KR101179538B1

KR101179538B1 - 무성영양생식 모체발아식물의 형질전환 방법

Info

Publication number: KR101179538B1
Application number: KR1020040004272A
Authority: KR
Inventors: 김태현; 정유철
Original assignee: (주)인비트로플랜트
Priority date: 2004-01-20
Filing date: 2004-01-20
Publication date: 2012-09-05
Also published as: KR20050076332A; WO2005077153A1; US20090288220A1

Abstract

본 발명은 단백질 등 목적물질을 생산하기 위한 형질전환 식물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제공되는 형질전환 식물은 조직배양 없이 대량 배양되고, 유전형질이 여러 세대에 걸쳐 안정적으로 보존되므로, 단백질 등 목적 물질을 단기간에 대량 수득할 수 있다. 또한, 적절한 발현벡터를 이용하여 목적 유전자의 발현시기를 조절함으로써 유전자 기능 분석 및 유전자 발현 식물체의 제조에 중요한 수단으로 이용 될 수 있다.

Description

무성영양생식 모체발아식물의 형질전환 방법 {A TRANSFORMATION METHOD FOR VIVIPAROUS PLANT}

도 1은 pCABIA1303 벡터의 개열지도를 나타낸다.

도 2a는 형질전환된 제 1세대 식물 (T₀)에 대한 공초점 현미경 사진을 나타낸다.

도 2b는 형질전환된 제 2세대 식물 (T₁)에 대한 공초점 현미경 사진을 나타낸다.

도 2c는 형질전환된 제 3세대 식물 (T₂)에 대한 공초점 현미경 사진을 나타낸다.

도 3a는 GUS 프라이머를 사용한 지놈 PCR 결과물에 대한 전기영동사진을 나타낸다.

도 3b는 mGFP5 프라이머를 사용한 지놈 PCR 결과물에 대한 전기영동사진을 나타낸다.

도 4a 내지 도 4c는 GUS 프라이머를 사용한 RT-PCR 결과물에 대한 전기영동사진을 나타낸다.

기술분야

본 발명은 형질전환된 식물로부터 목적 물질 예를 들어, 단백질, 항체, 펩타이드 등을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 형질전환 식물을 목적 물질을 생산하기 위한 바이오리액터 (bioreactor)로서 이용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 단위 영양생식 (vegetative apomixis)에 의해 번식하는 모체발아식물 (viviparous plant)을 목적 물질을 생산하도록 형질전환시키고 이로부터 목적 물질을 여러 세대에 걸쳐 안정적이고 대량으로 수득하는 방법에 관한 것이다.

종래기술

최근까지 생물 의약품 (biopharmaceuticals)의 대량 생산에 주로 미생물이 이용되었다. 예를 들어, 형질전환시킨 대장균 (E. coli), 효모 (yeast) 또는 곰팡이로부터 목적 물질 예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드 등을 대량 생산하는 방법은 비교적 잘 확립되었다. 그러나 미생물 시스템의 경우 단백질의 전사후과정 (post-transcription)의 결여, 응집체의 형성 및 용해도 저하 등으로 인하여 약제로서 이용하기에 적합한 단백질 등의 생산에 적용하기 어렵다. 즉, 대부분의 의료용 단백질은 전사후과정에 의해 단백질의 3차구조가 결정되고 이에 따라 그 약리 활성이 결정되는데, 미생물의 경우 이러한 변형 시스템이 (modification system)이 없거나 진핵세포와 상이하기 때문에 다양한 종류의 생리활성을 지닌 단백질 생산에는 적합 하지 못하다.

곤충 또는 동물 세포를 이용한 발현시스템은 미생물 시스템과 비교하여 포유류의 생산물을 비교적 정확하게 합성하고, 전사후과정을 통해 단백질의 생체 활성을 높일 수 있는 것으로 알려졌다 [참고문헌 MA JK, Vine ND. Plant expression systems for the production of vaccines. Curr Top Microbiol Immunol.236, 275-292(1999)]. 그러나 일반적으로 형질전환 곤충 또는 동물세포로부터 단백질 등의 제조는 배지의 가격이 매우 높고, 동물바이러스 감염에 의한 감염의 문제가 있으며, 생산, 분비된 의료용 단백질의 분리 정제가 매우 어렵고 비용이 많이 든다. 또한, 배양된 동물세포는 배양조건에 매우 민감하므로 이를 산업적 규모로 배양하는 것은 기술적으로 매우 어렵다.

이에 따라, 1980년대 중반 이후 상기 미생물, 곤충세포 또는 동물세포를 이용하는 시스템이 갖는 단점을 극복하고, 단백질 등 목적 물질을 저비용으로 대량 생산하기 위한 연구가 식물체에서 활발하게 이루어져 왔으며, 여러 식물 종에서 성공적인 결과가 보고 되었다. 이와 같이, 단백질, 항체 (antibody), 백신 (vaccine) 및 기타 치료제와 같은 약제, 생분해성 플라스틱 및 윤활유와 같은 산업용 화합물을 수득하기 위해, 형질전환시킨 식물로부터 목적 물질 (plant-derived products of interest; PPI)을 제조하는 것을 분자농업 (Molecular Farming) 또는 바이오농업 (biofarming)이라고 하며, 식물체에 기초한 시스템을 사용한 최초의 분자농업 생성물이 1989년에 보고 되었다. 식물체를 단백질 등 목적 물질을 생산하기 위한 바이오리액터 (bioreactor)로 이용하기 위해 유전공학기술을 적용하는 분자농업은, 상대적으로 저비용 (예를 들어, 미생물 배양 시스템의 약 1/3, 동물세포 배양 시스템의 약 1/30)으로 대량의 수용성 단백질 등을 제공하므로, 시간 및 비용 효율 면에서 종래 미생물 및 동물세포 시스템과 비교하여 매우 이상적인 대안으로 기대된다. 쿠스나디 등 (참고문헌: Ann R. Kusnadi, Zivko L. Nokolov, John A. Howard (1997) Producton of recombianat proteins in transgenic plants: practical considerations. Biotechnol. Bioeng. 56:473-484)은 식물에서 재조합 단백질을 생산하는 것이 작물에 따라 E. Coli에서 발효에 의해 생산하는 것의 약 1/10 ~ 1/50의 비용절감 효과가 있음을 보고한 바 있다. 이와 같이, 식물체를 이용한 단백질 등의 생산은 다음과 같은 장점을 갖는다: i) 배지에 당류와 염 (salt)류 만을 요구하므로 저렴하고 (동물 배지의 약 1/10⁴), ii) 세포 밖으로 분비된 단백질을 비교적 용이하게 분리 정제할 수 있으며, iii) 본질적으로 동물 바이러스에 감염될 우려가 없어 안전성을 확보할 수 있다. 또한, 화학물질을 사용하여 형질전환 식물로부터 유전자 발현을 조절하는 벡터 시스템은 형질전환식물로부터 목적 단백질의 제조를 조절할 수 있는 하나의 수단을 제공 한다 (참고문헌: Hartley et al, 2002, Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1377-1382).

현재까지 분자농업을 위해 약 350개의 후보 유전자가 동정 되었으며, 여러 회사들이 다양한 농작물을 사용하기 위해 연구 중에 있다. 예를 들어, 담배 (tabacco), 알팔파 (alfalfa), 옥수수 (maze), 바나나, 당근, 감자 또는 토마토와 같은 농작물에서 다양한 단백질, 항체 등이 생산 중에 있다. 형질전환 식물체로부 터 생산된 물질로서, 항응혈제 (Anticoagulants), 트롬빈 억제제 (Thrombin inhibitors), 성장호르몬 (Growth hormones), 혈액 대용물 (Blood substitutes), 콜라겐 대용물 (Collagen replacement), 항균제 (Antimicrobial agents), 호중구감소증 치료 및/또는 예방제(Treatment and/or prevention of neutropenia), 빈혈치료 및/또는 예방제 (Treatment and/or prevention of anaemia), 간염 치료 및/또는 예방제 (Treatment and/or prevention of hepatitis), 낭포성 섬유증, 간질환, 뇌출혈 치료 및/또는 예방제 (Treatment and/or prevention of cystic fibrosis, liver diseases and haemorrhage), 고셰병 치료 및/또는 예방제 (Treatment and/or prevention of Gaucher's disease), HIV 치료 및/또는 예방제 (Treatment and/or prevention of HIV), 고혈압 치료 및 예방제 (Treatment and/or prevention of hypertension), 유기인제 중독증 치료 및/또는 예방제 (Treatment and/or prevention of organophosphate poisoning) 등이 보고되었다.

그러나 식물체 시스템이 갖는 여러 장점에도 불구하고 현재까지 개발된 식물체 시스템을 이용한 단백질 등의 생산은, i) 일반적으로 바이오리액터로서의 이용되는 식물의 성장속도가 느리고, ii) 목적 물질의 발현수준 및 생산 수율이 낮으며, iii) 하류 공정 (downstream process)에 해당하는 기술의 개발이 확립되지 않았다는 단점이 있다. 따라서 식물체 시스템이 단백질 등의 대량 배양에 이용되기 위해서는, i) 상대적으로 성장속도가 빠르고 목적 물질의 생성 수율이 높은 새로운 식물체의 선별, ii) 선별된 식물체에 적합한 강력한 프로모터 (promoter) 및 형질전환 방법의 개발, 및 iii) 배양 최적화 기술 및 정제 방법의 개발 등이 지속적으 로 요구되고 있는 실정이다.

현재까지 다양한 식물체 형질전환 방법들이 개발 보고 되었다. 첫째, 조직 또는 세포를 이용하여 외래 유전자를 도입하고 조직배양하는 방법 (transformation of cell or tissues) 및 둘째, 조직배양 단계 없이 목적 물질을 발현하는 유전자 또는 식물체에 요구되는 형질 예컨대, 병충해 방지 특성 등을 제공하는 유전자를 식물체에 직접 도입하는 방법 (in planta transformation)으로 크게 구분된다.

조직 또는 세포를 이용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 식물 형질전환에 가장 일반적으로 사용되는 방법으로서, 식물체로부터 분리된 조직 또는 세포를 형질전환 시킨 후 이를 적합한 토양 또는 배지에서 조직배양하여 형질전환된 식물체를 수득하는 것이다. 이 방법은 담배 및 페투니아에서 가장 잘 확립되었다. 조직 또는 세포의 형질전환은 토양 미생물인 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하거나, 유전자 총을 이용하는 방법 (biolistic gene transfer), 융합 (PEG-mediated fusion), 일렉트로포레이션 (Electroporation) 또는 리포좀 (Liposome)을 매개로 하는 방법 등에 의해 수행 된다. 특히, 아그로박테리움 공동배양법은 종래에는 쌍자엽 식물의 형질전환에만 이용되었으나, 최근에는 단자엽 식물에서의 형질전환에도 이용되고 있는 방법으로서, 구체적으로 조직 절편을 아그로박테리움 (Agrobacterium)과 공동배양 시킨 후, 적절한 선택성 마아커 (selection marker)를 포함하는 재분화 배지에서 분화 (differentiation)시켜 형질전환 식물을 수득한다. 이 방법에 따르면 공동배양, 항생제 등을 이용한 아그로박테리움 제거 및 형질전환체 동정 등이 요구되며, 이에 따라 각 단계를 거치는 동안 식물조직의 재생능력이 손상되어 재분화 개체를 얻지 못하거나 형질전환 식물체의 발생 빈도가 현저히 저하된다. 이러한 문제를 해결하기 위해 제안된 것이 식물체를 전배양 (preculture)하거나, 형질전환 효율을 증진 시킬 수 있는 병원성이 높은 아그로박테리움을 이용하고 있으나 근본적인 해결책은 제시된 바 없다.

한편, 형질전환에 이용되는 토양 미생물로서 아그로박테리움 외에 TMV (Tobacco mosaic virus) 또는 CPMV (cow-pea mosaic virus) 등이 이용될 수 있다. 또한, 유전자 총을 이용한 방법 (Biolistic gene transfer)은 텅스텐이나 금 입자에 외래 유전자의 DNA를 코팅한 후 유전자 총을 이용하여 고속으로 식물조직에 입자를 쏘아 DNA를 식물세포 속으로 도입시켜 식물을 형질전환시키는 방법이다. 이 방법은 아그로박테리움의 숙주범위에 들지 않는 화본과류를 비롯하여 단자엽 식물의 형질전환에 주로 이용 되나, 쌍자엽 작물에 대해서도 사용되고 있다. 이 방법을 이용함에 있어, 포격되는 식물의 종류 및 조직에 따라 DNA가 식물세포로 침투될 수 있는 최적조건은 다르며 입자의 크기 및 밀도, DNA의 양 및 피복 방법, 그 외 DNA로 피복된 입자의 발사 속도 및 발사 횟수 등 여러 요소들이 작용할 수 있고 이에 대한 최적조건의 확립이 매우 중요하다. 또한, 이 방법은 일반적으로 모든 조직에 적용 가능하나 세포분열이 활발하고 재분화 능력이 있는 조직을 이용하는 것이 유리하다. 분열조직이나 어린 잎, 그리고 배발생 현탁 배양액과 같은 조직을 이용하여 성공적으로 형질전환 식물체를 얻은 사례가 다수 보고 되었다. 이와 같이, 아그로박테리움 공동 배양법이나 입자 포격을 이용한 식물 형질전환 방법은 식물의 재생 (regeneration) 과정이 필수적으로 필요하다. 따라서 재분화 방법이 잘 확립되어 있지 않거나 재분화 시간이 상당히 오랜 식물의 경우 이들 방법을 적용하기 어려운 단점이 있다. 또한 종종 재분화된 식물에서 체세포변이 (somaclonal variation)가 나타나는 문제점이 있으며, 유전적 안정성 (genetic stability)이 현격히 떨어진다. 따라서 형질전환 과정에서 나타나는 원하지 않는 유전적 변이가 조직배양 과정 중 유도되는 것인지, 체세포에 이미 존재하던 돌연변이의 결과인지 확인하여야 할 필요가 있으며, 만약 변이가 조직배양 과정 중에 발생한다면 돌연변이 유발단계를 찾아 이를 최소화하거나 방지할 수 있는 방법을 연구하고, 이미 존재하는 돌연변이의 경우에는 돌연변이 세포가 재분화 되는 것을 선택적으로 방지할 수 있도록 적절한 조절기구를 마련해야 한다. 그러므로 체세포 돌연변이를 최소화하고자 하는 요구는 기내배양을 거치지 않고 손상되지 않은 조직 절편 내로 유전자를 전이시켜 재분화 시킴으로써 조직 배양 단계를 없애거나 최소화하는 새로운 형질전환 방법의 개발을 필요로 한다.

인플란타 (In-planta) 형질전환 방법은 조직배양 및 재생과정 없이 형질전환 식물체를 수득할 수 있는 방법으로서 제시되었다. 이 방법은 식물의 생장점 또는 분열조직 (meristem)에 위치하는 세포들을 형질전환시킨 후 형질전환된 세포로부터 재분화 하는 줄기로부터 형질전환된 종자를 수득하거나, 부정근을 수득하는 방법이다. 분열조직을 형질전환시키기 위한 방법으로서, 진공을 이용한 형질전환법 (Vaccum infiltration method), 화아침지법 (Floral meristem dipping method), 아그로박테리움 분사법 (Agrobacteria spraying method) 등이 개발되었다. 이 방법은 아라비돕시스 (Arabidopsis)에서 가장 잘 확립되었다. 구체적으로, 화분에 있 는 식물체의 분열조직에 직접 아그로박테리움을 도입시킨 후 이 식물체로부터 생산된 종자를 선별 배지에 배양하여 형질전환체를 선발한다. 아그로박테리움의 T-DNA가 생식세포의 염색체로 삽입되고 다음 세대로 전달되어 형질 전환체가 나타난다. 한편, 아그로박테리움을 사용하지 않고, 수분시킨 꽃의 화주에 외래 유전자 DNA를 도포함으로서 형질전환된 종자를 얻는 방법이 벼 및 담배에서 1992년에 보고된 바 있다 (참고문헌: Langridge, P. et al. (1992) Transformation of cereals via Agrobacterium and the pollen pathway: a critical assessment, Plant J. 2:631-638). 이 방법에 따르면, 식물의 수분 과정에서 화분의 핵이 통과하는 화분관 (pollen tube pathway)이 형성되는데, 화분관이 형성되고 있는 암술의 주두를 절단하고 DNA를 직접 도입시켜 형질전환된 종자를 수득할 수 있다.

이와 같이, 종래의 식물체 형질전환 방법은 적용 가능한 식물체가 한정되어 있고, 형질전환 단계 및 조직배양 단계의 번거로움 또는 재분화 및 재생 과정에서의 체세포변이 등의 문제, 다음 세대로의 형질의 전달율의 저하 등의 문제점이 있어 단백질 등의 대량 생산을 위한 생물반응기로서 이용하기에 충분하지 못하다. 따라서 형질전환에 이용할 수 있는 새로운 식물종의 선택, 유전적으로 안정적이며 단백질 등 목적물질을 대량으로 생산할 수 있는 효율적인 형질전환 시스템의 개발 등에 대한 요구는 분자농업 분야에서 지속되고 있다.

본 발명은 단위영양생식 모체발아식물 (viviparous plant)을 단백질 등 목적물질의 생산을 위해 형질전환시켜 이용함으로써 상기 종래 분자농업 기술이 지니고 있는 문제점을 해결하기 위한 수단을 제공한다. 수분과 수정과정을 거치지 않고 완전한 새로운 개체를 생성하는, 무성영양생식으로 번식하는 식물에 대한 형질전환 및 이를 이용한 목적물질의 생산은 종래 분자농업분야에서 연구된 바 없는 것으로서, 목적물질의 안정적인 생산에 필수적인 유전형질의 세대간 균일성을 획기적으로 높일 수 있을 뿐만아니라 목적물질의 대량 생산을 가능하게 한다. 그러므로, 분자농업에서 단위영양생식으로 번식하는 식물체를 이용하면 특정 지역 및 환경에 적합한 식물체에 형절전환시킨 유전자형을 빠르게 고정시킴으로써 목적물질을 저렴하게 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명은 무성생식에 의해 번식하는 식물체를 유전 물질 (genetic materials)로 형질전환시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 단위영양생식에 의해 번식하는 모체발아식물 (viviparous plant)을 in vivo 형질전환 시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 단백질 등 목적 물질을 생산하기 위한 생물반응기로서 형질전환된 단위영양생식에 의한 모체발아식물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 형질전환된 단위영양생식에 의한 모체발아식물로부터 단백질 등 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 다년생 모체발아 식물로서 바이오매스가 큰 식물을 분류 선택하였다. 무성번식하는 다년생 모체발아식물은 완전히 분화된 자손 식물체, 어린식물 (plantlets, bulbils or gemmae)을 통해 번식하 며, 이들 식물체의 어린식물 형성 부위에 목적 물질을 발현하는 유전자를 코딩하는 DNA를 도입한 결과 형질전환된 어린 식물이 생성되었음을 확인하였다.

일 구체예에서, 모체발아식물로서 돌풀나무과 (Crassulaceae)에 속하는 카랑코에 (Kalanchoe) 또는 브리오필룸 (Bryophyllum) 을 사용하였다. 성숙한 식물의 잎 중 어린식물이 생성되지 않은 잎을 선택하고 잎자루를 포함한 잎을 수확 한 후, 어린식물이 발생하는 위치인 잎의 가장자리의 톱니모양 부위에 지름 0.2 mm의 텅스텐 핀을 이용하여 5 내지 10회 상처를 낸다. 핀에 의해 상처가 난 부분을 3 내지 5분간 방치한 뒤, 상처 난 부분에 아그로박테리움 현탁액을 1 내지 2방울 도포한 후 1500 lux, 약 25℃의 배양조건에서 5일 내지 10일간 배양한 다음 잎의 톱니 모양 부분에서 자라나온 무성영양번식 개체를 형질전환체의 선발에 사용한다. 이들 식물에서 어린식물이 발생하는 조직 부위에 대한 in situ 외래 유전자의 도입은 형질전환된 완전한 하나의 새로운 개체를 제공하였고, 이는 추가의 조직배양, 재생 및 재분화 과정 없이 형질전환 식물체를 수득할 수 있음을 제시한다.

다른 일 구체예에서 모체로부터 분리된 어린식물을 in situ 형질전환시켰다. 노지에서 재배한 식물로부터 이미 자연상태에서 생산된 무성영양번식 개체 중 길이 10 내지 15 mm 범위의 개체를 수확하고, 수확된 개체들의 기공을 최대한 열어주기 위하여 밀폐된 용기에 담고 충분한 수분을 공급하여 20 내지 30시간 동안 25℃에서 암배양을 수행한다. 암배양된 개체를 유리 비이커에 담고, 아그로박테리움 현탁액을 개체가 모두 잠길 수 있도록 가한다. 다음, Silwet L-77을 약 150 내지 250 ㎕/L로 가하고 탱크에 넣은 후 370 내지 450 mmHg/㎝의 압력으로 30분 동안 진공상 태를 유지시킨다. 30분 경과 후 진공상태를 급격하게 제거시켜 압력을 가하고, 개체를 현탁액에서 건져내어 3 MM paper에서 과하게 묻어있는 현탁액을 제거한다. 10 내지 20분간 공기-건조시킨 후에 3 MM 페이퍼가 깔려있는 페트리디쉬에 개체를 옮기고 뚜껑을 닫아 외부로 습기가 빠져나가지 않도록 파라필름으로 봉한다. 페트리디쉬를 다시 25℃에서 20 내지 30시간 암배양 한 뒤, 정상적인 개체만을 선발하여 이후 실험에 사용한다.

또한 일 구체예에서 형질전환된 모체발아 식물로부터 무성번식에 의해 생성되는 자손식물이 형질전환된 모체 식물과 동일한 유전형질을 지니고 있음을 확인하였다.

유전자의 도입 여부는 GFP 형광 검증 및 PCR 방법 (지놈 PCR 및 RT-PCR)을 통해 확인하였다. GFP 형광 검증은 380 nm의 UV 램프를 암실에서 조사하여, 도입된 GFP 형광의 발현을 관찰하였다. GFP 발현이 확인된 개체는 각각 독립된 화분에 옮기고, 개체마다 번호를 매겨 관리하여 새로운 세대로 세대교번이 일어나도록 재배한 뒤, 마찬가지의 방법으로 T₁ (제 2세대) 및 T₂ (제 3 세대)까지 선발, 확인하였다. 또한, 유전자 도입 여부를 세포 및 조직 수준에서 관찰하기 위해, 형질전환된 개체의 잎 부분을 절단한 후 공초점 현미경을 이용하여 460 nm의 UV 하에서 관찰하였다. 또한, 지놈 PCR 및 RT-PCR을 수행하여 유전자 도입 여부를 확인하였다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 기술된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예

실시예 1 실험 식물체 및 벡터의 제조

단위영양생식에 의해 번식하는 식물체 중에서 카랑코에 (Kalanchoe) 또는 브리필룸 (Bryphyllum) 속에 속하는 식물로서 카랑코에 피나타 (K. pinnata), 카랑코에 다이그레몬티아눔 (K. daigremontianum) 및 카랑코에 투비플로라 (K. tubiflora)를 사용하였다. 카랑코에 피나타 및 카랑코에 다이그리몬티아눔, 카랑코에 투비플로라는 북아프리카 마다가스카르 원산지로서 실험용 항온, 항습실에서 재배한 3개월 미만의 지상으로부터 길이 20 cm를 정도 성장한 개체를 실험에 사용하였다.

실시예 2 진공삽입 (vacuum infiltration)에 의한 형질전환

진공 삽입을 위해 먼저 상기 실시예 1에서 준비한 카랑코에 식물 종들의 잎의 가장자리로부터 크기 약 10 mm의 어린식물 (plantlet)을 수확하였다. 외래 DNA를 도입하기 위한 벡터로서 pCAMBIA1303 벡터 (입수처: Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture) (도 1) (서열번호: 1) 를 사용하였다. pCAMBIA1303 벡터는 선택성 마아커로서 하이그로마이신 (hygromycin) 내성 유전자와 카나마이신 (Kanamycin) 내성 유전자, 리포터 유전자로서 GUSA:GFP를 포함하였다. pCAMBIA1303 벡터는 항생제 적용범위가 넓고 두 개의 리포터 유전자를 지니므로 유전자 삽입여부의 확인에 용이하다. pCAMBIA1303 벡터가 함유된 아그로박테리아를 YEP배지 500 ml에서 2일 동안 27℃로 진탕 배양하였다. 다음 배양 된 아그로박테리아를 원심분리 튜브에 옮기고 2,500 rpm으로 15분간 원심분리하여 배지를 제거하여 아그로박테리아를 분리한 후 이를 0.5 g/l의 MES가 첨가된 MS 배지 200 mL에 현탁시켰다. 이 현탁액에 200 ㎕/L의 Silwet (catalog# vis-01) (등록상표명)을 첨가했다. 다음, 모체에서 발근까지 이루어진 어린 개체를 수확하여 제조된 현탁액에 담구고 400 mmHg 압력의 진공에서 30분간 유지시킨 이후 급격히 압력을 해제하고 3MM paper를 깔은 패트리디쉬에 펼치고 이를 25℃ 암 인큐베이터에서 1일간 배양했다. 1일 후 생성된 개체 중 잎의 형태가 정상적인 것을 취하여 화분으로 이식했다.

실시예 3 핀 프릭클 ( pin prickle ) 방법에 의한 형질전환

상기 실시예 2에서 제조한 아그로박테리아 배양액을 사용하였다. 실시예 1에서 선별한 식물 종의 성숙한 잎의 가장자리 부분에 텅스텐 핀으로 스트레스를 가한 후, 배양액을 도포한 다음 25℃ 광 배양기에서 새로운 어린 식물이 형성될 때까지 배양했다. 약 1주일 후에 발근이 이루어진 개체로서 새로운 개체가 생성된 것을 확인 한 후 이를 화분에 이식했다.

실시예 4 형질전환의 확인

i) GFP 형광검증

실시예 2 및 3의 형질전환된 식물에 대해 380 nm의 UV 램프를 암실에서 조사하고, 도입된 GFP 형광의 발현을 육안 관찰하였다. GFP 발현이 확인된 개체를 각각 독립된 화분에 옮긴 후 개체마다 번호를 매기고 새로운 세대로 세대교번이 일어나도록 재배하였다. 마찬가지의 방법으로 T₁ (제 2세대) 및 T₂ (제 3 세대)까지 선 발, 확인하였다. GFP 형광 검증은 380 nm의 UV 램프를 암실에서 조사하여, 도입된 GFP 형광의 발현을 관찰하였다. GFP 발현이 확인된 개체는 각각 독립된 화분에 옮기고, 개체마다 번호를 매겨 관리하여 새로운 세대로 세대교번이 일어나도록 재배한 뒤, 마찬가지의 방법으로 T1 (제 2세대) 및 T2 (제 3 세대)까지 선발, 확인하였다. 또한, 유전자 도입 여부를 세포 및 조직 수준에서 관찰하기 위해, 형질전환된 개체의 잎 부분을 절단한 후 공초점 현미경을 이용하여 460 nm의 UV 하에서 관찰하였다. 도 2a 내지 도 2c는 카랑코에 피나타에 대한 결과로서, 섹션 1은 UV 선, 섹션 2는 배경, 섹션 3은 정상 가시광선, 섹션 4는 혼합광선을 나타낸다.

ii) 지놈 PCR (genomic PCR) 수행

지놈 PCR 및 RT-PCR을 수행하여 유전자 도입 여부를 확인하였다. 용해 완충액 (lysis buffer)을 사용하여 식물의 지놈 DNA를 추출하였다. 추출한 지놈 DNA를 BamHI 및 HindⅢ로 처리하고, 37℃ 항온수조에서 45분간 반응시킨 후, 37℃ 항온 배양기에서 3시간 반응시켰다. 절단된 지놈 DNA 3 ㎕ 내지 5 ㎕ 넣고 GUS 프라이머 [left: ctgatagcgcgtgacaaaaa (서열번호 : 2) 및 right: ggcacagcacatcaaagaga (서열번호: 3)] 및 GFP 프라이머 [left: tcaaggaggacggaaacatc (서열번호: 4) 및 right: aaagggcagattgtgtggac (서열번호: 5)]를 가한 후 증류수 5 ㎕를 가하고, PCR-프리믹스 (premix) 10 ㎕를 넣어 PCR을 수행하였다. PCR은 i) 95℃에서 10분, ii) 94℃에서 30초, iii) 56℃에서 30초, iv) 72℃에서 30초간 수행한 다음 ii) 내지 iv) 과정을 30회 반복한 후 72℃에서 약 10분간 반응시켜 완성하였다. 도 3a는 카랑코에 피나타에서 GUS 프라이머를 사용한 결과를 나타내고, 도 3b는 카랑코에 피나타에서 mGFP5 프라이머를 사용한 결과를 나타낸다.

iii) RT (Reverse transcription)-PCR의 수행

먼저 식물 총 RNA를 열추출 (hot-extraction) 방법 (참고문헌: T.C. Verwoerd, B.M. Dekker, and A. Hoekema (1989) A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs. Nucl. Acids. Res 17: 2362)으로 추출하였다. 대상 조직을 액체질소에서 급속 냉동시킨 후 막자사발에서 곱게 갈고 2 ㎖ E-튜브에 옮겼다. 여기에 약 80℃로 가열한 500 ㎕의 추출 버퍼 [페놀 : 0.1 M LiCl, 100 mM Tris-HCl, pH=8.0), 10 mM EDTA, 1% SDS (1:1)]를 가한 후 교반한 후 250 ㎕ 클로로포름-이소아밀알코올 (chloroform-isoamylalchol) (24:1)을 가하고 다시 교반하였다. 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 튜브에 옮겼다. 다음 동량의 4 M LiCl을 가하고 14시간 동안 실온에서 반응시킨 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 수득하였다. 침전물을 150 ㎕의 디에틸파이로카보네이트 (diethyl pyrocabonate)(DEPC)가 처리된 증류수에 용해시키고 0.1 부피의 3 M 아세트산나트륨과 총 부피의 2배의 100% 에탄올을 가하고 -4℃ 냉동고에서 3시간 동안 반응시켰다. 다음 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 수득하고 50 ㎕의 DEPC 처리 증류수에 녹여 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 정제된 총 RNA의 농도를 분광분석기를 통하여 측정한 뒤 5 ㎍이 함유될 수 있도록 DEPC 처리된 증류수에 전체 부피가 10.5 ㎕가 되도록 희석시켜 0.5 ㎖ E-tube에 보관하였다. 다음 10 pM 올리고-dT 3.0 ㎕를 첨가하고 PCR 써모사이클러 (thermocycler) (PTC-0200, MJ Research)로 70℃에서 10분간 열을 가한 후 4℃로 냉각한 후 2.5 mm dNTPs 6.0 ㎕와 5 X 반응 완충액 5.0 ㎕를 가했다. 이후 37℃로 재가열하여 10분간 반응시키고 다시 4℃로 냉각했다. 다음 200 U/㎕의 역전사효소 0.5 ㎕를 가한 후 37℃에서 1시간동안 반응 시켰다. 후속하여 70℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 합성한 후 4℃에서 보관했다. cDNAs의 증폭을 위해 합성된 cDNA 3.0 ㎕, 10 pM 유전자 특이 프라이머 5`부위와 3`부위를 각각 1.0 ㎕씩, 2.5 mM dNTPs 2.5 ㎕과 멸균증류수 10 ㎕를 넣고, 2.0 ㎕의 10 X 반응 완충액, taq 중합효소 0.5 ㎕를 첨가하여 PCR 써모사이클러 (PTC-0200, MJ Research)로 PCR을 수행하였다. GUS 프라이머 [left: ctgatagcgcgtgacaaaaa (서열번호: 2) 및 right: ggcacagcacatcaaagaga (서열번호: 3)] 및 GFP 프라이머 [left: tcaaggaggacggaaacatc (서열번호: 4)및 right: aaagggcagattgtgtggac (서열번호: 5)]를 PCR에 사용하였다. PCR은 각각 i) 95℃에서 10분, ii) 94℃에서 30초, iii) 56℃에서 30초, iv) 72℃에서 30초간 수행한 다음 ii) 내지 iv)를 30회 반복 수행한 후 72℃에서 약 10분간 수행하여 완성하였다. 도 4a 내지 4c는 각각 카랑코에 피나타, 카랑코에 다이그리몬티아눔 및 카랑코에 투비플로라에 대해 GUS 프라이머를 사용한 RT-PCR 결과를 나타낸다. GFP 및 GUS 유전자를 사용하여 측정한 결과, 본 발명에 따르면 본 발명에 사용된 식물이 다음 자손세대는 물론 그 이후의 세대 (T₁ 및 T₂)까지도 외래 유전자를 안정적으로 발현하고 있음을 확인 할 수 있다. 표 1 및 표 2는 각각 진공삽입법 및 핀프릭클법에 의한 형질전환 효율을 나타낸 것이다.

표 1 진공삽입법에 의한 형질전환 효율

	카랑코에 피나타	카랑코에 다이그리몬티아눔	카랑코에 투비플로라
P	150	150	150
T₀ ^*/P (효율%)	109.95/150 (73.30%)	109.20/150 (72.80%)	93.48/150 (62.32%)
T₁ ^/T₀ ^ (효율%)	145.25/150 (96.83%)	145.53/150 (97.02%)	144.66/150 (96.44%)

P: 형절전환에 사용된 개체 수

T₀ ^*: 형질전환된 제 1세대 개체 수

T₁ ^*: 형질전환된 제 2세대 개체 수

표 2 핀프릭클법에 의한 형질전환 효율

	카랑코에 피나타	카랑코에 다이그리몬티아눔	카랑코에 투비플로라
P	150	150	150
T₀ ^*/P (효율%)	126.24/150 (84.16%)	121.11/150 (80.74%)	116.73/150 (77.82%)
T₁ ^/T₀ ^ (효율%)	148.35/150 (98.90%)	146.43/150 (97.62%)	145.52/150 (97.01%)

P: 형절전환에 사용된 개체 수

T₀ ^*: 형질전환된 제 1세대 개체 수

T₁ ^*: 형질전환된 제 2세대 개체 수

이와 같이, 본 발명에 따르면 무성 영양번식 식물을 형진전환시킴으로써, 유전형질의 변이를 최소화하면서 목적 외래 물질을 생산하는 유전자를 식물에 도입할 수 있으므로, 종래 분자농업에 이용되던 방법과 비교할 때, 훨씬 낮은 비용으로 다량의 단백질 등을 제조할 수 있다.

<110> INVITROPLANT CO., LTD. <120> A TRANSFORMATION METHOD FOR VIVIPAROUS PLANT <130> IPC-23950 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12361 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCAMBIA1303 <400> 1 catggtagat ctgactagtt tacgtcctgt agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact 60 cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc agcgttggtg 120 ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt 180 cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat 240 accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg 300 caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata cgccatttga 360 agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg tttgtgtgaa 420 caacgaactg aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg aaaacggcaa 480 gaaaaagcag tcttacttcc atgatttctt taactatgcc ggaatccatc gcagcgtaat 540 gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc atgtcgcgca 600 agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg tcagcgttga 660 actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa ggcactagcg ggactttgca 720 agtggtgaat ccgcacctct ggcaaccggg tgaaggttat ctctatgaac tgtgcgtcac 780 agccaaaagc cagacagagt gtgatatcta cccgcttcgc gtcggcatcc ggtcagtggc 840 agtgaagggc caacagttcc tgattaacca caaaccgttc tactttactg gctttggtcg 900 tcatgaagat gcggacttac gtggcaaagg attcgataac gtgctgatgg tgcacgacca 960 cgcattaatg gactggattg gggccaactc ctaccgtacc tcgcattacc cttacgctga 1020 agagatgctc gactgggcag atgaacatgg catcgtggtg attgatgaaa ctgctgctgt 1080 cggctttcag ctgtctttag gcattggttt cgaagcgggc aacaagccga aagaactgta 1140 cagcgaagag gcagtcaacg gggaaactca gcaagcgcac ttacaggcga ttaaagagct 1200 gatagcgcgt gacaaaaacc acccaagcgt ggtgatgtgg agtattgcca acgaaccgga 1260 tacccgtccg caaggtgcac gggaatattt cgcgccactg gcggaagcaa cgcgtaaact 1320 cgacccgacg cgtccgatca cctgcgtcaa tgtaatgttc tgcgacgctc acaccgatac 1380 catcagcgat ctctttgatg tgctgtgcct gaaccgttat tacggatggt atgtccaaag 1440 cggcgatttg gaaacggcag agaaggtact ggaaaaagaa cttctggcct ggcaggagaa 1500 actgcatcag ccgattatca tcaccgaata cggcgtggat acgttagccg ggctgcactc 1560 aatgtacacc gacatgtgga gtgaagagta tcagtgtgca tggctggata tgtatcaccg 1620 cgtctttgat cgcgtcagcg ccgtcgtcgg tgaacaggta tggaatttcg ccgattttgc 1680 gacctcgcaa ggcatattgc gcgttggcgg taacaagaaa gggatcttca ctcgcgaccg 1740 caaaccgaag tcggcggctt ttctgctgca aaaacgctgg actggcatga acttcggtga 1800 aaaaccgcag cagggaggca aacaagctag taaaggagaa gaacttttca ctggagttgt 1860 cccaattctt gttgaattag atggtgatgt taatgggcac aaattttctg tcagtggaga 1920 gggtgaaggt gatgcaacat acggaaaact tacccttaaa tttatttgca ctactggaaa 1980 actacctgtt ccgtggccaa cacttgtcac tactttctct tatggtgttc aatgcttttc 2040 aagataccca gatcatatga agcggcacga cttcttcaag agcgccatgc ctgagggata 2100 cgtgcaggag aggaccatct tcttcaagga cgacgggaac tacaagacac gtgctgaagt 2160 caagtttgag ggagacaccc tcgtcaacag gatcgagctt aagggaatcg atttcaagga 2220 ggacggaaac atcctcggcc acaagttgga atacaactac aactcccaca acgtatacat 2280 catggccgac aagcaaaaga acggcatcaa agccaacttc aagacccgcc acaacatcga 2340 agacggcggc gtgcaactcg ctgatcatta tcaacaaaat actccaattg gcgatggccc 2400 tgtcctttta ccagacaacc attacctgtc cacacaatct gccctttcga aagatcccaa 2460 cgaaaagaga gaccacatgg tccttcttga gtttgtaaca gctgctggga ttacacatgg 2520 catggatgaa ctatacaaag ctagccacca ccaccaccac cacgtgtgaa ttggtgacca 2580 gctcgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg 2640 ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa 2700 ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat 2760 tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc 2820 gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg aattaaacta tcagtgtttg acaggatata 2880 ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg 2940 tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc aaccacaggg ttcccctcgg 3000 gatcaaagta ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca 3060 gtgcagccgt cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc 3120 gccctgccct tttcctggcg ttttcttgtc gcgtgtttta gtcgcataaa gtagaatact 3180 tgcgactaga accggagaca ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc 3240 tatgcccgcg tcagcaccga cgaccaggac ttgaccaacc aacgggccga actgcacgcg 3300 gccggctgca ccaagctgtt ttccgagaag atcaccggca ccaggcgcga ccgcccggag 3360 ctggccagga tgcttgacca cctacgccct ggcgacgttg tgacagtgac caggctagac 3420 cgcctggccc gcagcacccg cgacctactg gacattgccg agcgcatcca ggaggccggc 3480 gcgggcctgc gtagcctggc agagccgtgg gccgacacca ccacgccggc cggccgcatg 3540 gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc 3600 cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc 3660 accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa 3720 gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc 3780 gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc 3840 gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc 3900 accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg 3960 cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc 4020 tggccggttt gtctgatgcc 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gagcgcacgc agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg 4920 gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag 4980 ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag accattaccg agctgctatc tgaatacatc 5040 gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa 5100 aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg 5160 tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg 5220 cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac 5280 aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc 5340 agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc 5400 gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc 5460 ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg 5520 atagtcgcag catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg 5580 gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg 5640 gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat 5700 ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg 5760 ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg 5820 tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca 5880 agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg 5940 taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc 6000 gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga 6060 tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag 6120 aagccagatg gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga 6180 agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga 6240 aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg 6300 gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag 6360 gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc 6420 cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt 6480 cacacatgta agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt 6540 taaaacttat taaaactctt 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tcttcccagt tttcgcaatc cacatcggcc agatcgttat 8280 tcagtaagta atccaattcg gctaagcggc tgtctaagct attcgtatag ggacaatccg 8340 atatgtcgat ggagtgaaag agcctgatgc actccgcata cagctcgata atcttttcag 8400 ggctttgttc atcttcatac tcttccgagc aaaggacgcc atcggcctca ctcatgagca 8460 gattgctcca gccatcatgc cgttcaaagt gcaggacctt tggaacaggc agctttcctt 8520 ccagccatag catcatgtcc ttttcccgtt ccacatcata ggtggtccct ttataccggc 8580 tgtccgtcat ttttaaatat aggttttcat tttctcccac cagcttatat accttagcag 8640 gagacattcc ttccgtatct tttacgcagc ggtatttttc gatcagtttt ttcaattccg 8700 gtgatattct cattttagcc atttattatt tccttcctct tttctacagt atttaaagat 8760 accccaagaa gctaattata acaagacgaa ctccaattca ctgttccttg cattctaaaa 8820 ccttaaatac cagaaaacag ctttttcaaa gttgttttca aagttggcgt ataacatagt 8880 atcgacggag ccgattttga aaccgcggtg atcacaggca gcaacgctct gtcatcgtta 8940 caatcaacat gctaccctcc gcgagatcat ccgtgtttca aacccggcag cttagttgcc 9000 gttcttccga atagcatcgg taacatgagc aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg 9060 ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc 9120 cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt gtggtgtaaa caaattgacg 9180 cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta 9240 attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga 9300 tagaagtatt ttacaaatac aaatacatac taagggtttc ttatatgctc aacacatgag 9360 cgaaacccta taggaaccct aattccctta tctgggaact actcacacat tattatggag 9420 aaactcgagc ttgtcgatcg acagatccgg tcggcatcta ctctatttct ttgccctcgg 9480 acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact tctacacagc catcggtcca 9540 gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc cggatcggac 9600 gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg aaattgccgt caaccaagct 9660 ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc cggagtcgtg gcgatcctgc 9720 aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc tccatacaag ccaaccacgg 9780 cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc ccgaacatcg cctcgctcca 9840 gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca ttgttggagc cgaaatccgc 9900 gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct catcgagagc 9960 ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc catcacagtt tgccagtgat acacatgggg 10020 atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc cttgcggtcc 10080 gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat ccatagcctc 10140 cgcgaccggt tgtagaacag cgggcagttc ggtttcaggc aggtcttgca acgtgacacc 10200 ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgcta aactccccaa tgtcaagcac 10260 ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat ctttgtagaa 10320 accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc cctcctacat cgaagctgaa 10380 agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg gagacgctgt cgaacttttc 10440 gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc tttttcatat ctcattgccc 10500 cccgggatct gcgaaagctc gagagagata gatttgtaga gagagactgg tgatttcagc 10560 gtgtcctctc caaatgaaat gaacttcctt atatagagga aggtcttgcg aaggatagtg 10620 ggattgtgcg tcatccctta cgtcagtgga gatatcacat caatccactt gctttgaaga 10680 cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg 10740 accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt 10800 gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg 10860 gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc 10920 ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt 10980 atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 11040 cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc 11100 ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt 11160 gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg 11220 ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat tcttggagta 11280 gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttggc aagctgctct agccaatacg caaaccgcct 11340 ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 11400 gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 11460 ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 11520 acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga 11580 gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 11640 aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 11700 taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 11760 atgctagagc agcttgagct tggatcagat tgtcgtttcc cgccttcagt ttagcttcat 11820 ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg gcgaacagtt 11880 catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca tggtggagca 11940 cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 12000 tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 12060 ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 12120 cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 12180 cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 12240 ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 12300 agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactcttga 12360 c 12361 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS Primer - left <400> 2 ctgatagcgc gtgacaaaaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GUS Primer - right <400> 3 ggcacagcac atcaaagaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP Primer - left <400> 4 tcaaggagga cggaaacatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Genome PCR <400> 5 aaagggcaga ttgtgtggac 20

Claims

i) 단위영양생식 (vegetative apomixis) 모체발아식물 (viviparous plant)을 배양하는 단계;

ii) 모체발아식물의 어린 식물 (plantlet) 생성 부위에 단백질, 항체 및 펩타이드를 포함하는 목적물질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 삽입하는 단계;

iii) 단계 ii)의 모체발아식물을 배양하여 어린 식물을 수득하는 단계; 및

iv) 어린 식물을 배양하는 단계를 포함하는 모체발아식물의 어린 식물을 형질전환하는 방법.
i) 단위영양생식 모체발아식물을 배양하는 단계;

ii) 모체발아식물로부터 어린 식물을 분리하는 단계;

iii) 분리된 어린식물에 단백질, 항체 및 펩타이드를 포함하는 목적물질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 삽입하는 단계; 및

iv) 단계 iii)의 어린 식물을 배양하는 단계를 포함하는 모체발아식물의 어린 식물을 형질전환하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,

모체발아식물이 카랑코에 (Kalanchoe) 또는 브리오필룸 (Bryophyllum) 임을 특징으로 하는 방법.
i) 단위영양생식 모체발아식물 (viviparous plant)을 배양하는 단계;

ii) 모체발아식물의 어린 식물 (plantlet) 생성 부위에 단백질, 항체 및 펩타이드를 포함하는 목적물질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 삽입하는 단계;

iii) 단계 ii)의 모체발아식물을 배양하여 어린 식물을 수득하는 단계;

iv) 어린 식물을 배양하여 형질전환 식물을 수득하는 단계; 및

v) 형질전환식물로부터 목적물질을 분리, 정제하는 단계를 포함하는 모체발아식물의 어린 식물로부터 목적물질을 수득하는 방법.
i) 단위영양생식 모체발아식물을 배양하는 단계;

ii) 모체발아식물로부터 어린 식물을 분리하는 단계;

iii) 분리된 어린식물에 단백질, 항체 및 펩타이드를 포함하는 목적물질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 삽입하는 단계;

iv) 단계 iii)의 어린 식물을 배양하여 형질전환식물을 수득하는 단계; 및

v) 형질전환식물로부터 목적물질을 분리, 정제하는 단계를 포함하는 모체발아식물의 어린 식물로부터 목적물질을 수득하는 방법.
삭제
제 4항 또는 제 5항에 있어서,

모체발아식물이 카랑코에 (Kalanchoe) 또는 브리오필룸 (Bryophyllum) 임을 특징으로 하는 방법.
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