MXPA00001427A

MXPA00001427A - Secuencias de nucleotidos frazzled, productos de expresion, composiciones y usos.

Info

Publication number: MXPA00001427A
Application number: MXPA00001427A
Authority: MX
Inventors: Janet Paulsen
Original assignee: Inst Genetics Llc
Priority date: 1997-07-11
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2005-01-25
Also published as: DE69832880D1; AU751803B2; ATE494375T1; DE69842091D1; WO1999002679A1; ATE313627T1; EP1591526B1; EP1000143B1; AU7363198A; US6165748A; JP2001509382A; JP2009142287A; EP1000143A1; EP1591526A3; DE69832880T2; EP1591526A2

Abstract

Se describen proteinas Frazzled purificadas, incluyendo WG67-16, WG67-19 y WA628 y los proceso para su fabricacion. Tambien se describen moleculas de ADN que codifican para las proteinas Frazzled, incluyendo WG67-16, WG67-19 y WA628. Las proteinas pueden ser usadas en la modulacion de la union de genes Wnt a sus receptor. Ellas son utiles en la modulacion de la formacion, crecimiento, diferenciacion, proliferacion y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y organos adultos y embrionarios. Tambien ellas son en el tratamiento de varios desordenes asociados con defectos en la formacion, crecimiento, diferenciacion, proliferacion y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y organos adultos y embrionarios, incluyendo, por ejemplo, tejidos hematopoleticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreaticos, hepaticos, del brazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y organos. Ademas, las proteinas pueden ser usadas para inducir la formacion, crecimiento, diferenciacion, proliferacion y/o mantenimiento de tejidos hematopoieticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares y cerebrales y de condorcitos y/o tejido cartilaginoso, y para reparacion de otros tejidos, tal como la reparacion de tejido pancreatico. Estas proteinas tambien son utiles para aumentar la actividad de otros factores de regeneracion y diferenciacion de tejidos y organos.

Description

i SECUENCIAS DE NUCLEÓTEDOS FRAZZLED, PRODUCTOS DE EXPRESIÓN, COMPOSICIONES Y USOS s Campo de la Invención La presente invención se refiere a la familia de proteínas Frazzled; al ADN que codifica para los miembros de esta familia, a procesos para obtenerlas y a métodos para utilizarlas. Estas proteínas pueden ser usadas para inducir la expresión de factores en y/o la diferenciación de varios tejidos y órganos y, particularmente, en la inducción de la 10 formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de varios tejidos y órganos. Las proteínas son útiles en el tratamiento de diversos desordenes asociados con _ defectos en la formación celular, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de estos diversos tejidos y órganos incluyendo, por ejemplo, cerebro, pulmón, páncreas, hígado, bazo, riñón, intestinos y/u otros tejidos y órganos. Las proteínas 15 también son útiles en la modulación de la formación celular, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de tejidos y órganos. Estas proteínas también son útiles para incrementar la actividad de otros factores de regeneración y diferenciación de tejidos y órganos. En particular, las proteínas son útiles en la modulación de la hematopoiesis y en la modulación del desarrollo de tejidos del intestino, neuronal, del cerebro y muscular. 20 Antecedentes de la Invención La búsqueda de moléculas responsables de la formación, proliferación, diferenciación y mantenimiento de tejidos y órganos, tales como los tejidos hematopoiéticos, intestinales, neuronales, del cerebro y musculares, ha sido extenso y existe una gran necesidad de factores útiles para el tratamiento de condiciones que involucran la degradación o daño de estos tejidos, así como varios desórdenes asociados con defectos en estos procesos. La presente invención se relaciona con una familia de proteínas designadas como Frazzled, familia la cual comparte homología con el dominio de unión a ligando de la familia de las proteínas Frizzled. 30 Previamente han sido descubiertas las estructuras de diversas proteínas codificadas por una familia de genes designada como frizzled. Se ha demostrado que los miembros de la familia de proteínas Frizzled se unen a la proteína Wingless (Wn), el prototipo Drosophila de la familia de la Wnt. Bhanot et al., Nature, 382:225-230 (1996). En mamíferos y otras especies, la familia Frizzled de proteínas son moléculas de receptor unidas a membrana, las cuales se unen a proteínas producidas por la familia de los genes wnt. Wang et al., J. Biol. Chem., 271:4468-4476 (1996). Los genes Wnt juegan múltiples papeles en la proliferación y diferenciación celular y son expresados en una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios, por ejemplo, cerebro, pulmón, páncreas, hígado, bazo, riñón, intestinos y/u otros tejidos y órganos. Se han identificado varios genes relacionados con las Frizzled (frzbs), los cuales codifican para proteínas que semejan Frizzleds, esto es, receptores que carecen de la mayoría del (los) dominio(s) de transmembrana. Se ha postulado que los Frzbs funcionan como antagonistas solubles de las señales de Wnt. Hoang, et al., JBC 271:26131 (1996). identificó un homólogo de frizzled (el cual ellos denominaron como frzb) expresado principalmente en los núcleos cartilaginosos de huesos de largo desarrollo que se demostró estaban involucrados en la morfogénesis del esqueleto de los mamíferos. A diferencia de los genes que codifican para la familia de proteínas Frizzled, el gene de frzb no contiene siete dominios de transmembrana. Los Frzbs de bovino y humano son 94% idénticos. Ratner, et al., PNAS 94:2859 (1997) identificó en bibliotecas de ADNc de ojos de ratón tres secuencias de ADN que codifican para proteínas relacionadas con frizzled, secretadas (sFRP-1, SFRP-2 y sFRP-3). Wang et al., Cell 88:757 (1997), aisló un homólogo de Xenopus de Frzb conteniendo un motivo Frizzled con terminación amino y el cual era soluble y secretable. También se encontró que se unía e inhibía Wnt-8 (un inductor ventral) y que actuaba como un inhibidor funcional de la señalización de Wnt a través de la unión extracelular directa. Leyns, et al., Cell 88:747 (1997), han identificado una proteína secretada, Frzb-1, conteniendo también similitud de secuencia al dominio extracelular de Frizzled.

Objetivos de la Invención La presente invención provee nuevas secuencias de ADN que codifican para nuevos miembros de una novedosa familia de proteínas denominada Frazzled. En modalidades particulares, la presente invención provee nuevas secuencias de ADN que codifican para proteínas Frazzled incluyendo, pero no limitadas a WG67-16, WG67-19 y WA628. En el Listado de Secuencias se proporcionan las secuencias de nucleótidos y las correspondientes f - secuencias de aminoácidos codificados por estas secuencias de ADN. En particular, la presente invención comprende secuencias de ADN aislado, codificando para una proteína 5 Frazzled que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en: nucleótidos #44 a #889 de la SEQ ID NO: 1; nucleótidos #8 a #850 de la SEQ ID NO: 3; y nucleótidos #80 a #967 de la SEQ ID NO: 5; así como también secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13-18; así como también fragmentos y vanantes de las anteriores secuencias de nucleótidos 10 y de aminoácidos que son susceptibles de ser obtenidos fácilmente a partir de lo anterior, y los cuales retienen actividad de Frazzled. La presente invención además comprende secuencias que hibridan a estas secuencias bajo condiciones de hibridación astringentes y que codifican para una proteína que presenta actividad de Frazzled. En una modalidad que actualmente se prefiere, estas secuencias hibridan a la SEQ ID NO: 15, 16, 17 y/o 18 bajo 13 condiciones de hibridación astringentes que incluyen, por ejemplo, el uso de condiciones iniciales de hibridación de baja astringencia (tal como 6X SSC, 0.5% SDS, a aproximadamente 60 °C, durante toda la noche, lo cual es seguido por una condición de lavado de alta astringencia (tal como 2XSSC, 0.1% SDS, a aproximadamente 20 °C) o aún lavado de más alta astringencia (tal como 0.1 XSSC, 0.1% SDS, a aproximadamente 65 °C, 20 por menos de una hora). La presente invención también provee métodos para la formación, proliferación, diferenciación y mantenimiento de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios incluyendo, por ejemplo, tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primario, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, renales, 25 intestinales y/u otros tejidos y órganos. También las proteínas de la invención pueden ser usadas para inducir la expresión de factores en y/o diferenciación de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios y, particularmente, para inducir la formación, crecimiento, proliferación, diferenciación y/o mantenimiento de varios tejidos y órganos. Específicamente, la invención provee métodos para inducir la formación de tejidos 30 hematopoiéticos, del tubo digestivo primario, neuronales, cerebrales y musculares, los cuales comprenden la administración a células progemtoras de una composición que comprende cuando menos una proteína que es un miembro de la familia de proteínas Frazzled. Las proteínas de la invención son útiles en el tratamiento de varios desórdenes asociados con defectos en la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios que incluyen, por ejemplo, tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primario, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, del bazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Ellas también son útiles en la modulación de la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios. Estas proteínas también son útiles para aumentar la actividad de otros factores de regeneración y diferenciación de tejidos y órganos. En modalidades preferidas, las composiciones útiles en estos métodos pueden comprender una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 4 y/o 6, así como también una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, 14, 1S, 16, 17 y/o 18. En una modalidad, el método comprende la administración de la composición a un paciente in vivo. Alternativamente, el método puede comprender la administración de la composición a células in vitro y la recuperación de tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, cerebro y músculo, los cuales pueden subsecuentemente ser administrados a un paciente. La composición además puede comprender un portador apropiado para la administración. En otras modalidades, la presente invención comprende vectores que comprenden las moléculas de ADN anteriores en asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello, asi como células hospederas transformadas con estos vectores. En todavía otras modalidades, la presente invención comprende métodos para la producción de proteínas Frazzled purificadas, WG67-16, WG67-1 y WA628, y composiciones que contienen las proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628. Estos métodos pueden comprender las etapas de cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que codifica para una proteína Frazzled tal como se describió anteriormente, y recuperando y purificando dicha proteína Frazzled del medio de cultivo. La presente invención además comprende el polipéptido Frazzled purificado que se produce por los métodos anteriores, así como también polipéptidos Frazzled purificados tales como WG67-16, WG67-19 y WA628 comprendiendo una secuencia de aminoácidos codificada por las anteñores secuencias de ADN. Las proteínas de la presente invención pueden comprender las secuencias de aminoácidos o porciones de ellas de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18 o proteína Frazzled tal como WG67-16, WG67-19 o WA628 que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 kD, dicha proteína comprendiendo las secuencias de aminoácidos o porciones de ellas de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18 y poseyendo actividad de proteína Frazzled.

Descripción de las Secuencias La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de 2190 nucleótidos de WG67-16, la secuencia de codificación de desde #44 hasta #889. La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de 281 aminoácidos codificados por la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de 1140 nucleótidos de WG67-19, la secuencia de codificación de desde #84 hasta #850. La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de 280 aminoácidos codificados por la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de 1146 nucleótidos de WA628-5, la secuencia de codificación de desde #80 hasta #967. La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de 295 aminoácidos codificados por la SEQ ID NO: 5. La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de 502 nucleótidos de WG67-SP. La SEQ ID NO: 8 es un sitio de reconocimiento insertado. La SEQ ID NO: 9 es un sitio de reconocimiento insertado. La SEQ ID NO: 10 es un sitio de reconocimiento insertado. Las SEQ ID NO: 11 y 12 son secuencias de nucleótidos de los primarios usados en el aislamiento de las secuencias de nucleótidos de la invención. La SEQ ID NO: 13 es una secuencia de aminoácidos de consenso que comprende ciertas de las proteínas Frazzled de la invención en donde la primera Xaa equivale a Ala o Ser; la segunda Xaa equivale a Met o Leu; la tercera Xaa equivale a Tyr o Phe: y la cuarta Xaa equivale a lie o Val.

La SEQ ID NO: 14 es una secuencia de aminoácidos de consenso que comprende ciertas de las proteínas Frazzled de la invención en donde la primera Xaa equivale a Ser o He y la segunda Xaa equivale a Asp o Lys. Las SEQ ID NO: 15-17 son secuencias de aminoácidos de consenso que comprenden ciertas de las proteínas Frazzled de la invención. La SEQ ID NO: 18 es una secuencia de aminoácidos de consenso que comprende ciertas de las proteínas Frazzled de la invención en donde la primera Xaa equivale a Lys o Arg y la segunda Xaa equivale a Asn o His.

Descripción de los Depósitos Dos plásmidos, pWG67-16/CS2+ y pWG67-16/pED6, conteniendo la secuencia de codificación del ADN de WG67-16, fueron usados para transformar una cepa de E. Coli que fue depositada con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 el 9 de mayo de 1997. A este depósito le ha sido asignado el número de acceso ATCC 98432. Este depósito cumple con los requerimientos del Tratado de Budapest. Un plásmido, pWG67-19, que contiene la secuencia de codificación del ADN de WG67-19 fue usado para transformar una cepa de E. Coli que fue depositada con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 el 13 de mayo de 1997. A este depósito le ha sido asignado el número de acceso ATCC 98434. Este depósito cumple con los requerimientos del Tratado de Budapest. Un plásmido, pWA628-5, que contiene la secuencia de codificación del ADN de WA628 fue usado para transformar una cepa de E. Coli que fue depositada con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 el 9 de mayo de 1997. A este depósito le ha sido asignado el número de acceso ATCC 98430. Este depósito cumple con los requerimientos del Tratado de Budapest.

Descripción Detallada de la Invención Como se emplea aquí, el término "proteína Frazzled" se refiere a los miembros de la proteína Frazzled que comparten homología de secuencia para los dominios de unión extracelular de la familia de la proteína Frazzled, incluyendo aquellas codificadas por los genes ?ß3, Hfo5 y Hfe7, así como también con otras proteínas Frazzled, y miembros de proteína Frazzled encontrados en otras especies y que comparten homología de secuencia a las proteínas Frazzled procedentes de otras especies, tales como aquellas descritas en Wang et al., J. Biol. Chem, 271:4468-4476 (1996). Los miembros específicos de la familia de la proteína Frazzled incluye las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628, que poseen las secuencias de aminoácidos como se específica en la SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6 y/o las SEQ ID NOs: 13-18, así como homólogos de estas proteínas encontradas en otras especies. Las proteínas de la familia Frazzled también existen en otras especies, incluyendo miembros de familia en Drosophila, Xenopus, C. Elegans, pez cebra, así como también en ratas, ratones y humanos. Las "proteínas Frazzled" también incluyen variantes de las proteínas Frazzled, tales como variantes alélicas o variantes inducidas por mutagénesis o deleciones, y fragmentos de Frazzled o proteínas Frizzled cuyas variantes y f agmentos retienen actividad de Frazzled, por ejemplo, tales como, la capacidad de unirse a proteínas, tales como las proteínas Wnt o proteínas similares a Wnt (proteínas Wnt o similares a Wnt que de otra manera se unen a receptores de membrana, tal como las proteínas Frizzled). Como se emplea aquí, el térrnino "actividad Frazzled" se refiere a una o más de las actividades que son presentadas por las proteínas Frazzled de la presente invención, por ejemplo, incluyendo pero no limitándose a las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628. En particular, la "actividad Frazzled" puede incluir la capacidad de unión a proteínas Wnt o similares a Wnt, y puede incluir la capacidad de regular la unión de proteínas Wnt o similares a Wnt de receptores tales como los receptores de la proteína Frizzled. Uno de tales ensayos de unión de Wnt se describe en Bhanot, Nature 382:225(1996). Brevemente, células transfectadas con una secuencia de codificación de una proteína que tiene actividad de Frazzled es incubada con medio acondicionado que contiene una proteína Wnt o similar a Wnt. La proteína Wnt unida es visualizada, por ejemplo, enseguida a la incubación con anticuerpo de anti-Wnt, por ejemplo, un anticuerpo fluorescente. La "actividad Frazzled" además incluye la capacidad de regular la formación, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de células y/o tejidos, incluyendo por ejemplo, tejido conectivo, órganos y curación de heridas. En particular, la "actividad Frazzled" incluye la capacidad de mejorar y/o inhibir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primario, neuronales, pancreáticos, cartilaginosos, cerebrales y musculares (tanto esquelético como cardiacos). La "actividad Frazzled" también incluye las actividades de proteínas Frazzled en los ensayos descritos en los ejemplos que se presentan en esto. V La presente invención también incluye variantes de proteína y fragmentos S funcionales de la secuencia de aminoácidos de las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled mostradas en las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6 y/o SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18, las cuales conservan actividad Frazzled. La presente invención también incluye anticuerpos para una proteína Frazzled purificada tal como la WG67-16, WG67-19 y WA628 descritas anteriormente. Las composiciones de la presente invención comprenden 10 una cantidad terapéutica de proteína Frazzled tal como una o más de las anteriores proteínas - WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled. Más aún, composiciones terapéuticas comprenden combinaciones efectivas de proteínas Frazzled y Wnt y/o similares a Wnt. Se espera que la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628, como se expresa por células de mamífero tales como las células CHO, existan como una población heterogénea 15 de especies activas de proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 con terminaciones N variantes. Basados en parte sobre el algoritmo de predicción del péptido señal de Von Heginje, los primeros 15 a 18 aminoácidos de WG67 y los primeros 24 a 26 aminoácidos de WA628 parecen estar involucrados en la señalización para la secreción del péptido maduro. Se espera que especies activas puedan opcionalmente incluir un péptido señal y 20 que las secuencias de ADN que codifican para proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 ^ activas pueden incluir secuencias de ADN que codifican para una(s) región(es) de péptido señal. En todavía otra modalidad, la presente invención comprende un método para la alterar la regulación de genes, el cual comprende la administración de una cantidad efectiva de las composiciones anteriores. Por ejemplo, la alteración de la regulación de los genes pancreáticos puede ser llevada a cabo estimulando o inhibiendo la unión por proteínas Wnt de proteínas receptoras, por ejemplo, la unión entre la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled de la presente invención y la proteína Wnt. De esta manera, la familia de la proteína Frazzled, incluyendo WG67-16, WG67-19 y WA628 puede regular la interacción de unión de genes Wnt con proteínas receptoras, tales como las proteínas receptoras Frizzled.

La presente invención también abarca vectores de fusión o híbridos que comprenden las secuencias del ADN de codificación de la presente invención y otras secuencias de - ¦· codificación Frazzled, unidas a secuencias específicas de tejido o secuencias reguladoras capaces de ser inducidas, tales como un promotor u operador. En una modalidad preferida S de la invención, la secuencia de codificación para la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 está operativamente ligada a uno o más promotores, mejoradores y/u otros agentes reguladores procedentes de genes que son selectivamente expresados en tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares y cerebrales o en células condrocitos y/o tejidos cartilaginosos. Por ejemplo, el promotor mejorador tipo II de colágeno, el cual se sabe que es expresado en cartílago durante la condensación - mesenquimatoso y cartílago. Metsaranta et al., Dev. Dynamics, 204:202-210 (1996); Li et al., Genes Develop., 9:2821-2830 (1996). Otro elemento regulador útil en la presente invención es el promotor de la tenascina C. La tenascina C es expresada en cartílago articular. Pacifici et al., Matrix Biol., 14:689-698 (1996). Adicionalmente, la secuencia de ADN que codifica para proteínas Frazzled tales como las WG67-16, WG67-19 y WA628 puede estar operativamente ligada a uno o mas secuencias reguladoras procedentes de proteínas de núcleo proteoglican, las cuales son selectivamente producidas en condrocitos y/o tejido de cartílago. En otras modalidades preferidas de la invención, las secuencias de codificación para proteínas Frazzled, tales como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628, están operativamente ligadas al promotor aislado procedente del gene IDX. Este promotor es expresado selectivamente en células y tejido pancreático. De esta forma, un vector de ADN híbrido en el que el promotor IDX está operativamente ligado a una secuencia de ADN que codifica para una proteína Frazzled tal como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 es útil para la expresión selectiva de la proteína en tejido pancreático. por ejemplo, para el tratamiento de un desorden pancreático o para la alteración de la regulación de genes pancreáticos, por ejemplo mediante la estimulación o inhibición de la unión por proteínas Wnt de su proteína receptora, por ejemplo uniendo entre las proteínas Frazzled expresadas tales como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 y la proteína Wnt. Vectores que emplean otros elementos reguladores selectivos de tejido y elementos reguladores susceptibles de ser inducidos también pueden ser útiles para la expresión selectiva, o susceptible de ser inducida, de las proteínas Frazzled tales como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 de la presente invención. Otro aspecto de la invención provee composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína Frazzled, tal como proteína WG67-S 16, WG67-19 y WA628 Frazzled de rata o humana, en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones de la invención pueden ser usadas para inducir la expresión de factores en y/o diferenciación de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios, y particularmente, para inducir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de varios tejidos y órganos, y puede ser 0 usada en la formación de tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares y cerebrales y condrocitos y/o fenotipo de tejido cartilaginoso. Estas composiciones pueden además ser utilizadas con el objeto de mejorar y/o inhibir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o niantenimiento de células beta, y otros tipos de células que se encuentran típicamente en las isletas de Langerhans u otras 5 células pancreáticas, así como también una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios incluyendo, por ejemplo tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, del bazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Ellas son útiles en el tratamiento de varios desórdenes asociados con defectos en la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios incluyendo, por ejemplo, tejidos cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, del bazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Las composiciones que comprenden miembros de proteína Frazzled tales como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 pueden ser usadas para tratar células precursoras o progenitoras, tales como células progenitoras pancreáticas, las cuales son capaces de diferenciarse en células que comprenden tejido u órganos diferenciados, tales como células pancreáticas, con el propósito de mejorar la formación, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de tales células, tejido u órganos. Métodos para la formación y mantenimiento de tales células se describen, por ejemplo, en WO93/00441, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia.

Las composiciones de la invención pueden comprender, además de un miembro de proteína Frazzled tal como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628, otros agentes terapéuticamente útiles que incluyen factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidemial (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de transformación (TGf-oc y TGF-ß), activinas, inhibirías, proteínas morfogenéticas de hueso (BMP), proteínas Wnt y factor de crecimiento similar a insulina (IGF). Las composiciones también pueden incluir una matriz apropiada, por ejemplo, para soportar la composición y proveer una superficie para el crecimiento de células condrocitos y/o crecimiento de tejido cartilaginoso. La matriz puede proveer la liberación lenta de la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled y/o el ambiente apropiado para la presentación de la misma. Las composiciones conteniendo el miembro de proteína Frazzled, tal como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628, pueden ser usadas en métodos para el tratamiento de un número de defectos de tejidos y en la curación y mantenimiento de varios tipos de tejidos y heridas. Los tejidos y heridas que pueden ser tratadas incluyen al cartílago, pero también pueden incluir la epidermis, nervio, músculo, músculo cardiaco, tejido conectivo, tal como hueso, tendón y ligamento y otros tejidos y heridas, y una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios incluyendo, por ejemplo, tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, del bazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Estos métodos, de conformidad con la presente invención, implican la administración de una cantidad efectiva de un miembro de proteína Frazzled tal como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628. Las composiciones conteniendo la protema Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 también pueden ser usadas para tratar o prevenir condiciones tales como la artritis reumatoidea, osteoartritis y otras anormalidades de tejidos cartilaginosos, u otras condiciones asociadas con otros órganos o tejidos, tales como tejido del páncreas, hígado, bazo, pulmón, cardiaco, cerebro y de riñón, y otros tejidos y órganos. Estos métodos también pueden implicar la adniinistración de una proteína de la invención en conjunto con la administración de cuando menos otra proteína, por ejemplo, factores de crecimiento que incluyen EGF, FGF, TGF-a, TGF-ß, BMP, activina, inhibina e IGF.

Todavía un aspecto adicional de la presente invención son secuencias de ADN que codifican para la expresión de un miembro de proteína Frazzled tal como proteína WG67-16, WG67-19 y WA628. Dichas secuencias incluyen la secuencia de nucleótidos en una dirección 5' a 3' ilustrada en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7, secuencias de ADN las cuales. por la degeneración del código genético, son idénticas a estas secuencias de ADN y las cuales codifican para proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18. Además se incluyen en la invención secuencias de ADN que se hibrídan bajo condiciones de hibridación astringentes con las secuencias de ADN de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7 y que codifican para una proteína que tiene la capacidad de unirse a una o más proteínas Wnt, y/o las cuales tienen la capacidad de mejorar y/o inhibir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación, mantenimiento de células pancreáticas, tales como las células beta productoras de insulina, o una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios incluyendo, por ejemplo, tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares, cerebrales. pulmonares, del bazo, hepáticos, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Las secuencias de ADN preferidas incluyen aquellas que se hibridan bajo condiciones de hibridación astringentes (ver, T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389). Generalmente se prefiere que tales secuencias de ADN codifiquen para un polipéptido que sea cuando menos aproximadamente 80% homólogo, y más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90% homólogo, a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6. También se prefieren secuencias de ADN que tienen más de 80% de homología con las SEQ ID NOs: 13 y/o 14; también se prefieren secuencias de ADN que tienen más de o igual al 80% de homología con las SEQ ID NOs: 15, 16, 17 y/o 18. Finalmente, también están incluidas en la invención variaciones alélicas y otras variantes de las secuencias de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7, sea que tales cambios de nucleótidos resulten en cambios en la secuencia del péptido, y en donde la secuencia del péptido todavía conserve actividad Frazzled. La presente invención también incluye fragmentos funcionales de las secuencias de ADN que codifican para miembros de la familia de la proteína Frazzled tales como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 de las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6 que codifican para un polipéptido que conserva actividad de proteína Frazzled. La determinación de si una variante o fragmento particular de un miembro de la familia de la proteína Frazzled tal como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 de la presente invención, tal como aquellas mostradas en las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6, conservan actividad Frazzled se realiza en forma rutinaria usando los ensayos descritos en los ejemplos de esto. Las secuencias de ADN de la presente invención también son útiles, por ejemplo, como sondas para la detección del AR m que codifica para otra proteína Frazzled en una población celular dada. Las secuencias de ADN también pueden ser útiles para la preparación de vectores para aplicaciones de terapia de genes como se describe más adelante. Un aspecto adicional de la presente invención incluye vectores que comprenden una secuencia de ADN como se describió anteriormente, en asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello. Estos vectores pueden ser empleados en un nuevo proceso para la producción de un miembro recombinante de la familia de la proteína Frazzled tal como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 de la invención, en el cual una línea celular transformada con una secuencia de ADN que codifica para un miembro de la familia de la proteína Frazzled tal como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 en asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello, es cultivada en un medio de cultivo apropiado y una proteína de la familia Frazzled es recuperado y purificado de allí. Este proceso puede emplear un número de células conocidas, tanto procarióticas como eucarióticas, como células hospederas para la expresión del polipéptido. Los vectores también pueden ser usados en aplicaciones de terapia de genes. En tal uso, los vectores pueden ser transfectados dentro de las células de un paciente ex vivo, y las células pueden ser ^introducidas dentro de un paciente. Alternativamente, los vectores pueden ser introducidos dentro de un paciente in vivo a través de transfección por objetivo. En una modalidad preferida de la invención, se preparan vectores usando uno o más elementos reguladores naturales y/o no naturales, tales como promotores y/o mejoradores asociados operativamente con la secuencia de codificación para WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled, con el objeto de lograr la expresión de WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled en un tejido celular deseado y/o en un tiempo deseado en el desarrollo. Por ejemplo, un vector puede ser construido usando el elemento promotor procedente del gene IDX bien caracterizado, el cual se sabe que es constitutivamente expresado en células pancreáticas, incluyendo células beta, durante el desarrollo. Mediante la asociación operativa del promotor procedente del gene IDX con la secuencia de codificación para Frazzled, y transformando células adecuadas, tales como células progenitoras pancreáticas como se describe en WO93/00441, uno pude expresar WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled en estas células, promoviendo de esta manera los efectos deseados de formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de células como las células beta pancreáticas que son capaces de secretar insulina, ya sea in vitro o in vivo. Todavía un aspecto adicional de la invención son miembros de la familia de la proteína Frazzled tales como las proteínas o polipéptidos WG67-16, WG67-19 y WA628. Tales polipéptidos están caracterizados por tener una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18, variantes de estas secuencias de aminoácidos, incluyendo variantes alélicas que ocurren en forma natural, y otras variantes en las que la proteínas conserva actividad Frazzled, por ejemplo, la capacidad de mejorar y/o inhibir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales. musculares, cerebrales y de condrocitos y/o tejido cartilaginoso y/o tejido de órgano pancreático u otro tejido de órgano, tal como tejido hematopoiético, del tubo digestivo primitivo, neuronal, muscular, pulmonar, del bazo, hepático, cardiaco, cerebral, y renal, características de la proteína Frazzled. Los polipéptidos preferidos incluyen un polipéptido que es cuando menos aproximadamente 80% homólogo y, más preferiblemente cuando menos aproximadamente 90% homólogo a un miembro de la familia de la proteína Frazzled tal como las secuencias de aminoácidos de WG67-16, WG67-I9 y WA628 de las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6. Finalmente, también están incluidas en la presente invención variaciones alélicas y otras variaciones de las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6, sea que tales cambios de aminoácidos sean inducidos por mutagénesis, alteración química o mediante alteración de la secuencia de ADN usada para producir el polipéptido, en donde la secuencia del péptido todavía tiene actividad Frazzled. La presente invención también incluye fragmentos de la secuencia de aminoácidos de los miembros de la familia de la proteína Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 de las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6, los cuales conservan actividad de proteína Frazzled. Alguien capacitado en la técnica fácilmente puede producir tales variaciones y fragmentos de la proteína WG67-16, WG67-1 y WA628 Frazzled usando técnicas conocidas en la técnica, y fácilmente pude probarlas para determinar su actividad, como se describe en los ejemplos y en la descripción de esto. Las proteínas purificadas de la presente invención también pueden ser usadas para generar anticuerpos, ya sea monoclonales o policlonales, para miembros de la familia de la S proteína Frazzled tales como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 y/u otras proteínas relacionadas, usando métodos que son conocidos en la técnica de la producción de anticuerpos. De esta forma, la presente invención también incluye anticuerpos para proteínas Frazzled humanas. Los anticuerpos pueden ser usados para la purificación de proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 o para la inhibición o prevención de los 0 efectos de proteínas Frazzled ya sea in vitro o in vivo. Las proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 son útiles para inducir el crecimiento y/o diferenciación de células embrionarias y/o células progenitoras. Así, las proteínas o composiciones de la presente invención también son útiles para el tratamiento de poblaciones celulares, tales como poblaciones de células embrionarias o de células madre, para generar, enriquecer o para S inhibir el crecimiento y/o diferenciación de las células. Por ejemplo, las proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 son útiles para el tratamiento de poblaciones celulares para mejorar y/o inhibir la formación, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de condrocitos, tejido cartilaginoso, otros tejidos conectivos y/u otras células tales como células de origen pancreático, o una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios 0 incluyendo, por ejemplo, tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, del bazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Las poblaciones de células tratadas son útiles para, entre otras cosas, aplicaciones de terapia de genes, como se describe más adelante. Es de particular interés que los genes frazzled para WG67-16, WG67-19 y WA628 5 parecen codificar para factores secretados, proveyendo de esta forma receptores solubles capaces de unirse con proteínas Wnt y similares a Wnt, y de esta manera iniciar y/o bloquear la transducción de señal por proteínas Wnt. De esta forma, la familia del gene frazzled, incluyendo WG67-16, WG67-19 y WA628, es capaz de regular la interacción de unión de los genes Wnt para proteínas receptoras, tales como las proteínas receptoras 0 Frizzled. Las actividades potenciales de regulación de la transducción de señal de estas proteínas, conjuntamente con la presencia y/o expresión de genes wnt en páncreas y otros órganos y tejidos sugiere que las proteínas Frazzled tales como las WG67-16, WG67-19 y WA628 son reguladores importantes de diferenciación de tejidos y órganos, y están involucradas en la inducción, formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de tejidos y órganos. De esta manera, las proteínas de la presente invención pueden ser útiles en la curación de heridas, reparación de tejidos y órganos y en procesos de regeneración, así como también en la diferenciación de tejido, por ejemplo, en el desarrollo embrionario. En particular, las proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 pueden ser útiles para la inducción, formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento y reparación de tejidos hematopoiético, del tubo digestivo primitivo, neuronal, muscular y cerebral y de condrocitos y/o tejido cartilaginoso. Así, estas proteínas y composiciones que las contienen, pueden ser útiles en el tratamiento de desórdenes del cartílago, tales como la osteoartritis, artritis reumatoidea y defectos de cartílago articular, y en el mejoramiento y/o inhibición de la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento celular, por ejemplo en la formación de condrocitos y/o tejido de cartílago. Las proteínas Frazzled proveídas con la presente incluyen factores codificados por las secuencias de ADN similares a las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7, pero dentro de las cuales se han proveído modificaciones o deleciones en forma natural (por ejemplo, variaciones alélicas en la secuencia de nucleótidos que pueden resultar en cambios de aminoácidos en el polipéptido) o que son deliberadamente diseñadas. Por ejemplo, polipéptidos sintéticos pueden total o parcialmente duplicar secuencias continuas de los residuos aminoácido de las SEQ ID NOs: 2, 4 y/o 6. Estas secuencias, en virtud de compartir características estructurales y conformacionales primarias, secundarias o terciarias con polipéptidos Frazzled, tales como WG67-16, WG67-19 y WA628, pueden poseer propiedades biológicas en común con ellos. Así, estas modificaciones y deleciones de polipéptidos Frazzled naturales pueden ser empleadas como substitutos biológicamente activos para polipéptido Frazzled que ocurren en forma natural, en procesos terapéuticos. Puede determinarse fácilmente si una variante o fragmento dado de una WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled conserva la actividad biológica de Frazzled sometiendo tanto una Frazzled como la variante o fragmento de una Frazzled a un ensayo para detenrünar actividad Frazzled. Por ejemplo, la variante o fragmento puede ser usado en un ensayo de unión competitiva para probar la unión al gene Wnt, o para probar la unión a Wnt o una proteína similar a Wnt. Otras mutaciones específicas de las secuencias de las proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628 descritas en la presente involucran modificaciones de sitios de glicosilación. Estas modificaciones pueden involucrar sitios de glicosilación con enlace O o enlace N. Por ejemplo, la ausencia de glicosilación o solo glicosilación parcial resulta a partir de la substitución o deleción de aminoácidos en sitios de reconocimiento de glicosilación con enlace a asparragina. Los sitios de reconocimiento de glicosilación con enlace a asparragina comprenden secuencias de tripéptido que son específicamente reconocidas mediante enzimas de glicosilación celular apropiadas. Estas secuencias de tripéptido son ya sea asparragina-X-treonina o asparragina-X-serina, en donde X es usualmente cualquier aminoácido. Una variedad de substituciones o deleciones de aminoácido en una o ambas de las posiciones de aminoácido primera o tercera de un sitio de reconocimiento de glicosilación (y/o deleción de aminoácido en la segunda posición) resulta en nula glicosilación en la secuencia del tripéptido modificada. Tales variantes de WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled están comprendidas dentro de la presente invención. Adicionalmente, la expresión bacteriana de proteínas Frazzled resultará en la producción de una proteína no glicosilada, aún si los sitios de glicosilación se dejan sin modificar. Dichas versiones de WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled producidas en forma bacteriana están dentro del alcance de la presente invención. La presente invención también abarca las nuevas secuencias de ADN, libres de asociación con secuencias de ADN que codifican para otros materiales proteináceos, y que codifican para la expresión de proteínas Frazzled, tales como WG67-16, WG67-19 y WA628. Estas secuencias de ADN incluyen aquellas descritas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7 en una dirección 5' a 3', así como secuencias de nucleótidos que incluyen las secuencias de aminoácidos de consenso de las SEQ ID NOs: 15, 16, 17 y/o 18, y aquellas secuencias que las hibridizan bajo condiciones astringentes de hibridización [por ejemplo, 0.1X SSC, 0.1% SDS a 65 °C; ver T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual) Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389] y codifican para una proteína que posee actividad Frazzled. Como se emplea aquí, el término "condiciones de hibridación astringentes" se refieren al uso de condiciones de hibridización de baja astringencia inicial (tal como 6X SSC, 0.5% SDS, a aproximadamente 60 °C) durante toda la noche, seguidas de condiciones de lavado de alta astringencia (tal como 2X SSC, 0.1% SDS, a aproximadamente 20 °C) o aún lavado de más alta astringencia (tal como 0.1X SSC, 0.1% SDS, a aproximadamente 65 °C, por menos de una hora). En forma similar, las secuencias de ADN que codifican para proteínas Frazzled WG67-16, WG67-19 y WA628, codificadas por las secuencias de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7, o proteínas Frazzled o WG67-16, WG67-19 y WA628 que comprenden la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6 y/o las SEQ ID NOs: 15, 16, 17 y/o 18, pero que difieren en secuencia de codón debido a las degeneraciones del código genético o variantes alélicas (cambios de base que ocurren en forma natural en la población de especies que pueden o pueden no resultar en un cambio de aminoácido) también codifican los nuevos factores descritos aquí. Las variaciones en las secuencias de ADN de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7 que son causadas por mutaciones puntuales o mediante modificaciones inducidas (incluyendo inserción, deleción y substitución) para mejorar la actividad, vida media o producción de los polipéptidos codificados también están comprendidas en la invención. Otro aspecto de la presente invención provee un novedoso método para la producción de proteínas Frazzled tales como WG67-16, WG67-19 y WA628. El método de la presente invención involucra el cultivo de una línea celular adecuada, la cual ha sido transformada con una secuencia de ADN que codifica para una proteína Frazzled. Tal como WG67-16, WG67-19 y WA628 de la invención, bajo el control de secuencias reguladoras conocidas. Las células hospederas transformadas son cultivadas y las proteínas Frazzled, tales como WG67-16, WG67-19 y WA628 son recuperadas y purificadas del medio de cultivo. Las proteínas purificadas están substancialmente libres de otras proteínas con las cuales son co-producidas, así como de otros contaminantes. Alternativamente, una(s) líneas celulares adecuada(s) puede(n) ser co-transfectada(s) con secuencias que codifican para Frazzled y codificando para Wnt o una proteínas similar a Wnt, ya sea en vectores separados o sencillo. El(los) producto(s) de expresión resultante(s) puede(n) ser purificado(s) como separado y/o complejos de Frazzled y proteína(s) Wnt y/o similares) a Wnt.

Las células o lineas celulares apropiadas pueden ser células de mamífero tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO). La selección de las células hospederas de mamífero apropiadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, tamizaje, producción y purificación del producto se conocen en la técnica. Ver, por 5 ejemplo, Gething and Sambrook, Nature. 293:620-625 (1981), o alternativamente, Kaufinan et al., Mol. Cell. Biol. 5(7):1750-1759 (1985) o Howley et al., Patente de los E.U.A: No. 4,419,446. Otra línea celular adecuada de mamífero, que se describe en los ejemplos que se acompañan es la línea celular COS-1 de mono. También es apropiada la línea celular de mamífero CV-1. 10 También las células de bacterias pueden ser hospederos adecuados. Por ejemplo, las varias cepas de E. Coli (por ejemplo, HB101, MC 1061) son bastante conocidas como células hospederas en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. Subtilis, Pseudomonas, otros bacilos y similares también pueden ser empleadas en este método. Para la expresión de la proteína en células de bacteria, generalmente no es necesario el ADN que i S codifica el péptido señal del propéptido de la Frazzled. Muchas cepas de células conocidas por aquellos capacitados en la técnica también pueden ser usadas como células hospederas para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Adicionalmente, en donde se desee, pueden utilizarse células de insecto como células hospederas en el método de la presente invención. Ver, por ejemplo, Miller et 0 al, Genetic Engineering, 8, 277-298 (Plenum Press 1986) y referencias citadas aquí. Otro aspecto de la presente invención proporciona vectores para uso en el método de expresión de estos novedosos polipéptidos Frazzled, tales como WG67-16, WG67-19 y WA628. Preferiblemente los vectores contienen las nuevas secuencias de ADN completas que fueron descritas anteriormente y las cuales codifican para los nuevos factores de la invención. Adicionalmente, los vectores contienen secuencias de control de expresión apropiadas que permiten la expresión de las secuencias de la proteína Frazzled. Alternativamente, también son modalidades de la invención vectores que incorporan secuencias modificadas como se describió anteriormente. Adicionalmente, las secuencias de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7 u otras secuencias que codifican para proteínas Frazzled, 0 tales como WG67-16, WG67-19 y WA628, podrían ser manipuladas para expresar una proteína Frazzled madura, tal como WG67-16, WG67-19 y WA628, mediante la deleción de las secuencias de péptido señal del propéptido Frazzled y reemplazándolas con secuencias que codifican para los péptidos señal del propéptido de otras proteínas Frazzled u otros propéptidos adecuados. Así, la presente invención incluye moléculas de ADN quiméricas que codifican para un péptido señal de propéptido procedente de un miembro de 5 la familia Frazzled unido en marco de lectura correcto a una secuencia de ADN que codifica para una proteína Frazzled, tal como polipéptido de WG67-16, WG67-19 y WA628. Las secuencias también pueden estar configuradas de una manera adecuada para formas multiméricas genéricas que incluyen homodímeros y heterodímeros y similares. Los vectores pueden ser empleados en el método de transformación de líneas 0 celulares y contienen secuencias reguladoras seleccionadas en asociación operativa con las secuencias de codificación de ADN de la invención que son capaces de dirigir la replicación y expresión de ellas en las células hospederas seleccionadas. Las secuencias reguladoras para tales vectores se conocen por aquellos capacitados en la técnica y pueden seleccionarse dependiendo de las células hospederas. Dicha selección es rutinaria y no S forma parte de la presente invención. Con el objeto de producir proteínas Frazzled de rata, humano o de otro mamífero, el ADN de codificación es transfectado dentro de un vector de expresión apropiado e introducido dentro de las células de mamífero u otros hospederos eucarioticos o procarioticos preferidos mediante técnicas de ingeniería genética convencionales. Se 0 contempla que el sistema de expresión preferido para la Frazzled humana, recombinante y biológicamente activa, sean células de mamífero establemente transformadas. Alguien capacitado en la técnica puede construir vectores de expresión de mamífero empleando las secuencias de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7, u otras secuencias de ADN que codifican para proteínas Frazzled u otras secuencias modificadas y vectores conocidos. 5 tales como pCD (Okayama et al., Mol Cell Biol., 2:161-170 (1982), pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J. 4:645-653 (1985) y pMT2 CXM. El vector de expresión de mamífero pMT2 CXM es un derivado de p91023(b) (Wong et al., Science 228:810-815, 1985) difiriendo del último en que éste contiene el gene de resistencia a la ampicilina en lugar del gene de resistencia a la tetraciclina y además 0 contiene un sitio Xhol para la inserción de clonas de ADNc. Los elementos funcionales del pMT2 CXM han sido descritos (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:689- 693) e incluyen genes VA de adenovirus, el origen SV40 de replicación incluyendo el mejorador de 72 bp, el promotor tardío mayor de adenovirus incluyendo el sitio de empalme 5' y la mayoría de la secuencia líder tripartita de adenovirus presente en ARNms tardío de adenovirus, un sitio de aceptación de empalme 3', un inserto DHFR, el sitio de poliadenilación temprana de SV40 (SV40) y secuencias del pBR322 requeridas para la propagación en E. Coli. El plásmido pMT2 CXM es obtenido mediante digestión con EcoRI de pMT2-VWF, el cual ha sido depositado con la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (EUA) bajo el número de acceso ATCC 67122. La digestión con EcoRI corta el inserto de ADNc presente en el pMT2-VWF, produciendo pMT2 en forma lineal, el cual puede ser ligado y usado para transformar E. Coli HB101 o DH-S para resistencia a la ampicilina. El ADN del plásmido pMT2 puede ser preparado mediante métodos convencionales. Entonces es construido el pMT2 CXM usando mutagénesis de circuito exterior/interior [Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)]. Esto elimina las bases 107S a 1145 relativas al sitio Hin III cercano a las secuencias del origen SV40 de replicación y secuencias del mejorador pMT2. Además inserta la siguiente secuencia: SEQ ID NO: 8: 5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3 ' en el nucleótido 1145. Esta secuencia contiene el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Xho I. Un derivado del pMT2CXM, denominado pMT23, contiene sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción PstI, Eco RI, Salí y Xhol, El ADN del plásmido pMT2 CXM y del pMT23 puede ser preparado por métodos convencionales. El pEMC2pi derivado del pMT21 también puede ser adecuado en la práctica de la invención. El pMT21 es derivado del pMT2 el cual es derivado del pMT2-VWF. Como se describió anteriormente la digestión con EcoRI corta el inserto de ADNc presente en pMT-VWF, produciendo pMT2 en forma lineal, el cual puede ser ligado y usado para transformar E. Coli HB101 o DH-5 para resistencia a ampicilina. El ADN del plásmido pMT2 puede ser preparado por métodos convencionales. El pMT21 es derivado del pMT2 a través de las siguientes dos modificaciones. Primera, 76 bp de la región 5' no traducida del ADNc de DHFR incluyendo una expansión de 19 residuos G procedentes de la cola G/C para la clonación de ADNc es eliminada. En este proceso, un sitio Xhol es insertado para obtener la siguiente secuencia inmediatamente corriente arriba de DHFR: SEQ ID NO: 9: 5'-CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG-3' PstI Eco RI Xhol Segunda, un único sitio Clal es introducido mediante digestión con EcoRV y Xbal, tratamiento con f agmento Klenow de polimerasa I de ADN, y unión a un ligador de Clal (CATCGATG). Esto elimina un segmento de 250 bp de la región (VAI) del ARN asociado del adenovirus pero no interfiere con la expresión o función del gene del ARN de VAI. El pMT21 es digerido con EcoRI y Xhol, y usado para derivar el vector pEMC2Bl . Una porción del líder EMCV es obtenida a partir de pMT2-ECATl [S.K. Jung et al., J. Virol 63:1651-1660 (1989)] mediante digestión con EcoRI y PstI, resultando en un fragmento de 2752 bp. Este fragmento es digerido con Taql produciéndose un fragmento de EcoRI-Taql de 508 bp que es purificado mediante electroforesia en gel de agarosa de baja fusión. Un adaptador de 68 bp y su cadena de complemento son sintetizados con una terminación saliente de Taql 5' y una terminación saliente de Xhol 3' que tiene la siguiente secuencia: SEQ ID NO: 10: 5 ' -OGAGGTT AAAAAACGTCTAGGCCCCCCG AACC ACGGGG ACGTGGTTTTC Taql CTTTGAAAAACACGATTGC-3 ' Xhol Esta secuencia empata la secuencia líder de virus EMC desde el nucleótido 763 al 827. También cambia el ATG en la posición 10 dentro del líder del virus EMC a un ATT y es seguido por un sitio Xhol. Una unión de tres vías del fragmento EcoRI-Xhol del pMT21 , el fragmento EcoRi-Taql del virus EMC, y el adaptador Taql-Xhol del adaptador del oligonucleótido de 68 bp resultando en el vector pEMC2pi. Este vector contiene el origen SV40 de replicación y mejorador, el promotor tardío mayor de adenovirus, una copia de ADNc de la mayoría de la secuencia líder tripartita de adenovirus, una pequeña secuencia de internación de híbrido, una señal de poliadenílación SV40 y el gene VA I de adenovirus, marcadores DHFR y ß-lactamasa y una secuencia de EMC, en relaciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del ADNc deseado en las células de mamífero. La construcción de los vectores puede involucrar la modificación de las secuencias de ADN de las WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled. Por ejemplo, ADNc de las WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled puede ser modificado eliminando los nucleótidos de no codificación en las terminaciones 5' y 3' de la región de codificación. Los nucleótidos de no codificación eliminados pueden o pueden no ser reemplazados por otras secuencias conocidas y que se sabe son benéficas, por ejemplo, para expresión. Estos vectores son transformados en células hospederas adecuadas para la expresión de Frazzleds, tales como proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628. Adicionalmente, las secuencias de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7 u otras secuencias de codificación para proteínas Frazzled pueden ser manipuladas para expresar un miembro de proteína Frazzled madura, tal como proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 mediante la deleción de las secuencias del péptido señal del propéptido de codificación de WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled y reemplazándolas con secuencias que codifican para los péptidos señal de los propéptidos completos de otras proteínas. Alguien capacitado en la técnica puede manipular las secuencias de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5 y/o 7 eliminando o reemplazando las secuencias reguladoras de mamífero que flanquean la secuencia de codificación con secuencias de bacterias para crear vectores bacterianos para expresión intracelular o extracelular por células de bacterias. Por ejemplo, las secuencias de codificación podrían ser manipuladas adicionalmente (esto es, ligadas a otros ligadores conocidos o modificadas eliminando secuencias de no codificación de ellas o alterando nucleótidos que se encuentran allí, mediante otras técnicas conocidas). La secuencia de codificación del miembro de la familia de la proteína Frazzled modificada, tal como WG67-16, WG67-19 y WA628, podría entonces ser insertada dentro de un vector bacteriano conocido usando procedimientos tales como el descrito en T. Taniguchi et al. Proa Nati. Acad. Sci. USA. 77-5230-5233 (1980). Este vector bacteriano ejemplificativo podría entonces ser transformado dentro de células hospederas bacterianas y de esta forma una proteína sería expresada. Para una estrategia para producir la expresión extracelular de proteínas Frazzled, tales como las WG67-16, WG67-1 y WA628, en células de bacterias, ver por ejemplo, la solicitud de patente Europea EPA 177,343. Además, las proteínas Frazzled de la invención, y los complejos Frazzled Wnt pueden ser expresados como una fusión de tioredoxina como se sabe por aquellos capacitados en la técnica y como se describe en la patente de los E.U.A. No. 5,646,016 y publicada en WO95/16044, el 15 de junio de 1995. Manipulaciones similares pueden realizarse para la construcción de un vector de insecto (ver, por ejemplo, los procedimientos descritos en la solicitud de patente europea publicada 155,476) para la expresión en células de insecto. Un vector de levadura podría ser construido también empleando secuencias reguladoras de levadura para expresión intracelular y extracelular de los factores de la presente invención mediante células de levadura. (Ver, por ejemplo, los procedimientos descritos en la solicitud publicada PCT WO86/00639 y la solicitud de patente Europea EPA 123,289). Un método para la producción de altos niveles de una proteína Frazzled tal como la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 de la invención en células de mamífero puede involucrar la construcción de células conteniendo copias múltiples de un gene Frazzled heterólogo, tal como los genes de WG67-16, WG67-19 y WA628. El gene heterólogo es ligado a un marcador susceptible de amplificación, por ejemplo, el gene de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) para el cual células que contienen copias de genes incrementados pueden seleccionarse para la propagación en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX) de acuerdo con los procedimientos de Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol.. 159:601 -629 (1982). Este planteamiento puede ser empleado con un número de diferentes tipos de células. Por ejemplo, un plásmido conteniendo una secuencia de ADN para un miembro de la familia de la proteína Frazzled de la invención en asociación operativa con secuencias de otro plásmido que hace posible la expresión de ello y el plásmido de expresión de DHFR pAdA26SV(A)3 [Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 2:1304 (1982) puede ser co-introducido dentro de células CHO deficientes en DHFR, DUKX-BII, mediante varios métodos que incluyen la co-precipitación con fosfato de calcio y transfección, electroforesia o fusión de protoplasto. Los transformantes de la expresión de DHFR son seleccionados para crecer el medio alfa con suero de res fetal dializado, y subsecuentemente seleccionado por amplificación para crecimiento en concentraciones crecientes de MTX (por ejemplo, etapas secuenciales en 0.02, 0.2, 1.0 y SuM MTX) como se describe en Kaufinan et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983). Los transformantes son clonados, y la expresión de la G67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled, biológicamente activa, es monitoreada por ensayo en una de las pruebas descritas en los ejemplos de más adelante. La expresión de la proteína Frazzled se incrementa con niveles crecientes de resistencia a MTX. Los polipéptidos de Frazzled son caracterizados usando técnicas estándar conocidas en la técnica tales como marcado por impulsos con metionina [35S] o cisterna y electroforesia en gel de poliacrilamida. Pueden seguirse procedimientos similares para producir otras proteínas Frazzled relacionadas. Una proteína de la presente invención, la cual demuestra actividad de Frazzled, tiene aplicación en la inducción, formación, crecimiento, proliferación, diferenciación y/o mantenimiento y curación de células y tejidos tales como tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares y cerebrales, o condrocitos y/o tejido cartilaginoso, así como tejido pancreático, y otros tejidos de órganos, en humanos y otros animales. Dicha preparación que emplea una proteína Frazzled puede tener uso profiláctico en el tratamiento de la artritis reumatoidea y la osteoartritis y en daño traumático a cartílago, así como en la prevención de tumores pancreáticos, diabetes y otros desórdenes del tejido pancreático. La formación de nuevas células beta, células de isletas de Langerhans, y otras células de fenotipo pancreático, inducidas por una proteína Frazzled contribuye a la reparación de condiciones o defectos de tejido congénitos, inducidos por trauma u oncológicos. Una proteína Frazzled, tal como las proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628, también puede ser usada en el tratamiento de enfermedad pancreática, y en otros procesos de reparación de tejido y órganos. Tales agentes pueden proporcionar un ambiente que atraiga células madre adecuadas, estimular el crecimiento y la proliferación de células formadoras de páncreas o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de páncreas, y pueden también sostener la regeneración de otros tejidos y órganos. Los polipéptidos Frazzled de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de desórdenes tales como la pancreatitis o diabetes. Las proteínas de la invención también pueden ser útiles en la curación de heridas y en la reparación de tejido relacionado. Los tipos de heridas incluyen, pero no se limitan a quemadas, cortadas y úlceras. (Ver, por ejemplo, la Publicación PCT WO84/01106 para una descripción de la curación de heridas y reparación de tejido relacionado). Además se contempla que proteínas de la invención puedan incrementar la supervivencia de células neuronales, astrocíticas y/o glial y, por lo tanto, ser útiles en el transplante y tratamiento de condiciones que presentan una disminución en la sobrevivencia neurona! y reparación. Las proteínas de la presente invención pueden ser útiles además para el tratamiento de condiciones relacionadas con otros tipos de tejidos, tales como nervio, epidermis, músculo, tejido conectivo, tales como hueso, cartílago, tendón y ligamento, y otros tejidos tales como hematopoiético, del tubo digestivo primitivo, neuronal, muscular y cerebral, y del páncreas, hígado, bazo, pulmón, cardiaco, cerebro y riñon. Las proteínas de la presente invención también pueden tener valor como un complemento dietético, o como aditivos para medio de cultivo celular. Para este uso, las proteínas pueden ser usadas en forma intacta, o pueden estar predigeridas para proporcionar un complemento de más fácil absorción. Las proteínas de la invención también pueden tener otras propiedades características útiles de la familia de proteínas Frazzled. Tales propiedades incluyen propiedades angiogénicas, quimotácticas y/o quimioatrayentes, y efectos sobre células que incluyen respuestas de diferenciación, respuestas proliferativas de células y respuestas que involucran la adhesión celular, migración y matrices extracelulares. Estas propiedades hacen que las proteínas de la invención sean agentes potenciales para la curación de heridas, reducción de fíbrosis y reducción de la formación de tejido de cicatrización. Las proteínas de la invención también pueden ser útiles para la inducción de la formación de células capaces de secretar hormonas valiosas, tales como insulina, glucagon, u otras hormonas endrócrinas y exócrinas. Un aspecto adicional de la invención es un método terapéutico y una composición para el tratamiento de desordenes de cartílago y tejido conectivo así como desórdenes del páncreas, diabetes y otras condiciones relacionadas con desordenes o enfermedades del tejido pancreático. La invención además comprende métodos terapéuticos y composiciones para la curación de heridas y la reparación de tejidos. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos una proteína Frazzled de la presente invención en mezcla con un vehículo, portador o matriz farmacéuticamente aceptable. Además se contempla que las composiciones de la invención puedan incrementar la supervivencia neuronal, de células glial y astrocitos y, por lo tanto, ser útiles en el transplante y tratamiento de condiciones que presentan una disminución en la sobrevivencia neuronal. Se espera que las proteínas de la invención puedan actuar en concierto con o quizás en forma sinérgica, con otras proteínas y factores de crecimiento relacionados. Métodos y composiciones terapéuticas adicionales de la invención, por lo tanto, comprenden una cantidad terapéutica de cuando menos una proteína Frazzled de la invención con una cantidad terapéutica de cuando menos otra proteína, tal como un miembro de la superfamilia de TGF-ß de proteínas, la cual incluye las proteínas morfogenéticas de hueso (BMPs), factores de crecimiento y diferenciación (GDFs) y otras proteínas. La composición puede incluir además otros agentes y factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidemial (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento de transformación (TGF-a y TGF-ß), activinas, inhibinas, y factor de crecimiento de ß-fíbroblasto (PFGF), hormona paratiroidea (PTH), factor inhibidor de leucemia (LIF HILDA/DIA), factores de crecimiento similares a insulina (IGF-I e IGF-II) y proteínas Wnt. Porciones de estos agentes también pueden ser usadas en composiciones de la presente invención. Está dentro de los conocimientos de la técnica la preparación y formulaciones de dichas composiciones de proteína aceptables en forma fisiológica, teniendo debida consideración respecto al pH, isotonicidad, estabilidad y similares. Las composiciones terapéuticas también son actualmente valiosas para aplicaciones veterinarias debido a la falta de especificidad a especies en las proteínas Frazzled. Particularmente, los animales domésticos y los caballos purasangre además de los humanos, son pacientes deseables para tales tratamientos con las proteínas Frazzled de la presente invención. £1 método terapéutico incluye la administración de la composición tópicamente, sistémicamente o .ocalmente como una inyección o implantación. Cuando se administra la composición terapéutica para usarse en esta invención es, por supuesto, en una forma fisiológicamente aceptable y libre de pirógenos. Además, la composición puede estar deseablemente en una forma viscosa encapsulada o inyectable para su liberación al sitio del tejido. La administración tópica puede ser adecuada para curar heridas y reparar tejidos. Agentes terapéuticamente útiles diferentes de las proteínas Frazzled que también pueden opcionalmente ser incluidos en la composición descrita anteriormente, pueden alternativa o adicionalmente, ser administrados simultánea o secuencialmente con la composición de Frazzled en los métodos de la invención. Para su implantación, la composición preferiblemente incluye una matriz capaz de liberar proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled al sitio del daño pancreático u otro daño de tejido, proveyendo una estructura para el desarrollo de tejido y óptimamente capaz de ser reabsorbida dentro del cuerpo. La matriz puede proveer liberación lenta de WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled y/u otra proteína, así como una presentación apropiada y un ambiente adecuado para la infiltración celular. Tales matrices pueden formarse a partir de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones de implantes médicos. La elección del material de la matriz está basada en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de interfase. La aplicación particular de las composiciones de WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled serán definidas por la formulación apropiada. El régimen de dosificación será determinado por el médico que atiende, considerando varios factores que modifican la acción de la proteína WG67-16, WG67-19 y WA628 Frazzled, por ejemplo, cantidad de tejido que se desea formar, el sitio del daño del tejido, la condición del tejido dañado, el tamaño de la lesión, tipo del tejido dañado, la edad, sexo y peso del paciente, la severidad de la infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosis puede variar con el tipo de matriz usada en la reconstitución y los tipos de proteínas Frazzled, tales como proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628 que se encuentran en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGF I (factor I de crecimiento similar a insulina) a la composición final también puede afectar la dosis. El avance puede ser monitoreado mediante evaluaciones periódicas del crecimiento y/o reparación del tejido. El avance puede ser monitoreado, por ejemplo, por rayos x, determinaciones histomorfométricas y marcado con tetraciclina. Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la invención en la recuperación, caracterización y uso de los miembros de la familia de la proteína Frazzled, tales como proteínas WG67-16, WG67-19 y WA628, y empleando el ADN para recuperar proteínas Frazzled y otras proteínas Frazzled, obteniendo las proteínas humanas y expresando las proteínas por vía de técnicas ^combinantes.

EJEMPLO 1: Aislamiento de los ADNs frazzled Xenopus por Hibridación Se aislaron ADNc de longitud completa de EA628-5, WG67-16 y WG-67-19 Xenopus a partir de una biblioteca de ADNc cebada con dT y construida en el vector de plásmido CS2+. EL ADNc fue hecho a partir de embriones Xenopus (etapa 11.5-12). Las secuencias sonda usadas para aislar las clonas para la WA628 y WG67 fueron las siguientes: SEQ ID NO: 11 : 5' - ATACATAGATTGCGAGCCACACGCCAA - 3' y SEQ ID NO: 12: 5' - ACGCACTTGGTGGATAATCCAATGTCA - 3', respectivamente. Las sondas de ADN fueron marcadas radioactivamente con 32P y usadas para tamizar la biblioteca de ADNc cebada con dT, Xenopus, bajo condiciones de hibridación lavado altamente astringentes, para identificar clonas que contienen secuencias de los genes de WA628 y WG67. Aproximadamente 80,000 transformantes de biblioteca fueron colocados en placa a una densidad de aproximadamente 4000 transformantes por placa sobre placas selectivas para tamizar para WA628. Aproximadamente 171,000 transformantes de biblioteca fueron colocados en placa a una densidad de aproximadamente 3800 transformantes por placa en placas selectivas para tamizar para WG67. Réplicas de nitrocelulosa de las colonias transformadas fueron hibridizadas a la sonda de ADN marcada con 32P en regulador de hibridación estándar (6X SSC, 0.5% SDS, 5X Denhardt, 10 mM EDTA, pH8, 100 mg ml de ácido ribonucleico de Levadura Bakers) bajo condiciones de alta astringencia (65 °C durante 2 horas). Después de hibridación durante 2 horas, los filtros fueron retirados de la solución de hibridación y lavados bajo condiciones de alta astringencia (2X SSC, 0.5% SDS, 21 °C durante 5 minutos; seguido de un segundo 2X SSC, 0.1% SDS, 21 °C durante 15 minutos; seguido por 2X SSC, 0.1% SDS, 65 °C durante 10 minutos). Los filtros fueron envueltos en envoltura de plástico y expuestos a película de rayos X durante toda la noche por 3 días a -80 °C con la ayuda de una pantalla de intensificación. Las autoradiografías fueron desarrolladas y transformantes de hibridación positivos de varías intensidades de señal fueron identificados. Estas clonas positivas fueron recolectadas, hechas crecer durante S horas en medio selectivo y colocadas en placa a una densidad baja (aproximadamente 100 colonias por placa). Réplicas de nitrocelulosa de las colonias fueron hibridizadas a la sonda marcada con 32P en regulador de hibridación estándar (6X SSC, 0.5% SDS, 5X Denhardt, 10 mM EDTA, pH8, 100 mg/ml de ácido ribonucleico de Levadura Bakers) bajo condiciones de alta astringencia (65 °C durante 2 horas). Después de hibridación durante 2 horas, los filtros fueron retirados de la solución de hibridación y lavados bajo condiciones de alta astringencia (por ejemplo 2X SSC, 0.5% SDS, 21 °C durante 5 minutos; seguido de 2X SSC, 0.1% SDS, 21 °C durante 15 minutos; seguido por un segundo 2X SSC, 0.1% SDS, 21 °C durante 15 minutos; seguido de 2X SSC, 0.1% SDS, 65 °C durante 10 minutos). Los filtros fueron envueltos en envoltura de plástico y expuestos a película de rayos X durante toda la noche hasta 3 días a -80 °C. Las autoradiografias fueron desarrolladas y transformantes de hibridación positivos fueron identificados. Patrones bacterianos de clonas positivas de hibridación, purificadas, fueron preparadas y se aisló ADN de plásmido. La secuencia del inserto de ADNc fue determinado. El inserto de ADNc contenía las secuencias de la sonda de ADN usadas en la hibridación. La WG67-19 varía de la WG-67-SP (secuencias de sEST) y la WG67-16 en que contiene una deleción que elimina el codón, esto es, 3 bases (1 aminoácido) GCC en el bp 47-49 de la secuencia de longitud completa de la WG67-19. La WG67-16 varía de la WG67-SP (la secuencia de sEST) (SEQ ID NO: 7) en que carece de 35 bases (bp 42-76) en la secuencia de WG67-16 proveída; esto resultó en la deleción de la Met de iniciación y por lo tanto requería reparación antes de la expresión. La WG67-16 y la WG67-19 diferían en el extremo 3' de sus secuencias en el bp 764 de la WG67-19 y termina 28 aminoácidos después del punto de divergencia. En un sistema de expresión de COS, la clona WG67-19 produce una proteína secretada.

EJEMPLO 2: Ensayos de Actividad de Cartílago A. Descripción de las células W-20 El uso de células estromáticas de médula ósea W-20 como una línea celular indicadora está basado en la conversión de estas células a células de tipo osteoblastos después del tratamiento con una proteína osteogénica, tal como una proteína BMP [Thies et al., Journal of Bone and Mineral Research, 5:305 (1990); y Thies et al., Endocrinology, 130:1318 (1992)], Específicamente, las células W-20 son una línea celular estromática de médula ósea clonal derivada a partir de ratones adultos mediante investigadores en el laboratorio del Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA. El tratamiento de células W-20 con ciertas proteínas BMP resulta en (1) producción incrementada de fosfatasa alcalina, (2) inducción de AMPc estimulada por ???, y (3) inducción de síntesis de osteocalcina por las células. Si bien (1) y (2) representan características asociadas con el fenotipo de osteoblastos, la capacidad de sintetizar osteocalcina es una propiedad fenotípica solamente desplegada por osteoblastos maduros. Además, hasta la fecha nosotros hemos observado conversión de células estromáticas W-20 a células de tipo osteoblastos solo con el tratamiento con BMPs. En esta forma, las actividades in vitro desplegadas por las células W-20 tratadas con BMP se correlacionan con la actividad de formación de hueso in vivo conocida para las BMPs. Más adelante se describen dos ensayos in vitro útiles en la comparación de actividades de BMP de nuevas moléculas osteoinductivas. B. Protocolo de Ensayo de Fosfatasa Alcalina de W-20 Células W-20 son colocadas en placa dentro de placas de cultivo de tejido de 96 pozos a una densidad de 10,000 células por pozo en 200 ul de medio (DME con 10% de suero de res fetal inactivado con calor, 2 mM de glutamina y 100 Unidades/ml de penicilina + 100 µg/ml de estreptomicina). Se permitió que las células se unieran durante toda la noche en un incubador con 95% de aire, 5% de C02, a 37 °C. Los 200 µ? de medio se retiraron de cada pozo con una pipeta multicanal y se reemplazaron con un volumen igual de la muestra de prueba entregada en DME con 10% de suero de res fetal inactivado con calor, 2 mM de glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina. Las substancias de prueba son ensayadas por triplicado. Las muestras de prueba y los estándares se dejan durante un período de incubación de 24 horas con las células indicadoras de W-20. Después de las 24 horas, las placas son retiradas del incubador a 37 °C y el medio de prueba es eliminado de las células. Las capas de células W-20 son lavadas tres veces con 200 µ? por pozo de salmuera regulada con fosfato y libre de calcio/magnesio y estos lavados son desechados. 50 µ? de agua destilada en vidrio son agregados a cada pozo y las placas de ensayo son entonces colocadas sobre un baño de hielo seco/etanol para un congelamiento rápido. Una vez congeladas, las placas son retiradas del baño de hielo seco/etanol y descongeladas a 37 °C. Esta etapa es repetida dos veces más para un periodo total de tres procedimientos de congelación-descongelación. Una vez terminado, la fosfatasa alcalina unida a membrana está disponible para las mediciones. 50 µ? de la mezcla de ensayo (50 mM glicina, 0.05% Tritón X-100, 4 mM MgCl2, 5 mM fosfato de p-nitrofenol, pH=10.3) se agregan a cada pozo de ensayo y las placas de ensayo son entonces incubadas durante 30 minutos a 37 °C en una baño de agua con agitación a 60 oscilaciones por minuto. Al final de la incubación de 30 minutos, la reacción es detenida agregando 100 µ? de NaOH 0.2 N a cada pozo y colocando las placas de ensaye sobre hielo. La absorbencia espectrofotométrica para cada pozo es leída a una longitud de onda de 405 nanometros. Estos valores se comparan entonces con estándares conocidos para dar un estimado de la actividad de fosfatasa alcalina en cada muestra. Usando cantidades conocidas de fosfato de p-nitrofenol se generan los valores de absorbancia. Se determinaron valores de absorbencia para cantidades conocidas de BMPs y se convirtieron a umoles de fosfato de p-nitrofenol separado por unida de tiempo. Estos valores son entonces usados para comparar las actividades de cantidades conocidas de proteína Frazzled para BMP-2. C. Protocolo RIA de Osteocalcína Células W-20 son colocadas en placa a 106 células por pozo en platos de cultivo de tejido multipozo de 24 pozos en 2 mis de DME conteniendo 10% de suero de res fetal ínactivado por calor, glutamina 2 mM. Se dejó que las células se unieran durante toda la noche en una atmósfera de 95% de aire y 5% de C(¼ a 37 °C. El día siguiente el medio es cambiado a DME conteniendo 10% de suero de res fetal ínactivado por calor, glutamina 2 mM y la substancia de prueba en un volumen total de 2 mi. Cada substancia de prueba es administrada para pozos por triplicado. Las substancias de prueba son incubadas con las células W-20 por una total de 96 horas con reemplazo a las 48 horas por los mismos medios de prueba. Al final de las 96 horas, se eliminaron 50 ul del medio de prueba de cada pozo y se probaron para determinar la producción de osteocalcína usando un radioinmunoensayo para osteocalcína de ratón. Los detalles del ensayo se describen en el equipo fabricado por Biomedical Technologies, Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072. Los reactivos para el ensayo se encontraron como números de producto BT-431 (estándar para osteocalcina de ratón), BT-432 (Osteocalcina de anti-ratón de cabra), BT-43 IR (osteocalcina de ratón iodada), BT-41S (suero de cabra normal) y BT-414 (IgG de anti-cabra de asno). El RIA paraosteocalcina sintetizada por células W-20 en respuesta al tratamiento con BMP es llevado a cabo como se describió en el protocolo proporcionado por el fabricante. Los valores obtenidos para estas muestras de prueba son comparados con estándares conocidos de osteocalcina de ratón y a la cantidad de osteocalcina producida por células W-20 en respuesta al desafio con cantidades conocidas de BMP-2. D. Ensayo de Sampath-Reddi Modificado por Rosen Una versión modificada del ensayo de formación de hueso de rata descrito en Sampath and Reddi, Proa Nati. Acad. Sci.. USA. 80:6591-6595 (1983) es usado para evaluar la actividad de las nuevas proteínas osteoinductivas o condroinductivas para la formación de hueso y/o cartílago y/u otro tejido conectivo. Este ensayo modificado es denominado aquí como el ensayo Sampath-Reddi modificado por Rosen. La etapa de precipitación de etanol del procedimiento de Sampath-Reddi es reemplazada por dialización (si la composición es una solución) o diafiltración (si la composición es una suspensión) de la fracción a ser probada contra agua. La solución o suspensión es entonces equilibrada a 0.1% de TFA. La solución resultante es agregada a 20 mg de una matriz de rata. Una muestra de matriz de rata simulada, no tratada con la proteína sirve como un control. Este material es congelado y liofilizado y el polvo resultante encerrado en cápsulas de gelatina #5. Las cápsulas son implantadas subcutáneamente en el área torácica abdominal de ratas Long Evans macho de 21-49 días de edad. Los implantes son retirados después de 7-14 días. La mitad de cada implante es usada para el análisis de fosfatasa alcalina [ver, Reddi et al., Proc. NaÜ. Acad. Sci.. 69:1601 (1972)]. La otra mitad de cada implante es fijada y procesada para análisis histológico. 1 um de secciones de glícometacrilato son teñidas con fuscina ácida y Von Kossa para registrar la cantidad de formación inducida de hueso y cartílago y otro tejido conectivo presente en cada implante. Los términos +1 a +5 representan el área de cada sección histológica de un implante ocupado por nuevas células de hueso y/o cartílago y matriz. Un registro de +5 indica que más del 50% del implante es hueso y/o cartílago nuevo producido como un resultado directo de la proteína en el implante. Un registro de +4, +3, +2 y +1 indicaría que más del 40%, 30%, 20% y 10% respectivamente del implante contiene nuevo cartílago y/o hueso. Alternativamente, los implantes son inspeccionados para determinar la apariencia del tejido similar a tendón embrionario, el cual es fácilmente reconocido por la presencia de haces densos de fibroblastos orientados en el mismo plano y empacados conjuntamente en forma apretada, [tejido similar a tendón-ligamento es descrito, por ejemplo, en Ham and Cormack, Histologv (JB Lippincott Co. (1979), pp. 367-369, cuya descripción se incorpora a la presente como referencia]. Estos hallazgos pueden ser reproducidos en ensayos adicionales en los que tejidos similares a tendón/ligamento son observados en los implantes conteniendo proteína Frazzled. Las proteínas Frazzled son evaluadas en cuanto a su actividad en este ensayo. Usando el análisis Northern, las proteínas pueden ser probadas en cuento a sus efectos sobre varias líneas celulares. Las líneas celulares incluyen líneas celulares derivadas de primordios de ratón E13. Después de 10 días de tratamiento con proteína WA545 el fenotipo celular es examinado histológicamente para identificar indicaciones de diferenciación de tejido. Además, puede realizarse análisis Northern de ARNm procedente de células tratadas con proteína WA545 para varios marcadores incluyendo uno o más de los siguientes marcadores para hueso, cartílago y/o tendón ligamento, como sigue: Marcador Hueso Cartílago Tendón/Ligamento Osteocalcina + - - Fosfatasa Alcalina + - - Proteína de Núcleo Proteoglican + Colágeno Tipo I + + + Colágeno Tipo II +/-1 + Decorina + + + Elastina +/-3 ? + 1- Marcador visto temprano, marcador no visto como formas de tejido óseo maduro 2- Marcador depende del sitio de tendón; más fuerte en la interfase ósea 3- Marcador visto en niveles bajos.

EJEMPLO 3: Modelo de Reparación de Cartílago Articular de Espesor Completo. Un modelo de defecto de cartílago articular de espesor completo en la unión patelar femoral de conejos adultos se utilizó para evaluar la capacidad de las proteínas Frazzled para afectar la reparación de cartílago y hueso. Conejos adultos New Zealand White son anestesiados y preparados para cirugía estéril. Se perfora un defecto de 3 x 3 mm a través del cartílago articular y dentro del hueso subcondral subyacente y dentro de la cavidad patelar de la unión de la rodilla. El defecto es dejado vacio, rellenado con esponja de colágeno (controles) o con esponja de colágeno embebida con una cantidad efectiva, por ejemplo 10 µg de las proteínas Frazzled de prueba (experimentales) . La incisión es cerrada y se deja a los animales libres de movimiento dentro de sus jaulas durante 4 semanas. Después de 4 semanas los animales son sacrificados y el defecto del cartílago articularhueso subcondral es evaluado histológicamente para determinar la arquitectura del tejido, cantidad y calidad de reparación del tejido. Después de 4 semanas, el tejido de reparación que contiene proteínas Frazzled de prueba es examinada para determinar signos de curación acelerada del hueso subcondral en comparación con los controles. El cartílago de reparación nuevamente formado sobre el hueso subcondral contiene células que muestran características arquitectónicas y propiedades de teñido similares a cartílago articular hialino normal. Las proteínas Frazzled son examinadas para determinar actividad que aumenta la capacidad del tejido dentro de un defecto osteocondral para regenerar cartílago que tiene características más consistentes con cartílago articular hialino normal.

EJEMPLO 4: Ensayo de Desarrollo Embrionario Las actividades son ensayadas usando tejido derivado a partir de embriones de Xempus laevis de etapa de gástrula en los que estaban sucediendo muchas interacciones inductivas. Estas incluían la inducción del neuroectodermo y el mesodenno, músculo notable y progenitores sanguíneos. La actividad de nuevos genes puede ser ensayada expresándolos ectópicamente en los embriones (como ARNms micro-inyectados) y analizando las secuencias. Las proteínas Frazzled de la invención fueron analizadas en cuanto a su actividad.

A. Hibridación in situ Embriones albinos fueron recolectados en varias etapas para fijación, permeabilizados con proteinasa K y pre-hibridizados. Entonces fueron hibridizados durante toda la noche con ribosondas marcadas con digoxigenina. Los embriones fueron lavados, tratados con Rnasa A y TI para eliminar el fondo y se bloquearon con Reactivo de Bloqueo de Boehringer Mannheim. Los embriones fueron incubados con anticuerpos de anti-digoxigenina conjugada con fosfatasa alcalina durante cuatro horas a temperatura ambiente, lavados en forma intensa antes de la reacción cromogénica con substrato de fosfatasa alcalina. Los embriones fueron entonces re-fijados y desteñidos para eliminar el fondo para fotografía. B. Fenotipo de la ganancia de la función en embriones completos Embriones inyectados con ARN sintético de codificación de WG67 o construcciones de ADN que expresan este gene no aumentaron. La formación de músculo es interrumpida y se nota un gran incremento en el volumen del tubo digestivo primitivo en las etapas de la maduración. Este incremento puede deberse a un aumento en la longitud del intestino, puesto que puede apreciarse un aumento en las curvas del tubo digestivo primitivo. Los embriones inyectados con WA628 muestran formación atenuada de cabeza. Se aprecia algo de expansión del tubo digestivo primitivo, pero ésta es mucho menos dramática que la observada con la WG67. Esta diferencia entre la WG67 y la WA628 en el perfil de actividad puede usarse en forma apropiada para dirigir específicamente el cambio en el tipo de tejido que se desea efectuar. C. Efectos de la expresión ectópica de WG67 y WA628 Se inyectaron embriones en la etapa de dos células con ARN sintetizado que se preparó a partir de WA628 o WG67, y fueron cosechados para análisis cuando embriones de control alcanzaron la etapa de primordio (24 horas después de la fertilización). La WA628 causa que los embriones pierdan estructuras neurales anteriores tales como el prosencéfalo y ojos, con una expansión del metencéfalo y un rompimiento de la migración de cresta neural. La WG67 aparentemente causa que los embriones pierdan tejido ventral con una sobre representación de estructuras dorsales como el prosencéfalo y glándula de .. cemento (primordio de mentón). Estos fenotipos pueden ser causados haciendo " antagonistas rutas de transducción de señal mediada por proteína wnt. 5 D. Ensayo de embrión completo. Fueron microinyectados embriones con 50 pg o 100 pg de ARN encasquillado in vitro, sintetizado, en las etapas de 2 células o 4 células. ARN de ß-galactosidasa estaba incluido como un rastreador de linaje para determinar la extensión de difusión del ARN inyectado. El producto del ARN de ß-galatosidasa fue visualizado histoquímicamente, 10 mediante teñido de X-gal. El área objetivo de estas micro-inyecciones fue la zona dorsal marginal o la zona ventral marginal de una de las 2 o 4 células. Se dejaron desarrollar los embriones hasta etapas deseadas antes de la cosecha para fijación, teñido con X-gal y fotografía. E. Perfil de expresión 15 La expresión de WG67 es cigótica . Está siempre restringida en forma ventral a un cuadrante de 60° a 90° centrado sobre la parte media ventral. En la etapa de gástrula temprana, la expresión de WG67 está restringida al ectodermo posterior y mesodermo. En la néurula temprana, la expresión se torna más anterior, en donde yace sobre el primordio del corazón. La WG67 también es expresada en el mesodermo de la futura región de formación de sangre y en el ectodermo superpuesto. La expresión de WA628 es predominantemente cigótica, con expresión por la néurula tardía en la región del prosencéfalo. F. Ensayo de casco de animal Fueron micro-inyectados embriones con 50 a 400 pg de ARN encasquillado en el 25 polo animal de una célula en etapa de 2 células. ARN de globina se usó como control. Se dejó que los embriones se desarrollaran hasta la etapa 8. Las células del polo animal de embriones fueron micro-disecados (cascos de animal) y cultivados hasta que los embriones sin inyección, intactos y fraternos alcanzaron las etapas 14 o 19. Quince cascos de animal micro-inyectados con el mismo ARN (experimental o globina) fueron acumulados para la 30 preparación de ARN total. Cinco embriones intactos fueron usados para la preparación de ARN de control de embrión completo. Estas muestras de ARN fueron transcriptas en forma inversa usando hexámero aleatorio como primarios para ADNc. Estas muestras de ADN fueron sometidas a PCR usando pares de primarios específicos de gene en la presencia de 32P-dCTP para ensayo con el propósito de determinar la presencia de ARNms correspondientes en las muestras originales de ARN. Los pares de primarios usados y el número de ciclos para cada par fueron optimizados. Los productos de estas reacciones PCR fueron subsecuentemente resueltas sobre geles de poliacrilamida. Se observaron cambios en los tipos de tejidos, que son indicativos de un rol de las Frazzleds de la invención en la hematopoiesis, formación del cerebro, formación del tubo digestivo primario y con la supresión de tejido muscular concomitante.

EJEMPLO 5: Clonación de Homólogos Frazzled Otras especies, en particular humanas, tienen secuencias de AON homólogas a Frazzled Xenopus. Secuencias de ADN que codifican por ejemplo, para Frazzleds humanas i S son aisladas mediante varias técnicas conocidas por aquellos capacitados en la técnica. La invención, por lo tanto, incluye secuencias de ADN que codifican para Frazzleds humanas y métodos para obtenerlas. Tales métodos emplean secuencias de nucleótidos de Frazzled Xenopus o porciones en el diseño de sondas para tamizar bibliotecas para gene humano o secuencias de codificación o fragmentos de ellas usando técnicas estándar. 0 De acuerdo con métodos, una secuencia Xenopus o una porción de ella es usada como sonda para tamizar una biblioteca genómica humana bajo condiciones de hibridación astringentes reducidas (por ejemplo, 0.2X SSC, 0.1% SDS, SO °C) o como una sonda para identificar una línea celular humana o tejido que sintetiza la proteína Frazzled humana análoga. Una biblioteca genómica humana, tal como catálogo Stratagene #945200 o 5 catálogo Clonetech #HL1067j, puede ser tamizada con dicha sonda, y determinados los positivos aislados y su secuencia de ADN. Una secuencia de codificación humana es usada como una sonda para identificar una línea celular humana o tejido que sintetice ARNm de Frazzled. Alternativamente, la secuencia de codificación Xenopus es usada como una sonda para identificar dicha línea 0 celular humana o tejido. Brevemente descrito, ARN es extraído de una fuente de célula o tejido seleccionada y ya sea sometida a electroforesia sobre gel de agarosa de formaldehido y transferida a nitrocelulosa, o hecha reaccionar con formaldehído y salpicada sobre nitrocelulosa directamente. La nitrocelulosa es entonces hibridizada bajo condiciones de astringencia reducida a una sonda derivada de una secuencia de codificación de la Frazzled Xenopus o humana. Líneas celular y tejidos humanos que son una fuente particularmente adecuada de ARNm Frazzled incluyen, por ejemplo, músculo, músculo esquelético, músculo cardiaco, placenta, cerebro y tejidos neuronales. Fuentes adicionales incluyen pulmón, páncreas, hígado, bazo, riflón, testículos, intestinos, así como otras líneas celulares y tejidos. Alternativamente, la secuencia de codificación de frazzled Xenopus es usada para diseñar primarios de oligonucleótidos que específicamente amplificarán una porción de la secuencia de codificación Frazzled ubicada en la región localizada entre los primarios utilizados par realizar la reacción de amplificación específica. Utilizando secuencias frazzled Xenopus y humana uno puede amplificar específicamente correspondientes secuencias de codificación frazzled humanas a partir de ARNm, ADNc o modelos de ADN genómicos. Una vez que una fuente positiva ha sido identificada mediante uno de los métodos anteriormente descritos, se selecciona ARNm mediante cromatografía de oligo (dT) celulosa y el ADNc es sintetizado y clonado en gtlO u otros vectores de bacteriófago conocidos por aquellos capacitados en la técnica, por ejemplo, ZAP, mediante técnicas establecidas. También es posible realizar la reacción de amplificación dirigida por primario de oligonucleótido, descrita anteriormente, directamente sobre una biblioteca de ADNc humana o genómica pre-establecida que ha sido clonada dentro de un vector bacteriófago. EN tales casos, una biblioteca que produce un producto de ADN amplificado en forma específica y que codifica para una porción de proteína Frazzled humana es tamizado directamente, utilizando como sonda el fragmento de ADN de codificación de Frazzled amplificada. Regiones conteniendo secuencias de aminoácidos que están altamente conservadas dentro de la familia Frazzled de proteínas son identificadas y se construyen secuencias de aminoácidos de consenso de estas regiones altamente conservadas, sobre la base de la similitud de las correspondientes regiones de las proteínas Frazzled individuales. Primarios de oligonucleótido diseñados sobre la base de la secuencia de aminoácidos de tales secuencia conservadas permiten la amplificación específica de las secuencias de codificación Frazzled humanas. Dos de tales secuencias de aminoácidos de consenso son presentadas más adelante, la primera siendo menos restrictiva: secuencia de aminoácidos de consenso: (1) SEQ ID NO: 13: Phe-Leu-Cys-Ala/Ser-Met/Leu-Tyr Phe-Ala-Pro-Ile/Val-Cys Y secuencia de aminoácidos de consenso (2): SEQ ID NO: 14: Trp-Pro-Glu-Ser/Ile-Leu-Asp Lys En donde X Y indica que cualquier residuo aminoácido puede aparecer en esa posición. Cuatro secuencias de aminoácidos de consenso adicionales incluyen las SEQ ID NOs: 15-18 como sigue. Por ejemplo, para distinguir homólogos de WA628, un 17mero degenerado es diseñado para los aminoácidos 150 a 155 como sigue: SEQ ID NO: 15: Thr-Ile-Thr-Asn-Asp-Thr Por ejemplo, para distinguir homólogos de WG67, un 17mero degenerado es diseñado para los aminoácidos 141 a 146 como sigue: SEQ ID NO: 16: Lys-Glu-Tyr-Gln-Tyr-Ala o, un 27mero degenerado diseñado para los aminoácidos 141 a 149, como sigue: SEQ ID NO: 17: Lys-Glu-Tyr-Gln-Tyr-Ala-Tyr-Lys-Glu Como todavía otro ejemplo, para distinguir homólogos tanto WA628 como de WG67, una sonda compuesta de 17mero para cubrir todas las posibilidades para los aminoácidos 288 a 293 y los aminoácidos 275 a 280 de la WG67-19 es diseñada como sigue: SEQ ID NO: 18 : Trp-Lys/Arg-Asn/His-His-Lys-Cys Primarios de oligonucleótido degenerado que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 y/o 18 son sintetizados en un sintetizador de ADN automatizado. Estos oligonucleótidos son utilizados como primarios para permitir la amplificación específica de una secuencia de nucleótidos específica procedente de ADNc genómico humano o ADNc humano usando técnicas de amplificación de PCR conocidas por aquellos capacitados en la técnica. Los productos de las reacciones de amplificación resultan en la identificación de secuencias de codificación de Frazzled humana. Usando técmcas moleculares estándar, estos productos de amplificación son usados para tamizar bibliotecas de ADNc para obtener clonas que contienen las secuencias de codificación Frazzled humana completas. Métodos adicionales conocidos por aquellos capacitados en la técnica también pueden ser usados para aislar proteínas Frazzled humanas y otras especies de la invención.

EJEMPLO 6: Ensayo de Células Madre Embrionarias. Pueden ensayarse con facilidad los efectos de proteínas Frazzled de la presente invención sobre los efectos del crecimiento y diferenciación in vitro de un número de líneas celulares madre embrionarias y disponibles. Una de tales línea celular es la ES-E14TG2, la cual está disponible en la American Type Culture Collection, en Rockville, Md. Para realizar los ensayos, se propagan células en la presencia de 100 unidades de LIF para mantenerlas en un estado no diferenciado. Los ensayos son iniciados removiendo primeramente el LIF y agregando las células en suspensión, en lo que se conoce como cuerpo embroides. Después de 3 días los cuerpos embroides son colocados en placa sobre placas recubiertas de gelatina (placas de 12 pozos para análisis PCR, placas de 24 pozos para inmunocitoquímica) y tratadas con las proteínas a ser probadas. Se suministra a las células los nutrientes y se tratan con el factor de proteína cada 2-3 días. Las células pueden ser adaptadas para que el ensayo sea conducido en medio complementado con 15% de Suero de Bovino Fetal (FBS) o con medio definido de CDM conteniendo mucho menores cantidades de FBS. Al final del periodo de tratamiento (variando de 7 a 21 días) el ARN es cosechado de las células y analizado mediante PCR múltiplex cuantitativa para los siguientes marcadores: Brachury, un marcador de mesodermo, AP-2, un marcador del ectodermo, y HNF-3, un marcador del endodermo. A través de la inmunocitoquímica, también es posible detectar la diferenciación de células neuronales (glia y neuronas), células de músculo (cardiomiocitos, músculo esquelético y suave), y varios otros marcadores de fenotipo tales como proteína de núcleo de proteoglican (cartílago), y citoqueratinas (epidermis). Puesto que estas células tienen una tendencia a diferenciarse autónomamente cuando el LIF es eliminado, los resultados son siempre cuantificados por comparación a un control no tratado. La descripción precedente detalla modalidades actualmente preferidas de la presente invención. Numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la misma se espera que se les ocurra a aquellos capacitados en la técnica al considerar esta descripción. Esas modificaciones y variaciones son parte de la presente invención y se cree que están comprendidas dentro de las reivindicaciones anexas a esto. La descripción de todas las publicaciones y solicitudes de patente que son citadas en esta descripción por medio de la presente se incorporan como referencias para la descripción aquí contenida.

LISTADO DE SECUENCIAS v (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Racie, Lisa et al. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de nucleótidos Frazzled, productos de expresión, composiciones y usos. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 18 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) REMITENTE: GENETICS INSTITUTE, INC. (B) CALLE: 87 CAMBRIDGEPARK DRIVE (C) CIUDAD: CAMBRIDGE (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EUA v - (F) CÓDIGO POSTAL: 02140 (V) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: EUA 08/893,654 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: M.C. Meinert (B) NÚMERO DE REGISTRO: 31,544 (C) NÚMERO DE REREFENCIA/EXPEDIENTE: GI 5279 (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (617) 498-8574 (B) TELEFAX: (617) 876-5851 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2190 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 58..873 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2190 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 44..889 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:1: GAATTCCATA GCAACAAACA GTACCCATAG CAACAAACAG TAC ATG ACT GGA GTC 55 Met Thr Gly Val 1 TTC CTG CTC CTC TGC GCC TCC ATG CTG GCC GCC GCC GCC GCC TTT GAC 103 Phe Leu Leu Leu Cys Ala Ser Met Leu Ala Ala Ala Ala Ala Phe Asp 5 10 15 20 ATT GGA TTA TCC ACC AAG TGC GTT CCC ATT CCC AAA GAG ATG GCC ATG 151 lie Gly Leu Ser Thr Lys Cys Val Pro lie Pro Lys Glu Met Ala Met 25 30 35 TGC AAT GAC GTC GGC TAC TCG GAG ATG CGG TTG CCA AAC CTG TTG GGA 199 Cys Asn Asp Val Gly Tyr Ser Glu Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu Gly 40 45 50 CAC ACT AAC ATG GCA GAA GTC GTG CCC AAG TCA GCA GAG TGG CAG AAC 247 His Thr Asn Met Ala Glu Val Val Pro Lys Ser Ala Glu Trp Gln Asn 55 60 65 CTC CTA CAG ACC GGC TGC CAC CCC TAT GCC AGG ACC TTC CTA TGC TCC 295 Leu Leu Gln Thr Gly Cys His Pro Tyr Ala Arg Thr Phe Leu Cys Ser 70 75 80 CTA TTC GCC CCA GTC TGC CTG GAC ACG TTC ATC CAG CCC TGC CGC AGC 343 Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Thr Phe lie Gln Pro Cys Arg Ser 85 90 95 100 ATG TGT GTT GCT GTA AGA AAC AGT TGT GCT CCA GTT CTG GCA TGT CAT 391 Met Cys Val Ala Val Arg Asn Ser Cys Ala Pro Val Leu Ala Cys His 105 110 115 GGG CAC TCC TGG CCT GAG AGC TTA GAC TGT GAC AGG TTC CCA GCT GGG 439 Gly His Ser Trp Pro Glu Ser Leu Asp Cys Asp Arg Phe Pro Ala Gly 120 125 130 GAA GAC ATG TGT CTG GAC ACT CTC AGC AAA GAG TAT CAG TAT GCC TAT 487 Glu Asp Met Cys Leu Asp Thr Leu Ser Lys Glu Tyr Gln Tyr Ala Tyr 135 140 145 AAA GAA CTG CCA AAG CCA AGC TGC CAG GGC TGC CCA CTT ATT GAA GAA 535 Lys Glu Leu Pro Lys Pro Ser Cys Gln Gly Cys Pro Leu lie Glu Glu 150 155 160 " " TTC TTT TCA CAC AAG ACA GTC TTG GAA GCT TTT TGT GAC AAT AAC TTT 583 Phe Phe Ser His Lys Thr Val Leu Glu Ala Phe Cys Asp Asn Asn Phe 165 170 175 180 GCT GTT AAA GTG AAA TTG GCA AAG AAG AAA ACA ACT TCA GGA CTT CAT 531 Ala Val Lys Val Lys Leu Ala Lys Lys Lys Thr Thr Ser Gly Leu His 185 190 195 GAA TAT GAG ACC GAA GGC CCA GTT GAG TTC ATT AAA CAA GGT CTG CTC 679 Glu Tyr Glu Thr Glu Gly Pro Val Glu Phe lie Lys Gln Gly Leu Leu 200 205 210 CTT CCA TAT GAC ACA CGT ACC ATG ATT GAA CAG TGG CTG CTG ATT AAT 727 Leu Pro Tyr Asp Thr Arg Thr Met lie Glu Gln Trp Leu Leu lie Asn 215 220 225 GAG AAT TGT GCT CAG AAG CTG ATA CGG AAC AGA CCC ACA GTG TAT GTT 775 Glu Asn Cys Ala Gln Lys Leu lie Arg Asn Arg Pro Thr Val Tyr Val 230 235 240 ATT GCT GGT GAC ATC CAT CAT GGA AAG ATT AAA ATC TTC TGC TCC CCC 823 lie Ala Gly Asp lie His His Gly Lys lie Lys lie Phe Cys Ser Pro 245 250 255 260 TGT GTA CTC AGA GAA TGG AAC ACG ACT TAC TTT TTC AGG CAG AGA CTA 871 Cys Val Leu Arg Glu Trp Asn Thr Thr Tyr Phe Phe Arg Gln Arg Leu 265 270 275 TAC ATT ACA AGA ATT TGA AAATAACAAA AAAATTCACC AGCACCTCGG 919 Tyr lie Thr Arg lie * 280 , - ACTACCAAAT GAGCGTCTTG CTCTATATGT CCTTAGAAAT CAAGGGCTTG TTCCGGAGCA 979 TGTTGAAACT AGAACTTTGT ATAGCACTTT CCAGCCAAAC ATTTCCCAGG GGAAACTAGA 1039 AATGTGGGTT GATGTTTTTC CAAAAAGTTT AGGACCTCCT GGACCACCAT TCAATATTAC 1099 TCCTCGCAAA GCAAAGAAGT ATGTACTTCG TGTTATCGTT TGGAATACCA AAGATGTCAT 1159 TCTAGATGAG AAAAGTATTA CTGGAGAAGA AATGAGTGAT ATTTATGTGA AGGGGTGGAT 1219 TCCTGGCAAT GAAGAAAATA AGCAGAAAAC AGATGTGCAC TACAGGTCAC TGGATGGGGA 1279 AGGAAACTTT AACTGGAGAT TTGTTTTTCC ATTTGAATAT CTGCCGGCCG AACAGCTGTG 1339 CATTGTTTCT AAAAAGGAAC ATTTCTGGAG CCTTGACAAT ACAGAATTTA AGCTGCCACC 1399 CAAACTAATT CTTCAGATAT GGGACAATGA TAAATTCTCC TTGGATGACT ATTTAGGTTT 1459 TGTAGAACTT GATTTACATC GAGCAACAAT GCCTGCAAAA GTTCCAGAGA AATGCACTTT 1519 AGACTTAGTT GACCAGGCCA ACCATTCAAA GGTGGCCTCT CTGTTTGAGC AGAAATCCAT 1579 GAAGGGATGG TGGCCATGCT ATGCAGAAAA AGATGGAAAA CGGATATTAT CTGGGAAAAT 1639 TGAGATGACC CTTGAGGTAC TGAATGAAAA AGAGGCTGAC GAACGGCCTG CTGGCAAGGG 1699 ACGAGATGAG CCCAACATGA ACCCCAAGTT AGAGCTACCA AACCGGCCAG ACACCTCCTT 1759 CCTCTGGTTT ACAAACCCAT GCAAGACCAT GAAATTTATC ATATGGCGCA GATTTAAATG 1819 GGTATTTATT GGACTCATCG TCCTGCTCCT TGTACTTCTG TTCCTTGCAG TCTTCTTCTA 1879 TTCTTTGCCG GGCTATGTTT CTATGAAGAT TGTGAAACCC AATGTATAAG AACAGCAACG 1939 AAATGCCAAC ATGGACCATA CTCTCCCTAC TTAACTTAAT GAATTTATAT TCTTAAAACT 1999 TGAAAAAAGA GACAAAGTGA ATCTTAGAGA AAAAAAACAC CCACCACGTA CTTTATTTCA 2059 CACAAGCCTT GGGTGCAGGG TTCAACATTT GTACACTTAT ATACAAAGCT TACATATCAC 2119 TACTTTTTTT ATTCCATGGG TTCACACTCA ACTGTGATAA TGTGTTTTTC TCTTTATAAT 2179 AGAACCATAT G 2190 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 281 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Thr Gly Val Phe Leu Leu Leu Cys Ala Ser Met Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Phe Asp lie Gly Leu Ser Thr Lys Cys Val Pro lie Pro Lys 20 25 30 Glu Met Ala Met Cys Asn Asp Val Gly Tyr Ser Glu Met Arg Leu Pro 35 40 45 Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Met Ala Glu Val Val Pro Lys Ser Ala 50 55 60 Glu Trp Gln Asn Leu Leu Gln Thr Gly Cys His Pro Tyr Ala Arg Thr 65 70 75 80 Phe Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Thr Phe lie Gln 85 90 95 Pro Cys Arg Ser Met Cys Val Ala Val Arg Asn Ser Cys Ala Pro Val 100 105 110 Leu Ala Cys His Gly His Ser Trp Pro Glu Ser Leu Asp Cys Asp Arg 115 120 125 Phe Pro Ala Gly Glu Asp Met Cys Leu Asp Thr Leu Ser Lys Glu Tyr 130 135 140 Gln Tyr Ala Tyr Lys Glu Leu Pro Lys Pro Ser Cys Gln Gly Cys Pro 145 150 155 160 Leu lie Glu Glu Phe Phe Ser His Lys Thr Val Leu Glu Ala Phe Cys 165 170 175 Asp Asn Asn Phe Ala Val Lys Val Lys Leu Ala Lys Lys Lys Thr Thr 180 185 190 Ser Gly Leu His Glu Tyr Glu Thr Glu Gly Pro Val Glu Phe lie Lys 195 200 205 Gln Gly Leu Leu Leu Pro Tyr Asp Thr Arg Thr Met lie Glu Gln Trp 210 215 220 Leu Leu lie Asn Glu Asn Cys Ala Gln Lys Leu lie Arg Asn Arg Pro 225 230 235 240 Thr Val Tyr Val lie Ala Gly Asp lie His His Gly Lys lie Lys lie 245 250 255 Phe Cys Ser Pro Cys Val Leu Arg Glu Trp Asn Thr Thr Tyr Phe Phe 260 265 270 Arg Gln Arg Leu Tyr lie Thr Arg lie 275 280 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1140 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) UBICACIÓN: 8..850 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CTCGAGC ATG ACT GGA GTC TTC CTG CTC CTC TGC GCC TCC ATG CTG GCC Met Thr Gly Val Phe Leu Leu Leu Cys Ala Ser Met Leu Ala 1 5 10 GCC GCC GCC TTT GAC ATT GGA TTA TCC ACC AAG TGC GTT CCC ATT CCC Ala Ala Ala Phe Asp lie Gly Leu Ser Thr Lys Cys Val Pro lie Pro 15 20 25 30 AAA GAG ATG GCC ATG TGC AAT GAC GTC GGC TAC TCG GAG ATG CGG TTG 145 Lys Glu Met Ala Met Cys Asn Asp Val Gly Tyr Ser Glu Met Arg Leu 35 40 45 CCA AAC CTG TTG GGA CAC ACT AAC ATG GCA GAA GTC GTG CCC AAG TCA 193 Pro Asn Leu Leu Gly His Thr Asn Met Ala Glu Val Val Pro Lys Ser 50 55 60 GCA GAG TGG CAG AAC CTC CTA CAG ACC GGC TGC CAC CCC TAT GCC AGG 241 Ala Glu Trp Gln Asn Leu Leu Gln Thr Gly Cys His Pro Tyr Ala Arg 65 70 75 ACC TTC CTA TGC TCC CTA TTC GCC CCA GTC TGC CTG GAC ACG TTC ATC 289 Thr Phe Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Thr Phe lie 80 85 90 CAG CCC TGC CGC AGC ATG TGT GTT GCT GTA AGA AAC AGT TGT GCT CCA 337 Gln Pro Cys Arg Ser Met Cys Val Ala Val Arg Asn Ser Cys Ala Pro 95 100 105 110 GTT CTG GCA TGT CAT GGG CAC TCC TGG CCT GAG AGC TTA GAC TGT GAC 385 Val Leu Ala Cys His Gly His Ser Trp Pro Glu Ser Leu Asp Cys Asp 115 120 125 AGG TTC CCA GCT GGG GAA GAC ATG TGT CTG GAC ACT CTC AGC AAA GAG 433 Arg Phe Pro Ala Gly Glu Asp Met Cys Leu Asp Thr Leu Ser Lys Glu 130 135 140 TAT CAG TAT GCC TAT AAA GAA CTG CCA AAG CCA AGC TGC CAG GGC TGC 481 Tyr Gln Tyr Ala Tyr Lys Glu Leu Pro Lys Pro Ser Cys Gln Gly Cys 145 150 155 CCA CTT ATT GAA GAA TTC TTT TCA CAC AAG ACA GTC TTG GAA GCT TTT 529 Pro Leu lie Glu Glu Phe Phe Ser His Lys Thr Val Leu Glu Ala Phe 160 165 170 TGT GAC AAT AAC TTT GCT GTT AAA GTG AAA TTG GCA AAG AAG AAA ACA 577 Cys Asp Asn Asn Phe Ala Val Lys Val Lys Leu Ala Lys Lys Lys Thr 175 180 185 190 ACT TCA GGA CTT CAT GAA TAT GAG ACC GAA GGC CCA GTT GAG TTC ATT 625 Thr Ser Gly Leu His Glu Tyr Glu Thr Glu Gly Pro Val Glu Phe lie 195 200 205 AAA CAA GGT CTG CTC CTT CCA TAT GAC ACA CGT ACC ATG ATT GAA CAG Lys Gln Gly Leu Leu Leu Pro Tyr Asp Thr Arg Thr Met lie Glu Gln 210 215 220 TGG CTG CTG ATT AAT GAG AAT TGT GCT CAG AAG CTG ATA CGG AAC AGA Trp Leu Leu lie Asn Glu Asn Cys Ala Gln Lys Leu lie Arg Asn Arg 225 230 235 CCC ACA GTG TAT GTT ATT GCT GGT GAC ATC CAT CAT GGA AAG GTT AAA 769 Pro Thr Val Tyr Val lie Ala Gly Asp lie His His Gly Lys Val Lys 240 245 250 GTC AAC AGG GTT TTC CAC TGG CAG AAA AAG GAC TCT CAG CTG ACA CTT Val Asn Arg Val Phe His Trp Gln Lys Lys Asp Ser Gln Leu Thr Leu 255 260 265 270 GCC ACA AGG AGG TGG AGA CAC CAT AAA TGT TAA TACAGTTCTT GTACTTCACT Ala Thr Arg Arg Trp Arg His His Lys Cys * 27 280 GTATGTAAAT ACACAAGGCA CTCTTTTTTA AAAGGACTAT AAATATATAT ATATATATAT 930 ATATATATAT ATAGTAAAAC ATAAAGACTT ATTATAACAG CTGGATTGAG CGCATCCCAT 990 TACCATGCTG AAGAGGAAAT ACTATAAAAT TGCAGCAATT ATATGAACAT TGTATAAACT 1050 GAGCAAATAT TATATGTATA AAGTGAGAAA ATATTAAATA TTTATAACGG AAAAAAAAAA 1110 AAAAAAAAAA AAACTCGATC GATGGGATCC 1140 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 280 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Met Thr Gly Val Phe Leu Leu Leu Cys Ala Ser Met Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Phe Asp lie Gly Leu Ser Thr Lys Cys Val Pro lie Pro Lys Glu 20 25 30 - Met Ala Met Cys Asn Asp Val Gly Tyr Ser Glu Met Arg Leu Pro Asn , 35 40 45 Leu Leu Gly His Thr Asn Met Ala Glu Val Val Pro Lys Ser Ala Glu 50 55 60 Trp Gln Asn Leu Leu Gln Thr Gly Cys His Pro Tyr Ala Arg Thr Phe 65 70 75 80 Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Thr Phe lie Gln Pro 85 90 95 Cys Arg Ser Met Cys Val Ala Val Arg Asn Ser Cys Ala Pro Val Leu 100 105 110 Ala Cys His Gly His Ser Trp Pro Glu Ser Leu Asp Cys Asp Arg Phe 115 120 125 Pro Ala Gly Glu Asp Met Cys Leu Asp Thr Leu Ser Lys Glu Tyr Gln 130 135 140 Tyr Ala Tyr Lys Glu Leu Pro Lys Pro Ser Cys Gln Gly Cys Pro Leu 145 150 155 160 lie Glu Glu Phe Phe Ser His Lys Thr Val Leu Glu Ala Phe Cys Asp 165 170 175 Asn Asn Phe Ala Val Lys Val Lys Leu Ala Lys Lys Lys Thr Thr Ser 180 185 190 Gly Leu His Glu Tyr Glu Thr Glu Gly Pro Val Glu Phe lie Lys Gln 195 200 205 Gly Leu Leu Leu Pro Tyr Asp Thr Arg Thr Met lie Glu Gln Trp Leu 210 215 220 Leu lie Asn Glu Asn Cys Ala Gln Lys Leu lie Arg Asn Arg Pro Thr 225 230 235 240 Val Tyr Val lie Ala Gly Asp lie His His Gly Lys Val Lys Val Asn 245 250 255 Arg Val Phe His Trp Gln Lys Lys Asp Ser Gln Leu Thr Leu Ala Thr 260 265 270 Arg Arg Trp Arg His His Lys Cys 275 280 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1146 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) UBICACIÓN: 80..967 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: GAATTCCCAT AGCAACAAAC AGTACATCAT TTGGGAAGGA GAAACATTTG TCTTTTGTGC ATCCATAAGG AAAATCCCA ATG GCC CCT CAG CTG TGT CAG AGC CTG GGA AAG Met Ala Pro Gln Leu Cys Gln Ser Leu Gly Lys 1 5 10 CCA CTG ATT GTT TTG CTG TGC TTC TTG GCG TGT GGC TCG CAA TCT ATG Pro Leu lie Val Leu Leu Cys Phe Leu Ala Cys Gly Ser Gln Ser Met 15 20 25 TAT CTG GAC TTC TTT GGC AGC TCC TCA AGA TGC ATG CGA ATC CCA AAG Tyr Leu Asp Phe Phe Gly Ser Ser Ser Arg Cys Met Arg lie Pro Lys 30 35 40 AGT ATG GCT CTC TGC TAT GAC ATT GGA TAT TCG GAG ATG AGG ATC CCC 256 Ser Met Ala Leu Cys Tyr Asp lie Gly Tyr Ser Glu Met Arg lie Pro 45 50 55 AAC TTG CTG GAA CAT GAG ACG ATG GCC GAG GCA ATC CAA CAA TCC TCA 304 Asn Leu Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Ala lie Gln Gln Ser Ser 60 65 70 75 AGC TGG TTA CCT CTT TTG GCA AGA GAG TGC CAT CCT GAT GCA AGA ATA 352 Ser Trp Leu Pro Leu Leu Ala Arg Glu Cys His Pro Asp Ala Arg lie 80 85 90 TTC CTC TGC TCA CTC TTT GCA CCT ATT TGC TTT GAT CGG TAT ATC TTC 400 Phe Leu Cys Ser Leu Phe Ala Pro lie Cys Phe Asp Arg Tyr lie Phe 95 100 105 CCA TGT CGC AGT CTG TGT GAG GCT GTA AGG AGC AGC TGT GCC CCT ATC 448 Pro Cys Arg Ser Leu Cys Glu Ala Val Arg Ser Ser Cys Ala Pro lie 110 115 120 ATG GCC TGT TAT GGG TAC CCT TGG CCT GAG ATC CTC AAA TGC GAT AAG 496 Met Ala Cys Tyr Gly Tyr Pro Trp Pro Glu lie Leu Lys Cys Asp Lys 125 130 135 TTT CCT GAA GAC CAC GGC ATG TGT ATC TCA ACT ATC ACA AAT GAT ACT 54 Phe Pro Glu Asp His Gly Met Cys lie Ser Thr lie Thr Asn Asp Thr 140 145 150 155 GGT TCT ACC CGT AGA ACA GTG CCC CGA GCC AGC TGT AGA GAC TGT GAA 592 Gly Ser Thr Arg Arg Thr Val Pro Arg Ala Ser Cys Arg Asp Cys Glu 160 165 170 CTT GAA GAA GGC AGC ACT TCC AAG GAG ATA CTG GAT ACA TTC TGC CAT 640 Leu Glu Glu Gly Ser Thr Ser Lys Glu lie Leu Asp Thr Phe Cys His 175 180 185 AAT GAT TTT GTT GCC AAG GTC CGT ATC ACC AAA AAG AAC ATC ACT TCC 688 Asn Asp Phe Val Ala Lys Val Arg lie Thr Lys Lys Asn lie Thr Ser 190 195 200 GCT AAC CTT TAC GAC TTT GAT TTG GAT TCC AAA CTT GAG ATC CTG AAA 736 Ala Asn Leu Tyr Asp Phe Asp Leu Asp Ser Lys Leu Glu lie Leu Lys 205 210 215 CAC GGC TCG TTA CCC AAA ACA GAC GTC CTT CCT AGG CTT CAG CAG TGG 784 His Gly Ser Leu Pro Lys Thr Asp Val Leu Pro Arg Leu Gln Gln Trp 220 225 230 235 CTG GAT CTG GAT GCT ACC TGT GTG CAG AAT ATC ATG CGT GGG ACC CGC 832 Leu Asp Leu Asp Ala Thr Cys Val Gln Asn lie Met Arg Gly Thr Arg 240 245 250 ACA GGC GTC TAT GTG ATT TGT GCA GAA GTG CAA GAG GGG AAG GTA GTG 880 Thr Gly Val Tyr Val lie Cys Ala Glu Val Gln Glu Gly Lys Val Val 255 260 265 o 52 GTG AAC AAT GCC TAC GCA TGG CAG AAA AAG AAC AAA AAC CTG CAT TTC 928 Val Asn Asn Ala Tyr Ala Trp Gln Lys Lys Asn Lys Asn Leu His Phe 270 275 280 GCT GTA CGG AAA TGG AAG AAT CAC AAG TGT CGA CCA TAG GAATTCCCAA 977 Ala Val Arg Lys Trp Lys Asn His Lys Cys Arg Pro * 285 290 295 TTCGTTGTAC AGAAACCAAA GTCCTGTGTT GTGAAATAGT AGAAGCAGGG GCATTCACGA 1037 GAACTGTATA TAATACTGTA TATATCTATG TTAACTTACT ATAAAACCTT ATTGATAAAA 1097 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ?????????? AACTCGAGC 1146 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 295 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Met Ala Pro Gln Leu Cys Gln Ser Leu Gly Lys Pro Leu lie Val Leu 1 5 10 15 Leu Cys Phe Leu Ala Cys Gly Ser Gln Ser Met Tyr Leu Asp Phe Phe 20 25 30 Gly Ser Ser Ser Arg Cys Met Arg lie Pro Lys Ser Met Ala Leu Cys 35 40 45 Tyr Asp lie Gly Tyr Ser Glu Met Arg lie Pro Asn Leu Leu Glu His 50 55 60 Glu Thr Met Ala Glu Ala lie Gln Gln Ser Ser Ser Trp Leu Pro Leu 65 70 75 80 Leu Ala Arg Glu Cys His Pro Asp Ala Arg lie Phe Leu Cys Ser Leu 85 90 95 Phe Ala Pro lie Cys Phe Asp Arg Tyr lie Phe Pro Cys Arg Ser Leu 100 105 110 Cys Glu Ala Val Arg Ser Ser Cys Ala Pro lie Met Ala Cys Tyr Gly 115 120 125 Tyr Pro Trp Pro Glu lie Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro Glu Asp His 130 135 140 Gly Met Cys lie Ser Thr lie Thr Asn Asp Thr Gly Ser Thr Arg Arg 145 150 155 160 Thr Val Pro Arg Ala Ser Cys Arg Asp Cys Glu Leu Glu Glu Gly Ser 165 170 175 Thr Ser Lys Glu lie Leu Asp Thr Phe Cys His Asn Asp Phe Val Ala 180 185 190 Lys Val Arg lie Thr Lys Lys Asn lie Thr Ser Ala Asn Leu Tyr Asp 195 200 205 Phe Asp Leu Asp Ser Lys Leu Glu lie Leu Lys His Gly Ser Leu Pro 210 215 220 Lys Thr Asp Val Leu Pro Arg Leu Gln Gln Trp Leu Asp Leu Asp Ala 225 230 235 240 Thr Cys Val Gln Asn lie Met Arg Gly Thr Arg Thr Gly Val Tyr Val 245 250 255 lie Cys Ala Glu Val Gln Glu Gly Lys Val Val Val Asn Asn Ala Tyr 260 265 270 Ala Trp Gln Lys Lys Asn Lys Asn Leu His Phe Ala Val Arg Lys Trp 275 280 285 Lys Asn His Lys Cys Arg Pro 290 295 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 502 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CATGACTGGA GTCTTCCTGC TCCTCTGCGC CTCCATGCTG GCCGCCGCCG CCGCCTTTGA 60 CATTGGATTA TCCACCAAGT GCGTTCCCAT TCCCAAAGAG ATGGCCATGT GCAATGACGT 120 CGGCTACTCG GAGATGCGGT TGCCAAACCT GTTGGGACAC ACTAACATGG CAGAAGTCGT 180 GCCCAAGTCA GCAGAGTGGC AGAACCTCCT ACAGACCGGC TGCCACCCCT ATGCCAGGAC 240 CTTCCTATGC TCCCTATTCG CCCCAGTCTG CCTGGACACG TTCATCCAGC CCTGCCGCAG 300 CATGTGTGTT GCTGTAAGAA ACAGTTGTGC TCCAGTTCTG GCATGTCATG GGCACTCCTG 360 GCCTAAGAGC TTAGACTGTG ACAGGTTCCC AGCTGGGGAA GACATGTGTC TGGACACTCT 20 CAGCAAAGAG TATCAGTATG CCTATAAAGA ACTGCCAAAG CCAAGCTGCC AGGGCTGCCC 480 ACTTATTGAA GAATTCTTTT CA 502 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8 CATGGGCAGC TCGAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9 CTGCAGGCGA GCCTGAATTC CTCGAGCCAT CATG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 68 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: CGAGGTTAAA AAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC TTTGAAAAAC ACGATTGC (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 ATACATAGAT TGCGAGCCAC ACGCCAA (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12 ACGCACTTGG TGGATAATCC AATGTCA (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13 Phe Leu Cys Xaa Xaa Xaa Ala Pro Xaa Cys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14 Trp Pro Glu Xaa Leu Xaa 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 Thr lie Thr Asn Asp Thr 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Lys Glu Tyr Gln Tyr Ala 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17 Lys Glu Tyr Gln Tyr Ala Tyr Lys Glu 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA Trp Xaa Xaa His Lys Cys

Claims

Novedad de la Invención 1. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteina que tiene actividad de proteína Frazzled y que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en: (a) nucleótídos #44 a #889 de la SEQ ID NO: 1 ; (b) nucleótídos #8 a #850 de la SEQ ID NO: 3; (c) nucleótídos #80 a #967 de la SEQ ID NO: 5; y (d) SEQ ID NO: 7.
2. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína que tiene actividad de proteína Frazzled y que hibridiza a una secuencia de ADN de la reivindicación 1 bajo condiciones de hibridación astringentes.
3. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína que tiene actividad de proteína Frazzled y que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en: (a) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; (b) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; y (c) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
4. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína que tiene actividad de proteína Frazzled y que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en: (a) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; y (b) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
5. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína que tiene actividad de proteína Frazzled y que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en: (a) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (b) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; (c) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y (d) nucleótídos que codifican para los aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
6. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína que tiene actividad de proteína Frazzled y que bibridiza a un ADN de la reivindicación 3 bajo condiciones de hibridación astringentes.
7. Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína que tiene actividad 5 de proteína Frazzled y que bibridiza a un ADN de la reivindicación 5 bajo condiciones de hibridación astringentes.
8. Un vector que comprende una molécula de ADN de la reivindicación 1, en asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello.
9. Un vector que comprende una molécula de ADN de la reivindicación 3, en 10 asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello.
10. Una célula hospedera transformada con un vector de la reivindicación 8.
11. Una célula hospedera transformada con un vector de la reivindicación 9.
12. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo consistente en: i S (a) nucleótidos #44 a #889 de la SEQ ID NO: 1 ; (b) nucleótidos #8 a #850 de la SEQ ID NO: 3; (c) nucleótidos #80 a #967 de la SEQ ID NO: 5; y (d) SEQ ID NO: 7.
13. Un vector que comprende una molécula de ADN de la reivindicación 12 en 0 asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello.
14. Una célula hospedera transformada con un vector de la reivindicación 13.
15. Una molécula de ADN aislada y que codifica para una proteína seleccionada del grupo formada por WG67-16, WG67-19 y WA628.
16. Una molécula de ADN aislada, de conformidad con la reivindicación 15, 5 comprendiendo además una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido 5* señal de propéptido adecuado para y ligado en marco a la secuencia de codificación de ADN.
17. Un vector que comprende una molécula de ADN de la reivindicación 16 en asociación operativa con una secuencia de control de expresión para ello.
18. Una célula hospedera transformada con un vector de la reivindicación 17. 0
19. Una molécula de ADN aislada que comprende los nucleótidos #44 a #889 de la SEQ ID NO: 1.
20. Una molécula de ADN aislada que comprende los nucleótidos #8 a #850 de la SEQ ID NO: 3.
21. Una molécula de ADN aislada que comprende los nucleótidos #80 a #867 de la SEQ ID NO: 5.
22. Una molécula de ADN aislada que comprende la SEQ ID NO: 7.
23. Una molécula de ADN aislada que comprende el ADN del ATCC 98430.
24. Una molécula de ADN aislada que comprende el ADN del ATCC 98432.
25. Una molécula de ADN aislada que comprende el ADN del ATCC 98434.
26. Un método para la producción de proteína Frazzled, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1 ; y (b) recuperar dicha proteína Frazzled.
27. Un método para la producción de proteína Frazzled, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 3; y (b) recuperar dicha proteína Frazzled.
28. Un método para la producción de proteína Frazzled, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que comprende la SEQ ID NO: 1 ; y (b) recuperar dicha proteína Frazzled.
29. Un método para la producción de proteína Frazzled, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que comprende la SEQ ID NO: 3; y (b) recuperar dicha proteína Frazzled.
30. Un método para la producción de proteína Frazzled, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que comprende la SEQ ID NO: 5; y (b) recuperar dicha proteína Frazzled.
31. Un método para la producción de WG67-16, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que codifica para WG67-16 Frazzled; y (b) recuperar dicha WG67- 16.
32. Un método para la producción de WG67-19, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que codifica para WG67-19 Frazzled; y (b) recuperar dicha WG67-19.
33. Un método para la producción de WG628, dicho método comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula hospedera transformada con una secuencia de ADN que codifica para WG628 Frazzled; y (b) recuperar dicha WG628.
34. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos #44 a #889 de la SEQ ID NO: 1.
35. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos #8 a #850 de la SEQ ID NO: 3.
36. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos #80 a #967 de la SEQ ID NO: S.
37. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de ADN de la SEQ ID NO: 7.
38. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16 y 17.
39. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual es codificado por una secuencia de ADN de la reivindicación 1.
40. Un polipéptido Frazzled purificado, el cual es codificado por una secuencia de ADN de la reivindicación 3.
41. Una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polipéptido Frazzled de conformidad con la reivindicación 39.
42. Una composición que comprende una cantidad terapéutica de un polipéptido Frazzled de conformidad con la reivindicación 40.
43. Un método para la modulación de la regulación de genes pancreáticos, el cual comprende la adrninistración de una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 41.
44. Una proteína Frazzled purificada, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
45. Una proteína Frazzled purificada, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
46. Una proteína Frazzled purificada, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
47. Anticuerpos para un polipéptido Frazzled purificado de la reivindicación 39.
48. Una proteína Frazzled purificada que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 kd.
49. Anticuerpos para una proteína Frazzled purificada seleccionada del grupo consistente en WG67-16, WG67-19 y WA628.
50. Un método para la modulación del desarrollo celular, el cual comprende la administración de una cantidad efectiva de una proteína Frazzled.
51. El método de la reivindicación 50, en donde dicha célula es un tejido seleccionado del grupo consistente en hematopoiético, del tubo digestivo primitivo, neurona! y músculo. i? 63
52. El método de la reivindicación SO, en donde dicha proteína Frazzled es codificada por una secuencia de ADN de la reivindicación 1.
53. El método de la reivindicación 50, en donde dicha proteína Frazzled es codificada por una secuencia de ADN de la reivindicación 2.
54. El método de la reivindicación 50, en donde dicho método comprende la administración de la composición a un paciente in vivo.
55. Un método para la modulación de los efectos de los genes wnt, el cual comprende la etapa de admimstrar una cantidad efectiva de proteína Frazzled codificada por un ADN de la reivindicación 1.
56. Un método para la modulación de los efectos de los genes wnt, el cual comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de proteína Frazzled codificada por un ADN de la reivindicación 3.
57. Un método para la modulación de los efectos de los genes wnt, el cual comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de proteína Frazzled codificada por un ADN de la reivindicación 5.
58. Un método para la modulación de la actividad de proteínas wnt, el cual comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de proteína Frazzled codificada por un ADN de la reivindicación 5.
59. Un método para inducir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y mantenimiento, el cual comprende la administración de una cantidad efectiva de una proteína Frazzled codificada por un ADN de la reivindicación 5.
60. Un método para inducir la formación de condrocitos y/o tejido de cartílago, el cual comprende la administración a células progenitoras de una composición comprendiendo una proteína Frazzled codificada por un ADN de la reivindicación 5.
61. El método de la reivindicación 60, en donde dicho método comprende la administración de la composición a células in vitro y recuperación de condrocitos y/o tejido de cartílago. Extracto de la Descripción Se describen proteínas Frazzled purificadas, incluyendo WG67-16, WG67-19 y WA628 y los procesos para su fabricación. También se describen moléculas de ADN que codifican para las proteínas Frazzled, incluyendo WG67-16, WG67-19 y WA628. Las proteínas pueden ser usadas en la modulación de la unión de genes Wnt a sus receptor. Ellas son útiles en la modulación de la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios. También ellas son útiles en el tratamiento de varios desórdenes asociados con defectos en la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento celular de una variedad de tejidos y órganos adultos y embrionarios, incluyendo, por ejemplo, tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares, cerebrales, pulmonares, pancreáticos, hepáticos, del bazo, renales, intestinales y/u otros tejidos y órganos. Además, las proteínas pueden ser usadas para inducir la formación, crecimiento, diferenciación, proliferación y/o mantenimiento de tejidos hematopoiéticos, del tubo digestivo primitivo, neuronales, musculares y cerebrales y de condrocitos y/o tejido cartilaginoso, y para reparación de otros tejidos, tal como la reparación de tejido pancreático. Estas proteínas también son útiles para aumentar la actividad de otros factores de regeneración y diferenciación de tejidos y órganos.