MX2014006446A

MX2014006446A - Cepas de levadura manipuladas para producir etanol a partir de acido acetico y glicerol.

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Publication number: MX2014006446A
Application number: MX2014006446A
Authority: MX
Inventors: Paul Klaassen; Johannes Adrianus Maria De Bont; Aloysius Wilhelmus Rudolphus Hubertus Teunissen; Wouter Willem Antonius Hartman; Shimaira Van Beusekom
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-26
Publication date: 2014-09-01
Also published as: US20150176032A1; AU2012346662A1; EA201491056A8; BR112014012963A2; CN104126011A; EP2785849A2; PL2785849T3; CN107189954A; MY169074A; US20180251798A1; WO2013081456A2; CA2857247C; BR112014012963B8; US9988649B2; CA2857247A1; ES2648865T3; DK2785849T3; CN104126011B; JP2015504309A; EP3321368A3

Abstract

Procesos para producir etanol a partir de hidrolizados lignocelulósicos que comprenden hexosas, pentosas y ácido acético, en el cual se usan células de levadura modificadas genéticamente que comprenden un gen exógeno que codifica una acetaldehído deshidrogenasa y un gen bacteriano que codifica una enzima con actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+. El proceso se caracteriza además porque el glicerol está presente o es alimentado al medio de cultivo, con lo cual la célula de levadura modificada fermenta las hexosas, las pentosas, el ácido acético y el glicerol en etanol. La invención se relaciona además con células de levadura que se usan en dichos procesos. Las células de levadura comprenden ventajosamente modificaciones genéticas que mejoran la utilización de glicerol, tales como modificaciones que aumentan una o más entre actividad dihidroxiacetona quinasa y el transporte de glicerol dentro de la célula. Preferiblemente la célula de levadura comprende además un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional y/o genes exógenos funcionales que le confieren a la célula la capacidad para convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato y pueden comprender una modificación genética que aumenta la actividad acetil-CoA sintetasa.

Description

CEPAS DE LEVADURA MANIPULADAS PARA PRODUCIR ETANOL A PARTIR DE ÁCIDO ACÉTICO Y GLICEROL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la manipulación mediante ingeniería genética del metabolismo o ingeniería metabólica en microorganismos tales como levaduras. En particular, la invención se relaciona con cepas de levadura que fueron manipuladas para producir etanol a partir de ácido acético y glicerol. Además de ácido acético y glicerol, la cepa de levadura también puede consumir hexosas y pentosas para la producción de etanol. La invención se relaciona además con procesos en donde las cepas manipuladas de la invención producen etanol a partir de ácido acético y glicerol .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El bioetanol de segunda generación es producido, por ejemplo, a partir de las fracciones lignocelulósicas de una biomasa vegetal que se hidroliza en azúcares monoméricos libres, tales como hexosas y pentosas, para su fermentación en etanol. Los hidrolizados lignocelulósicos contienen grandes cantidades de ácido acético, que es un potente inhibidor de la capacidad fermentativa de. los microorganismos usados para la producción de etanol, tales como levaduras.

En Sonderegger et al., (2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 2892-2897) se divulga la expresión heteróloga de fosfotransacetilasa y acetaldehido deshidrogenasa en la cepa fermentadora de xilosa, Saccharomyces cerevisiae. En combinación con la fosfocetolasa nativa, Sonderegger et al., crearon una via de fosfocetolasa funcional con capacidad de una reoxidación neta del NADH generada por la expresión heteróloga de una xilosa reductasa y una xilitol deshidrogenasa que la cepa emplea en la utilización de xilosa.

En Guadalupe et al., (2009, Appl. Environ. Microbiol. doi: 10.1128/AEM.01772-09) se divulga una cepa de Saccharomyces cerevisiae en la cual se elimina la producción del producto secundario glicerol por interrupción de los genes de glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependientes de NAD endógenos (GPD1 y GPD2) . La expresión del gen mhpF de E. coli, que codifica la acetaldehido deshidrogenasa dependiente de NAD acetilante, restableció la capacidad de la cepa de GPD interrumpido para crecer anaeróbicamente por adición de suplementos de ácido acético en el medio.

En Yu et al., (2010, Bioresour. Technol. 101(11): 4157-61. Epub 9 de febrero, 2010) se divulgan cepas de Saccharomyces cerevisiae manipuladas metabólicamente para una producción mejorada de etanol a partir de glicerol por sobreexpresión simultánea de glicerol deshidrogenasa (GCY) , dihidroxiacetona quinasa (DAK) y la proteina de captación de glicerol (GUP1) .

En Lee y Dasilva (2006, Metab Eng. 8(1): 58-65) se divulga la levadura Saccharomyces cerevisiae manipulada para producir 1, 2-propandiol a partir de glicerol, entre otros por introducción de expresión de los genes mgs y gldA de Escherichia coli.

Un objeto de la presente invención comprende proveer levaduras capaces de producir etanol a partir de ácido acético y glicerol (y hexosas y pentosas) , asi como procesos en donde se utilizan estas cepas en la producción de etanol y/u otros productos de fermentación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Se muestra la evolución de los niveles de glicerol neto (g/1) (es decir, producción menos consumo) en el tiempo (horas) para las cepas RN1041, RN1041+pRN595 , RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189 de S. cerevisiae.

Figura 2. Se muestra la evolución de los niveles de ácido acético neto (g/1) (es decir, producción menos consumo) en el tiempo (horas) para las cepas RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189 de S. cerevisiae.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones La identidad de secuencia se define en la presente como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteina) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótido) , determinada por comparación de las secuencias. En el arte, la "identidad" también hace referencia al grado de relación de secuencias entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según sea el caso, determinado por la coincidencia de las cadenas de dichas secuencias. La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina por comparación de la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente utilizando mediante métodos conocidos. Los términos "identidad de secuencia" o "similitud de secuencia" significa que dos secuencias de (poli) péptidos o dos secuencias de nucleótidos, cuando se alinean de manera óptima, preferentemente sobre la longitud completa (de al menos la secuencia más corta en la comparación) y se maximiza la cantidad de coincidencias y se minimiza la cantidad de huecos, tal como con los programas Clustal (1.83), GAP o BESTFIT usando los parámetros predeterminados, comparten al menos un porcentaje determinado de identidad de secuencia definida en otra parte en la presente. El programa GAP emplea el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizar la cantidad de coincidencias y minimizar la cantidad de huecos. En general, se usan los parámetros predeterminados de GAP, con una restricción para la creación de huecos = 50 (nucleótidos) / 8 (proteínas) y una restricción para la extensión de huecos = 3 (nucleótidos) / 2 (proteínas) . Para nucleótidos, la matriz de puntaje predeterminada que se utiliza es nwsgapdna y para proteínas, la matriz de puntaje predeterminada que se utiliza es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919) . Un programa de alineación múltiple preferido para alienar las secuencias de proteínas de la invención es Clustal (1.83) usando una matriz Blosum y los ajustes predeterminados (penalidad por apertura de hueco: 10; penalidad por extensión de hueco: 0,05). Está claro que cuando se dice que dos secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un grado de identidad de secuencia determinado con secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Las alineaciones de secuencia y las calificaciones para el porcentaje de identidad de secuencia se pueden determinar usando programas para computadora, tal como el paquete GCG Wisconsin, Versión 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, EE.UU., o el software abierto Emboss para Windows (versión actual 2.7.1-07). Como alternativa, se puede determinar el porcentaje de similitud o identidad efectuando búsquedas contra bases de datos tales como FASTA, BLAST, etc.

Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para obtener la mayor coincidencia posible entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas para computadora disponibles al público. Los métodos con programas para computadora preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, el paquete de programas GCG (Devereux, J. , et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El programa BLASTX se encuentra disponible al público por NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD. 20894; Altschul S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). También es posible usar el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992) ; Penalidad de falta de coincidencia o hueco: 12; y Penalidad por longitud de hueco: 4. Un programa que es de utilidad con estos parámetros se encuentra disponible al público como el programa "Ogap" del Genetics Computer Group, Madison, I. Los parámetros mencionados son los parámetros predeterminados para comparaciones de aminoácidos (sin penalidades para las faltas de coincidencia terminales) .

Los parámetros preferido para la comparación de ácidos nucleicos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); Matriz de comparación: coincidencias = +10, coincidencias erróneas = 0; Penalidad de falta de coincidencia o hueco: 50; Penalidad por longitud de hueco: 3. Se encuentra disponible como el programa Gap del Genetics Computer Group, Madison, is. Estos fueron los parámetros predeterminados para comparaciones de ácidos nucleicos .

Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, el especialista también puede considerar las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservadoras", como resultará evidente para el especialista. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas comprende glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; el grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo comprende serina y treonina; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida comprende asparagina y glutamina; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas comprende fenilalanina, tirosina y triptofano; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas comprende lisina, arginina e histidina; y el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre comprende cisteina y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadora preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina . Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos divulgada en la presente son aquellas en las cuales se ha eliminado al menos un residuo en las secuencias divulgadas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferentemente, el cambio de aminoácido es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos naturales son: Ala por ser; Arg por lys; Asn por gln o His; Asp por glu; Cys por ser o ala; Gln por asn; Glu por asp; Gly por pro; His por asn o gln; lie por leu o val; Leu por ile o val; Lys por arg; Gln por glu o asn; Met por leu o ile; Phe por met, leu o tyr; Ser por thr; Thr por ser; Trp por tyr; Tyr por trp o phe; y Val por ile o leu.

Las secuencias de nucleótidos de la invención también se pueden definir por su capacidad para hibridizarse con partes de las secuencias de nucleótidos especificas divulgadas en la presente, respectivamente, bajo condiciones de hibridación moderadas, o preferentemente bajo condiciones de hibridación severas. Las condiciones de hibridación severas se definen en la presente como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 25 aproximadamente, preferentemente 50 nucleótidos aproximadamente, 75 ó 100 y con mayor preferencia de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibridice a una temperatura de aproximadamente 65 °C en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferentemente SSC 6x o cualquier otra solución con una fuerza iónica comparable, y lavado a 65 °C en una solución que comprende aproximadamente 0,1 M de sal, o menos, preferentemente SSC 0,2 x o cualquier otra solución con una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas y preferentemente el lavado se efectúa por al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones habitualmente permitirán una hibridación especifica de secuencias que tienen aproximadamente un 90% o más de identidad de secuencia.

Las condiciones moderadas se definen en la presente como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibridice a una temperatura de aproximadamente 45 'C en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferentemente SSC 6x o cualquier otra solución con una fuerza iónica comparable, y lavado a temperatura ambiente en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferentemente SSC 6x o cualquier otra solución con una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se lleva a cabo durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas y preferentemente el lavado se efectúa por al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones habitualmente permitirán una hibridación especifica de secuencias que tienen hasta un 50% de identidad de secuencia. El especialista en el arte podrá modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar específicamente secuencias con una identidad que varía entre 50% y 90%.

Una "construcción de ácido nucleico" o un "vector de ácido nucleico" significa en la presente una molécula de ácido nucleico elaborada por el hombre utilizando la tecnología de ADN recombinante . Por ese motivo, el término "construcción de ácido nucleico" no incluye moléculas de ácido nucleico naturales aunque una construcción de ácido nucleico puede comprender (partes de) moléculas de ácido nucleico naturales. Los términos "vector de expresión" o "construcción de expresión" se refieren a secuencias de nucleótidos capaces de afectar la expresión de un gen en células huésped o en organismos huésped que sean compatibles con dichas secuencias. Estos vectores de expresión incluyen típicamente al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción 3' . También se pueden usar otros factores necesarios o beneficiosos para la expresión, tales como elementos potenciadores . El vector de expresión se introducirá en una célula huésped adecuada y podrá lograr la expresión de la secuencia de codificación en un cultivo celular in vitro de la célula huésped. El vector de expresión será adecuado para la replicación en la célula o el organismo huésped de la invención.

Según se usa en la presente, el término "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refiere a un fragmento de ácido nucleico cuya función es controlar la transcripción de una o más secuencias de codificación, y se ubica 5' con respecto a la dirección de transcripción desde el sitio de inicio de la transcripción de la secuencia de codificación, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, pero en un sentido no limitativo, sitios de unión de factores de transcripción, sitios de unión de proteínas represoras y activadores, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un especialista en el arte para que actúe directa o indirectamente en la regulación de la cantidad de transcripción a partir del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de los tejidos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y del desarrollo. Un promotor "índucible" es un promotor regulado fisiológicamente o por el desarrollo, por ejemplo por la aplicación de un inductor químico.

El término "marcador de selección" es un término familiar para un especialista en el arte y se usa en la presente para describir cualquier entidad genética que, cuando se expresa, se puede usar para seleccionar una o más células que contienen al marcador de selección. El término "informante" se puede usar indistintamente con el término marcador, aunque se usa principalmente para hacer referencia a marcadores visibles, tal como la proteina fluorescente verde (GFP) . Los marcadores de selección pueden ser dominantes o recesivos o bidireccionales .

Según se usa en la presente, el término "ligado operativamente" se refiere al ligamiento de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando se encuentra en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está ligada operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia de codificación. El término ligado operativamente significa que las secuencias de ADN ligadas típicamente son contiguas y, cuando fuera necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas contiguas, se encuentran en el mismo marco de lectura.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente y hacen referencia a moléculas que consisten en una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción, un tamaño, una estructura tridimensional o un origen específico .

Los "hongos" (en singular hongo) se refieren en la presente a un microorganismo eucariota heterotrófico que digiere su alimento externamente, absorbiendo moléculas de nutrientes en sus células. Los hongos pertenecen a un reino separado de organismos eucariotas e incluyen levaduras, mohos y champiñones. Los términos hongos, hongo y fúngicos, según se usan en la presente, incluyen entonces expresamente a las levaduras asi como a los hongos filamentosos.

El término "gen" se refiere a cualquier fragmento de ADN que comprende una región (la "región transcripta") que se transcribirá en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, ligado operativamente a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Entonces, habitualmente un gen puede comprender varios fragmentos ligados operativamente, tal como un promotor, una secuencia directriz 5', una región de codificación y una secuencia no traducida 3', que comprenden un sitio de poliadenilación . La "expresión de un gen" se refiere al proceso en donde una región de ADN que está ligada operativamente a regiones reguladoras apropiadas, en particular un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir que tiene la capacidad de poder traducirse en una proteina o péptido biológicamente activo.

El término "homólogo" cuando se usa para indicar la relación entre una molécula dada ( recombinante) de ácido nucleico o polipéptido y un organismo huésped o una célula huésped, significa que en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido es producida por una célula huésped u organismos de la misma especie, preferentemente de la misma variedad o cepa. Si es homologa de una célula huésped, la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido típicamente (pero no necesariamente) ligado operativamente a otra secuencia promotora (heteróloga) y, si corresponde, otra secuencia señal secretora (heteróloga) y/o secuencia de terminación que en su ambiente natural. Se comprenderá que las secuencias reguladoras, las secuencias señal, las secuencias de terminación, etc. también pueden ser homologas de la célula huésped. En este contexto, el uso de elementos de secuencia "homólogos" solamente permite la construcción de organismos modificados genéticamente (GMO) "autoclonados" (la autoclonación se define en la presente como en los Lineamientos Europeos 98/81/EC Anexo II) . Cuando se usa para indicar la relación de dos secuencias de ácidos nucleicos, el término "homólogo" significa que una secuencia de ácido nucleico de cadena simple se puede hibridizar con una secuencia de ácido nucleico de cadena simple complementaria. El grado de hibridación puede depender de una cantidad de factores incluyendo la cantidad de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridación, tales como temperatura y concentración de sales, como se describirá más adelante .

Los términos "heterólogo" y "exógeno", cuando se usan con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o una proteína se refiere a un ácido nucleico o una proteína que no forma parte naturalmente del organismo, la célula, el genoma o secuencia de ADN o ARN en donde está presente, o que se encuentra en una célula o una ubicación o ubicaciones en el genoma o una secuencia de ADN o ARN que difiere de la que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos y exógenos no son endógenos de la célula en la cual se introducen, sino que se han obtenido de otra célula o se han producido mediante síntesis o de forma recombinante . En general, aunque no necesariamente, dichos ácido nucleicos codifican proteínas, es decir proteínas exógenas, que no son producidas normalmente por la célula en la cual se transcribe o expresa el ADN. De manera similar, el ARN exógeno codifica proteínas que normalmente no se expresan en la célula en la cual está presente el ARN exógeno. Los ácidos nucleicos y las proteínas heterólogos/exógenos también se conocen como ácidos nucleicos o proteínas extraños. Cualquier ácido nucleico o proteína que un especialista en el arte reconocería como extraños para la célula en la cual se expresa, está comprendido en la presente por el término ácido nucleico o proteína heterólogo o exógeno. Los términos heterólogo y exógeno también se aplican a combinaciones no naturales de secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, es decir, combinaciones donde al menos dos de las secuencias combinadas son extrañas entre sí.

La "actividad específica" de una enzima se interpreta en la presente como la cantidad de actividad de una enzima particular por cantidad de proteínas totales de la célula huésped, habitualmente expresada en unidades de actividad enzimática por mg de proteínas totales de la célula huésped. En el contexto de la presente invención, se puede incrementar o disminuir la actividad específica de una enzima particular en comparación con la actividad específica de dicha enzima en una célula huésped de tipo salvaje (por lo demás idéntica) .

El término "condiciones anaeróbicas" o un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como condiciones o un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxígeno o en donde sustancialmente no se consume oxígeno, o preferentemente se consume menos de 5, 2,5 o 1 mmol/l/h, más preferentemente 0 mmol/l/h (o sea el consumo de oxígeno no es detectable) , y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones .

Descripción de la invención La expresión de una acetaldehido deshidrogenasa exógena en levadura permite que la levadura convierta el ácido acético, que puede estar presente en grandes cantidades en los hidrolizados lignocelulósicos , en etanol . Se ha propuesto la reducción dependiente de NADH del ácido acético en etanol como un reemplazo de formación de glicerol como un depósito rédox en cultivos que crecen en glucosa anaeróbicos de S. cerevisiae, proporcionando asi una base estequiométrica para eliminar la producción de glicerol (como producto secundario) durante la producción industrial de etanol y en consecuencia lograr un mayor rendimiento de etanol (Guadalupe et al., supra) . Sin embargo, la estequiometria de estas reacciones es tal que la reducción de una molécula de ácido acético en etanol requerirá que no se formen dos moléculas de glicerol. Los inventores de la presente han encontrado, no obstante, que en la práctica la cantidad de ácido acético que típicamente está presente en los hidrolizados lignocelulósicos industriales es tal que la cantidad de NADH necesaria para reducirlo en etanol excede la cantidad de NADH que se volvería disponible al impedir la producción de glicerol en levaduras cultivadas bajo condiciones anaeróbicas. Sorprendentemente, ahora los inventores de la presente han encontrado que se pueden reducir cantidades mucho mayores de ácido acético en etanol por consumo simultáneo de glicerol por la levadura, en lugar de impedir su producción.

Se generan grandes cantidades de glicerol como un producto secundario en la producción de biodiesel a partir de reacciones de transesterificación usando aceites vegetales o grasas animales y un alcohol. Por ello se prevé que la disponibilidad de glicerol crudo aumentará durante los próximos años como resultado del crecimiento en la producción de biodiesel en todo el mundo. En consecuencia, se podrá disponer de grandes cantidades de glicerol a un costo bajo. La presente invención provee medios y métodos para valorizar el glicerol obtenido, por ejemplo, como un producto secundario de la producción de biodiesel, por conversión del mismo en etanol que se puede usar como biocombustible . Al mismo tiempo la presente invención está dirigida al problema de grandes cantidades de ácido acético presentes en los hidrolizados lignocelulósicos y que inhiben la capacidad fermentativa de las levaduras productoras de etanol a partir de estos hidrolizados. Una ventaja adicional de la presente invención es que al dejar la vía de respuesta a glicerol de gran osmolaridad intacta en las células de levadura de la invención (a diferencia de las cepas en donde (todos) los genes de glicerol fosfato deshidrogenasa son inactivados como se describe en Guadalupe et al., supra) , se obtienen cepas de levadura más robustas con una mejor capacidad para manejar el estrés osmótico que puede aparecer bajo las condiciones de fermentación industrial.

En un primer aspecto, la invención se relaciona con una célula huésped fúngica que comprende un gen exógeno que codifica una enzima con capacidad para reducir acetil-CoA en acetaldehido, donde dicho gen le confiere a la célula la capacidad para convertir ácido acético en etanol. Una enzima con capacidad para reducir acetil-CoA en acetaldehido se interpreta en la presente como una enzima que cataliza la siguiente reacción (ACDH; EC 1.2.1.10): acetaldehido + NAD+ + Coenzima A «? acetil-Coenzima A + NADH + H+.

Por consiguiente, la enzima cataliza la conversión de acetil-CoA en acetaldehido (y viceversa) y también se conoce como una acetaldehido deshidrogenase o una acetil-CoA reductasa (dependiente de NAD acetilante) . La enzima puede ser una enzima bifuncional que además cataliza la conversión de acetaldehido en etanol (y viceversa; véase más adelante) . Por conveniencia, una enzima que tiene la capacidad para reducir al menos acetil-CoA en acetaldehido o en etanol se denominará "acetaldehido deshidrogenasa" en la presente. Se considera además en la presente que la célula huésped fúngica tiene actividades endógenas de acetil-CoA sintetasa y alcohol deshidrogenasa que le permiten a la célula, provista de actividad acetaldehido deshidrogenasa, completar la conversión de ácido acético en etanol.

El gen exógeno puede codificar una enzima monofuncional que solamente tiene actividad acetaldehido deshidrogenasa (es decir, una enzima que solamente tiene la capacidad para reducir la acetil-CoA en acetaldehido) tal como, por ejemplo, la acetaldehido deshidrogenasa codificada por el gen mhpF de E. coli. Un gen exógeno adecuado que codifica una enzima con actividad acetaldehido deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N°: 1. Los ejemplos adecuados de procariotas que comprenden enzimas monofuncionales con actividad acetaldehido deshidrogenasa se proveen en la Tabla 1. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas monofuncionales se encuentran disponibles en bases de datos públicas y el especialista puede utilizarlas- para diseñar secuencias de nucleótidos de codones optimizados que codifican la correspondiente enzima monofuncional (véase, por ejemplo, la SEQ ID N°: 2).

Tabla 1: Enzimas con actividad acetaldehido deshidrogenasa relacionadas con el mhpF de E. coli Organismo Identidad de aminoácidos (%) Escherichia coli cepa K12 subcepa MG1655 100% Shigella sonnei 100% Escherichia coli IAI39 99% Citrobacter youngae ATCC 29220 93% Citrobacter sp. 30_2 92% Klebsiella pneumoniae 342) 87% Klebsiella variicola 87% Pseudomonas putida 81% Ralstonia eutropha JMP134 82% Burkholderia sp. H160 81% Azotobacter vinelandii DJ 79% Ralstonia metallidurans CH34 70% Xanthobacter autotrophicus Py2 67% Burkholderia cenocepacia J2315 68% Frankia sp. EANlpec 67% Polaromonas sp. JS666 68% Burkholderia phytofirmans PsJN 70% Rhodococcus opacus B4 64% Preferiblemente, la célula huésped comprende un gen exógeno que codifica una enzima bifuncional con actividad acetalcehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, donde dicho gen le confiere a la célula la capacidad para convertir ácido acético en etanol. La ventaja de usar una enzima bifuncional con actividades acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa en oposición a enzimas separadas para cada una de las actividades acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, es que permite una canalización directa del intermediario entre enzimas que catalizan reacciones consecutivas en una vía lo cual ofrece la posibilidad de un medio eficiente, exclusivo y protegido de distribución de metabolitos. La canalización de sustratos disminuye entonces el tiempo de tránsito de los intermediarios, previene la pérdida de intermediarios por difusión, protege a los intermediarios lábiles del solvente y también impide la entrada de intermediarios en las vías metabólicas competitivas. La enzima bifuncional permite entonces una conversión más eficiente de ácido acético en etanol en comparación con las enzimas separadas acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa. Una ventaja adicional del uso de la enzima bifuncional es que también se puede usar en células huésped que tienen poca o ninguna actividad alcohol deshidrogenasa bajo la condición usada, tal como por ejemplo condiciones anaeróbicas y/o condiciones de represión de catabolitos.

Las enzimas bifuncionales con actividad acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa son conocidas en el arte en procariotas y protozoarios, incluyendo por ejemplo las enzimas bifuncionales codificadas por los genes adhE de Escherichia coli y ADH2 de Entamoeba histolytica (véase por ejemplo Bruchaus y Tannich, 1994, J. Biochem. 303: 743-748/ Burdette y Zeikus, 1994, J. Biochem. 302: 163-170; Koo et al., 2005, Biotechnol. Lett. 27: 505-510; Yong et al., 1996, Proc Nati Acad Sci USA, 93: 6464-6469) . Las enzimas bifuncionales con actividad acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa son proteínas más grandes que consisten de alrededor de 900 aminoácidos y son bifuncionales por cuanto exhiben tanto actividad acetaldehido deshidrogenasa (ACDH; EC 1.2.1.10) como1 actividad alcohol deshidrogenasa (ADH; EC 1.1.1.1). Los genes adhE de E. coli y ADH2 de Entamoeba histolytica presentan un 45% de identidad de aminoácidos. Por ello, en una forma de realización de la invención, un gen exógeno adecuado que codifica una enzima bifuncional con actividad acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID N°: 3 y 5. Los ejemplos adecuados de procariotas que comprenden enzimas bifuncionales con actividad acetaldehido deshidrogenasa y actividad alcohol deshidrogenasa se indican en las Tablas 2 y 3. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas bifuncionales se encuentran disponibles en bases de datos públicas y el especialista puede utilizarlas para diseñar secuencias de nucleótidos de codones optimizados que codifican la correspondiente enzima bifuncional (véase, por ejemplo, la SEQ ID N°: 4 ó 6) .

Tabla 2: Enzimas bifuncionales con actividad acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa relacionadas con el gen adhE de E. coli Organismo Identidad de aminoácidos (%) Escherichia coli 0157 :H7 cepa Sakai 100% Shigella sonnei 100% Shigella dysenteriae 1012 99% Klebsiella pneumoniae 342 97% Enterobacter sp. 638 94% Yersinia pestis biovar Microtus cepa 91001 90% Serratia proteamaculans 568 90% Pectobacterium carotovorum WPP14 90% Sodalis glossinidius cepa 'morsitans' 87% Erwinia tasmaniensis Etl/99 86% Aeromonas hidrophila ATCC 7966 81% Vibrio vulnificus YJ016] 76% Tabla 3: Enzimas bifuncionales con actividad acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa relacionadas con el gen ADH2 de Entamoeba histolytica Organismo Identidad de aminoácidos (%) Entamoeba histolytica HM-l : IMSS 99% Entamoeba dispar SAW760 98% Mollicutes bacterium D765% Fusobacterium mortiferum ATCC 981764% Actinobacillus succinogenes 130Z 63% Pasteurella multocida Pm70 62% Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 61% Streptococcus sp. 2_1_36FAA] 61% El gen exógeno que codifica la enzima bifuncional que tiene actividades acetaldehido deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa, de una enzima que tiene actividad acetaldehido deshidrogenasa, preferiblemente es una construcción de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima ligada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la expresión de la enzima con la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención. Por consiguiente, el gen o la construcción de expresión comprenderá al menos un promotor que es funcional en la célula huésped ligado operativamente a la secuencia de codificación. El gen o la construcción puede comprender además una secuencia directriz 5' ubicada 5' con respecto a la región de codificación y una secuencia no traducida 3' (extremo 3' ) que comprende un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción ubicada 3' con respecto a la secuencia de codificación.

En un aspecto, la invención se relaciona con métodos para preparar o construir las células de levadura de la invención. Para tal fin, se usan técnicas estándar de genética y de biología molecular que son conocidas en general en el arte y que se han descrito, por ejemplo, en Sambrook y Russell (2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" (3a edición) , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., (1987, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing y Wiley Interscience, Nueva York) . Aún más, la construcción de las cepas de levadura huésped mutadas se lleva a cabo mediante cruzamientos genéticos, esporulación de los diploides resultantes, disección de las tetradas de las esporas haploides que contienen a los marcadores auxotróficos deseados, y purificación de la colonia de dichas levaduras huésped haploides en un medio de selección apropiado. Todos estos métodos son métodos estándar de genética de levaduras conocidos en el arte. Véase, por ejemplo, Sherman et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1978) y Guthrie et al., (Eds.), Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology, Volumen 194, Academic Press, San Diego (1991) .

Los promotores adecuados para la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad acetaldehido deshidrogenasa y opcionalmente alcohol deshidrogenasa (asi como otras enzimas de la invención; véase más adelante) incluyen promotores que preferentemente no son sensibles a una represión por catabolitos (glucosa) , que son activos bajo condiciones anaeróbicas y/o que preferentemente no requieren de xilosa o arabinosa para la inducción. Los promotores que poseen estas características se encuentran ampliamente disponibles y son conocidas por el especialista. Los ejemplos adecuados de tales promotores incluyen, por ejemplo, promotores de genes glucolíticos , tales como el promotor de la fosfofructoquinasa (PPK) , de la triosa fosfato isomerasa (TPI) , de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GDP, TDH3 o GAPDH) , de la piruvato quinasa (PYK), de la fosfoglicerato quinasa (PGK), de la glucosa-e-fosfato isomerasa (PGI1) , promotores de levaduras. Se pueden consultar detalles adicionales acerca de tales promotores de levadura en (WO 93/03159) . Otros promotores de utilidad son los promotores de genes que codifican proteínas ribosómicas (TEF1) , el promotor del gen de lactasa (LAC4), los promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4 y semejantes) , el promotor de enolasa (ENO) y el promotor del transportador de hexosa (glucosa) (HXT7). Como alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que tiene actividad acetaldehido deshidrogenasa y opcionalmente actividad alcohol deshidrogenasa es sobreexpresada bajo condiciones anaerobicas mediante el uso de un promotor anóxico tal como, por ejemplo, el promotor ANBl de S. cerevisiae (SEQ ID N°: 19). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias activadoras 5' serán conocidos por los especialistas en el arte. Preferentemente, el promotor que está ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos definida previamente es homólogo de la célula huésped. Las secuencias de terminadores adecuadas se pueden obtener, por ejemplo, del gen de citocromo el (CYC1) o un gen de alcohol deshidrogenasa (por ejemplo, ADH1) .

Para aumentar la probabilidad que la enzima que tiene actividad acetaldehido deshidrogenasa y opcionalmente actividad alcohol deshidrogenasa se exprese a niveles suficientes y en una forma activa en las células huésped transformadas de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica estas enzimas, asi como otras enzimas de la invención (véase más adelante) , son adaptadas preferiblemente para optimizar su utilización de codones a la de la célula huésped en cuestión. La capacidad de adaptación de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima a la utilización de codones de una célula huésped se puede expresar como el índice de adaptación de codones (CAI). El índice de adaptación de codones se define en la presente como una medida de la capacidad de adaptación relativa de la utilización de codones de un gen hacia la utilización de codones de genes de gran expresión en una célula u organismo huésped particular. La capacidad de adaptación relativa (w) de cada codón es la relación de la utilización de cada codón, con respecto a la del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice CAI se define como la media geométrica de estos valores de la capacidad de adaptación relativa. Se excluyen los codones no sinónimos y los codones de terminación (dependientes del código genético) . Los valores del CAI varían en un rango de entre 0 y 1, donde los valores más altos indican una mayor proporción de los codones más abundantes (véase Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; también véase: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(8): 2242-51). Una secuencia de nucleótidos adaptada preferentemente tiene un CAI de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7_, 0,8 ó 0,9. Se prefieren las secuencias cuyos codones fueron optimizados para su expresión en la célula huésped fúngica en cuestión, tal como por ejemplo células de S. cerevisiae.

La secuencia de nucleótidos codifica una enzima que tiene actividad acetaldehido deshidrogenasa y opcionalmente actividad alcohol deshidrogenasa que preferiblemente se expresa en una forma activa en la célula huésped transformada. Por consiguiente, la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped produce una acetaldehido deshidrogenasa con una actividad especifica de al menos 0,005, 0,010, 0, 020, 0, 050 ó 0,10 µ???? min-1 (mg de proteína) -1, determinada como la velocidad dependiente de acetil-CoA de reducción de NADH en extractos celulares de la célula huésped transformada a 30 °C como se describe en los Ejemplos en la presente.

La célula huésped a transformar con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad acetaldehido deshidrogenasa y opcionalmente actividad alcohol deshidrogenasa preferiblemente es una célula huésped de levadura. Preferentemente, la célula huésped es una célula cultivada. La célula huésped de la invención es más preferentemente una célula huésped capaz de un transporte activo o pasivo de pentosas (xilosa y preferentemente también arabinosa) en la célula. La célula huésped preferentemente contiene una glucólisis activa. La célula huésped además puede contener preferentemente una vía de pentosa fosfato endógena y puede tener actividad xilulosa quinasa endógena de modo que la xilulosa isomerizada de xilosa puede ser metabolizada en piruvato. El huésped contiene más preferentemente enzimas para la conversión de una pentosa (preferentemente a través del piruvato) en un producto de fermentación deseado, tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, 1, 3-propandiol, butanoles (1-butanol, 2-butanol, isobutanol) y productos derivados de isoprenoides . Una célula huésped particularmente preferida es una célula de levadura que naturalmente puede realizar una fermentación alcohólica, preferentemente, una fermentación alcohólica anaeróbica. La célula huésped tiene además, preferentemente, una gran tolerancia al etanol, una gran tolerancia al pH bajo (es decir, tiene la capacidad de crecer a un pH menor que 5, 4 ó 3) y a los ácidos orgánicos como ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico y productos de degradación de azúcar, tal como furfural e hidroxi-metilfurfural, y una gran tolerancia a temperaturas elevadas. Cualquiera de estas características o actividades de la célula huésped puede estar presente naturalmente en la célula huésped o se puede introducir o modificar mediante una modificación genética, preferentemente por autoclonación o mediante los métodos de la invención que se describirán más adelante. Una célula adecuada es una célula cultivada, una célula que se puede cultivar en un proceso de fermentación, por ejemplo en una fermentación sumergida o en estado sólido. Las células particularmente adecuadas son microorganismos eucariotas como por ejemplo hongos; sin embargo, las más adecuadas para su uso en la presente invención son levaduras.

Las levaduras se definen en la presente como microorganismos eucariotas e incluyen a todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Yeasts: characteristics and identification, J.A. Barnett, R.W. Payne, D. Yarrow, 2000, 3a ed. , Cambridge University Press, Cambridge, RU; y, The yeasts, a taxonomic study, CP. Kurtzman y J.W. Fell (eds) 1998, 4a ed., Elsevier Science Publ., B.V., Amsterdam, Los Países Bajos) que predominantemente crecen en una forma unicelular. Las levaduras pueden crecer mediante brotación de un tallo unicelular o pueden crecer mediante fisión del organismo. Las células de levadura preferidas para su uso en la presente invención pertenecen al género Saccharomyces , Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces , Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces o Yarrowia. Preferentemente la levadura es capaz de fermentación anaeróbica, más preferentemente capaz de fermentación alcohólica anaeróbica. A lo largo de los años se han hecho sugerencias para la introducción de diferentes organismos para la producción de bioetanol a partir de azúcares de cultivo. En la práctica, sin embargo, todos los procesos de bioproducción de etanol han continuado usando las levaduras del género Saccharomyces como productores de etanol. Esto es debido a las muchas características atractivas de las especies de Saccharomyces para los procesos industriales, es decir, una gran capacidad de crecimiento anaeróbico con tolerancia a ácido, etanol y osmolaridad, y por supuesto, su gran capacidad termentadora de alcoholes. Las especies de levadura preferidas como células huésped incluyen S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus y Schizosaccharomyces pombe.

En una forma de realización adicional, la célula huésped de la invención comprende además una modificación genética que introduce actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ en la célula. La glicerol deshidrogenasa codificada por el gen endógeno GCY1 de levadura parece ser específico del cofactor NADP+ (EC 1.1.1.72) en oposición a NAD+ (EC 1.1.1.6). Las levaduras tales como S. cerevisiae aparentemente no contienen actividad glicerol deshidrogenasa dependiente de NAD+ (EC 1.1.1.6) (véase, por ejemplo, la vía de KEGG 00561) . Una glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ se interpreta en la presente como una enzima que cataliza la siguiente reacción química (EC 1.1.1.6): glicerol + NAD+ <? glicerona + NADH + H+ Otros nombres de uso común incluyen glicerina deshidrogenasa y glicerol : AD+ 2-oxidorreductasa.

Preferiblemente la modificación genética que introduce la actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ en la célula huésped es la expresión de una glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ que es heteróloga de la célula huésped. Más preferiblemente, la secuencia de nucleótidos para la expresión de una glicerol deshidrogenasa heteróloga en las células de la invención es una secuencia que codifica una glicerol deshidrogenasa bacteriana que emplea NAD+ como cofactor (EC 1.1.1.6). Un ejemplo adecuado de una glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ bacteriana para la expresión en una célula huésped de la invención es por ejemplo el gen gldA de E. coli descrito en Truniger y Boos (1994, J Bacteriol., 176(6): 1796-1800), cuya expresión en levadura ya ha sido informada (Lee y Dasilva, 2006, Metab Eng. 8(1): 58-65). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una glicerol deshidrogenasa heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N°: 7 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene una o varias sustituciones, inserciones y/o supresiones en comparación con la SEQ ID N°: 7. En una forma de realización preferida se sobreexpresa una secuencia de nucleotidos de codones optimizados (véase antes) que codifica la glicerol deshidrogenasa heterologa, tal como por ejemplo una secuencia de nucleotidos de codones optimizados que codifica la secuencia de aminoácidos de la glicerol deshidrogenasa de la SEQ ID N°: 7. Una secuencia de nucleotidos de codones optimizados tal se provee, por ejemplo, en la SEQ ID N°: 21 (posiciones 10 - 1113; CAI = 0, 976) .

Para la sobreexpresión de la secuencia de nucleotidos que codifica la glicerol deshidrogenasa, la secuencia de nucleotidos (a sobreexpresar) se coloca en una construcción de expresión en donde está ligada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobreexpresión de la enzima glicerol deshidrogenasa con la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase antes) . Los promotores adecuados para la (sobre) expresión de la secuencia de nucleotidos que codifica la enzima con actividad glicerol deshidrogenasa incluyen promotores que preferentemente no son sensibles a una represión por catabolitos (glucosa) , que son activos bajo condiciones anaeróbicas y/o que preferentemente no requieren de xilosa o arabinosa para la inducción. Los ejemplos de dichos promotores se proporcionaron previamente. La expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped produce una actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ especifica de al menos 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 ó 5,0 U min-1 (mg de proteína) -1, determinada en extractos celulares de las células huésped transformadas a 30 °C como se describe en los Ejemplos en la presente .

En una forma de realización adicional, la célula huésped de la invención comprende además una modificación genética que aumenta la actividad específica de la dihidroxiacetona quinasa en la célula. Los datos del transcriptoma han mostrado que la dihidroxiacetona quinasa DAK1 endógena ya se expresaba a niveles altos en S. cerevisiae. Un aumento adicional de la actividad dihidroxiacetona quinasa en las células de la invención no sería entonces estrictamente necesario. Sin embargo, en una forma de realización preferida, para lograr índices de conversión óptimos, la célula huésped de la invención comprende entonces una modificación genética que aumenta la actividad específica de la dihidroxiacetona quinasa en la célula. Una dihidroxiacetona quinasa se interpreta en la presente como una enzima que cataliza la siguiente reacción química ( (EC 2.7.1.29): ATP + glicerona <? ADP + glicerona fosfato Otros nombres de uso común incluyen glicerona quinasa, ATP : glicerona fosfotransferasa y acetol quinasa (fosforilante) . Se entiende que la glicerona y la dihidroxiacetona son una misma molécula. Preferentemente la modificación genética causa la sobreexpresion de una dihidroxiacetona quinasa, por ejemplo mediante sobreexpresion de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa puede ser endógena para la célula o puede ser una dihidroxiacetona quinasa que es heteróloga para la célula. Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la sobreexpresion de dihidroxiacetona quinasa en las células de la invención son por ejemplo los genes de dihidroxiacetona quinasa de S. cerevisiae (DAK1) y (DAK2) tal como describen, por ejemplo, Molin et al., (2003, J. Biol. Chem. 278: 1415-1423). Preferiblemente, la secuencial de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencial de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID N°: 8 y 9. En una forma de realización preferida, se sobreexpresa una secuencia de nucleótidos de codones optimizados (véase antes) que codifica la dihidroxiacetona quinasa tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de codones optimizados que codifica la dihidroxiacetona quinasa de la SEQ ID N°: 8 o una secuencia de nucleótidos de codones optimizados que codifica la dihidroxiacetona quinasa de la SEQ ID N°: 9. Una secuencia de nucleótidos preferida para la sobreexpresion de una dihidroxiacetona quinasa es una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de la SEQ ID N°: 8 (S. cerevisiae (DAK1) ) o que contiene una o varias sustituciones, inserciones y/o supresiones en comparación con la SEQ ID N°: 8.

Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la sobreexpresion de una dihidroxiacetona quinasa heteróloga en las células de la invención son, por ejemplo, secuencias que codifican dihidroxiacetona quinasas bacterianas tal como el gen dhaK de Citrobacter freundii, por ejemplo el descrito por Daniel et al., (1995, J. Bacteriol. 177: 4392-4401). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N°: 25 o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene una o varias sustituciones, inserciones y/o supresiones en comparación con la SEQ ID N°: 25. En una forma de realización preferida se sobreexpresa una secuencia de nucleótidos de codones optimizados (véase antes) que codifica la dihidroxiacetona quinasa heteróloga, tal como por ejemplo una secuencia de nucleótidos de codones optimizados que codifica la secuencia de aminoácidos de la dihidroxiacetona quinasa de la SEQ ID N° : 25. Una secuencia de nucleótidos de codones optimizados tal se provee, por ejemplo, en la SEQ ID N°: 26 (posiciones 10 - 1668).

Para la sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa, la secuencia de nucleótidos (a sobreexpresar) se coloca en una construcción de expresión en donde está ligada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobreexpresión de la enzima dihidroxiacetona quinasa con la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase antes) . Los promotores adecuados para la (sobre) expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima con actividad dihidroxiacetona quinasa incluyen promotores que preferentemente no son sensibles a una represión por catabolitos (glucosa) , que son activos bajo condiciones anaeróbicas y/o que preferentemente no requieren de xilosa o arabinosa para la inducción. Los ejemplos de dichos promotores se proporcionaron previamente. En las células de la invención, una dihidroxiacetona quinasa a sobreexpresarse preferiblemente se sobreexpresa en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por una o más modificaciones genéticas que causan la sobreexpresión . Preferiblemente, la dihidroxiacetona quinasa se sobreexpresa bajo condiciones anaeróbicas en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión. Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresión se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad especifica en la célula) , al nivel de estado estacionario de la prote na de la enzima asi como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica la enzima en la célula. La sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped produce una actividad dihidroxiacetona quinasa especifica de al menos 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 ó 0,05 U min-1 (mg de proteína) -1, determinada en extractos celulares de las células huésped transformadas a 30 °C como se describe en los Ejemplos en la presente.

En una forma de realización adicional, la célula huésped de la invención comprende además una modificación genética que aumenta el transporte de glicerol en la célula. Preferiblemente, la modificación genética que aumenta el transporte de glicerol en la célula preferiblemente es una modificación genética que causa la sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una entre una proteina de captación de glicerol y un canal de glicerol.

Una proteina de captación de glicerol se interpreta en la presente como una proteina que abarca multimembranas que pertenece a la superfamilia que incluye 0-aciltransferasas (MBOAT) unida a membrana incluyendo por ejemplo las proteínas de captación de glicerol de S. cerevisiae codificadas por los genes GUP1 y GUP2. Preferentemente la modificación genética causa la sobreexpresión de una proteína de captación de glicerol, por ejemplo mediante sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de captación de glicerol. La secuencia de nucleótidos que codifica la proteina de captación de glicerol puede ser endógena para la célula o puede ser una proteína de captación de glicerol que es heteróloga para la célula. Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la sobreexpresión de proteínas de captación de glicerol en las células de la invención son, por ejemplo, los genes de proteínas de captación de glicerol de S. cerevisiae (GUPl) y (GUP2) y ortólogos de los mismos como describen, por ejemplo, Neves et al., (2004, FEMS Yeast Res., 5: 51-62) . Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos que codifica la proteína de captación de glicerol comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID N° : 10 (Guplp) y 11 (Gup2p) . En una forma de realización preferida se sobreexpresa una secuencia de nucleotidos de codones optimizados (véase antes) que codifica la proteína de captación de glicerol tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleotidos de codones optimizados que codifica la proteína de captación de glicerol de la SEQ ID N° : 10 o una secuencia de nucleotidos de codones optimizados que codifica la proteína de captación de glicerol de la SEQ ID N°: 11. Aunque aún no es clara la naturaleza exacta de la influencia de GUPl sobre el transporte de glicerol, Yu et al., (2010, supra) han demostrado que la sobreexpresión de GUPl en S. cerevisiae mejora la producción de etanol sobre células cultivadas en glicerol. Una secuencia de nucleotidos preferida para la sobreexpresión de una proteína de captación de glicerol es entonces una secuencia de nucleotidos que codifica una proteína de captación de glicerol capaz de rescatar el fenotipo asociado al estrés por sales de un mutante guplA de S. cerevisiae por complementacion como describen Neves et al., (2004, supra) . Dichos ortólogos de complementacion del GUPl de S. cerevisiae incluyen secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 60, 68, 72, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 10 y se pueden obtener de las especies de levadura que pertenecen a los géneros de Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces , Candida, Pichia, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowia.

Un canal de glicerol se interpreta en la presente como un miembro de la familia MIP de proteínas de canales revisado por Reizer et al., (1993, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28: 235-257), donde dichas proteínas de canales comprenden un dominio transmembrana de 250-280 aminoácidos que consiste de seis dominios que abarcan toda la membrana y que tienen al menos un 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de aminoácidos, o al menos un 55, 60, 65, 70, 80, 90, 95, 98 ó 99% de similitud de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de la SEQ ID N°: 12, la acuagliceroporina FPS1 de S. cerevisiae. Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la sobreexpresión de un canal de glicerol en las células de la invención incluyen secuencias de nucleótidos que codifican el gen de acuagliceroporina FPS1 de levadura, por ejemplo, de S. cerevisiae (Van Aelst et al., 1991, EMBO J. 10: 2095-2104) y ortólogos de los mismos de otras levaduras incluyendo Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus y Zygosaccharomyces rouxii como se describe, por ejemplo, en Neves et al., (2004, supra) . Sin embargo, no se excluye el uso de canales de glicerol bacterianos o de plantas ya que por ejemplo Luyten et al., (1995, EMBO J. 14: 1360-1371) han demostrado que el facilitador de glicerol de E. coli, que solamente tiene un 30% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de la acuagliceroporina FPS1 de S. cerevisiae, puede complementar la captación de glicerol en un mutante fpslA de S. cerevisiae. La secuencia de nucleótidos que codifica el canal de glicerol puede ser endógena para la célula o puede ser un el canal de glicerol que es heterólogo para la célula. En una forma de realización preferida se sobreexpresa una secuencia de nucleótidos de codones optimizados (véase antes) que codifica el canal de glicerol, tal como por ejemplo una secuencia de nucleótidos de codones optimizados que codifica la acuagliceroporina de la SEQ ID N°: 12.

Para la sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina de captación de glicerol y/o la proteina del canal de glicerol, la secuencia de nucleótidos (a sobreexpresar) se coloca en una construcción de expresión en donde está ligada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobreexpresión de la proteina de captación de glicerol y/o la proteina del canal de glicerol con la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase antes) . Los promotores adecuados para la (sobre) expresión de la secuencia de nucleótido que codifican la proteina de captación de glicerol y/o la proteina del canal de glicerol incluyen promotores que preferentemente no son sensibles a una represión por catabolitos (glucosa), que son activos bajo condiciones anaeróbicas y/o que preferentemente no requieren de xilosa o arabinosa para la inducción. Los ejemplos de dichos promotores se proporcionaron previamente. En las células de la invención, una proteina de captación de glicerol y/o una proteina de un canal de glicerol a sobreexpresarse preferiblemente se sobreexpresa en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por una o más modificaciones genéticas que causan la sobreexpresión. Preferiblemente, la proteina de captación de glicerol y/o la proteina del canal de glicerol se sobreexpresa bajo condiciones anaeróbicas en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión . Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresión se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad especifica en la célula) , al nivel de estado estacionario de la proteina de la enzima asi como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica la enzima en la célula.

En una forma de realización preferida de la célula huésped de la invención, la expresión de la proteina del canal de glicerol definida previamente está reducida o inactivada. Una modificación genética que reduce o inactiva la expresión de la proteina del canal de glicerol puede ser útil para. reducir o prevenir el transporte de glicerol fuera de la célula. Preferiblemente, la reducción o inactivación de la expresión de la proteina del canal de glicerol se combina con la sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina de captación de glicerol definida previamente.

En una forma de realización adicional, la célula huésped de la invención comprende además una modificación genética que aumenta la actividad acetil-CoA sintetasa especifica en la célula, preferiblemente bajo condiciones anaeróbicas ya que esta actividad es limitante de la velocidad bajo estas condiciones. La acetil-CoA sintetasa o la acetato-CoA ligasa (EC 6.2.1.1) se interpreta en la presente como una enzima que cataliza la formación de un nuevo enlace químico entre el acetato y la coenzima A (CoA) . Preferentemente la modificación genética causa la sobreexpresión de una acetil-CoA sintetasa, por ejemplo mediante sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa puede ser endógena para la célula o puede ser una acetil-CoA sintetasa que es heteróloga para la célula. Las secuencias de nucleótidos que se pueden usar para la sobreexpresión de acetil-CoA sintetasa en las células de la invención comprende, por ejemplo, los genes de acetil-CoA sintetasa de S. cerevisiae (ACS1 y ACS2) como describen, por ejemplo, de Jong-Gubbels et al., (1998, FEMS Microbiol Lett., 165: 15-20) . Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID N°: 13 y 14.

En una forma de realización, la secuencia de nucleótidos que se sobreexpresa codifica una acetil-CoA sintetasa con una gran afinidad por el acetato. Se prefiere usar una acetil-CoA sintetasa con una gran afinidad por acetato para las condiciones bajo las cuales hay una relativamente baja concentración de ácido acético en el medio de cultivo, por ejemplo no más de 2 g de ácido acético/1 de medio de cultivo. Una acetil-CoA sintetasa con una gran afinidad por acetato se define en la presente como una acetil-CoA sintetasa con una mayor afinidad por acetato que la acetil-CoA sintetasa codificada por el ACS2 de S. cerevisiae. Preferiblemente, una acetil-CoA sintetasa con una gran afinidad por acetato tiene una Km para acetato no mayor que 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2 ó 0,1 mM, tal como por ejemplo la acetil-CoA sintetasa codificada por el gen ACS1 de S. cerevisiae. Más preferiblemente, se sobreexpresa la secuencia de nucleótidos de codones optimizados (véase antes) que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° : 13.

En otra forma de realización, la secuencia de nucleótidos que se sobreexpresa codifica una acetil-CoA sintetasa con una velocidad máxima alta (vmáx) . Se prefiere usar una acetil-CoA sintetasa con una velocidad máxima alta para la condición bajo la cual hay una concentración relativamente alta de ácido acético en el medio de cultivo, por ejemplo al menos 2, 3, 4 ó 5 g de ácido acético/1 de medio de cultivo. Una acetil-CoA sintetasa con una velocidad máxima alta se define en la presente como una acetil-CoA sintetasa con una velocidad máxima más alta que la acetil-CoA sintetasa codificada por el ACS1 de S. cerevisiae. Preferiblemente, la acetil-CoA sintetasa con una velocidad máxima alta es la acetil-CoA sintetasa codificada por el gen ACS2 de S. cerevisiae. Más preferiblemente, se sobreexpresa la secuencia de nucleótidos de codones optimizados (véase antes) que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 14.

Para la sobreexpresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la acetil-CoA sintetasa, la secuencia de nucleótidos (a sobreexpresar) se coloca en una construcción de expresión en donde está ligada operativamente a regiones/secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para asegurar la sobreexpresión de la enzima acetil-CoA sintetasa con la transformación de la construcción de expresión en la célula huésped de la invención (véase antes). Los promotores adecuados para la ( sobre ) expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima con actividad acetil-CoA sintetasa incluyen promotores que preferentemente no son sensibles a una represión por catabolitos (glucosa) , que son activos bajo condiciones anaeróbicas y/o que preferentemente no requieren de xilosa o arabinosa para la inducción. Los ejemplos de dichos promotores se proporcionaron previamente. En las células de la invención, una acetil-CoA sintetasa a sobreexpresarse se sobreexpresa en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por una o más modificaciones genéticas que causan la sobreexpresion. Preferiblemente, la acetil-CoA sintetasa se sobreexpresa bajo condiciones anaeróbicas en al menos un factor de 2, 5, 10, 20, 50 ó 100 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresion. Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresion se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima (actividad especifica) , al nivel de estado estacionario de la proteina de la enzima asi como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica la enzima.

En una forma de realización adicional, la célula huésped de la invención comprende además una modificación genética que reduce la actividad glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente NAD+ especifica en la célula. La glicerol 3-fosfato deshidrogenasa o la glicerolfosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8) cataliza la reducción de dihidroxiacetona fosfato en sn-glicerol 3-fosfato oxidando al mismo tiempo NADH en NAD+. En las células de la invención, la actividad glicerofosfato deshidrogenasa especifica preferiblemente se reduce en al menos un factor de 0,8, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05 ó 0,01 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión, preferiblemente bajo condiciones anaeróbicas .

Preferentemente, la actividad glicerofosfato deshidrogenasa es reducida en la célula huésped mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión o que inactivan un gen que codifica para una glicerofosfato deshidrogenasa. Preferiblemente, las modificaciones genéticas reducen o inactivan la expresión de cada copia endógena del gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa especifica en el genoma de la célula. Una célula dada puede comprender múltiples copias del gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa especifica con una y la misma secuencia de aminoácidos como resultado de una di, poli o aneuploidia. Preferiblemente, en tales casos la expresión de cada copia del gen especifico que codifica la glicerolfosfato deshidrogenasa está reducida o inactivada. Como alternativa, una célula puede contener diversas (iso) enzimas diferentes con actividad glicerolfosfato deshidrogenasa que difiere en la secuencia de aminoácidos y cada una de las cuales está codificada por un gen diferente. En tales casos, en algunas formas de realización de la invención se prefiere que solamente se reduzcan o inactiven determinados tipos de las isoenzimas en tanto otros tipos no son afectados (véase más adelante) . Preferentemente, el gen se inactiva mediante supresión de al menos parte del gen o mediante ruptura del gen, en donde en este contexto el término gen también incluye a cualquier secuencia no codificante corriente arriba o corriente abajo de la secuencia codificante, cuya supresión (parcial) o inactivación resulta en una reducción de la expresión de la actividad glicerofosfato deshidrogenasa en la célula huésped.

Un gen preferido que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa cuya actividad será reducida o inactivada en la célula de la invención es el gen GPD2 de S. cerevisiae descrito por Eriksson et al., (1995, Mol. Microbiol. 17: 95-107), que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 15 y ortólogos del mismo en otras especies. Por ello, un gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa cuya actividad será reducida o inactivada en la célula de la invención preferiblemente es un gen que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 15.

En una forma de realización preferida de la invención, la célula huésped de la invención comprende una vía de respuesta a glicerol funcional de gran osmolaridad. Por ello, preferiblemente sólo se reduce o inactiva la actividad de los genes que codifican una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 15, en tanto al menos un gen endógeno que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 16 es funcional. La SEQ ID N°: 16 representa la secuencia de aminoácidos codificada por el gen GPD1 de S. cerevisiae descrito por Albertyn et al., (1994, Mol. Cell. Biol. 14 : 4135-4144), que tiene un 69% de identidad de aminoácidos con la glicerolfosfato deshidrogenasa GPD2 de S. cerevisiae. El gen GPDl de S. cerevisiae es la glicerolfosfato deshidrogenasa inducida por estrés de S. cerevisiae, que es importante para el crecimiento bajo estrés osmótico como puede suceder bajo las condiciones de fermentación industrial. Su expresión está regulada, entre otros, por la vía de respuesta a glicerol de gran osmolaridad. Por ello es ventajoso que la célula huésped de la invención tenga al menos una copia funcional de un gen endógeno que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 16.

A pesar de lo mencionado, ahora los inventores han encontrado sorprendentemente que la inactivación de la glicerol fosfato deshidrogenasa GPD1 de S. cerevisiae tiene un efecto más ventajoso sobre la reducción de la producción de glicerol y el aumento del consumo de glicerol y acetato en comparación con la inactivación de la glicerolfosfato deshidrogenasa GPD2 de S. cerevisiae. Por ello, en una forma de realización más preferida, la célula huésped de la invención comprende una modificación genética que reduce o inactiva la expresión de al menos el o los genes que codifican una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 16 (GPD1) .

En una forma de realización adicional, está reducida o inactivada la actividad de todos los genes en la célula huésped que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa. En tales células, preferiblemente todas las copias de los genes endógenos que codifican una glicerolfosfato deshidrogenasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 15 ó 16 se inactivan o al menos tienen una expresión reducida.

En otra forma de realización de la invención, la célula huésped no es una célula de levadura que comprende un gen exógeno que codifica una enzima con la capacidad para convertir piruvato y coenzima-A en formiato y acetil-CoA. Preferiblemente, la célula huésped no es una célula de levadura que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una piruvato formiato liasa.

En aún otra forma de realización de la invención, la célula huésped es una célula huésped en donde la actividad formiato deshidrogenasa específica es al menos un 81, 85, 90, 95 ó 100% de la actividad formiato deshidrogenasa específica en una cepa de la célula huésped que es genéticamente idéntica excepto por una modificación genética seleccionada del grupo que consiste de: a) (la introducción de) un gen exógeno que codifica una enzima con actividad acetaldehído deshidrogenasa, donde dicho gen confiere a la célula la capacidad para convertir ácido acético en etanol; b) (la introducción de) un gen bacteriano que codifica una enzima con actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+; y c) cualquiera de las otras modificaciones genéticas descritas previamente en la presente. Por consiguiente, una célula huésped preferida de la invención no es una célula de levadura que comprende una modificación genética que reduce la actividad formiato deshidrogenasa especifico dependiente de NAD+ en la célula.

En una forma de realización preferida adicional, la célula huésped de la invención tiene al menos uno entre: a) la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa; y b) la capacidad para convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato. En el caso de a) la célula preferentemente contiene un gen exógeno funcional de xilosa isomerasa, donde dicho gen confiere a la célula la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa. En el caso de b) la célula preferentemente contiene genes exógenos funcionales que codifican una L-arabinosa isomerasa, una L-ribuloquinasa y una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa, donde dicho genes juntos confieren a la célula la capacidad de isomerizar convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato .

Las células huésped fúngicas que tienen la capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa se describen, por ejemplo, en WO 03/0624430 y O 06/009434. La capacidad de isomerizar xilosa en xilulosa preferentemente es conferida a la célula por transformación con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una xilosa isomerasa. Preferentemente la célula adquiere entonces la capacidad de isomerizar directamente xilosa en xilulosa. Más preferentemente, la célula adquiere entonces la capacidad para crecer aeróbicamente y/o anaeróbicamente sobre xilosa como única fuente de energía y/o de carbono por isomerización directa de xilosa en xilulosa (y el metabolismo posterior de xilulosa) . En la presente se considera que la isomerización directa de xilosa en xilulosa tiene lugar en una sola reacción catalizada por una xilosa isomerasa, a diferencia de la conversión en dos pasos de xilosa en xilulosa a través de un intermediario de xilitol catalizado por una xilosa reductasa y una xilitol deshidrogenasa, respectivamente.

En el arte se han descrito diversas xilosa isomerasas (y sus secuencias de aminoácidos y codificantes de nucleótidos) que se pueden usar exitosamente para conferirle a la célula de la invención la capacidad de isomerizar directamente xilosa en xilulosa. Incluyen las xilosa isomerasas de Piromyces sp. y de otros hongos anaeróbicos que pertenecen a las familias Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces o Ruminomyces (WO 03/0624430), Cyllamyces aberensis (US 20060234364), Orpinomyces (Madhavan et al., 2008, DOI 10.1007/s00253-008-1794-6) , la xilosa isomerasa del género bacteriano Bacteroides, incluyendo por ejemplo B. thetaiotaomicron (WO 06/009434), B. fragilis y B. uniformis (WO 09/109633) , la xilosa isomerasa de la bacteria anaeróbica Clostridium phytofermentans (Brat et al., 2009, Appl .

En'viron. Microbiol. 75:2304-2311), las xilosa isomerasas de Clostridium difficile, Ciona intestinales y Fusobacterium mortiferum.

Las células huésped fúngicas que tienen la capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato como se describe, por ejemplo, en Wisselink et al., (2007, AEM Accepts, publicado en linea antes de su impresión el 1 de junio, 2007; Appl . Environ. Microbiol. doi : 10.1128 /AEM.00177-07) y en EP 1 499 708. La capacidad para convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato preferentemente es conferida a la célula por transformación con una construcción de ácido (s) nucleico (s) que comprende secuencias de nucleótidos que codifican: a) una arabinosa isomerasa; b) una ribuloquinasa, preferentemente una L-ribuloquinasa, una xilosa isomerasa; y c) una ribulosa-5-P-4-epimerasa , preferentemente una L-ribulosa-5-P-4-epimerasa .

Preferentemente, en las células de la invención, la capacidad para convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato es la capacidad para convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato a través de las subsiguientes reacciones de 1) isomerización de arabinosa en ribulosa; 2) fosforilación de ribulosa en ribulosa 5-fosfato; y 3) epimerización de ribulosa 5-fosfato en D-xilulosa 5-fosfato. Las secuencias de nucleótidos adecuadas que codifican arabinosa isomerasas, una ribuloquinasas y ribulosa-5-P-4-epimerasas se pueden obtener de Bacillus subtilis, Escherichia coli (véase, por ejemplo, EP 1 499 708) , Lactobacilli , por ejemplo Lactobacillus plantarum (véase, por ejemplo, isselink et al., supra) , o especies de Clavibacter, Arthrobacter y Gramella, siendo las preferidas Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens y Gramella forsetii (véase WO2009/011591) .

La célula huésped transformada de la invención preferentemente comprende además actividad xilulosa quinasa de modo que la xilulosa isomerizada a partir de xilosa pueda ser metabolizada en piruvato. Preferentemente, la célula contiene actividad xilulosa quinasa endógena. Más preferentemente, la célula de la invención comprende una modificación genética que incrementa la actividad xilulosa quinasa especifica. Preferentemente la modificación genética causa la sobreexpresión de una xilulosa quinasa, por ejemplo mediante sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica para una xilulosa quinasa. El gen que codifica para la xilulosa quinasa puede ser endógeno a la célula o puede ser una xilulosa quinasa que es heteróloga a la célula. Una secuencia de nucleótidos que se puede usar para la sobreexpresión de xilulosa quinasa en las células de la invención es por ejemplo el gen de xilulosa quinasa de S. cerevisiae (XKS1) descrito por Deng y Ho (1990, Appl .

Biochem. Biotechnol. 24-25: 193-199). Otra xilulosa quinasa preferida es una xilosa quinasa relacionada con la xilulosa quinasa de Piromyces (xylB; véase WO 03/0624430) . Esta xilulosa quinasa de Piromyces en realidad está más relacionada con quinasas de procariotas que con todas las quinasas eucariotas conocidas, tal como la quinasa de levadura. Se ha indicado que las xilulosa quinasas eucariotas son quinasas de azúcares no especificas, que tienen un amplio rango de sustratos que incluye xilulosa. Por el contrario, las xilulosa quinasas procariotas, con las cuales la quinasa de Piromyces está más relacionada, se han indicado como quinasas más especificas para xilulosa, es decir tienen un rango de sustrato más estrecho. En las células de la invención, una xilulosa quinasa a sobreexpresarse se sobreexpresa en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por una o más modificaciones genéticas que causan la sobreexpresion. Se comprenderá que estos niveles de sobreexpresion se pueden aplicar al nivel de estado estacionario de la actividad de la enzima, al nivel de estado estacionario de la proteina de la enzima asi como también al nivel de estado estacionario del transcripto que codifica para la enzima.

Una célula de la invención preferentemente comprende además una modificación genética que incrementa el flujo de la vía de pentosa fosfato como se describe en WO 06/009434. En particular, la modificación genética causa un flujo incrementado de la parte no oxidativa de la vía de pentosa fosfato. Una modificación genética que cause un flujo incrementado de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se entiende en la presente como designando a la modificación que incrementa el flujo en al menos un factor de 1,1, 1,2, 1,5, 2, 5, 10 ó 20 en comparación con el flujo en una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa el flujo incrementado. El flujo de la parte no oxidativa de la vía de pentosa fosfato se puede medir como se describe en WO 06/009434.

Se pueden introducir modificaciones genéticas que incrementen el flujo de la ruta de las pentosas fosfato en las células de la invención de varias maneras. Estas incluyen por ejemplo conseguir mayores niveles de actividad de estado estacionario de xilulosa quinasa y/o uno o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato y/o un nivel reducido en estado estacionario de la actividad inespecífica de aldosa reductasa. Estos cambios en los niveles de actividad de estado estacionario pueden estar afectados por la selección de los mutantes (espontáneos o inducidos por químicos o por radiación) y/o mediante tecnología de ADN recombinante por ejemplo mediante sobreexpresion o inactivación, respectivamente, de genes que codifican para las enzimas o factores que regulan a estos genes .

En una célula preferida de la invención, la modificación genética comprende la sobreexpresion de al menos una enzima de la (parte no oxidativa) ruta de las pentosas fosfato. Preferentemente la enzima se elige del grupo que consiste en las enzimas que codifican para ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Se pueden sobreexpresar diferentes combinaciones de las enzimas de la (parte no oxidativa) ruta de las pentosas fosfato. Por ejemplo las enzimas que se sobreexpresan pueden ser al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa y transcetolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa y transaldolasa; o al menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, y transaldolasa; o al menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, y transcetolasa . En una forma de realización de la invención se sobreexpresa cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, transcetolasa y transaldolasa en la célula de la invención. Se prefiere una célula en la cual la modificación genética comprende al menos la sobreexpresion de la enzima transaldolasa. Se prefiere más una célula en la cual la modificación genética comprende al menos la sobreexpresion de ambas enzimas transcetolasa y transaldolasa dado que una célula huésped tal ya tiene la capacidad de crecer bajo condiciones anaeróbicas sobre xilosa. De hecho, se ha encontrado que bajo algunas condiciones las células que solamente sobreexpresan la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen el mismo índice de crecimiento anaeróbico sobre xilosa como lo hacen las células huéspedes que sobreexpresan las cuatro enzimas, o sea la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Más aun, las células de la invención que sobreexpresan ambas enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa se prefieren frente a las células huéspedes que solamente sobreexpresan la isomerasa o solo la 3-epimerasa ya que la sobreexpresión de una sola de estas enzimas puede producir desequilibrios metabolicos.

Existen diversos medios disponibles en el arte para la sobreexpresión de enzimas en las células de la invención. En particular, se puede sobreexpresar una enzima mediante el incremento del número de copias del gen que codifica para la enzima en la célula, por ejemplo mediante la integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula huésped, mediante la expresión del gen desde un vector de expresión multicopia episomal o mediante la introducción de un vector de expresión episomal que comprende múltiples copias del gen. La secuencia de codificación usada para la sobreexpresión de las enzimas preferentemente es homologa de la célula huésped de la invención. Sin embargo, se pueden aplicar asimismo las secuencias de codificación que son heterólogas para la célula huésped de la invención.

Como alternativa, la sobreexpresión de enzimas en las células de la invención se puede llevar a cabo mediante el uso de un promotor que no sea nativo de la secuencia codificante de la enzima a sobreexpresar, o sea un promotor que sea heterólogo de la secuencia codificante a la que está ligado operativamente. A pesar de que el promotor es preferentemente heterólogo de la secuencia codificante a la que está ligado operativamente, también es preferible que el promotor sea homólogo, o sea endógeno, para la célula de la invención. Preferentemente el promotor heterólogo tiene la capacidad de producir un mayor nivel de estado estable del transcripto que comprende la secuencia de codificación (o tiene la capacidad de producir más moléculas del transcripto, es decir moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que el promotor que es nativo para la secuencia de codificación, preferentemente bajo condiciones donde la xilosa o la xilosa y glucosa se encuentran disponibles como fuentes de carbono, más preferentemente como principales fuentes de carbono (es decir, más del 50% de la fuente de carbono disponible consiste de xilosa o xilosa y glucosa) , con mayor preferencia como fuentes únicas de carbono.

Otra célula huésped preferida de la invención comprende una modificación genética que reduce la actividad aldosa reductasa inespecifica en la célula. Preferentemente, la actividad inespecifica de aldosa reductasa se reduce en la célula huésped mediante una o más modificaciones genéticas que reducen la expresión o que inactivan un gen que codifica para una aldosa reductasa inespecifica. Preferentemente, las modificaciones genéticas reducen o inactivan la expresión de cada copia endógena de un gen que codifica una aldosa reductasa inespecifica que tiene la capacidad de reducir una aldopentosa, incluyendo, xilosa, xilulosa y arabinosa, en el genoma de la célula. Una célula dada puede comprender múltiples copias de genes que codifican para aldosas reductasas inespecificas como resultado de di-, poli- o aneuploidía, y/o la célula puede contener varias (iso) enzimas con actividad de aldosa reductasa que difieren en su secuencia de aminoácidos y que codifican cada una para un gen diferente. También en dichas instancias se reduce o se inactiva preferentemente la expresión de cada gen que codifica para una aldosa reductasa inespecifica . Preferentemente, el gen se inactiva mediante supresión de al menos parte del gen o mediante ruptura del gen, en donde en este contexto el término gen también incluye a cualquier secuencia no codificante corriente arriba o corriente abajo de la secuencia codificante, cuya supresión (parcial) o inactivación resulta en una reducción de la expresión de la actividad inespecífica de aldosa reductasa en la célula huésped. Una secuencia de nucleótidos que codifica una aldosa reductasa cuya actividad debe reducirse en la célula de la invención y las secuencias de aminoácidos de dichas aldosa reductasas se describen en WO 06/009434 e incluyen, por ejemplo, los genes de aldosa reductasa ( inespecificos ) del gen GRE3 de S. cerevisiae (Tráff et al., 2001, Ap l . Environ. Microbiol. 67: 5668-5674) y ortólogos de los mismos en otras Una célula huésped transformada preferida adicional de acuerdo con la invención puede comprender otras modificaciones genéticas que dan como resultado una o más de las características seleccionadas del grupo que consiste de (a) mayor transporte de xilosa y/o arabinosa en la célula; (b) menor sensibilidad a represión por catabolitos; (c) mayor tolerancia a etanol, osmolaridad o ácidos orgánicos; y (d) producción reducida de productos secundarios. Los productos secundarios comprenderán moléculas que contienen carbono que son distintas del producto de fermentación deseado e incluyen, por ejemplo, xilitol, arabinitol, glicerol y/o ácido acético. Cualquier modificación genética descrita en la presente se puede introducir mediante los procesos clásicos de mutagénesis y examen y/o selección del mutante deseado, o simplemente por examen y/o selección de los mutantes espontáneos con las características deseadas. Como alternativa, las modificaciones genéticas pueden consistir de la sobreexpresión de genes endógenos y/o de la inactivación de genes endógenos. Los genes cuya sobreexpresión es deseada para incrementar el transporte de arabinosa y/o xilosa en la célula preferentemente se seleccionan entre genes que codifican un transportador de hexosas o pentosas. En S. cerevisiae y otras levaduras, estos genes incluyen HXT1, HXT2, HXT4, HXT5, HXT7 y GAL2 , siendo los más preferidos HXT7, HXT5 y GAL2 (véase Sedlack y Ho, Yeast 2004; 21: 671-684). Otro transportador preferido para la expresión en levadura es el transportador de glucosa codificado por el gen SUT1 de P. stipitis (Katahira et al., 2008, Enzyme Microb. Technol, 43: 115-119). De manera similar, se pueden sobreexpresar ortólogos de estos genes de transportadores en otras especies. Otros genes que se pueden sobreexpresar en las células de la invención incluyen genes que codifican enzimas glucoliticas y/o enzimas etanologénicas , tales como alcohol deshidrogenasas . Los genes endógenos preferidos para la inactivación incluyen genes de hexosa quinasa por ejemplo el gen HXK2 de S. cerevisiae (véase Diderich et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1587-1593); los genes MIG1 o MIG2 de S. cerevisiae; genes que codifican las enzimas relacionadas con el metabolismo del glicerol tales los genes de la glicerol-fosfato deshidrogenasa 1 y/o 2 de S. cerevisiae; u ortólogos (hibridizantes) de estos genes en otras especies. Otras modificaciones preferidas adicionales de células huésped para la fermentación de xilosa se describen en van Maris et al., (2006, Antonie van Leeuwenhoek 90: 391-418), WO2006/009434 , WO2005/023998 , WO2005/111214 y WO2005/091733. Cualquiera de las modificaciones genéticas de las células de la invención descritas en la presente preferentemente se introduce o modifica, en lo posible, por modificación genética de autoclonacion.

Una célula huésped preferida de acuerdo con la invención tiene la capacidad para crecer sobre al menos uno entre xilosa y arabinosa como fuente de carbono/energía, preferentemente como única fuente de carbono/energia, y preferentemente bajo condiciones anaeróbicas, es decir, las condiciones definidas más adelante en la presente para el proceso de fermentación anaeróbica. Preferiblemente, cuando se hace crecer sobre xilosa como fuente de carbono/energia la célula huésped no produce esencialmente xilitol, por ejemplo el xilitol producido se encuentra por debajo del limite de detección o por ejemplo menos que un 5, 2, 1, 0,5 ó 0,3% del carbono consumido en una base molar. Preferiblemente, cuando se hace crecer sobre arabinosa como fuente de carbono/energia, la célula no produce esencialmente arabinitol, por ejemplo el arabinitol producido se encuentra por debajo del limite de detección o por ejemplo menos que un 5, 2, 1, 0,5 ó 0,3 % del carbono consumido en una base molar.

Una célula de levadura preferida de la invención tiene la capacidad para crecer sobre una combinación de a) alíñenos una entre una hexosa, una pentosa, b) ácido acético; y c) glicerol a una velocidad de al menos 0, 01, 0,02, 0, 05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 bajo condiciones aeróbicas, o, más preferentemente, a una velocidad de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ó 0,2 h-1 bajo condiciones anaeróbicas. Por ello, preferentemente la célula huésped tiene la capacidad para crecer sobre al menos uno entre xilosa y arabinosa como única fuente de carbono/energía a una velocidad de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 bajo condiciones aeróbicas, o, más preferentemente, a una velocidad de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ó 0,2 h-1 bajo condiciones anaeróbicas. Más preferentemente la célula huésped tiene la capacidad para crecer sobre una mezcla de una hexosa (por ejemplo, glucosa) y al menos uno entre xilosa y arabinosa (a una relación ponderal de 1:1) como única fuente de carbono/energia a una velocidad de al menos 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,25 ó 0,3 h-1 bajo condiciones aeróbicas, o, más preferentemente, a una velocidad de al menos 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,08, 0,1, 0,12, 0,15 ó 0,2 h-1 bajo condiciones anaeróbicas.

En un aspecto, la invención se relaciona con el uso de una célula de levadura de acuerdo con la invención para la preparación de un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste de etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrilico, 1 , 3-propandiol , butanoles y productos derivados de isoprenoides .

En otro aspecto, la invención se relaciona con un proceso para producir un producto de fermentación seleccionado del grupo que consiste de etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrilico, 1 , 3-propandiol, butanoles (1-butanol, 2-butanol, isobutanol) y productos derivados de isoprenoides . El proceso comprende preferentemente los pasos de: a) fermentar un medio con una célula de levadura, donde el medio contiene o es alimentado con: a) una fuente de al menos una entre una hexosa y una pentosa; b) una fuente de ácido acético; y c) una fuente de glicerol y de esa manera la célula de levadura fermenta ácido acético, glicerol y al menos una entre hexosa y pentosa en etanol. La célula de levadura preferentemente es una célula (huésped) definida previamente en la presente. El proceso comprende preferentemente un paso adicional en el cual se recupera el producto de fermentación. El proceso puede ser un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentado o un proceso continuo, que son bien conocidos en el arte. En el proceso de la invención, la fuente de glicerol puede ser cualquier fuente de carbono de un estado más reducido que la glucosa. Una fuente de carbono de un estado más reducido que la glucosa se interpreta como una fuente de carbono cuyo estado promedio de reducción por mol de C (de los compuestos en la misma) es mayor que el estado de reducción por mol de C de glucosa. Los ejemplos de fuente de carbonos de un estado más reducido que la glucosa incluyen por ejemplo alcanoles tales como propanol y butanol; polioles tales como 1,3-propandiol, butandiol, glicerol, manitol y xilitol.

En un proceso preferido la fuente de hexosa comprende o consiste de glucosa. Preferiblemente la fuente de pentosa comprende o consiste de al menos una entre xilosa y arabinosa. Preferentemente, el medio fermentado por las células de la invención comprende o es alimentado con (fracciones de) biomasa hidrolizada que comprende al menos una entre una hexosa y una pentosa, tal como glucosa, xilosa y/o arabinosa. Las (fracciones de) biomasas hidrolizadas que comprenden las hexosas y pentosa habitualmente también comprenderán ácido acético (o una sal del mismo) . Un ejemplo de biomasa hidrolizada que se podrá fermentar en los procesos de la invención es por ejemplo una biomasa lignocelulósica hidrolizada. La biomasa lignocelulósica se interpreta en la presente como una biomasa vegetal compuesta por celulosa, hemicelulosa y lignina. Los polímeros de carbohidratos (celulosa y hemicelulosas ) están fuertemente unidos a la lignina. Los ejemplos de biomasa lignocelulósica que se puede hidrolizar para su uso en la presente invención incluyen residuos de la agricultura (incluyendo, residuos de maíz y bagazo de caña de azúcar) , residuos leñosos (incluyendo descartes de papeleras y aserraderos y desechos de papeles (municipales) . Los métodos de hidrólisis de una biomasa, tal como lignocelulosas, son conocidos en el arte per se e incluyen por ejemplo ácidos, tal como ácido sulfúrico, y enzimas, tales como celulasas y hemicelulasas .

En el proceso de la invención, las fuentes de xilosa, glucosa y arabinosa pueden ser xilosa, glucosa y arabinosa como tales (es decir, como azúcares monoméricos) o se pueden encontrar en la forma de cualquier carbohidrato, oligómero o polímero, que comprenda unidades de xilosa, glucosa y/o arabinosa, tal como por ejemplo lignocelulosa, arabinanos, xilanos, celulosa, almidón y semejantes. Para liberar las unidades de xilosa, glucosa y/o arabinosa de dichos carbohidratos, se pueden agregar carbohidrasas apropiadas (tales como arabinasas, xilanasas, glucanasas, amilasas, celulasas, glucanasas y semejantes) al medio de fermentación o se pueden producir en la célula huésped modificada. En este último caso, la célula huésped modificada se puede manipular genéticamente para producir y excretar tales carbohidrasas. Una ventaja adicional de usar fuentes de glucosa oligo- o poliméricas es que permite mantener una concentración baja o más baja de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo usando cantidades limitantes de la velocidad de las carbohidrasas, preferentemente durante la fermentación. Esto impedirá, a su vez, la represión de los sistemas requeridos para el metabolismo y transporte de azúcares distintos de glucosa, tales como xilosa y arabinosa. En un proceso preferido, la célula huésped modificada fermenta tanto la xilosa como la glucosa, y el menos una entre xilosa y arabinosa, preferentemente en forma simultánea en cuyo caso preferentemente se usa una célula huésped modificada que no es sensible a la represión por glucosa para prevenir el crecimiento diáuxico. Además de una fuente de al menos una entre xilosa y arabinosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además los ingredientes apropiados necesarios para el crecimiento de la célula huésped modificada. Las composiciones de medios de fermentación para el crecimiento de microorganismos eucariotas, tales como levaduras, son bien conocidas en el arte .

En el proceso de la invención, el medio preferiblemente comprende además y/o es alimentado con una fuente de glicerol. El glicerol de utilidad en el proceso de la presente invención ventajosamente puede ser glicerol generado como un producto secundario de la producción de biodiesel a partir de reacciones de transesterificación usando aceites vegetales o grasas animales y un alcohol.

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se corre en ausencia de oxigeno o en donde sustancialmente no se consume oxigeno, o preferentemente se consume menos de 5, 2,5 ó 1 mmol/l/h, más preferentemente 0 mmol/l/h (o sea el consumo de oxigeno no es detectable) , y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones. En ausencia de oxigeno, el NADH que se produce en la glicólisis y la formación de biomasa, no se puede oxidar mediante la fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno requiriendo por lo tanto NAD+. Por consiguiente, en un proceso preferido de fermentación anaeróbica se usa piruvato como electrón (y aceptor de hidrógeno) y es reducido en productos de fermentación tal como etanol, asi como productos de fermentación distintos de etanol, tal como ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrilico, 1, 3-propandiol, butanoles (1-butanol, 2-butanol, isobutanol) , productos derivados de isoprenoides . Los procesos anaeróbicos de la invención se prefieren ante los procesos aerobicos porque los procesos anaeróbicos no necesitan inversiones y energía para la aireación y además, los procesos anaeróbicos producen mayores rendimientos de producto que los procesos aerobicos.

Como alternativa, el proceso de fermentación de la invención se puede correr bajo condiciones aeróbicas de oxigeno limitado. Preferentemente, en un proceso aeróbico bajo condiciones de oxigeno limitado, el índice de consumo de oxígeno es de al menos 5,5, más preferentemente al menos 6 y aún más preferentemente de al menos 7 mmol/l/h. En un proceso de fermentación de oxígeno limitado aeróbico preferido de la invención, la célula de levadura de la invención consume menos que un 30, 20, 18, 15, 12, 10, 8 ó 5% de la cantidad de oxígeno sobre una base de C-molar relacionado con la fuente de carbono consumido durante la conversión de la fuente de carbono en el producto de fermentación. El coeficiente de conversión de oxígeno consumido sobre sustrato utilizado sobre una base de C-molar (COS) se interpreta en la presente como los moles de 02 usado por mol de C de la fuente de carbono consumido. Por consiguiente, el proceso de la invención se puede llevar a cabo bajo condiciones anaeróbicas estrictas (es decir COS = 0,0) o el proceso de la invención se puede llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas, preferiblemente de oxígeno limitado, en donde el COS preferiblemente es menor que 0,3, 0,2, 0,18, 0,15, 0,12, 0,1, 0,08 ó 0,05.

El proceso de fermentación se corre preferentemente a una temperatura que es óptima para las células modificadas de la invención. Por lo tanto, para la mayoría de las células de levadura, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es menor que 42oC, preferentemente menos de 38oC. En el caso de las células de levadura, el proceso de fermentación preferentemente tiene lugar a una temperatura que es menor que 35, 33, 30 ó 28°C y a una temperatura que es mayor que 20, 22 ó 25°C.

Un proceso de fermentación preferido de acuerdo con la invención es un proceso para la producción de etanol, con lo cual el proceso comprende el paso de fermentar un medio con una célula de levadura, con lo cual el medio contiene o es alimentado con: a) una fuente de al menos una entre una hexosa y una pentosa; b) una fuente de ácido acético; y, c) una fuente de glicerol, con lo cual la célula de levadura fermenta ácido acético, glicerol y al menos una entre una hexosa y pentosa en etanol, y opcionalmente, b) recuperación del etanol. El medio de fermentación puede efectuarse además como se describió previamente. En el proceso, la productividad volumétrica de etanol preferentemente es de al menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ó 10,0 g de etanol por litro por hora. El rendimiento de etanol con xilosa y/o glucosa y/o arabinosa y/o acetato y/o glicerol en el proceso es preferentemente de al menos un 50, 60, 70, 80, 90, 95 ó 98%. El rendimiento de etanol se define en la presente como un porcentaje del rendimiento teórico máximo, que en el caso de xilosa, glucosa y arabinosa es de 0,51 g de etanol por g de xilosa, glucosa o arabinosa. Para el glicerol, el rendimiento teórico máximo es 0,50 g de etanol por g de glicerol y para el ácido acético el rendimiento teórico máximo es de 0,77 g de etanol por g de ácido acético.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en un sentido no limitativo para indicar que los Items que le siguen a la palabra están incluidos, pero no se excluyen los ítems que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento con el determinativo indefinido "un" o "uno/a" no excluye la posibilidad de que haya presente más de un elemento, a menos que en el contexto se indique claramente la presencia de uno y tan solo uno de los elementos. Por consiguiente, el determinativo indefinido "un" o "uno/a" usualmente denota "al menos uno" .

Todas las referencias a patentes y de la literatura citadas en la presente memoria descriptiva, se incorporan por completo en la presente a modo de referencia.

Los siguientes ejemplos se proveen para propósitos ilustrativos solamente y no tienen en absoluto la intención de limitar el alcance de la invención.

E emplo 1. Ensayos de actividad enzimática Se prepararon extractos celulares para ensayos de actividad a partir de cultivos de lotes aeróbicos o anaeróbicos de crecimiento exponencial y se analizaron por su contenido de proteínas como se describe en Abbot et al., (2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2320-2325) .

Se midió la actividad acetaldehído deshidrogenase dependiente de NAD+ (EC 1.2.1.10) a 30 °C por monitoreo de la oxidación de NADH a 340 nm. La mezcla de reacción (volumen total 1 mi) contenía solución amortiguadora de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,5), NADH 0,15 mM y extracto celular. La reacción comenzó con la adición de acetil-Coenzima A 0,5 mM.

Para la determinación de la actividad glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.8), los extractos celulares se prepararon como se describió previamente excepto que se reemplazó la solución amortiguadora de fosfato por solución amortiguadora de trietanolamina (10 mM, pH 5). Las actividades glicerol-3-fosfato deshidrogenasa se evaluaron en extractos celulares a 30 °C como se describió con anterioridad (Blomberg y Adler, 1989, J. Bacteriol. 171: 1087-1092.9). Las velocidades de reacción eran proporcionales a las cantidades de extracto celular agregadas.

La actividad acetil-CoA sintasa (EC 6.2.1.1) se midió como describen Frenkel y Kitchens (1977, J. Biol. Chem. 252: 504-507) que es una modificación del método de Webster (Webster, 1969, ethods Enzymol., 13: 375-381). La formación de NADH medida es espectrofotométrica cuando la acetil-CoA producida está acoplada con reacciones con citrato sintasa y malato deshidrogenasa . El sistema de ensayo contenía Tris-Cl 100 mM (pH 7,6), MgC12 10 mM, ATP 6 m , malato 5 mM, NAD+ 1 mM, NADH 0,1 mM, ditiotreitol o 2 -mercaptoetanol 2,5 mM, coenzima A 0,2 mM, 25 µ? de citrato sintasa (80 unidades/mg) , 20 µ? de malato deshidrogenasa (1000 unidades/mg) y acetato 10 mM y la velocidad de reacción se midió se midió a 340 nm y se calculó a partir del coeficiente de extinción de NADH (6, 22 x 106 cm2/mol) .

La actividad de la glicerol deshidrogenasa y de la dihidroxiacetona quinasa se midieron a 30 °C en extractos celulares, esencialmente como se describió con anterioridad (González et al., 2008, Metab. Eng. 10, 234-245). Las actividades enzimáticas de la glicerol deshidrogenasa y de la dihidroxiacetona quinasa se informan como moles de sustrato/min/mg de proteína celular.

Ejemplo 2. Construcción de la cepa Todas las modificaciones comienzan con la cepa fermentadora de xilosa y arabinosa RN1008 his-.

RN1008 his-, también se denomina RN1041 en la presente, es una cepa fermentadora de arabinosa y xilosa basada en CEN.PK) con el siguiente genotipo: Mat a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-Ptpi: :TAL1, loxP-Ptpi : : RKI1, loxP-Ptpi-TKLl , loxP-Ptpi-RPEl, delta: :-LEU2, delta :: PadhlXKSlTcycl-URA3-Ptpi-xylA-Tcycl, delta: :LEU2-AAAaraABD.

Mat a = tipo de apareamiento a ura3-52, leu2-112, his3::loxP son mutaciones en los genes ura3, leu2 y his3, ura3 está complementado por la construcción de sobreexpresión xylA-XKS, leu2 está complementado por la construcción de sobreexpresión AraABD. his3 se podría usar para la selección de plásmidos adicionales, RN1041 necesita histidina en el medio para su crecimiento. gre3::loxP = supresión del gen gre3 que codifica la xilosa reductasa, el sitio loxP queda después de la eliminación del marcador. loxP-Ptpi = sobreexpresión de la via het pentosa fosfato, el sitio loxP 5' con respecto al promotor constitutivo queda después de la eliminación del marcador delta: := integración de la construcción después de la recombinación sobre las repeticiones terminales largas del retrotransposón Tyl .

AAAaraABD = genes araA, araB y araD de Arthrobacter aurescens de codones optimizados (véase WO2009/011591 ) Construcciones de supresión para GPD1 y GPD2 La supresión de GPD1 en RN1041 produce la cepa RN1197. La supresión de GPD2 en RN1041 produce la cepa RN1198. En esta cepa se suprime después gpdl para producir la cepa RN1199. En estas cepas se introdujeron plásmidos para la sobreexpresión de los genes ACS (RN1200 en RN1207, Tabla 4) y otros genes como se muestra en la Tabla 4. gpdl : : hphMX Se utilizan los cebadores gpdluf, gpdlur, gpdldf y gpdldr para la amplificación de fragmentos de secuencias genómicas 5' y 3' con respecto al gen GPD1 para su inactivación. Ambos fragmentos GPDl 5' y 3' se clonan en un vector Topo Blunt (Invitrogen) para obtener pGPDlup y pGPDldown, respectivamente. gpdluf: AAGCTTGGTACCCGCCTTGCTTCTCTCCCC (SEQ ID N°:41) gpdlur: TCTAGACCAGCATTCAAGTGGCCGGA (SEQ ID N°: 42) gpdldf: CGTACGAGTTGTTGAATGGCCAATCCGCT (SEQ ID N°: 43) gpdldr: CCATGGTACCGAGTGGTGTTGTAACCACCCT (SEQ ID N°: 44) gpdlcf: ACCAATACGTAAACGGGGCG (SEQ ID N° : 45) gpdlcr: AATACACCCATACATACGGACGC (SEQ ID N°: 46) El plásmido pRN593 (SEQ ID N° : 40) se construye por ligación del fragmento recortado con HindIII y Xbal del pGPDlup con el fragmento hphMX recortado con Spel y BsrGI (colección de plásmidos de C5 Yeast Company) y el fragmento recortado con BsiWI y Ncol del pGPDldown en el vector Topo T/A recortado con HindIII y Ncol ( Invitrogen) . El plásmido pRN593 se recorta con Kpnl para obtener un fragmento de supresión para interrumpir la copia genómica (SEQ ID N°: 17). La mezcla de fragmentos lineales se usa para la transformación de levadura. Los transformantes se seleccionan por su resistencia a higromicina. Una integración correcta da como resultado la supresión del marco de lectura abierto GPD1. La integración se verifica por PCR con los cebadores gpdlcf y gpdlcr. gpd2 : : natMX Se utilizan los cebadores GPD2uf, GPD2ur, GPD2df y GPD2dr para la amplificación de fragmentos de secuencias genómicas 5' y 3' con respecto al gen GPD2 para su inactivación. Se amplifica un fragmento de PCR 5' de 407 bp con un sitio AflII por el extremo 3' (derivado de la secuencia GPD2) y un sitio BglII por el extremo 5' (para aislar la construcción de supresión) usando GPD2uf, GPD2ur y se clona en el pCR2.1 (Topo T/A, Invitrogen).

GPD2uf: GGTACCAGATCTTTTGCGGCGAGGTGCCG (SEQ ID N°: 32) GPD2ur: TCTAGACTTAAGGAATGTGTATCTTGTTAATCTTCTGACAGC (SEQ ID N°: 33) Se amplifica un fragmento de PCR 3' de 417 bp con un sitio Xhol por el extremo 5' y un sitio BglII por el extremo 3' usando GPD2df y GPD2dr.

GPD2df: CTCGAGATAGTCTACAACAACGTCCGCA (SEQ ID N°: 34) GPD2dr: CCATGGAGATCTGCAGTGAAAAAGCTCGAAGAAACAGCT (SEQ ID N°: 35) Para la construcción final, se recorta el plásmido que contiene al fragmento 5' con AflII y Kpn, el fragmento 3' se recorta con Xhol en Ncol y el marcador natMX (colección de plásmidos Royal Nedalco) se recorta con AflII en Xhol y los fragmentos se ligan entre si para producir el plásmido pRN594 (SEQ ID N°: 36). El pRN594 se recorta con BglII antes de la transformación de la levadura. Los transformantes se seleccionan por su resistencia a nourseotricina . La integración correcta se verifica por PCR.

Método de clonación para la sobreexpresión de los genes ACS1 y ACS2 de Saccharomyces cerevisiae El marco de lectura abierto de ACS1 se amplifica por PCR con los cebadores acslf y acslr. acslf: TTAAGCTTAAAATGTCGCCCTCTGCCGT (SEQ ID N°: 47) acslr: AAGCGCGCTACAACTTGACCGAATCAATTAGATGTCTAACAATGCCAGGG (SEQ ID N°: 48) Este fragmento de PCR se recorta con las enzimas de restricción HindIII y BssHII y se liga con el fragmento del promotor TEF1 recortado con Salí y HindIII (colección de C5 Yeast Company) y el fragmento terminador de ADHl recortado con BssHII y BsiWI (colección de C5 Yeast Company) . Este fragmento combinado es sometido a PCR con los cebadores específicos del promotor y del terminador y se clona en el vector Topo Blunt (Invitrogen) para dar el pACSl.

El marco de lectura abierto de ACS2 se amplifica por PCR con los cebadores acs2f y acs2r. acs2f : AACTGCAGAAAATGACAATCAAGGAACA AAAGTAGTTTATGAAGCTCA (SEQ ID N°: 49) acs2r: ACGTCGACTATTTCTTTTTTTGAGAGAAAAATTGGTTCTCTACAGCAGA (SEQ ID N° : 50) Este fragmento de PCR se recorta con las enzimas de restricción PstI y Salí y se liga con el fragmento del promotor PGKl recortado con Spel y PstI (colección de C5 Yeast Company) y el fragmento terminador de PGI1 recortado con Xhol y Bsi I (colección de C5 Yeast Company) . Este fragmento combinado es sometido a PCR con los cebadores específicos del promotor y del terminador y se clona en el vector Topo Blunt (Invitrogen) para dar el plásmido pACS2.

La construcción de sobreexpresión ACS1 se recorta del pACSl con las enzimas de restricción Salí y BsiWI, la construcción de sobreexpresión ACS2 se recorta del pACS2 con las enzimas de restricción Spel y BsiWI, el marcador KanMX se recorta con BspEI y Xbal (colección de plásmidos de C5 Yeast Company) . Estos fragmentos se ligan al plásmido pRS306 + 2mu ORI (colección de plásmidos de C5 Yeast Company) recortado con BspEI y Xhol para dar el plásmido final pRN753 (SEQ ID N°: 51). Este plásmido se usa para transformar las cepas de levadura según se indica en la Tabla 4 y los transformantes se seleccionan por resistencia a G418. La sobreexpresion se verifica por qPCR. Un plásmido alternativo que se puede usar para la sobreexpresion de ACSl y ACS 2 es el pRN500 (SEQ ID N°: 20) .

Expresión de adhE de E. coli, ADH2 de E. histolytica o mphF de E. coli La secuencia del promotor PGK1 (Spel-PstI) y la secuencia del terminador de ADHl (AflII-Notl) se agregan a los fragmentos sintéticos de codones optimizados y se clonan en el pRS303 con 2µ ori recortado con Spel y Notl y la construcción de expresión se clona en este vector. La expresión se verifica por qPRC. Las secuencias de codones optimizados para el mphF de E. coli (SEQ ID N°: 2), el adhE de E. coli (SEQ ID N°: 4) y el ADH2 de E. histolytica (SEQ ID N°: 6) son las que se indican en el listado de secuencias.

Para la expresión del gen mhpF de E. coli, se ligó un fragmento del promotor de PGK1 de levadura (Spel-PstI) y un fragmento del terminador de ADHl (AflII-Notl) (ambos de la colección de plásmidos de Nedalco) en el fragmento sintético de codones optimizados que codifica el mhpF de E. coli (SEQ ID N°: 2) . El pRS 303 con 2µ ori (= pRN347, colección de plásmidos de Royal Nedalco) se recortó con Spel y Notl y la construcción de expresión mhpF se clonó en este vector para producir el pRN558 (SEQ ID N° : 29) .

Para la expresión del gen adhE de E. coli, se recorta un fragmento sintético de codones optimizados que codifica al gen adhE de E. coli (SEQ ID N°: 4) con Xbal y AflII y se liga en el pRN558 recortado con Xbal y AflII (reemplaza al gen mhpF de E. coli en el pRN558) para producir el pRN595 (SEQ ID N°: 30) .

Para la expresión del gen adh2 de Entamoeba histolytica, se recorta un fragmento sintético de codones optimizados que codifica al gen adh2 de E. histolytica (SEQ ID N°: 6) con Xbal y AflII y se liga en el pRN558 recortado con Xbal y AflII (reemplaza al gen mhpF de E. coli en el pRN558) para producir el pRN596 (SEQ ID N° : 31).

El pRN595 se usa luego en la construcción de los plásmidos pRN957 y pRN977 (véase más adelante) . Queda claro que los plásmidos pRN558 y pRN596 se pueden usar de la misma manera, reemplazando asi la expresión del gen adhE de E. coli por el gen mhpF de E. coli o por el gen adh2 de E. histolytica, respectivamente .

Expresión del gldA de E. coli La construcción para la expresión en levadura de gldA de E. coli se realizó ligando un fragmento del promotor de ACTl de levadura (recortado con las enzimas de restricción Spel y PstI), un ORF sintético (SEQ ID N°: 21), que codifica el gldA de E. coli, (recortado con PstI y BssHII) y un fragmento del terminador de CYC1 de levadura (recortado con BssHII y BsiWI) juntos en el pCRII Blunt (Invitrogen) para obtener el pRNgldA (SEQ ID N° : 28) .

Sobreexpresión de DAKl Se conduce una PCR con el ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores que introducen un sitio Xbal 5' con respecto al ATG y un sitio Salí 3' con respecto al TAA para producir el fragmento de la SEQ ID N°: 22. Se liga un fragmento de ADN que comprende al promotor de TPIl de S. cerevisiae 5' con respecto al ORF DAKl y el fragmento de ADN que comprende al fragmento del terminador de PGI1 de S. cerevisiae se liga 3' con respecto al ORF DAKl para producir el pRNDAK (SEQ ID N°: 38).

Expresión del dhaK de C. freundii La construcción para la expresión en levadura del dhaK de Citrobacter freundii se realizó ligando el fragmento del promotor de TPIl de levadura (recortado con las enzimas de restricción Xhol y Xbal), un ORF sintético (SEQ ID N°: 26), que codifica al dhaK de C. freundii, (recortado con Xbal y Salí) y un fragmento del terminador de PGIl de levadura (recortado con Xhol y Bsi I) juntos en el pCRII Blunt (Invitrogen) para obtener el pRNdhaK (SEQ ID N°: 27).

Sobreexpresión de GUP1 Se conduce una PCR con el ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores que introducen un sitio HindIII 5' con respecto al ATG y un sitio BamHI 3' con respecto al TAA para producir el fragmento de la SEQ ID N°: 23. Se liga un fragmento de ADN que comprende al promotor de TDH3 de S. cerevisiae 5' con respecto al ORF GUP1 y el fragmento de ADN que comprende al fragmento del terminador de CYC1 de S. cerevisiae se liga 3' con respecto al ORF GUP1.

Sobreexpresión de FPS1 Se conduce una PCR con el ADN genómico de S. cerevisiae con cebadores que introducen un sitio Nsil 5' con respecto al ATG y un sitio BamHI 3' con respecto al TAA para producir el fragmento de la SEQ ID N°: 24. Se liga un fragmento de ADN que comprende al promotor de ADH1 (medio) de S. cerevisiae 5' con respecto al ORF FSPl y el fragmento de ADN que comprende al fragmento del terminador de CYC1 de S. cerevisiae se liga 3' con respecto al ORF FSPl.

Construcción del pRN347 y la cepa RN1151 de levadura El pRN347 se construye por clonación del origen de replicación 2D (que fue amplificado por PCR a partir del pYES2) en el pRS303 (con el gen HIS3 para la complementación) . RN1041 se transforma con el plásmido pRN347 para producir la cepa RN1151.

Cepas que expresan el gldA de E. coli y el dhaK de C. freundii o que sobreexpresa DAKl Para la construcción del pRN957, se recorta la construcción de expresión gldA de E. coli del plásmido pRNgldA con las enzimas de restricción Spel y BsiWI. La construcción de expresión dhaK de C. freundii se recorta del plásmido pRNdhaK con las enzimas de restricción BsiWI y Xhol. Estos fragmentos se ligan en el plásmido pRN595 recortado con las enzimas de restricción Spel y Salí para obtener el pRN957 (SEQ ID N°: 37).

Para la construcción del pRN977, se recorta la construcción de expresión gldA de E. coli del plásmido pRNgldA con las enzimas de restricción Spel y BsiWI. La construcción de expresión DAKl se recorta del plásmido pRNDAK con las enzimas de restricción BsiWI y Xhol. Estos fragmentos se ligan en el plásmido pRN595 recortado con las enzimas de restricción Spel y Salí para obtener el pRN977 (SEQ ID N° : 39).

Los plásmidos pRN957 y pRN977 se usan para transformar RN1041, RN1197, RN1198 y RN1199 para obtener las cepas de levadura como se muestra en la Tabla 4A y Tabla 4B.

Tabla 4A O Tabla 4B E emplo 3. Fermentaciones anóxicas en medio de peptona con extracto de levadura estéril con las cepas construidas en la presencia y ausencia de glicerol y/o ácido acético La prueba del principio de la reducción concomitante de ácido acético y oxidación de glicerol se obtuvo usando un medio que contiene 1% de extracto de levadura y 1% de peptona. Los experimentos se corrieron en un cultivo Chemostat (1 litro de volumen de trabajo) a D = 0,05 h-1 y el pH se mantuvo en 5,5 por adición automática de KOH o de H2S04. Se agregaron glucosa (50 g/1) y xilosa (50 g/1) como fuente de carbono y de energía al medio de peptona con extracto de levadura. Para demostrar con estos experimentos la prueba del principio, no se incluyó arabinosa. Cuando fuera necesario, se agregó ácido acético al medio de peptona con extracto de levadura a 4 g/1 y glicerol a 10 g/1. La temperatura se mantuvo a 32 °C.

Los precultivos de las cepas se preparan por inoculación de un cultivo madre de glicerol congelado de la levadura en un medio YP (extracto de levadura a 1% p/v y peptona a 1% p/v) con adición de cada uno de los azúcares glucosa y xilosa (cada uno a 1% p/v) a 32 °C y pH 5,5. Después de 24 hs de incubación bajo condiciones óxicas en frascos de agitación, se usaron 50 mi de este cultivo para inocular los cultivos Chemostat.

En el estado estacionario de las fermentaciones (5 cambios de volúmenes) , se tomó una muestra para efectuar un análisis del consumo de azúcares (glucosa y xilosa) , del consumo de ácido acético y de metabolitos (etanol y glicerol) . Las concentraciones de etanol, glicerol y ácido acético se monitorean mediante análisis de HPLC Para determinar el consumo de azúcares, la glucosa y la xilosa se determinan mediante análisis de HPAEC (Dionex) .

La cepa RN1151 no puede alcanzar una situación estado estacionario en el medio que contiene ácido acético 4 g/1 y tampoco en la presencia o ausencia de glicerol. Si no se agrega ácido acético al medio, el organismo en estado estacionario consumía toda la glucosa y xilosa (menos de 1 g/1 remanente) . No se consumió glicerol, sino que en su lugar era producido.

Las cepas RN1200 y RN1201 fueron evaluadas de manera similar sobre un medio con ácido acético y ya sea con o sin adición de glicerol. Estas cepas se comportan de manera claramente diferente de la cepa RN1151. En el medio que contiene glicerol, los azúcares glucosa y xilosa son consumidos casi por completo (menos que 1 g/1 remanente) . Los niveles de ácido acético disminuyen hasta 0,5 g/1 y las concentraciones de glicerol al final de la fermentación es de 3 g/1 en los tres casos. Las cantidades de etanol producidas por las cepas RN1200 y RN1201 variaron en un rango de entre 43 y 47 g/1 en varios experimentos. En el medio que no contiene glicerol, pero que contiene 4 g/1 de ácido acético, no se logró un estado estacionario estable. Las cepas no pueden crecer bajo estas condiciones. A partir de estos resultados se concluye que la expresión de los genes gldA y adhE de E. coli en combinación con la sobrerregulación de DAK1 o la expresión de dhaK de C. freundii, tiene un profundo efecto sobre el rendimiento de las cepas. En la presencia de glicerol, pueden consumir glicerol y ácido acético.

Las cepas RN1202 a RN1207 son similares a las cepas RN1200 y RN1201 excepto por el hecho que se han suprimido los genes GPD1 y/o GPD2. En el medio que contiene 4 g/1 de ácido acético, los azúcares glucosa y xilosa son consumidos casi por completo (menos que 1 g/1 remanente) si se agrega glicerol al medio como es el caso para las cepas RN1200 y RN1201. Si no se agrega glicerol, no se logra un estado estacionario .

E emplo 4. Fermentaciones anóxicas con las cepas construidas en ácido acético que comprende hidrolizados lignocelulósicos en la presencia o ausencia de glicerol El hidrolizado de fibras de maíz contiene: glucosa (38 g/1) , xilosa (28 g/1) , arabinosa (12 g/1) y ácido acético (4 g/1) . Se preparó tratando fibras de maíz a 160 C y a pH 3,0 durante 20 minutos, seguido por hidrólisis enzimática con celulasas y hemicelulasas . Se agregó ácido acético a este hidrolizado dando como resultado una concentración total de ácido acético en el hidrolizado de 10 g/1. El pH de este hidrolizado enriquecido en ácido acético se restableció en pH = 4,5 por adición de KOH. Se agregó extracto de levadura a este hidrolizado para alcanzar una concentración final de 5 g/1. Este hidrolizado enriquecido se empleó en todos los experimentos subsiguientes. Durante las fermentaciones el pH se mantuvo en 6,5 por adición automática de KOH o de H2S0 .

Los precultivos de las cepas se preparan por inoculación de un cultivo madre de glicerol congelado de la levadura en un medio YP (extracto de levadura a 1% p/v y peptona a 1% p/v) con adición de cada uno de los azúcares glucosa, xilosa y arabinosa (cada uno a 1% p/v) a 32 °C y pH 5,5. Después de 24 hs de incubación bajo condiciones óxicas en frascos de agitación, se usaron 50 mi de este cultivo para inocular los cultivos del fermentador . Las fermentaciones se realizan en una instalación de fermentación por lotes alimentado. El hidrolizado (ya sea con o sin adición de glicerol a 50 g/1) es bombeado en el termentador. Si no se agregaba glicerol, entonces se agregaban 40 mi de agua. Durante las primeras 6 horas, la velocidad de flujo para el hidrolizado se define a una velocidad de 5 mi por hora. Durante las siguientes 6 horas, la velocidad de flujo se define en 10 mi por hora. A continuación, la velocidad de flujo se define en 20 mi por hora durante otras 43 horas. El volumen total al final de la fermentación alcanza los 1000 mi. Estas fermentaciones anóxicas de lotes alimentados se conducen a un pH = 4,5 aproximadamente con agitación suave a 100 rpm. La temperatura durante las fermentaciones se definió en 32 °C. Para minimizar la infección, los hidrolizados se calientan durante 10 min a 105 °C antes de las fermentaciones y se agrega el antibiótico kanamicina a una concentración final de 50 \iq/ml.

Al final de las fermentaciones después de 55 hs, se tomó una muestra para efectuar un análisis del consumo de azúcares (glucosa, xilosa y arabinosa) , del consumo de ácido acético y de metabolitos (etanol y glicerol) . Las concentraciones de etanol, glicerol y ácido acético en el tiempo se monitorean mediante análisis de HPLC. Para determinar el consumo de azúcares, la glucosa, la xilosa y la arabinosa se determinan mediante análisis de HPAEC (Dionex) .

La cepa RN1151 (= RN1041 complementada con HIS3) es evaluada sobre un hidrolizado ya sea con o sin adición de glicerol. En ambos casos, la concentración de glucosa al final de la corrida de fermentación (55 hs) es de 35 g/1 en tanto la xilosa y la arabinosa permanecen a sus concentraciones iniciales de 28 y 12 g/1, respectivamente. Las cantidades de etanol producidas son de 2 g/1 y el ácido acético está presente a 9,5 g/1. No se detecta consumo de glicerol en el hidrolizado que contiene glicerol. La fermentación de los azúcares se detiene durante el transcurso de la operación de lotes alimentado debido a los niveles crecientes de ácido acético. Inicialmente, no hay ácido acético en el termentador, pero mientras se bombea el hidrolizado que contenia niveles tóxicos de ácido acético, la concentración rápidamente alcanza niveles tóxicos.

Las cepas RN1200 y RN1201 se evalúan de manera similar sobre un hidrolizado ya sea con o sin adición de glicerol. Estas cepas se comportan de manera claramente diferente de la cepa RN1151. En el hidrolizado que contiene glicerol, los azúcares, glucosa, xilosa y arabinosa, son consumidos por completo. Los niveles de ácido acético disminuyen hasta 2 g/1 y las concentraciones de glicerol al final de la fermentación es de 29,5 g/1 en los tres casos. Las cantidades de etanol producidas por las cepas RN1200 y RN1201 son de 51,7 y 52,2 g/1, respectivamente. En el hidrolizado que no contiene glicerol, se consume considerablemente menos azúcar. Los niveles de xilosa y arabinosa permanecen sin cambios a 28 y 12 g/1, respectivamente. Hay consumo de glucosa pero hasta un grado limitado solamente. Al final de la fermentación, la concentración remanente es de 32 g/1 en los tres casos, donde el etanol alcanza una concentración de 3 g/1. La concentración de ácido acético cae a 9,1 g/1 al final de la fermentación, al tiempo que se produce algo de glicerol (menos que 0,5 g/1). A partir de estos resultados se concluye que la expresión de los genes gldA y adhE de E. coli en combinación con la sobrerregulacion de DAKl o la expresión de dhaK de C. freundii, tiene un profundo efecto sobre el rendimiento de las cepas. En la presencia de glicerol, pueden consumir glicerol y ácido acético y producir etanol adicional (en comparación con la cepa RN1151). En ausencia de glicerol, las cepas consumen algo de ácido acético. Pero durante la fermentación, el nivel de ácido acético aumenta a niveles tóxicos.

Las cepas RN1202 a RN1207 son similares a las cepas RN1200 y RN1201 excepto por el hecho que se han suprimido los genes GPD1 y/o GPD2. En el hidrolizado que contiene glicerol, los azúcares, glucosa, xilosa y arabinosa, son consumidos por complete, como era el caso de la cepa RN1200. Los niveles de ácido acético disminuyen de manera similar hasta aproximadamente 2 g/l y las concentraciones de glicerol al final de la fermentación es de 28 g/l en estos tres casos. Las cantidades de etanol producidas por las cepas RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 y RN1207 son de 51,6, 52.9, 52,1, 52,5, 53,1 y 52,3 g/l, respectivamente. En el hidrolizado que no contiene glicerol, se consume considerablemente menos azúcar. Los niveles de xilosa y arabinosa permanecen sin cambios a 28 y 12 g/l, respectivamente. Hay consumo de glucosa pero hasta un grado limitado solamente. Al final de la fermentación, la concentración remanente en el hidrolizado sin glicerol de glucosa es de 31 g/l, donde en los tres casos el etanol alcanza una concentración de 3 g/l. La concentración de ácido acético cae a 9,1 g/l al final de la fermentación, en tanto se produce algo de glicerol (menos que 0,5 g/l) . A partir de estos resultados, se puede concluir que la supresión de los genes GPDl y/o GPD2 junto con las demás modificaciones en RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 y RN1207 da como resultado cepas que permiten conducir las reacciones deseadas .

Materiales y métodos para los Ejemplos 5-8 Técnicas generales de biología molecular A menos que se indique lo contrario, los métodos utilizados son técnicas bioquímicas estándar. Los ejemplos de libros de texto adecuados sobre metodología general incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Medios Los medios usados en los experimentos era ya sea el medio YEP (10 g/1 de extracto de levadura, 20 g/1 de peptona) o medio sólido YNB (6,7 g/1 de base de nitrógeno de levadura, 15 g/1 de agar) , suplementado con azúcares como se indica en los ejemplos. Para el medio YEP sólido, se agregó agar 15 g/1 al medio líquido antes de la esterilización.

En los experimentos de AFM, se usó el medio de minerales. La composición del medio de minerales fue descrito por Verduyn et al., (Yeast (1992), Volumen 8, 501-517) y fue suplementado con 2,325 g/1 de urea y azúcares como se indica en los ejemplos.

Transformación de células de levadura La transformación de levadura se realizó de acuerdo con el método descrito por Schiestl y Gietz (Current Genetics (1989), Volumen 16, 339-346).

PCR de colonias Se extrajo ADN genómico de colonias de levadura individuales para la PCR de acuerdo con el método descrito por Lóoke et al., (BioTechniques (2011), Volumen 50, 325-328).

Procedimiento de AFM El Monitor de Fermentación de Alcoholes (AFM; Halotec, Veenendaal, Los Países Bajos) es un biorreactor paralelo de laboratorio robusto y amigable para el usuario que permite efectuar comparaciones precisas de velocidades y rendimientos de conversión de carbono de seis fermentaciones anaeróbicas simultáneas.

El cultivo inicial del experimento AFM contenía 50 mg de levadura (peso seco) . Para determinarlo, se obtuvo una curva de calibración para la cepa RN1041 de la biomasa versus la DO700. Esta curva de calibración se usó en el experimento para determinar el volumen de cultivo celular necesario para 50 mg de levadura (peso seco) .

Antes de comenzar el experimento de AFM, se hicieron crecer precultivos como se indica en los ejemplos. Para cada cepa se midió la DO700 y se inocularon 50 mg de levadura (peso seco) en 400 mi de Medio de minerales (Verduyn et al., (Yeast (1992), Volumen 8, 501-517), suplementado con 2,325 g/1 de urea y azúcares según se indica en los ejemplos.

Ensayo de actividad gliceroldeshidrogenasa El método de determinación del ensayo de actividad gliceroldeshidrogenasa fue adoptado de Lin y Magasanik (1960) J Biol Chem.235: 1820-1823.

Tabla 5: Condiciones de ensayo El extracto libre de células se preparó cosechando células por centrifugación. Las células se cosecharon en la fase exponencial. El pélet de células se lavó una vez con solución amortiguadora de carbonato/bicarbonato 1 M (pHIO) y se preparó un extracto libre de células en la misma por adición de esferas de vidrio y vortexeo a velocidad máxima por intervalos de 1 minuto hasta lograr la ruptura de las células. Esto último se verificó con microscopio.

Experimentos en frascos de agitación Los experimentos anaeróbicos en frascos de agitación se condujeron como se indica en los ejemplos. En los experimentos típicos se emplean frasco Erlenmeyer de 100 mi con 25 mi de medio. Para asegurar las condiciones anaeróbicas, el frasco se cerró con un cierre hidráulico.

Para cada tiempo, se inoculó un frasco de agitación separado, omitiendo de esa manera la aireación durante la toma de muestras.

Cepas La cepa parental usada en los experimentos descritos en los ejemplos 5 a 8 es RN1041.

La cepa RN1041 fue descrita en WO 2012067510 y tiene el siguiente genotipo: MAT a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-pTPIl: :TAL1, loxP-pTPIl : : RKI1, loxP-pTPIl-TKLl , loxP-pTPIl-RPEl, delta: :pADHl-XKSl-tCYCl-LEU2, delta :: URA3-pTPIl-xylA-tCYCl MAT a = tipo de apareamiento a ura3-52, leu2-112, HIS3::loxP son las mutaciones en los genes URA3, LEU2 y HIS3, respectivamente. La mutación ura3-52 es complementada por el gen ÜRA3 en la construcción de sobreexpresión xylA; la mutación leu2-112 es complementada por el gen LEU2 en la construcción de sobreexpresión XKSl. La supresión del gen HIS3 causea auxotrofia de histidina. Por esta razón, la cepa RN1041 necesita histidina en el medio para su crecimiento. gre3::loxP es una supresión del gen GRE3, que codifica aldosa reductasa. El sitio loxP quedó en el genoma después de remover el marcador. loxP-pTPIl indica la sobreexpresión, en los experimentos que se describen en la presente, de los genes de la via de pentosas fosfato no oxidativa por reemplazo del promotor nativo por el promotor del gen TPI1. El sitio loxP 5' con respecto al promotor fuerte, constitutivo TPI1 permanece en el genoma después de remover el marcador (Kuyper et al, FEMS Yeast Research 5 (2005) 925-934) . delta:: significa integración cromosómica de la construcción después de la recombinación sobre las repeticiones terminales largas del retrotransposon Tyl.

Ejemplo 5. Construcción de las cepas Tabla 6. Cepas construidas La supresión del gen GPD1 (gpdl) y/o del gen GPD2 (gpd2) se efectuó como se describió en el Ejemplo 2.

Las cepas RN1041, RN1067, RN1068 y RN1069 fueron transformadas con el plásmido pRN977. Este plásmido contiene las siguientes características: el gen HIS3 para la selección de los transformantes, el origen de replicación 2µ, el marcador de resistencia a ampicilina para la selección en E. coli, el gen adhE de E. coli bajo el control del promotor PGK1 y el terminador ADH1, el gen DAK1 de S. cerevisiae bajo el control del promotor TPI1 y el terminador PGI1 y el gen gldA de E. coli, bajo el control del promotor ACT1 y el terminador CYC1. Todos los promotores y terminadores son de S. cerevisiae. La secuencia del plásmido pRN977 se muestra en la SEQ ID N°: 39.

Después de la transformación de las cepas RN1041, RN1067, RN1068 y RN1069, se tomaron formas aisladas de colonias individuales para efectuar un análisis por PCR de las colonias a fin de verificar la presencia del plásmido pRN977. Se seleccionó una colonia representativa de cada transformación para experimentos posteriores. Estas cepas seleccionadas se denominan RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189.

De manera similar, se generaron transformantes según las siguientes especificaciones: Tabla 7. Transformantes El plásmido pRN957 es similar al pRN977; sin embargo, el gen DAK1 de S. cerevisiae fue reemplazado por el gen dhaK de Citrobacter freundii. La secuencia de este plásmido, pRN957, se muestra en la SEQ ID N°: 37.

Como cepa control, se transformó la cepa RN1041 con el plásmido pRN595 (RN1041+pRN595 ) . Este plásmido, pRN595, es similar al pRN977; sin embargo, no contiene a los genes gldA y DAK1. La secuencia del plásmido pRN595 se muestra en la SEQ ID N°: 30.

Ejemplo 6. Experimentos en frascos de agitación Se evaluó el rendimiento de las cepas construidas en un experimento en frasco de agitación anaeróbico. Para ello, las células se hicieron crecer previamente en el medio de minerales (Verduyn) suplementado con glucosa como fuente de carbono. Los cultivos se incubaron durante la noche en un agitador rotatorio a 280 rpm y 30°C.

Se tomó una alícuota de las células de los cultivos de la noche para la inoculación de los cultivos anaeróbicos. La cantidad de células era tal que el cultivo anaeróbico tenía una densidad óptica inicial a 600 nm de aproximadamente 0,1.

La composición de carbono del medio de minerales era: 2,5% de glucosa, 2,5% de xilosa, 1% de glicerol y 2 g/l de HAc. El valor del pH se ajustó en pH 4,5. Los frascos de agitación se cerraron con un cierre hidráulico con el fin de asegurar las condiciones anaeróbicas. Se inoculó un frasco separado para cada tiempo.

Los resultados del aumento o de la disminución de glicerol neto, después de 94 horas de fermentación, y del consumo de HAc, se indican en la siguiente tabla.

Tabla 8: Valores de consumo de glicerol y HAc y producción de etanol por cada cepa La cepa indicada en la tabla 8 como RN1041 fue transformada con el plásmido pRS323, un vector de clonación estándar que contiene al gen HIS3 y un origen de replicacion 2µ, complementando de esta manera la auxotrofia de histidina.

Los resultados muestran que: - RN1041 produce glicerol, lo cual tiene sentido dado que ambos genes GPD1 y GPD2 son activos y que no hay sobreexpresión de gldA y DAK1. Dado que adhE no está sobreexpresado en esta cepa, el consumo de HAc es bajo.

- Las cepas RN1186 a RN1189 muestran consumo de glicerol y HAc, lo cual da como resultado un aumento en el título de etanol en comparación con la cepa RN1041.

- Los experimentos con los transformantes RN1190, RN1191 y RN1193 muestran los mismos resultados, es decir, consumo de glicerol y acetato, no obstante en un grado ligeramente menor. Aquí también el título de etanol era mayor en comparación con la cepa RN1041. El resultado de la cepa RN1192 es un artefacto, ya que una caracterización posterior de esta cepa mostró que había perdido su plásmido pRN957.

La sobreexpresión de ya sea una dihidroxiacetona quinasa homologa o heteróloga, en combinación con la sobreexpresión de gldA y adhE, da como resultado un consumo simultáneo de acetato y glicerol bajo condiciones anaeróbicas .

E emplo 7. Experimentos con el AFM Se repitió el experimento descrito en el Ejemplo 6 con una configuración ligeramente diferente, es decir, el AFM (Monitor de Fermentación Alcohólica) , que permite la determinación en línea de dióxido de carbono, durante el experimento .

Las cepas evaluadas fueron RN1041, RN1041+pRN595 , RN1186, RN1187, RN1188 y RN1189. La cepa RN1041 fue transformada con el plásmido pRS323, un vector de clonación estándar que contiene al gen HIS3 y un origen de replicación 2µ, complementando de esta manera la auxotrofia de histidina.

Las cepas fueron precultivadas durante la noche en el medio de minerales con 2% de glucosa como fuente de carbono, en un agitador rotatorio a 280 rpm y 30°C.

Las células se cosecharon y se inició el experimento con el AFM como se describió previamente.

Se tomaron muestran a intervalos regulares y se determinaron los azúcares, etanol, glicerol y HAc por HPLC. Los resultados se indican en la siguiente tabla.

Tabla 9: Valores de consumo de glicerol y HAc y producción de etanol por cada cepa en el tiempo = 112 horas.

La evolución de los niveles de glicerol y HAc en el tiempo se muestra en las Figuras 1 y 2.

Las cepas RN1041 y RN1041+pRN595 muestran producción de glicerol neto. Inicialmente, las cepas RN1186 y RN1188 muestran producción de glicerol; sin embargo, después de aproximadamente 24 a 32 horas, comenzó el consumo de glicerol y continuó hasta que al final se observó consumo de glicerol neto .

Las cepas RN1187 y RN1189 no muestran una producción inicial de glicerol, como se observó con las cepas RN1186 y RN1188. Después de 24 horas, comienza el consumo de glicerol. El consumo de glicerol es significativamente mayor en estas cepas en comparación con las cepas RN1186 y RN1188. Estos resultados indican que la supresión del gen GPD1 da como resultado un mayor consumo de glicerol que la supresión del gen GPD2.

La cepa RN1041+pRN595 muestra un mayor consumo de HAc que la cepa de referencia RN1041. Las cepas RN1186 y RN1188 muestran un mayor consumo de HAc que las cepas RN1041+pRN595. Este resultado indicaba que el consumo de glicerol aumentaba el consumo de HAc. Este efecto es más fuerte aún en las cepas RN1187 y RN1189.

Ejemplo 8. Ensayo de actividad gliceroldeshidrogenasa Se preparó un extracto libre de células (CFE) con las cepas RN1041 y RN1190 como se describió previamente. Se condujo un ensayo de actividad gliceroldeshidrogenasa, derivado del protocolo de Lin (1960) . Los resultados se indican en la siguiente tabla.

Tabla 10. Ensayo de actividad gliceroldeshidrogenasa La cepa indicada en la tabla 10 como RN1041 fue transformada con el plásmido pRS323, un vector de clonación estándar que contiene al gen HIS3 y un origen de replicación 2µ, complementando de esta manera la auxotrofia de histidina.

Estos resultados indican que: a) el gen gldA de E. coli, expresado en la cepa RN1190, es dependiente de NAD+, y b) el incremento en la cantidad de CFE dio como resultado un aumento proporcional del índice de conversión de NAD+, y por ende de glicerol en dihidroxiacetona .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un proceso para producir etanol, CARACTERIZADO PORQUE el proceso comprende el paso de fermentar un medio con una célula de levadura, donde el medio contiene o es alimentado con: a) una fuente de al menos una entre una hexosa y una pentosa; b) una fuente de ácido acético; y, c) una fuente de glicerol, donde la célula de levadura fermenta ácido acético, glicerol y al menos una entre una hexosa y pentosa en etanol, y opcionalmente, recuperar el etanol, donde la célula de levadura comprende un gen exógeno que codifica una enzima con actividad acetaldehido deshidrogenasa, donde dicho gen confiere a la célula la capacidad para convertir ácido acético en etanol, y donde la célula de levadura comprende un gen bacteriano que codifica una enzima con actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+.

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE el gen exógeno que codifica la enzima con actividad acetaldehido deshidrogenasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos uno de: i) al menos un 64% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N° : 1, ii) al menos un 76% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N°: 3 y, iii) al menos un 61% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N°: 5; y, en donde el gen bacteriano que codifica una enzima con actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+ comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 45% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID N°: 7.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE la célula de levadura comprende una modificación genética que reduce la actividad especifica de la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ en la célula.

4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO PORQUE la modificación genética que reduce la actividad especifica de la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ en la célula es una modificación genética que reduce o inactiva la expresión de un gen endógeno que codifica una glicerolfosfato deshidrogenasa cuya secuencia de aminoácidos presenta al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 16.

5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE la célula de levadura comprende una modificación genética que aumenta la actividad especifica de la dihidroxiacetona quinasa, en donde la modificación genética es la sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidroxiacetona quinasa, y en donde, preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la dihidroxiacetona quinasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID N° : 8, 9 y 25.

6. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 - 5, CARACTERIZADO PORQUE la célula además comprende una modificación genética que aumenta al menos uno de : i) la actividad acetil-CoA sintetasa especifica, y en donde, preferiblemente, la modificación genética es la sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa; y, ii) el transporte de glicerol en la célula,

7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 6, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa codifica una acetil-CoA sintetasa con un mayor índice máximo que la acetil-CoA sintetasa codificada por el gen ACS1 de S. cerevisiae, o en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una acetil-CoA sintetasa codifica una acetil-CoA sintetasa con una mayor afinidad por acetato que la acetil-CoA sintetasa codificada por el gen ACS2 de S. cerevisiae, y en donde la modificación genética que aumenta el transporte de glicerol en la célula es la sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica al menos uno entre una proteína de captación de glicerol y un canal de glicerol, en donde, preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de captación de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 50% de identidad de secuencia de aminoácidos con al menos una de las SEQ ID N°: 10 y 11, y en donde, preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica el canal de glicerol comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 30% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 250 y 530 de la SEQ ID N°: 12.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, CARACTERIZADO PORQUE la modificación genética aumenta la actividad acetil-CoA sintetasa especifica bajo condiciones anaeróbicas .

9. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 - 8, CARACTERIZADO PORQUE la célula de levadura comprende al menos uno de: i) un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional, donde dicho gen confiere a la célula la capacidad para isomerizar xilosa en xilulosa; y, ii) genes exógenos funcionales que codifican una L-arabinosa isomerasa, una L-ribuloquinasa y una L-ribulosa-5-fosfato 4-epimerasa, donde dicho genes juntos confieren a la célula la capacidad de convertir L-arabinosa en D-xilulosa 5-fosfato; y en donde, preferiblemente, la célula de levadura comprende al menos una modificación genética adicional que da como resultado una característica seleccionada del grupo que consiste de: a) una mayor actividad específica de xilulosa quinasa; b) un mayor flujo de la vía de pentosa fosfato c) una actividad específica de aldosa reductasa reducida no específica d) un transporte incrementado de al menos una entre xilosa y arabinosa dentro de la célula huésped; e) una menor sensibilidad a la represión de catabolitos ; f) una mayor tolerancia a etanol, osmolaridad o a ácidos orgánicos; y, g) una producción reducida de productos secundarios.

10. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE la célula de levadura es de un género seleccionado del grupo que consiste de Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Yarrowía .

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE la célula de levadura pertenece a una especie seleccionada del grupo que consiste de S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis, K. marxianus y Schizosaccharomyces pombe.

12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE el medio contiene o es alimentado con un hidrolizado lignocelulósico .

13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE la célula de levadura fermenta bajo condiciones anaerobicas.

14. Una célula de levadura, CARACTERIZADA PORQUE comprende : a) un gen exógeno que codifica una enzima con actividad acetaldehido deshidrogenasa, donde dicho gen confiere a la célula la capacidad para convertir ácido acético en etanol; y, b) un gen bacteriano que codifica una enzima con actividad glicerol deshidrogenasa ligada a NAD+, donde la célula de levadura no es una célula de levadura que comprende una modificación genética capaz de reducir la actividad formiato deshidrogenasa dependiente de NAD+ especifica en la célula.

15. Una célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADA PORQUE la célula de levadura además es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 - 11.