MX2014006571A - Polipeptidos que tienen actividad de xilanasa y polinucleotidos que los codifican. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, dominios catalíticos y dominios de unión a carbohidrato, y polinucleótidos que codifican los polipéptidos, dominios catalíticos y dominios de unión a carbohidrato. La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos, así como a métodos para producir y utilizar los polipéptidos, dominios catalíticos y dominios de unión a carbohidrato.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE XILANASA Y POLINUCLEOTIDOS QUE LOS CODIFICAN CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, dominios catalíticos y dominios de unión a carbohidrato, y polinucleótidos que codifican los polipéptidos, dominios catalíticos y dominios de unión a carbohidrato. La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos, así como métodos para producir y utilizar los polipéptidos, dominios catalíticos y dominios de unión a carbohidrato.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La lignocelulosa, el recurso de biomasa renovable más grande del mundo, está compuesta principalmente por lignina, celulosa y hemicelulosa, siendo una gran parte de esta última xilano. Las xilanasas (por ejemplo, endo-1, 4-beta-xilanasa, EC 3.2.1.8) hidrolizan conexiones ß- 1 , 4 -xilosídicas internas en xilano para producir xilosa y xilo-oligómeros de peso molecular más pequeño. Los xilanos son polisacáridos formados de D-xilopiranosas unidas por 1, 4^-glicósido. Las beta-xilosidasas catalizan la exo-hidrólisis de (1?4)-xilooligosacáridos beta cortos para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de extremos terminales no reductores.

Ref . :247886 La celulosa es un polímero de glucosa unido por enlaces beta- 1,4. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos unidos a beta. Estas enzimas incluyen endoglucanasas , celobiohidrolasas y beta-glucosidasas . Las endoglucanasas digieren el polímero de celulosa en ubicaciones aleatorias, abriéndolo al ataque por parte de celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa unido a beta-1,4 soluble en agua. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa para convertirla en glucosa.

La conversión de materias primas lignocelulósicas en etanol tiene las ventajas de la fácil disponibilidad de grandes cantidades de materia prima, el deseo de evitar quemar o rellenar vertederos con los materiales y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, cultivos herbáceos y desechos sólidos municipales se han considerado como materias primas para la producción de etanol. Estos materiales consisten principalmente en celulosa, hemicelulosa y lignina. Una vez que la lignocelulosa se convierte en azúcares fermentables , por ejemplo, glucosa, las azúcares fermentables se fermentan fácilmente mediante levadura para convertirse en etanol.

Existe la necesidad en la técnica de mejorar las composiciones enzimáticas celulolíticas a través de la complementación con enzimas adicionales para aumentar la eficiencia y proporcionar soluciones de enzimas rentables para la degradación de lignocelulosa .

La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad de xilanasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de xilanasa seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 ; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en al menos condiciones de rigurosidad alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la misma o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de xilanasa.

La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que comprenden un dominio catalítico seleccionado a partir del grupo constituido por: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2; (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que se híbrida al menos en condiciones de rigurosidad alta con los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; o el complemento de longitud completa de la misma; (c) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; (d) una variante de los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del dominio catalítico de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad potenciadora celulolítica .

La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que comprenden un dominio de unión a carbohidrato ligado operablemente a un dominio catalítico, en donde el dominio de unión se selecciona del grupo que consiste en: (a) un dominio de unión a carbohidrato que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 ; (b) un dominio de unión a carbohidrato codificado por un polinucleótido que se híbrida al menos en condiciones de rigurosidad alta con los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de longitud completa de la misma; (c) un dominio de unión a carbohidrato codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1; (d) una variante de los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del dominio de unión a carbohidrato de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de unión.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención; constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células hospederas recombinantes que comprenden los polinucleótidos; y métodos para producir los polipéptidos.

La presente invención también se refiere a procesos para degradar o convertir un material celulósico o que contiene xilano que comprenden: tratar el material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención. En un aspecto, los procesos comprenden además recuperar el material celulósico o que contiene xilano degradado o convertido.

La presente invención también se refiere a procesos para producir un producto de fermentación que comprende: (a) sacarificar un material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que contiene actividad de xilanasa de la presente invención; (b) fermentar el material celulósico o que contiene xilano sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

La presente invención también se refiere a procesos para fermentar un material celulósico o que contiene xilano que comprenden: fermentar el material celulósico o que contiene xilano con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico o que contiene xilano se sacarifica con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención. En un aspecto, la fermentación del material celulósico o que contiene xilano produce un producto de fermentación. En otro aspecto, los procesos comprenden además recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido señal que comprende o está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 22 de la SEQ ID NO: 2, que está ligado operablemente a un gen que codifica una proteína, en donde la proteína es ajena al péptido señal; constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospederas recombinantes que comprenden los polinucleótidos ; y métodos para producir una proteína.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de la xilanasa GH10 de Penicillium capsulatum (P244K1) en hidrólisis de mazorcas de maíz pretratadas alcalinamente tamizadas molidas para obtener glucosa a 50-60°C por una composición enzimática.

La Figura 2 muestra el efecto de la xilanasa GH10 de Penicillium capsulatum (P244K1) en hidrólisis de mazorcas de maíz pretratadas alcalinamente tamizadas molidas para obtener xilosa a 50-60°C por una composición enzimática.

Definiciones Acetilxilan esterasa: La expresión "acetilxilan esterasa" significa una carboxilesterasa (EC 3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, alfa-naftil acetato y p-nitrofenil acetato. Parpara los efectos de la presente invención, la actividad de acetilxilan esterasa se determina utilizando 0.5 mM de p-nitrofenilacetato como sustrato en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 que contiene 0.01% TWEEN™ 20 (monolaurato de polioxietilensorbitán) . Una unidad de acetilxilan esterasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µp??? de anión de p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25 °C.

Variante alélica: La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede dar como resultado polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Alfa-L-arabinofuranosidasa: La expresión "alfa-L-arabinofuranosidasa" significa una alfa-L-arabinofuranosida arabinofuranohidrolasa (EC 3.2.1.55) que cataliza la hidrólisis de residuos de alfa-L-arabinofuranosida no reductores terminales en alfa-L-arabinosidas . La enzima actúa en alfa-L-arabinofuranosidas , alfa-L-arabinanos que contienen conexiones (1,3)- y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . La alfa-L-arabinofuranosidasa se conoce también como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa, polisacárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranosida hidrolasa, L-arabinosidasa o alfa-L-arabinanasa . Parpara los efectos de la presente invención, la actividad de alfa-L-arabinofuranosidasa se determina utilizando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidad media (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co . icklow, Irlanda) por mi de 100 mM de acetato de sodio pH 5 en un volumen total de 200 µ? durante 30 minutos a 40 °C seguido por análisis de arabinosa mediante cromatografía en columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.).

Alfa-glucuronidasa: El término "alfa-glucuronidasa" significa una alfa-D-glucosiduronato glucuronohidrolasa (EC 3.2.1.139) que cataliza la hidrólisis de una alfa-D-glucuronosida en D-glucuronato y un alcohol. Parpara los efectos de la presente invención, la actividad de alfa-glucuronidasa se determinó de acuerdo con de Vries, 1998, J. Bacteriol . 180: 243-249. Una unidad de al a-glucuronidasa equivale a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µp??? de ácido glucurónico o 4-O-metilglucurónico por minuto a pH 5, 40 °C.

Beta-glucosidasa: El término "beta-glucosidasa" significa una D-glucósido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de residuos de beta-D-glucosa no reductores terminales con la liberación de beta-D-glucosa. Para los efectos de la presente invención, la actividad de beta-glucosidasa se determina utilizando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosida como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol . 42: 55-66. Una unidad de beta-glucosidasa se define como 1.0 µ???? de anión de p-nitrofenolato producido por minuto a 25 °C, pH 4.8 de 1 mM de p-nitrofenil -beta-D-glucopiranosida como sustrato en 50 mM de citrato de sodio que contiene 0.01% de TWEEN® 20.

Beta-xilosidasa : El término "beta-xilosidasa" significa una beta-D-xilosida xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.37) que cataliza la exo-hidrólisis de ( 1?4 ) -xilooligosacáridos beta cortos para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos de extremos terminales no reductores . Para los efectos de la presente invención, una unidad de beta-xilosidasa se define como 1.0 umol de anión de p-nitrofenolato producido por minuto a 40°C, pH 5 de 1 mM de p-nitrofenil-beta-D-xilosida como sustrato en 100 mM de citrato de sodio que contiene 0.01% de TWEEN® 20.

Dominio de unión a carbohidrato: La expresión "dominio de unión a carbohidrato" significa la región de una enzima que media la unión de la enzima a regiones amorfas de un sustrato de celulosa. El dominio de unión a carbohidrato (CBD) se encuentra típicamente en el N-terminal o en el C-terminal de una enzima.

Dominio catalítico: La expresión "dominio catalítico" significa la región de una enzima que contiene la maquinaria catalítica de la enzima.

ADNc: El término "ADNc " se refiere a una molécula de ADN que puede prepararse mediante transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm maduro, que ya ha experimentado corte y empalme, obtenida a partir de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias de tipo intrón que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de varios pasos, incluido el corte y empalme, antes de aparecer como un ARNm maduro que ya ha experimentado corte y empalme .

Celobiohidrolasa: El término "celobiohidrolasa" significa una 1 , -beta-D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91 y E.C. 3.2.1.176) que cataliza la hidrólisis de conexiones 1 , 4 -beta-D-glucosídicas en celulosa, celooligosacáridos o cualquier glucosa unida a beta-1,4 que contiene polímero, que libera celobiosa del extremo reductor (celobiohidrolasa I) o N-terminalo reductor (celobiohidrolasa II) de la cadena (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases , Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al . , 1998, Biochem. Soc . Trans . 26: 173-178). La actividad de celobiohidrolasa se determina de acuerdo con los procedimientos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh y Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; y Tomme et al., 1988, Eur . J. Biochem. 170: 575-581.

Enzima celulolítica o celulasa: La expresión "enzima celulolítica" o "celulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico. Las enzimas incluyen endoglucanasa (s) , celobiohidrolasa (s) , beta-glucosidasa (s) o combinaciones de los mismos. Los dos abordajes básicos para medir la actividad celulolítica incluyen: (1) medir la actividad celulolítica total y (2) medir las actividades celulolíticas individuales (endoglucanasas , celobiohidrolasas , y beta-glucosidasas) como se ha descrito en Zhang et al., Outlook for cellulase improvement : Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad celulolítica total se mide generalmente utilizando sustratos insolubles, incluyendo papel de filtro hatman N'l, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa algal, algodyn, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo de papel de filtro utilizando papel de filtro Whatman ?? como sustrato. El ensayo se estableció por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities. Puré Appl . Chem. 59: 257-68).

Para los efectos de la presente invención, la actividad de la enzima celulolítica se determina midiendo el aumento en hidrólisis de un material celulósico mediante enzima (s) celulolítica (s) en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína enzimática celulolítica/g de celulosa en PCS (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada, por ejemplo, 50°C, 55°C o 60°C, en comparación con una hidrólisis testigo sin adición de proteína enzimática celulolítica. Condiciones típicas son 1 mi de reacciones, lavadas o sin lavar de PCS, 5% de sólidos insolubles, 50 mM de citrato de sodio pH 5, 1 m de MnS04, 50°C, 55°C o 60°C, 72 horas, análisis de azúcar mediante columna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.).

Material celulósico: La expresión "material celulósico" significa cualquier material que contiene celulosa. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa es celulosa, el segundo más abundante es hemicelulosa y el tercero es pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha dejado de crecer, también contiene polisacáridos y se refuerza mediante lignina polimérica covalentemente reticulada a hemicelulosa . La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y de este modo un beta- (1-4) -D-glucano lineal, mientras que las hemicelulosas incluyen una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos , arabinoxilanos y mananos en estructuras ramificadas complejas con un espectro de sustituyentes . Aunque es generalmente polimorfa, la celulosa se encuentra en tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas de glucano paralelas. Las hemicelulosas generalmente se enlazan con hidrógeno a celulosa, así como a otras hemicelulosas, que ayudan a estabilizar la matriz de pared celular.

La celulosa se encuentra generalmente, por ejemplo, en los tallos, hojas, vainas, cáscaras y mazorcas de plantas u hojas, ramas y madera de árboles. El material celulósico puede ser, de modo no taxativo, residuo agrícola, material herbáceo (incluyendo cultivos de energía) , desechos sólidos municipales, residuos de fábricas de pulpa y papel, papel de desecho, y madera (incluyendo residuo forestal) (ver, por ejemplo, iselogel et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), páginas 105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics , in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor en jefe, Volumen 65, páginas 23-40, Springer-Verlag, New York) . Se comprende en la presente que la celulosa puede estar en la forma de lignocelulosa, un material de pared celular vegetal que contiene lignina, celulosa y hemicelulosa en una matriz mezclada. En un aspecto preferido, el material celulósico es cualquier material de biomasa. En otro aspecto preferido, el material celulósico es lignocelulosa, que comprende celulosa, hemicelulosas y lignina.

En un aspecto, el material celulósico es residuo agrícola. En otro aspecto, el material celulósico es material herbáceo (incluyendo cultivos de energía) . En otro aspecto, el material celulósico es desecho sólido municipal. En otro aspecto, el material celulósico es residuo de fábrica de pulpa o papel. En otro aspecto, el material celulósico es desecho de papel. En otro aspecto, el material celulósico es madera (incluyendo residuo forestal) .

En otro aspecto, el material celulósico es caña común. En otro aspecto, el material celulósico es bagazo. En otro aspecto, el material celulósico es bambú. En otro aspecto, el material celulósico es mazorca de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es fibra de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es forraje de maíz. En otro aspecto, el material celulósico es miscanthus. En otro aspecto, el material celulósico es cáscara de naranja. En otro aspecto, el material celulósico es paja de arroz. En otro aspecto, el material celulósico es pasto varilla. En otro aspecto, el material celulósico es paja de trigo.

En otro aspecto, el material celulósico es chopo. En otro aspecto, el material celulósico es eucalipto. En otro aspecto, el material celulósico es abeto. En otro aspecto, el material celulósico es pino. En otro aspecto, el material celulósico es álamo. En otro aspecto, el material celulósico es pícea. En otro aspecto, el material celulósico es sauce.

En otro aspecto, el material celulósico es celulosa algal . En otro aspecto, el material celulósico es celulosa bacteriana. En otro aspecto, el material celulósico es linter de algodón. En otro aspecto, el material celulósico es papel de filtro. En otro aspecto, el material celulósico es celulosa microcristalina . En otro aspecto, el material celulósico es celulosa tratada con ácido fosfórico.

En otro aspecto, el material celulósico es una biomasa acuática. Tal como se utiliza en la presente la expresión "biomasa acuática" significa biomasa producida en un ambiente acuático mediante un proceso de fotosíntesis. La biomasa acuática puede ser algas, plantas emergentes, plantas de hojas flotantes o plantas sumergidas.

El material celulósico puede utilizarse si se somete a pretratamiento, utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica, como se describe en la presente. En un aspecto preferido, el material celulósico se pretrata.

Secuencia codificante: La expresión "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido el cual específica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG y termina con un codón de finalización tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de estos.

Secuencias de control: La expresión "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativo o exógeno entre sí. Las secuencias de control de este tipo incluyen, sin carácter limitante, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de tipo propéptido, un promotor, una secuencia de tipo péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Pueden proporcionarse secuencias de control con enlazantes a efectos de introducir sitios de restricción específicos facilitando la ligadura de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido .

Endoglucanasa: El término "endoglucanasa" significa una endo-1, - (1, 3 ; 1, 4) -beta-D-glucan 4 -glucanohidrolasa (E.C. 3.2.1.4) que cataliza la endohidrólisis de conexiones 1,4-beta-D-glicosídicas en celulosa, derivados de celulosa (tales como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa) , liquenina, enlaces beta-1,4 en glucanos beta-1,3 mezclados tales como glucanos beta-D de cereal o xiloglucanos , y otro material vegetal que contiene componentes celulósicos. La actividad de endoglucanasa puede determinarse a través de la medición de la reducción en la viscosidad del sustrato o el aumento en la reducción de los extremos determinada por un ensayo de reducción de azúcar (Zhang efc al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para los efectos de la presente invención, la actividad de endoglucanasa se determina mediante el uso de carboximetil celulosa (QIC) como sustrato de acuerdo con el procedimiento de Ghose, 1987, Puré andAppl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40°C.

Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa que participa en la producción de un polipéptido que incluye, a modo no taxativo, transcripción, modificación post-transcripcional , traducción, modificación post -traducción y secreción.

Vector de expresión: La expresión "vector de expresión" significa una molécula de ADN circular o lineal que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está ligado operablemente a secuencias de control que proporcionan su expresión.

Glicósido hidrolasa de la familia 61: La expresión "glicósido hidrolasa de la familia 61" o "familia GH61" o "GH61" significa un polipéptido dentro de la Familia 61 de glicósido hidrolasas de acuerdo con Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities , Biochem. J. 280: 309-316, y Henrissat B., y Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. Las enzimas en esta familia se clasificaron originalmente como una familia de glicósido hidrolasas en base a la medición de actividad de endo-1, 4-beta-D-glucanasa muy débil en un miembro de la familia. La estructura y modo de acción de estas enzimas son no canónicos y no pueden considerarse como glicosidasas genuinas . Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZy en base a su capacidad de mejorar la desintegración de lignocelulosa cuando se utiliza en conjunto con una celulasa o una mezcla de celulasas.

Feruloil esterasa: La expresión "feruloil esterasa" significa una hidrolasa de azúcar 4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (EC 3.1.1.73) que cataliza la hidrólisis de grupos 4-hidroxi-3 -metoxicinamoilo (feruloilo) de azúcar esterificada, que es generalmente arabinosa en sustratos de biomasa naturales, para producir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato) . La feruloil esterasa es también conocida como esterasa de ácido ferúlico, hidroxicinamoil esterasa, FAE-III, cinamoil éster hidrolasa, FAEA, cinnAE, FAE-I o FAE-II. Para los efectos de la presente invención, la actividad de feruloil esterasa se determina utilizando 0.5 mM de p-nitrofenilferulato como sustrato en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0. Una unidad de feruloil esterasa equivale a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µ???? de anión de p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.

Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido o un dominio catalítico o un dominio de unión a carbohidrato que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del N-terminal y/o carboxilo de un polipéptido o dominio maduro; en donde el fragmento tiene actividad de xilanasa o actividad de unión a carbohidrato. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 320 residuos de aminoácidos, por ejemplo, al menos 340 residuos de aminoácidos o al menos 360 residuos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Enzima hemicelulolítica o hemicelulasa: La expresión "enzima hemicelulolítica" o "hemicelulasa" significa una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material hemicelulósico . Ver, por ejemplo, Shallom, D. y Shoham, Y. Microbial hemicellulases . Current Opinión In Microbiology, 2003, 6 (3) : 219-228). Hemicelulasas son componentes clave en la degradación de biomasa vegetal. Ejemplos de hemicelulasas incluyen, a modo no taxativo, una acetilmananesterasa, una acetilxilan esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido coumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa, una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa y una xilosidasa. Los sustratos de estas enzimas, las hemicelulosas , son un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados y lineales que están unidos a través de enlaces de hidrógeno a los microfibrilos de celulosa en la pared celular vegetal, reticulándolos en una red robusta. Las hemicelulosas también se unen covalentemente con lignina, formando con la celulosa una estructura altamente compleja. La estructura y organización variables de las hemicelulosas requieren la acción concertada de muchas enzimas para su degradación completa. Los módulos catalíticos de hemicelulasas son glicósido hidrolasas (GHs) que hidrolizan enlaces glicosídicos o carbohidrato esterasas (CEs) , que hidrolizan conexiones de éster de grupos laterales de acetato o ácido ferúlico. Estos módulos catalíticos, en base a homología de su secuencia primaria, pueden asignarse en familias GH y CE. Algunas familias, con un pliegue similar general, pueden agruparse además en clanes, marcados alfabéticamente (por ejemplo, GH-A) . Una clasificación más informativa y actualizada de estas y otras enzimas activas sobre carbohidratos está disponible en la base de datos de Enzimas Activas sobre Carbohidratos (CAZy) . Las actividades de enzima hemicelulolítica puede medirse de acuerdo con Ghose y Bisaría, 1987, Puré & Appl . Chem. 59: 1739-1752, a temperatura adecuada, por ejemplo, 50 °C, 55 °C o 60 °C, y pH, por ejemplo, 5.0 o 5.5.

Condiciones de rigurosidad alta: La expresión "condiciones de rigurosidad alta" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 50% de formamida, seguido por procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS a 65°C.

Células hospederas: La expresión "célula hospedera" significa cualquier tipo de célula que es susceptible a la transformación, transíección, transducción o similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula original que no sea idéntica a la célula original debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Aislado: El término "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no ocurre en la naturaleza. Ejemplos no taxativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia incluyendo, a modo no taxativo, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se eliminó parcialmente de uno o más o todos los constituyentes naturales con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por el hombre con respecto a esa sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de sustancia con respecto a otros componentes con los cuales está asociado naturalmente (por ejemplo, producción recombinante en una célula hospedera; múltiples copias de un gen que codifica la sustancia y uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente con el gen que codifica la sustancia) .

Condiciones de rigurosidad baja: La expresión "condiciones de rigurosidad baja" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 25% de formamida, seguido por procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS a 50°C.

Polipéptido maduro: La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final luego de la traducción y cualquier modificación post-traducción, tal como procesamiento del N-terminal, truncación del C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 23 y 400 de la SEQ ID NO: 2 (P244K1) en base al programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice los aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID NO: 2 son un péptido señal. En la técnica existe constancia de que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido diferente en el C-terminal y/o el N-terminal) expresados por el mismo polinucleótido .

Secuencia que codifica el polipéptido maduro: La expresión "secuencia que codifica el polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de xilanasa. En un aspecto, la secuencia que codifica el polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos comprendidos entre el nucleótido 67 y 1435 de la SEQ ID NO: 1 (D72Z3A) o la secuencia de ADNc de la misma en base al programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice los nucleótidos 1 a 66 de la SEQ ID NO: 1 codifican un péptido señal.

Condiciones de rigurosidad media: La expresión "condiciones de rigurosidad media" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 35% de formamida, seguido por procedimientos de Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas . El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS a 55°C.

Condiciones de rigurosidad media-alta: La expresión "condiciones de rigurosidad media-alta" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 35% de formamida, seguido por procedimientos De Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS a 60°C.

Constructo de ácido nucleico: La expresión "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono o bicatenaria, la cual se aisla a partir de un gen de origen natural o se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de un modo sintético o que no existiría en la naturaleza, que comprende una o más secuencias de control .

Ligado operablemente: La expresión "ligado operablemente" se refiere a una configuración en la cual una secuencia de control se coloca en una posición adecuada respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de modo que la secuencia de control dirija la expresión de la secuencia codificante.

Polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica: La expresión "polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica" significa un polipéptido GH61 que cataliza la mejora de la hidrólisis de un material celulósico por la enzima que tiene actividad celulolítica. Para los efectos de la presente invención, la actividad potenciadora celulolítica se determina midiendo el aumento en azúcares reductores o el aumento de celobiosa y glucosa de la hidrólisis de un material celulósico por la enzima celulolítica en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína total/g de celulosa en forraje de maíz pretratado (PCS) , en donde la proteína total comprende 50-99.5% p/p de proteína enzimática celulolítica y 0.5-50% p/p de proteína de un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica durante 1-7 días a temperatura adecuada, tal como 40°C-80°C, por ejemplo, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C o 70°C, y un pH adecuado, tal como 4-9, por ejemplo, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 o 7.0, en comparación con una hidrólisis testigo con igual carga de proteína total sin actividad potenciadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS) . En un aspecto preferido, una mezcla de CELLUCLAST® 1.5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) en presencia de 2-3% de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae de peso de proteína total (producida recombinantemente en Aspergillus oryzae de acuerdo con WO 02/095014) o 2-3% de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus de peso de proteína total (producida recombinantemente en Aspergillus oryzae como se describe en WO 2002/095014) de carga de proteína de celulasa se utiliza como la fuente de la actividad celulolítica .

Los polipéptidos GH61 que tienen actividad potenciadora celulolítica mejoran la hidrólisis de un material celulósico catalizado por la enzima que tiene actividad celulolítica reduciendo la cantidad de enzima celulolítica requerida para alcanzar el mismo grado de hidrólisis preferiblemente al menos 1.01-veces, por ejemplo, al menos 1.05-veces, al menos 1.10-veces, al menos 1.25-veces, al menos 1.5-veces, al menos 2 -veces, al menos 3 -veces, al menos 4 -veces, al menos 5-veces, al menos 10 -veces o al menos 20 -veces.

Forraje de maíz pretratado: El término "PCS" o "Forraje de maíz pretratado" significa un material celulósico derivado de forraje de maíz mediante tratamiento con calor y ácido sulfúrico diluido, pretratamiento alcalino, pretratamiento neutral o cualquier pretratamiento conocido en la técnica.

Identidad secuencial: La afinidad entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por el parámetro "identidad secuencial".

Para los efectos de la presente invención, la identidad secuencial entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y unsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS ("EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277) , preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62) . El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción - nobries) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Residuos idénticos x 100) / (Longitud de alineación -Número total de huecos en alineación) Para los efectos de la presente invención, la identidad secuencial entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) según se implemento en el programa Needle del paquete de EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de huecos de 10, una penalización por extensión de huecos de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción - nobries) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100 )/ (Longitud de alineación - Número total de huecos en alineación) Subsecuencia: El término " subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia que codifica un polipéptido maduro; en donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad de xilanasa. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos 960 nucleótidos, por ejemplo, al menos 1020 nucleótidos o al menos 1080 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de xilanasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o supresión, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución se refiere al reemplazo del aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción se refiere a la supresión del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a la adición de un aminoácido adyacente a un aminoácido que ocupa una posición y que le sigue inmediatamente.

Condiciones de rigurosidad muy alta: La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 50% de formamida, seguido por procedimientos De Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS a 70°C.

Condiciones de rigurosidad muy baja: La expresión "condiciones de rigurosidad muy alta" significa sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, y 25% de formamida, seguido por procedimientos De Southern Blot estándar durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces durante 15 minutos cada vez utilizando 2X SSC, 0.2% de SDS a 45°C.

Material que contiene xilano: La expresión "material que contiene xilano" significa cualquier material que comprende un polisacárido de pared celular vegetal que contiene una estructura principal de residuos de xilosa unidos a beta- (1-4). Los xilanos de plantas terrestres son heteropolímeros que poseen una estructura principal de beta- (1-4) -D-xilopiranosa, que está ramificada por cadenas de carbohidrato cortas. Los mismos comprenden ácido D-glucurónico o su 4 -O-metiléter, L-arabinosa, y/o varios oligosacáridos , compuestos por D-xilosa, L-arabinosa, D- o L-galactosa y D-glucosa. Los polisacáridos de tipo xilano pueden dividirse en homoxilanos y heteroxilanos , que incluyen glucuronoxilanos , (arabino) glucuronoxilanos, (glucurono) arabinoxilanos, arabinoxilanos y heteroxilanos complejos. Ver, por ejemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci . 186: 1-67.

En los procesos de la presente invención, puede utilizarse cualquier material que contiene xilano. En un aspecto preferido, el material que contiene xilano es lignocelulosa .

Actividad degradadora de xilano o actividad xilanolítica: La expresión "actividad degradadora de xilano" o "actividad xilanolítica" significa una actividad biológica que hidroliza el material que contiene xilano. Los dos abordajes básicos para medir la actividad xilanolítica incluyen: (1) medir la actividad xilanolítica total y (2) medir las actividades xilanolíticas individuales (por ejemplo, endoxilanasas , beta-xilosidasas , arabinofuranosidasas , alf -glucuronidasas , acetilxilan esterasas, feruloil esterasas y alfa-glucuronil esterasas) . El avance reciente en ensayos de enzimas xilanolíticas se resumió en varias publicaciones, incluyendo Biely y Puchard, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova y Biely, 2006, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, y Kubicek, 1997, Biochemical Journal 321: 375-381.

La actividad degradadora de xilano total puede medirse mediante la determinación de los azúcares reductores formados de varios tipos de xilano, incluyendo, por ejemplo, xilanos de cascarilla de avena, madera de haya y madera de alerce, o mediante determinación fotométrica de fragmentos de xilano teñidos liberados de varios xilanos teñidos covalentemente . El ensayo de actividad xilanolítica total más común se basa en la producción de azúcares reductores de 4-0-metil glucuronoxilano polimérico como se describe en Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23 (3) : 257-270. La actividad de xilanasa también puede determinarse con 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en 0.01% de TRITON® X-100 (4- (1, 1, 3, 3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol) y 200 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6 a 37°C. Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1.0 µ???? de azurina producida por minuto a 37 °C, pH 6 de 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en 200 mM de fosfato de sodio pH 6.

Para los efectos de la presente invención, la actividad degradadora de xilano se determina midiendo el aumento en hidrólisis de xilano de madera de abedul (Sigma Chemical Co., Inc., St . Louis, MO, EE.UU.) mediante enzimas degradadoras de xilano en las siguientes condiciones: 1 mi de reacciones, 5 mg/ml de sustrato (sólidos totales) , 5 mg de proteína xilanolítica/g de sustrato, 50 mM de acetato de sodio pH 5, 50°C, 24 horas, análisis de azúcar utilizando un ensayo de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PHBAH) como se describe en Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Bioche 47: 273-279.

Xilanasa: El término "xilanasa" significa una 1,4-beta- D-xilano-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de conexiones 1 , 4 -beta-D-xilosídicas en xilanos. Para los efectos de la presente invención, la actividad de xilanasa se determina con 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en 0.01% de TRITON® X-100 y 200 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio pH 6 a 37°C.

Una unidad de actividad de xilanasa se define como 1.0 µ???? de azurina producida por minuto a 37°C, pH 6 de 0.2% de AZCL-arabinoxilano como sustrato en 200 mM de fosfato de sodio pH 6.

Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% y al menos 100% de la actividad de xilanasa del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Polipéptidos que tienen actividad de xilanasa En una modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene una identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 de al menos 80%, por ejemplo, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%, que tiene actividad de xilanasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

Un polipéptido de la presente invención comprende o está constituido preferentemente por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; o una variante alélica de la misma; o es un fragmento de la misma que tiene actividad de xilanasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, el polipéptido comprende o está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 23 y 400 de la SEQ ID NO: 2.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de xilanasa codificada por polinucleótidos que se hibridan en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la misma, o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .

El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1, o una subsecuencia de la misma, así como el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, el polipéptido maduro de la misma o un fragmento de la misma, puede utilizarse para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar polipéptidos que codifican ADN que tienen actividad de xilanasa de cepas de diferentes géneros o especies de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, este tipo de sondas se pueden utilizar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos estándar de Southern Blot, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este. Las sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de AR . Las sondas se etiquetan típicamente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina) . La presente invención abarca este tipo de sondas.

Una biblioteca de ADN o ADNc genómico preparada a partir de otras cepas puede someterse a estudio para detectar ADN que se híbrida con las sondas descritas anteriormente y codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa. El ADN genómico o de otro tipo procedente de otras cepas de este tipo se puede separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, o mediante otras técnicas de separación. El ADN de las colecciones o el ADN separado se puede transferir a nitrocelulosa u otro material portador adecuado e inmovilizarlo sobre este. Con el fin de identificar un clon o ADN que se hibride con la SEQ ID NO: 1, la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la misma, o una subsecuencia de la misma, el material portador se utiliza en una Southern Blot .

Para los efectos de la presente invención, la hibridación indica que los polinucleótidos se hibridan con una sonda de ácido nucleico etiquetada que corresponde a (i) la SEQ ID NO: 1; (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la misma; (iii) la secuencia de ADNc de la misma; (iv) el complemento de longitud completa de la misma; o (v) una subsecuencia de la misma; en condiciones de rigurosidad muy baja a muy alta. Las moléculas con las cuales se híbrida la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica .

En un aspecto, la sonda de ácidos nucleicos está constituida por un polinucleótido que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 2; el polipéptido maduro de este; o un fragmento de este. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico está constituida por la SEQ ID NO: 1; la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la misma; o la secuencia de ADNc de la misma.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de xilanasa codificada por polinucleótidos que tienen una identidad secuencial con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma de al menos 80%, por ejemplo, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En un aspecto, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidos en el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o actividad de la proteína; deleciones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el N-terminal o en el C-terminal, tales como un residuo de metionina en el N-terminal; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como una región de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Algunos ejemplos de sustituciones conservadoras son las sustituciones dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos de bajo peso molecular (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . En la técnica existe constancia de sustituciones de aminoácidos que no alteran, generalmente, la actividad específica y han sido descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

Alternativamente, los cambios de los aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades físico-químicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios de los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de escaneo de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, las mutaciones de solo alanina se introducen en cada residuo en la molécula y las moléculas mutantes resultantes se evalúan para detectar la actividad de xilanasa para identificar residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Remítase también a Hilton et al., 1996, J. Biol .

Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse mediante análisis físico de la estructura, según se determina mediante las técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de aminoácidos de sitio de contacto posible. Remítase, por ejemplo, a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir a partir de una alineación con un polipéptido relacionado .

Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de un único o múltiples aminoácidos pueden realizarse y evaluarse utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o transposición, seguidos por un procedimiento de evaluación relevante, tal como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. íVatl . Acad. Sci. EE.UU. 86: 2152-2156; WO 95/17413 o WO 95/22625. Otros métodos que pueden utilizarse incluyen PCR susceptible a errores, expresión de bacteriófagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE . UU. N.° 5,223,409; WO 92/06204) , mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127) .

Los métodos de mutagénesis/transposición pueden combinarse con métodos de detección automatizada de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células hospederas (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospederas y secuenciarse rápidamente utilizando métodos estándar en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido.

Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido.

Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido de fusión o polipéptido de fusión escindible en el cual otro polipéptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido de fusión esté controlada por el mismo promotor o promotores y el mismo terminador. Los polipéptidos de fusión también pueden construirse utilizando tecnología de inteínas en la cual se crean los polipéptidos de fusión post-traduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio escindible entre los dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de escisión incluyen, a modo no taxativo, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J". Ind. Microbiol . Biotechnol . 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins : Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de xilanasa Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención puede obtenerse de microorganismos de cualquier género. Parpara los efectos de la presente invención, la expresión "obtenerse de", tal como se utiliza en la presente en conexión con una fuente dada, significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual el polinucleótido de la fuente se ha insertado. En un aspecto, el polipéptido obtenido a partir de una fuente determinada se secreta extracelularmente .

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Penicillium. En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Penicillium capsulatum. En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido IBT 4903 de Penicillium capsulatum.

Se sobreentenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, p. ej . , anamorfos, independientemente del nombre de la especie con el cual se los conoce. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados .

Las cepas de estas especies son de dominio público y se puede acceder a ellas fácilmente en una serie de colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .

El polipéptido puede identificarse y obtenerse de otras fuentes, incluidos microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, composta, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, tierra, composta, agua, etc.) utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son de uso común en la técnica. Un polinucleótido que codifica el polipéptido puede obtenerse entonces mediante la detección de manera similar de una biblioteca de ADN o ADNc genómico de otro microorganismo o muestra de ADN mezclada. Una vez que se detecta un polinucleótido que codifica un polipéptido con la sonda, el polinucleótido puede aislarse o clonarse mediante el uso de técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Dominios catalíticos: En una modalidad, la presente invención también se refiere a dominios catalíticos que tienen una identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2 de al menos 80%, por ejemplo, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%. En un aspecto, los dominios catalíticos comprenden secuencias de aminoácidos que difieren en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, de los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2.

El dominio catalítico preferiblemente comprende o consiste en los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2, o una variante alélica de la misma; o es un fragmento de la misma que tiene actividad potenciadora celulolítica .

En otra modalidad, la presente invención también se refiere a dominios catalíticos codificados por polinucleotidos que se hibridan en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta (como se definió anteriormente) con los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1; la secuencia de ADNc de la misma; o el complemento de longitud completa de la misma (Sambrook et al., 1989, supra) .

En otra modalidad, la presente invención también se refiere a dominios catalíticos codificados por polinucleotidos que tienen una identidad secuencial con respecto a los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1 o las secuencias de ADNc de la misma de al menos 80%, por ejemplo, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%.

El polinucleótido que codifica el dominio catalítico preferiblemente comprende o consiste en los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1, o las secuencias de ADNc de la misma, o es la secuencia contenida en IBT 4903 de Penicillium capsulatum.

En otra modalidad, la presente invención también se refiere a variantes del dominio catalítico de los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO : 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En un aspecto, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidos en la secuencia de los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2 es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 10.

Dominios de unión En una modalidad, la presente invención también se refiere a dominios de unión a carbohidrato que tienen una identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 de 80%, por ejemplo, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%. En un aspecto, los dominios de unión a carbohidrato comprenden secuencias de aminoácidos que difieren en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, de los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO : 2.

El dominio de unión a carbohidrato preferiblemente comprende o consiste en los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2, o una variante alélica de la misma; o es un fragmento de la misma que tiene actividad de unión a carbohidrato.

En otra modalidad, la presente invención también se refiere a dominios de unión a carbohidrato codificados por polinucleótidos que se hibridan en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta o condiciones de rigurosidad muy alta (como se definió anteriormente) con 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de longitud completa de la misma (Sambrook et al., 1989, supra) .

En otra modalidad, la presente invención también se refiere a dominios de unión a carbohidrato codificados por polinucleótidos que tienen una identidad secuencial con respecto a los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1 de al menos 80%, por ejemplo, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%.

El polinucleótido que codifica el dominio de unión a carbohidrato preferiblemente comprende o consiste en los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1, o es la secuencia contenida en IBT 4903 de Penicillium capsulatum.

En otra modalidad, la presente invención también se refiere a variantes del dominio de unión a carbohidrato de los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En un aspecto, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidos en la secuencia de los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO : 2 es de hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 10.

Un dominio catalítico ligado operablemente al dominio de unión a carbohidrato puede ser de una hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidoreductasa o transferasa, por ejemplo, una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa , catalasa, celobiohidrolasa , celulasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa ciclodextrina, desoxirribonucleasa , endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o beta-xilosidasa . El polinucleótido que codifica el dominio catalítico puede obtenerse a partir de cualquier procariota, eucariota u otra fuente .

Polinucleótidos La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican un polipéptido, un dominio catalítico y un dominio de unión a carbohidrato de la presente invención, como se describe en la presente.

Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento de ADN o ADNc genómico o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos de ADN genómico puede efectuarse, por ejemplo, mediante el uso de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o detección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. También se pueden utilizar otros procedimientos para la amplificación de ácidos nucleicos tal ' como la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , transcripción activada por la ligadura (LAT) y amplificación basada en polinucleótidos (NASBA) . Los polinucleótidos pueden clonarse de una cepa de Penicillium, o un organismo relacionado y, por lo tanto, por ejemplo, pueden ser una variante alélica o de especie de la región que codifica el polipéptido del polinucleótido.

La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para sintetizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas no naturales del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir de algún modo en el diseño del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similares. Las variantes pueden construirse en base al polinucleótido presentado como la secuencia que codifica un polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, o las secuencias de ADNc de la misma, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que no resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponde al uso de codón del organismo hospedero destinado a la producción de la enzima o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que puede dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, ver, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Constructos de ácidos nucleicos La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido de la presente invención ligado operablemente a una o más (por ejemplo, varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula hospedera adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control .

El polinucleótido puede manipularse en una variedad de modos para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinante son de uso común en la técnica.

La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que se reconoce por una célula hospedera para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control de la transcripción que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedera, incluidos los promotores híbridos, truncados y mutados, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos intracelulares o extracelulares , tanto homólogos como heterólogos respecto a la célula hospedera.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedera bacteriana son los promotores obtenidos del gen alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens {amyQ) , gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , gen penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , gen amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , gen levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB) , genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operón lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315) , gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y gen de la beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 80: 21-25). Promotores adicionales se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. En WO 99/43835 se describen ejemplos de promotores tándem.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula hospedera fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa ácida estable de Aspergillus niger, Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamilasa (glaA) , TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787) , amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatu Daría (WO 00/56900) , Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900) , lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, xilanasa III de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei y factor de elongación de traducción de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder sin traducir se ha reemplazado por un líder sin traducir de un gen alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder sin traducir se ha reemplazado por un líder sin traducir de un gen triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no taxativos incluyen promotores modificados de un gen alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en el cual el líder sin traducir se ha reemplazado por un líder sin traducir de un gen triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. Otros promotores se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,011,147.

En un hospedero de tipo levadura, los promotores útiles se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, deshidrogenasa de alcohol/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospederas de tipo levadura son descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, el cual es reconocido por una célula hospedera para terminar la transcripción. El terminador está ligado operablemente al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula hospedera puede utilizarse en la presente invención.

Los terminadores preferidos para células hospederas bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii {aprH) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB) .

Terminadores preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoder a reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, xilanasa III de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei y factor de elongación de traducción de Trichoderma reesei.

Los terminadores preferidos para células hospederas de tipo levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospederas de tipo levadura se describen en Romanos et al., 1992, mencionado anteriormente.

La secuencia testigo también puede ser una región estabilizadora de ARNm corriente abajo de un promotor y corriente arriba de la secuencia codificadora de un gen que aumenta la expresión del gen.

Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen de un gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177 : 3465-3471).

La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que sea importante para la traducción por parte de la célula hospedera. El líder está ligado operablemente al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Se puede utilizar cualquier líder que sea funcional en la célula hospedera.

Los líderes preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .

Los líderes adecuados para células hospederas de tipo levadura se obtienen de los genes para enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y deshidrogenasa de alcohol/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae .

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia ligada operablemente al extremo 3' del polinucleótido y, cuando se transcribe, es reconocida por la célula hospedera como una señal para agregar residuos de poliadenosina a ARNm transcrito. Se puede utilizar cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa similar a la tripsina de Fusarium oxysporum.

Las secuencias de poliadenilación útiles para las células hospederas de tipo levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol . 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región que codifica un péptido señal que codifica un péptido señal unido al N-terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido a la vía secretoria de la célula. El extremo 5' de la secuencia que codifica el polinucleótido puede contener de manera intrínseca una secuencia que codifique un péptido señal ligada de manera natural en el marco de lectura de la traducción al segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. De manera alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia que codifique un péptido señal que sea exógena respecto a la secuencia codificante. La secuencia que codifica el péptido señal exógena puede ser necesaria cuando la secuencia codificante no contenga de manera natural ninguna secuencia que codifique un péptido señal. Alternativamente, una secuencia que codifica un péptido señal puede reemplazar simplemente la secuencia que codifica un péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia que codifique un péptido señal que dirija el polipéptido expresado hacia la vía secretoria de una célula hospedera.

Las secuencias que codifican un péptido señal efectivas para células hospederas bacterianas son las secuencias que codifican un péptido señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermcphilus, proteasas neutrales de Bacillus stearothermqphilus (npr , nprS, nprM) y prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Secuencias que codifican un péptido señal efectivas para células hospederas fúngicas filamentosas son las secuencias que codifican un péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.

Los péptidos señal útiles para las células hospederas de tipo levadura se obtienen de los genes para el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa Saccharomyces cerevisiae . Otras secuencias que codifican un péptido señal útiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una secuencia que codifique un propéptido, la cual codifique un propéptido situado en el N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos) . Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo mediante la escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia que codifica un propéptido puede obtenerse de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutral de Bacillus subtilis {nprT) , lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae .

Cuando ambas secuencias de propéptido y de péptido señal están presentes, la secuencia de propéptido se ubica junto al N-terminal de un polipéptido y la secuencia de péptido señal se ubica junto al N-terminal de la secuencia de propéptido.

También puede ser deseable agregar secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula hospedera. Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que provocan que la expresión del gen se encienda o apague en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Las secuencias reguladoras en sistemas procariotas incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras, se puede utilizar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden utilizarse el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae, promotor de celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei y promotor de celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato-reductasa, que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de las metalotioneínas , que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría ligado operablemente a la secuencia reguladora.

Vectores de expresión La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de terminación de la transcripción y la traducción. Los diversos nucleótidos y secuencias de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (por ejemplo, varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en los sitios. Como alternativa, el polinucleótido se puede expresar insertando el polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprenda el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se sitúa en el vector de modo que la secuencia codificante esté ligada operablemente a las secuencias de control adecuadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar una expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual se vaya a introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado .

El vector puede ser un vector replicante de manera autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicacion. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedera, se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en los cuales se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido, o se pueden utilizar dos o más vectores o plásmidos que contengan de forma conjunta el ADN total que se ha de introducir en el genoma de la célula hospedera, o se puede utilizar un transposón .

El vector preferiblemente contiene uno o más (por ejemplo, varios) marcadores selecciónateles que permiten una selección fácil de células transformadas, transíectadas , de transducción o similares. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a virus o biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a los auxótrofos y similares .

Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis dal o marcadores que confieren resistencia antibiótica, tales como resistencia ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina . Algunos marcadores adecuados para células hospederas de tipo levadura incluyen, sin carácter limitante, ADE2 , HIS3, LEU2 , LYS2 , MET3 , TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para su uso en una célula hospedera fúngica filamentosa incluyen, a modo no taxativo, adeA (fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa) , adeB (fosforibosil-aminoimidazol sintasa) , amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidin-5' -fosfato descarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) y fcrpC (antranilato sintasa) , así como equivalentes de los mismos. Preferidos para su uso en una célula de Aspergillus son los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus . Preferidos para su uso en una célula de Trichoderma son los genes adeA, adeB, amdS, hph y pyrG.

El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable dual como se describió en O 2010/039889. En un aspecto, el marcador seleccionable dual es un sistema de marcador seleccionable dual hph-tk.

El vector preferiblemente contiene un elemento que permite la integración del vector en el genoma de la célula hospedera o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

La integración del vector en el genoma de la célula hospedera puede depender de la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa. De manera alternativa, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una o más ubicaciones concretas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación concreta, los elementos de integración deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como entre 100 y 10 000 pares de bases, entre 400 y 10 000 pares de bases y entre 800 y 10 000 pares de bases, que posean un grado de identidad secuencial elevado respecto a la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de una recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia diana en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedera mediante recombinación no homologa.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que regule la replicación autónoma que esté en funcionamiento en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que permite replicar un plásmido o vector in vivo .

Algunos ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060 y ???ß?, que permiten la replicación en Bacillus .

Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en una célula hospedera de levadura son los dos orígenes de replicación de micrones, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.

Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883) . Se puede lograr el aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprendan el gen de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 00/24883.

Más de una copia de un polinucleótido de la presente invención puede insertarse en una célula hospedera para aumentar la producción de un polipéptido. Puede obtenerse un incremento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera o incluyendo un gen que sea un marcador seleccionable amplificable junto con el polinucleótido, de modo que las células que contengan copias amplificadas del gen que es un marcador seleccionable y, por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, se puedan seleccionar cultivando las células en presencia del agente de selección apropiado.

Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos para un experto en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra) .

Células hospederas La presente invención también se refiere a células hospederas recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención ligado operablemente a una o más (por ejemplo, varias) secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedera de modo que el constructo o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extra-cromosómico auto-replicante como se describió anteriormente. La expresión "célula hospedera" abarca cualquier progenie de una célula original que no sea idéntica a la célula original debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula hospedera dependerá en gran medida del gen que codifique el polipéptido y de su fuente .

La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplouna procariota o una eucariota.

La célula hospedera procariota puede ser cualquier bacteria Gram positiva o Gram negativa. Bacterias Grampositivas incluyen, a modo no taxativo, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Bacterias Gramnegativas incluyen, a modo no taxativo, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.

La célula hospedera bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus incluyendo, a modo no taxativo, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii , Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus li heniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis .

La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus incluyendo, a modo no taxativo, las células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus .

La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces incluyendo, a modo no taxativo, las células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans .

La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede realizarse mediante transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang y Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168: 111-115), transformación de células competentes (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol . 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol . 56: 209-221), electroporación (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli podría realizarse mediante transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (ver, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede realizarse mediante transformación de protoplastos, electroporación (ver, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399- 405), conjugación (ver, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol . 171: 3583-3585) o transducción (ver, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede realizarse mediante electroporacion (ver, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol . Métodos 64: 391-397) o conjugación (ver, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede realizarse mediante competencia natural (ver, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformación de protoplastos (ver, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporacion (ver, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugación (ver, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula hospedera.

La célula hospedera también puede ser una célula eucariota tal como una célula vegetal, fúngica, de mamífero, o insecto.

La célula hospedera puede ser una célula fúngica. "Hongos", tal como se utiliza en la presente, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como el Oomycota y todos los hongos mitospóricos (según lo definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi , 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) .

La célula hospedera fúngica puede ser una célula de levadura. "Levadura", tal como se utiliza en la presente, incluye levadura ascosporogénea (Endomicetales) , levadura basidiosporogénea y levadura que pertenece a Hongos imperfectos (Blastomicetos) . Ya que la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, parpara los efectos de la presente invención, levadura debería definirse según se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editores, Soc. App. Bacterio!. Symposium Series No. 9, 1980) .

La célula hospedera de tipo levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula , Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica .

La célula hospedera fúngica puede ser una célula de tipo hongo filamentoso. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según lo definido por Hawksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por tener una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo mediante elongación y catabolismo del carbono es obligadamente aeróbico. En cambio, el crecimiento vegetativo de levaduras tales como Saecharomyees cerevisiae tiene lugar mediante la gemación de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo.

La célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, ñureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o Trichoderma .

Por ejemplo, la célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense , Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus , Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatu , Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Humicola insolens , Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa, Penicillium purpurogenu , Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris , Trametes villosa , Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatu , Trichoderma reesei o Trichoderma viride.

Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que implica la formación de protoplastos, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Procedimientos adecuados para la transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma se describen en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc . Nati. Acad. Sci . EE.UU. 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/'Technology 6: 1419-1422. Métodos adecuados para transformar la especie Fusarium son descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Se puede transformar la levadura mediante la utilización de los procedimientos descritos por Becker y Guarente, En Abelson, J.N. y Simón, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci . EE.UU. 75: 1920.

Métodos de producción La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una célula, que en su forma tipo salvaje produce el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido. En un aspecto, la célula es una célula de Penicillium. En otro aspecto, la célula es una célula de Penicillium capsulatum. En otro aspecto, la célula es una célula de IBT 4903 de Penicillium capsulatum.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una célula hospedera recombinante de la presente invención en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido.

Las células se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden cultivarse mediante cultivo de matraces de agitación o fermentación a pequeña escala o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, de lote, de lote alimentado o en estado sólido) en laboratorio o termentadores industriales en un medio adecuado y en condiciones que permiten que el polipéptido se exprese y/o aisle. El cultivo toma lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si el polipéptido se secreta en el medio nutritivo, el polipéptido puede recuperarse directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, puede recuperarse a partir de los lisados celulares.

El polipéptido puede detectarse utilizando métodos de uso común en la técnica que son específicos para los polipéptidos . Estos métodos de detección incluyen, sin carácter limitante, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.

Se puede recuperar el polipéptido utilizando métodos de uso común en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales incluyendo, a modo no taxativo, recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. En un aspecto, se recupera un caldo de fermentación completo que comprende un polipéptido de la presente invención.

El polipéptido puede purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, a modo no taxativo, procedimientos de cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad, hidrófobos, cromatoenfoque y exclusión de tamaño) , electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE o extracción (ver, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.

En un aspecto alternativo, el polipéptido no se recupera, sino más bien se utiliza una célula hospedera de la presente invención que expresa el polipéptido como una fuente del polipéptido.

Plantas La presente invención también se refiere a plantas aisladas, por ejemplo, una planta, parte de una planta o célula vegetal transgénica que comprende un polinucleótido de la presente invención de modo de expresar y producir un polipéptido o dominio en cantidades recuperables. El polipéptido o dominio puede recuperarse de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido o dominio puede utilizarse como tal para mejorar la calidad de un alimento o alimento para animales, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, palatabilidad y propiedades reológicas o para destruir un factor antinutritivo.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot . ) o monocotiledónea (una monocot . ) . Ejemplos de plantas monocotiledóneas son pastos, tales como pasto de la pradera (pasto azul, Poa) , forraje tal como Festuca, Lolium, pasto templado, tal como Agrostis y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.

Algunos ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las legumbres, tales como altramuces, papa, remolacha azucarera, chícharo, frijol y soja, y las plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tales como la coliflor, la colza, y el organismo modelo Arabidopsis thaliana estrechamente relacionado .

Ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hojas, raíz, frutos, semillas y tubérculos, así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los compartimentos celulares vegetales específicos, tales como los cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma, también se consideran partes de una planta. Además, cualquier célula vegetal, independientemente del origen del tejido, se considera una parte de una planta. Asimismo, las partes de una planta, tales como tejidos y células específicos, aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de una planta, por ejemplo, embriones, endospermo, aleurona y capas de semilla.

También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de una planta y células vegetales .

La planta o célula vegetal transgénica que expresa el polipéptido o dominio puede construirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye mediante la incorporación de uno o más constructos de expresión que codifican el polipéptido o dominio en el genoma de la célula vegetal o genoma de cloroplastos y la propagación de la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta o célula vegetal transgénica .

El constructo de expresión es convenientemente un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio ligado operablemente con secuencias reguladoras requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de una planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células vegetales en las cuales se ha integrado el constructo de expresión y secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la plantas en cuestión (el último caso depende del método de introducción de ADN que se ha de utilizar) .

La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias del promotor y terminador y opcionalmente secuencias de señal o transitorias, se determina, por ejemplo, en base a cuándo, dónde y cómo el polipéptido o dominio se desea que se exprese. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica para el desarrollo, una fase o un tejido, del producto génico no se puede dirigir a un tejido o parte de una planta específico tal como las semillas o las hojas. Secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para la expresión constitutiva puede utilizarse el promotor 35S-CaMV, el promotor de la ubiquitina 1 de maíz o el promotor de la actina 1 de arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol . 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores de órganos específicos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tal como semillas, tubérculos de papa y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303) o de tejidos sumidero metabólicos tales como meristemas (Ito efc al., 1994, Plant Mol. Biol . 24: 863-878), un promotor específico de semilla tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz ( u et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), un promotor Vicia faba de la leguminosa B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711) , un promotor de una proteína del cuerpo de aceite de una semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor de la proteína de almacenamiento napA de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja, tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor del gen adenina metiltransferasa del virus del cólera (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) o un promotor inducible por lesiones tal como el promotor de la papa pin2 (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede inducirse mediante tratamientos abióticos tales como temperatura, sequía o alteraciones en salinidad o inducirse mediante sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico y metales pesados.

También puede utilizarse un elemento potenciador de promotores para alcanzar una mayor expresión de un polipéptido o dominio en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador de promotores puede ser un intrón que se ubica entre el promotor y el polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen de actina 1 de arroz para potenciar la expresión.

El gen del marcador seleccionable y cualesquiera otras partes del constructo de expresión se pueden elegir entre los que se encuentran disponibles en la técnica.

El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/'Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es un método para generar dicotiledóneas transgénicas (para una reseña, remítase a Hooykas y Schilperoort , 1992, Plant Mol. Biol . 19: 15-38) y para transformar monocotiledoneas, aunque pueden utilizarse otros métodos de transformación para estas plantas. Un método para generar monocotiledoneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas de oro o de tungsteno microscópicas recubiertas con el ADN transformante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol . 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneos se basa en la transformación de protoplastos como lo describen Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos de transformación adicionales incluyen aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,395,966 y 7,151,204 (estando ambas incorporadas a la presente a modo de referencia en su totalidad) .

Tras la transformación, se seleccionan los transformantes en los que se ha incorporado el constructo de expresión y se regeneran en forma de plantas completas de acuerdo con métodos de uso común en la técnica. Habitualmente el procedimiento de transformación está diseñado para la supresión selectiva de genes seleccionados, ya sea durante la regeneración o en las siguientes generaciones, mediante, por ejemplo, la cotransformación con dos constructos de ADN-T independientes o la escisión específica para el sitio del gen seleccionado por acción de una recombinación específica.

Además de la transformación directa de un genotipo de planta particular con un constructo de la presente invención, pueden obtenerse plantas transgénicas mediante el cruzamiento de una planta que tiene el constructo con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica un polipéptido o dominio puede introducirse en una variedad de planta particular mediante cruzamiento, sin la necesidad de transformar directamente una planta de esa variedad dada. Por lo tanto, la presente invención no abarca únicamente una planta regenerada directamente a partir de células que han sido transformadas de acuerdo con la presente invención, sino que también la progenie de tales plantas. El término "progenie", tal como se utiliza en la presente, se puede referir a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención. La progenie puede incluir un constructo de ADN preparado de acuerdo con la presente invención. El cruzamiento resulta en la introducción de un transgén en una línea de planta mediante polinización cruzada de una línea de partida con una línea de planta donante. Ejemplos no limitantes de los pasos se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 7,151,204.

Se pueden generar plantas mediante un proceso de conversión por retrocruzamiento . Por ejemplo, las plantas incluyen plantas a las que se les denomina híbrido, línea, endógamo o genotipo convertido por retrocruzamiento.

Los marcadores genéticos se pueden utilizar para facilitar la introgresión de uno o más transgenes de la invención de un contexto genético a otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas frente al cultivo selectivo convencional, ya que se puede utilizar para evitar errores debidos a las variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos referentes al grado relativo del germoplasma élite en la progenie individual de un cruzamiento particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado, que por lo demás tiene un contexto genético no deseable desde un punto de vista agronómico, se cruza con un progenitor élite, se pueden emplear marcadores genéticos para seleccionar la progenie que no solamente posea el rasgo de interés, sino que también posea una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De este modo, se minimiza el número de generaciones requeridas para introgresar uno o más rasgos en un contexto genético particular.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido o dominio de la presente invención que comprende (a) cultivar una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polipéptido que codifica el polipéptido o dominio en condiciones propicias para la producción del polipéptido o dominio; y (b) recuperar el polipéptido o dominio.

Supresión o reducción de actividad de xilanasa La presente invención también se refiere a métodos para producir un mutante de una célula original, que comprende interrumpir o eliminar un polinucleótido, o una porción de la misma, que codifica un polipéptido de la presente invención, que resulta en que la célula mutante produce menos polipéptido que la célula original cuando se cultiva en las mismas condiciones.

La célula mutante puede construirse mediante la reducción o supresión de expresión del polinucleótido utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, inserciones, interrupciones, reemplazos o supresiones. En un aspecto preferido, el polinucleótido está inactivado. El polinucleótido a modificar o inactivar puede ser, por ejemplo, la región de codificación o una parte de la misma esencial para la actividad o un elemento regulador requerido para la expresión de la región de codificación. Un ejemplo de la secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia promotora o una parte funcional de la misma, es decir, una parte que es suficiente para afectar la expresión del polinucleotido. Otras secuencias de control para una modificación posible incluyen, a modo no taxativo, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, secuencia de péptido señal, terminador de transcripción y activador transcripcional .

La modificación o inactivación del polinucleotido puede realizarse sometiendo la célula original a mutagénesis y seleccionando células imitantes en las cuales la expresión del polinucleotido se ha reducido o eliminado. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, puede realizarse, por ejemplo, mediante el uso de un agente de mutagenización físico o químico adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Más aún, la mutagénesis puede realizarse mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes de mutagenización.

Ejemplos de un agente de mutagenización físico o químico adecuado a efectos de la presente incluyen irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil- ' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , 0-metil hidroxilamina, ácido nitroso, metanosulfonato de etilo (EMS) , bisulfito de sodio, ácido fórmico y análogos de nucleótidos.

Cuando se utilizan los agentes, la mutagénesis se realiza típicamente mediante la incubación de la célula original para mutagenizarse en presencia del agente de mutagenización de elección en condiciones adecuadas, y la detección y/o selección de células mutantes que exhiben expresión reducida o ninguna expresión del gen.

La modificación o inactivación del polinucleótido puede lograrse mediante la inserción, sustitución o supresión de uno o más nucleótidos en el gen o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción de los mismos. Por ejemplo, los nucleótidos pueden insertarse o eliminarse de modo de resultar en la introducción de un codón de finalización, la supresión del codón de inicio o un cambio en el marco de lectura abierto. La modificación o inactivación puede lograrse mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis generada por PCR de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Aunque, en principio, la modificación puede realizarse in vivo, es decir, directamente en la célula que expresa el polinucleótido a modificar, se prefiere que la modificación se realice in vítro como se ejemplifica más adelante .

Un ejemplo de un modo conveniente para eliminar o reducir la expresión de un polinucleótido se basa en las técnicas de reemplazo de genes, supresión de genes o interrupción de genes. Por ejemplo, en el método de interrupción de genes, una secuencia de ácido nucleico que corresponde al polinucleótido endógeno se mutageniza in vitro para producir una secuencia de ácido nucleico defectuosa que se transforma entonces en la célula original para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homologa, la secuencia de ácido nucleico defectuosa reemplaza el polinucleótido endógeno. Puede ser deseable que el polinucleótido defectuoso también codifique un marcador que puede utilizarse para la selección de transformadores en los cuales el polinucleótido se ha modificado o destruido. En un aspecto, el polinucleótido se altera con un marcador seleccionable tal como aquellos descritos en la presente.

La presente invención también se refiere a métodos para inhibir la expresión de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa en una célula, que comprende administrar a la célula o expresar en la célula una molécula de ARN de doble hebra (ARNdh) , en donde el AR dh comprende una subsecuencia de un polinucleótido de la presente invención. En un aspecto preferido, el ARNdh es de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex de longitud.

El ARNdh es preferiblemente un ARN pequeño de interferencia (ARNip) o un micro ARN (miARN) . En un aspecto preferido, el ARNdh es un ARN pequeño de interferencia para inhibir la transcripción. En otro aspecto preferido, el ARNdh es micro ARN para inhibir la traducción.

La presente invención también se refiere a las moléculas de ARN de doble hebra (ARNdh) , que comprenden una porción de la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 para inhibir la expresión del polipéptido en una célula. Si bien la presente invención no se limita por cualquier mecanismo particular de acción, el ARNdh puede ingresar a una célula y provocar la degradación de un ARN de una sola hebra (ARNhs) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNm endógenos. Cuando una célula se expone a ARNdh, ARNm del gen homólogo se degrada selectivamente por un proceso llamado interferencia de ARN (iARN) .

Los ARNdh de la presente invención pueden utilizarse en silenciamiento de genes. En un aspecto, la invención proporciona métodos para degradar selectivamente ARN utilizando una iARNdh de la presente invención. El proceso puede ponerse en práctica in vitro, ex vivo o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNdh pueden utilizarse para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano o un animal. Los métodos para realizar y utilizar las moléculas de ARNdh para degradar selectivamente ARN son bien conocidos en la técnica; ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,489,127; 6,506,559; 6,511,824 y 6,515,109.

La presente invención se refiere además a una célula mutante de una célula original que comprende una interrupción o supresión de un polinucleótido que codifica el polipéptido o una secuencia de control de la misma o un gen silenciado que codifica el polipéptido, que resulta en la célula mutante que produce menos polipéptido o ningún polipéptido en comparación con la célula original.

Las células mutantes con deficiencia de polipéptido son particularmente útiles como células hospederas para la expresión de polipéptidos nativos y heterólogos . Por lo tanto, la presente invención se refiere además a métodos para producir un polipéptido nativo o heterólogo, que comprende (a) cultivar la célula mutante en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. La expresión "polipéptidos heterólogos" significa polipéptidos que no son nativos a la célula hospedera, por ejemplo, una variante de una proteína nativa. La célula hospedera puede comprender más de una copia de un polinucleótido que codifica el polipéptido nativo o heterólogo.

Los métodos utilizados para el cultivo y la purificación del producto de interés pueden realizarse mediante métodos conocidos en la técnica.

Los métodos de la presente invención para producir un producto esencialmente libre de xilanasa son de interés particular en la producción de polipéptidos eucariotas, en particular proteínas fúngicas tales como enzimas. Las células con deficiencia de xilanasa también pueden utilizarse para expresar proteínas heterólogas de interés farmacéutico tales como hormonas, factores de crecimiento, receptores y similares. La expresión "polipéptidos eucariotas" incluye no solamente polipéptidos nativos, pero también aquellos polipéptidos, por ejemplo, enzimas, que se han modificado mediante sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, u otras modificaciones para mejorar la actividad, termoestabilidad, tolerancia a pH y similar.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un producto de proteína esencialmente libre de actividad de xilanasa que se produce mediante un método de la presente invención.

Formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares La presente invención también se refiere a una formulación de caldo de fermentación o una composición celular que comprende un polipéptido de la presente invención. El producto de caldo de fermentación comprende además ingredientes adicionales utilizados en el proceso de fermentación, tales como, por ejemplo, células (incluyendo, las células hospederas que contienen el gen que codifica el polipéptido de la presente invención que se utiliza para producir el polipéptido de interés) , desechos celulares, biomasa, medios de fermentación y/o productos de fermentación. En algunas modalidades, la composición es un caldo completo destruido por células que contiene ácido orgánico, células destruidas y/o desechos celulares y medio de cultivo.

La expresión "caldo de fermentación", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una preparación producida por fermentación celular que no se somete a ninguna recuperación o se somete a recuperación y/o purificación mínima. Por ejemplo, los caldos de fermentación se producen cuando cultivos microbianos se cultivan hasta la saturación y se incuban en condiciones de carbono limitado para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, expresión de enzimas mediante células hospederas) y secreción en medio de cultivo celular. El caldo de fermentación puede contener contenidos no fraccionados o fraccionados de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo de fermentación no está fraccionado y comprende el medio de cultivo utilizado y desechos celulares presentes después de que se eliminan las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) , por ejemplo, mediante centrifugación. En algunas modalidades, el caldo de fermentación contiene medio de cultivo utilizado, enzimas extracelulares y células microbianas viables y/o no viables .

En una modalidad, la formulación de caldo de fermentación y composiciones celulares comprenden un primer componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o una sal del mismo y un segundo componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 6 o más carbonos y/o una sal del mismo. En una modalidad específica, el primer componente de cido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal del mismo, o una mezcla de dos o más de los anteriores y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanecarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal del mismo o una mezcla de dos o más de los anteriores.

En un aspecto, la composición contiene un ácido orgánico y opcionalmente contiene además células destruidas y/o desechos celulares. En una modalidad, las células destruidas y/o desecho celular se eliminan de un caldo completo destruido por células para proporcionar una composición que está libre de estos componentes.

Las formulaciones del caldo de fermentación o composiciones celulares pueden comprender además un conservante y/o agente anti-microbiano (por ejemplo, bacteriostático) , incluyendo, a modo no taxativo, sorbitol, cloruro de sodio, sorbato de potasio, y otros conocidos en la técnica.

Las formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares pueden comprender además múltiples actividades enzimáticas, tales como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, una hemicelulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina. Las formulaciones de caldo de fermentación o composiciones celulares también pueden comprender una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una liasa, una oxidoreductasa o una transferasa, por ejemplo, una alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, amilasa, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa , celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, glucoamilasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

El caldo completo o la composición destruidos por células pueden contener el contenido no fraccionado de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo completo o la composición destruidos por células contienen el medio de cultivo utilizado y desechos celulares presentes después de que se cultivan las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) para saturación y se incuban en condiciones de carbono limitado para permitir síntesis de proteína (por ej mplo, expresión de celulasa y/o enzima de glucosidasa) . En algunas modalidades, el caldo completo o la composición destruidos por células contienen el medio de cultivo celular utilizado, enzimas extracelulares y células fúngicas filamentosas destruidas. En algunas modalidades, las células microbianas presentes en el caldo completo o la composición destruidos por células pueden permeabilizarse y/o lisarse utilizando métodos conocidos en la técnica.

Un caldo completo o composición celular como se describe en la presente es típicamente un líquido, pero puede contener componentes insolubles, tales como células destruidas, desechos celulares, componentes de medios de cultivo y/o enzimas insolubles. En algunas modalidades, los componentes insolubles pueden eliminarse para proporcionar una composición líquida aclarada.

Las formulaciones de caldo completas y composiciones de la presente invención pueden producirse mediante un método descrito en WO 90/15861 o WO 2010/096673.

Se proporcionan ejemplos a continuación de usos preferidos de las composiciones de la presente invención. La dosificación de la composición y otras condiciones en las cuales la composición se utiliza pueden determinarse en base a los métodos conocidos en la técnica.

Composiciones enzimáticas La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferentemente, las composiciones están enriquecidas en un polipéptido de este tipo. El término "enriquecido" indica que la actividad de xilanasa de la composición se ha aumentado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.

Las composiciones pueden comprender un polipéptido de la presente invención como el principal componente enzimático, por ejemplo, una composición de un monocomponente . Alternativamente, las composiciones celulares pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, una hemicelulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina. Las composiciones celulares también pueden comprender una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una hidrolasa, una isomerasa, una ligasa, una liasa, una oxidoreductasa o una transferasa, por ejemplo, una alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, amilasa, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa , carbohidrasa, carboxipeptidasa , catalasa, celobiohidrolasa , celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa , endoglucanasa , esterasa, glucoamilasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. Las composiciones se pueden preparar de acuerdo con métodos de uso común en la técnica y se pueden presentar en forma de una composición líquida o seca. Las composiciones pueden estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

Se proporcionan más adelante ejemplos de usos preferidos de las composiciones de la presente invención. La dosificación de la composición y otras condiciones en las cuales la composición se utiliza pueden determinarse en base a los métodos conocidos en la técnica.

Usos La presente invención también se dirige a los siguientes procesos para utilizar los polipéptidos que tienen actividad de xilanasa o composiciones de los mismos.

La presente invención también se refiere a procesos para degradar o convertir un material celulósico o que contiene xilano, que comprende: tratar el material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención. En un aspecto, los procesos comprenden además recuperar el material celulósico o que contiene xilano degradado o convertido. Productos solubles de degradación o conversión del material celulósico o que contiene xilano puede separarse del material celulósico o que contiene xilano insoluble utilizando un método conocido en la técnica tal como, por ejemplo, centrifugación, filtración o sedimentación por gravedad.

La presente invención también se refiere a procesos para producir un producto de fermentación que comprende: (a) sacarificar un material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que contiene actividad de xilanasa de la presente invención; (b) fermentar el material celulósico o que contiene xilano sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

La presente invención también se refiere a procesos para fermentar un material celulósico o que contiene xilano que comprenden: fermentar el material celulósico o que contiene xilano con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico o que contiene xilano se sacarifica con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención. En un aspecto, la fermentación del material celulósico o que contiene xilano produce un producto de fermentación. En otro aspecto, los procesos comprenden además recuperar el producto de fermentación de la fermentación.

Los procesos de la presente invención pueden utilizarse para sacarificar el material celulósico o que contiene xilano en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables en muchos productos de fermentación útiles, por ejemplo, combustible, etanol potable y/o químicos base (por ejemplo, ácidos, alcoholes, cetonas, gases y similares) . La producción de un producto de fermentación deseado del material celulósico o que contiene xilano típicamente involucra pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación) y fermentación.

El procesamiento del material celulósico o que contiene xilano de acuerdo con la presente invención puede lograrse utilizando métodos convencionales en la técnica. Más aun, los procesos de la presente invención pueden implementarse utilizando cualquier aparato de procesamiento de biomasa convencional configurado para funcionar de acuerdo con la invención .

La hidrólisis (sacarificación) y fermentación, separadas o simultáneas, incluyen, a modo no taxativo, hidrólisis y fermentación separadas (SHF) ; sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) ; sacarificación y co- fermentación simultáneas (SSCF) ; hidrólisis y fermentación híbridas (HHF) ; hidrólisis y co-fermentación separación (SHCF) ; hidrólisis y co-fermentación híbridas (HHCF) ; y conversión microbiana directa (DMC) , también a veces denominada bioprocesamiento consolidado (CBP) . SHF utiliza etapas de proceso separadas para primero hidrolizar enzimáticamente el material celulósico en azúcares fermentables , por ejemplo, glucosa, celobiosa y monómeros de pentosa y luego fermentar los azúcares fermentables en etanol . En SSF, la hidrólisis enzimática del material celulósico y la fermentación de azúcares en etanol se combinan en una etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E., ed. , Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212) . SSCF implica la co- fermentación de múltiples azúcares (Sheehan, J., y Himmel, M . , 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy' s research and development activities for bioethanol, Biotechnol . Prog. 15: 817-827) . HHF implica una etapa de hidrólisis separada y además una etapa de sacarificación e hidrólisis simultánea, que puede llevarse a cabo en el mismo reactor. Las etapas en un proceso HHF pueden llevarse a cabo a diferentes temperaturas, es decir, sacarificación enzimática a temperatura alta seguida por SSF a una temperatura más baja que la cepa de fermentación puede tolerar. DMC combina los tres procesos (producción de enzimas, hidrólisis y fermentación) en una o más (por ejemplo, varias) etapas donde el mismo organismo se utiliza para producir las enzimas para la conversión del material celulósico en azúcares fermentables y para convertir los azúcares fermentables en un producto final (Lynd et al., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentáis and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol . Reviews 66: 506-577). Debe comprenderse en la presente que cualquier método conocido en la técnica que comprende pretratamiento, hidrólisis enzimática (sacarificación) , fermentación o una combinación de los mismos, puede utilizarse en la puesta en práctica de los procesos de la presente invención.

Un aparato convencional puede incluir un reactor agitado de lote alimentado, un reactor agitado de lote, un reactor agitado de flujo continuo con ultrafiltración y/o un reactor de columna de flujo-pistón continuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella María Zanin y Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., y Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz . Microb. Technol . 7: 346-352), un reactor de desgaste (Ryu y Lee, 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol . Bioeng. 25: 53-65) o un reactor con agitación intensiva inducida por un campo electromagnético (Gusakov et al., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl . Biochem. Biotechnol . 56: 141-153). Tipos de reactores adicionales incluyen reactores de lecho fluidizado, de manto y flujo ascendente, inmovilizados y de tipo extrusor para hidrólisis y/o fermentación.

Pretratamiento . Al poner en práctica los procesos de la presente invención, cualquier proceso de pretratamiento conocido en la técnica puede utilizarse para interrumpir los componentes de pared celular vegetal del material celulósico o que contiene xilano (Chandra et al., 2007, Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol . 108: 67-93; Galbe y Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin . /Biotechnol . 108: 41-65; Hendriks y Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh y Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang y Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

El material celulósico o que contiene xilano también puede someterse a reducción del tamaño de partícula, tamizado, pre-remojo, humectante, lavado y/o acondicionamiento anterior al pretratamiento utilizando métodos conocidos en la técnica.

Los pretratamientos convencionales incluyen, a modo no taxativo, pretratamiento con vapor (con o sin explosión) , pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con agua caliente, pretratamiento alcalino, pretratamiento con cal, oxidación en húmedo, explosión en húmedo, explosión de fibras con amoníaco, pretratamiento organosolv y tratamiento biológico. Pretratamientos adicionales incluyen pretratamientos de percolación de amoníaco, ultrasonido, electroporación, micrcondas, a¾ supercrítico, H20 supercrítico, ozono, líquido iónico y irradiación de rayos gama.

El material celulósico o que contiene xilano puede pretratarse antes de la hidrólisis y/o fermentación. El pretratamiento se realiza preferiblemente antes de la hidrólisis. Alternativamente, el pretratamiento puede llevarse a cabo simultáneamente con hidrólisis de enzimas para liberar azúcares fermentables , tales como glucosa, xilosa y/o celobiosa. En la mayoría de los casos la etapa de pretratamiento en sí resulta en un poco de conversión de biomasa en azúcares fermentables (incluso en ausencia de enzimas) .

Pretratamiento con vapor. En pretratamiento con vapor, el material celulósico o que contiene xilano se calienta para alterar los componentes de la pared celular vegetal, incluyendo lignina, hemicelulosa y celulosa para preparar la celulosa y otras fracciones, por ejemplo, hemicelulosa, accesible para enzimas. Se pasó el material celulósico o que contiene xilano hacia o a través de un recipiente de reacción donde se inyecta vapor para aumentar la temperatura y presión requeridas y se retiene en el mismo durante el tiempo de reacción deseado. El pretratamiento con vapor se realiza preferiblemente a 140-250°C, por ejemplo, 160-200°C o 170-190 °C, donde el intervalo de temperatura óptimo depende de la adición de un catalizador químico. El tiempo de residencia para el pretratamiento con vapor es preferiblemente de 1-60 minutos, por ejemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos o 4-10 minutos, donde el tiempo de residencia óptimo depende del intervalo de temperatura y adición de un catalizador químico. El pretratamiento con vapor permite cargas sólidas relativamente altas, de modo que el material celulósico o que contiene xilano es generalmente sólo humedad durante el pretratamiento. El pretratamiento con vapor a menudo se combina con una descarga explosiva del material después del pretratamiento, que es conocido como explosión con vapor, es decir, pasando rápido a presión atmosférica y flujo turbulento del material para aumentar el área de superficie accesible mediante fragmentación (Duff y Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe y Zacchi, 2002, Appl . Microbiol . Biotechnol . 59: 618-628; Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20020164730) . Durante el pretratamiento con vapor, los grupos acetilo de hemicelulosa se escinden y el ácido resultante autocataliza la hidrólisis parcial de la hemicelulosa a monosacáridos y oligosacáridos . Se elimina la lignina solamente de forma limitada.

Pretratamiento químico: La expresión "tratamiento químico" se refiere a cualquier pretratamiento químico que promueve la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina. El pretratamiento puede convertir la celulosa cristalina en celulosa amorfa. Ejemplos de procesos de pretratamiento químico adecuados incluyen, por ejemplo, pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con cal, oxidación en húmedo, explosión de fibras con amoníaco/por vapor (AFEX) , percolación de amoníaco (APR) , líquido iónico y pretratamientos organosolv.

Un catalizador tal como H2S04 o S02 (típicamente 0.3 a 5% p/p) se agrega a menudo antes del pretratamiento con vapor para disminuir el tiempo y la temperatura, aumentar la recuperación y mejorar la hidrólisis enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl . Biochem. Biotechnol . 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol . 39: 756-762) . En pretratamiento con ácido diluido, el material celulósico o que contiene xilano se mezcla con ácido diluido, típicamente H2S04 y agua para formar una suspensión, calentada por vapor a la temperatura deseada y después de un tiempo de residencia pasada a temperatura atmosférica. El pretratamiento con ácido diluido puede realizarse con una cantidad de diseños de reactores, por ejemplo, reactores de pistón-flujo, reactores de contracorriente o reactores de lecho de encogimiento contracorriente continuo (Duff y Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115) .

También pueden utilizarse varios métodos de pretratamiento en condiciones alcalinas. Estos pretratamientos alcalinos incluyen, a modo no taxativo, hidróxido de sodio, cal, oxidación en húmedo, percolación de amoníaco (APR) y explosión de fibra con amoníaco/por vapor (AFEX) .

El pretratamiento con cal se realiza con óxido de calcio o hidróxido de calcio a temperaturas de 85-150°C y tiempos de residencia desde 1 hora a varios días ( yman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900 y WO 2006/110901 describen métodos de pretratamiento que utilizan amoníaco.

La oxidación con humedad es un pretratamiento térmico realizado típicamente a 180-200°C durante 5-15 minutos con la adición de un agente oxidativo tal como peróxido de hidrógeno o sobrepresión de oxígeno (Schmidt y Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl .

Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Bíotechnol . Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J". Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). El pretratamiento se realiza preferiblemente a 1-40% de materia seca, por ejemplo, 2-30% de materia seca o 5-20% de materia seca y a menudo el pH inicial aumenta mediante la adición de álcalis tales como carbonato de sodio.

Una modificación del método de pretratamiento con oxidación en húmedo, conocida como explosión en húmedo (combinación de oxidación en húmedo y explosión con vapor) puede manejar materia seca hasta 30%. En la explosión en húmedo, el agente oxidante se introduce durante el pretratamiento después de un cierto tiempo de residencia. El pretratamiento finaliza entonces pasando rápidamente a presión atmosférica (WO 2006/032282) .

La explosión de fibras con amoníaco (AFEX) implica tratar el material celulósico o que contiene xilano con amoníaco líquido o gaseoso a temperaturas moderadas tales como 90-150 °C y presión alta tal como 17-20 bar durante 5-10 minutos, donde el contenido de materia seca puede llegar al 60% (Gollapalli efc al., 2002, Appl . Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018) . Durante el pretratamiento AFEX, la celulosa y las hemicelulosas permanecen relativamente intactas . Los complejos de lignina-carbohidrato se escinden.

El pretratamiento organosolv deslignifica el material celulósico o que contiene xilano mediante extracción utilizando etanol acuoso (40-60% de etanol) a 160-200°C durante 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol . Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl . Biochem. Biotechnol. 121: 219-230) . Generalmente se agrega ácido sulfúrico como un catalizador. En el pretratamiento organosolv, la mayoría de hemicelulosa y lignina se elimina.

Otros ejemplos de métodos de pretratamiento adecuados son descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. 105-108: 69-85, y Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, y Solicitud Publicada de los Estados Unidos 2002/0164730.

En un aspecto, el pretratamiento químico se lleva a cabo preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido y más preferiblemente como un tratamiento con ácido diluido continuo. El ácido es típicamente ácido sulfúrico, pero también pueden utilizarse otros ácidos, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloruro de hidrógeno o mezclas de los mismos. El tratamiento con ácido leve se lleva a cabo en el intervalo de pH de preferiblemente 1-5, por ejemplo, 1-4 o 1-2.5. En un aspecto, la concentración de ácido está en el intervalo de preferiblemente 0.01 a 10 %p de ácido, por ejemplo, 0.05 a 5 %p de ácido o 0.1 a 2 %p de ácido. El ácido se pone en contacto con el material celulósico o que contiene xilano y se mantiene a una temperatura en el intervalo de preferiblemente 140-200°C, por ejemplo, 165-190°C, durante periodos en el intervalo de 1 a 60 minutos.

En otro aspecto, el pretratamiento se lleva a cabo en una suspensión acuosa. En aspectos preferidos, el material celulósico o que contiene xilano está presente durante el pretratamiento en cantidades preferiblemente entre 10-80 %p, por ejemplo, 20-70 %p o 30-60 %p, tal como aproximadamente 40 %p. El material pretratado celulósico o que contiene xilano puede estar sin lavar o lavarse utilizando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, lavarse con agua.

Pretratamiento mecánico o pretratamiento físico: La expresión "pretratamiento mecánico" o "pretratamiento físico" se refiere a cualquier pretratamiento que promueve la reducción del tamaño de partículas. Por ejemplo, el pretratamiento puede implicar varios tipos de trituración o molienda (por ejemplo, molienda seca, molienda húmeda o molienda de bola vibratoria) .

El material celulósico o que contiene xilano puede pretratarse físicamente (mecánicamente) y químicamente. El pretratamiento mecánico o físico puede acoplarse con una explosión con vapor/humeante, hidrotermólisis, tratamiento con ácido leve o diluido, alta temperatura, tratamiento con presión alta, irradiación (por ejemplo, irradiación de microondas) o combinaciones de los mismos. En un aspecto, presión alta significa presión en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 100 a aproximadamente 400 psi, por ejemplo, aproximadamente 150 a aproximadamente 250 psi. En otro aspecto, alta temperatura significa temperaturas en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 300°C, por ejemplo, aproximadamente 140 a aproximadamente 200°C. En un aspecto preferido, el pretratamiento mecánico o físico se realiza en un proceso por lote utilizando un sistema de hidrolizador con una pistola de vapor que utiliza presión alta y temperatura alta como se definió anteriormente, por ejemplo, un hidrolizador Sunds disponible por Sunds Defibrator AB, Suecia. Los pretratamientos físicos y químicos pueden llevarse a cabo secuencialmente o simultáneamente, según se desee.

Por consiguiente, en un aspecto preferido, el material celulósico o que contiene xilano está sometido a pretratamiento físico (mecánico) o químico o cualquier combinación de los mismos, para promover la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina.

Pretratamiento biológico: La expresión "pretratamiento biológico" se refiere a cualquier pretratamiento biológico que promueve la separación y/o liberación de celulosa, hemicelulosa y/o lignina del material celulósico o que contiene xilano. Las técnicas de pretratamiento biológico pueden implicar aplicar microorganismos y/o enzimas solubilizantes de lignina (ver, por ejemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh y Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversión of cellulosic biomass, Adv. Appl. Micróbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D. , 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, en Enzymatic Conversión of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. 0. y Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J. , Du, J. , y Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Olsson y Hahn-Hagerdal , 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz . Microb. Tech. 18: 312-331; y Vallander y Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng. /Biotechnol . 42: 63-95).

Sacarificación . En la etapa de hidrólisis, también conocida como sacarificación, el material celulósico o que contiene xilanol, por ejemplo, pretratado, se hidroliza para desintegrar celulosa y/o hemicelulosa en azúcares fermentables , tales como glucosa, celobiosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, mañosa, galactosa y/u oligosacáridos solubles. La hidrólisis se realiza enzimáticamente por una composición enzimática como se describe en la presente en presencia de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa de la presente invención. Los componentes de enzimas de las composiciones pueden agregarse simultáneamente o secuencialmente .

La hidrólisis enzimática se lleva a cabo preferiblemente en un ambiente acuoso adecuado en condiciones que pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. En un aspecto, la hidrólisis se lleva a cabo en condiciones adecuadas para la actividad de los componentes de enzimas, es decir, óptimas para los componentes de enzimas. La hidrólisis puede llevarse a cabo como un proceso de lote alimentado o continuo donde el material celulósico o que contiene xilano se alimenta gradualmente a, por ejemplo, una enzima que contiene solución de hidrólisis.

La sacarificación se realiza generalmente en reactores de tanque con agitación o termentadores en pH controlado, temperatura, y condiciones de mezcla. El tiempo de proceso adecuado, temperatura y condiciones de pH pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la sacarificación puede durar hasta 200 horas, pero se realiza típicamente para preferiblemente aproximadamente 12 a aproximadamente 120 horas, por ejemplo, aproximadamente 16 a aproximadamente 72 horas o aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. La temperatura está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 25 °C a aproximadamente 70°C, por ejemplo, aproximadamente 30°C a aproximadamente 65 °C, aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C o aproximadamente 50 °C a aproximadamente 55 °C. El pH está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 8, por ejemplo, aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7, aproximadamente 4 a aproximadamente 6 o aproximadamente 5.0 a aproximadamente 5.5. El contenido de sólidos secos está en el intervalo de preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 50 %p, por ejemplo, aproximadamente 10 a aproximadamente 40 %p o aproximadamente 20 a aproximadamente 30 %p .

Las composiciones de enzimas pueden comprender cualquier proteíná útil para degradar o convertir el material celulósico o que contiene xilano.

En un aspecto, las composiciones enzimáticas comprenden adicionalmente una o más (por ejemplo, varias) proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina. En otro aspecto, la celulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa . En otro aspecto, la hemicelulasa es preferiblemente una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una acetilmananesterasa, una acetilxilan esterasa, una arabinanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa de ácido coumárico, una feruloil esterasa, una galactosidasa , una glucuronidasa, una glucuronoil esterasa, una mananasa, una manosidasa, una xilanasa y una xilosidasa.

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas . En otro aspecto, la composición enzimática comprende o comprende adicionalmente una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas y una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo de enzimas celulolíticas y enzimas hemicelulolíticas. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una beta-glucosidasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y una celobiohidrolasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa y una beta-glucosidasa . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una beta-glucosidasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa y un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica .

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una acetilmananesterasa . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una acetilxilan esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una arabinanasa (por ejemplo, alfa-L-arabinanasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una arabinofuranosidasa (por ejemplo, alfa-L-arabinofuranosidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una esterasa de ácido coumárico. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una feruloil esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una galactosidasa (por ejemplo, alfa-galactosidasa y/o beta-galactosidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una glucuronidasa (por ejemplo, alfa-D-glucuronidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una glucuronoil esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una mananasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una manosidasa (por ejemplo, beta-manosidasa) . En otro aspecto, la composición enzimática comprende una xilanasa. En un aspecto preferido, la xilanasa es una xilanasa de la Familia 10. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una xilosidasa (por ejemplo, beta-xilosidasa) .

En otro aspecto, la composición enzimática comprende una esterasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una expansina. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una lacasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una enzima ligninolítica . En un aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una peroxidasa de manganeso. En otro aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una peroxidasa de lignina. En otro aspecto preferido, la enzima ligninolítica es una enzima que produce H202. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una pectinasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una peroxidasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una proteasa. En otro aspecto, la composición enzimática comprende una swollenina.

En los procesos de la presente invención, las enzimas pueden agregarse antes o durante la sacarificación, sacarificación y fermentación, o fermentación.

Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden ser proteínas naturales, proteínas recombinantes o una combinación de proteínas naturales y recombinantes. Por ejemplo, uno o más (por ejemplo, varios) componentes pueden ser proteínas nativas de una célula, que se utiliza como una célula hospedera para expresar recombinantemente uno o más {por ejemplo, varios) otros componentes de la composición enzimática. Uno o más (por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden producirse como monocomponentes, que se combinan entonces para formar la composición enzimática. La composición enzimática puede ser una combinación de preparaciones de proteína multicomponentes y monocomponentes.

Las enzimas utilizadas en los procesos de la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para su uso, tal como, por ejemplo, una formulación de caldo de fermentación o una composición celular, un lisado celular con o sin desechos celulares, una preparación enzimática purificada o semi -purificada, o una célula hospedera como una fuente de las enzimas. La composición enzimática puede ser un polvo seco o granulado, un granulado no empolvado, un líquido, un líquido estabilizado o una enzima protegida estabilizada. Las preparaciones de enzima líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse mediante la adición de estabilizadores tales como un azúcar, un alcohol de azúcar u otro poliol, y/o ácido láctico u otro ácido orgánico de acuerdo con procesos establecidos.

Las cantidades óptimas de las enzimas y polipéptidos que tienen actividad de xilanasa dependen de varios factores incluyendo, a modo no taxativo, la mezcla de componentes de enzimas celulolíticas y/o hemicelulolíticas , el material celulósico o que contiene xilano, la concentración de material celulósico o que contiene xilano, el pretratamiento del material celulósico o que contiene xilano, temperatura, tiempo, pH e inclusión de organismo de fermentación (por ejemplo, levadura para Sacarif cación simultánea y fermentación) .

En un aspecto, una cantidad efectiva de enzima celulolítica o hemicelulolítica al material celulósico o que contiene xilano es de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 25 mg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 15 mg, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg o aproximadamente 2.5 a aproximadamente 10 mg por g del material celulósico o que contiene xilano.

En otro aspecto, una cantidad efectiva de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa al material celulósico o que contiene xilano es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50.0 mg, por ejemplo, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5 mg, aproximadamente 0.025 a aproximadamente 1.5 mg, aproximadamente 0.05 a aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.075 a aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.25 mg, aproximadamente 0.15 a aproximadamente 1.25 mg o aproximadamente 0.25 a aproximadamente 1.0 mg por g del material celulósico o que contiene xilano.

En otro aspecto, una cantidad efectiva de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa a la enzima celulolítica o hemicelulolítica es de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 1.0 g, por ejemplo, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1.0 g, aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.75 g, aproximadamente 0.15 a aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.25 g o aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 g por g de enzima celulolítica o hemicelulolítica .

Los polipéptidos que tienen actividad enzimática celulolítica o actividad enzimática hemicelulolítica así como otras proteínas/polipéptidos útiles en la degradación del material celulósico o que contiene xilano, por ejemplo, polipéptidos GH61 que tienen actividad potenciadora celulolítica (de aquí en adelante denominados colectivamente "polipéptidos que tienen actividad enzimática") pueden derivar u obtenerse de cualquier origen adecuado, incluyendo, origen bacteriano, fúngico, de levadura, vegetal o de mamífero. El término "obtenido" también significa en la presente que la enzima pudo haber sido producida recombinantemente en un organismo hospedero que emplea métodos descritos en la presente, en donde la enzima producida recombinantemente es nativa o ajena al organismo hospedero o tiene una secuencia de aminoácidos modificada, por ejemplo, que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos que se eliminan, insertan y/o sustituyen, es decir, una enzima producida recombinantemente que es un mutante y/o un fragmento de una secuencia de aminoácidos nativa o una enzima producida por procesos de transposición de ácido nucleico conocidos en la técnica. Abarcados en el significado de una enzima nativa son variantes naturales y dentro del significado de una enzima ajena son variantes obtenidas recombinantemente, tales como mediante mutagénesis dirigida al sitio o transposición.

Un polipéptido que tiene actividad enzimática puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano Grampositivo tal como un polipéptido de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, Caldicellulosíruptor, Acidothermus, Thermobifidia, o Oceanobacillus que tiene actividad enzimática, o un polipéptido bacteriano Gram negativo tal como un polipéptido de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campyldbacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria o Ureaplasma que tiene actividad enzimática.

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilu , Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis que tiene actividad enzimática.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus que tiene actividad enzimática.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans que tiene actividad enzimática.

El polipéptido que tiene actividad enzimática también puede ser un polipéptido fúngico y más preferiblemente un polipéptido de levadura tal como un polipéptido que tiene actividad enzimática de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia; o más preferiblemente un polipéptido fúngico filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidiu , Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus , Meripilus , Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piroyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonywpha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella o Xylaria que tiene actividad enzimática.

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis que tiene actividad enzimática.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus , Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense , Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei , Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride o Trichophaea saccata que tiene actividad enzimática.

También pueden utilizarse mutantes modificados químicamente o manipulados con proteínas de polipéptidos que tienen actividad enzimática.

Uno o más {por ejemplo, varios) componentes de la composición enzimática pueden ser un componente recombinante , es decir, producido mediante la clonación de una secuencia de ADN que codifica el único componente y posterior célula transformada con la secuencia de ADN y expresada en un hospedero (ver, por ejemplo, WO 91/17243 y WO 91/17244) . El hospedero es preferiblemente un hospedero heterólogo (la enzima es ajena con respecto al hospedero) , pero el hospedero puede en ciertas condiciones también ser un hospedero homólogo (la enzima es nativa con respecto al hospedero) . La proteínas celulolíticas monocomponentes también pueden prepararse mediante la purificación de la proteína de un caldo de fermentación.

En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas celulolíticas comprenden una preparación enzimática celulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones enzimáticas celulolíticas comerciales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, CELLIC® CTec (Novozymes A/S) , CELLIC® CTec2 (Novozymes A/S) , CELLIC® CTec3 (Novozymes A/S) , CELLUCLAST™ (Novozymes A/S) , NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S) , CELLUZYME™ (Novozymes A/S) , CEREFLO™ (Novozymes A/S) , y ULTRAFLO™ (Novozymes A/S) , ACCELERASE™ (Genencor Int.), LA INEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM) ; METHAPLUS® S/L 100 (DSM) , ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH) , FIBREZYE® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.) o VTSCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). Las enzimas de celulasa se agregan en cantidades efectivas de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 5.0 %p de sólidos, por ejemplo, aproximadamente 0.025 a aproximadamente 4.0 %p de sólidos o aproximadamente 0.005 a aproximadamente 2.0 %p de sólidos.

Ejemplos de endoglucanasas bacterianas que pueden utilizarse en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, una endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente de los Estados Unidos No. 5,275,944; WO 96/02551; Patente de los Estados Unidos No. 5,536,655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanasa III de Thermobifida fusca (WO 05/093050); y endoglucanasa V de Thermobifida fusca (WO 05/093050) .

Ejemplos de endoglucanasas fúngicas que pueden utilizarse en la presente invención, incluyen, a modo no taxativo, una endoglucanasa I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglucanasa I de Trichoderma reesei Cel7B (no. de acceso de GENBANK™ M15665) , endoglucanasa II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanasa II Cel5A de Trichoderma reesei (no. de acceso de GENBANK™ M19373) , endoglucanasa III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, no. de acceso de GENBANK™ AB003694) , endoglucanasa V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, no. de acceso de GENBANK™ Z33381) , endoglucanasa de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanasa de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanasa de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanasa de Fusarium oxysporum (no. de acceso de GENBANK™ L29381) , endoglucanasa de Humicola grísea var. thermoidea (no. de acceso de GENBANK™ AB003107) , endoglucanasa de Melanocarpus albomyces (no. de acceso de GENBANK™ MAL515703) , endoglucanasa de Neurospora crassa (no. de acceso de GENBANK™ XM_324477) , endoglucanasa V de Humicola insolens, endoglucanasa CBS 117.65 de Myceliophthora thermophila, endoglucanasa basidiomycete CBS 495.95, endoglucanasa CBS 494.95 de basidiomycete, endoglucanasa NRRL 8126 CEL6B de Thielavia terrestris, endoglucanasa NRRL 8126 CEL6C de Thielavia terrestris, endoglucanasa NRRL 8126 CEL7C de Thielavia terrestris, endoglucanasa NRRL 8126 CEL7E de Thielavia terrestris, endoglucanasa NRRL 8126 CEL7F de Thielavia terrestris, endoglucanasa ATCC 62373 CEL7A de Cladorrhinum foecundissi u y endoglucanasa cepa No. VTT-D-80133 de Trichoderwa reesei (no. de acceso de GENBANK™ M15665) .

Ejemplos de celobiohidrolasas útiles en la presente invención incluyen, a modo no taxativo, celobiohidrolasa II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740) , celobiohidrolasa I de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolasa II de Chaetomium thermophilum, celobiohidrolasa I de Humicola insolens, celobiohidrolasa II de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobiohidrolasa II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325) , celobiohidrolasa II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435) , celobiohidrolasa I de Trichoder a reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei y celobiohidrolasa II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086) .

Ejemplos de beta-glucosidasas útiles en la presente invención incluyen, a modo no taxativo, beta-glucosidasas de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288) , Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499) , Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol . Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 y WO 2010/088387) , Thielavia terrestris (WO 2011/035029) y Trichophaea saccata (WO 2007/019442) .

La beta-glucosidasa puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, la beta-glucosidasa es una proteína de fusión BG de variante de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) o una proteína de fusión de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637.

Otras endoglucanasas , celobiohidrolasas y beta-glucosidasas útiles se describen en numerosas familias de Glicosil Hidrolasas utilizando la clasificación de acuerdo con Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities , Biochem. J. 280: 309-316, and Henrissat B., and Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Otras enzimas celulolíticas que pueden utilizarse en la presente invención se describen en WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, O 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, O 2003/052055, WO 2003/052056, O 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, O 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, O 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente de los Estados Unidos No. 5,457,046, Patente de los Estados Unidos No. 5,648,263 y Patente de los Estados Unidos No. 5,686,593.

En los procesos de la presente invención, cualquier polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica puede utilizarse como un componente de la composición enzimática.

Ejemplos de polipéptidos GH61 que tienen actividad potenciadora celulolítica útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, polipéptidos GH61 de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131 y WO 2011/035027) , Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 y WO 2010/065830) , Trichoderma reesei (WO 2007/089290) , Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864 y WO 2009/085868) , Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp . (WO 2011/039319), Penicillium sp. (WO 2011/041397) y Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504) .

En un aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica se utiliza en presencia de un catión metálico divalente activante soluble de acuerdo con WO 2008/151043, por ejemplo, manganeso o cobre.

En otro aspecto, el polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica se utiliza en presencia de un compuesto dioxi, un compuesto bicíclico, un compuesto heterocíclico, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto de quinona, un compuesto que contiene azufre o un licor obtenido de un material celulósico pretratado tal como forraje de maíz pretratado (PCS) .

El compuesto dioxi puede incluir cualquier compuesto adecuado que contenga dos o más átomos de oxígeno. En algunos aspectos, los compuestos dioxi contienen un resto arilo sustituido tal como se describe en la presente. Los compuestos dioxi pueden comprender uno o más (por ejemplo, varios) hidroxilo y/o derivados de hidroxilo, pero también incluyen restos de arilo sustituido que carecen de hidroxilo y derivados de hidroxilo. Ejemplos no taxativos de los compuestos dioxi incluyen pirocatecol o catecol ; ácido cafeico; ácido 3 , 4 -dihidroxibenzoico; 4-tert-butil-5-metoxi-1, 2-benzenediol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-trihidroxibenzoato; 2 , 3 , 4 -trihidroxibenzofenona ; 2,6-dimetoxifenol ; ácido sinapínico; ácido 3 , 5 -dihidroxibenzoico; 4-cloro-l, 2-benzenediol; 4 -nitro-1 , 2 -benzenediol ; ácido tánico; galato de etilo; glicolato de metilo; ácido dihidroxifumárico; 2 -butino- 1 , 4 -diol ; (ácido crocónico; 1,3- propanediol; ácido tartárico; 2 , 4 -pentanediol ; 3 -etioxi -1 , 2 -propanediol ; 2 , 4 , ' -trihidroxibenzofenona; cis-2-buteno-l, 4-diol ; 3 , 4 -dihidroxi-3 -ciclobuteno-1 , 2 -diona; dihidroxiacetona ; acrolein acetal; metil-4 -hidroxibenzoato ; ácido 4-hidroxibenzoico; y metil-3 , 5-dimetoxi-4 -hidroxibenzoato; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto bicíclico puede incluir cualquier sistema de anillos condensados sustituido adecuado tal como se describe en el presente. Los compuestos pueden comprender uno o más {por ejemplo, varios) anillos adicionales y no están limitados a un número específico de anillos a menos que se indique de otra forma. En un aspecto, el compuesto bicíclico es un flavonoide. En otro aspecto, el compuesto bicíclico es un isoflavonoide opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el compuesto bicíclico es un ión flavilio opcionalmente sustituido, tal como una antocianidina opcionalmente sustituida o antocianina opcionalmente sustituida, o uno de sus derivados. Ejemplos no taxativos de los compuestos bicíclicos incluyen epicatequina ; quercetina; miricetina; taxifolina; kaempferol; morina; acacetina; naringenina; isorhamnetina; apigenina; cianidina; cianina; kuromanina; keracianina; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto heterocíclico puede ser cualquier compuesto adecuado, tal como un anillo aromático o no aromático opcionalmente sustituido que comprenda un heteroátomo, tal como se describe en la presente. En un aspecto, el compuesto heterocíclico es un compuesto que comprende un resto heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o un resto heteroarilo opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el resto heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o resto heteroarilo opcionalmente sustituido es un heterocicloalquilo de 5 miembros opcionalmente sustituido o un resto heteroarilo de 5 miembros opcionalmente sustituido. En otro aspecto, el resto heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido es un resto opcionalmente sustituido seleccionado entre pirazolilo, furanilo, imidazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, oxazolilo, pirrolilo, piridilo, pirimidilo, piridazinilo , tiazolilo, triazolilo, tienilo, dihidrotienopirazolilo, tianaftenilo, carbazolilo, bencimidazolilo , benzotienilo, benzofuranilo, indolilo, quinolinilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzooxazolilo, benzimidazolilo, isoquinolinilo, isoindolilo, acridinilo, benzoisazolilo, dimetilhidantoína, pirazinilo, tetrahidrofuranilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, indolilo, diazepinilo, azepinilo, tiepinilo, piperidinilo y oxepinilo. En otro aspecto, el resto heterocicloalquilo opcionalmente sustituido o el resto heteroarilo opcionalmente sustituido es un furanilo opcionalmente sustituido. Ejemplos no taxativos de los compuestos heterocíclicos incluyen (1,2-dihidroxietil ) -3 , 4 -dihidroxifuran-2 (5H) -ona,- 4-hidrioxi-5- metil-3-furanona; 5-hidroxi-2 (5H) -furanona; [1,2-dihidroxietil] furan-2 ,3,4 (5H) -triona; a-hidroxi-?-butirolactona ; ?-lactona ribónica; ?-lactona de ácido aldohexuronicaldohexuronico; d-lactona de ácido glucónico; 4-hidroxicoumarina; dihidrobenzofurano; 5- (hidroximetil) furfural ; furoina; 2 (5H) -furanona; 5,6-dihidro-2H-piran-2-ona; y 5 , 6-dihidro-4-hidroxi-6-metil-2H-piran-2-ona; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto que contiene nitrógeno puede incluir cualquier compuesto adecuado con uno o más átomos de nitrógeno. En un aspecto, el compuesto que contiene nitrógeno comprende un resto de tipo amina, imina, hidroxilamina o nitróxido. Ejemplos no taxativos de los compuestos que contienen nitrógeno incluyen acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2 -aminofenol ; 1, 2-bencenodiamina; 2,2,6, 6-tetrametil-l-piperidiniloxi ; 5,6,7,8-tetrahidrobiopterina; 6 , 7 -dimetil-5 , 6,7, 8-tetrahidropterina; y ácido maleamico; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto quinónico puede ser cualquier compuesto adecuado que comprenda un resto de tipo quinona tal como se describe en la presente. Ejemplos no taxativos de los compuestos de quinona incluyen 1 , 4 -benzoquinona; 1,4-naftoquinona; 2-hidroxi-l, 4 -naftoquinona ; 2 , 3 -dimetoxi-5-metil-1, 4 -benzoquinona o coenzima Q0; 2 , 3 , 5 , 6 -tetrametil -1 , 4 -benzoquinona o duroquinona; 1 , 4 -dihidroxiantraquinona ; 3- hidroxi-l-metil-5 , 6-indolinediona o adrenocromo; 4 -tere-butil-5-metoxi-l, 2 -benzoquinona ; pirroloquinolina quinona; o una sal o solvato de los mismos.

El compuesto que contiene azufre puede incluir cualquier compuesto adecuado que comprenda uno o más átomos de azufre. En un aspecto, el compuesto que contiene azufre comprende un resto seleccionado entre tionilo, tioéter, sulfinilo, sulfonilo, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfónico y éster sulfónico. Ejemplos no taxativos de compuestos que contienen azufre incluyen etanotiol; 2-propanotiol ; 2-propeno-l-tiol ; ácido 2-mercaptoetanosulfónico; bencenotiol ; benceno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; o una sal o solvato de los mismos.

En un aspecto, una cantidad efectiva del compuesto descrito anteriormente a material celulósico como una relación molar con unidades de glucosilo de celulosa es de aproximadamente 10~6 a aproximadamente 10, por ejemplo, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 5, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 1, aproximadamente 10"5 a aproximadamente 1, aproximadamente 10~5 a aproximadamente 10"1, aproximadamente 10"4 a aproximadamente 10"1, aproximadamente 10~3 a aproximadamente 10"1, o aproximadamente 10"3 a aproximadamente 10"2. En otro aspecto, una cantidad efectiva del compuesto descrito anteriormente es de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 1 M, por ejemplo, aproximadamente 0.5 µ? a aproximadamente 0.75 M, aproximadamente 0.75 µ? a aproximadamente 0.5 M, aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 0.25 M, aproximadamente 1 µ? a aproximadamente 0.1 M, aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 µ? a aproximadamente 25 mM, aproximadamente 10 µ? a aproximadamente 10 mM, aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 5 mM o aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 1 mM.

El término "licor" significa la fase de solución, ya sea acuosa, orgánica o una combinación de las mismas, que surge del tratamiento de un material de lignocelulosa y/o hemicelulosa en una suspensión o monosacáridos de los mismos, por ejemplo, xilosa, arabinosa, mañosa, etc., en condiciones como se describe en la presente, y los contenidos solubles de los mismos. Un licor para la mejora celulolítica de un polipéptido GH61 puede producirse mediante el tratamiento de un material de lignocelulosa o hemicelulosa (o materia prima) aplicando calor y/o presión, opcionalmente en presencia de un catalizador, por ejemplo, ácido, opcionalmente en presencia de un disolvente orgánico, y opcionalmente en combinación con interrupción física del material, y luego separando la solución de los sólidos residuales. Las condiciones determinan el grado de mejora celulolítica obtenible a través de la combinación de licor y un polipéptido GH61 durante la hidrólisis de un sustrato celulósico por una preparación celulasa. El licor puede separarse del material tratado utilizando un método estándar en la técnica, tal como filtración, sedimentación o centrifugación.

En un aspecto, una cantidad efectiva del licor a celulosa es de aproximadamente 10~6 a aproximadamente 10 g por g de celulosa, por ejemplo, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 7.5 g, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 5 g, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 2.5 g, aproximadamente 10"6 a aproximadamente 1 g, aproximadamente 105 a aproximadamente 1 g, aproximadamente 10"5 a aproximadamente 10"1 g, aproximadamente 10"4 a aproximadamente 10"1 g, aproximadamente 10"3 a aproximadamente 10"1 g o aproximadamente 10"3 a aproximadamente 102 g por g de celulosa .

En un aspecto, una o más (por ejemplo, varias) enzimas hemicelulolíticas comprenden una preparación enzimática hemicelulolítica comercial. Ejemplos de preparaciones enzimáticas hemicelulolítica comerciales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, SHEARZY E™ (Novozymes A/S) , CELLIC® HTec (Novozymes A/S) , CELLIC® HTec2 (Novozymes A/S) , CELLIC® HTec3 (Novozymes A/S) , VISCOZYME® (Novozymes A/S) , ULTRAFLO® (Novozymes A/S) , PULPZYME® HC (Novozymes A/S) , MULTIFECT® Xylanase (Genencor) , ACCELLERASE® XY (Genencor) , ACCELLERASE® XC (Genencor) , ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes) , HSP 6000 Xylanase (DSM) , DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Gales, Reino Unido) , DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Gales, Reino Unido) , y DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Gales, Reino Unido).

Ejemplos de xilanasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, xilanasas de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP :AAR63790 ; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256) , Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772) , Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210) y Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083) .

Ejemplos de beta-xilosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, beta-xilosidasas de Neurospora crassa (número de acceso de SwissProt Q7SOW4) , Trichoderma reesei (número de acceso UniProtKB/TrEMBL Q92458) , y Talaromyces emersonii (número de acceso SwissProt Q8X212) .

Ejemplos de acetilxilan esterasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, acetilxilan esterasas de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918) , Chaetomium globosum (número de acceso de Uniprot Q2GWX4) , Chaetomium gracile (número de acceso de GeneSeqP AAB82124) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709) , Hypocrea jecorina (WO 2005/001036) , Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (número de acceso de UniProt q7s259) , Phaeosphaeria nodorum (número de acceso de Uniprot Q0UHJ1) y Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846) .

Ejemplos de feruloil esterasas (esterasas de ácido ferúlico) útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, feruloil esterasas de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), JVeosartorya fischeri (número de acceso de UniProt A1D9T4) , Neurospora crassa (número de acceso de UniProt Q9HGR3) , Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) y Thielavia terrestris (WO 2010/053838 y WO 2010/065448) .

Ejemplos de arabinofuranosidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, arabinofuranosidasas de Aspergillus niger (número de acceso de GeneSeqP AAR94170) , Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 y WO 2009/073383) , y M. giganteus (WO 2006/114094) .

Ejemplos de alfa-glucuronidasas útiles en los procesos de la presente invención incluyen, a modo no taxativo, alfa-glucuronidasas de Aspergillus clavatus (número de acceso de UniProt alccl2) , Aspergillus fumigatus (número de acceso de SwissProt Q4WW45) , Aspergillus niger (número de acceso de Uniprot Q96WX9) , Aspergillus terreus (número de acceso de SwissProt Q0CJP9) , Humicola insolens (WO 2010/014706) , Penicillium aurantiogriseum ( O 2009/068565) , Talaromyces emersonii (número de acceso de UniProt Q8X211) y Triaoderma reesei (número de acceso de Uniprot Q99024) .

Los polipéptidos que tienen actividad enzimática utilizados en los procesos de la presente invención pueden producirse mediante fermentación de las cepas microbianas indicadas anteriormente en un medio de nutrientes que contiene fuentes de carbono y nitrógeno adecuadas y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Bennett, J.W. y LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungí, Academic Press, CA, 1991) . Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Intervalos de temperatura y otras condiciones adecuadas para el crecimiento y producción de enzimas con conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Bailey, J.E., y Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986) .

La fermentación puede ser cualquier método de cultivo de una célula que resulta en la expresión o aislamiento de una enzima o proteína. La fermentación puede comprenderse, por lo tanto, que comprende cultivo de matraces de agitación o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, de lote, de lote alimentado o estado sólido) en laboratorio o Eermentadores industriales realizada en un medio adecuado y en condiciones que permiten que la enzima se exprese o aisle. Las enzimas resultantes producidas mediante los métodos descritos anteriormente pueden recuperarse del medio de fermentación y purificarse mediante procedimientos convencionales.

Fermentación . Los azúcares fermentables obtenidos del material celulósico o que contiene xilano hidrolizado puede fermentarse por uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos de fermentación capaces de fermentar los azúcares directamente o indirectamente en un producto de fermentación deseado. "Fermentación" o "proceso de fermentación" se refiere a cualquier proceso de fermentación o cualquier proceso que comprende una etapa de fermentación. Los procesos de fermentación también incluyen procesos de fermentación utilizados en la industria de alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino) , industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados) , industria de cuero e industria de tabaco. Las condiciones de fermentación dependen del producto de fermentación deseado y el organismo de fermentación y pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica.

En la etapa de fermentación, azúcares, liberados del material celulósico o que contiene xilano como resultado de las etapas de pretratamiento e hidrólisis enzimática, se fermentan a un producto, por ejemplo, etanol, mediante un organismo de fermentación, tal como levadura. La hidrólisis (sacarificación) y fermentación pueden estar separadas o simultáneas, como se describe en la presente.

Cualquier material celulósico o que contiene xilano hidrolizado adecuado puede utilizarse en la etapa de fermentación al poner en práctica la presente invención. El material se selecciona generalmente en base al producto de fermentación deseado, es decir, la sustancia a obtener de la fermentación, y el proceso empleado, como es bien conocido en la técnica.

La expresión "medio de fermentación" se comprende en la presente que se refiere a un medio antes de que se agregue el microorganismo de fermentación, tal como, un medio que resulta de un proceso de sacarificación, así como un medio utilizado en un proceso de sacarificación simultánea y procesos de fermentación (SSF) .

"Microorganismo de fermentación" se refiere a cualquier microorganismo, incluyendo organismos bacterianos y fúngicos, adecuados para su uso en un proceso de fermentación deseado para producir un producto de fermentación. El organismo de fermentación puede ser organismos que fermentan hexosa y/o pentosa o una combinación de los mismos. Ambos organismos de fermentación de hexosa y pentosa son bien conocidos en la técnica. Microorganismos de fermentación adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa, xilosa, xilulosa, arabinosa, maltosa, mañosa, galactosa y/u oligosacáridos , directamente o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Ejemplos de organismos de fermentación bacterianos y fúngicos que producen etanol son descritos por Lin et al., 2006, Appl . Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

Ejemplos de microorganismos de fermentación que pueden fermentar azúcares de hexosa incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tales como levadura. Levadura preferida incluye cepas de Candida, Kluyveromyces, y Saccharomyces, por ejemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae .

Ejemplos de organismos de fermentación que pueden fermentar azúcares de pentosa en su estado nativo incluyen organismos bacterianos y fúngicos, tales como un poco de levadura. Levadura que fermenta xilosa preferida incluye cepas de Candida, preferiblemente C. sheatae o C. sonorensis; y cepas de Pichia, preferiblemente P. stipitis, tales como P. stipitis CBS 5773. Levadura que fermenta pentosa preferida incluye cepas de Pachysolen, preferiblemente P. tannophilus . Los organismos que no son capaces de fermentar azúcares de pentosa, tales como xilosa y arabinosa, pueden modificarse genéticamente para hacerlo mediante métodos conocidos en la técnica.

Entre los ejemplos de bacterias que pueden fermentar hexosa y pentosa para obtener etanol de forma eficiente se incluyen, por ejemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofer entans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum y Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, ver supra) .

Otros organismos de fermentación incluyen cepas de Bacillus, tales como Bacillus coagulans; Candida, tales como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii , C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii , C. utilis y C. scehatae; Clostridium, tales como C. acetobutylicum, C. thermocellum y C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas E. coli que hayan sido modificadas genéticamente para mejorar el rendimiento de etanol; Geobacillus s . ; Hansenula, tales como Hansenula anómala ; Klebsiella, tales como K. oxytoca; Kluyveromyces, tales como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans y K. fragilis; Schizosaccharomyces, tales como S. pombe; Thermoanaerobacter, tales como Thermoanaerobacter saccharolyticum; y Zymomonas, tales como Zymomonas mobilis.

En un aspecto preferido, la levadura es una Bretannomyces . En un aspecto más preferido, la levadura es Bretannomyces clausenii. En otro aspecto preferido, la levadura es una Candida. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida sonorensis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida boidinii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida blankii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida brassicae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida diddensii. En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida entomophiliia . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida pseudoCropicalis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida scehatae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Candida utilis. En otro aspecto más preferido, la levadura es una Clavispora . En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora lusitaniae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Clavispora opuntiae. En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces. En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces fragilis . En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces marxianus . En otro aspecto más preferido, la levadura es Kluyveromyces thermotolerans . En otro aspecto más preferido, la levadura es Pachysolen . En otro aspecto más preferido, la levadura es Pachysolen tannophilus . En otro aspecto más preferido, la levadura es una Pichia. En otro aspecto más preferido, la levadura es una Pichia stipitis . En otro aspecto preferido, la levadura es una Saccharomyces spp. En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces cerevisiae . En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces distaticus . En otro aspecto más preferido, la levadura es Saccharomyces uvarum.

En un aspecto preferido, la bacteria es una Bacillus. En un aspecto más preferido, la bacteria es Bacillus coagulans. En otro aspecto más preferido, la bacteria es una Clostridium. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium acetobutylicum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium phytofermentans. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Clostridium thermocellum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Geobacilus sp . En otro aspecto más preferido, la bacteria es una Thermoanaerobacter. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Thermoanaerobacter saccharolyticum. En otro aspecto más preferido, la bacteria es una Zymomonas. En otro aspecto más preferido, la bacteria es Zymomonas mobilis.

Entre las levaduras apropiadas para la producción de etanol disponibles en el mercado se incluyen, por ejemplo, BIOFERM™ AFT y XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE.UU.), las levaduras ETHANOL RED™ (Fermentis/Lesaffre , EE.UU.), FALI™ (Fleischmann' s Yeast, EE.UU.), FERMIOL™ (DSM Specialties) , GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suecia) y las levaduras frescas SUPERSTART™ y THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EE.UU.).

En un aspecto preferido, el microorganismo de fermentación ha sido modificado genéticamente para que posea la capacidad de fermentar azúcares de pentosa, tales como los que utilizan xilosa, arabinosa y los microorganismos que coutilizan xilosa y arabinosa.

La clonación de genes heterólogos a varios microorganismos de fermentación ha llevado a la construcción de organismos capaces de convertir hexosas y pentosas en etanol (cofermentación) (Chen y Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl . Biochem. Biotechnol . 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLl and TALl genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobio xylose fermentation: a proof of principie, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech.

Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol . Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al . , 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, ????. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, isomerasa de xilosa) .

En un aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Candida sonorensis . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Escherichia coli. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Klebsiella oxytoca. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Kluyveromyces marxianus . En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Saccharomyces cerevisiae. En otro aspecto preferido, el microorganismo de fermentación modificado genéticamente es Zymomonas mobilis.

Es bien sabido en la técnica que los organismos ya descritos pueden también utilizarse para producir otras sustancias, tal como se describe en la presente.

El microorganismo de fermentación se agrega normalmente al material o hidrolisado celulósico degradado o que contiene xilano y la fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 8 y aproximadamente 96 horas, por ejemplo, aproximadamente 24 a aproximadamente 60 horas. La temperatura es normalmente de entre aproximadamente 26 °C y aproximadamente 60 °C, por ejemplo, aproximadamente 32 °C o 50 °C, y aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 8, por ejemplo, pH 4-5, 6 o 7.

En un aspecto, la levadura y/u otro microorganismo se aplica al material celulósico degradado o que contiene xilano y la fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 12 a aproximadamente 96 horas, por ejemplo normalmente 24-60 horas. En otro aspecto, la temperatura es preferentemente de entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 60 °C, por ejemplo, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 50 °C, aproximadamente 32 °C a aproximadamente 50 °C o aproximadamente 32 °C a aproximadamente 50 °C y en general el pH es de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7. Sin embargo, algunos organismos de fermentación, por ejemplo, bacterias, tienen una temperatura óptima de fermentación mayor. Preferentemente se aplica levadura u otro microorganismo de fermentación en cantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferentemente de aproximadamente 107 a 1010, especialmente aproximadamente 2 x 108 células viables por mi de caldo de fermentación. Se puede encontrar más información con relación al uso de levadura para la fermentación en, por ejemplo, "The Alcohol Textbook" (Editors K. Jacques, T.P. Lyons y D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999) , que se incorpora en la presente a modo de referencia.

Se puede utilizar un estimulador de la fermentación junto con cualquiera de los procesos descritos por la presente para realizar una mejora mayor en el proceso de fermentación y, en particular, la actuación del microorganismo de fermentación, por ejemplo, una mejora del índice y del rendimiento de etanol . Un "estimulador de la fermentación" hace referencia a estimuladores para el crecimiento de los microorganismos de fermentación, en particular levaduras. Los estimuladores de la fermentación preferidos para el crecimiento incluyen vitaminas y minerales. Entre los ejemplos de vitaminas se incluyen multivitaminas , biotina, pantotenato, ácido nicotínico, raeso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzoico, ácido fólico, riboflavina y vitaminas A, B, C, D y E. Ver, por ejemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002) , que se incorpora por la presente a modo de referencia. Entre los ejemplos de minerales se incluyen minerales y sales minerales que pueden proveer nutrientes que comprenden P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn y Cu.

Productos de fermentación: Un producto de fermentación puede ser cualquier sustancia que deriva de la fermentación. El producto de fermentación puede ser, pero no se limita a, un alcohol (por ejemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol , 1 , 3 -propanediol [propilenglicol] , butanodiol, glicerina, sorbitol y xilitol) ; un alqueno (por ejemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano y dodecano) , un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano) , un alqueno (por ejemplo penteno, hexeno, hepteno y octeno) ; un aminoácido (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina y treonina) ; un gas (por ejemplo, metano, hidrógeno (¾) , dióxido de carbono (CX¾) , y monóxido de carbono (CO) ) ; isopreno; una cetona (por ejemplo, acetona) ; un ácido orgánico (por ejemplo, ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2 , 5-diceto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico y ácido xilónico) ; y policétido. El producto de fermentación puede también ser una proteína como producto de alto valor.

En un aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcohol. Se entenderá que el término "alcohol" comprende una sustancia que contiene uno o más restos hidroxilo. En un aspecto más preferido, el alcohol es n-butanol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es isobutanol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es etanol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es metanol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es arabinitol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es butanodiol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es etilenglicol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerina. En otro aspecto más preferido, el alcohol es glicerol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es 1 , 3 -propanodiol . En otro aspecto más preferido, el alcohol es sorbitol. En otro aspecto más preferido, el alcohol es xilitol. Ver, por ejemplo, Gong et al., 1999, Ethanol production from renewable resources, en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemania, 65: 207-241; Silveira y Joñas, 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl . Microbiol . Biotechnol . 59: 400-408; Nigam y Singh, 1995, Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6) : 595-603.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alcano. El alcano puede ser un alcano ramificado o no ramificado. En otro aspecto más preferido, el alcano es pentano. En otro aspecto más preferido, el alcano es hexano. En otro aspecto más preferido, el alcano es heptano. En otro aspecto más preferido, el alcano es octano. En otro aspecto más preferido, el alcano es nonano. En otro aspecto más preferido, el alcano es decano. En otro aspecto más preferido, el alcano es undecano. En otro aspecto más preferido, el alcano es dodecano.

En otro aspecto más preferido, el producto de fermentación es un cicloalcano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclopentano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclohexano. En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es cicloheptano . En otro aspecto más preferido, el cicloalcano es ciclooctano.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un alqueno. El alqueno puede ser un alqueno no ramificado o ramificado. En otro aspecto más preferido, el alqueno es penteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hexeno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es hepteno. En otro aspecto más preferido, el alqueno es octeno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un aminoácido. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido aspártico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutámico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es glicina. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es lisina. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es serina. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es treonina. Ver, por ejemplo, Richard, A., and Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un gas. En otro aspecto más preferido, el gas es metano. En otro aspecto más preferido, el gas es H2. En otro aspecto más preferido, el gas es C02. En otro aspecto más preferido, el gas es CO. Ver, por ejemplo, Kataoka et al., 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; y Gunaseelan, 1997, Biomass and Bioenerg 13(1-2) : 83-114, Anaerobic digestión of biomass for methane production: A review.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es isopreno.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es cetona. Se entenderá que el término "cetona" comprende una sustancia que contiene uno o más restos de cetona. En otro aspecto más preferido, la cetona es acetona. Ver, por ejemplo, Qureshi y Blaschek, 2003, ver mencionado anteriormente.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un ácido orgánico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acético. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido acetónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido adípico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido ascórbico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido cítrico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido 2 , 5 -diceto-D-glucónico . En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fórmico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido fumárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucárico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glucurónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido glutárico. En otro aspecto preferido, el ácido orgánico es ácido 3 -hidroxipropiónico . En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido itacónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido láctico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido málico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido malónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido oxálico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido propiónico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido succínico. En otro aspecto más preferido, el ácido orgánico es ácido xilónico. Ver, por ejemplo, Chen y Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl . Biochem. Biotechnol . 63-65: 435-448.

En otro aspecto preferido, el producto de fermentación es un policétido.

Recuperación. El producto de fermentación puede ser recuperado opcionalmente del medio de fermentación mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica que incluye, a modo no taxativo, cromatografía, procesos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación o extracción. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulósico fermentado o que contiene xilano y purificado por métodos convencionales de destilación. Se puede obtener etanol con una pureza de hasta 96 %vol . , que se puede utilizar como, por ejemplo, etanol carburante, etanol para beber, es decir bebidas alcohólicas neutras potables o etanol industrial Péptido señal La presente invención también se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un péptido señal que comprende o está constituido por los aminoácidos comprendidos entre el aminoácido 1 y el 22 de la SEQ ID NO: 2. El polinucleótido puede además comprender una proteína de que codifica un gen, que está ligado operablemente al péptido señal. Preferentemente, la proteína es ajena al péptido señal. En un aspecto, el polinucleótido que codifica el péptido señal está constituido por los nucleótidos comprendidos entre el nucleótido 1 y 66 de la SEQ ID NO: 1.

La presente invención se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospederas recombinantes que comprenden los polinucleótidos .

La presente invención también se refiere a métodos de producción de una proteína que comprenden (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende el polinucleótido ligado operablemente a un gen que codifica la proteína; y opcionalmente (b) recuperar la proteína.

La proteína puede ser nativa o heteróloga respecto a la célula hospedera. El término "proteína" no se usa en la presente para referirse a una longitud específica del producto codificado y, por lo tanto, comprende péptidos, oligopéptidos y polipéptidos. El término "proteína" también abarca dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas también incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.

Preferentemente, la proteína es una hormona, enzima, receptor o porción del mismo, anticuerpo o porción del mismo, o un reportero. Por ejemplo, la proteína puede ser una hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidoreductasa o transferasa, por ejemplo, un alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, amilasa, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrin glicosiltransferasa, deoxiribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, glucoamilasa, invertasa, laccasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.

El gen puede obtenerse a partir de cualquier procariota, eucariota u otra fuente.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Cepas Se utilizó la cepa IBT 4903 de Penicillium capsulatum como fuente de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa. Se utilizó la cepa MT3568 de Aspergillus oryzae para la expresión del gen de Penicillium capsulatum que c polipéptido que tiene actividad de xilanasa. MT3568 de A. oryzae es un gen amdS (acetamidasa) alterado derivado de JaL355 de Aspergillus oryzae (WO 2002/40694) en el que la auxotrofía de pyrG se restauró al alterar el gen acetamidasa de A. oryzae (amdS) .

Medios y soluciones El medio de YP+2% de glucosa estaba compuesto por un 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de glucosa en agua desionizada.

Las placas de PDA estaban compuestas por infusión de papa hecha al hervir 300 g de papas en rebanadas (lavadas pero no peladas) en agua durante 30 minutos y luego decantar o colar el caldo con una estopilla. Luego se agregó agua destilada hasta que el volumen total de la suspensión fue de 1 litro, y luego se agregaron 20 g de dextrosa y 20 g de polvo de agar. Se esterilizó el medio mediante el uso de un autoclave a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) .

Las placas de LB estaban compuestas por 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 15 g de Bacto-agar y agua desionizada hasta 1 litro.

El medio LB estaba compuesto por 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio y agua desionizada hasta 1 litro.

Las placas de sacarosa COVE estaban compuestas por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 mi de solución salina COVE y agua desionizada hasta 1 litro. El medio se esterilizó mediante el uso de un autoclave a 1.05 kg/cm2 (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) . El medio se enfrió hasta 60°C y luego se agregaron acetamida estéril y CsCl en concentraciones de 10 mM y 15 mM y posteriormente TRITON® X-100 a 50 µ? por 500 mi de medio.

La solución salina COVE estaba compuesta por 26 g de MgS04-7H20, 26 g de KCl, 26 g de KH2P04, 50 mi de solución de metales traza COVE y agua desionizada hasta 1 litro.

La solución de metales traza COVE estaba compuesta por 0.04 g de Na2B407 · 10H2O, 0.4 g de CuS04-5H20, 1.2 g de FeS04-7H20, 0.7 g de MnS04-H20, 0.8 g de Na2Mo04 · 2H20, 10 g de ZnS04-7H20 y agua desionizada hasta 1 litro.

El medio Dap-4C estaba compuesto por 20 g de dextrosa, 10 g de maltosa, 11 g de MgS04-7H20, 1 g de KH2P04, 2 g de ácido cítrico, 5.2 g de ?3?04·?20, 0.5 g de extracto de levadura (Difco) , 1 mi de DOWFAX™ 63N10 (Dow Chemical Company, Midland, MI, EE.UU.), 0.5 mi de solución de metales traza KU6 , 2.5 g de CaC03 y agua desionizada hasta 1 litro. El medio se esterilizó mediante el uso de autoclave a 1.05 kg/cm2 (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998). Antes del uso, se agregaron 3.5 mi (NH4)2HP04 estéril al 50% y 5 mi de ácido láctico estéril al 20% por 150 mi de medio.

La solución de metales traza KU6 se compuso de 0.13 g de NiCl2/ 2.5 g de CuS04-5H20, 13.9 g de FeS04-7H20, 8.45 g de MnS04-H20, 6.8 g de ZnCl2, 3 g de ácido cítrico y agua desionizada hasta 1 litro.

Ejemplo 1: Fuente de información de secuencia de ADN para la cepa IBT 4903 de Penicillixx capsulatum Se generó una fuente de información de secuencia genómica mediante secuenciación con ADN Ilumina en el Beijing Genome Institute (BGI) en Pekín, China a partir de ADN genómico aislado de la cepa IBT 4903 de Penicillium capsulatum. Un ensamblaje preliminar del genoma se analizó utilizando el Paquete de Análisis de Secuencias Pedant-Pro™ (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemania) . Se utilizaron modelos de genes construidos mediante el software como punto de partida para detectar homólogos de GH10 en el genoma. Se construyeron modelos de genes precisos manualmente mediante el uso de proteínas múltiples de secuencia GH10 conocidas como guía.

Ejemplo 2: Extracción genómica de ADN de la cepa IBT 4903 de Penicillium capsulatum Se propagó la cepa IBT 4903 de Penicillium capsulatum en placas de PDA mediante crecimiento a 26°C durante 7 días. Se utilizaron esporas cosechadas de las placas de PDA para inocular 25 mi de medio de YP+2% de glucosa en un matraz oscilante con deflectores e incubado a 26°C durante 72 horas con agitación a 85 rpm.

Se aisló el ADN genómico de acuerdo con un protocolo modificado del Plant Maxi Kit DNEASY® (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca) . El material fúngico del cultivo mencionado anteriormente se cosechó mediante centrifugación a 14000 x g durante 2 minutos. El sobrenadante se removió y el gránulo (0.5 g) se congeló en nitrógeno líquido con arena de cuarzo y se molió hasta obtener un polvo fino en un mortero preenfriado. Se transfirió el polvo a un tubo de centrífuga de 15 mi, seguido de la adición de 5 mi de solución amortiguadora API (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca) precalentado a 65°C y 10 µ? de solución concentrada de RNasa A (100 mg/ml) seguido de agitación excéntrica vigorosa. Luego de incubar durante 10 minutos a 65 °C e invertir el tubo a intervalos regulares, se agregaron 1.8 mi de solución amortiguadora AP2 (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca) al lisado mezclando con suavidad seguido de incubación en hielo durante 10 minutos. Luego el lisado se centrifugó a 3000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se decantó en una columna de agitación máxima QIASHREDDER™ (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca) colocada en un tubo colector de 50 mi y se centrifugó a continuación a 3000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El flujo se transfirió a un nuevo tubo de 50 mi y se incorporó un volumen de 1.5 de solución amortiguadora AP3/E (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca), seguido de agitación excéntrica. Se transfirieron 15 mi de la muestra a una columna de agitación DNEASY® Maxi colocada en un tubo colector de 50 mi y se centrifugó a 3000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el flujo y se agregaron 12 mi de solución amortiguadora AW (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca) a la columna de agitación DNEASY® Maxi colocada en un tubo colector de 50 mi y se centrifugó a 3000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego de descartar el flujo, se repitió el centrifugado para desechar el alcohol sobrante. La columna de agitación DNEASY® Maxi se transfirió a un nuevo tubo de 50 mi y se agregaron 0.5 mi de solución amortiguadora AE (QIAGEN Danmark, Copenhague, Dinamarca) precalentada a 70 °C. Luego de incubar por 5 minutos a temperatura ambiente, la muestra se eluyó por centrifugado a 3000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se repitió la elución con 0.5 mi adicionales de solución amortiguadora AE y se combinaron los eluatos. La concentración del ADN cosechado se midió mediante UV a 260 nm.

Ejemplo 3: Construcción de un vector de expresión de Aspergillus oryzae que contiene la secuencia genómica de la cepa IBT 4903 de Penicillium capsulatum Se diseñaron dos cebadores sintéticos de oligonucleótidos que se muestran más adelante para amplificar el gen (P244K1) de la cepa IBT 4903 de Penicillium capsulatum mediante PCR partiendo del ADN genómico preparado en el Ejemplo 2. Se utilizó un kit de clonación IN-FUSION™ (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, California, EE.UU.) para clonar el fragmento directamente en el vector de expresión pDaul09 (WO 2005/042735) .

Cebador F-P244K1: 5' -ACACAACTGGGGATCCACCATGGTGTTCCTATCTGCACGTACGC-3 ' (SEQ ID NO: 3) Cebador R-P244K1: 5' -CCCTCTAGATCTCGAGGGCTATCTTCCCGTCAGACAGCT-3 ' (SEQ ID NO: 4) Las letras en negrita representan la secuencia de genes, secuencia subrayada es homologa a los sitios de inserción pDaul09.

Se utilizó un kit de PCR de alta fidelidad PHUSION® (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia) para la amplificación. La reacción de PCR estaba compuesta por 5 µ? de solución amortiguadora 5X HF (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia), 0.5 µ? de dNTPs (10 mM) , 0.5 µ? de polimerasa de ADN PHUSION® (0,2 unidades/µ?) (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia) 1 µ? de cebador F-P244K1 (5µ ) , 1 µL de cebador R-P244K1 (5µ?), 0.5 µ? de ADN genómico de Penicillium capsulatum (100 ng/µ?) y 16.5 µ? de agua desionizada en un volumen total de 25 µ? . Se realizó la amplificación con un motor de ADN PTC-200 (MJ Research Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 35 ciclos cada uno a 98°C durante 10 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 2.5 minutos; y 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos. La muestra después se mantuvo a 12 °C hasta que se retiró de la máquina de PCR.

Los productos de reacción se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.0% con el uso de 40 mM de base Tris, 20 mM de acetato de sodio, 1 mM de solución amortiguadora de EDTA disódico (TAE) en la que una banda de producto de 1513 pb se quitó del gel y se purificó mediante el uso de ADN de PCR GFX® ILLUSTRA® y Kit de Purificación de Banda de Gel (GE Healthcare Life Sciences, Brondby, Dinamarca) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego el fragmento se clonó en pDaul09 digerido con Bam HI y Xho I usando un kit de clonación IN-FUSION™ que resultó en el plásmido pP244 l. La clonación del gen P244K1 en pDaul09 digerido con Bam HI -Xho I resultó en la transcripción del gen P244K1 de Penicillium capsulatum bajo control de un promotor doble NA2-tpi. El promotor NA2-tpi es un promotor modificado del gen que codifica la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en la que el líder no traducido se ha reemplazado por un líder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .

El protocolo de clonación se llevó a cabo con las instrucciones del kit de clonación IN-FUSION™ y se generó un constructo P244K1 GH10. El plásmido tratado y el inserto se transformaron en células químicamente competentes ONE SHOT® TOP10F' de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se colocaron en placas de LB complementadas con 0.1 mg de ampicilina por mi.

Después de incubar a 37°C durante la noche, las colonias se observaron creciendo según fueron seleccionadas sobre las placas de ampicilina de LB . Cuatro colonias transformadas con el constructo P244K1 GHIO se cultivaron en un medio de LB complementado con 0.1 mg de ampicilina por mi y el plásmido se aisló usando un Kit Miniprep de Agitación QIAPREP® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU) de acuerdo con el protocolo del fabricante .

Los plásmidos aislados fueron secuenciados con cebadores de vector y cebadores específicos del gen P244K1 para determinar un clon de expresión de plásmidos representativo que estuviera libre de errores de PCR.

Ejemplo 4: Caracterización de la secuencia genómica de IBT 4903 de Penicillium capsulatum que codifica un polipéptido P244K1 GHIO que tiene actividad de xilanasa La secuenciación de ADN del clon genómico P244K1 GHIO de IBT 4903 de Penicillium capsulatum se realizó con un Secuenciador de ADN automatizado Applied Biosystems Model 3700 utilizando la versión 3.1 química terminal BIG-DYE™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE.UU.) y estrategia de paseo con cebadores. Los datos de secuencia de nucleótidos se examinaron para determinar la calidad y todas las secuencias se compararon entre sí con ayuda del programa informático PHRED/PHRAP (Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU. ) .

La secuencia de ADN genómico y secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia que codifica xilanasa Penicillium capsulatum P244K1 GH10 se muestran en la SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. La secuencia codificante es 1438 pb incluyendo el codón de finalización, que se interrumpe por cuatro intrones de 70 pb (nucleótidos 57 a 126), 57 pb (nucleótidos 284 a 340), 53 pb (nucleótidos 474 a 526) y 55 pb (nucleótidos 641 a 695) . La proteína prevista codificada es de 400 aminoácidos. Utilizando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se previo un péptido señal de 22 residuos. La proteína madura prevista contiene 378 aminoácidos con una masa molecular prevista de 40.3 kDa y un punto isoeléctrico de 4.54.

Una alineación global en pares comparativa de secuencias de aminoácidos se determinó utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J". Mol. Biol . 48: 443-453) con penalización abierta por brecha de 10, penalización por extensión de brecha de 0.5 y la matriz EBLOSUM62. La alineación mostró que la secuencia de aminoácidos deducida del ADN genómico Penicillium capsulatum que codifica la xilanasa GH10 (polipéptido maduro) comparte 79.6% de identidad secuencial (excluyendo brechas) respecto a la secuencia de aminoácidos deducida de una xilanasa GH10 de Penicillium sp . (GENESEQP AYB51189) .

Ejemplo 5: Expresión de la xilanasa Pe icillium capsulatum GH10 P244K1 Protoplastos MT3568 de Aspergillus oryzae preparados de acuerdo con el método de Patente europea EP0238023, páginas 14-15, se transformaron con el plásmido pP244Kl.

Los transformadores se purificaron en placas de selección de sacarosa COVE a través de una única conidia antes de esporularlos en placas PDA. La producción de la xilanasa Penicillium capsulatum GH10 por los transformadores se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo de 1 mi de cultivos estacionarios con 96 pocilios profundos a 30°C en YP+2% de medio de glucosa. La expresión se verificó en un E-Page 8% de gel SDS-PAGE 48 pocilios (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) mediante tinción Coomassie. Se seleccionó un transformador para trabajo adicional y se designó Aspergillus oryzae 34.1.

Para producción a mayor escala, las esporas Aspergillus oryzae 34.1 se esparcieron en una placa PDA e incubaron durante 5 días a 37 °C. La placa de esporas confluentes se lavó dos veces con 5 mi de 0.01% TWEEN® 20 para maximizar la cantidad de esporas recogidas. La suspensión de esporas se utilizó entonces para inocular veinticinco matraces de 500 mi que contienen 100 mi de medio Dap-4C. Los cultivos se incubaron a 30°C con agitación constante a 100 rpm. Al día cuatro post- inoculación, cada caldo de cultivo se recogió mediante filtración a través de un filtro MF75 SUPOR® MachV 0.2 µp? PES para la parte superior del frasco (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) . Los caldos de cultivo de A. oryzae 34.1 produjeron una banda a aproximadamente 52 kDa según se determinó por SDS-PAGE utilizando un gel E-Page 8% SDS-PAGE 48 pocilios. La identidad de esta banda como el polipéptido Penicillium capsulatum GH10 se verificó mediante secuenciación de péptidos.

Ejemplo 6: Método alternativo para producir la xilanasa Penicillium capsulatum GH10 (P244K1) En base a la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID NO: 1, puede obtenerse un gen sintético de una cantidad de vendedores tales como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef -Engert-Str . 11, 93053, Regensburg, Alemania) o DNA 2.0 (DNA2.0, 1430 01 Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, EE.UU.) . El gen sintético puede diseñarse para incorporar secuencias de ADN adicionales tales como sitios de restricción o regiones de recombinación homologas para facilitar la clonación en un vector de expresión.

Utilizando los dos cebadores de oligonucleótidos sintéticos F-P244K1 y F-P244K1 descritos anteriormente, puede utilizarse una reacción PCR simple para amplificar el marco de lectura abierto de longitud completa del gen sintético de la SEQ ID NO: 1. El gen puede clonarse entonces en un vector de expresión como se describe en la presente y expresarse en una célula hospedera como se describe en la presente, por ejemplo, Aspergillus oryzae.

Ejemplo 7: Purificación de la xilanasa Penicillium capsulatum GH10 P244K1 Un volumen de 1000 mi del caldo filtrado Aspergillus oryzae 34.1 (Ejemplo 5) se ajustó a pH 7.0 y filtró utilizando un filtro 0.22 µp? PES (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) . Se agregó sulfato de amonio al filtrado a una concentración de 1.8 . El filtrado se cargó en una columna de 60 mi Phenyl SEPHAROSE™ 6 de flujo rápido (alta sus) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrada con 1.8 M de sulfato de amonio pH 7.0. Después de la aplicación la columna se lavó con 3 volúmenes de columna de la solución amortiguadora de equilibrio seguido por 7 volúmenes de columna de 0.9 M sulfato de amonio a una tasa de flujo de 15 ml/minuto (la proteína permaneció unida a la columna) . La xilanasa GH10 se eluyó con 5 volúmenes de columna de 50 mM HEPES pH 7.0 a una tasa de flujo de 15 ml/minuto. Las fracciones de 10 mi se recogieron y analizaron mediante SDS-PAGE (Ejemplo 5) . Las fracciones se reunieron y aplicaron a una columna SEPHADEX™ G-25 (medio) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrada en 25 mM HEPES pH 7.0. Las fracciones se recogieron, reunieron y aplicaron a una columna 60 mi SOURCE™ 15Q (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrada en 50 mM HEPES pH 7.0. Después de la aplicación la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de la solución amortiguadora de equilibrio y la xilanasa GH10 unida se eluyó con un gradiente lineal en 20 volúmenes de columna de 0-1000 mM cloruro de sodio. Las fracciones de 10 mi se recogieron y analizaron mediante SDS-PAGE (Ejemplo 5) y fracciones con la xilanasa GH10 se reunieron a un volumen final de 90 mi. La concentración de proteínas se determinó mediante A280/A260 absorbancia.

Ejemplo 8: Ensayo de hidrólisis de mazorcas de maíz pretratadas Las mazorcas de maíz se pretrataron con NaOH (0.08 g/g mazorcas de peso seco) a 120°C durante 60 minutos a 15% de sólidos de peso seco total (TS) . El material resultante se lavó con agua hasta que fue de pH 8.2, resultando en mazorcas de maíz pretratadas alcalinamente lavadas (APCC) . Las mazorcas de maíz pretratadas alcalinamente tamizadas (GS-APCC) se prepararon ajustando el pH de APCC a 5.0 mediante la adición de 6 M HCl y agua con mezclado extensivo, molido APCC en un triturador multi-utilidad en húmedo Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, India) , y autoclave durante 45 minutos a 121°C, con TS final de 3.33%. La hidrólisis de GS-APCC se llevó a cabo utilizando placas de pocilios profundos de 2.2 mi (Axygen, Union City, CA, EE.UU.) en un volumen de reacción total de 1.0 mi.

La hidrólisis se realizó con 10 mg de sólidos totales GS-APCC por mi de 50 mM acetato de sodio pH 5.0 que contiene 1 mM de sulfato de manganeso y varias composiciones enzimáticas (expresadas como mg de proteína por gramo de celulosa) . Se prepararon las composiciones enzimáticas y luego se agregaron simultáneamente a todos los pocilios en un volumen en el intervalo de 50 µ? a 200 µ?, para un volumen final de 1 mi en cada reacción. La placa se selló entonces utilizando una selladora de calor de placa ALPS-300™ (Abgene, Epsom, United Kingdom) , se mezclo bien y se incubó a una temperatura específica durante 72 horas. Todos los experimentos indicados se llevaron a cabo por triplicado.

Después de la hidrólisis, las muestras se filtraron utilizando una placa de filtro de 96 pocilios 0.45 µp\ MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) y los filtrados se analizaron para determinar el contenido de azúcar según se describe más adelante. Cuando no se utiliza inmediatamente, las alícuotas filtradas se congelaron a -20°C. Las concentraciones de azúcar de muestras diluidas en 0.005 M H2S0 se midieron utilizando una columna 4.6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.) mediante elución con 0.05% p/p ácido benzoico- 0.005 M H2S04 a 65°C a una tasa de flujo de 0.6 mi por minuto, y cuantificación mediante integración de señales de glucosa, celobiosa, y xilosa de la detección del índice de refracción (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) calibradas por muestras de azúcar pura. Los equivalentes de glucosa resultantes se utilizaron para calcular el porcentaje de conversión de celulosa para cada reacción. Los equivalentes de xilosa resultantes se utilizaron para calcular el porcentaje de conversión de xilo-oligosacárido para cada reacción.

Glucosa, celobiosa y xilosa se midieron individualmente. Las concentraciones de azúcar medidas se ajustaron para el factor de dilución apropiado. El procesamiento de todos los datos HPLC se realizó utilizando el programa informático MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland, WA, EE.UU.).

El grado de conversión de celulosa a glucosa se calculó utilizando la siguiente ecuación: % de conversión de glucosa = (concentración de glucosa/concentración de glucosa en una digestión límite) x 100. Para calcular el % de conversión, un punto de conversión de 100% se configuró en base al testigo de celulasa (50-100 mg de celulasa Trichoderma reesei por gramo de celulosa) , y todos los valores se dividieron en este número y luego se multiplicaron por 100. Se promediaron los puntos de datos por triplicado y se calculó la desviación estándar .

El grado de conversión de xilo-oligosacárido a xilosa se calculó utilizando la siguiente ecuación: % de conversión de xilosa = (concentración de xilosa/concentración de xilosa en una digestión límite) x 100. Para calcular el % de conversión, un punto de conversión de 100% se configuró en base al testigo de celulasa (50-100 mg de celulasa Trichoderma reesei complementada con xilanasa Aspergillus fumigatus (xyl3; WO 2006/078256) y beta-xilosidasa Talaromyces e ersonii [ver Ejemplo 9] por gramo de celulosa) , y todos los valores se dividieron en este número y luego se multiplicaron por 100. Se promediaron los puntos de datos por triplicado y se calculó la desviación estándar.

Ejemplo 9: Preparación de una composición enzimática Preparación de celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus. La celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A (SEQ ID NO: 5 [secuencia de ADN] y la SEQ ID NO: 6 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó recombinantemente en Aspergillus oryzae según se describe en WO 2011/057140. El caldo de celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A se filtró, concentró, y la solución amortiguadora se intercambió con 20 mM Tris-HCl pH 8.0 utilizando un concentrador de flujo tangencial (Pall Filtron, Northborough, A, EE.UU.) equipado con una membrana de polietersulfona 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, EE.UU.). El caldo desalinizado de celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus GH7A se purificó utilizando una columna Q SEPHAROSE® (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrada en 20 mM Tris-HCl pH 8. La proteína se eluyó utilizando un gradiente lineal 0 a 1 M NaCl. Las fracciones se recogieron y las fracciones que contienen la celobiohidrolasa I se reunieron en base a SDS-PAGE utilizando un 8-16% CRITERION® libre de manchas SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.).

Preparación de celobiohidrolasa II ' de Aspergillus fumigatus. La celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus GH6A (SEQ ID NO: 7 [secuencia de ADN] y la SEQ ID NO: 8 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó recombinantemente en Aspergillus oryzae según se describe en O 2011/057140. El caldo filtrado de la celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus GH6A se filtró y la solución amortiguadora se intercambió en 20 mM Tris pH 8.0 utilizando una columna de 400 mi SEPHADEX™ G-25 (GE Healthcare, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones se reunieron y ajustaron a 1.2 M sulfato de amonio-20 mM Tris pH 8.0. La celobiohidrolasa II se cargó en una columna PHENYL SEPHAROSE™ 6 de flujo rápido (alta sus) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibró en 20 mM Tris pH 8.0 con 1.2 M de sulfato de amonio, y eluyó con 20 mM Tris pH 8.0 sin sulfato de amonio. Se reunieron las fracciones .

La preparación de polipéptido Penicillium sp. (emersonii) GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica . El polipéptido Penicillium sp. {emersonii) GH61A (SEQ ID NO: 9 [secuencia de ADN] y la SEQ ID NO: 10 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó recombinantemente y purificó de acuerdo con WO 2011/041397.

Preparación de endoglucanasa II Trichoderma reesei GH5. La endoglucanasa II Trichoderma reesei GH5 (SEQ ID NO: 11 [secuencia de ADN] y la SEQ ID NO: 12 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó recombinantemente de acuerdo con WO 2011/057140. El caldo de endoglucanasa II Trichoderma reesei GH5 se filtró, desalinizó y se sometió a intercambio de solución amortiguadora en 20 mM Tris pH 8.0 utilizando un concentrador de flujo tangencial equipado con una membrana de polietersulfona 10 kDa.

Preparación de beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus GH3A. (U569) (SEQ ID NO: 13 [secuencia de ADN] y la SEQ ID NO: 14 [secuencia de aminoácidos deducida]) se preparó recombinantemente de acuerdo con WO 2005/047499 utilizando Aspergillus oryzae como un hospedero. El caldo se filtró y ajustó a pH 8.0 con 20% de acetato de sodio, que hizo la solución túrbida. Para eliminar la turbidez, la solución se centrifugó a 20000 x g durante 20 minutos, y el sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración 0.2 m (Nalgene, ochester, NY, EE.UU.). El filtrado se diluyó con agua desionizada para alcanzar la misma conductividad que 50 mM Tris/HCl, pH 8.0. La solución de enzima ajustada se aplicó a una columna Q SEPHAROSE® de flujo rápido (GE Healthcare, Piscata ay, NJ, EE.UU.) equilibrada en 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 y se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 500 mM cloruro de sodio. Las fracciones se reunieron y trataron con 1% (p/v) carbón activado para eliminar el color del grupo beta-glucosidasa. El carbón se eliminó mediante filtración de la suspensión a través de una unidad de filtración 0.2 µp? (Nalgene, Rochester, Y, EE.UU.). El filtrado se ajustó a pH 5.0 con 20% de ácido acético y se diluyó 10 veces con agua desionizada. El filtrado ajustado se aplicó a una columna SP SEPHAROSE® de flujo rápido (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrada en 10 mM ácido succínico pH 5.0 y la beta-glucosidasa se eluyó con un gradiente lineal de 0 a 500 mM cloruro de sodio.

Preparación de beta-xilosidasa Talaromyces emersonii GH3. La beta-xilosidasa Talaromyces emersonii GH3 (SEQ ID NO: 15 [secuencia de ADN] y la SEQ ID NO: 16 [secuencia de aminoácidos deducida] ) se preparó recombinantemente en Aspergillus oryzae según se describe en WO 2011/057140. La beta-xilosidasa Talaromyces emersonii GH3 se desalinizó y se sometió a intercambio de solución amortiguadora en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 utilizando un concentrador de flujo tangencial equipado con una membrana de polietersulfona 10 kDa.

La concentración de proteína para cada uno de los monocomponentes descritos anteriormente se determinó utilizando un kit de ensayo de proteínas Microplate BCA™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) en el cual se utilizó albúmina de suero como una proteína estándar. Cada monocomponente , preparado según se describió anteriormente, se combinó para producir una composición enzimática compuesta por 37% de celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus Cel7A, 25% de celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus Cel6A, 15% de polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica Penicillium e ersonii GH61A, 10% de endoglucanasa II Trichoderma reesei GH5, 5% de xilanasa, 5% de beta-glucosidasa Aspergillus fumigatus, y 3% de beta-xilosidasa Talaromyces emersonii. La composición enzimática se designa en la presente como "composición enzimática sin xilanasa" .

Ejemplo 10: Efecto de la xilanasa Penicillium capsulatum GH10 (P244K1) en la hidrólisis de GS-APCC a 50-60°C mediante una composición enzimática.

El efecto de la xilanasa Penicillium capsulatum GH10 (P244 1) en la hidrólisis de GS-APCC con la composición enzimática sin xilanasa (Ejemplo 9) se evaluó a 50°C, 55°C y 60°C. La composición enzimática sin xilanasa se llevó a cabo como un testigo. La composición enzimática con la xilanasa Penicillium capsulatum GH10 se agregó a las reacciones de hidrólisis de GS-APCC a 1.425 mg de proteína total por g de celulosa, mientras la composición enzimática sin xilanasa se agregó a las reacciones de hidrólisis de GS-APCC a 1.5 mg de proteína total por g de celulosa.

El ensayo se realizó tal como se describe en el Ejemplo 8. Las reacciones de 1 mi con GS-APCC (1% de sólidos totales) se llevaron a cabo durante 72 horas en 50 mM de acetato de sodio pH 5.0 que contenía 1 mM de sulfato de manganeso. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado e implicaron una única mezcla al comienzo de la hidrólisis.

Tal como se muestra en la Figura 1, la composición enzimática que incluyó la xilanasa GH10 de Penicillium capsulatum (P244K1) aumentó considerablemente la hidrólisis de la celulosa a glucosa en comparación con la composición enzimática sin xilanasa a 1.425 y 1.5 mg de proteína total por gramo de celulosa (dado que el grado de conversión de celulosa para la xilanasa GH10 de Penicillium capsulatum (P244K1) fue más alto que la composición enzimática sin xilanasa) a 50°C, 55°C y 60°C.

Tal como se muestra en la Figura 2, la composición enzimática que incluyó la xilanasa GH10 de Penicillium capsulatum (P244K1) aumentó considerablemente la hidrólisis de xilo-oligosacárido a xilosa en comparación con la composición enzimática sin xilanasa a 1.425 y 1.5 mg de proteína total por gramo de celulosa (dado que el grado de conversión de xilo-oligosacárido a xilosa para la xilanasa GH10 de Penicillium capsulatum (P244K1) fue más alto que la composición enzimática sin xilanasa) a 50°C, 55°C y 60°C.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes párrafos numerados. [1] Un polipéptido aislado que tiene actividad de xilanasa seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en al menos condiciones de rigurosidad alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la misma o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de xilanasa . [2] El polipéptido del párrafo 1 que tiene al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad secuencial con el péptido maduro de la SEQ ID NO: 2. [3] El polipéptido del párrafo 1 que está codificado por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad alta o muy alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la misma o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) . [4] El polipéptido del párrafo 1 que está codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad secuencial con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma. [5] El polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-4 que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2. [6] El polipéptido del párrafo 5, en donde el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 23 a 400 de la SEQ ID NO : 2. [7] El polipéptido del párrafo 1 que es una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones. [8] El polipéptido del párrafo 1 que es un fragmento de la SEQ ID NO: 2, en donde el fragmento tiene actividad de xilanasa. [9] Un polipéptido aislado que comprende un dominio catalítico seleccionado del grupo que consiste en: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2; (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que se híbrida al menos en condiciones de rigurosidad muy alta con los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; o el complemento de longitud completa de la misma (c) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; (d) una variante de los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO : 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del dominio catalítico de (a), (b) , (c) o (d) que tiene actividad de xilanasa. [10] El polipéptido el párrafo 9 que comprende, además, un dominio de unión a carbohidrato. [11] Un polipéptido aislado que comprende un dominio de unión a carbohidrato ligado operablemente a un dominio catalítico, en donde el dominio de unión se selecciona del grupo que consiste en: (a) un dominio de unión a carbohidrato que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2; (b) un dominio de unión a carbohidrato codificado por un polinucleótido que se híbrida al menos en condiciones de rigurosidad muy alta con los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de longitud completa de la misma; (c) un dominio de unión a carbohidrato codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1; (d) una variante de los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del dominio de unión a carbohidrato de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de unión a carbohidrato. [12] El polipéptido del párrafo 11, en donde el dominio catalítico se obtiene de una hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidoreductasa o transferasa, por ejemplo, una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, glicosiltransferasa ciclodextrina, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o beta-xilosidasa . [13] Una composición que comprende el polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-12. [14] Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-12. [15] Un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende el polinucleótido del párrafo 14 ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedero de expresión . [16] Una célula hospedera recombinante que comprende el polinucleótido del párrafo 14 ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido. [17] Un método de producción del polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-12 que comprende: cultivar una célula, que en su forma natural produce el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido. [18] El método del párrafo 17 que comprende, además, recuperar el polipéptido. [19] Un método de producción de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa que comprende: cultivar la célula hospedera del párrafo 16 en condiciones propicias para la producción del polipéptido. [20] El método del párrafo 19 que comprende, además, recuperar el polipéptido. [21] Una planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-12. [22] Un método de producción de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, que comprende: cultivar la planta o célula vegetal transgénica del párrafo 21 en condiciones propicias para la producción del polipéptido. [23] El método del párrafo 22 que comprende, además, recuperar el polipéptido. [24] Un método de producción de un mutante de una célula original que comprende inactivar un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-12, que resulta en que el mutante produce menos polipéptido que la célula original . [25] Una célula mutante producida mediante el método del párrafo 24. [26] La célula mutante del párrafo 25 que comprende, además, un gen que codifica una proteína nativa o heteróloga. [27] Un método de producción de una proteína que comprende: cultivar el mutante del párrafo 25 o 26 en condiciones propicias para la producción de la proteína. [28] El método del párrafo 27 que comprende, además, recuperar la proteína. [29] Una molécula de AR inhibitoria de doble hebra (ARNdh) que comprende una subsecuencia del polinucleótido del párrafo 14, en donde opcionalmente el ARNdh es un ARNip o una molécula de miARN. [30] La molécula de ARN inhibitoria de doble hebra (ARNdh) del párrafo 29 que tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex de longitud . [31] Un método para inhibir la expresión de un polipéptido que tiene actividad de xilanasa en una célula que comprende administrar a la célula o expresar en la célula la molécula de ARN inhibitoria de doble hebra (ARNdh) del párrafo 29 o 30. [32] Una célula producida mediante el método del párrafo 31. [33] La célula del párrafo 32 que comprende, además, un gen que codifica una proteína nativa o heteróloga. [34] Un método de producción de una proteína que comprende: cultivar la célula del párrafo 32 o 33 en condiciones propicias para la producción de la proteína. [35] El método del párrafo 34 que comprende, además, recuperar la proteína. [36] Un polinucleótido aislado que codifica un péptido señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID NO : 2. [37] Un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un gen que codifica una proteína operativamente ligada al polinucleótido del párrafo 36, en donde el gen es ajeno al polinucleótido que codifica el péptido señal. [38] Una célula hospedera recombinante que comprende un gen que codifica una proteína operativamente ligada al polinucleótido del párrafo 36, en donde el gen es ajeno al polinucleótido que codifica el péptido señal. [39] Un método de producción de una proteína que comprende: cultivar una célula hospedera recombinante que comprende un gen que codifica una proteína operativamente ligada al polinucleótido del párrafo 36, en donde el gen es ajeno al polinucleótido que codifica el péptido señal, en condiciones propicias para la producción de la proteína. [40] El método del párrafo 39 que comprende, además, recuperar la proteína. [41] Un proceso para degradar o convertir un material celulósico o que contiene xilano que comprende: tratar el material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia del polipéptido que tiene actividad de xilanasa de cualquiera de los párrafos 1-12. [42] El proceso del párrafo 41, en donde el material celulósico o que contiene xilano es pretratado. [43] El proceso del párrafo 41 o 42, en donde la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulosa, un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica, una heraicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica , una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina. [44] El proceso del párrafo 43, en donde la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa . [45] El proceso del párrafo 43, en donde la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una xilanasa, una acetilxilan esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa y una glucuronidasa . [46] El proceso de cualquiera de los párrafos 41-45 que comprende, además, recuperar el material celulósico o que contiene xilano degradado. [47] El proceso del párrafo 46, en donde el material celulósico o que contiene xilano degradado es una azúcar. [48] El proceso del párrafo 47, en donde el azúcar es seleccionada del grupo que consiste en glucosa, xilosa, mañosa, galactosa y arabinosa. [49] Un proceso de producción de un producto de fermentación que comprende: (a) sacarificar un material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia de un polipéptido que contiene actividad de xilanasa de cualquiera de los párrafos 1-12; (b) fermentar el material celulósico o que contiene xilano sacarificado con uno o más microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación de la fermentación. [50] El proceso del párrafo 49, en donde el material celulósico o que contiene xilano es pretratado. [51] El proceso del párrafo 49 o 50, en donde la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulosa, un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina. [52] El proceso del párrafo 51, en donde la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa . [53] El proceso del párrafo 51, en donde la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una xilanasa, una acetilxilan esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa y una glucuronidasa . [54] El proceso de cualquiera de los párrafos 49-53, en donde las etapas (a) y (b) se realizan en simultáneo en una sacarificación y fermentación simultáneas. [55] El proceso de cualquiera de los párrafos 49-54, en donde el producto de fermentación es un alcohol, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, un aminoácido, un gas, isopreno, una cetona, un ácido orgánico o policétido. [56] Un proceso de fermentación de un material celulósico o que contiene xilano que comprende: fffermentar el material celulósico o que contiene xilano con uno o más microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico o que contiene xilano es sacarificado con una composición enzimática en presencia del polipéptido que tiene actividad de xilanasa de cualquiera de los párrafos 1-12. [57] El proceso del párrafo 56, en donde la fermentación del material celulósico o que contiene xilano produce un producto de fermentación. [58] El proceso del párrafo 57 que comprende, además, recuperar el producto de fermentación a partir de la fermentación . [59] El proceso del párrafo 57 o 58, en donde el producto de fermentación es un alcohol, un alcano, un cicloalcano, un alqueno, un aminoácido, un gas, isopreno, una cetona, un ácido orgánico o policétido. [60] El proceso de cualquiera de los párrafos 56-59, en donde el material celulósico o que contiene xilano es pretratado antes de la sacarificación. [61] El proceso de cualquiera de los párrafos 56-60, en donde la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulosa, un polipéptido que tiene actividad potenciadora celulolítica, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina. [62] El proceso del párrafo 61, en donde la celulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una beta-glucosidasa . [63] El proceso del párrafo 61, en donde la hemicelulasa es una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una xilanasa, una acetilxilan esterasa, una feruloil esterasa, una arabinofuranosidasa, una xilosidasa y una glucuronidasa . [64] Una formulación de caldo entero o composición de cultivo celular que comprende el polipéptido de cualquiera de los párrafos 1-12.

La invención descrita y reivindicada en la presente no debe estar limitada en cuanto a su alcance por los aspectos específicos que se describen en la presente, ya que se pretende que estos aspectos sean ilustraciones de varios aspectos de la invención. Se pretende que cualesquiera aspectos equivalentes queden incluidos en el alcance de esta invención. En efecto, varias modificaciones de la invención, además de las que se muestran y describen en la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. También se pretende que tales modificaciones queden incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas. En caso de conflicto, regirá la presente descrpición, incluidas las definiciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un polipéptido aislado caracterizado porque tiene actividad de xilanasa seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 ; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se híbrida en al menos condiciones de rigurosidad alta con (i) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1, (ii) la secuencia de ADNc de la misma o (iii) el complemento de longitud completa de (i) o (ii) ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; (d) una variante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de xilanasa.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o consiste en la SEQ ID NO: 2 o el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

3. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende un dominio catalítico seleccionado a partir del grupo constituido por: (a) un dominio catalítico que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2; (b) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que se híbrida en al menos condiciones de rigurosidad muy alta con los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de ADNc de la misma; o el complemento de longitud completa de la misma; (c) un dominio catalítico codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los nucleótidos 67 a 1261 de la SEQ ID NO: l o la secuencia de ADNc de la misma; (d) una variante de los aminoácidos 23 a 342 de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del dominio catalítico de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de xilanasa.

4. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende un dominio de unión a carbohidrato ligado operablemente a un dominio catalítico, en donde el dominio de unión se selecciona del grupo que consiste en: (a) un dominio de unión a carbohidrato que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 ; (b) un dominio de unión a carbohidrato codificado por un polinucleótido que se híbrida al menos en condiciones de rigurosidad alta con los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1 o el complemento de longitud completa de la misma; (c) un dominio de unión a carbohidrato codificado por un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad secuencial con respecto a los nucleótidos 1331 a 1435 de la SEQ ID NO: 1; (d) una variante de los aminoácidos 366 a 400 de la SEQ ID NO: 2 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más posiciones; y (e) un fragmento del dominio de unión a carbohidrato de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de unión a carbohidrato.

5. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Un método de producción del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende : (a) cultivar una célula, que en su forma natural produce el polipéptido, en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido.

7. Un método de producción de un polipéptido caracterizado porque tiene actividad de xilanasa que comprende : (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende el polinucleótido de la reivindicación 5 ligado operablemente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido.

8. Una planta, parte de una planta o célula vegetal transgénica transformada con un polinucleótido caracterizada porque codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. Un método de producción de un polipéptido caracterizado porque tiene actividad de xilanasa que comprende : (a) cultivar la planta o célula vegetal transgénica de la reivindicación 8 en condiciones propicias para la producción del polipéptido; y opcionalmente (b) recuperar el polipéptido.

10. Un método de producción de un mutante de una célula original caracterizado porque comprende la inactivación de un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que resulta en que el mutante produzca menos polipéptido que la célula original.

11. Un polinucleótido aislado que codifica un péptido señal caracterizado porque comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 22 de la SEQ ID NO : 2.

12. Un método de producción de una proteína caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula hospedera recombinante que comprende un gen que codifica una proteína operativamente ligada al polinucleótido de la reivindicación 11, en donde el gen es ajeno al polinucleótido que codifica el péptido señal, en condiciones propicias para la producción de la proteína; y opcionalmente (b) recuperar la proteína.

13. Un proceso para degradar o convertir un material celulósico o que contiene xilano caracterizado porque comprende tratar el material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia del polipéptido que tiene actividad de xilanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

14. Un proceso para producir un producto de fermentación caracterizado porque comprende: (a) sacarificar un material celulósico o que contiene xilano con una composición enzimática en presencia del polipéptido que tiene actividad de xilanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4; (b) fermentar el material celulósico o que contiene xilano sacarificado con uno o más microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación; y (c) recuperar el producto de fermentación a partir de la fermentación.

15. Un proceso de fermentación de un material celulósico o que contiene xilano caracterizado porque comprende fermentar el material celulósico o que contiene xilano con uno o más microorganismos de fermentación, en donde el material celulósico o que contiene xilano es sacarificado con una composición enzimática en presencia del polipéptido que tiene actividad de xilanasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

16. Una formulación de caldo entero o composición de cultivo celular caracterizada porque comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.