado, y el terminador de la polimerasa I y ARN dentro de las células. La transcripción intracelular por la polimerasa I y el ARN, produce vARN sintético, que se empaca dentro de las partículas del virus de la progenie con infección con el virus auxiliar. Con ambos métodos, los virus transfectantes (esto es, aquellos que contienen ARN derivado del cADN clonado) se seleccionan a partir de la población del virus auxiliar. Figura 2. Diagrama esquemático de la generación de los constructos de polimerasa I de ARN. Los cADN derivados del virus de la influenza se amplificaron por PCR, se digirieron con BsmBI y se clonaron dentro de los sitios BsmBI del vector pHH21 (E. Hoffmann, Ph.D. tesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany) , que contiene al promotor humano de la polimerasa I de ARN (P) y el terminador de ratón de la polimerasa I de ARN (T) . El nucleótido de timidina en la dirección 5' de la secuencia del terminador (*T) representa la terminación 3' del ARN viral de la influenza. Las secuencias del virus A de la influenza se muestran en letras negritas. Figura 3. Método propuesto de genética inversa para generar los virus segmentados de ARN en sentido negativo. Los plásmidos que contienen el promotor de polimerasa I de ARN, un cADN por cada uno de los ocho segmentos virales de ARN, y el terminador de polimerasa I de ARN, se transfectan en células junto con los plásmidos de expresión de proteina. Aunque se pueden generar virus infecciosos con los plásmidos que expresan PA, PBl, PB2 y NP, la expresión de todas las proteinas estructurales restantes (mostradas entre corchetes) incrementa la eficiencia de la producción de virus dependiendo del virus generado. Figura 4. Detección del epitope FLAG en células infectadas con un virus transfectante. Se usó el teñido por anticuerpos para identificar el NA en células MDCK infectadas con el virus PR8-WSN-FL79 (A, D) o el virus A/WSN/33 de tipo silvestre (B, E) , o sobre células MDCK simuladamente infectadas (C, F) . Nueve horas después de la infección, se fijaron las células con paraformaldehido, se trataron con Tritón X-100 y se incubaron con anticuerpos monoclonales anti-FLAG (A-C) o anti- SN NA (D-F) . El teñido Golgi intenso (rojo) es aparente en las muestras positivas (A, D y E) .
Figura 5. Recuperación de los mutantes PA. El gen de PA de cada virus se amplificó por RT-PCR con cebadores que resultaron en un fragmento de 1226 pares base (posición 677 a la 1903 del mARN, pistas 1, 3, 5) que se digirió después con la enzima de restricción Bsp 1201 (en la posición 846 del mARN pistas 4 y 7) o PvuII (en la posición 1284 del mARN pistas 2, 6) . La presencia de los sitios Bsp 1201 o PvuII en los productos de PCR produjeron fragmentos de 169 pb y 1057 pb o 607 pb y 619 pb respectivamente. MW= marcadores de peso molecular. Figura 6A y 6B. Cebadores empleados para amplificar las secuencias de influenza. Figura 7. El plásmido pPolI-GFP para generar el ARN parecido al virus de la influenza que codifica la proteina GFP. Este plásmido contiene el gen GFP (derivado de pEGFP-Nl; Clontech, Palo Alto, CA) en una orientación antisentido entre las regiones no codificadoras 5' y 3' del segmento 5' y 3' del segmento 5 del virus A de la influenza, flanqueado por el promotor humano de polimerasa I de ARN y el terminador de ratón de polimerasa I de ARN. Figura 8. Diagrama esquemático de la estrategia de generación del VLP. Se transfectaron dentro de células 293T, plásmidos de expresión de proteina individuales y un plásmido que contenia al promotor de la polimerasa I de ARN, un cADN que codifica al gen reportero GFP, y el terminador de la polimerasa I de ARN. La transcripción intracelular de la polimerasa I de ARN produce el vARN del GFP de polaridad negativa como se indica por las letras invertidas. Se cosecharon los sobrenadantes que contenían los VLPs, se mezclaron con el virus auxiliar de la influenza y se inocularon dentro de células MDCK. Figuras 9A y 9B. Las proteinas PA, PBl, PB2 y NP del virus A de la influenza forman cápsidas del vARN de GFP producido por la polimerasa I de ARN, conduciendo a la expresión de la GFP. Se transfectaron células 293T con los plásmidos que expresaban las proteinas PB2, PBl, PA y NP (A) o con todos los plásmidos excepto el que expresaba la proteina NP (B) , junto con la polimerasa I de ARN-plásmido del gen GFP para la síntesis intracelular del vARN del gen reportero. Las células se fijaron 48 horas después de la transfección, y se determinó la expresión de GFP con un microscopio de fluorescencia. Figura 10A y 10B. Generación de los VLPs de la influenza infecciosos. Se transfectaron células 293T con 9 plásmidos, cada uno expresando una proteina estructural viral diferente (A) , o con 8 plásmidos, omitiendo el constructo para NP (B) , junto con la polimerasa I de ARN-plásmido del gen GFP. 48 horas después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes que contenían el VLP, se mezclaron con un virus auxiliar A/ SN/33 y se inocularon dentro de células MDCK. Se fijaron las células 10 horas después de la infección, y se determinó la expresión de GFP con un microscopio de fluorescencia. Figura 11. Esquema del uso de la recombinasa Cre para expresar la proteina NS2 de la influenza en una célula, el genoma de la cual se aumenta en una molécula recombinante de ADN. El genoma de la célula comprende una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor ligado a un sitio de recombinación especifico del sitio (por ejemplo loxP) ligado a una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un sitio de recombinación especifico del segundo sitio en la misma orientación que el sitio de recombinación especifico del primer sitio ligado al gen NS2. Figura 12. Preparación del virus de la influenza defectuoso en la replicación. Descripción detallada de la invención Definiciones Como se usa aqui, los términos "aislado y/o purificado" se refiere a la preparación in vi tro, aislamiento y/o purificación de un vector o plásmido de la invención, de manera que no esté asociado con substancias in vivo, o se purifique substancialmente a partir se substancias in vi tro. Como se usa aqui, el término "ácido nucleico recombinante" o "secuencia o segmento de ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo el ADN, que sea derivado o aislado a partir de una fuente, que se puede alterar químicamente de forma posterior in vi tro, de manera que su secuencia no se presenta naturalmente, o corresponde a secuencias que se presentan naturalmente que no se colocan como se posicionarian en el genoma natural. Un ejemplo del ADN "derivado" a partir de una fuente, seria una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento útil, y que se sintetiza químicamente después en una forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" a partir de una fuente, seria una secuencia útil de ADN que se extirpa o separa de dicha fuente por medios químicos, por ejemplo, mediante el uso de endonucleasas de restricción, de manera que se puede además manipular, por ejemplo, amplificar para su uso en la invención, por la metodología de la ingeniería genética. Como se usa aqui, "recombinación especifica del sitio" pretende incluir los siguientes tres eventos: 1) eliminación de un segmento objetivo de ADN flanqueado por sitios o secuencias de recombinación especifica del sitio, por ejemplo, sitios loxP; 2 ) inversión de la secuencia de nucleótido de un segmento objetivo de ADN flanqueado por sitios o secuencias de recombinación especificas del sitio, por ejemplo, sitios Jox; y 3) intercambio reciproco de segmentos objetivos de ADN próximos a los sitios de recombinación especifica del sitio o secuencias, por ejemplo, sitios Jox localizados en moléculas diferentes de ADN. Los sistemas de recombinasa específicos del sitio incluyen pero no se limitan a, el sistema Cre/loxP del bacteriófago Pl (patente U.S. No. 5,658,772). Para remediar la reversibilidad de una reacción de recombinación especifica en el sitio, la estructura del sistema de recombinación se puede alterar. Se puede mutar la secuencia de recombinación especifica del sitio en una forma tal que el producto de la reacción de recombinación ya no se reconozca como un substrato para la reacción inversa, con lo que se estabiliza el evento de integración o extirpación. Por ejemplo, para separar las secuencias indeseables, se colocan los sitios Jox en la misma orientación para flanquear las secuencias indeseables. Otros sitios Jox incluyen los sitios loxB, loxL y loxR que son secuencias de nucleótidos aisladas a partir de E. coli (Hoess y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 3398 (1982)). Se pueden también producir los sitios Jox por una diversidad de técnicas sintéticas que se conocen en el arte. Por ejemplo, las técnicas sintéticas para la producción de sitios Jox se describen por Ito y colaboradores, Nuc. Acid Res., 10, 1755 (1982) y Ogilvie y colaboradores, Science, 214, 270 (1981) . Como se usa aqui, la expresión "sitio Jox" significa una secuencia de nucleótidos en la cual el producto del gen cre puede catalizar una recombinación especifica del sitio. LoxP es una secuencia de nucleótidos de 34 pares base que se puede aislar a partir del bacteriófago Pl por los métodos conocidos en el arte (ver por ejemplo, Hoess y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 3398 (1982) ) . El JoxP consiste de dos repeticiones invertidas de 13 pares base separados por una región espadadora de 8 pares base. Como se usa aqui, la expresión "gen cre" significa una secuencia de nucleótidos que codifica un producto de un gen enzimático que efectúa la recombinación especifica del sitio del ADN en células eucarióticas en los sitios Jox. Un gen cre que se puede aislar a partir del bacteriófago Pl por los métodos conocidos en el arte (ver Abremaid y colaboradores, Cell, 32, 1301-1311 (1983)). Replicación del virus de la influenza. Los virus A de la influenza poseen un genoma de ocho ARNs virales de sentido negativo de hebra simple (vARNs) que codifican un total de 10 proteinas. El ciclo de vida del virus de la influenza comienza con el enlace de la hemaglutinina (HA) a los receptores que contienen el ácido siálico en la superficie de la célula huésped, seguido por la endocitosis mediada por el receptor. El pH inferior en los endosomas tardíos, activa un giro conformacional en el HA, con lo cual se expone la terminación N de la subunidad HA2 (el denominado péptido de fusión) . El péptido de fusión inicia la fusión de la membrana viral y endosomal, y se liberan del citoplasma la proteina de matriz (Ml) y los complejos RNP. Los RNPs consisten de la nucleoproteina (NP) , que encapsida al vARN, y el complejo de polimerasa viral, que se forma por las proteinas PA, PBl y PB2. Se transportan los RNPs dentro del núcleo, en donde toma lugar la transcripción y la replicación. El complejo de polimerasa y ARN cataliza tres reacciones diferentes: La síntesis de un mARN con una cubierta 5' y una estructura PoliA 3', de un ARN complementario de longitud completa (cARN) , y de un vARN genómico usando el cADN como plantilla. Los vARNs recientemente sintetizados, NP y proteinas de polimerasa, se ensamblan después dentro de NRPs, se exportan del núcleo y se transportan a la membrana del plasma, en donde sucede el florecimiento de las partículas del virus de la progenie. La proteina de neurominidasa (NA) juega un papel crucial tardío en la infección, al eliminar el ácido siálico de los sialiloligosacáridos, liberando asi viriones recientemente ensamblados a partir de la superficie celular y evitando la autoagregación de las partículas de virus. Aunque el ensamble del virus involucra interacciones proteina-proteina y proteina-vARN, la naturaleza de estas interacciones es ampliamente desconocida. Togotovirus El togotovirus (THOV) representa un nuevo género en la familia de Orthomyxoviridae. Se transmite por las garrapatas, y se ha encontrado en animales domésticos incluyendo camellos, cabras y ganado. Consecuentemente, el THOV se puede replicar en células de vertebrados y garrapatas. El genoma del THOV comprende seis segmentos de ARN en sentido negativo de hebra simple. Las proteinas codificadas por los tres grandes segmentos, muestran una homología importante con el virus de la influenza con las proteinas de polimerasa PB2, PBl y PA. El segmento 5 codifica una proteina relacionada con el NP del virus de la influenza. La glicoproteina THOV, que se codifica por el segmento 4, no es homologa ni con el HA ni con el NA del virus de la influenza, pero muestra una similitud de secuencia con la glicoproteina del Baculovirus. El segmento más pequeño se piensa que codifica una proteina de matriz y no se parece a ninguna de las proteinas del virus de la influenza. Como el virus de la influenza, las terminaciones 3' y 5' del vARN se requieren para promover la actividad, y esta actividad se localiza en las terminales 14 y 15 de los nucleótidos de las terminaciones 3' y 5' del vARN respectivamente. La síntesis de mARN del THOV, se ceba por las estructuras de cubierta derivadas de la célula huésped. Sin embargo, en contraste con el virus de la influenza, solamente las estructuras de cubierta (sin los nucleótidos adicionales) se desdoblan de los mARNs celulares (Albo y colaboradores, 1996; Leahy y colaboradores, 1997; Weber y colaboradores, 1996) . Los ensayos de desdoblamiento in vi tro, revelan que las terminaciones 5' y 3' del vARN, se requieren para la actividad de la endonucleasa (Leahy y colaboradores, 1998), pero la adición de un promotor del modelo de cARN no estimula la actividad de la endonucleasa (Leahy y colaboradores, 1998), como se ha demostrado por el virus de la influenza (Cianci y colaboradores, 1995; Hagen y colaboradores, 1994) . Una estructura de "gancho" se ha propuesto para el THOV (Leahy y colaboradores, 1997; Weber y colaboradores, 1997), que es similar a la estructura de sacacorchos propuesta para el virus de la influenza (Flick y colaboradores, 1996) . Esta estructura de "gancho" sin embargo, se encuentra solamente en el promotor de vARN del THOV. La secuencia del promotor de cADN, no permite la formación de pares base entre las posiciones 2 y 9 y entre la 3 y 8 en la terminación 5' del cARN. Las alteraciones en las posiciones 3 u 8 para permitir la formación de pares base entre estos nucleótidos, estimula la actividad de la endonucleasa, que es una evidencia fuerte de soporte de la estructura propuesta de gancho (Leahy y colaboradores, 1998) . Sin embargo, esta estructura puede ser crucial para la regulación del ciclo de vida del THOV, el promotor del vARN, al formar la estructura de "gancho", puede estimular la actividad de la endonucleasa PB2, con lo cual se permite la transcripción. El promotor de cARN en contraste, puede no formar la estructura de "gancho" y puede por lo tanto ser incapaz de estimular la actividad de la endonucleasa, resultando asi en la replicación. Bunyaviridae La familia Bunyaviridae incluye diversos virus que provocan las fiebres hemorrágicas o encefaliticas en los humanos (por ejemplo, fiebre de valle Rift, Hantaan, La Crosse y fiebre hemorrágica de Congo-Crimea) . Los viriones envueltos y esféricos contienen tres segmentos de ARN en sentido negativo de hebra simple (revisado en Elliot, 1997) . El segmento más grande (L) codifica la proteina de polimerasa de ARN viral (proteina L) , mientras que el segmento M codifica las dos glicoproteinas virales Gl y G2, y una proteina no estructural (NSm) . El segmento más pequeño (S) codifica la proteina de nucleocápsida (N) y una segunda proteina no estructural (NSs) . La replicación y transcripción del virus toman lugar en el citoplasma, y los viriones recientemente ensamblados se acoplan a través de las membranas del aparato de Golgi. Bridgen & Elliot (1996) han establecido un sistema de genética inversa para generar el virus infeccioso de la Bunyamwera completamente a partir de cADNs clonados. Siguieron una estrategia primero descrita por Schnell et al. (1994) para el virus de la rabia: la transcripción intracelular de un cADN que codifica el ARN antigenómico de sentido positivo (pero no para el ARN genómico de sentido negativo) en células que expresaban la polimerasa y la nucleoproteina viral. Bridgen & Elliot (1996) infectaron células HeLaT4+ con virus de vacuna que expresaban la polimerasa T7 y transfectaron estas células con los plásmidos que expresaban las proteinas codificadas por los segmentos S, M y L. Transfectaron después estas células con tres plásmidos que codificaban los cADNs antigenómicos de longitud completa, flanqueados por el promotor de la polimerasa T7 y la ribozima del virus delta de hepatitis. Para incrementar el número de partículas de Bunyavirus en relación con el número de partículas del virus de vacuna, los autores utilizaron células de mosquitos en las cuales se replica el virus de Bunyamwera pero no el de vacuna. Este protocolo se puede usar no solamente para preparar por ingeniería genética Bunyaviridae, sino también generar virus reclasificantes que no se pueden obtener fácilmente al coinfectar células con diferente cepas de Bunyaviridae . Para estudiar los elementos promotores del Bunyavirus y las proteinas virales que se requieren para la transcripción y replicación, Dunn et al. (1995) clonaron el gen CAT en la orientación de sentido negativo entre las regiones no traducidas 5' y 3' del segmento S ARN de Bunyamwera. Se transfectaron las células con constructos que expresan las proteínas codificadas por el segmento L y S y se transfectaron después con ARN transcrito in vi tro lo que resultó en la actividad CAT. El segmento S del bunyavirus codifica dos proteinas, N y NSs, en estructuras de lectura traslapantes. Para determinar si ambas de estas proteinas se requieren para la transcripción y replicación, se probaron constructos que expresaban solamente N o NSs para la actividad CAT. La expresión de la proteina N, junto con la proteina L, resultó en la actividad CAT, mientras que no se detectó actividad CAT con la expresión NSs del constructo. Asi, las proteinas de L y N, son suficientes para la transcripción y replicación del ARN parecido al buniavirus . Como con el virus de la influenza, las secuencias terminales de ARNs del buniavirus, son complementarias y altamente conservadas. Se ha supuesto por lo tanto que estos elementos de secuencia definen al promotor buniaviral y son cruciales para la actividad del promotor. La eliminación de los cinco nucleótidos en la terminación 3' del ARN viral, reduce drásticamente la expresión CAT (Dunn y colaboradores, 1995) . En contraste, la adición de dos nucleótidos en la terminación 5', o de 11 o 35 nucleótidos en la terminación 3', no cancela la expresión de CAT (Dunn y colaboradores, 1995) . Por lo tanto, como en el complejo de polimerasa del virus de la influenza, la proteina de polimerasa del buniavirus puede comenzar aparentemente de manera interna la transcripción y/o replicación. La invención se describirá además por los siguientes ejemplos. Ejemplo 1 Materiales y métodos Células y virus. Células 293T de riñon embriónico humano, y células de riñon canino de Madin-Derby (MDCK) se mantuvieron en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero de becerro fetal al 10% y en un medio modificado Eagle (MEM) que contenia 5% de suero de becerro recién nacido, respectivamente. Se mantuvieron todas las células a 37 °C en C02 al 5%. Se propagaron los virus de la influenza A/WSN/33 (H1N1) y A/PR/8/34 (H1N1) en huevos de 10 dias de edad. Construcción de plásmidos. Para generar los constructos de polimerasa I de ARN, se introdujeron los cADNs clonados derivados del ARN viral del A/WSN/33 o del A/PR/8/34 entre las secuencias de promotor y terminador de la polimerasa I de ARN. Brevemente, los cADNs clonados se amplificaron por PCR con cebadores que contenían los sitios de BsmBI, digeridos con BsmBI, y clonados dentro de los sitios de BsmBI del vector pHH21 que contiene al promotor humano de la polimerasa 1 ARN y el terminador de ratón de la polimerasa 1 ARN, separado por sitios BsmBI (Figura 2) . Los genes PB2, PBl, PA, HA, NP, NA, M y NS de la cepa A/WSN/33, se amplificaron por PCR mediante el uso de los siguientes plásmidos: pSCWPB2, pGW-PBl, y pSCWPA (todos obtenidos del Dr. Debi Nayak de la University of California Los Angeles), y pWH17, pWNP152, pT3WNA15 (Castrucci y colaboradores, 1992), pGT3WM, y pWNSl, respectivamente. El gen PBl del virus de la influenza A/PR/8/34, se amplificó por usar pcADN774 (Pérez y colaboradores, 1998) como una plantilla. Ver la figura 6 para la secuencia de los cebadores. Para asegurar que los genes estuvieran libres de mutaciones indeseables, los fragmentos derivados de PCR fueron formados en secuencias con un autosecuenciador (Applied Biosystem Inc., CA, USA) de conformidad con el protocolo recomendado por el fabricante. Los cADNs que codifican los genes HA, NP, NA Y Ml del virus A/WSN/33, se clonaron como se describió (Huddleston y colaboradores, 1982) y se subclonaron dentro de un vector de expresión eucariótica pCAGGS/MCS (controlado por el promotor de la ß-actina de pollo) (Niwa y colaboradores, 1991) , resultando respectivamente en pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15, y PCAGGS-WSN-Ml-2/1. Los genes M2 y NS2 del virus A/PR/8/34 se amplificaron por PCR y se clonaron dentro de pCAGGS/MCS, resultando el pEP24c y pCA-NS2. Finalmente, se usaron pcADN774 (PBl) , pcADN762 (PB2 ) , y pcADN787 ( PA) , para expresar las proteinas PB2, PBl, y PA bajo control del promotor de citomegalovirus (Pérez y colaboradores, 1998) . Generación de las partículas infecciosas de influenza. Se transfectaron células 293T (1 x 106) con un máximo de 17 plásmidos en cantidades diferentes con el uso del Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se mezclaron el reactivo de transfección y el ADN (2 µl de Trans IT-LT-1 por µg de ADN) , se incubaron a temperatura ambiente durante 45 minutos y se agregaron a las células. Seis horas después, se reemplazó la mezcla de reactivo de transfección-ADN por Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) que contenia 0.3% de albúmina de suero de bovino y 0.01% de suero de becerro fetal. En tiempos diferentes después de la transfección, se cosecharon los virus a partir del sobrenadante y se titularon sobre células MDCK. Ya que el virus auxiliar no se requirió por este procedimiento, se analizaron los virus transfectantes recuperados sin purificación de placa. Determinación del porcentaje de células transfectadas con plásmidos que producen virus. 24 horas después de la transfección, se dispersaron células 293T con 0.02% de EDTA dentro de células simples. La suspensión de células se diluyó después 10 veces y se transfirió a las monocapas confluentes de células MDCK en placas de 24 pozos. Se detectaron los virus por el ensayo de hemaglutinación. Ensayo de inmunoteñido. Nueve horas después de la infección con el virus de la influenza, se lavaron las células dos veces con solución salina amortiguada de fosfato (PBS) y fijada con paraformaldehido 3.7% (en PBS) durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Enseguida, se trataron con Tritón X-100 0.1% y se procesaron como se describe por Neumann et al (1997) . Resultados Generación del virus infeccioso por la expresión impulsada por plásmidos de segmentos virales de ARN, tres subunidades de polimerasa y la proteina NP. Aunque la transfección de células con una mezcla de RNPs extraídos de viriones purificados resulta en partículas infecciosas de influenza, esta estrategia no es probablemente eficiente cuando se usa con ocho diferentes RNPs generados in vi tro. Para producir virus de influenza infecciosos completamente a partir de cADNs, se generaron ocho RNPs virales generados in vivo. Asi, se prepararon los plásmidos que contienen cADNs para los ARNs virales de longitud completa del virus A/WSN/33, flanqueado por el promotor humano de polimerasa I de ARN y el terminador de ratón de polimerasa I de ARN. En principio, la transfección de estos ocho plásmidos dentro de células eucarióticas, debe resultar en la síntesis de todos los ocho vARNs de la influenza. Las proteinas PB2, PBl, PA y NP, generadas por la cotransfección de los plásmidos de expresión de proteinas, deben después ensamblar los ARNs dentro de los vRNPs funcionales, que se replican y transcriben, formando finalmente virus infecciosos de la influenza (Figura 3) . 1 x 106 células 293T se transfectaron con plásmidos de expresión de proteinas (1 µg de pcADN762 (PB2) , 1 µg de pcADN774 (PBl) , 0.1 µg de pcADN78(PA), y 1 µg de pCAGG-WSN-NP0/14 ) y 1 µg de cada uno de los siguientes plásmidos de polimerasa I de ARN (pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PBl, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pPolI-WSN-M, y pPolI-WSN-NS) . La decisión de usar una cantidad reducida de pcADN787 (PA) , se basó en las observaciones previas (Mena y colaboradores, 1996) , y en los datos sobre las condiciones óptimas para la generación de partículas parecidas al virus (VLPs) (no se muestran los datos) . Veinticuatro horas después de la transfección de las células 293T, se encontraron 7 x 103 pfu de virus por ml en el sobrenadante (Experimento 1, Tabla 1), demostrando por primera vez la capacidad de la genética inversa para producir el virus A de la influenza completamente a partir de los plásmidos.
Tabla 1. Ajustes de plásmidos usados para producir el virus de la influenza a partir de cADN* clonado.
*Las células 293T, se transfectaron con los plásmidos indicados. Veinticuatro (Experimentos 1 y 2) o cuarenta y ocho horas después (Experimentos 3-8), se determinó la concentración del virus sobrenadante en las células MDCK. t A menos que se indique de otra manera, los plásmidos se construyeron con cADNs que representan los ARNs del virus A/WSN/33.
Eficiencia de la producción del virus de la influenza con la coexpresión de todas las proteinas estructurales virales. Aunque la expresión de las proteinas de polimerasa y NP virales es suficiente para la generación impulsada por el plásmido de los virus de la influenza, fue posible que se mejorara la eficiencia. En estudios previos, la expresión de todas las proteinas estructurales del virus de la influenza (PB2, PBl, PA, HA, NP, NA, Ml, M2 , Y NS2) resultaron en VLP que contenían un vARN artificial que codificaba un gel reportero de cloranfenicol-acetiltransferasa (Mena y colaboradores, 1996) . Entonces, la disponibilidad del complemento completo de proteinas estructurales, en lugar de solamente aquel requerido para la replicación y transcripción del ARN viral, puede mejorar la eficiencia de la producción del virus. Hasta este punto, se transfectaron células 293T con cantidades óptimas de plásmidos de expresión de proteinas virales (como se juzga por la producción de VLP; datos no publicados) : 1 µg de pcDNA762 (PB2) y pcDNA774 (PBl) ; 0.1 µg de pcDNA787 (PA) ; 1 µg de pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NPO/14, y pCAGGS-WNA15; 2 µgde pCAGGS-WSN-Ml-2/1; 0.3 µg de pCA-NS2; y 0.03 µg de pEP24c (para M2) , junto con 1 µg de cada plásmido de la polimerasa I de ARN (experimento 2, tabla 1) . Se transfectó un segundo conjunto de células con el mismo conjunto de plásmidos de polimerasa I de ARN, con excepción del gen PBl, para el cual el pPolI- PR/8/34-PB1 se substituyó en un esfuerzo por generar un virus reclasificante, junto con los plásmidos que expresan solamente PA, PBl, PB2 y NP (experimento 3, tabla 1) o aquellos que expresan todas las proteinas estructurales de la influenza (experimento 4, tabla 1). Los rendimientos del virus WSN no diferian apreciablemente a las 24 horas (experimentos 1 y 2, tabla 1) o a las 36 horas (no se muestran los datos) posteriores a la transfección. Sin embargo, se encontró un incremento de más de 10 veces en los rendimientos del virus con el PR/8/34-PB1, cuando todas las proteinas estructurales virales de influenza se suministraron (experimentos 3 y 4, tabla 1) . Los controles negativos, que carecían de una de los plásmidos para la expresión de las proteinas PA, PBl, PB2 o NP, no resultaron en algún virus (experimentos 5-8, tabla 1) . Asi, dependiendo del virus generado, la expresión de todas las proteinas estructurales del virus A de la influenza mejoraron apreciablemente la eficiencia del método de genética inversa. Enseguida, la cinética de producción del virus después de la transfección de la célula se determinó utilizando el conjunto de plásmidos usado para generar un virus con el gen A/PR/8/34-PB1. En dos de los tres experimentos, se detectó primero el virus a las 24 horas después de la transfección. La concentración medida en ese momento, >103 pfu/ml, tuvo un incremento hasta de >106 pfu/ml por 48 horas después de la transfección (tabla 2) . Para estimar el porcentaje de células transfectadas con plásmido que estaban produciendo virus, se trataron las células 293T con EDTA (0.02%) 24 horas después de la transfección para dispersar las células y después se ejecutaron estudios limitantes de dilución. En este experimento, no se encontró virus libre en el cultivo sobrenadante en este punto de tiempo. Los resultados indicaron que 1 en 103'3 células generó partículas infecciosas de virus. Tabla 2. Cinética de la producción de virus después de la transfección de plásmidos en células 293T*.
Horas después Concentraciones del virus en el de la sobrenadante de cultivo (pfu/ml) ansfección Experimentos del plásmido 1 2 3 6 0 ND ND 12 0 ND 0 18 0 ND 0 24 0 2 x 103 6 x 103 30 ND 5 x 104 9 x 104 36 6 x 102 > 1 x 10s 7 x 10s 42 ND > 1 x 106 5 x 106 48 8 x 104 > 1 x 106 1 x 107 * Las células 293T se transfectaron con 8 plásmidos de polimerasa I de ARN que codifican los genes del virus A/WSN/33 con excepción del gen PBl, que se deriva del virus A/PR/8/34, y nueve plásmidos de expresión de proteina que se describen en el texto. En diferentes puntos de tiempo, se concentraron virus en el sobrenadante de cultivo en células MDCK. ND = no se hizo. Recuperación del virus de la influenza que contiene el epítope FLAG en la proteina NA. Para verificar que el nuevo sistema de genética inversa permitiera la introducción de mutaciones dentro del genoma del virus de la influenza A, se generó un virus que contenia un epitope FLAG (Castrucci y colaboradores, 1992) en la proteina NA. Se transfectaron células 293T con un plásmido de polimerasa I de ARN (pPolI-WSN-NA/FL79) que contenia un cADN que codificaba a la proteína NA y a un epítope FLAG al fondo de la cabeza de la proteína, junto con la polimerasa I de ARN requerida y los plásmidos de expresión de proteínas. Para confirmar que el virus recuperado (PR8-WSN-FL79) expresara de hecho la proteína NA-FLAG, se llevaron a cabo ensayos de inmuno teñido de células infectadas con el virus de tipo silvestre A/WSN/33 o PR8-WSN-FL79. Un anticuerpo monoclonal para el epitope FLAG detectó las células infectadas con PR8-WSN-FL79, pero no aquellas infectadas con el virus de tipo silvestre (figura 4) . La recuperación del virus PR8-WSN- FL79, fue tan eficiente como aquella del virus de tipo silvestre no etiquetado (no se muestran los datos) . Estos resultados indican que el nuevo sistema de genética inversa permite la introducción de mutaciones dentro del genoma del virus A de la influenza. Generación de virus infeccioso de influenza que contienen mutaciones en el gen PA. Para producir los virus que poseen mutaciones en el gen PA, se introdujeron dos mutaciones silentes que creaban nuevas secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción (Bsp 1201 en la posición 846 y PvuII en la posición 1284 del mARN) . No fue posible modificar previamente este gen por genética inversa, debido a la carencia de un sistema confiable de selección. Se recuperaron los virus transfectantes, PA-T846C y PA-A 1284. Los virus transfectantes recuperados se clonaron biológicamente por dos diluciones limitantes consecutivas. Para verificar que los virus recuperados fueran de hecho transfectantes con las mutaciones en el gen PA, se obtuvo el cADN para el gen PA por PCR de transcriptasa inversa. Como se muestra en la figura 5, los virus PA-T846C y PA-A1284C tuvieron las mutaciones esperadas dentro del gen PA, como se demuestra por la presencia de sitios de restricción recientemente introducidos. La PCR de las mismas muestras y cebadores virales sin la etapa de transcripción inversa, falló al producir cualquiera de los productos (no se muestran los datos), indicando que el cADN del PA se originaba de hecho a partir de un vARN en lugar del plásmido usado para generar los virus. Estos resultados ilustran la forma en que los virus con genes mutados se pueden producir o recuperar sin el uso de virus auxiliar. Discusión. Los sistemas de genética inversa aquí descritos, permiten que se produzcan eficientemente los virus de influenza A, completamente a partir de cADNs clonados. Bridgen y Elliott (1996) también utilizaron genética inversa para generar un virus de Bunyamwera (familia Bunyaviridae) , pero solamente contiene tres segmentos del ARN en sentido negativo, y la eficiencia de su producción fue baja, 102 pfu/107 células. Aunque los rendimientos de virus difieren entre los experimentos, se observaron consistentemente > 103 pfu/106 células para el virus de la influenza, que contiene 8 segmentos. Hay diversas explicaciones para la elevada eficiencia del sistema de genética inversa descrito anteriormente. En lugar de producir RNPs in vi tro (Luytjes y colaboradores, 1989) , se generaron RNPs in vivo a través de la síntesis intracelular de vARNs usando polimerasa I de ARN y a través de la expresión impulsada por plásmidos de las proteínas virales de polimerasa y NP. También, el uso de células 293T, que se transfectaron fácilmente con los plásmidos (Goto y colaboradores, 1997), aseguraron que una gran población de células recibiera todos los plásmidos necesarios para la producción del virus. Además, el gran numero de transcriptos producidos por la polimerasa I de ARN, que está entre las enzimas más abundantemente expresadas en células en crecimiento, contribuyó probablemente a la eficiencia global del sistema. Estas caracteristicas condujeron a un número correspondientemente abundante de transcriptos de vARN y cantidades adecuadas de la proteina viral para la formación de cápsidas de vARN, formación de RNPs en el núcleo, y la exportación de estos complejos a la membrana celular, en donde los nuevos virus se ensamblan y liberan. Los sistemas de genética inversa previamente establecidos (Enami y colaboradores, 1990; Neumann y colaboradores, 1994; Luytjes y colaboradores, 1989; Pleschka y colaboradores, 1996) requieren la infección con un virus auxiliar y por lo tanto métodos de selección que permitan un número pequeño de transfectantes a ser llamados a partir de un número vasto de virus auxiliares. Se han empleado tales estrategias para generar virus de influenza que poseen uno de los siguientes genes derivados del cADN: PB2 (Subbarao y colaboradores, 1993), HA (Enami y colaboradores, 1991: Horimoto y colaboradores, 1994), NP (Li y colaboradores, 1995), NA (Enami y colaboradores, 1990), M (Castrucci y colaboradores, 1995; Yasuda y colaboradores, 1994), y NS (Enami y colaboradores, 1991) . La mayoria de los métodos de selección, excepto aquellos aplicables a los genes HA y NA, se basan en la temperatura de crecimiento, restricción del rango del huésped, o sensibilidad del medicamento, limitando así la utilidad de la genética inversa para el análisis funcional de los productos de genes. Aún con los genes HA y NA, para los cuales están disponibles sistemas confiables de selección impulsados por anticuerpos, es difícil producir virus con defectos prominentes de crecimiento. En contraste, el sistema de genética inversa aquí descrito, no requiere un virus auxiliar y permite que se generen transfectantes con mutaciones en cualquier segmento del gen o con severos defectos de crecimiento. Esta ventaja se demuestra en la figura 5, con la recuperación del virus transfectante con un gen mutado PA. Al tener la tecnología para introducir cualquier mutación viable dentro del genoma del virus A de la influenza, se permitirá que los investigadores atiendan diversas cuestiones de larga duración, tales como la naturaleza de las secuencias regulatorias en regiones no traducidas del genoma viral, relaciones de fusión de la estructura de proteínas vírales, y la base molecular de la restricción huésped-rango y la patogenicidad viral. Aunque las vacunas inactivadas de la influenza están disponibles, su eficacia es subóptima debido parcialmente a sus capacidad limitada para obtener las respuestas celulares locales de IgA y de T citotóxica. Los ensayos clínicos de las vacunas de influenza en vivo adaptadas en frío, ahora en desarrollo, sugieren que tales vacunas se atenúan óptimamente, de manera que no provocarán síntomas de la influenza, pero todavía inducirán la inmunidad protectora (revisado en Keitel & Piedra, 1998) . Sin embargo, los resultados preliminares indican que estas vacunas con virus vivos no serán significativamente más efectivas que las mejores vacunas inactivadas (revisado en Keitel y Piedra, 1998), dando lugar a una mayor mejora. Una posibilidad sería modificar una vacuna adaptada en frío con el sistema de genética inversa arriba descrito. Alternativamente, se podría comenzar a partir de raspar usando genética inversa, para producir una cepa de influenza A "maestra" con mutaciones atenuantes múltiples en los genes que codifican las proteínas internas. La aplicación más fascinante del sistema de genética inversa aquí descrito, puede estar situada en la producción rápida de vacunas atenuadas con virus vivos en los casos de pandemias sospechosas, que involucren nuevos subtipos HA o NA del virus de la influenza. Este nuevo sistema de genética inversa probablemente enriquecerá el uso de los virus de la influenza como vectores para vacuna. Los virus se pueden preparar por ingeniería para expresar proteínas externas o epítopes inmunogénicos además de las proteínas vírales de la influenza. Uno podria por ejemplo, generar virus con proteínas externas como un noveno segmento (Enami y colaboradores, 1991) y usarlas como vacunas vivas. No solamente los virus de la influenza estimulan las respuestas inmunes humorales y mediadas por células fuertes, sino que también permiten un amplio arreglo de proteínas NA y HA de superficie del virión (por ejemplo 15 subtipos HA y 9 subtipos NA y sus variantes epidémicas) , permitiendo la inmunización repetida de la misma población objetivo. Los VLPs de la influenza que poseen un vARN artificial que codifica un gen reportero, se han producido al expresar proteinas estructurales vírales y vARN con el sistema de polimerasa T7-vacuna (Mena y colaboradores, 1996) . Al usar la genética inversa, se pueden generar ahora VLPs que contienen vARNs que codifican las proteínas requeridas para la transcripción y replicación del vARN (esto es PA, PBl, PB2 y NP) , así como proteínas) que codifican los vARNs de interés. Tales VLPs, pueden ser vehículos útiles para la entrega de genes. De manera importante, su carencia de genes que codifiquen proteínas estructurales vírales, aseguraría que los virus infecciosos no se produjeran después de la terapia de genes con VLP. Ya que el genoma del virus de la influenza no se integra dentro del cromosoma huésped, el sistema VLP sería apropiado para terapia de genes en situaciones que requieren solamente la transducción de corto plazo de la célula (por ejemplo, para el tratamiento del cáncer) . En contraste con los vectores de adenovirus (Kovesdi y colaboradores, 1997), los VLPs de la influenza pueden contener las variantes HA y NA, permitiendo un tratamiento repetido de las poblaciones objetivo. La familia Orthomyxoviridae comprende los virus A, B y C de la influenza, asi como el Thogotovirus recientemente clasificado. La estrategia para generar un virus infeccioso de la influenza A completamente a partir de los cADNs clonados aqui descritos, aplicaría a cualquier ortomixovirus, y tal vez a otros virus segmentados de ARN en sentido negativo también (por ejemplo Bunyaviridae, Arenaviridae) . La capacidad de manipular el genoma viral sin limitaciones técnicas, tiene profundas implicaciones para el estudio de los ciclos de vida viral y su regulación, la función de las proteínas virales y los mecanismos moleculares de la patogenicidad viral. Ejemplo 2 La expresión de las proteínas PB2, PBl, PA y NP del virus de la influenza, conduce a la replicación y transcripción de un ARN viral artificial. Para generar los VLPs de la influenza, se empleó el sistema de polimerasa I de ARN para la síntesis intracelular de los ARNs vírales de la influenza in vivo, (figura 7) . En este sistema, un cADN que codifica un gen reportero en la orientación antisentido, está flanqueado por las regiones no codificadoras 5' y 3' y un ARN viral de la influenza. Esta cinta se inserta entre un promotor de polimerasa I de ARN y el terminador. La transfección de tales constructos en células eucarióticas, conduce a la transcripción del gen reportero por la polimerasa I de ARN celular, con lo que se generan los ARNs de la influenza similares al virus (Neumann y colaboradores, 1994) . Con la infección del virus de la influenza, se replican los vARNs artificiales y se transcriben por el complejo de polimerasa viral, resultando en la expresión del gen reportero.
Para determinar si la expresión de las proteínas PBl, PB2, PA y NP conduce a la expresión del gen reportero codificado por el transcripto derivado de la polimerasa I de ARN, se transfectaron dentro de células de riñon embriónico humano (293T) , plásmidos (1 µg cada uno) que expresan la proteína NP del virus A/WSN/33 (H1N1) bajo control del promotor de la ß actina del pollo (pCAGGS-WSN-NPO/14) , las proteínas de polimerasa del virus A/PR/8/34 bajo control del promotor del cytomegalovirus [pcADN762 (PB2) , ?cADN774 (PBl) , y pcADN787 (PA) ] , y un constructo de gen reportero de la polimerasa I de ARN (pPoLL-GFP) . Cuarenta y ocho horas después, el 30%-40% de las células estaban expresando la GFP (figura 9) . En contraste, la expresión de la GFP no se pudo detectar en las células transfectadas que carecían de la polimerasa o de las proteinas NP. Estos resultados indicaron que las proteínas NP y las tres polimerasas de influenza viral, hablan formado un complejo funcional que se replicaba y transcribía en el vARN de GFP derivado de la polimerasa I de ARN-. Transcripción y replicación óptima del vARN. Para determinar las cantidades de ADN de plásmido requeridas para la expresión óptima del GFP reportero, se moduló la expresión de las proteínas de polimerasa y el NP. Los estudios previos habían indicado que grandes cantidades de PA, reducen el grado de la expresión del gen reportero en los sistemas de transcripción/replicación (Mena y colaboradores, 1996) . Por lo tanto, en una forma en etapas, se redujo la expresión de PA a partir del plásmido, identificando 0.1 µg de pcADN787 (PA) , como la cantidad de plantilla que produce la expresión más fuerte del GFP. Con el NP, el componente estructural principal de los complejos RNP, se pueden requerir elevadas cantidades del plásmido de expresión de proteinas. Sin embargo, las cantidades superiores del plásmido, no afectaron apreciablemente el número de células 293T positivas de GFP. Además, diversas cantidades de los plásmidos de expresión de proteína PB2 y PBl (en el intervalo de 1.0 hasta 0.03 µg) no afectaron la expresión de GFP en las células 293T. Asi, se usaron en todos los experimentos subsecuentes, 0.1 µg de pcADN787 (PA) , y 1.0 µg de pcADN774 (PBl) , pcADN762 (PB2) , y pCAGGS-WSN-NPO/14.
Formación de los VLPs de la influenza a partir de cADNs clonados. Los estudios previos con el sistema de polimerasa de ARN T7 y el virus de vacuna, mostró que la formación de los VLPs de la influenza requieren nueve proteinas del virus de la influenza: PB2, PBl, PA, HA, NA, NP, Ml, M2 y NS2 (Mena y colaboradores, 1996) . La proteína NS1 en contraste, es innecesaria para la formación de partículas (Mena y colaboradores, 1996) .
Para establecer un sistema eficiente impulsado por el plásmido para la generación de VLP, se generaron cADNs que codificaban los genes HA, NA, Ml, M2 y NS2. Los cADNs se clonaron dentro del vector de expresión eucariótica pCAGGS/MCS (controlado por el promotor ß-actina del pollo), resultando en pEWSN-HA, pCAGGS-WNA15, pCAGGS-WSN-Ml-2/1, pEP24c y pCA-NS2 respectivamente. La expresión de cada proteína se confirmo por el análisis de manchado Western. Para generar VLPs, se transfectaron 106células 293T, con 1.0 µg de cada plásmido de expresión de proteinas (con la excepción de pcADN787 (PA) , para el cual se empleó 0.1 µg) , y con 1 µg del constructo de gen reportero pPoII-GFP. Se cosecharon los sobrenadantes de cultivo,, 48 horas después de la transfección y se mezclaron con el virus A/WSN/33 para suministrar las proteinas del virus de la influenza requeridas para la replicación y transcripción del vARN de GFP. La mezcla se inoculó después dentro de células MDCK. Diez horas después de la incubación, se detectaron células MDCK positivas a GFP, correspondiendo a 450 partículas/ml de sobrenadante (tabla 3) . Así, la expresión impulsada por el plásmido de todas las proteínas estructurales virales de la influenza, resultó en la formación de VLPs infecciosos de la influenza que contenían vARN de GFP. Además, el vARN de GFP se entregó a las células MDCK. Ensamble óptimo del virus de la influenza. Se estudió también la formación de VLP en células que expresaban cantidades diferentes del constructo de gen reportero de polimerasa I de ARN, así como de los ADNs de los plásmidos de HA, NA, Ml, M2 y NS2. En los experimentos con pPoll-GFP, 1.0 µg del ADN de plásmido fue altamente eficiente para generar VLPs, mientras que se redujo significativamente la eficiencia de 2.0 µg o 3.0 µg. Ya que las proteinas NS2 y M2 se expresan en cantidades menores después en la infección, era probable que cantidades relativamente pequeñas de los plásmidos de expresión, se necesitarían para una formación óptima de VLP. La reducción del constructo de expresión M2 a partir de 1.0 µg hasta 0.3 µg, resultó en un incremento de más de diez veces en el número de células MDCK positivas al GFP (tabla 3) . La reducción adicional del plásmido hasta 0.03 µg, no incrementó el número de VLPs. Para el NS2, las cantidades menores del plásmido probado (0.1 µg) se asociaron con una formación menos eficiente de VLPs (tabla 3) . La proteína Ml es el componente estructural principal del virión. Asi, altos niveles de expresión del Ml se requieren probablemente para la formación eficiente de VLP. Esta predicción se probó en experimentos que comparan la formación de VLP en células transfectadas con 1.0 µg o 2.0 del ADN del plásmido de Ml. Como se muestra en la tabla 3, las cantidades superiores de plásmido resultaron en un incremento de más de 10 veces en el número de células MDCK positivas al GFP. La comparación de dos cantidades diferentes de plásmidos (1 µg contra 2 µg) que expresan las proteínas HA y NA, no reveló diferencias apreciables en la formación de VLP, conduciendo a la selección de 1 µg de cada plásmido (pEWSN-HA, pCAGGS-WNA15) para su uso en experimentos posteriores. En total, estos estudios resultaron en un incremento de >100 veces en la eficiencia de la formación de VLP, conduciendo finalmente a la producción de más de 104 partículas infecciosas del virus de la influenza por ml de sobrenadante (figura 10) .
Tabla 3. Cantidades óptimas del ADN de plásmido para la formación de VLPs infecciosos *.
* Células 293T se transfectaron con los plásmidos de expresión para todas las nueve proteínas estructurales del virus de la influenza y con el plásmido del gen GFP-polimerasa I de ARN. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recolectaron los sobrenadantes que contenían VLP, y se mezclaron con un virus auxiliar A/WSN/33, y se inocularon dentro de células MDCK. Se fijaron las células 10 horas después de la infección y se determinó la expresión de GFP con un microscopio de fluorescencia. Se variaron solamente las cantidades de los plásmidos de Ml, M2 y NS2 (letras negritas) para determinar sus cantidades óptimas para la expresión de GFP en células MDCK. t La eficiencia relativa de la formación de VLP, se determinó al contar el número de células positivas GFP en cinco campos microscópicos. La muestra que contenía 1 µg en cada plásmido (que produjo 450 VLP infecciosos/ml de 5 sobrenadantes) se escogió como referencia (valor de 1) . Autenticidad de los VLPs producidos completamente a partir de plásmidos. Para verificar que los VLPs inician la infección de la misma manera que los virus auténticos de influenza, se neutralizaron VLPs con anticuerpo para el HA de WSN. Los sobrenadantes que contenían VLP"s derivados de las células 293T transfectadas con plásmidos, se incubaron con un acumulado de anticuerpos monoclonales de HA de WSN, o con un anticuerpo monoclonal para la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (control negativo) durante 1 hora a temperatura ambiente. El virus auxiliar A/PR/8/34, que no se neutraliza por el acumulado de anticuerpos monoclonales anti HA de WSN, se agregó a la mezcla y se inoculó dentro de las células MDCK. Solamente el anticuerpo monoclonal específico del anti-HA de WSN, neutralizó los VLPs, indicando que el HA alivia la colocación y entrada de los VLPs. Enseguida, se identificó un conjunto mínimo de proteínas requeridas para la formación de VLPs. Otros han establecido que las tres polimerasas del virus de la ymtyy -y ^vH^??tíi. r. influenza y el NP, son esenciales para la replicación y transcripción de vARN (Honda y colaboradores, 1988) . Por lo tanto, cada una de estas cuatro proteínas se incluyó, pero se omitieron consecutivamente el HA, NA, Ml, M2 o NS2. La exclusión de cualquiera de estos plásmidos, no afectó la replicación/transcripción del vARN de GFP en células 293T transfectadas. Los sobrenadantes derivados de las células 293T transfectadas que carecían de la proteína HA, NA, Ml o NS2, no promovieron la expresión de GFP en las células MDCK infectadas, indicando la ausencia de VLPs infecciosos. Los VLPs infecciosos se detectaron con la omisión de M2, pero el número fue bajo (> una reducción de 500 veces en comparación con el conjunto completo de proteínas estructurales) . Así, todas las proteínas estructurales del virus de la influenza, se requieren para la formación eficiente de VLPs infecciosos, según los datos a partir de estudios del sistema virus-vacuna (Mena y colaboradores, 1996) . La glicoproteina VSV puede reemplazar las proteinas HA y NA en la producción de VLPs. Las proteínas HA y NA del virus de la influenza, se reemplazaron con la proteína G de VSV, que funciona en el enlace y fusión del receptor. En las células 293T transfectadas con pPoll-GFP; cantidades óptimas de los constructos de expresión PB2, PBl, PA, NP, Ml, M2 y NS2; y 1 µg del constructo VSV-G (pCAGGS-VSV-G) , substitución de la proteína VSV-G para las glicoproteínas del virus de la influenza, no afectaron adversamente la formación de VLP. Por el contrario, los números superiores de células positivas a GFP, se encontraron reproduciblemente cuando el VSV-G, más que el HA y el NA, sirvieron como la glicoproteína viral. Así, la proteína VSV G, se puede incorporar eficientemente dentro de viriones de la influenza y puede funcionar así como el HA y el NA en la liberación y entrada del virus. Un sistema eficiente para la generación de partículas infecciosas del virus de la influenza, sería un activo en investigación, con este virus y potencialmente en la producción de vacunas y vectores para terapia de genes. En contraste con el sistema existente de virus de vacuna, la estrategia de producción de VLP aquí descrita es altamente eficiente, tanto en la transfección inicial de la célula como en el rendimiento de VLPs (>104 partículas infecciosas/ml de sobrenadante) . Además, se impulsa completamente por plásmidos que expresan las proteínas del virus de la influenza (esto es en ausencia de cualquier otra proteína viral) , lo cual simplifica ampliamente la interpretación de los resultados. Otra ventaja importante, es la capacidad de estudiar los efectos de las mutaciones letales en la formación de viriones, empaque de complejos RNP, acoplamiento de la replicación y enlace y procesos de fusión. Además, es probable que el sistema descrito anteriormente, operaría igualmente bien con otros virus, por ejemplo, paramixovirus y rhabdovirus. Las proteínas HA y NA del virus de la influenza, se pueden remplazar funcionalmente por la glicoproteína G de VSV. Previamente, se había reportado que los virus de la influenza fallaban al incorporar la proteína VSV G cuando se suministraba por el virus recombinante SV 40 (Naim y colaboradores, 1993) . Los resultados aquí descritos sugieren que ni el HA ni el NA son esenciales para la formación de VLPs, aunque no se puede excluir que estas glicoproteínas juegan un papel en las interacciones con otras proteínas vírales, afectando así la estructura de los viriones, como se sugiere por las formas alargadas de los virus que expresan HAs, NAs, con menos extensión, o ambos (Garcia-Sastre y colaboradores, 1995; Jin y colaboradores, 1994; Jin y colaboradores, 1997; Mitnaul y colaboradores, 1996) . El sistema arriba descrito basado en plásmidos, puede ser particularmente útil para el suministro de genes terapéuticos. Los VLPs se pueden preparar para que contengan el vARN que codifica las proteínas requeridas para la transcripción y replicación (esto es, la NP y las polimerasas) , Así como un vARN que codifique la proteína de interés. Estas partículas son infecciosas y pueden entregar un gen designado dentro de células objetivo, en donde se replicaría y sería transcrito. Debido a que estas partículas no contienen un complemento completo de los genes vírales, no pueden producir virus infecciosos de progenie. Esta característica, junto con la carencia de integración del genoma viral dentro de los cromosomas huésped, aseguraría la seguridad biológica del suministro de genes en sujetos humanos y no humanos. Finalmente, la disponibilidad de 15 subtipos HA y 9 subtipos NA y sus variantes, permitiría la administración repetida de VLPs, con lo cual se supera la inmunoresistencia a las proteínas generadas por el vector, uno de los mayores obstáculos que se encaran con el uso repetido de otros vectores vírales tales como los adenovirus. Un beneficio adicional del sistema impulsado por plásmidos, se presentaría en situaciones que requieren solamente de la expresión de corto plazo de proteínas externas, como el tratamiento del cáncer. Ejemplo 3 Al usar el sistema Cre-loxP, se puede generar líneas de células de empaque para la producción de virus defectuosos en la replicación. Por ejemplo, se prepara un vector de expresión de proteínas que contiene una cinta de detención de la transcripción (por ejemplo pBS302 of life Technologies, Bethesda, Maryland; and Saurer y colaboradores, 1993; Lasko y colaboradores, 1992; Pichel y colaboradores, 1993; Bolívar y colaboradores, 1977; Stuhl y colaboradores, 1981; Stuhl, 1985; Fiers y colaboradores, 1978), flanqueada por dos sitios loxP, y uno de los genes vírales. La transcripción, iniciada en la secuencia del promotor, se bloquea en los sitios de detención de la transcripción. Así, el gen viral no se transcribe ni traduce. Una célula que está transfectada establemente con tal vector, se infecta con un virus de la influenza que carece del vARN que codifica el gen clonado dentro del sistema loxP. Este virus también contiene un vARN adicional que codifica la proteína Cre. Este virus no es viable en células normales, porque carece de su vARNs. Sin embargo, en la línea de célula de empaque, la proteína Cre que se expresa de vARN, resulta en la recombinación en el sitio loxP, resultando en la eliminación del sitio de detención de la transcripción. Así, los genes virales respectivos se transcriben y expresan ahora, permitiendo que el virus se amplifique en estas células (figura 11) . Además, las líneas de células de empaque, se preparan para expresar las proteínas vírales tardías (esto es HA, NA, Ml, M2 y NS2) controladas por el sistema JoxP (figura 12) . La HA y NA se pueden remplazar por otras proteínas virales de fusión y de enlace al receptor (por ejemplo GP Ebola, GP Marburg, glicoproteínas GPl y GP2 del Bunyaviridae, las proteínas G y/o F del rhabdovirus y paramyxovirus, la glicoproteína del thogotovirus, y las glicoproteínas de ARN con hebra positiva) . Las partículas similares al virus, se generan y contienen los vARNs que codifican las proteínas requeridas para la replicación/transcripción (esto es, las proteínas de polimerasa y NP) , un vARN que codifica el gen de interés, y un vARN que codifica a Cre. Estos vARNs se empacan dentro de partículas similares al virus en las líneas de empaque de células. Estas partículas similares al virus se pueden usar para propósitos de terapia de genes y vacunas, ya que (i) no contienen el complemento completo de los genes vírales y entonces no se pueden formar partículas infecciosas de progenie, satisfaciendo las preocupaciones severas de seguridad; (ii) expresarán probablemente la proteína externa en niveles elevados; (iii) no expresan las glicoproteínas vírales (HA, NA) que son los antígenos principales; así, se debe limitar la respuesta inmune del huésped contra las proteínas vírales.
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Claims (105)

  1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición que comprende una pluralidad de vectores de ortomixovirus que cuando están presentes en una célula huésped en ausencia del virus auxiliar, produce concentraciones elevadas del virus, caracterizada porque comprende: a) un vector que comprende a un promotor ligado operativamente a un cADN del PA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PB2 del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del HA del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un virus de la influenza cADN del NP, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado - . ¡ • smr-jiv**iy operativamente a un cADN del NA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del M del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de transcripción, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NS del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción; y b) un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PBl del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PB2 del virus de la influenza, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NP del virus de la influenza.
  2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el HA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el Ml del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el M2 del virus de la influenza, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NS2 del virus de la influenza.
  3. 3. Una composición caracterizada porque comprende una pluralidad de vectores de ortomixovirus que comprende: un vector que comprende un promotor de la polimerasa I de ARN, ligado operativamente a un cADN del PA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I de ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I de ARN, ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I de ARN, ligado operativamente a un cADN del PB2 del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del HA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del NP del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del NA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del M del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor de la polimerasa I del ARN, ligado operativamente a un cADN del NS del virus . de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I del ARN, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PBl del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PB2 del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NP del virus de la influenza, y un vector que comprende un promotor de polimerasa I de ARN, ligado a secuencias 5' no codificadoras del virus de la influenza, ligadas a un cADN de interés o fragmento del mismo en una 5 orientación antisentido, ligada a secuencias 3' no codificadoras del virus de la influenza, ligada a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I de ARN.
  4. 4. La composición de conformidad con la 10 reivindicación 3, caracterizada porque comprende además un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el HA de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NA del virus de la 15 influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica al Ml del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica al M2 del virus de la influenza, y a un vector 20 que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica al NS2 del virus de la influenza.
  5. 5. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque los vectores 25 que comprenden el cADN están ligados. ^y^i^.^ ^ ~-r.
  6. 6. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque los vectores que codifican las proteínas virales están ligados.
  7. 7. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque cada vector que comprende cADN está sobre un plásmido separado.
  8. 8. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque cada vector que codifica una proteína está sobre un plásmido separado.
  9. 9. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque los vectores de a) comprende un promotor de polimerasa I de ARN, promotor de polimerasa II de ARN, promotor de polimerasa III de ARN, promotor T7, o promotor T3.
  10. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el promotor de polimerasa I de ARN es un promotor de polimerasa I de ARN humano .
  11. 11. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque cada uno de los vectores que codifican una proteína viral, comprenden además una secuencia de terminación de la transcripción de ARN.
  12. 12. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la secuencia de terminación de la transcripción de los vectores de a) comprende una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I de ARN, secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa II de ARN, secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa III de ARN, o una ribozima.
  13. 13. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque un vector que comprende un promotor ligado a secuencias 5' no codificadoras del virus de la influenza, ligadas a un cADN de interés ligados a secuencias 3' no codificadoras del virus de la influenza, ligadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
  14. 14. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, caracterizada porque cualquiera de los cADNs está en la orientación de sentido.
  15. 15. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, caracterizada porque cualquiera de los cADNs está en una orientación antisentido.
  16. 16. Un método para preparar el virus de la influenza, caracterizado porque comprende: hacer contacto de una célula con la composición de la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en una cantidad efectiva para producir un virus infeccioso de la influenza.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende el aislamiento del virus.
  18. 18. El virus caracterizado porque es obtenido por el método de la reivindicación 16.
  19. 19. Una composición que comprende una pluralidad de vectores de ortomixovirus, caracterizada porque comprende : un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN, ligado operativamente a un cADN de PA del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I y ARN, un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN, un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN de PB2 del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I, un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN, ligado operativamente a un cADN del NP del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica PA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica PBl del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica PB2 del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica NP del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica HA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica NA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica Ml del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica M2 del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica a NS2 del virus de la influenza, y un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN ligado a las secuencias 5' no codificadora del virus de la influenza, ligado a un cADN antisentido de interés, ligado a las secuencias 3' no codificadoras del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  20. 20. Un método para la preparación de un vehículo de entrega de genes, caracterizado porque comprende: poner en contacto las células con la composición de la reivindicación 19 en una cantidad efectiva para producir el virus de la influenza y aislar el virus.
  21. 21. El virus obtenido por el método de la reivindicación 20.
  22. 22. Una célula caracterizada porque hace contacto con la composición de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, ó 19.
  23. 23. Una célula caracterizada porque está infectada con el virus de la reivindicación 18.
  24. 24. Una célula caracterizada porque está infectada con el virus de la reivindicación 21.
  25. 25. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del PA de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  26. 26. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del PBl de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  27. 27. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del PB2 de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  28. 28. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del NP de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  29. 29. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del HA de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  30. 30. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del MA de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  31. 31. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del Ml de la influenza ligado a .Z .. __ . ~ _______ . -<H-r^h* rr& ¿ la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  32. 32. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del M2 de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  33. 33. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del NS2 de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  34. 34. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del M de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  35. 35. Un vector caracterizado porque comprende un promotor humano de la polimerasa I y ARN ligado operativamente a un cADN del NS de la influenza ligado a la secuencia de terminación de la transcripción de la polimerasa I y ARN.
  36. 36. Una célula huésped, el genoma de la cual se aumenta establemente con al menos uno de los siguientes: una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio loxP, ligado a una región codificadora HA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora NA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción 5 ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que 10 comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora PA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un 15 primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora PBl del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un 20 promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora PB2 del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox, ligado a una región codificadora NP del virus de la influenza.
  37. 37. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque se aumenta con una molécula recombinante de ADN que comprenden un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora HA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora NA del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; y una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped, ligado a un primer sitio lox, ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza.
  38. 38. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la célula se aumenta con una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligada a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza.
  39. 39. La célula huésped de conformidad con las reivindicaciones 36, 37 o 38, caracterizado porque los sitios Jox son sitios JoxP.
  40. 40. Un método para la preparación de un virus de la influenza infeccioso defectuoso en la replicación, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la célula huésped de la reivindicación 36 o 37 con un virus recombinante de la influenza que comprende: vARN que comprende una estructura de lectura abierta Cre, y vARN que comprende genes de la influenza no presentes en el genoma de la célula huésped; y (ii) recuperar el virus de la célula huésped.
  41. 41. Un método para la preparación de un virus de la influenza infeccioso defectuoso en la replicación, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la célula huésped de la reivindicación 38 con un virus recombinante de la influenza que comprende: vARN que comprende una estructura de lectura abierta de Cre, vARN que comprende PA, vARN que comprende PBl, vARN que comprende PB2, vARN que comprende NP, vARN que comprende HA, vARN que comprende NA, vARN que comprende Ml, y vARN que comprende M2; y (ii) recuperar el virus de la célula huésped.
  42. 42. Un método para la preparación de un virus de la influenza infeccioso, defectuoso en la replicación, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la célula huésped de la reivindicación 38 con un virus recombinante de la influenza que comprende: vARN que comprende una estructura de lectura abierta de Cre, vARN que comprende PA, vARN que comprende PBl, vARN que comprende PB2, vARN que comprende NP, vARN que comprende HA, vARN que comprende NA, vARN que comprende M; y (ii) recuperar el virus de la célula huésped.
  43. 43. Un método para la preparación de un virus infeccioso defectuosos en la replicación, caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la célula huésped de la reivindicación 36 o 37 con un vector que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica Cre, y una pluralidad de vectores, cada uno comprendiendo un promotor ligado operativamente a un gen de la influenza que no se expresa por la célula huésped; y (ii) recuperar el virus de la célula huésped.
  44. 44. El virus caracterizado porque se prepara por el método de la reivindicación 41.
  45. 45. Una célula caracterizada porque se infecta con el virus de la reivindicación 44.
  46. 46. El virus caracterizado porque se prepara por el método de la reivindicación 42.
  47. 47. Una célula caracterizada porque se infecta con el virus de la reivindicación 46.
  48. 48. El virus caracterizado porque se prepara por el método de la reivindicación 43.
  49. 49. Una célula caracterizada porque se infecta con el virus de la reivindicación 48.
  50. 50. El virus caracterizado porque se prepara por el método de la reivindicación 40.
  51. 51. Una célula caracterizada porque se infecta con el virus de la reivindicación 50.
  52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el virus recombinante comprende además vARN que comprende una estructura deseada de lectura abierta.
  53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la pluralidad de vectores comprende además un vector que comprende un promotor ligado a una región no codificadora 5' del virus de la influenza ligada a una estructura deseada de lectura abierta ligada a una región no codificadora 3' del virus de la influenza.
  54. 54. El método de conformidad con las reivindicaciones 41 o 42, caracterizado porque el virus recombinante comprende además vARN que comprende una estructura deseada de lectura abierta.
  55. 55. Una célula huésped, el genoma de la cual caracterizado porque se aumenta con una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción, ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora de proteína de enlace en la superficie de la célula huésped; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora de una proteína de fusión; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; y una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la trnascripción ligada a un segundo sitio lox ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza.
  56. 56. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la proteína de enlace de la superficie de la célula huésped es HA.
  57. 57. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la proteína de fusión es NA.
  58. 58. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque los sitios lox son sitios loxP.
  59. 59. Una célula huésped, el genoma de la cual se aumenta con una molécula recombinante de ADN, caracterizada porque comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a ún segundo sitio lox ligado a una región codificadora de una proteína de fusión y enlace de superficie a la célula huésped; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio loxP ligado a una región codificadora Ml del virus de la influenza; una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio loxP ligado a una región codificadora NS2 del virus de la influenza; y una molécula recombinante de ADN que comprende un promotor funcional en la célula huésped ligado a un primer sitio lox ligado a un segmento de ADN que comprende una secuencia de detención de la transcripción ligada a un segundo sitio loxP ligado a una región codificadora M2 del virus de la influenza.
  60. 60. La células huésped de conformidad con la reivindicación 59 caracterizada porque los sitios lox son sitios loxP.
  61. 61. Un método para la preparación de un virus infeccioso defectuoso en la replicación, caracterizado porque comprende: i) poner en contacto la célula huésped de la reivindicación 55 o 59 con un virus recombinante de la influenza que comprende: vARN que comprende una estructura de lectura abierta Cre, PA que comprende vARN, NP que comprende vARN, PBl que comprende vARN, y PB2 que comprende vARN y ii) recuperar el virus de la células huésped.
  62. 62. El virus caracterizado porque se prepara por el método de la reivindicación 61.
  63. 63. Una célula caracterizada porque se infecta con el virus de la reivindicación 62.
  64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el virus recombinante comprende además un vARN que comprende una estructura deseada de lectura abierta.
  65. 65. La composición de conformidad con las reivindicaciones 3, 4 o 19, caracterizada porque el cADN de antisentido comprende la estructura de lectura abierta que codifica un polipéptido inmunogénico o un péptido de un patógeno.
  66. 66. Un método para la preparación de un virus de la influenza, caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula con la composición de la reivindicación 65, en una cantidad efectiva para producir el virus infeccioso de la influenza.
  67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque comprende el aislamiento del virus .
  68. 68. El virus caracterizado porque se obtiene por el método de la reivindicación 67.
  69. 69. El método de conformidad con las reivindicaciones 52, 53 o 64, caracterizado porque la estructura de lectura abierta codifica un polipéptido inmunogénico o un péptido de un patógeno.
  70. 70. El virus caracterizado porque se obtiene por el método de la reivindicación 69.
  71. 71. El método de confofmidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la estructura de lectura abierta codifica un polipéptido inmunogénico o un péptido de un patógeno.
  72. 72. El virus caracterizado porque se obtiene por el método de la reivindicación 71.
  73. 73. Un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del virus de las reivindicaciones 68, 70 o 72, para inmunizar al individuo.
  74. 74. Un vector que comprende un promotor de la polimerasa I y ARN, ligado operativamente a un cADN del virus de ARN de sentido positivo, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I y ARN.
  75. 75. El vector de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el cADN está en orientación de sentido.
  76. 76. El vector de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el cADN está en orientación de antisentido.
  77. 77. Una composición caracterizada porque comprende un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN, ligado operativamente a un cADN de un virus de ARN en sentido positivo en orientación de sentido, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I y ARN; y un vector que comprende un promotor de polimerasa I y ARN, ligado operativamente a un cADN de un virus de ARN en sentido positivo en orientación de antisentido, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I y ARN.
  78. 78. Un método para la preparación de un virus infeccioso, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula huésped con el vector de la reivindicación 74, para producir un virus infeccioso.
  79. 79. Un método para la preparación de un virus infeccioso, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula huésped con la composición de la reivindicación 77, para producir un virus infeccioso.
  80. 80. Un método para la preparación de un virus de la influenza, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del PBl del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del P32 del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del HA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NP del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NA del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del M del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN del NS del virus de la influenza, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADM que codifica el PBl del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el PB2 del virus de la influenza, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NP del virus de la influenza, de manera de producir un virus infeccioso.
  81. 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque demás comprende un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el HA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NA del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el Ml del virus de la influenza, un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el M2 del virus de la influenza, y un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica el NS2 del virus de la influenza.
  82. 82. El método de conformidad con las reivindicaciones 80 ó 81, caracterizado porque además comprende un vector que comprende un promotor ligado a secuencias 5' no codificadoras del virus de la influenza, ligadas a un cADN de interés o un fragmento del mismo, en una orientación antisentido ligada a secuencias 3' no codificadoras del virus de la influenza, ligadas a una secuencia de terminación de la transcripción.
  83. 83. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 80 a la 82, caracterizado porque además comprende el aislamiento del virus.
  84. 84. El virus caracterizado porque se obtiene por el método de la reivindicación 83.
  85. 85. Una célula caracterizada porque hace contacto con el virus de la reivindicación 84.
  86. 86. Una célula caracterizada porque está infectada con el virus de la reivindicación 84.
  87. 87. Un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del virus de la reivindicación 84 para inmunizar al individuo.
  88. 88. Un vector caracterizado porque comprende un promotor ligado operativamente a un cADN que comprende al menos una porción del genoma de un virus de ARN de hebra negativa, ligado a una secuencia de terminación de la transcripción.
  89. 89. El vector de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el cADN es una porción de un virus de ARN no segmentado de hebra simple.
  90. 90. El vector de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el cADN se obtiene de un virus de ARN segmentado de hebra simple.
  91. 91. El vector de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el promotor es un promotor de polimerasa I y ARN.
  92. 92. El vector de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la secuencia de terminación es una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I y ARN.
  93. 93. Una composición caracterizada porque comprende una pluralidad de vectores virales que comprenden a) al menos un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un cADN que comprende al menos una porción del genoma de un virus de hebra negativa de ARN ligado a una secuencia de terminación de la transcripción; y b) al menos un vector que comprende un promotor ligado operativamente a un segmento de ADN que codifica al menos una proteína viral del virus de ARN de hebra negativa.
  94. 94. La composición de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque el promotor del vector de a) es un promotor de polimerasa I y ARN.
  95. 95. La composición de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque el vector de a) comprende además una secuencia de terminación de la transcripción.
  96. 96. La composición de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque la secuencia de terminación de la transcripción es una secuencia de terminación de la transcripción de polimerasa I y ARN.
  97. 97. Un método para la preparación de un virus, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula huésped con el vector de la reivindicación 88 de manera de producir un virus infeccioso.
  98. 98. Un método para la preparación de un virus, caracterizado porque comprende poner en contacto una célula huésped con el vector de la reivindicación 93 de manera de producir un virus infeccioso.
  99. 99. Un virus caracterizado porque está aislado por el método de cualesquiera de las reivindicaciones 97 ó 98.
  100. 100. El uso del virus de cualesquiera de las reivindicaciones 18, 21, 44, 46, 48, 50, 62, 68, 70, 72, 84 ó 99.
  101. 101. El uso del virus de conformidad con la reivindicación 100 para terapia de genes.
  102. 102. El uso del virus de conformidad con la reivindicación 100 para una vacuna.
  103. 103. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16, 20 u 82, caracterizado porque el cADN antisentido de interés o la estructura de lectura abierta, codifica una proteína terapéutica.
  104. 104. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16, 20, 66, 69, 71, 73, 82 u 87, caracterizado porque el cADN de interés o la estructura de lectura abierta, codifican una proteína inmunogénica.
  105. 105. El virus de cualesquiera de las reivindicaciones 18, 21, 44, 48, 50, 62, 68, 70, 72, 84 ó 99, caracterizado porque es un virus reclasificante.
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