MX2013011130A - Metodos de administracion de antagonistas de integrina beta7. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos de tratamiento de trastornos inflamatorios gastrointestinales tales como enfermedades intestinales inflamatorias incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. También se proporcionan métodos de administración de antagonistas de integrina beta7, tales como anticuerpos anti-beta7. Además, se proporcionan regímenes de dosificación particulares, incluyendo regímenes que comprenden la administración subcutánea y la administración usando dispositivos autoinyectables.

Description

MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN DE ANTAGONISTAS DE INTEGRINA BETA7 REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional estadounidense N.° 61/470.360, presentada el 31 de marzo de 2011 y de la solicitud provisional estadounidense N.° 61/550.216, presentada el 21 de octubre de 2011 , que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un listado de secuencias que ha sido presentado en formato ASCII y que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. El nombre de la copia ASCII, creada el 15 de marzo de 2012, es "P4622R1WO- SequenceListing.txt" y tiene un tamaño de 17.964.

CAMPO Se proveen métodos para tratar trastornos inflamatorios gastrointestinales tales como enfermedades intestinales inflamatorias que incluyen colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. También se proveen métodos para administrar antagonistas de integrina beta7, tales como anticuerpos anti-beta7. Asimismo, se proveen regímenes de dosificación particulares, con inclusión de regímenes de dosificación que comprenden administración subcutánea y administración con el uso de dispositivos autoinyectables.

ANTECEDENTES La enfermedad intestinal inflamatoria (IBD, por sus siglas en inglés Inflammatory Bowel Disease) es una afección autoinmune inflamatoria crónica del tracto gastrointestinal (Gl), que se presenta clínicamente como colitis ulcerativa (CU) o enfermedad de Crohn (CD, del inglés Crohn's disease). La CD es una enfermedad inflamatoria transmural crónica con el potencial de afectar cualquier parte del tracto Gl, y la CU es una inflamación de la mucosa del colon. Ambas afecciones se caracterizan clínicamente por deposiciones frecuentes, desnutrición y deshidratación, con interrupción en las actividades de la vida diaria. La CD se complica frecuentemente por el desarrollo de anabolismo alterado, constricciones y fístulas, y puede requerir cirugía repetida. La CU, con menor frecuencia, se puede complicar por diarrea con sangre severa y megacolon tóxico, lo que también requiere cirugía. Ambas afecciones IBD están asociadas con un aumento en el riesgo de tumores en el tracto Gl. La etiología de IBD es compleja, y muchos aspectos de la patogénesis permanecen sin aclararse.

El tratamiento de IBD moderada a severa impone desafíos significativos para los médicos a cargo, porque la terapia convencional con corticosteroides y terapia inmunomodulatoria (por ejemplo, azatioprina, 6 mercaptopurina y metotrexato) se asocia con efectos adversos e intolerancia, y no ha demostrado ningún beneficio en la terapia de mantenimiento (esteroides). Los anticuerpos monoclonales dirigidos a factor de necrosis tumoral alfa (TNF-an ndel inglés Tumor Necrosis Factor Alpha) tales como infliximab (un anticuerpo quimérico) y adalimumab (un anticuerpo completamente humano), se usan actualmente en el tratamiento de CD. El infliximab también ha demostrado eficacia y ha sido aprobado para uso en CU. No obstante, aproximadamente 10% a 20% de los pacientes con CD no responden inicialmente a la terapia anti TNF, y otro ~20% a 30% de los pacientes con CD pierden respuesta con el tiempo (Schnitzler et al., Gut 58:492-500 (2009)). Otros eventos adversos (EAs) asociados con TNFs incluyen tasas elevadas de infección bacteriana, con inclusión de tuberculosis y, más raramente, linfoma y desmielinación (Chang et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220 (2006); Hoentjen et al., World J. Gastroenterol. 15(17):2067 (2009)). No existe terapia actual que alcance remisión sostenida en más del 20%-30% de los pacientes con IBD con enfermedad crónica (Hanauer et al., Lancet 359:1541-49 (2002); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)). Asimismo, la mayoría de los pacientes no alcanzan remisión sostenida libre de esteroides y curación de la mucosa, resultados clínicos que se correlacionan con la verdadera modificación de la enfermedad. Por ende, es necesario desarrollar terapia más enfocada en IBD que sea optimizada para uso crónico: un perfil de seguridad mejorado con remisión sostenida, particularmente remisión libre de esteroides y prevención de complicaciones a largo plazo en mayor proporción de pacientes, con inclusión de aquellos pacientes que nunca responden a un agente terapéutico anti TNF o que pierden la respuesta con el tiempo.

Las integrinas son receptores glucoproteínas de superficie celular heterodiméricas alfa/beta que participan en numerosos procesos celulares, con inclusión de adhesión, señalización, proliferación y migración de leucocitos, así como también en la regulación de genes (Hynes, R. O., Cell, 1992, 69:11-25; y Hemler, M. E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368). Están compuestas por dos subunidades transmembrana a y ß de interacción no covalente, heterodiméricas, que se unen específicamente a distintas moléculas de adhesión celular (CAMs, del inglés Cell Adhesión Molecules) sobre el endotelio, epitelio y proteínas de la matriz extracelular. De esta manera, las integrinas pueden funcionar como receptores de adhesión celular específicos para tejidos que ayudan a reclutar leucocitos a partir de la sangre en casi todos los sitios tisulares de manera altamente regulada, participando en el alojamiento de leucocitos en tejido normal y en sitios de inflamación (von Andrian et al., N Engl J Med 343:1020-34 (2000)). En el sistema inmune, las integrinas colaboran en el tráfico, la adhesión y la infiltración de leucocitos durante los procesos inflamatorios (Nakajima, H. et al., J. Exp. Med., 1994, 179:1145-1154). La expresión diferencial de las integrinas regula las propiedades adhesivas de las células y las diferentes integrinas participan en diferentes respuestas inflamatorias. (Butcher, E. C. et al., Science, 1996, 272:60-66). Las integrinas que contienen beta7 (es decir, alpha4beta7 y alfaEbeta7) se expresan principalmente en los monocitos, linfocitos, eosinófilos, basófilos y macrófagos pero no en los neutrófilos (Elices, M. J. et al., Cell, 1990, 60:577-584).

La integrina a4ß7 es un receptor de alojamiento de leucocitos que es importante en la migración de células a la mucosa intestinal y tejidos linfoides asociados, tales como parches de Peyer en el intestino delgado, folículos linfoides en el intestino grueso, y nodulos linfáticos mesentéricos. En el intestino, la rodadura de leucocitos y la firme adhesión al endotelio de la mucosa se inicia mediante señales desde las quimioquinas y es mediado a través de sialilo Lewis X asociado con la molécula de adhesión celular de adresina de la mucosa (MAdCAM)-1. La señalización de quimioquinas induce a la integrina a4ß7 a someterse a un cambio en la afinidad de unión a MAdCAM-1 de baja a alta. El leucocito luego se arresta y comienza el proceso de extravasación a través del endotelio vascular al tejido subyacente. Se cree que esta extravasación ocurre tanto en el estado de recirculación de células inmunes normal como en las afecciones inflamatorias (von Andrian et al., supra). Los números de células a4ß7+ en los infiltrados y la expresión del ligando MAdCAM-1 son superiores en los sitios de inflamación crónica, tal como en el tracto intestinal de los pacientes con CU o CD (Briskin et al., Am J Pathol 151 :97-110 (1997); Souza et al., Gut 45:856-63 (1999)). La a4ß7 se une preferentemente a vénulas endoteliales altas que expresan MAdCAM— 1 y molécula de adhesión celular vascular (VCAM)-1 , así como también al fragmento de la molécula de fibronectina de la matriz extracelular CS-1 (Chan et al., J Biol Chem 267:8366-70 (1992); Ruegg et al., J Cell Biol 17:179-89 (1992); Berlín et al., Cell 74:185-95 (1993)). Junto con MAdCAM-1 expresada en forma constitutiva en los vasos de la mucosa intestinal, la integrina a4ß7 juega un rol selectivo en el tropismo intestinal pero no parece contribuir al alojamiento de los leucocitos en el tejido periférico o el SNC. En cambio, el trafico linfoide periférico no se ha asociado con la interacción de a4ß1 con VCAM-1 (Yednock et al., Nature 356:63-6 (1992); Rice et al., Neurology 64:1336-42 (2005)).

Otro miembro de la familia de integrinas ß7, que se expresa exclusivamente en los linfocitos T y se asocia con los tejidos de la mucosa, es la integrina a?ß7, también conocida como "CD103". La integrina a?ß7 se une selectivamente a E-caderina en las células epiteliales y se ha establecido que participa en la retención de células T en el tejido de la mucosa en el compartimiento de linfocitos intraepiteliales (Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993); Karecla et al. Eur J Immunol 25:852-6 (1995)). Se ha informado que las células a?ß7+ en la lámina propia exhiben citotoxicidad contra las células epiteliales pensionadas o infectadas (Hadley et al., J ¡mmunol 159:3748-56 (1997); Buri et al., J Pathol 206:178-85 (2005)). La expresión de a?ß7 se incrementa en CD (Elewaut et al., Acta Gastroenterol Belg 61 :288-94 (1998); Oshitani et al., Int J Mol Med 12:715-9 (2003)), y se ha informado que el tratamiento con anticuerpos anti-ocEp7 atenúa la colitis experimental en los ratones, lo que implica un rol para los linfocitos a?ß7+ en modelos experimentales de IBD (Ludviksson et al., J Immunol 162:4975-82 (1999)).

La administración de anticuerpos monoclonales contra alfaE beta7 previene y mejora, según lo informado, la colitis inducida por inmunización en ratones IL-2 ~/_, lo que sugiere que el desencadenamiento y el mantenimiento de la enfermedad intestinal inflamatoria depende de la localización colónica de los linfocitos CD4+ en la lámina propia que expresan alfaEbeta7 (Ludviksson et al., J Immunol. 1999, 162(8):4975-82). Según lo informado, un anticuerpo anti-a4 (natalizumab) tiene eficacia en el tratamiento de pacientes con CD (Sandborn et al., N Engl J Med 2005; 353:1912-25) y un anticuerpo anti-ct4 7 (MLN-02, LN0002, vedolizumab) es efectivo en los pacientes con CU (Feagan et al., N Engl J Med 2005;352:2499-507) según lo informado. Estos hallazgos validan a a4ß7 como blanco terapéutico y sustentan la idea que la interacción entre a4ß7 y MAdCAM-1 media la patogénesis de IBD. Por ende, los antagonistas de integrina beta7 tienen gran potencial como agentes terapéuticos para tratar IBD.

Los anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra la subunidad de integrina ß7 han sido descritos con anterioridad. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional N.° WO 2006/026759. Un anticuerpo de esta clase, rhuMAb Beta7 (etrolizumab) deriva del anticuerpo monoclonal de rata anti-ratón/humano FIB504 (Andrew et al. 1994). Fue diseñado para incluir estructuras de cadena liviana ?1 y cadena pesada de lgG1 humana (publicación de patente internacional N.° WO 2006/026759).

RhuMAb Beta7 une a4ß7 (Holzmann et al., Cell 56:37-46 (1989); Hu et al., Proc Nati Acad Sci USA 89:8254-8 (1992)) y a?ß7 (Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993)), que regulan el tráfico y la retención de subconjuntos de linfocitos, respectivamente, en la mucosa intestinal. Los estudios clínicos han demostrado la eficacia de un anticuerpo anti a4 (natalizumab) para el tratamiento de CD (Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)), y se han informado resultados alentadores para el anticuerpo anti a4ß7 (LDP02/MLN02/ LN0002/vedolizumab) en el tratamiento de CU (Feagan et al., N Engl J Med 352:2499-507 (2005)). Estos hallazgos ayudan a validar a a4ß7 como potencial blanco terapéutico y sustentan la hipótesis de que la interacción entre a4ß7 y la molécula de adhesión celular de la adresina de la mucosa 1 ( AdCAM 1 ) contribuye a la patogénesis de la enfermedad intestinal inflamatoria (IBD).

A diferencia del natalizumab, que une a4 y por ende une tanto a4ß1 como a4ß7, rhuMAb Beta7 se une específicamente a la subunidad ß7 de a4ß7 y a?ß7 y no se une a las subunidades individuales de integrinas a4 o ß1. Esto quedó demostrado por la incapacidad del anticuerpo de inhibir la adhesión de células Ramos a4ß1+a4ß7 a la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM 1 ) a concentraciones tan altas como de 100 nM. En forma importante, esta característica de rhuMAb Beta7 indica selectividad: los subconjuntos de células T que expresan a4ß1 mas no ß7 no deberían ser afectados directamente por rhuMAb Beta7.

El sustento de los efectos específicos para el intestino de rhuMAb Beta7 sobre el alojamiento de los leucocitos proviene de varios estudios no clínicos in vivo. En ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID, del inglés Severe Combined Immunodeficient) reconstituidos con células CD45RBaltoCD4+ T (un modelo animal de colitis), rhuMAb Beta7 bloqueó el alojamiento de linfocitos radiomarcados en el colon inflamado pero no bloqueó el alojamiento en el bazo, un órgano linfoide periférico. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional N.° WO 2006/026759. Asimismo, la ß7 anti-murino quimérica rata-ratón (anti ß7, muFIB504) no pudo reducir el grado histológico de la inflamación del sistema nervioso central (SNC) o mejorar la supervivencia de la enfermedad en el receptor de células T de proteínas básicas de la mielina (MBP-TCR, del inglés Myelin Basic Protein T Cell Receptor) en ratones transgénicos con encefalitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal de esclerosis múltiple. Id. Asimismo, en dos estudios de seguridad en monos cynomolgus, rhuMAb Beta7 indujo un incremento moderado en los números de linfocitos en sangre periférica que se debió en gran medida a un marcado incremento (aproximadamente del triple al séxtuple) en células T en sangre periférica CD45RA_P7alt0, un subconjunto que es similar a nivel fenotípico con las células T efectoras/de memoria de alojamiento en intestino en los humanos. Véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional N.° WO 2009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Artículo aceptado, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x. Por el contrario, rhuMAb Beta7 tuvo un efecto nulo o mínimo sobre el número de células T en sangre periférica CD45RA+ 7intermedio, un subconjunto que es similar a nivel fenotípico a las células T sin activación previa en los humanos, y un efecto nulo sobre el número de células T en sangre periférica CD45RA~p7 ajo, un subconjunto que es similar a nivel fenotípico con las células T efectoras/de memoria de alojamiento periférico en los humanos, lo que confirma la especificidad de rhuMAb Beta7 para la subpoblación de linfocitos de alojamiento en intestino (publicación de patente internacional N.° WO 2009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Artículo Aceptado, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x).

Si bien los estudios clínicos han demostrado la eficacia de un anticuerpo anti-a4 (natalizumab) para el tratamiento de CD (Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)), y se han informado resultados alentadores para el anticuerpo anti-a4 7 (LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab) en el tratamiento de CU, persiste la necesidad de mejoras adicionales en el tratamiento de estos trastornos. Por ejemplo, el tratamiento con natalizumab ha sido asociado con casos confirmados de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML, del inglés Progressive Multifocal Leukoencephalopathy) en pacientes con enfermedad de Crohn (y, por separado, esclerosis múltiple) que recibieron tratamiento concomitante con natalizumab e inmunosupresores. La PML es una afección neurológica potencialmente fatal ligada a la reactivación de un poliomavirus (virus JC) y replicación viral activa en el cerebro. No existen intervenciones conocidas que puedan prevenir la PML en forma confiable ni tratar la PML de manera adecuada, si es que esto ocurre. Una limitación del tratamiento con vedolizumab es que se administra por vía intravenosa, lo que puede ser inconveniente para el paciente y también puede estar asociado con eventos indeseables o adversos; por ejemplo, reacciones en el sitio de infusión. Por consiguiente, es necesario alcanzar enfoques terapéuticos mejorados para el tratamiento de trastornos inflamatorios gastrointestinales tales como IBD, por ejemplo, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, así como también regímenes de dosificación más deseables.

La invención descrita en la presente cubre ciertas de las necesidades anteriormente descritas y provee otros beneficios.

Todas las referencias citadas en la presente, con inclusión de solicitudes y publicaciones de patentes, se incorporan por referencia en su totalidad para cualquier propósito.

SÍNTESIS Los métodos de la invención se basan, al menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden administrar cantidades terapéuticamente efectivas de antagonistas de integrina beta7, tales como anticuerpos anti-beta7, con inclusión de rhuMAb Beta7 (etrolizumab) tanto por vía subcutánea como por vía intravenosa.

Conforme a ello, en un aspecto, se proporcionan métodos de tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un sujeto mamífero que comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina beta7. En ciertas formas de realización, el sujeto mamífero es un paciente. En ciertas formas de realización, el paciente es un ser humano. En ciertas formas de realización, el antagonista de integrina beta7 se administra por vía intravenosa. En ciertas formas de realización, el antagonista de integrina beta7 se administra por vía subcutánea.

En un aspecto, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad intestinal inflamatoria. En ciertas formas de realización, la enfermedad intestinal inflamatoria es colitis ulcerativa (UC) o enfermedad de Crohn (CD). En ciertas formas de realización, el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 monoclonal. En ciertas de estas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 está seleccionado de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 es un fragmento de anticuerpo. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 comprende seis regiones hipervariables (HVRs), en donde: (i) HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácido A1-A11, en donde A1-A11 es RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8) o RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9) o una variante de SEQ ID NOs:1 , 7, 8 ó 9 (SEQ ID NO:26), en donde el aminoácido A2 está seleccionado del grupo que consiste en A, G, S, T y V y/o el aminoácido A3 está seleccionado del grupo que consiste en S, G, I, K, N, P, Q, R y T, y/o A4 está seleccionado del grupo que consiste en E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N y R, y/o el aminoácido A5 está seleccionado del grupo que consiste en S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T y V, y/o el aminoácido A6 está seleccionado del grupo que consiste en V, R, I, A, G, K, L, y Q, y/o el aminoácido A7 está seleccionado del grupo que consiste en D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S y T, y/o el aminoácido A8 está seleccionado del grupo que consiste en D, G, N, E, T, P y S, y/o el aminoácido A9 está seleccionado del grupo que consiste en L, Y, I y M, y/o el aminoácido A10 está seleccionado del grupo que consiste en L, A, I, M y V y/o el aminoácido A11 está seleccionado del grupo que consiste en H, Y, F y S; (ii) HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácido B1-B8, en donde B1-B8 es KYASQSIS (SEQ ID NO:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:20) o XaaYASQSIS (SEQ ID NO:21 , donde Xaa representa cualquier aminoácido) o una variante de SEQ ID NOs:2, 20 o 21 (SEQ ID NO:27), en donde el aminoácido B1 está seleccionado del grupo que consiste en K, R, ?, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y y Xaa (donde Xaa representa cualquier aminoácido), y/o el aminoácido B4 está seleccionado del grupo que consiste en S y D, y/o el aminoácido B5 está seleccionado del grupo que consiste en Q y S, y/o el aminoácido B6 está seleccionado del grupo que consiste en S, D, L y R, y/o el aminoácido B7 está seleccionado del grupo que consiste en I, V, E y K; (iii) HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácido C1-C9, en donde C1-C9 es QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3) o una variante de SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:28), en donde el aminoácido C8 está seleccionado del grupo que consiste en N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I L y M; (iv) HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácido D1-D10, en donde D1-D10 es GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4); (v) HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácido E1-E17 en donde E1-E17 es GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) o una variante de SEQ ID NO:5 (SEQ ID NO:29), en donde el aminoácido E2 está seleccionado del grupo que consiste en Y, F, V y D, y/o el aminoácido E6 está seleccionado del grupo que consiste en S y G, y/o el aminoácido E10 está seleccionado del grupo que consiste en S e Y, y/o el aminoácido E12 está seleccionado del grupo que consiste en N, T, A y D, y/o el aminoácido 13 está seleccionado del grupo que consiste en P, H, D y A, y/o el aminoácido E15 está seleccionado del grupo que consiste en L y V, y/o el aminoácido E17 está seleccionado del grupo que consiste en S y G; y (vi) HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácido F2-F11 , en donde F2-F11 es MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) o RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 19); o comprende la secuencia de aminoácido F1-F11 , en donde F1-F11 es AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:16), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:17) o AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:18) o una variante de SEQ ID NOs:6, 16, 17, 18 ó 19 (SEQ ID NO:30), en donde el aminoácido F2 es R, M, A, E, G, Q, S, y/o el aminoácido F11 está seleccionado del grupo que consiste en F e Y. En algunas de tales formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 comprende tres secuencias de regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1-H3) y tres secuencias de regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1-L3), en donde: (i) HVR-L1 comprende SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9; (ii) HVR-L2 comprende SEQ ID NO:2; (ili) HVR-L3 comprende SEQ ID NO:3; (iv) HVR-H1 comprende SEQ ID NO:4; (v) HVR-H2 comprende SEQ ID NO:5; y (vi) HVR-H3 comprende SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:19.

En otro aspecto, se proporcionan métodos de administración por vía subcutánea de cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos anti-beta7 en una dosis ponderada. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis de 0,5 mg/kg. En ciertas formas de realización, el anticuerpo ant¡-beta7 se administra en una dosis de 1 ,5 mg/kg. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis de 3,0 mg/kg. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis de 4,0 mg/kg. En un aspecto, el anticuerpo anti-beta7 se administra a intervalos regulares en el tiempo. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez por semana. En ciertas formas de realización, el anticuerpo antl-beta7 se administra una vez cada dos semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada cuatro semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada seis semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada ocho semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo antl-beta7 se administra durante un período de dos meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de tres meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de seis meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 12 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo antibeta? se administra durante un período de 18 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 24 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante la vida del sujeto. En ciertas formas de realización el anticuerpo anti-beta7 es rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto más, se proporcionan métodos de administración por vía subcutánea de cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos anti-beta7 en una dosis plana. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis plana de entre 50 mg y 450 mg. En ciertas formas de realización, la dosis plana es 50 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 100 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 150 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 200 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 300 mg. En ciertas formas de realización, la dosis plana es de 350 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 400 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 420 mg. En algunas de tales formas de realización, la dosis plana es de 450 mg. En un aspecto, el anticuerpo anti-beta7 se administra a intervalos regulares en el tiempo. En algunas de tales formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada semana. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada dos semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada cuatro semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada seis semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada ocho semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de dos meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de tres meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de seis meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 12 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo antibeta? se administra durante un período de 18 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 24 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante la vida del sujeto. En ciertas formas de realización el anticuerpo anti-beta7 is rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto más, se proporcionan métodos de administración de cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos anti-beta7 en una dosis plana, en donde la administración comprende la administración de una primera dosis de carga y la administración de al menos una posterior dosis de mantenimiento, en donde cada una de las dosis de carga y la al menos una dosis de mantenimiento se administra en una dosis plana. En ciertas formas de realización, la dosis de carga del anticuerpo anti-beta7 se administra por vía intravenosa. En ciertas formas de realización, la dosis de carga del anticuerpo anti— beta7 se administra por vía subcutánea. En ciertas formas de realización, la al menos una posterior dosis de mantenimiento del anticuerpo anti-beta7 se administra por vía intravenosa. En ciertas formas de realización, la al menos una posterior dosis de mantenimiento del anticuerpo anti-beta7 se administra por vía subcutánea. En ciertas formas de realización, cada una de las dosis de carga y al menos una posterior dosis de mantenimiento se administra por vía intravenosa. En ciertas formas de realización, cada una de las dosis de carga y al menos una posterior dosis de mantenimiento se administra por vía subcutánea. En ciertas formas de realización, la dosis de carga se administra por vía intravenosa y cada una de al menos una posterior dosis de mantenimiento se administra por vía subcutánea. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de entre 400 mg y 450 mg y la dosis de mantenimiento está entre 50 mg y 350 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En ciertas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En ciertas formas de realización el anticuerpo anti-beta7 es rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto, se proporcionan métodos de administración por vía subcutánea de cantidades terapéuticamente efectivas de anticuerpos anti-beta7 antibodies en una dosis de carga seguida por una o dos dosis de mantenimiento. En ciertas formas de realización, la primera dosis de mantenimiento se administra el mismo día que la dosis de carga. En ciertas formas de realización, la primera dosis de mantenimiento se administra un día después de la dosis de carga. En ciertas formas de realización, la primera dosis de mantenimiento se administra una semana después de la dosis de carga. En ciertas formas de realización, la primera dosis de mantenimiento se administra dos semanas después de la dosis de carga. En ciertas formas de realización, la primera dosis de mantenimiento se administra cuatro semanas después de la dosis de carga. En ciertas formas de realización, la segunda y cada dosis de mantenimiento posterior se administra cada dos semanas. En ciertas formas de realización, la segunda y cada dosis de mantenimiento posterior se administra cada cuatro semanas. En ciertas formas de realización, la segunda y cada dosis de mantenimiento posterior se administra cada ocho semanas. En ciertas formas de realización, la primera dosis de mantenimiento se administra dos semanas después de la dosis de carga, la segunda dosis de mantenimiento se administra dos semanas después de la primera dosis de mantenimiento y cada dosis de mantenimiento posterior se administra cada cuatro semanas. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de dos meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de tres meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de seis meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 12 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 18 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de 24 meses. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 se administra durante la vida del sujeto. En ciertas formas de realización el anticuerpo anti-beta7 es rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto más, se proporciona un artículo de manufactura que comprende un antagonista de integrina beta7. En ciertas formas de realización, el artículo de manufactura comprende una jeringa prellenada o un dispositivo autoinyector que comprende 2 mi (150 mg) de antagonista de integrina beta7. En ciertas formas de realización, el artículo de manufactura comprende una jeringa prellenada o un dispositivo autoinyector que comprende 1 mi (180 mg) de antagonista de integrina beta7. En ciertas formas de realización el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 o rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto más, se proporcionan métodos de administración por vía subcutánea de cantidades terapéuticamente efectivas de un antagonista de integrina beta7 con al menos un compuesto adicional. En ciertas formas de realización, el al menos un compuesto adicional está seleccionado de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP) y metotrexato.

En otro aspecto, se proporcionan métodos de administración por vía subcutánea de cantidades terapéuticamente efectivas de un antagonista de integrina beta7, donde el sujeto o el paciente no logró previamente al menos un agente biológico. En ciertas formas de realización, el agente biológico está seleccionado de adalimumab, etanercept, infliximab, golimumab, certolizumab pegol, natalizumab y vedolizumab. En ciertas formas de realización el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 o rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto más, se proporcionan métodos de administración por vía subcutánea de cantidades terapéuticamente efectivas de un antagonista de integrina beta7 con un dispositivo autoinyectable. En ciertas formas de realización, el dispositivo autoinyectable está seleccionado de una jeringa prellenada, un dispositivo de microaguja, un dispositivo autoinyector y un dispositivo inyectable sin aguja. En ciertas formas de realización, el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 o rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

En otro aspecto más, se proporcionan métodos de inducción de la remisión en un paciente con colitis ulcerativa. Estos métodos incluyen la administración de un anticuerpo anti-beta7 de acuerdo con cualquiera de las dosis o regímenes posológicos indicados con anterioridad. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 es rhuMAb Beta7 (etrolizumab). En ciertas formas de realización, la remisión en el paciente se determina para ser inducida cuando el puntaje absoluto de la Clínica Mayo < 2 y el subpuntaje individual >1 , que también se menciona como remisión clínica. En ciertas formas de realización, la remisión en el paciente se induce al menos en la semana 10 después del inicio del tratamiento con anticuerpo anti-beta7. En ciertas formas de realización, los pacientes administrados con anticuerpo anti-beta7 tal como se describió con anterioridad retienen remisión clínica desde la inducción y continúan en remisión durante cierto período, también mencionado como remisión sostenida. En algunas de tales formas de realización, la remisión sostenida es durante un período de 8 semanas después de la inducción de la remisión o un período de 30 semanas después de la inducción de la remisión o un período de 50 semanas después de la inducción de la remisión o un período de 54 semanas o más después de la inducción de la remisión. En ciertas formas de realización, los pacientes administrados con anticuerpo anti-beta7 de acuerdo con cualquiera de las dosis o regímenes posológicos indicados con anterioridad experimentan una remisión sostenida libre de esteroides. En ciertas formas de realización, los pacientes que experimentan una remisión sostenida libre de esteroides discontinúan el uso de corticosteroides en la semana 30 después de la inducción de la remisión y sostienen la remisión a lo largo de la semana 50 o la semana 54 o más tiempo después de la inducción de la remisión. En ciertas formas de realización, los pacientes administrados con anticuerpo anti-beta7 tal como se describió con anterioridad experimentan un tiempo de brote reducido o una tasa reducida de brotes durante un período determinado. En ciertas formas de realización, los pacientes administrados con anticuerpo anti-beta7 tal como se describió con anterioridad experimentan una curación de la mucosa. En ciertas formas de realización, los pacientes que experimentan una curación de la mucosa son determinados para tener un subpuntaje de endoscopia de 0 ó 1 tal como se evalúa por sigmoidoscopía flexible. En ciertas formas de realización, el anticuerpo anti-beta7 es rhuMAb Beta7 (etrolizumab).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A-1C muestra los perfiles de tiempo-concentración media en suero en grupo de rhuMAb Beta7 en el estudio de Fase I, tal como se describe en el Ejemplo 1. (A) rhuMAb Beta7 en suero en pacientes en la etapa de dosis en aumento única del estudio que recibieron fármaco de estudio IV; (B) rhuMAb Beta7 en suero en pacientes en la etapa de dosis en aumento única del estudio que recibieron fármaco de estudio a 3,0 mg/kg IV en comparación con pacientes que recibieron la misma dosis de fármaco de estudio SC; (C) rhuMAb Beta7 en suero pacientes en la etapa de dosis en aumento múltiple del estudio. Cada gráfico muestra la concentración de rhuMAb Beta7 en suero ^g/mL) sobre el eje vertical, y el tiempo (días) sobre el eje horizontal.

La Figura 2A-2D muestra la ocupación de la integrina beta7 tal como se describe en el Ejemplo 1. (A) Ocupación en muestras de cada paciente en cohorte G; cuatro pacientes (V, W, X, Y) recibieron 0,5 mg/kg de rhuMAb beta7 SC mientras que uno recibió placebo (P6); (B) Ocupación en muestras de cada paciente en cohorte H; tres pacientes (AA, BA, DA) recibieron 1 ,5 mg/kg de rhuMAb beta7 SC mientras que uno recibió placebo (P8); (C) Ocupación en muestras de cada paciente en cohorte I; cuatro pacientes (EA, FA, GA, HA) recibieron 3,0 mg/kg de rhuMAb beta7 SC mientras que uno recibió placebo (P9); (D) Ocupación en muestras de cada paciente en cohorte J; cinco pacientes (IA, JA, KA, LA, MA) recibieron 4,0 mg/kg de rhuMAb beta7 IV mientras que uno recibió placebo (P10). Cada gráfico muestra ocupación sobre el eje vertical, y el día del estudio sobre el eje horizontal. Ciertos pacientes tuvieron erupciones durante el estudio, y esto se indicó entre paréntesis para cada paciente con el día de la erupción indicado.

La Figura 3A-3E muestra cambios individuales en el Puntaje de la Clínica Mayo según se describe en el Ejemplo 1. (A) Cohorte G (0,5 mg/kg SC); (B) Cohorte H (1 ,5 mg/kg SC); (C) Cohorte I (3 mg/kg SC); (D) Cohorte J (4 mg/kg IV); (E) placebo. Para cada gráfico, se ilustra el Puntaje de la Clínica Mayo sobre el eje vertical, y el tiempo (días) se muestra sobre el eje horizontal. Las flechas indican los días en los que se administró el fármaco de estudio (A-D) o el placebo (E).

La Figura 4 muestra el perfil tiempo-concentración de rhuMAb Beta7 en suero (nivel mediano) simulado usando un modelo farmacocinético derivado de los datos farmacocinéticos preliminares de Fase I tal como se describe en el Ejemplo 2. La concentración de rhuMAb Beta7 en suero simulada ( g/mL) se encuentra sobre el eje vertical; el tiempo (días) se encuentra sobre el eje horizontal.

La Figura 5 muestra una comparación de la exposición en estado estable predicha-simulación en la población (Cmax y AUCo-84) y la variabilidad para la dosificación plana versus la basada en peso corporal, tal como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 6A y 6B muestra la alineación de las secuencias de las cadenas pesadas y livianas variables para lo siguiente: secuencia consenso de subgrupo kappa I humano de cadena liviana (FIG. 6A, SEQ ID NO:12), secuencia consenso de subgrupo III humano de cadena pesada (FIG. 6B, SEQ ID NO:13), cadena liviana variable de anticuerpo beta7 de rata anti-ratón (Fib504) (FIG. 6A, SEQ ID NO:10), cadena pesada variable de anticuerpo beta7 de rata anti-ratón (Fib504) (FIG. 6B, SEQ ID NO:11 ), y variantes de anticuerpos humanizados: cadena liviana variable de injerto hu504K humanizado (FIG. 6A, SEQ ID NO:14), cadena pesada variable de injerto hu504K humanizado (FIG. 6B, SEQ ID NO: 15), variantes hu504-5, hu504-16, y hu504-32 (las variaciones de aminoácidos de injerto hu504K humanizado se indican en la FIG. 6A) (cadena liviana}* (SEQ ID NOS:22-24, respectivamente, por orden de aparición) y FIG. 6B (cadena pesada) para las variantes hu504-5, hu504-16, y hu504-32 (SEQ ID NO:25).

La Figura 7 muestra el esquema de estudio para el estudio clínico de Fase II tal como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 8 muestra el Puntaje parcial de la Clínica Mayo (pMCS, del inglés partial Clínica Mayo Scoring) para los pacientes con colitis ulcerativa moderada a severa enrolados en el estudio abierto tal como se describe en el Ejemplo 2.

DESCRIPCIÓN DETALLADA A menos que se definan de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por el técnico medianamente versado en el arte al cual pertenece la invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2da ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ta ed., John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992), ofrecen una guía general para los técnicos versados en el arte de muchos de los términos usados en la presente solicitud. ALGUNAS DEFINICIONES A los efectos de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, siempre que sea apropiado, los términos usados en forma en singular también incluirán la forma en plural y vice versa. En el caso de que cualquier definición establecida a continuación entre en conflicto con cualquier documento incorporado en la presente por referencia, las definiciones establecidas a continuación tendrán prioridad.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen sus referentes en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por ende, por ejemplo, la referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a "una célula" incluye mezclas de células, y similares.

Los rangos provistos en la memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas incluyen ambos extremos y todos los valores entre estos extremos. Como resultado, por ejemplo, un rango de 2,0 a 3,0 pulgadas incluye 2,0, 3,0, y todos los valores comprendidos entre 2,0 y 3,0.

"Tratamiento", "tratar", y todas las variaciones gramáticas de las mismas hacen referencia a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural de la célula o individuo que están siendo tratados, y se puede realizar ya sea para profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, reducir la tasa de avance de la enfermedad, mejorar o apaliar el estado de la enfermedad, la remisión o el pronóstico mejorado.

"Régimen de tratamiento" se refiere a una combinación de dosis, frecuencia de administración, o duración de tratamiento, con o sin la adición de un segundo medicamento.

"Régimen de tratamiento efectivo" se refiere a un régimen de tratamiento que ofrece una respuesta beneficiosa a un paciente que recibe el tratamiento.

"Modificar un tratamiento" se refiere a cambiar el régimen de tratamiento, lo que incluye cambiar la dosis, frecuencia de administración, o duración de tratamiento, y/o la adición de un segundo medicamento.

La "respuesta del paciente" o "capacidad de respuesta del paciente" se puede evaluar usando cualquier objetivo que indique un beneficio para el paciente, que incluye, sin limitaciones: (1 ) inhibición, hasta cierto punto, del avance de la enfermedad, con inclusión de la ralentización o el arresto completo; (2) reducción en el número de episodios y/o síntomas de la enfermedad; (3) reducción en el tamaño de la lesión; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración celular de la enfermedad en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la diseminación de la enfermedad; (6) reducción de la respuesta autoinmune, que puede, mas no necesariamente tiene que, generar la regresión o ablación de la lesión de la enfermedad; (7) alivio, hasta cierto punto, de uno o más síntomas asociados con el trastorno; (8) incremento en la duración de la presentación libre de enfermedad después del tratamiento; y/o (9) mortalidad reducida en cierto punto de tiempo después del tratamiento. El término "capacidad de respuesta" se refiere a una respuesta mensurable, que incluye respuesta completa (RC) y respuesta parcial (RP).

Tal como se usa en la presente, "respuesta completa" o "RC" hace referencia a la desaparición de todos los signos de inflamación o remisión en respuesta al tratamiento. Esto no significa necesariamente que la enfermedad se haya curado.

"Respuesta parcial" o "RP" se refiere a una disminución de al menos 50% en la severidad de la inflamación, en respuesta al tratamiento.

Una "respuesta beneficiosa" de un paciente al tratamiento con un antagonista de integrina beta7 y frases similares se refiere al beneficio clínico o terapéutico impartido a un paciente que padece, o en riesgo de padecer, un trastorno inflamatorio gastrointestinal a partir o como resultado del tratamiento con el antagonista, tal como un anticuerpo anti— integrina beta7. Dicho beneficio incluye respuestas celulares o biológicas, una respuesta completa, una respuesta parcial, una respuesta estable (sin avance o recidiva), o una respuesta con recidiva posterior del paciente a partir o como resultado del tratamiento con el antagonista.

"Un paciente mantiene la capacidad de respuesta a un tratamiento" cuando la capacidad de respuesta del paciente no disminuye con el tiempo durante el transcurso de un tratamiento.

El término "muestra", tal como se usa en la presente, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra entidad molecular que ha de ser caracterizada y/o identificada, por ejemplo, sobre la base de características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra de la enfermedad" y variaciones de la misma se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto de interés para la cual se esperaría o se conoce que contiene la entidad celular y/o molecular que ha de ser caracterizada. La muestra se puede obtener a partir de un tejido para el sujeto de interés o a partir de la sangre periférica del sujeto.

"Un antagonista de integrina beta7" o "antagonista beta7" se refiere a cualquier molécula que inhibe una o más actividades biológicas o bloquea la unión de la integrina beta7 con una o más de sus moléculas asociadas. Los antagonistas de la invención se pueden usar para modular uno o más aspectos de los efectos asociados con beta7, que incluyen mas no se limitan a: la asociación con la subunidad de integrina alfa 4, la asociación con la subunidad de integrina alfa E, la unión de integrina alfa4beta7 a MAdCAM, VCA -1 o fibronectina y la unión de integrina alfaEbeta7 a E-caderina. Estos efectos pueden ser modulado por cualquier mecanismo relevante a nivel biológico, que incluye la interrupción de la unión de ligando a la subunidad beta7 o la integrina dimérica alfa4beta7 o alfaEbeta7, y/o mediante la interrupción de la asociación entre las subunidades de integrinas alfa y beta de tal manera que se inhiba la formación de la integrina dimérica. En una forma de realización de la invención, el antagonista beta7 es un anticuerpo anti-integrina beta7 (o anticuerpo anti-beta7). En una forma de realización, el anticuerpo anti-integrina beta7 es un anticuerpo anti-integrina beta7 humanizado y, con mayor particularidad, un anticuerpo anti-beta7 monoclonal humanizado recombinante (o rhuMAb beta7). En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-beta7 de la presente invención son anticuerpos antagonistas anti-integrina beta7 que inhiben o bloquean la unión de la subunidad beta7 con la subunidad de integrina alfa4, la asociación con la subunidad de integrina alfaE, la unión de integrina alfa4beta7 a MAdCAM, VCAM-1 o fibronectina y la unión de integrina alfaEbeta7 a E-caderina.

Por "subunidad beta7" o "subunidad ß7" se hace referencia a la subunidad de integrina ß7 humana (Erle et al., (1991 ) J. Biol. Chem. 266:11009-11016). La subunidad beta7 se asocia con la subunidad de integrina alfa4, tal como la subunidad alfa4 humana (Kilger y Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354). La integrina alfa4beta7 se expresa, según lo informado, sobre una mayoría de linfocitos maduros, así como también una pequeña población de timocitos, células de la médula ósea y mastocitos. (Kilshaw y Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21 :2591-2597; Gurish et al., (1992) 149: 1964-1972; y Shaw, S. K. y Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). La subunidad beta7 también se asocia con la subunidad alfaE, tal como la subunidad de integrina alfaE humana (Cepek, K. L, et al. (1993) J. Immunol. 150:3459). La integrina alfaEbeta7 se expresa en los linfocitos intra-epiteliales intestinales (HELs, del inglés Intra-Intestinal Epithelial Lymphocites) (Cepek, K. L. (1993) supra).

Por "subunidad alfaE" o "subunidad de integrina alfaE" o "subunidad ?a?" o "subunidad de integrina aE" o "CD103" se hace referencia a una subunidad de integrina que se encontró está asociada con integrina beta7 sobre linfocitos intra-epiteliales, donde la integrina alfaEbeta7 media la unión de los ¡ELs al epitelio intestinal expresando E-caderina (Cepek, K. L. et al. (1993) J. Immunol. 150:3459; Shaw, S. K. y Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335).

"MAdCAM" o "MAdCAM-1" son términos que se usan en forma intercambiable en el contexto de la presente invención y se refieren a la molécula de adhesión celular-1 de la adresina de la mucosa, que es un polipéptido de una sola cadena que comprende una cola citoplasmática corta, una región transmembrana y una secuencia extracelular compuesta por tres dominios de tipo inmunoglobulina. Los ADNc para MAdCAM-1 de murino, humano y macaco han sido clonados (Briskin, et al., (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan et al., (1996) J. Immunol. 156:2851-2857).

Las expresiones "VCAM-1 " o "molécula de adhesión celular-1 vascular" o "CD106" se refieren a un ligando de alfa4beta7 y alfa4beta1 , expresado sobre endotelio activado e importante en las interacciones endotelio-leucocito tal como unión y trasmigración de leucocitos durante la inflamación.

"CD45" se refiere a una proteína de la familia de las proteínas tirosina fosfatasas (PTP, del inglés Protein Tyrosine Phosphatase). Se conoce que las PTPs son moléculas de señalización que regulan una variedad de procesos celulares que incluyen el crecimiento celular, la diferenciación, el ciclo mitótico, y la transformación oncogénica. Esta PTP contiene un dominio extracelular, un único segmento transmembrana y dos dominios catalíticos intracitoplasmáticos en tándem, y por ende pertenece a la PTP de tipo receptor. Este gen se expresa específicamente en células hematopoyéticas. Se ha demostrado que esta PTP es un regulador esencial de la señalización de receptores de antígenos de células T y B. Funciona a través de interacción directa con los componentes de los complejos de los receptores de antígenos o mediante la activación de varias quinasas de familia Src necesarias para la señalización de receptores de antígenos. Esta PTP también suprime las JAK quinasas, y por ende funciona como un regulador de la señalización de receptores de citoquinas. Se han informado cuatro variantes de transcriptos alternativamente empalmadas de este gen, que codifican distintas isoformas. (Tchilian EZ, Beverley PC (2002). "CD45 in memory and disease". Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 50 (2): 85-93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, et al. (2004). "Interleukin-6, CD45 and the src-kinases in myeloma cell proliferation" '. Leuk. Linfoma 44 (9): 1477-81.

Existen varias isoformas de CD45: CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (ABC). La CD45 es también altamente glucosilada. La CD45R es la proteína más larga y migra a 200 kDa cuando es aislada de células T. Las células B también expresan CD45R con glicosilación más pesada, llevando el peso molecular a 220 kDa, de ahí el nombre "B220"; la isoforma de célula Bde 220 kDa. La expresión de B220 no se restringe a células B y también se pueden expresar sobre células T activadas, sobre un subconjunto de células dendríticas y otras células que presentan antígenos. Stanton T, Boxall S, Bennett A, et al. (2004). "CD45 variant alíeles: possibly increased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIV seropositive Ugandans." Immunogenetics 56 (2): 107-10.

"Linfocitos de alojamiento intestinal" hace referencia a un subgrupo de linfocitos que tienen la característica de alojarse selectivamente en los tejidos y nodulos linfáticos intestinales pero no al alojamiento en los tejidos y nodulos linfáticos periféricos. Este subgrupo de linfocitos se caracteriza por un único patrón de expresión de una combinación de múltiples moléculas de superficie celular que incluyen, mas no se limitan a, la combinación de CD4, CD45RA y Beta7. Típicamente, al menos dos subconjuntos de linfocitos CD4 + en sangre periférica se pueden subdividir sobre la base de los marcadores de las células CD45RA y Beta7, CD45RA" ß703?{0, y CD45RA" p7abaj0 CD4 + . Las células CD45RA~ 7Dalt0 CD4 + se alojan preferentemente en los tejidos y nodulos linfáticos intestinales, mientras que las células CD45RA" 70baj0 CD4 + se alojan preferentemente en los tejidos y nodulos linfáticos periféricos (Rott et al. 1996; Rott et al. 1997; Williams et al. 1998; Rosé et al. 1998; Williams y Butcher 1997; Butcher et al. 1999). Los linfocitos de alojamiento intestinal son, por ende, un subgrupo distintivo de linfocitos identificados como CD45RA" 7Galt0 CD4 + en un ensayo de citometria de flujo. Los métodos para identificar este grupo de linfocitos son ampliamente conocidos en el arte y también se revelan en detalle en los Ejemplos de la presente solicitud.

Tal como se usa en la presente con respecto a un marcador de superficie celular, el símbolo "+" indica una expresión positiva de un marcador de superficie celular. Por ejemplo, los linfocitos CD4 + son un grupo de linfocitos sobre cuyas superficies celulares se expresa CD4.

Tal como se usa en la presente con respecto a un marcador de superficie celular, el símbolo "-" indica una expresión negativa de un marcador de superficie celular. Por ejemplo, los linfocitos CD45RA" son un grupo de linfocitos sobre cuyas superficies celulares no se expresa CD45RA.

Tal como se usa en la presente con respecto a la expresión de un marcador de superficie celular, el símbolo "bajo" indica un nivel relativamente bajo de expresión de un marcador de superficie celular sobre linfocitos, mientras que "alto" indica un nivel relativamente alto de expresión de un marcador de superficie celular sobre linfocitos. En una citometría de flujo, la intensidad de ß7p3|?° es al menos de aproximadamente 10 o 100 veces más alta que la de 7Dbaj0. Por ende, tal como se indica en la presente en las formas de realización de ejemplo, los linfocitos CD45RA" 7Dbaj0 CD4 + y CD45RA" 7Dalt0 CD4 + se ubican en distintas porciones de una gráfica de puntos o histograma de un análisis de citometría de flujo donde el eje X es la intensidad de la expresión de CD45AR y el eje Y es la intensidad de la expresión de Beta7.

"Linfocitos de alojamiento periférico" hace referencia a un subgrupo de linfocitos que tienen la característica de alojarse en tejidos y nodulos linfáticos periféricos y no en tejidos y nodulos linfáticos intestinales. En una forma de realización de ejemplo, tal como se explicó con anterioridad en la presente, los linfocitos de alojamiento periférico son un grupo distintivo de linfocitos identificados como células CD45RA" 37Dbai° CD4 + en un ensayo de citometría de flujo. Los métodos para identificar este grupo de linfocitos son conocidos en el arte.

"Trastornos inflamatorios gastrointestinales" son un grupo de trastornos crónicos que causan inflamación y/o ulceración en la membrana mucosa. Estos trastornos incluyen, por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, colitis indeterminada y colitis infecciosa), mucositis (por ejemplo, mucositis oral, mucositis gastrointestinal, mucositis nasal y proctitis), enterocolitis necrotizante y esofagitis.

Las expresiones "enfermedad intestinal inflamatoria" o "IBD" se usan en forma intercambiable en la presente para hacer referencia a las enfermedades del intestino que causan inflamación y/o ulceración e incluyen, sin limitación, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.

La "enfermedad de Crohn (CD)" y la "colitis ulcerativa (CU)" son enfermedades intestinales inflamatorias crónicas de etiología desconocida. La enfermedad de Crohn -a diferencia de la colitis ulcerativa- puede afectar cualquier parte del intestino. La característica más prominente de la enfermedad de Crohn es el engrasamiento edematoso de color rojizo-violáceo granular de la pared intestinal. Con el desarrollo de la inflamación, estos granulomas con frecuencia pierden sus límites circunscriptos e se integran al tejido aledaño. Las características clínicas predominantes son la diarrea y la obstrucción del intestino. Tal como en el caso de la colitis ulcerativa, el curso de la enfermedad de Crohn puede ser continuo o recidivante, leve o severo, pero -a diferencia de la colitis ulcerativa- la enfermedad de Crohn no es curable por resección del segmento del intestino implicado. La mayoría de los pacientes con enfermedad de Crohn requieren cirugía en algún momento, pero la posterior recidiva es común y el tratamiento médico continuo es usual.

La enfermedad de Crohn puede afectar cualquier parte del tracto alimentario desde la boca hasta el ano, si bien típicamente aparece en la región ileo-cólica, del intestino delgado o colónico-anorrectal. A nivel histopatológico, la enfermedad se manifiesta mediante granulomatomas discontinuos, abscesos crípticos, fisuras y úlceras aftosas. El infiltrado inflamatorio es mixto, consta de linfocitos (células tanto T como B), células plasmáticas, macrófagos y neutrófilos. Existe un incremento desproporcionado en las células plasmáticas que segregan IgM e IgG, macrófagos y neutrófilos.

Los fármacos antiinflamatorios sulfasalazina y ácido 5-aminosalisílico (5-ASA) se usan para tratar enfermedad de Crohn colónica levemente activa y son comúnmente prescritos en un intento por mantener la remisión de la enfermedad. El metroidazol y la ciprofloxacina son similares en eficacia a la sulfasalazina y son particularmente prescritos para tratar enfermedad perianal. En algunos casos más severos, se prescriben corticosteroides para tratar exacerbaciones activas y pueden, a veces, mantener la remisión. La azatioprina y la 6-mercaptopurina también fueron usadas en pacientes que requieren la administración crónica de corticosteroides. Se ha sugerido que estos fármacos participan en la profilaxis a largo plazo. Desafortunadamente, puede existir un gran retraso (de hasta seis meses) antes de que ejerza acción en algunos pacientes. Los fármacos antidiarreicos también pueden brindar alivio de los síntomas en algunos pacientes. La terapia nutricional o dieta elemental pueden mejorar el estado nutricional de los pacientes e inducir la mejoría de los síntomas de la enfermedad aguda, pero no induce remisiones clínicas sostenidas. Se usan antibióticos para tratar el sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado secundario y en el tratamiento de complicaciones piogénicas.

La "colitis ulcerativa (CU)" aflige al intestino grueso. El curso de la enfermedad puede ser continuo o recidivante, leve o severo. La lesión más temprana es una infiltración inflamatoria con formación de abscesos en las bases de las criptas de Lieberkuhn. La coalescencia de estas criptas distendidas y rotas tienden a separar la mucosa superpuesta de su suministro de sangre, lo que genera ulceración. Los síntomas de la enfermedad incluyen calambres, dolor abdominal inferior, sangrado rectal, y frecuentes deposiciones blandas que consisten principalmente de sangre, pus y moco con escasas partículas fecales. Se puede requerir una colectomía total para la colitis ulcerativa incesante aguda, severa o crónica.

Las características clínicas de la CU son altamente variables, y el desencadenamiento puede ser insidioso o abrupto, y puede incluir diarrea, tenesmo y sangrado rectal recidivante. Con la implicación fulminante de todo el colon, puede aparecer el megacolon tóxico, una emergencia con riesgo de vida. Las manifestaciones extraintestinales incluyen artritis, pioderma gangrenoso, uveítis y eritema nodoso.

El tratamiento de la CU incluye sulfasalazina y fármacos relacionados que contienen salicilato para casos leves y fármacos corticosteroides para casos severos. La administración tópica de salicilatos o de corticosteroides a veces es efectiva, particularmente cuando la enfermedad se limita al intestino distal, y se asocia con una disminución de los efectos adversos en comparación con el uso sistémico. Las medidas de apoyo, tales como la administración de hierro y agentes antidiarreicos, a veces son indicadas. A veces también se prescribe azatioprina, 6-mercaptopurina y metotrexato para uso en los casos dependientes de corticosteroides refractarios.

Una "dosis efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y durante períodos de tiempo necesarios, a fin de alcanzar el resultado profiláctico o terapéutico deseado.

Tal como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier sujeto individual para quien el tratamiento es deseado. En ciertas formas de realización de la presente, el paciente es un humano.

Un "sujeto", en la presente, es típicamente un humano. En ciertas formas de realización, un sujeto es un mamífero no humano. Los ejemplos de mamíferos no humanos incluyen animales de laboratorio, domésticos, mascotas, animales de deporte y animales de granja, por ejemplo, ratones, gatos, perros, caballos y vacas. Típicamente, el sujeto puede ser elegido para el tratamiento, por ejemplo, tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.

Tal como se usa en la presente "tiempo de vida" de un sujeto se refiere al tiempo restante de la vida del sujeto una vez iniciado el tratamiento.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan en forma intercambiable en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre que exhiba la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpos (tal como se describe en mayor detalle en la presente). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o maduro en cuanto a la afinidad.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden solamente una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción preferentemente retiene al menos una -y típicamente la mayoría- de las funciones que normalmente se asocian con esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión de antígeno del anticuerpo intacto y, por ende, retiene la habilidad de unir el antígeno. En otra forma de realización, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, uno que comprende la región Fe, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociadas con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión de FcRn, modulación de la vida media del anticuerpo, función de ADCC y unión de complementos. En una forma de realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media ¡n vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, dicho fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión de antígeno ligado a una secuencia Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un único antígeno. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos monoclonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un único determinante sobre el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales en la presente específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica u homologa respecto de las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo respecto de las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente estadounidense N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de ¡nmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR del inglés Framework Región) de la ¡nmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una ¡nmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todos los de las FRs son los de una ¡nmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprende al menos una porción de una región constante (Fe del inglés Constant Región) de ¡nmunoglobulina, típicamente de una ¡nmunoglobulina humana. Para mayores detalles, véase Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase, además, los siguientes artículos de revisión y referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Un "anticuerpo humano" es aquél que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que ha sido hecho usando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos como los revelados en la presente. Dichas técnicas incluyen cribar bibliotecas combinatorias derivadas de humanos, tales como bibliotecas de visualización de fagos (véase, por ejemplo, Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) y Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)); usando líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991 )); y generando anticuerpos monoclonales en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena (véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)). Esta definición de anticuerpo humano excluye en forma específica un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión de antígeno a partir de un animal no humano.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ciertas formas de realización, el anticuerpo se purificará (1 ) a más del 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el método de Bajory, y con frecuencia más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal mediante el uso de secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductores usando colorante plata o azul de Coomassie. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no está presente. Por lo general, no obstante, el anticuerpo aislado se prepara mediante al menos un paso de purificación.

Las expresiones "región hipervariable" "HVR" o "HV" (del inglés Hypervariable Región) cuando se usan en la presente se refieren a las regiones de un dominio de anticuerpo variable que son hipervariables en secuencia y/o forman lazos estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (H1 , H2, H3), y tres en VL (L1 , L2, L3). Un número de delineaciones de regiones hipervariables se encuentra en uso y están abarcadas en la presente. Las regiones de determinantes de complementariedad de Kabat (CDRs del inglés Complementarity Determining Regions) se basan en la variabilidad de las secuencias y son más comúnmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 )). Chothia en cambio se refiere a la ubicación de los lazos estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDRs de Kabat y los lazos estructurales de Chothia, y son usadas por el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVRs se destacan a continuación.

Lazo Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Enumeración de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Enumeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" tales como las siguientes: 24-36 o 24-34 (L1 ), 46-56 o 49-56 o 50-56 o 52-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL y 26-35 (H1 ), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en VH. Los residuos de dominios variables se enumeran de acuerdo con Kabat et al., supra para cada una de estas definiciones.

Los residuos "estructurales o "FR" (del inglés Framework) son aquellos residuos de dominios variables distintos de los residuos de regiones hipervariables tal como se definen en la presente.

Una "estructura de consenso humana" es una estructura que representa los residuos de aminoácidos que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias estructurales VL o VH de inmunoglobulina humana. Por lo general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza a partir de un subgrupo de secuencias de dominios variables. Por lo general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo tal como lo describen Kabat et al. En una forma de realización, para VL, el subgrupo es un subgrupo kappa I tal como lo describen Kabat et al. En una forma de realización, para VH, el subgrupo es un subgrupo III tal como lo describen Kabat et al.

Un anticuerpo "maduro en cuanto a la afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo, que generan una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esa(s) alteración(es). En ciertas formas de realización, los anticuerpos maduros en cuanto a la afinidad tienen afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno blanco. Los anticuerpos maduros en cuanto a la afinidad son producidos mediante procedimientos conocidos en el arte. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración en cuanto a la afinidad mediante barajado de dominios VH y VL. La mutagenesis aleatoria de CDR y/o residuos estructurales es descrita por: Barbas et al. Proc Nal Acad. Sci, USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1996); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

La frase "sustancialmente similar" o "sustancialmente igual", tal como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por lo general, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/de comparación) a tal punto que la persona versada en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores de poca o ninguna importancia biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores es menor a aproximadamente 50%, menor a aproximadamente 40%, menor a aproximadamente 30%, menor a aproximadamente 20%, menor a aproximadamente 10% como una función del valor para el anticuerpo de referencia/de comparación.

"Afinidad de unión" por lo general se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y por lo general puede representarse mediante la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir mediante métodos comunes conocidos en el arte, que incluyen los descritos en la presente. Los anticuerpos de afinidad baja por lo general unen el antígeno lentamente y tienden a disociarse rápidamente, mientras que los anticuerpos de afinidad alta por lo general unen el antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. En el arte se conocen una variedad de métodos para medir la afinidad de unión; cualquiera de ellos se puede usar para los fines de la presente invención.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren en gran medida en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no se distribuye en forma uniforme en todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados "regiones hipervariables" en los dominios variables tanto de cadena liviana como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan "regiones estructurales" (FRs). Los dominios variables de las cadenas livianas y pesadas nativas comprenden, cada uno, cuatro FRs, adoptando en gran medida una configuración de lámina ß, conectada mediante tres regiones hipervariables, que forman lazos que conectan, en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas juntas en cercana proximidad por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC del inglés Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity).

La digestión de papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión de antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión de antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse rápidamente. El tratamiento de pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión de antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión de antígeno y de reconocimiento de antígeno completo. Esta región consta de un dímero de dominio variable de una cadena pesada y una cadena liviana en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión de antígeno sobre la superficie del dímero VR-VL. En forma colectiva, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. No obstante, incluso un único dominio variable (o mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir el antígeno, si bien a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1 ) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab= difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisternas de la región bisagra del anticuerpo. "Fab'-SH" es la designación, en la presente, para Fab' en donde el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otras copulaciones químicas de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas livianas" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno entre dos tipos claramente distintos, denominados kappa (?) y lambda (?), sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Según las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases.

Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (¡sotipos), por ejemplo, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son ampliamente conocidas y se describen, por lo general, por ejemplo, en Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4ta ed. (W. B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más proteínas o péptidos adicionales.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se usan en la presente en forma intercambiable para hacer referencia a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no los fragmentos de anticuerpos tal como se definen a continuación. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fe.

Un "anticuerpo desnudo" a los fines de la presente es un anticuerpo que no está conjugado a una fracción citotóxica o radiomarcador.

El término "región Fe" en la presente se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, con inclusión de las regiones Fe de secuencias nativas y regiones Fe variantes. Si bien las fronteras de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fe de cadena pesada de IgG humana usualmente se define por cubrir desde un residuo de aminoácido en posición Cys226, o desde Pro230, hasta su término carboxilo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de enumeración EU) de la región Fe se puede extraer, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o al diseñar en forma recombinante el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 extraídos, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 extraídos, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.

A menos que se indique lo contrario, en la presente la enumeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU tal como lo describen Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), que se incorpora expresamente en la presente por referencia. El "índice EU tal como lo describe Kabat" se refiere a la enumeración de residuos del anticuerpo EU de lgG1 humana.

Una "región Fe funcional" posee una "función efectora" de una región Fe de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" de ejemplo incluyen unión de C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; unión de receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe esté combinada con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar usando varios ensayos tal como los descritos en la presente, a modo de ejemplo.

Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Las regiones Fe humanas de secuencias nativas incluyen una región Fe de lgG1 humana de secuencia nativa (alotipos A y no A); región Fe de lgG2 humana de secuencia nativa; región Fe de lgG3 humana de secuencia nativa; y región Fe de lgG4 humana de secuencia nativa así como también variantes de origen natural de las mismas.

Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. En ciertas formas de realización, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido parental, por ejemplo, desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y en ciertas formas de realización, desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido parental. En ciertas formas de realización, la región Fe variante de la presente posee al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido parental, o al menos aproximadamente 90% de homología con la misma, o al menos aproximadamente 95% de homología con la misma.

En función de la secuencia de aminoácidos de dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos pueden ser subdivididos en "subclases" (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, e lgA2. Sus dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos reciben la denominación a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de estructuras de unidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

La expresión "citotoxicidad mediada por células función de anticuerpo" se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no especificas que expresan factores de Fe (FcRs) (por ejemplo células NK (Natural Killer, Killer naturales), neutrófilos, y macrófagos) reconocen un anticuerpo ligado sobre una célula objetivo y subsiguientemente causan la lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FCYRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FCYRI, FcyRIl y FCYRIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Quinat, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, es posible llevar a cabo un ensayo de ADCC in vitro, tales como el descrito en las patentes de los EE. UU. N.° 5,500,362 o 5,821 ,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen PBMC (peripheral blood mononuclear cells, células mononucleares de sangre periférica) y las células NK (Natural Killer). Como alternativa o a título adicional, es posible evaluar in vivo la actividad de ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el que se revela en Clynes ef al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo funciones efectoras. En determinadas formas de realización, las células expresan por lo menos FCYRIII y llevan a cabo una función efectora de ADCC . Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen las PBMC (peripheral blood mononuclear cells, células mononucleares de sangre periférica), células NK (Natural Killer, Killer naturales), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa de las mismas, por ejemplo, de la sangre o de PBMC descrito en la presente.

Las expresiones "Fe receptor" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se liga a la región de Fe de un anticuerpo. En determinadas formas de realización, un FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR es uno que se liga a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye los receptores de las subclases FCYRI, FCYRII, y FCYRIII, lo que incluye las variantes alélicas y las formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FCYRIIA (un "receptor activante") y FcyRI IB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren primariamente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcyRIIA contiene un ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, motivo de activación basado en el inmuno receptor tirosina) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, motivo de inhibición basado en inmuno receptor tirosina) en su dominio citoplásmico (Véase una revisión en: Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcRs son objeto de una revisión en: Ravetch and Quinat, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991 ); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). En la presente, otros FcRs, que incluyen los que han de ser identificados en el futuro, están incluidos en la expresión "FcR". La expresión también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas. Anticuerpos con una mejor ligación al neonatal Fe receptor (FcRn), y mayores semividas, se describen en el documento WO 00/42072 (Presta, L.) y US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Estos anticuerpos comprenden una región de Fe con una o más sustituciones en la presente que mejoran la ligación de la región de Fe a FcRn. Por ejemplo, la región de Fe puede tener sustituciones en una o más de las posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 31 1 , 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 ó 434 (numeración Eu de los residuos). En determinadas formas de realización, la variante de anticuerpo que comprende la región Fe con una mejor ligación comprende sustituciones de aminoácidos en una, dos o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de la región de Fe de la misma (numeración Eu de los residuos).

Los fragmentos de anticuerpo "FV de cadena simple" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios se hallan presentes en una única cadena de polipéptidos. En determinadas formas de realización, el polipéptido Fv comprende además un ligador polipéptido entre los dominios VH y VL lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la ligación del antígeno. Para una revisión del scFv véase: Plückthun en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Los fragmentos HER2 anticuerpo scFv se describen en el documento W093/16185; en la patente de los EE. UU. N.° 5.571.894; y en la patente de los EE. UU. N.° 5.587.458.

La expresión "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de ligación de antígeno, los cuales fragmentos comprenden un dominio variable pesado (VH) conectado a un dominio liviano variable (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL). Mediante la utilización de un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de ligación de antígeno. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161 ; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "madurado en afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables del mismo que tienen como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo genitor que no posee tal(es) alteracion(es). En determinadas formas de realización, los anticuerpos madurados en afinidad tendrán afinidades nanomolares o aún picomolares con respecto al antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados en afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la especialidad. Marks et al. Bio/Technology 10:779—783 (1992) describe la maduración de afinidad mediante barajeo de los dominios de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o de los residuos de armazón se describe en: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

En la presente, una "variante de secuencias de aminoácidos" es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos que difiere de un anticuerpo de especie principal. En determinadas formas de realización, las variantes de secuencias de aminoácidos poseerán una homología de por lo menos el 70% con el anticuerpo de especies principal, o tendrán una homología de por lo menos aproximadamente 80%, o de por lo menos aproximadamente 90% con el anticuerpo de especies principal. Las variantes de secuencias de aminoácidos poseen sustituciones, supresiones, y/o adiciones en determinadas posiciones dentro de, o adyacentes a, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos en la presente incluyen una variante ácida (por ejemplo, una variante de anticuerpo desamidada), una variante básica, un anticuerpo con una extensión líder amino-terminal (por ejemplo, VHS-) sobre una o dos cadenas livianas del mismo, un anticuerpo con un residuo lisina C—terminal sobre una o más cadenas pesadas del mismo, etc., e incluyen combinaciones de variaciones correspondientes a las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y/o livianas. La variante de anticuerpo de particular interés en la presente es el anticuerpo que comprende una extensión líder amino-terminal sobre una o dos cadenas livianas del mismo, que opcionalmente comprende además otra secuencia de aminoácidos y/o diferencias de glicosilación con respecto al anticuerpo de especies principal.

En la presente, un anticuerpo "variante de glicosilación" es un anticuerpo con una o más partes carbohidrato fijadas a él que difieren de una o más partes carbohidrato fijadas a un anticuerpo de especie principal. Los ejemplos de variantes de glicosilación en la presente incluyen un anticuerpo con una estructura oligosacárida G1 o G2, en lugar de de una estructura oligosacárida Go, fijada a una región de Fe de la misma, habiendo una o dos partes carbohidrato fijadas a una o dos cadenas livianas de la misma, un anticuerpo sin carbohidrato fijado a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, etc., y combinaciones de las alteraciones de glicosilación. Cuando el anticuerpo tiene una región de Fe, es posible fijar una estructura oligosacárida a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, por ejemplo en el residuo 299 (298, numeración Eu de residuos).

La expresión "agente citotóxico" tal como se la utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de células. La expresión tiene por objeto incluir isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y las toxinas tales como las toxinas de moléculas pequeñas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, lo que incluye fragmentos y/o variantes de las mismas.

La expresión "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citoquinas abarcan las linfoquinas, monoquinas, y las hormonas polipéptidas tradicionales. Entre las citoquinas se hallan las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humano, la hormona de crecimiento humano N-metionilo, y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratiroidea; la tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; las hormonas glicoproteínas tales como el FSH (follicle stimulating hormone, hormona estimuladora de los folículos), la TSH (thyroid stimulating hormone, hormona estimuladora de la tiroides), y la LH (luteinizing hormone, hormona luteinizante), el factor del crecimiento de los fibroblastos, la prolactina; el lactógeno placentario, factor a y beta de la necrosis de los tumores, la sustancia inhibidora mullerian de péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor del crecimiento endotelial, integrina; trombopoietina (TPO); los factores del crecimiento de los nervios tales como NGF-ß; factor del crecimiento de las plaquetas, TGFs (transforming growth factors, factores de crecimiento de transformación) tales como TGF-a y TGF-ß; el factor I y II similar a insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-a, -ß, y -?; los factores estimuladoras de colonias (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); las interleuquinas (ILs) tales como IL-1 , IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL— 10, IL-11 , IL-12; un factor de la necrosis de los tumores tales como TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipéptidos que incluyen LIF y KL (kit ligand, ligando de kit). Tal como se la utiliza en la presente, la expresión "citoquina" incluye las proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células recombinantes y de los equivalentes citoquinas de secuencia nativa.

En la presente, la expresión "agente inmunosupresor" tal como se la utiliza en la presente para la terapia adjunta, se refiere a sustancias que actúan de manera de suprimir o enmascarar el inmuno sistema del sujeto sometido a tratamiento. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citoquina, regulan descendentemente o suprimen la autoexpresión de antígenos, o enmascaran los antígenos de MHC. Los ejemplos de tales agentes incluyen las pirimidinas 2-aminc— 6-aril-5-sustituidas (Véase la patente de los EE. UU. N.° 4,665,077); los NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs, fármacos antiinflamatorios no esferoides); ganciclovir; tacrolimus; los glucocorticoides tales como el cortisol o la aldosterona; los agentes anti-inflamatorios tales como un inhibidor de la ciclooxigenasa; un inhibidor de 5-lipoxigenase, o un antagonista del receptor de leucotrieno; los antagonistas de la purina tales como la azatioprina o el micofenotomofetil (MMF); los agentes alquilantes ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que enmascara los antígenos de MHC, descrito en la patente de los EE. UU. N.° 4.120., 649); los anticuerpos anti-idiotípicos para los antígenos de MHC y los fragmentos de MHC; la ciclosporina; 6 mercaptopurina; los esteroides tales como los corticosteroides o los glucocorticosteroides o análogos de los glucocorticoides, por ejemplo, la prednisona, metilprednisolona, lo que incluye SOLU-MEDROL.RTM. metilprednisolona sodio succinato, y dexametasona; los inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como el metotrexato (oral o subcutáneo); los agentes antimalaria tales como la cloroquina e hidroxicloroquina; sulfasalazina; leflunomida; los anticuerpos o antagonistas de citoquina o del receptor de citoquina, lo que incluye los anticuerpos anti-interferón-alfa, -beta, o -gamma, anticuerpos a anti de TNF(factor de necrosis de los tumores) (infliximab (REMICADE.RTM.) o adalimumab), anti-TNF-alfa immunoadhesina (etanercept), anticuerpos anti-TNF-beta, y anticuerpos anti-interleuquina-2 (IL-2) y anticuerpos anti— IL— 2 receptor, y anticuerpos y antagonistas anti-interleuquina-6 (IL— 6) ; anticuerpos anti-LFA-1 , lo que incluye anticuerpos anti-CD11a y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; la globulina heterologa anti-linfocito; los anticuerpos pan-T; los anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; un péptido soluble que contiene un dominio ligante LFA-3 (WO 90/08187 publicado el 26 de julio de 1990); estreptoquinasa; factor beta de crecimiento de transformación (TGF-beta); estreptodomasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; clorambucil; desoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (Cohén et al., patente de los EE. UU. N.° 5,114,721 ); fragmentos del receptor de las células T (Offner et al., Science, 251 : 430-432 (1991 ); WO 90/11294; laneway, Nature, 341 : 482 (1989); y WO 91/01133); antagonistas de BAFF tales como anticuerpos de BAFF o BR3 o inmuno adhesinas y antagonistas de zTNF4 (para una revisión, véanse Mackay y Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002) y véase también la siguiente definición; los agentes biológicos que interfieren con la señales de las células T Helper, tales como el ligando anti-CD40 receptor o anti-CD40 (CD154), lo que incluye anticuerpos bloqueantes con respecto al ligando CD40-CD40 (por ejemplo, Durie et al., Science, 261 : 1328-30 (1993); Mohán et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)) y CTLA4-Ig (Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)); y los anticuerpos de receptor anti-célula T (EP 340,109) tales como T10B9.

Las expresiones "mejora" o "mejoría" tal como se las utiliza en la presente se refieren a una disminución, reducción o eliminación de una condición, enfermedad, trastorno o fenotipo, lo que incluye una anomalía o un síntoma.

Un "síntoma" de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, la enfermedad inflamatoria de los intestinos, por ejemplo, la colitis ulcerante o la enfermedad de Crohn) es un fenómeno o alejamiento mórbidos con respecto a lo normal en cuanto a estructura, función o sensación, experimentados por un sujeto e indicativo de una enfermedad.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para prevenir, realizar una mejoría en, o tratar una enfermedad o trastorno (por ejemplo, la enfermedad inflamatoria de los intestinos, por ejemplo, la colitis ulcerante o la enfermedad de Crohn). Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo se refiere a una cantidad del anticuerpo que es efectiva para prevenir, realizar una mejoría en, o tratar la enfermedad o trastorno especificados. De manera similar, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una combinación de un anticuerpo y un segundo compuesto se refiere a una cantidad del anticuerpo y una cantidad del segundo compuesto que, en combinación, es efectiva para prevenir, realizar una mejoría en, o tratar la enfermedad o trastorno especificados.

Debe entenderse que la expresión "una combinación de" dos compuestos no significa que los compuestos han de administrarse mezclados entre si. Por lo tanto, el tratamiento o uso de una combinación de este tipo abarca la mezcla de los compuestos o una administración por separado de los compuestos, e incluye la administración en el mismo día o en días diferentes. Por lo tanto la terminología "combinación" significa que se utilizan dos o más compuestos para el tratamiento, sea individualmente sea conjuntamente en forma de una mezcla conjunta. Si se administra un anticuerpo y un segundo compuesto, por ejemplo, en combinación a un sujeto, el anticuerpo se halla presente en el sujeto en un momento en el que el segundo compuesto también se halla presente en el sujeto, tanto si el anticuerpo y el segundo compuesto se administran al sujeto individualmente o en forma de mezcla. En determinadas formas de realización, antes del anticuerpo se administra un compuesto diferente del anticuerpo. En determinadas formas de realización, después del anticuerpo se administra un compuesto diferente del anticuerpo.

A los fines de la presente, la expresiones "factor a de necrosis de los tumores" se refiere a una molécula TNF-a que comprende la secuencia de aminoácidos descrita in Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) o en Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985).

En la presente, un "inhibidor de TNF-alfa" es un agente que inhibe, en alguna amplitud, un función biológica del TNF-alfa, generalmente por medio de ligación al TNF-alfa y neutralización de su actividad. Los ejemplos de inhibidores de TNF específicamente considerados en la presente son el etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®), adalimumab (HUMIRA®), golimumab (SIMPONITM), y certolizumab pegol (CIMZIA®).

La expresión "corticosteroide" se refiere a cualquiera de varias sustancias de presentación natural o sintetizadas que imitan o aumentan los efectos de los corticosteroides de presentación natural. Los ejemplos de corticosteroides sintéticos abarcan prednisona, prednisolona (que incluye metilprednisolona), dexametasona triamcinolona, y betametasona.

La expresión "antagonista" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, inhibir, abrogar, reducir o interferir con, las actividades de una proteína especificada, lo que incluye su ligación a uno o más receptores en el caso de un ligando o ligación a uno o más ligandos en el caso de un receptor. Los antagonistas incluyen los anticuerpos y los fragmentos de los mismos que ligan antígenos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de transcripción y de traducción, y similares. Los antagonistas también incluyen inhibidores de pequeñas moléculas de la proteína, y proteínas de fusión, y derivados que se ligan específicamente a la proteína, con lo que secuestran su ligación a su objetivo, variantes de antagonistas de la proteína, moléculas antisentido dirigidas a la proteína, aptámeros de ARN, y ribozimas contra la proteína.

La expresión "dispositivo de autoinyección" se refiere a un dispositivo médico para la autoadministración de un agente terapéutico, por ejemplo, por un paciente o mediante una persona que provee cuidados a domicilio. Los dispositivos de autoinyección incluyen dispositivos autoinyectores y otros dispositivos diseñados para la autoadministración.

En la presente se definen o caracteriza de alguna otra manera una variedad de términos adicionales.

COMPOSICIONES Y MÉTODOS A. Antagonistas de Beta7 integrina Se proveen métodos para tratar un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, mediante la administración de antagonistas de la beta7 integrina. Los ejemplos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se liga a las fusiones de inmunoglobulina con beta7 integrina, y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como también anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Como alternativa, un antagonista potencial puede ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada de la beta7 integrina que reconoce el ligando pero no imparte ningún efecto, con lo que inhibe de manera competitiva la acción de la beta7 integrina.

Otro antagonista potencial de la beta7 integrina es un constructo ARN o ADN antisentido preparado mediante el uso de tecnología antisentido, donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa de manera de bloquear directamente la traducción de mARN por el hecho de hibridar al mARN apuntado y de prevenir la traducción de la proteína. Es posible utilizar la tecnología antisentido para expresar la expresión de los genes por intermedio de la formación de triple hélice o de ADN o ARN; estos dos métodos se basan en la ligación de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia de polinucleótidos, que en la presente codifica la beta7 integrina, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN de manera que sea complementario con una región del gen que interviene en la transcripción (triple hélice-véase Lee et al., Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241 : 456 (1988); Dervan et al., Science, 251 :1360 (1991 )), con lo que se previene la transcripción y la producción de la beta7 integrina. El oligonucleótido de ARN antisentido híbrida con el mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN en la proteína beta7 integrina (antisentido— Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, Fia., 1988). Los oligonucleótidos arriba descritos también pueden ser entregados a células de manera tal que el ARN o ADN antisentido puedan ser expresados in vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO . Si se utiliza ADN antisentido, los oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de traducción-iniciación, por ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo, son típicos.

Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se ligan al sitio activo, con el ligando o con el sitio de ligación de la molécula, con lo que bloquean la actividad biológica normal de la beta7 integrina. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, típicamente péptidos solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptidilo sintéticos.

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el desdoblamiento especifico del ARN. Las ribozimas actúan mediante hibridación especifica para las secuencias, para el ARN objetivo complementario, seguida por desdoblamiento endonucleolítico. Los sitios específicos para el desdoblamiento de ribozima dentro de un ARN objetivo potencial pueden ser identificados mediante técnicas conocidas. Para mayores detalles véanse, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y la Publicación de PCT N.° WO 97/33551 (publicado el 18 de setiembre de 1997).

Las moléculas de ácido nucleico en la formación de la triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser monocatenarias y compuestas de desoxinucleótidos. La composición de base de estos oligonucleótidos se diseña de manera tal que promueve la formación de la triple hélice por intermedio de las reglas de apareamiento de bases de Hoogsteen, que por lo general requieren tramos considerables de purinas o de pirimidinas en una de las cadenas de un dúplex. Para mayores detalles véase por ejemplo, la Publicación de PCT N.° WO 97/33551. Estas pequeñas moléculas pueden ser identificadas mediante cualquiera de los ensayos de selección sistemáticas anteriormente descritas en la presente y/o mediante cualesquiera otras técnicas de selección sistemática bien conocidas de la persona con pericia en la especialidad.

Los ensayos de selección sistemática para los antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se ligan o forman complejos con la beta7 integrina codificada por los genes identificados en la presente, o que de alguna otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Dichos ensayos de selección sistemática incluirán ensayos aptos para la selección sistemática de elevada productividad horaria de bibliotecas químicas, lo que los hace particularmente adecuados para identificar candidatos a fármacos de pequeñas moléculas.

Los ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, e incluyen ensayos de ligación proteína-proteína, ensayos de selección sistemática bioquímicas, e inmunoensayos, y ensayos basados en células, bien caracterizados en la especialidad. B. Anticuerpos anti- beta 7 inteqrina En una forma de realización, los antagonistas de beta7 integrina son anticuerpo anti-beta7. Los anticuerpos dados a título de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, humanos, biespecíficos, y heteroconjugados, etc., descritos en lo que sigue 1. Anticuerpos policlonales Es posible suscitar anticuerpos policlonales en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (SC) o intraperitoneales (IP) del antígeno relevante y de un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en la especie a ser inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa bocallave, albúmina de suero, tiroglobuiina bovina o inhibidor de tripsina de soja, mediante la utilización de un agente bifuncional o derivante, por ejemplo, maleimidobenzoíl sulfosuccinimida éster (conjugación por intermedio de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (por intermedio de residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCfe, o R1N=C=NR, donde R y R1 son diferentes grupos alquilo.

Se inmunizan animales contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación por ejemplo, de 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund, e inyectándose la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después los animales reciben un refuerzo con de 1/5 a 1710 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. A los siete a catorce días se sangraron los animales, y se ensayó el suero para establecer la titulación del anticuerpo. Los animales reciben un refuerzo hasta la meseta de la titilación. En determinadas formas de realización, el animal recibe un refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un agente reticulante diferente. También es posible preparar conjugados en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. También pueden utilizarse de manera conveniente agentes de agregación tales como alumbre para reforzar la inmuno respuesta.. 2. Anticuerpos monoclonales Es posible preparar anticuerpos monoclonales mediante el método de hibridomas descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o también es posible prepararlos mediante métodos de ADN recombinante (Véase por ejemplo, la patente de los EE. UU. N.° 4.816.567).

En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped adecuado, tal como un hámster, como arriba descrito a efectos de suscitar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se ligarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Como alternativa, es posible inmunizar linfocitos in vitro. Después de la inmunización, se aislan los infocitos y se los fusiona con una cepa de células de mieloma para lo cual se utiliza un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, de manera de formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo adecuado, el cual medio puede contener una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma genitoras no fusionadas (que también reciben la designación de "compañero de fusión"). Por ejemplo, si la célula de mieloma genitora carece de la HGPRT o HPRT (enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopteria, y timidina (medio HAT), las cuales sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

En determinadas formas de realización, las células de mieloma compañeras de fusión son aquellas que fusionan eficientemente, soportan una producción estable de elevado nivel de anticuerpos por las células seleccionadas productoras de anticuerpos, y son sensibles a un medio selectivo que selecciona en contra de las células genitoras no fusionadas. En determinadas formas de realización, las cepas de células de mieloma son cepas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 provistos por el Salk Institute Cell Distribución Center, San Diego, Calif. USA, y las derivadas SP-2 por ejemplo, células X63-Ag8-653 provistas por The American Type Culture Collection, Manassas, Va., USA. También se han descrito cepas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Se ensaya el medio de cultivo en el que están creciendo células de hibridoma para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. En determinadas formas de realización, se determina el carácter de ligación específico de los anticuerpos monoclonales mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de ligación in vitro, tales como radioinmunoensayo (RIA) o ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) La afinidad de ligación del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo mediante el análisis de Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Una vez que se han identificado células de hibridoma que producen anticuerpos con el carácter específico, afinidad, y/o actividad, deseados, es posible subclonar los clones mediante la limitación de los procedimientos de dilución, y se los cultiva mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para esta finalidad incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, es posible cultivar las células de hibridoma ¡n vivo como tumores de ascites en un animal por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en ratones. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados de manera conveniente del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero, mediante procedimientos de purificación convencionales para anticuerpos tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, mediante proteína A o proteína G-Sefarosa) o mediante cromatografía de intercambio de iones, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis sobre gel, diálisis, etc.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se lo secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante sondas de oligonucleótidos que son capaces de ligarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente de dicho ADN. Una vez aislado, es posible colocar el ADN en vectores de expresión, los que son seguidamente transfectados en células huésped tales como células E. coli, células COS de simios, células CHO (Chínese Hámster Ovary, de ovario de hámster chino), o células de mieloma que por lo demás no produzcan proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en las bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).

En otra forma de realización, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generados por ejemplo mediante las técnicas descritas en: McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson er a/., Nature, 352:624-628 (1991 ) y Marks er a/., J. Mol. Biol., 222:581- 597 (1991) describe la aislación de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, mediante la utilización de bibliotecas de fagos. En publicaciones subsiguientes se describe la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (en el intervalo de nM) mediante baraje de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como también mediante infección combinatoria y recombinación ¡n vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21 :2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para la aislación de anticuerpos monoclonales.

El ADN que codifica el anticuerpo puede ser modificado para producir polipéptidos de anticuerpo quiméricos o de fusión, por ejemplo, mediante la substitución de secuencias de dominios constantes de cadena pesada y liviana humanas (CH y CL) para las secuencias murinas homologas (patente de los EE. UU. N.° 4.816.567; y Morrison, eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984)), para lo cual se utiliza la secuencia que codifica la inmunoglobulina con la totalidad o una parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptidos no inmunoglobulina pueden reemplazar los dominios de un anticuerpo, o se los reemplaza por los dominios variables de un sitio que combina un antígeno de un anticuerpo a efectos de crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio que combina un antígeno que tiene un carácter específico para un antígeno y otro sitio que combina un antígeno que tiene una carácter específico para un antígeno diferente.

Los ejemplos de anticuerpos anti-beta7 abarcan Fib504, Fib 21 , 22, 27, 30 (TidsweII, M. J Immunol. 1997 Aug 1 ;159(3): 1497-505) o derivados humanizados de los mismos. Los anticuerpos humanizados de Fib504 se revelan en detalle en la Publicación U.S. N.° 20060093601 (emitida como patente de los EE. UU. N.° 7.528.236), la totalidad de cuyo contenido se incorpora en la presente a título de referencia (véase también la siguiente exposición). 3. Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos anti-beta7 integrina de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinas) abarcan las inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias ligantes de antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en el que unos residuos de una CDR (complementary determining región, región determinadora complementaria) del receptor ha sido reemplazados por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo de donante) tales como ratón, rata o conejo que tienen el carácter específico, afinidad y capacidad deseados. En algunos casos, los residuos de armazón de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también comprenden residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR o secuencias de armazón. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos una, y típicamente dos, dominios variables, en los que sustancialmente la totalidad de las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y sustancialmente la totalidad de las regiones de FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá de manera óptima por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la especialidad. En términos generales, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos él desde una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos reciben frecuentemente la designación de residuos "importados", que típicamente se toman de u n dominio variable de "importación". Esencialmente, la humanización puede llevarse a cabo mediante el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], para lo cual se sustituyen secuencias de CDRs o de CDR de roedor en lugar de las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por lo tanto, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los EE. UU. N.° 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio humano variable intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y algunos residuos de FR han sido reemplazados por residuos tomados de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La elección de los dominios humanas variables, tanto livianas como pesadas, a ser realizada para marcar los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir el carácter antigénico y las respuesta HAMA (human anti-ratón anticuerpo humano anti-ratón) cuando el anticuerpo está destinado a uso terapéutico humano. De acuerdo con el denominado método del "best-fit (mejor calce)" la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es sometida a una selección sistemática contra la totalidad de la biblioteca de secuencias de dominio humano variable conocidas. Se identifica la secuencia de dominio V humana que se halle más cercana a la del roedor y la FR (regiones de armazón) humana dentro de la misma aceptada para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151 :2296 (1993); Chothia eí al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). En otro método se utiliza una región de armazón en particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas livianas o pesadas. Puede utilizarse el mismo armazón para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151 :2623 (1993)). También es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de una elevada afinidad de ligación para el antígeno y de otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esto, de acuerdo con determinadas formas de realización, se preparan los anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias genitoras de diversos productos humanizados conceptuales, para lo cual se utilizan modelos tridimensionales de las secuencias genitoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina son comúnmente disponibles y son conocidos de las personas con pericia en la especialidad. Se dispone de programas de computadoras que ilustran y visualizan estructuras conformacionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La observación de estas visualizaciones permite el análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de ligarse a su antígeno. De esta manera, es posible seleccionar los residuos de FR y combinárselos a partir de las secuencias del receptor y de importación de manera tal que se logre la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad con respecto al o los antígenos. En términos generales, los residuos de la región hipervariable son los que intervienen directamente y más sustancialmente en la ligación del antígeno.

Se consideran diversas formas de anticuerpo anti-beta7 integrina humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que está opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos a efectos de generar un inmunoconjugado. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo conjugado, tales como un anticuerpo lgG1 intacto.

Los anticuerpos anti-beta7 humanizados dados a título de ejemplo incluyen, pero sin limitación rhuMAb Beta7, que es un anticuerpo monoclonal humanizado contra la subunidad integrinaü DP7 y que fue derivado a partir del anticuerpo monoclonal humano de rata anti-ratón FIB504 (Andrew et al., 1994 J Immunol 1994;153:3847-61 ). Ha sido diseñado de manera de incluir la cadena pesada de la inmunoglobulina humana lgG1 y los armazones de cadena liviana ?1 , y es producido por células de ovario de hámster chino. Este anticuerpo se liga a dos integrinas, a4ß7 (Holzmann et al. 1989 Cell, 1989;56:37-46; Hu ef al., 1992, Proc Nati Acad Sci USA 1992;89:8254-8) y a?ß7 (Cepek et al., 1993 J Immunol 1993;150:3459-70), que regulan el tráfico y la retención de los subconjuntos de linfocitos en el tracto gastrointestinal e intervienen en las IBD (inflammatory bowel disease, enfermedades inflamatorias del intestino) tales como la colitis ulcerante (UC) y la enfermedad de Crohn's (CD). rhuMAb Beta7 es un potente bloqueador in vitro de la interacción celular entre a4ß7 y sus ligandos (molécula de adhesión de adresina mucosal- [MAdCAM]-1 , molécula de adhesión de células vasculares [VCAM]-1 , y fibronectina) así como también de la interacción entre a?ß7 y su ligando (E-cadherina). rhuMAb Beta7 se liga de manera reversible, con una elevada afinidad similar, a ß7 sobre los linfocitos de conejos, monos cynomolgus, y seres humanos. También se liga a un ß7 de ratón con una elevada afinidad. La secuencia de aminoácidos como también la preparación mediante rhuMAb Beta7 y de sus variantes se revelan in detalle en por ejemplo la Solicitud de patente N.° 20060093601 (emitida como patente de los EE. UU. N.° 7.528.236), cuyo contenido se revela en la presente en su totalidad.

En las FIGS. 6A y 6B se ilustra la alineación de secuencias de cadenas livianas y pesadas variables para los siguientes: secuencia de consenso de kappa I de subgrupo de cadena humana liviana (FIG. 6A, SEQ ID NO:12), secuencia de consenso de subgrupo III de cadena pesada humana (FIG. 6B, SEQ ID NO:13), anticuerpo de rata anti-ratón beta7 (Fib504) cadena liviana variable (FIG. 6A, SEQ ID NO:10), anticuerpo de rata anti-ratón beta7 (Fib504) cadena pesada variable (FIG. 6B, SEQ ID NO:11 ), y variantes de anticuerpo humanizado. La cadena liviana variable hu504Kinjerto humanizado (FIG. 6A, SEQ ID NO:14), cadena pesada variable hu504K injerto humanizado (FIG. 6B, SEQ ID NO: 15), las variantes hu504-5, hu504-16, y hu504-32 (variaciones de aminoácidos a partir de injerto hu504K humanizado se indican en la FIG. 6A (cadena liviana) (SEQ ID NOS:22-24, respectivamente, en orden de aparición) y FIG. 6B (cadena pesada) para las variantes hu504-5, hu504-16, y 504-32 (SEQ ID NO:25). 4. Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, es posible generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que tienen la capacidad, al ser inmunizados, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión (JH) del anticuerpo en los ratones mutantes quiméricos y de cepa germinal resulta en una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia del conjunto ordenado del gen de la inmunoglobulina humana de cepa germinal en dichos ratones muíante de cepa germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos al tener lugar la exposición al antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); patentes de los EE. UU. N.° Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591 ,669 (todas de GenPharm); patente de los EE. UU. N.° 5,545,807; y WO 97/17852.

Como alternativa, es posible utilizar la técnica de visualización de los fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553

[1990]) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina procedente de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, unos genes de dominio V de anticuerpo son clonados en marco en un gen de proteína de recubrimiento se mayor sea menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se visualiza como fragmentos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Dado que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola cadena, del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta dichas propiedades. Por lo tanto, el fago ¡mita algunas de las propiedades de la célula B. La visualización del fago puede llevarse a cabo en una variedad de formatos, revisados en por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Para la visualización de los fagos pueden utilizarse varias fuentes de segmentos de gen V. Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991 ) han aislado un conjunto ordenado diverso de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña biblioteca combinatoria aleatoria de genes de V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Es posible construir un repertorio de genes de V a partir de donantes humanos no inmunizados, y los anticuerpos con respecto a un conjunto ordenado de antígenos (que incluyen autoantígenos) pueden ser aislados siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991 ), o por Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse también las patentes de los EE. UU. Nros. 5.565.332 y 5.573.905.

Como se expuso en lo que precede, también es posible generar anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (Véase las patentes de los EE. UU. Nros. 5.567.610 y 5.229.275). 5. Fragmentos de anticuerpos En determinadas circunstanciases ventajoso utilizar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos enteros. El menor tamaño de los fragmentos permite un despojamiento rápido, y puede llevara un mejor acceso a los tumores sólidos.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se han derivado de anticuerpos intactos (Véase por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, es ahora posible producir estos fragmentos directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos anteriormente mencionadas. Como alternativa, es posible recuperar los fragmentos Fab'-SH directamente a partir de E. coli y acoplárselos químicamente de manera de formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 pueden ser aislados directamente a partir de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para la persona con pericia en la especialidad. En otras formas de realización, el anticuerpo elegido es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Véanse el. Documento WO 93/16185; la patente de los EE. UU. N.° 5,571 ,894; y la patente de los EE. UU. N.° N.° 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, descrito en la patente de los EE. UU. N.° 5,641 ,870, por ejemplo. Tales fragmentos lineales de anticuerpos pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. 6. Anticuerpos biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen características de ligación especificas para por lo menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos dados a título de ejemplo pueden ligarse a dos epítopes diferentes de beta7 integrina descritos en la presente. Otros anticuerpos de este tipo pueden combinar un sitio de ligación de TAT con un sitio de ligación para otra proteína. Como alternativa, un brazo de anti-Beta7 integrina puede ser combinado con un brazo que se liga a una molécula disparadora sobre un leucocito tal como una molécula receptora dato células T (por ejemplo, CD3), o receptores Fe para IgG (FCY.R), tales como Fc.yRI (CD64), FC.YRII (CD32) y Fe. Y.RIII (CD16), de manera de enfocarse en, y localizar, mecanismos de defensa celular con respecto a la célula que expresa TAT. También es posible utilizar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos con respecto a células que expresan TAT. Estos anticuerpos poseen un brazo que liga TAT y un brazo que se liga con el agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-alfa, alcaloide vincam, cadena de ricina A, metotrexato o el isótopo radioactivo hapteno). Los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')2)-Los métodos para preparar los anticuerpos biespecíficos son conocidos en la especialidad. La producción tradicional de los anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos pares de cadena de inmunoglobulina pesada-liviana, teniendo las dos cadenas características especificas diferentes (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la disposición aleatoria de las cadenas livianas y pesadas de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta tiene usualmente lugar mediante pasos de cromatografía de afinidad, y los rendimientos del producto son bajos. Se revelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991 ).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de los anticuerpos con las características de ligación deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. En determinadas formas de realización, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que comprende por lo menos parte de la bisagra, las regiones CH2, y CH3. En determinadas formas de realización, la primera región constante de cadena pesada (CHI) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena liviana, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, y si desea, la inmunoglobulina cadena liviana, son insertados en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en una célula huésped adecuada. Esto provee una mayor flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en aquellas formas de realización cuando relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proveen el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o para la totalidad de las cadenas de polipéptidos en un único vector de expresión cuando la expresión de por lo menos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales tiene como resultado elevados rendimientos o cuando las relaciones no tienen un efecto significativo sobre el rendimiento de la combinación de cadena deseada.

En determinadas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada híbrida de inmunoglobulina con una primera característica de ligación específico en uno de los brazos, y un par cadena pesada-cadena liviana híbrida de inmunoglobulina (que provee una segunda característica de ligación específica) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de indesenadas combinaciones de cadenas de inmunoglobulina, ya que la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en solamente una molécula biespecífica provee una manera fácil para la separación. Este enfoque se revela en el documento WO 94/04690. Para mayores detalles acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et ai, Methods in Enzymology 121 :210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los EE. UU. N.° 5.731.168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse de manera de maximizar el porcentaje de estos heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo de células recombinantes. En determinadas formas de realización, la interfaz comprende por lo menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la primera molécula de anticuerpo son reemplazados por cadenas de tamaño mayor (por ejemplo, tosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes sobre la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo por el hecho de reemplazar las cadenas laterales de grandes aminoácidos con otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto provee un mecanismo para incrementar el rendimiento de un heterodímero en comparación con los productos terminales no deseados tales como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidita, el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto como por ejemplo para apuntar las células del inmuno sistema hacia células no deseadas (patente de los EE. UU. N.° 4.676.980), y para el tratamiento de una infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Es posible preparar los anticuerpos heteroconjugados utilizando cualesquiera métodos de reticulación adecuados. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la especialidad, y se refieren en la patente de los EE. UU. N.° 4.676.980, junto con una cantidad de técnicas de reticulación.

En la bibliografía especializada también se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, es posible preparar anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de enlaces químicos. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que unos anticuerpos intactos son desdoblados proteol ¡ticamente de manera de generar fragmentos F(ab').sub.2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complexante ditiol, arsenito de sodio, a efecto de estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos de Fab' son seguidamente convertidos en derivados de TNB (tionitrobenzoato). Uno de los derivados Fab'-TNB es seguidamente reconvertido en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina, y se lo mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB de manera de formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser utilizados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los progresos más recientes han facilitado la recuperación directa de los fragmentos de Fab'-SH a partir de de E. coíi, que pueden ser acoplados químicamente de manera de formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizado F(ab'). Cada fragmento de Fab' fue secretado por separado desde el E. coli y sometido a un acoplamiento químico directo in vitro de manera de formar el anticuerpo de específico. Este anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de ligarse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como también de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos tumores de mama humanos. También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos biespecíficos de anticuerpos directamente a partir de un cultivo de células recombinantes. por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos mediante la utilización de cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera lec a de las proteínas Fos y Jun fueron ligadas a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región bisagra de manera de formar monómeros, y seguidamente se los reoxidó de manera de formar los heterodímeros de anticuerpo. También es posible utilizar este método para la producción de homodímeros de anticuerpos. Las tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha propuesto un mecanismo alternativo para preparar fragmentos biespecíficos de anticuerpos. Los fragmentos comprenden un V.sub.H conectado a un V.sub.L mediante un ligador que es demasiado corta para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Por lo tanto, los dominios V.sub.H y V.sub.L de un fragmento se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios V.sub.L y V.sub.H de otro fragmento, con lo cual se forman dos sitios de ligación de antígeno. También se ha informado acerca de otra estrategia para producir fragmentos biespecíficos de anticuerpos mediante la utilización de cimeros de cadena simple Fv (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se consideran anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, es posible preparar anticuerpos triespecíficos Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). 7. Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugado también se hallan dentro de los alcances de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugado sus están compuestos de dos anticuerpos unidos de manera covalente entre si. Los anticuerpos de este tipo han sido propuestos por ejemplo para apuntar las células del inmuno sistema a células no deseadas [patente de los EE. UU. N.° 4,676,980], y para el tratamiento de la infección por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se considera que los anticuerpos pueden ser preparados ¡n vitro mediante la utilización de métodos conocidas en la química de las proteínas sintéticas, lo que incluye aquellas en cuya preparación intervienen agentes de reticulación. Por ejemplo, es posible construir inmunotoxinas mediante la utilización de una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de un enlace tioeter. Los ejemplos de reactivos adecuados para esta finalidad incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimídato y aquellos revelados por ejemplo en la patente de los EE. UU. N.° 4.676.980. 8. Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápidamente que un anticuerpo bivalente mediante una célula que expresa un antígeno al cual se ligan los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de los de la clase IgM) con tres o más sitios de ligación de antígeno ((por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que puede producirse fácilmente mediante expresión recombinante de ácido nucleico que codifican las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de ligación de antígenos. En determinadas formas de realización, el dominio de dimerización comprende (o consiste en) una región de Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región de Fe y tres o más sitios de ligación aminc— terminales con respecto a la región de Fe. En determinadas formas de realización, el anticuerpo multivalente de la presente comprende (o consiste en) tres a aproximadamente ocho, pero típicamente cuatro, sitios de ligación de antígenos. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena polipéptido (y típicamente dos cadenas de polipéptidos), en donde la o las cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1-(X1 ).sub.n-VD2-(X2).sub.n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptidos de una región Fe, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CH1-ligador flexible -VH-CH1-cadena de la región de Fe; o VH-CH1-VH-CH1 -cadena de la región de Fe. El anticuerpo multivalente en la presente puede además comprender por lo menos dos (y típicamente cuatro) polipéptidos de dominios variable de cadena liviana. El anticuerpo multivalente en la presente puede, por ejemplo comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena liviana. Los polipéptidos del dominio variable de cadena liviana considerados en la presente comprenden un dominio variable de cadena liviana, y opcionalmente comprenden además un dominio CL. 9. Diseño de la función del efector Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a su función de efector, por ejemplo, de manera de reforzar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC; antigen-dependent cell-mediated citotoxicity) y/o para completar la citotoxicidad dependiente de un complemento (CDC, complement dependent citotoxicity) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo uno o más sustituciones de aminoácidos en la región de Fe del anticuerpo. Como alternativa o a título adicional, es posible introducir uno o más residuos en la región de Fe, de manera de permitir la formación del enlace disulfuro entre cadenas en esta región . El anticuerpo homodimérico así generado pueda tener una mejor capacidad de internalización y/o una mayor matanza de células mediada por complemento y citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC). Véase Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B.

J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodímeros con una actividad tumoral acrecentada también puede prepararse utilizando ligadores cruzados heterobifunctionales descritos en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, es posible diseñar un anticuerpo que tiene una región dual de Fes y que por ello puede tener una mayor lisis de complemento y mayor capacidad de ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la semivida del anticuerpo en el suero, es posible incorporar un epítope salvaje de ligación de receptor en el anticuerpo (en especial un fragmento del anticuerpo) como se describe en la patente de los EE. UU. N.° 5.739.277, por ejemplo. Tal como se la utiliza en la presente, la expresión "epítope de ligación de receptor" se refiere a un epítope de la región de Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, Igd, lgG2, lgG3, o lgG4) que es responsable de incrementar la semivida de la molécula de IgG en el suero in vivo. 10. Inmunoconjugados El antagonista o anticuerpo utilizado en los métodos de la presente es opcionalmente conjugado a otro agente, tal como un agente citotóxico, o citoquina.

Habitualmente la conjugación se llevará se llevará a cabo por intermedio de un enlace covalente cuya naturaleza precisa será determinado por la molécula apuntadora y el sitio de ligación sobre el antagonista o péptido de anticuerpo de integrina beta7 Típicamente, un agente no peptídico es modificado mediante la adición de un ligador que permite la conjugación al anticuerpo anti-beta7 integrina por intermedio de sus cadenas de aminoácidos laterales, cadenas de carbohidrato, o grupos reactivos inducidos sobre el anticuerpo mediante modificación química. Por ejemplo, puede haber un fármaco fijado por intermedio del grupo épsilon-amino de un residuo lisina, por intermedio de un grupo amino alfa libre, mediante un intercambios de disulfuro a un residuos cisteína, o mediante la oxidación de los 1 ,2- dioles en una cadena carbohidrato con ácido periódico a efectos de permitir la fijación de los fármacos que contienen varios nucleófilos por intermedio de un enlace de base de Schiff. Véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. N.° 4.256.833.

Los agentes modificadores de las proteínas contienen reactivos que reaccionan con amina (por ejemplo, esteres reactivos, isotiocianatos, aldehidos y haluros de sulfonilo), reactivos que reaccionan con tiol (por ejemplo, derivados de haloacetilo y maleimidas), y reactivos que reaccionan con ácido carboxílico y aldehidos carboxílicos. Los antagonistas de integrina beta 7 o los polipéptidos de anticuerpo puede ser unidos de manera covalente a agentes peptídicos por intermedio de la utilización de reactivos reticulantes bifuncionales. Los reactivos heterobifuncionales son de uso más común y permiten el acoplamiento controlado de dos proteínas diferentes mediante la utilización de dos o más partes reactivas (por ejemplo, amino reactivo plus tiol, yodoacetamida, o maleimida). La utilización de tales agentes ligantes es bien conocida en la especialidad. Véase, por ejemplo, Brinkley, supra, y la patente de los EE. UU. 4.671.958. También es posible utilizar ligadores peptídicos. Como alternativa, es posible vincular un polipéptido anticuerpo de beta7 integrina a una parte peptídica por intermedio de la preparación de un polipéptido de fusión.

Los ejemplos de otros agentes de acoplamiento proteína bifuncionales N-succinimidil— 3— (2— piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), {esteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos fluoruro bis-activo (tales como 1 ,5-difluor-2,4-dinitrobenceno). 11. Inmunoliposomas Los anticuerpos anti-beta7 integrina revelados en la presente también pueden ser formulados en forma de inmunoliposomas. Un "Nposoma" es una pequeña vesícula compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que es útil para la entrega de un fármaco a un mamífero. Los componentes del Nposoma se encuentran comúnmente dispuestos en una formación de dicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la especialidad, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); patentes de los EE. UU. Nros.° 4.485.045 y 4.544.545; y W097/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. En la patente de los Estados Unidos N.° 5.013.556 se revelan liposomas con un tiempo de circulación reforzada.

Es posible generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípidos que contiene fosfatidilcolina, colesterol y PEG-PE (fosfatidiletanolamina derivado de PEG). Los liposomas se extruyen a través de filtros cuyos poros tienen un tamaño definido de manera de obtener liposomas con el diámetro deseado.

Los fragmentos Fab" del anticuerpo de la presente dimensión pueden ser conjugados a los liposomas descritos en Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) por intermedio de una reacción de intercambio de disulfuros. Oficialmente hay un agente quimioterapéutico contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19):1484 (1989). 12. Vectores, células huésped y métodos recombinantes para la producción de anticuerpos en la presente se proveen también ácido nucleico son aislados que codifican los anticuerpos o agentes péptidos anti-beta7 descritos en la presente, vectores y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos, y técnicas recombinantes para la producción de los anticuerpos.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica puede ser aislado e insertado en un vector replicable para su ulterior clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. En otra forma de realización, el anticuerpo puede ser producido por una combinación homologa, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5,204,244, específicamente incorporada en la presente a título de referencia. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aisla fácilmente y se lo secuencia mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante sondas de oligonucleótidos que son capaces de ligarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo). Hay muchos rectores disponibles. Por lo general, los componentes de los vectores incluyen sin limitación uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento reforzador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción ,por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5.534.615 emitida el día 9 de julio de 1996 y específicamente incorporada en la presente a título de referencia.

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN de los vectores en la presente abarcan las células procariotas, de levadura o eucariotas anteriormente descritas en lo que precede. Los procariotas adecuados para esta finalidad incluyen las eubacterias, tales como los organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, las Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como también Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P revelado en DD 266,710 publicado el 12 abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped clonante E. coli adecuado es el E. coli 294 (ATCC 31 ,446), si bien también son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. co//' X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos tienen una finalidad más ilustrativa que limitante.

Además de los procariotas, los microbios procariotas tales como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpo anti-beta7 integrina. El Saccharomyces cerevisiae, o levadura común para horno, es el más comúnmente utilizado entre los microorganismos eucariotas inferiores. Sin embargo, hay una cantidad de otros géneros, especies y cepas comúnmente disponibles y útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentoso tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-Beta7 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y sus correspondientes células huésped de insecto permisivos tomados de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Se dispone públicamente de una variedad de cepas virales para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y es posible utilizar tales virus como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda. Como huéspedes es también posible utilizar cultivos de células de planta de algodón, maíz, papa, soja, petunia, tomate, y tabaco.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en células invertebradas, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha transformado en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de cepas de célula huésped adecuadas tomadas de mamíferos abarcan la cepa de riñon de mono CV1 transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); cepa de riñon embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en un cultivo de suspensión, Graham er al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de hígado de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de cáncer chino /-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células sertori de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano s (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC; células FS4s; y una cepa de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción de anticuerpo anti-beta7 integrina, y las cultiva en un medio nutriente convencional modificado de manera adecuada a efectos de inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Las células huéspedes utilizadas para producir el anticuerpo anti-beta7 integrina de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como el Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Médium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Dulbecco's Modified Eagle's Médium ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 1 02:255 (1980), patentes de los EE. UU. Nros. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente de los EE. UU. Re. 30.985 puede ser utilizado como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede recibir un complemento en la medida de lo necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como GENTAMYCIN.TM.drug), elementos vestigiales (que se definen como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micro molecular), y glucosa o una fuente de energía equivalente. También es posible incluir cualquiera otro suplemento necesario en las concentraciones adecuadas conocidas en la especialidad . Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y similares, son aquellas anteriormente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para la persona con pericia en la especialidad.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, es posible producir el anticuerpo intracelularmente, en el espacio periplásmico, o directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso se retiran los restos de partículas, sea huéspedes celular sea fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados en el espacio periplásmico de E. coli. En pocas palabras, se descongela pasta de células en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a lo largo de aproximadamente 30 minutos. Los restos de células pueden removerse mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo es secretado en el medio, por lo general se empieza por concentrar los materiales sobrenadantes tomados de tales sistemas de expresión mediante un filtró disponible en el comercio para la concentración de proteínas, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasas tal como PMSF en cualquiera de los pasos precedentes a efecto de inhibir la proteólisis, y pueden incluirse antibióticos para impedir el desarrollo de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede ser purificada mediante por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación típica .El grado de actitud de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que se halla presente en el anticuerpo. Es posible utilizar la proteína A para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de .gamma.1 , .gamma.2, o .gamma.4 humanas. (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los tipos de isotipos de ratón y para la .gamma.3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se fija el ligando de afinidad suele ser la agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices mecánicamente estables tales como el vidrio poroso controlado o el poli(estirendivinil) benceno permite caudales del flujo más rápidos y menores tiempos de procesamiento que los que se logren con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C.sub.l-13, la resina Bakerbond ABX.TM.resin (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de las proteínas tales como el fraccionamiento sobre una columna intercambiadores de iones, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE.TM. sobre una resina intercambiadora de aniones o cationes (tales como una columna de ácido poliaspártico), cromatografía mediante SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de aluminio también se encuentran disponibles, en función del anticuerpo a ser recuperado. Después de cualesquiera pasos de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede ser sometido a una cromatografía de interacción hidrófobo de bajo pH mediante un tampón de elución con un pH entre aproximadamente aproximadamente 2.5-4.5, típicamente llevado a cabo con bajas concentraciones de sal (por ejemplo, sal a aproximadamente 0-0,25 M).

C. Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos, antagonistas o anticuerpos de la invención se preparan para su almacenamiento mediante el mezclado del anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables carecen de toxicidad para los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes de conservación (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadoras de sales tales sodio; complejo de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o sus partes no iónicos tales como TWEEN.TM., PLURONICS.TM. o polietilenglicol (PEG).

La formulación de la presente puede también contener más de un compuesto activo en la medida de lo necesario para la indicación particular que se está tratando, típicamente aquellos con actividades complementarias que no influyen adversamente entre si. Es conveniente que tales moléculas se encuentren presentes en combinación en cantidades que son efectivas para la finalidad prevista.

Los ingredientes activos también pueden estar entrampados en microcápsulas preparadas por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y de poli— (metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales para la entrega de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dicha técnicas se revelan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones a ser utilizadas para la administración in vivo han de ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Es posible preparar preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, las cuales matrices se hallan en la forma de artículos configurados, por ejemplo, películas, e hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico), poliláctidos (patente de los EE. UU. N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y .gamma, etil-L-glutamato, etileno-acetato de etilo no degradable, copolímeros de ácido láctico- ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT.TM. (Microesferas inyectables compuestos de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido),y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Si bien los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido lácticc—ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante intervalos de tiempo más breves. Si las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden degradarse o agregarse como resultado de la exposición a una humedad a 37 °C, resultando una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la naturaleza inmunógena. Es posible concebir estrategias racionales para la estabilización, en función del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de un enlace intermolecular S— S por intermedio de intercambio de tiodisuífuro, es posible lograr una estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, liofilizándose a partir de soluciones ácidas, controlándose el contenido de humedad, mediante los aditivos adecuados, y desarrollándose composiciones específicas de matrices polisémicas.

D. Administración El médico que administre el tratamiento está en condiciones de determinar la dosis adecuada para el sujeto individual para una dosificación basada en peso o mediante dosificación llana, siguiéndose las instrucciones en la etiqueta. La preparación y los programas de dosificación para los compuestos terapéuticos secundarios y de otros compuestos administrados en combinación con los antagonistas de la integrina beta7 pueden ser utilizados en base a las instrucciones del fabricante o ser determinadas empíricamente por la persona con pericia en la especialidad.

Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosis adecuada del antagonista de integrina beta7 y de cualquier otra terapéutica secundaria o de otro compuesto administrado en combinación con el anticuerpo no agotador dependerá del trastorno inflamatorio gastrointestinal a ser tratado , por ejemplo, IBD, UC, CD, de la gravedad y desarrollo de la enfermedad, tanto si el antagonista de la integrina beta 7 o la combinación se administra para fines preventivos como terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al antagonista de la integrina beta7 o a la combinación, y el criterio del médico a cargo. El antagonista de la integrina beta7 o la combinación se administra de manera conveniente al paciente de una sola vez, o lo que es más típico, a lo largo de una serie de tratamientos. En determinadas formas de realización, el antagonista de integrina beta7 se administra una vez por semana, o una vez cada dos semanas, o una vez cada cuatro semanas, o una vez cada seis semanas o una vez cada ocho semanas, a lo largo de un período de un mes (cuatro semanas), o de dos meses, tres meses, o de seis meses, o 12 meses, o 18 meses, o 24 meses, o crónicamente durante el intervalo de vida del paciente. En determinadas formas de realización, el tratamiento es autoadministrado por el mismo paciente.

En función del tipo y gravedad de la enfermedad, una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg a 4,0 mg/kg de anticuerpo anti-beta7 es una dosis inicial candidata para la administración al paciente, tanto si se trata de una o más administraciones separadas, o mediante infusión continua. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, se mantiene el tratamiento hasta que tenga lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación.

Por ejemplo, en determinadas formas de realización, al paciente se la administrar una dosis plana de anticuerpo anti-beta7. Una dosis plana es una cantidad particular de anticuerpo anti-beta7 que se administra a cada paciente independientemente de su peso corporal. En función del tipo y severidad de la enfermedad, al paciente se le administra una dosis llana de entre aproximadamente50 mg y 450 mg de anticuerpo anti-beta7, que puede consistir en uno o más inyecciones o infusiones o administraciones, separadas. Una dosificación llana de este tipo puede administrarse por vía intravenosa o subcutánea o mediante otras rutas descritas en la presente. En determinadas formas de realización, la dosis llana es de 50 mg, o de 100 mg, o de 150 mg, o de 200 mg, o de 300 mg, o de 400 mg, o de 420 mg, o de 450 mg.

En determinadas formas de realización, una dosis de carga llana inicial de anticuerpo anti-beta7 es seguida por una o más dosis de mantenimiento llanas de anticuerpo anti-beta7. La dosis de carga es una cantidad de anticuerpo anti-beta 7 mayor que la dosis de mantenimiento. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de entre aproximadamente 400 mg y 450 mg y la dosis de mantenimiento de entre aproximadamente 50 mg y 350 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg, o de 420 mg, o de 430 mg, o de 450 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de mantenimiento es de 50 mg, o de 100 mg, o de 150 mg, o de 200 mg, o de 300 mg, o de 350 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg. En determinadas formas de realización, la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg.

En determinadas formas de realización, se administra la primera dosis de mantenimiento el mismo día que la dosis de carga. En determinadas formas de realización, se administra la primera dosis de mantenimiento un día después de la dosis de carga. En determinadas formas de realización, se administra la primera dosis de mantenimiento una semana después de la dosis de carga. En determinadas formas de realización, se administra la primera dosis de mantenimiento dos semanas después de la dosis de carga. En determinadas formas de realización, se administra la primera dosis de mantenimiento cuatro semanas después de la dosis de carga. En determinadas formas de realización, la dosis de mantenimiento segunda y cada dosis de mantenimiento subsiguiente se administras cada dos semanas .En determinadas formas de realización, la dosis de mantenimiento segunda y cada dosis de mantenimiento subsiguiente se administras cada cuatro semanas. En determinadas formas de realización, la dosis de mantenimiento segunda y cada dosis de mantenimiento subsiguiente se administras cada ocho semanas. En determinadas formas de realización, se administra la primera dosis de mantenimiento dos semanas después de la dosis de carga, la segunda dosis de mantenimiento se administra dos semanas después de la primera dosis de mantenimiento, y cada dosis de mantenimiento subsiguiente se administra cada cuatro semanas. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante un período de dos meses. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante un período de tres meses. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante un período de seis meses. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante un período de 12 meses. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante un período de 18 meses. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante un período de 24 meses. En determinadas formas de realización, se administra el anticuerpo anti-beta7 durante la vida del sujeto.

Típicamente, el médico clínica administrará un anticuerpo (solo o en combinación con un segundo compuesto) de la invención hasta que se llegue a una o más dosis que provean el efecto biológico deseado. El progreso de la terapia de la invención se supervisa fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

El antagonista de integrina beta7 puede ser administrado mediante cualquier medio adecuado lo que incluye la administración parenteral, tópica, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, y/o intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. También se considera la administración intratecal (Véase la Publicación de patente U.S. N.° 2002/0009444 por Grillo-López). Además, el antagonista de integrina beta7 pueden administrarse de manera conveniente mediante infusión de pulsos, por ejemplo, con dosis declinantes del anticuerpo. En determinadas formas de realización, la dosificación se administra por vía intravenosa o subcutánea. Es posible proveer cada tipo exposición mediante medios de administración iguales o diferentes. En una forma de realización, cada exposición al anticuerpo anti-beta7 es mediante administración subcutánea. En una forma de realización, la primera exposición al anticuerpo anti-beta7, por ejemplo, la dosis de carga, es mediante administración intravenosa y cada exposición subsiguiente es mediante administración subcutánea.

En determinadas formas de realización, se administra un anticuerpo anti-beta7 mediante por ejemplo un dispositivo de autoinyección, un dispositivo autoinyector, u otro dispositivo diseñado para la administración. En la especialidad se conocen varios dispositivos de autoinyección, lo que incluye dispositivos autoinyectores, y los mismos se encuentran disponibles en el comercio. Los dispositivos indicados a título de ejemplo Incluyen, sin limitación, jeringas prellenadas (tales como BD HYPAK SCF®, READYFILLTM, y STERIFILL SCFTM de Becton Dickinson; jeringas prellenadas con polímero CLEARSHOTTM de Baxter; y jeringas prellenadas Daikyo Seiko CRYSTAL ZENITH® provistos por West Pharmaceutical Services); dispositivo de inyección tipo lapicera descartables tales como BD Pen de Becton Dickinson; dispositivos ultraafiladas y de microagujas (tales como INJECT-EASETM y dispositivos microinfusores de Becton Dickinson; y H-PATCHTM provisto por Valeritas) así como también dispositivo de inyección libres de agujas (tales como BIOJECTOR® y IJECT® provisto por Bioject; y dispositivos SOF-SERTER® y de parches provistos por Medtronic). En determinadas formas de realización, el rhuMAb Beta7 es un artículo de manufactura que comprende una jeringa prellenada que comprende 2 ML (150 mg) de rhuMAb Beta7. En determinadas formas de realización, el rhuMAb Beta7 es un artículo de manufacture que comprende una jeringa prellenada que comprende 1 ML (180 mg) de rhuMAb Beta7.

Como se observa, es posible administrar un antagonista de integrina beta7 solo o en combinación con por lo menos un segundo compuesto terapéutico. Estos son unos compuesto terapéutico se utiliza por lo general en las mismas dosis y con vías de administración como las indicadas anteriormente, o con aproximadamente 1 a 99 % de la dosis indicadas anteriormente. En determinadas formas de realización, si se utilizan dichos segundos compuestos, se los utiliza en cantidades inferiores que en el caso en que el antagonista de integrina beta7 no estuviese presente, de manera de eliminar o reducir los efectos secundarios costados por ello.

Como también se indica (véase en lo que sigue) en el que se reconoce una variedad de segundos compuestos terapéuticos adecuados para el tratamiento del IBD, por ejemplo, colitis ulcerante y enfermedad de Crohn, y de la misma manera se han descrito dosificaciones y método de administración para dichos segundos compuestos terapéuticos.

La administración del antagonista de integrina beta7 y de cualquier 2 compuesto terapéutico puede efectuarse simultáneamente, por ejemplo en forma de una única composición o en forma de dos o más composiciones distintas, utilizándose las mismas vía de administración o vías de administración diferentes. Como alternativa o antitradicional, la administración puede efectuarse consecutivamente, en cualquier orden. En determinadas formas de realización, puede haber intervalos de minutos a días, de semanas a meses, entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el antagonista de la integrina beta7 puede ser administrado en primer lugar, seguido por el segundo compuesto terapéutico. Sin embargo, también se considera la administración simultánea o la administración del segundo compuesto terapéutico antes del antagonista de la integrina beta7.

La atención estándar para los sujetos con UC activa de moderada a severa implica la terapia con dosis estándar de un aminosalicilato, un corticosteroide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) y/o azatioprina. La terapia con un antagonista de integrina beta7, tal como un anticuerpo anti-7 integrina, revelado en la presente, tendrá como resultado una mejora en la remisión de la enfermedad (un rápido control de la enfermedad y/o una remisión prolongada), y/o una respuesta clínica, superior a lo lograda con la atención estándar para dichos sujetos.

En una forma de realización, el tratamiento de la presente invención para él IBD (enfermedad inflamatoria de los intestinos) en un sujeto humano con IBD comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo anti-beta7 integrina, y comprende además administrar al sujeto una cantidad efectiva de un segundo medicamento, que es un ¡nmunosupresor, un agente para el control del dolor, un agente antidiarreico, un antibiótico, o una combinación de los mismos.

En una forma de realización dada a título de ejemplo, dicho medicamento secundario se seleccionan el grupo consistente en un aminosalicilato, un corticosteroide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) y azatioprina. En otra forma de realización dada a título de ejemplo, dicho medicamento secundario es otro antagonista de la integrina beta7, tal como otro anticuerpo anti-beta7 integrina o un anticuerpo contra una citoquina.

La totalidad de estos segundos medicamentos puede utilizarse en combinación entre si o de por si con el primer medicamento, de manera tal que la expresión "segundo medicamento", tal como se la utiliza en la presente, no significa que es el único medicamento aparte del primer medicamento, respectivamente. Por lo tanto, no es necesario que el segundo medicamento sea el un medicamento, sino que puede constituir o comprender más de un fármaco de este tipo.

En la presente, la administración combinada incluye la co administración, para lo cual se utilizan formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde por lo general hay un intervalo de tiempo durante el cual ambos agentes activos, o todos ellos, ejercen sus actividades biológicas de manera simultánea.

La administración combinada de un segundo médicamente incluye la coadministración (administración simultánea), para lo cual se utilizan formulaciones separadas o una única formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde por lo general hay un período de tiempo mientras ambos agentes activos (medicamentos), o la totalidad de ellos, ejercen sus actividades biológicas de manera simultánea.

E. Diseño de regímenes de tratamiento El desarrollo de fármacos es un proceso complejo y costoso. Se estima que el costo para llevar un nuevo fármaco al mercado es de entre 800 millones y 1000 millones de dólares. Menos del 10% de los fármacos en los ensayos clínicos de fase I llega a la fase de aprobación. Dos razones clave por las cuales los fármacos fracasan en las etapas finales son una falta de entendimiento de la relación entre la respuesta dosis-concentraciones y los acontecimientos de seguridad no previstos. Dado este escenario, es importante disponer de herramientas que ayuden a predecir como un fármaco se comportará ¡n vivo y que ayuden en el éxito de un candidato clínico terapéutico (Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)).

La PK (Pharmacoquinetics, farmacocinética) caracterizan las propiedades de absorción, distribución, metabolismo, y eliminación de un fármaco. La PD (Pharmacodynamics, farmacodinámica) define la respuesta fisiológica y biológica frente al fármaco administrado. La modelación PK/PD establece el enlace matemático y teórico entre estos dos procesos y ayuda a mejor predecir la acción del fármaco. La modelación PK/PD integrada y el diseño experimental asistido por computadora por medio de simulación se están incluyendo gradualmente en muchos programas de desarrollo de fármacos, y están teniendo una incidencia creciente (Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)).

Típicamente el testeo PK/PD se lleva a cabo en cada etapa del proceso del desarrollo del fármaco. Dado que el desarrollo se está haciendo cada vez más complejo, insume tiempo e impone elevados costos, las empresas están tratando de hacer un mejor uso de los datos de PK/PD para eliminar desde el inicio los candidatos deficientes y para identificar aquellos con una mejor probabilidad de éxito clínico (Lakshmi Kamath, supra).

Los enfoques de modelación PK/PD están demostrando ser útiles para determinar las relaciones entre respuesta del biomarcador, niveles de fármaco, y regímenes de dosificación. El perfil de PK/PD de un candidato a fármaco y la capacidad de predecir la respuesta de un paciente al mismo, son críticos para el éxito de los ensayos clínicos. Los avances recientes en las técnicas de biología molecular y una mejor comprensión de los objetivos para diferentes enfermedades, han validado los biomarcadores como un buen indicador clínico de la eficiencia terapéutica de un fármaco. Los ensayos con biomarcadores ayudan a identificar una respuesta biológica a un candidato a fármaco. Una vez que se han validado clínicamente un biomarcador, es posible modelar de manera efectiva simulaciones de ensayo. Los biomarcadores tienen la capacidad potencial de lograr un status de subrogado que algún día pueda sustituir los resultados clínicos en el desarrollo de las fármacos (Lakshmi Kamath, supra).

La cantidad de biomarcadores en la sangre periférica puede utilizarse para identificar la respuesta biológica a un tratamiento con antagonistas de beta7, por lo que puede funcionar como un buen indicador clínico de la eficacia terapéutica de un tratamiento candidato.

La modelación tradicional de PK/PD en el desarrollo de los fármacos define parámetros tales como la concentración de la dosis del fármaco, efectos de la exposición al fármaco, semivida del fármaco, concentración del fármaco a lo largo del tiempo, y efectos del fármaco en función del tiempo . Cuando se los utiliza más ampliamente, las técnicas cuantitativas tales como la modelación de fármacos, modelación de enfermedades, modelación de los ensayos, y modelación del mercado, pueden dar un respaldo a la totalidad del proceso del desarrollo, con lo que es posible lograr mejores decisiones por el hecho de tener en cuenta explícitamente el riesgo y la mejor utilización del conocimiento. Hay una variedad de herramientas de modelación de PK/PD disponibles para los investigadores del desarrollo de fármacos, por ejemplo el WinNonlin y el Knowledgebase Server (PKS) desarrollados por Pharsight, Inc. Mountain View, California.

Se considera que la memoria descriptiva precedente y los siguientes ejemplos son suficientes para permitir que una persona con pericia en la especialidad lleve la invención a la práctica. A la persona con pericia en la especialidad se le ocurrirán diversas modificaciones de la invención en adición a las mostradas y descritas en la presente, en base a la descripción precedente y de los ejemplos siguientes que recaen dentro de los alcances de las reivindicaciones adjuntas.

Se da por entendido que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o situación específicos están dentro de las capacidades de una persona con la pericia habitual en especialidad, a la luz de las enseñanzas contenidas en la presente.

Otros detalles de la invención se ilustran mediante los siguientes ejemplos, que no son limitantes. Las revelaciones de todas las menciones o citas contenidas en la memoria descriptiva se incorporan expresamente en la presente a título de referencia EJEMPLOS Ejemplo 1 UN ESTUDIO DOBLE CIEGO. CONTROLADO MEDIANTE PLACEBO. ALEATORIZADO. MULTICENTRO. DE FASE I. PARA EVALUAR LA SEGURIDAD. FÁRMACOCIN ÉTICA. FÁRMACODINÁMICA. Y CARÁCTER INMUNOGÉNICO DE RHUMAB BETA7 INTRAVENOSO Y SUBCUTÁNEO ADMINISTRADO EN UNA ETAPA DE DOSIS SIMPLE Y CON ESCALADA DE DOSIS. SEGUIDA POR UNA ETAPA DE MÚLTIPLES DOSIS. DE TRATAMIENTO EN PARALELO. EN PACIENTES CON COLITIS ULCERANTE Descripción del estudio Descripción de rhuMAb Beta7 (etrolizumab) El RhuMAb Beta7 (etrolizumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado basado en las secuencias de consenso de lgG1 humano subgrupo III VH, ? subgrupo I VL y está específicamente dirigido contra la subunidad ß7 del heterodímero integrina. Ha demostrado ligarse con una elevada afinidad a a4ß7 (Kd de aproximadamente 116 pM) y a?ß7 (Kd de aproximadamentel 800 pM).

Este anticuerpo recombinante tiene dos cadenas pesadas (446 residuos) y dos cadenas livianas (214 residuos) que están ligados covalentemente por enlaces disulfuro intercadena e intracadena típicos de anticuerpos de lgG1. Para el trabajo descrito en la presente, reproducido en células CHO (células de ovario de hámster chino). La masa molecular de la molécula rhuMAb Beta7 intacta, non glicosilada, era de aproximadamente 144 kDa. Cada cadena pesada de rhuMAb Beta7 tiene un sitio de glicosilación N ligado conservado en Asn297. Los oligosacáridos presentes en este tipo eran típicos de aquellos observados en anticuerpos recombinantes expresados en células CHO, siendo las glicoformas predominantes los G0 asiáticos, biantenarios, y los glicanos G1. La masa de la forma rhuMAb Beta7 más prevalente que contiene dos glicanos GO y sin residuos lisina terminales era de aproximadamente 147 kDa.

El rhuMAb Beta7 fue suministrado por Genentech en forma de una solución acuosa opalescente, de incoloro a ligeramente amarillo, en un tampón fisiológicamente aceptable. Diseño general del estudio Este primer estudio de fase I en humanos consistió en una etapa aleatorizada (dentro de la cohorte de dosis), doble ciego, controlado por placebo, de dosis simple, de escalada de dosis, seguida por una etapa aleatorizada (a través de las cohortes de dosis) doble ciego, controlado por placebo, de múltiples dosis, de tratamiento en paralelo. A los pacientes que participaron en la etapa de dosis única del estudio quienes recibieron rhuMAb Beta7 no se le permitió participar en la etapa de múltiples dosis. Sin embargo, a los pacientes que recibieron placebo en la etapa de dosis única del estudio se les permitió participar en la etapa de múltiples dosis. En este estudio participaron 48 pacientes con una colitis ulcerante. Se llevó a cabo el estudio en pacientes de 18 a 70 años de edad que tenían un diagnóstico de colitis ulcerante de moderada a severa , eran pacientes externos, y tenían un puntaje de la Clínica Mayo (MCS)= 5 puntos en la línea de base. El intervalo para el MCS es de 0 a 12, y los puntajes más elevados indican una actividad más severa de la enfermedad (Schroeder et al., N. Engl. J. Med. 317:1625-1629 (1987); véase también la siguiente Tabla I). En este estudio no se incluyeron pacientes que estaban sistemáticamente indispuestos y que requerían hospitalización o cirugía debido a su colitis ulcerante. Por otra parte, el investigador consideró que los pacientes elegibles eran candidatos para una terapia biológica, por cuanto tenían una enfermedad de moderada a severa que no habían respondido a la terapia estándar con 5-ASA, inmunosupresores (azatioprina o 6-mercaptopurina), o esteroides.

Tabla 1. Sistema de puntaje de la Clínica Mayo para la evaluación de la actividad de la colitis ulcerante. a Cada paciente efectúa su propio control a efectos de establecer el grado de anormalidad de la frecuencia de sus deposiciones. b El puntaje de sangrado diario representa el sangrado más severo del día. c La evaluación global hecha por el médico tiene en cuenta los otros tres criterios, los recuerdos diarios del paciente acerca de su incomodidad abdominal y su sentido general de bienestar, como también los hallazgos médicos y el status de performance del paciente.

El objetivo de la dosis única, escalada de dosis, del estudio tenía por objeto evaluar la seguridad y tolerabilidad de la administración del rhuMAb Beta7 en los pacientes con UC. En esta etapa, los pacientes fueron reclutados secuencialmente en cinco cohortes de dosis ascendentes (Cohortes A-F; obsérvese que se omitió una cohorte E planificada que había de recibir una dosis de 1 ,0 mg/kg SC, pero aquí se mantuvo la designación A-F) y tratada con dosis individuales intravenosas (IV) o subcutáneas (SC) a uno de cuatro niveles de dosis (0,3, 1 ,0, 3,0, o 10,0 mg/kg) (Véase la Tabla 2).

Se planificó el reclutamiento de cinco pacientes por cohorte. Dentro de cada corte, los pacientes fueron asignados aleatoriamente para recibir rhuMAb Beta7 o placebo. Para la etapa de dosis individuales, las decisiones de escalada de la dosis se basaron en la evaluación de la seguridad clínica de los cortes que recibieron fármacos de estudio por intermedio de la vía IV (Cohortes A, B, C, y D). Sobre la base de la experiencia anterior con la administración SC de otros anticuerpos monoclonales en humanos, se preveía que la exposición después de la administración de SC sería inferior que la exposición lograda después de la administración IV.

Se preveía que cualesquiera toxicidades agudas (por ejemplo, reacciones de hipersensibilidad, reacciones de infusión, o reacciones de tipo malestar por suero) se manifestarían y probablemente se resolverían durante el período de seguimiento de seguridad de 14 días. Después de haberse completado la dosificación en la etapa de dosis individuales, se evaluaron los datos de seguridad y de farmacocinética (PK) antes de comenzar la etapa de múltiples dosis.

La etapa de múltiples dosis tratamiento en paralelo ((Cohortes G-J) empezaron aproximadamente 10 semanas después de haberse completado la dosificación para el último paciente tratado en la cohorte F (3,0 mg/kg SC) de la etapa de dosis única. Durante estas 10 semanas, se revisaron los datos de PK y de seguridad clínica para la etapa de dosis simple del estudio . El diseño paralelo y el intervalo de dosis propuesto para la etapa de múltiples dosis estaban condicionados con respecto a una dosis tolerada máxima MTD (máximum tolerated dose) de > 10 mg/kg tomado de la etapa de dosis individual, y fue confirmado al revisarse los datos de PK en la etapa de dosis individual a efectos de asegurar que los datos de PK en la etapa de dosis simple, a efecto de asegurar que la farmacocinética humana proyectada, basada en el estudio con cynomolgus, estaban soportados (Véase en lo que sigue). La dosis máxima de 4,0 mg/kg IV administrado cada cuatro semanas durante tres ciclos en la etapa de múltiples dosis se hallaban dentro de los factores de seguridad determinados a partir de los datos de toxicología en los monos cynomolgus (Publicación Internacional de patentes N.° WO2009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Accepted Article, doi: 10.1 11 1/j.1476-5381.2011.01205.x), con factores de seguridad de 16 veces sobre la HED (human equivalent dose, dosis humana equivalente) y de 21veces sobre la base de la exposición medida por el área bajo la curva (AUC) (Véase en lo que sigue). El objetivo primario de la etapa de múltiples dosis era el de caracterizar la seguridad de la dosificación múltiple a través de un intervalo de dosis propuesto (0,5-4 mg/kg) y caracterizar el potencial de carácter inmuno génicas con dosificación repetida en un grupo de pacientes con colitis ulcerante. En esta parte del estudio, los pacientes fueron distribuidos aleatoriamente para recibir rhuMAb Beta7 o placebo en una de cuatro cohortes de dosis (Véase la Tabla 2). Se administró RhuMAb Beta7 o placebo subcutáneamente (0,5mg/kg, 1 ,5 mg/kg, o 3,0 mg/kg) o por vía intravenosa (4,0 mg/kg) cada cuatro semanas durante tres ciclos, en los días 1 , 29, y 57 (Véase la Tabla 2). La evaluación de la seguridad a la exposición al nivel de 4,0 mg/kg fue importante para considerar la administración de rhuMAb Beta7 con una dosificación llana.

Se evaluaron la incidencia y la naturaleza de los acontecimientos adversos, acontecimientos adversos serios, y anormalidades de laboratorio. Se evaluó la seguridad mediante la incidencia de los acontecimientos adversos, graduados de acuerdo con el National Cáncer Institute Common Toxicity Criteria for Adverse Events (NCI CTCAE, Criterios Comunes del Instituto Nacional del cáncer para Acontecimientos Adversos), v3.0. Se hizo un seguimiento de los pacientes para establecer la seguridad, durante 18 semanas (hasta el Día 127) durante la etapa de dosis simple del estudio y durante 28 semanas (hasta el Día 197) durante la etapa de múltiples dosis. Se recolectaron muestras de sangre para las evaluaciones de PK, PD exploratorio, y anticuerpo anti terapéutico (ATA).

Tabla 2. Cohortes de estudio IV = intravenoso; SC = subcutáneo. a fármaco de estudio administrado una vez cada cuatro semanas durante tres ciclos en los Días l, 29, y 57.

DLT (Dose-Limitinq Toxicities. Toxicidades que Limitan la Dosis) Por definición, un DLT es cualquier acontecimiento adverso de grado igual o superior al tres de NCI CTCAE que tienen lugar dentro de los 14 días de la administración del fármaco de estudio durante la etapa de dosis simple del estudio que el investigador copatrocinador juzgara que podría tener cualquier relación razonable posible con el huMAb Beta7. Dentro de esta categoría, la toxicidades relacionados con la infusión de grado 3 (por ejemplo, región alérgica /hipersensibilidad, fiebre, dolor, broncoespasmo, estornudos o hipoxia) que ocurriese durante una infusión, fue considerado como un DLT. La exacerbación la colitis ulcerante no fue considerada como un DLT.

Se definió el MTD como un nivel de dosis debajo del que dos o más pacientes tratados con rhuMAb Beta7 experimentaron un DLT como anteriormente definido. Si no más de un paciente experimentó un DLT en cada uno de los seis cohortes de dosis simple, el MTD no ha sido definido, y la dosis ensayada más elevada es de 10 mg/kg. Fundamentos para el diseño del estudio En este estudio se evaluó la seguridad, tolerabilidad, perfil de PK, carácter inmmunogénico, y marcadores de PD exploratorios de rhuMAb Beta7 sobre períodos de tiempo cortos e intermedios.

Fundamentos para el diseño de dos etapas La etapa de dosis individuales estaba diseñada primariamente para evaluar la toxicidad aguda. Los ejemplos de este tipo de toxicidad potencial incluyen las reacciones de hipersensibilidad, mareo por el suero, e irritación de los tejidos locales después de la administración SC. Este tipo de toxicidad puede tener lugar con cualquier proteína terapéutica, independientemente de su vía de administración. Si bien el objetivo para el rhuMAb Beta7 es la subpoblación 7hlQh gut-homing de linfocitos, que representan una pequeña proporción (aproximadamente 2%-10%) de la población local de linfocitos en los humanos (Rott et al., J Immunol 156:3727-36, 1996), cualesquiera reacciones por infusión fueron supervisados estrictamente.

La administración de múltiples dosis permite una evaluación de la toxicidad con dosis repetidas de SC y IV de rhuMAb Beta7 con un seguimiento de 28 semanas. Para evaluar mejor el potencial del carácter inmunógeno en una población de IBD, se administró el fármaco de estudio a los pacientes cada cuatro semanas durante tres ciclos en la etapa de múltiples dosis. Además, durante la etapa de múltiples dosis del estudio se habilitó la evaluación de la farmacocinética de múltiples dosis, los marcadores PD exploradores, y la evidencia de la actividad biológica, lo que facilitó la selección de dosis y de los intervalos de dosis para los estudios de Fase II (véase en lo que sigue).

Fundamentos de la población de estudio Se requirió que los pacientes en este estudio tuvieron una colitis ulcerante con un MCS de= 5 en la línea de base, y que el investigador considerará como elegibles para la terapia biológica por el hecho de que tenían una enfermedad de moderada a severa que había demostrado una respuesta inadecuada a la terapia estándar con fármacos 5-ASA, inmunosupresores (azatioprina o 6 mercaptopurina), o esteroides. A ningún paciente con un historial de infección oportunista clínicamente significativa, infección crónica o latente, o supresión del conteo de WBC, se le permitió formar parte del estudio. Esta población del paciente fue seleccionado a efectos de aproximarse lo mejor posible a la población final de estudio para esta terapia, minimizándose al mismo tiempo el riesgo potencial de una mayor sensibilidad a las infecciones introducidas por el tratamiento concomitante con corticosteroides de elevada dosis y fármacos inmunosupresores.

Fundamentos para la dosis inicial, intervalo de dosis, v régimen de dosificación La selección de la dosis de Fase I se basó en una combinación de factores de seguridad no clínicos, farmacocinética humana proyectada y datos de PD no clínicos exploratorios. La dosificación múltiple fue incorporada en este estudio a efectos de determinar el potencial carácter inmuno génico y para evaluar la seguridad de la exposición acumulativa de rhuMAb Beta7. Los elevados niveles y la frecuencia propuesta proveyeron una oportunidad para evaluar la relación entre el perfil de PK, perfil PD exploratorio, y cualquier evidencia de actividad biológica en pacientes con colitis ulcerante. Esto facilitó la selección del intervalo de dosis y de la frecuencia de dosis, adecuados, para el estudio conceptual de la Fase II (véase lo que sigue).

Se utilizaron los datos de RhuMAb Beta7 PK de monos cynomolgus para determinar la saturación de los receptores ß7 (Publicación Internacional de patentes N.° WO2009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., Artículo Aceptado, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x). Los datos recolectados después de la administración de dosis simples de 1 , 3, y 10 mg/kg de rhuMAb Beta7 sugirieron una farmacocinética no lineal debajo de la farmacocinética no lineal sugerida inferior a los 3 mg/kg, lo que indique que las dosis de 3 mg/kg o superiores son necesarios para saturar por completo el huelgo mediado por el ß7 receptor. Por ello, la dosis de 1 mg/kg en el mono cynomolgus pareció ser una dosis saturadora no receptora; la correspondiente concentración máxima media máximo observado del suero en esta dosis era de 25,1 pg/mL. La HED (dosis humana equivalente) para la dosis no saturante de 1 mg/kg en los monos cynomolgus es de aproximadamente 0.3 mg/kg; no se esperaría que esta dosis simple de partida propuesta de 0,3 mg/kg resultaría en concentraciones en el suero de > 10 pg/mL, por lo que no debería ser una dosis de saturación.

La dosis de partida propuesta en los humanos, de 0,3 mg/kg de rhuMAb Beta7 administrada mediante infusión IVB, fue seleccionada a efecto de evaluar cualesquiera de reacciones agudas como resultado de la aplicación del fármaco de estudio, y fue respaldado por un estudio de toxicología no clínico en monos cynomolgus (Publicación Internacional de patentes N.° WO2009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol., artículo aceptado, doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01205.x). Los factores de seguridad para dosis simples para la dosis de partida fueron estimados sobre la base del NOAEL de e 50 mg/kg, con dosis dadas un a vez por semana durante 12 semanas (Publicación Internacional de patentes N.° WO2009140684), el huelgo humano proyectado (CL) y el volumen humano proyectado del compartimiento central (Vi). Los factores de seguridad fueron de 53,7 sobre la base de HED, 76,2 sobre la base de la exposición (AUC), 167 sobre la base de la dosis, y 175 sobre la base de la concentración máxima prevista (Cmax) (Véase la Tabla 33). En el régimen de múltiples dosis propuesto más elevado de 4 mg/kg IV para un total de tres dosis, los factores de seguridad son de 16,1 sobre la base de HED, 21,1 sobre la base de AUC, 50 sobre la base de la dosis, y de 34,4 sobre la base de Cmax (Véase Tabla 3).

Los fundamentos para seleccionar una dosis de partida de 0.3 mg/kg mediante la utilización de NOAEL en lugar de MABEL se basan en diversos factores. Primero, el apuntar a las integrinas no es novedoso, por cuanto se ha apuntado al a4ß7 en estudios clínicos previos tanto mediante natalizumab como con MLN02 (que también lleva la denominación de MLN0002 o vedolizumab) sin acontecimientos adversos agudos serios (Feagan et al., N Engl J Med 352:2499-507 (2005); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)). En segundo lugar, el mecanismo propuesto para la acción de rhuMAb Beta7 es el de bloquear el tráfico de los linfocitos hacia los intestinos y posiblemente bloquear la retención de los linfocitos en el epitelio. No se ha comprobado que este mecanismo de acción esté asociado con acontecimientos adversos agudos con antagonistas previos de la integrina. Por otra parte, no se ha comprobado que el rhuMAb Beta7 tuviera alguna propiedad agonista evidente, ni que haya inducido una liberación de citoquina in vitro. Finalmente, el rhuMAb Beta7 no ha demostrado ninguna citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos ni una actividad de citotoxicidad dependiente del complemento , en ensayos in vitro con concentraciones de hasta 10 g/mL. Tampoco ha habido evidencia alguna de cambios en los subconjuntos de células periféricas en los estudios no clínicos completados en ratones y monos cynomolgus. Por ello se consideró que 0,3 mg/kg era una dosis de partido razonable para este primer ensayo humano llevado a cabo para la colitis ulcerante.

Tabla 3. Estimaciones de factor de segundad para dosis individuales y dosis repetidas, para rhuMAb Beta7.

AUC =área bajo la curva de concentración del suero - tiempo; AUC = área bajo la curva de concentración del suero - tiempo desde el instante 0 hasta infinidad; CL = huelgo; Cmax = máxima concentración observada ; HED = dosis humana equivalente; IV = intravenoso; NOAEL = no observed adverse effect level (nivel hasta el que no se observó efecto adverso). a La dosis individual más baja es de 0,3 mg/kg IV. La dosis individual más elevada es de 10 mg/kg IV. La dosis repetida más elevada es de 4 mg/kg IV CADA cuatro semanas durante un total de tres dosis IV (reclutamiento en paralelo). b Factor de seguridad = HED/DosiSh, donde h es humano. La conversión del NOAEL de mono cynomolgus a HED se basó en el peso corporal, y se calculó dividiendo el NOAEL por 3.1. Suponiendo un NOAEL de= 50 mg/kg ? 12, el HED es de 6,1 mg/kg para factores de seguridad de dosis individuales y de 193 mg/kg (16,1 mg/kg ? 12) para factores de seguridad para dosis repetidas. c Factor de seguridad = DosiSc/Dosisih, donde c es mono cynomolgus y h es humano. Suponiendo un NOAEL de= 50 mg/kg ? 12, Dosisc es de 50 mg/kg para factores de seguridad de dosis simples y de 600 mg/kg (50 mg/kg ? 12) para factor de seguridad para dosis repetidas. d Factor de seguridad = AUCc/AUCh, donde c es mono cynomolgus y h es humano. Para factor de seguridad de dosis individuales, se calculó el AUCC para lo cual se utiliza la relación AUCC = DosiSc/C - El CU de 2,93 mL/día/kg se determinó calculando la CL media después de cuatro dosis semanales de 25 mg/kg en monos cynomolgus. Suponiendo un NOAEL de= 50 mg/kg, el AUCC era de 17065 dia · pg/mL para factor de seguridad de dosis individuales. Para los factores de seguridad para dosis repetidas, se determinó un AUCC de 188846 dia · Mg/mL calculando la media geométrica AUCinf para el grupo de la dosis 50 mg/kg x 12 IV. Se estimó el AUCh utilizando la relación AUCt, = dos¡Sh/(CLh). La estimación más conservadora de CLh se utilizó para calcular factores de seguridad basados en la exposición. Se estimó un CLh mediante el método de invariantes de especies-tiempo (Dedrick 1973). El AUCh estimado para la administración IV de una dosis individual de 0,3 mg/kg, una dosis individual de10 mg/kg, y tres dosis de 4 mg/kg, era de 224, 7463, y 8955 dia* Mg/mL, respectivamente. e Factor de seguridad Cmax-c/Cmax-h. donde c es mono cynomolgus y h es humano. Cmax-c es la media geométrica de la concentración máxima observada en los monos cynomolgus. Suponiendo un NOAEL de = 50 mg/kg, la media geométrica de Co-c observada después de una administración individual IV de 50 mg/kg era de 1.315 Mg/mL. La media geométrica de Cmax-c observada después de 12 dosis IV de 50 mg/kg era de 3.444 pg/mL. Se estimó el Cmax-h. Y se determinó que era similar al observado para otros anticuerpos de lgG1 en humanos. El valor estimado de Cmax-h para la administración IV de una dosis individual de 0,3 mg/kg, una dosis individual de 10 mg/kg, y de tres dosis de 4 mg/kg era de 7,5, 250, y 100 Mg/mL, respectivamente. f El factor de seguridad se basa en un valor predicho de Cmax-h estimado como dosis/Vi, que supone que no hay acumulación después de dosis repetidas de 4 mg/kg, dada cada cuatro semanas para un total de tres dosis.

La selección de un intervalo de dosis objetivo y de un régimen de dosificación fueron estimadas sobre la base de perfiles de concentración de rhuMAb Beta7 en el suelo y un tiempo presentados para mantenerse constantes a niveles superiores a la concentración objetivo de 1-10 Mg/mL. Esta concentración objetivo se basa en los resultados de estudios in vivo de rhuMAb Beta7 en ratones y monos cynomolgus, que mostrar que una concentración mínima de 1-10 pg/mL era necesaria para mantener la ocupación de los receptores ß7 sobre células T de sangre periférica en circulación . La ocupación de los receptores ß7 sobre las células T de sangre periférica en circulación es un marcador PD exploratorio que fue evaluado en el estudio de Fase I. Mientras no se sepa cómo este marcador se correlaciona n con la actividad clínica, es también reconocido la importancia de la concentración objetivo de 1-10 pg/mL para la eficacia clínica.

Se preveía que el esquema de dosificación-escalada planificado optimizaría la capacidad de evaluar la seguridad del rhuMAb Beta7 cuando se lo administra sobre un amplio intervalo de dosis y exposiciones. No se anticipó una acumulación imprevista o imprevista del fármaco de estudio después de la administración IV cada cuatro semanas .

Mediciones de los resultados Las medidas primarias de los resultados para este estudio fueron: (1) incidencia, naturaleza, y gravedad de efectos adversos (graduados de acuerdo con el NCI CTCAE, Versión 3.0); y (2) incidencia y naturaleza de las anomalías de laboratorio, basados en hematología, química clínica, y resultados de análisis de orina.

Las medidas secundarias de los resultados para este estudio fueron el perfil de PK y los parámetros derivados del perfil de concentración en el suero - tiempo después de la administración de rhuMAb Beta7, lo que incluye aquellos parámetros enumerados: Cmax; CL, o CL aparente CL (CL/F) para fármacos administrados por vía subcutánea; Volumen de distribución (V) o volumen aparente de distribución (V/F) para fármacos administrados por vía subcutánea; AUC; semivida de eliminación (t1/2); proporcionalidad de la dosis; y biodisponibilidad SC. Las medidas secundarias de los resultados también incluyen la incidencia oral; y la biodisponibilidad SC. Las medidas secundarias de los resultados también incluyen la incidencia de los anticuerpos dirigidos contra rhuMAb Beta7, basados en muestras obtenidas en múltiples instantes de tiempo antes y después de la dosificación para cada paciente.

También se investigaron determinadas mediciones de resultados exploratorios. Los mismos incluyen un cambio desde la línea de base en los marcadores PD (que puede incluir la ocupación del receptor por el rhuMAb Beta7, con respecto al nivel del receptor de ß7 de la superficie de las células, y/o de los subconjuntos de células T que expresan la ß7 integrina), medida mediante citometría de flujo de subconjuntos de linfocitos; y cambios desde la línea de base en los MCS modificados.

Población de estudio Se seleccionaron pacientes externos con colitis ulcerosa de moderada a grave y MCS mayor o igual que 5 para que formaran parte del estudio. Si los pacientes habían recibido corticosteroides en alta dosis para el manejo agudo de su enfermedad, la dosis fue reducida a d 20 mg/día de prednisona, o equivalente de prednisona, durante 2 semanas como mínimo antes de la administración del fármaco del estudio.

En cualquier momento durante el estudio, se les permitió a los pacientes que tuvieron un recrudecimiento de su colitis ulcerosa que recurrieran a una terapia de rescate con esteroides (IV, oral y/o tópico). También se permitió como terapia de rescate el agregado de o los aumentos de las dosis de 5-ASA (oral o tópico) y/o inmunosupresores (es decir, azatioprina, 6 mercaptopurina o metotrexato). El uso de agentes anti-TNF (por ejemplo, infliximab, adalimumab, certolizumab), Tysabri® (natalizumab), ciclosporina, tacrolimus o agentes experimentales no fue permitido como terapia de rescate durante el transcurso del estudio.

Los pacientes en etapa de multidosis del estudio quienes recibieron terapia de rescate por recrudecimiento de colitis ulcerosa no recibieron dosis adicionales del fármaco del estudio pero sí continuaron con un seguimiento de evaluaciones de seguridad, PK, PD exploratorio y ATA.

No debía incluirse en el estudio ningún paciente con inmunosupresión significativa sospechada desde el punto de vista clínico sobre la base de frecuencia y gravedad de infecciones oportunistas anteriores y prueba de recuento de WBC disminuido en sangre periférica en examen. Dado que una parte de los pacientes puede haber recibido tratamiento previo con infliximab, no se les exigió a los pacientes que interrumpieran la terapia anti-TNF al menos 12 semanas antes de iniciar el tratamiento en este estudio.

Infliximab tiene una vida media de entre 8 y 9 días; por lo tanto, se consideró adecuado un período de lavado de 12 semanas (alrededor de 10 medias de vida) para una depuración de fármaco de la evaluación justa, biológica y que le asegure al paciente su seguridad respecto de cualquier caso adverso asociado con rhuMAb Beta-7.

Antes de formar parte del estudio, se examinó a los pacientes en forma específica respecto de alguna evidencia de infección, en particular de virus JC (medido por plasma JCV ADN), infección de colon por citomegalovirus (CMV) (por biopsia colónica), infección respiratoria, helmíntica o parasítica. Los pacientes con alguna infección activa descubierta fueron excluidos.

Criterios de inclusión Los pacientes deben haber cumplido con los siguientes criterios para poder ser elegidos para el estudio: (1 ) deben ser capaces de proporcionar un consentimiento informado por escrito y estar dispuestos a ello; (2) tener entre 18 y 70 años de edad; (3) ser de sexo masculino o femenino con potencial reproductivo: deben estar dispuestos a usar un método de contracepción confiable (por ejemplo, anticonceptivo hormonal, en parche, anillo vaginal, dispositivo intrauterino o barrera física) a partir del inicio del estudio hasta 4 meses como mínimo (alrededor de 5 vidas medias) después de la última dosis del fármaco del estudio; (4) deben contar con un diagnóstico de colitis ulcerosa de moderada a grave con un MCS e 5 puntos en el examen (ver con anterioridad); (5) su placa radiográfica de tórax no debe presentar anormalidades significativas desde el punto de vista clínico dentro de los 6 meses anteriores al examen; (6) deben ser candidatos posibles para recibir terapia biológica según la opinión del investigador, en lo referente a contar con una enfermedad grave que demuestre una respuesta inadecuada a terapia estándar con fármacos 5-ASA, inmunosupresores (azatioprina, 6 mercaptopurina o metotrexato) o esteroides. En los Estados Unidos de América, los pacientes que forman parte de la etapa MD deben haber demostrado una respuesta inadecuada, o intolerancia, tanto a inmunosupresores como a terapias anti-TNF; (7) la enfermedad debe tener una duración de= 12 semanas al momento del examen (después de un primer diagnóstico del médico); (8) los pacientes que se tratan con altas dosis de corticosteroides deben reducir la dosis a= 20 mg/día de prednisona, o equivalente de prednisona, durante al menos 2 semanas antes de comenzar con las dosis del fármaco del estudio el Día 1. Los corticosteroides tópicos y las preparaciones 5 ASA tópicas deben ser eliminadas durante al menos 1 semana antes de comenzar las dosis con el fármaco del estudio el Día 1 ; (9) los pacientes en tratamiento con 5 ASA oral deben estar bajo una dosis estable o discontinua durante al menos 4 semanas antes de comenzar las dosis con el fármaco del estudio el Día 1 ; (10) los pacientes que hayan recibido con anterioridad una terapia anti-TNF deben haber discontinuado la terapia durante al menos 12 semanas antes de comenzar con las dosis del fármaco del estudio el Día 1; (11 ) respecto de la terapia inmunosupresora para la etapa de única dosis: en los Estados Unidos de América: los pacientes deben interrumpir la terapia inmunosupresora (es decir, azatioprina, 6-mercaptopurina, o metotrexato) al momento de comenzar con las dosis del fármaco del estudio el Día 1. Fuera de los Estados Unidos de América: según el criterio del investigador, los pacientes pueden interrumpir la terapia inmunosupresora (es decir, azatioprina, 6 mercaptopurina o metotrexato) al momento de iniciar las dosis con el fármaco del estudio el Día 1 , o pueden continuar recibiendo estas terapias en una dosis estable durante el estudio; (12) terapia inmunosupresora para la etapa de dosis múltiples: en los Estados Unidos de América: según el criterio del investigador, los pacientes pueden interrumpir la terapia inmunosupresora (azatioprina, 6 mercaptopurina o metotrexato) al momento de la primera dosis con el fármaco del estudio el Día 1 , o pueden continuar recibiendo estas terapias en una dosis estable durante hasta 6 semanas (Día 43), durante el estudio. Sin embargo, el Día 43, todos los pacientes deben haber interrumpido sus terapias inmunosupresoras para el resto de la etapa MD del estudio (hasta el Día 197). Además, para los pacientes que reciben esteroides, la disminución gradual debe comenzar el Día 57 en pacientes que hayan tenido una respuesta clínica, o en la visita siguiente cuando se logre la respuesta clínica. La respuesta clínica será juzgada por el investigador y tendrá en cuenta la sigmoidoscopía flexible del Día 43. Fuera de los Estados Unidos de América: según el criterio del investigador, los pacientes pueden interrumpir la terapia inmunosupresora (azatioprina, 6 mercaptopurina o metotrexato) al momento de la primera dosis con el fármaco del estudio el Día 1 , o pueden continuar recibiendo estas terapias en una dosis estable durante el estudio.

Criterios de exclusión Los pacientes que cumplían con cualquiera de los siguientes criterios fueron excluidos del ingreso al estudio. Entre los criterios de exclusión relacionados con UC se incluyen: (1) requerimiento de hospitalización debido a la gravedad de la colitis ulcerosa; (2) anemia de moderada a grave (hemoglobina < 10 g/dl); (3) cualquier manifestación de colitis ulcerosa que pudiera requerir, según el criterio del investigador, un tratamiento con > 20 mg diarios de prednisona, o equivalente de prednisona, durante el transcurso del estudio.

Entre los criterios de exclusión relacionados con la salud en general se incluyen: (1) embarazo o lactancia; (2) falta de acceso venoso periférico; (3) incapacidad para cumplir con el protocolo del estudio, según el criterio del investigador; (4) resultado positivo de parásitos y huevos en análisis de materia fecal, de patógenos en cultivo de heces de Clostridium difficile en prueba de toxinas en materia fecal; (5) enfermedad significativa sin control, como ser trastornos neurológicos, cardíacos, pulmonares, renales, hepáticos, endocrinos o Gl; (6) anormalidades en el ECG, incluso evidencia de infarto de miocardio agudo, bloqueo completo de la rama izquierda, bloqueo cardíaco de segundo grado, o bloqueo cardíaco completo; (7) diabetes controlada en forma pobre (hemoglobina glicosilada [HbA1c] > 8,0%); (8) condiciones diferentes de colitis ulcerosa (por ejemplo, asma) que podrían requerir de tratamiento con > 20 mg por día de prednisona, o equivalente de prednisona, durante el transcurso del estudio; (9) antecedentes de malignidad salvo carcinoma de célula basal extirpado o carcinoma de célula escamosa de la piel extirpado; (10) función renal deteriorada (creatinina > 1,5 x límite superior de normal [ULN]); (11 ) función hepática deteriorada (transaminasas > 2,5 x ULN, o anormalidades en pruebas de función sintética que a criterio del investigador resultan significativas desde el punto de vista clínico).

Entre los criterios de exclusión relacionados con factores de riesgo por infecciones se incluyen: (1) deficiencia inmune congénita; (2) inmunoglobulinas séricas IgA e IgG (incluso IgG de subclases 2 y 3) por debajo del límite inferior normal de laboratorio; (3) prueba positiva de JVC ADN sérico; (4) pruebas positivas de anticuerpos que indiquen infección activa o anterior con HIV o hepatitis B o C; (5) títulos de anticuerpos IgM positivos en presencia de títulos IgG negativos en virus Epstein Barr (EBV); (6) biopsia de mucosa intestinal positiva con CMV; (7) examen positivo de prueba de piel derivada de proteína purificada (PPD) por infección tuberculosis micobacteriana latente o análisis de laboratorio tales como QuantiFERON®-TB Gold (QFT-G, o análisis de sangre equivalente) son exámenes aceptables. El QFT-G (o análisis de sangre equivalente) debe ser realizado en pacientes vacunados con anterioridad con el bacilo Calmette-Guérin (BCG). Si la prueba de PPD negativa ha sido documentada dentro de los 3 meses antes del examen, no es necesario que se la repita; (8) antecedentes de infecciones bacterianas sistémicas, fúngicas o parasitarias (más de dos hospitalizaciones por año o más de dos ciclos de antibióticos IV por año); (9) antecedentes de infecciones fúngicas invasivas tales como Candida o Aspergillus (excluyendo candidiasis oral u otras infecciones fúngicas superficiales) dentro de los 6 meses antes del inicio del tratamiento del estudio; (10) antecedentes de infección de herpes grave (simple tipo 1 , simple tipo 2, o zoster) o reactivación dentro de las 12 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio, o recurrencia frecuencia del herpes (más de 2 veces por año); (11) antecedentes de cualquier otra infección oportunista dentro de las 12 semanas antes del inicio del tratamiento del estudio; (12) antecedentes de PML; (13) cualquier signo o síntoma de infección corriente o reciente; (14) antibiótico oral recibido dentro de las 4 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio, o antibióticos IV dentro de las 8 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio; (15) vacuna viva atenuada recibida dentro de las 4 semanas anteriores al examen; (16) hospitalización dentro de las 4 semanas anteriores al examen.

Entre los criterios de exclusión relacionados con medicamentos se incluyen: (1 ) tratamiento recibido y experimental dentro de las 12 semanas anteriores al examen (o dentro de 5 vidas medias del producto experimental, el período que fuera mayor); (2) los pacientes que hayan completado la etapa SD de este estudio pero que no hayan recibido rhuMAb Beta 7 (es decir, el placebo) no serán excluidos de participar en la etapa MD; (3) pacientes que hayan recibido alguna terapia biológica dentro de las 12 semanas anteriores al examen; (4) trombocitopenia (recuento de plaquetas < 75.000/µ?), neutropenia (recuento absoluto de neutrófilos < 1.500/µ?), o linfopenia (recuento absoluto de linfocitos < 800/µ?); (5) pacientes que hayan recibido ciclosporina o tacrolimus (FK506) dentro de los 3 meses anteriores al inicio del tratamiento del estudio.

Métodos de ensayo Análisis de ADN JCV Se realizó un análisis de ADN JCV en pacientes en el suero de línea de base y luego, cada 4 semanas durante el estudio, mediante el uso de JCV DNA DetectRD Qualitative Assay (#8145), con una prueba positiva clasificada como 80 copias/ml o superior. Se realizó un ensayo cuantitativo de ADN JCV (JCV DNA Ultraquantü Quantitative Assay [#8147]) en pacientes que pasaron a ser ADN JCV positivos durante el estudio. Este ensayo tiene un límite de detección inferior de 80 copias/ml.

Análisis farmacocinéticos v anticuerpo antiterapéutico (ATA) Se obtuvieron muestras de suero de todos los pacientes para determinar y caracterizar los farmacocinéticos de rhuMAb Beta 7 y para realizar una valoración de ATAs. Se sometieron a examen los niveles de suero de rhuMAb Beta 7 y ATAs para las muestras clínicas a través de métodos inmunométricos como parte del programa de evaluaciones descripto a continuación.

El programa de evaluaciones de ATAs siguió los lineamientos generales de las pruebas de ATA (Mire-Sluis et al. J Immunol Methods 289:1-16 (2004)). El programa de evaluaciones de ATAs tenía dos títulos: un título de examen y un título de caracterización. El título de examen tuvo un examen inicial de muestras de suero, una prueba de confirmación para los resultados positivos en el examen inicial, y titulación de muestras positivas confirmadas. Los sueros positivos fueron guardados en un banco para su posible uso futuro. Se validaron los ensayos de parte de examen. Dado que se esperaba que los altos niveles de suero de rhuMAb Beta 7 interfirieran con la detección de ATAs, se obtuvieron muestras lavadas después de la administración de la dosis final de rhuMAb Beta 7 cuando se anticipaba que los niveles de fármaco cayeran por debajo de niveles que se esperaba interfirieran con el ensayo.

Ensayo farmacocinético Se validó un ELISA en formato sándwich con un sistema de detección calorimétrico para cuantificar rhuMAb Beta 7 (PR0145223) en suero humano. Se revistieron placas de microtitulación con anticuerpo anti-rhuMAb Beta 7 en 1 ,0 pg/ml para capturar rhuMAb Beta 7. Se agregaron muestras diluidas, estándar y controles a la placa y se las incubó. Con posterioridad, se agregaron anti-rhuMAb Beta 7 biotinilado y estreptavidina conjugada en peroxidasa de rábano (HRP) para la detección y se lo incubó. Se agregó un sustrato de peroxidasa (tetrametilbencidina) para desarrollar color, y se detuvo la reacción con el agregado de 1 M de ácido fosfórico. Se leyeron las placas a 450 nm para detectar la absorbancia y a 620 o 630 nm como absorbancia de referencia. La concentración mínima cuantificable de este ensayo fue de 12,5 ng/ml.

Ensayo de anticuerpo antiterapéutico Se validó un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECLA) puente de anticuerpo para detectar anticuerpos en PR0145223 (rhuMAb Beta 7) en suero humano. El ensayo hizo uso de PR0145223 conjugado en biotina y PR0145223 conjugado en Sulfo-TAG para capturar anticuerpos directos contra PR0145223. Se agregaron el conjugado de rhuMAb Beta 7 biotinizado en 2 pg/ml y el conjugado de Sulfo-TAG rhuMAb Beta 7 en 2 pg/ml a una microplaca de polipropileno de 96 cavidades (Corning). Con posterioridad, se agregaron muestras diluidas y controles a la microplaca y se las incubó en forma conjunta con los conjugados hasta el día siguiente. Asimismo, se bloqueó Meso Scale Discovery® (MSD; Gaithersburg, MD) revestido con estreptavidina con diluyente de ensayo hasta el día siguiente a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C. Luego, se transfirieron las muestras de la placa de polipropileno a la placa de MSD bloqueada y se la incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego, se lavó la placa de MSD tres veces con tampón de lavado. Se agregó MSD 2x Read Buffer T a la placa de MSD y se leyó la placa en el lector MSD Sector Imager 6000. Se determinaron los valores de las titulaciones de anticuerpos por medio de un programa de reducción de datos de titulación de registro.

Durante la validación del ensayo, se terminó que la titulación mínima que podía registrarse era: Registroi0(dilución mínima) = 1 ,30 unidades de titulación.

Ensayos farmacodinámicos Se extrajeron muestras de sangre periférica de pacientes y se midieron los marcadores de PD exploratorio, en tiempo real, por análisis de fluorescencia de células activadas (FACS) de subgrupos de linfocitos de sangre periférica mediante el uso de métodos citométricos de flujo estándar. Se analizaron los datos para cada cohorte después de medir todas las muestras.

Se creó el ensayo de beta 7 para evaluar la presencia y la expresión de beta 7 mediante el uso de rhuMAb Beta 7 conjugada de PE (ficoeritrina) (anticuerpo de competencia) para detectar los sitios libres disponibles antes y después de la dosis con un anticuerpo antibeta 7 conjugado de PE (anticuerpo no de competencia), que no fue inhibido por la presencia de rhuMAb Beta 7 y se proveyó la evaluación de la expresión de beta 7 total durante la dosificación.

En resumen, se agregaron 100 mi de sangre total anticoagulada con heparina sódica en tubos de tinción etiquetados en forma adecuada en hielo y se los incubó durante 30 minutos. Después de la incubación, se agregó un cóctel que contenía cócteles de anticuerpo apropiados a los tubos adecuados y se los incubó durante 30 minutos en la oscuridad, en hielo. Luego, se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato que contenía 2% de suero de ternero normal y después, por último, se volvió a suspender en 1% de paraformaldehído y se lo almacenó a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C hasta adquirirlo en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCalibur.

Se adquirieron los tubos con un conteo detenido de 50.000 eventos totales.

Resultados Las dos tablas siguientes muestran las características de línea de base de los pacientes tanto para la etapa de dosis única como para la etapa de dosis múltiples.

Tabla 4. Características de línea de base de acientes ara a eta a SAP.

Tabla 5. Características de línea de base de acientes ara la eta a MAD.

De acuerdo con lo indicado con anterioridad, las mediciones del resultado primario de este estudio de Fase I fueron la seguridad y la tolerancia. Para la etapa de dosis única, no se observó ninguna toxicidad limitante de la dosis y ninguna reacción del sitio de la inyección o infusión. Siete pacientes experimentaron eventos adversos graves (seis recibieron rhuMAb Beta 7 y uno recibió placebo) en la etapa de dosis única. Existieron dos eventos adversos graves relacionados con la curación de una herida deteriorada en dos pacientes que recibían tratamiento activo quienes fueron sometidos a una colectomía de urgencia por exacerbación de UF, sin embargo, había factores confusos significativos. No se presentaron reacciones del sitio de la inyección significativas desde el punto de vista clínico en la etapa de dosis múltiples del estudio. Hubo un evento adverso grave en la etapa de dosis múltiples del estudio.

No hubo señales identificadas concernientes a la seguridad de rhuMAb Beta 7 en dosis (únicas o múltiples) testeadas en el estudio de Fase I. No se cumplió con los criterios definidos en el protocolo respecto de DLT en ninguna de las cohortes de dosis. La incidencia general de AEs fue comparable en términos generales entre cohortes, sin tendencia aparente hacia un aumento que dependa de la dosis en la incidencia de AEs. La mayoría de AEs fueron de NCI CTCAE de grado 1 o 2. Siete pacientes que recibieron rhuMAb Beta 7 en el estudio de Fase I informaron SAEs: seis estaban en la etapa SD, y uno, en la etapa MD. No hubo un aumento aparente relacionado con la dosis en la incidencia de eventos relacionados con infecciones en la etapa SD del estudio. No se informó de ningún efecto adverso relacionado con inyecciones o infusiones en ninguna etapa del estudio. Sí hubo un aumento en la incidencia de efectos adversos que fueron informados dentro de las 24 horas después de la administración del fármaco del estudio entre pacientes tratados con rhuMAb Beta 7 (45% de los pacientes en la etapa SD y 55,6% de los pacientes en la etapa MD) en comparación con el placebo (20% de los pacientes en ambas etapas SD y MD). Sin embargo, todos los efectos adversos que se produjeron dentro de las 24 horas de la administración del fármaco del estudio fueron NCI CTCAE de grado 1 o 2.

Se recolectaron muestras de sangre de cada uno de los pacientes en determinados momentos durante todo el estudio y se midió la concentración de suero rhuMAb Beta 7 para evaluar PK. La evaluación de PK fue llevada a cabo para datos disponibles de concentración de suero-tiempo a través del uso de métodos estándar no compartimentales (NCA) y el programa de computación WinNonlin Pro versión 5.1 .1 (Pharsight). Se usaron tiempos de muestreo de sangre reales. Los resultados son mostrados en la Figura 1. La Figura 1A muestra los resultados para la etapa SAD del estudio, la Figura 1 B muestra el perfil de PK de una dosis única de rhuMAb Beta 7 administrada en 3,0 mg/kg IV comparada con 3,0 mg/kg SC, y la Figura ÍC muestra los resultados de la etapa AD del estudio.

El análisis de los datos presentados en la Figura 1A muestra que las concentraciones de suero rhuMAb Beta 7 exhibieron una disposición bifásica con una fase de distribución rápida inicial seguida de una fase de eliminación lenta. Al administrar IV, el Cmax aumentó en una forma proporcional a la dosis y dio un promedio de 9,33 pg/ml para el grupo de dosis de 0,3 mg/kg y 239 pg/ml para el grupo de dosis de 10 mg/kg. De forma similar, el área media del grupo por debajo de la curva de concentración-tiempo (AUCo-¡nf) varió entre 76,9 y 2.500 por día ? pg/ml y fue proporcional a la dosis en forma aproximada, según lo demuestran valores similares de AUC normalizados por la dosis a través del espectro de dosis. La vida media de eliminación terminal fue de aproximadamente 2 semanas (~14 días). Los perfiles de PK de dosis menores (0,3 mg/kg y 1 mg/kg) sugieren una leve tendencia de PK no lineal, posiblemente dada la contribución de una depuración mediada por blanco en concentraciones más bajas.

El análisis de los datos presentados en la Figura 1 B muestra que la eliminación de la cohorte SC fue, en general, coherente con la cohorte IV. La evaluación preliminar que compara valores AUCo-¡nf de cohorte de dosis SC única de 3 mg/kg y AUCo-¡nf de cohorte de dosis IV única de 3 mg/kg estimó una biodisponibilidad aproximada comprendida entre 66% y 67%.

El análisis de los datos presentados en la Figura 1 C muestra que, en forma coherente con los datos de PK de dosis única, la exposición de suero rhuMAb Beta 7 en general, era proporcional a la dosis. El programa de dosificación de una vez cada 4 semanas dio como resultado una acumulación de fármaco de mínima a moderada en el transcurso del tiempo. La dosis más alta de cohorte IV de 4 mg/kg presentó un Cmax promedio (DDdesviacion estándar) de 117 D D31 y 136 D D24 g/ml después de la primera y de la última dosis, respectivamente. De forma similar a la cinética de dosis única, las vidas medias de eliminación terminal en cohortes de dosis múltiples fueron de alrededor de 2 semanas.

Se llevó a cabo una evaluación PK de población preliminar en busca de datos a partir de todas las cohortes de dosis única mediante el uso de NONMEM VI (ICON). Se llevó a cabo un análisis exploratorio de una sola variable mediante el gráfico de la variabilidad interindividual (IIV) para la depuración (CL) o volumen central de distribución (Vi) en comparación con el peso corporal (BW) como covariable. La CL o Vi de rhuMAb Beta 7 no parece corresponderse con el BW en esta evaluación, lo que sugiere que podría reemplazarse una dosis fija por una dosis basada en el peso corporal.

En resumen, el análisis descripto con anterioridad indica una farmacocinética lineal general con una leve tendencia a PK no lineal en dosis < 3 mg/kg. La eliminación de la vida media seguida de dosis única IV de 3 y 10 mg/kg fue de alrededor de 2 semanas (-14 días) y la biodisponibilidad de SC fue de alrededor de 66%-67%.

Los resultados del análisis de anticuerpos antiterapéuticos (ATA) reveló que un paciente en la cohorte SAD que recibió 0,3 mg/kg de IV obtuvo un resultado positivo para ATA el día 29 y permaneció positivo hasta el día 127. Esta positividad de ATA no ejerció ningún impacto en PK (datos que no se muestran).

Se midió la presencia de beta 7 integrina en muestras de cada uno de los pacientes en distintos momentos. Para la etapa SAD del estudio, se mantuvo la presencia en 1-10 pg/ml (datos que no se muestran). La Figura 2 muestra los resultados del análisis de presencia de la etapa MAD del estudio. Los datos sugieren una relación de dosis en duración de saturación de receptor beta 7 con presencia completa retenida en dosis mensuales tan bajas como 0,5 mg/kg SC.

Asimismo, se analizaron los datos que evidencian una posible actividad clínica. Un parámetro que fue investigado como cambios individuales en puntaje de la Clínica Mayo (MCS). Los resultados son mostrados en la Figura 3. Para todos los pacientes en la etapa de dosis múltiple, el MSC de la línea de base media (+ sd) fue de 9,3 + 1 ,9. La respuesta clínica fue definida como una reducción en MSC de 3 puntos más 30% de reducción desde la línea de base y una reducción de >_1 punto en el puntaje de sangrado rectal o sangrado absoluto de 0/1. De acuerdo con las Figuras 3 A a E, el día 71 , 12/18 pacientes tratados con rhuMAb Beta 7 y 4/5 pacientes tratados con placebo demostraron una respuesta clínica por estos criterios. Además, se definió una remisión clínica como MCS absoluto < 2 más ningún subpuntaje individual > 1. Las Figuras 3 A a E muestran que 3/18 pacientes tratados con rhuMAb Beta 7 y 1/5 pacientes tratados con placebo demostraron una remisión clínica por estos criterios. Algo importante, se observó actividad clínica en pacientes tratados con rhuMAb Beta 7 que no estaban en tratamiento con esteroides y la actividad clínica fue más coherente en los cohortes H e I.

EJEMPLO 2 ESTUDIO CONTROLADO POR PLACEBO DOBLE CIEGO ALEATORIZADO DE FASE II PARA EVALUAR LA EFICACIA Y LA SEGURIDAD DE rhuMAb BETA 7 EN PACIENTES CON COLITIS ULCEROSA DE MODERADA A GRAVE Y ESTUDIO COMPLEMENTARIO DE ETIQUETA ABIERTA Diseño del estudio Descripción del estudio Este estudio de Fase II es un estudio aleatorizado, doble ciego, multicentro controlado por placebo para evaluar la eficiencia y la seguridad a través de dos niveles de dosis de rhuMAb Beta 7 en comparación con placebo en pacientes con UC de moderada a grave. Esta población de pacientes blanco es la misma que fue estudiada en el estudio de Fase I descripto con anterioridad. El criterio principal de valoración de eficacia será evaluado en la Semana 10 (2 semanas después de administrar la dosis final del fármaco del estudio) con un criterio secundario de valoración de eficacia en la Semana 6.

Los pacientes serán aleatorizados en una proporción de 1 :1 :1 a través de un rango de dosis de rhuMAb Beta 7 100 mg SC (dosis fija) en las Semanas 0, 4 y 8 y 420 mg SC (dosis de carga fija) en la Semana 0 seguido de 300 mg de SC en las Semanas 2, 4 y 8 o SC placebo correspondiente. La Figura 7 muestra el esquema del estudio. El estudio será dividido en un período de examen de entre 0 y 35 días, un período de tratamiento doble ciego de 10 semanas, un período de seguimiento de seguridad de 18 semanas y un período de seguimiento de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) de 17 meses (2 años después de la aleatorización).

Para ser elegibles, los pacientes deben tener un mínimo de 12 semanas de duración de UC diagnosticada de acuerdo con los lineamientos prácticos de la American College of Gastroenterology (ACG); es decir, la evidencia clínica y endoscópica corroborada por, en ciertas instancias un MCS de=?5, o en ciertas instancias, un MCS de =D6, incluso un subpuntaje de endoscopía de=?2; un subpuntaje de sangrado rectal de =D1 (ver Tabla 1 ); una evidencia endoscópica de actividad de la enfermedad de un mínimo de 25 cm desde el anillo anal.

Antes de la aleatorización, los pacientes deben ser sometidos a dosis estables de medicaciones concomitantes para UC. Las dosis orales de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA) e inmunosupresores (azatioprina [AZA], 6-mercaptopurina [6-MP], o metotrexato) deben ser mantenidas estables durante al menos 4 semanas antes de la aleatorización en el Día 1. Los pacientes que están recibiendo corticosteroides o 5-ASA tópica deben interrumpir 2 semanas antes de la aleatorización del Día 1. Las dosis orales de corticosteroides deben ser mantenidas estables durante 2 semanas antes de la aleatorización en el Día 1. Los pacientes que reciben esferoides en altas dosis deben reducir la dosis a=D20 mg/día durante 2 semanas antes de la aleatorización en el Día 1 . Para los pacientes que reciben corticosteroides orales durante el período del tratamiento del estudio, la disminución gradual debe comenzar en la Semana 0 en una proporción de 5 mg de prednisona o equivalente de prednisona por semana durante 2 semanas y luego, en una proporción de 2,5 mg de prednisona o equivalente de prednisona por semana hasta la interrupción total. Para pacientes que reciben inmunosupresores orales (diferentes de corticosteroides orales), la disminución gradual de inmunosupresores debe comenzar en la Semana 8, y los pacientes deben interrumpir por completo los inmunosupresores en la Semana 10. Los pacientes que han recibido con anterioridad terapia anti-TNF, deben haber interrumpido la terapia durante al menos 8 semanas antes de la aleatorización para recibir el fármaco del estudio el Día 1. Si los pacientes experimentan una actividad persistente o en aumento de la enfermedad en cualquier momento durante el estudio, puede aumentarse o iniciarse una terapia de rescate en forma de un aumento de dosis de esteroides y/o inmunosupresores de acuerdo con el criterio clínico del investigador. Los pacientes que requieren terapia de rescate estarán autorizados para permanecer en el estudio pero interrumpirán el tratamiento del estudio y, durante análisis de datos, serán clasificados como que han experimentado una falla en el tratamiento.

Los pacientes serán evaluados para determinar si fallaron en responder a una terapia convencional, incluso al menos un agente anti-TNF. De la forma empleada en la presente, la pérdida de respuesta y/o intolerancia de agentes anti-TNF e inmunosupresores significa lo siguiente. Respecto de agentes anti-TNF, la pérdida de respuesta y/o intolerancia significa que los síntomas de enfermedad activa persisten a pesar de un tratamiento previo con uno o más de los siguientes: (a) infliximab: 5 mg/kg IV, 3 dosis durante 6 semanas con evaluación en la semana 8; (b) adalimumab: una dosis de 160 mg SC en la semana 0, seguido de una dosis de 80 mg en la semana 2 y luego, de 40 mg en las semanas 4 y 6, con evaluación en la semana 8; o síntomas activas recurrentes durante la dosificación de mantenimiento programado con regularidad seguido de una respuesta previa (no califica la interrupción electiva del tratamiento por parte del paciente que ha respondido y no perdió la respuesta); o antecedentes de intolerancia a al menos un anticuerpo anti-TNF (incluso, pero no en forma exclusiva o limitativa a la reacción relacionada con infusiones o a la reacción del sitio de inyección, infecciones, insuficiencia cardíaca congestiva, desmielinización). Respecto de los agentes ¡nmunosupresores, pérdida de respuesta y/o intolerancia significa que los síntomas de la enfermedad activa persisten a pesar de un tratamiento previo con uno o más de los siguientes: azatioprina () o dosis equivalente de 6-mercaptopurina mg/kg () o metotrexato, 25 mg SC/intramuscular (o según indicación) por semana durante 8 semanas como mínimo; o antecedentes de intolerancia a al menos uno inmunosupresor (incluso, pero no en forma exclusiva, pancreatitits, fiebre inducida por fármaco, erupción, náuseas/vómitos, prueba de función hepática elevada, mutación genética por tiopurina S— metiltransferasa, infección).

La aleatorización del tratamiento del estudio será estratificado por un tratamiento concomitante con corticosteroides (sí/no), tratamiento concomitante con ¡nmunosupresores (sí/no), exposición anti-TNF previa (sí/no) (salvo en pacientes aleatorizados en los Estados Unidos de América), y sitio de estudio.

La actividad de la enfermedad UC será evaluada mediante el uso de CS en el examen (y esto será considerado un MCS de línea de base), en la Semana 6 (2 semanas después de la dosificación en la Semana 4), y en la Semana 10 (2 semanas después de la dosis final del fármaco del estudio). Se obtendrán biopsias de colon durante la sigmoidoscopía flexible llevada a cabo en los mismos períodos de tiempo. También se reunirá un MCS parcial durante todo el estudio. Los resultados informados de los pacientes (PROs) también serán evaluados mediante el uso de un breve cuestionario de la enfermedad de inflamatoria intestinal (SIBDQ) y MCS, que será completado por los pacientes en el Día 1 y en las Semanas 6 y 10. Además, la actividad de la enfermedad, los síntomas diarios y el impacto de la UC serán reunidos en un diario del paciente, completado día por día por ellos mismos a partir del examen (alrededor de 7 días antes y hasta el Día 1 ) y al menos 7 días antes y hasta las visitas de estudio en las semanas 6 y 10. También se obtendrán muestras de suero y materia fecal para un análisis de biomarcadores. Las heces serán obtenidas en el examen y en las semanas 6 y 10, y 28 para medir los biomarcadores. Entre los biomarcadores ilustrativos que serán medidos se incluyen, sin que la enumeración sea taxativa, lipocalina, calprotectina y lactorferrina. El suero y el plasma serán obtenidos en el examen, en el Día 1 y en las semanas 4, 6, 10, 16 y 28 para medir los biomarcadores exploratorios.

El criterio principal de valoración de eficacia para este estudio es la proporción de pacientes que logran una remisión clínica, definida como una reducción absoluta en MCS de=D2 sin subpuntaje individual que exceda 1 punto, en la Semana 10. Los criterios secundarios de valoración adicionales se encuentran en las mediciones del resultado del estudio.

Estudio complementario de etiqueta abierta Este estudio será un ensayo complementario de etiqueta abierta (OLE) para evaluar la seguridad y la tolerancia de rhuMAb Beta 7 en pacientes con UC de moderada a grave quienes fueron inscriptos en el Estudio de Fase II descripto con anterioridad y quienes cumplieron con los criterios de elegibilidad para ingresar al estudio de OLE. Este estudio recibirá alrededor de 120 pacientes.

Todos los pacientes de este estudio de OLE recibirán tratamiento con rhuMAb Beta 7 en una dosis de 300 mg SC cada 4 semanas. El estudio estará dividido en un período de tratamiento de etiqueta abierta de 104 semanas, un postratamiento de seguimiento de seguridad de 12 semanas y un período de monitoreo de leucoencefalopatía multifocal progresivo ampliado (PML) de 104 semanas posterior a la última dosis de rhuMAb Beta 7.

Todos los pacientes (placebo o activo) que forman parte del estudio de Fase II descripto con anterioridad pueden ingresar al presente estudio de OLE si cumplen con alguno de los siguientes criterios: • si no han obtenido una respuesta clínica en el estudio de Fase II en la Semana 10; los pacientes pueden ingresar en cualquier momento después de la Semana 10 y hasta e incluso la semana 28; la respuesta clínica es definida como en el estudio de Fase II: al menos una reducción de 3 puntos y 30% de la línea de base en MCS y una reducción de > 1 punto en el subpuntaje de sangrado rectal o puntaje de sangrado rectal absoluto de 0 o 1. · si tuvieron una respuesta clínica (de acuerdo con lo definido con anterioridad) en el estudio de Fase II en la Semana 10 pero tuvieron un recrudecimiento de UC entre la Semana 10 y la Semana 28; el recrudecimiento de UC es definido de la misma forma que en el estudio de Fase II: un aumento de 2 puntos en el MCS parcial con 3 días de sangrado rectal continuo y un puntaje de endoscopía de 2 en sigmoidoscopía flexible · si completaron el estudio de Fase II a través del seguimiento de la Semana 28.

Los pacientes de los Estados Unidos de América también deben contar con terapia inmunosupresora concomitante interrumpida antes de su ingreso al estudio de OLE y deben haber reducido gradualmente por completo los corticosteroides orales dentro de las 24 semanas de su inscripción en el estudio de OLE.

Fundamento del diseño del estudio Fundamento de la dosis El fundamento para el régimen propuesto es resumido a continuación.

Las dosis fijas propuestas a ser administradas SC en el estudio de Fase II (100, 300 y 420 mg) son equivalentes a 1 ,25; 3,75 y 5,25 mg/kg, respectivamente, para un paciente de peso medio de 80 kg. Se espera que las dosis elegidas para el estudio de Fase II provean niveles de exposición observados que demostraron una actividad clínica preliminar en el estudio de Fase Ib (la etapa de dosis múltiples descripta con anterioridad).

Además, de acuerdo con lo ilustrado en el perfil de tiempo-suero rhuMAb Beta 7 predicho por la simulación con el uso de datos PK de Fase I preliminar (Figura 4), los brazos de dosis propuestos de 100 y 420/300 mg proveen un rango de dosis de alrededor de 4,4 veces y una separación de exposición clara, después de contemplar la variabilidad interindividual en la exposición. Además, se espera que el brazo de dosis de 100 mg alcance un nivel de concentración mínimo de estado constante comprendido entre 1 y 10 Mg/ml (concentración mínima requerida para presencia de receptor) en todos los pacientes, y se anticipa que el brazo de dosis de 420/300 mg ofrezca un nivel de concentración mínimo de estado constante sobre 10 pg/ml en > 90% de los pacientes. La primera dosis de carga de 420 mg y una dosis adicional en la Semana 2 de 300 mg en este brazo de dosis pretenden maximizar la exposición a rhuMAb Beta 7 con mayor anterioridad en el transcurso del tratamiento para explorar si una mayor exposición temprana al fármaco inducirá a un comienzo más rápido de la respuesta clínica. En comparación con los datos observados de exposición media del grupo a partir de la cohorte IV de 4 mg/kg de dosis múltiple de Fase I, la exposición predicha dentro de las primeras 2 o 4 semanas (Día 0 a 14 o Día 0 a 28) para el brazo de dosis alta propuesto tiene un margen de seguridad de 2,5 (basado en Cmax) o de entre 1 ,3 y 2,2 (basado en AUC) (Tabla 6).

Tabla 6. Margen de seguridad para el brazo de dosis alta propuesto en comparación con la exposición de cohorte IV de dosis múltiple de Fase I.

La dosis fija fue propuesta y justificada sobre la base de las siguientes consideraciones. En primer lugar, se llevó a cabo un análisis exploratorio de una sola variable donde se gráfico la variabilidad interindividual (IIV) respecto de la depuración (CL) o volumen central de distribución (Vi) (obtenido a partir del modelo PK de población base preliminar) en comparación con el peso como covariable. Los gráficos IIV de CL o IIV de Vi en comparación con el peso mostraron poca o nada de dependencia de CD o V en el peso corporal. En segundo lugar, se comparó la variabilidad en la concentración máxima de suero de estado constante predicho del modelo PK de población (CmaxSs) y el área por debajo de la curva de concentración de suero-tiempo desde el Día 0 hasta el Día 84 (AUC0-34) para pacientes que reciben una dosis fija (300 mg) o una dosis basada en el peso corporal equivalente (3,75 mg/kg). De acuerdo con lo mostrado por la Figura 5, Cmaxss mediana y AUCo-84 eran similares entre las dosis fijas y la basada en el peso corporal. Los escenarios de dosis simulados y mostrados en la Figura 5 se basaban en una dosis de peso corporal de 3,75 mg/kg y una dosis fija de 300 mg. La Figura 5 también muestra que IIV de la exposición es similar o levemente menos en el escenario de dosis fija en comparación con el escenario de dosis basada en el peso corporal.

En resumen, los regímenes de dosificación de Fase II propuestos de 100 mg SC en las Semanas 0, 4 y 8 y de 420 mg SC en la Semana 0 seguido de 300 mg SC en las Semanas 2, 4 y 8 se basan en los datos PK/PD y clínicos integrados y en el equilibrio necesario para satisfacer la necesidad de seguridad y la variación de dosis así como también la actividad clínica demostrada en forma potencial. La dosis fija es soportada y justificada por la característica de PK conocida de rhuMAb Beta 7 y el resultado de la evaluación de variabilidad de exposición de acuerdo con lo descripto en la presente.

Mediciones del resultado Medición del resultado de eficacia primaria La medición del resultado de eficacia primaria es una remisión clínica en la Semana 10. La remisión clínica es definida por un MCS=D2 sin subpuntaje individual que exceda en 1 punto (ver Tabla 1 ).

Mediciones del resultado de eficacia secundaria Las mediciones de resultado de eficacia secundaria para este estudio son (1 ) respuesta clínica en la Semana 6 y en la Semana 10 donde la respuesta clínica es definida por al menos una reducción de 3 puntos y 30% a partir de la línea de base en MCS y una reducción de=D 1 punto en el subpuntaje de sangrado rectal o puntaje de sangrado rectal absoluto de 0 o 1 ; (2) remisión clínica (definida más abajo) en la Semana 6; y (3) un indicador de puntaje endoscópico y puntaje de sangrado rectal de 0 en la Semana 6 y en la Semana 10.

Mediciones del resultado exploratorio La medición del resultado exploratorio para este estudio es el tiempo hasta el recrudecimiento de UC en pacientes que habían logrado una respuesta o remisión. Para esta medición de resultado, se define un recrudecimiento como un aumento de 2 puntos en el MCS parcial acompañado de 3 días de sangrado rectal continuo y un puntaje de endoscopía de 2 en sigmoidoscopía flexible.

Mediciones del resultado de seguridad Se evaluarán la seguridad y la tolerancia de rhuMAb Beta 7 mediante el uso de las siguientes mediciones: (1 ) incidencia de eventos adversos y eventos adversos graves con la graduación otorgada por los Criterios sobre Terminología Común de Eventos Adversos del National Cáncer Institute (NCI CTCA) versión 4.0; (2) cambios significativos desde el punto de vista clínico en signos vitales y medidas de seguridad de laboratorio; (3) interrupción debido a uno o más eventos adversos; (4) incidencia y naturaleza de reacciones del sitio de inyección e hipersensibilidad; (5) incidencia de complicaciones infecciosas; y (6) inmunogenicidad de acuerdo con lo medido por la incidencia de ATAs. Mediciones del resultado farmacocinético Las mediciones del resultado farmacocinético incluyen lo siguiente: (1 ) Cmax después de la primera dosis y de la dosis final; (2) tiempo hasta la concentración máxima (Tmax) después de la primera dosis y de la dosis final; (3) área por debajo de la curva de concentración de suero-tiempo (AUC) dentro de un intervalo de dosis después de la dosis final; (4) AUC desde el momento 0 hasta el momento de la última observación detectable (AUCúitima) o hasta el infinito (AUCinf); (5) depuración aparente (CL/F); (6) volumen aparente de distribución (V/F); y (7) eliminación de vida media (ti/2).

Criterios de inclusión Los pacientes deben cumplir con los siguientes criterios para poder ser elegidos para ingresar al estudio: (1 ) deben ser capaces de proporcionar un consentimiento informado por escrito y estar dispuestos a ello; (2) tener entre 18 y 75 años de edad; (3) ser de sexo masculino o femenino con potencial reproductivo dispuestos a usar un método de contracepción de alta eficacia (por ejemplo, contracepción hormonal [oral o en parche], anillo vaginal, dispositivo intrauterino, barrera física o pareja vasectom izada) desde el inicio del estudio hasta un mínimo de 4 meses (alrededor de 5 vidas medias) después de la dosis final del fármaco del estudio; (4) debe ser un paciente externo con diagnóstico de UC moderada a grave, en ciertos casos, con un MCS de 5 o más, o en ciertos casos, con un MCS de 6 o más, incluso un subpuntaje de endoscopía de 2 o más; un subpuntaje de sangrado rectal de 1 o más (ver Tabla 1 ) y actividad de la enfermedad con un mínimo de 25 cm desde el anillo anal; (5) una duración de la enfermedad en el momento del examen de 12 meses o más (es decir, después del primer diagnóstico de un médico de acuerdo con los lineamientos de ACG); (6) los pacientes que reciban corticosteroides deben haber recibido una dosis estable de no más de 20 mg/día de prednisona o equivalente de prednisona durante 2 semanas como mínimo antes de la dosificación con el fármaco del estudio en el Día 1 ; (7) se deben haber retirado los corticosteroides tópicos y las preparaciones de 5-ASA tópicas durante 2 semanas como mínimo antes de la dosificación del fármaco del estudio en el Día 1 ; (9) los pacientes que reciban inmunosupresores en forma de AZA, 6-MP, o metotrexato deben estar recibiendo una dosis estable durante 4 semanas antes de la dosificación con el fármaco del estudio en el Día 1. Se les debe recomendar a los pacientes que toman metotrexato que también deben tomar 1 mg/día de complemento de ácido fólico (o equivalente) si no tiene contraindicaciones; (10) los pacientes que toman probióticos (por ejemplo Culturelle, Saccharomyces boulardii) deben tomar dosis estables durante 2 semanas antes de la dosificación con él fármaco del estudio en el Día 1 ; (11 ) los pacientes que toman antidiarreicos (por ejemplo loperamida, difenoxilato con atropina) deben tomar dosis estables durante 2 semanas antes de la dosificación con el fármaco del estudio en el Día 1 ; (12) los pacientes que hayan recibido con anterioridad una terapia anti-TNF deben haber interrumpido la terapia durante un mínimo de 8 semanas antes de la dosificación con el fármaco del estudio en el Día 1 ; (13) los pacientes que hayan recibido con anterioridad una terapia con ciclosporina o tacrolimus (FK506) deben haber interrumpido la terapia durante un mínimo de 4 semanas antes del inicio del fármaco del estudio en el Día 1 ; (14) los pacientes que hayan sido tratados con anterioridad con alimentación por sonda, dietas de fórmula definida o alimentación/nutrición parenteral deben haberlo interrumpido 3 semanas antes del inicio del fármaco del estudio en el Día 1 ; (15) los pacientes con diagnóstico de UC moderada a grave no necesitan responder o ser tolerantes a inmunosupresores (por ejemplo AZA, 6-MP o metotrexato) y al menos un agente anti-TNF.

Criterios de exclusión Los pacientes que cumplen con cualquiera de los siguientes criterios serán excluidos del ingreso al estudio. Entre los criterios de exclusión relacionados con UC se incluyen: (1 ) colectomía total o subtotal o resección extensiva de colon; (2) presencia de una ileostomía o colostomía; (3) anemia de moderada a grave (hemoglobina < 9 g/dl); (4) un antecedente o evidencia de displasia de la mucosa de colon.

Entre los criterios de exclusión relacionados con la salud en general se incluyen: (1 ) embarazo o lactancia; (2) falta de acceso venoso periférico; (3) incapacidad para cumplir con el protocolo del estudio, según el criterio del investigador; (4) mortalidad concurrente no controlada significativa, como ser trastornos neurológicos, cardíacos, pulmonares, renales, hepáticos, endocrinos o gastrointestinales (Gl); (5) anormalidades significativas en el ECG, incluso evidencia de infarto de miocardio agudo, bloqueo completo de la rama izquierda, bloqueo cardíaco de segundo grado, o bloqueo cardíaco completo; (6) diabetes controlada en forma pobre (hemoglobina glicosilada [HbA1c] > 8,0%); (7) abuso de alcohol activo; (8) condiciones diferentes de colitis ulcerosa (por ejemplo, asma de moderado a grave) que podrían requerir de tratamiento con > 20 mg por día de prednisona, o equivalente de prednisona, durante el transcurso del estudio; (9) antecedentes de malignidad salvo carcinoma de célula basal extirpado o carcinoma de célula escamosa de la piel extirpado; (10) función renal deteriorada (creatinina sérica > 1 ,5 x límite superior de normal [ULN]); (11 ) función hepática deteriorada (transaminasas > 2,5 x ULN, fosfatasa alcalina > 2,5 x ULN, bilirrubina total > 1 ,5 x ULN, o anormalidades en pruebas de función sintética hepática que a criterio del investigador resultan significativas desde el punto de vista clínico). Si el paciente presenta un diagnóstico de colangitis esclerosante primaria, transaminasas séricas > 3 x ULN, fosfatasa alcalina > 3 x ULN, bilirrubina total > 2,5 x ULN, o anormalidades en pruebas de función sintética hepática que a criterio del investigador resultan significativas desde el punto de vista clínico; (12) hospitalización (que no fuera por razones electivas) dentro de las 4 semanas anteriores al examen; (13) trombocitopenia (recuento de plaquetas < 75.000/µ?); (14) anormalidades significativas en el examen neurológico de línea de base (incluso anormalidades de línea de base en el miniexamen de estado mental ( MSE) y evaluación de PML).

Entre los criterios de exclusión relacionados con factores de riesgo por infecciones se incluyen: (1 ) deficiencia inmune congénita; (2) pruebas positivas de anticuerpos que indiquen infección activa o anterior con HIV o hepatitis B (HBV) o C (HVC); (3) titulaciones de anticuerpos IgM positivos en presencia de titulaciones IgG negativas en virus Epstein Barr (EBV); (4) resultado positivo de huevos y parásitos en análisis de materia fecal, cultivo positivo de patógenos en heces, o ensayo positivo de toxinas de Clostridium difficile en examen; (5) biopsia de mucosa intestinal positiva con citomegalovirus (CMV); (6) examen positivo de infección tuberculosis (TB) micobacteriana latente; (7) prueba de piel derivado de proteína purificada (PPD) o análisis de laboratorio tales como QuantiFEROND-TB Gold (QFT-G) y análisis de sangre equivalente) son exámenes aceptables. (8) QFT-G (o análisis de sangre equivalente) debe ser realizado en pacientes vacunados con anterioridad con el bacilo Calmette-Guérin (BCG); (9) si se ha documentado una prueba de PPD dentro de los 3 meses antes del examen, no es necesario que se la repita; (10) los pacientes con un antecedente de infección IB latente que hayan recibido una terapia apropiada y documentada pueden ser incluidos si el examen de detección y la placa de tórax de rayos X realizada dentro de los 3 meses anteriores al examen no revelan ninguna evidencia de infección activa en ese momento. En ese caso, no se requerirá una prueba del examen de TB; (11 ) antecedentes de alguna infección oportunista dentro de las 12 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio; (12) enfermedad de desmielinización o antecedentes de PML; (13) algún signo o síntoma reciente o corriente de infección (dentro de las 4 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio); (14) antibióticos orales recibidos dentro de las 4 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio o antibióticos IV dentro de las 8 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio; (15) vacuna viva atenuada recibida dentro de las 4 semanas antes del inicio del tratamiento del estudio; (16) neuropenia (recuento absoluto de neutrófilos < 1500/µ?) o linfopenia (recuento absoluto de linfocitos <500 /µ?).

Entre los criterios de exclusión relacionados con medicamentos concomitantes para UC se incluyen: (1) cualquier tratamiento de investigación recibido dentro de las 12 semanas anteriores al inicio del tratamiento del estudio (o dentro de las 5 vidas medias del producto de la investigación, la que fuera mayor); (2) exposición previa (dentro de las 6 semanas anteriores) a rituximab; (3) exposición previa a rhuMAb Beta 7; (4) antecedentes de reacciones anafilácticas o alérgicas graves a anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados, o proteínas de fusión.

Tratamiento del estudio Fármaco y placebo de la prueba Genentech preparó el producto del fármaco rhuMAb Beta 7 y el placebo. Son soluciones acuosas de transparentes de levemente opalescentes, de incoloras a ligeramente amarillentas. Ambas soluciones son estériles y líquidas sin conservantes destinadas a la administración IV y SC.

Posoloqía y administración Los pacientes fueron designados en forma aleatoria (1 :1 :1 ) para que recibieran (1 ) 100 mg de rhuMAb Beta 7 en la Semana 0 seguido de placebo en la Semana 2 y 100 mg de rhuMAb Beta 7 en las Semanas 4 y 8; o (2) 420 mg de rhuMAb Beta 7 en la Semana 0 seguido de 300 mg en las Semanas 2, 4 y 8; o bien (3) placebo en las Semanas 0, 2, 4 y 8.

Todas las dosis fueron administradas en forma subcutánea. Las inyecciones serán administradas en el abdomen. Si el abdomen no estuviera disponible para recibir la inyección, el paciente puede recibir una dosis SC en el muslo. Cada paciente recibirá una o más inyecciones según sea necesario para la dosis particular a ser administrada.

Métodos de ensayo Ensayos de anticuerpos antiterapéuticos Se obtendrán muestras de suero de todos los pacientes para una valoración de ATAs. Se analizarán las muestras de ATA de suero mediante el uso de un ensayo de electroquimioluminiscencia puente de anticuerpo validado. Pueden usarse muestras de PK para evaluar la respuesta de ATA, de ser necesario. Los ensayos seguirán los lineamientos generales de las pruebas de ATA (Mire-Sluis et al. J Immunol Methods 289:1-16 (2004)). El método del ensayo es descripto en detalle con anterioridad.

Ensayos farmacocinéticos Se obtendrán muestras de suero de todos los pacientes para determinar y caracterizar el PK de rhuMAb Beta 7. Se analizarán las muestras de PK de suero mediante el uso de ELISA puente validada, con una concentración cuantificable mínima de 12,5 ng/ml. El método del ensayo es descripto en detalle con anterioridad.

Ensayos farmacodinámicos Se analizarán muestras de suero y/o sangre total mediante el uso de método calificados de análisis de biomarcadores PD exploratorios, incluyendo, sin que la enumeración sea taxativa, citometría de flujo, qRT PCR, y/o ELISA. Con anterioridad se describen detalles adicionales sobre los ensayos. No obstante, para el estudio de Fase II, será usado un anticuerpo antibeta 7 de competencia diferente, FIB504, (que se une al mismo epítope que rhuMAb Beta 7) en vez de rhuMab Beta 7.

Análisis de eficacia Criterio principal de valoración de eficacia El criterio principal de valoración es el mantenimiento de la remisión. La expresión "mantenimiento de la remisión" hace referencia a la proporción de pacientes en remisión clínica en un momento dado, por ejemplo, a los 6 meses, al año, o a los 2 años. La diferencia entre cada brazo de rhuMAb Beta 7 y placebo será evaluada mediante el uso de la estadística de prueba Mantel-Haenszel, estratificada por tratamiento concomitante con corticosteroides, tratamiento concomitante con inmunosupresores y exposición previa a anti-TNF. En forma adicional, la diferencia entre grupos de tratamiento será evaluada mediante la construcción de 80% de intervalos de confianza para el criterio principal de valoración. Se proveerá un resumen de estadísticas descriptivas para cada grupo de tratamiento.

También puede evaluarse una remisión constante. Una remisión constante es la cantidad de pacientes que una vez inducidos en remisión, permanecen en remisión con el correr del tiempo. La experiencia del paciente individual de la remisión temporal la que es inducida al recrudecimiento siguiente. Esto significa que el paciente no requiere un aumento de medicación concomitante para UC para retener la remisión.

Criterio secundario de valoración de eficacia Los criterios secundarios de valoración de eficacia para este estudio son los siguientes: (1 ) la proporción de pacientes con respuesta clínica en la Semana 6 y en la Semana 10 donde se define una respuesta clínica es definida por al menos una reducción de 3 puntos y 30% a partir de la línea de base en MCS y una reducción de >D 1 punto en el subpuntaje de sangrado rectal o puntaje de sangrado rectal absoluto de 0 o 1 ; (2) la proporción de pacientes en remisión clínica (definida más con anterioridad) en la Semana 6; y (3) la proporción de pacientes que lograron un puntaje endoscópico y un puntaje de sangrado rectal de 0.

Los criterios secundarios de valoración de eficacia serán analizados de la misma forma (según la descripción anterior) como la medición del resultado de eficacia primaria. Análisis de seguridad Se evaluará la seguridad mediante el registro de eventos adversos, la realización de ensayos de laboratorio clínico y la evaluación de inmunogenicidad a través de la medición de ATAs. Se analizarán los pacientes de acuerdo con el tratamiento real recibido.

Los eventos adversos serán registrados a partir del momento en que se dé el consentimiento informado hasta que un paciente completa el estudio o lo interrumpe en forma prematura. Se proveerán resúmenes individuales de eventos adversos para el período de examen, el período de tratamiento de 10 semanas y el período de seguimiento de 18 semanas. Los eventos adversos serán resumidos por el grupo de tratamiento.

Se resumirán los datos de laboratorio clínico (química del suero, evaluaciones hematológicas, incluso un recuento completo de sangre con recuentos diferenciales y de plaquetas, y valores de uroanálisis) por grupo de tratamiento con uso de estadísticas descriptivas.

Se incluirán en el análisis de seguridad a todos los pacientes.

Análisis farmacocinéticos y farmacodinámicos Se estimarán los parámetros PK derivados de concentraciones de suero de rhuMAb Beta 7, incluso Cmax después de la primera dosis y de la última dosis, Tmax después de la primera dosis y de la última dosis, AUC dentro del intervalo de la última dosificación (AUCúit¡ma) o en infinito (AUCinf), CL/F, V/F y t-1/2 para todos los pacientes con el uso de métodos PK de población o no compartimentales. Se prepararán gráficos de perfiles de tiempo-concentración de rhuMAb Beta 7 sérica individuales y medios. Se enumerarán los parámetros PK y las concentraciones de rhuMAb Beta 7 sérica por paciente y régimen de dosificación y serán resumidos por estadísticas descriptivas.

Los datos PK de este estudio pueden ser combinados con datos del estudio de Fase I para llevar a cabo un análisis de PK de población. Se estimará un valor típico de población de parámetros PK para toda la población del estudio, junto con estimados de varianza intra e inter-paciente y un estimado de error aleatorio. Los estimados de parámetros de pacientes individuales serán calculados mediante el uso de un procedimiento de análisis post-hoc. Se preparará un análisis probable y se presentará el análisis PK de población en un informe separado del Informe del Estudio Clínico. El análisis PK de población puede incluir un análisis exploratorio para identificar las covariantes de línea de base que afectan el PK de rhuMAb Beta 7 en esta población de pacientes. Las covariables de línea de base a ser examinadas incluirán características demográficas y otras, tales como la gravedad de la enfermedad y las mediciones de laboratorio seleccionadas. Los datos serán resumidos mediante el uso de estadísticas descriptivas apropiadas.

La valoración de la relación entre exposición y respuesta clínica será exploratoria, y pueden evaluarse las relaciones entre la exposición de rhuMAb Beta 7 (Cmax, Cmjn, o AUC) y los criterios de valoración clínicos (como ser MCS).

Todos los análisis relacionados con objetivos de biomarcadores PD serán exploratorios. Los resultados serán resumidos como valores absolutos y/o cambios de línea de base. Se llevarán a cabo análisis adicionales de PD y PK, según sea apropiado.

Resultados preliminares del estudio complementario de etiqueta abierta Se evaluaron a los 16 primeros pacientes en el estudio complementario de etiqueta abierta, los cuales en su totalidad responden a agentes anti-TNF, mediante el uso del puntaje parcial de la Clínica Mayo (pMCS). El pMCS incorporó tres componentes del puntaje de la Clínica Mayo completo, que eran: la cantidad de heces que el paciente excretaba por día, la cantidad de sangrado rectal experimentado por el paciente cada día; y la valoración general del médico sobre la enfermedad del paciente, que se basaba en los dos componentes anteriores pero también tenía en cuenta cualquier dolor abdominal que sufriera el paciente y el estado del paciente en general con relación a su UC. Los resultados preliminares de cada uno de los 16 pacientes son mostrados en la Figura 8.

Como puede verse en la Figura 8, 13 de 16 pacientes demostraron al menos una mejora en un punto del pMCS. Once de los 16 pacientes demostró una mejora de 2 puntos en el pMCS. Además, seis de los pacientes fueron tratados durante 12 a 16 semanas y 3-4 de ellos demostró una mejora con el transcurso del tiempo. De esta forma, aunque en forma preliminar, estos datos proveen prueba de actividad clínica de rhuMAb Beta 7 en pacientes con UC de moderada a grave refractaria a terapia anti-TNF.

En resumen, rhuMAb Beta 7 une a4ß7 y a?ß7, receptores que regulan el tránsito y la retención de subgrupos de linfocitos, respectivamente, en la mucosa intestinal. Los estudios clínicos han demostrado la eficiencia del anticuerpo anti-alfa4 (matalizumab) para el tratamiento de CD, y se han observado resultados alentadores para el anticuerpo anti-alfa4 beta 7 (LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab) en el tratamiento de UC. Estos descubrimientos validan la alfa4beta7 como diana terapéutica y soportan la hipótesis de la interacción entre alfa4beta7 y MAcCAM I contribuye a la patogénesis de IBD. La especificidad de rhuMAb Beta 7 para bloquear el tránsito de linfocitos en la mucosa intestinal además de los efectos terapéuticos aditivos potenciales para dirigir alfaEbeta7 son razones obligadas para perseguir el desarrollo clínico de este anticuerpo en IBD. Los beneficios potenciales de rhuMAb Beta 7 pueden incluir una reducción de la gravedad de la enfermedad en pacientes con UC, de acuerdo con lo medido por el puntaje de la Clínica Mayo, y también puede incluir inducción de remisión, así como medido por el puntaje de la Clínica Mayo.

Claims (79)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un método de tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un paciente, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina beta7, en donde el antagonista de integrina beta7 se administra por vía subcutánea.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 monoclonal.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis de 0,5 mg/kg, o 1 ,5 mg/kg, o 3,0 mg/kg, o 4,0 mg/kg.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez cada cuatro semanas.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de dos meses o tres meses o seis meses o 12 meses o 18 meses o 24 meses o durante la vida del paciente.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el paciente es un ser humano.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad intestinal inflamatoria.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad intestinal inflamatoria es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo anti-beta7 está seleccionado de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo anti-beta7 es un fragmento de anticuerpo.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende seis regiones hipervariables (HVRs), en donde: (i) HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácido A1-A11 , en donde Al-Al 1 es RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1 ); RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8) o RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9) o una variante de SEQ ID NOs:1 , 7, 8 ó 9 (SEQ ID NO:26), en donde el aminoácido A2 está seleccionado del grupo que consiste en A, G, S, T y V y/o el aminoácido A3 está seleccionado del grupo que consiste en S, G, I, K, N, P, Q, R y T, y/o A4 está seleccionado del grupo que consiste en E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N y R, y/o el aminoácido A5 está seleccionado del grupo que consiste en S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T y V, y/o el aminoácido A6 está seleccionado del grupo que consiste en V, R, I, A, G, K, L, M y Q, y/o el aminoácido A7 está seleccionado del grupo que consiste en D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S y T, y/o el aminoácido A8 está seleccionado del grupo que consiste en D, G, N, E, T, P y S, y/o el aminoácido A9 está seleccionado del grupo que consiste en L, Y, I y M, y/o el aminoácido A10 está seleccionado del grupo que consiste en L, A, I, M y V y/o el aminoácido A11 está seleccionado del grupo que consiste en H, Y, F y S; (ii) HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácido B1-B8, en donde B1-B8 es KYASQSIS (SEQ ID NO:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:20) o XaaYASQSIS (SEQ ID NO:21 , donde Xaa representa cualquier aminoácido) o una variante de SEQ ID NOs:2, 20 o 21 (SEQ ID NO:27), en donde el aminoácido B1 está seleccionado del grupo que consiste en K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y y Xaa (donde Xaa representa cualquier aminoácido), y/o el aminoácido B4 está seleccionado del grupo que consiste en S y D, y/o el aminoácido B5 está seleccionado del grupo que consiste en Q y S, y/o el aminoácido B6 está seleccionado del grupo que consiste en S, D, L y R, y/o el aminoácido B7 está seleccionado del grupo que consiste en I, V, E y K; (iii) HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácido C1-C9, en donde C1-C9e QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3) o una variante de SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:28), en donde el aminoácido C8 está seleccionado del grupo que consiste en N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I L y M; (iv) HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácido D1-D10, en donde D1-D10 es GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4); (v) HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácido E1-E17, en donde E1-E17 es GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) o una variante de SEQ ID NO:5 (SEQ ID NO:29), en donde el aminoácido E2 está seleccionado del grupo que consiste en Y, F, V y D, y/o el aminoácido E6 está seleccionado del grupo que consiste en S y G, y/o el aminoácido E10 está seleccionado del grupo que consiste en S e Y, y/o el aminoácido E12 está seleccionado del grupo que consiste en N, T, A y D, y/o el aminoácido 13 está seleccionado del grupo que consiste en P, H, D y A, y/o el aminoácido E15 está seleccionado del grupo que consiste en L y V, y/o el aminoácido E17 está seleccionado del grupo que consiste en S y G; y (vi) HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácido F2-F11 , en donde F2 -F1 1 es MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) o RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:19); o comprende la secuencia de aminoácido F1-F11 , en donde F1-F11 es AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:16), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:17) o AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:18) o una variante de SEQ ID NOs:6, 16, 17, 18 ó 19 (SEQ ID NO:30), en donde el aminoácido F2 es R, M, A, E, G, Q, S, y/o el aminoácido F11 está seleccionado del grupo que consiste en F e Y.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11 , en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende tres secuencias de regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1-H3) y tres secuencias de regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1-L3), en donde: (i) HVR-L1 comprende SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9; (ii) HVR-L2 comprende SEQ ID NO:2; (iii) HVR-L3 comprende SEQ ID NO:3; (iv) HVR-H1 comprende SEQ ID NO:4; (v) HVR-H2 comprende SEQ ID NO:5; y (vi) HVR-H3 comprende SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:19.

13. Un método de tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un paciente, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina beta7, en donde el antagonista de integrina beta7 se administra por vía subcutánea en una dosis plana.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 monoclonal.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis plana de entre 50 mg y 450 mg.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 50 mg.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 100 mg.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 150 mg.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 200 mg.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 300 mg.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 350 mg.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 400 mg.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 420 mg.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la dosis plana es de 450 mg.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra una vez por semana o una vez o cada dos semanas o una vez cada cuatro semanas o una vez cada seis semanas o una vez cada ocho semanas.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de dos meses o tres meses o seis meses o 12 meses o 18 meses o 24 meses o durante la vida del paciente.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el paciente es un ser humano.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad intestinal inflamatoria.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la enfermedad intestinal inflamatoria es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el anticuerpo anti-beta7 está seleccionado de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el anticuerpo anti-beta7 es un fragmento de anticuerpo.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende seis regiones hipervariables (HVRs), en donde: (i) HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácido A1-A11 , en donde AlA11 es RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1 ); RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8) o RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9) o una variante de SEQ ID NOs:1 , 7, 8 ó 9 (SEQ ID NO:26), en donde el aminoácido A2 está seleccionado del grupo que consiste en A, G, S, T y V y/o el aminoácido A3 está seleccionado del grupo que consiste en S, G, I, K, N, P, Q, R y T, y/o A4 está seleccionado del grupo que consiste en E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N y R, y/o el aminoácido A5 está seleccionado del grupo que consiste en S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T y V, y/o el aminoácido A6 está seleccionado del grupo que consiste en V, R, I, A, G, K, L, M y Q, y/o el aminoácido A7 está seleccionado del grupo que consiste en D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S y T, y/o el aminoácido A8 está seleccionado del grupo que consiste en D, G, N, E, T, P y S, y/o el aminoácido A9 está seleccionado del grupo que consiste en L, Y, I y M, y/o el aminoácido A10 está seleccionado del grupo que consiste en L, A, I, M y V y/o el aminoácido A11 está seleccionado del grupo que consiste en H. Y. F y S; (¡i) HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácido B1-B8, en donde B1-B8 es KYASQSIS (SEQ ID NO:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:20) o XaaYASQSIS (SEQ ID NO:21, donde Xaa representa cualquier aminoácido) o una variante de SEQ ID N0s:2, 20 o 21 (SEQ ID NO:27), en donde el aminoácido B1 está seleccionado del grupo que consiste en K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y y Xaa (donde Xaa representa cualquier aminoácido), y/o el aminoácido B4 está seleccionado del grupo que consiste en S y D, y/o el aminoácido B5 está seleccionado del grupo que consiste en Q y S, y/o el aminoácido B6 está seleccionado del grupo que consiste en S, D, L y R, y/o el aminoácido B7 está seleccionado del grupo que consiste en I, V, E y K; (iii) HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácido C1— C9, en donde C1— C9 es QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3) o una variante de SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:28), en donde el aminoácido C8 está seleccionado del grupo que consiste en N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I L y M; (iv) HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácido D1-D10, en donde D1-D10 es GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4); (v) HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácido E1-E17 en donde E1-E17 es GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) o una variante de SEQ ID NO:5 (SEQ ID NO:29)en donde el aminoácido E2 está seleccionado del grupo que consiste en Y, F, V y D, y/o el aminoácido E6 está seleccionado del grupo que consiste en S y G, y/o el aminoácido E10 está seleccionado del grupo que consiste en S e Y, y/o el aminoácido E12 está seleccionado del grupo que consiste en N, T, A y D, y/o el aminoácido 13 está seleccionado del grupo que consiste en P, H, D y A, y/o el aminoácido E15 está seleccionado del grupo que consiste en L y V, y/o el aminoácido E17 está seleccionado del grupo que consiste en S y G; iy (vi) HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácido F2-F1 1 , en donde F2-F11 es MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) o RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:19); o comprende la secuencia de aminoácido F1-F11 , en donde F1-F1 1 es AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:16), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:17) o AQTGSSGYFDF (SEQ ID N0:18) o una variante de SEQ ID NOs:6, 16, 17, 18 ó 19 (SEQ ID NO:30), en donde el aminoácido F2 es R, M, A, E, G, Q, S, y/o el aminoácido F11 está seleccionado del grupo que consiste en F e Y.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende tres secuencias de regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1-H3) y tres secuencias de regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1-L3), en donde: (i) HVR-L1 comprende SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9; (ii) HVR-L2 comprende SEQ ID NO:2; (iii) HVR-L3 comprende SEQ ID NO:3; (iv) HVR-H1 comprende SEQ ID NO:4; (v) HVR-H2 comprende SEQ ID NO:5; y (vi) HVR-H3 comprende SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:19.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis plana de 100 mg cada cuatro semanas, en donde el paciente sufre de colitis ulcerativa y en donde el paciente experimenta curación de la mucosa o una tasa reducida del brote en el tiempo.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra en una dosis plana de 300 mg cada cuatro semanas, en donde el paciente sufre de colitis ulcerativa y en donde el paciente experimenta curación de la mucosa o una tasa reducida del brote en el tiempo.

36. Un método de tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un paciente, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina beta7, en donde la administración comprende la administración de una primera dosis de carga y la administración de al menos una posterior dosis de mantenimiento, en donde cada una de las dosis de carga y la al menos una dosis de mantenimiento se administra por vía subcutánea en una dosis plana.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 monoclonal.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la dosis de carga está entre 400 mg y 450 mg y la dosis de mantenimiento está entre 50 mg y 350 mg.

39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de mantenimiento es de 50 mg o 100 mg o 150 mg o 200 mg o 300 mg o 350 mg.

41. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg o 100 mg o 150 mg o 200 mg o 300 mg o 350 mg.

42. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 420 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg o 100 mg o 150 mg o 200 mg o 300 mg o 350 mg.

43. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 430 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg o 100 mg o 150 mg o 200 mg o 300 mg o 350 mg.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg o 100 mg o 150 mg o 200 mg o 300 mg o 350 mg.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 50 mg.

46. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 100 mg.

47. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 150 mg.

48. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 200 mg.

49. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 300 mg.

50. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la dosis de carga es de 400 mg o 420 mg o 430 mg o 450 mg y la dosis de mantenimiento es de 350 mg.

51. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la dosis de carga es de 420 mg.

52. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la dosis de carga es de 450 mg.

53. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la primera dosis de mantenimiento se administra un día o una semana o dos semanas o cuatro semanas después de la dosis de carga.

54. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la primera dosis de mantenimiento se administra el mismo día que la dosis de carga.

55. El método de acuerdo con la reivindicación 53 o la reivindicación 54, en donde la segunda y cada dosis de mantenimiento posterior se administra cada dos semanas o cada cuatro semanas o cada ocho semanas.

56. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la primera dosis de mantenimiento se administra dos semanas después de la dosis de carga, la segunda dosis de mantenimiento se administra dos semanas después de la primera dosis de mantenimiento y cada dosis de mantenimiento posterior se administra cada cuatro semanas.

57. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el anticuerpo anti-beta7 se administra durante un período de dos meses o tres meses o seis meses o 12 meses o 18 meses o 24 meses o durante la vida del paciente.

58. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el paciente es un ser humano.

59. El método de acuerdo con la reivindicación 36, en donde el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad intestinal inflamatoria.

60. El método de acuerdo con la reivindicación 59, en donde la enfermedad intestinal inflamatoria es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.

61. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el anticuerpo anti-beta7 está seleccionado de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano y un anticuerpo humanizado.

62. El método de acuerdo con la reivindicación 61 , en donde el anticuerpo anti-beta7 es un fragmento de anticuerpo.

63. El método de acuerdo con la reivindicación 61 , en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende seis regiones hipervariables (HVRs), en donde: (i) HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácido A1-A11 , en donde Al-Al 1 es RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1 ); RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8) o RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9) o una variante de SEQ ID NOs:1 , 7, 8 ó 9 (SEQ ID NO:26), en donde el aminoácido A2 está seleccionado del grupo que consiste en A, G, S, T y V y/o el aminoácido A3 está seleccionado del grupo que consiste en S, G, I, K, N, P, Q, R y T, y/o A4 está seleccionado del grupo que consiste en E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N y R, y/o el aminoácido A5 está seleccionado del grupo que consiste en S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T y V, y/o el aminoácido A6 está seleccionado del grupo que consiste en V, R, I, A, G, K, L, M y Q, y/o el aminoácido A7 está seleccionado del grupo que consiste en D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S y T, y/o el aminoácido A8 está seleccionado del grupo que consiste en D, G, N, E, T, P y S, y/o el aminoácido A9 está seleccionado del grupo que consiste en L, Y, I y M, y/o el aminoácido A10 está seleccionado del grupo que consiste en L, A, I, M y V y/o el aminoácido A 1 está seleccionado del grupo que consiste en H, Y. F y S; (ii) HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácido B1-B8, en donde B1-B8 es KYASQSIS (SEQ ID NO:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:20) o XaaYASQSIS (SEQ ID NO:21, donde Xaa representa cualquier aminoácido) o una variante de SEQ ID NOs:2, 20 o 21 (SEQ ID NO:27), en donde el aminoácido B1 está seleccionado del grupo que consiste en K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y y Xaa (donde Xaa representa cualquier aminoácido), y/o el aminoácido B4 está seleccionado del grupo que consiste en S y D, y/o el aminoácido B5 está seleccionado del grupo que consiste en Q y S, y/o el aminoácido B6 está seleccionado del grupo que consiste en S, D, L y R, y/o el aminoácido B7 está seleccionado del grupo que consiste en I, V, E y K; (i¡¡) HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácido C1-C9, en donde C1-C9 es QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3) o una variante de SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:28), en donde el aminoácido C8 está seleccionado del grupo que consiste en N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I L y M; (iv) HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácido D1-D10, en donde D1-D10 es GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4); (v) HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácido E1-E17 en donde E1-E17 es GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5) o una variante de SEQ ID NO:5 (SEQ ID NO:29), en donde el aminoácido E2 está seleccionado del grupo que consiste en Y, F, V y D, y/o el aminoácido E6 está seleccionado del grupo que consiste en S y G, y/o el aminoácido E10 está seleccionado del grupo que consiste en S e Y, y/o el aminoácido E12 está seleccionado del grupo que consiste en N, T, A y D, y/o el aminoácido 13 está seleccionado del grupo que consiste en P, H, D y A, y/o el aminoácido E15 está seleccionado del grupo que consiste en L y V, y/o el aminoácido E17 está seleccionado del grupo que consiste en S y G; y (vi) HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácido F2-F11 , en donde F2 -F11 es MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) o RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:19); o comprende la secuencia de aminoácido F1-F11 , en donde F1-F11 es AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:16), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:17) o AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:18) o una variante de SEQ ID NOs:6, 16, 17, 18 ó 19 (SEQ ID NO:30), en donde el aminoácido F2 es R, M, A, E, G, Q, S, y/o el aminoácido F11 está seleccionado del grupo que consiste en F e Y.

64. El método de acuerdo con la reivindicación 63, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende tres secuencias de regiones hipervariables de cadena pesada (HVR-H1-H3) y tres secuencias de regiones hipervariables de cadena liviana (HVR-L1-L3), en donde: (i) HVR-L1 comprende SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 o SEQ ID NO:9; (i¡) HVR-L2 comprende SEQ ID NO:2; (¡ii) HVR-L3 comprende SEQ ID NO:3; (iv) HVR-H1 comprende SEQ ID NO:4; (v) HVR-H2 comprende SEQ ID NO:5; y (vi) HVR-H3 comprende SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO:19.

65. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-54 o 56-64, en donde el antagonista de integrina beta7 se administra con al menos un compuesto adicional seleccionado de ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), azatioprina (AZA), 6-mercaptopurina (6-MP) y metotrexato.

66. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-54 o 56-64, en donde el paciente no logró previamente al menos un agente biológico.

67. El método de acuerdo con la reivindicación 66, en donde el agente biológico está seleccionado de adalimumab, etanercept, infliximab, golimumab, certolizumab pegol, natalizumab y vedolizumab.

68. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-54 o 56-64, en donde el antagonista de integrina beta7 se administra con un dispositivo autoinyectable.

69. El método de acuerdo con la reivindicación 68, en donde el dispositivo autoinyectable está seleccionado de una jeringa prellenada, dispositivo de microaguja, dispositivo autoinyector y dispositivo de inyección sin agujas.

70. Un artículo de manufactura que comprende una jeringa prellenada que comprende un formulación líquida de antagonista de integrina beta7, en donde el volumen de la formulación es de 2 mi y la cantidad de antagonista de integrina beta7 es 150 mg.

71. El artículo de manufactura de acuerdo con la reivindicación 70, en donde el antagonista de integrina beta7 es etrolizumab.

72. Un artículo de manufactura que comprende una jeringa prellenada que comprende una formulación líquida de antagonista de integrina beta7, en donde el volumen de la formulación es de 1 mi y la cantidad de antagonista de integrina beta7 es 180 mg.

73. El artículo de manufactura de acuerdo con la reivindicación 72, en donde el antagonista de integrina beta7 es etrolizumab.

74. Un método de inducción de la remisión en un paciente que padece de colitis ulcerativa que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de etrolizumab, en donde el etrolizumab se administra por vía subcutánea en una dosis plana de 100 mg o 300 mg cada cuatro semanas.

75. El método de acuerdo con la reivindicación 74, que también comprende la determinación del puntajes Clínica Mayo y subpuntajes Clínica Mayo, en donde se determina que el paciente tenga un puntaje absoluto Clínica Mayo Score < 2 y ningún subpuntaje individual >1.

76. El método de acuerdo con la reivindicación 75, en donde la remisión se induce al menos en la semana 10 después de la primera administración de etrolizumab.

77. Un método de inducción de la remisión sostenida en un paciente que padece de colitis ulcerativa, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de etrolizumab, en donde etrolizumab se administra por vía subcutánea en una dosis plana de 100 mg o 300 mg cada cuatro semanas, en donde la remisión se retiene durante un período de 8 semanas después de la inducción de la remisión o un período de 30 semanas después de la inducción de la remisión o un período de 50 semanas después de la inducción de la remisión o un período de 54 semanas o más después de la inducción de la remisión.

78. El método de acuerdo con la reivindicación 77, en donde la remisión es remisión libre de esteroides.

79. El método de acuerdo con la reivindicación 78, en donde la remisión libre de esteroides es durante 20 semanas después de la inducción de la remisión o durante 24 semanas o más después de la inducción de la remisión.