MX2013004825A - Sistema de cest que muestran una sensibilidad independiente de la concentracion. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de protones móviles no equivalentes que pertenecen a los estereoisómeros de un agente de CEST que se distinguen por NMR en un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST y a los compuestos del complejo de Lantánido (III) que despliegan al menos dos estereoisómeros en solución que se distinguen por NMR útiles como agentes sensibles de CEST independientes de la concentración.

Description

SISTEMAS DE CEST QUE MUESTRAN UNA SENSIBILIDAD INDEPENDIENTE DE LA CONCENTRACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de la Captura de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI) basada en la Transferencia por Saturación dependiente del Intercambio Químico (CEST) . Más en particular, se relaciona a sistemas de CEST que muestran una sensibilidad independiente de la concentración y para su uso en mapeo in vivo de parámetros físicos o químicos de interés diagnóstico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La modalidad de Transferencia por Saturación de Intercambio Químico (CEST) es un procedimiento de captura de imágenes introducido recientemente que se basa en el uso de moléculas (agentes de CEST) que contienen una o más combinaciones de protón o protones intercambiables (véase, por ejemplo, Balaban, R.S., Methods in Biomedical Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy . Chichester, UK: John Wiley & Sons; 2000. Vol. 1, p. 661-6667; Young IR, editor).

Esta técnica de captura de imágenes se basa en un fenómeno, conocido en la NMR de alta resolución como experimento de doble resonancia, en la cual se aplica el pulso de una segunda frecuencia de radio (rf ) , centrado finamente en la frecuencia de resonancia de los protones móviles, que se derivan del espectro de NMR, para saturar los giros de los mismos. Por lo tanto, se crea una magnetización saturada que se transfiere al "volumen" de agua por intercambio químico, que resulta en una reducción ordenada de la señal de volumen de agua. El efecto se refiere como Transferencia de Saturación o efecto ST . El contraste en el CEST resultante que se basa en la imagen MR se determina por la extensión de la transferencia: la más grande es la cantidad de magnetización saturada transferida a los protones de agua, la más pequeña es la intensidad de señal de agua resultante, la más fuerte es el contraste (contraste negativo) en la imagen registrada por MRI .' El requisito básico para un agente de CEST es la presencia del protón o protones móviles (o protones intercambiables, como se utilizan en la presente de forma intercambiable) que tienen una tasa de intercambio (Kex) apropiada, y la separación de cambio químico adecuada con los protones de volumen de agua de tal modo que permiten ambos de la activación del sitio de intercambio y la transferencia de la saturación. Aproximadamente, esta condición se alcanza cuando kex se aproxima a ?? (Kex ·= ??) donde Av es la separación de cambio químico en Hz entre las dos combinaciones de intercambio. Se sabe que los agentes de contraste de CEST están agrupados principalmente en sistemas diamagnéticos y paramagnéticos . Los ejemplos adecuados de agentes de CEST diamagnéticos de bajo peso molecular (DIACEST) se proporcionaron primero por Balaban en WO 00/66180, la cual llevó a cabo la mayoría del trabajo en este campo. Los agentes diamagnéticos macromoleculares son, a su vez, descritos, por ejemplo, en J. Am. Chem. Soc 2001; 123:8628-8629.

Los agentes de CEST paramagnéticos ( PARACEST) , incluyen principalmente derivados de tetra-amida macrociclica de DOTA proporcionados para cuatro combinaciones de protones móviles N-H magnéticamente equivalentes o seudoequivalentes , que se reportaron por primera vez por Sherry (véase, por ejemplo, J. Am. Chem. Soc 2001; 123:1517-1518). Los hallazgos importantes en los agentes de CEST paramagnéticos también se discuten en Magn. Reson. Med 2002; 47:639-648.

Woods et al., demostraron que también los grupos OH pueden explotarse en un experimento de CEST con una sonda de PARACEST, al menos bajo ciertas condiciones experimentales, que incluyen el uso de solventes en seco (véase, por ejemplo, J. Am. Chem. Soc 2006; 128:10155-10162). Sin embargo, al disolver el complejo probado en agua pura, no puede detectarse el efecto de CEST a partir del hidroxilo y los protones de agua enlazados al metal, evitando tanto como sea posible el uso de aplicaciones de CEST "ir¡ vivo".

Después, Morrow y colaboradores demostraron que el efecto de CEST desde los grupos donadores de alcoholes puede detectarse en agua pura, al utilizar ' complejos macrociclicos de Ln(III) de tres cargas positivas con ligandos neutros que comprenden grupos alcoholes colgantes (véase, por ejemplo, Inorg. Chem. 2009; 48:7237-7243). La existencia de estereoisómeros múltiples de los derivados de cicleno utilizados se discute en el articulo que concluye que los complejos de Ln(III) tienen sólo una forma diasteromérica en solución que potencialmente son ventajosos para los experimentos de PARACEST.

Una clase adicional de agentes de CEST paramagnéticos de alta sensibilidad se representa particularmente por LIPOCEST, liposomas que contienen un reactivo de cambio paramagnético para protones de agua en la cavidad interior acuosa (véase, por ejemplo, Angew. Chem. Int Ed Engl 2003; 42:4527-4529).

Entre los agentes de CEST, una clase de interés particular se representa por los agentes "sensibles", es decir, agentes de contraste dotados con al menos un protón intercambiable cuya capacidad de transferencia de saturación se correlaciona con un parámetro fisicoquimico de interés diagnóstico del microambiente en el cual se distribuye el agente. Estos agentes, además de actuar como agentes típicos de CEST y proporcionar el contraste de CEST, también son capaces de reportar sobre los cambios del parámetro, típicamente seleccionados del pH, temperatura, metabolitos o concentración de iones específica, presión parcial de 02 o C02, actividad de proteínas o enzimas, en el órgano o región del cuerpo en el cual se distribuyen, para actuar de este modo como biomarcadores útiles de enfermedades específicas estrechamente relacionadas a estos cambios (véase, por ejemplo, Top Curr. Chem. 2002, 221, 123-164).

En este sentido, la cantidad de transferencia de saturación (ST) observada en un procedimiento de CEST depende de los contenidos de agua y de la sonda de CEST, es decir, en otras palabras, de su concentración local en el tejido considerado. En consecuencia, la propiedad sensible peculiar mostrada por estos agentes, en la práctica, puede explotarse apropiadamente sólo cuando se conoce la concentración actual de los mismos.

A su vez, para ser explotable efectivamente en determinaciones in vivo, un agente sensible de CEST puede desplegar su sensibilidad en modo independiente de la concentración .

Esta tarea puede lograrse al utilizar agentes de CEST que contienen al menos dos series de protones magnéticamente no equivalentes, cuyo efecto de ST muestre una dependencia diferente desde el parámetro fisicoquimico de interés. En este caso, en efecto, puede explotarse una aproximación radiométrica, basada en la siguiente ecuación (1) utilizada por primera vez y descrita por Balaban y Ward (para cualquier detalle de la ecuación anterior véase, por ejemplo, agn. Reson. Med. 2000; 44:799-802), explotaron una proporción comparativa entre los efectos de ST inducidos por la irradiación selectiva de las dos resonancias diferentes, identificadas respectivamente como sitio 1 y sitio 2 en la ecuación anterior, que hacen que la cantidad de ST medida y, a su vez, el parámetro de diagnóstico evaluado, sean independientes de la concentración absoluta de la sonda de CEST administrada.

Ejemplos de agentes sensibles que permiten la explotación de esta aproximación radiométrica incluyen complejos de lantánidos (Ln) monomoleculares que contienen dos sitios de protones magnéticamente no equivalentes, comúnmente pertenecientes a uno del o los grupos de amida primaria en el o los brazos colgantes coordinados al ion metálico, en donde el segundo se representa típicamente por la o las moléculas de agua coordinadas al centro del Ln en el complejo quelado (véase, por ejemplo, Angew. Chem. Int Ed 2002; 41:1919-1921 y 4334-4336).

Las moléculas diamagnéticas tales como 5 , 6-dihidrouracilo e iopamidol contienen dos combinaciones de protones activos de CEST que también se han experimentado con éxito como reporteros de pH independientes de la concentración (véase, por ejemplo, Magn. Reson. Med. 2000; 44:799-802, Invest. Radiol . 2004; 39:235-243; Magn. Reson. Med. 2005; 53:830-834 y J. Am. Chem. Soc 2005; 131:1380-1381) .

Alternativamente, los sistemas de CEST pueden explotarse al comprender dos (o más) sondas de CEST que tienen el mismo patrón de biodistribucion pero propiedades de NMR muy diferentes, por ejemplo, que dependen del ion de Ln(III) coordinado, cada uno de los cuales se proporciona para una o unas combinaciones de protones diferentes (véase, por ejemplo, Magn. Reson. Med. 2002; 47:639-648).

El desarrollo de los agentes sensibles de CEST, sin embargo, todavía no es satisfactorio, principalmente debido al número limitado de sistemas de CEST que muestran una sensibilidad independiente de la concentración.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la tarea anterior, la presente invención se dirige a la identificación de una fuente alternativa de protones móviles magnéticamente no equivalentes aprobados para establecer los procedimientos sensibles independientes de la concentración basada en CEST y a los sistemas de CEST alternativos que muestran una sensibilidad independiente de la concentración.

La solución de la presente invención se refiere al utilizar estereoisómeros que se distinguen por NMR a partir de un agente de CEST paramagnetico como una fuente alternativa de protones intercambiables magnéticamente no equivalentes .

Más en particular, la presente invención se relaciona con el uso de isómeros que se distinguen por NMR a partir de un agente de CEST paramagnético como una fuente de protones móviles magnéticamente no equivalentes para ajustar un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basado en CEST.

En una modalidad adicional, la invención se relaciona con un procedimiento por MRI radiométrica basada en CEST que comprende explotar los protones móviles magnéticamente no equivalentes que pertenecen al menos a dos isómeros de un agente de CEST paramagnético que se distinguen por NMR.

En una modalidad diferente, la invención se relaciona con una clase de compuestos del complejo de Lantánidos (III) dotados con un grupo de intercambio de protones en un brazo colgante del ligando quelante que despliega al menos dos estereoisómeros en solución que se distinguen por NMR y para el uso de estos compuestos del complejo en procedimientos de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST como agentes de contraste de CEST independientes de la concentración para proporcionar un contraste de CEST independiente de la concentración.

En incluso una modalidad adicional de la invención que se relaciona con el uso de los compuestos del complejo de Lantánidos (III) identificados como agentes de CEST sensibles independientes de la concentración y a un método de captura de imágenes radiométricas basada en CEST que comprende utilizar los mismos para proporcionar mapas independientes de la concentración del parámetro físico o químico del interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido del cuerpo humano o animal .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Espectro de :H NMR de YbHPD03A en D20 (278K, 600 MHz) .

Figura 2 : panel a) Magnificación del Espectro de YbHPD03A en D20 (inferior) y H20 (superior) en la cual los diferentes cambios químicos (72 y 99 ppm, respectivamente, a 20°C) que se muestran por los protones del OH que se intercambian a partir de dos isómeros que se distinguen del complejo y se resaltan; panel b) espectro Z de YbHPD03A (solución 24mM, 293 K, pH 7.31, energía de irradiación 24 µ?, tiempo de irradiación 2s).

Figura 3: panel a) imagen por MR in vitro (densidad de protones) de un espectro que contiene soluciones de YbHPD03A que tienen todas una concentración de 24mM pero diferente pH (capilares 1-11), o el mismo pH (7.31) pero diferentes concentraciones (desde 3 a 24mM) (capilares 7, 12-14); panel b) leyenda del Espectro; panel c) mapa de ST obtenido tras la irradiación de los protones hidroxílicos a 72 ppm (20°C; pulso de la energía de irradiación 24 µ?) ; panel d) mapa de ST obtenido tras la irradiación de los protones hidroxílicos a 99 ppm (20°C, pulso de la energía de irradiación 24 µ?) ; panel e) variación del efecto de ST con variación del pH obtenido tras la irradiación de protones hidroxílicos de los dos isómeros, a 72 ppm respectivamente (cuadrado) y 99 ppm (círculos) (curvas de calibración) (solución de 24mM, 20°C; pulso de irradiación 24 µ?; tiempo de irradiación 2s) ; panel f ) curva radiométrica que muestra la dependencia de valores radiométricos a partir del pH que resulta por la aplicación de la aproximación radiométrica a las curvas de ST del panel e) . En la figura, el valor radiométrico (mostrado en el eje vertical (Y) de la gráfica) destaca para el valor calculado al utilizar la ecuación anterior (1) tras la irradiación del protón móvil a 72 ppm (sitio 1) y a 99 ppm (sitio 2), respectivamente.

Figura 4 : panel a) Curva radiométrica que muestra la dependencia del efecto de ST a partir de la Temperatura (valor radiométrico, obtenido por aplicación de la aproximación radiométrica en las curvas de calibración de ST registradas, respectivamente, a 20°C (cuadrados) y 37°C (circuios) ; panel b) espectro Z de YbHPD03A (solución 24mM, pH 7.31) registrado a 37°C (linea más oscura) y 20°C, mismo pH (linea gris) al utilizar un pulso de irradiación de 24 µ?.

Figura 5: panel a) Imagen por MR in vitro de un espectro que contiene 3 diferentes gránulos de células MSH que se han incubado (vaso capilar 2) o electroporado (vaso capilar 3) con una solución de YbHPD03A, o célula incubada con PBS y utilizada como referencia (vaso capilar 1) . Un vaso capilar vacio (4) se incluye también en el espectro; paneles b) y c) mapas de ST recolectados tras la irradiación, el espectro respectivamente está a 72 y 99 ppm, respectivamente.

Figura 6: espectro Z obtenido desde una vejiga de un ratón inyectada con 200 µ?, de una solución de YbHPD03A 150mM, registrada en un espectrómetro Bruker Avance300. En el espectro registrado, la línea más oscura corresponde a la curva de fijación y la más clara a la curva de fijación traducida con el fin de tener el mínimo del espectro Z que corresponde a 0 ppm.

Figura 7 : curva radiométrica de YbHPD03A medida in vitro a 33° obtenida a partir de las curvas de calibración registradas a esta temperatura, como por el Ejemplo 6.

Figura 8 : imagen morfológica (imágenes a la izquierda) y mapas de ST registrados en la región del tumor del ratón antes (PRE) , e inmediatamente después (Post) de la inyección i.v. de YbHPD03A. El efecto de ST calculado tras la irradiación a 66.2 y 91.6 ppm, respectivamente, se superpuso en la imagen anatómica correspondiente donde la región del tumor aparece como área más clara (rojo en la imagen actualmente observada) . En la figura, el símbolo @ indica la frecuencia de irradiación utilizada para promover la transferencia de saturación, que es, a decir, de 66.2 y 91.6 ppm.

Figura 9: fórmula del derivado tetramérico del YbHPD03A, identificado por otra parte como ( Yb3+) 4HPD03A-tetrámero o simplemente, Tetrámero.

Figura 10: panel a) curvas radiométricas medidas a diferentes temperaturas, que oscilan desde 298 hasta 312K, tras la irradiación de los protones del hidroxilo de dos isómeros del YbHPD03A-tetrámero y la aplicación de la aproximación radiométrica; panel b) dependencia de la temperatura del cambio químico por N R de los protones hidroxílicos que pertenecen a dos isómeros de YbHPD03A-tetrámero que se distinguen por NMR.

Figura 11: imágenes por MRI de un espectro que contiene el YbHPD03A-tetrámero a diferentes concentraciones, que oscilan desde 0.26 hasta 8.4mM (pH 7.4 y 298K) . Imagen de T2 pesada, a la izquierda; mapa de ST obtenido, a la derecha.

Figura 12 : panel a) Espectro de EuHPD03A en D20 por XH NMR; panel b) Magnificación del Espectro de EuHPD03A en D20, por NMR, 278K, pH 2 (superior) y H20, 310K, pH 2 (inferior) al confirmar la existencia de dos isómeros que se distinguen por NMR, que tienen cambio químico de 20.5 y 16.7, respectivamente (pH 2 y 20°C), incluso que se distinguen a la temperatura fisiológica (espectrómetro Advance 600).

Figura 13: panel a) espectro Z de EU ( III ) HPD03A (20mM) a pH 5.92 y 37°C a pulso de energía diferente; panel b) espectro Z de EU ( III ) HPD03A (20mM) a pH 7.46 y 37°C a pulso de energía diferente; panel c) perfil de ST de EU (III) HPD03A 20mM a pH 7.46, 37°C y energía de irradiación de 24 µ?.

Figura 14: espectro Z adquirido a 7T de una solución del Compuesto 2, a pH 5.8 y 298 K.

Figura 15: Dependencia del pH del efecto de ST obtenido tras la irradiación de los protones hidroxilicos de los dos isómeros magnéticamente no equivalentes desplegados por el Compuesto 2 (a 20°C) (curvas de calibración) .

Figura 16: curva radiométrica que reporta la dependencia del pH de ST (valores radiométricos ) que resultan por aplicación de la aproximación radiométrica a las curvas de ST de la figura 15.

Figura 17: Comparación del Espectro por 1H NMR del Compuesto 3 registrado en D20 a 278K y 298K, y 600 MHz de campo magnético. El espectro de alta resolución registrado a baja temperatura muestra claramente la presencia de dos conjuntos de señales debido a los dos isómeros principales (SAP y TSAP) dentro de la solución. Estas mismas señales son mucho más amplias a temperatura ambiente.

Figura 18: espectro Z del Compuesto 3, registrado de las soluciones (20mM) amortiguadas a diferentes valores de pH que oscilan desde 6.41 hasta 8, 20 °C; campo magnético de 7T, energía de irradiación 24 µ?.

Figura 19: perfiles de Transferencia de Saturación ST (a la izquierda) y espectros Z correspondientes (a la derecha) obtenidos a partir de soluciones acuosas (20mM) del Compuesto 4 amortiguadas a diferentes valores de pH que oscilan desde 5.08 hasta 6.30, a 293 K, campo magnético 7T, energía de irradiación 24 µ?.

Figura 20: curva de ST radiométrica que muestra la dependencia a partir del pH de valores radiométricos calculados, para el Compuesto 4, a partir de las curvas de ST obtenidas tras la irradiación de protones hidroxilicos a 75 y 100 ppm, respectivamente.

Figura 21: espectro Z del Compuesto 5, registrado a partir de soluciones acuosas (20mM) amortiguadas a diferentes valores de pH que oscilan de 5.5 y 8.1, 20°C campo magnético 7T, energía de irradiación 24 µ .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente, una fuente de protones móviles magnéticamente no equivalentes que permiten el establecimiento de un procedimiento por RI de CEST independiente de la concentración, que se representa por los protones móviles que pertenecen al menos a dos isómeros que se distinguen por NMR a partir de un agente de CEST paramagnético .

En este respecto, a menos que se proporcione de otra forma, la expresión "isómeros que se distinguen por NMR a partir de un agente de CEST" se refiere a estereoisómeros del agente de CEST que se proporcionan por señales de protones móviles las cuales se separan y, de este modo, se distinguen en el espectro de NMR, o, en otras palabras, las cuales muestran resonancias distintas (en el espectro de NMR) para los protones intercambiables, cada resonancia corresponde a un estereoisómero que se distingue por NMR.

En este sentido, los agentes de CEST adecuados, proporcionados para este tipo de protones magnéticamente no equivalentes, son, de preferencia los compuestos del complejo de Lantánidos (III) que comprenden un grupo que intercambia protones en un brazo colgante de ligando quelante que despliega al menos dos estereoisómeros en solución que se distinguen por NMR.

El espectro de NMR de estos compuestos del complejo, en efecto, muestra de forma interesante al menos dos resonancias separadas del protón intercambiable, que corresponde cada una con uno de los isómeros que se distingue por NMR, que pueden irradiarse selectivamente en procedimientos de captación de imágenes radiométricas basadas en CEST.

El uso de isómeros que se distinguen por NMR a partir de compuestos del complejo de Lantánidos (III) adecuados como una fuente de protones móviles magnéticamente no equivalentes explotables en un procedimiento de captación de imágenes radiométricas basadas en CEST constituye una modalidad de la presente invención.

Ahora está claro que, para explotar apropiadamente esta fuente alternativa de protones móviles no equivalentes en procedimientos basados en CEST in vivo, es necesario que el complejo de lantánidos utilice una sonda de CEST que despliegue una pluralidad de estereoisómeros que se distinguen por NMR bajo condiciones fisiológicas, o, en otras palabras, que las resonancias de los protones intercambiables de los estereoisómeros diferentes desplegados por el complejo de Ln(III) son incluso cambiados apropiadamente y bien detectados en solución acuosa, a temperatura ambiente y pH fisiológico .

Una clase particular de compuestos del complejo de Ln(III) se identifica en la presente, que comprende un ligando quelante macrociclico dotado con un grupo hidroxilo (-0H) que intercambia protones en un brazo colgante, que existe en solución como una mezcla de una pluralidad de isómeros que se distinguen por NMR. De manera ventajosa, el espectro de NMR de estos compuestos del complejo despliega al menos dos resonancias de los protones de OH que se intercambian, que corresponden a estereoisómeros diferentes, que incluso están presentes y bien separados en solución acuosa, y bajo condiciones de pH fisiológico y de temperatura .

El uso de esta clase particular de compuestos del complejo de lantánidos (III) en un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST representa una modalidad preferida de la presente invención.

Por lo tanto, en una modalidad la presente invención se relaciona con el uso de compuestos del complejo de lantánidos (III) que comprenden un ligando quelante dotado con un grupo hidroxilo que intercambia protones en un brazo colgante en procedimientos de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST que explotan (al menos dos) protones móviles magnéticamente no equivalentes cada uno proporcionado por un estereoisómero que se distingue por NMR del complejo de lantánidos en cuestión.

Los iones metálicos de Lantánidos (III) adecuados (o Ln(III)) se seleccionan del grupo que consiste de: praseodimio (III), neodimio (III), dísprosio (III), erbio (III), terbio (III), holmio (III), tulio (III), iterbio (III), y europio (III), donde el europio (III) e iterbio (III) se prefieren, y el iterbio (III) se prefiere particularmente .

Por otra parte, los ligandos quelantes adecuados de acuerdo con la invención incluyen ligandos quelantes macrocíclicos dotados con un grupo hidroxilo (OH) que intercambia protones en un solo brazo colgante.

Los preferidos son ligandos quelantes de la fórmula R es -CH (R2) -COOH, Ri es H o un alquilo de Ci a C5 de cadena recta o ramificada, que se interrumpe opcionalmente por un grupo seleccionado del grupo -O-, -N-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, y se sustituye opcionalmente por uno o más átomos de halógeno, grupos hidroxilo (-0H) , un grupo fenilo o fenilo sustituido, o por un grupo seleccionado de -COOH, -NHR3 o -NR4R5, en donde R3, R4 y R5 son, los mismos o diferentes entre si, H o un grupo alquilo de Ci a C3 recto o ramificado el cual se sustituye opcionalmente por uno o más grupos hidroxilo o alcoxi de C1-C3, R2 es H o una cadena de alquilo de ??-05 que se sustituye opcionalmente por uno de los grupos alcoxi de C1-C3, o hidroxialcoxi .

En este sentido, debe ser claro para la persona experimentada que, cuando el ligando quelante de la fórmula (I) forma complejos con un ion metálico de Lantánido (III) de tres cargas positivas, el grupo carboxilico de la porción R está en la forma desprotonada (-CH (R2) -COOH) correspondiente.

En la presente descripción, a menos que se proporcione de otra manera, con el término grupo alquilo de C1-C5 recto o ramificado se pretende una cadena de alquilo lineal o ramificada con 1 a 5 átomos de carbono. Ejemplos adecuados para grupos alquilo comprenden metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ter-butilo, n-pentilo, y similares.

Los grupos alquilo anteriores además pueden sustituirse y/o interrumpirse por uno o más de halógeno, hidroxilo, alcoxi, amino, hidroxialcoxi , grupo fenilo o fenilo sustituido como se establece en lo anterior.

Con el halógeno o átomos de halógeno, se pretenden átomos de yodo, cloro, bromo, o flúor, estos últimos siendo particularmente preferidos.

Con el término fenilo sustituido, se pretende un grupo fenilo que se sustituye por uno o más del átomo de halógeno, hidroxilo (OH) , o grupos alcoxi de C1-C3, o un grupo seleccionado de -(CH2)nCOOH, -N02, -NHR3, o un grupo NR4R5, en el cual n es 0 ó 1 y R3, R4, y R5 son como se definen en lo anterior .

Con el término alcoxi de CX-C3 se pretende cualquier grupo alquil-oxi en donde la porción alquilo incluye hasta 3 átomos de carbono.

Con el grupo hidroxialcoxi se pretende cualquiera de los grupos alcoxi de C1-C3 anteriores en donde la porción alquilo está además sustituida por un grupo hidroxilo.

Ejemplos adecuados de grupos alcoxi o hidroxialcoxi de la invención comprenden, por ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, hidroximetiloxi, -2-hidroxietoxi , 2,3-dihidroxipropoxi , y similares.

De preferencia, dentro de los compuestos de la fórmula (I), R2 representa H, y Ri es H o un alquilo de C1-C4 de cadena recta o ramificada, opcionalmente interrumpido por un átomo de oxigeno, o sustituido por un -OH, -NH2 o un grupo fenilo que puede estar a su vez sustituido o no por un hidroxilo, un alcoxi de Ci~C3, un nitro o un grupo carboxilo.

Incluso de mayor preferencia, dentro de los compuestos de la fórmula (I); R2 es H y Ri representa un grupo seleccionado de: -H, -CH3, -CH2CH3 , -CH2OH, -CH2-O-CH3, -CH(CH2OH)2, -CH2CH (OH) -CH2OH, -CH2-0-CH2-C6H5, -CH2-O-CH2- (C6H5-COOH) , -CH2-0-CH2-(C6H5-N02) .

Se prefiere especialmente de acuerdo con la invención, un complejo de Ln(III) de un ligando de la fórmula (I) en el cual R2 es H y Ri es -CH3, aunque el ion quelado de Ln(III) se selecciona a partir de Yb(III) o Eu(III).

Los derivados de dimero o multimero comprenden al menos dos ligandos quelantes de la fórmula (I) , opcionalmente ligados a través de sus grupos Ri que pueden estar funcionalizados en forma adecuada, si es apropiado, que están comprendidos dentro de la presente invención, y en general están dotados con una sensibilidad incrementada.

Por consiguiente, en una modalidad diferente, la invención se relaciona con compuestos del complejo de Ln(III) en donde el ligando quelante es un derivado dimérico o multimérico de un compuesto de la fórmula (I) .

Un ejemplo de este tipo de compuesto, por ejemplo, se describe en el Ejemplo 1 a continuación, junto con el esquema para su preparación.

El ligando quelante tetramérico del Ejemplo 1, o HPD03A-Tetrámero, como se utiliza en la presente de forma intercambiable, asi como las sales del mismo y los complejos quelados del mismo con (hasta) cuatro iones metálicos paramagnéticos es novedoso y constituye un objeto adicional de la presente invención.

En este sentido, dentro de los iones metálicos paramagnéticos adecuados se seleccionan de lo siguiente: Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Ni (2+) , Rh(2+), Co(2+), Cr(3+), Gd(3+), Eu(3+), Dy(3+), Tb(3+), Pm(3+), Nd(3+), Tm(3+), Ce(3+), Y(3+), Ho(3+), Er(3+), La(3+), Yb(3+), n(3+), Mn(2+). De mayor preferencia, el ion metálico paramagnético es Gd(3+) o un metal de lantánido seleccionado de Yb(3+), Eu(3+) o Dy(3+).

Un objeto adicional de la presente invención es una composición de diagnóstico que comprende un complejo paramagnético, o, especialmente un Ln(III) bis- o poli-quelado de un derivado dimérico o multimérico de un ligando quelante de la fórmula (I), o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, junto con aditivos adecuados y/o portadores para el uso en la captura de imágenes por MR. En una modalidad preferida, la composición de diagnóstico comprende el (Yb3+) 4HPD03A-Tetrámero, que tiene la estructura de la figura 9.

El ligando quelante de la fórmula (I) , comprende al menos tres grupos carboxilicos en un esqueleto macrociclico, que de manera conveniente puede estar en forma de sales fisiológicamente aceptables.

Los ejemplos adecuados de cationes de bases inorgánicas que pueden utilizarse para salificar los ligandos de la invención comprenden iones de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como potasio, sodio, calcio o magnesio .

Los cationes preferidos de bases orgánicas comprenden, ínter alia, aquellos de aminas primarias, secundarias y terciarias tales como etanolamina, dietanolamina, morfolina, glucamina, N-metilglucamina, N,N-dimetilglucamina .

Los aniones preferidos de ácidos inorgánicos comprenden los iones de ácidos de halógeno tales como cloruros, bromuros, yoduros u otros iones tales como sulfato.

Los aniones preferidos de ácidos orgánicos comprenden aquellos ácidos utilizados de forma rutinaria en técnicas farmacéuticas para la salificación de sustancias básicas tales como, por ejemplo, acetato, succinato, citrato, fumarato, maleato u oxalato.

Los cationes y aniones de aminoácidos preferidos comprenden, por ejemplo, aquellos de taurina, glicina, lisina, arginina, ornitina o de ácidos aspártico y glutámico.

Por otra parte, los tres grupos carboxílicos del ligando macrociclico están todos involucrados con la quelación del ion lantánido de tres cargas positivas. Como resultado, los compuestos del complejo de Ln(III) de la fórmula (I) son neutros, y de este modo adecuados para aplicaciones in vivo sin ninguna neutralización o salificación adicional.

En el caso, a su vez, el ligando quelante comprende un grupo acidico adicional en su estructura, es necesario su neutralización con un catión utilizado de forma rutinaria en técnicas farmacéuticas, por ejemplo seleccionado de aquellos listados anteriormente, para proporcionar una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los complejos quelados de Ln(III) de la fórmula (I) en los cuales Ri es diferente de H, y el derivado de dimero o multimero del mismo, incluye un centro quiral, representado por el carbono hidroxilado en el brazo colgante. Para ello, en solución, se despliega una pluralidad de formas estereoisoméricas que difieren, esencialmente, en la disposición de los brazos de acetato (orientados en dirección o en contra de las manecillas del reloj), en las dos conformaciones del anillo macrocíclico y en la conformación del centro quiral (R,S) . En este sentido, una persona con experiencia está consciente que cuando Ri es H, el carbón pierde su quiralidad, pero todavía existen los isómeros que difieren en la disposición de los brazos de acetato o en la conformación del anillo.

La presente invención está basada en la observación de los diasteroisómeros desplegados en solución acuosa, a temperatura ambiente, por su clase preferida de compuestos del complejo, se distinguen en el espectro de NMR. Más en particular, se encuentra que los compuestos del complejo de Ln(III) de la fórmula (I), establecidos por la invención, son desplegados en solución, a temperatura y pH fisiológicos, en al menos dos resonancias que cambian de forma adecuada para los protones de OH intercambiables, que corresponde cada uno a un diasteroisomero diferente del complejo, que se distingue por NMR. De manera ventajosa, los estereoisomeros diferentes del mismo complejo se probaron para tener la misma biodistribución in vivo y misma proporción de concentración relativa con el tiempo. Por lo tanto, la pluralidad de resonancias de protones de OH adecuadamente cambiadas a partir de los estereoisomeros de un compuesto del complejo de Ln(III) de la fórmula (I) que se distinguen por NMR, desplegados en solución pueden utilizarse de manera provechosa para establecer el procedimiento por MRI radiométrica a base de CEST explotable en condiciones in vivo, para proporcionar imágenes de CEST in vivo que no se afectan por la concentración local del complejo en cuestión.

Además, de manera interesante, la cantidad de transferencia de saturación ST obtenida por la saturación selectiva de los protones intercambiables de OH a partir de los compuestos del complejo de Ln(III) de acuerdo con la invención es marcadamente sensible a, o, en otras palabras, sensible para los . parámetros físicos o químicos del microambiente en el cual se distribuyen. Como resultado, la clase particular de compuestos del complejo de Ln(III) establecido por la presente invención, además de ser explotable en- el procedimiento de captura de imágenes por CEST para proporcionar el contraste de CEST independiente de la concentración, de manera provechosa también puede explotarse como agentes sensibles de CEST, en particular en los procedimientos de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST que se permiten para proporcionar mediciones y mapas in vivo de los parámetros físicos o químicos de interés diagnóstico que no se afectan por la concentración local del agente mismo.

Por lo tanto, en una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con el uso de un compuesto del complejo de Ln(III) de la fórmula (I) como agente sensible de CEST independiente de la concentración, especialmente en un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST para la determinación in vivo de parámetros físicos o químicos de interés diagnóstico.

En la presente invención, a menos que se indique de otra forma, con el parámetro físico o químico de interés diagnóstico se pretende un parámetro seleccionado de temperatura, pH, presión parcial de oxigeno (p02) o dióxido de carbono (pC02) , concentración especifica del ion o metabolito, o actividad enzimática especifica.

En este sentido, ahora es claro que, al conocer el valor, o el mapa, del o los parámetros físicos o químicos en el órgano o región del cuerpo bajo investigación, un médico puede proporcionar evaluaciones de diagnóstico de aquellos procesos fisiológicos o metabólicos de interés diagnóstico que se relacionan estrictamente con el o los parámetros evaluados .

Incluso en una modalidad adicional, la invención se relaciona con un procedimiento por MRI radiométrico basado en CEST que comprende explotar, es decir, irradiar con un pulso de radiofrecuencia adecuado y, de este modo, inducir una transferencia de saturación a la señal de volumen de agua, al menos dos protones móviles magnéticamente no equivalentes que se proporcionan por dos o más estereoisómeros de una sonda de CEST adecuada que se distinguen por NMR.

En este sentido, debe ser claro para el técnico experimentado que se comprende dentro de la presente invención un procedimiento de MRI radiométrico basado en CEST al explotar los protones móviles magnéticamente no equivalentes que pertenecen a los isómeros que se distinguen por NMR de cualquier sonda de CEST adecuada. En una modalidad preferida, la sonda de CEST afectada es un agente de CEST paramagnético y, de mayor preferencia, es un compuesto del complejo de Ln(III) establecido por la presente invención.

En una modalidad particularmente preferida, la sonda de CEST es un complejo de Ln(III) del ligando quelante HPD03A, o un complejo bis- o poliquelado de su derivado dimérico o multimérico, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo.

Por consiguiente, en una modalidad preferida del mismo, la presente invención se relaciona con un procedimiento de MRI radiométrico basado en CEST que comprende utilizar un compuesto del complejo de Ln(III) de la fórmula (I), o un derivado de dímero o multimero del mismo, para proporcionar la captura de imágenes de CEST in vivo independiente de la concentración. Incluso de mayor preferencia, el procedimiento de MRI radiométrico basado en CEST se emplea para la determinación in vivo del parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal, que no se afecta por la concentración local del agente de CEST.

Más en particular, en una modalidad preferida la invención se relaciona con un procedimiento de Captura de imágenes de CEST independiente de la concentración para obtener imágenes de un órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal, que comprende: a) administrar uno de los complejos quelados de Ln(III) de la fórmula (I) o un derivado de dimero o multimero del mismo a un sujeto humano o animal y, opcionalmente, registrar las imágenes morfológicas por MRI de la región del órgano, fluido o tejido del cuerpo humano o animal de interés, de preferencia al utilizar las secuencias pesadas de T2, b) recolectar un espectro Z en un intervalo de frecuencias finamente sintonizadas en las frecuencias de resonancia de dos protones móviles magnéticamente no equivalentes que pertenecen a los estereoisómeros del complejo del Lantánido administrado que se distinguen por NMR, y calcular los valores radiométricos del efecto de transferencia de saturación (ST) medidos para estas dos combinaciones de protones móviles , c) obtener las imágenes independientes de la concentración de la región del órgano, fluido o tejido del cuerpo humano o animal, en donde la etapa C del procedimiento comprende de preferencia superponer el mapa de valores radiométricos, obtenidos de los efectos de ST medidos en la etapa b) del procedimiento, en las imágenes morfológicas registradas previamente del órgano, región, fluido o tejido del cuerpo humano o animal. En este sentido, en la etapa b) las frecuencias de resonancia de los dos protones móviles magnéticamente no equivalentes se obtiene desde el espectro de NMR del complejo, de tal forma que si no es ya conocido, puede registrarse de forma apropiada antes de la captura de imágenes por CEST.

El procedimiento de Captura de imágenes por CEST anterior puede implementarse in vitro (ex vivo) o, de preferencia, in vivo, para obtener imágenes in vivo de una región de órgano, fluido o tejido del cuerpo humano o animal.

En otra modalidad preferida, la invención se relaciona con un método para determinar, mediante el uso de la técnica por MRI de CEST, un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, región, fluido o tejido del cuerpo humano o animal que comprende: i) administrar uno de los complejos quelados de Ln(III) de la fórmula (I) o un derivado de dímero o multímero de los mismos a un sujeto humano o animal y, opcionalmente, registrar la imagen morfológica por MRI del órgano, región, fluido o tejido del cuerpo humano o animal de interés , ii) recolectar un espectro Z, en un intervalo de frecuencias finamente sintonizadas en las frecuencias de resonancia de dos protones móviles magnéticamente no equivalentes que pertenecen a los estereoisómeros que se distinguen por NMR del complejo de Lantánido administrado, y calcular los valores radiométricos a partir del efecto de transferencia de saturación (ST) medidos para estas dos combinaciones de protones móviles, iii) obtener, a partir de la ST calculada, un mapa (o mapa radiométrico) independiente de la concentración del parámetro de interés en el órgano, región, fluido o tejido del cuerpo humano o animal afectado de interés, al superponer el mapa en la imagen morfológica, la determinación se realiza in vitro (ex vivo), o de preferencia, in vivo, en un órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal.

En una modalidad especialmente preferida, la invención se relaciona con un procedimiento de Captura de imágenes de CEST independiente de la concentración para obtener mapas ín vivo del pH en un órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal de interés que comprende explotar dos protones móviles magnéticamente no equivalentes que pertenecen a los estereoisómeros que se distinguen por NMR de un complejo quelado de Ln(III) del ligando quelante HPD03A, o de un derivado de dimero o multímero del mismo, o de una sal fisiológicamente aceptable de los mismos.

En este sentido, una persona experimentada está consciente de que las etapas de captura de imágenes detalladas anteriormente, incluyen irradiar la frecuencia del protón móvil, recolectar el espectro Z, calcular un efecto de ST radiométrico y, al utilizar curvas de calibración previamente realizadas, obtener un mapa del parámetro físico o químico deseado en un órgano o región del cuerpo, que se realizan automáticamente por tomografía, una vez ajustada apropiadamente, de acuerdo con los procedimientos utilizados en la práctica de diagnóstico actual, y al utilizar procedimientos de procesamiento de datos, por ejemplo, descritos en el protocolo de captura de imágenes proporcionado en la sección experimental y en la literatura citada, incorporada en la presente para referencia.

En los métodos de la invención, el compuesto del complejo de Ln(III) de la fórmula (I) (o el dimero o multímero del mismo, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo) que actúa como un agente de CEST de acuerdo con la invención se administra en forma de una preparación farmacéutica adecuada.

En este sentido, de acuerdo con una modalidad preferida en particular de la presente invención, ambos de los procedimientos anteriores basados en CEST se realizan en cuerpos de humano o animal pre-administrados adecuadamente con una preparación farmacéutica que comprende una cantidad adecuada del compuesto del complejo de Lantánido de acuerdo con la invención. En otras palabras, de acuerdo con una modalidad particularmente preferida, la presente invención se relaciona con un método para la captura de imágenes in vivo de un órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal o para la evaluación o mapeo in vivo, por el uso de la técnica por RI de CEST, de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal por el uso de la técnica de Captura de imágenes por Resonancia Magnética basada en CEST que se lleva a cabo en un cuerpo humano o animal pre-administrado adecuadamente con una preparación farmacéutica que comprende una cantidad adecuada de un compuesto del complejo de Lantánido (III) de acuerdo con la invención. "Cantidad adecuada", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier cantidad de un agente de contraste de la invención, o composición farmacéutica de la misma, que es suficiente para cumplir con su o sus propósitos de diagnóstico pretendidos: es decir, por ejemplo, para adquirir las imágenes contrastadas independientes de la concentración o proporcionar los mapas independientes de la concentración de un parámetro de interés en un órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo de un humano o animal de interés, por el uso de la técnica de captura de imágenes por MRI basada en CEST.

En este respecto, la administración o pre-administración, por ejemplo, puede ocurrir por inyección intravascular (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial , intraventricular , y asi sucesivamente) o intratecal, intraperitoneal , intralinfática, intracavital, oral o enteralmente . Las formulaciones farmacéuticas inyectables de los compuestos del complejo de Lantánido (III) de la fórmula (I) se preparan típicamente al disolver el ingrediente activo en agua de pureza adecuada, es decir, el complejo lantánido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los excipientes farmacéuticamente aceptables desde el punto de vista farmacológico. La formulación resultante se esteriliza de forma adecuada y puede utilizarse como tal o puede liofilizarse y reconstituirse alternativamente antes del uso.

Estas formulaciones pueden administrarse en concentraciones que dependen de los requerimientos de diagnóstico, a una dosis que oscila de 0.01 a 0.5mmol/kg de peso corporal.

Como se ha mencionado anteriormente, de acuerdo con la presente invención, se prefiere en particular, un complejo de Ln(III) de un ligando de la fórmula (I) en donde R2 es H y Ri es -CH3, aunque el ion quelado de Ln(III) se selecciona de Y (III) o Eu(III).. Los compuestos del complejo de lantánido de este ligando se han utilizado de este modo como ejemplo no limitante, representativo de la presente invención.

Este ligando se conoce en la técnica con el nombre de HPD03A y el complejo quelado del mismo con Gd3+ es el agente de contraste bien conocido utilizado en la captura de imágenes por MRI convencional, desde hace tiempo fabricada como ProHance™. La toxicidad muy baja y la excelente tolerabilidad mostrada por este agente son conocidas en la técnica desde hace mucho tiempo y hace su uso particularmente ventajoso y seguro en procedimientos de captura de imágenes de CEST, incluso en dosis que esta técnica requiere de hasta 10 veces la dosis (0. lmmol/kg) típicamente utilizada en la MRI convencional.

La estructura de los complejos de Gd(III) e YB(III) de HPD03A se ha determinado por medio de rayos X (véase por ejemplo, Kumar, K.; Chang, C. A.; Francesconi, L. C; Dischino, D. D.; alley, M. F.; Gougoutas, J. Z . ; Tweedle, M. F. Inorg. Chem. 1994, 33, 3567-75). En el articulo citado se reporta que, incluso al iniciar desde una solución racémica, la presencia de una unidad asimétrica incluye el grupo 2-hidroxipropil quiral que resulta en dos complejos independientes que tienen una conformación diasteromérica que difiere de la conformación relativa del macrociclo, aunque todos los brazos coordinados de los dos complejos aislados tengan la misma orientación, es decir, están trenzados en el mismo sentido.

En solución, los complejos de Ln(III) del HPD03A, tienen la siguiente estructura (en la cual el protón móvil del OH está circulado) , típicamente despliega ocho formas isoméricas, más específicamente cuatro diaesteroisómeros y cuatro enantiómeros , que se esquematizan en el Esquema 1 a continuación .

Esquema 1 enantlómeros ?(????)?? ?(dddd) 5 ?(????) A(6d56)S ?(dddd)?? ?{??? )$ ?(dddd) ?* ?(???? 5 Dos de las formas diasteroisoméricas , más probablemente atribuidas a las formas R y S, respectivamente, del mismo conformador, se detectan en el espectro de NMR (mostrado en la figura 1), y, en particular, en el espectro Z de Yb-HPD03A (reportado en la figura 2b) que muestra claramente dos regiones de transferencia de saturación, que se atribuyen de forma razonable a los dos diasteroisómeros principales. Una evidencia de otros dos diasteroisómeros, puede a su vez, derivarse por una comparación del espectro de NMR del complejo registrado a diferente temperatura.

En total acuerdo con todo lo anterior, los grupos hidroxilo de dos diasteroisómeros del complejo que se distinguen con NMR muestran buenos cambios químicos diferentes, respectivamente a 72 y 99 ppm a 20°C, mostrados en la figura 2a) , y diferentes tasas de intercambio, que pueden explotarse para establecer un procedimiento con base radiométrica de acuerdo con la presente invención.

La sensibilidad mostrada por este complejo hacia el pH también se ha verificado, por medio de experimentos por MRI in vitro reportados en detalle en la sección experimental .

Los resultados obtenidos confirman que la dependencia de la transferencia de saturación en el pH desplegado es diferente para cada uno de los protones móviles del OH a partir de los diasteroisómeros de Yb-HPD03A. Esto permite la explotación de una aproximación radiométrica que permite una evaluación independiente de la concentración del pH intracelular en la prueba realizada con células madre mesenquimales .

De forma interesante, los mapas de ST obtenidos de esta prueba, mostrados en los paneles b y c de la figura 5, respectivamente, confirman que un efecto de ST pudiera verse sólo para aquellas células incubadas o electroporadas con YbHPD03A, aunque cualquier saturación se registró en ausencia del complejo. El efecto de ST observado fue mayor para aquellas células electroporadas, que corresponden a un pH medido de 7.00 + 0.2 aunque el pH medido en el gránulo de células 2 fue de 6.8 + 0.3.

En forma notable, la alta sensibilidad mostrada por Yb (III ) HPD03A hacia el pH, permite su uso efectivo en la determinación del pH ambiental en una región del tumor (tumor subcutáneo), como se muestra en la figura 8. Este resultado, para conocimiento, nunca se había logrado antes con agentes de CEST.

También se ha probado la sensibilidad mostrada por Yb ( I I I ) HPD03A hacia la temperatura ambiental. Los resultados obtenidos, en particular, resaltan la sensibilidad relevante para la temperatura desplegada por los cambios químicos de los dos protones hidroxílicos de los dos disterómeros distinguidos por NMR. De este modo, puesto que el cambio químico no depende de la concentración, la temperatura del ambiente puede obtenerse exactamente de forma simple por el valor del cambio químico observado en el espectro Z del complejo.

Como se espera, una sensibilidad incrementada mucho mayor, en particular hacia la temperatura, se ha observado con el derivado tetramérico de Yb ( III ) HPD03A, incluidos hasta cuatro protones móviles de OH para cada uno de los estereoisómeros que se distinguen.

También se probó la misma sensibilidad hacia el pH mostrada por Yb ( III ) HPD03A para el compuesto del complejo de Eu(III) correspondiente. El espectro de NMR de este complejo, mostrado en la figura 12, despliega claramente la presencia de dos isómeros principales. Las señales que pertenecen al grupo idroxílico de estos isómeros se han asignado al comparar el espectro de NMR de dos diferentes soluciones que contienen EuHPD03A en agua y D20, respectivamente. Dos cambios químicos (para los protones de OH de los dos diasteroisómeros) se han asignado, de este modo, respectivamente a 20.5 ppm (de agua), y 16.7 ppm, a un pH=2 y 37°C. Sin embargo, como aparece desde la figura 13, al incrementar el pH de la solución hacia los valores fisiológicos, la tasa de intercambio de protones incrementa y la separación en el cambio químico entre estas dos señales disminuye haciendo difícil la irradiación selectiva de los mismos bajo condiciones fisiológicas. Un perfil de ST, sin embargo, se registró al utilizar un pulso de irradiación diferente, mostrando que al trabajar a ßµ? (energía de irradiación) es posible observar ambas de las dos resonancias distintas y entonces realizar una medición radiométrica, aunque una transferencia de saturación está en cualquier caso haciendo que se observen al utilizar una frecuencia de resonancia de valor intermedio (con respecto a las frecuencias de absorción real) , es decir, aproximadamente a 18 ppm. A partir de todo lo anterior, resulta que YbHPD03A y EuHPD03A pueden utilizarse efectivamente como aqentes sensibles de CEST para la evaluación in vivo del pH y la temperatura .

En este sentido, uno puede asumir con toda seguridad que ambos» de Yb- y RuHPD03A tienen las mismas propiedades, en términos de biodistribución, excreción y tolerabilidad, mostrados por ProHance®, el complejo de Gadolinio correspondiente y, por lo tanto, pueden permitir el mismo tipo de captura de imágenes anatómicas convencionales que promueven. De manera ventajosa, sin embargo, el uso de complejos de Yb y Eu permite la adquisición de la captura de imágenes anatómicas basadas en CEST y además para suplementar e integrar la información anatómica ya permitida por ProHance® en la MRI convencional con información adicional que respecta al pH y/o temperatura de la región anatómica mejorada en donde se distribuye el agente.

Como una prueba más del principio, la sensibilidad al pH desplegado por el complejo de Yb(III) del ácido 4- [2-hidroxi-3- [4,7, 10-tris [carboximetil 2- (1, 1-dimetiletoxi- 1, , 7, 10-tetraazaciclododec-l-il] propoxi] benzoico (de aquí en adelante como Compuesto 2) que tiene la siguiente fórmula Compuesto 2 también se evaluó.

El espectro Z del Compuesto 2 (reportado en la figura 14) muestra dos regiones de transferencia de saturación que se atribuyen a los dos diasteroisómeros principales del complejo dentro de la solución. La presencia de dos diasteroisómeros distintos se proporciona para dos resonancias de protones de OH que cambian de forma adecuada a 50 y 94 ppm, respectivamente.

Las pruebas de sensibilidad realizadas con este complejo confirmaron su sensibilidad al pH, tal como éste aparece desde las figuras 15 y 16, que es mayor a un pH más ácido, de preferencia que oscila de 5.5 a 6.2, debido a una tasa de intercambio mayor mostrada por los protones hidroxilicos de los diasteroisómeros de este complejo, sobre los protones móviles en el Yb (III) HPD03A.

Un ejemplo adicional del agente sensible al pH de acuerdo con la invención, se representa por el complejo de Yb 3+ del ácido 1- (2-hidroxietil) -1,4,7,10-tetraazaciclododecan-4 , 7 , 10-triacético, de aquí en adelante Compuesto 3, que tiene la fórmula Compuesto 3 El espectro de NMR de este compuesto, reportado en la figura 17, muestra dos conjuntos de señales que se atribuyen a la presencia de dos isómeros principales, que corresponden a las formas SAP y TSAP del compuesto. Por supuesto, los cuatro isómeros que están presentes en la solución difieren ya sea en la disposición de los brazos de acetato o en la conformación del anillo macrocíclico. Puesto que estos isómeros son pares de enantiómeros , se esperan actualmente dos conjuntos de señales en el espectro de N R como enantiómeros que se distinguen desde un punto de vista de NMR. En total acuerdo con lo anterior, el espectro Z del Compuesto 3 (reportado en la figura 18 para cada uno de los valores de pH probados) muestra la presencia de dos regiones de saturación que se atribuye a los grupos de OH en los brazos hidroxietilo de los dos antiprismas cuadrados diferentes y en los isómeros (SAP y TSAP) del antiprisma cuadrado trenzado proporcionados para este compuesto, cuyas resonancias se cambian a 78 y 99 ppm, respectivamente.

Los resultados de la prueba de sensibilidad realizada con este compuesto en un intervalo de pH que oscila de 6.4 a 8, proporcionados en la figura 18 confirman su sensibilidad hacia el pH.

Otro ejemplo del compuesto del complejo de Ln(III) de acuerdo con la invención es el complejo de Yb(III) del ácido 1 [ 2, 3-dihidroxi-3-aminopropil ] 1,4,7,10- tetraazaciclododecan- , 7 , 10-triacético (de aquí en adelante Compuesto 4) que tiene la siguiente fórmula Compuesto 4 En este caso, la presencia de dos diasteroisómeros distintos puede proporcionarse para los cuatro protones móviles no equivalentes, que pertenecen a los dos grupos diferentes de hidroxilo - OH en cada uno de los dos isómeros diferentes de SAP y TSAP.

Por supuesto, el espectro Z y los perfiles de Transferencia de Saturación ST del Compuesto 4 (reportado en la figura 19) confirman la presencia de tres resonancias de protones que cambian de forma apropiada, a 10, 75 y 100 ppm, respectivamente. De éstas, las resonancias sumamente cambiadas (a 75 y 100 ppm, respectivamente) , se atribuyen de forma razonable a los protones que se intercambian de los grupos OH más cercanos a la esfera de coordinación del centro metálico proporcionado por los dos isómeros distintos (SAP y TSAP) del compuesto en la solución, aunque la señal menos cambiada se atribuye a un protón de intercambio del grupo restante de OH, más distante del centro metálico. Una cuarta combinación que se intercambia no se detecta en el espectro, probablemente debido a su tasa de intercambio muy rápida en la escala de tiempo de la NMR.

Las pruebas de sensibilidad realizadas in vitro con este compuesto del complejo confirman su sensibilidad al pH como aparece en la figura 19 y la figura 20.

En particular, los resultados obtenidos confirman que la dependencia de la transferencia de saturación a partir del pH desplegado por los protones móviles del OH de los dos diasteroisómeros a 75 y 100 ppm, respectivamente, es diferente. Esto permite la explotación de una aproximación radiométrica que permite una evaluación independiente de la concentración de pH intracelular en la prueba realizada con células macrofágicas de murino (J774) marcadas con este compuesto de complejo produciendo un valor pH de 6.8.

Como un ejemplo adicional, el complejo de Yb a partir del ácido 1 [1, 3, -trihidroxibutan-2-il] 1, 4 , 7 , 10-tetraazaciclododecan- , 7 , 10-triacético (de aquí en adelante compuesto 5) , que tiene la siguiente estructura Compuesto 5 se ha investigado.

En este respecto, de nada vale que el complejo de Gd3+ de este mismo ligando quelante sea un agente de contraste bien conocido, clínicamente aprobado para uso en la captura de imágenes por RI convencional y fabricado como GADOVIST®. Su preparación se describe en EP0448191.

La estructura de este compuesto incluye dos centros quirales que incrementan significativamente el número de estereoisómeros potenciales sobre, por ejemplo, Yb (III) HPD03A.

El espectro Z de este compuesto, proporcionado como figura 21, muestra al menos dos picos que se distinguen a 50 y 75 ppm, respectivamente, que se deben a las dos formas estereoisoméricas más abundantes entre la pluralidad que esto permite. La alta tasa de intercambio caracterizada por los protones móviles de este compuesto resulta en que los isómeros más abundantes que se distinguen por NMR se detectan sólo a valores de pH bajos, alrededor de 5.5. A valores de pH mayores, en su lugar, aparece en el espectro un pico a -75, de forma similar debido a un cambio en la estructura del compuesto .

Aunque no se abarca por los complejos de Lantánido ( III ) de la fórmula (I) , se prefiere de acuerdo con la presente invención, que el Compuesto 5 anterior se proporcione a partir del agente dentro de la solución para protones móviles no equivalentes que pertenecen a los grupos hidroxilo de estereoisómeros que se distinguen por N R, aprobados para establecer un procedimiento de captura de imágenes de CEST independiente de la concentración de acuerdo con la presente invención.

Por lo tanto, el uso de un complejo de Lantánido (III) a partir del ácido 1 [1, 3, 4-trihidroxibutan-2-il] 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan- , 7, 10-triacético en un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST de acuerdo con la invención, asi como un procedimiento por MRI radiométrico basado en CEST al explotar dos protones móviles magnéticamente no equivalentes proporcionados por dos isómeros del complejo de Ln(III) que se distinguen por NMR, se comprenden dentro de la presente invención y constituyen una modalidad adicional de la misma.

SECCIÓN EXPERIMENTAL Los ligandos quelantes de la fórmula (I) son conocidos en la técnica o pueden prepararse fácilmente de acuerdo con procedimientos conocidos o rutas sintéticas bien conocidas por el técnico experimentado.

Los ejemplos no limitantes de procedimientos sintéticos, sin embargo, se incluyen a continuación, por ejemplo, en los Ejemplos 1 - 3, junto con los detalles relacionados con el uso de los compuestos del complejo de lantánido (III) de acuerdo con la invención en el procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST.

Procedimiento y condiciones de captura de imágenes por CEST La mejora del contraste por MR de CEST se ha determinado en imágenes adquiridas a 7 T en un espectrómetro Bruker Avance 300 equipado con una sonda de captura de microimágenes Micro2.5. Se utilizó una secuencia de eco del espín típicamente POCO COMÚN (factor poco común de 64) con un tiempo de eco de 3.3 ms y un valor TR de 5 s . Se utilizó una matriz de adquisición de 64x64 con un FOV cuadrado de 10mM. Toda la secuencia fue precedida por un esquema de saturación que consistió de un pulso de onda continuo de 2 s de longitud con una intensidad de RF de 24, 12, 6 µ? . El espectro Z se analizó exitosamente con el fin de determinar el valor radiométrico al utilizar un software compilado en la plataforma operativa MATLAB, como se describe, ampliamente, en Development and validatíon of a smoothing-splines-based correction method for improving the analysis of CEST-MR images, Stancanello J Terreno E, Delli Castelli D, Cabella C, Uggeri F 1, Aime S.; CONTRAST MEDIA & MOLECULAR IMAGING Volumen: 3, Articulo: 4, Páginas: 136-149, 2008; y en Methods for an improved detection of the MRI-CEST effect. Terreno E, Stancanello J, Longo D, Delli Castelli D, Milone L, Sanders HMHF, Kok MB, Uggeri F, Aime S; CONTRAST MEDIA & MOLECULAR IMAGING; Volumen: 4, Articulo: 5; Páginas 237-247; 2009 de los cuales todos se incluyen para referencia en su totalidad. La concentración paramagnética total de la solución se determinó a través de la medición de susceptibilidad magnética de la solución en un espectrómetro Bruker Avance 600 (12T) .

Ejemplo 1 Preparación del ( Yb3+) 4HPD03A-tetrámero .

El complejo quelado tetramérico YbHPD03A-tetrámero se ha preparado al utilizar el procedimiento sintético esquematizado en el Esquema 2, cuyas etapas principales se detallan a continuación.

Esquema 2 .OH + Bf/\ COOH THF temperatura NaH ambiente ,COOH (I) Ácido 3 , 6-dioxa-8-nonenoico (I): Una solución de 2-aliloxietanol (112 g; 1.1 moles) en THF (100 mi) se filtró en una suspensión de hidruro de sodio (60% en aceite) (88 g; 2.2 moles) en THF (250 mi) bajo agitación mecánica. Después de 20 h a temperatura ambiente, se agregó por goteo una solución de ácido bromoacético (138.9 g; 1.0 mol) en THF (150 mi), provocando el reflujo espontáneo del solvente. La solución se mantuvo bajo reflujo durante 2 horas, luego se diluyó con etanol (50 mi), y después de 30 minutos, se concentró la suspensión. El residuo se disolvió en agua (400 mi) y la solución se enjuagó con etiléter (3 x 100 mi), diclorometano (2 x 100 mi) ; la fase acuosa se acidificó a pH 1 con clorhidrato ácido al 37% y el producto se extrajo con diclorometano (300 mi + 4 50 mi) . La fase orgánica se enjuagó con agua (4 x 50 mi) , salmuera (40 mi) y se evaporó a un residuo liquido que se destiló bajo vacio, a una presión de 67 Pa, para obtener ácido 3 , 6-dioxa-8-nonenoico (I) como liquido incoloro (119.5 g; 0.746 mol). Rendimiento del 75%. p.eb67 Pa 98 - 100°C. Titulo 93.5%. 12 ,12' -bis [2-aza-3-oxo-5 , 8-dioxa-ll-undecanil] -1 , 13-dien- , 7 , 17 , 20-trioxa-9 , 15-dioxo-10 , 14-diazatricosano (II) Se agregaron ácido 3, 6-dioxa-8-nonenoico (I) (40.1 g; 0.25 mol), diisopropiletilamina (42.6 mi; 32.4 g; 0.25 mol) y hexafluorofosfato de O- (benciltriazol-l-il ) -?,?,?' ,?'-tetrametiluronio [HBTU] (96.0 g; 0.25 mol) a una suspensión de 2, 2' -bis-aminometilen-1 , 3-diaminopropano (7.2 g; 0.050 mol) en dimetilformamida (200 mi). Después de cinco dias la solución se evaporó al residuo (200 g) que se trató con etiléter (4 x 400 mi, 4 x 50 mi) ; la solución de éter se enjuagó con solución de NaHC03 al 5% (6 x 50 mi), en salmuera, y se evaporó a un residuo (84.6 g) que se trató con agua (2 x 100 mi) y luego se secó bajo alto vacio (50 Pa) para proporcionar 12, 12' -bis [2-aza-3-oxo-5, 8-dioxa-ll-undecanil ] -1 , 13-dien-4 , 7,17, 20-trioxa-9, 15-dioxo-10 , 14-diazatricosano (II) como residuo sólido (34.5 g) . 12 , 12 ' -bis [2-aza-3-oxo-5 , 8-dioxa-10 , ll-oxxranundecil] -(1,2) (22 ,23) -dioxiran-4 , 7 , 17 ,20-trioxa-9 , 15-dioxo-10 , 14-diazatricosano (III) Una solución de ácido m-cloroperbenzoico (70.5%) (MCPBA) (36.9 g; 0.150 mol) en cloroformo (500 mi) se separó a partir de agua y por goteo en una solución de 12 , 12 ' -bis [2-aza-3-oxo-5, 8-dioxa-ll-undecanil] -1, 13-dien-4, 7, 17, 20-trioxa-9, 15-dioxo-10, 14-diazatricosano (II) (17.5 g; 0.025 mol) en cloroformo (300 mi) bajo agitación. Después de dos días a temperatura ambiente, la solución se enjuagó con solución de NaHC03 al 5% hasta que se completó la eliminación de ambos ácidos m-cloroperbenzoico y m-clorobenzoico, luego con agua y salmuera. La solución orgánica se evaporó a residuo para proporcionar 12, 12' -bis [2-aza-3-oxo-5, 8-dioxa-10, 11-oxiranundecil] -(1,2) (22, 23) -dioxiran- , 7 , 17 , 20-trioxa-9, 15-dioxo-10, 14-diazatricosano (III) como un sólido semejante a cera (20.0 g) . 1 ,23-bis [4,7, 10-triacetic[l ,4 , 7 , 10-tetraazaciclododecan- (1) -il] ] -12 , 12' -bis [11 [4,7, 10-triacétic) -[1,4,7, 10-tetraazaciclododecan- (1) -il] ] 2-aza-3-oxo-5 , 8-dioxi-10-hidroxiundecanil] 2 , 22-dihidroxi-4 ,7,17, 20-tetroxi-9 , 15-dioxo-10 , 14-diazatricosano (V) Una solución de 12 , 12 ' -bi s [ 2-aza-3-oxo-5 , 8-dioxa-10, 11-oxiranundecil] -(1,2) (22, 23) -dioxiran-4 , 7, 17 , 20-trioxa-9, 15-dioxo-10, 14-diazatricosano (III) (3.6g; 0.0047 mol), 1 , 1-dimetiletil tris-éster del ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1 , , 7-triacético (10.3 g; 0.020 mol) y diisopropiletilamina (4.0 mi; 0.047 mol) en acetonitrilo (50 mi) se calentó a 50°C durante diez dias. La solución se evaporó para proporcionar 1 , 23-bis [ 4 , 7 , 10-tris ( 1 , 1-dimetiletilacetato) [1,4,7, 10-tetraazaciclodecan- ( 1 ) -il ] -12, 12' -bis [11 [4, 7, 10-tris (1, 1-dimetiletilacetato) [1,4, 7, 10-tetraazaciclodecan- (1) -il] ] -2-aza-3-oxo-5, 8-dioxi-10-hidroxiundecanil] -2 , 22-dihidroxi- ,7,17, 20-tetroxi-9 , 15-dioxo-10, 14-diazatricosano (IV). El residuo sin purificar se enfrió con un baño de hielo; se agregó ácido trifluoroacético (20 mi) en el agitador; se agregó en la solución de trisisopropilsilano (100 mcl) . Después de cinco días, se agregó etiléter (200 mi) y el precipitado se filtró y se secó (13.4 g) . El sólido se disolvió en agua (15 mi) y se purificó por cromatografía en el Amberchrome CG161 (2.6 x 55 cm) (???? FPLC) al utilizar metanol/agua como eluyente (gradiente de 0 a 100% v/v) . Después de la liofilizacion de la fracción pura, el producto (V) deseado se obtuvo como un sólido blanco (4.4 g) ; Título Complejométrico = 74% (con sulfato de zinc 0.1 N y murexida a pH 10) la principal impureza estuvo representada por ácido trifluoroacético .

El espectro de NMR (13C) del producto obtenido es consistente con la estructura del ligando quelante.

Complejo de Tetraiterbio (1:4) de 1 , 23-bis [4 , 7 , 10-triacetato [1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecan- (1) -il] ] -12 , 12' -bis [11 [4,7, 10-triacetato) -[1,4,7, 10-tetraazaciclododecan- (1) -il] ] 2-aza-3-oxo-5 , 8-dioxi-10-hidroxiundecanil] 2 , 22-dihidroxi-4,7,17,20-tetroxi-9,15-dioxo-10,14-diazatricosano (VI); Una solución de cloruro de iterbio hexahidratado (3.92 moles) en agua (25 mi) se agregó a la solución del ligando (V) (3.5 g; 0.98mmol; la cantidad molar exacta del ligando se determinó por titulación complejométrica) en agua (100 mi) en el agitador, la solución se neutralizó muy lentamente a pH 7.0 con hidróxido de sodio 2N (11.4 mi). Cuando el exceso de ligando fue < 0.2%, y el pH fue constante, la solución se desalinizó por medio de la columna Sephadex G10 para proporcionar, después que la solución liofilizó el complejo deseado, complejo de Iterbio (1:4) de 1, 23-bis [4, 7, 10-triacetato[l, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan- ( 1 ) -il] ] -12, 12' -bis [11 [4, 7, 10-triacetato) - [1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecan- (1) -il] ] 2-aza-3-oxo-5, 8-dioxi-10-hidroxiundecanil] 2, 22-dihidroxi- , 7, 17, 20-tetroxi-9, 15-dioxo-10, 14-diazatricosano (VI) (2.3 g) .

Ejemplo 2 Preparación del complejo quelado de Iterbio a partir del ácido 1 ( 2-hidroxietil ) -1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-4 ,7,10-triacético (Compuesto 3) El complejo quelado de Iterbio que corresponde al Compuesto 3 se preparó al utilizar el procedimiento sintético general que se esquematiza en el Esquema 3, cuyas etapas principales se detallan a continuación Esquema 3 1- [2- [tetrahidropiran- (2-il) -oxo] etil] -1,4,7, 10-tetraazaciclo-dodecan-4 , 7 , 10-triacétie- (1 , 1-dimetiléster) (VIII) Se sintetizó (2-bromoetoxi ) tetrahidropirano (VII) de acuerdo con el procedimiento descrito en J. Org. Chem. 1986, 51, 752-755. Este sustrato (27.5mmoles 5.75 g) se disolvió en 50 mi de acetonitrilo y se agregó por goteo a una suspensión de K2C03 (75mmoles; 10.37 g) y se preparó bromohidrato de D03A-tris- ter-butiléster, por ejemplo, como se describe en W096/28433 (25mmoles; 14.89 g) en acetonitrilo (150 mi) . Después de una noche a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se evaporó. El residuo luego se disolvió en acetato de etilo (100 mi) y se enjuagó con agua y SALMUERA. La solución orgánica se concentró en vacío y el producto sin purificar se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con gradiente de acetato de etilo/etanol . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se evaporaron para proporcionar un aceite amarillo (8.1 g; rendimiento del 49%) .

H NMR (600 MHz, CD3C1) y 13C NMR (150 MHz, CD3CI ) son consistentes con la estructura propuesta.

MS [M+H]+ calculada: 642.46, encontrada: 643.64. Ácido 1- (2-hidroxietil) -1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-4 , 7 , 10-triacético (IX) El intermediario VIII (15 g; 21.5mmoles) se disolvió en agua (30 mi), THF (60 mi) y ácido acético (120 mi) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 h con el fin de eliminar la porción de THP. La mezcla luego se concentró y se agregaron por goteo triisopropilsilano (120 µ?) y TFA (40 mi) a 0°C. Después de 3 días a temperatura ambiente, el producto sin purificar se precipitó con dietiléter (200 mi), se separó por filtración y se purificó mediante cromatografía líquida en resina de Amberchrom CG161 con TFA al 0.2% en agua. Las fracciones que contienen el producto deseado luego se combinaron y liofilizaron, se acidificaron con HC1 1N (60 mi) y se liofilizaron otra vez (7.3 g; rendimiento de 80%). lH NMR (600 MHz, D20) y 13C NMR (150 MHz , D20) son consistentes con la estructura propuesta.

MS [M+H]+ calculada: 390.21, encontrada: 391.53. 1- (2-hidroxietil) -1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-4 , 7 , 10-triacetato (3-) metalato (X) Las reacciones para formar complejos se realizaron con MeCl3 (Me = Yb, Eu, Tm o Dy) en solución acuosa a pH 6.5 por el método de la adición del ligando (Véase, J. Med. Chem. 2006, 49, 4926) . Una cantidad equimolar de solución acuosa de MeCl3 se agregó lentamente a la solución acuosa de IX manteniendo el valor de pH a 6.5 con NaOH 0.1 N. La mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que el pH permaneció constante. Cuando se alcanzó un pequeño excedente de metal, se monitoreó con el ensayo de naranja de xilenol, (véase Constrast Med. Mol. Imaging 2006, 1, 184) se agregó un pequeño excedente de ligando (< 2%) .

Los complejos entonces se desalaron mediante cromatografía de exclusión de tamaños y se liofilizaron.

El título del complejo, determinado por la prueba de Evans (DM Corsi, C. P. Iglesias, H. van Bekkurn, JA Peters, Magnetic Resonance in Chemistry, 2001, 39, (11), 723-726) fue de 98%.

Ejemplo 3 Preparación del complejo quelado de Iterbio a partir del ácido 1 [2, 3-dihidroxipropil] -1,4,7, 10-tetraazaciclododecan- , 7 , 10-triacético (Compuesto 4) El complejo quelado de Iterbio que corresponde al Compuesto 4 se ha preparado al utilizar el procedimiento sintético del Esquema 4, cuyas etapas principales se detallan a continuación.

Esquema 4 Acido 1 [2 , 3-dihidroxipropil] 1,4,7,10 tetraazaciclododecan-4 , 7 , 10-triacético (XIII) Una solución de 2 , 3-epoxipropanol (12.0 g 0.20 mol), 1, 1-dimetiletil tris-éster del ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1, , 7 -triacético (10.3 g; 0.020 mol) (XI) y diisopropiletilamina (8.0 mi; 0.09 mol), en acetonitrilo (50 mi), se calentó a 50°C durante tres días. La solución se evaporó para proporcionar 1[2,3-dihidroxipropil] 1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-4 , 7,10-tris ( 1 , 1-dimetiletilacetato) (XII ) . El residuo sin purificar se disolvió en diclorometano (100 mi) y se enfrió con baño de hielo y ácido trifluoroacético (15 mi) luego se agregó al agitador; el diclorometano se evaporó, se agregaron ácido trifluoroacético (90 mi) y triisopropilsilano (200 µ? ) . Después de un día, se agregó etiléter (200 mi) y el precipitado se filtró y se secó (16.5 g) . El sólido se disolvió en agua (30 mi) y se purificó en Amberlite XAD 1600 (5 x 12 cm) (AKTA FPLC) con agua como eluyente. Después de liofilizar el ligando deseado (XIII) de la fracción pura se obtuvo como un sólido blanco (10.6 g) .

El espectro de NMR (13C) es consistente con la estructura del ligando quelante.

La titulación complej ométrica del ligando recolectado luego se realizó (con sulfato de zinc 0.1N y murexida a pH 10) para evaluar la cantidad de óxido de Lantánido requerido para la formación extensa de complejos.

El título obtenido (41.9%) confirma la presencia residual del solvente y ácido trifluoroacético que se eliminaron después de la formación del complejo de ligando.

Metalato de 1 [2 , 3-dihidroxi-3-aminopropil] 1 , 4 , 7 , 10-tetraazaciclododecan-4 , 7 , 10-triacetato (XIV); Se agregó óxido metálico (2.21mmoles) a la solución de 1 [2 , 3-dihidroxipropil] 1,4,7, 10-tetraazaciclododecan- , 7 , 10-triacético (XII) (4.4 g; 4.43mmoles; calculado por titulación complejométrica) en agua (30 mi) en el agitador, la solución se calentó a 90°C. Cuando se disolvió el óxido, la solución se enfrió, se filtró en Millipore de 0.45 µ?a y se agregó lentamente Relite 3ASFB a pH 7; la resina se filtró y la solución se liofilizó para proporcionar el Metalato de 1 [2, 3-dihidroxipropil] 1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-4 , 7, 10-triacetato (XIV) El exceso de ligando, se determinó por titulación comple ométrica con el cloruro metálico 0.001 M al utilizar naranja de xilenol como indicador a pH 5.8.

El titulo del complejo se determinó a su vez por la prueba de Evans (DM Corsi, C. P. Iglesias, H. van Bekkum, JA Peters, Magnetic Resonance in Chemistry, 39, 11, páginas 723- 726, 2001 Ejemplo 4 Prueba in vitro Sensibilidad de Yb ( III ) HPD03A hacia el pH La sensibilidad del Yb (III) HPD03A hacia el pH se investigó in vitro al utilizar un espectro que contiene 14 capilares, de los cuales 11 comprenden soluciones de YbHPD03A que tienen una concentración 24mM y pH diferente que oscila de 5.19 a 8.75 (capilares 1-11), y 3 que contienen soluciones de YbHPD03A a pH 7.31 y concentraciones que oscilan de 3 a 24m . Los experimentos de MRI en CEST se realizaron a 20°C y 37°C. Se registraron las imágenes por MR del espectro irradiadas a 72 y 99 ppm, respectivamente y se muestran en la figura 3. En particular, la figura 3c) muestra el mapa de ST obtenido tras la irradiación de los protones hidroxilicos a 72 ppm (20°C; pulso de energía de irradiación 24 µ?) , aunque la figura 3d) muestra el mapa de ST obtenido tras la irradiación de los protones hidroxilicos a 99 ppm (20°C; pulso de energía de irradiación 24 µ?) .

Los resultados obtenidos confirman que la dependencia del pH de la transferencia de saturación desplegada por cada uno de los protones de OH de los dos diasteroisómeros de Yb ( III ) HPD03A dentro de la solución es diferente, en donde esto permite la explotación de una aproximación radiométrica . Las curvas de calibración que luego se realizaron, se reportaron en la figura 3e) , al medir la variación del efecto de ST con la variación del pH obtenido tras la irradiación de protones hidroxilicos de los dos isómeros a 72 ppm y 99 ppm, respectivamente, aprobados para obtener la curva radiométrica de la figura 3f) .

Ejemplo 5 Uso del Yb (III) HPDQ3A para evaluar el pH intracelular .

Se seleccionaron células madre mesenquimales como la linea celular para la prueba. Las células utilizadas en el experimento se extrajeron a partir de la médula ósea de murino, luego se cultivaron en el medio Alpha MEM con 20% de FBS (Suero Fetal de Bovino) . En el primer pasaje se agregó primocina a las células. Cuando la confluencia fue de aproximadamente 70%, las células se separaron con 0.25 de tripsina-edta, se enjuagaron con PBS y se resuspendieron con una solución de YbHPD03A 0.15 M. Parte de las células se incubaron a 37 °C durante 3 horas aunque en parte se electroporaron . Luego las células se enjuagaron en PBS y se prepararon para el experimento de MRI.

En particular: los mapas de CEST (mostrados en la figura 5) se obtuvieron para un espectro que contiene: 1) un gránulo de células MSH incubadas durante 3 horas con una solución que contiene 0.15 M de YbHPD03A en PBS a 37° a pH 7.4 (capilar 2); 2) un gránulo de células MSH electroporadas con una solución 0.15 M de YbHPD03A en PBS a pH 7.4 (capilar 3); 3) un gránulo de células NSH incubadas sólo con PBS y utilizadas como referencia (capilar 1), y un capilar vacio (capilar 4) . El efecto del % de ST se midió tras la irradiación del espectro a 72 y 99 ppm, respectivamente. Los mapas de ST obtenidos se reportaron en la figura 5, paneles b y c, respectivamente, lo que muestra que un efecto del % de ST pudiera verse sólo para aquellas células incubadas o electroporadas con YbHPD03A, aunque se registró cualquier saturación en ausencia del complejo. El efecto de ST observado fue mayor para aquellas ' células electroporadas, que corresponden a un pH medido de 7.00 + 0.2 aunque el pH medido en el gránulo de células incubadas del capilar 2 fue de 6.8 + 0.3.

Ejemplo 6 Pruebas in vivo Uso de Yb ( III ) HPD03A para la evaluación del pH en un modelo animal de melanoma Las mediciones in vivo se realizaron tras la inyección intravenosa de 1.2mmoles/Kg de YbHPD03A en un modelo animal de melanoma. Ratones C57B16 hembra (Charles River Laboratories, Calco, Italia) de 6 a 10 semanas de edad se inocularon subcutáneamente en el flanco izquierdo con 0.2 mi de una suspensión simple que contiene aproximadamente lxlO6 células de melanoma de murino B16, obtenidas a partir del ATCC (Manassas, VA, EUA) y desarrolladas en medio DMEM (Medio de Eagle Modificado de Dulbecco) suplementadas con FBS al 10%, glutamina 2mM, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina .

Las imágenes MR mejoradas con contraste de CEST se adquirieron a 7 T en un espectrómetro Bruker Avance 300 (Bruker, Alemania) equipado con una sonda de captura de microimágenes Micro2.5.

Los ratones se inyectaron con la solución de YbHPD03A (200 µL de una solución 150mM de YbHPD03A, que corresponde a 1.2mmoles/Kg del agente de CEST, es decir, tres veces la dosis clínicamente aprobada para ProHance®) 7 días después de la inoculación celular, es decir, cuando la masa del tumor alcanzó un diámetro medio de aproximadamente 4mm.

El espectro Z se adquirió antes e inmediatamente después de la inyección i.v. del agente al utilizar una secuencia POCO COMÚN (factor poco común de 8, tiempo de eco efectivo de 4.1 ms) precedida por un pulso de onda continua cuadrada (duración 2 s, energía 12 µ?, intervalo frecuencia de -20 a 20 ppm en etapas de 1 ppm) . El contraste de CEST se midió en la vejiga, los ríñones y el tumor. El espectro Z recolectado en la vejiga (reportado en la figura 6) reveló un cambio para la combinación de intercambio que corresponde a una T fisiológica menor (33°C) que los 37°C esperados, debido a la anestesia. La calibración de la dependencia de ST a partir del pH luego se repitió a esta temperatura, al seguir el procedimiento anteriormente descrito en el Ejemplo 2. La curva radiométrica obtenida se muestra en la Figura 7.

El efecto de ST luego se midió en la vejiga, los ríñones y el tumor por aplicación del método radiométrico, resultando en un pH de 6.06 + 0.2 en la vejiga, 6.24 + 0.2 en la médula de los ríñones, 6.6 + 0.2 en la región del tumor.

En la Figura 8 el mapa de ST calculado en el área de tumor se superpuso en la imagen anatómica correspondiente, donde aparece como área más clara, la cual actualmente brilla en rojo en la imagen que aparece en la pantalla del tomógrafo .

Ejemplo 7 Prueba in vitro Propiedades de sensibilidad de Yb ( III) HPD03A hacia la temperatura .

Una solución de Y ( III ) HPD03A (24mM) que tiene un pH 7.31 se utilizó para la prueba. El espectro Z de la solución, registrado a 20 y 37°C, respectivamente, muestra que el cambio químico de los protones hidroxílicos de los diasteroisómeros de Yb ( III ) HPD03A distinguidos por NMR dentro de la solución es muy sensible a la temperatura. En efecto, como se muestra en la figura 4, panel b) cuando se pasa de 20° a 37 °C, las frecuencias de resonancia que corresponden a dos estereoisomeros diferentes del complejo cambia de 99 a 88 y de 72 a 64.3 ppm, respectivamente. Puesto que el cambio químico del protón no depende de la concentración del agente, la recolección simple del espectro Z permite determinar exactamente la temperatura del ambiente y, luego, para determinar el pH por medio de una calibración in vitro adecuada.

Ejemplo 8 Propiedades sensibles del Yb ( III ) HPD03A-tetrámero hacia la temperatura .

La prueba se realizó con un espectro que contiene la solución de YbHPD03A-tetrámero en suero que tiene concentración diferente, que oscila de 0.26 a 8.4mM, pH 7.4 y 298 K. La dependencia de los cambios químicos de los protones móviles del OH (de los estereoisomeros del complejo tetramérico) se probó en la Temperatura por la operación como se describió anteriormente para el compuesto monomérico. Las curvas radiométricas obtenidas, desplegadas en la figura 10, confirman sustancialmente los resultados obtenidos con el compuesto monomérico en el Ejemplo 7. Sin embargo, como se espera, y como aparece en la figura 10, panel b) la sensibilidad por molécula del complejo tetramérico resulta en un incremento mucho mayor (cuando se compara con el complejo monomérico correspondiente) .

Ejemplo 9 Uso del Compuesto 4 para evaluar el pH intracelular .

Se seleccionaron células (J774) macrofágicas de murino como la linea celular de la prueba. El intervalo de sensibilidad de la curva radiométrica obtenida con este compuesto se sintonizó primero de forma apropiada en el intervalo de pH intracelular.

En particular, por aplicación de la aplicación radiométrica a las curvas de ST calculadas sobre el pH tras la irradiación de las dos combinaciones de protones móviles más cambiadas a 75 ppm (sitio 1) y 100 ppm (sitio 2), respectivamente, aprobados para obtener la curva radiométrica de la figura 20, al desplegar la variación de ST radiométrico con el pH, en un intervalo de pH 5.5 a 7.

El Compuesto 4 se interiorizó en las células (J774) macrofágicas de murino. Las J774 se obtuvieron de la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC, Manassass, VA) . Las células se cultivaron en el medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal de bovino (FBS) al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Se sembraron en frascos de 75 cm2 a una densidad de aproximadamente 2xl04 células/cm2 y se cultivaron en una incubadora humidificada con C02 al 5% a 37°C. Las J774 se incubaron durante la noche con 70mM del compuesto 4. Las células se enjuagaron y reincubaron con su medio de crecimiento durante 3 horas. Las células luego se separaron con Tripsina-EDTA al 0.25% y se prepararon para el experimento por MRI de CEST.

Se calculó un valor radiométrico de la transferencia de saturación al adquirir el espectro Z de un espectro que contiene gránulos de células ya sea incubados durante la noche con el compuesto 4 o incubados con el medio de crecimiento.

El efecto de ST se observó para células incubadas producidas para un valor de pH de 6.8.

Ejemplo 10 Prueba in vitro Sensibilidad del Compuesto 4 hacia el pH.

La sensibilidad del compuesto 4 hacia el pH se investigó in vitro al utilizar un espectro que contiene 6 capilares que comprenden soluciones del complejo de Iterbio que tienen una concentración de 20mM y diferente pH, que oscila de 5.08 a 7.4. Los experimentos por RI de CEST se realizaron a 20°C. El espectro Z recolectado del espectro irradiado (energía de irradiación 24 µ?) a 75 y 100 ppm, respectivamente, se muestran en la figura 19.

La curva de ST radiométrica que se obtuvo como una función del pH se muestra en la figura 20.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. El uso de estereoisómeros de un agente de CEST que se distinguen por NMR en un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente de CEST es un compuesto del complejo de Lantánido (III) que comprende un ligando quelante macrocíclico dotado con un grupo que intercambia protones del hidroxilo en un brazo colgante en un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde el ion metálico de Lantánido (III) del complejo de Lantánido (III) se selecciona del grupo que consiste de praseodimio (III), neodimio (III), disprosio (III), erbio (III), terbio (III), holmio (III), tulio (III), iterbio (III), y europio (III), donde el europio (III) e iterbio (III). (no termina la idea)

4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, en donde el ion de Lantánido (III) es Iterbio (III) o Europio (III) .

5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el ligando quelante macrocíclico del complejo tiene la fórmula (I) donde : R es -CH (R2) -COOH, Ri es H o un alquilo de C1-C5 de cadena recta o ramificada, que se interrumpe opcionalmente por un grupo seleccionado del grupo de -O-, -N-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, y se sustituye opcionalmente por uno o más átomos de halógeno, grupos hidroxilo (-OH), un grupo fenilo o fenilo sustituido, o por un grupo seleccionado de -COOH, -NHR3 o -NR4R5, en donde R3, 4 y 5 son, los mismos o diferentes entre si, un grupo alquilo de C1-C3 recto o ramificado el cual se sustituye opcionalmente por uno o más hidroxilos o grupos alcoxi de C1-C3, R2 es H o una cadena de alquilo de C1-C5 que se sustituye opcionalmente por uno de los grupos alcoxi de C1-C3 , o hidroxialcoxi, o un derivado dimérico o multimérico de los mismos.

6. El uso de un complejo de lantánido (III) de conformidad con la reivindicación 5, en el cual en la fórmula (I) R2 es H y Ri representa un grupo seleccionado de: -H, -CH3, —CH2CH3 , -CH2OH, -CH2-O-CH3, -CH(CH2OH)2, -CH2-CH (OH) -CH2OH, —CH2—O-CH2—C6H5 , -CH2-0-CH2- (C6H5-COOH) , -CH2-0-CH2- (C6H5-N02) .

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en donde en la fórmula (I) R2 es H, Rx es CH3 y el ion metálico de lantánido se selecciona de Yb (III) o Eu (IIII) .

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el agente de CEST es un complejo quelado de Lantánido (III) del ácido 1[1,3,4-trihidroxibutan-2-il] 1,4,7, 10-tetraazaciclododecan- ,7,10-triacético .

9. El uso del compuesto del complejo de lantánido (III) de la fórmula (I), como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, o un derivado dimérico o multimérico de los mismos, o del complejo quelado de Lantánido (III) de la reivindicación 8 como el agente de contraste de CEST independiente de la concentración.

10. El uso de un compuesto del complejo de lantánido (III) de conformidad con la reivindicación 9, como agente sensible de CEST, para obtener los mapas independientes de la concentración de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico.

11. Un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST se caracteriza porque comprende explotar protones intercambiables magnéticamente no equivalentes que pertenecen a los estereoisómeros que se distinguen por NMR de un agente de CEST.

12. Un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST de conformidad con la reivindicación 11, se caracteriza porque el agente de CEST comprende un compuesto del complejo de Ln(III) como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.

13. Un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, se caracteriza para proporcionar la captura de imágenes de CEST in vivo independiente de la concentración .

14. Un procedimiento de captura de imágenes radiométricas basadas en CEST de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, se caracteriza para obtener mapas in vivo independientes de la concentración a partir de un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un órgano, fluido o tejido en el cuerpo humano o animal.

15. Un método para determinar un parámetro físico o químico de interés diagnóstico en un sujeto humano o animal pre-administrado con un compuesto quelado de Ln(III) de la fórmula (I) o un derivado de dímero o multimero del mismo, por una técnica de MRI de CEST, se caracteriza porque comprende : i) opcionalmente, registrar las imágenes morfológicas por MRI del órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo humano o animal de interés ii) recolectar un espectro Z, en un intervalo de frecuencias finamente sintonizadas en las frecuencias de resonancia de dos protones móviles magnéticamente no equivalentes que pertenecen a los estereoisómeros que se distinguen por NMR del complejo de Lantánido pre-administrado, y calcular los valores radiométricos a partir del efecto de transferencia de saturación ST medido por estas combinaciones de protones móviles, iii) al obtener, a partir de los valores de ST calculados, un mapa independiente de la concentración del parámetro de interés en el órgano, región, fluido o tejido en el cuerpo humano o animal afectado de interés, al superponer el mapa en la imagen morfológica.

16. El HPD03A-Tetrámero, las sales del mismo y los complejos quelados del mismo con iones metálicos paramagnéticos .

17. Una composición de diagnóstico, se caracteriza porque comprende (Yb34) 4HPD03A-tetrámero junto con aditivos adecuados fisiológicamente aceptables y/o portadores.