MXPA01004318A

MXPA01004318A - Transferencia de especies trans de genes apopticos y plantas transgenicas asi desarrolladas.

Info

Publication number: MXPA01004318A
Application number: MXPA01004318A
Authority: MX
Inventors: Martin B Dickman
Original assignee: Univ Nebraska Lincoln
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2003-06-06
Also published as: WO2000026391A3; JP2002538769A; EP1161546A2; WO2000026391A2; IL142690A0; AU1241100A; CN1413257A; HK1042926A1; KR20010087383A; CA2348705A1

Abstract

La invencion se refiere a transferencia de especies trans de genes apoptoticos a celulas vegetales, plantas transgenicas asi desarrolladas, y analisis de seleccion utilizando estas plantas. La invencion tambien se refiere a metodos de seleccion de descubrimiento de medicamento utilizando celulas de plantas transgenicas. Ademas, la invencion se refiere a metodos para identificar los componentes de la trayectoria apoptotica de planta utilizando proteinas no vegetales y acidos nucleicos.

Description

«5f TRANSFERENCIA DE ESPECIES TRANS DE GENES APOPTICOS Y PLANTAS TRANSGÉNICAS ASÍ DESARROLLADAS CAMPO TÉCNICO 5 La presente invención se refiere en general a modulación de apoptosis en plantas, y más particularmente, a la nueva transferencia de genes que codifican las proteínas de trayectoria apoptótica de especies no vegetales en plantas, generando así plantas con resistencia incrementada a varios ataques bióticos y abióticos así como también proporcionando 10 otras ventajas relacionadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Con avances recientes para entender las trayectorias de señalización complejas que inducen la muerte celular programada en 15 células animales, la búsqueda se ha intensificado para identificar trayectorias similares en organismos distantes evolutivos, tales como plantas. En las plantas, los regímenes de muerte celular programada se reconoce que ocurren en puntos específicos durante el desarrollo, y pueden activarse en respuesta a patógenos (ver, Woodson et al. , Plant 20 Physiol. 99:526-532, 1 992; O'Neill eí al., The Plant Cell 5:419-432, 1 993; Chasan, The Plant Cell 6:91 7-91 9, 1 994; Smart, New Phytol. 726:41 9-448, 1994; Keen, Ann. Rev. Genet. 24:447-463, 1990; Lamb, Cell 76:419-422, 1994; Mittler eí al. , Cell 7:29-42, 1 995). Entre las circunstancias relacionadas a la muerte, en las cuales se ha sugerido que la muerte 25 celular juega un papel determinativo se encuentra la muerte celular asociada a la resistencia hipersensible (HR) que es característica de varias interacciones de planta-microbio incompatibles. Aunque la evidencia morfológica que demuestra las marcas de contraste de apoptosis, incluyendo las escalas de ADN y cuerpos apoptóticos (Wyllie, Curr. Opin. Gen. Dev. 5:97-1 04, 1995) ahora se ha reportado en el desarrollo de la planta, la muerte asociada a la enfermedad, y en la reacción hipersensible (Wang et al., The Plant Cell 8:375-391 , 1996; Ryerson and Heath, The Plant Cell 8:393-402, 1 996) muy poco se sabe acerca de los genes y proteínas correspondientes que controlan la muerte celular de la planta y si los genes animales (vertebrados e invertebrados) que se sabe que controlan apoptosis en células animales tiene homólogos en plantas. Dentro de los tejidos animales, la homeostasis se mantiene por ei proceso de apoptosis, es decir, el proceso fisiológico normal de muerte celular programada. Los cambios a la trayectoria apoptótica que previenen o retrasan el cambio celular normal pueden ser justamente tan importantes en la patogénesis de enfermedades como lo son las anormalidades en la regulación del ciclo celular. Como la división celular, que se controla a través de las interacciones complejas entre las proteínas reguladoras del ciclo celular, la apoptosis se regula de manera similar bajo circunstancias normales por la interacción de productos de gen que ya sea previenen o inducen la muerte celular. Ya que las funciones de apoptosis para mantener la homeostasis de tejido en un rango de procesos fisiológicos tales como desarrollo embriónico, regulación celular inmune y cambio celular normal, la disfunción o pérdida de apoptosis regulada puede conducir a una variedad de estados de enfermedad patológica. Por ejemplo, la pérdida de apoptosis puede conducir a la acumulación patológica de linfocitos auto-reactivos que ocurre con muchas enfermedades autoinmunes. La inhibición o pérdida inapropiada de apoptosis también puede conducir a la acumulación de células viralmente infectadas y de células hiperproliferativas tales como células tumorales o neoplásticas. De manera similar, la activación inapropiada de apoptosis también puede contribuir a una variedad de estados de enfermedad patológica incluyendo, por ejemplo, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), enfermedades neurodegenerativas y lesión isquémica. Los tratamientos que se diseñan específicamente para modular las trayectorias apoptóticas en estas y otras condiciones patológicas pueden alterar la progresión natural de muchas de estas enfermedades. De acuerdo con lo anterior, dada la importancia reconocida de apoptosis en animales y su importancia reportada en el desarrollo y la resistencia a patógeno en plantas (Mittler, en: When Cells Die, Lockshin eí al. (eds.), pp. 147-174, 1998) el entendimiento de la trayectorias apoptóticas en tales organismos como plantas podría ser valuable. Aunque la apoptosis se media por diversas señales e interacciones complejas de productos de gen celular, los resultados de estas interacciones se alimentan por último en una trayectoria de muerte celular que se conserva evolutivamente entre humanos e invertebrados. La trayectoria, por sí misma, incluye una cascada de eventos de activación del cimógeno proteolítico análogo a aquel de la cascada de coagulación sanguínea. De manera interesante, los esfuerzos para identificar una trayectoria análoga en plantas todavía tienen que realizarse y la relación entre la apoptosis de mamíferos e invertebrados con aquella de las trayectorias de muerte celular programada en plantas permanece ambigua, en el mejor de los casos. Sin embargo, la respuesta hipersensible así como también la senescencia de la planta demuestran las características consistentes con una trayectoria de muerte celular programada (Drake eí al., Plant Mol. Biol. 30:755-767, 1 996). De acuerdo con lo anterior, el entendimiento de la trayectoria de muerte celular programada de plantas puede conducir a los métodos de regulación de la misma y de acuerdo con lo anterior, a plantas transgénica que contienen modulares de muerte celular que tienen características fenotípicas únicas, tal como resistencia a varios ataques bióticos y abióticos, así como también el tiempo de durabilidad de las plantas cortadas, frutas y vegetales. Por lo tanto, existe una necesidad en la materia de métodos para identificar componentes de trayectoria de muerte celular en plantas así como también métodos para modular la muerte celular programada en plantas. Además, existe una necesidad en la materia de producir plantas resistentes a ataque biótico y abiótico para mejorar la vitalidad y producción del cultivo. También existe una necesidad en la materia de producir plantas y productos de planta con senescencia reducida. La presente invención satisface esta necesidad a través de la transferencia de especies trans de genes que codifican proteínas de trayectoria apoptótica, permitiendo la modulación de las trayectorias de muerte celular programada de la planta para la prevención de la senescencia y patología de la célula vegetal, así como también proporcionar métodos y composiciones para analizar los compuestos para habilidad de aumento e inhibitoria apoptótica, mientras proporcionar además ventajas relacionadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Brevemente establecida, la presente invención proporciona métodos para modular la apoptosis en plantas a través del uso de secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de trayectoria apoptótica biológicamente funcionales. En un aspecto, la presente invención proporciona una planta transgénica, que comprende células vegetales que contienen al menos una secuencia de nucleótidos heterólogos capaz de codificar una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional o una variedad funcional de la misma. En ciertas modalidades, la planta transgénica tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína anti-apoptótica. En varias modalidades, la secuencia de nucle?tidos puede codificar Ced-9, Bcl-2, IAP, E1 B 19K y variantes funcionales de las mismas. En todavía otras modalidades, la expresión de la proteína de trayectoria apoptótica se controla por promotores constitutivos, inducibles o específicos de tejido. Como se trata en mayor detalle abajo, los aspectos adicionales de la presente invención proporciona varias plantas resistentes bióticas y abióticas. La presente invención también proporciona células vegetales y semillas, que contienen una secuencia de nucieótidos heterólogos capaz de codificar una trayectoria de proteína apoptótica biológicamente funcional o una variante funcional de la misma. En otras diversas modalidades, se proporcionan las células vegetales que tienen las mismas características como se observa arriba para una planta transgénica. Como se observa arriba, la presente invención proporciona plantas resistentes al ataque biótica, transgénicas. Las plantas contienen una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional, preferentemente una proteína anti-apoptótica. En ciertas modalidades, la proteína anti-apoptótica se selecciona del grupo que consiste de Ced-9, Bcl-2, IAP, E1 B 19K, y homólogos de las mismas. En las diversas modalidades, el ataque biótico es el resultado de un patógeno. Dentro de un aspecto relacionado, se proporcionan las plantas resistentes al ataque abiótico, transgénicas. Las plantas contienen una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional, preferentemente una proteína anti-apoptótica. En ciertas modalidades, la proteína anti-apoptótica se selecciona del grupo que consiste de Ced-9, Bcl-2, IAP, E 1 B 1 9K, y variantes funcionales de las mismas. Además, la presente invención proporciona métodos para generar tales plantas resistentes abióticas o bióticas, transgénicas, que comprenden transformar una célula vegetal con un vector que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional, la secuencia de ácido nucleico operablemente asociada con un promotor, que produce una planta de las células vegetales transformadas, y seleccionar una planta transformada que tiene resistencia biótica o abiótica. En todavía otros aspectos de la presente invención, se proporcionan métodos para modular apoptosis en una planta, que comprenden transformar una célula vegetal con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional normalmente no producida por la célula vegetal, la secuencia de ácido nucleico operablemente asociada con un promotor inducible, cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones adecuadas para la formación de una planta, y desarrollar la planta bajo condiciones y por un tiempo suficiente para inducir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Los métodos para identificar genes de planta que tienen actividad de trayectoria apoptótica también se proporcionan, que comprenden transformar células animales con una biblioteca de cADN vegetal, en donde cada miembro de la biblioteca de cADN se asocia operablemente con un promotor, contactar la(s) célula(s) tranformada(s) con un inductor apoptótico, y detectar actividad apoptótica en las células, y comparar esta actividad con una línea celular de control, en donde un incremento o reducción en actividad indica la presencia de una proteína de trayectoria apoptótica en la biblioteca de cADN vegetal. En aspectos relacionados, la presente invención proporciona, métodos para identificar un gen apoptótico que funciona en plantas, que comprenden transformar uno o más células vegetales con al menos una molécula de ácido nucleico heterólogo, en donde la molécula de ácido nucleico se asocia operablemente con un promotor, contactar la(s) célula(s) transformada(s) con un inductor apoptótico, y detectar actividad apoptótica en las células, y comparar esta actividad con una línea celular de control, en donde un incremento o reducción en actividad indica la presencia de un gen de trayectoria apoptótica que funciona en plantas. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una biblioteca de cADN heteróloga, en donde cada miembro de la biblioteca de cADN se asocia operablemente con un promotor. Las plantas transgénicas, células vegetales, y métodos de la presente invención como se describen arriba, tienen aplicación general a la muerte celular programada de planta. De acuerdo con lo anterior, se proporcionan los métodos para identificar los componentes de la trayectoria de muerte celular en plantas así como también los métodos para modular la muerte celular programada en plantas. Como se observa arriba, la presente invención también proporciona plantas resistentes al ataque biótico o abiótico para mejorar la vitalidad y producción del cultivo. Además, se proporcionan las plantas y productos de planta con senescencia reducida que conducen a tiempos de durabilidad más largos de vegetales y frutas cortadas así como también flores cortadas, etc. Además, la presente invención tiene aplicación a métodos y composiciones para analizar compuestos para habilidad de aumento e inhibitoria apoptótica, mientras proporcionar además otras ventajas relacionadas. Estos y otros aspectos de la presente invención será evidentes después déla referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anexos. Además, diversas referencias se establecen abajo que describen en más detalles ciertos procedimientos o composiciones (por ejemplo, plásmidos, etc.) y se incorporan por lo tanto para referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1 A y 1 B son representaciones esquemáticas de plásmidos que contienen una molécula de ácido nucleico de codificación IAP. Las Figuras 2A y 2B son representaciones esquemáticas de plásmidos que contienen una molécula de ácido nucleico de codificación Bcl-2. Las Figuras 3A y 3B son representaciones esquemáticas de plásmidos que contienen una molécula de ácido nucleico de codificación Ced-9. Las Figuras 4A-4C son representaciones esquemáticas de plásmidos que contienen una molécula de ácido nucleico de codificación E1 B-19K. La Figura 5 es una imagen explorada que representa análisis Northern Blot de expresión de transgen en plantas de tabaco transformadas. Las vías 1 -3 representan la expresión de IAP en plantas de tabaco separadas, la vía 4 representa la expresión en una planta de tabaco transformada con un vector de control, las vías 5-6 representan la expresión de Ced-9 en plantas de tabaco separadas. La Figura 6 es una fotografía de la morfología de la hoja después de la inoculación de tres líneas de tabaco transgénicas (A, C, D) y una línea de control (B) con Sclerotinia sclerotiorum. La Figura 7 es una fotografía de la morfología de la hoja después de la inoculación de control de tipo silvestre (A, B, C) y dos líneas de tabaco transgénicas que expresan IAP (D y E) con virus de mosaico de tabaco (TMV). La Figura 8 es una imagen explorada que representa análisis Northern Blot de transformantes de tabaco primarios (cultivo Glurk) que contienen Bcl-2. Las vías 2, 3, 5 y 7 demuestran expresión de Bcl-2, mientras que la vía de control representa la transformación con un vector (G1 15) sin inserción de Bcl-2. La Figura 9 es una imagen explorada que representa análisis Northern Blot de transformantes de tabaco primarios que contienen Ced-9. Las vías 4 y 8 demuestran la expresión. Las Figuras 1 0A y 10B son fotografías de la morfología de la hoja después de la inoculación de tabaco que contiene Bcl-2 con TMV. La hoja central es de tipo silvestre mientras que las hojas restantes se derivan de plantas de tabaco que contienen Bcl-2 separadas. Las Figuras 1 1 A y 1 1 B son imágenes escaneadas de análisis Western Blot de expresión de TMV en líneas de tabaco que contienen gen N (A) y ausentes de gen N (B) que contienen genes Bcl-2 o Ced-9. B es Bcl-2, C es Ced-9, T es TMV y A representa las muestras de hoja tomadas de secciones adyacentes al sitio de inoculación. La Figura 12 es una fotografía de la morfología de la hoja de plantas de tabaco que contienen Bcl-2 y Ced-9 después de la inoculación con virus de peste negra del tomate (TSWV). Las hojas derechas inferiores y superiores son controles, mientras que la hoja izquierda superior es una cultivo Glurk que contiene Ced-9 y la hoja izquierda inferior es un cultivo Turkish que contiene Ced-9. La Figura 13 es una imagen explorada de análisis Northern Blot de expresión de Ced-9 de una planta de tabaco transgénica independiente. Las vías 1 -4 son plantas de progenie individual. Las Figuras 14A a 14C son fotografías de la morfología de la hoja de plantas de tabaco transgénicas independientes. 14A representa la resistencia de la planta que contiene Bcl-2 a TMV, la hoja central siendo un control positivo, 14B representa la resistencia de planta que contiene Ced-9 a TMV, y 14C representa la resistencia de planta que contiene Ced-9 a TSWV. La Figura 15 es una fotografía de la morfología de la hoja de hojas inoculadas de S. sclerotiorum. Las hojas inferiores son controles de tipo silvestre, las hojas superiores contienen Ced-9. Las Figuras 16A y 16B son fotografías de la morfología de la hoja de plantas que contienen Bcl-2 (A) y plantas que contienen Ced-9 (B) después de la inoculación con Sclerotina. Las Figuras 17A-17C son fotografías de la morfología de la hoja de líneas de tabaco que contienen Bcl-2 (A) y líneas de tabaco que contienen Ced-9 (B) después de la inoculación con Sclerotina. La Figura 18 es una imagen explorada de análisis Northern Blot de expresión de Ced-9 en plantas resistentes a Sclerotina (vías 5-7) y plantas no resistentes (líneas 1 -4). La Figura 19 es una fotografía de la morfología de la hoja de Bcl-2, IAP, Ced-9, E1 B 19K y control (solamente vector); izquierda a derecha respectivamente, después de la inoculación con Cercospora nicotianae. Las Figuras 20A y 20B son fotografías de la morfología de la hoja de plantas de tabaco que contienen Bcl-xL. En 20A, las hojas superiores contienen una mutación de G1 38A en Bcl-xL, mientras que las hojas inferiores contienen Bcl-xL de tipo silvestre. En 20B, las hojas a mano izquierda contienen una mutación de G 1 38A en Bcl-xL, mientras que las hojas a mano derecha contienen Bcl-xL de tipo silvestre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de establecer la invención, puede ser útil para un entendimiento de la misma establecer las definiciones de ciertos términos que se utilizarán de aquí en adelante. Un "necrótrofo", como se utiliza en la presente, se refiere a un patógeno que mata una célula para completar su ciclo de vida y obtener nutrición por el uso del material de la célula muerta (por ejemplo, muchos hongos). Un "ataque biótico", como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio de la planta causado por agentes biológicos o viables (agentes bióticos). De acuerdo con lo anterior, los agentes bióticos que causan un ataque biótico incluyen, por ejemplo, insectos, hongos, bacterias, virus, nematodos, viroides, micloplasmas, etc. Un "ataque abiótico". como se utiliza en la presente, se refiere a un cambio de la planta por un agente no viviente o no viable (agente abiótico). De acuerdo con lo anterior, los agentes abióticos que causan un ataque abiótico incluyen, por ejemplo, factores ambientales tales como baja humedad (sequía), humedad elevada (inundación), deficiencia nutriente, niveles de radiación, contaminación del aire (ozono, lluvia acida , dióxido de azufre, etc), temperatura (extremos calientes y fríos), y toxicidad del suelo, así como también daño herbicida, daño pesticida, u otras prácticas agrícolas (por ejemplo, sobre-fertilización, uso inapropiado de rociadores químicos, etc.). Una "proteína de trayectoria apoptótica", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquiera de las proteínas que se incluyen en la trayectoria de muerte celular programada como se ha aclarado en un número de organismo, incluyendo humano, ratón, C. elegans, Drosophila Melanogaster y proteínas de baculovirus, excluyendo el gen p35 de baculovirus. Además, las frases "gen que codifica la proteína de trayectoria apoptótica" o "gen de trayectoria apoptótica" se utilizan recíprocamente en la presente. Una variedad de proteínas de trayectoria apoptótica se conoce y son útiles dentro del contexto de la presente invención. Las moléculas ejemplificativas incluyen moléculas de caspasa (actualmente 14 de las cuales se han identificado), miembros de la familia bcl-2, (por ejemplo, bcl-2, bcl-xL, bcl-xs, bcl-W, McL-1 , A1 , NR-1 3, Ced-9, E 1 B 1 9K. BHRF1 , KSHV ORF 16, LMW5-HL, KS-bcl-2, etc. ), Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid, Bik, Hrk, BNIP3, BimL, EGL1 , inhibidores de apoptosis (por ejemplo, lAP-baculovirus, DIAP 1 & 2-Drosophila, c-IAP 1 & 2-humano, X-IAP-humano, NIAP-humano, survivin-humano, etc. ) y lo similar. Las secuencias de estos y otros genes se encuentran disponibles de la Base de Datos del Banco Genético y se describen en numerosas publicaciones incluyendo When Cells Die, editada por Lockshin eí al., Wiley-Liss, Nueva York, 1998. Como se utiliza en la presente, una "rev-caspasa" se refiere a una proteína de cisteína que separa las proteína después de residuos Asp y se expresa como un cimógeno, en el cual una subunidad pequeña es N-terminal a una subunidad grande (ver, por ejemplo, PCT WO 99/00632). Dentro del contexto de esta invención, debe entenderse que las proteínas de trayectoria apoptótica incluyen secuencias de proteínas de tipo silvestre, así como también otras variantes (incluyendo alelos) de la secuencia de proteinas nativa. Brevemente, tales variables pueden resultar de polimorfismos naturales y pueden sintetizarse por metodología recombinante, y difieren de la proteína de tipo silvestre por una o más substituciones de aminoácido, inserciones, eliminaciones o lo similar. Típicamente, cuando se dirigen, las substituciones de aminoácidos, serán conservativas, es decir, la substitución de aminoácidos dentro de grupos de aminoácidos polares, no polares, aromáticos, cargados, etc. En la región de homología a la secuencia nativa, las variantes deben tener al menos preferentemente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, y dentro de ciertas modalidades, más de 92%, 95% o 97% de identidad. Tal secuencia de aminoácidos e identidad de ácido nucleico puede determinarse por metodologías estándar, incluyendo el uso del la metodología de investigación del Centro Nacional para Información de Biotecnología BLAST disponible en www.ncbi.nlm.nih.gov. Las metodologías de identidad preferidas son los algoritmos BLAST sin intersticio. Sin embargo, los algoritmos de identidad descritos en la Patente de E.U. 5,691 , 179 y Altschul eí al., Nucleic Acid. Res. 25:3389-3402, 1997 también son útiles y se incorporan en la presente para referencia. De acuerdo con lo anterior, su BLAST sin intersticio 2.0 es útil, entonces se utiliza con establecimientos de defecto. Además, una variante de nucleótido típicamente será suficientemente similar en secuencia para hibridizar la secuencia de referencia bajo condiciones de hibridización severas (para moléculas de ácido nucleico arriba de aproximadamente 500 bp, las condiciones severas incluyen una solución que comprende aproximadamente 1 M Na* A 25°C a 30°C por debajo de Tm; por ejemplo, 5 x SSPE, 0.5% SDS, a 65°C, ver, Ausuble, eí al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing , 1 995; Sambrook eí al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold, Spring Harbor Press, 1989). Algunas variantes pueden no hibridizar la secuencia de referencia debido a la degeneración del codón, tal como degeneraciones introducidas por la optimización de codón en un huésped particular, en tal caso la identidad del aminoácido puede utilizarse para valorar la similitud de la variante con la proteína de referencia. Una "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de polinucleótido en la forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico más larga, que se ha separado de su célula fuente (incluyendo el cromosoma normalmente reside en él) al menos una vez en una forma substancialmente pura. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprenderse de una amplia variedad de nucleótidos, incluyendo ADN, ARN, análogos de nucleótido o alguna combinación de estos. El término "in vitro" se refiere a sistemas que comprenden menos de una célula completa. El término "ex vivo" se refiere a sistemas de cultivo celular, que incluyen, por ejemplo, cultivo celular primario y secundario, cultivo de órgano completo, y sistemas similares. El término "in vivo" se refiere a organismos completos. "Modificación genética", como se utiliza en la presente, se refiere a la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico heterólogos en una o más células vegetales, que pueden generar plantas completas, viables, sexualmente competentes. Los términos "transgénico" y "genéticamente modificado" se utilizan recíprocamente en la presente para referirse a una planta que se ha generado a través del proceso arriba mencionado. Las plantas transgénicas de la presente invención son capaces de auto-polinizarse o trans-polinizarse con otras plantas de la misma especie de manera que el gen exterior, llevado en la linea germinal, puede insertarse en o multiplicarse en variedades vegetales agrícolamente útiles. El término "célula vegetal", como se utiliza en la presente, se refiere a protoplasto, células que producen gameto, y células que son capaces de regenerarse en dos plantas completas. De acuerdo con lo anterior, una semilla que comprende múltiples células vegetales capaces de regenerarse en una planta completa se incluye en la definición de "célula vegetal". Como se utiliza en la presente, "tejido vegetal" incluye tejidos de una planta diferenciados y sin diferenciar, incluyendo pero no limitándose a raíces, tallos, vastagos, hojas, polen, semillas, tejido tumoral y varias formas de células y cultivo tales como células únicas, protoplasto, embriones y tejido calloso. Como se utiliza en la presente, el término "planta" se refiere a ya sea una planta completa, una parte de la planta, o un grupo de células vegetales, tal como tejido vegetal, por ejemplo. Las plantas de invernadero también se incluyen dentro del significado de "planta". Las plantas adecuadas para utilizarse en la invención incluyen cualquier planta dispuesta a aceptar técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, espárrago, maíz tierno y de campo, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo perlado, centeno, y avena y ornamentales. Ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, tomate, papa, arabidópsis, tabaco, algodón semilla de uva , frijoles de campo, semilla de soya, pimientos, lechuga, guisantes, alfalfa, trébol, cultivos de col o Brassica olerecea (por ejemplo, repollo, brócoli, coliflor, col de Bruselas), rábano, zanahoria, remolachas, berenjena, espinaca, pepino, chayóte, melones, cantalupo, girasoles y varias plantas ornamentales. La planta de tabaco se utiliza en la presente como una planta ejemplificativa. El término "secuencia de ácido nucleico heterólogo", como se utiliza en la presente, se refiere a al menos un gen estructural, el gen operablemente asociada con una secuencia reguladora tal como un promotor. La secuencia de ácido nucleicos se origina en una especie exterior, o en la misma especie si se modifica substancialmente de su forma original. Por ejemplo, el término "secuencia de ácido nucleico heterólogo" incluye un ácido nucleico que se origina en la misma especie, en donde la secuencia se asocia operativamente con un promotor que difiere del promotor de tipo silvestre o natural. Un "gen estructural" es una secuencia de ADN que se transcribe en un ARN mensajero (mARN) que se traduce entonces en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. El término "expresión" se refiere a biosíntesis de un producto de gen. El término "operativamente asociado" se refiere a enlace funcional entre una secuencia promotora y el gen estructural regulado por la secuencia de ácido nucleico promotora. El promotor operablemente asociado controla la expresión del polipéptido codificado por el gen estructural. Un "promotor", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de ADN que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente, un promotor se ubica en la región 5' de un gen, próxima al sitio de inicio transcripcional de un gen estructural. Un "vector de clonación", como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ADN tal como un plásmido, cósmido, o bacteriófago que tiene la capacidad de replicarse autonómicamente una célula huésped. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción en los cuales las secuencias de ADN exteriores pueden insertarse en un modo determinable sin la pérdida de función biológica esencial del vector, así como también, un gen marcador que es adecuado para utilizarse en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Un "vector de expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ADN, que comprende un gen que se expresa en una célula huésped. Típicamente la expresión del gen se coloca bajo el control de ciertos elementos reguladores incluyendo promotores, elementos reguladores específicos de tejido, e intensificadores. Tal gen se, como se observa arriba, "asocia operablemente" con los elementos reguladores. Como se utiliza en la presente, un "patógeno" se refiere a cualquier agente que causa una enfermedad o estado de enfermedad en una planta, que incluye, pero no se limita a virus, hongos, bacteria, nematodos, y otros microorganismos relacionados. Como se utiliza en la presente, "modular" se refiere a la habilidad para alterar o cambiar del nivel basal. Como se utiliza en la presente, "inhibir" se refiere a la habilidad de bloquear, retrasar o reducir la severidad de una actividad o resultado en un modo estadísticamente significativo. A. GENES DE TRAYECTORIA APOPTÓTICA Y PRODUCTOS DE GEN Como se observa arriba, la presente invención proporciona plantas transgénicas y tejidos vegetales que contienen genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica, permitiendo así la expresión de los genes. Una variedad de genes que codifican las proteínas de trayectoria apoptótica se conocen y son útiles dentro del contexto de la presente invención. Las moléculas ejemplificativas incluyen moléculas de caspasa (actulmente 14 de las cuales se han identificado). Apaf-1 (Banco genético NM 001 160 y AF013263), miembros de la familia bcl-2, (por ejemplo, bcl-2, bcl-xL, bcl-xs, bcl-W, McL-1 , A1 , NR-1 3, Ced-9, E 1 B 1 9K. BHRF1 , KSHV ORF 16, LMW5-HL, KS-bcl-2, etc.), Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Bid (Banco genético NM 001 196) Bik, Hrk, BNIP3, BimL, EGL1 , inhibidores de apoptosis (por ejemplo, baculovirus OplAP, DIAP 1 & 2-Drosophila, c-IAP 1 & 2-humano, X-IAP-humano, NIAP-humano, survivin-humano, etc.), y lo similar (ver Tabla de abajo para un listado ejemplificativo de los Números de Acceso del Banco genético). Dada la descripción proporcionada en la presente, un gen de trayectoria apoptótica puede aislarse de una variedad de tipos de células y diseñarse en un vector de expresión adecuado para utilizarse en las plantas. Tabla 1 La presente invención , como se describe en la presente, proporciona células vegetales y tejidos vegetales que expresan genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica heteróloga. Los genes de trayectoria apoptótica pueden aislarse de ya sea ADN genómico, o preferentemente, bibliotecas de cADN. El aislamiento de los genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica de ADN genómico o cADN típicamente puede proceder al, primero, generar una biblioteca de ADN apropiada a través de las técnicas para construir bibliotecas que se conocen en la materia (ver Sambrook eí al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, 1 989) o se compró de fuentes comerciales (por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA). Brevemente, las bibliotecas de cADN pueden construirse de vectores de bacteriófago (por ejemplo, ?ZAPII), plásmidos u otros, que son adecuados para su selección, mientras que las bibliotecas de ADN pueden construirse en vectores cromosómicos, tales como YACs (cromosomas artificiales de levadura), vectores de bacteriófago, tales como ?EMBL3, ?gt1 1 , cósmidos o plásmidos. En una modalidad, ias secuencias de ácido nucleico de trayectoria apoptótica conocidas pueden utilizarse para diseñar una prueba de hibridización de oligonucleótido para seleccionar librerías de cADN o genómicas. Preferentemente, tales pruebas de oligonucleótidos son 20-30 bases en longitud. Para facilitar la detección de hibridización, el oligonucleótido pueden marcarse convenientemente, generalmente en el extremo 5', con una molécula reportadora, tal como radionúclido (por ejemplo, 32P), etiqueta enzimática, etiqueta de proteína, etiqueta fluorescente, o biotina. Tales bibliotecas se colocan generalmente entonces como fago o colonias, dependiendo del vector utilizado. Subsecuentemente, una membrana de nylon o nitrocelulosa, a la cual las colonias o fago se han transferido, se prueba para identificar los clones candidatos que contienen el gen que codifica la proteína de trayectoria apoptótica. Tales candidatos pueden verificarse como conteniendo ADN que codifica la proteína de trayectoria apoptótica por cualquiera de un número de varios medios que incluyen, por ejemplo, análisis de secuencia de ADN o hibridización con una segunda prueba sin cubrir. Una vez que se identifica la biblioteca como conteniendo un gen que codifica la proteína de trayectoria apoptótica, el gen puede aislarse mediante amplificación. Brevemente, cuando se utilizada ADN de biblioteca de cADN como un templado de amplificación, los primarios se diseñan en base a las secuencias del gen que codifican la proteína de trayectoria apoptótica (ver, por ejemplo, Tabla 1 ). Los primarios para la amplificación se derivan preferentemente de secuencias en la región sin traducir 5' y 3' con objeto de aislar un cADN de longitud completa. Los primarios preferentemente tienen un contenido de GC de aproximadamente 50% y contienen sitios de restricción para facilitar la clonación, y no tienen secuencias auto-complementarias ni contienen secuencias complementarias a su extremo 3' (para prevenir la formación de primario-dímero). Los primarios se templan a ADN genómico o cADN y suficientes ciclos de amplificación se llevan a cabo para producir un producto fácilmente visualizado por coloración y electroforesis de gel. El fragmento amplificado se purifica e inserta en un vector, tal como ?gt10 o pBS(M13+), y se propaga. La confirmación de la naturaleza del fragmento se obtiene por análisis de secuencia de ADN o indirectamente a través de la secuenciación de aminoácido de la proteina codificada. Otros métodos también pueden utilizarse para obtener una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de trayectoria apoptótica. Por ejemplo, tal molécula de ácido nucleico puede obtenerse de una biblioteca de expresión al seleccionar con un anticuerpo o anticuerpos reactivos a una proteína de trayectoria apoptótica (ver, Sambrook, eí al., Molecular Cloninh: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Pres, NY, 1989; Ausuble, eí al. , Curren Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-lntescience, NY, 1995). Los genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica de una variedad de especies pueden aislarse utilizando metodologías estándar. Para especies cercanamente relacionadas, la secuencia humana o porción de la misma puede utilizarse como una prueba en una biblioteca de cADN o genómica. Por ejemplo, en el caso de caspasa, un fragmento que comprende el sitio catalítico puede marcarse y utilizarse como una prueba en una biblioteca construida de ratón, primate, rata, perro u otro vertebrado, especies de mamíferos o de sangre caliente. Una hibridización inicial en severidad normal puede producir fragmentos o clones candidatos. Si ninguna hibridización se observa inicialmente, los grados variables de severidad pueden utilizarse (ver Sambrook eí al., supra, y otras fuentes bien conocidas para condiciones de severidad). Aunque tales pruebas también pueden utilizarse para probar bibliotecas de diversas especies evolutivas, tal como Drosophila, las condiciones de hibridización serán probablemente más relajadas. Aunque las condiciones de hibridización relajada utilizando pruebas designadas de secuencias humanas pueden identificar los genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica de diversas especies evolutivas, puede ser más benéfico intentar aislar directamente estos genes de una biblioteca utilizando métodos que no requieren la secuencia humana por sí. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, amplificación utilizando primarios derivados de áreas conservadas, amplificación utilizando primarios degenerados de varias regiones, anticuerpos que prueban las bibliotecas de expresión, y lo similar. Por ejemplo, la amplificación cebada aleatoria (por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa) puede emplearse (ver, por ejemplo, Methods Enzymol. 254:275, 1 995; Trends Genet. 1 1 :242, 1995; Liang and Pardee, science 257:967, 1992; Welsh eí al., Nucí. Acids. Res. 20:4965, 1992). Además, las variaciones de PCR cebada aleatoria también puede utilizarse, especialmente cuando un gen particular o familia de gen se desea. En tal método, uno de los primarios de amplificación es un "oligo (dT) ancoreforme (oligo(dT)dN)" y el otro primario es un primario degenerado en base a la secuencia de nucleótidos o de aminoácido de un gen relacionado. Una secuencia de gen se identifica como una proteína de trayectoria apoptótica por similitud del aminoácido, similitud del ácido nucleico y/o equivalencia funcional. Además, un gen puede identificarse como una proteína de trayectoria apoptótica en base a algoritmos de computadora que comparan la funcionalidad y estructura secundaria o relacionan la función con la estructura de domino en un formato terciario, tales algoritmos se encuentran actualmente disponibles. Los genes candidatos se expresan y el producto de gen se examina para la actividad enzimática y/u otras actividades funcionales utilizando análisis apoptóticos estándar y análisis descritos en la presente u otros análisis equivalentes. Las variantes de los genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica proporcionadas en la presente pueden diseñarse de variantes naturales (por ejemplo, polimorfismos, variantes de empalme, mutantes), sintetizarse o construirse. Muchos métodos se han desarrollado para generar mutantes (ver, generalmente, Sambrook eí al., supra; Ausubel eí al., supra, y la descripción anterior). Brevemente, los métodos preferidos para generar unas pocas substituciones de nucleótidos utilizan un oligonucleótido que se extiende sobre la base o bases a mutarse y contiene la base o bases mutadas. El oligonucleótido se hibridiza a ácido nucleico de un solo filamento complementario y la síntesis de doble filamento se ceba del oligonucleótido. El ácido nucleico de doble filamento se prepara para la transformación en células huésped, típicamente E. coli, pero alternativamente, otras procarióticas, levadura y otras eucarióticas. La selección estándar y procedimientos de crecimiento del vector se utilizan para identificar las secuencias mutantes y obtener producciones elevadas. De manera similar, las eliminaciones y/o inserciones de los genes que codifican la proteína de trayectoria apoptótica pueden construirse por cualquiera de una variedad de métodos conocidos como se trata supra. Por ejemplo, el gen puede digerirse con enzimas de restricción y religarse de manera que una secuencia se elimina o religa con secuencias adicionales de manera que se hace una inserción o substitución larga. Otros medios para generar secuencias variantes pueden emplearse con métodos conocidos en la materia , por ejemplo aquellos descritos en Sambrook, eí al. , supra y Ausuble eí al. , supra. La verificación de secuencias variantes se lleva a cabo típicamente por mapeo de enzima de restricción, análisis de secuencia o hibridización de prueba. Las plantas transgénicas y células vegetales que expresan moléculas de ribozima y antisensibles dirigidas a las proteína de trayectoria apoptótica también se contemplan dentro del alcance de la presente invención. La expresión de moléculas de ARN antisensible actuará para bloquear directamente la traslación de mARN al unir al mARN objetivo y prevenir la traslación de la proteína. La expresión de ribozimas, que son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la separación específica de ARN también pueden utilizarse para bloquear la traslación de la proteina. El mecanismo de la acción de ribozima incluye la hibridización específica de secuencia de la molécula de ribozima a ARN objetivo complementario, seguida de una separación endonucleolítica. Dentro del alcance de la invención se diseñan moléculas de ribozima de motivo forjado en frío que específica y eficazmente cataliza la separación endonucleolítica de secuencias de ARN. Las moléculas de ARN pueden generarse por la transcripción de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN . Los ácidos nucleicos y oligonucleótidos para utilizarse como se describe en la presente pueden sintetizarse de cualquier método conocido por aquellos expertos en esta materia (ver, por ejemplo, WO 93/01 286, Solicitud de E.U. No. de Serie 07/723,454; Patente de E.U . No. 5,218,088; Patente de E. U . No. 5, 175,269; Patente de E. U. No. 5, 109, 124). La identificación de ribozimas y oligonucleótidos para utilizarse como agentes antisensibles, y ADN para terapia genética incluyen métodos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las propiedades deseables, longitudes y otras características de tales oligonucleótidos se conocen bien. Los nucleótido antisensibles son oligonucleótidos que se unen en una manera específica de secuencia a ácidos nucleicos, tal como mARN o ADN. Cuando se unen a mARN que tiene secuencias complementarias, antisensibles, se previene la traslación del mARN (ver, por ejemplo, Patente de E. U. No. 5, 168,053 para AItman eí al., Patente de E. U. No. 5, 190,931 para Inouye; Patente de E. U. No. 5, 135,917 para Burch; Patente de E.U. No. 5,087,617 para Smith y Clusel eí al., Nucí.

Acids. Res. 27:3405-341 1 , 1993, que describe los oligonucleótidos antisensibles fungiformes). Las moléculas triples se refieren a filamentos de ADN únicos que unen ADN doble que forma una molécula triple colineal, previniendo así la transcripción (ver, por ejemplo, Patente de E. U. No. 5, 176,996 par Hogan eí al., que describe métodos para hacer oligonucieótidos sintéticos que se unen a sitios objetivo en ADN doble). Los nucleótidos antisensibles particularmente útiles y las moléculas triple son moléculas que son complementarias a o unen el filamento sensible de ADN o mARN que codifica una proteína incluida en modular la trayectoria de apoptosis o una proteina que media cualquier otro proceso no deseado de manera que la inhibición de traslación de la proteína es deseable. Los oligonucleótidos antisensibles se diseñan típicamente para resistir la degradación por enzimas nucleolíticas endógenas al utilizar tales enlaces como: fosforotioato, metilfosfonato, sulfona, sulfato, quetilo, fosforoditioato, fosforramidato, esteres de fosfato y otros de tales enlaces (ver, por ejemplo, Agrwal eí al., Tetrehedron Lett. 28:3539-3542, 1987; Miller eí al., J. Am. Chem. Soc. 93:6657-6665, 1971 ; Stec eí añl., Tetrehedron Lett. 26:21 91 -2194, 1985; Moody eí al., Nucí. Acids. Res. 72:4769-4782, 1989, Uznanski eí al., Nucí. Acids. Res., 1 989; Letsinger eí al., Tetrahedron 40.1 37-143, 1984; Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54:367-402, 1985; Eckstein, Trends Biol. Sci. 74:97-100, 1989, Stein en -. Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohén, Ed. Macmillan Press, Londres, pp. 97-1 1 7, 1 989; Jager eí al., Biochemistru 27.7237-7246, 1988). Con respecto a las proteínas de trayectoria apoptótica producidas en la plantas, tales proteínas pueden asilarse por métodos estándar, tal como cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de ion metálico, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, y otros métodos de aislamiento de proteína conocidos (ver generalmente Ausuble eí al. , supra, Sambrook eí al., supra). Una proteína purificada aislada da una sola banda en SDS-PAGE cuando se tiñe con azul Coomassie. Debe reconocerse que la presente invención comprende la producción de proteínas de trayectoria apoptótica vegetales endógenas así como también la producción recombinante de proteínas apoptóticas no vegetales, tales como proteínas apoptóticas de mamífero, utilizando así la planta como un vehículo de producción recombinante. Además, la presente invención también puede utilizarse para estudiar los genes animales y su funcionalidad en una célula vegetal. De acuerdo con lo anterior, como se describe en mayor detalle abajo, al generar una planta transgénica que contiene una proteína de trayectoria apoptótica que inhibe la apoptosis, la producción recombinante de cualquier número de péptidos y polipéptidos, incluyendo polipéptidos y péptidos no relacionados a apoptosis, puede aumentarse grandemente al reducir los eventos de muerte celular asociados con producción recombinante de polipéptidos heterólogos o endógenos (por ejemplo, anticuerpos). Las proteínas de trayectoria apoptótica pueden expresarse como una proteína de fusión hexa-his y aislarse por cromatografía que contiene metal, tal como perlas acopladas de níquel. Brevemente, una secuencia que codifica Hisß, se enlaza a una secuencia de ADN que codifica una proteína de trayectoria apoptótica. Aunque la secuencia de His6 puede colocarse en cualquier lugar en la molécula, preferentemente se enlaza en el extremo 3' inmediatamente precedente al codón de terminación. La fusión puede construirse por cualquiera de una variedad de métodos. Un método conveniente es la amplificación del gen que codifica la proteína de trayectoria apoptótica utilizando un primario aguas abajo que contiene los codones para His6. Las proteínas de trayectoria apoptótica purificadas pueden utilizarse en análisis para seleccionar compuestos inhibidores. Estos análisis pueden llevarse a cabo in vitro o in vivo y utilizar cualquiera de los métodos descritos en la presente o conocidos en la materia . La proteína también pede cristalizarse y someterse a análisis de rayos X para determinar su estructura tridimensional, o utilizarse para elevar anticuerpos. Además, como se describe, infra, los ácidos nucleicos heterólogos que codifican proteinas de trayectoria apoptóticas pueden expresarse en plantas para crear células vegetales para utilizarse en análisis de selección para inhibidores e intensificadores de apoptosis. B. VECTORES Y METODOLOGÍAS DE TRANSFORMACIÓN Las proteinas de trayectoria apoptótica pueden expresarse en una variedad de organismos huésped. Sin embargo, como se observa en la presente estas proteínas ofrecen ventajas inesperadas cuando se colocan dentro de células vegetales, particularmente en donde no se han identificado proteínas de trayectoria apoptótica similar. Por ejemplo, cuando e expresa en proteínas inhibidoras de trayectoria apoptótica de células vegetales pueden utilizarse para incrementar la resistencia al ataque abiótico y biótico, incluyendo resistencia a infecciones virales y fúngicas. Además, la habilidad para modular la muerte celular en plantas ofrece la habilidad de acoplar la expresión de compuestos insecticidas, por ejemplo, toxinas codificadas de Bacillus thuringiensis (ver, por ejemplo, Solicitud de PCT WO 97/34926), dentro de la planta. De acuerdo con lo anterior, la tolerancia al herbicida más elevada dentro de la planta puede lograrse en una planta que iniciaría normalmente un ciclo de muerte celular programado cuando se expresan ciertos tipos o niveles de compuestos insecticidas. De manera similar, la tolerancia al herbicida más elevada puede lograrse al incrementar la resistencia de la célula vegetal a casos de muerte celular programada inducida por herbicidas. La transferencia del material genético es rutina en muchos tipos de plantas y posible a grados variables en todos los tipos de planta. Un experto en la materia apreciará que existe una amplia variedad de vectores adecuados para la expresión en células vegetales fácilmente obtenibles. 1. Vectores Las plantas transgénicas de la presente invención se producen al contactar una célula vegetal con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un gen estructural que codifica una proteína que modula la muerte celular programada (es decir, apoptosis). Para ser eficaz una vez introducido en células vegetales, el gen estructural de interés debe asociarse operativamente con un promotor que es eficaz en la células vegetales para causar la transcripción del gen de interés. Adicionalmente, una secuencia de poliadenilación o secuencia de control de transcripción, también reconocida en células vegetales, puede emplearse. Se prefiere que el vector que contiene la secuencia de ácido nucleico también contiene uno o más genes marcadores seleccionables de manera que las células transformadas pueden seleccionarse fácilmente de células no transformadas, en cultivo, como se describe en la presente. Aquellos de experiencia ordinaria en la materia serán capaces de seleccionar un vector apropiado para la introducción de una secuencia de ácido nucleico heter?logo en un estado relativamente intacto. De esta manera, cualquier vector producirá una planta que lleva la secuencia de ADN introducida será suficiente. De acuerdo con lo anterior, el ADN libre puede utilizarse aún cuando solamente ocurrirá probablemente transformación de baja eficacia. La selección del vector, o ya sea el uso de un vector, se guía típicamente por el método de transformación seleccionado. En breve, la secuencia de ADN que codifica una proteína de trayectoria apoptótica se introduce en un vector de expresión apropiado para la célula vegetal huésped. En ciertas modalidades, la proteína de trayectoria apoptótica es un inhibidor de apoptosis, mientras que en otras modalidades, la proteína de trayectoria apoptótica es un intensificador o iniciador de apoptosis. Los inhibidores preferidos incluyen, pero no se limitan a IAP, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-W, McL-1 , A1 , NR-13, Ced-9, E 1 B 19K. BHRF1 , Bag-1 y lo similar. En otras modalidades, el ácido nucleico que codifica la proteína de trayectoria apoptótica se inserta en un vector y se enlaza a otra molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de manera que se produce una proteína de fusión. La secuencia de proteína de trayectoria apoptótica se deriva, como se describe en la presente. Como se trata arriba, la secuencia puede contener codones alternativos para cada aminoácido con codones múltiples. Los codones alternativos pueden seleccionarse como "óptimos" para las especies huésped, tales procedimientos de optimización se conocen bien en la materia. Además, los sitios de restricción se incorporan típicamente en las secuencias primarias y se eligen con respecto al sitio de clonación del vector. Si es necesario, los codones de terminación e iniciación pueden diseñarse en las secuencias primarias. En un mínimo, el vector debe contener una secuencia promotora. Como se observa arriba, un "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene elementos que dirigen la transcripción de un gen enlazado/asociado. En un mínimo, un promotor contienen un sitio de enlace de polimerasa de ARN. Más típicamente, en eucarióticas, las secuencias promotores contienen sitios de enlace para otros factores transcripcionales que controlan la velocidad y temporización de la expresión del gen. Tales sitios incluyen caja TATA, caja CAAT, caja POU, sitio de enlace AP1 y lo similar. Las regiones promotoras también puede contener elementos intensificadores. Cuando un promotor se enlaza a un gen para permitir la transcripción del gen, se "enlaza o asocia operablemente" con el mismo. Otras secuencias reguladoras también pueden incluirse. Tales secuencias incluyen una secuencia de señal de terminación de transcripción, intrones, secuencia de señal de secreción, origen de replicación, marcador seleccionabie, y lo similar. Las secuencias reguladoras se asocian operablemente entre sí para permitir la transcripción o traslación. Los vectores de expresión utilizados en la presente incluyen un promotor diseñado para la expresión de las proteínas en una célula huésped. Los promotores adecuados se utilizan ampliamente y se conocen en la materia. Los promotores constitutivos o inducibles se prefieren. En otras modalidades preferidas, el vector también incluye una secuencia terminadora de transcripción. Una "región terminadora de transcripción" tiene ya sea una secuencia que proporciona una señal que termina la transcripción por Ja polimerasa que reconoce el promotor seleccionado y/o una secuencia de señal para poliadenilación. Como se observa arriba, los vectore(s) empleados en la presente invención generalmente comprenden una secuencia de ácido nucleico que comprenden al menos un gen estructural que codifica una proteína de trayectoria apoptótica, operablemente asociada con un promotor. Para comenzar un proceso de transformación de acuerdo con la presente invención, es necesario primero construir un vector adecuado e introducirlo apropiadamente en la célula vegetal. Los detalles de la construcción de los vectores utilizados en la presente se conocen por aquellos expertos en la materia de ingeniería genética de plantas como son los métodos de transformación requisito, sin embargo ambos se tratan en mayor detalle en la presente. Típicamente un vector de expresión contiene elementos de ácido nucleico procariótico para un origen de replicación bacterial (por ejemplo, E. coli. Ori) y un gen reportador o un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia antibiótica) para proporcionar el crecimiento y selección del vector de expresión en un huésped bacterial, los elementos de ácido nucleico que controlan el inicio de transcripción, tal como un promotor tanto para crecimiento bacterial como vegetal, elementos de ácido nucleico que controlan el procesamiento de transcripciones tales como secuencia de terminación/poliadenilación de transcripción; y un gen reportador o marcador que se asocia operablemente con un promotor. Los genes reportadores útiles incluyen ß-glucuronidasa, ß-galactosidasa, transferasa de acetil cloranfenicol, luciferaza, y lo similar. Preferentemente, el gen reportador es ya sea ß-glucuronidasa (GUS) o proteína fluorescente verde (GFP). Los marcadores seleccionables preferibles incluyen resistencia antibiótica tal como G418, higromicina, canamicina, bialofos (impartidos por el gen bar), etc. En ciertas modalidades, los sistemas de expresión bacterial se utilizan para sintetizar las cantidades de una construcción para la digestión de endonucleasas de restricción subsecuente para extirpar el gen de interés. El gen de interés se liga entonces en un vector de expresión de planta y se utiliza para transformar las células vegetales. De acuerdo con lo anterior, un experto en la materia fácilmente reconocerá que uno puede utilizar genes reportadores completamente diferentes o marcadores seleccionables en bacterias como opuestos a las plantas. La selección bacterial preferida se lleva a cabo utilizando resistencia a la ampicilina, mientras que las células de plantas transgénicas se seleccionan en base a la resistencia a canamicina. Las descripciones generales de los vectores de expresión de planta y genes reportadores pueden encontrarse en Gruber eí al., "Vectors for Plant Tranformation, in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology" en Glich eí al. , Eds. Pp. 89-1 19, CRC Press, 1993. además, los vectores de expresión GUS y los casettes de gen GFP se encuentran disponibles de Clontech Laboratories, Inc. , Palo Alto, Calif, mientras que los vectores de expresión GFP y casettes de gen GFP se encuentran disponibles de Aurora Biosciences (San Diego, CA). La secuencia de ácido nucleico que codifican las proteínas de trayectoria apoptóticas también pueden incluir una señal de secreción, mediante la cual el polipéptido resultante es una proteína precursora procesada y secretada. La proteína resultante procesada puede recuperarse de los tejidos o célula vegetal o floema. Las señales de secreción adecuadas para utilizarse se encuentra ampliamente disponibles y se conocen en la materia, ver por ejemplo, During eí al. , Plant Mol. Biol. 75:281 -293, 1990; Lindsey and Jqnes en: Plant Cell Line Selection, pp. 317-335, VCH Weinham, Alemania, 1990; Gruber and Crosby en; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp. 89-1 17, CRC Press, Boca Ratón, FL, 1993. Las secuencia de ácido nucleico heterólogo utilizadas en la presente invención pueden introducirse en células vegetales utilizando plásmidos Ti, plásmidos inductores de raíz (Ri), bombardeo de partícula, electroporación, y vectores de virus vegetal. (Para revisiones de tales técnicas y vectores, ver, por ejemplo, Weissbach & Weisssbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VHl, pp. 421 -463; 1988; Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. , Blackie, Londres, Ch. 7-9, 1 988 y Horsch eí al. , Science 227.1229, 1985; y Gene Transfer to Plants, eds. Potrykus, Springer Veraa, 1995) todas incorporada en la presente para referencia. Los vectores de expresión que contienen fragmentos sintéticos o genómicos pueden introducirse en protoplastos o en tejidos intactos o células aisladas. Preferentemente, los vectores de expresión se introducen en tejido intacto. Los métodos generales para cultivar tejidos de plantas se proporciona en Miki eí al., en Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich eí al. , Eds. , pp. 67-68 CRC Press, 1993); y por Phillips eí al. , en Corn & Corn Improvement, 3rd Edición , Sprague eí al. , Eds. American Society of Agronomy Inc, eí al., pp. 345-387 1 988 y como se describe en más detalle abajo. 2. Promotores Una vez que la planta huésped se ha seleccionado y el método de transferencia de gel en la planta determinado, un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido, o regulado de manera desarrollada/inducible para la planta huésped se selecciona de manera que la proteína exterior se expresa en la(s) parte(s) deseada(s) de la planta (por ejemplo, todas las células, algunas células, o tejidos completos). Como aquellos de experiencia ordinaria en la materia apreciarán fácilmente, cualquier promotor compatible de planta puede utilizarse para accionar la expresión de un gen estructural y, más específicamente, un gen de trayectoria apoptótica. Aunque el promotor endógeno del gen estructura de interés puede utilizarse para regulación transcripción del gen, preferentemente, el promotor es una secuencia reguladora exterior. Para vectores de expresión de planta, los promotores virales adecuados incluyen promotores de ARN 35S y ARN 1 9S de CaMV (Brisson eí al. , Nature 370: 51 1 , 1 984; Odell eí al., Nature 373:810, 1 985); el promotor de transcripción de longitud completa de Virus de Mosaico de Escrofularia FMV) (Gowda eí al. , J. Cell Biochem. 73D;301 , 1 989 y Patente de E. U. No. 5,378,61 9) y el promotor de proteína de recubrimiento a TMV (Tákamatsu eí al. , EMBO J 6: 307, 1987). Alternativamente, los promotores de planta tales como promotor inducible de luz de la subunidad pequeña de carboxilada de bis-fosfato de ribulosa (ssRUBISCO) (Coruzzi eí al., EMBO J 3: 1671 , 1 984; Broglie eí al. , Science 224.838, 1 984); promotor de sintasa de manopino (Velten eí al. , EMBO J 3.2723, 1 984) promotores de sintasa de nopalina (NOS) y sintasa de octopina (OCS) (llevados en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens) o promotores de impacto térmico, por ejemplo, semilla de soya hsp 17.5-E o hsp17.3-B (Gurley eí al.. Mol. Cell. Biol. 6: 559, 1986; Severin eí al., Plant Mol. Biol. 75:827, 1 990) pueden utilizarse. Ver Publicación de PCT WO 91 /19806 para una revisión de una variedad de promotores de planta conocidos que son adecuados para utilizarse dentro del contexto de la presente invención. a. Promotores Constitutivos Los promotores útiles dentro del contexto de la presente invención incluyen tanto promotores naturales inducibles como constitutivos así como también promotores diseñados. Tales promotores pueden obtenerse de plantas, virus, u otras fuentes, e incluyen , pero no se limitan a: el promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV), como se utiliza en la presente, la frase promotor "35S de CaMV" incluye variaciones y análogos del promotor 35S de CaMV, por ejemplo, promotores derivados por medio de ligaciones con regiones operadoras, mutagénesis aleatoria o controlada, promotores dobles, etc. ; promotores de genes de proteína de almacenamiento de semilla tales como Zmal OKz o Zmag 1 2 (ceína de maíz y genes de gluteína , respectivamente), o "genes de manejo local" que se expresan en todas las células (tal como Zmaact, un gen de actína de maíz), (ver, Benfey eí al., Science 244: 174-181 , 1989; Elliston en Plant Biotechnology, eds. , Kung and Arntzem, Butterworthd Publishers, Bostos, Mass. , p. 1 1 5-1 39, 1 989). De acuerdo con lo anterior, la presente invención puede utilizar promotores de genes que se sabe que proporcionan expresión elevada en partes de la planta comestibles, tal como el promotor de gen de patatina de papa, ver, por ejemplo, Wenzler eí al. , Plant Mol. Biol. 72:41 -45, 1 989. Aunque los promotores CaMV son ejemplos comunes de promotores constitutivos también lo son el promotor de ubiquitina (ver Solicitud de Patente EP 0342926) y el promotor de metiltransferasa de ADN de virus de Cólera (ver, Patente de E.U. No. 5,563,328). b. Promotores Inducibles Como se observa arriba, los promotores inducibles son útiles dentro del contexto de la presente invención. Un promotor inducible es un promotor que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una secuencia de ácido nucleico en respuesta a un inductor. En la ausencia de un inductor, la secuencia no se transcribirá. En una modalidad, el factor de proteína que se une específicamente a un promotor inducible para activar la transcripción se presenta en una forma inactiva que se convierta entonces directa o indirectamente a la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un ataque biótico o abiótico tal como, un agente químico tal como una proteina, metabolito (azúcar, alcohol, etc), un regulador de crecimiento, herbicida, o un compuesto fenólico o una tensión fisiológica impuesta directamente por calor, sal, elementos tóxicos, etc, o indirectamente a través de la acción de un agente de enfermedad o patógeno tal como un virus. Una célula vegetal que contiene un promotor inducible puede exponerse a un inductor al aplicar externamente el inductor a la célula tal como mediante rociado, humectación, calentamiento, exposición a la luz, exposición al patógeno, o métodos similares. En ciertas modalidades, el promotor inducible puede encontrarse en un estado inducido por toda la formación de la semilla o al menos por un periodo que corresponde a la transcripción de la secuencia de ácido nucleico de las moléculas de ácido nucleico recombinantes.

Para ser más útil, un promotor inducible preferentemente proporciona poca o nada de expresión en la ausencia del inductor; expresión elevada en la presencia del inductor; usa un esquema de inducción que no interfiere con la fisiología normal de la planta; y tiene poco efecto en la expresión de otros genes. Ejemplos de promotores inducibles útiles dentro del contexto de la presente invención incluyen aquellos inducidos por medios químicos, tal como promotor de metaoltioneína de levadura que se activa por iones de cobre (Mett eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. 90:4567, 1 993); secuencias reguladoras In2-1 e ln2-2 que se activan por bencenosulfonamidas substituidas, por ejemplo, asegurador de herbicida (Hershey eí al., Plant Mol. Biol 77:679, 1 991 ); la secuencia promotora del gen químicamente inducible aislada de una subunidad de 27 kD del gen de glutationa-S-transferasa de maíz (GST II), inducido por N,N-dialil-2,2-dicloroacetamida (nombre común; dicloramida) o bencil-2-cloro-4-(trifluorometil)-5-tiazolacarboxilato (nombre común: flurazola) y como se describe en la Solicitud de PCT publicada No. WO 90/08830; las secuencias reguladoras de GRE que se inducen por glucorticoides (Schena eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. E. U.A. 88: 10421 , 1 991 ; promotor de impacto de calor de 70 kDa de D. Melanogaster (Freeling and Bennet, Maize ADN 1 , Ann. Rev. Of Genetics 79.297-323) y el promotor de dehidrogenasa de alcohol que se induce por etanol (Nagao eí al. , Miflin, Ed. , Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, p. 384-438, Universidad de Oxford Press, Oxford, 1 986) o el promotor Lex A que se activa con tratamiento químico y se encuentra disponible a través de Ligand Pharmaceuticals. Otros promotores inducibles incluyen aquellos inducidos por ataque patógeno, tales como promotores inducibles de nematodo descritos en la Publicación de PCT número WO 98/22599. el promotor inducible de glucorticoide (Aoyama and Chua, The Plant J. 77.605-612, 1997), un promotor de sintasa de chalcona y el promotor activado de defensa (prop1 -1 ) (Strittmatter eí al., Biol/Technology 73: 1085-1089, 1995). Los promotores inducibles también se han descrito en la Solicitud publicada No. EP89/103888.7 por Ciba-Geigy, en donde un número de promotores inducibles se identifican, incluyendo los genes de proteína PR, especialmente los genes de proteína PR de tabaco, tales como PR-1 a, PR-1 b, PR-1 c, PR-1 , PR-A, PR-S, el gen de quitinasa de pepino, y los genes de beta-1 ,3-glucanasa de tabaco básico. Los promotores inducibles por herida (WIN) también pueden ser útiles en el contexto de la presente invención , ver Lindsey and Jones en : Plant Cell Line Selection, pp. 317-335, VCH Weinham, Alemania, 1990, para una descripción de los mismos. Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles e intensificadores se conocen por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. c. Promotores específicos de tejido Los promotores específicos de tejido también pueden utilizarse en la presente invención. Un ejemplo de un promotor específico de tejido es el promotor expresado en meristemos de vastago (Atanassova eí al., Plant J. 2:291 , 1992). Otros promotores específicos de tejido útiles en las plantas transgénicas, que incluyen el promotor cdc2a y el promotor cyc07, se conocerán por aquellos de experiencia en la materia. (Ver, por ejemplo, Ito eí al., Plant Mol. Biol. 24:863, 1994; Martínez eí al., Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 89:7360, 1992; Medford eí al., Plant Cell 3:359, 1991 ; Terada eí al., Plant Journal 3:241 -1993; Wissenbach et al., Plant Journal 4:41 1 , 1993; promotor de patatina clase I dirigido de tubérculo; Bevan eí al., Nuleic Acids Res. 74:4625-38, 1986; los promotores asociados con genes ADPGPP de tubérculo de papa, Muller eí al., Mol. Gen. Genet. 224.1 36-46, 1990; el promotor de semilla de soya de ß-conglicina, también conocida como la proteína 7S, que acciona la transmisión dirigida de semilla, Bray, Planta 772:364-370, 1987, promotores dirigidos de semilla de los genes de ceína de endoesperma de maíz, Pedersen eí al., Cell 29: 101 5-26, 1982; y promotores específicos de polen tales como aquellos descritos en la Patente de E. U. No. 5,086, 169 para Mascarenhas que describe un promotor específico de polen aislado de maíz; Patente de E. U. No. 5,412,085 para Alien eí al., que describe otro promotor específico de polen de maíz; Patente de E. U. No. 5,477,002 para Tuttle eí al. , que describe un promotor específico; Patente de E. U. No. 5,470,359 para Huffman eí al., que describe un promotor específico de tapetum; WO 92/1 1379 para Drape eí al, que describe un promotor específico de tapetum aislado de Brassicaceae, Plant 8(1 ):55-63, 1 995, que describe un promotor específico de polen de tabaco. También puede ser deseable incluir secuencias de intrón en las construcciones promotoras ya que la inclusión de secuencias de intrón en la región de codificación puede resultar en especificidad y expresión aumentada . De esta manera , puede ser ventajosos unir las secuencias de ADN a expresarse a una secuencia promotora que contiene las primeras secuencias de intrón y exón de un polipéptido que es único para las células / tejidos de una planta. Adicionalmente, las regiones de un promotor pueden unirse a regiones de un promotor diferente con objeto de obtener un promotor quimérico. 3. Marcadores Los vectores de la presente invención, también preferentemente incluyen al menos un marcador/reportado punteable o seleccionable que es funcional en el huésped. Números genes para este propósito se han identificado (ver, por ejemplo, Fraley, Mass. , p. 395-407, 1989; Weising eí al., Ann. Rev. Genet. 22.421 -477, 1988). Un gen marcador seleccionable incluye cualquier gen que confiere un fenotipo o rasgo en el huésped que permite que las células transformadas se identifiquen y crezcan selectivamente. De acuerdo con lo anterior, los genes marcadores de selección codifican un producto de gen de selección que confiere a la célula vegetal resistencia a un agente químico o tensión fisiológica, o confiere una característica fenotípica distinguible a las sellas de tal manera que las células vegetales transformadas con la molécula de ácido nucleico recombinante pueden seleccionarse fácilmente utilizando un agente selectivo. Los genes marcadores seleccionables adecuados para huéspedes bacteriales incluyen el gen de resistencia a ampicilina (Ampr), gen de resistencia a tetraciclina (Tcr) y el gen de resistencia a canamicina (Kanr). El gen resistente a la ampicilina se prefiere actualmente. Los marcadores adecuados para eucarióticas usualmente requieren una deficiencia complementaria (por ejemplo, quinasa de timidina (tk) en huéspedes tk). Sin embargo, los marcadores de medicamento también se encuentran disponibles (por ejemplo, resistencia a G41 8 y resistencia a higromicina). Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen, el gen de barra, deaminasa de adenosina, reductasa de dihidrofolato, higromicina-B-fosfotransferasa, quinasa de timidina, xantina-guanina fosforibosil-transferasa y amino-glicósido 3'-O-fosfotransferasa II (canamicina, neomicina y resistencia a G4185). Otros marcadores adecuados se conocen por aquellos expertos en la materia. Además, la identificación de la expresión del gen puede llevarse a cabo por tales métodos como Northern Blots del mARN de interés producido por la planta. 4. Métodos de Transformación La transformación de plantas de acuerdo con la invención pede llevarse a cabo en esencialmente cualquiera de las diversas maneras conocidas por aquellos expertos en la materia de biología molecular de planta. (Ver, por ejemplo, Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, . Wu and Grossman, Eds. , Acadamic Press, incorporada en la presente para referencia). Como se utiliza en la presente, el término "transformación" significa alteración del genotipo de una planta huésped por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo. Los métodos para introducir vectores de expresión en tejido vegetal incluyen medios físicos y químicos, incluyendo electroporación, bombardeo de partícula, infección viral y bacterial/co-cultivación con, por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens. Estos métodos de transformación son útiles para introducir genes exteriores tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Potrykus, Annu Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. 42:205-225, 1 991 y Shimamoto eí al., Nature 338:274-276, 1989. Los métodos principales para causar integración estable de ADN exógeno en ADN genómico de planta incluyen los siguientes planteamientos: 1 ) transferencia de gen mediada por Agrobacterium; Horsch eí al., Science 227: 1229-1 985; Gruber eí al., supra; Klee eí al., Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486, 1 987; Klee eí al., Molecular Biology of Plant Nuclear Genes 6:2-25, 1 989; Gatenby, Plant Biotechnology, 93-1 12, 1989, ; White, Plant Biotechnology, 3-34 1989, y 2) toma de ADN directa, Paszkowski et al. , Molecular Biology of Plant Nuclear Genes 6.52-68, 1989, incluyendo métodos para toma directa de ADN en protoplastos, Toriyama eí al., Bio/Technology 6:1072-1074, 1988; toma de ADN inducida por impacto eléctrico breve de células vegetales, Zhang eí al., Plant Cell Rep. 7:379-384, 1 988; y Fromm eí al. , Nature 379:791 -792, 1 986. La inyección ADN en tejidos o células vegetales por bombardeo de partícula, Klein eí al. , Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, 56-66, 1988; Klein eí al., Bio/Technology 6:559-563, 1 988; McCabe eí al., Bio/Technology 6:923-926, 1 988 y Sanford, Physiol. Plant 79:206-209, 1 990, por el uso de sistemas micropequeños, Hess, Int. Rev. Cytol 707:367-395, 1987, Neuhaus eí al., Theor. Appl. Genet. 75:30-36, 1987, Neuhaus and Spangenberg , Physiol. Plant 79:21 3-21 7, 1990 o por la incubación directa de ADN con polen de germinación; DeWet eí al., Experimental Manipulation of Ovule Tissue, 197-209, 1985, Ohta, Y, . Proc. Nati. Acad. Sci USA 83:71 5-719, 1986, o 3) el uso de un virus de planta como vectores de gen, Klee eí al. , Ann. Rev. Plant. Physiol. 38:467-486, 1 987M Futterer eí al. , Physiol Plant 79: 1 54-1 57, 1 990. El uso de Virus de Mosaico de Coliflor (CaMV) (Howell eí al. , Science 208: 1265, 1980) y virus gemini (Goodman, J. Gen. Virol. 54:9, 1981 ) como vectores se ha sugerido pero por mucho los sucesos reportados mayores han sido con Agrobacteria sp. (Rorsch eí al., Science 227: 1229-1231 , 1985). Los métodos para el uso de Agrobacterium en base a sistemas de transformación ahora se han descrito por muchas diferentes especies. Generalmente las cepas de bacterias se utilizan que contienen versiones modificadas del plásmido Ti que ocurre naturalmente de manera que ADN se transfiere a la planta huésped sin la formación subsecuente de tumores. Estos métodos incluyen la inserción dentro de los bordes del plásmido Ti del ADN a insertarse en el genoma de la planta enlazado a un gen marcador de selección para facilitar la selección de las células transformadas. Tal sistema de vector se describe por Hadjukiewicz eí al. , Plant Mol Bio. 25:989-994, 1 994. Tal sistema binario comprende un primer plásmido Ti que tiene una región de virulencia (vir) esencial para la introducción de ADN de transferencia (T-ADN) en plantas, y un plásmido quimérico. El último contiene al menos una región borde de la región T-ADN de un plásmido Ti tipo silvestre que flanquea el ácido nucleico a transferirse. ' Los sistemas de plásmido Ti binarios se han mostrado eficaces para transformar células vegetales (De Framond Biotechnology 1 :262 , 1983; Hoekema eí al. , Nature 303: 1 79, 1983). Los sistemas binarios adicionales se describen en la Publicación de PCT Nos. WO 99/01 563 y WO 99/10514. Los tejidos de planta y bacterias se cultivan juntos para permitir la transferencia de ADN exterior en células vegetales después las plantas transformadas se regeneran en el medio de selección. Cualquier número de tejidos y órganos puede servir como objetivos de transformación mediada por Agrobacterium como se describe específicamente para los miembros del Brassicaceae. Estos incluyen capas celulares delgadas (Charest eí al., Theor. Appl. Genet. 75:438-444, 1 988), cotiledones (Moloney eí al., Plant Cell Repts. 8:238-242, 1 989) y embrioides (Neuhaus eí al., Theor. Appl. Genet. 75:30-36, 1987). Un experto en la materia entiende, sin embargo, que puede ser deseable en algunos cultivos elegir un método o tejido diferente de transformación. Puede ser útil generar un número de plantas transformadas individuales con cualquier construcción recombinante con objeto de recuperar las plantas libres de cualquier efecto de posición. En ciertas modalidades, puede ser preferible seleccionar plantas que contienen una copia de la molécula de ácido nucleico heterólogo introducida con objeto de minimizar los efectos silenciosos. En una modalidad, los vectores de expresión se introducen en los tejidos vegetales utilizando co-cultivación de células vegetales con virus o bacterias. Por ejemplo, los sistemas a base de ARN de planta viral pueden utilizarse, típicamente al insertar el gen estructural de interés en las regiones promotoras de revestimiento de un virus de planta adecuado bajo el control de un promotor. Los sistemas a base de ARN de planta viral se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,500,360; 5, 316,931 y 5,589,367, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad . Como se observa arriba, en ciertas modalidades de la presente invención, el sistema de plásmido Ti de Agrobacterium se utiliza , Watson eí al., Recombinant ADN, a Short Course, Scientific American Books, 164-175, 1983. Los plásmidos que inducen tumor (Ti) de A. tumefaciens contienen un segmento de ADN de plásmido conocido como ADN de transformación (T-ADN) que se transfiere a células vegetales en donde se integra en el genoma del huésped vegetal. La construcción del sistema de vector de transformación tiene dos etapas básicas. Primero, un vector plásmido se construye, el cual se replica en Escherichia coli (E. coli). Este plásmido contiene el ADN que codifica la proteína de interés (una proteína antigénica en esta invención); este ADN se flanquea por secuencias borde de T-ADN que definen los puntos en los cuales el ADN se integra en el genoma de la planta. Usualmente un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como un gen que codifica la resistencia a un antibiótico tal como canamicina) también se inserta entre las secuencias de borde izquierdo (LB) y borde derecho (RB); la expresión de este gen en células vegetales transformadas dan un método de selección positivo para identificar aquellas plantas o células vegetales que tienen una región de T-ADN integrada. Watson eí al., Recombinant ADN, a Short Course, Scientific American Books, 164-175, 1983; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989. Esta segunda etapa incluye la transferencia del plásmido de E. coli a Agrobacterium. Esto puede llevarse a cabo a través del sistema de acoplamiento de conjugación, o por toma directa de ADN de plásmido por Agrobacterium. Para transferencia subsecuente del T-ADN a plantas, la cepa de Agrobacterium utilizada contiene genes de virulencia (vir) para transferencia de T-ADN a células vegetales, White, Plant Biotechnology, 3-34, 1989; Fraley; Plant Biotechnology, 395-407, 1989; Hajdukiewicz eí al., Plant Mol. Bio. 25:989-994, 1 994. Aquellos expertos en la materia deberían reconocer que estas son múltiples elecciones de cepas de Agrobacterium y estrategias de construcción de plásmido que pueden utilizarse para optimizar la transformación genética de las plantas. También reconocerán que A. tumefaciens puede no ser la única cepa de Agrobacterium utilizada. Otras cepas de Agrobacterium tal como A. rhizogenes deben ser más adecuadas en algunas aplicaciones. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de las especies vegetales y el sistema de suministro de Agrobacterium. Un planteamiento muy conveniente es el procedimiento del disco de la hoja que puede llevarse a cabo con cualquier explanta de tejido que proporciona una buena fuente para el inicio de la diferenciación de la planta completa. La adición de tejido fomentador puede ser deseable bajo ciertas condiciones. Otros procedimientos tal como la transformación in vitro de protoplastos de regeneración con A. tumefaciens puede seguirse para obtener células vegetales transformadas así como también, Potrykus, Plant Mol. Biol. 42:205-225, 1991 ; White, Plant Biotechnology, 3-34, 1 989. Los métodos que incluyen el uso de Agrobacterium incluyen, pero no se limitan a: 1 ) co-cultivación de Agrobacterium con protoplastos aislados, cultivados; 2) transformación de tejidos o células vegetales con Agrobacterium; o 3) transformación de semillas, ápices o meristemos con Agrobacterium. Además, la transferencia de gen puede llevarse a cabo por una transformación in situ por Agrobacterium, como se describe por Bechtold eí al. , C. R. Acad. Sci. Paris 376: 1 194, 1993 y los métodos de transformación como se describe en la Solicitud de Patente de E.U. No. 08/667, 188 y la Publicación de PCT correspondiente No. WO 97/48814, y se ejemplifica en la presente. En resumen, este planteamiento se basa en la infiltración al vacío de una suspensión de células de Agrobacterium. El método preferido para introducir ácido nucleico heterólogo en células vegetales es infectar tales células vegetales, una explanta, un meristemo o una semilla, con Agrobacterium tumefacines transformado como se describe arriba. Bajo condiciones apropiadas conocidas en la materia, las células vegetales transformadas se desarrollan para formar vastagos, raíces, y desarrollarse más en plantas. En una modalidad , el(los) vector(es) de la invención comprende(n) un sistema binario de plásmido Ti en donde la secuencia de ácido nucleico heterólogo codifica una proteína de trayectoria apoptótica. En ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico codifican al menos una proteína anti-apoptótica. Tales vectores pueden contener opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda o más proteína de trayectoria apoptótica . Alternativamente, dos o más vectores pueden utilizarse en donde cada vector contiene una secuencia de ácido nucleico heterólogo. Otros genes de trayectoria apoptótica pueden utilizarse para la construcción de uno o más vectores, en una manera similar. En ciertas modalidades, las secuencia de ácido nucleico heterólogo pueden introducirse en una célula vegetal al contactar la célula vegetal utilizando medios químicos o físicos directos. Por ejemplo, el ácido nucleico puede transferirse físicamente mediante microinyección directamente en células vegetales por el uso de micropipetas o bombardeo de partícula. Alternativamente, el ácido nucleico puede transferirse en la célula vegetal al utilizar glicol de polietileno que forma un complejo de precipitación con material genético que se toma por la célula. Otro método para introducir ácido nucleico en una célula vegetal es penetración balística de velocidad elevada por partículas pequeñas con el ácido nucleico a introducirse contenido ya sea dentro de la matriz de partículas o perlas pequeñas, o en la superficie de las mismas (Klein eí al., Nature 327:70, 1987, Patente de E.U. Nos. 4,945,050, 5,036,006 y 5, 100,792). Típicamente, cuando se utiliza bombardeo de partícula pequeña, el ADN se absorbe en microproyectiles tales como cristales de sulfato de magnesio o partículas de tungsteno y los microproyectiles se aceleran físicamente en tejidos vegetales o células. Aunque, típicamente solamente una introducción única de una nueva secuencia de nucleótido se desea, es método típicamente proporciona múltiples introducciones. El ácido nucleico heterólogo también puede introducirse en células vegetales por electroporación (Fromm eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. 82:5824, 1 985, que se incorpora en la presente para referencia). En esta técnica, los protoplastos de planta se electroporan en la presencia de vectores o ácidos nucleicos que contienen las secuencias de ácido nucleico relevantes. Los impulsos eléctricos de intensidad de campo elevada permeabilizan inversamente las membranas que permiten la introducción de ácidos nucleicos. Los protoplastos de planta electroporada reforman la pared celular, dividen y forman un callo de planta. La selección de las células de planta transformadas con el gen transformado puede llevarse a cabo utilizando marcadores fenotípicos como se describe en la presente. Además, como se describe arriba, el virus de mosaico de coliflor (CaMV) también puede utilizarse como un vector para introducir ácido nucleico heterólogo en células vegetales (Patente de E. U. No. 4,407,956). El genoma de ADN viral de CaMV se inserta en un plásmido bacterial de origen que crea una molécula de ADN recombinante que puede propagarse en bacterias. Después de clonar, el plásmido recombinante puede clonarse y modificarse además por la introducción de la secuencia de ácido nucleico deseada. La porción viral modificada del plásmido recombinante se extirpa entonces del plásmido bacterial de origen y se utiliza para inocular las plantas o células vegetales. En las diversas modalidades, la invención proporciona métodos para producir una planta transgénica que tiene apoptosis modulada, resistencia al ataque biótico y/o ataque abiótico. El método comprende contactar una célula vegetal con un vector, que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que comprende al menos un gen estructural que codifica una proteína de trayectoria apoptótica; y seleccionar una planta que muestra resistencia al ataque bi?tico o abiótico y/o apoptosis modulada. Como se utiliza en la presente, el término "contactar" se refiere a cualquier significado de introducir vector(es9 en la célula vegetal, incluyendo medios químicos, físicos o mecánicos, como se describe arriba, preferentemente, el contacto se refiere a introducir el ácido nucleico o vector en células vegetales (incluyendo una explanta , un meristemo o una semilla), a través de Agrobacterium tumefaciens transformado con el ácido nucleico heterólogo como se describe arriba. Normalmente, una célula vegetal se regenera para obtener una planta completa del proceso de transformación. El producto inmediato de la transformación se refiere como un "transgenote". Los términos "crecimiento", "producción", o "regeneración" como se utilizan en la presente, se refieren al crecimiento de una planta completa de una célula vegetal, un gripo de células vegetales, una parte de la planta (incluyendo semillas) o un tejido vegetal (por ejemplo, de un protoplasto, callos o parte del tejido). La regeneración de protoplastos varía de especies a especies de plantas, pero generalmente una suspensión de protoplastos se hace primero. En ciertos aspectos, la formación de embrión puede inducirse entonces de la suspensión de protoplastos a la etapa de maduración y germinación como embriones naturales. El medio de cultivo generalmente contendrá varios aminoácidos y hormonas, necesarios para el crecimiento y regeneración. Ejemplos de hormonas utilizadas incluyen auxina y citoquininas. Algunas veces es ventajoso agregar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para tales especies como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, genotipo y la historia del cultivo. Si estas variables se controlan , la regeneración es reproducible. La regeneración también ocurre de callos vegetales, explantas, órganos o partes. La transformación puede llevarse a cabo en el contexto de regeneración de parte de la planta u órgano (ver Methods in Enzymology, Vol. 1 18 y Klee eí al., Ann. Rev. Plant. Phys 38:467 , 1987)-El uso del método de disco de la hoja-transformación-regeneración de Horsch eí al., Science 227: 1229, 1985, los discos se cultivan en medio selectivo, seguido por la formación de vastago en aproximadamente 2-4 semanas. Los vastagos que se desarrollan se extirpan de callos y se transplanta a medio selectivo inducido por raíz apropiado. El medio de selección apropiado se conoce en la materia y se describe por Curry y Casells en: Plant Cell Culture Protocols, pp. 31 -43, Humana Pres, Totowa, NJ, 1999; Blackwell eí al., IBIDI 19-30, 1999; Franklin and Dixon en: Plant Cell Culture, pp. 1 -25, IRL Press, Oxford, 1994. Las plantas de invernadero con raíz se transplantan al suelo tan pronto como sea posible después de que aparecen las raíces. Las plantas de invernadero pueden replantarse como se requiera, hasta alcanzar la madurez. En cultivos vegetativamente preparados, las plantas transgénicas maduras se propagan por la toma de cortes o por técnicas de cultivo de tejido para producir múltiples plantas idénticas. La selección de transgenotes deseables se hace y nuevas variedades se obtienen y propagan vegetativamente para uso comercial. En cultivos propagados de semilla , las plantas transgénicas maduras pueden auto-cruzarse para producir una planta innata homocigótica. La planta innata produce semilla que contiene la(s) secuencia(s) de ácido nucleico heteróloga(s). Estas semillas pueden desarrollarse para producir plantas que podrían producir el fenotipo seleccionado, por ejemplo, resistencia al patógeno. Las partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, frutas y lo similar se incluyen en la invención, siempre que estas partes comprenden las células que se han transformado como se describe. La progenie y variantes, y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la presente invención siempre que estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico heterólogo. Se contempla en ciertas modalidades que una célula vegetal se transformará con una molécula de ADN recombinante que contiene al menos dos secuencias de ADN o transformarse con más de una molécula de ADN recombinante. Las secuencias de ADN o moléculas de ADN recombinante en tales modalidades pueden enlazarse físicamente, al encontrarse en el mismo vector, o separarse físicamente en diferentes vectores. Una célula puede transformarse simultáneamente con más de un vector siempre que cada vector tenga un vector que permite secuencialmente una etapa de regeneración intermedia después de la transformación con el primer vector. Además, es posible ejecutar una cruza sexual entre plantas individuales o líneas vegetales que contienen secuencias de ADN diferentes o moléculas de ADN recombinante preferentemente las secuencias de ADN o las moléculas recombinantes se enlazan o ubican en el mismo cromosoma, y después seleccionar de la progenie de la cruza, las plantas que contienen tanto secuencias de ADN como moléculas de ADN recombinante. La expresión de moléculas de ADN recombinante que contienen las secuencias de ADN y promotores descritos en la presente en células vegetales transformadas puede monitorearse utilizando técnicas de Northern Blot. Las técnicas de Southern blot y/o expresión del marcador, así como también otras técnicas conocidas por aquellos de experiencia en la materia.

C. GENERACIÓN DE PLANTAS Y PORCIONES DE PLANTAS CON CARACTERÍSTICAS DESEABLES La presente invención se dirige al descubrimiento sorprendente de que las proteínas de trayectoria apoptótica heteróloga funcionan en plantas. De acuerdo con lo anterior, tal descubrimiento ofrece una variedad de ventajas, que incluye resistencia incrementada de las plantas y porciones de las plantas (por ejemplo, flores cortadas, vegetales, etc). a ataques bióticos o abióticos así como también inhibición de senescencia. Además, la presente invención proporciona métodos para identificar homólogos de proteína apoptótica de planta funcional y métodos para identificar inhibidores e intensificadores de proteínas de trayectoria apoptótica dentro del contexto de una célula vegetal. 1 . Resistencia al ataque biótico/agente Los ataques bióticos son ataques incurridos por una planta como el resultado directo o indirecto de un cambio por un agente biótico.

Los agentes bióticos incluyen, por ejemplo, insectos, hongos, bacterias, virus, nematofdos, viroides, micloplasmas, etc. Los agentes bióticos típicamente inducen la muerte celular programada en células vegetales afectadas. Tal muerte celular programada se piensa que ocurre con objeto de inhibir la difusión de un patógeno invasor. Sin embargo, en una modalidad de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico capaces de codificar las proteinas incluidas en subregular ia apoptosis en otros organismos se suministran a las células vegetales y las plantas que se desarrollan a partir de las mismas tienen una resistencia demostrada a una variedad de agentes bióticos.

En ciertas modalidades, las plantas resistentes al ataque biótico ofrecen ventajas significativas relacionadas a la producción del cultivo y salud continuada de ornamentales. Los agentes bióticos guía incluyen varios patógenos tales como hongos y virus. Un patógeno ejemplificativo, es el patógeno fúngico Sclerotinia sclerotiorum, que es uno de los patógenos de planta omnivoroso y más no específico conocido, (ver, por ejemplo, Pudrí, Phytopathology 69.875-880, 1979). Además, una variedad de otros patógenos económicamente importantes se conoce incluyendo los hongos Botrytis cinérea, Magnaportyhe grisea, Phytophthora spp, Cochliobolus spp, Fusarium graminearum, y Frusarium spp, los nematodos Meloidogyne spp (nematodos de nudo de raíz), virus tales como virus de mosaico de tabaco (TMV) y virus de peste negra del tomate (TSWV), virus de grabado de tabaco (TEV), virus de necrosis de tabaco (TNV), virus de mosaico de impacto de trigo (WSMV), virus de mosaico de trigo transmitido por el suelo (SBWMV), virus de enanismo amarillo de cebada (BYDV), la bacteria Pseudomonas spp y Xanthomonas ssp, así como también muchos otros. Un número de ejemplos se encuentran disponibles y pueden identificarse fácilmente por aquellos de experiencia ordinaria en la materia, ver, por ejemplo, Plant Pathology, 4th ed, Agrios, ed. , Academic Press, San Diego, 1997. En una modalidad , la presente invención proporciona plantas transgénicas resistentes al ataque biótico. En esta modalidad, las secuencias de ácido nucleico heterólogo que codifican proteínas de trayectoria apoptótica se transfieren en plantas por los métodos elucidados arriba. en ciertas modalidades, la proteína de trayectoria apoptótica codificada es una proteína anti-apoptótica, es decir, la proteína regula negativamente ya sea directa o indirectamente, la entrada de la célula en o la progresión del ciclo de muerte celular programada. Los inhibidores preferidos incluyen, pero no se limitan a reguladores negativos dominantes, tale como moléculas de caspasa mutada de cisteína de sitio activo tales como, . IAP, Bcl-2, Bcl-xL. Bcl-W, McL-1 , A1 , NR-1 3, Ced-9, E1 B 19K. BHRF1 , Bag-1 y lo similar. De acuerdo con lo anterior, los inhibidores ejemplificados en la presente incluyen Bcl-2 y Ced-9. Estos inhibidores apoptóticos confieren resistencia al ataque biótico en las plantas en las cuales se transfieren. La resistencia al ataque biótico ejemplificativo es resistencia al patógeno que incluye resistencia a varios virus y hongos tales como virus de mosaico de tabaco (TMV), virus de necrosis de tabaco (TNV), virus de grabado de tabaco (TEV), virus de peste negra del tomate (TSWV), Slcerotinia sclerotiourum 1980 (Dickman and Mitra, Physiol, Mol, . Plant. Pathol 47 :255-263, 1992); Botrytis cinérea (ATCC), Cercospora nicotianae y Glomerella cingulata. Debe observarse, sin embargo, que la invención no se limita a la resistencia a estos patógenos ejemplificativos. De acuerdo con lo anterior, en ciertos aspectos la expresión y aplicación de insecticidas y tratamiento con herbicidas puede inducir un estado de enfermedad en una planta que conduce a un evento apoptótico, de esta manera la expresión de un polipéptido anti-apoptótico puede incrementar la habilidad de una planta particular para expresar un compuesto insecticida y/o incrementar la resistencia de la planta particular al tratamiento sin varios herbicidas, resistiendo así un ataque abiótico. 2. Resistencia al ataque abiótico/agente Como se indica arriba, la presente invención, también proporciona resistencia incrementada a ataques abióticos. Los agentes abióticos que causan ataques abióticos incluyen, por ejemplo, factores ambientales tales como baja humedad (sequía), humedad elevada (inundación), deficiencia nutriente, niveles de radiación, contaminación del aire (ozono, lluvia acida, dióxido de azufre, etc), temperatura (extremos calientes y fríos), y toxicidad del suelo, así como también daño herbicida, daño pesticida, u otras prácticas agrícolas (por ejemplo, sobre-fertilización, uso inapropiado de rociadores químicos, etc.). De acuerdo con lo anterior, dado que tales agentes abióticos juegan un papel cada vez más creciente en la viabilidad de una variedad de tipos de plantas incluyendo, cultivos alimenticios y ornamentales, la presente invención puede utilizarse para producir plantas con- resistencia incrementada a estos ataques. En una modalidad, como se observa con respecto a los ataques bióticos, la presente invención proporciona plantas transgénicas resistentes al ataque abiótico. En esta modalidad, las secuencias de ácido nucleico heterólogo que codifican proteínas de trayectoria apoptótica se transfieren en las plantas por los métodos detallados en la presente. Como con resistencia al ataque biótico, estos inhibidores apoptóticos confieren resistencia al ataque abiótico en las plantas en las cuales se transfieren. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que dada la descripción proporcionada en la presente, la resistencia a un ataque biótico o abiótico/agente particular puede probarse fácilmente utilizando la planta completa o secciones de la hoja como apropiadas para el método de acción del agente particular. 3. Senescencia La senescencia en plantas se conocen por ser un proceso regulado que resulta por último en muerte celular (ver generalmente, Guiamet eí al., Plant Cell Phys 37 : 1 123-1 130, 1990 para una descripción detallada en la misma). Además, se acompaña por muchos de los cambios estructurales y bioquímicos tal como inducción de proteasas de cisteína, Rnasas, etc. que son consistentes con la muerte celular programada. De acuerdo con lo anterior, al utilizar la transferencia de moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína de trayectoria apoptótica heteróloga, la presente invención proporciona métodos para modular la senescencia en plantas. Aunque tiene la aplicación general para incrementar la longevidad de la planta, pueden realizarse otras ventajas. Por ejemplo, la inhibición de la senescencia puede conducir a tiempos de durabilidad más largos para vegetales y frutas, así como también conducir a incrementar la longevidad y apariencia estética de flores cortadas y otras ornamentales. Además, en la planta viviente la duración de floración creciente y producción de fruta puede lograrse. De acuerdo con lo anterior, la presente invención tiene amplia utilidad tanto en el mercado de productos alimenticios así como también en el mercado ornamental. Además, los métodos de la presente invención pueden utilizarse para identificar los modulares de la muerte celular programada de planta endógena que a su vez pueden sobre-expresarse selectivamente en la célula vegetal apropiada para lograr la senescencia reducida. D. MÉTODOS QUE UTILIZAN TRANSFERENCIA DE TRANS-ESPECIES DE GENES DE TRAYECTORIA APOPTÓTICA 1 . Inhibidores e intensificadores de actividad apoptótica La investigación de inhibidores e intensificadores de apoptosis de planta puede proporcionar datos útiles en el contexto de diseñar plantas transgénicas así como también herbicidas y pesticidas. Además, con el descubrimiento inesperado y sorprendente de que los genes que codifican las proteínas de trayectoria apoptótica de especies altamente diversas funcionan de manera similar en plantas, las células vegetales pueden utilizarse en análisis para probar la funcionalidad de genes de que codifican la proteína de trayectoria apoptótica preferida. Por ejemplo, los genes de trayectoria apoptótica mamíferos tales como caspazas y miembros de la familia Bcl-2 pueden transferirse en células vegetales e inhibición o aumento de apoptosis estudiada por una variedad de métodos tales como análisis de extractos de ácido nucleico para la identificación de marcadores apoptóticos tales como escalas de ADN, análisis de coloración TÚNEL, y/o microscopia de la célula para identificar condensación nuclear apoptótica. Los intensificadores e inhibidores candidatos pueden aislarse o procurarse de una variedad de fuentes, tales como humano, roedor, mosca (D. melanogaster), gusano (C. elegans), virus (por ejemplo, vaculovirs, virus de herpes), bacterias, hongos, plantas, parásitos, bibliotecas de químicos, péptidos o derivados de péptidos y lo similar. Los inhibidores e iptensificadores también pueden diseñarse racionalmente, en base a la estructura de proteína determinada de cristalografía de rayos X (ver, Míttl eí al., J. Biol. Chem. 272:6539-6547, 1997). En ciertas modalidades preferidas, el inhibidor dirige una proteina de trayectoria apoptótica específica (por ejemplo, bcl-2 o un homólogo de la misma). Sin sostenerse a ningún mecanismo particular, el inhibidor puede actuar al prevenir el procesamiento de un cimógeno de trayectoria apoptótica (por ejemplo, una caspasa), al prevenir la actividad enzimática, al prevenir la interacción de los componentes de trayectoria (ya sea directa o indirectamente) o por otro mecanismo. El inhibidor, por sí mismo, puede actuar directa o indirectamente. En modalidades preferidas, los inhibidores de apoptosis en plantas reducen la muerte celular programada a medida que se mide por las escalas de ADN, de marcado final de mella dUTP mediada por deoxitransferasa terminal (TÚNEL) (equipos comerciales disponibles), el nivel de nucleasas dependientes de Ca2+ (Mittier eí al., Plant Cell 7: 1951 -1962, 1995), uso de tintes vitales tal como azul Trypan, o métodos similares. En otras modalidades preferidas, los inhibidores son moléculas pequeñas. En una modalidad más preferida, los inhibidores previenen la apoptosis. Los inhibidores que pueden penetrar las células se prefieren . Además, los intensificadores de actividad apoptótica o expresión de proteína de trayectoria apoptótica son deseables en ciertas circunstancias. En tiempos, la apoptosis creciente mitigará el daño por patógeno, especialmente con respecto a patógenos que requieren una célula viviente para funcionar (por ejemplo, patógenos virales o fúngicos). De acuerdo con lo anterior, ia expresión inducible por patógeno de tales intensificadores puede ser benéfica. Los intensificadores pueden incrementar la velocidad o eficacia de progresión apoptótica como se demuestra por los niveles incrementados de escala de ADN, células positivas TÚNEL, supra-regulación de nucleasas dependientes de Ca2+ (Mittier eí al. , Plant Cell 7: 1 951 -1962, 1 995), procesamiento de cimógeno (caspasa u homólogo de la misma), incremento de transcripción o traslación, o actuar a través de otros mecanismos. Como es aparente para un experto en la materia, muchas de las líneas guía presentadas arriba se aplican también al diseño de intensificadores. Los análisis de selección para inhibidores e intensificadores variarán de acuerdo con el tipo de inhibidor o intensificador y la naturaleza de la actividad que se efectúa . Los análisis pueden llevarse a cabo in vitro o in vivo. En general, los análisis in vitro se diseñan para evaluar los eventos fenotípicos apoptóticos, escala de ADN, coloración TÚNEL, niveles de nucleasa dependientes de Ca2+ (Mittier eí al., Plant Cell 7: 1951 -1 962, 1 995), procesamiento de proteína o actividad enzimática, y los análisis in vivo se diseñan para evaluar tales pensamientos como reactividad a cambios bióticos y abióticos. En cualquiera de los análisis, una reducción o incremento estadísticamente significativo en comparación con un control apropiado es indicativo de resistencia, aumento o inhibición. 2. Identificación de proteínas apoptóticas de planta y genes asociados Un análisis in vitro para investigar las proteínas de trayectoria apoptótica en plantas puede llevarse a cabo al examinar el enlace de proteinas de la célula vegetal a proteínas mamíferas (u otras proteínas de trayectoria apoptótica conocidas). Brevemente, una biblioteca de expresión de cADN de planta puede seleccionarse para la habilidad del producto expresado para unir varios componentes de trayectoria apoptótica mamíferos. De manera similar, los extractos de planta pueden seleccionarse. Por ejemplo, la proteína Apaf-1 puede inmovilizarse en una superficie sólida, tal como una columna y contactarse con los productos de expresión de la biblioteca de cADN de planta. Las proteínas que se unen al Apf-1 de mamífero y que se eluyen subsecuentemente por un gradiente pH, gradiente de sal, o lo similar pueden indicar un homólogo de caspasa-9 de planta. De acuerdo con lo anterior, cualquier proteína de trayectoria apoptótica podría inmovilizarse en una manera similar y utilizarse como prueba de una biblioteca de expresión de cADN de planta. Como alguien de experiencia ordinaria en la materia apreciará, el descubrimiento sorprendente de que las proteínas apoptóticas de diversas especies pueden retener la actividad funcional en plantas, indica que cualquiera de los métodos conocidos para probar las interacciones de proteína-proteína pueden ser útiles en identificar homólogos de la proteína de planta para otras proteínas apoptóticas conocidas. Un experto en ia materia reconocerá que una variedad de métodos de marcación y detección puede utilizarse. Tales métodos incluyen análisis inmunosorbantes enlazados de enzima, ultrecentrífuga analítica y uso del BiaCore™ (BiaCore, Uppsula, Suecia). De acuerdo con lo anterior, en un método para identificar proteinas de trayectoria apoptótica de planta, una proteína de fusión se construye comprendiendo una proteína de trayectoria apoptótica heteróloga conocida o fragmento de la misma y una secuencia de péptido de etiqueta (por ejemplo, glutationa-S-trasferasa) que se une por un anticuerpo u otra molécula (por ejemplo, glutationa). Un vector que codifica la proteína de fusión se transforma en bacteria. La proteína de fusión se purifica. En resume, una proteína de fusión Bcl-2 GST (glutationa-S-transferasa) en pGEX-4T-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), se induce por IPTG y se purifica utilizando perlas de glutadiona (ver, Kaelin eí al., Cell 64:521 , 1991 ). Las células que contienen las construcciones de biblioteca de expresión derivadas de plantas pueden marcarse metabólicamente. Los extractos de las células se incuban con perlas de glutationa-Sefarosa cargadas GST-Bcl-2. Alternativamente, la proteína de fusión puede inmunopreciarse o lo similar. La proteína sin unir aleja, y la proteína unida se eluye. Las proteínas unidas pueden fraccionarse además por electroforesis de gel, por ejemplo. Las proteínas unidas pueden entonces utilizares para enjuagar anticuerpos, análisis de secuencia de aminoácidos, y otras pruebas in vitro. Los clones que codifican las proteinas unidas pueden aislarse por cualquiera de una variedad de métodos estándar, incluyendo inmunoselección de una biblioteca de expresión, hibridización de prueba en donde la prueba se basa en una secuencia de aminoácido parcial, y otros métodos conocidos. Una vez que se detecta una interacción de proteína-proteína entre la biblioteca de expresión de planta o extracto de planta y un componente de la trayectoria apoptótica conocida, la proteína de la biblioteca de expresión de planta puede identificarse mediante secuencia y el cADN apropiado, identificado. En una modalidad, los métodos para detectar proteínas de trayectoria apoptótica de planta se proporcionan, que comprenden transferir o transformar células con una biblioteca de cADN de expresión derivada de planta; y detectar interacciones entre las proteínas expresadas de la célula y las proteínas de trayectoria apoptótica heteróloga. En otra modalidad, los métodos para detectar proteínas de trayectoria apoptótica de planta putativa se proporcionan, que comprenden contactar los extractos de planta o proteínas de planta derivadas de una biblioteca de expresión con una proteina de trayectoria apoptótica heteróloga conocida y las proteínas derivadas de la planta. En varios métodos alternativos, los genes de las plantas o animales pueden probarse para equivalencia funcional o seleccionarse para actividad apoptótica al expresar el gen derivado de la planta en una célula animal y el gen derivado de animal en la célula vegetal. Por ejemplo, una biblioteca de cADN de una fuente de célula o tejido se construye en un vector de manera que una proteína de fusión se genera con una proteína reportadora o etiqueta de péptido. La etiqueta o reportadora puede ser cualquier proteína que permite la medición sensible y conveniente. Por ejemplo, ß-galactosidasa y péptido FLAG pueden utilizarse. Además, las etiquetas múltiples pueden utilizarse para permitir la detección de un análisis de sandwich . En general, el vector utilizara un promotor fuerte para conducir la expresión de los genes de fusión de cADN y un origen apropiado de replicación para la célula huésped. La biblioteca de genes vegetales se transforma entonces o transfecta en células huésped animales. Alternativamente, los genes animales pueden probarse para equivalencia apoptótica funcional al transformar una variedad de células huésped vegetales (por ejemplo, tabaco-(BY-2) Nagata eí al., Int. Rev. Cytol 732:30, 1992, maíz (Hi-ll), The Maize Handbook, pp. 663-671 , Freeling eí al., eds Springer NY, 1 994; Arabidopsis (lansberg erecta) Fuerst et al., Plant Physiol 7 72.1023-1028, 1996) por cualquiera de los métodos descritos en la presente u otros métodos conocidos. Alternativamente, las proteínas de trayectoria apoptótica de planta adicionales pueden identificarse por otros métodos, tales como sistema de dos híbridos de levadura. Brevemente, en un sistema de dos híbridos, una fusión de una proteína de trayectoria apoptótica de dominio de enlace de ADN (por ejemplo, fusión GAL4-Bcl-2) se construye y transforma o transfecta en una célula que contiene un sitio de enlace GAL4 enlazado a un gen marcador seleccionable. Una biblioteca de cADNs derivados de tejidos y células vegetales se fusiona al GAL4, el dominio de activación también se construye y co-transforma o co-transfecta. Cuando el cADN en la fusión del cADN-dominio de activación GAL4 codifica una proteína que interactúa con Bcl-2, el marcador seleccionable se expresa. Las células que contiene el cADN se desarrollan entonces, la construcción se aisla y caracteriza. Los análisis adicionales pueden conducirse para determinar si una proteina codifica por. un polinucleótido es funcionalmente equivalente a una proteína de trayectoria de apoptosis conocida codificada por otro polinucleótido, o además, para determinar si un gen vegetal o cADN tiene actividad pro- o anti-apoptótica. En una modalidad tales análisis se llevan a cabo al expresar el gen de interés heterólogamente en cualquiera de varios sistemas, incluyendo por ejemplo, sistemas mamíferos, incluyendo, humano, células o líneas celulares en cultivo de tejido, un sistema nematodo C. elegans en donde los nematodos tienen mutaciones en los genes ced 9, ced 4 o ced 3 que funcionan en la muerte celular programada (De acuerdo con lo anterior, puede buscar restauración funcional), y la mosca de fruta, D. melanogaster, en particular bajo control de un promotor específico del ojo en una cepa de moscas genéticamente diseñada para tener ojos pequeños debido a la apoptosis excesiva en la retina de la mosca debido a la sobre-expresión heteróloga o eliminación de genes que controlan la apoptosis en el ojo de la mosca. Cuando se utilizan sistemas de análisis de mamíferos, la expresión es por la transfección del gen o cADN bajo control de un promotor (por ejemplo, CMV). Las células que expresan el(los) genes se observan para evidencia de inducción espontánea de apoptosis o se someten a estímulos que inducen la apoptosis y se mide el efecto de la expresión del(los) gen(es) en ya sea las cinéticas o el grado de apoptosis. Los estímulos que inducen apóptosis se conocen por aquellos expertos en la materia e incluyen, extracción del factor de crecimiento, radiación de ionización, estimulación con ligantes que unen receptores muertos de la familia del receptor TNF (por ejemplo, Fas, TNFa, TRAIL) y expresión heteróloga de genes pro-apoptóticos (por ejemplo, Bax, Bad). La apoptosis en las células transfectadas en respuesta a estímulos apoptóticos se mide utilizando un número de análisis, todos conocidos por aquellos expertos en la materia, incluyendo inducción de actividad enzimática de caspasa (medida al determinar la habilidad de un extracto detergente de las células para separar el substrato de caspasa Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aminometilcumarina). La degradación de ADN (como se determina por electroforesis de gel de agarosa), condensación nuclear (como se determina por Hoechst o coloración DAPI9, liberación de citocromo c de mitocondria a citoplasma (medida, por ejemplo, ya sea por estudios de fracción celular o por ubicación de inmunocitoquímica con un anticuerpo monoclonal de citocroma c), y función mitocondroal (media por la reducción de las sales de tetrazoleo, MTT o MTS). De acuerdo con lo anterior, un gen de interés se determinar que es funcionalmente equivalente a un gen conocido (por ejemplo, Bcl-2, Bax) si sus efectos en apoptosis (incremento reducción de ya sea las cinéticas o grado del fenotipo apoptótico o apoptosis inducida por su cuenta) son cualitativa y/o cuantitativamente similares; y en el caso de un gen vegetal, es un gene pro- o anti-apoptosis si la expresión de este gen influencia las cinéticas o grado de fenotipo de apoptosis o induce apoptosis por su cuenta. Con respecto a los sistemas de C. elegans, a expresión del gen en un pérdida de ced 9 de función del gusano mutante, en el cual muchas o la mayoría de las células de gusano experimentan muerte celular programada, rescataría alguna o todas de las células si el gen codificó una proteina anti-apoptótica (por ejemplo, ced 9 rescata en un perdida de ced 9 de función de gusano). La expresión del gen en una perdida de ced 3 o ced 4 de función de la cepa de gusano mutante en la cual 128 células programadas para experimente apoptosis en el desarrollo de hermafrodita se evita, restauraría las muertes celulares faltantes si el gen fue anti- apoptótico. Además con respecto a sistemas de D. melanogaster, el gen se consideraría que codifica una proteína anti-apoptótica si restaura los ojos de la mosca a un tamaño normal y se consideraría pro-apoptótico si la expresión da como resultado una reducción adicional en el tamaño del ojo de la mosca. Los análisis in vivo se llevan a cabo típicamente en células transformadas o transfectadas ya sea transitoria o establemente con un vector de expresión que contienen un gen que codifica una proteína de trayectoria apoptótica, tal como aquellas descritas en la presente. En el contexto una célula vegetal los análisis in vivo típicamente incluirán el cambio de las células, planta o porción de la planta con un agente biótico o abiótico y la morfología del sitio de inoculación observado para señales de apoptosis. Estos sitios de inoculación pueden caracterizarse además por el análisis subsecuente para fragmentación de AD y el cambio del número de células positivas TÚNEL en comparación con las muestras de control. Además, dentro del contexto de célula animal tales células pueden utilizarse para medir el procesamiento de caspasa, cambio de substrato, o apoptosis en la presencia o ausencia de un compuesto candidato. Cuando se analiza la apoptosis, una variedad de análisis celulares puede utilizarse incluyendo, por ejemplo, coloración por tinte y microscopia para examinar la fragmentación de ácido nucleico y porosidad de las células. Además, el análisis in vivo de la habilidad de la proteína de trayectoria apoptótica transfectada o transformada o proteína así activada para separar substratos conocidos que se co-transfectan, co- transforman o colocan en el medio de cultivo celular en la presencia del compuesto candidato puede llevarse a cabo permitiendo así la detección y determinación de cambio de substrato. Las metodologías de detección de enzimas de trayectoria apoptótica son aquellas comúnmente utilizadas para analizar ias reacciones enzimáticas e incluyen, por ejemplo, SDS-PAGE, espectoscopia, análisis HPLC, autoradiografía, quemiluminiscencia, reacciones cromogénicas, e inmunoquímica (por ejemplo, manchado, precipitado, etc). además, una variedad de métodos de detección para observar la muerte celular programada (es decir, apoptosis) en plantas se encuentran disponibles. Ver por ejemplo, Mittier eí al., Plant Cell 7:29-42, 1995; Mittier eí al., Plant Mol. Biol. 34:209-221 , 1997; equipos TÚNEL de Oncor and Boehringer-Mannheim. Cuando el análisis de actividad de caspasa se desea, por ejemplo, cuando los genes de trayectoria apoptótica de planta putativa se expresan en una célula animal o en donde de otra manera sea necesario, los substratos cromogénicos se utilizan preferentemente. El cambio de estos substratos mide, directa o indirectamente, la trayectoria apoptótica y, en particular, la actividad enzimática de una o más moléculas de caspasa. En este aspecto una variedad de substratos tales como moléculas de caspazas marcadas, lamina, PARP y análogos de substrato de caspasa se conocen por aquellos de experiencia en la materia. Tales substratos también se encuentran disponibles comercialmente de tales compañías como Oncogen Research Products, Cambridge, MA. Los análogos de substrato ilustrativos que se marcan con marcadores fluorescentes incluyen, ZEVD-amc (carbobenzoxi-Glu-Val-Asp-aminometilcumarin), YVAD-amc (Acetil-Tyr-Val-Ala-Asp-aminometilcumarin) y DEVD-amc (Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aminometilcumarin). Además, en otras modalidades de análisis, los promotores eucarióticos pueden utilizarse dentro de una construcción para suministra ya sea proteínas pro o oanti-apoptóticas inducibles o constitutivamente expresadas a células para su análisis. Por ejemplo, las células pueden transformarse o transfectarse de manera que sobre-expresan el polipéptido anti-apoptótico Bcl-2, proporcionando así células en donde las preparaciones de membrana tendrían un nivel más elevado de Bcl-2, de manera que solamente los intensificadores de apoptosis que fueron capaces de superar la inhibición de Bcl-2 se detectarían. De acuerdo con lo anterior, la célula podría transformarse con un segundo vector que contienen un cADN inducible de una biblioteca de expresión de planta. En este aspecto, tales células podrían tratarse con un estímulo de apoptosis de manera que la célula se "equilibra" para apoptosis antes de la inducción de la transcripción de cADN. Los métodos descritos arriba para la identificación de inhibidores e intensificadores para apoptosis proporcionan un formato alternativo para medir la actividad apoptótica, en que una célula se trata de manera que se "equilibra" para muerte celular programada. De esta manera, la célula ha sintetizado y/o activado todos los componentes necesarios que se requieren para la muerte celular programada. Todo lo que se requiere es un estimulo para causar que la célula se extienda más allá de su punto de sujeción y en apoptosis. De acuerdo con lo anterior, un intensificador causaría que la célula progrese en muerte celular programada, mientras que un inhibidor retrasaría o suprimiría este progreso en la presencia de un estimulo apoptótico (por ejemplo, anticuerpos anti-fas, estauroesporina y lo similar). El punto de sujeción que evita que la célula proceda en muerte celular programada puede ser la sobreexpresión de una proteína de trayectoria apoptótica que es un polipéptido de supervivencia celular (anti-apoptótico) o tratamiento de las células con inhibidores apoptóticos conocidos. Los polipéptidos anti-apoptótico se caracterizan en que muestran la habilidad para prevenir la apoptosis cuando se expresa o activa en una célula inducida para experimentar la apoptosis. Por ejemplo, en ia ausencia de un polipéptido anti-apoptótico de funcionamiento, una célula tratada con un intensificadora apoptótico (por ejemplo, un agente pro-apoptótico) iniciará o acelerará la apoptosis. Sin embargo, en la presencia de un polipéptido apoptótico, el tratamiento con un agente/intensificador apoptótico puede iniciar la trayectoria de muerte celular programada. Dependiendo del punto al cual funciona el polipéptido anti-apoptótico, la trayectoria de muerte celular programada puede inhibirse temprana o relativamente tarde dentro de la ejecución de la cascada de eventos que conducen a la muerte celular final. Los polipéptidos anti-apoptóticos y sus ácidos nucleicos de codificación se conocen bien en la materia e incluyen, por ejemplo, la familia Bcl-2 de proteínas relacionadas Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 , E 1 B 19K, IAP, Ced-9, Bcl-w, etc, asi como las formas negativas dominantes de las caspazas. Estas formas incluyen, por ejemplo, caspazas con una mutación de inactivación de la cisteína de sitio activo. La sobre-expresión de un polipéptido anti-apoptótico puede lograrse utilizando, por ejemplo, métodos recombinantes conocidos por aquellos expertos en la materia. Los procedimientos de rutina para llevar a cabo tales métodos de expresión recombinante se describen en, por ejemplo, Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1992), Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, Nueva York (1995). Tales métodos pueden utilizarse para expresar estable o transitoriamente un polipéptido anti-apoptótico en un nivel que es suficiente para prevenir la inducción de apoptosis. La molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido anti-apoptótico puede codificarse por, por ejemplo, un ácido nucleico homólogo derivado de las mismas especies o tipo celular, o alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede codificarse por un ácido nucleico heterólogo de una especie diferente o tipo celular. La fuente del ácido nucleico de codificación no es importante ya que el polipéptido anti-apoptótico codificado muestra la actividad de inhibición de apoptosis. Un nivel de expresión de un polipéptido anti-apoptótico que es suficiente para prevenir la inducción de apoptosis se conoce por aquellos expertos en la materia y también puede determinarse de manera rutinaria por aquellos expertos en la materia. Los vectores de expresión y sistemas se conocen y encuentran comercialmente disponibles los que proporcionar expresión de polipéptido recombinante. Es una materia de rutina para un experto en la materia elegir un vector o sistema que proporcionará niveles suficientes de expresión en una célula huésped particular.

Alternativamente, el nivel de expresión suficiente para prevenir la inducción de apoptosis puede determinarse rutinariamente al expresar el polipéptido anti-apoptótico y después medir si la célula sobrevive después del tratamiento con un agente pro-apoptótico; o inducción de molécula de cADN derivada de la planta. En adición a los métodos recombinantes de sobre-expresión de un polipéptido anti-apoptótico, una célula puede utilizarse, la cual sobre-expresa inherentemente un polipéptido anti-apoptótico. Un ejemplo específico de una célula que sobre-expresa inherentemente un polipéptido anti-apoptótico es el linfoma celular B en el cual Bcl-2 se identificó inicialmente. Esta leucemia tiene una transubicación de cromosa 14 a 1 8 casando un alto nivel de expresión de Bcl-2 y por lo tanto supervivencia celular. De acuerdo con lo anterior, el fenotipo de leucemia se debe a la supervivencia celular incrementada. Otras líneas celulares que sobre-expresan inherentemente un polipéptido anti-apoptótico pueden utilizarse similarmente en los métodos de la invención. El bloque de apoptosis debido a la sobre-expresión de un polipéptido anti-apoptótico y el tratamiento de las células con un agente pro-apoptótico proporciona influencias antagonísticas a la célula. De esta manera, las células se equilibran esencialmente para muerte celular programada. Un agente pro-apoptótico puede ser una variedad de diferentes ataques a la célula incluyendo, estímulos moleculares, ambientales y físicos. Como se define previamente, tales estímulos se conocen por aquellos expertos en ia materia y pueden caracterizase al activar una molécula dentro de la trayectoria apoptótica. Ejemplos de agentes pro-apoptóticos incluyen inductores tales como depravación de un factor de crecimiento, ligante Fas, anticuerpo anti-Fas, estaurosporina, Factor de Necrosis de Tumor, irradiación gama y ultravioleta. De esta manera, el tratamiento de una célula que sobre-expresa un polipéptido anti-apoptótico con un agente pro-apoptótico preparará la célula para apoptosis ya que tanto las señales positivas como negativas proporcionas efectos de equilibrio. Una ventaja de esta preparación es que todos los componentes de la muerte celular se encuentran disponibles para apoptosis una vez que se recibe un señal que supera el bloque del polipéptido anti-apoptótico. Esto permite la inducción rápida de apoptósis que puede utilizarse para seleccionar compuestos que poseen actividad que inducen apoptosis en la presencia de Bcl-2 o Bcl-XL, o moléculas relacionadas. Tales células son particularmente útiles en seleccionar bibliotecas de expresión de cADN derivadas de planta para polipéptidos anti-apoptóticos. De manera similar, los polipéptidos anti-apoptóticos pueden expresarse bajo la dirección de un promotor inducible. De acuerdo con lo anterior, estas células pueden contener construcciones de expresión de cADN derivadas de planta bajo expresión constitutiva. De esta manera, si la inducción no conduce a la muerte celular, un regulador de muerte celular derivada del cADN expresado se presenta putativamente. Una proteína anti-apoptótica derivada de una biblioteca de expresión de cADN derivada de planta también puede identificarse por un método que comprende transformar las células huésped tales como células mamiferas con una biblioteca de expresión de cADN, que contacta las células con un inductor apoptótico tal como estauroesporina, irradiación gama, anti-Fas, o un ligante Fas, o lo similar y detectar células que no introducen apoptosis, identificando así una célula y una construcción de cADN que expresa una proteína anti-apoptótica. La construcción de expresión puede entonces secuenciarse y la secuencia elucidarse. 3. Alto Rendimiento Los métodos descritos en la presente también están dispuestos a formatos de alto rendimiento (por ejemplo, un análisis de formato multi-cavidad en donde grandes números de muestras pueden seleccionarse rápida y eficazmente). Por ejemplo, un formato de 96 cavidades proporciona ventajas prácticas ya que las placas apropiadas para manipulaciones y dispositivos de medición se encuentran comercialmente disponibles. Tales procedimientos pueden automatizarse además para incrementar más la velocidad y eficacia del método. Estas características, combinadas con la especificidad del método, permiten la selección de alto rendimiento libre de célula de intensificadores o inhibidores candidatos de actividad apoptótica. E. APLICACIONES FARMACÉUTICAS Los intensificadores e inhibidores de muerte celular programada pueden utilizarse en el contexto de esta invención para ejercer control sobre el proceso de muerte celular. De esta manera, estos intensificadores e inhibidores tendrán utilidad en enfermedades caracterizadas por ya sea niveles excesivos o insuficientes de apoptosis y protección de plantas de ataques bióticos y abióticos. De acuerdo con lo anterior, los inhibidores de apoptosis en plantas pueden tener valor terapéutico humano potencial para tratar las principales enfermedades neurodegenerativas: ataque, Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Alzheimer y ALS. También, los inhibidores pueden utilizarse para inhibir apoptosis en le corazón después de infección miocardial, en el riñon después de isquemia aguda, y en las enfermedades del hígado. Las composiciones farmacéuticas también se proporcionan por la presente invención. Estas composiciones pueden contener cualquiera de los intensificadores, inhibidores, moléculas de ADN, vectores o células huésped anteriores, junto con un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, excipiente o diluyentes. Generalmente, tales vehículos serían no tóxicos a los recipientes en las dosis y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de tales composiciones incluye combinar el agente terapéutico con reguladores, antioxidantes tal como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 1 0 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos que incluyen glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes de quelación tales como EDTA, glutationa y otros estabilizantes y excipientes. La salina regulada netural o salina mezclada con albúmina de suero especíico son diiuyentes apropiados ejemplificativos. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse por la administración por una variedad de diferentes vías, incluyendo por ejemplo intraarticularmente, intracranialmente, intradérmicamente, intrahepatícamente, intramuscularmente, intraocularmente, intraperitonealmente, intratecalmente, intravenosamente, subcutáneamente y aún directamente en un tumor. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden colocarse dentro de contenedores, junto con material de empaque que proporciona instrucciones que consideran el uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración del reactivo, así como también dentro de ciertas modalidades, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, salina o PBS) que puede ser necesario para reconstituir la composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas son útiles tanto para propósitos de diagnóstico como terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrase en una manera apropiada a la enfermedad a tratarse (o prevenirse). La cantidad y frecuencia de administración se determinará por tales factores como la condición de un paciente, y el tipo y severidad de la enfermedad del paciente. Las dosis pueden determinarse más exactamente durante las pruebas clínicas. Los pacientes pueden monitorearse para eficacia terapéutica por tecnología apropiada, incluyendo señales de exacerbación clínica, formación de imágenes y lo similar. En otras modalidades, las proteínas de trayectoria apoptótica derivada de planta pueden suministrarse a las células como parte de vehículos de suministro de gen. En muchas enfermedades y síndromes, muy poca apoptosis es una característica importante en su desarrollo. El tratamiento de muchas enfermedades autoinmunes y tumores sería benéfico de la apoptosis incrementada. Un medio para incrementar la apoptosis es proporcionar células objetivo con genes caspasa en una forma expresable. Esto puede llevarse a cabo por suministro de ADN o cADN capaz de la transcripción in vivo de un polipéptido pro-apoptótico. Más específicamente, con objeto de producir un polipéptido apoptótico in vivo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido apoptótico se coloca bajo el control de un promotor eucariótico (por ejemplo, un promotor pol lll, CMV o promotor SV40). En donde se desea controlar de manera más específica la transcripción, un polipéptido apoptótico puede colocarse bajo el control de un promotor específico de célula o tejido (por ejemplo, a células objetivo en el hígado) o un promotor inducible, tal como metalotioneína. Muchas técnicas para la introducción de ácidos nucleicos en células se conocen. Tales métodos incluyen vectores retrovirales e infección de retrovirus subsecuente, vectores virales adenovirales o adeno-asociados e infección subsecuente, y complejos de ácido nucleico con un agente de condensación (por ejemplo poli-lisina). Estos complejos o vectores virales pueden dirigirse a tipos de células particulares por medio de un ligando incorporado en el vehículo. Muchos ligandos específicos para células tumorales y otras células se conocen bien en la materia. Una amplia variedad de vectores puede utilizarse dentro del contexto de la presente invención, incluyendo por ejemplo, plásmidos, virus, retrotransponos y cósmidos. Los ejemplos representativos incluyen vectores adenovirales (por ejemplo, WO 94/26914, WO 93/9191 ; Yei eí al. , Gene Therapy 7 : 192-200, 1994; Kolls eí al., PNAS 97(1 ):215-219, 1994; Kass-Eisler eí al., PNAS 90(24): 1 1498-502, 1 993; Guzmán eí al., Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzmán eí al., Cir, Res, 73(6): 1202-1207, 1993; Zabner eí al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li eí al., Hum. Gene. Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud eí al., Eur. J. Neurosci. 5(1 0): 1287-1291 , 1992), vectores adeno-asociado tipo i ("AAV-1 ") o adeno-asociado tipo 2 ("AAV-2") (ver WO 95/1 3365; Flotte eí al., PNAS 90(22): 1061 3-10617, 1993), vectores delta de hepatitis, vivo, virus delta atenuado y vectores virales de herpes (por ejemplo, Patente de E. U. No. 5,288,641 ), así como también los vectores que se describen dentro de la Patente de E. U. No. 5, 166,320. Otros vectores representativos incluyen vectores retrovirales (por ejemplo, EP 0 41 5 731 ; WO 90/07936; WO 91 /02805; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; Patente de E. U. No. 5,219,740; WO 93/1 1230; WO 93/10218. Dentro de ciertos aspectos de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína de trayectoria apoptótica pueden introducirse en una célula huésped utilizando un vehículo, o varios métodos físicos. Los ejemplos representativos de tales métodos incluyen la transformación utilizando precipitación de fosfato de calcio (Dubensky eí al. , PNAS 87 :7529-7533, 1984), la microinyección directa de tales moléculas de ácido nucleico en células objetivo intactas (Acsadi eí al., Nature 352.81 5-81 8, 1 991 ) y la electroporación mediante la cual las células suspendidas en una solución de conducción se someten a un campo eléctrico intenso con objeto de polarizar temporalmente la membrana , permitiendo la entrada de las moléculas de ácido nucleico. Otros procedimientos incluyen el uso de moléculas de ácido nucleico enlazadas a un adenovirus inactivo (Cotton eí al., PNAS 80:6094, 1990), lipofección (Felgner eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989), bombardeo de microproyectiles (Williams eí al., PNAS 88:2726- 2730, 1991 ), los compuestos de policación tales como polilisina, ligantes específicos receptores, liposimas que atrapan las moléculas de ácido nucleico, fusión de esferoplatos mediante la cual el E. coli que contienen las moléculas de ácido nucleico se separan de sus paredes celulares exteriores y funden en células animales utilizando glicol de polietileno, transducción viral (Cline eí al., Pharma. Ther. 29:69, 1985; y Friedmann eí al. , Science 244: 1275, 1989) y ligando de AND (Wu eí al., J. of Biol. Chem 264: 16985-16987, 1 989) así como también virus inactivados de psoralen tal como Sensai o Adenovirus. Los vehículos apropiados incluyen matrices activadas por gen como se describe en la Patente de E. U. No. 5,763,416 y WO 97/38729, Ser de E.U. No. 08/631 ,334. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. EJEMPLOS EJEMPLO 1 CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR BINARIO QUE CONTIENE IAP La estructura de lectura abierta (ORF) dentro del vector pOPIAPRC (Birmbaum eí al., J. of Virology 68:2521 -2528, 1994) se diseñó por PCR para introducir un sitio Neo I en el extremo 5' y sitio Bam Hl en el extremo 3'. Esta manipulación introdujo un residuo Ala entre los residuos Met (posición 1 ) y Ser (posición 2) de la proteina nativa. Las condiciones de PCR utilizadas fueron como sigue: 1 min 94°C; 1 min 45°C; 2 min 72°C para ciclos seguidos por 35 ciclos adicionales de 1 min 94°C, 1 min 55°C; 2 min 72°C. Primario pcr-5: 5'-gttgcagaccatggccagctcccgagcattggc-3'. Primario pre-3: 5'-ttttggatccttttattgttacacttgg-3' El producto PCR se digirió con Neo I y Bam Hl y se subclonó en el casette de expresión vegetal pRTL2 (descrito por Carrington eí al. J. of Virology 64: 1 590-1597; 1990 como pRTOLGUS). El vector resultante se refiere como pPTN 144 (Figura 1 A). El casette 35S-IAP de pPTN144 se subclonó utilizando Hind lll en el vector binario pZP212 (Hadjukiewicz et al., Plant Mol. Bio 25,989-994, 1994). El vector resultante se refiere como pPTN 148 (Figura 1 B): EJEMPLO II CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR BINARIO QUE CONTIENE CED-9 La ORF de Ced-9 se diseñó por PCR para introducir un sitio Neo I en el extremo 5' y un sitio Xba I en el extremo 3'. Esta manipulación introdujo un residuo Ala entre los residuos Met (posición 1 ) y Thr (posición 2) de la proteína nativa. Las condiciones de PCR fueron idénticas a aquellas descritas para el diseño del pOPIAPRC ORF. Primario ced-5: 5'-gaattccggtttgagccatggcgacacgctgcacggcg-3' Primario ced-3-2: 5'-ttttttctagaaatacgttacttcaagctg-3'. El producto PCR se digirió con Neo I y Xba I y se subclonó en el casette de expresión vegetal pRTL2 (Carrington eí al. J. of Virology 64: 1590-1 597; 1990). El vector resultante se refiere como pPTN143 (Figura 3A). El casette de expresión vegetal ced-9 de pPTN143 se subclonó como un fragmento Hind lll en el vector binario pZP21 2 (Hadjukiewicz eí al. , Plant Mol. Bio 25/989-994, 1994). El vector resultante se refiere como pPTN 147 (Figura 3B): EJEMPLO lll CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR BINARIO QUE CONTIENE BCL-2 El cADN de bcl-2 se diseñó para introducir un sitio Neo I en el extremo 5' de la ORF para bcl-2 y un sitio Xba I en el extremo 3' de la ORF. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con los siguientes primarios utilizando las condiciones idénticas recitadas en el Ejemplo I. Primario Bcl2-5: 5'-tttttcctctgggagggccatggcgcacgctgg-3' Primario Bcl2-3: 5'-ttttttctagatgctcttcgggcgtgg-3' Estas manipulaciones introdujeron un residuo Ala entre los residuos Met (posición 1 ) y His (posición 2) de la proteína nativa. El producto PCR se digirió entonces con Neo I y Xba I y se subclonó en el casette de expresión vegetal pRTL2. El vector resultante se refiere como pPTN 1 57 (Figura 2A). El casette de expresión vegetal de bcl-2 completo se subclonó entonces en el vector binario pZP212 utilizando Hind lll de endonucleasa seguido por ligación. El vector resultante se refiere en la presente como pPTN 161 (Figura 2B): EJEMPLO IV CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR BINARIO QUE CONTIENE E 1 B 19K El fragmento Eco Rl/Bam Hi dentro del vector pCMV19K (White and Cipriani, Mol. Cell. Biol. 70: 1 20-1 30, 1 990) se subclonó en pBluescript KS para análisis de secuencia. El vector resultante se refiere como pPTN 145 (Figura 4C). En base a los datos de secuencia obtenidos de los primario pPTN 145 templados se diseñaron para introducir un sitio Neo I en el extremo 5' de la ORF y un sitio Bam Hl en el extremo 3' de la ORF por PCR. Esa manipulación no agrega un residuo adicional dentro de la proteína. Primario pPTN 145-5: 5'-gcttcctgaactccatggaggcttggg-3' Primario pPTN 145-3: 5'-tttttggatccaacattcattcccgaggg-3' Debido a un sitio interno Neo I dentro de la ORF de E 1 B 19K, el fragmento de pPTN145 se subclonó en pRTL2 (NcoMBam Hl) como una ligación triple NcoMKpn I y Kpn MBam Hl. El vector resultante se refiere como pPTN 160 (Figura 4A). El casette de 35S-19k de pPTN 160 se subclonó en el vector binario pZP212 como un fragmento Hind lll. El vector resultante se refiere como pPTN 162 (Figura 4B). Figura 4B). EJEMPLO V PROCEDIMIENTO DE TRANSFORMACIÓN DE LA PLANTA Cepas de Aqrobacterium: la cepa de Agrobacterium tumefaciens, C58C 1 (Mol. Gen. Genet. 204:383, 1 986) se utilizó en todas las transformaciones de tabaco. Los vectores binarios pPTN 147, pPTN148, pPTN 161 y pPTN 162 se movilizaron en C58C1 por acoplamiento tri-parental (Ditta eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:7347-7351 , 1 980) con 1 00 mg/l de Estreptomicina, 100 mg/L de Espectinomicina, 50 mg/L de Rifampicina, 50 mg/L de Gentamicina y 1 .5 de sacarosa. El cultivo Glurk Nicotiana tabacum de tabaco tipo silvestre (genotipo NN) o cultivo Turkisk N. tabacum (genotipo nn) se utilizaron para inoculación de patógeno, y para la construcción de plantas transgénicas. (Ambos cultivos Glurk y Turkish se encuentran disponibles de una variedad de fuentes incluyendo la Universidad de Nebraska en Lincoln, Collection). Las transformaciones de tabaco se condujeron utilizando una modificación del procedimiento de baño químico de la hoja (Horsch eí al., Science 227: 1229-1231 , 1985). Las explantas se prepararon de las primeras dos hojas de plantas de 30-40 dias de edad. Después de un periodo de co-cultivación de 3 días las explantas se subcultivaron en medio MS/B5 complementado con 1 mg/1 BAP, 0.1 mg/1 NAA y 100 mg/l de Kanamicina. Los antibióticos de Carbenicilina y Cefotaxima se agregaron para contraseleccionar contra Agrobacterium. Las explantas se sulcultivaron cada 2 semanas a medio fresco. Los vastagos tolerantes de Kanamicina diferenciada se ejercieron después de 6-8 semanas en cultivo.

Los vastagos se sembraron en un medio en base a MS/B5 complementado con 0.1 mg/1 NAA y 50 mg/l Kanamicina. sembraron en un medio en base a MS/B5 complementado con 0.1 mg/1 NAA y 50 mg/l Kanamicina. EJEMPLO VI ANÁLISIS DE SELECCIÓN PARA LÍNEAS TRANSGÉNICAS Las plantas transgénicas resistentes a Kanamicina se propagan en medio de sales básales Murashige-5kOOG (Sigma), complementaron con sulfato de Kanamicina (100 mg/l), NAA (auxina), 0.1 mg/l y BAP (citoquinina) 1 mg/l. Para los estudios de expresión, las hojas de tabaco se recolectaron, congelaron en nitrógeno liquido y trituraron en un polvo. El ARN vegetal se aisló como se describe en el Ejemplo VIII. Las machas de ARN se hibridizaron con pPN 147, pPTN 148, pPTN 1612 o pPTN 162. rARN 18S sirvió como un control interno para asegurar la carga de ARN equivalente. La hibridización de mancha de ARN y enjuague de membrana se llevaron a cabo bajo condiciones severas (Sambrook eí al., supra). Análisis Western: Proteínas TMV se detectaron por al teñir de azul Coomassie y/o inmunoanálisis de SDS PAGE. El tejido de planta infectado se enterró en ddH20 (0.2 g de tejido/1 ml) e hirvió 1 -5 min, cinco volúmenes de regulador de carga Laemmli (Laemmli, Nature 227:680-685, 1970). Aproximadamente 1 5 µl se aplicaron a 12% de geles de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a membranas de ntriocelulosa, y después de detectaron con un anticuerpo policlonal TMV hecho contra viriones diluidos 1 : 1000 (disponible de ATCC PVAS-135, Manassass, VA) utilizando análisis clorométricos (equipo Immun-Blot, BioRad) (Figuras 1 1 A y 1 1 B). Análisis Northern y Southern: El análisis Southern (datos no mostrados) y Northern blots indicaron tanto la presencia como la expresión de los cuatro transgenes. EJEMPLO Vil INOCULACIÓN DE PATÓGENO Y ANÁLISIS DE RESISTENCIA Se investigó evaluación de la resistencia de la planta a virus de mosaico de tabaco (TMV). En este experimento los cultivos de tabaco con (Glurk) y sin (Turkish) gen N para resistencia a TMV se transformaron. Un mínimo de 10 líneas de Glurk y Turkish resistentes a la canamicina se obtuvieron con cada uno de los cuatro transgenes. El análisis Southern (datos no mostrados) y Northern blots indicaron tanto la presencia como la expresión de los cuatro transgenes (Figura 5, demuestra expresión de IAP y Ced-9, mientras que las Figuras 8 y 9 muestran expresión de Bcl-2 y Ced-9, respectivamente). No hubo correlación entre el número de copia, el nivel de expresión y la respuesta de la planta. No hubo diferencias fisiológicas detectables entre las plantas transgénicas cuando se comparan con controles de tipo silvestre. Todas las plantas florecieron y establecieron semillas en una manera similar. El tabaco resistente a la canamicina de inserción de copia única aleatoriamente elegido se evaluó para respuesta a cambio de patógeno. El tabaco transgénico se probó para resistencia a virus de mosaico de tabaco (TMV) virus de necrosis de tabaco (TNV), virus de grabado de tabaco (TEV), virus de peste negra del tabaco (TSWV), Sclerotinia sclerotiorum 1980 (Dickman and Mitra, Physiol. Mol. Plant Phatol. 47 :255-263, 1 992); Botrytis cinérea (ATCC), Cercospora nicotianae, y Glomerella cingulata. El tabaco de control y transgénico se desarrollaron a 25°C con 16 h de periodos de luz en un invernadero. Análisis virales: Las hojas de tabaco separadas se polvearon con carborundo y rub-inocularon con 1 10 µg de TMV en 50 µg de H2O. Después de 5 min, las hojas se enjuagaron completamente con agua, colocaron en platos de petri y mantuvieron a 25°C bajo iluminación constante. Las inoculaciones con TNV y TSWV fueron similares excepto que el jugo de la planta infectada diluido 1 /25 (p/v) en 10 mM regulador de fosfato de Na (pH 7) se utilizó para inoculum. Los efectos de la expresión del gen anti-apoptótico en TMV tanto en líneas de tabaco resistentes (NN) como susceptibles (nn) se efectuaron. El gen N confiere una respuesta hipersensible a infección TMV que evita la difusión sistémica del virus. Las lesiones necróticas aparecen 4 a 5 días después de la inoculación con TMV y continúan expandiéndose en tamaño tiempo extra. El desarrollo de lesión local parece ser bi-fásica en naturaleza. Inicialmente, las lesiones pequeñas remojadas en agua (1 -2 mm) se desarrollan después de dos a tres día, después de los cuales se vuelven uniformemente necróticas. Después de esto, la necrosis continua para expandirse con márgenes cloróticos, en lugar de remojados en agua. El movimiento del virus se limita a la vecindad de la lesión que crece y subsecuentemente coalescencia, dando como resultado la muerte de la hoja completa. TMV no induce síntomas visibles o las hojas inoculadas sin el gen B pero se replica y difunde por toda la hoja. TMV se inoculó en las cuatro líneas Glurk transgénicas diferentes (NN) (utilizando un mínimo de tres líneas diferentes) así como también dos líneas Turkish (nn). El tabaco y tabaco transformado que contiene vector sólo y vector solamente con plantas sirvieron como controles. Además, los análisis de hojas separadas se utilizaron en la mayoría de los experimentos ya que son experimentalmente ventajosos y demostraron una correlación del 100% en respuesta al cambio de patógeno cuando se compara con plantas completas en un invernadero. La inoculación de TMV dio elevación a las lesiones locales en líneas Glurk tanto con como sin genes Bcl-2, CED 9 e IAP. En todos estos estudios, las plantas transgénicas que contienen el adenovirus E 1 B-19k en cualquier cultivo de tabaco no parecieron resistentes a este patógeno y de esta manera no se evaluaron más. El crecimiento secundario de las lesiones se limitó grandemente, sin embargo, en aquellas líneas que expresan los otros transgenes (Figuras 7, 10A y 10B). De esta manera, Bcl-2, CED-9 e IAP parecen potenciar la resistencia proporcionada por el gen N al prevenir la expansión de la lesión. Fue posible que TMV pudiera expandirse fuera de las lesiones iniciales sin inducir necrosis adicional. Para determinar esto, el análisis de Western blot se hizo por separado en lesiones locales y tejidos circundantes (Figura 1 1 A). Aunque el virus fue abundante dentro de las lesiones, ningún virus se detectó fuera de los límites de las lesiones que confirma que la resistencia del gen N se potenció sin embargo por Bcl-2 y ced-9. Por el otro lado, Bcl2 y ced-9 no tuvieron efecto en la acumulación de TMV en ias líneas Turkish (Figura 1 1 B). Muchas combinaciones de planta huésped-virus también dan aumento a las lesiones locales necróticas pero no se limitan a genotipos de huésped particular. En tales combinaciones la planta se llama un huésped de lesión local del virus. El tabaco es un huésped de lesión local para un número de virus, incluyendo virus de necrosis de tabaco (TNV) y virus de peste negra del tomate (TSWV). A diferencia del TMV y el gen N, las bases genéticas de tales respuestas necróticas genéricas se desconocen pero es probablemente que difiera de un virus a otro debido a que la morfología de las lesiones locales varía ampliamente. Fue de interés, por lo tanto, determinar los efectos de los transgenes en la respuesta del huésped a estos virus de planta disparados. Sorprendentemente, las hojas de líneas de tabaco que expresan Bcl-2 o ced-9 no tuvieron síntomas visibles después de la inoculación con ya sea TNV o TSWV (Figura 12). La necrosis se limitó grandemente en plantas que expresan IAP después de la inoculación con cada uno de estos virus también. De esta manera, el tabaco con cualquier transgen no es más un huésped de lesión local para estos dos virus. De manera no inesperada, el mismo fenotipo se observó tanto en antecedente genético NN como en nn debido a que el gen N es específico de TMV. Además, el virus de grabado de tabaco (TEV) también se ha probado como se describe para otros virus de arriba, y demuestra independencia del gen N similar como TSWV. De acuerdo con lo anterior, las células que expresan Bcl-2 y Ced-9 no tuvieron síntomas visibles de inoculación con TEV (datos no mostrados). Las plantas de tabaco seleccionadas se protegieron (por ejemplo, cruzaron con un mismo genotipo). De manera importante, entre las plantas de progenie, aquellas sin resistencia a la canamicina y que carecen de expresión del transgen fueron todas ahora susceptibles. La progenie resistente a canamicina que expresa el transgen (ver Figura 1 3 (Ced-9 ejemplificativo Bcl-2 e IAP similar), 14A (expresión de Bcl-2 e inoculación de TMV), 14B (expresión de Ced-9 e inoculación de TMV9, 14C (expresión de Ced-9 e inoculación de TSWV) fueron virtualmente resistentes e idénticos en fenotipo después del cambio viral como se observa en los paréntesis. Análisis Fúnqico: Para análisis de hoja separados, un mínimo de 2 hojas por planta de 1 0 plantas individuales/trangenes de ambos cultivos se inocularon al colocar 5 mm de toma de agar que contienen puntas de hifal que crecen activamente de colonias de 3 días de edad de ya sea S. sclerotiorum o B. cinérea crecieron en agar de dextrosa de papa. Las hojas se colocaron en papel de filtro estéril humedecido en platos de petri de vidrio e incubaron por 3-7 días a 25°C y humedad elevada. Para inoculaciones de planta completa (S. Sclerotiorum solamente) las ascoesporas («10 /ml) se incubaron durante 2 horas en medio líquido YPSS (Tuite, 1 968) y rociaron en hojas de tabaco hasta el derrame. Las plantas inoculadas se colocaron en una cámara de neblina a 100% de humedad relativa a 25°C en la oscuridad. Un mínimo de cinco plantas/líneas se utilizaron. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los análisis con Sclerotinia sclerotiorum indicaron que tabaco transgénico fue altamente tolerante y en la mayoría de los casos completamente resistente a diferencia del tabaco de tipo silvestre que es altamente susceptible. Este hongo requiere la inoculación con una fuente nutricional, a diferencia de numerosos otros hongos que pueden suministrarse en agua o regulador solo. Como se muestra en la Figura 15, el hongo cuando se inocula con una fuente nutricional rica, crece junto con la fuente de hoja de tabaco, pero no ocurre la infección o colonización del huésped. El hongo eventualmente deja de crecer presumiblemente debido a la depleción de la fuente nutricional y aún de manera más importante con periodos extendidos de incubación, el hongo aún es incapaz de colonizar e infectar el tejido vegetal. En contraste, el hongo de tipo silvestre sobre el mismo periodo de tiempo coloniza completamente y macera el tejido de la hoja (Figura 1 5).

Las plantas de tabaco previamente descritas que se protegen también se evaluaron para respuesta a cambio de S. sclerotiorum (Figura 16). De nuevo, las plantas de progenie sin resistencia a la canamicina y que carecen de expresión del transgen fueron generalmente resistentes e idénticas en fenotipo a los transformantes primarios, origen. Batrytus cinérea también un patógeno fúngico necrotrófico de rango de huésped amplio mostró una respuesta similar cuando se inoculó en tabaco transgénico que contiene cualquiera de los tres transgenes. En ambos ejemplos fúngicos, las inoculaciones de planta completa fueron idénticas en respuesta fenotípica como aquellas observadas en análisis de hoja separados (Figuras 17A-Bcl-2 de expresión, 17B-Ced-9 de expresión). Además, las plantas que codifican los tres transgenes Ced-9, Bcl-2 y IAO fueron resistentes tanto a Cercospora nicotiance (Figura 19) como Glomerella cingulata en una manera similar a aquella descrita por S. sclerotiorum (datos no mostrados). Por último, las plantas se transformaron con un vector que codifica bcl-xL de tipo silvestre y mutante no funcional de G138A de bcl-XI en el mismo vector de origen como arriba. Después de la exposición de S. sclerotiorum. EJEMPLO VIII AISLAMIENTO Y MANCHADO DE ARN DE LÍNEAS DE TABACO TRANSFORMADAS Las cepas resistentes a la canamicina regeneradas de plantas de tabaco transformadas se analizaron al hibridizar muestras de ARN con una prueba radiomarcada que comprende el gen que codifica la proteína de trayectoria apoptótica de interés, Gordon-Kamm eí al., The Plant Cell 2:603-618, 1990. El ARN total de las hojas de las plantas de tabaco transformadas se aisló como se describe, Strommer et al, , en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pp. 49-65, CRC Press, Boca Ratón FL, 1993. Aproximadamente 600 a 700 mg de hoja se corta de una planta, el reborde central se remueve y la hoja se coloca en hielo. Las hojas se siembran con nitrógeno líquido y se transfiere a un tubo de microcentrífuga. 1 ml de TRIzol se agrega y las hojas se dejan descongelar. La muestra se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos después de la adición de 0.2 ml de cloroformo, mezclado, e incubación subsecuente por un adicional de 3 minutos. Las muestras se centrifugan entonces a 12,000 x g a 4°C durante 15 minutos y el sobrenadante se transfiere a un tubo separado. Al sobrenadante de agregan 0.5 ml de alcohol de isopropilo y la solución resultante se mezcla gentilmente e incuba durante 1 0 minutos a temperatura ambiente. La muestra se centrífuga entonces a 12,000 x g a 4°C durante 10 minutos y el sobrenadante se remueve. La pastilla se enjuaga con 1 ml de 75% de etanol y se mezcla gentilmente. La pastilla enjuagada se centrifuga a 7,500 x g a 4°C durante 5 minutos, el sobrenadante se remueve, y el vacío de pastilla resultante se seca por 3 a 5 minutos o se deja secar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Subsecuentemente, 20 a 50 µl de DEPC H2O o Formamida se agrega e incuba a 55°C durante 10 minutos. Las muestras se utilizan entonces o mantienen a -80°C hasta que sea necesario.

Las preparaciones de ARN se resuelven utilizando electroforesis de gel utilizando procedimientos estándar y se transfieren a una membrana para su hibridización (ver Sambrook eí al., supra). Primero la membrana se prehibridiza en un horno giratorio a 65°C durante 1 ora con 25 ml de solución que comprende (12.5 ml de 1 M NaHPO pH 7.2, 0.25 g BSA, 50 µl de EDTA (0.5 M de reserva), 1 .75 g SDS y ddH2O a 25 ml (aprox. 1 1 .5 ml). Las pruebas se preparan al marcar klenow con 32P-dCTP. La prueba puede entonces agregarse directamente a la solución de hibridización y dejarse incubar durante la noche a 65°C en un horno giratorio. La membrana se enjuaga entonces durante 10 minutos a temperatura ambiente con 50 ml de una solución de enjuague de baja severidad (2 ml 1 M NaHPO4, pH 7.2, 0.25 g BSA, 100 µl EDTA (0.5 M de reserva), 2.5 g de SDS y ddH2O a 50 ml). La membrana se enjuaga entonces con una vez durante 10 minutos a temperatura ambiente y dos veces durante 10 minutos a 65°C con 50 ml de una solución de enjuague de baja severidad (8 ml 1 M NaHPO4 l pH 7.2, 400 µl EDTA (0.5 M de reserva), 2 g SDS, y ddH2O a 200 ml). La membrana se expone entonces a película X-OMAT por 5 a 10 horas a -80°C utilizando una pantalla de intensificación. A partir de lo anterior se apreciará que, aunque las modalidades específicas de la invención se han descrito en la presente para propósitos de ilustración, varias modificaciones pueden hacerse sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con lo anterior, la invención no se limita excepto por las reivindicaciones anexas. Todas las referencias, incluyendo artículos de periódico, patentes y solicitudes de patente citadas dentro de la presente solicitud e incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una planta transgénica, que comprende células vegetales que contienen al menos una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional o una variante funcional de la misma. 2. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional codificada por dicha secuencia de nucleótidos 3. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína anti-apoptótica. 4. La planta transgénica según la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína anti-apoptótica se selecciona del grupo que consiste de Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP y E1 B 19K. 5. La planta transgénica según la reivindicación 3, caracterizada porque dicha proteína anti-apoptótica es Ced-9 o Bcl-2. 6. La planta transgénica según las reivindicaciones 1 o 3, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos incluye un promotor específico de tejido. 7. La planta transgénica según la reivindicación 6, caracterizada porque dicho promotor específico de tejido se selecciona del grupo que consiste de un promotor de amilasa alfa, un promotor de patatina, y un promotor de glutenina. 8. La planta transgénica según las reivindicaciones 1 o 3, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos incluye un promotor inducible. 9. La planta transgénica según la reivindicación 8, caracterizada porque el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste de un promotor inducible de herida, un promotor de dehidrogenasa de alcohol, y un promotor de sintasa de chalcona. 10. La planta transgénica según las reivindicaciones 1 o 3, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos incluye un promotor constitutivo. 1 1 . La planta transgénica según la reivindicación 10, caracterizada porque dicho promotor constitutivo se selecciona del grupo que consiste de un promotor de transferasa de metilo adenina, un promotor 35S y un promotor de ubiquitina. 12. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque la proteína de trayectoria apoptótica se selecciona del grupo que consiste de caspasa, una rev-caspasa, miembros de la familia Bcl-2, Apaf-1 , Bad, Bax, Ced-9 y Ced-4. 1 3. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha planta es una planta dicotiledónea. 14. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha planta es una planta monocotiledónea. 1 5. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha planta es resistente al ataque biótico. 16. La planta transgénica según la reivindicación 1 5, caracterizada porque el ataque biótico se induce por un insecto. 17. La planta transgénica según la reivindicación 1 5, caracterizada porque el ataque biótico se induce por un patógeno, 18. La planta transgénica según la reivindicación 17, caracterizada porque dicho patógeno se selecciona del grupo que consiste de un hongo, un nematodo, una bacteria, y un virus. 19. La planta transgénica según la reivindicación 1 7, caracterizada porque dicho patógeno es un virus. 20. La planta transgénica según la reivindicación 19, caracterizada porque dicho virus se selecciona del grupo que consiste de virus de mosaico de tabaco (TMV), virus de necrosis de tabaco (TNV), virus de grabado de tabaco (TEV) y virus de peste negra del tomate (TSWV). 21 . La pianta transgénica según la reivindicación 17, caracterizada porque dicho patógeno es un hongo. 22. La planta transgénica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicho hongo es Sclerotinia sclerotiorum. 23. La planta transgénica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicho hongo se selecciona del grupo que consiste de Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinérea, Cercospora nicotianae, y Glomerella cingulata. 24. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha planta es resistente al ataque abiótico. 25. La planta transgénica según la reivindicación 24, caracterizada porque el ataque abiótico se induce por un agente seleccionado del grupo que consiste de humedad elevada , humedad inferior, salinidad, deficiencia nutriente, contaminación del aire, toxicidad del suelo, herbicidas e insecticidas. 26. La planta transgénica según la reivindicación 1 , caracterizada porque al menos una porción de dicha planta muestra un nivel reducido de senescencia. 27. Una célula vegetal, que contiene una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional o una variante funcional de la misma. 28. La célula vegetal según ia reivindicación 27, caracterizada porque comprende además una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional codificada por dicha secuencia de nucleótidos. 29. La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína anti-apoptótica. 30. La célula vegetal según la reivindicación 29, caracterizada porque dicha proteina anti-apoptótica se selecciona del grupo que consiste de Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP y E 1 B 19K. 31 . La célula vegetal según la reivindicación 29, caracterizada porque dicha proteina anti-apoptótica es Ced-9 o Bcl-2. 32. La célula vegetal según las reivindicaciones 27 o 29, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos incluye un promotor específico de tejido. 33. La célula vegetal según la reivindicación 32, caracterizada porque dicho promotor específico de tejido se selecciona del grupo que consiste de un promotor de amilasa alfa, un promotor de patatina, y un promotor de glutenina. 34. La célula vegetal según las reivindicaciones 27 o 29, caracterizada porque dicha secuencia de nucieótidos incluye un promotor inducible. 35. La célula vegetal según la reivindicación 34, caracterizada porque dicho promotor inducible se selecciona del grupo que consiste de un promotor inducible de herida, un promotor de dehidrogenasa de alcohol, y un promotor de sintasa de chalcona. 36. La célula vegetal según las reivindicaciones 27 o 29, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos incluye un promotor constitutivo. 37. La célula vegetal según la reivindicación 36, caracterizada porque dicho promotor constitutivo se selecciona del grupo que consiste de un promotor de transferasa de metilo adenina, un promotor 35S y un promotor de ubiquitina. 38. La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha proteína de trayectoria apoptótica se selecciona del grupo que consiste de caspasa, una rev-caspasa, miembros de la familia Bcl-2, Apaf-1 , Bad, Bax, Ced-9 y Ced-4. 39. La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha célula vegetal es una célula vegetal dicotiledónea. 40. La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha célula vegetal es una célula vegetal monocotiledónea. 41 . La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha célula vegetal es resistente al ataque biótico. 42. La célula vegetal según la reivindicación 41 , caracterizada porque el ataque biótico se induce por un insecto. 43. La célula vegetal según la reivindicación 41 , caracterizada porque el ataque biótico se induce por un patógeno, 44. La célula vegetal según la reivindicación 43, caracterizada porque dicho patógeno se selecciona del grupo que consiste de un hongo, un nematodo, una bacteria , y un virus. 45. La célula vegetal según la reivindicación 43, caracterizada porque dicho patógeno es un virus. 46. La célula vegetal según la reivindicación 45, caracterizada porque dicho virus se selecciona del grupo que consiste de virus de mosaico de tabaco (TMV), virus de necrosis de tabaco (TNV), virus de grabado de tabaco (TEV) y virus de peste negra del tomate (TSWV). 47. La célula vegetal según la reivindicación 43, caracterizada porque dicho patógeno es un hongo. 48. La célula vegetal según la reivindicación 47, caracterizada porque dicho hongo se selecciona del grupo que consiste de Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinérea, Cercospora nicotianae, y Glomerella cingulata. 49. La célula vegetal según la reivindicación 43, caracterizada porque dicho patógeno es el hongo Sclerotinia sclerotiorum. 50. La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha célula vegetal es resistente al ataque abiótico. 51 . La célula vegetal según la reivindicación 50, caracterizada porque el ataque abiótico se induce por un agente seleccionado del grupo que consiste de humedad elevada, humedad inferior, salinidad, deficiencia nutriente, contaminación del aire, toxicidad del suelo, herbicidas e insecticidas. 52. La célula vegetal según la reivindicación 27, caracterizada porque dicha célula vegetal muestra un nivel reducido de senescencia. 53. Una semilla que es capaz de germinar en una planta que tienen en su genoma una secuencia de ácido nucleico heterólogo capaz de codificar una trayectoria apoptótica biológicamente funcional. 54. Una planta resistente al ataque biótico, transgénica que contiene una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína anti-apoptótica biológicamente funcional, 55. La planta según la reivindicación 54, caracterizada porque dicha proteína anti-apoptótica se selecciona del grupo que consiste de Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP, E 1 B 19K y homólogos de las mismas. 56. La planta según la reivindicación 54, caracterizada porque el ataque biótico es un patógeno. 57. Una planta resistente al ataque abiótico, transgénica que contiene una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína anti-apoptótica biológicamente funcional, 58. La planta según la reivindicación 57, caracterizada porque dicha proteina anti-apoptótica se selecciona del grupo que consiste de Ced-9, Bcl-2, Bcl-xL, IAP, E1 B 19K y variantes funcionales de las mismas. 59. Un método para generar una planta resistente abiótica o biótica, transgénica, que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional, dicha secuencia de ácido nucleico operablemente asociada con un promotor; (b) producir una planta de dichas células vegetales transformadas; y (c) seleccionar una planta transformada que tiene resistencia biótica o abiótica. 60. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque la planta transgénica es resistente al patógeno. 61 . El método según la reivindicación 59, caracterizado porque la etapa de transformación es por medios físicos. 62. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque la etapa de transformación es por medios químicos. 63. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque dicha célula vegetal se selecciona del grupo que consiste de protoplastos, células que producen gameto, y células que son capaces de regenerarse en una planta completa . 64. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque el promotor es un promotor constitutivo. 65. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible. 66. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque el promotor es un promotor específico de tejido. 67. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque la planta es una planta dicotiledónea. 68. El método según la reivindicación 59, caracterizado porque la planta es una planta monocotiledónea. 69. Una planta producida por el método según la reivindicación 59. 70. Tejido vegetal derivado de una planta producida por el método según la reivindicación 59. 71 . Un método para modular apoptosis en una planta, que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteina de trayectoria apoptótica biológicamente funcional no producida normalmente por la célula vegetal, dicha secuencia de ácido nucleico operablemente asociada con un promotor inducible; (b) cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones adecuadas para la formación de una planta; y (c) desarrollar ia planta bajo condiciones y por un tiempo suficiente para inducir la transcripción de dicha secuencia de ácido nucleico. 72. Un método para identificar genes de planta que tienen actividad de trayectoria apoptótica, que comprende: (a) transformar célula(s) animale(s) con una biblioteca de cADN, en donde cada miembro de la biblioteca de cADN se asocia operablemente con un promotor; (b) contactar la(s) célula(s) transformada(s) con un inductor apoptótico; y (c) detectar actividad apoptótica en dicha(s) célula(s), y comparar esta actividad con una línea celular de control, en donde un incremento o reducción en actividad apopt?tica indica la presencia de un gen que codifica una proteína de trayectoria apoptótica en la biblioteca de cADN de planta. 75. El método según la reivindicación 74, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico heterólogo comprende una biblioteca de cADN heteróloga, en donde cada miembro de la biblioteca de cADN se asocia operablemente con un promotor. 76. El método según la reivindicación 74, caracterizado porque el inductor de apoptosis es un ataque biótico. 77. El método según la reivindicación 76, caracterizado porque el ataque biótico es un patógeno. 78. El método según la reivindicación 74, caracterizado porque el inductor de apoptosis es un ataque abiótico. 79. Una planta transgénica, que comprende células vegetales que contienen al menos una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifica una variante funcional de una proteína de trayectoria apoptótica biológicamente funcional.