MX2015001499A - Produccion de virus infecciosos de influenza. - Google Patents

Produccion de virus infecciosos de influenza.

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Abstract

La invención se relaciona con un método para producir los virus infecciosos de influenza donde las células CHO se infectan con una semilla del virus infeccioso de influenza que se ha generado al transfectar las células con un conjunto apropiado de vectores de expresión. La invención también se relaciona con un casete de recombinación, y con un vector que comprende dicho casete de recombinación, que puede usarse en los métodos para producir los virus infecciosos, y particularmente en el método de acuerdo con la invención.

Description

PRODUCCION DE VIRUS INFECCIOSOS DE INFLUENZA Campo de la invención La invención se refiere a un metodo para producir virus infecciosos de influenza, en donde las células CHO son infectadas con una semilla de virus de influenza infeccioso, el cual ha sido generado al transfectar células con un conjunto apropiado de vectores de expresión. La invención también se refiere a un casete de recombinación, y a un vector que comprende dicho casete de recombinación, que puede ser usado en métodos para producir virus infecciosos, y en particular en los métodos de acuerdo con la invención.
Antecedentes de la invención El virus de influenza es el agente causante de una enfermedad respiratoria altamente contagiosa, comúnmente llamada “gripe”, la cual afecta animales y humanos provocando problemas económicos y de salud pública. El virus de influenza es un virus de RNA envuelto con un genoma segmentado que consiste de segmentos de RNA negativos de filamento simple. Los virus de influenza abarcan los tres tipos: virus de influenza A, influenza B e influencia C. Los virus de influenza A y B son responsables de epidemias de influenza humana que resultan en la muerte de alrededor de 50 000 personas al año (Rossman, et al, 2011 , Virology, 411 (2):229-236). Mientras que los virus de influenza A infectan tanto humanos como y una amplia variedad de animales (aves, cerdos, caballos, perros, gatos, etc. , siendo la reserva natural más grande las aves acuáticas, los virus de influenza B son restringidos predominantemente a humanos, lo cual es parcialmente provocado por la incapacidad de la proteína B/NS1 a contrarrestar la respuesta inmune innata de otras especies (Sridharan et al, 2010, J Biol Chem, 285(1 1).7852-7856) y los virus de influenza C son aislados de humanos y cerdos.
Los virus tipo A tienen una forma esférica o filamentosa y tienen un tamaño de aproximadamente 80 a 150 nm. La envoltura viral, que consiste de una bicapa lipídica, es derivada de la membrana de plasma de la célula huésped. Las espículas formadas de glicoproteínas de superficie, HA (hemaglutinína) y NA (neuraminidasa), los principales objetivos para los anticuerpos de huésped, son insertadas en esta envoltura. La proteína M2, la cual también es incrustada en la membrana, es un canal de iones que funciona principalmente durante la decapsidación del virus. La proteína de matriz M1 está ubicada sobre la periferia interior del virus asociada a la bicapa lipídica y con la ribonucleoproteína (RNP). Tiene un papel fundamental en la exploración nucleo-citoplásmica de RNPs. En la cápside, los segmentos de vRNA poseen extremos 5’ y 3’ no de codificación que contienen las señales necesarias para la transcripción, la replicación y la encapsidación del genoma viral. Los ocho vRNA de lo virus de influenza A llamados PA (polimerasa ácida), PB1 (proteína de polimerasa básica 2), PB2 (proteína de polimerasa básica 2), NP (nucleoproteína), HA, NA, M y NS (proteína no estructural) codifican una o más proteínas mediante empalme alternativo. El segmento PA codifica la proteína PA; el segmento PB1 codifica las proteínas PB1 , PB1 -F2 y PB1 -N40; el segmento NP codifica la proteína NP; el segmento HA codifica la proteína HA; el segmento NA codifica la proteína NA; el segmento M codifica las proteínas M1 y M2; el segmento NS codifica las proteínas no estructurales NS1 y NS2 o NEP (Exportación nuclear de vRNPs). Los vRNAs son enrollados sobre NP, la cual une 24 nucleótidos por monómero, el complejo de polimerasa se une a los dos extremos de la molécula de RNA, formando una estructura de horquilla de cabello. Este complejo consiste de PB1 , PB2 y PA. La combinación de RNA, NP y polimerasa forma el complejo de ribonucleoproteína (RNP).
Los virus tipo B tienen una glicoproteína además de NA llamada NB, I actual tiene una estructura tipo III similar a la proteína M2.
Los virus tipo C tienen solo una glicoproteína de superficie multífuncional, “proteína de fusión hemaglutinina-esterasa” (HeF).
Así, el genoma de virus tipos A y B contiene 8 RNA virales (vRNA, mientras que el genoma del virus de influenza tipo C contiene solo 7.
Los virus de influenza A también son divididos en distintos subtipos de acuerdo con la naturaleza de las glicoproteínas virales de superficie, es decir, hemaglutinina (HA) (H1 a H17) y neuraminidasa (NA) (N1 a N9).
El descubrimiento por Burnet, en 1936, de que el virus de influenza podría crecer en huevos de gallina con embrión ha permitido el estudio de sus propiedades y ha permitido el desarrollo de vacunas inactivadas (De Ona et al, 1995, J Clin Microbiol, 33(7): 1948-1949). Como se describe por la World Health Organization (WHO), la vacunación es la manera más efectiva para prevenir la infección. Afortunadamente, han estado disponibles vacunas seguras y efectivas por más de 70 años. La vacuna de gripe estacional contiene diferentes tipos y subtipos de influenza (A/H1 N1 , A/H3N2 y B) que son actualizadas dos veces al año (una vez para el hemisferio norte y una vez para el sur) debido a las modificaciones antigénicas. Por esta razón, la WHO coordina una Global Influenza Surveillance Network (GISN) para monitorear la epidemiología de virus de influenza. Una vez que los virus a ser incluidos en la siguiente vacuna estacional han sido determinados, las cepas de virus de semilla de crecimiento alto candidatas deben ser preparadas por los WHO Collaborating Centers como el New York Medical College (NYMC, EE.UU.), el National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, UK), el grupo CSL (Australia) y el National Institute for Infectious Diseases (NIID, Japón) (Gerdil et a., 203, Vaccine, 21 (16):2776-1779). Cepas de vacuna son amplificadas entonces en huevos, líneas de células MDCK o Vero por los fabricantes (Koudstaal et al, 209, Vaccine, 27(19):2588-2593). Actualmente, MDCK (Tree et al., 201 , Vaccine, 19(25-26):3444-3450), Vero (Kistner et al, 1998, Vaccine, 16(9-10):960-968) y PER.C6® (Pau et a, 201 , Vaccine, 19(17-19):2716-2721) son las tres líneas celulares que pueden cumplir los requerimientos reguladores y se ha mostrado que aseguran exitosamente la replicación de virus de influenza A y B. Las tres líneas celulares han sido adaptadas para crecer en medios libres de suero (Coussens et al, 2011 , Vaccine, 29(47):8661 -8668).
La introducción de los virus de influenza en las células (primer paso de infección) ocurre a través de la interacción específica entre la proteína de superficie de hemaglutinina (HA) de influenza y receptores de superficie celular específicos. Los receptores de membrana celular huésped específicos para virus de influenza son hechos de estructuras de carbohidratos de cadenas de sialil lactosamina (ácido siálico [Sia] alfa2-3/6 galactosa [Gal] beta1-4/3 N-acetilglucosamina) (Suzuki et al, 2011 , Adv Exp Med Biol, 705:443-452). Los virus de influenza humana de preferencia se unen a receptores celulares conteniendo un enlace Sia2-6Gal, mientras que los virus aviarios de preferencia se unen a receptores Sia2-3Gal (Cussens et al, 21 1 , Vaccine, 29(47):8661-8668). Cuando dos virus infectan la misma célula, diferentes combinaciones de vRNAs genómicos, llamadas reagrupados, pueden surgir. Esta propiedad ha sido usada para la producción de vacunas de influenza A para combinar las propiedades antigénicas de HA y proteínas de neuraminidasa (NA) de virus en circulación objetivo con las características de crecimiento favorables (genes internos) de un virus adaptado a huevo, llamado A/Puerto Rico/8/34 (H1 N1).
Desafortunadamente, el éxito para derivar e virus de alto rendimiento deseado es impredecible. Además, algunas cepas no pueden ser usadas si han sido aisladas de líneas celulares no validadas, ya que no son aceptables por las autoridades regulatorias como una cepa de vacuna progenitora (Nicolson et al, 2005, Vaccine, 23(22):2943-2952). Con respecto a los virus de influenza tipo B hasta muy recientemente no se ha identificado ningún virus B teniendo las características de crecimiento de A/PR/8/34 (H1 N1 ). Por lo tanto, el virus B en circulación epidemica (o estacional) fue usado directamente para infectar huevos de gallina con embrión y varios pasos fueron necesarios para mejorar el rendimiento de cepas de vacuna B (Iwatsuki-Horimoto et al, 2008, Virus Res, 135(1 ): 161-165).
Desde 1999, se alcanzaron mejoras significativas en términos de velocidad y seguridad gracias a la teenología de genética inversa con base en plásmidos, la cual permite la generación de virus de influenza infecciosos completamente a partir de cDNA viral clonado (Fodor et al, 1999, J Virol, 73(1 1 ):9679-682). Se desarrollaron diferentes sistemas con base en un conjunto de plásmidos capaces de inducir la expresión de los ocho vRNAs y al menos el complejo de proteína de polimerasa y la nucleoproteína (NP) requerida para la transcripción. El complejo de proteína de polimerasa y NP también puede ser expresado ya sea por transfección de cuatro plásmidos adicionales o mediante el uso de plásmidos con promotores bidireccionales que permiten tanto síntesis de vRNA como mRNA a través de RNA polimerasa I (POL 1 ) y II (POL 2)(Jackson et al, 2011 , J Gen Virol, 92(Pt1 ): 1 -17) respectivamente. El número total de plásmidos transfectados puede variar de 16 (Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96(16):9345-9350) o 12 (Fodor et al, 1999, J Virol, 73(1 1 ): 9679-9682) a 8 (Hoffmann et al, 2002, Vaccine, 20(25-26:3165-3170), dependiendo si la estrategia es unidireccional o bidireccional, y de 3 (Neumann et al, 2005, Proc Nati Acad Sci USA, 102(46): 16825-16829) a 1 (Zhang et al, 2009, J Virol, 83(18):9296-9303) si el o los plásmidos codifican varios vRNA.
Los sistemas genéticos inversos actuales se basan en el uso de Per.C6® (Koudstaal et al, 2009, VAccine, 27(19):2588-2593), CÉLULAS CEP (primarias de embriones de pollo) o fibroblastos embriónicos de pollo (CEF) (Zhang et al, 2009, J. Virol, 83(18):9296-9303), células 293T solas (Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96 (16):9345-9350) o con amplificación adicional en MDCK (Hoffmann et al, 2002, Vaccine, 20(25-26):3165-3170; Schickli et al, 2001 , Philos Trans R Soc Lond Biol Sci, 356(1416):1965-1973), células Vero solas (Nicolson et al, 2005, Vaccine, 23(22):2943-2952; Neumann et al, 2005, Proc Nati Acad Sci USA, 102(46):16825-16829) o con amplificación adicional en riñón bovino Madin-Darby (MDBK) (Fodor et al, 199, J Virol, 73(11 ): 9679-9682), células CEP o CeF (Legastelois et al, 2007, Influenza Other Respi Viruses, 1 (3) : 95- 104 ; Whitelcy et al, 2007, Influenza Other Respi Viruses, 1 (49: 157-166).
Cuando una mezcla de líneas celulares es usada para producir virus mediante método genético inverso, la línea celular que puede ser transfectada es considerada la más eficiente como la que es responsable de la generación de virus de influenza infecciosos, mientras que las otras líneas celulares contribuyen a la multiplicación de los virus s infecciosos. Debido a que el promotor RNA POL I es generalmente usado en los plásmidos que permiten la producción de vRNAs de influenza, las células de humano y simio son las líneas celulares más apropiadas a ser usadas como línea celular transfectada en el sistema genético inverso. Sin embargo, el promotor POL I de origen canino o pollo también puede ser usado en células de caninos o aves respectivamente (Massin et al, 2005, J. Virol, 79(21 ): 13811-13816; Murakami et al, 2008, 82(3):1605-1609). Por otra parte, los plásmidos que permiten la producción de mRNA que codifica proteínas virales usualmente contienen un Cytomegalovirus (CMV) o promotor de beta actina POLII que pueden trabajar en una célula eucariótica (Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA; 96(16):9345-9350; Schickli et al, 2001 , Philos Trans R Soc Lond Biol Sci, 356( 1416) : 1965- 1973) .
La mayoría del tiempo, en los sistemas genéticos inversos descritos antes, las células son usualmente cultivadas en un medio conteniendo suero para asegurar el crecimiento vigoroso de los diferentes tipos celulares justo antes de la transfección. Adicionalmente, la tripsina de origen porcino también es usada en el medio de infección para sostener la proliferación viral después de la infección. Para obtener suficientes virus, varias amplificaciones en huevos o células también pueden ser necesarios después del primer paso de transfección.
El virus pandémico A/H1 N1 (2009) demostró la velocidad con la cual un virus de influenza A puede diseminarse entre la población e ilustró la necesidad de acelerar la producción de reagrupamiento vía genética inversa. Así, el reto principal es asegurar que se produzcan altas cantidades de dosis de vacunas en un mínimo de tiempo para ser distribuidas alrededor del mundo, idealmente más rápido que el esparcimiento de virus.
Las aproximaciones convencionales usadas para clonación requieren enzimas de restricción. Sin embargo, los sitios de restricción frecuentemente están presentes en cDNA de influencia diferente complementario a vRNA, requiriendo ya sea la implementación de modificaciones de vector o mutagénesis de genoma viral. La aproximación de recombinación simplificada fue desarrollada previamente para clonar cDNA de influencia complementario a vRNA para propósito de genética inversa (Stech et al, 2008, Nucleic Acid Res, 36(21 ):e139; Wang et al, 2008, J Virol Methods, 151 (1 ):74-78). Recombinación homologa involucra un proceso de ruptura y reunión en regiones de secuencias de DNA idénticas entre dos moléculas de DNA para resultar en nuevas combinaciones de material genético (Watt et al, 1985, Proc Nati Acad Sci, 82:4768-4772). Estos sistemas de clonación de recombinación previamente descritos se basan en un casete de recombinación de 25 nucleótidos comprendiendo los extremos no de codificación conservados de 5’ (Uni13) y 30 (Uni12) de consenso de segmentos de influenza A entre promotor y terminador POL I humano. Permiten la clonación rápida y directa de cualquier genoma de influenza A. Sin embargo, debido a que las secuencias de nucleótidos de extremos no de codificación 5’ y 3’ de vRNA de genomas de influenza B son diferentes de virus de influenza A, genomas de influenza B no pueden ser clonados con base en este casete de recombinación.
Así, también existe la necesidad de desarrollar una aproximación universal para clonar genomas de virus de RNA y en particular los genomas de influenza A, B y C, tan rápida y tan eficientemente como sea posible.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar herramientas y métodos otiles que facilitan y/o aceleran la producción de una vacuna de influenza en condiciones seguras optimizadas, especialmente cuando un nuevo virus de influenza en circulación ha sido identificado y podría ser responsable de una gripa epidemica o pandémica.
Para este efecto, la materia de la invención se refiere a nuevos métodos para producir un gran panel de virus infecciosos tipo A y tipo B, incluyendo virus reagrupados o quiméricos, en particular virus que han sido generados mediante genética inversa. Estos métodos hacen más fácil la fabricación de virus de influenza en condiciones más seguras. En otro aspecto, la invención proporciona un vector recombinante universal que permite la clonación de cualquier tipo de fragmento de RNA de influenza de virus tipo A o B, los cuales probaron ser una herramienta útil para realizar métodos genéticos inversos.
Definiciones Un “promotor” o “secuencia promotora” es una región reguladora de DNA capaz de unirse a una RNA polimerasa presente en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3’). Para fines de definir la presente invención, la secuencia promotora es unida en su extremo 3' por el sitio de iniciación de transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5’) para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por arriba de los antecedentes. Dentro de la secuencia promotora se encuentra un sitio de iniciación de transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, por mapeo con nucleasa S 1 ) , así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables para la unión a RNA polimerasa. El promotor puede ser asociado operativamente con otras secuencias de control de expresión, incluyendo secuencias mejoradoras y represoras. Por ejemplo, el promotor de RNA Polimerasa I humano (promotor RNA POLI humano), es un promotor que se une a RNA polimerasa I humana; el promotor de RNA polimerasa I de ave es un promotor que se une a RNA polimerasa I de ave o el promotor de T7 polimerasa es un promotor que se une a la RNA polimerasa de bacteriófago T7.
Los términos “vector”, “vector de clonación” y “vector de expresión” significan el vehículo por el cual el DNA (por ejemplo, un gene extraño) puede ser introducido en una célula huésped, con el fin de transformar el huésped y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traslación) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus recombinantes, fagomidos, transposones, y cromosomas artificiales, etc.; son discutidos con mayor detalle a continuación.
Los vectores normalmente comprenden el DNA de un microorganismo, en el cual el DNA extraño es insertado. Una manera común de insertar un segmento de DNA en otro segmento de DNA involucra el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que cortan DNA en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción. En general, el DNA extraño es insertado en uno o más sitios de restricción del DNA de vector, y entonces es realizado por el vector en una célula huésped junto con el DNA de vector transmisible. Un segmento o secuencia de DNA teniendo DNA insertado o adicionado, tal como un vector de expresión, también puede ser llamado un “construcción de DNA”. Un tipo común de vector es un “plásmido”, el cual generalmente es una molécula auto-contenida de DNA de doble filamento, usualmente de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente DNA adicional (extraño) y que puede introducirse fácilmente en una célula huésped adecuada. Un vector de plásmido con frecuencia contiene DNA codificador y DNA promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar DNA extraño y usualmente una secuencia de terminación. El DNA codificar es una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos particular de una proteina o enzima particular o un segmento de vRNA de un virus. El DNA promotor es una secuencia de DNA que inicia, regula o media o controla de otra manera la expresión del DNA codificador. El DNA promotor y DNA codificador pueden ser del mismo gene o de diferentes genes, y pueden ser de organismos iguales o diferentes. Un gran número de vectores, incluyendo plásmido y vectores fúngicos, han sido descritos para replicación y/o expresión en una variedad de huéspedes eucarióticos y procarióticos. Ejemplos no limitantes incluyen plásmidos pKK (Clontech), plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, Wl), plásmidos pRSET o PREP (Invitrogen, San Diego, CA) o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Veberly, MA), plásmidos pVAX1 (Life technology, Cergy Pontoise, FR) y muchas células huéspedes apropiadas, usando métodos descritos o citados en la presente o conocidos de otra manera para aquéllos expertos en la téenica relevante. Los vectores de clonación recombinantes con frecuencia incluyen uno o más sistemas de replicación, uno o más marcadores para selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión. El vector de clonación recombinante también puede contener un sistema de seleccionable de antibióticos, tal como el sistema descrito en Peubez et al, 2010, Microbial Cell Factories, 9:65.
Como se usa en la presente, el término “cebador” se refiere a la función del oligonucleótido. Un cebador es un oligonucleótido usado para amplificar una secuencia objetivo normalmente mediante extensión del oligonucleótido después de la hibridación a la secuencia objetivo.
Por “RNA polimerasa II” quiere decir el enzima que cataliza, en eucariotes, la transcripción de DNA en mRNA o precursor de mRNA.
Por “RNA polimerasa I” quiere decir la enzima que cataliza, en eucariotes, la transcripción de DNA en RNA ribosomal (rRNA) o precursor de rRNA.
El término “plásmido unidireccional” denota un plásmido de DNA que contiene solo un casete de transcripción, lo cual permite la transcripción de dicho DNA en rRNA si el casete de transcripción contiene un promotor de polimerasa que se une a RNA polimerasa I o permite la transcripción de dicho DNA en mRNA si el casete de transcripción contiene un promotor de polimerasa que se une a RNA polimerasa II. Por ejemplo, tales plásmidos incluyen aquéllos descritos por Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96(16):9345-9350, y en US 2009/0246830 o US 201 1/0143424.
El término “plásmido bidireccional” denota un plásmido de DNA que contiene dos casetes de transcripción, los cuales permiten la transcripción de dicho DNA en rRNA y en mRNA debido que el primer casete de transcripción contiene un promotor de polimerasa que se une a RNA polimerasa I y el segundo casete de transcripción contiene un promotor de polimerasa que se une a RNA polimerasa II. Por ejemplo, tales plásmidos incluyen aquellos como se describe en Hoffman et al, 2000, PNAS, 97(11 ):61 Ob-6113 y en WO 01/83794.
El término “virus de influenza” denota el tipo de especie de la familia Orthomyxoviridae. Los virus de influenza de acuerdo con la invención son como se describe antes en la presente.
De preferencia, el virus de influenza de acuerdo con la invención es un virus de influenza A o B. El virus de influenza A o B puede ser cualquier cepa de virus. En particular, el virus de influenza A es seleccionado del grupo que consiste de virus H1 N1 , H2N2, H3N1 , H3N2, H3N8, H5N1 , H7N1 , H7N7, H1 N2, H9N2, H7N2, H7N3 y H10N7.
Por “virus estacional o pandémico” se quiere decir un aislado clínico de virus de influenza que ha sido aislado a partir de un huésped infectado, tal como humano.
Por “virus de influenza infeccioso” se quiere decir un virus de influenza que es capaz de replicar en una célula permisiva. Los métodos para determinar si un virus es infeccioso son bien conocidos por alguien experto en la téenica. Por ejemplo, determinando si un virus es infeccioso puede ser realizado usando el ensayo TCID5o· El TCID5o es un método para valorar la cantidad de virus infeccioso en una muestra (por ejemplo, un sobrenadante de cultivo celular infectado, o un fluido alantoico infectado) al introducir diluciones increméntales de la muestra en celulas permisivas (tales como células MDCK) y determinar la dilución de punto final que induce la infección de 50% de las células permisivas usando el método estadístico Spearman-Karber.
En algunas modalidades, dicho virus de influenza infeccioso puede ser un virus de influenza reagrupado, un virus de influenza quimérico o virus de influenza atenuado. De preferencia, dicho virus de influenza infeccioso es un virus de influenza reagrupado. Aún preferiblemente, dicho virus de influenza infeccioso es un virus de influenza quimérico reagrupado.
Por “células permisivas” se quiere decir células que permiten que el virus de influenza tanto penetre a dichas células como alcance su ciclo de replicación completo hasta la producción de nuevos virus infecciosos. Células altamente permisivas son células donde los virus de influenza replican activamente y producen altas cantidades de virus infeccioso.
El término “virus reagrupado” denota un virus, el cual contiene material genético que resulta de la combinación de material genético de al menos dos virus donadores. Cuando el virus de reagrupado es usado para preparar una vacuna de gripe, su material genético usualmente contiene al menos los genes HA y NA de un virus estacional o pandémico, mientras que los otros genes (genes de esqueleto) son de uno o varios virus donadores diferentes, los cuales han sido seleccionados por su capacidad para crecer fácilmente sobre el substrato de producción usado para fabricar la vacuna de gripe (tal como la cavidad alantoica de huevos de gallina con embrión o una línea celular permisiva) y/o ser menos o no patogénicos para los humanos. Ejemplos de virus donadores que contribuyen como “proveedor” de genes de esqueleto incluyen virus A/Puerto Rico/8/34 (H1 N1 ) (A/PR/8/34), B/Lee/40 y/o B/Panama/45/90.
El término “virus quimérico” denota un virus que contiene gene quimérico que codifica proteína quimérica. Por “gene y/o proteína quimérico” se quiere decir que dicho gene o proteína es obtenido por la combinación de al menos dos porciones de genes o dos porciones de proteínas, según sea apropiado, derivado de al menos dos virus donadores diferentes. Por ejemplo, en el caso de virus de influenza tipo A o B, dicho gene y/o proteína quimérico puede ser un vRNA o proteína de HA quimérico y/o NA quimérico.
El término “virus atenuado” denota un virus que replica en una célula permisiva pero ha perdido parcialmente o incluso totalmente la capacidad para repicar en animales o humanos. Por lo tanto, la virulencia de un virus atenuado es reducido fuertemente o incluso está totalmente ausente en humanos y animales. Los síntomas clínicos asociados con la infección por un virus atenuado son reducidos o incluso están totalmente ausentes en animales o humanos. Ejemplos de virus atenuados son bien conocidos en I téenica. Un virus atenuado puede ser preparado, por ejemplo, de un virus tipo salvaje mediante pasos seriales (por ejemplo en substratos de cultivo diferentes, o una temperatura menor que de su óptima replicación), tecnología de DNA recombinante, mutagénesis de sitio dirigido, manipulación genética. Un virus atenuado útil en la presente invención no puede generar efectos laterales o efectos laterales de baja intensidad en la mayoría de individuos vacunados, mientras que se retiene su capacidad para inducir una respuesta inmune protectora en un sujeto.
El termino “virus inactivado” denota un virus incapaz de replicación a cualquier grado significativo en células permisivas. Los virus pueden ser inactivados por un número de medios bien conocidos para aquéllos expertos en la téenica. Ejemplos de métodos para inactivar un virus incluyen manipulación genética, tratamientos químicos o físicos, o tratamientos de radiación (incluyendo formaldehído, betapropiolactona, detergentes, radiación por calor o electromagnética normalmente en las formas de radiación de rayos X o ultravioleta). En el marco de la invención, los virus de influenza inactivados útiles son aquéllos que han retenido la capacidad para inducir una respuesta inmune protectora en un sujeto.
El término “genética inversa” denota métodos moleculares para producir virus reagrupados, infecciosos, o virus atenuados para sus DNAs complementarios (cDNAs). Estos métodos son muy ventajosos para producir virus de influenza reagrupado mediante reagrupamiento de vRNAs entre diferentes virus de influenza. Los métodos de genética inversa son bien conocidos por alguien experto en la técnica. Los métodos de genética inversa pueden ser aquéllos descritos antes, por ejemplo, los métodos usando los plásmidos descritos en Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad SciUSA, 96(16):9345-9350; Neumann et al, 2005, Proc Nati Acad Sci USA, 102(46):16825-16829; Zhang et al, 2009, J Virol, 83(18):9296-9303; Massin et al, 2005, J Virol, 79(21 ): 1381 1 - 13816; Murakami et al, 2008, (2(3): 1605-1609; y/o las celulas descritas en Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Scie USA, 96(16):9345-9350; Neumann et al, 2005, Proc Nati Acad Sci USA; 102(46):16825-16829; Zhang et al, 2009, J Virol, 83(18):9296-9303; Massin et al, 2005, J Virol, 79(21 ): 13811 -13816; Murakami et al, 2008, 82(3): 1605-1609; Koudstaal et al, 2009, Vaccine, 27(19:2588-2593; Schickli et al, 2001 , Philos Trans R Soc Lond Biol Scie, 356(1416):1965-1973; Nicolson et al, 2005, Vaccine, 23(22):2943-2952; Legastelois et al, 2007; Influenza Other Respi Viruses, 1 (3) : 95- 104; Whitelcy et al, 2007, Infuenza Other Respi Viruses, 1 (4): 157-166.
De preferencia, dichos métodos pueden ser: (i) el método de 16 plásmidos, tal como el método descrito por Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Scie USA, 96(16):9345-9350, y en US 2009/0246830 o US 2011/0143424, en el cual el virus de influenza es producido al transfectar células, usando un derivado de poliamina (Trans IT-LT1 ), con 8 plásmidos conteniendo cada uno un cDNA complementario a un vRNA de influenza bajo el control de un promotor de RNA polimerasa I y un terminador de RNA polimerasa I, y 8 plásmidos conteniendo cada uno un cDNA complementario a uno de los mRNAs de PA, PB1 , PB2, NP, HA, NA, M y NS bajo el control de promotor de RNA polimerasa II. En particular, las células son células adherentes embriónicas de riñón humano (línea celular 293T); (ii) el método de 12 plásmidos, tal como el método descrito por Fodor et al, 1999, J Virol, 73(11 ):9679-9682, y en US 2004/0142003, US 2012/0058538 en el cual el virus de influenza es producido al transfectar un primer tipo celular con 8 plásmidos conteniendo cada uno un cDNA complementario a un vRNA de influenza bajo el control de un promotor de RNA polimerasa I y un terminador de RNA polimerasa I (ribozima delta de hepatitis) y 4 plásmidos conteniendo cada uno un cDNA complementario a uno de los mRNAs de NPO, PA, PB1 y PB2 bajo el control de promotor de RNA polimerasa II, y al amplificar adicionalmente el virus en un segundo tipo celular. En particular, dicho primer tipo celular es células Vero y dicho segundo tipo celular es MDBK; (iii) el método de 13 plásmidos, tal como el método descrito por De Wit et al, 2007, Journal of General Virology, 88: 1281 -1287 en el cual el virus de influenza es producido al transfectar células con 8 plásmidos conteniendo cada uno un cDNA complementario a un vRNA de influenza bajo el control de un promotor de T7 RNA polimerasa y un terminador de T7 RNA polimerasa, 4 plásmidos conteniendo cada uno un cDNA complementario a uno de los mRNAs de NP, PA, PB1 y PB2 bajo el control de RNA polimerasa II, y un plásmido conteniendo el cDNA complementario al mRNA que codifica la T7 RNA polimerasa y una señal de localización nuclear bajo el control de RNA polimerasa II. En particular, las células transfectadas son células Vero, 293T o QT6 (línea celular de fibrosarcoma de la codorniz japonesa). (iv) el método de 8 plásmidos, tal como el método descrito por Hoffmann et al, 2000, PNAS, 97(11 ):6108-6113 y en WO 01/83794 en el cual cada plásmido es capaz de expresar tanto mRNA como vRNA(s). Así, cada plásmido contiene cDNA complementario a un vRNA de influenza y dos casetes de transcripción en lugar de uno como en el caso precedente. El cDNA complementario de cada uno de los ocho vRNAs de virus de influenza es insertado entre el terminado de polimerasa I y el promotor de polimerasa I. Esta unidad de transcripción de polimerasa I es flanqueada por el promotor de polimerasa II y una señal de poliadenilación. El primer casete de transcripción permite la transcripción de cDNA en la forma de vRNA. El segundo casete de transcripción permite la transcripción de cDNA en la forma de mRNA, el cual es traducido entonces en proteína o proteínas virales usándola maqumaria celular. Con la ayuda este doble sistema de casete para transcripción, tambien llamado sistema Poli l-Pol II, el cDNA del mismo plásmido es transcrito tanto en la forma de vRNA como en la forma de mRNA. Esto manifiesta por sí mismo en el nivel de la célula transfectada mediante la expresión de un vRNA y de una o más proteínas virales. En particular, un co-cultivo de células MDCK adherentes y de células 293T y, como agente de transfección, un derivado de poliamina (Trans IT-LT1 ) son usados. (iv) el método de 3 plásmidos, tal como el método descrito por Neumann et al, 2005, PNAS, 102(46): 16825-16829, en el cual el virus de influenza es producido al transfectar células con un plásmido conteniendo los 8 cDNAs complementarios a vRNAs de PB2, PB1 , PA; HA, NP, NA, M y NS cada uno bajo el control de un promotor de RNA polimerasa I y un terminador de polimerasa I y 2 plásmidos, conteniendo el primero los 3 cDNA complementarios a uno de los mRNAs de PB2, PB1 y PA y el segundo conteniendo el cDNA complementario para el mRNA de NP, bajo el control de un promotor de RNA polimerasa II. En particular, las células transfectadas son 293T o Vero. (vi) el método de 1 plásmico, tal como el método descrito por Zhang et al. J. Virol, 83(18): 9296-9303, en el cual el virus de influenza es producido al transfectar células con un plásmido conteniendo los 8 cDNAs complementarios para vRNA de PB2, PB1 , PA, HA, NP, NA, M y NS bajo el control de terminador de polimerasa I de murino y un promotor de RNA polimerasa I de pollo y con un promotor de polimerasa II y una señal de poliadenilación entre cDNAs de PB2.PB1 , PA y NP. En particular, las células transfectadas son células CEF. (vii) el método descrito en WO 2005/062820 usando dos sistemas celulares diferentes: en un primer paso, las células son transfectadas con 8 plásmidos bidireccionales con el sistema Poll-Polll (Pol/Poll) y encones en un segundo paso, las células transfectadas son cultivadas con células de otra línea celular que es muy permisiva para el virus de influenza con el fin de amplificar la producción del virus de influenza. En particular, dichas células transfectadas en el primer paso son células Vero, y esa otra línea celular en el segundo paso son líneas celulares CEK o CEF, las cuales son líneas derivadas de células de embriones de pollo.
“Proteínas de virus de influenza” denota las proteínas PB1 , PB2, PA, HA, NP, NA, M1 , M2, NS1 y NS2/NEP para influenza tipo A, proteínas PB1 , PB2, PA, HA, NR,NA, NB, M1 , BM2, NS1 y NS2/NEP para influenza tipo B, o PB1 , PB2, PA, HEF, NP, M1 , M1’, CM2, NS1 y NS2/NEP para influenza tipo C.
Por “proteínas de virus de influenza necesarias para formar el complejo de ribonucleoproteína” se quiere decir las proteínas PA, PB1 , PB2 y NP para virus de influenza tipo A, B o C.
Por “vRNA” se quiere decir el RNA viral de sentido negativo del virus de influenza, el cual es encapsulado en el complejo de ribonucleoproteína. Cuando el virus de influenza es de tipo A o B, dichos vRNAs son vRNAs de PB2, PB1 , PA, HA, NP, NA, M y NS. Cuando el virus de influenza es de tipo C, dichos vRNAs son vRNAs de PB1 , PB2, PA, HEF, NP, M y NS.
Por “cRNA” se quiere decir el intermediario de RNA de sentido positivo, el cual es complementario al vRNA. Una vez en el núcleo, el RNA viral de sentido negativo entrante (vRNA) es transcrito en RNA mensajero (mRNA) por un mecanismo dependiente de cebador. Estos productos de mRNA son copias incompletas de la plantilla de vRNA y son rematados y poliadenilados, a diferencia de vRNA. La replicación ocurre vía un proceso de dos pasos. Una copia de sentido positivo de longitud completa del vRNA se hace primero que es referida como RNA complementario (cRNA) y a su vez se usa como una plantilla para producir más vRNA.
Casete recombinante, vectores y sus usos Un objetivo de la presente invención es proporcionar un novedoso casete de recombinación que puede ser usado para clonar cDNAs complementarios a vRNAs de un virus de RNA de filamento simple negativo en un vector de expresión. Dicho casete de recombinación es así en particular útil para clonar cDNAs complementario a vRNAs de virus de influenza tipo A y tipo B.
La invención se refiere así a un casete de recombinación comprendiendo, o consistiendo de, en el sentido 5’ a 3’: - una secuencia de reconocimiento complementario invertido para la primera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento y produce extremos pegajosos; - un sitio de restricción para una segunda enzima de restricción, el cual tiene su sitio de corte dentro de su secuencia de reconocimiento; - un sitio de restricción para una tercera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte dentro de su secuencia de reconocimiento; y - una secuencia de reconocimiento para dicha primera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento y produce extremos pegajosos; en donde dicha segunda y tercera enzimas de restricción son diferentes.
Una “enzima de restricción” denota una endonucleasa que se une a un sitio de reconocimiento y entonces corta un filamento de DNA en una posición fija en relación a su secuencia de reconocimiento (enzima de restricción tipo II). La “secuencia de reconocimiento” es la secuencia de nucleotidos específica a la cual se une una enzima de restricción antes de cortar el esqueleto de DNA. Las secuencias de reconocimiento son generalmente 4 a 8 pares de bases de longitud, y con frecuencia son palindrómicas - esto es, se leen igual hacia atrás y hacia adelante cuando se leen en la dirección 5’ - 3’, y la secuencia de reconocimiento es con frecuencia igual en ambos filamentos del DNA. El “sitio de corte” es la secuencia de nucleótidos específica en la cual corta la enzima de restricción. En algunos casos, los puntos de corte ocurren exactamente en el eje de simetría del sitio de restricción palindrómico, dando productos los cuales son de extremo romo. Algunas nucleadas de restricción producen cortes escalonados, los cuales dejan colas de filamento simple cortas en los dos extremos de cada fragmento, conocidas como “extremos cohesivos" o “extremos pegajoso”.
Las posiciones de corte en relación a la secuencia de reconocimiento dependen de la enzima. Por ejemplo, para las enzimas Sapl o Bbsl (enzima de restricción tipo 11 S) , el sitio de corte está fuera de la secuencia de reconocimiento: Secuencia de reconocimiento de Sapl·. GCTCTTC.
Y 5’ G C T C T T C (N)2 3’ 3’ C G A G A A G (N}4 5’ t Secuencia de reconocimiento de Bbsl: GAAGAC 5 G A A G A C (N)? 3’ 3’ C T T C T G (N)« 5’ Y, : Sitio de corte Como se usa en la presente, un “sitio de restricción” de preferencia denota una secuencia de nucleótidos, la cual consiste de la secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción y la cual contiene el sitio de corte de dicha enzima.
En algunas modalidades, dicha primera enzima de restricción que tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento puede ser Bbsl, Sapl, Acelll, Bsal o BsmB1.
De preferencia, dicha primera enzima de restricción es Bbsl o Sapl. En consecuencia, cuando la primera enzima de restricción es Bbsl, dicha secuencia de reconocimiento complementaria invertida consiste de la secuencia 5’-GTCTTC-3’, consistiendo dicha secuencia de reconocimiento Bbsl de la secuencia 5’-GAAGAC-3’. Cuando la primera enzima de restricción es Sapl, dicha secuencia de reconocimiento complementario invertida consiste de la secuencia 5’-GAAGAGC-3’, consistiendo dicha secuencia de reconocimiento de Sapl de la secuencia 5’-GCTCTTC-3’.
Con el fin de minimizar el riesgo de tener el segundo y tercer sitios de restricción presentes en el genoma viral, dichos sitios de restricción de preferencia tienen una secuencia de nucleótidos larga. En algunas modalidades, el sitio de restricción de dicha segunda y tercera enzimas de restricción es al menos, o exactamente, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de largo. De preferencia, el sitio de restricción de dicha segunda y tercera enzimas de restricción es al menos, o exactamente, 7 u 8 nucleótidos de largo.
En algunas modalidades, dicha segunda y tercera enzimas de restricción son seleccionadas del grupo que consiste de Notl y Sbfl. Todavía de preferencia, dicha segunda enzima de restricción es Notl y dicha tercera enzima de restricción es Sbfl.
En consecuencia, el sitio de restricción de la segunda o tercera enzima de restricción puede consistir de la secuencia 5’-GCGGCCGC-3’ o de la secuencia 5’-CC TGCAGG-3’. De preferencia, el sitio de restricción de la segunda enzima de restricción consiste de la secuencia 5’-GCGGCCGC-3’, y el sitio de restricción de la tercer enzima de restricción consiste de la secuencia 5’-CCTGCAGG-3’.
El casete de recombinación puede comprender nucleótidos adicionales entre dicha secuencia de reconocimiento complementario para una primera enzima de restricción y dicho sitio de restricción para una segunda enzima de restricción; y/o entre dicho sitio de restricción para una segunda enzima de restricción y dicho sitio de restricción para una tercera enzima de restricción. En algunas modalidades, dichos nucleótidos adicionales pueden consistir de un tramo de al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 nucleótidos. En algunas modalidades, dichos nucleótidos adicionales consisten de un tramo de cuando mucho 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 nucleótidos.
En consecuencia, dicho casete de recombinación es al menos, o exactamente, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 nucleotidos de largo. De preferencia, dicho casete de recombinación es al menos, o exactamente, 28 o 30 nucleótidos de largo.
De preferencia, dicho casete de recombinación consiste de la secuencia 5’-GTCTTCGCGGCCGCCCTGCAGGGAAGAC-3’ (SEQ ID NO:2).
Se tiene que entender que dicho casete de recombinación es ácido nucleico de doble filamento, y que la secuencias descritas antes en la presente corresponden al filamento de codificación del ácido nucleico.
La invención también se refiere a un vector comprendiendo, en el sentido 5’ a 3’: - un promotor que se une a RNA polimerasa I, o una T7 RNA polimerasa, - el casete de recombinación de acuerdo con la invención, - una secuencia de terminador, entendiéndose que: - cuando el promotor se une a RNA polimerasa I, dicha secuencia de terminador es secuencia de ribozima delta de hepatitis, y - cuando el promotor se une a T7 RNA polimerasa, dicha secuencia de terminador es la secuencia de terminador de T7 polimerasa.
Por “secuencia de terminador” se quiere decir una secuencia que marca el extremo de gene u operón sobre DNA para transcripción. Dicha secuencia de ribozima delta de hepatitis comprende, o consiste de, secuencia SEQ ID NO: 3. Dicha secuencia de terminador de T7 polimerasa comprende, o consiste de, secuencia SEQ ID NO:4.
En algunas modalidades, dicho promotor se une a una RNA polimerasa I de roedor o a RNA polimerasa I humana. De preferencia, dicho promotor se une a una RNA polimerasa I de ratón o hámster.
En algunas modalidades, dicho promotor el cual se une a RNA polimerasa I de roedor comprende, o consiste de la secuencia SEQ ID N0.5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.
En algunas modalidades, dicho promotor que se une a RNA polimerasa I humana comprende o consiste de la secuencia SEQ ID NO: 8.
De preferencia, dicho vector comprende en el sentido de 5’ a 3’: - un promotor que se une a RNA polimerasa I humana, - el casete de recombinación de secuencia SEQ ID NO:2, - la secuencia de ribozima delta de hepatitis de secuencia SEQ ID NO:3.
Más preferiblemente, dicho vector comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.
Todavía preferiblemente, dicho vector comprende en el sentido de 5’ a 3’: - un promotor que se une a RNA polimerasa I de roedor, - el casete de recombinación de secuencia SEQ ID NO:2, - la secuencia de ribozima delta de hepatitis de secuencia SEQ ID NO:3.
Todavía preferiblemente, dicho vector comprende en el sentido de 5’ a 3’: - un promotor que se une a T7 polimerasa de secuencia SEQ ID NO:9, - el casete de recombinación de secuencia SEQ ID NO:2, - el terminador de T7 polimerasa de secuencia SEQ ID NO:4.
En el vector de acuerdo con la invención, dicho casete de recombinación es precedido por el promotor que se une a RNA polimerasa I, o a T7 RNA polimerasa, y es seguido inmediatamente por la secuencia de terminador.
En algunas modalidades, dicho vector también puede comprender un gene de resistencia a antibióticos, tal como el gene de resistencia a kanamicina. De acuerdo con esto, dicho vector comprende o consiste de la secuencia SEQ ID 0: 10, es decir, dicho vector es el así llamado plásmido pSP-flu universal.
En algunas modalidades, el vector de acuerdo con la invención no comprender cualquier gene de resistencia a antibiótico, pero comprende un sistema de selección libre de antibiótico, tal como el sistema descrito en Peubez et al, 2010, Microbial Cell Factories, 9:65.
El vector de acuerdo con la invención puede usarse en un método para producir virus de RNA de filamento simple negativos, en particular virus de RNA de filamento simple negativos infecciosos, por genética inversa. En particular, dicho vector puede ser usado para cDNA complementario a vRNA.
Por ejemplo, dicho virus de RNA de filamento simple negativo puede ser un virus de la familia Arenaviridae, tal como el virus choriomeningotis linfocítico; la familia Orthomyxoviridae, tal como un virus de Influenza, un Isavirus y un Thogotovirus; la familia Paramyxoviridae, tal como el virus de sarampión, el virus de paperas, el virus respiratorio sincitial, el virus de peste bovina, el virus de moquillo canino; la familia Bynyaviridae, tal como el virus de encefalitis de California y el Hantavirus; la familia Rhabdoviridae, tal como el virus de la rabia; la familia Filoviridae , tal como el virus de ébola, y el virus de Marburg; la familia Bornaviridae, tal como virus de enfermedad de Borna.
De preferencia, dicho virus de RNA de filamento simple negativo puede ser un virus reagrupado y/o virus quimérico. Estos virus pueden ser atenuados o virus inactivados.
En una modalidad preferida particular, dicho virus de RNA de filamento simple negativo es un virus de influenza.
Los métodos para producir virus de RNA de filamento simple, negativo, mediante genética inversa son bien conocidos por el experto en la téenica. Por ejemplo, dicho método es un método para producir el virus VSV como se describió en Pattnaik et al, 1992, Ce II , 69(6):1011 -1020; el virus de la rabia como se describió en Schnell et al, 1994, EMBO J, 13(18):4195-4203; el virus de sarampión como se describió en Radecke et al, 1995, EMBO J, 14(23):5773-5784; el virus Sendai como se describió en Garcin et al, 1995, EMBO J, 14(24):6087-6094; el virus de parainfluenza tipo 3 como se describió en Hoffman y Banerjee, 1997, J Virol, 71 (6):4272-4277 y en Durbin et al, 1997, Virology, 235(2):323-332; el virus SV5 como se describió en He et al, 1997, Virology, 237(2):249-260; el virus de peste bovina como se describió en Barón y Barrett, 1997, J Virol, 71 (2): 1265-1271 el virus RSV como se describió en Jin et al, 1998, Virology, 251 (1):206-014; el virus de Newcastle como se describió en Peeters et al, 199, J Virol, 73(6):5001-5009; el virus de Ebola como se describió en Neumann et al, 2002, J Virol, 76(1 ):406-410; el virus de parainfluenza tipo 2 como se describió en Kawano et al, 2001 , Virology, 283(1 ) : 99- 112; el virus Metapneumovirus como se describió en Herfst et al, 2004, J Virol, 78(15):8264-8270; el virus Bunyamwera como se describió en Bridgen y Elliott, 1996, Proc Nati Acad Sci USA; 93(26): 15400-15404.
De preferencia, dicho método para producir virus de RNA de filamento simple negativo mediante genética inversa es un método para producir virus de influenza como se describió antes en la presente. Más preferiblemente, dicho método productor de virus de influenza puede ser el método descrito en Neuman et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96(16): 9345-9350, US 2009/0246830, US 201 1/0143424, Hoffmann et al, 2002, Vaccine, 20(25-26):3165-3170, WO 01/83794, Fodor et al, 1999, J Virol, 73(11 ):9679-9682, en US 2004/0142003, US 2012/0058538, De Wit et al, 2007, Journal of Generl Virology, 88:1281-1287, en WO 2005/062820, o el método de acuerdo con la invención. Todavía de preferencia, dicho vector es usado en el método de acuerdo con la invención.
El vector de acuerdo con la invención puede ser usado en dichos métodos después de que los cDNAs complementarios a los virus de vRNAs han sido clonados en uno más de dichos vectores.
Estrategia de clonación En el contexto de la invención, la estrategia de clonación involucra recombinación homologa entre el vector de acuerdo con la invención y la secuencia de cDNA a ser clonada.
De esta manera, la invención proporciona un método de clonar un cDNA complementario a vRNA de un virus de RAN, el cual comprende los siguientes pasos: (i) producir un cDNA complementario a un vRNA del virus RNA mediante RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) de RNA viral del virus usando un cebador hacia adelante conteniendo nucleótidos de la secuencia de promotor del vector de acuerdo con la invención, y un cebador inverso conteniendo nucleótidos del terminador del vector de acuerdo con la invención; (ii) linealizar el vector de acuerdo con la invención usando la primera enzima de restricción del casete de recombinación; (iii) contactar el cDNA obtenido en el paso (i) con el vector linealizado obtenido en el paso (ii) en condiciones que permiten la recombinación homologa entre dicho cDNA con dicho vector.
En el paso (i), la transcripción inversa puede ser realizada mediante metodos bien conocidos por alguien experto en la téenica. De preferencia, la transcripción inversa es realizada como se describió en el párrafo 1.8 de los ejemplos.
En algunas modalidades, dicho cebador inverso comprende, en su lado 5’, al menos 17 nucleótidos de la secuencia de terminador del vector de acuerdo con la invención. De preferencia, dicho cebador inverso comprende, en su lado 5’, al menos 17 nucleótidos de la secuencia de ribozima delta de hepatitis. Aún preferiblemente, el cebador inverso comprende, en su lado 5’, la secuencia 5’-CTGGGACCATGCCGGCC-3’ (SEQ ID NO: 1 1 ). Dicho cebador inverso comprende además, en 3’ a los nucleótidos de la secuencia de terminador, nucleótidos complementarios al vRNA a ser transcrito de manera inversa.
En algunas modalidades, dicho cebador hacia adelante comprende, en su lado 5’, al menos 17 nucleótidos de la secuencia promotora del vector de acuerdo con la invención. De preferencia, dicho cebador hacia adelante comprende, en su lado 5’, al menos 17 nucleótidos del promotor que se une a RNA polimerasa I humana. Aún preferiblemente, dicho cebador hacia adelante comprende, en su lado 5’, la secuencia 5 -TGGGCCGCCGGGTTATT-3’ (SEQ ID NO: 12). Dicho cebador hacia adelante comprende además, en 3’ a los nucleótidos de la secuencia de promotor, nucleótidos complementarios al vRNA a ser transcrito de manera inversa.
El paso (ii) puede ser realizado mediante métodos bien conocidos por alguien experto en la téenica. De preferencia, paso (ii) es realizado como se describió en el párrafo 1.8 de los ejemplos.
El paso (iii) puede ser realizado mediante métodos bien conocidos por alguien experto en la técnica. De preferencia, el paso (iii) es realizado como se describió en el párrafo 1.8 de los ejemplos.
Debido al uso de dichos cebadores hacia adelante y hacia atrás en el paso (ii), el cDNA obtenido comprende, en el sentido 5’ a 3’, una secuencia de nucleótidos del promotor que se une a polimerasa I humana, codificando el cDNA un vRNA de un virus y una secuencia de nucleótidos de la secuencia de ribozima delta de hepatitis. En consecuencia, en el paso (iii) el cDNA obtenido en el paso (i) es clonado en antisentido hacia el vector de acuerdo con la invención.
En algunas modalidades, dicha estrategia de clonación comprende además un paso (iv) que consiste en eliminar los vectores que no contienen el cDNA obtenido en el paso (i). El paso (iv) puede ser realizado al digerir los vectores que han sido contactados con el cDNA obtenido en el paso (iii) con la segunda y tercera enzimas de restricción descritas en el párrafo “Casete recombinante, vectores y usos”, por ejemplo, al usar las enzimas Notl y Sbfl en condiciones apropiadas, si el casete de recombinación incluyó sitios de restricción de Notl y Sbfl. Dichas condiciones apropiadas son bien conocidas por alguien experto en la teenica.
Gracias a las características del vector de acuerdo con la invención, esta estrategia de clonación puede ser realizada para insertar el cDNA complementario a un vRNA de tipo A así como virus de influenza tipo B. El vector de acuerdo con la invención representa una herramienta mejorada sobe la técnica anterior ya que permite la clonación de un cDNA complementario a vRNA tanto de virus de influenza tipo A como tipo B.
Métodos para producir virus de influenza infecciosos Con el fin de sostener un alto rendimiento e producción de influenza, las células deben expresar receptores Sia2-6Gal o Sia2-3Gal sobre su superficie. Aunque las células CHO-K1 no expresan receptores Sia2-6Gal y expresan solo pobremente receptores Sia2-3Gal (expresados en 30% de las células), se ha encontrado de manera sorprendente que la línea de células CHO-K1 , la cual es un sub-clon de la línea de células CHO es una línea celular muy eficiente para la producción de virus de influenza, el cual ha sido generado por biología molecular, en particular por métodos genéticos inversa por medio de un conjunto apropiado de vectores de expresión.
De acuerdo con esto, la invención se refiere a un método para producir virus de influenza infecciosos, de acuerdo con los cuales la proliferación (amplificación) del virus es lograda por infectar células CHO con una semilla de virus de influenza infecciosos obtenidos por genética inversa usando un conjunto de vectores de expresión capaces de generar virus de influenza infeccioso, y el método para producir virus de influenza infecciosos involucra así un paso preliminar de acuerdo con los cuales las células son transfectadas con dicho conjunto de vectores de expresión. El sobrenadante de medio conteniendo células transfectadas se vuelve infeccioso, puede ser recolectado y usado como semilla infecciosa para infectar una población separada de células CHO. De manera alternativa, después del paso de transfección, las células CHO pueden ser adicionadas in situ a las células transfectadas para permitir la proliferación de virus de influenza.
La materia de la invención es por lo tanto, un método para producir virus de influenza infeccioso (“método de genética inversa”), en donde dicho método comprende los pasos que comprenden o consisten de: a) transfectar células con un conjunto de vectores de expresión para generar una semilla de virus de influenza infecciosos, b) infectar células CHO con dicha semilla de virus de influenza infecciosos.
En el método de acuerdo con la invención, la semilla de virus de influenza infecciosos es obtenida al transfectar células con un conjunto de vectores de expresión capaces de generar dichos virus infecciosos.
Usualmente, el paso b) de infectar celulas CHO es realizado al adicionar células CHO a las células transfectadas con el conjunto de vectores de expresión capaces de generar dichos virus infecciosos (las “células transfectadas”), permitiendo por ello la proliferación de virus infecciosos que han sido generados. El paso b) de infectar células CHO también puede ser realizado al adicionar la semilla de virus de influenza infecciosos generados en el paso a) a las células CHO.
Se entiende bien que la infección en células CHO con dicha semilla de virus de influenza infecciosos se hace bajo condiciones de cultivo bien conocidas por el experto en la téenica que permiten la proliferación de virus de influenza infeccioso. La proliferación del virus de influenza infeccioso puede ser amplificado adicionalmente mediante infecciones sucesivas de poblaciones de células CHO o cualquier otra población de células altamente permisivas, o al infectar la cavidad alantoica de huevos de gallina con embrión.
La producción de virus de influenza infecciosos es lograda al infectar ex vivo o in vitro células CHO con dicha semilla de virus de influenza infecciosos en condiciones que son bien conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, dicha infección puede ser realizada a una temperatura comprendida entre 32 y 38°C, o más usualmente entre 34°C y 37°C, y con 5% a 10% de CO2. Como una materia de ejemplo específico, la infección puede ser realizada a aproximadamente 35°C con aproximadamente 8% de C02. En general, la tripsina o una enzima teniendo una actividad de serina proteasa es adicionada al medio para permitir que el virus replique en células y para asegurar la propagación de los virus de influenza a través de las células CHO.
En una modalidad particular preferida, la infección de células CHO con dicha semilla de virus de influenza infecciosos es realizada en un medio de infección, el cual es un medio libre de suero. De preferencia, dicho método para producir virus de influenza infecciosos es realizado completamente en la ausencia de suero.
De preferencia el método de acuerdo con la invención es realizado en la ausencia de un virus auxiliar, lo cual significa que el uso de un conjunto apropiado de vectores de expresión solos es suficiente para permitir la generación de virus de influenza infecciosos por genética inversa.
De acuerdo con las características estructurales de los vectores de expresión usados, las células o líneas celulares usadas para el paso de transfección pueden comprender o consistir de una línea de células CHO, una mezcla de una línea de células CHO con otra línea celular que no es una línea de células CHO.
Cuando el método de acuerdo con la invención es realizada mediante genética inversa usando un conjunto de vectores de expresión comprendiendo plásmidos para producción de vRNA bajo el control de promotor que se une a RNA polimerasa I humana, de preferencia las células usadas para transfección son células de origen de primate o de preferencia una mezcla de células de origen de primate y células CHO. Las células de origen de primate pueden ser, por ejemplo, células PER.C6® (Crucell), células T 293 o células Vero. Normalmente, las células usadas para transfección son células Vero o de preferencia una mezcla de células Vero y células CHO.
En la misma manera, cuando los plásmidos para producción de vRNA contienen un promotor que se une a RNA polimerasa I de canino o ave (Massin et al, 2005, J Virol, 79(21 ): 13811 -13816; Murakami et al, 2008, 82(3):1605-1609), de preferencia las células usadas para transfección son células respectivamente de origen canino, tales como células MDCK (o de preferencia una mezcla de células de origen canino o células CHO) o células de pollo, tales como células CEF o células CEP (o de preferencia una mezcla de células de origen de pollo y células CHO).
Por último, cuando los plásmidos para producción de vRNA contienen un promotor que se une a RNA polimerasa I de roedor, tal como una RNA polimerasa I de hámster o ratón, el paso de transfección puede ser realizado usando solo células CHO. En ese caso, las células CHO son el único tipo de células a ser usado para ambos pasos de transfección e infección. Por lo tanto, la producción de virus de influenza infecciosos a partir de un conjunto apropiado de vectores de expresión puede involucrar solamente el uso de células CHO, lo cual simplifica el proceso de producción de virus de influenza. Solo una línea celular tiene que ser cultivada.
De manera alternativa, cuando el conjunto apropiado de vectores de expresión comprende plásmidos para producción de vRNA bajo el control del promotor de T7 polimerasa y un plásmido de expresión de proteína adicional que codifica la T7 polimerasa como se describe por De Wit et al, 2007, J. Gen. Virol, 88 (Pt4): 1284-1287, las células CHO también pueden ser el único tipo de células a ser usado tanto para pasos de transfección como infección y para asegurar la producción de virus de influenza infecciosos.
En algunas modalidades, las células usadas para transfección (por ejemplo, células CHO o una mezcla de células Vero y células CHO) pueden ser células recombinantes que expresan de manera estable proteínas PB2, PB1 , PA y NP de influenza y el conjunto de vectores a ser incorporado en las células recombinantes son un conjunto de vectores de expresión capaces de expresar vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA.
De esta manera, en algunas modalidades, dichas células en el paso a) comprenden o consisten de células Vero o una mezcla de células Vero y células CHO.
En alguna modalidad también, dichas células en el paso a) comprenden o consisten de células CHO.
La línea celular para uso de acuerdo con la invención es una línea de células CHO. Las líneas de células CHO son comúnmente usadas para la producción de proteína industrial y muchas de las líneas de células CHO son conocidas para la persona experta en la téenica. Por ejemplo, tales líneas de células CHO incluyen, por ejemplo, la línea de células CHO-K1 disponible en el catálogo ATCC bajo el número CCI-61 o CCL-9618, la línea de células CHO DP-12 (ATCC Número: CRL-12444 y 12445) y la línea de células CHO 1-15 (ATCC Número CRL-9606). De acuerdo con una modalidad, la línea celular usada para el propósito de la invención es una línea de células CHO, la cual no expresa en su superficie los receptores Sia2-6Gal, pero expresa débilmente los receptores Sia 2-3Gal, de manera que menos de 50% de la población celular es fluorescente en presencia de la aglutinina de Maackia amurensis etiquetada con digoxigenina. De preferencia, la línea celular usada para el propósito de la invención es la línea de células CHO-K1 , en particular la línea celular referida en ATCC bajo el número CCL-61. Todavía preferiblemente, la línea de células CHO-K1 , por ejemplo, la línea de células CHO-K1 referida en ATCC bajo el número CCL-61 , está en la forma de una suspensión de células. Por ejemplo, tal suspensión de células puede ser obtenida mediante cultivo de la línea celular en un medio libre de suero.
Cuando una línea de células de primate es usada en combinación con una línea de células CHO para realizar el método de acuerdo con la invención, las líneas de células Vero disponibles en el catálogo ATCC bajo el número CCL-81 , CRL-1586, CRL-1587 o CCL-81.5 son preferidas debido a que fueron aprobadas hace mucho tiempo por las autoridades reguladoras. Las líneas de células T 293 preferidas incluyen la línea disponible en el catálogo de ATCC bajo el número CRL-11268.
Las células CHO y transfectadas, en particular células Vero, son de preferencia cultivadas de acuerdo con las regulaciones GLP (Good Laboratory Practices)/GMP (Good Manufacturing practices) o los requerimientos de la autoridad de control nacional. Por ejemplo, dichas células pueden ser identificadas por los registros históricos, es decir, información del origen de las células, su método de desarrollo, el límite de edad de cultivo in vitro para producción. Dichas células también pueden estar libres de bacterias cultivables, micoplasmas, hongos, virus endógenos. Guía relacionada con consideraciones para cultivos celulares y materiales usados para soportar cultivos celulares para producción de vacuna pueden encontrarse en el comité de expertos de WHO sobre estandarización biológica, 47° reporte, requerimientos para el uso de células animales como substratos in vitro para la producción de biológicos (WHO technical report series, 1998, 878:19-52), en la caracterización y calificación de substratos celulares y otros materiales biológicos usados en la producción de vacunas virales para indicaciones de enfermedad infecciosas (departamento estadounidense de servicios de salud y humanos del centro de administración de alimentos y fármacos para evaluación e investigación de biológicos [February 2010]), en el párrafo 5.2.3 de la European Pharmacopoeia, 5a edición, o en nota para guía sobe calidad de productos bioteenológicos: derivación y caracterización de substratos celulares usados para la producción de productos biotecnológicos/biológicos (cpmp(ich/294/95) publicado por la European Medicines Agency.
Las células CHO y las transfectadas, en particular células Vero, son adaptadas de preferencia para cultivo en medio libre de suero y/o condiciones libres de componentes animales.
La adaptación celular a cultivo en medio libre de suero puede lograre fácilmente por alguien experto en la técnica al pasar progresivamente células en medios conteniendo cantidades de suero decrecientes, hasta que las células pueden sobrevivir y proliferar exitosamente en un medio libre de suero.
Cuando las células Vero o una mezcla de células Veroy células CHO son usadas para transfección, las células Vero las cuales son adherentes son separadas de preferencia de su soporte, por ejemplo, mediante tratamiento con tripsina antes de la transfección para mejorar la eficacia de transfección. De acuerdo con esto, la transfección es realizada de preferencia en una suspensión de células. Sin embargo, las células pueden volverse adherentes en el curso del método. De manera alternativa, uno también puede usar una línea de células Vero adaptadas para crecer en suspensión como se describe en US 2009/0203112, la cual es incorporada en la presente por referencia.
En el marco de los métodos de acuerdo con la invención, la transfección puede ser realizada mediante cualquier método conocido por el experto en la téenica. Por ejemplo, la transfección puede ser realizada mediante electroporación de membrana, electroporación nuclear. De preferencia, la transfección (paso a) es realizado mediante electroporación nuclear. La expresión “electroporación nuclear” es entendida por significar un método de transfección de ácidos nucleicos por medio de uno o más choques eléctricos cuya intensidad es suficiente para aumentar el número de poros nucleares y/o la permeabilidad de los mismos. En general, la intensidad total del o los choques eléctricos es al menos 2 kV/cm y la duración total del o los choques es al menos 10 ps. Electroporación nuclear de las células en suspensión es realizada por medio de uno o más choques eléctricos cuya intensidad total es al menos 2 kV/cm y para lo cual la duración total del o los choques es al menos 10 ps. De preferencia, la intensidad total del o los choques está entre 2 y 10 kV/cm y la duración total del o los choques está entre 10 y 1000 ps. Aún más preferiblemente, la intensidad del o los choques está entre 2 y 6 kV/cm y la duración total del o los choques está entre 100 y 600 ps. De preferencia, varios choques eléctricos interrumpidos por uno 0 más periodos de descanso son entregados a las células. US 2007/0059834 cuyo tema es incorporado en la presente por referencia, describe modos de administración prácticos de choques eléctricos a células seguidos por periodos de descanso. Siguiendo el o los choques eléctricos, también es posible aplicar a las células una corriente eléctrica cuya intensidad no exceda 2.5 A y durante un periodo de entre 1 y 50 ms. Normalmente, el paso de transfección es realizado como es detallado en el párrafo 1.9. de los Ejemplos, es decir, la transfección es realizada usando un nucleofector, tal como el nucleofector comercializado por Lonza usando el programa U-023.
La solución de transfección es elegida de manera que protege las células del o los choques eléctricos y de manera que no evita la difusión de los vectores de expresión hacia los núcleos. US 2005/0064596, cuyo tema es incorporado en la presente por referencia, describe solución de transfección optimizada. Son formulaciones cuya capacidad amortiguadora es al menos 20 mM pH 1 y las cuales tienen fuerzas iónicas de al menos 200 mM, cuando son sometidas a una temperatura de 25°C y a una variación de pH en el rango de 7 a 8. De preferencia, las concentraciones solares de Na+ y K+ en estas formulaciones están entre 100 y 150 mM y entre 2 y 6 mM, respectivamente. Generalmente también contienen iones Mg++. Los medios de transfección los cuales pueden ser usados en el contexto de la invención están dados, a manera de ejemplo: - Solución de transfección no. 1 : 4-6 mM KCI, 10-20 mM MgCI2, 120-160 mM y Na2HP04/NaH2P04 (pH 7.2); - Solución de transfección no. 2: 4-6 mM KCI, 10-20 mM MgCI2, 5-25 mM HEPES, 120-160 mM y Na2HP04/NaH2P04 (pH 7.2) y 5-100 mM de lactobionato de sodio o 5-100 mM manitol o 5-100 mM succinato de sodio o 5-100 mM de cloruro de sodio; - Solución de transfección no. 4: 4-6 mM KCI, 10-20 mM MgCI2, 5-25 mM HEPES, 50-160 mM Na2HP04/NaH2P04 (pH 7.2) y 5-100 mM de lactobionato de sodio o 5-100 mM manitol o 5-100 mM succinato de sodio o 5-100 mM de cloruro de sodio; - Solución de transfección no. 5: 4-6 mM KCI, 10-20 mM MgCI2, 80-100 mM NaCI, 8-12 mM glucosa, 0.3-0.5 mM Ca(N03)2, 20-25 mM HEPES y 50-100 mM tris/HCI o 30-50 mM Na2HP04/NaH2P04 (pH 7.2); - Solución de transfección no. 6: 0.1 -3.0 mM MgCI2, 50-200 mM K2HP04/KH2P04 (pH 6.5) y/o 1 -50 mM manitol y/o 1 -50 mM de succinato de sodio; y - Solución de transfección no. 7: 0.42 mM Ca(N03)2; 5.36 mM KCI; 0.41 mM MgSO4; 103 mM NaCI; 23.8 mM NaHCO3; 5.64 mM Na2HP04; 11.1 mM d(+)-glucosa; 3.25 mM glutationa; 20 mM HEPES; pH 7.3; - Solución salina amortiguadora de fosfato (PBS).
Aún preferiblemente la solución de electroporación es la solución V provista por Lonza en el kit referido como AmaxaMR Cell line Nucleofector Kit V- VCA-1003.
Consecutivo al paso de transfección, se adiciona un medio de cultivo a las células transfectadas en una proporción de al menos 5 volúmenes de medio de cultivo por 1 volumen de solución de transfección, de preferencia 10 volúmenes, todavía de preferencia 15 volúmenes de medio de cultivo por 1 volumen de solución de transfección. De preferencia, el medio de cultivo es un medio adecuado para el cultivo de células CHO. Un medio adecuado para tanto células CHO como células Vero o una mezcla de un medio adecuado para células CHO y un medio adecuado para células Vero también puede ser usado cuando las células Vero son usadas durante el paso de transfección.
En particular, la transfección es realizada como se describe en el párrafo 1.9 de los ejemplos.
El medio usado durante el paso de infección (medio de infección) puede ser cualquier medio adecuado para el cultivo de células CHO. Aún si algunos virus de influenza infecciosos pueden proliferar en algún grado en células CHO en un medio infeccioso sin tripsina, muy preferiblemente contiene o ha sido adicionada tripsina o una enzima teniendo una actividad de serina proteasa para permitir que el virus replique en células y para asegurar la propagación de los virus de influenza a través de las otras células CHO. En realidad, la hemaglutinina de virus de influenza debe ser cortada mediante una serina proteasa para que el virus sea capaz de replicar en las células de preferencia, la tripsina es de origen sintético o está libre de cualquier producto de origen animal. La tripsina o más generalmente cualquier enzima teniendo una actividad de serina proteasa, tal como pronasa, subtilisina, plasmina o termolisina puede ser producida mediante recombinación genetica. La tripsina puede ser producida en particular por medio de plantas transgénicas (WO 00/05384), levaduras o bacterias (WO 01/55429). Por ejemplo, una tripsina recombinante provista por Gibco bajo el nombre comercial TrypLE Select o por Invitrogen bajo el nombre comercial TrypLE Express es adecuado para el propósito de la invención.
De preferencia, el medio usado en el contexto de la invención, incluyendo medio de cultivo y medio de infección están libres de suero de origen animal, de preferencia están libres de cualquier proteína de origen animal y aún más preferiblemente están libres de cualquier componente de origen animal. Ejemplos de medios libres de suero de origen animal y/o libres de materia prima de origen animal, los cuales pueden ser adecuados para el tema de la invención son comercializados bajo los nombres VP SFM (InVitrogen), Eiserf (InVitrogen), LC17 (Cambrex), Pro CHO 5-CDM (Cambrex), HyQ SFM4CHO (Hyclone), HqQ SFM4CHO-Utiity (Hyclone), HyQ PF Vero (Hyclone), medio libre de proteína Ex cell 325 PF CHO (JRH Biosciences), medio libre de suero Ex cell 302 (JRH Biosciences), Excell 525, Ex CellMR CD CHO Fusión (SAFC Biosciences). Por lo tanto es posible realizar el método de acuerdo con la invención usando medios libres de animales (por ejemplo, los cuales están libres de cualquier contaminante o componente de origen animal). En particular, un medio adecuado para el tema de la invención es el medio Ex CellMR CD CHO Fusión fabricado por SAFC Biosciences complementado con L-Glutamina. Para producir virus de influenza infeccioso por infección de celulas CHO, tripsina o un derivado de tripsina, de preferencia libre de cualquier componente de origen animal, es adicionado a este medio.
En algunas modalidades, la cantidad total de células sometidas a transfección es por ejemplo, 0.5, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 6 o incluso 10 millones de células o más.
En una modalidad adicional, cuando las células sometidas a transfección son una mezcla de células Vero y células CHO, las células Vero y CHO pueden estar presentes en una proporción Vero:CHO que varía de 0.5: 1 a 2:1 , por ejemplo, de 1 : 1 , 1.5:1 , 1 :0.5, o 1 : 1.5. Normalmente dicha proporción de células Vero:CHO es de 1 :1. Por ejemplo, cuando dicha proporción de células Vero:CHO es de 1 :1 , la cantidad de células de cada tipo representa, por ejemplo, al menos 0.5, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3 millones de células.
En algunas modalidades, la cantidad de células CHO que son adicionadas después del paso de transfección para realizar el paso de infección es por ejemplo, al menos 0.5, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3 millones de células.
En algunas modalidades del método de la invención, los vectores de expresión comprenden vectores de expresión que permiten la expresión tanto de una o más proteínas de influenza y uno o más vRNAs de influenza, entendiéndose que la expresión de dicho conjunto de vectores de expresión permite (i) la formación del complejo de ribonucleoproteína (RNP) conteniendo los vRNAs de dicho virus, y (ii) el montaje de dichas partículas virales en dichas células transfectadas. Opcionalmente, el virus auxiliar puede ser adicionado a dicho conjunto de vectores de expresión.
Tales vectores son por ejemplo, plásmidos bidireccionales que promueven la expresión tanto de mRNAs como vRNAs, conteniendo cada plásmido: - uno o más cDNAs complementarios para uno o más de los ocho vRNAs seleccionados entre los vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, MS, HA y NA de influenza o los cRNA(s) correspondientes, en donde cada cDNA está bajo el control de - un promotor que se une a RNA polimerasa II (promotor POL II), permitiendo por ello la expresión de las proteínas de influenza correspondientes, y de - un promotor que se une a RNA polimerasa I (promotor POL I); permitiendo por ello la expresión de los vRNAs correspondientes, o dichos cRNAs correspondientes.
En algunas modalidades, el promotor que se une a RNA polimerasa II es un promotor que se une a RNA polimerasa II humana y/o el promotor que se une a RNA polimerasa I es un promotor que se une a RNA polimerasa I humana.
De preferencia, si el conjunto de vectores de expresión es transfectado en células CHO, el promotor que se une a RNA polimerasa I es un promotor que se une a una RNA polimerasa I de roedor. El promotor que se une a RNA polimerasa I de roedor de preferencia se une a RNA polimerasa I de hámster o ratón.
En algunas modalidades, el conjunto de vectores de expresión que permite la expresión tanto de mRNAs como vRNAs, o los cRNAs correspondientes comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho plásmidos bidireccionales como se define antes en la presente. De preferencia, dichos vectores de expresión consisten de ocho plásmidos bidireccionales, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAs seleccionados entre vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNA(s) correspondientes. De preferencia, dichos vectores de expresión consisten de los ocho plásmidos descritos en Ozawa et al, 2007, J Virol, 81 (17):9556-9559.
El conjunto de vectores de expresión también puede comprender: - vectores de expresión que permiten la expresión de solo uno o más mRNAs que codifican una o más proteínas de influenza, y - vectores de expresión que permiten la expresión de solo uno o más vRNAs de influenza o los cRNAs correspondientes, del virus de influenza, entendiéndose que la expresión de dicho conjunto de vectores de expresión permite (i) la formación del complejo de ribonucleoproteína (RNP) conteniendo el vRNA de dicho virus, y (ii) el montaje de dichas partículas virales en dichas células transfectadas, y (iii) el montaje de dichas partículas virales en dichas células transfectadas.
Los vectores que inducen la expresión de solo proteínas de influenza deberán al menos inducir la expresión de proteínas PB1 , PB2, PA y NP, pero también inducen la expresión de las otras proteínas de influenza (proteínas M, NS, HA y NA). De preferencia, dichos vectores de expresión son plásmidos unidireccionales, conteniendo cada plásmido uno o más cDNAs que inducen la expresión de al menos una o más proteínas seleccionadas entre el grupo de proteínas PB1 , PB2, PA y NP, en donde cada cDNA está bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa II. De acuerdo con esto, dichos vectores de expresión pueden comprender los plásmidos descritos en Fodor et al, 1999, J Virol, 73(1 1 ):9679-9682, o los plásmidos pVAX1 , cada uno clonado con el cDNA correspondiente a una de las proteínas PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, como se describe en el párrafo 1.8 de los ejemplos. De manera alternativa, el conjunto de vectores de expresión comprende ocho plásmidos distintos, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a un mRNA que codifica una proteína viral distinta entre proteínas PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa II. De acuerdo con esto, dichos vectores de expresión pueden comprender los ocho plásmidos descritos en Neumann et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96(16):9345-9350.
Los vectores que permiten la expresión de uno o más vRNAs de influenza o los cRNAs correspondientes, deberán inducir la expresión de vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes. De preferencia, dichos vectores de expresión son plásmidos unidireccionales, conteniendo cada plásmido uno o más cDNAs complementarios a uno o más de dichos vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, estando cada cDNA bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I. Dichos vectores de expresión pueden comprender al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho plásmidos. Aún preferiblemente, dichos vectores de expresión que permiten la expresión de vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, comprenden ocho plásmidos diferentes, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAS PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I. De acuerdo con esto, dicho conjunto de vectores de expresión comprende los ocho plásmidos descritos en Neumann et al, 1999, Proc Nati Acad Sci USA, 96(16):9345-9350 o en Fodor et al, 1999, J Virol, 73(1 1 ):9679-9682. En otra modalidad, el conjunto de vectores de expresión que permiten la expresión de vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, es representado por un plásmido conteniendo los 8 cDNAs complementarios a vRNAs PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, o los cRNAs correspondientes, es representado por un plásmido conteniendo los 8 cDNAs complementarios a vRNAs PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, estando cada uno bajo el control de un promotor de RNA polimerasa I y un terminador de polimerasa como se describió por Neumann et al, 2005, Proc Nati Acad Sci USA, 102(46):16825-16829. En otra modalidad, el conjunto de vectores de expresión que permite la expresión de vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, comprenden por ejemplo dos plásmidos diferentes, un plásmido conteniendo seis cDNAs, cada uno de dichos cDNA siendo complementario a cada uno de los vRNAs PB1 , PB2, PA, NP, M y NS bajo el control de un promotor de RNA polimerasa I y un plásmido conteniendo dos cDNAs, cada uno de dicho cDNA siendo complementario a cada uno de vRNAs HA y NA, cada uno del cDNA estando bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I. Los plásmidos conteniendo un cDNA complementario a uno de los vRNAs HA y NA, estando cada uno de los cDNA bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I. Los plásmidos conteniendo un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAs PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, o los cRNAs correspondientes, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I son obtenidos de preferencia al clonar dicho cDNA en el vector comprendiendo la secuencia SEQ ID NO:2. Aún preferiblemente, cada uno de dichos plásmidos es obtenido al clonar dicho cDNA en el vector comprendiendo o consistiendo de la secuencia SEQ ID NO: 10, es decir, en el plásmido pSP-flu universal.
En una modalidad preferida particular, el conjunto de vectores de expresión comprende: - cuatro plásmidos diferentes, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a un mRNA que codifica una de las cuatro proteínas PB2, PB1 , PA y NP virales bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa II, tal como los plásmidos descritos en Fodor et al, 1999, J Virol, 73(11 ):9679-9682, o los plásmidos pVAX1 clonaos con el cDNA que codifica PB2, PB1 , PA y NP como se describe en el párrafo 1.8 de los ejemplos, y - ocho plásmidos diferentes, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAS PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, o los cRNAs correspondientes, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I, siendo obtenido cada plásmido al clonar dicho cDNA en el vector de acuerdo con la invención, tal como plásmido pSTP-flu universal.
De preferencia, vectores capaces de expresar vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza son vectores de acuerdo con la invención, en los cuales los cDNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, respectivamente, han sido clonados.
Los vectores capaces de expresar proteínas de PB1 , PB2, PA y NP de influenza pueden ser, entonces, por ejemplo, el plásmido pVAX1 (Life technology, Cergy Pontoise, FR).
En otra modalidad de la invención, los virus de influenza infecciosos producidos de acuerdo con el proceso de la invención pueden ser un virus de influenza tipo salvaje, tal como un virus de influenza estacional o uno pandemico, un virus de influenza reagrupado, un virus de influenza quimérico o incluso un virus de influenza atenuado.
De preferencia, dicho virus de influenza infeccioso que es producido de acuerdo con el proceso de la invención es un virus de influenza reagrupado.
Aún preferiblemente, dicho virus de influenza infeccioso es un virus de influenza quimérico reagrupado.
Los virus de influenza infecciosos producidos pueden ser cualquier subtipo de cepas A, cepas B, o cepas C. Puede ser una cepa viral que infecte seres humanos, tales como cepas A/H1 N1 , A/H3N2, A/H5N1 , A/H7N1 o B. Puede ser una cepa viral que infecte aves, tales como cepas A/H5N1 , A/H5N2, A/H5N8, A/H5N9, A/H7N1 , A/H7N3, A/H7N7. También puede ser una cepa viral que infecte caballos (cepas A/H3N8), cerdos (cepas A/H1 N1 ; A/H3N2 o A/H1 N2) y similares.
Los virus de influenza infecciosos producidos pueden ser responsables de influenza estacional humana. En particular, dicho virus de influenza producido de acuerdo con la invención puede ser una cepa A/H1 N1 , A/H3N2 o una cepa B. También puede ser un virus responsable de gripe aviar.
Los virus de influenza infecciosos producidos de acuerdo con la invención también podrían ser responsables de influenza pandémica. En particular, dicho virus de influenza producido podría ser, por ejemplo, una cepa A/H1 N1 , A/H5N1 o A/H7N1.
De preferencia, los virus de influenza infecciosos son virus de influenza infecciosos reagrupados, es decir, contienen material genético que se deriva de al menos dos virus donadores.
Ejemplos de virus reagrupados tipo A útiles para la fabricación de una vacuna de influenza tipo A son de tipo 6:2 o 5:3, en los cuales los 6 o 5 vRNAs respectivos son de un virus donador teniendo buenas capacidades de crecimiento sobre el substrato de producción, como A/PR/8/34 ( H 1 N 1 ) , mientras que los vRNAs faltantes son segmentos de HA, NA y posiblemente PB1 a partir de un virus estacional o pandémico. Cuando el reagrupamiento es un virus H1 N1 de tipo 6:2, puede comprender los 6 vRNAs (PB1 , PB2, PA, NP, M, NS) de virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) y los vRNAs de HA y NA de un virus estacional o pandémico.
En particular, en el caso de virus reagrupados tipo A de tipo 6:2, los 6 segmentos de vRNAs pueden derivarse del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) y puede comprender o consistir del vRNA de PA de secuencia SEQ ID NO: 13, el vRNA de PB1 de secuencia SEQ ID NO:14, el vRNA de PB2 de secuencia SEQ ID NO: 15, el vRNA de NP de secuencia SEQ ID NO: 16, el vRNA de M de secuencia SEQ IDNO: 17, el vRNA de NS de secuencia SEQ ID NO: 18.
Un virus reagrupado tipo B útil para la fabricación de una vacuna de influenza tipo B es por ejemplo, de tipo 2:2:4 (provisto por New York Medical College) en el cual los vRNAs de PB2 y NP son del virus B/Lee/40, el vRNA de PA y NS son del virus B/Panama/45/90 y los vRNAs de HA, NA, PB1 y M son de un virus estacional B llamado B/Hubei-Wujiangang/158/209.
Los virus de influenza infecciosos producidos también pueden ser virus de influenza quiméricos, en particular virus de influenza reagrupados quiméricos y todavía más particularmente dicho virus de influenza quimérico contiene vRNAs de HA y/o NA de influenza quiméricos.
En algunas modalidades, dicho vRNA de HA o NA es quimérico.
De preferencia, dichos vRNAs de HA o NA de influenza quiméricos codifica una proteína de HA o NA quimérica. Comprende uno o más dominios de vRNA de HA o un fragmento de vRNA de NA de un virus donador (tal como A/PR8/34 (H1 N1 ) o B/Lee/40 y uno o más dominios de un vRNA de HA o NA de un virus de influenza estacional o pandémico. En particular, dicho dominio de vRNA de HA del virus estacional o pandemico es complementario a un mRNA que cdoifica el ectodominio antigénico de HA, tal como HA1 y/o H12 o dicho dominio de vRNA de NA del virus estacional o pandémico es complementario a un mRNA que codifica el ectodominio antigénico de NA de dicho virus estacional o pandémico.
Por ejemplo, dicho vRNA de HA quimérico contiene los dos dominios NCR (Región no de codificación), el dominio SP (péptido de señal), el dominio HA2, el dominio TM (Trans-membrana) y el dominio Cyto (citoplásmico) derivado de un virus donador, mientras que el dominio HA1 es derivado de un virus de influenza estacional o un virus de influenza pandémico.
De preferencia, en el caso de virus de influenza tipo A, el vRNA de HA quimérico contiene los dos dominios NCRs, SP, HA2, TM y Cyto del virus donador A/PR/8/34 (H1 N1 ), y el dominio HA1 de un virus de influenza tipo A estacional o pandémico.
Aún preferiblemente, en el caso de virus de influenza tipo A, el vRNA de HA quimérico contiene los dos dominios NCRs, SP, HA2, TM y Cyto de secuencias respectivas SEQ ID NO: 19, 20, 21 , 22, 23 y 24 del virus donador A/PR/8/34 (H1 N1 ) y el dominio HA1 de un virus de influenza tipo A estacional o pandémico.
De preferencia, en el caso de virus de influenza tipo B, el vRNA de HA quimérico contiene los dominios NCRs, SP, HA2, TM, Cyto de un virus donador, tal como A/PR/8/34 (H1 N1 ) o B/Lee/40 y el dominio HA1 de un virus tipo B estacional.
En el caso de vRNA de NA quimérico, contiene los dominios NCRs, TM, Cyto y de tallo derivados de un virus donador, mientras que el dominio llamado ectodominio es derivado de un virus de influenza estacional o pandemico. De preferencia, en el caso de virus de influenza tipo A, el vRNA de NA quimérico contiene los dominios NCRs, TM, Cyto y Tallo del virus donador A/PR/8/34 (H1 N1 ) y el ectodominio de un virus de influenza estacional o pandémico. Aún preferiblemente, en el caso de virus de influenza tipo A, el vRNA de NA quimérico contiene los NCRs, TM, Tallo y Cyto de secuencias respectivas SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 y 29 del virus donador A/PR/8/34 (H1 N1 ) y el ectodominio de un virus estacional o pandémico. De preferencia, en el caso de virus de influenza tipo B, el vRNA de NA quimérico contiene los dominios NCRs, TM, Tallo y Cyto de un virus donador, tal como A/PR/8/34 (H1 N1 ) o B/Lee/40, y el ectodominio de un virus tipo B estacional.
Células huésped La invención también se refiere a una célula CHO, la cual comprende un conjunto de vectores de expresión como se definió antes en la presente.
Dicha célula CHO y virus de influenza infecciosos son como se describió antes.
Así, en particular, dicha célula CHO es una célula CHO-K1 , como se describió antes.
En una modalidad particular, dicho conjunto de vector de expresión comprende: (i) Vectores de expresión capaces de expresar proteínas PB2, PB1 , PA y NP de influenza, y comprendiendo cuatro plásmidos diferentes, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a un mRNA que codifica una de las proteínas virales seleccionadas entre proteínas PB2, PB1 , PA y NP bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa II, y (ii) vectores de expresión capaces de expresar vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, y comprendiendo ocho diferentes plásmidos, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAs seleccionados entre los vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, o los cRNAs correspondientes, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I de roedor, y siendo obtenida al clonar dicha secuencia de cDNA en un vector de acuerdo con la invención, entendiendose que dicho vector comprende un promotor que se une a RNA polimerasa I de roedor.
Dichos vectores de expresión capaces de expresar proteínas PB2, PB1 , PA y NP de influenza pueden comprender los plásmidos descritos en Fodor et al, 1999, J Virol, 73(11 ):9679-9682, o los plásmidos pVAX, conteniendo cada uno el cDNA complementario a un mRNA que codifica una de las proteínas virales seleccionadas entre PB2, PB1 , PA y NP como se describe en el párrafo 1.8 de los ejemplos.
De preferencia, dicho vector de acuerdo con la invención comprende un promotor que se une a RNA polimerasa I de hámster. De manera alternativa, el promotor de los ocho plásmidos conteniendo el cDNA complementario a los vRNAs es un promotor T7 polimerasa. En ese caso, el conjunto de vectores de expresión contiene un plásmido adicional (el número total es 13) conteniendo un cDNA complementario a un mRNA que codifica la T7 polimerasa como se describe por De Wit et al, 2007, J. Gen. Virol, 88 (Pt4): 1284-1287.
La invención tambien se refiere a una célula CHO recombinante que expresa de manera estable proteínas PB2, PB1 , PA y NP de influenza. En una modalidad particular, tales células CHO recombinantes también pueden contener un conjunto de vectores de expresión capaces de expresar vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M y NS de influenza.
De preferencia, dicha célula CHO recombinante es una célula CHO-K1 recombinante.
Los métodos para establecer células estables son bien conocidos por alguien experto en la téenica. Por ejemplo, dicho método es descrito por Wang et al, 2012, Genet Mol Res, 1 1 (2): 1442-1448 o por Liu et al, 2011 , Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 27(5):7474-754.
Método para preparar composiciones farmacéuticas La invención también se refiere a un método para preparar una composición de vacuna de influenza, dicho método comprende: a) producir virus de influenza mediante un método de acuerdo con cualquier modalidad de la invención como se describió previamente; b) recolectar los virus de influenza infecciosos después de la multiplicación en células CHO, de preferencia en células CHO-K1 , c) purificar el virus de influenza infeccioso recolectado, d) opcionalmente inactivar el virus purificado, y e) mezcla el virus purificado con un portador farmacéuticamente aceptable.
La purificación puede ser breve y puede limitarse a un paso para concentrar el virus mediante centrifugación después de haber aclarado de manera general el virus infeccioso recolectado. La purificación puede ser complementada con el paso de centrifugación realizado, por ejemplo, por medio de gradientes de densidad de sacarosa (EP 0 7760362). Métodos cromatográficos también pueden ser realizados con el fin de purificar el virus. Una suspensión de virus enteros purificados es obtenida de esta manera, la cual puede ser procesada adicionalmente para obtener la composición de vacuna final. La suspensión de virus purificada también puede experimentar tratamientos subsecuentes. Los productos derivados de virus de gripe son así obtenidos. La suspensión viral puede ser fragmentada usando detergentes o solventes lipidíeos de acuerdo con los métodos bien conocidos para aquéllos expertos en la téenica, con el fin de fabricar, por ejemplo, vacunas con base en virus fragmentados o divididos, los virosomas conteniendo la hemaglutinina de virus de gripe y las vacunas de subunidades conteniendo la hemaglutinina de virus de gripe, las cuales son obtenidas a partir de los virus purificados son considerados como productos derivados de virus de gripe.
La composición de vacuna final puede hacerse de virus de gripe inactivado entero o virus de gripe atenuado.
La inactivación de la suspensión viral es realizada por medios convencionales, usando b-propiolactona (E. Budowsky et al. 1991 , Vaccine, 9: 319-325; 1991 , Vaccine, 9: 398-402; 1993, Vaccine, 11 :343-348), etilenimina o derivados (D. King 1991 , Avian Dis. 35:505-514) o formol (EP 0 776 0362). La inactivación del virus puede realizarse antes o después del paso de purificación.
La composición de vacuna final es generalmente formulada con un portador farmacéuticamente aceptable.
Por “portador farmacéuticamente aceptable” se quiere decir cualquier solvente, medio de dispersión, carga, etc., comúnmente usado en la formulación de farmacéuticos y vacunas para mejorar la estabilidad, esterilidad y capacidad de entrega del agente activo, el cual no produce alguna reacción secundaria, por ejemplo, una reacción alérgica, en humanos. El excipiente es seleccionado de la base de la forma farmacéutica elegida, el método y la ruta de administración. Excipientes apropiados, y requerimientos en relación a la formulación farmacéutica, son descritos en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (19a edición, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)), lo cual representa un trabajo de referencia en el campo. Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, soluciones salinas amortiguadas con fosfato, solución de glicina al 0.3%.
La composición de vacunas con base en virus enteros inactivados también puede comprender uno o más auxiliares. Estas vacunas pueden ser formuladas con sales de aluminio, tales como gel de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o alumbre, o en una emulsión agua-en- aceite o aceite-en-agua. Cualquier auxiliar capaz de aumentar la respuesta humoral y/o celular contra la gripe puede usarse. Como ejemplo de formulaciones auxiliares no limitantes, se hace mención de la emulsión MF59®, las formulaciones basadas en liposomas y formulaciones basadas en MPL, en Corynebacterium parvum, en saponina, en lisolecitina, en derivados plurónicos, o en combinaciones de los mismos. También pueden usarse agonistas de TLR.
Las vacunas obtenidas por medio del método de acuerdo con la invención son para uso para proteger humanos y animales contra la gripe.
En el campo veterinario, la vacuna es usada principalmente en el campo de prevención de gripe aviar, pero también puede usarse para prevenir o reducir los síntomas de gripe y/o secreción viral en miembros de la familia de equmos, en particular caballos, miembros de la familia de caninos, en particular perros, miembros de la familia de felinos, en particular gatos, miembros de la familia de porcinos, en particular cerdos, mustélidos, en particular visones y hurones, y especies de aves, en particular, gallina, pato, pavo, codorniz, gallina de guinea, ganso y avestruz.
En humanos, la vacuna es usada en el campo de la prevención de gripe epidémica y gripe pandémica. Aunque la gripe epidémica afecta una población humana ya sensibilizada por contacto (por infección) o por inmunización con una o más cepas de virus de influenza para lo cual existe una relación antigénica con HA del virus responsable de la epidemia y en el cual existe una cierta inmunidad, incluso si es solo parcialmente efectiva, la gripe pandémica afecta a una población humana no sensibilizada a un nuevo virus debido a que HA de este nuevo virus no tiene o tiene muy poca relación antigénica con los virus de circulación previa.
La vacuna de gripe epidémica es pretendía para proteger la población humana contra formas de gripe estacional ocasionadas por virus de influenza estacional en circulación que tienen una relación antigénica con virus previos que ya habían circulado. Actualmente, los virus de influenza responsables de gripe epidémica son de tipo A y pertenecen a los subtipos H1 N1 o H3N2 o son de tipo B.
La vacuna de gripe pandémica es pretendida para proteger la población humana contra la infección por un virus de influenza pandémica, el cual es un nuevo virus de influenza que no tiene relación antigénica en términos de HA con virus en circulación anteriores. Actualmente, el virus de influenza responsable de gripe pandémica es virus A/H1 N1.
La vacuna de gripe epidérmica o pandémica puede estar en la forma de una vacuna atenuada viva o una vacuna inactivada, aunque una vacuna inactivada es preferida para la prevención de gripe pandémica. La vacuna puede estar en la forma de una vacuna monovalente (vacuna preparada a partir de una cepa de virus de gripe simple) o de una vacuna multivalente (vacuna preparada a partir de varias cepas de virus de gripe). La composición de la vacuna de gripe epidémica está actualmente en la forma de una vacuna trivalente preparada a partir de virus H3N2 y H1 N1 y de un virus tipo B. La vacuna inactivada está generalmente en la forma de virus entero, de virus fragmentado (virus dividido) o de virosomas, o en una forma de subunidad conteniendo HA, y opcionalmente contiene uno o más auxiliares tales como aquellos mencionados antes. La vacuna atenuada viva generalmente es administrada de manera oral o nasal para promover el desarrollo de inmunidad e mucosa, la vacuna inactivada puede ser administrada de manera parenteral (intramuscular o subcutánea), intradérmica o incluso mucosa (intranasalmente), o incluso al combinar dos utas de administración diferentes como se describió en WO 01/22992. El esquema de inmunización generalmente proporciona una inyección o una inyección seguida por un refuerzo. La dosis de vacuna administrada depende de la edad del individuo y en la presencia o usencia de un auxiliar. Convencionalmente, la dosis de vacuna contiene el equivalente de 15 mg de HA de cada cepa de vacuna contenido en la vacuna. Esta dosis puede ser reducida a aproximadamente 1 a 2 pg de HA cuando la vacuna es auxiliada, o incrementada a 30 pg de HA o incluso más en individuos mayores o individuos que sufren de una deficiencia inmune.
Las composiciones pueden ser adminisstradas usando jeringas hipodérmicas convencionales o jeringas de seguridad, tales como aquéllas comercialmente disponibles de Becton Dickinson Corporation (Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) o inyectores a chorro. Para la administración intradérmica, pueden emplearse jeringas hipodérmicas convencionales usando la téenica Mantoux o dispositivos de entrega intradérmica especializaos, tales como sistema de micromyección BD Soluvia(MR) (Becton Dickinson Corporation, Franklin Lakes, NJ, EE.UU., tambien pueden ser usados.
El volumen de composición administrado dependerá del método de administración. En el caso de inyecciones subcutáneas, el volumen está generalmente entre 0.1 y 1.0 mi, de preferencia aproximadamente 0.5 i.
A lo largo de esta aplicación, se citan varias referencias. Las descripciones de estas referencias son incorporadas aquí por referencia en la presente descripción.
La presente invención será ilustrada adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.
Breve descripción de las figuras Figura 1 : La ilustración del esquema aerodinámico para rápida generación de virus de influenza recombinantes que podrían usarse como reagrupados de vacuna. pSP-flu corresponde al vector universal consistiendo de la secuencia SEQ ID NO: 10.
Figura 2: Estrategia de clonación usando plásmido pSP-flu universal. La ubicación de gene de resistencia a kanamicina es mostrada en blanco, el promotor de POL 1 y ribozima son mostrados en negro. El plásmido fue linealizado con Bbsl, y se mezcló con el cDNA viral conteniendo 17 nucleótidos del promotor y la ribozima en los extremos, antes de la transformación de E. coli competente. El cDNA recombinado en plásmido circular dentro de las regiones de complementariedad terminal para introducir segmentos de genoma de virus entre promotor POL I y ribozima.
Ejemplo 1. Materiales y metodos 1.1. Células La suspensión de células CHOK1 (ATCC <Número:CCL-61 <) fue cultivada en matraces con agitador de 125 mi (Thermo Scientific) en medio ExCell CD CHO Fusión (SIGMA-ALDRICH, St Quentin Fallavier, FR) complementado con 4 mM L-glutamina (Gibco® bajo agitación. Las células MDCK adherentes (CCL-34) y células Vero (ATCC número: CCL-81 ) fueron cultivadas en matraces de cultivo de tejido (Becton Dickinson) en DMEM (Gibco®) complementado con 10% FBS (Thermo Scientific) o en VP-SFM (Gibco® complementado con 0.1 % povidona K30 (Sanofi Pasteur), respectivamente. Las células CEP fueron recolectadas a partir de embriones de pollo libres de patógenos específicos (SPF) de 10 días de edad (Valo Biomedia, Oserholz-Scharmbeck, GE) y se cultivaron en matraces de cultivo de tejido (Becton Dickinson) en DMEMF12+Glutamax I (HAM) (Gibco®) complementado con 5% FBS (Thermo Scientific). Todos los cultivos celulares fueron mantenidos a 37°C en una atmosfera de 95% de aire y 5% CO2. 1.2 Análisis de receptor El análisis de expresión de residuo Sia2-3Gal y Sia2-6Gal sobre la superficie de tipos de células diferentes se realizó usando kit de diferenciación de digoxigenina glicano (Roche, Mannhein, GE). Dos millones de células fueron lavadas dos veces en PBS 1 x (Eurobio, Courtaboeuf, FR) y una vez en un amortiguador conteniendo 0.05 M T ris-HCI, 0.15 M NaCI, 1 mM MgCI2, 1 mM MnCI2 y 1 mM FcaCI2, pH 7.5. Las células fueron incubadas durante 1 h a temperatura ambiente con lectinas etiquetadas con digoxigenina Aglutinina de Sambucus nigra (SNA) (1/1000) específica para residuos Sia2-6Gal, o Aglutinina de Maackia amurensis (MAA) (1/300) específica para Sia2-3Gal. Las células de control fueron incubadas sin lecitinas. Las células fueron lavadas dos veces en TBS (0.05M Tris-HCI, 0.15 M NaCI, pH 7.5) y tratadas con 1/40 Fragmento Fab anti-digoxigenina-fluoresceína (Roche) durante 1 h a temperatura ambiente (en la obscuridad). Después de dos lavados en PBS 1x (Eurobio), las células fueron analizadas por intensidad de fluorescencia verde en citómetro de capilar de Guava. 1.3. Virus Los virus de influenza B/Brisbane/60/08 y virus de vacuna reagrupados A/New Caledonia/20/99 (HN1 ) IR116, A/Vietnam/1194/04 (H5N 1 ) rg14 y A/California/07/09 (H1 N1 ) X179A fueron obtenidos de IBSC (Hertofordshire, UK). Los virus fueron propagado en huevos de gallina con embrión (Valo Biomedia) y se recolectaron de fluidos alantoicos infectados. 1.4. Infección de virus Las células fueron sembradas en placas de 6 cavidades (Corning N, EE.UU., 4 h antes de la inyección, a una densidad de 1.6 x 105 celulas/cm2 en el medio de cultivo libre de suero apropiado para cada tipo celular, y en un volumen final de 1 mi. Las infecciones fueron realizadas en varias multiplicidades de infección (MOI) durante 1 h a 35°C. El medio de cultivo libre de suero apropiado para cada tipo de célula, sin suero, (2ml) conteniendo tripsina porcina (SIGMA-Aldrich) fue adicionado y las células fueron incubadas durante 4 días a 35°C en 8% de CO2. 1.5. Ensayo de hemaglutinación El ensayo de HA fue realizado al diluir serialmente 50 mI de sobrenadantes de cultivo d 2 veces con PBS 1 x (Gibco® en placas de fondo en V (Corning). Subsecuentemente, 50 ml de glóbulos rojos de poco al 5% (Sanofi Pasteur, Alba-la -Romaine, FR) se adicionaron a cada cavidad. Las placas fueron incubadas durante 1 h a 4°C y la hemaglutinación o la ausencia de hemaglutinación fue determinada visualmente para cada cavidad. 1.6. Ensayo de TCID5o Se sembraron células MDCK en placas de 96 cavidades (Corning) a una densidad de 2.5 x 106 células/cm2 en DMEM (Gibco®. Complementadas con 1 mg/ml de tripsina porcina (SIGMA-ALDRICH). Las células fueron infectadas con 50 mI de diluciones virales seriales 1 :10 y se incubaron durante 4 días, a 35°C. Los sobrenadantes de estos cultivos fueron probados entonces en un ensayo de hemaglutinación.
Los títulos de TCID50 de acuerdo con el método estadístico de Spearman-Karber (Diavid John Finncy, 1952, Statistical method in biológica assay (Método estadístico en ensayo biológico), Hafner editor). 1.7. Eficiencia de transfección Dos millones de células fueron centrifugadas durante 10 min a 200 x g, resuspendidas en 100 mI de solución de cGMP (buenas prácticas de fabricación actuales) V (Lonza, Bae, CH) a temperatura ambiente y 10 pg de pGFP (Sanofi Pasteur) fueron adicionados. Se realizó la nucleoporación con un Nucleofector (Lonza) usando diferentes programas. Las células fueron incubadas en placas de 6 cavidades (Corning) en el medio óptimo para cada tipo celular durante 24 h a 37°C, 5% CO2. Las células fueron analizadas por intensidad de fluorescencia verde de citómetro capilar de Guava (Millipore, Bellerica, MA, EE UU ). 1.8. DNA de plásmido Los 12 plásmidos para el rescate de virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) infeccioso han sido descritos previamente por Fodor et al, 1999, J Virol, 73(11 ):9679-9682. La misma metodología fue aplicada con algunas modificaciones como se menciona más adelante.
Las regiones de codificación de proteínas PB2, PB1 , PA y NP de virus A/WSN/33 (H1 N1) (WSN) fueron clonadas en el plásmido pVAX1 (Life technology, Cergy Pontoise, FR) entre el promotor CMV y los sitios de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino (BGH-poIyA). El plásmido pVAX1 (Life technology) fue modificado por expresión de RNA viral. Brevemente, un fragmento de DNA, correspondiente a promotor POL 1 humano y secuencias de ribozimas delta de hepatitis separadas por un enlazador conteniendo sitio Bbsl para linealización, sitios Notl y Sbfl, se clonaron en el plásmido pVAX1 y el promotor CMV y el sitio BH-poIyA fueron removidos. El plásmido resultante fue llamado “psP-flu universal”.
El RNA viral fue extraído de fluido alantoico infectado con mini kit de RNA viral QIAamp (Qiaen, Courtaboeuf, FR) y los cDNAs genómicos complementarios a vRNAs fueron obtenidos con un sistema de RT-PCR de un paso de Superscript III (Life technology) usando un par de cebadores conteniendo 17 nucleótidos a partir de ribozima delta de hepatitis (5’-ctgggaccatgccggcc) (SEQ ID 0: 11 ) y 17 nucleótidos y del promotor POL 1 (5’-tgggccgccgggttatt) (SEQ ID NO: 12), respectivamente.
Los parámetros de ciclo de temperatura fueron 47°C durante 0 min, 94°C durante 2 min y entonces 40 ciclos (94°c durante 15 s, 60°C durante 30 s y 72°C durante 2 min) y 72°C durante 5 min. Cada fragmento fue purificado subsecuentemente con kit de extracción de gel GenElute (SIGMA-ALDRICH) y se clonó en el plásmido pSP-flu universal, previamente linealizado por Bbsl (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.), mediante recombinación homologa usando un kit de clonación Fusión HD PCR (Clontech, Gtakara Bio, Saint Germain en Laye, FR). Se generaron preparaciones de DNA de plásmido libre de edotoxina usando un kit Nucleobond Maxi EF (Machercy Nagel, Düren, GE). 1.9. Genética inversa Un millón de células Vero y un millón de células CHOK1 se mezclaron y centrifugaron durante 10 min a 200 x g y se resuspendieron en 10 mI de solución V (Lonza) a temperatura ambiente. Una mezcla de 1 mg de cada uno de los 8 plásmidos de expresión de vRNA y 0.5 pg de cada uno de los 4 plásmidos de expresión de proteína fueron adicionados a las células y la nucleofección fue realizada con el nucleofector (Lonza) usando el programa U-023. Las células fueron incubadas en placas de 6 cavidades en medio Ex -cellMRCD CHO fusión (SIGMA-ALDRICH) complementado con 4 mM L-Glutamina (Gibco®). Después de 2 de incubación a 37°C, 5% CO2, 2 millones de células CHOK1 fueron adicionadas en el mismo medico complementado con tripsina recombinante (TryLE Select) (Gibco®) y se incubaron en una plataforma rotatoria a 35°C, 8% C02. 1.10. Inhibición de ensayo de hemaglutinación (1HA) Un suero específico para HA de virus A/California/07/09 (H1 N1), comprado a National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), fue tratado con Enzima destructora de receptor de Vibrio Cholera (RDE, Sigma, 10 mU/ml) durante 18 h a 37°C. La RDE fue inactivada a 56°C durante 1 h. El suero tratado con RDE fue incubado entonces con 5% glóbulos rojos de pavo (RBC) durante 2 horas a 4°C y centrifugado durante 10 min a 2000 rpm. Las diluciones eriales del suero tratado fueron incubadas entonces con 4HAU del virus a ser probado durante 1 h a temperatura ambiente y entonces con 0.25% RBC de pollo durante 1 h a 4°C. El título de 1HA es determinado mediante la dilución más alta del suero que inhibe la hemaglutinación de RBC mediada por el virus. 2. Resultados 2.1. Crecimiento celular Celulas MDCK, CHO-K1 , Vero y CEP fueron valoradas primero por su capacidad para sostener el crecimiento en el medio más apropiado para cada tipo celular ya sea en suspensión para CHO-K1 o como adherente para los otros tipos celulares. El nivel de duplicación de población (pdl) fue determinado para cada tipo celular al estimar la duración necesaria para una generación. Como se ve en la Tabla 1 , MDCK y CHO-K1 presentaron un pdel más corte (23 y 18 h, respectivamente) comparado con células Vero (38 h) y CEP (48 h). Es importante notar que las líneas de células CHO-K1 y Vero fueron cultivadas sin suero.
Tabla 1 : Nivel de duplicación de población (pdl) de células MDCK, CHO- K1 , Vero y CEP Los estudios de crecimiento fueron realizados durante 6 días a 37°C y el nivel de duplicación de población (pdl) fue calculado al estimar el tiempo necesario para una generación. Se calculó a partir de la proporción T/N, en donde T es la duración del cultivo celular y N es el número de generaciones celulares calculadas a partir de la siguiente ecuación Cf=Ci x 2N, en donde Co u Cf son las concentraciones celulares iniciales y finales, respectivamente. Los valores representan el promedio y desviación estándar (S.D.) de tres experimentos independientes. 2.2. Receptor de influenza Durante la infección, los virus de aves así como las variantes de virus humanas adaptadas a huevo se unen principalmente a enlace Sia2-3Gal, mientras que los aislados clínicos aislados directamente de humano se unen preferencialmente al enlace Sia2-6Gal (Suzuki et al, 2011 , Adv Exp Med Biol, 705:443-452).
Para detectar los dos tipos de receptores de virus de influenza sobre la superficie de diferentes tipos celulares, la lectina MAA (específica para el enlace Sia2-3Gal) y la lectina SNA (específica para enlace Sia2-6Gal) fueron usadas. Las células fueron incubadas durante 1 h a temperatura ambiente con lectinas etiquetadas con digoxigenina aglutinina de Sambucus nigra (SNA) (específica para Sia2-6Gal) o aglutinina de Maackia amurensis (MAA) (específica para Sia2-3Gal). Las células fueron incubadas entonces con fragmento Fab anti-digoxigenina-fluoresceína y se analizaron por intensidad de florescencia usando el sistema de citometría capilar de Guava. Los valores exhibidos en la tabla 2 representan el promedio y desviación estándar (S.D.) de tres experimentos independientes.
MAA y SNA se unen fuertemente a la superficie de celulas Vero y MDCK (más de 80% de células) significando que los dos receptores (Sia2-3-Gal y Sia2-6Gal) fueron expresados en células MDCK y Vero (Tabla 2). Más aún, MAA unido a 73% de células CEP mientras que SNA solo unido a 23% de células CEP indicando que un alto número de células CEP expresó receptor Sia2-3-gal, pero un bajo número expresó Sia2-6Gal. El origen aviar de células CEP podría explicar por qué expresaron mucho más receptores aviares que receptores humanos. Las células CHO-K1 no expresan receptor Sia2-Gal, y solo débilmente Sia2-3Gal.
Tabla 2: Receptores de virus de influenza en células MDCK, CHO-K1 , Vero y CEP se analizaron usando un kit de diferenciación de glicano de digoxigenina. 2.3. Producción de virus Los fluidos alantoicos de virus de influenza fueron puestos en contacto directamente con la línea celular para ser probados sin la adaptación anterior. Dos virus reagrupados de influenza A (A/New/Caledonia/20/99 (H1 N1 ) IVR1 16, y A/Vietnam/1 194/04 (H5N1 ) rg14) y un virus de influenza B (B/Brisbane/60608 linaje B/Victoria/2/87 fueron probados. Se usaron varias concentraciones de MOI (10 \ 10 2 y 10 3) y tripsina porcina (0, 1 , 2, 5 y 8 mg/ml). Los resultados obtenidos con MOI de 10 1 y la concentración de tripsina más apropiada después de 3 días de infección para virus de influenza tipo A y después de 4 días de infección para virus de influenza tipo B son desplegados para cada tipo celular (ver Tablas 3 y 4).
Tabla 3: Infecciones de células MDCK, CHO-K1 , Vero y CEP con virus de influenza A *: expresado como log10 TCID50/ml Tabla 4: Infecciones de células MDCK, CHO-K1 y Vero con virus de influenza B Reagrupados A/New Caledonia/20/99 (H1 N1 ) IVR116 y A/Vietnam/1194/04 (H5N1 ) rg14 crecieron en los cuatro tipos celulares probados sin la necesidad de adaptación previa. Más aún, la mejor producción de virus reagrupados A/New Caledonia/20/99 (H1 N1 ) IVR116 fue observada en células CHO-K1 que produjeron los títulos virales más altos (>107 TCID50). La producción de virus reagrupado A/Vietnam/1194/04 (H5N1 ) rg14 fue estrechamente igual en todos los tipos celulares (aproximadamente 103 TCID50/ml).
Con respecto al a producción de virus infecciosos tipo B, como se muestra en la Tabla 4, el virus B/Brisbane/60/08 replicó bien en las tres lineas celulares sin la necesidad de adaptación previa. 2.4. Producción de virus a través del rescate de virus de influenza infecciosos mediante métodos de genética inversa 2.4.1. Capacidad de las líneas celulares a ser transfectadas También es importante probar la capacidad de los diferentes tipos celulares para producir virus después de la transfección por un conjunto de vectores de expresión capaces de generar virus de influenza infecciosos. En un primer paso, es importante probar la capacidad de estos tipos celulares diferentes a ser transfectados, y en particular a ser transfectados con material que no involucra el uso de materia prima de origen animal. La teenología de nucleoporación provista por Amaxa (Amaxa, Lonza tecnoloenfoca el núcleo se usó para la transfección de las células. Se usó un plásmido de proteína fluorescente verde (GFP) para valorar la capacidad de las diferentes líneas celulares a ser transfectadas. Las células fueron resuspendidas en solución V, incubadas con plásmido pGFP y nucleoporadas con el nucleofector. Diferentes programas (U-023, A-024, V-001 , T-030, L-005) fueron probados. Las células fueron incubadas entonces durante un día a 37°C y el porcentaje de células fluorescentes verdes fue analizado por citometría de Guava. El porcentaje promedio de células que expresan GFP y la desviación estándar se calcularon a partir de 3. Experimentos independientes con el programa de transfección óptimo son mostrados en la Tabla 5.
Tabla 5: Susceptibilidad de células MDCK, CH0-K1 , Vero y CEP a nucleoporación Más de 0% de las células expresaron GPF, lo cual significa que todas las líneas celulares probadas son transfectables mediante nucleoporación. 2.4.2. Optimización del paso de clonación de cDNA de influenza Para ser eficiente, la vacuna de gripe, la cual usualmente contiene el material antigénico derivado de dos virus tipo A y un virus tipo B, debe ser actualizado cada año dependiendo de los nuevos virus en circulación que aparezcan y sean responsables de gripe estacional o gripe pandémica. De manera importante, el material antigénico de HA y NA debe ser actualizado de manera que corresponda a aquél del nuevo virus circulante. Para realizar genética inversa, los genes que codifican HA y NA deben ser clonados en el plásmido de expresión de vRNA bajo el control de un promotor POL I cada año o cuando un nuevo virus circulante ha sido caracterizado. Los otros plásmidos de vRNA que codifican vRNA A/PR/8/34 interno y los plásmidos de expresión de proteína son usualmente construidos solo na vez. Como el paso de clonación en el plásmido de expresión de vRNA podría ser muy complicado cuando se hace genetica inversa sobre genes HA y NA desconocidos, se desarrolló un plásmido de genética inversa universal que podría usarse para la clonación mediante recombinación de segmentos de influenza de virus tipo A y B. Pero el requerimiento estricto para iniciación y terminación preciso de las transcripciones de vRNA limita dramáticamente la elección de regiones de recombinación. Así, se usó un nuevo casete de recombinación, no específico para el genoma de influenza, comprendiendo los últimos 17 nucleótidos del promotor POL 1 y los primeros 17 nucleótidos de la ribozima delta de hepatitis. Adicionalmente, 28 nucleótidos, comprendiendo Bbsl para linealizar el plásmido circular, los sitios Notl y Sbfl para excluir plásmido vacío fueron incorporados entre el promotor POL 1 y la ribozima delta de hepatitis. El plásmido resultante, llamado “pSP-flu universal” es relativamente pequeño (2202pb) y contenía un gene de resistencia a kanamicina (Figura 2). Para preparar cDNA de influenza para clonación, se transcribieron a la inversa vRNAs en cDNAs conteniendo extremos de recombinación y se clonaron entre el promotor POL 1 y la ribozima. Usando este plásmido de producción de RNA mejorado, varios genes de virus de influenza A y B fueron clonados mediante recombinación homologa. La proporción de clones positivos fue mayor que 90% para clonación “fácil” y 30% para clonación “difícil” con un promedio de 150 clones por experimento de clonación.
El plásmido pSP-flu universal así desarrollado presenta varias mejoradas para clonación de genoma de influenza fácil y rápida. El casete recombinante puede ser usado para clonar cada fragmento de RNA de influenza de virus tipo A y B. En segundo lugar, como es difícil asegurar que los vectores linealizados estuvieron libres de plásmidos vacíos que generan colonias de soporte, el plásmido pSP-flu universal contiene tres sitios enzimáticos ( Bbsl , Sbfl y Notl) que pueden usarse para remover cualquier plásmido vacío residual después del paso de clonación. La linealización con enzima Bbsl, conteniendo un punto de corte fuera del sitio de reconocimiento, generó extremos cohesivos y permitió la recircularización de plásmido. 2.4.3. Rescate de virus de influenza Las líneas de células CHO-K1 y Vero con base en sus buenas propiedades de crecimiento fueron probadas para rescatar el virus de influenza infeccioso por genética inversa.
La tripsina porcina generalmente usada para rescatar virus de infuenza mediante genética inversa, fue reemplazada por una enzima libre de origen animal y altamente purificada (TrypLE TM Select) de Gibco. En un primer experimento, el rescate de virus reagrupados conteniendo vRNA de HA y NA de virus A/WSN/33 (H1 N1 ) y los seis genes virales restantes (PB1 , PB2, PA, NP, M y NS) de virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) se realizó mediante nucleoporación de los doce plásmidos (4 plásmidos permitiendo la expresión de mRNA de PB1 , PB2, NA y NP bajo el control de promotor de POL II humano y 8 plásmidos que permiten la expresión de los 8 vRNAs bajo el control de promotor POL I humano) en Vero y/o CHO-K1. No se obtuvieron partículas virales después de la transfección de células Vero o CHO-K1 solas pero, cando las células Vero fueron mezcladas con células CHO-K1 , los virus fueron detectados mediante ensayo de hemaglutinación en los sobrenadantes de la mezcla celular tan pronto como 2 días después de la transfección.
Adicionalmente, fue fácil visualizar signos de una infección en la mezcla de Vero/CHO-K1 nucleoporada. En realidad, después de un cultivo de cuatro días, las células transfectadas sin plásmidos fueron individualizadas claramente mientras que las células transfectadas con los doce plásmidos y derramando partículas virales en el sobrenadante fueron agregadas. Varios virus reagrupados de virus de influenza fueron rescatados muy rápidamente usando esta téenica conteniendo el esqueleto interno (PB1 , PB2, PA, NP, M y NS) del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) y expresando las proteínas HA y NA de diferentes virus de influenza, tal como A/WSN/33 (H1 N1 ), A/PR/8/34 (H1 N1 ), A/NC/20/99 (H1 N1 ) IVR116, A/Solomon lsland/03/06 (H1 N1 ) IVR145, A/Vietnam/1194/04 (H5N1 ) rg14, A/Brisbane/10/07 IVR-147 (H3N2), A/Uruguay/716/07 (H3N2) X175C y A/Wisconsin/67/05 (H3N2) X161 b.
Los resultados obtenidos fueron altamente reproducibles de un experimento a otro y la mayoría de los títulos óptimos de tiempo fueron obtenidos cinco días después de la transfección. Por ejemplo, un virus reagrupado conteniendo HA y NA de A/Vietnam/1 194/04 (H5N1 ) rg14 fue producido en el sobrenadante de cultivo celular con un título tan alto como 128 HAU/50 m? después de transfección de una mezcla de Vero/CHOK1 usando tres programas de nucleoporación diferentes (U-023, U-027, F-014). Otros virus reagrupados conteniendo HA y NA de los virus a/H1 N1 o a/H3N2 citados antes alcanzaron títulos similares (hasta 256-512 HAU/50 mI) cinco días despues de la transfección. Los títulos TCID50 correspondientes variaron entre 4 y 7 Iog10 TCID50/ml.
Un sistema de genética inversa mejorado es descrito en este estudio usando dos líneas celulares, a saber Vero y CHO-K1 que son adecuadas para ser usadas para producción de vacuna humana. Como se muestra mediante el estudio de infección viral, varios virus A/H1 N1 y A/H5N1 o virus reagrupados fueron recuperados fácilmente usando la mezcla de células Vero/CHO-K1. En la misma manera que los virus A/H3N2 también fueron rescatados demostrando que este sistema puede ser usado para la producción de reagrupamiento de cualquier virus pandémico y estacional. Los virus pueden ser recuperados directamente del sobrenadante Vero/CHO-K1 y titulado por ensayo HAU tan pronto como dos días después de la transfección. Cuando el virus deberá ser producido a una escala industrial, por ejemplo en el marco de una producción de vacuna humana o veterinaria, el sobrenadante puede ser usado como una semilla para infectar adicionalmente un stock de células CHO-K1 .
Adicionalmente como se mostró en los ejemplos, la generación de virus de influenza infecciosos mediante genética inversa usando una mezcla de Vero y CHO-K1 o la producción de virus mediante infección directa de células CHO-K1 con una semilla viral infecciosa no requieren el uso de suero y/o material biológico de origen animal. Los virus de influenza infecciosos así producidos son, por lo tanto más seguros debido a la posible contaminación mediante agentes adventicios como virus, micoplasma y priones ya no exista. Adicionalmente, la falta de suero en los medios usados durante la transfección y/o pasos de infección facilita el proceso de purificación y hace más fácil fabricar la vacuna de gripe. Para nuestro conocimiento es la primera vez que se describe un proceso totalmente libre de animales para rescatar virus de influenza por genética inversa. 3. Producción de virus de influenza quiméricos mediante genética inversa 3.1. Construcción de genes quiméricos de HA y NA Las construcciones quiméricas fueron montadas primero en sílice usando el programa Vector NTI. El gene quimérico de HA A/California/07/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ) contiene las regiones no de codificación (NCR), el péptido de señal (SP), el dominio HA2, el dominio transmembrana ™ y el dominio Cyto del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) y el dominio HA1 del virus A/California/07/09 (H1 N1 ).
El gene quimérico de NA A/California/07/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ) contiene las regiones no de codificación (NCR), el dominio transmembrana ™, el dominio Cyto y el tallo del virus A/PR/8/34 (GH1 N1 ) y el ectodominio del virus A/California/07/09 (H1 N1 ).
Una vez que estas secuencias han sido determinadas, los genes HA y HA quimérico correspondientes fueron sintetizados y clonados en el plásmido pSP-flu universal. 3.2. Producción del virus de influenza quimerico mediante genética inversa Producción de los virus de influenza quiméricos mediante genética inversa fue realizada como se describió antes en al presente, es decir, al usar cuatro plásmidos para expresión de las proteínas virales PB1 , PB2, PA y NA, y ocho plásmidos para expresión de los vRNAs PB1 , PB2, PA, NP, NS, M, HA quimérico y NA quimérico fueron introducidos en la mezcla de células CHO-K1/Vero mediante nucleoporación como se mencionó antes. Los virus producidos son “bi-quiméricos” debido a que contienen dos genes quiméricos. Contienen los genes PB2, PA, NP, NS y M del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ), el gene PB1 del virus A/Californía/07/09 (H1 N1 ), el gene quimérico HA A/California/07/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ) y el gene quimérico NA A/California/707/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ). El virus A/NC/20/99 (H1 N1) fue usado como control positivo para cada uno experimento de genética inversa.
En un primer experimento, la concentración de tripsina a ser usada fue determinada. Entre las concentraciones de tripsina probadas (1 a 6 USP/ml), solo las concentraciones de tripsina de 3 y 4 USP/ml permiten la producción de virus de influenza quiméricos (Tabla 6). En los experimentos subsecuentes, se mostró que una concentración de 4 USP/ml es ligeramente mejor que 3 USP/ml debido a que el título de hemaglutinina fue ligeramente mayor (64 HAU/50 mI comparado con 32 HAU/50 m I ) .
Tabla 6: Determinación de la concentración de tripsina necesaria para obtener el virus de influenza quimérico A/California/07/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ) mediante genética inversa La producción de reagrupado quimérico A/California/07/09- A/PR/8/34 (H1 N1 ) fue reproducible. El virus quimérico fue detectable en el sobrenadante de cultivo celular a partir de la post-nucleoperación de qumto día y producida de maenra óptima en el octavo o noveno día post- nucleoporación.
Virus “mono-quiméricos” conteniendo ya sea un gene HA quimérico o un gene NA quimérico también fueron producidos exitosamente mediante genética inversa usando el gene A/California/07/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ) de HA quimérico y el gene NA del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) o el gene A/California/07/09-A/PR/8/34 (H1 N1 ) de NA quimerico y el gene HA del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ). 3.3. Valoración de la antigenicidad de proteína HA producida mediante el virus quimérico Para verificar que el uso de un gene quimérico de HA no alteró la antigenicidad de la proteína HA expresada por el virus quimérico, comparamos los títulos obtenidos en el ensayo de hemaglutinación de inhibición como se describió en 1.10 usando un virus probado ya sea el virus reagrupado A/California/07/09 (H1 N1 ) o el virus “bi-quimérico” como es obtenido en 3.2. Mientras mayores sean los títulos en el ensayo de hemaglutinación de inhibición, más fuerte será el reconocimiento del antígeno de HA por el anticuerpo. Los títulos 1HA obtenidos con los dos virus probados fueron mayores que 10240, lo cual significa que la antigenicidad de la proteína HA expresada por el virus bi-quimérico está bien conservada y muy similar o idéntica a aquélla de reagrupado A/California/07/09 (H1 N1 ). 4. Comparación de la producción de virus de influenza reagrupado en dos mezclas de células: células Vero/CEF y células Vero/CHO-K1 Un millón de células Vero fueron suspendidas en solución V (Lonza) a temperatura ambiente. Una mezcla de 1 mg de cada uno de los 6 plásmidos de expresión de vRNA que expresan el vRNA de PB1 , PB2, PA, NP, M y NS del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ), 1 pg de cada uno de los 2 plásmidos de expresión de vRNA expresando el vRNA de NA y HA del virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1 , y 0.5 pg de cada uno de los 4 plásmidos de expresión de proteína expresando el mRNA de PB1 , PB2, PA, NP del virus A/PR/8/34 (H1 N1) fue adicionado a las células y la nucleofección se realizó con el nucleofector (Lonza) usando el programa V-001. Las células fueron incubadas en placas de 6 cavidades en 1.5 mi de medio DMEM-F12® (Gibco®). Después de 2 h de incubación a 3°C, 5% CO2, un millón de células CEF (fibroblastos de embriones de pollo) fue adicionado en el mismo medio complementado con tripsina porcina (Sigma) y se incubaron en una plataforma rotatoria a 35°C, 8% de C02. A intervalos regulares, se recolectaron 100 ml de cultivo de sobrenadante con el fin de evaluar el título viral con un ensayo de hemaglutinación. Los resultados del ensayo de hemaglutinación son presentados en la Tabla 7 a continuación.
Quinientos mil células Vero y quinientos mil CHO-K1 fueron mezcladas y fueron resuspendidas en solución V (Lonza) a temperatura ambiente. Una mezcla de 1 mg de cada uno de los 6 plásmidos de expresión de vRNA expresando el vRNA de PB1 , PB2, PA, NP, M y NS del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ), 1 pg de cada uno de los 2 plásmidos de expresión de vRNA que expresan el vRNA de NA y HA del virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1 ), y 0.5 pg de cada uno de los 4 plásmidos de expresión de proteína expresando el mRNA de PB1 , PB2, PA, NP del virus A/PR/8/34 (H1 N1 ) fue adicionado a las células y nucleofección se realizó con el nucleofector (Loonza) usando el programa U-023. Las células fueron incubadas en placas de 6 cavidades en medio Ex -cellMRCD CHO fusión (SIGMA-ALDRICH) complementado con 4 mM L-glutamina (Gibco®). Después de 3 h de incubación a 37°C, 5% C02 (estando entonces la concentración final de tripsina a 2 mg/ml). A intervalos regulares, 100 ml de cultivo de sobrenadante fueron recolectados con el fin de evaluar el título viral con un ensayo de hemaglutinación. Los resultados del ensayo de hemaglutinación son presentados en la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7: Título viral del sobrenadante de cultivo (UHA/50 mI) D: Días después de transfección. NT: No probado.
Los resultados muestran que el sistema de células Vero/CHO-K1 permite la producción de virus de influenza reagrupado solo cuatro días después de la transfección, mientras que necesita al menos 7 días para producir la misma cantidad de virus de influenza reagrupado usando el sistema Vero/Cef. El sistema de células Vero/CHO-K1 también produce una alta cantidad de virus reagrupado (512 UHA/50 mI). Así, los resultados demuestran que el sistema Vero/CHO-K1 es más eficiente que el sistema de células Vero/CEF para producir virus de influenza reagrupado.

Claims (25)

dq REIVINDICACIONES
1. Un método para producir virus de influenza infecciosos, en donde dicho método comprende los pasos que consisten de: a) transfectar células con un conjunto de vectores de expresión para generar una semilla de virus infecciosos de influenza, b) infectar células CHO con dicha semilla de virus de influenza infeccioso.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde las células en el paso a) son células de origen de primate, na mezcla de células de origen de primate y células CHO o consisten de células CHO.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las células de origen de primate son células Vero.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas células CHO son células CHO-K1.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho conjunto de vectores de expresión comprende: - expresar vectores permitiendo la expresión de mRNAs que codifican al menos proteínas PB1 , PB2, PA y NP de influenza, y - vectores de expresión que permiten la expresión de al menos vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de infuenza, o los cRNAs correspondientes, entendiéndose que la expresión de dicho conjunto de vectores de expresión permite (i) la formación del complejo de ribonucleoproteína (RNP) conteniendo el o los vRNAs de influenza, y (ii) la generación de virus de influenza infeccioso en dichas células transfectadas.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde: (i) dichos vectores de expresión que permiten la expresión de mRNAs que codifican proteínas PB1 , PB2, PA y NP de influenza comprenden cuatro diferentes plásmidos unidireccionales, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a un mRNA que codifica una de las cuatro proteínas distintas seleccionadas de proteínas de influenza PB1 , PB2, PA y NP bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa II, y (ii) dichos vectores de expresión que permiten la expresión de vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, comprenden ocho diferentes plásmidos unidireccionales, conteniendo cada plásmido un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAs distintos de dichos vRNAs de influenza PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA, o a los cRNAs correspondientes, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde cada uno de dichos plásmidos conteniendo un cDNA complementario a uno de dichos vRNAs de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA de influenza, o los cRNAs correspondientes, bajo el control de un promotor que se une a RNA polimerasa I ha sido obtenido al clonar dicha secuencia de cDNA en un vector comprendiendo, en el sentido de 5’ a 3’: a) un promotor que se une a RNA polimerasa I, o una T7 RNA polimerasa; b) un casete de recombinación que comprende, en el sentido 5’ a 3’: - una secuencia de reconocimiento complementaria invertida para una primera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento y produce extremos pegajosos; - un sitio de restricción para una segunda enzima de restricción, el cual tiene su sitio de corte dentro de su secuencia de reconocimiento; - un sitio de restricción para una tercera enzima de restricción, que tiene su sitio de corte dentro de su secuencia de reconocimiento; y - una secuencia de reconocimiento para dicha primera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento y produce extremos pegajosos; en donde dicha segunda y tercera enzimas de restricción son diferentes; y c) una secuencia de terminador; se entiende que: cuando el promotor se une a RNA polimerasa I, dicha secuencia de terminador es secuencia de ribozima delta de hepatitis; y cuando el promotor se une a T7 RNA polimerasa, dicha secuencia de terminador es secuencia de terminador de T7 polimerasa.
8. El metodo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho vector comprende la secuencia SEQ ID NO:1.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho conjunto de vectores de expresión comprende ocho diferentes plásmidos bidireccionales, cada plásmido conteniendo un cDNA complementario a uno de los ocho vRNAs distintos seleccionados de dichos vRNAs de influenza de PB1 , PB2, PA, NP, M, NS, HA y NA bajo el control de dos promotores, en donde dicho primer promotor se une a polimerasa I y dicho segundo promotor se une a polimerasa II, entendiendose que la expresión de dicho conjunto de vectores de expresión permite (i) la formación del complejo de ribonucleoproteína (RNP) conteniendo el o los vRNAs de influenza y (ii) la generación de virus de influenza infecciosos en dichas células transfectadas.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los virus de influenza infecciosos producidos son virus de influenza tipo A o tipo B.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dichos virus de influenza infecciosos producidos son virus de influenza infecciosos reagrupados, el material genético del cual resulta de la combinación del material genético de al menos dos virus donadores.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde uno de los virus donadores es A/Puerto Rico/8/34 (H1 N1 ) (A/PR/8/34), B/Lee/40 o B/Panama/45/90.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde los virus de influenza infecciosos producidos son virus quiméricos.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho virus quimérico contiene vRNAs de HA y/o NA de influenza quiméricos.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el vRNA de HA de influenza y/o vRNAs de NA comprenden uno o más dominios de un vRNA de HA o uno o más dominios de un vRNA de NA de un virus estacional o pandémico y uno o más dominios de un vRNA de HA o uno más dominios de un vRNA de NA de otro virus donador, en donde al menos un dominio del vRNA de HA de dicho virus de influenza estacional o pandémico es complementario a la región de un mRNA que codifican el ectodominio antigénico de HA, tales como HA1 y/o HA2 de dicho virus de influenza estacional o pandémico, y al menos un dominio del vRNA de NA de dicho virus de influenza estacional o pandémico es complementario a la región de un mRNA que codifica el ectodominio antigénico de NA de dicho virus de influenza estacional o pandémico.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho método es realizado completamente en un medio libre de suero o en condiciones libres de componente animal.
17. Un método para preparar una composición de vacuna de influenza, dicho método comprende: a) producir virus de influenza mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; b) recolectar los virus de influenza infecciosos después de la multiplicación en células CHO, c) purificar el virus de influenza infeccioso recolectado, d) opcionalmente inactivar el virus purificado, y e) mezclar el virus purificado con un portador farmacéuticamente aceptable.
18. Una célula CHO, la cual comprende un conjunto de vectores de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.
19. La célula CHO de acuerdo con la reivindicación 18, la cual es una célula CHO-K1.
20. Un vector que comprende, en el sentido 5’ a 3’: - un promotor que se une a RNA polimerasa I, o a T7 RNA polimerasa; - un casete de recombinación que comprende, en el sentido 5’ a 3’: - una secuencia de reconocimiento complementaria invertida para una primera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento y produce extremos pegajosos; - un sitio de restricción para una segunda enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte dentro de su secuencia de reconocimiento; - un sitio de restricción para una tercera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte dentro de su secuencia de reconocimiento; y - una secuencia de reconocimiento para dicha primera enzima de restricción, la cual tiene su sitio de corte fuera de su secuencia de reconocimiento y produce extremos pegajosos; en donde dichas segunda y tercera enzimas de restricción son diferentes; y - una secuencia de terminador; entendiéndose que; cuando el promotor se une a RNA polimerasa I, dicha secuencia de terminador es secuencia de ribozima delta de hepatitis, cuando el promotor se une a T7 RNA polimerasa, dicha secuencia de terminado es secuencia de terminador de T7 polimerasa.
21. El vector de acuerdo con la reivindicación 20, en donde dicho promotor se une a RNA polimerasa I de roedor o a RNA polimerasa I humana.
22. El vector de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 , en donde dicha primera enzima de restricción del casete de recombinación es Bbsl o Sapl, y dicha segunda y tercera enzimas de restricción del casete de recombinación son seleccionados del grupo que consiste de Notl y Sbfl.
23. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde dicho casete de recombinación consiste de la secuencia SEQ ID NO:2.
24. El vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde dicho vector comprende la secuencia SEQ ID NO:1.
25. Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 para uso en un método para producir virus RNA reagrupados mediante genética inversa.
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