JP2015530875A - 感染性インフルエンザウイルスの産生 - Google Patents
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Abstract
Description
「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞中に存在するRNAポリメラーゼに結合し、下流(3’方向)コード配列の転写を開始することのできるDNA調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は、その3’末端において、転写開始部位を境界とし、上記バックグラウンドで検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように、上流(5’方向)に伸長する。プロモーター内配列には、転写開始部位(たとえば、ヌクレアーゼS1を用いたマッピングによって好都合に定義される)、ならびにRNAポリメラーゼへの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が見出される。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む、他の発現制御配列と動作的に関連付けられる場合もある。たとえば、ヒトRNAポリメラーゼIプロモーター(ヒトRNA POLIプロモーター)は、ヒトRNAポリメラーゼIに結合するプロモーターであり、鳥RNAポリメラーゼIプロモーターは、鳥RNAポリメラーゼIに結合するプロモーターであり、またはT7ポリメラーゼプロモーターは、バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼに結合するプロモーターである。
(i)16プラスミド法、たとえば、ポリアミン誘導体(Trans IT−LT1)を使用して、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびRNAポリメラーゼIターミネーターの制御下にある、1つのインフルエンザvRNAに相補的なcDNAをそれぞれが含有している8つのプラスミドと、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下にある、PA、PB1、PB2、NP、HA、NA、M、およびNS mRNAの1つに相補的なcDNAをそれぞれが含有している8つのプラスミドとを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Neumanら、1999、Proc Natl Acad Sci USA、96(16):9345〜9350、およびUS2009/0246830またはUS2011/0143424に記載の方法。詳細には、細胞は、ヒト腎臓胚性接着細胞(293T細胞系)である;
(ii)12プラスミド法、たとえば、第1の細胞型に、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびRNAポリメラーゼIターミネーター(肝炎デルタリボザイム)の制御下にある、1つのインフルエンザvRNAに相補的なcDNAをそれぞれが含有している8つのプラスミドと、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下にある、NP、PA、PB1、およびPB2 mRNAの1つに相補的なcDNAをそれぞれが含有している4つのプラスミドとを遺伝子導入し、第2の細胞型においてウイルスをさらに増幅することによってインフルエンザウイルスを産生する、Fodorら、1999、J Virol、73(11):9679〜9682、およびUS2004/0142003、US2012/0058538に記載の方法。詳細には、前記第1の細胞型は、Vero細胞であり、前記第2の細胞型は、MDBKである;
(iii)13プラスミド法、たとえば、T7 RNAポリメラーゼプロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼターミネーターの制御下にある、1つのインフルエンザvRNAに相補的なcDNAをそれぞれが含有している8つのプラスミドと、RNAポリメラーゼIIの制御下にある、NP、PA、PB1、およびPB2 mRNAsの1つに相補的なcDNAをそれぞれが含有している4つのプラスミドと、RNAポリメラーゼIIの制御下にある、T7 RNAポリメラーゼおよび核局在化シグナルをコードしているmRNAに相補的なcDNAを含有している1つのプラスミドとを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、De Witら、2007、Journal of General Virology、88:1281〜1287に記載の方法。詳細には、遺伝子導入細胞は、Vero、293T、またはQT6(ウズラからの線維肉腫細胞系)細胞である。
(iv)8プラスミド法、たとえば、各プラスミドによって、mRNAおよびvRNAの両方が発現し得る、Hoffmannら、2000、PNAS、97(11):6108〜6113およびWO01/83794に記載の方法。すなわち、各プラスミドは、1つのインフルエンザvRNAに相補的なcDNA、および前述の場合のような1つに代えて、2つの転写カセットを含有している。8つのインフルエンザウイルスvRNAのそれぞれに相補的なcDNAが、ポリメラーゼIターミネーターとポリメラーゼIプロモーターの間に挿入されている。このポリメラーゼI転写単位には、ポリメラーゼIIプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが隣接している。第1の転写カセットによって、cDNAのvRNAの形での転写が可能になる。第2の転写カセットによって、cDNAのmRNAの形での転写が可能になり、次いでmRNAは、細胞機構を使用してウイルスタンパク質に翻訳される。PolI−PolII系とも呼ばれる、この二重カセット系が転写に活用されて、同じプラスミドのcDNAが、vRNAの形とmRNAの形の両方で転写される。cDNAは、遺伝子導入細胞のレベルで、vRNAおよび1つまたはそれ以上のウイルスタンパク質の発現によって顕在化する。詳細には、接着性MDCK細胞および293T細胞の共培養、ならびに遺伝子導入剤として、ポリアミン誘導体(Trans IT−LT1)を使用する。
(v)3プラスミド法、たとえば、それぞれRNAポリメラーゼIプロモーターおよびポリメラーゼIターミネーターの制御下にある、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、およびNS vRNAに相補的な8つのcDNAを含有している1つのプラスミドと、第1のものがPB2、PB1、およびPA mRNAのいずれか1つに相補的な3つのcDNAを含有しており、第2のものがNP mRNAに相補的なcDNAを含有している、RNAポリメラーゼIIプロモーターの制御下にある2つのプラスミドとを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Neumannら、2005、PNAS、102(46):16825〜16829に記載の方法。詳細には、遺伝子導入細胞は、293TまたはVeroである。
(vi)1プラスミド法、たとえば、ネズミポリメラーゼIターミネーターおよびニワトリRNAポリメラーゼIプロモーターの制御下にある、PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、およびNS vRNAに相補的な8つのcDNAを含有しており、PB2、PB1、PA、およびNP cDNAの間にポリメラーゼIIプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを有する、1つのプラスミドを細胞に遺伝子導入することによってインフルエンザウイルスを産生する、Zhangら、J.Virol.、83(18):9296〜9303に記載の方法。詳細には、遺伝子導入細胞は、CEF細胞である。
(vii)異なる2種の細胞系を使用するWO2005/062820に記載の方法:第1の工程において、PolI−PolII系(PoI/PoII)を有する8つの双方向性プラスミドを細胞に遺伝子導入し、次いで第2の工程において、インフルエンザウイルスの産生を増幅するために、遺伝子導入細胞を、インフルエンザウイルスに対して非常に許容性である別の細胞系からの細胞と共に培養する。詳細には、第1の工程における前記遺伝子導入細胞は、Vero細胞であり、第2の工程における前記他の細胞系は、ニワトリ胚細胞由来の系統であるCEKまたはCEF細胞系である。
本発明の意図は、マイナス一本鎖RNAウイルスのvRNAに相補的なcDNAを発現ベクターにクローン化するのに使用することのできる新規の組換えカセットを提供することである。すなわち、前記組換えカセットは、A型およびB型インフルエンザウイルスのvRNAに相補的なcDNAをクローン化するのに特に有用である。
− 認識配列の外側に切断部位(cutting site)を有し、粘着末端を生じる、第1の制限酵素の逆方向相補的認識配列(inverted complementary recognition sequence);
− 認識配列の内側に切断部位を有する第2の制限酵素の制限部位;
− 認識配列の内側に切断部位を有する第3の制限酵素の制限部位;および
− 認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、前記第1の制限酵素の認識配列
を含み、またはこれらからなり、
前記第2と第3の制限酵素は異なる、組換えカセットに関する。
− RNAポリメラーゼIまたはT7 RNAポリメラーゼに結合するプロモーター、
− 本発明による組換えカセット、
− ターミネーター配列
を含み、
− プロモーターがRNAポリメラーゼIに結合するとき、前記ターミネーター配列は、肝炎デルタリボザイム配列であり、
− プロモーターがT7 RNAポリメラーゼに結合するとき、前記ターミネーター配列は、T7ポリメラーゼターミネーター配列である
と理解される、ベクターに関する。
− ヒトRNAポリメラーゼIに結合するプロモーター、
− 配列番号:2の配列の組換えカセット、
− 配列番号:3の配列の肝炎デルタリボザイム配列
を含む。
− げっ歯類RNAポリメラーゼIに結合するプロモーター、
− 配列番号:2の配列の組換えカセット、
− 配列番号:3の配列の肝炎デルタリボザイム配列
を含む。
− 配列番号:9の配列のT7ポリメラーゼに結合するプロモーター、
− 配列番号:2の配列の組換えカセット、
− 配列番号:4の配列のT7ポリメラーゼターミネーター
を含む。
本発明の文脈において、クローン化戦略には、本発明によるベクターと、クローン化されるcDNA配列間での相同組換えが必要となる。
(i)本発明によるベクターのプロモーター配列からのヌクレオチドを含有している順方向プライマー、および本発明によるベクターのターミネーターからのヌクレオチドを含有している逆方向プライマーを使用しての、ウイルスのウイルスRNAのRT−PCR(逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応)によって、RNAウイルスのvRNAに相補的なcDNAを産生する工程、
(ii)組換えカセットの第1の制限酵素を使用して、本発明によるベクターを直線化する工程、
(iii)工程(i)で得たcDNAと、工程(ii)で得た直線化されたベクターとを、前記cDNAと前記ベクター間の相同組換えが可能になる条件で接触させる工程
を含む方法をさらに提供する。
高い収量のインフルエンザ産生を維持するために、細胞は、その表面上にSia2−6GalまたはSia2−3Gal受容体を発現させなければならない。CHO−K1細胞は、Sia2−6Gal受容体を発現させず、Sia2−3Gal受容体を不十分にしか発現させないが(細胞の30%で発現される)、意外にも、分子生物学によって、特に、適当な一式の発現ベクターによって逆遺伝学法により生成されたインフルエンザウイルスの産生には、CHO細胞系のサブクローンであるCHO−K1細胞系が、非常に効率のよい細胞系であることが見出された。
a)細胞に一式の発現ベクターを遺伝子導入して、感染性インフルエンザウイルスのシードを生成する工程、
b)CHO細胞を感染性インフルエンザウイルスの前記シードで感染させる工程
を含む、またはこれらからなる、感染性インフルエンザウイルスの産生方法(「逆遺伝学法」)である。
− 遺伝子導入溶液番号1:4〜6mM KCl、10〜20mM MgCl2、120〜160mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2);
− 遺伝子導入溶液番号2:4〜6mM KCl、10〜20mM MgCl2、5〜25mM HEPES、120〜160mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2);
− 遺伝子導入溶液番号3:4〜6mM KCl、10〜20mM MgCl2、50〜160mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)、および5〜100mMのラクトビオン酸ナトリウムまたは5〜100mMのマンニトールまたは5〜100mM
のコハク酸ナトリウムまたは5〜100mMの塩化ナトリウム;
− 遺伝子導入溶液番号4:4〜6mM KCl、10〜20mM MgCl2、5〜25mM HEPES、50〜160mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)、および5〜100mMのラクトビオン酸ナトリウムまたは5〜100mMのマンニトールまたは5〜100mMのコハク酸ナトリウムまたは5〜100mMの塩化ナトリウム;
− 遺伝子導入溶液番号5:4〜6mM KCl、10〜20mM MgCl2、80〜100mM NaCl、8〜12mMのグルコース、0.3〜0.5mM Ca(NO3)2、20〜25mM HEPES、および50〜100mM tris/HClまたは30〜50mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2);
− 遺伝子導入溶液番号6:0.1〜3.0mM MgCl2、50〜200mM K2HPO4/KH2PO4(pH6.5)、および/または1〜50mMのマンニトールおよび/または1〜50mMのコハク酸ナトリウム;ならびに
− 遺伝子導入溶液番号7:0.42mM Ca(NO3)2;5.36mM KCl;0.41mM MgSO4;103mM NaCl;23.8mM NaHCO3;5.64mM Na2HPO4;11.1mMのd(+)−グルコース;3.25μMのグルタチオン;20mM HEPES;pH7.3;
− リン酸緩衝食塩水(PBS)。
− インフルエンザPB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNAの中から選択される8つのvRNAの1つまたはそれ以上、または対応するcRNAに相補的な1つまたはそれ以上のcDNAを含有しており、各cDNAは、
− RNAポリメラーゼIIに結合し、その結果、対応するインフルエンザタンパク質の発現を可能にするプロモーター(POLIIプロモーター)、
− RNAポリメラーゼIに結合し、その結果、対応するvRNA、または前記の対応するcRNAの発現を可能にするプロモーター(POLIプロモーター)
の制御下にある。
− 1つまたはそれ以上のインフルエンザタンパク質をコードしている1つまたはそれ以上のmRNAだけの発現を可能にする発現ベクターと、
− インフルエンザウイルスの1つまたはそれ以上のインフルエンザvRNAまたは対応するcRNAだけの発現を可能にする発現ベクターと
を含んでもよく、前記一式の発現ベクターの発現によって、(i)前記ウイルスのvRNAを含有しているリボ核タンパク質複合体(RNP)の形成、および(ii)前記遺伝子導入細胞中での前記ウイルス粒子の組立てが可能になると理解される。
− 各プラスミドが、RNAポリメラーゼIIに結合するプロモーターの制御下にある、4種のウイルスPB2、PB1、PA、およびNPタンパク質の1つをコードしているmRNAに相補的な1つのcDNAを含有している、異なる4つのプラスミド、たとえば、実施例の第1.8節に記載のとおりに、PB2、PB1、PA、およびNPをコードするcDNAがクローン化された、Fodorら、1999、J Virol、73(11):9679〜9682に記載のプラスミドまたはpVAX1プラスミドと、
− 各プラスミドが、RNAポリメラーゼIに結合するプロモーターの制御下にある、8つのPB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNA、または対応するcRNAの1つに相補的な1つのcDNAを含有しており、前記cDNAを万能pSP−fluプラスミドなどの本発明によるベクターにクローン化することにより得たものである、異なる8つのプラスミドと
を含む。
本発明はまた、上で定義したとおりの一式の発現ベクターを含むCHO細胞に関する。
(i)インフルエンザPB2、PB1、PA、およびNPタンパク質を発現することができ、各プラスミドが、RNAポリメラーゼIIに結合するプロモーターの制御下にある、PB2、PB1、PA、およびNPタンパク質の中から選択されるウイルスタンパク質の1つをコードしているmRNAに相補的な1つのcDNAを含有している、異なる4つのプラスミドを含む、発現ベクターと、
(ii)インフルエンザPB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNA、または対応するcRNAを発現することができ、各プラスミドが、げっ歯類RNAポリメラーゼIに結合するプロモーターの制御下にある、PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNAの中から選択される8つのvRNAまたは対応するcRNAの1つに相補的な1つのcDNAを含有しており、前記cDNA配列を本発明によるベクターにクローン化して得たものである、異なる8つのプラスミドを含み、げっ歯類RNAポリメラーゼIに結合するプロモーターを含むと理解される、発現ベクターとを含む。
本発明はまた、
a)以前に記載したとおりの本発明のいずれかの実施形態による方法によってインフルエンザウイルスを産生するステップと、
b)感染性インフルエンザウイルスを、CHO細胞、好ましくはCHO−K1細胞中で増加させた後、収穫するステップと、
c)収穫した感染性インフルエンザウイルスを精製する工程と、
d)場合により、精製したウイルスを不活化する工程と、
e)精製したウイルスを薬学的に許容される担体と混合する工程と
を含む、インフルエンザワクチン組成物の調製方法に関する。
1. 材料および方法
1.1. 細胞
CHOK1細胞(ATCC番号:CCL−61)の懸濁液は、125mLのシェーカーフラスコ(Thermo Scientific)において、4mMのL−グルタミン(Gibco(登録商標))によって補充したEx−Cell CD CHO融合培地(SIGMA−ALDRICH、St Quentin Fallavier、FR)で、撹拌しながら培養した。接着性MDCK細胞(CCL−34)およびVero細胞(ATCC番号:CCL−81)は、組織培養フラスコ(Becton Dickinson)において、それぞれ、10%FBS(Thermo Scientific)によって補充したDMEM(Gibco(登録商標))、または0.1%ポビドンK30(Sanofi Pasteur)によって補充したVP−SFM(Gibco(登録商標))で培養した。CEP細胞は、10日齢の特定病原体除去(SPF)ニワトリ胚(Valo Biomedia、Osterholz−Scharmbeck、GE)から採取し、組織培養フラスコ(Becton Dickinson)において、5%FBS(Thermo Scientific)によって補充したDMEMF12+Glutamax I(HAM)(Gibco(登録商標))で培養した。すべての細胞培養物を、95%空気および5%CO2の雰囲気中にて37℃で保った。
異なる細胞型の表面におけるSia2−3GalおよびSia2−6Gal残留物発現の分析を、ジゴキシゲニングリカン識別キット(Roche、Mannhein、GE)を使用して実行した。200万個の細胞を、1倍PBS(Eurobio、Courtaboeuf、FR)中で2回、0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、1mM MgCl2、1mM MnCl2、および1mM CaCl2を含有する緩衝液pH7.5中で1回洗浄した。細胞を、ジゴキシゲニン標識レクチンである、Sia2−6Gal残留物に特異的なセイヨウニワトコアグルチニン(SNA)(1/1000)またはSia2−3Galに特異的なイヌエンジュアグルチニン(MAA)(1/300)と共に室温で1時間インキュベートした。対照細胞は、レクチンなしでインキュベートした。細胞をTBS(0.05M Tris−HCl、0.15M NaCl、pH7.5)中で2回洗浄し、室温(暗所)にて1時間、1/40抗ジゴキシゲニン−フルオレセインFab Fragment(Roche)で処理した。1倍PBS(Eurobio)中で2回洗浄した後、Guavaキャピラリーサイトメーターにおいて細胞を緑色蛍光強度について分析した。
インフルエンザB/ブリスベン/60/08ウイルス、ならびに再集合体ワクチンウイルスA/ニューカレドニア/20/99(H1N1)IVR116、A/ベトナム/1194/04(H5N1)rg14、およびA/カリフォルニア/07/09(H1N1)X179Aを、NIBSC(Hertfordshire、UK)から得た。ウイルスは、孵化鶏卵(Valo Biomedia)において繁殖させ、感染尿膜腔液から収穫した。
感染の4時間前に、6ウェルプレート(Corning、NY、US)において、細胞を、各細胞型に適した無血清培養培地に、最終体積を1mlとして、1.6×105細胞/cm2の密度で播いた。感染は、35℃にて1時間、種々の感染多重度(MOI)で実行した。ブタトリプシン(SIGMA−ALDRICH)を含有する各細胞型に適した血清なしの無血清培養培地(2ml)を加え、細胞を8%CO2中にて35℃で4日間インキュベートした。
HA検定は、V底プレート(Corning)において培養上清50μlを1倍PBS(Gibco(登録商標))で2倍に段階希釈することにより実行した。引き続いて、0.5%ニワトリ赤血球細胞(Sanofi Pasteur、Alba−la−Romaine、FR)50μlを各ウェルに加えた。プレートを4℃で1時間インキュベートし、各ウェルについて、赤血球凝集または赤血球凝集の欠如を視覚的に決定した。
96ウェルプレート(Corning)において、MDCK細胞を、1μg/mlのブタトリプシン(SIGMA−ALDRICH)で補充したDMEM(Gibco(登録商標))に、2.7×106細胞/cm2の密度で播いた。細胞を、1:10の連続ウイルス希釈物50μlで感染させ、35℃で4日間インキュベートした。次いで、こうした培養物からの上清を赤血球凝集検定において試験した。Spearman−Karberの統計的方法に従って、TCID50力価を算出した(David John Finney、1952、Statistical method in biological assay、Hafner editor)。
200万個の細胞を200×gで10分間遠心分離し、室温でcGMP(現行の優良医薬品製造基準)solution V(Lonza、Basel、CH)100μlに再懸濁し、pGFP(Sanofi Pasteur)プラスミド10μgを加えた。nucleoporationを、Nucleofector(Lonza)によって、異なるプログラムを使用して実行した。6ウェルプレート(Corning)において、各細胞型に最適な培地にて、37℃、5%CO2で24時間、細胞をインキュベートした。Guavaキャピラリーサイトメーター(Millipore、Bellerica、MA、US)において、細胞を緑色蛍光強度について分析した。
感染性A/PR/8/34(H1N1)ウイルスのレスキューのための12のプラスミドは、以前より、Fodorら、1999、J Virol、73(11):9679〜9682に記載されている。以下で言及するとおりの多少の改変を加えて、同じ方法を適用した。
100万個のVero細胞と100万個のCHOK1細胞を混合し、200×gで10分間遠心分離し、室温でsolution V(Lonza)100μlに再懸濁した。8つのvRNA発現プラスミドそれぞれ1μgと4つのタンパク質発現プラスミドそれぞれ0.5μgの混合物を細胞に加え、nucleofector(Lonza)を用い、U−023プログラムを使用して、nucleofectionを実行した。細胞を、6ウェルプレートにおいて、4mMのL−グルタミン(Gibco(登録商標))で補充したEx−cell(商標)CD CHO融合培地(SIGMA−ALDRICH)中でインキュベートした。37℃、5%CO2で2時間インキュベートした後、組換えトリプシン(TryLE Select)(Gibco(登録商標))で補充した同じ培地において200万個のCHOK1細胞を加え、回転台上において35℃、8%CO2でインキュベートした。
国立生物学的製剤研究所(NIBSC)から購入したA/カリフォルニア/07/09(H1N1)ウイルスのHAに特異的な血清を、コレラ菌のReceptor Destroying Enzyme(RDE、Sigma、10mU/mL)によって37℃で18時間処理した。RDEを56℃で1時間かけて不活化させた。次いで、RDE処理した血清を、5%シチメンチョウ赤血球細胞(RBC)と共に4℃で2時間インキュベートし、2000rpmで10分間遠心分離した。次いで、処理した血清の段階希釈物を、試験するウイルス4HAUと共に室温で1時間、次いで0.25%ニワトリRBCと共に4℃で1時間インキュベートした。IHA力価は、ウイルスが媒介となるRBCの赤血球凝集を阻害する、血清の最高希釈度によって決定される。
2.1. 細胞成長
MDCK、CHO−K1、Vero、およびCEP細胞について、CHO−K1については懸濁液中で、または他の細胞型については接着として、各細胞型の最も適当な培地において成長を維持し得るその能力を評価した。1世代に必要な存続期間を推定することにより、集団倍加レベル(pdl)を各細胞型について決定した。表1に見られるように、MDCKおよびCHO−K1は、Vero細胞(38時間)およびCEP細胞(48時間)に比べて、短いpdl(それぞれ23時間および18時間)を示した。CHO−K1およびVero細胞系は、血清なしで培養されたことに留意することが重要である。
感染の際、鳥ウイルスならびに卵順応ヒトウイルス変異株は、Sia2−3Gal結合に主に結合するのに対し、ヒトから直接単離された臨床分離株は、Sia2−6Gal結合に優先的に結合する(Suzukiら、2011、Adv Exp Med Biol、705:443〜452)。
インフルエンザウイルスの尿膜腔液を、事前順応なしで、試験する細胞系と直接接触させた。2種のインフルエンザA再集合体ウイルス(A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)IVR116およびA/ベトナム/1194/04(H5N1)rg14)ならびに1種のインフルエンザBウイルス(B/ブリスベン/60/08系統B/ビクトリア/2/87)を試験した。種々のMOI(10−1、10−2、および10−3)ならびにブタトリプシン濃度(0、1、2、5、および8μg/mL)を使用した。A型インフルエンザウイルスについては感染から3日後、B型インフルエンザウイルスについては感染から4日後に、10−1のMOIおよび最も適当なトリプシン濃度で得られた結果を、各細胞型について示す(表3および表4を参照されたい)。
2.4.1. 細胞系が遺伝子導入を受け得る能力
感染性インフルエンザウイルスを生成し得る一式の発現ベクターによる遺伝子導入後に、異なる細胞型のウイルス産生能を試験することも重要である。第1の工程では、こうした異なる細胞型が遺伝子導入を受け得る、詳細には、動物起源の原材料の使用を伴わない材料による遺伝子導入を受け得る能力を試験することが重要である。Amaxa(Amaxa、Lonza technology)によって提供される、核を標的とするnucleoporation技術を細胞の遺伝子導入に使用し、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミドを使用して、異なる細胞系の被遺伝子導入能を評価した。細胞をV solutionに再懸濁し、pGFPプラスミドと共にインキュベートし、nucleofectorでnucleoporationを施した。異なるプログラム(U−023、A−024、V−001、T−030、L−005)を試験した。次いで、細胞を37℃で1日インキュベートし、緑色蛍光細胞の百分率をGuavaサイトメトリーによって分析した。最適な遺伝子導入プログラムを用いて3つの独立した実験から算出したGFP発現細胞の百分率平均値および標準偏差を、表5に示す。
効率よくするために、通常は2種のA型ウイルスおよび1種のB型ウイルス由来の抗原性材料を含有するインフルエンザワクチンは、出現し、季節性インフルエンザまたは汎流行性インフルエンザの原因になる新たな循環ウイルスに応じて、毎年更新されなければならない。重要なことに、HAおよびNA抗原性材料は、新たな循環ウイルスの抗原性材料に対応するように更新されなければならない。逆遺伝学を実行するために、HAおよびNAをコードする遺伝子は、毎年、または新たな循環ウイルスが特徴付けられたときに、POLIプロモーターの制御下にあるvRNA発現プラスミドにクローン化しなければならない。内部A/PR/8/34vRNAをコードしている他のvRNAプラスミドおよびタンパク質発現プラスミドは、通常1回しか構築されない。vRNA発現プラスミドにおけるクローン化工程は、未知のHAおよびNA遺伝子に対して逆遺伝学を行うとき、非常に扱いに注意を要することになりかねないため、A型およびB型ウイルスからの任意のインフルエンザ分節の組換えによるクローン化に使用することのできる万能逆遺伝学プラスミドが開発された。しかし、vRNA転写の正確な開始および停止のための要件が厳格であるために、組換え領域の選択は、劇的に制限される。したがって、POL1プロモーターの最後の17ヌクレオチドおよび肝炎デルタリボザイムの最初の17ヌクレオチドを含む、インフルエンザゲノムに特異的でない新たな組換えカセットを使用した。さらに、環状プラスミドを直線化するためのBbsI、空のプラスミドを除外するためのNotIおよびSbfI部位を含む28ヌクレオチドを、POL1プロモーターと肝炎デルタリボザイムの間に組み込んだ。「万能pSP−flu」と名付けた、得られたプラスミドは、比較的小さく(2202pb)、カナマイシン耐性遺伝子を含有していた(図2)。クローン化用のインフルエンザcDNAを調製するために、vRNAを逆転写して、組換え末端を含有しているcDNAとし、POL1プロモーターとリボザイムの間にクローン化した。この改良されたRNA産生プラスミドを使用して、インフルエンザAおよびBウイルスからのいくつかの遺伝子を、相同組換えによってクローン化した。陽性クローンの割合は、「容易な」クローン化については90%を上回り、「困難な」クローン化については30%であり、平均は、クローン化実験あたり150クローンであった。
逆遺伝学によって感染性インフルエンザウイルスをレスキューし得るその能力について、その良好な成長特性を根拠に、CHO−K1およびVero細胞系を試験した。
3.1. HAおよびNAキメラ遺伝子の構築
最初に、ソフトウェアVector NTIを使用して、キメラ構築物をコンピューター内で組立てた。HAキメラ遺伝子A/カリフォルニア/07/09−A/PR/8/34(H1N1)は、A/PR/8/34(H1N1)ウイルスの非コード領域(NCR)、シグナルペプチド(SP)、HA2ドメイン、膜貫通(TM)ドメイン、およびCytoドメイン、ならびにA/カリフォルニア/07/09(H1N1)ウイルスからのHA1ドメインを含有している。
逆遺伝学によるキメラインフルエンザウイルスの産生は、上記したとおり、すなわち、ウイルスタンパク質PB1、PB2、PA、およびNAの発現用の4つのプラスミド、ならびにvRNA PB1、PB2、PA、NP、NS、M、キメラHA、およびキメラNAの発現用の8つのプラスミドを使用し、これらを、先に言及したとおりのnucleoporationによってCHO−K1/Vero細胞の混合物に導入することにより実行した。産生されたウイルスは、2つのキメラ遺伝子を含有しているので、「二重キメラ」である。ウイルスは、A/PR/8/34(H1N1)ウイルスからのPB2、PA、NP、NS、およびM遺伝子、A/カリフォルニア/07/09(H1N1)ウイルスからのPB1遺伝子、HAキメラ遺伝子A/カリフォルニア/07/09−A/PR/8/34(H1N1)、およびNAキメラ遺伝子A/カリフォルニア/07/09−A/PR/8/34(H1N1)を含有している。各逆遺伝学実験について、A/NC/20/99(H1N1)ウイルスを陽性対照として使用した。
HAキメラ遺伝子の使用によって、キメラウイルスによって発現されるHAタンパク質の抗原性が変化しなかったことを検証するために、本発明者らは、再集合体A/カリフォルニア/07/09(H1N1)ウイルスまたは3.2で得たような「二重キメラ」ウイルスのいずれかを試験ウイルスとして使用して、1.10に記載のとおりの阻害赤血球凝集検定において得られた力価を比較した。阻害赤血球凝集検定における力価が高いほど、抗体によるHA抗原の認識が強力であった。試験した2種のウイルスで得られたIHA力価は、10240より高かったが、これは、二重キメラウイルスによって発現されたHAタンパク質の抗原性が、十分に保存され、A/カリフォルニア/07/09(H1N1)再集合体のものと非常に似通っているまたは同一であることを示している。
100万個のVero細胞を室温でsolution V(Lonza)に再懸濁した。A/PR/8/34(H1N1)ウイルスのPB1、PB2、PA、NP、M、およびNSのvRNAを発現する6つのvRNA発現プラスミドそれぞれ1μg、A/ベトナム/1203/04(H5N1)ウイルスのNAおよびHAのvRNAを発現する2つのvRNA発現プラスミドそれぞれ1μg、およびA/PR/8/34(H1N1)ウイルスのPB1、PB2、PA、NPのmRNAを発現する4つのタンパク質発現プラスミドそれぞれ0.5μからなる混合物を細胞に加え、nucleofector(Lonza)を用い、V−001プログラムを使用して、nucleofectionを実行した。6ウェルプレートにおいて、細胞をDMEM−F12(登録商標)培地(Gibco(登録商標))1.5ml中でインキュベートした。37℃、5%CO2で2時間インキュベートした後、ブタトリプシン(Sigma)で補充した同じ培地に、100万個のCEF(ニワトリ胚線維芽細胞)細胞を加え、回転台上において、35℃、8%CO2でインキュベートした。赤血球凝集検定によってウイルス力価を測定するために、一定の間隔で、培養上清100μlを採取した。赤血球凝集検定の結果を以下の表7に示す。
Claims (25)
- a)細胞に一式の発現ベクターを遺伝子導入して、感染性インフルエンザウイルスのシードを生成する工程、
b)CHO細胞を感染性インフルエンザウイルスの前記シードで感染させる工程
を含む、感染性インフルエンザウイルスの産生方法。 - 工程a)における細胞が、霊長類起源の細胞である、霊長類起源の細胞とCHO細胞の混合物である、またはCHO細胞からなる、請求項1に記載の方法。
- 霊長類起源の細胞がVero細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記CHO細胞がCHO−K1細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一式の発現ベクターが、
− 少なくともインフルエンザPB1、PB2、PA、およびNPタンパク質をコードしているmRNAの発現を可能にする発現ベクターと、
− 少なくともインフルエンザPB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNA、または対応するcRNAの発現を可能にする発現ベクターと
を含み、
前記一式の発現ベクターの発現によって、(i)該インフルエンザvRNAを含有しているリボ核タンパク質複合体(RNP)の形成、および(ii)前記遺伝子導入細胞中での感染性インフルエンザウイルスの生成が可能になると理解される、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - (i)インフルエンザPB1、PB2、PA、およびNPタンパク質をコードしているmRNAの発現を可能にする前記発現ベクターが、異なる4つの一方向性プラスミドを含み、各プラスミドは、RNAポリメラーゼIIに結合するプロモーターの制御下にある、PB1、PB2、PA、およびNPインフルエンザタンパク質から選択される4種の別個のタンパク質の1つをコードしているmRNAに相補的なcDNAを含有しており、
(ii)インフルエンザPB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNA、または対応するcRNAの発現を可能にする前記発現ベクターが、異なる8つの一方向性プラスミドを含み、各プラスミドは、RNAポリメラーゼIに結合するプロモーターの制御下にある、前記PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNAインフルエンザvRNAから選択される8つの別個のvRNA、または対応するcRNAに相補的なcDNAを含有している、
請求項5に記載の方法。 - RNAポリメラーゼIに結合するプロモーターの制御下にある、前記インフルエンザPB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNA vRNA、または対応するcRNAの1つに相補的なcDNAを含有している前記各プラスミドが、センス鎖の5’から3’に、
a)RNAポリメラーゼIまたはT7 RNAポリメラーゼに結合するプロモーターと;
b)センス鎖の5’から3’に、
− 認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、第1の制限酵素の逆方向相補的認識配列;
− 認識配列の内側に切断部位を有する第2の制限酵素の制限部位;
− 認識配列の内側に切断部位を有する第3の制限酵素の制限部位;および
− 認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、前記第1の制限酵素の認識配列を含み、
前記第2および第3の制限酵素は異なる、組換えカセットと;
c)
− 該プロモーターがRNAポリメラーゼIに結合するとき、前記ターミネーター配列は、肝炎デルタリボザイム配列であり;
− 該プロモーターがT7 RNAポリメラーゼに結合するとき、前記ターミネーター配列は、T7ポリメラーゼターミネーター配列である
と理解される、ターミネーター配列と
を含むベクターに前記cDNA配列をクローン化することによって得たものである、請求項6に記載の方法。 - 前記ベクターが、配列番号:1の配列を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記一式の発現ベクターが、異なる8つの双方向性プラスミドを含み、各プラスミドは、2つのプロモーターの制御下にある、前記PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、およびNAインフルエンザvRNAから選択される8つの別個のvRNAの1つに相補的なcDNAを含有しており、前記第1のプロモーターは、ポリメラーゼIに結合し、前記第2のプロモーターは、ポリメラーゼIIに結合し、
前記一式の発現ベクターの発現によって、(i)該インフルエンザvRNAを含有しているリボ核タンパク質複合体(RNP)の形成、および(ii)前記遺伝子導入細胞中での感染性インフルエンザウイルスの生成が可能になると理解される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 産生される感染性インフルエンザウイルスが、A型またはB型インフルエンザウイルスである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 産生される感染性インフルエンザウイルスが、再集合体感染性インフルエンザウイルスであり、その遺伝物質は、少なくとも2種のドナーウイルスの遺伝物質を組み合わせた結果として得られる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ドナーウイルスが、A/プエルトリコ/8/34(H1N1)(A/PR/8/34)、B/Lee/40、またはB/パナマ/45/90のうちの1つである、請求項11に記載の方法。
- 産生される感染性インフルエンザウイルスがキメラウイルスである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラウイルスが、キメラインフルエンザHAおよび/またはNA vRNAを含有している、請求項13に記載の方法。
- キメラインフルエンザHA vRNAおよび/またはNA vRNAが、季節性または汎流行性ウイルスからのHA vRNAの1つもしくはそれ以上のドメインまたはNA vRNAの1つもしくはそれ以上のドメインと、別のドナーウイルスからのHA vRNAの1つもしくはそれ以上のドメインまたはNA vRNAの1つもしくはそれ以上のドメインとを含み、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのHA vRNAの少なくとも1つのドメインは、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのHA1および/またはHA2のような、HAの抗原性外部ドメインをコードしているmRNAの領域に相補的であり、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのNA vRNAの少なくとも1つのドメインは、前記季節性または汎流行性インフルエンザウイルスからのNAの抗原性外部ドメインをコードしているmRNAの領域に相補的である、請求項14に記載の方法。
- 前記方法を、無血清培地または無動物成分条件において完全に実行する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- a)請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によってインフルエンザウイルスを産生する工程と;
b)感染性インフルエンザウイルスを、CHO細胞中で増加させた後収穫する工程と、
c)収穫した感染性インフルエンザウイルスを精製する工程と、
d)場合により、精製したウイルスを不活化する工程と、
e)精製したウイルスを薬学的に許容される担体と混合する工程と
を含む、インフルエンザワクチン組成物の調製方法。 - 請求項5〜9のいずれか1項で定義したとおりの一式の発現ベクターを含むCHO細胞。
- CHO−K1細胞である、請求項18に記載のCHO細胞。
- センス鎖の5’から3’に、
− RNAポリメラーゼIまたはT7 RNAポリメラーゼに結合するプロモーターと;
− センス鎖の5’から3’に、
− 認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、第1の制限酵素の逆方向相補的認識配列;
− 認識配列の内側に切断部位を有する第2の制限酵素の制限部位;
− 認識配列の内側に切断部位を有する第3の制限酵素の制限部位;および
− 認識配列の外側に切断部位を有し、粘着末端を生じる、前記第1の制限酵素の認識配列を含み、
前記第2および第3の制限酵素は異なる、組換えカセットと;
− 該プロモーターがRNAポリメラーゼIに結合するとき、前記ターミネーター配列は、肝炎デルタリボザイム配列であり、
− 該プロモーターがT7 RNAポリメラーゼに結合するとき、前記ターミネーター配列は、T7ポリメラーゼターミネーター配列である
と理解される、
− ターミネーター配列と
を含むベクター。 - 前記プロモーターが、げっ歯類RNAポリメラーゼIまたはヒトRNAポリメラーゼIに結合する、請求項20に記載のベクター。
- 組換えカセットの前記第1の制限酵素が、BbsIまたはSapIであり、組換えカセットの前記第2および第3の制限酵素が、NotIおよびSbfIからなる群から選択される、請求項20または21に記載のベクター。
- 前記組換えカセットが、配列番号:2の配列からなる、請求項20〜22のいずれか1項に記載のベクター。
- 配列番号:1の配列を含む、請求項20〜23のいずれか1項に記載のベクター。
- 再集合体RNAウイルスを逆遺伝学によって産生する方法において使用するための、請求項20〜24のいずれか1項に記載のベクター。
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