MX2014013424A

MX2014013424A - Anticuerpo de antagonista especifico de heterodimero alfa-4-beta-7.

Info

Publication number: MX2014013424A
Application number: MX2014013424A
Authority: MX
Inventors: Ian Foltz; Taruna Arora; Frederick W Jacobsen; Hailing Hsu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2015-07-29
Also published as: SG174344A1; EP2408816B1; CL2011002306A1; MX357213B; NZ595464A; TWI477511B; JP2014140372A; EP2408816A2; CA2754113C; CN102388068A; KR101391472B1; MA33213B1; IL232009A; IL232008A; IL214868A; US20120177662A1; CN102388068B; IL232009A0; IL239965A0; IL232008A0

Abstract

Se describen proteínas de unión a antígeno específicas de heterodímero alfa4beta7, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para hacerlas y usarlas.

Description

ANTICUERPO DE ANTAGONISTA ESPECIFICO DE HETERODIMERO ALFA-4-BETA-7 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C 119(e) del número de solicitud de patente estadounidense 61/162,154, presentada el 20 de marzo de 2009 y la solicitud de patente estadounidense número 61/306,829, presentada el 22 de febrero de 2010, las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Campo de la invención Esta solicitud proporciona composiciones y métodos que se refieren a proteínas de unión de antígeno específico de heterodímero alfa4beta7.

Antecedentes Las integrinas son proteínas transmembrana Tipo I heterodiméricas formadas por dos subunidades (una subunidad alfa y una subunidad beta), y median muchas interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular diferentes. De manera funcional, las integrinas han mostrado estar involucradas en diversos procesos biológicos, incluyendo migración y recirculación de leucocitos y la respuesta inmune. En mamíferos, existen 18 subunidades alfa conocidas y ocho subunidades beta conocidas, las cuales se combinan para formar 24 integrinas distintas. La especificidad de ligando es determinada en gran parte por las combinaciones particulares de subunidades alfa y beta expresadas, mientras que la afinidad para ligando es modulada mediante cambios conformacionales de integrina y es dependiente de catión divalente.

Los ligandos para integrinas forman un grupo estructuralmente diverso que incluye proteínas de matriz extracelular, tales como colágenos, fibronección, vitronectina y lamininas; contra-receptores, tales como moléculas de adhesión celular (por ejemplo, molécula de adhesión celular vascular o VCAM) y proteínas de plasma. Numerosos microorganismos patogénicos también utilizan integrinas para iniciar la infección o como sitios para unión a toxina. Los ligandos estructuralmente diversos comparten un residuo de ácido aspártico o glutámico expuesto, usualmente presentes en un lazo flexible, extendido, el cual es importante para reconocimiento por integrinas.

Las alfa4 integrinas (alfa 4 acompañada con ya sea la subunidad betal o beta7) juegan un papel importante en el sistema inmune. La alfa4-beta 1 es expresada en linfocitos y células mieloides; parece ser el principal compañero de unión para molécula de adhesión de célula vascular (VCAM). VCAM es expresada por doquier sobre endotelio vascular, es sobre-regulada durante la inflamación y liga alfa4beta7 así como alfa4beta1 (aunque débilmente a alfa4beta7). Aunque también se detectó sobre células T periféricas, células B, células NK y eosinófilos, alfa4beta7 es muy altamente expresada en una subpoblación de células T de memoria CD4+CD45RA, la cual ha mostrado dirigirse preferencialmente al intestino. El ligando primario para el heterodímero alfa4beta7 es molecula de adhesión de células de adresina de mucosa 1 (MAdCAM-1 o MAdCAM), la cual se expresa en endotelio de intestino.

Además de emparejarse con la cadena alfa4, la subunidad beta7 también se asocia con alfaE para formar alfaEbeta7, la cual es expresada principalmente sobre linfocitos intraepiteliales (IEL) en intestino, pulmón y tracto genitourinario. AlfaEbeta7 también se expresó sobre células dendríticas en el intestino. El heterodímero alfaEbeta7 se une a E-cadherina, la cual es expresada sobre células epiteliales. Las células IEL se piensa que proporcionan un mecanismo para inmunosupervivencia dentro del compartimiento epitelial.

Los anticuerpos que ligan alfa4 e inhiben la unión de alfa4beta1 a VCAM-1 y fibronección mapean a una región de 52 aminoácidos de alfa4, entre los residuos 152 y 203 (Schiffer et al., J. Biol. Chem. 270:14270; 1995). Tidswell et al. (J. Immuno 159:1497; 1997) identificó dominios de beta7 que son importantes en la unión a MAdCAM-1, utilizando un panel de anticuerpos que ligan beta7 en una aproximación de subunidad beta7 quimérica de ratón/humano. Encontraron que seis de siete anticuerpos que inhibieron la unión a MAdCAM-1 y E-cadherina mapearon a una región comprendiendo aminoácidos 176 a 250, la cual parece tener homología ai sitio de adhesión dependiente de iones metálicos (MIDAS) de otras subunidades de integrina. Uno de los anticuerpos usados por Tidswell et al. fue un anticuerpo específico de heterodímero alfa4beta7 referido como ACT-1.

El anticuerpo ACT-1 fue descrito de manera original por Lazarovitz et al. (J. Immunol. 133:1857; 1984) como un anticuerpo desarrollado al inmunizar ratones con línea de linfocitos T específicos de toxoide de tétano humano a partir de PBMC. Posteriormente, se mostró que ACT-1 se une al heterodímero alfa4beta7 específicamente (Schweighoffer et al., J. Immunol. 151 :717, 1993). Aunque ACT-1 no se une a alfa4beta7 de murino, se une a alfa4beta7 a partir de al menos algunas especies de primates o humanas y se ha mostrado que atenúa la colitis espontánea en tamarinos de parte superior de algodón cautivos (Hesterberg et al., Gastroenterology 111 :1373; 1996) ACT-1 ha sido humanizado y evaluado como un terapéutico humano en colitis ulcerosa (Feagan et al., N Engl J Med. 352:2499; 2005) y recientemente en la enfermedad de Crohn (Feagan et al, Clinical Gastroenterology and Hepatology, 6:1370, 2008). ACT-1 humanizado, también conocido como vedolizumab, es descrito en WO 98/06248 y la patente estadunidense 7,147,85, así como WO 07/061679 y US 2007-0122404. Otro anticuerpo humanizado, natalizumab (Tysabri®), se ha usado para tratar la enfermedad de Crohn. Natalizumab es una versión humanizada de un anticuerpo de murino específico de alfa4. Vedolizumab ha mostrado conducir a una respuesta de anticuerpo anti humanizada neutralizante en una porción de los pacientes, y el natalizumab ha sido asociado con leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), un desorden neurológico que es asociado con la reactivación de infección anterior con virus JC en individuos inmunocomprometidos. De acuerdo con esto, existe un agente terapéutico que mejora estas desventajas mientras que se interrumpe la trayectoria alfa4beta7/MAdCAM-1.

Breve descripción de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión de antígeno aislado que se une específicamente a alfa4beta7 humana (es decir, una proteína de unión de antígeno específico de heterodímero afla4beta7). En otro aspecto de la invención, la proteína de unión de antígeno se une específicamente a la alfa4beta7 de un primate no humano, un mono cinomólogo, un chimpance, un mamífero o primate, un roedor, un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de Indias, un gato o un perro. En otra modalidad, la proteína de unión de antígeno aislada comprende un anticuerpo humano; un anticuerpo quimérico; un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo recombinante; un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno; un anticuerpo de cadena simple; un diacuerpo; un triacuerpo; un tetracuerpo; un fragmento Fab; un fragmento F(ab’)2; un anticuerpo de dominio; un anticuerpo IgD; un anticuerpo IgE; un anticuerpo IgM; un anticuerpo lgG1 ; un anticuerpo lgG2; un anticuerpo lgG3; un anticuerpo lgG4; o un anticuerpo lgG4 teniendo al menos una mutación en una región de gozne que alivia una tendencia para formar enlace disulfuro de cadena intra-H. En otro aspecto, la proteína de unión de antígeno aislada comprende una región constante de cadena pesada a partir de uno de los anticuerpos antes mencionados; en otro aspecto, la región constante es un polipéptido que comprende SEQ ID NO:72; un polipéptido al menos 90% idéntico a SEQ ID NO:72; un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:72 a partir de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido removidos; o uno de los polipéptidos antes mencionados, el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales. En una modalidad, la proteína de unión de antígeno aislada comprende una región constante de cadena ligera kappa, en otra comprende una región de cadena ligera lambda. En una modalidad, la región constante de cadena ligera es un polipéptido que comprende SEQ ID No:70; un polipéptido al menos 90% idéntico a SEQ ID NO:70; un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:70 a partir de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales ha sido removido; o uno de los polipéptidos antes mencionados, el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales.

Una modalidad de la presente invención proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 teniendo una cadena pesada y una cadena ligera, cada una de las cuales comprende una o más regiones determinantes de complementaridad, o CDRs. En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena pesada comprende CDR1 , CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera comprende CDR1 , CDR2 y CDR3, en donde cada CDR respectiva es seleccionada del grupo que consiste de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:55, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:58; CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:56 y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:59; y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:57, y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO.60.

En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena pesada comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FTs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4, y la región variable de cadena ligera comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4. En un aspecto, las FRs son seleccionadas de la misma SEQ ID NO que las CDRs; en otro, las FRs son seleccionadas de una SEQ ID NO diferente. En una modalidad adicional, la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específico de heterodímero alfa4beta7, en donde la región variable de cadena ligera comprende SEQ ID NO:55 y la región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO: 58; la región variable de cadena ligera comprende SEQ ID NO:56 y la región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO:59; o la región variable de cadena ligera comprende SEQ ID N0.57, y la región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO:60.

En otro aspecto de la invención, la presente invención proporciona una proteína de unión de antígeno específico de heterodímero alfa4beta7 aislada, teniendo una cadena pesada y una cadena ligera, cada una de las cuales comprende una o más regiones determinantes de complementaridad, o CDRs. En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena pesada comprende CDR1 , CDR2 y CDR3 y la región variable de cadena ligera comprende CDR1 , CDR2 y CDR3. En una modalidad, las CDRs de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:3; una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% identica a una CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:5; una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:7; una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:22; y una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO: 24; y las CDR1 , CDR2 y CDR3 variables de cadena pesada son de SEQ ID NO:58.

En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena pesada comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FRE3 y FR4, y la región variable de cadena ligera comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4. En un aspecto, las FRs son seleccionadas de la misma SEQ ID NO como las CDRs; en otra, las FRs son seleccionadas de una SEQ ID NO diferente. En una modalidad adicional, la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específico de heterodímero alfa4beta7, en donde la región variable de cadena ligera es seleccionada del grupo que consiste de una región variable de cadena ligera al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:3; una región variable de cadena ligera al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:5; una región variable de cadena ligera al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:7; una región variable de cadena ligera al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:22; y una región variable de cadena ligera al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:24; y la región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO:58.

Otro aspecto de la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada teniendo una región variable de cadena pesada comprendiendo CDR1 , CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera comprendiendo CDR1 , CDR2 y CDR3, en donde las CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:12; una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1 , CDR2, y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:25; y una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:26; y las CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada son seleccionadas del grupo que consiste de una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:41 ; y una CDR1 , CDR2 y CDR3 al menos 90% idéntica a una CDR1 , CDR2 y CDR3, respectivamente, de SEQ ID NO:54. En una modalidad, la región variable de cadena ligera es seleccionada del grupo que consiste de regiones variables que son al menos 90% idénticas a cualquiera de SEQ ID Nos: 12, 25 y 26, y la región variable pesada es seleccionada del grupo que consiste de regiones variables que son al menos 90% idénticas a cualquiera de SEQ ID Nos: 41 y 54. En otro aspecto de la invención, la región variable de cadena pesada comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4, y la región variable de cadena ligera comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4. En un aspecto, las FRs son seleccionadas de la misma SEQ ID NO como las CDRs; en otra, las FRs son seleccionadas de una SEQ ID NO diferente.

En una modalidad, la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada, teniendo una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 , CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera comprendiendo CDR1 , CDR2 y CDR3, en donde cada CDR respectiva es al menos 90% idéntica a una CDR seleccionada del grupo que consiste de una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:10, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:38; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:2 y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:30; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:20, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:51 ; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:11 , y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:39; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:13, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:42, una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 17, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:46; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:8, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:36; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:19, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:49; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:18, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:47; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:21 , y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:52; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:3, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:31; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:7, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:35; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:6, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:34; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 , y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:29; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:22, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:50; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:24, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:40; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:9, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:37; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:4, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:32; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:28, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:53; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:16, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:45; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:15, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:44; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:43, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:43; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:27, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:43; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:5, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:33; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:12, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:41 ; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:23, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:48; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:25, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:54; una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO:26, y una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:54. En otro aspecto, las CDRs de cadena pesada y cadena ligera son idénticas a las CDRs respectivas de las SEQ ID NOs declaradas. En una modalidad de la invención, la región variable de cadena pesada comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4 y la región variable de cadena ligera comprende además cuatro regiones de marco de trabajo (FRs) designadas FR1 , FR2, FR3 y FR4. En un aspecto, las FRs son seleccionadas de la misma SEQ ID NO como las CDRs; en otra, las FRs son seleccionadas de una SEQ ID NO diferente.

En otra modalidad, una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en donde la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:10, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:38, La región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:2, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:30; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:20, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:51 ; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:11 , y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:39; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:13, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:42; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:17, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:46; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:8, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:36; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:19, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:49; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:18, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:47; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:21 , y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:52; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:3, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:31 ; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:7, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:35; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:6, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:34; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:1 , y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:29; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:22, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:50; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:24, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:40; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:9, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:37; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:4, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:32; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:28, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:53; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID N0:16, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:45; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID N0:15, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:44; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID N0:14, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:43; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:27, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:43; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID N0:5, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:33; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:12, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:41 ; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:23, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:48; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:25, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:54; la región variable de cadena ligera es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:26, y la región variable de cadena pesada es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:54. En otro aspecto, las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera son idénticas a las regiones variables respectivas de las SEQ ID NOs declaradas.

Un aspecto de la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 teniendo una EC50 de menos de 35 ng/ml en un ensayo de unión de células T de memoria CD4+; otro proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 la cual tiene una EC50 de menos de 10 ng/ml en un ensayo de unión de células T de memoria CD4+. En otra modalidad, la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 teniendo una IC50 en un ensayo de competencia MAdCAM de menos de 30 ng/m; en otro se proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada, la cual tiene una IC50 de menos de 10 ng/ml en un ensayo de competencia MAdCAM. (Un aspecto de la invención proporciona una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada, que se une a un muíante S250N de alfa4beta7.

En un aspecto de la invención, la presente proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos antes mencionados. En otro aspecto de la invención, el ácido nucleico es un vector. En otra modalidad de la invención, la invención proporciona células hupesped transformadas o transfectadas con los ácidos nucleicos inventivos. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar un polipéptido que comprende incubar las células huésped bajo condiciones que promueven la expresión de los polipéptidos y recolectar los polipéptidos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula aislada que secreta una proteína de unión de antígeno que liga alfa4beta7. En otra modalidad, la célula es un hibridoma. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer una proteína de unión de antígeno que liga específicamente alfa4beta7 (es decir, alfa4beta7 humana), comprendiendo incubar dicha célula aislada bajo condiciones que le permiten expresar dicha proteína de unión de antígeno.

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión de antígeno aislada que liga específicamente un heterodímero alfa4beta7. En otra modalidad, la proteína de unión de antígeno aislada, cuando se une a alfa4beta7 humano, inhibe la unión de alfa4beta7 a MAdCAM-1. De acuerdo con esto, una modalidad de la invención proporciona un método para inhibir al menos una actividad de alfa4beta7, que comprende contactar una célula que exprese alfa4beta7 con una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, de manera que la actividad es parcial o completamente inhibida. En un aspecto, tal método es realizado in vivo. En un aspecto de la invención, la proteína de unión de antígeno aislado inhibe la adhesión de células que expresan alfa4beta7 a células que expresan MAdCAM-1. Todavía en otro aspecto de la invención, la proteína de unión de antígeno aislado inhibe el tráfico de células que expresan alfa4beta7 a áreas o tejidos poblados por células que expresan MAdCAM-1 ; en un ejemplo de tal modalidad, las proteínas de unión de antígeno aisladas inhiben el tráfico de linfocitos al intestino.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica comprendiendo la proteína de unión de antígeno. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar una condición en un sujeto que comprende administrar la composición farmacéutica al sujeto, en donde la condición es tratable al reducir la actividad (parcial o completamente) de alfa4beta7 en el sujeto. En otra modalidad, el sujeto es un ser humano. En otra modalidad, la condición es una condición inflamatoria del sistema gastromtestinal. Así, se proporciona un método para tratar un individuo afligido con una condición caracterizada por tráfico inapropiado de células que expresan alfa4beta7 a tejidos comprendiendo células que expresan MAdCAM, comprendiendo administrar al individuo una proteína de unión de antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 en una cantidad suficiente para inhibir (parcial o completamente) el tráfico de células que expresan alfa4beta7 a tejidos comprendiendo células que expresan MAdCAM. En una modalidad, la condición es enfermedad de intestino inflamatorio, por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad de Celiac (esprue no tropical), enteropatía asociada con artropatías seronegativas, colitis microscópica o colagenosa, gastroenteritis eosinofílica, o pouchitis resultante después de proctocolectomía y anastomosis ileoanal. En otra modalidad, la condición es pancreatitis s, diabetes mellitus dependiente de insulina, mastitis, colecistitis, colangitis, pericolangitis, bronquitis crónica, sinusitis crónica, asma o enfermedad de injerto versus huésped.

En otra modalidad, el método comprende además administrar al sujeto un segundo tratamiento. En otra modalidad, el segundo tratamiento es administrado al sujeto antes y/o simultáneamente con y/o después de la composición farmacéutica es administrada al sujeto. En otra modalidad, el segundo tratamiento comprende un agente antiinflamatorio. En otra modalidad, la segunda composición farmacéutica comprende un agente seleccionado del grupo que consiste de medicamentos anti-inflamatorios no esteroidales, esteroides y agentes inmunomoduladores. En otra modalidad, el método comprende administrar al sujeto un tercer tratamiento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la longevidad de un sujeto que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para disminuir la actividad de alfa4beta7 en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para disminuir el tráfico mediado por alfa4beta7 (por ejemplo, la guía a intestino mediada por alfa4beta7) en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica.

Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona composiciones, kits y métodos que se refieren a moléculas que se unen a la integrina alfa4beta7 (“alfa4beta7”), incluyendo moléculas que agonizan o antagonizan alfa4beta7, tales como anticuerpos anti-alfa4beta7, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-alfa4beta7 antagonistas, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos. También se proporcionan ácidos nucleicos y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica todo o una porción de un polipéptido que se une a alfa4beta7, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todo o parte de un anticuerpo anti-alfa4beta7, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo, plásmidos y vectores comprendiendo tales ácidos nucleicos y células o líneas de células comprendiendo tales ácidos nucleicos y/o vectores y plásmidos. Los métodos provistos incluyen, por ejemplo, métodos para hacer, identificar o aislar moléculas que se unen a alfa4beta7, tales como anticuerpos anti-aifa4beta7, métodos para determinar si una molécula se une a alfa4beta7, métodos para determinar si una molécula agoniza o antagoniza alfa4beta7, métodos para hacer composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, comprendiendo una molécula que se une a alfa4beta7, y métodos para administrar una molécula que se une a alfa4beta7 a un sujeto, por ejemplo, métodos para tratar una condición mediada por alfa4beta7, y para agonizar o antagonizar una actividad biológica de alfa4beta7, in vivo o in vitro.

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos son indicadas usando abreviaturas de una o tres letras. A menos que se indique de otra manera, cada secuencia de polipéptido tiene extremo amino a la izquierda y un extremo carboxi a la derecha; cada secuencia de ácido nucleico de filamento simple, y el filamento superior de cada secuencia de ácido nucleico de filamento doble tiene un extremo 5’ a la izquierda y un extremo 3’ a la derecha. Una secuencia de polipéptido o polinucleótido particular también puede describirse al explicar cómo difiere de una secuencia de referencia.

A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y téenicos usados en conexión con la presente invención tendrán los significados que son entendidos comúnmente por aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos singulares deberán incluir pluralidades y términos plurales deberán incluir el singular. En general, las nomenclaturas usadas en conexión con, y técnicas de, cultivo celular y de tejido, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de ácido nucleico y proteína e hibridación descritas en la presente son aquéllas bien conocidas y comúnmente usadas en la teenica. Los métodos y técnicas de la presente invención son realizados en general de acuerdo con los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que son citadas y discutidas a través de la presente especificación a menos que se indique de otra manera. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular), Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un manual de laboratorio), Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1990), los cuales son incorporados en la presente por referencia. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación son realizadas de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes, como es logrado comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. La terminología usada en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquéllas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Técnicas estándares pueden ser usadas para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y entrega, y tratamiento de pacientes.

Los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, deberán ser entendidos para tener los siguientes significados: El término “molécula aislada” (donde la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo) es una molécula que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no está asociada con componentes naturalmente asociados que la acompañan en su estado natural, (2) está substancialmente libre de otras moléculas de la misma especie (3) es expresada por una célula a partir de una especie diferente, o (4) no ocurren por naturaleza sin intervención humana. Así, una molécula que es químicamente sintetizada, o sintetizada en un sistema celular diferente de la célula a partir de la cual se origina de manera natural, será “aislada” de sus componentes asociados de manera natural. Una molécula también puede hacerse substancialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante aislamiento, usando téenicas de purificación bien conocidas en la técnica. La pureza de molécula u homogeneidad puede ser ensayada por una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede ensayarse usando electroforesis de gel de poliacrilamida y manchado del gel para visualizar el polipéptido usando técnicas bien conocidas en el área. Para ciertos propósitos, mayor resolución puede ser provista al usar HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación.

Los términos “inhibidor alfa4-beta7” y “antagonista alfa4beta7” son usados de manera intercambiable. Cada uno es una molécula que inhibe de manera detectable al menos una función de alfa4beta7. De manera contraria, un “agonista alfa4beta7” es una molécula que aumenta de manera detectable al menos una función de alfa4beta7. La inhibición provocada por un inhibidor alfa4beta7 no necesita estar completas siempre y cuando sea detectable, por ejemplo, al usar un ensayo. Cualquier ensayo de una función de alfa4beta7 puede usarse, ejemplos de los cuales se proporcionan en la presente. Ejemplos de funciones de alfa4beta7 que pueden inhibirse por un inhibidor alfa4beta7 (o incrementado por un agonista alfa4beta7) incluyen unión de ligando (es decir, unión a MAdCAM-1), adhesión a celulas que expresan ligando, tráfico a un compartimiento particular, tal como el intestino, liberación de citocinas, quimiocinas y otros mediadores, intensificar o exacerbar la respuesta inflamatoria y daño de tejido, y así sucesivamente. Ejemplos de tipos de inhibidores alfa4beta7 y agonistas alfa4beta7 incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de unión alfa4beta7, tales como proteínas de unión de antígeno (por ejemplo, proteínas de unión de antígeno alfa4beta7), anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo.

Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína" se refieren cada uno a una molécula comprendiendo dos residuos de aminoácidos unidos unos a otros mediante enlaces de péptido. Estos términos abarcan, por ejemplo, proteínas naturales y artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido (tales como muteínas, variantes y proteínas de fusión) de una secuencia de proteínas así como proteínas modificadas post-traslacionalmente, o de otra manera covalente o no covalentemente. Un péptido, polipéptido o proteína puede ser monomérico o polimérico.

El término “fragmento de polipéptido” como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino-terminal y/o carboxi-terminal como se compara con una proteína de longitud completa correspondiente. Los fragmentos pueden ser, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también pueden ser, por ejemplo, cuando mucho 1 ,000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también pueden resultar de procesamiento proteolítico (u otro), el cual, por ejemplo, resulta en variación en el extremo amino y/o carboxi de uno a cinco aminoácidos de lo predicho. Un fragmento puede comprender además, en cualquiera o ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína que ocurre de manera natural diferente (por ejemplo, un dominio de cierre de leucina o Fe) o una secuencia de aminoácidos artificiales (por ejemplo, una secuencia de enlazador artificial o una proteína tag).

Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que han sido modificados en cualquier forma y por cualquier razón, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducir la susceptibilidad a oxidación, (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alterar las afinidades de unión, y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, substituciones de aminoácidos simples o múltiples (por ejemplo, substituciones de aminoácido conservador) pueden hacerse en la secuencia que ocurre de manera natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido fuera del o los dominios que forman contactos intermoleculares). Las secuencias de consenso pueden ser usadas para seleccionar residuos de aminoácidos para substitución; aquéllos de habilidad en la téenica reconocen que los residuos de aminoácidos adicionales también pueden ser substituidos.

Una “substitución de aminoácido conservador” es una que no cambia substancialmente las características estructurales de la secuencia madre (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia madre, o romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia madre o son necesarios para su funcionalidad). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos son descritas en Proteins, Structures and Molecular Principies (Proteínas, Estructuras y Principios moleculares) (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (Introducción a la estructura de proteínas) (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991 )); y Thornton et al., Nature 354:105 (1991 ), los cuales son incorporados en la presente por referencia.

La presente invención también proporciona análogos de péptido de polipéptidos de unión alfa4beta7. Los análogos no de péptido son comúnmente usados en la industria farmacéutica como medicamentos con propiedades análogas a aquéllas del péptido de plantilla. Estos tipos de compuesto no de péptido son llamados “imitadores de péptido" o “peptidoimitadores”, ver, por ejemplo, Faucher, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al. J.

Med. Chem. 30:1229 (1987), los cuales son incorporados en la presente por referencia. Los imitadores de peptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden ser usados para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidoimitadores son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: — CH2NH— , — CH2S— , — CH2— CH2— , — CH=CH— (cis y trans), — COCH2 — , — CH(OH)CH2— y — CH2SO— , mediante métodos bien conocidos en la téenica. La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también pueden usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos comprendiendo una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso substancialmente idéntica pueden generarse mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992), incorporados en la presente por referencia), por ejemplo, al adicionar residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares los cuales cielizan el péptido.

Una “variante” de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos son insertados en, suprimidos de y/o substituidos en la secuencia de aminoácidos en relación a otra secuencia de polipéptido.

Las variantes de la invención incluyen proteínas de fusión.

Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que ha sido modificado químicamente, por ejemplo, vía conjugación a otra porción química (tal como, por ejemplo, polietilenglicol o albúmina, por ejemplo, albúmina de suero humano), fosforilación y/o glicosilación. A menos que se indique de otra manera, el término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos comprendiendo dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, ejemplos de los cuales se describen a continuación.

Una “proteína de unión de antígeno” es una proteína que comprende una porción que se une a un antígeno y, de manera opcional, una porción de marco de trabajo o andamio que permite que la porción de unión a antígeno adopte una conformación que promueva la unión de la proteína de unión a antígeno al antígeno. Ejemplos de proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, una porción de unión de antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpos y análogos de anticuerpos. La proteína de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un andamio de proteína alternativo o andamio artificial con CDRs o derivados de CDR injertados. Tales andamios incluyen, pero no están limitados a, andamios derivados de anticuerpos comprendiendo mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión de antígeno así como andamios completamente sintéticos comprendiendo, por ejemplo, un polímero biocompatible, ver, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Biomformatics (Proteínas: estructura, función y bioinformática), volumen 53, Emisión 1 :121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Además, los imitadores de anticuerpo de péptido (“PAMs”) pueden usarse, así como andamios basados en imitadores de anticuerpos que utilizan componentes de fibronección como un andamio.

Una proteína de unión de antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina que ocurre de manera natural. Una “inmunoglobulina” es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina que ocurre de manera natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada" (aproximadamente 50-70kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 hasta 110 o más aminoácidos principalmente responsables para reconocimiento de antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de función de efector. Las cadenas ligeras humanas son clasificadas como cadenas ligeras kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes son unidas por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyendo una región “D” de aproximadamente 10 más aminoácidos. Ver de manera general, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión de anticuerpo, de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las regiones variables de cadenas de inmunoglobulina que ocurren de manera natural exhiben la misma estructura general de regiones de marco de trabajo conservadas de manera relativa (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementaridad o CDRs. A partir del extremo N a extremo C, tanto las cadenas pesadas como ligeras comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico), 5a ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, N1H, N1H Publication no. 91 -3242, 1991. Otros sistemas de numeración para los aminoácidos en cadenas de inmunoglobulinas incluyen IMGT® (el sistema de información ImMunoGeneTics internacional; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) y AHo (Honegger y Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-670; 2001).

Los anticuerpos pueden ser obtenidos a partir de fuentes tales como suero o plasma que contienen inmunoglobulinas teniendo especificidad antigénica variada. Si tales anticuerpos son sometidos a purificación por afinidad, pueden ser enriquecidos para una especificidad antigénica particular. Tales preparaciones enriquecidas de anticuerpos usualmente se hacen de menos de aproximadamente 10% de anticuerpo teniendo actividad de unión específica para el antígeno particular. Someter estas preparaciones a varias rondas de purificación por afinidad puede aumentar la proporción de anticuerpo teniendo actividad de unión específica para el antígeno. Los anticuerpos preparados en esta manera son frecuentemente referidos como “monoespecíficos”. Las preparaciones de anticuerpos monoespecíficos pueden hacerse de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 99.9% de anticuerpo teniendo actividad de unión específica para el antigeno particular.

Un “anticuerpos” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión de antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto para unión específica, a menos que se especifique de otra manera. Las porciones de unión a antígeno pueden ser producidas mediante teenicas de DNA recombinante o mediante corte enzimático o químico de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, Ínter alia, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs) y fragmentos de región determinante de complementaridad (CDR), fragmentos de región variable, anticuerpos de cadena simple (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente teniendo los dominios VL, VH, CL y CH1 ; un fragmento F(ab’)2 es un fragmento bivalente teniendo dos fragmentos Fab enlazados a un puente disulfuro en la región de gozne; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL o un fragmento de unión a antígeno de un dominio VH o VL (patente estadounidense no. 6,846,634, 6,696,245, publicación de solicitud estadounidense no. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291 , 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341 :544-546, 1989).

Un anticuerpo de cadena simple (scFv) es un anticuerpo en el cual una región de VL y VH se unen vía un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena de proteína continua en donde el enlazador es suficientemente largo para permitir que la cadena de proteína se doble nuevamente sobre sí misma y forme un sitio de unión de antígeno monovalente (ver, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-26 y Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. US 85:5879-83. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes comprendiendo dos cadenas de polipéptidos, en donde cada cadena de polipéptidos comprende dominios VH y VL unidos por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejado entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario sobre otra cadena de polipéptido (ver, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. US 90:6444-48 y Poljak et al., 1994, Structure 2:1 121-23). Si las dos cadenas de polipéptidos de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejado tendrán dos sitios de unión a antígeno idénticas. Las cadenas de polipéptidos teniendo diferentes secuencias pueden ser usadas para hacer un diacuerpo con dos sitios de unión de antígeno diferentes. De manera similar, los triacuerpos y tetracuerpos son anticuerpos comprendiendo tres y cuatro cadenas de polipéptidos, respectivamente y formando tres y cuatro sitios de unión de antígeno, respectivamente, los cuales pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) y regiones de marco de trabajo (FR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. supra; Lefranc et al., supra y/o Honegger y Pluckthun, supra. Una o más CDRs pueden incorporarse en una molécula ya sea de manera covalente o no covalente para hacerla una proteína de unión a antígeno. Una proteína de unión a antígeno puede incorporar la o las CDRs como parte de una cadena de polipéptido mayor, puede enlazar la o las CDRs a otra cadena de polipéptido, o puede incorporar la o las CDRs de manera no covalente. Las CDRs permiten que la proteína de unión a antígeno se una específicamente a un antígeno de interés particular.

Una proteína de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos unos a otros o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana que ocurre de manera natural normalmente tiene dos sitios de unión idéntica, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene dos sitios de unión diferentes.

El término “anticuerpo humano” incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. En una modalidad, todos los dominios variables y constantes son derivados de secuencias de inmunoglobulinas humanas (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden ser preparados en una variedad de formas, ejemplos de los cuales se describen más adelante, incluyendo a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que es genéticamente modificado para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican cadena pesada y/o ligera humanos.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o más substituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos, de manera que el anticuerpo humanizado es menos probable para inducir una respuesta inmune, y/o induce una respuesta inmune menos severa, como se compara con el anticuerpo de especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una modalidad, ciertos aminoácidos en el marco de trabajo y dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo de especie no humana son mutados para producir el anticuerpo humanizado. En otra modalidad, el o los dominios constantes de un anticuerpo humano son fusionados al o a los dominios variables de una especie no humana. En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácidos en una o más secuencias de CER de un anticuerpo no humano son cambiados para reducir la probable inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los residuos de aminoácidos cambiados ya sea no son críticos para unión inmunoespecífica dei anticuerpo a su antígeno, o los cambios a la secuencia de aminoácidos que se hacen son cambios conservadores, de manera que la unión del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano al antigeno. Ejemplos de cómo hacer anticuerpos humanizados pueden encontrarse en las patentes estadounidenses nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293.

El termino “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos diferentes. En una modalidad, una o más de las CDRs son derivadas de un anticuerpo anti-alfa4beta7 humano. En otra modalidad, todas las CDRs son derivadas de un anticuerpo anti-aifa4beta7 humano. En otra modalidad, las CDRs de más de un anticuerpo anti-alfa4beta7 humano se mezclan e igualan en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-alfa4beta7 humano, una CDR2 y una CDR3 a partir de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-alfa4beta7 humano y las CDRs de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-alfa4beta7. Otras combinaciones son posibles y se incluyen dentro de las modalidades de la invención.

Adicionalmente, las regiones de marco de trabajo pueden ser derivadas de uno de los mismos anticuerpos anti-alfa4beta7, a partir de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, homologa a, o derivada de un anticuerpo de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas a, homologas a o derivadas de un anticuerpo(s) de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de tales anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada (es decir, la capacidad para unir específicamente alfa4beta7). Ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 4,816,567 y Morrison, 1985, Science 229: 1202-07.

Un “anticuerpo neutralizante” o un “anticuerpo inhibitorio" es un anticuerpo que inhibe la interacción de alfa4beta7 con MAdCAM-1 , cuando un exceso del anticuerpo anti-alfa4beta7 reduce la cantidad de interacción por al menos aproximadamente 20% usando un ensayo, tal como aquéllos descritos en la presente en los Ejemplos. En varias modalidades, la proteína de unión a antígeno reduce la interacción de alfa4beta7 con MAdCAM-1 alfa4beta7 por al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95&, 97%, 99% y 99.9%.

Los fragmentos o análogos de anticuerpos pueden prepararse fácilmente por aquéllos de habilidad ordinaria en la téenica siguiendo las enseñanzas de esta especificación y usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los extremos amino y carboxi de fragmentos o análogos ocurren cerca de los límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados por comparación de los datos de secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos a bases de datos de secuencias públicas o propietarias. Los métodos de comparación computarizados pueden usarse para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína predichos que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se doblan en una estructura tridimensional conocida. Ver, por ejemplo, Bowie et al., 1991 , Science 253:164.

Un “anticuerpo injertado con CDR” es un anticuerpo comprendiendo una o más CDRs derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y el marco de trabajo de otro anticuerpo de especie o isotipo igual o diferente.

Un “anticuerpo multi-específico” es un anticuerpo que reconoce más de un epitope sobre uno o más antígenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un “anticuerpo bi-específico”, el cual reconoce dos epitopes distintos en los mismos o diferentes antígenos.

Una proteína de unión a antígeno “se une específicamente” a un antígeno (por ejemplo, alfa4beta7 humano) si se une al antígeno con una constante de disociación de 1 nanomolar o menos. Como se usa en la presente, una proteína de unión a antígeno es “específica de heterodímero” si se une a una primera integrina heterodimérica pero no a otras integrinas que comparten una cadena con la primera integrina. Por ejemplo, un anticuerpo que es específica de heterodímero alfa4beta7 se unirá a alfa4beta7 pero no a alfa4beta1 o alfaEbeta7.

Las integrinas son conocidas por adaptarse a diferentes conformaciones, dependiendo del estado de activación de la o las células que las expresan y en la presencia o ausencia de ciertos iones de metal. Una integrina en conformación “activa” se une a su ligando cognado con mayor afinidad que la misma integrina en conformación “inactiva”. Una proteína de unión a antígeno puede unirse a una integrina en solo su conformación activa, en solo su conformación inactiva, o en ambas o cualquiera de las conformaciones. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 puede ligar a alfa4beta7 en la presencia o ausencia del catión divalente de manganeso2* (Mn2*), indicando que la proteína de unión a antígeno liga tanto alfa4beta7 activo como inactivo.

Un “dominio de unión a antígeno", “región de unión a antígeno” o “sitio de unión a antígeno” es una porción de una proteína de unión a antígeno que contiene residuos de aminoácidos (u otras porciones) que interactúan con un antígeno y contribuyen a la especificidad de proteína de unión a antígeno y afinidad por el antígeno. Para un anticuerpo que se une específicamente a su antígeno, esto incluirá al menos parte de al menos uno de sus dominios de CDR.

Un “epitope” es la porción de una molécula que se une por una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, por un anticuerpo). Un epitope puede comprender porciones no contiguas de la molécula (por ejemplo, en un polipéptido, residuos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria de polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, están los suficientemente cerca una de las otras para ligarse a una proteína de unión a antígeno).

El “porcentaje de identidad” de dos secuencias de polinucleótido o dos polipéptidos es determinado al comparar las secuencias usando el programa de computación GAP (una parte del GCG Wisconsin Package, versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando sus parámetros de error.

Los términos “polinucleótido”, “oligonucelótido” y “ácido nucleico" son usados de manera intercambiable a lo largo e incluyen moléculas de DNA (por ejemplo, cDNA o DNA genómico), moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA), análogos del DNA o RNA generados usando análogos de nucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido y análogos de nucleótidos que ocurren de manera no natural) e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser de filamento simple o filamento doble. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden un marco de lectura abierto contiguo que codifica un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo, de la invención.

Dos polinucleótidos de filamento simple son “el complemento” uno de otro si sus secuencias pueden ser alineadas en una orientación antiparalela, de manera que cada nucleótido en un polinucleótido está opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin la introducción de aberturas, y sin nucleótidos no emparejados en el extremo 5’ o 3’ de cualquier secuencia. Un polinucleótido es “complementario” a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridar a otro bajo condiciones moderadamente severas. De esta manera, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un “vector” es un ácido nucleico que puede ser usado para introducir otro ácido nucleico enlazado a el en una célula. Un tipo de vector es un “plásmido”, el cual se refiere a una molécula de DNA de doble filamento lineal o circular en la cual pueden ligarse segmentos de ácido nucleico adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados defectuosos de replicación), en donde pueden introducirse segmentos de DNA adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped, en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos comprendiendo un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) son integrados en el genoma de una célula huésped sobre introducción en la célula huésped, y por ello son replicados junto con el genoma huésped. Un “vector de expresión’’ es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido elegido.

Una secuencia de nucleótido es “enlazada de manera operable” a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora afecta la expresión (por ejemplo, el nivel, sincronización o ubicación de expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una “secuencia reguladora” es un ácido nucleico que afecta la expresión (por ejemplo, el nivel, sincronización o ubicación de expresión) de un ácido nucleico al cual está operablemente enlazado. La secuencia reguladora puede ejercer, por ejemplo, sus efectos directamente sobre el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más moléculas diferentes (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o el ácido nucleico). Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Ejemplos adicionales de secuencias reguladoras son descritos en, por ejemplo, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Teenología de expresión de genes: metodos en enzimologia) 185, Academic Press, San Diego, CA y Barón et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.

Una “célula huésped” es una célula que puede ser usada para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. Una célula huésped puede ser un procariote, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariote, por ejemplo, un eucariote de célula simple (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula vegetal (por ejemplo, célula de planta de tomate o tabaco), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Ejemplos de células huésped incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (ver Gluzman et al., 1981 , Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados tales como Veggie CHO y líneas de células relacionadas las cuales crecen en medios libres de suero (ver Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31 ) o CHO cepa DX-B11 , la cual es deficiente en DHFR (ver Urlaub et al., 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. US 77:4216-20), células HeLa, líneas de células BHK (ATCC CRL 10), línea de células CV1/EBNA derivada de la línea de celulas de riñón de monoverde africano CV1 (ATCC CCL 70) (ver McMahan et al, 1990, EMBO J. 10:2821), células de riñón embriónico humano, tales como 293, 293 EBNA o SR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, otras líneas de células de primate transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantas primarias, HL-60, U937, HaK o Jurkat. Normalmente, una célula huésped es una célula cultivada que puede ser transformada o transfectada con un ácido nucleico de codificación de polipéptido, la cual puede ser expresada en la célula huésped. La frase “célula huésped recombinante” puede usarse para denotar una célula huésped que ha sido transformada o transfectada con un ácido nucleico a ser expresado. Una célula huésped también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico pero no lo expresa a un nivel deseado a menos que una secuencia reguladora sea introducida en la célula huésped, de manera que se vuelva enlazada operablemente con el ácido nucleico. Se entiende que el término célula huésped se refiere no solo a la célula en cuestión particular, sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesoras debido a, por ejemplo, mutación o influencia ambiental, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula madre, pero todas están incluidas todavía dentro del alcance del término como se usa en la presente.

Proteínas de unión a antígeno En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, muteinas de anticuerpos y variantes de anticuerpos) que se unen a alfa4beta7, por ejemplo, alfa4beta7 humano.

Las proteínas de unión a antígeno de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas de unión a antígeno que inhiben una actividad biológica de alfa4beta7. Ejemplos de tales actividades biológicas incluyen unión de alfa4beta7 a MAdCAM-1 , y adhesión entre células que expresan alfa4beta7 y aquéllas que expresan MAdCAM-1. Otras actividades biológicas incluyen aquéllas medidas por alfa4beta7 in vivo, tal como tráfico o guía a casa; en particular, alfa4beta7 está involucrado en el tráfico de linfocitos al intestino. La expresión de MAdCAM-1 incrementada en el intestino inflamado intensifica el reclutamiento de linfocitos que expresan alfa4beta7 al intestino, donde la activación de linfocitos aberrante aumenta la respuesta inflamatoria y daño de tejido.

Diferentes proteínas de unión a antígeno pueden unirse a diferentes dominios o epitopes de alfa4beta7 o actúan mediante mecanismos de acción diferentes. Ejemplos incluyen pero no están limitados a proteínas de unión que interfieren con la capacidad de alfa4beta7 a unir MAdCAM-1 o que inhiben las interacciones celulares tales como adhesión entre las células que expresan alfa4beta7 y las células que expresan MAdCAM-1. El sitio de acción puede ser, por ejemplo, intracelular (por ejemplo, al interferir con una cascada de señalización intracelular) o extracelular. Una proteína de unión a antígeno no necesita inhibir completamente la actividad inducida por alfa4beta7 para encontrar uso en la presente invención; en su lugar, las proteínas de unión a antígeno que reducen una actividad de alfa4beta7 particular son contempladas tambien para uso. (Discusiones en la presente de mecanismos particulares de acción para proteínas de unión a antígeno de unión a alfa4beta7 para tratar enfermedades particulares son ilustrativas solamente y los métodos presentados en la presente no están ligados por ello).

Otros derivados de anticuerpos anti-alfa4beta7 dentro del alcance de esta invención incluyen conjugados covalentes o agregados de anticuerpos anti-alfa4beta7, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante expresión de proteínas de fusión recombinante comprendiendo polipéptidos heterólogos fusionados al extremo N o extremo C de un polipéptido de anticuerpo anti-alfa4beta7. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal (o líder) heterólogo, por ejemplo, el líder de factor alfa de levadura, o un péptido tal como una etiqueta de epitope. Proteínas de fusión conteniendo proteína de unión a antígeno pueden comprender péptidos adicionados para facilitar la purificación o identificación de proteína de unión a antígeno (por ejemplo, poli-His). Una proteína de unión a antígeno también puede ser enlazada al péptido FLAG® ASp-Tyr-Lys-Asp-Aps-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:62) como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1998 y patente estadounidense 5,011 ,912. El péptido FLAG® es altamente antigénico y proporciona un epitope reversiblemente unido por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), permitiendo un rápido ensayo y fácil purificación de proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar proteínas de fusión, en los cuales el peptido FLAG® es fusionado a un polipéptido dado están comercialmente disponibles (Sigma-Aldrich, St. Louis MO).

Los oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a antígeno pueden emplearse como antagonistas alfa4beta7. Los oligómeros pueden estar en la forma de dímeros, trímeros u oligómeros mayores enlazados covalentemente o enlazados no covalentemente. Los oligómeros comprendiendo dos o más proteínas de unión a antígeno son contemplados para uso, con un ejemplo siendo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

. Una modalidad es dirigida a oligómeros comprendiendo múltiples proteínas de unión a antígeno unidas vía interacciones covalentes o no covalentes entre porciones de péptidos fusionadas a las proteínas de unión a antígeno. Tales péptidos pueden ser enlazadores de péptido (separadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los cierres de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligermización de proteínas de antígeno unidas a ellos, como se describe con más detalle más adelante.

En modalidades particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro proteínas de unión a antígeno. Las proteínas de unión a antígeno del oligómero pueden estar en cualquier forma, tal como cualquiera de las formas descritas antes, por ejemplo, variantes o fragmentos. De preferencia, los oligómeros comprenden proteínas de unión a antígeno que tienen actividad de unión de alfa4beta7.

En una modalidad, un oligómero es preparado usando polipeptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión comprendiendo ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fe) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991 , PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 (“Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins" (Construcción de proteínas de fusión de inmunoglobulina), en Current Protocols in lmmunology, Sup. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11.

Una modalidad de la presente invención se dirige a un dímero comprendiendo dos proteínas de fusión creadas al fusionar un fragmento de unión a alfa4beta7 de un anticuerpo anti-alfa4beta7 a la región Fe de un anticuerpo. El dímero puede hacerse al insertar, por ejemplo, una fusión de gene que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión de gene en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y permitiendo que la proteína de fusión expresada se asemeje mucho como moléculas de anticuerpo, sobre lo cual enlaces disulfuro intercadena se forman entre las porciones de Fe para producir el dímero.

El término “polipéptido” Fe” como se usa en la presente incluye formas naturales y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fe de un anticuerpo. Las formas truncadas de tales polipéptidos conteniendo la región de gozne que promueve la dimerización tambien son incluidas. Las proteínas de fusión comprendiendo las porciones de Fe (y oligómeros formados a partir de ellas) ofrecen la ventaja de fácil purificación mediante cromatografía por afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido de Fe adecuado, descrito en la solicitud de PCT WO 93/10151 (incorporada aquí por referencia), es un polipéptido de cadena simple que se extiende desde la región de gozne N-terminal al extremo C natural de la región de Fe de un anticuerpo lgG1 humano. Otro polipéptido de Fe útil es la muteína de Fe descrita en la patente estadounidense 5,457,035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a aquélla de la secuencia de Fe natural presentada en WO 93/10151 , excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para receptores de Fe.

En otras modalidades, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo anti-alfa4beta7 puede ser substituida por la porción variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

De manera alternativa, el oligómero es una proteína de fusión comprendiendo múltiples proteínas de unión a antígeno, con o sin enlazadores de péptido (péptidos separadores). Entre los enlazadores de péptido adecuados se encuentran aquéllos descritos en las patentes estadounidenses 4,751 ,180 y 4,935,233.

Otro metodo para preparar proteínas de unión a antígeno oligoméricas involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios de cierre de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Los cierres de leucina son identificados de manera original en varias proteínas de unión a DNA (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759) y han sido encontrados en una variedad de proteínas diferentes. Entre los cierres de leucina conocidos se encuentran los péptidos que ocurren de manera natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Ejemplos de dominios de cierre de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles son descritos en la solicitud de PCT WO 94/10308 y el cierre de leucina derivado de proteína surfactante de pulmón D (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191 , incorporada aquí por referencia. El uso de un cierre de leucina modificado que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En una aproximación, las proteínas de fusión recombinantes comprendiendo un fragmento de anticuerpo anti-alfa4beta7 o derivado fusionado a un péptido de cierre de leucina son expresados en células huésped adecuadas, y los fragmentos de anticuerpos anti-alfa4beta7 oligoméricos solubles o derivados de los mismos que forman son recuperados a partir del sobrenadante de cultivo.

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno que interfieren con la unión de alfa4beta7 a MAdCAM- 1. Tales proteínas de unión a antígeno pueden hacerse contra alfa4beta7, o un fragmento, variante o derivado de la misma, y son clasificados en ensayos convencionales para la capacidad de interferir con la unión de alfa4beta7 a MAdCAM-1. Ejemplos de ensayos adecuados son ensayos que prueban las proteínas de unión a antígeno para la capacidad de inhibir la unión de MAdCAM-1 (es decir, MAdCAM-1 soluble) a células que expresan alfa4beta7, o que prueban proteínas de unión a antígeno para la capacidad para reducir una respuesta biológica o celular que resulta de la interacción de MAdCAM-1 y alfa4beta7 (es decir, la adhesión de células que expresan alfa4beta7 a MAdCAM-1 o células que expresan MAdCAM-1 ). Ensayos adicionales que prueban las proteínas de unión a antígeno incluyen aquéllas que comparan cualitativa o cuantitativamente la unión de una proteína de unión a antígeno a un polipéptido alfa4beta7 a la unión de una proteína de unión a antígeno conocida a un polipéptido alfa4beta7, varios ejemplos de los cuales son descritos en la presente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que demuestra selectividad de especies. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno se une a un alfa4beta7 de mamífero, por ejemplo, a alfa4beta7 humano y uno o más de alfa4beta7 de ratón, rata, conejillo de Indias, hámster, gerbo, gato, conejo, perro, cabra, borrego, vaca, caballo, camello y primate no humano. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno se une a uno o más alfa4beta7 de primate, por ejemplo, a alfa4beta7 humano y no o más de alfa4beta7 de cinomólogo, tití, Rhesus, tamarino o chimpancé. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a alfa4beta7 de humano, cinomólogo, tití, Rhesus, tamarino o chimpance. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno no se une a uno o más de alfa4beta7 de ratón, rata, conejillo de Indias, hámster, gerbo, gato, conejo, perro, cabra, borrego, vaca, caballo, camello y primate no humano. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno no se une a una especie de mono del Nuevo Mundo, tal como un tití.

En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno no exhibe unión específica a cualquier proteína que ocurre de manera natural diferente de alfa4beta7. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno no exhibe unión específica a alguna proteína que ocurre de manera natural diferente de alfa4beta7 de mamífero. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno no exhibe unión específica a alguna proteína que ocurre de manera natural diferente de alfa4beta7 de primate. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno no exhibe unión específica a alguna proteína que ocurre de manera natural diferente de alfa4beta7 humano. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a alfa4beta7 de al menos un primate no humano, por ejemplo, mono cinomólogo, y alfa4beta7 humano. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno se une específicamente a primate no humano, mono cinomólogo y alfa4beta7 humano con una afinidad de unión similar. En otra modalidad, la proteína de unión de antígeno bloquea una actividad de alfa4beta7 de primate no humano, mono cinomólogo y humano. En otra modalidad, la proteína de unión de antígeno tiene una IC50 o EC50 similar contra alfa4beta7 de primate no humano, mono cinomólogo y humano en un ensayo como se describe en la presente.

Uno puede determinar la selectividad de una proteína de unión a antígeno para una alfa4beta7 usando metodos bien conocidos en la téenica y siguiendo las enseñanzas de la especificación. Por ejemplo, uno puede determinar la selectividad usando Western blot, FACS, ELISA o RIA.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno de unión alfa4beta7 (por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa4beta7), que tiene una o más de las siguientes características: se une tanto a alfa4beta7 de humano y primate no humano, inhibiendo la unión de MAdCAM-1 a alfa4beta7, inhibe la adhesión de células que expresan alfa4beta7 a MAdCAM-1 , inhibe la adhesión de células que expresan alfa4beta7 a células que expresan MAdCAM-1 , inhibe el tráfico de células que expresan alfa4beta7 a tejidos comprendiendo células que expresan MAdCAM-1 , se une tanto a formas activas como inactivas de alfa4beta7, provoca relativamente poca sub-regulación de alfa4beta7 expresada en superficie celular.

Fragmentos de unión a antígeno de proteínas de unión a antígeno de la invención pueden producirse mediante técnicas convencionales. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fab y F(ab’)2. Los fragmentos de anticuerpo y derivados producidos mediante técnicas de ingeniería genética también son contemplados.

Modalidades adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, de murino). Tales anticuerpos humanizados pueden ser preparados mediante téenicas conocidas, y ofrecen la ventaja de in unogenicidad reducida cuando los anticuerpos son administrados a humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo de murino (o todo o parte del sitio de unión a antígeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. De manera alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal de murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y diseñados adicionalmente incluyen aquéllos descritos en Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. US 84:3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934 y Winter et al., 1993, TIPS 14:139. En una modalidad, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo injertado con CDR. Las técnicas para humanizar anticuerpos son descritas en, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense no. 10/194,975 (publicada el 27 de febrero de 2003). Las patentes estadounidenses nos 5,869,619, 5,225,539, 5,821 ,337, 5,859,205, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39 y Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41.

Los procedimientos han sido desarrollados para generar anticuerpos humanos o parcialmente humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se ha preparado ratones en los cuales uno o más genes de ¡nmunoglobulina endógena han sido activados por varios medios. Los genes de ¡nmunoglobulina humana han sido introducidos en ratones para reemplazar los genes de ratón inactivados. Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas de polipeptido de ¡nmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. En una modalidad, un animal no humano, tal como un ratón transgénico, es inmunizado con un polipéptido alfa4beta7, de manera que los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido alfa4beta7 son generados en el animal. Un ejemplo de un inmunógeno adecuado es un alfa4beta7 humano soluble, tal ocmo un polipéptido comprendiendo una porción de alfa4beta7, u otro fragmento inmunogénico afla4beta7. Otro ejemplo de un inmunógeno adecuado es un alfa4beta7 humano soluble, tal como un polipéptido comprendiendo una porción de alfa4beta7, u otro fragmento inmunogénico alfa4beta7. Otro ejemplo de un inmunógeno adecuado son células que expresan altos niveles de alfa4beta7, o preparaciones de membrana celular a partir del mismo.

Ejemplos de téenicas para la producción y uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las patentes estadounidense 5,814,318, 5,569,825 y 5,545,806, Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice (Producción de anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos) en Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols (Ingeniería de anticuerpos: Métodos y protocolos), Humana Press, NJ:191-200, Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820- 26, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40, Davis et al., 1999, Cáncer Metástasis Rev. 18:421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231 :11-23, Jakobovits, 1998, Adv Drug Deliv Rev 31 :33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs, 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics 42:413-21 , Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15: 146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1 :247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21 , Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58, Jakobovits et al, 1993, Proc Nati Acad Sci US 90:2551 -55. Chen, J. et al., 1993, Int Immunol 5: 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol 14: 845-51 , Harding eta I., 1995, Ann NY Acad Sci, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies (Aproximaciones transgénicas a anticuerpos monoclonales humanos) en Handbook of Experimental Pharmacology (Manual de farmacología experimental) 113: 49-101 , Lonberg et al., 1995, Inte Rev Immunol 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nat Biotechnol 14: 826, Taylor et al., 192, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, Int Immunol 6: 579-91 , Tomizuka et al., 1997, Nat Gen 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proc Nati Acad Sci US. 97: 722-27, Tuaillon et al., 1993, Proc Nati Acad Sci US. 90: 3720-24 y Tuaillon et al., 1994, J Immunol 152: 2912-20. Estos y otros ejemplos también son discutidos en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2007-0098715, publicada el 3 de mayo de 2007.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a alfa4beta7. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos usando cualquier téenica conocida en la técnica, por ejemplo, al inmortalizar células de bazo recolectadas del animal transgénico después de la terminación del programa de inmunización. Las células de bazo pueden ser inmortalizadas usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, al fusionarlas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para usarse en procedimientos de fusión productores de hibridoma de preferencia son no productoras de anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos, los cuales soportan el crecimiento de solo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Ejemplos de líneas de células adecuadas para usarse en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4 1 , Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11 , MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; ejemplos de líneas de células usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas de células útiles para fusiones de células son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En una modalidad, una línea de células de hibridoma es producida al inmunizar un animal (por ejemplo, un animal transgénico teniendo secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno de alfa4beta7; recolectar células de bazo del animal inmunizado; fusionar las células de bazo recolectadas a una línea de células de mieloma, generando por ello células de hibridoma; establecer líneas de células de hibridoma a partir de las células de hibridoma, e identificar una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipéptido alfa4beta7. Tales líneas de células de hibridoma y anticuerpos monoclonales anti-alfa4beta7 producidos por ellos, son abarcadas por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea de células de hibridoma pueden purificarse usando cualquier téenica conocida en la técnica. Los hibridomas o mAbs pueden clasificarse adicionalmente para identificar mAbs con propiedades particulares, tales como la capacidad para bloquear una actividad inducida por alfa4beta7.

Ejemplos de tales clasificaciones son provistos en los ejemplos más adelante.

Los anticuerpos monoclonales también pueden ser producidos usando un proceso referido como inmunización genética. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el antígeno de interés puede ser incorporado en un vector viral (tal como un vector adenoviral). El vector resultante es usado entonces para desarrollar una respuesta inmune contra el antígeno de interés en un animal huésped adecuado (por ejemplo, un ratón diabético no obeso, o NOD). Esta técnica es substancialmente descrita por Ritter et al, Biodrugs16(1): 3 - 10 (2002), cuya descripción es incorporada por referencia en la presente.

La evolución de las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) en el dentro del sitio de unión de anticuerpos también ha sido usada para aislar anticuerpos con afinidad incrementada, por ejemplo, anticuerpos teniendo afinidad incrementada para c-erbB-2, como se describe por Schier et al., 1996, J: Mol. Biol. 263:551. De acuerdo con esto, tales téenicas son útiles para preparar anticuerpos para alfa4beta7.

Las proteínas de unión a antígeno dirigidas contra un alfa4beta7 pueden ser usadas, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos alfa4beta7 o células que expresan alfa4beta7, ya sea in vitro o in vivo. Las proteínas de unión a antígeno también pueden ser empleadas para purificar proteínas alfa4beta7 mediante cromatografía por inmunoafinidad. Aquéllas proteínas de unión a antígeno que pueden bloquear adicionalmente la interacción de MAdCAM-1 y alfa4beta7 pueden usarse para inhibir una actividad biológica que resulta de tal interacción. Proteínas de unión a antígeno de bloque puede usarse en métodos de la presente invención. Tales proteínas de unión a antígeno que funcionan como antagonistas de alfa4beta7 pueden emplearse para tratar cualquier condición inducida por alfa4beta7, incluyendo pero no limitando a condiciones inflamatorias. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal anti-alfa4beta7 humano generado por procedimientos que involucra la inmunización de ratones transgénicos es empleado para tratar tales condiciones.

Las proteínas de unión a antígeno pueden emplearse en un procedimiento in vitro, o administradas in vivo para inhibir una actividad biológica inducida por alfa4beta7. Los desórdenes provocados o exacerbados (directa o indirectamente) por alfa4beta7 y su interacción con MAdCAM-1 , ejemplos de los cuales son provistos en la presente, pueden ser tratados de esta manera. En una modalidad, la presente invención proporciona un método terapéutico que comprende administración in vivo de una proteína de unión a antígeno de bloqueo de alfa4beta7 a un mamífero en necesidad del mismo en una cantidad efectiva para reducir la actividad biológica inducida por alfa4beta7.

Las proteínas de unión a antígeno de la invención incluyen anticuerpos monoclonales parcialmente humanos y completamente humanos que inhiben una actividad biológica de alfa4beta7. Una modalidad es dirigida a un anticuerpo monoclonal humano que al menos bloquea parcialmente la interacción de alfa4beta7 humano con MAdCAM-1. En una modalidad, los anticuerpos son generados al inmunizar un ratón transgenico con un inmunógeno alfa4beta7. En otra modalidad, el inmunógeno es un polipéptido alfa4beta7 humano (por ejemplo, una célula transformada o transfectada para expresar alfa4beta7, o una célula que expresa de manera natural alfa4beta7). Las líneas de células de hibridoma derivadas de tal ratón inmunizado, en donde el hibridoma secreta un anticuerpo monoclonal que liga alfa4beta7, también son provistas en la presente.

Aunque los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados serán adecuados para muchas aplicaciones, en particular aquéllas que involucran la administración del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de proteínas de unión a antígeno serán adecuadas para ciertas aplicaciones. Los anticuerpos no humanos de la invención pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal productor de anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro o primate no humano (tal como mono (por ejemplo, mono cinomólogo o Rhesus) o simio (por ejemplo, chimpancé)). Anticuerpos no humanos de la invención pueden ser usados, por ejemplo, en aplicaciones basadas en cultivo celular e in vitro, o cualquier otra aplicación donde una repuesta inmune al anticuerpo de la invención no ocurre, es insignificante, puede ser prevenida, no es una preocupación o es deseada. En una modalidad, un anticuerpo no humano de la invención es administrado a un sujeto no humano. En otra modalidad, el anticuerpo no humano no provoca una respuesta inmune en el sujeto no humano. En otra modalidad, el anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón de la invención es administrado a un ratón. Un anticuerpo de una especie particular puede hacerse al, por ejemplo, inmunizar un animal de esa especie con el inmunógeno deseado (por ejemplo, células que expresan alfa4beta7, o un polipéptido alfa4beta7 soluble) o usar un sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (por ejemplo, un sistema basado en exhibición de fago o bacteriana para generar anticuerpos de una especie particular), o al convertir un anticuerpo de una especie en un anticuerpo a partir de otra especie al reemplazar, por ejemplo, la región constante del anticuerpo con una región constante de la otra especie, o al reemplazar uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo de manera que se asemeja de manera más cercana a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico comprendiendo secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpos de dos o más especies diferentes.

Las proteínas de unión a antígeno pueden ser preparadas mediante cualquiera de una variedad de téenicas convencionales. Por ejemplo, pueden ser purificadas a partir de células que las expresan de manera natural (por ejemplo, un anticuerpo puede ser purificado a partir de un hibridoma que lo produce), o producidas en sistemas de expresión recombinante, usando cualquier téenica conocida en el área. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses (Anticuerpos monoclonales, hibridomas: Una nueva dimensión en análisis biológicos, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antiboides: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un manual de laboratorio), Harlow y Lands (eds.), Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, (1988).

Cualquier sistema de expresión conocido en la técnica puede ser usado para hacer los polipéptidos recombinantes de la invención. En general, las células huésped son transformadas con un vector de expresión recombinante que comprende DNA que codifica un polipéptido deseado. Entre las células huésped que pueden emplearse son procariotes, levaduras o células eucarióticas mayores. Los procariotes incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucarióticas mayores incluyen células de insectos y líneas de células establecidas de origen mamífero. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981 , Cell 23: 175), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas de células BHK (ATCC CRL 10) y la línea de células CVI/EBNA derivada de la línea de células de riñón de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan et al., 1991 , EMBO J. 10:2821. Vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares de bacterias, hongos, levaduras y mamíferos son descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Vectores de clonación: Un manual de laboratorio), Elsevier, Nueva York, 1985).

Las células transformadas pueden ser cultivadas bajo condiciones que promueven expresión del polipéptido y el polipéptido recuperado mediante procedimientos de purificación de proteína convencionales. Uno de tales procedimientos de purificación incluye el uso de cromatografía por afinidad, por ejemplo, sobre una matriz teniendo todo o una porción (por ejemplo, el dominio extracelular) de alfa4beta7 unido a ella. Los polipéptidos contemplados para uso en la presente incluyen polipéptidos de anticuerpos anti-af!a4beta7 de mamífero, recombinantes, substancialmente homogéneos, substancialmente libres de materiales endógenos contaminantes.

La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos puede verificarse por cualquier medio conocido en la téenica, y puede ser idéntica a las secuencias descritas en la presente en el Listado de Secuencias, o puede diferir de aquéllas secuencias en uno o más residuos de aminoácidos como resultado de procesamiento. Por ejemplo, en todo o una porción de los polipéptidos substancialmente homogéneos, un aminoácido C-terminal de cualquiera de la cadena ligera o la cadena pesada (o molécula de cadena simple relevante) puede ser removida, mediante procesamiento proteolítico u otro procesamiento que ocurre durante el cultivo, por ejemplo, procesamiento de residuos Lys extermínales. De manera alternativa, más de un residuo amino C-terminal es removido, por ejemplo, dos aminoácidos C-terminales, o tres, cuatro o cinco aminoácidos C-terminales. Por ejemplo, C-terminal pudiera truncarse a prolina amidada de la cadena pesada de un anticuerpo como se describe. De manera similar, los aminoácidos N-terminales pueden estar ausentes, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales pueden estar ausentes.

De manera alternativa o adicional, los residuos de aminoácidos pueden experimentar modificaciones post-traslacionales, por ejemplo pero no limitando a, glutamina (en particular, glutamina en el extremo N) pueden cielizarse o convertirse a ácido piroglutámico; de manera adicional o alternativa, los aminoácidos pueden experimentar deamidación, isomerización, glicación y/u oxidación. Los polipeptidos de la invención pueden experimentar modificación post-traslacional adicional, incluyendo glicosilación, por ejemplo, glicosilación N-enlazada u O-enlazada, en sitios que son bien conocidos en la téenica. Como se describe previamente, pueden hacerse cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para evitar o minimizar tales alteraciones, o para facilitarlas en circunstancias donde tal procesamiento sea benéfico.

Las preparaciones de polipéptidos substancialmente homogéneos pueden comprender aproximadamente 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de polipéptido habiendo experimentado una forma particular (o formas) de procesamiento. Las preparaciones de polipeptidos substancialmente homogéneos pueden comprender algunas (menos de o igual a 50%), la mayoría (más de 50% pero menos de 90%) o substancialmente todas (más de 90%) de una forma o formas particulares de polipépitdo procesado. Más aún, tales preparaciones pueden comprender polipéptidos que tienen niveles variantes de más de un tipo de modificación relacionada con procesamiento, por ejemplo, un polipéptido puede tener algo, la mayoría o substancialmente toda la Usina C-terminal removida (por ejemplo, la Usina C-terminal en SEQ ID NO:72) y algo, la mayoría o substancialmente todo un aminoácido N-terminal convertido a ácido piroglutámico (por ejemplo, cualquier polipéptido mostrado en la Tabla 1 y/o 2 o en las secuencias de consenso).

Las proteínas de unión a antígeno pueden ser preparadas y clasificadas por propiedades deseadas, mediante cualquiera de una variedad de téenicas conocidas. Ciertas de las técnicas involucran aislar un ácido nucleico que codifica una cadena de polipéptido (o porción del mismo) de una proteína de unión a antígeno de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-alfa4beta7), y manipular el ácido nucleico a través de la tecnología de DNA recombinante. El ácido nucleico puede fusionarse a otro ácido nucleico de interés, o alterarse (por ejemplo, mediante mutagénesis u otras técnicas convencionales) para adicionar suprimir o substituir uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo.

En un aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo anti-alfa4beta7 de la invención. Tales fragmentos pueden consistir completamente de secuencias derivadas de anticuerpos o pueden comprender secuencias adicionales. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, F(ab’)2, anticuerpos de cadena simple, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos o anticuerpos de dominio. Otros ejemplos son provistos en Lunde et al., 2002, Bioche. Soc. Trans. 30:500-06.

Los anticuerpos de cadena simple pueden formarse al enlazar fragmentos de dominio variable (región Fv) de cadena pesada y ligera vía un puente de aminoácido (enlazador de peptido corto), resultando en una cadena de polipéptido simple. Tales FVs de cadena simple (scFvs) han sido preparados al fusionar DNA codificando un enlazador de péptido entre DNAs que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes pueden doblarse nuevamente sobre sí mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001 , Biomol. Eng. 18:95-108). Al combinar polipéptidos comprendiendo VL y VH, uno puede formar scFvs multiméricos que pueden unirse a diferentes epítopes (Kriangkum et al, 2001 , Biomol. Eng. 18:31-40). Las téenicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena simple incluyen aquéllas descritas en la patente estadounidense no. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. US 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87.

Proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos) de la invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la téenica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, por ejemplo, una región constante de cadena pesada tipo alfa, delta, épsilon, gamma o mu, humana. En una modalidad, la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o muteína de una región constante que ocurre de manera natural.

Las técnicas son conocidas para derivar un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, conmutación de subclase. Así, los anticuerpos de IgG pueden ser derivados de un anticuerpo de IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que posen las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo padre), pero también exhiben propiedades biológicas asociadas con un isotipo de anticuerpo o subclase diferente de aquélla del anticuerpo padre. Las técnicas de DNA recombinantes pueden ser empleadas. El DNA clonado que codifica polipéptidos de anticuerpos particulares puede emplearse en tales procedimientos, por ejemplo, DNA que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Ver además Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16. Más aún, si se desea una lgG4, también puede desearse introducir una mutación puntual ((CPSCP -> CPPCP) en la región de gozne como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, incorporada por referencia en la presente) para aliviar una tendencia para formar enlaces disulfuro de cadena intra-H que conducen a heterogeneidad en los anticuerpos de lgG4.

Más aún, téenicas para derivar proteínas de unión a antígeno teniendo diferentes propiedades (es decir, afinidades variantes para el antígeno al cual se unen) también son conocidas. Una de tales técnicas, referida como entremezclado de cadena, involucra desplegar repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina sobre la superficie de bacteriófago filamentoso, frecuentemente referido como despliegue de fagos. El entremezclado de cadena ha sido usado para preparar anticuerpos de alta afinidad para hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como se describe por Marks et al., 1992, BioTechnology, 10:779.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que tiene una baja constante de disociación de alfa4beta7. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno tiene una Kd de 100 pM o menor. En otra modalidad, la Kd es 10 pM o menor; en otra modalidad, es 5 pM o menor, o es 1 pM o menor. En otra modalidad, la Kd es substancialmente la misma que un anticuerpo descrito en la presente en los Ejemplos. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno se une a alfa4beta7 con substancialmente la misma Kd como un anticuerpo descrito en la presente en los Ejemplos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que inhibe una actividad de alfa4beta7, por ejemplo, unión (o adhesión) a MAdCAM-1 , unión a células que expresan AdCAM-1 , o adhesión entre células que expresan alfa4beta7 y células que expresan MAdCAM-1. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno tiene una IC50 de 1000 pM o menor. En otra modalidad, la IC50 es 500pM o menor; en otra modalidad, la IC50 es 100pM o menor. En otra modalidad, la IC5o es substancialmente la misma que aquélla de un anticuerpo descrito en la presente en los Ejemplos. En otra modalidad, la proteina de unión a antígeno inhibe una actividad de alfa4beta7 con substancialmente la misma IC50 que un anticuerpo descrito en la presente en los Ejemplos.

En una modalidad, las proteínas de unión a antígeno de la presente invención tienen una afinidad aparente para alfa4beta7 (o células que expresan alfa4beta7) de 1000 pM o menor. En otras modalidades, las proteínas de unión a antígeno exhiben una afinidad aparente de 500 pM o menor, 200 pM o menor, 100 pM o menor, 80 pM o menor, 40 pM o menor, o 15 pM o menor. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno exhibe una afinidad aparente substancialmente igual que aquélla de un anticuerpo descrito en la presente en los Ejemplos. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno tiene una afinidad aparente substancialmente igual que aquélla de un anticuerpo descrito en la presente en los Ejemplos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que une tanto formas activas como inactivas de alfa4beta7. En otra modalidad, una proteína de unión a antígeno une solo una forma, o preferencialmente une una forma, de alfa4beta7. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno puede ligar alfa4beta7 en la presencia o ausencia de Mn2+ (es decir, liga tanto formas activas como inactivas). De manera alternativa, una proteína de unión a antígeno puede ligar alfa4beta7 solo en la presencia de Mn2+ o solo en la ausencia de n2+, o puede ligar con mayor afinidad bajo una de tales condiciones que con otra, indicando unión preferencial a una forma particular de alfa4beta7.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una proteína de unión a antigeno que compite para unir a alfa4beta7 con un anticuerpo descrito en la presente. Tal capacidad de competencia puede determinarse mediante métodos que son bien conocidos en la téenica, por ejemplo, mediante competencia en unión a células que expresan alfa4beta7 como es observado usando técnicas de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) u otros ensayos, similares, mediante competencia en un ensayo tal como un ensayo de adhesión (es decir, entre células que expresan alfa4beta7 y células que expresan MAdCAM-1), o mediante competencia en otro ensayo descrito en la presente. En un aspecto, una proteína de unión a antígeno que compite para unión a alfa4beta7 con un anticuerpo descrito en la presente se une al mismo epitope o un epitope de traslape (o adyacente) como el anticuerpo. En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno que compite para unión a alfa4beta7 con un anticuerpo descrito en la presente inhibe una actividad de alfa4beta7.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que se une a alfa4beta7 humano expresado en la superficie de una celula y, cuando se une así, inhibe la interacción de alfa4beta7 con MAdCAM-1 sin provocar una reducción significativa en la cantidad de alfa4beta7 en la superficie de la célula. Puede usarse cualquier método para determinar o estimar la cantidad de alfa4beta7 sobre la superficie y/o en el interior de la célula. En una modalidad, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno que se une a alfa4beta7 expresada en la superficie de una célula y, cuando se une así, inhibe la interacción alfa4beta7 con MAdCAM-1 sin incrementar significativamente la velocidad de internalización del alfa4beta7 de la superficie de la célula. En otras modalidades, la unión de la proteína de unión a antígeno a la célula que expresa alfa4beta7, provoca menos de aproximadamente 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% o 0.1 % de la alfa4beta7 de superficie celular a ser internalizada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno teniendo una vida media de al menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En una modalidad, la proteína de unión a antígeno tiene una vida media de al menos tres días. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno tiene una vida media de cuatro días o más. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno tiene una vida media de ocho días o más. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno es derivada o modificada de manera que tiene una vida media más larga que como se compara con la proteína de unión a antígeno no derivada o no modificada. En otra modalidad, la proteína de unión a antígeno contiene una o más mutaciones puntuales para aumentar la vida media de suero, tal como se describe en WO 00/09560, publicada el 24 de febrero de 200, incorporada por referencia.

La presente invención proporciona además proteínas de unión a antígeno multi-específicas, por ejemplo, proteína de unión a antígeno biespecífica, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno que se une a dos epitopes diferentes de alfa4beta7, o a un epitope de alfa4beta7 y un epitope de otra molécula, vía dos sitios o regiones de unión a antígeno diferentes. Más aún, la proteína de unión a antígeno biespecífica como se describe en la presente, puede comprender un sitio de unión de alfa4beta7 de uno de los anticuerpos descritos en la presente y una segunda región de unión de aifa4beta7 de otro de los anticuerpos descritos en la presente, incluyendo aquéllos descritos en la presente por referencia a otras publicaciones. De manera alternativa, una proteína de unión a antígeno biespecífico puede comprender un sitio de unión a antígeno de uno de los anticuerpos descritos en la presente y un segundo sitio de unión a antígeno de otro cuerpo de alfa4beta7 que es conocido en la téenica, o de un anticuerpo que es preparado mediante métodos conocidos o los métodos descritos en la presente.

Numerosos métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica, y son discutidos en la solicitud de patente estadounidense 09/839,632, presentada el 20 de abril de 2001 (incorporada por referencia en la presente). Tales métodos incluyen el uso de hibridomas híbridos como se describe por Milstein et al., 1983, Nature 305:537, y otros (patente estadounidense 4,474,893, patente estadounidense 6,106,833), y acoplamiento químico de fragmentos de anticuerpos (Brennan et al., 1985, Science 229:81 ; Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367; patente estadounidense 6,010,902). Más aún, los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos vía medios recombinantes, por ejemplo, al usar porciones de cierre de leucina (es decir, a partir de las proteínas Fos y Jun, las cuales forman preferencialmente heterodímeros; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547) u otras estructuras de dominio interactivas de cierre y clave como se describe en la patente estadounidense 5,582,996. Téenicas útiles adicionales incluyen aquéllas descritas en Kortt et al., 1997, supra; patente estadounidense 5,959,083; y patente estadounidense 5,807,706.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno de la presente invención comprende un derivado de un anticuerpo. El anticuerpo derivado puede comprender cualquier molécula o substancial que imparta una propiedad deseada al anticuerpo, tal como una vida media incrementada en un uso particular. El anticuerpo derivado puede comprender, por ejemplo, una porción detectable (o de etiquetado) (por ejemplo, molécula radioactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como perla magnética o electrodensa (por ejemplo, oro)), o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)), una porción terapéutica o diagnóstica (por ejemplo, una porción radioactiva, citotóxica o farmacéuticamente activa), o una molécula que aumenta la conveniencia del anticuerpo para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivar un anticuerpo incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano) y polietilenglicol (PEG). Derivados enlazados a albúmina y PEGilados de anticuerpos pueden ser preparados usando téenicas bien conocidas en la técnica. En una modalidad, el anticuerpo es conjugado o enlazado de otra manera a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede ser modificada químicamente con, por ejemplo, un químico seleccionado del grupo que consiste de dextrano, poli(n-vinil pirrolidona), polieitlenglicoles, homopolímeros de propilenglicol, co-polímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes polivinílicos. Solicitud de patente estadounidense no. 20030195154.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para clasificar una molécula que se une a alfa4beta7 usando las proteínas de unión a antígeno de la presente invención. Cualquier técnica de clasificación adecuada puede ser usada. En una modalidad, una molécula alfa4beta7, o un fragmento de la misma a la cual una proteína de unión a antígeno de la presente invención se une, es contactada con la proteína de unión a antígeno de la invención y con otra molécula, en donde la otra molécula se une a alfa4beta7 si reduce la unión de la proteína de unión a antígeno a alfa4beta7. La unión de la proteína de unión a antígeno puede ser detectada usando cualquier método adecuado, por ejemplo, un ELISA. La detección de unión de la proteína de unión a antígeno a alfa4beta7 puede simplificarse al etiquetar de manera detectadle la proteína de unión a antígeno, como se discute antes. En otra modalidad, la molecula de unión a alfa4beta7 es analizada adicionalmente para determinar si inhibe la activación y/o señalización de alfa4beta7.

Acidos nucleicos En un aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas. Los ácidos nucleicos comprenden, por ejemplo, polinucléotido que codifican toda o parte de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, muteína o variante de los mismos, polinucleótidos suficientes para usarse como sondas de hibridación, iniciadores de PCR o iniciadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucléotido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos anti-sentido para inhibir la expresión de un polinucléotido y secuencias complementarias de los anteriores. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser, por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1 ,000, 1 ,500, 3,000, 5,000 o más nucleótidos de longitud y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o parte de un ácido nucleico mayor, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser de filamento simple o filamento doble y pueden comprender nucleótidos de RNA y/o DNA y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de anticuerpo (por ejemplo, cadena pesada o ligera, dominio variable solamente o longitud completa) pueden aislarse a partir de células B de ratones que han sido inmunizados con alfa4beta7. El ácido nucleico puede ser aislado mediante procedimientos convencionales, tal como reacción en cadena de polimerasa (PCR).

La invención proporciona además ácidos nucleicos que hibridan a otros ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación particulares. Los métodos para hibridar ácidos nucleicos son bien conocidos en la téenica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Moleclar Biology (Protocolos actuales en biología molecular, John Wilcy & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en la presente, una condición de hibridación moderadamente severa usa una solución de prelavado conteniendo cloruro de sodio/citrato de sodio 5x (SSC), 0.5% SDS, 1.0 m EDTA (pH 8.0), amortiguador de hibridación de aproximadamente 50% formamida, SSC 6X y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una conteniendo aproximadamente 50%, formamida con una temperatura de hibridación de 42°C) y condiciones de lavado de 60°C, en SSC 0.5X, 0.1 % SDS. Una condición de hibridación severa híbrida en SSC 6X a 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.1X, 0.2% SDS a 65°C. Adicionalmente, alguien de habilidad en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para incrementar o disminuir la severidad de hibridación, de manera que los ácidos nucleicos comprendiendo secuencias de nucleótidos que sean al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% idénticas unas a otras normalmente permanecen hibridadas unas a otras. Los parámetros básicos que afectan la elección de condiciones de hibridación y guía para idear condiciones adecuadas se exponen por ejemplo, por Sambrook, Fritsch yManiatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: Un manual de laboratorio), Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular), 1995, Ausubel et al., eds., John Wilcy & Sons, INc., secciones 2.10 y 6.3-6.4) y pueden determinarse fácilmente por aquellos de habilidad ordinaria en la téenica con base en, por ejemplo, la longitud y/o composición de base del DNA.

Los cambios pueden ser introducidos mediante mutación en un ácido nucleico, conduciendo por ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno) que lo codifica. Pueden introducirse mutaciones usando cualquier técnica conocida en la técnica. En una modalidad, uno o más residuos de aminoácidos particulares son cambiados usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis de sitio dirigido. En otra modalidad, uno o más residuos aleatoriamente seleccionados se cambian usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis aleatoria. Sin embargo si se hace, un polipéptido muíante puede ser expresado y clasificado para una propiedad deseada (por ejemplo, unión a alfa4beta7 o bloqueo de la unión de alfa4beta7 a una adresina, tal como MAdCAM).

Las mutaciones pueden ser introducidas en un ácido nucleico sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido que la codifica. Por ejemplo, uno puede hacer substituciones de nucleótidos que conducen a substituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos no esenciales. En una modalidad, una secuencia de nucleótidos, o un fragmento deseado, variante o derivado del mismo, es mutado de manera que codifica una secuencia de aminoácidos comprendiendo una o más supresiones o substituciones de residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la mutagénesis inserta un aminoácido adyacente a uno o más residuos de aminoácidos. De manera alternativa, una o más mutaciones pueden ser introducidas en un ácido nucleico que cambia selectivamente la actividad biológica (por ejemplo, unión de alfa4beta7, inhibición de unión de alfa4beta7 a una adresina, tal como MAdCAM, etc.) de un polipéptido que lo codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica. Ejemplos de cambios cuantitativos incluyen incrementar, reducir o eliminar la actividad. Ejemplos de cambios cualitativos incluyen cambiar la especificidad de antígeno de una proteína de unión a antígeno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para usarse como iniciadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico de la invención. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de longitud completa de la invención, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción activa (por ejemplo, una porción de unión a alfa4beta7) de un polipéptido de la invención.

Las sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico de la invención pueden usarse para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcripciones que codifican un polipéptido de la invención. La sonda puede comprender un grupo de etiqueta, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima. Tales sondas pueden ser usadas para identificar una célula que expresa el polipéptido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona vectores comprendiendo un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una porción del mismo. Ejemplos de vectores incluyen, pero no están limitados a, plásmidos, vectores virales, vectores de mamífero no episomales y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en la base de las células huésped para ser usadas para expresión, la cual es enlazada operablemente a la secuencia de ácido nucleico a ser expresada. Las secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped (por ejemplo, ¡ntensificador de gene temprano de SV40, promotor de virus de sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido, ver Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11 :287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237, incorporadas por referencia en la presente en su totalidad), y aquéllas que dirigen expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a un tratamiento o condición particular (por ejemplo, el promotor de metalotionina en células de mamífero y el promotor que responde a estreptomicina y/o que responde a tet en sistemas tanto procarióticos como eucarióticos (ver ed.). Aquéllos expertos en la téenica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en células huésped para producir por ello proteínas o péptidos, incluyendo proteínas de fusión o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped, en las cuales un vector de expresión recombinante de la invención ha sido introducido. Una célula huésped puede ser una célula procariótica (por ejemplo, E. coli) o célula eucariótica (por ejemplo, células de levadura, insecto o mamífero (por ejemplo, células CHO)). El DNA de vector puede ser introducido en células procarióticas o eucarióticas vía técnicas de transformación o transfección convencionales. Para transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usada, solo una pequeña fracción de células puede integrar el DNA extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gene que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) generalmente es introducido en las celulas huésped junto con el gene de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquéllos que confieren la resistencia a medicamentos, tal como G418, higromicina y metotrexato. Las células establemente transfectadas con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas mediante selección de medicamento (por ejemplo, células que han incorporado el gene marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras morirán), entre otros métodos.

Indicaciones En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar un sujeto. El método puede, por ejemplo, tener un efecto generalmente saludable sobre el sujeto, por ejemplo, puede incrementar la longevidad esperada del sujeto. De manera alternativa, el método puede, por ejemplo, tratar, prevenir, curar, aliviar o mejorar (“tratar”) una enfermedad, desorden condición o malestar (“una condición”). Entre las condiciones a ser tratadas de acuerdo con la presente invención son condiciones caracterizadas mediante expresión o actividad inapropiada de alfa4beta7. Tales condiciones incluyen aquéllas que son asociadas con tráfico inapropiado de células, por ejemplo, el tráfico de leucocitos (tales como linfocitos o monocitos) al tracto gastromtestinal u otros tejidos comprendiendo células que expresan MAdCAM-1 (como un resultado de la unión de los leucocitos a las células que expresan MAdCAM-1). Enfermedades las cuales pueden ser tratadas de acuerdo con esto, incluyen enfermedad inflamatoria de intestino, tal como colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad de Celiac (esprue no tropical), enteropatía asociada con artropatías seronegativas, colitis microscópica o colagenosa, gastroenteritis eosinofílica, o pouchitis resultando después de la proctocolectomía y anastomosis ileoanal. Condiciones adicionales que pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención incluyen pancreatitis, diabetes mellitus dependientes de insulina, mastitis, colecistitis, colangitis, pericolangitis, bronquitis crónica, sinusitis crónica, asma y enfermedad de injerto versus huésped.

Métodos terapéuticos y administración de proteínas de unión a antígeno Ciertos métodos provistos en la presente comprenden administrar una proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7 a un sujeto, reduciendo por ello una respuesta biológica inducida por alfa4beta7 que juega un papel en una condición particular. En modalidades particulares, los métodos de la invención involucran contactar alfa4beta7 endógeno con una proteína de unión a antígeno alfa4beta7, por ejemplo, vía administración a un sujeto o en un procedimiento ex vivo.

El término “tratamiento” abarca alivio o prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un desorden, o reducción de severidad de enfermedad y similares. Una proteína de unión a antígeno no necesita efectuar una cura completa, o erradicar cada síntoma o manifestación de una enfermedad, para constituir un agente terapeutico viable. Como es reconocido en el campo pertinente, medicamentos empleados como agentes terapéuticos pueden reducir la severidad de un estado de enfermedad dado, pero no necesitan abolir cada manifestación de la enfermedad a ser considerada como agentes terapéuticos útiles. De manera similar, un tratamiento profilácticamente administrado no necesita ser completamente efectivo para prevenir el inicio de una condición con el fin de constituir un agente profiláctico viable. Simplemente reducir el impacto de una enfermedad (por ejemplo, al reducir el número o severidad de sus síntomas, o al incrementar la efectividad de otro tratamiento, o al producir otro efecto benéfico), o reducir la probabilidad de que la enfermedad ocurrirá o empeorará en un sujeto, es suficiente. Una modalidad de la invención es dirigida a un método que comprende administrar a un paciente un antagonista alfa4beta7 en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida sobre la línea de base de un indicador que refleja la severidad del desorden particular.

Como es entendido en el campo pertinente, composiciones farmacéuticas comprendiendo las moléculas de la invención son administradas a un sujeto en una manera apropiada a la indicación. Composiciones farmacéuticas pueden ser administradas mediante cualquier téenica adecuada, incluyendo pero no limitando a, de manera parenteral, tópica o mediante inhalación. Si se inyecta, la composición farmacéutica puede ser administrada, por ejemplo, vía ruta intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección de bolo o infusión continua. La administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión es contemplada, como son entrega transdérmica y liberación sostenida a partir de implantes. La entrega mediante inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, uso de un nebulizador, inhalación del antagonista en forma de aerosol y similares. Otras alternativas incluyen gotas para los ojos; preparaciones orales incluyendo píldoras, jarabes, pastillas o goma de mascar; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, atomizaciones y ungüentos.

El uso de proteínas de unión a antígeno en procedimientos ex vivo también es contemplado. Por ejemplo, sangre u otro fluido corporal del paciente puede ser contactado con una proteína de unión a antígeno que liga alfa4beta7 ex vivo. La proteína de unión a antígeno puede unirse a una matriz insoluble o material de soporte sólido adecuado.

Ventajosamente, las proteínas de unión a antígeno son administradas en la forma de una composición que comprende uno o más componentes adicionales, tales como portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende adicionalmente uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, una segunda substancia inhibidora de inflamación o inmune, una substancia anti-angiogénica, una substancia analgésica, etc., ejemplos no exclusivos de los cuales son provistos en la presente. En varias modalidades particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes fisiológicamente activos además de una proteína de unión a antígeno de unión a alfa4beta7.

En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una proteína de unión a antígeno de la invención junto con una o más substancias seleccionadas del grupo que consiste de un amortiguador, un antioxidante, tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como aquéllos teniendo menos de 10 aminoácidos), una proteína, un aminoácido, un carbohidrato, tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tales como EDTA, glutationa, un estabilizante y un excipiente. Solución salina amortiguada neutral o solución salina mezclada con albúmina de suero conespecífica son ejemplos de diluyentes apropiados. De acuerdo con estándares de industria apropiados, los conservadores, tales como alcohol bencílico, también pueden ser adicionados. La composición puede ser formulada como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Componentes adecuados son no tóxicos para recetores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Ejemplos adicionales de componentes que pueden ser empleados en formulaciones farmacéuticas son presentados en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Ciencias farmacéuticas de Remington), 16a ed. (1980) y 20a ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Los kits para uso por practicantes de medicina incluyen una substancia inhibidora de alfa4beta7 de la invención y una etiqueta u otras instrucciones para uso para tratar cualquiera de las condiciones discutidas en la presente. En una modalidad, el kit incluye una preparación estéril de una o más proteínas de unión a antígeno de unión alfa4beta7, las cuales pueden estar en la forma de una composición como se describe antes, y pueden estar en uno o más viales.

Las dosificaciones y la frecuencia de administración pueden variar de acuerdo con tales factores como la ruta de administración, las proteínas de unión a antígeno particulares empleadas, la naturaleza y severidad de la enfermedad a ser tratada, ya sea que la condición sea aguda o crónica, y el tamaño y condición general del sujeto. Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas mediante procedimientos conocidos en la teenica pertinente, por ejemplo, en ensayos clínicos que pueden involucrar estudios de escala de dosis.

Una substancia inhibidora de alfa4beta7 de la invención puede administrarse, por ejemplo, una vez o más de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares sobre un periodo de tiempo. En modalidades particulares, una proteína de unión a antígeno es administrada sobre un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, para uno, dos, tres meses o incluso de manera indefinida. Para tratar condiciones crónicas, el tratamiento de largo plazo es generalmente más efectivo. Sin embargo, para tratar condiciones agudas, administración para periodos más cortos, por ejemplo, de una a seis semanas, puede ser suficiente. En general, la proteína de unión a antígeno es administrada hasta que el paciente manifiesta un grado médicamente relevante de mejora sobre la línea de base para el indicador o indicadores elegidos.

Modalidades particulares de la presente invención involucran administrar una proteína de unión a antígeno a una dosificación desde aproximadamente 1 ng de proteína de unión a antígeno por kg de peso de sujeto por día (“1 ng/kg/día") hasta aproximadamente 10 mg/kg/día, más preferiblemente desde aproximadamente 500 ng/kg/día hasta aproximadamente 5 mg/kg/día, y muy preferiblemente desde aproximadamente 5 mg/kg/dia hasta aproximadamente 2 mg/kg/día, a un sujeto. En modalidades adicionales, una proteína de unión a antígeno es administrada a adultos una vez por semana, dos veces por semana, o tres o más veces por semana, para tratar una enfermedad, condición o trastorno mediado por alfa4beta7, por ejemplo, un desorden médico descrito en la presente. Si se inyecta, la cantidad efectiva de una proteína de unión a antígeno por dosis de adulto puede variar desde 1-20 mg/m2 y de preferencia es aproximadamente 5-12 mg/m2. De manera alternativa, una dosis simple puede ser administrada; la cantidad puede variar desde 5-100 mg/dosis. Un rango para una dosis simple es aproximadamente 20-30 g por dosis. En una modalidad de la invención, una dosis simple de 25 mg/dosis es repetidamente administrada por inyección. Si una ruta de administración diferente de inyección es usada, la dosis es ajustada de manera apropiada de acuerdo con prácticas médicas estándares. Un ejemplo de un régimen terapéutico involucra inyectar una dosis de aproximadamente 20-30 mg de proteína de unión a antígeno a una a tres veces por semana sobre un periodo de al menos tres semanas, a través de tratamiento durante periodos más largos, puede ser necesario para inducir el grado deseado de mejora. Para sujetos pediátricos (edad 4-17), un régimen adecuado ejemplar involucra la inyección subcutánea de 0.4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de proteína de unión a antígeno administrada dos o tres veces por semana.

Modalidades particulares de los métodos provistos en la presente involucran inyección subcutánea desde 0.5 mg hasta 10 mg, de preferencia desde 3 hasta 5 mg, de una proteína de unión a antígeno, una o dos veces por semana. Otra modalidad es dirigida a administración pulmonar (por ejemplo, mediante nebulizador) de 3 o más mg de proteina de unión a antígeno una vez a la semana.

Ejemplos de regímenes terapéuticos provistos en la presente comprenden inyección subcutánea de una proteína de unión a antígeno una vez a la semana, a una dosis de 1.5 a 3 mg, para tratar una condición en la cual alfa4beta7 juega un papel. Ejemplos de tales condiciones son provistos en la presente e incluyen, por ejemplo, condiciones reumáticas como se describe previamente, y otras condiciones en las cuales el tráfico excesivo o inapropiado de células que expresan alfa4beta7 juegan un papel (descrito en la presente; por ejemplo, enfermedad inflamatoria de intestino, pancreatitis, etc). La administración semanal de proteína de unión a antígeno es continuada hasta que un resultado deseado es logrado, por ejemplo, los síntomas del sujeto se calman. El tratamiento puede reanudarse según sea necesario, o de manera alternativa, las dosis de mantenimiento pueden ser administradas.

Otros ejemplos de regímenes terapéuticos provistos en la presente comprenden administración subcutánea o intravenosa de una dosis de 1 , 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 15 o 20 miligramos de un inhibidor alfa4beta7 de la presente invención por kilogramo de masa corporal del sujeto (mg/kg). La dosis puede ser administrada una vez al sujeto, o más de una vez a un cierto intervalo, por ejemplo, una vez al día, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, tres veces al mes, dos veces al mes, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses, o una vez al año. La duración del tratamiento y cualquier cambio a la dosis y/o frecuencia de tratamiento, pueden alterarse o variarse durante el curso de tratamiento con el fin de cumplir las necesidades particulares del sujeto.

En otra modalidad, una proteína de unión a antígeno es administrada al sujeto en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora, de preferencia una mejora sostenida, en al menos un indicador que refleja la severidad del desorden que está siendo tratado. Varios indicadores que reflejan el grado del malestar, enfermedad o condiciones del sujeto, pueden ser valorados para determinar si la cantidad y tiempo del tratamiento es suficiente. Tales indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores clínicamente reconocidos de severidad de enfermedad, síntomas o manifestaciones del desorden en cuestión. En una modalidad, una mejora es considerada sostenida si el sujeto exhibe la mejora sobre al menos dos ocasiones separadas por dos a cuatro semanas. El grado de mejora generalmente es determinado por un médico, quien puede tomar esta determinación con base en signos, síntomas, biopsias u otros resultados de prueba, y quienes pueden emplear cuestionarios que son administrados al sujeto, tales como cuestionarios de calidad de vida desarrollados para una enfermedad dada.

La alteración de expresión de alfa4beta7 y/o activación de alfa4beta7, o su compañero de unión MAdCAM-1 , son asociadas con un una variedad de desórdenes, incluyendo, por ejemplo, condiciones inflamatorias del sistema gastrointestinal. Los sujetos con un desorden dado pueden ser clasificados, para identificar aquellos individuos quienes han alterado expresión y/o activación de alfa4beta7 o MAdCAM-1 , identificado por ello los sujetos que pueden beneficiarse más a partir del tratamiento con un alfa4beta7 que une proteína de unión a antígeno. Así, los métodos de tratamiento provistos en la presente comprenden opcionalmente un primer paso para medir los niveles de expresión o activación de alfa4beta7 o MAdCAM del sujeto. Una proteína de unión a antígeno puede ser administrada a un sujeto en quien la expresión y/o activación de alfa4beta7 y/o MAdCAM-1 está por arriba de lo normal.

Los niveles del sujeto de actividad alfa4beta7 o MAdCAM-1 pueden monitorearse antes, durante y/o después del tratamiento con una proteína de unión a antígeno, para detectar cambios, si hay, en actividad alfa4beta7 o MAdCAM-1. Para algunos desórdenes, la incidencia de actividad de alfa4beta7 y/o MAdCAM-1 elevada puede variar de acuerdo con factores tales como la etapa de la enfermedad o la forma particular de la enfermedad. Téenicas conocidas pueden ser empleadas para medir tal actividad, por ejemplo, en muestras de tejido o sangre del sujeto. La actividad de alfa4beta7 o MAdCAMI puede medirse usando cualquier técnica adecuada.

Modalidades particulares de métodos y composiciones de la invención involucran el uso de una proteína de unión a antígeno y uno o más antagonistas de alfa4beta7 adicionales, por ejemplo, dos o más proteínas de unión a antígeno de la invención, o una proteína de unión a antígeno de la invención o uno o más antagonistas de alfa4beta7 diferentes. En modalidades adicionales, la proteína de unión a antígeno es administrada sola o en combinación con otros agentes útiles para tratar la condición que aflige al paciente. Ejemplos de tales agentes incluyen tanto medicamentos proteicos como no proteicos. Cuando múltiples terapéuticos son co-administrados, las dosificaciones pueden ser ajustadas de manera acorde, como es reconocido en la téenica pertinente. “Co-administración” y terapia de combinación no están limitadas a administración simultánea, pero también incluyen regímenes de tratamiento, en los cuales una proteína de unión a antígeno es administrada al menos una vez durante el curso de tratamiento que involucra administrar al menos otro agente terapéutico al paciente.

Ejemplos de otros agentes que pueden ser co-administrados con una proteína de unión a antígeno son otras proteínas de unión a antígeno o polipéptidos terapéuticos que son elegidos de acuerdo con la condición particular a ser tratada. De manera alternativa, medicamentos no proteicos que son útiles para tratar una de las condiciones particulares discutidas antes pueden ser co-administradas con un antagonista de alfa4beta7.

Terapia de combinación En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar un sujeto con una proteína de unión a antígeno inhibidora de alfa4beta7 y uno o más tratamientos diferentes. En una modalidad, tal terapia de combinación logra sinergia o un efecto aditivo al, por ejemplo, atacar múltiples sitios u objetivos moleculares en un tumor. Tipos de terapias de combinación que pueden ser usadas en conexión con la presente invención incluyen inhibir o activar (según sea apropiado) múltiples nodulos en una ruta relacionada con enfermedad simple, múltiples trayectorias en una célula objetivo, y múltiples tipos de células dentro de un tejido objetivo.

En otra modalidad, un método de terapia de combinación comprende administrar al sujeto dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los agonistas o antagonistas de alfa4beta7 descritos en la presente. En otra modalidad, el método comprende administrar al sujeto dos o más tratamientos que inhiben o activan juntos (directa o indirectamente) transducción de señales mediada por alfa4beta7. Ejemplos de tales métodos incluyen usar combinaciones de dos o más proteínas de unión a antígeno inhibidoras de alfa4beta7, de una proteína de unión a antígeno inhibidora de alfa4beta7 y una o más porciones terapéuticas diferentes teniendo propiedades anti-inflamatorias (por ejemplo, agentes anti-inflamatorios no esferoidales, esferoides, y/o inmunomoduladores), o de una proteína de unión a antígeno inhibidora de alfa4beta7 y uno o más tratamientos diferentes (por ejemplo, cirugía, ultrasonido o tratamiento efectivo para reducir la inflamación). Agentes útiles que pueden combinarse con inhibidores de alfa4beta7 incluyen aquéllos usados para tratar, por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, tales como aminosalicilato (por ejemplo, mesalamina), corticosteroides (incluyendo predisona), antibióticos, tales como metronidazol o ciprofloxacina (u otros antibióticos útiles para tratar, por ejemplo, pacientes afligidos con fístulas), e inmunosupresores tales como azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, tacrolimus y ciclosporina. Combinaciones de tales agentes tambien son contempladas para usarse con los inhibidores de alfa4beta7 inventivos. Tal o tales agentes pueden administrarse de manera oral o mediante otra ruta, por ejemplo, vía supositorio o enema.

Adicionalmente, uno o más anticuerpos o derivados de anticuerpos anti-alfa4beta7 pueden usarse en combinación con una o más moléculas u otros tratamientos, en donde la o las otras moléculas y/o tratamientos no se unen directamente a o afectan alfa4beta7, pero cuya combinación es efectiva para tratar o prevenir la condición siendo tratada. Por ejemplo, un inhibidor de alfa4beta7 puede ser usado en combinación con terapia probiótica, u otra terapia usada para restaurar o mantener la flora de intestino normal. En una modalidad, una o más de las moléculas y/o tratamientos trata o previene una condición que es provocada por una o más de otras moléculas o tratamientos en el curso de terapia, por ejemplo, náusea, fatiga, alopecia, caquexia, insomnio, etc. En cada caso, donde una combinación de moléculas y/u otros tratamientos es usada, la o las moléculas individuales y/o tratamientos pueden administrarse en cualquier orden, sobre cualquier periodo de tiempo, el cual sea efectivo, por ejemplo de manera simultánea, consecutiva o alternada. En una modalidad, el método de tratamiento comprende completar un primer curso de tratamiento con una molécula u otro tratamiento antes de comenzar un segundo curso de tratamiento. La longitud de tiempo entre el fin del primer curso de tratamiento y comienzo del segundo curso de tratamiento puede ser de cualquier longitud de tiempo que permita que el curso total de terapia sea efectivo, por ejemplo, segundos, minutos, horas, días, semanas, meses o incluso años.

En otra modalidad, el método comprende administrar uno o más de los antagonistas de alfa4beta7 descritos en la presente y uno o más tratamientos diferentes (por ejemplo, un tratamiento terapéutico o paliativo). Donde un método comprende administrar más de un tratamiento a un sujeto, se entenderá que el orden, momento, número, concentración y volumen de las administraciones es limitado solamente por los requerimientos médicos y limitaciones del tratamiento, es decir, dos tratamientos pueden ser administrados al sujeto, por ejemplo, de manera simultánea, consecutiva, alternada o de acuerdo con cualquier otro régimen.

Los siguientes ejemplos, tanto reales como vaticinados, son provistos para el propósito de ilustrar modalidades específicas o características de la presente invención y no limitan su alcance.

Ejemplo 1 : Preparación de anticuerpos Anticuerpos monoclonales contra alfa4beta7 humano se desarrollaron al inmunizar ratones XenoMouseMR XG2kappalambda (kl) y XG4kl (ratones transgénicos que expresan lgG2 o lgG4 humanas, y cadenas ligeras kappa y lambda humanas, respectivamente; Abgenix Inc., Fremont CA) con células que expresan alfa4beta7 humano, ya sea células 293 de riñón embriónico humano (HEK) transientemente transfectadas (293-A4B7) o células de ovario de hámster chino (CHO) establemente transfectadas (CHO-A4B7). El título de suero fue monitoreado mediante análisis clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) comparando células transfectadas con alfa4beta7 con células padres de control respectivas. Animales hiperinumnes a partir de cualquier campaña de inmunización fueron sacrificados y tejidos de bazo y nodulos linfáticos fueron sometidos a fusión de hibridoma.

Los anticuerpos específicos de heterodímero alfa4beta7 fueron identificados usando una serie de ensayos. Los sobrenadantes de hibridoma fueron clasificados primero mediante teenología de ensayo de microvolumen fluorométrica (FMATMR Applera Corporation, Foster City CA; un sistema de detección celular de clasificación de alto rendimiento) para unión a células transfectadas con alfa4beta7 como se compara con células transfectadas falsas. Sobrenadantes identificados como positivos para unión a alfa4beta7 (1001 sobrenadantes de unión positiva de campaña de inmunización celular de CHO-a4b7 y 1143 sobrenadantes de unión positiva de campaña de inmunización de células 293-a4b7) fueron evaluadas para la capacidad para inhibir adhesión de células HUT78 a MAdCAM-1-Fc en una manera similar como se describe (Erle, J. Immunol, (1994) 153:517). En este ensayo, 60 sobrenadantes de campaña CHO-a4b7 y 174 sobrenadantes de campaña 293-a4b7 mostraron más de 90% de inhibición (n=2) y fueron sometidos a análisis de potencia y especificidad adicionales.

Células 293 transfectadas con alfa4beta7, transfectadas con alfa4beta1 y transfectadas con alfaEbeta7 fueron preparadas y usadas en análisis FACS con los sobrenadantes de hibridoma que fueron identificados en el ensayo de inhibición. Los sobrenadantes que demostraron unión a solo las células transfectadas con alfa4beta7 fueron clasificados como específicas de heterodímeros, debido a que los anticuerpos de la subunidad alfa4 de esta integrina también se unirían a células transfectadas con alfaEbeta7. Los sobrenadantes de hibridoma también fueron analizados para actividad de unión a células 293 transfectadas con alfa4beta7 de mono cinomólogo mediante análisis FACS. Siete líneas de campaña CHO-a4b7 y 25 líneas de la campaña 293-a4b7 fueron seleccionadas para sub-clonación y análisis adicional.

Ejemplo 2: Análisis de anticuerpos Las células secretadoras de anticuerpos fueron clonadas, y los ácidos nucleicos codificadores de anticuerpo fueron aislados y secuenciados. La mutagénesis dirigida a sitio fue usada a variantes preparadas que difirieron de las secuencias aisladas en uno o más residuos de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos y variantes son mostradas en las Tablas 1 y 2 a continuación. Se reconoce que los límites de las regiones de CDR y FR pueden variar de las mostradas a continuación, como se discute previamente en la presente.

Tabla 1: Análisis de secuencia de cadenas ligeras Tabla 1 (continuación) Tabla 1 (continuación) Tabla 2: Análisis de secuencias de cadenas pesadas Tabla 2 (continuación) Tabla 2 (continuación) Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos fueron analizadas adicionalmente por similitudes. Las cadenas ligeras kappa fueron agrupadas en tres grupos, y una secuencia de consenso fue desarrollada para cada grupo. Hubo tres anticuerpos con cadenas ligeras lambda, ninguna de las cuales soportó suficiente similitud unas a otras para formar un grupo de secuencias relacionadas a partir de las cuales pudiera desarrollarse una secuencia de consenso. Dos de las variantes desarrolladas variaron en la cadena ligera lambda. Las cadenas pesadas fueron agrupadas en cuatro grupos con una cadena pesada simple categorizada en un qumto grupo, y una secuencia de consenso fue desarrollada para grupos 1 a 4. Estos resultados son mostrados en la Tabla 3(a) y 3(b) a continuación; las secuencias de consenso son mostradas en el Listado de secuencias. Los números en parentesis indican la SEQ ID NO en el Listado de secuencias.

Tabla 3(a): Agrupamiento de anticuerpos por cadena ligera kappa, con cadena pesada correspondiente Tabla 3(b): Agrupamiento de anticuerpos por cadena ligera lambda, con cadena pesada correspondiente Los límites de CDR dentro de las secuencias de consenso (las cuales pueden variar, como se discute previamente), fueron como sigue: Grupo Kappa CDR 24-35, CDR2 51-57, DCR3 90-99; Grupo kappa 2 CDR1 24-34, CDR2 51-56, CDR3 89-97; Grupo kappa 3 CDR1 24-34, CDR2 50-56, CDR3 89-97; Grupo de cadena pesada G1 CDR1 31 -35, CDR2 50-66, CDR3 99-1 10, Grupo de cadena pesada 2 CDR1 31 -35, CDR2 50-66, CDR3 99-107; Grupo de cadena pesada 3 CDR1 31 -35, CDR2 50-66, CDR3 99-1 14; y Grupo de cadena pesada 4 CDR1 31 -35, CDR2 50-66, CDR3 99-114.

Ejemplo 3: Ensayos funcionales Este ejemplo describe varios ensayos que fueron usados para caracterizar los anticuerpos.

Ensayo de adhesión HUT78 Placas recubiertas (por ejemplo, placas de 96 cavidades Costar® 3368; Corning Incorporated Life Sciences, Lowell MA) son preparadas al recubrir placas de 96 cavidades durante la noche a 4°C con 20 microG/ml MAdCAM-1 (o una concentración similar de lgG1 humana como un control de recubrimiento) diluida en amortiguador de fosfato pH9.0. El recubrimiento es removido y las placas son bloqueadas con 100 microlitros de 3% BSA/PBS, incubada durante 1 o más a temperatura ambiente. Las placas son lavadas tres veces con solución de sal balanceada de Hank’s (HBSS).

Celulas HUT78 (una línea de células de linfoma de células T humanas que exhiben las características de una línea de células T maduras con fenotipo inductor/ayudante; ATCC TIB 161 ), cultivadas a confluencia, son pelletizadas y lavadas 3X en HBSS, entonces resuspendidas en HBSS a concentración apropiada para producir ~30,000 células en 50 microlitros.

Los anticuerpos a ser probados son diluidos a dos veces la concentración final, y entonces titulados 1 :4 en HBSS libre de magnesio, libre de calcio conteniendo 1 % BSA con 1 mM Mn2+. Cincuenta microlitros de titulación de anticuerpo o control se adicionaron a cada cavidad de una placa de fondo VEE, seguido por 50 microlitros de células HUT78. Las células y anticuerpos son incubados a 4°C durante 30 minutos, entonces son adicionados a las placas recubiertas y se incubaron a 37°C durante 40 minutos. Las células sobre placas recubiertas son lavadas tres veces en HBSS a temperatura ambiente, al quitar la película de HBSS entre lavados. Las celulas adherentes son congeladas-descongeladas a -20°C seguido por la adición de 100 microlitros de amortiguador de tinte/lisis CyQuant® (un amortiguador usado en una ensayo de cuantificación de células basado en fluorescencia útiles en Molecular Probes® de clasificación de alto rendimiento, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA. La señal fluorescente a partir de cada cavidad es cuantificada a excitación de 485 nm y emisión de 530 nm, por ejemplo, usando un Tecan GENiosPro, un lector de microplaca de múltiples etiquetas (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Suiza).

Ensayo de adhesión de células CD4+ humano Las placas son recubiertas con MAdCAM-1 -Fc humano o IgG humano (3 microG/ml en 20 mM amortiguador de fosfato, pH 9.10, 130 mM NaCI), 100 microlitros/cavidad, a 4°C durante la noche, se bloquearon con 200 microlitros/cavidad de reactivo de bloqueo (3% albúmina de suero bovino en PBS) a temperatura ambiente durante al menos dos horas. Las placas son lavadas entonces tres veces con amortiguador de adhesión (30mM HEPES, pH 7.4, 120mM NaCI, 1mM MnCI2, 10 g/ml IgG humana).

Las diluciones seriales de anticuerpos a ser probados son preparados y adicionados a la placa (35 microlitros/cavidad); células T de CD4+ aisladas (250,000 células/35 microlitros/cavidad) son adicionadas y las placas son incubadas a 4°C durante 2 h. Después de lavar tres veces con amortiguador de adhesión, las placas son congeladas a -20°C durante la noche. El reactivo de detección (100 microlitros/cavidad de reactivo CyQUANT®; Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) es adicionado y las placas son incubadas a 37°C durante 45 minutos. Los resultados son determinados al leer la fluorescencia a excitación de 485 nm y emisión de 530 nm.

EC50 en unión de celulas T de memoria CDr+CD45RA humanas Las células mononucleares de sangre periférica humana (PMBC; frescas o congeladas y descongeladas, por ejemplo en solución salina amortiguada con fosfato con 2% FBS) son lavadas y resuspendidas en amortiguador HEPES (30mM HEPES 140nM NaCI) con 1 % BSA, con o sin 1 mM MnCI2 (dependiendo del experimento; Mn2+ es necesario para unión de MAdCAM) y se platinaron en placas de 96 cavidades (106 células/cavidad). Las células son incubadas con 10 microG/ml de IgG humana durante 30 minutos en hielo para bloquear unión no específica. Las células son incubadas entonces con diluciones seriales de anticuerpos anti-alfa4beta7 biotinilados en placas de 96 cavidades durante una hora en hielo, seguido por adición de dilución 1 :100 de estreptavidina-ficoeritrinta (PE; Jackson ImmunoResearch Laboratories INcI, West Grove, PA), 4 microlitros CD3-Pacific Blue, CD4-PerCP-Cy5.5 e isotiocianato de CD45RA-fluoresceína (FITC) (BD Biosciences, San José CA) durante un volumen final de 100 microlitros, y se incubaron por otra hora en hielo. Las células fueron lavadas dos veces con amortiguador HEPES (con o sin MnCI2, de manera correspondiente) y entonces se fijaron en 200 microlitros de amortiguador HEPES más 0.5% paraformaldehído (nuevamente, con o sin MnCI2, de manera correspondiente). El porcentaje de celulas T de memoria CD4+CD45RA de unión a anticuerpo de alfa4beta7 positivas es determinado usando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), por ejemplo, un citómetro de flujo de mesa de trabajo BDMR LSR II (BD Biosciences, San José CA). EC50 es definida como la concentración de anticuerpo alfa4beta7 a la cual 50% de los sitios alfa4beta7 sobre células de memoria CD4CD45RA se unen mediante el anticuerpo alfa4beta7.

IC50 en bloqueo de unión de MAdCAM-1 -Fc a células T de memoria CD4+CD45RA humanas PBMC (frescas o congeladas como se describe previamente) son lavadas y resuspendidas en amortiguador HEPES (30mM HEPES+1 40nM NaCI) con 1 % BSA y 1 mM MnCI. a una concentración final de 107 células/ml. Las células son bloqueadas como se describe previamente; después del bloqueo, las células son incubadas con una dilución serial de anticuerpo anti-alfa4beta7 (o control apropiado) en placas de 96 cavidades durante 30 minutos en hielo, y entonces con 0.3 microG/ml de proteína MAdCAM-1-Fc biotinilada durante otra hora.

Después de dos lavados en amortiguador HEPS con 1 mM MnCI, las células son tratadas con dilución 1 :100 de estreptavidina-PE; 4 microlitros CD3-Pacific Blue, CD4-PerCP-Cy5.5 y CD45RA- FITC como se describe previamente, en un volumen final de 100 microlitros. Despues de una hora de incubación en hielo, las células se lavan dos veces con amortiguador HEPES con 1 mM MnCI y entonces se fijan en 200 microlitros de amortiguador más 0.5% paraformaldehído. El porcentaje de células T de memoria CD+CD45RA de unión a MAdCAM-1-Fc positivas es determinado mediante análisis de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), como se describe previamente. IC50 se define como la concentración de anticuerpo alfa4beta7 en la cual la unión de MAdCAM-1 -Fc a alfa4beta7 sobre células de memoria CD4CD45RA es inhibida por 50%.

Inducción de alfa4beta7 mediante ácido retinoico sobre células T activadas PBMC humanas aisladas son activadas por anti CD3 (unida en placa, 5 microG/ml), IL-2 humana (20 ng/ml) en la presencia o ausencia de ácido retinoico (1000 nM) durante 7 días. Las células activadas son lavadas dos veces con amortiguador de manchado (PBS más 0.5% BSA y 1 mM MnCI) y se incubaron con 100 microG/ml de Ig humana durante 30 minutos para bloquear unión no específica. Las células son incubadas primero en una dilución serial de anticuerpos anti-afla4beta7 durante 30 minutos en hielo, y entonces son manchadas con 1 microG/ml de MAdCAM-1 -Fc biotinilada por otros 30 minutos. Después de lavar dos veces con amortiguador de manchado, las células son manchadas con Streptavidina-PE (1 : 1000) durante 30 minutos. Las células son analizadas por clasificación celular activada por fluorescencia, por ejemplo, con un FACSCaliburMR (BD Biosciences, San José CA). Las células preparadas en esta manera pueden ser usadas para experimentos adicionales, tales como ensayos de competencia.

Ensayos de competencia Anticuerpos alfa4beta7 también fueron examinados por su capacidad para competir con otros anticuerpos anti-alfa4beta7 y/o beta7 en la unión a células que expresan alfa4beta7 mediante teenología de ensayos de microvolumen fluorométrico o FMAT, substancialmente como se describe por Fiscella, et al, Nature Biotechnology 21 :302-307; 2003. Brevemente, las células que expresan altos niveles de alfa4beta7 son preparadas, por ejemplo, mediante co-transfección transiente de células con ácidos nucleicos que codifican alfa4 y ácidos nucleicos que expresan beta7. Las líneas de células estables son preparadas en una manera similar, usando células y protocolos apropiados para transfección estable. Las células transfectadas son clasificadas, por ejemplo, por FACS, usando anticuerpos para alfa4, anticuerpos para beta7 y/o ligando es decir, MAdCAM-1 , por ejemplo, una proteína de fusión MAdCAM-1-Fc. Las células pueden experimentar varios ciclos de clasificación y selección para producir líneas de células clónales con niveles elevados, reproducibles de expresión de alfa4beta7.

Unión a S250N muíante Los anticuerpos también fueron evaluados por su capacidad para reconocer S250N muíante puntual en la cadena de beta7, que se conoce como crítica para unión a ACT-1 (J Immunol. 159:1497, 1997). Células 293 que co-expresan de manera transiente alfa4beta7 teniendo la mutación S250N en la cadena beta (ref) son preparadas en una manera similar como aquélla previamente descrita para la preparación de células que expresan altos niveles de alfa4beta7.

Brevemente, un total de 1x106 células transfectadas para perfil son recolectadas usando una disolución de disociación celular y centrifugadas a 1000 rp durante 5 minutos. Las células son bloqueadas entonces con 0.5 mi de amortiguador de bloqueo (1 % de suero de cabra/PBS) durante 30 minutos a 1 h a 4°C con agitación. Para manchado de MAdCAM-1-Fc, las células son incubadas durante 1 h a 4°C con agitación en amortiguador de Mn2+ (1 mM MnCI2 en 30mM HEPES + 1 % suero de cabra). Las células son centrifugadas entonces a 1000 rpm/5 min, y 0.5 mi de amortiguador de bloqueo fresco junto con 10 microG/ml de anticuerpo primario son adicionados, seguido por incubación durante 30 min a 1 a 4°C con agitación. Después de dos lavados con 4 mi de PBS frío (cada lavado), anticuerpo secundario (es decir, anticuerpo conjugado con IgG anti-cabra-Ficoeritrina; Southerm Biotech, 1 :250 diluida o 0.1 microG/106 células) en 0.5 mi de amortiguador de bloqueo se adiciona y las células son incubadas durante 20-30 min a 4°C. Las celulas son lavadas una última vez con 4 mi de PBS frío, entonces resuspendidos en 0.5 mi de amortiguador FACS por perfil.

Unión a polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) Para análisis de SNP de la subunidad a4, exones de gene a4 1-28 de 90 individuos (180 genomas haploides) representando diferentes grupos étnicos fueron amplificados mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y secuenciados subsecuentemente. Tres SNPs candidatos en la región de codificación del gene a4 fueron identificados y uno de los tres resultó en un cambio de aminoácidos (Arg878Gln). De manera similar para el análisis de SNP de subunidad b7, la región de codificación de exones de gene b7 2-15 de 90 individuos (180 genomas haploides) representando diferentes grupos étnicos fueron amplificados por PCR y subsecuentemente secuenciados. Tres SNPs fueron identificados y dos de ellos resultaron en cambios de aminoácidos. Los datos de análisis de SNP en casa fueron comparados con información en la base de datos NCB I (NCBI: National Center for Biotechnology Information, una división de National Library of Medicine (NLM) en National Institutes of Health (N1H)). Solo la mutación A/G resultante en Gln878Arg en la subunidad a4 ocurre a alta frecuencia - 20% o 30% tanto en SNP en casa como la base de datos pública, respectivamente. Los otros SNPs ocurren a baja frecuencia. Esta información es resumida en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4: Frecuencia de SNPs en beta7 y alfa4 humanos Construcciones mutantes puntuales representando SNPs alteradoras de aminoácidos (a4b7(E97V); a4b7(R213S); a4b7(G629S; a4(V824A)b7; a4(Q878R)b7) en los dominios extracelulares tanto de alfa4 como beta7, fueron generados. Cada construcción de mutante puntual fue transfectada a células 293 junto con la construcción de expresión de compañero tipo natural. Las células 293 transfectadas fueron manchadas primero con 1 microG/ml de IgG humano o anticuerpo anti-alfa4beta7, se lavaron con PBS y se mancharon con IgG antí-humana de cabra de anticuerpo secundario conjugado con ficoeriterina. Después de lavar con PBS; las celulas fueron analizadas mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, por ejemplo, con un FACSCaliburMR (BD Biosciences, San José CA). La intensidad de manchado con fluorescencia (promedio geométrico) para cada manchado de anticuerpo es indicada en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5: Unión a SNPs Estos resultados indicaron que todos los anticuerpos probados se unieron a los SNPs conocidos de alfa4beta7.

Las actividades de varios anticuerpos específicos de heterodímero alfa4beta7 en varios ensayos diferentes son comparadas en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6: Caracterización de anticuerpos a alfa4-beta7 Soler et al. Reportó la especificidad de unión de un anticuerpo anti-alfa4beta7 humanizado conocido como vedolizumab (J Phrmacol Exp Ther 330:864; 2009). Este anticuerpo fue reportado para tener una EC50 sobre linfocitos T de memoria CD4+ de 0.042 microgramos/ml (42 ng/ml). El vedolizumab también inhibió la unión de MAdCAM-1 soluble a celulas T de memoria de alfa4beta7hi con una IC50 de 0.034 microgramos/ml (34 ng/ml). En contraste, muchos de los anticuerpos mostrados en la Tabla 6 tienen una EC50 sobre células T de memoria (es decir, células CD4+CD45RA) de menos de 10 ng/ml, y todos ellos tienen una EC50 de menos de 35 ng/ml (también tienen una EC50 de más de 0.1 ng/ml en este ensayo). Adicionalmente, varios de los anticuerpos mostrados en la Tabla 6 demostraron una IC50 en un ensayo de competencia de MAdCAM de menos de 10 ng/ml y muchos demostraron una IC50 de menos de 30 ng/ml (todos exhibieron una IC50 de más de 0.1 ng/ml en este ensayo). Aunque Soler et al. no hicieron mención de la capacidad de vedolizumab para unir un mutante S250N de alfa4beta7, el anticuerpo de murino ACT-1 a partir del cual vedolizumab es derivado es conocido por ser incapaz de unir un mutante S250N (Tidswell et al., J Immunol. 159:1497; 197) y de acuerdo con Soler et al., vedolizumab y ACT-1 exhiben la misma especificidad de antígeno. Así, vedolizumab tampoco une el mutante S250N, en contraste con varios de los anticuerpos mostrados en la Tabla 6.

Ejemplo 4: Análisis adicional Varios anticuerpos representativos con diferentes propiedades en los ensayos funcionales antes mencionados fueron elegidos para análisis adicional como se describe más adelante.

Afinidad de unión a a4b7 humano Para medir la afinidad de unión celular de anticuerpos anti-alfa4beta7 humanos, se usó un Ensayo de exclusión cinetica, el cual mide eventos de unión en fase de solución para calcular la constante de constante de disociación de equilibrio, Kd, KinExA® Technology (Sapidyne Instruments, Boise, ID), substancialmente como se describe previamente por Xie et al. J. Imm., Methods 304:1 (2005) y Rathanaswami et al. Anal. Biochem. 373:52 (2008). Brevemente, células HUT78 que expresan alfa4beta7 humano fueron tituladas 1 en 3 de ~506 células/ml a ~400 células/ml y entonces se equilibraron con una concentración final de ya sea 2 o 30 pM de mAb 2F12 o 18A1 1 y 30 o 500 pM durante 17C8 durante 18 horas a 4°C. El anticuerpo libre restante en el sobrenadante en equilibrio fue medido mediante teenología KinExA® al pasar el sobrenadante sobre perlas PMMA pre-recubiertas con Fe anti-humano de cabra y detectado con (H+L) Cy5 anti-humano de cabra (substancialmente como se describe por Rathanaswami et al. Biochem Biophys Research Commun:1004 (2005). La constante de disociación de equilibrio (Kd) es obtenida usando el programa de cómputo KinExA® mediante “análisis de n-curvas”, el cual ajusta todas las curvas dadas a un solo valor de Kd simultáneamente (Rathanswami et al. 2005 y Xie et al., supra); los resultados son mostrados a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7: Afinidad de unión de anticuerpos Estos anticuerpos demostraron una Kd en un ensayo KinExA® mayor que 0.05 pM, pero menores que 80 pM, menores que 15 pM, o menores que 5 pM.

Características de PK/PD Un estudio farmacodinámico (PD) y farmacocinetico (PK) de dosis simple de tres anticuerpos anti-alfa4beta7 completamente humanos en monos cinomólogos machos fue conducido siguiendo administración intravenosa (IV; 5 mg/kg) o subcutánea (SC; 0. O mg/kg). Exposición PK inicial similar (C0; concentración en el tiempo cero) y distribución dentro de la circulación central después de 5 mg/kg IV fue observada. Después de la administración SC, tanto Cmax (concentración máxima en suero) y AUC (área bajo la curva de concentración-tiempo) exhibió la proporcionalidad de dosis dentro del rango de dosis 0.5-5 mg/kg SC para los tres anticuerpos. La biodispon ibilidad absoluta después de SC para los tres anticuerpos probados varió de 44 a 68%.

Alfa4beta7 libre sobre células T antes y después del tratamiento de anticuerpo fueron cuantificadas por anticuerpo anti-alfa4beta7 PE-conjugado 27G8. El nivel de soporte fue controlado al manchar con anticuerpo anti-alfa4beta7 PE-conjugado 27G8 en la presencia de 10 mg/ml de anticuerpo siendo probada antes y despues del tratamiento de anticuerpos. La saturación fraccionada fue determinada mediante porcentaje de sitios alfa4beta7 libres en comparación con el pre-tratamiento para cada anticuerpo. CD4-PerCP, CD99-APC y CD28-FITC se usaron para distinguir células de memoria central, natural y de memoria efectoras. La saturación fraccionada de alfa4beta7 sobre células T naturales, fue mostrada debido a la variabilidad y sensibilidad a ensayo limitada en la población de células de memoria de cinomólogo. Para tratamiento de 18A11 , los tres grupos de dosificación permanecieron saturados del día 1 a día 14. En el día 29, los tres grupos perdieron cobertura. Tanto en el tratamiento 2F12 y 17C8, se observó la pérdida de cobertura objetivo en el día 14 en el grupo de baja dosificación (0.5 mg/kg).

Además de la detección de alfa4beta7 libre, la saturación objetivo también fue determinada mediante manchado con anticuerpo anti-humano PE-conjugado A35 en la ausencia o presencia de 10 mg/ml de anticuerpo. Los sitios de alfa4beta7 totales fueron estimados con pre-incubación de muestras con 10 mg/ml de anticuerpo anti-alfa4beta7 seguido por manchado con anticuerpo anti-humano. La saturación objetivo fue determinada mediante el porcentaje de sitios alfa4beta7 totales ocupados por los anticuerpos anti-alfa4beta7 para cada muestra. Los tres anticuerpos anti-alfa4beta7 completamente humanos demostraron saturación de alfa4beta7 que fue mantenida en promedio de 81 a 100% dentro de 14 días despues de 5 mg/kg IV.

El modelado PK/PD fue conducido sobre concentraciones de anticuerpo anti-alfa4beta7 de suero y datos de saturación de receptor de alfa4beta7 correspondientes usando un modelo Emax directo. Los parámetros de PD estimados de modelo son Emax (saturación de receptor alfa4beta7 máxima) de 92%, EC50 (concentración de anticuerpo anti-alfa4beta7 a la cual 50% de la Emax fue alcanzada) de 52 ng/ml, y E0 (saturación de receptor alfa4beta7 inicial) de 18%. Los tres anticuerpos exhibieron efectos PD in vivo potentes sobre receptores de alfa4beta7 de saturación con t1/2 promedio de ~3-5 días en monos cinomólogos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende CDR1 , CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:37, y una región variable de la cadena ligera que comprende CDR1 , CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO:9.

2. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la región variable de la cadena ligera es por lo menos 90% identica a SEQ ID NO:9, y la región variable de la cadena pesada es por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO:37.

3. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero de conformidad con la reivindicación 2, en la cual la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO:9, y la región variable de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de un polipéptido que comprende SEQ ID NO:37 y un polipéptido que comprende SEQ ID NO:37 en donde el aminoácido N-terminal se convierte en ácido piroglutámico.

4. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 1 , la cual comprende también una región constante de la cadena ligera y una región constante de la cadena pesada.

5. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 4, en donde la región constante de la cadena ligera es una región constante de la cadena ligera de tipo kappa; y la región constante de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: a') una región constante proveniente de un anticuerpo IgD; b') una región constante proveniente de un anticuerpo I g E ; c') una región constante proveniente de un anticuerpo IgM; d') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG1 ; e') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG2; f) una región constante proveniente de un anticuerpo lgG3; g') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG4; y h') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG4 que tiene por lo menos una mutación en una región de gozne que alivia una tendencia a formar enlace disulfuro de cadena intra-H.

6. La protefna de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 4, en donde la región constante de la cadena ligera se selecciona a partir del grupo que consiste de: a) un polipeptido que comprende SEQ ID NO:70; b) un polipéptido por lo menos 90% idéntico a SEQ ID NO:70; c) un polipéptido de a) el cual Incorpora una o más modificaciones post-traslacionales; y d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se indica SEQ ID NO:70 de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido eliminados, y la región constante de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: a') un polipeptido que comprende SEQ ID NO:72; b’) un polipéptido por lo menos 90% idéntico a SEQ ID NO:72; c') un polipéptido de a') el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales; y d') un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se indica SEQ ID NO:72 de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido eliminados.

7. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 2 la cual comprende también una región constante de la cadena ligera y una región constante de la cadena pesada.

8. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región constante de la cadena ligera es una región constante de la cadena ligera de tipo kappa; y la región constante de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: a') una región constante proveniente de un anticuerpo IgD; b') una región constante proveniente de un anticuerpo IgE; c') una región constante proveniente de un anticuerpo IgM; d') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG1 ; e') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG2; f) una región constante proveniente de un anticuerpo lgG3; g') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG4; y h') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG4 que tiene por lo menos una mutación en una región de gozne que alivia una tendencia a formar enlace disulfuro de cadena intra-H.

9. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 7, en donde la región constante de la cadena ligera se selecciona a partir del grupo que consiste de: a) un polipeptido que comprende SEQ ID NO:70; b) un polipéptido por lo menos 90% idéntico a SEQ ID N 0 : 70 ; c) un polipéptido de a) el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales; y d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se indica SEQ ID NO:70 de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido eliminados, y la región constante de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: a') un polipéptido que comprende SEQ ID NO:72; b') un polipéptido por lo menos 90% idéntico a SEQ ID NO:72; c') un polipeptido de a') el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales; y d') un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se indica SEQ ID NO:72 de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido eliminados.

10. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 3, la cual comprende también una región constante de la cadena ligera y una región constante de la cadena pesada.

11 . La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 10, en donde la región constante de la cadena ligera es una región constante de la cadena ligera de tipo kappa; y la región constante de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: a') una región constante proveniente de un anticuerpo IgD; b') una región constante proveniente de un anticuerpo Ig E ; c') una región constante proveniente de un anticuerpo IgM; d') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG1 ; e') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG2; f) una región constante proveniente de un anticuerpo IgG 3 ; g') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG4; y h') una región constante proveniente de un anticuerpo lgG4 que tiene por lo menos una mutación en una región de gozne que alivia una tendencia a formar enlace disulfuro de cadena intra-H.

12. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 10, en donde la región constante de la cadena ligera se selecciona a partir del grupo que consiste de: a) un polipeptido que comprende SEQ ID NO:70; b) un polipéptido por lo menos 90% idéntico a SEQ ID NO:70; c) un polipéptido de a) el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales; y d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se indica SEQ ID NO:70 de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido eliminados, y la región constante de la cadena pesada se selecciona a partir del grupo que consiste de: a') un polipéptido que comprende SEQ ID NO:72; b') un polipéptido por lo menos 90% idéntico a SEQ ID NO:72; c') un polipéptido de a') el cual incorpora una o más modificaciones post-traslacionales; y d') un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se indica SEQ NO:72 de la cual uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos N-terminales y/o C-terminales han sido eliminados.

13. Una proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada que tiene una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO:37, y la región variable de la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO:9.

14. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 13, en donde el ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena pesada comprende SEQ ID NO:64, y el ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena ligera comprende SEQ ID NO:63.

15. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 13, la cual comprende tambien una región constante de la cadena ligera y una región constante de la cadena pesada, en donde la región constante de la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO:70 y la región constante de la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO:72.

16. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 15, en donde la región constante de la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:69, y la región constante de la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:71.

17. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 14, la cual comprende tambien una región constante de la cadena ligera y una región constante de la cadena pesada, en donde la región constante de la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO:70 y la región constante de la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que codifica para SEQ ID NO:72.

18. La proteína de unión a antígeno específica de heterodímero alfa4beta7, aislada de conformidad con la reivindicación 17, en donde la región constante de la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ NO:69, y la región constante de la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:71 .

19. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 1 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

20. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 2 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

21 . Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 3 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

22. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 4 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

23. Una composición que comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 5 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

24. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 6 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

25. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 7 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

26. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 8 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

27. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 9 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

28. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 10 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

29. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 1 1 y un diiuyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

30. Una composición que comprende la proteína de conformidad con ia reivindicación 12 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

31. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 13 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

32. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 14 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

33. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 15 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

34. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 16 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

35. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 17 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.

36. Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 18 y un diluyente, excipiente o portador fisiológicamente aceptable.